JP2003125750A

JP2003125750A - マイクロピペット、インジェクション装置およびマイクロインジェクションの方法

Info

Publication number: JP2003125750A
Application number: JP2002200703A
Authority: JP
Inventors: Yukio Hiramoto; 幸男平本
Original assignee: NARISHIGE KK
Current assignee: NARISHIGE KK
Priority date: 2001-07-10
Filing date: 2002-07-10
Publication date: 2003-05-07

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明では、インジェクション液を注入させ
る量または核を吸引させたときの位置を調節することが
できるマイクロピペットおよびインジェクション装置を
提供することを課題とする。【解決手段】マイクロピペット１の先端から後方に離
れた所定位置に後方に向かって広がるテーパ部１２ａを
設ける。このテーパ部１２ａの内径が小さい部分に培養
液６の界面を位置させておいて、マイクロピペット１内
の空気Ａにインジェクション装置２により低い圧力を加
えることで、精子Ｓをマイクロピペット１内に吸引させ
る。このとき、培養液６の界面がテーパ部１２ａの内径
の大きい部分に移動し、所定位置で止まる。そのため、
マイクロピペット１のテーパ部１２ａで培養液６の界面
の位置を調節するだけで、精子Ｓをマイクロピペット１
内に吸引させたときの精子Ｓの位置を調節できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、主として生命科学
におけるマイクロインジェクション、核移植および体外
受精などを行うためのマイクロピペットに関するもので
ある。

【０００２】

【従来の技術】従来、生物学や基礎医学やバイオテクノ
ロジの分野では、生物の微小な器官、組織、細胞などを
顕微鏡で観察しながら機械的操作を行うマイクロマニピ
ュレーションと呼ばれる作業が行われている。このマイ
クロマニピュレーションとしては、組織の中から細胞を
採取したり、細胞の中から核や細胞質を採取したり、採
取した核や細胞質を別の細胞に移植する作業や、細胞内
にさまざまな物質を注入させるいわゆるマイクロインジ
ェクションと呼ばれる作業などがある。このマイクロマ
ニピュレーションを行うための実験器具および装置とし
ては、マイクロピペット、インジェクション装置および
マニピュレータなどが主に使用されている。細胞内にＤ
ＮＡ溶液などの液体（以下、インジェクション液とい
う。）を注入する作業においては、まず、インジェクシ
ョン装置のシリンジでマイクロピペット内の圧力を低く
して、インジェクション液をマイクロピペット内に吸い
込む。つぎに、このマイクロピペットをマニピュレータ
により３次元的に微動操作してマイクロピペットの先端
を細胞内に差し込む。インジェクション装置のシリンジ
でマイクロピペット内の圧力を高くするとチューブおよ
びインジェクションホルダを介してマイクロピペット内
のインジェクション液が細胞内に注入される。一方、細
胞内の核や細胞質を吸引する作業においては、インジェ
クション装置のシリンジでマイクロピペット内の圧力を
低くすることによりマイクロピペット内に細胞内の核や
細胞質を吸引する。ここで、マイクロピペットは、外径
が約１ｍｍ程度のガラス管の一端を外側に向かって先細
りとなるテーパ形状に加工したものである。そして、マ
イクロインジェクションを行う場合には、このマイクロ
ピペットのテーパ形状となった先端部にインジェクショ
ン液を封入し、その後端部にインジェクション液にシリ
ンジからの圧力を伝達させる媒体として気体または液体
を封入する。また、細胞内の核や細胞質を吸引する場合
には、マイクロピペットの先端部に細胞や核の培養液を
封入し、その後端部に前記媒体として気体または液体を
封入する。

【０００３】このような従来のマイクロピペットでは、
インジェクション装置によりマイクロピペット内の圧力
を高くしてインジェクション液を注入する場合、そのイ
ンジェクション液はほぼ一定の速度で細胞内に連続的に
注入され続ける。逆に、マイクロピペット内の圧力を低
くして細胞内の核や細胞質を吸引する場合、ほぼ一定の
速度でマイクロピペット内に余分な細胞質が連続的に吸
引され続け、また、核がマイクロピペットの先端より後
方に離れた位置まで吸い込まれてしまう。この現象は、
マイクロピペット内から細胞内に注入させるインジェク
ション液の量がシリンジの操作によるピストンの移動量
に比べて極めて少ないため、マイクロピペット内の圧力
はマイクロピペットの先端からのインジェクション液の
流出では、ほとんど変化しないことにより発生するもの
である。また、マイクロピペット内に細胞内の核や細胞
質を吸引するときにも、同様の原因により、この現象が
発生する。

【０００４】このような現象の発生を防止するために、
従来は、顕微鏡で細胞の体積の増加または減少が認めら
れたときにマイクロピペットを引き抜く方法を行ってい
たが、この方法は作業者のかんに頼るものであるため、
誤差が大きく、定量的な操作には向かなかった。そこ
で、ブレーキ付きのマイクロピペットを用いる方法や、
水銀を利用する方法で定量的な操作が行われるようにな
った。これらの方法のうちブレーキ付きのマイクロピペ
ットを用いる方法では、マイクロピペットの一部に内径
が小さい部分を作り、その部分に粘度の高い液を入れて
抵抗を大きくして、インジェクション液の注入や細胞内
の核などの吸引を遅くすることができた。一方、水銀を
利用する方法は、水銀を入れたマイクロピペットの基部
から圧力を加えると水銀が先端方向に向かって移動し、
圧力が大きいほど水銀界面は先細りしている先端に近い
位置で止まることから、水銀界面とマイクロピペット先
端部とで囲まれた部分の体積は圧力を調節することによ
って変えることができるということを利用したものであ
る。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
ブレーキ付きのマイクロピペットを用いる方法では、細
胞内にインジェクション液を注入する場合、マイクロピ
ペットから流出させるインジェクション液の速度を遅く
することはできたが、細胞内に所定量のインジェクショ
ン液が注入された後でも、そのインジェクション液の動
きを完全には止めることができなかった。また、細胞内
の核や細胞質を吸引するような場合でも、同様の理由で
培養液の吸引を完全には止めることができず、余分な細
胞質がマイクロピペット内に吸い込まれ続けるという問
題や核がマイクロピペットの先端より後方に離れた位置
に吸い込まれるという問題が生じた。すなわち、インジ
ェクション液を注入させる量または核を吸引させたとき
の位置を調節することが困難であった。一方、従来の水
銀を利用する方法では、インジェクション液を注入させ
る量または核を吸引させたときの位置を調節することが
できたが、マイクロピペットの先端に形成されているテ
ーパ形状の内径が小さい部分を利用しているので、マイ
クロピペットの先端の太さやインジェクション液の量を
自由に設定することができなかった。また、水銀の毒性
も問題であったため、この水銀を利用する方法で実験を
行うことが法律上規制されることが多く、実質的にその
使用ができなくなってきた。

【０００６】そこで、本発明の課題は、インジェクショ
ン液を注入させる量または核などを吸引させたときの核
などの位置を調節することができるマイクロピペットお
よびインジェクション装置を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】前記課題を解決した本発
明のうちの請求項１に記載の発明は、微量の液体や微小
固体を注入または吸引するためのマイクロピペットであ
って、マイクロピペットの先端から後方に離れた所定位
置に、圧力調節液が入り、かつ、後方に行くにしたがっ
て拡幅するテーパを有する圧力調節部が設けられ、この
圧力調節部に接触する前記圧力調節液の界面の面積が増
減することにより、微量の液体や微小固体の注入または
吸引を調節することを特徴とする。

【０００８】ここで、「圧力調節液」としては、種々の液
体を用いることができる。たとえば、インジェクション
液や培養液などをそのまま圧力調節液として利用しても
よいし、インジェクション液などに混合しないパラフィ
ン油などを圧力調節液として利用してもよいし、さら
に、表面張力の大きい水などを圧力調節液として利用し
てもよい。ただし、水などのインジェクション液や培養
液と混合しやすい液体を圧力調節液として利用する場合
には、この水などがインジェクション液などに混合しな
いように、この水とインジェクション液などの間にこれ
らの液体と混合しないパラフィン油などを介在させる必
要がある。

【０００９】請求項１に記載の発明によれば、たとえ
ば、インジェクション液を細胞内に注入する場合は、ま
ず、圧力調節液と空気（気体）との界面を圧力調節部の
内径が大きい部分に位置させておく。マイクロピペット
内の空気の圧力を上げれば、圧力調節液と空気との界面
は圧力調節部の内径が小さい部分に移動する。この圧力
調節液と空気との界面が小さくなると、空気の圧力によ
り界面を圧力調節液側に押す力が減り、この力が表面張
力により界面を空気側に押す力と等しくなった位置で、
この界面の動きが止まる。また、マイクロピペット内に
細胞内の核などを吸引する場合は、まず、圧力調節液と
空気との界面を圧力調節部の内径が小さい部分に位置さ
せておく。マイクロピペット内の空気の圧力を下げれ
ば、圧力調節液と空気との界面は圧力調節部の内径が大
きい部分に移動する。この圧力調節液と空気との界面が
大きくなると、表面張力により界面を空気側に押す力が
減り、この力が空気の圧力により界面を圧力調節液側に
押す力と等しくなった位置で、この界面の動きが止ま
る。したがって、マイクロピペットの圧力調節部で圧力
調節液と空気との界面の位置を圧力により調節するだけ
で、細胞内にインジェクション液を注入させる量や細胞
内の核などをマイクロピペット内に吸引させたときの位
置を調節することができる。マイクロピペットの先端か
ら後方に離れた所定位置に圧力調節部が設けられている
ので、マイクロピペットの先端の太さや形を自由に設定
することができる。さらに、この圧力調節部の内径が最
も小さい部分まで十分に利用できるので、水銀よりも表
面張力が小さい液体を圧力調節液として使用することが
できる。

【００１０】請求項２に記載の発明は、マイクロピペッ
ト内の圧力を連結手段を介して加圧手段で調節すること
により微量の液体や微小固体を注入または吸引させるイ
ンジェクション装置であって、前記マイクロピペットと
して請求項１に記載のマイクロピペットを使用したこと
を特徴とする。

【００１１】請求項２に記載の発明によれば、たとえ
ば、加圧手段を操作することで連結手段を介してマイク
ロピペット内の空気の圧力を調節することができる。し
たがって、請求項１に記載の発明による効果に加え、加
圧手段の操作により、細胞内に注入するインジェクショ
ン液の量や細胞内の核などをマイクロピペット内に吸引
させたときの位置を調節することができる。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下、図面を参照して、本発明に
係るマイクロピペットおよびインジェクション装置の詳
細について説明する。図１（ａ）に示すように、マイク
ロピペット１は、外径が約１ｍｍ程度の円管となる基部
１１と、この基部１１の一端から外側に向かって先細り
のテーパ形状となる先端部１２とを有している。この先
端部１２には、図１（ｂ）に示すように、その先端から
後方に離れた所定位置に、一度内径が絞られた後、後方
に行くにしたがって拡幅するテーパ部（圧力調節部）１
２ａが形成されている。このマイクロピペット１の先端
部１２は、外径が約１ｍｍ程度のガラス管の先端をマイ
クロピペット製作器（図示せず）により加熱して引っ張
ることで形成される。また、この先端部１２のテーパ部
１２ａは、マイクロフォージ（図示せず）によりこの先
端部１２の所定部を電熱線で加熱して縮ませることで形
成される。ここで、マイクロピペット１はまっすぐなま
までも使用できるが、その先端とテーパ部１２ａを含む
先端部１２は、操作の際に容器の中で水平に保っておく
ことが必要なので、マイクロピペット１は基部１１と先
端部１２の間の適当な位置で熱を加えることにより２０
〜３０度程度曲げて、先端部１２を斜め上から容器の中
に入れることができるようにして使うことが多い。そこ
で、本実施形態でも、マイクロピペット１の基部１１と
先端部１２の間を曲げた状態にして使用することとす
る。

【００１３】このマイクロピペット１の基部１１の後端
には、図２（ａ）および（ｂ）に示すように、右側のイ
ンジェクション装置２Ｒのインジェクションホルダ２１
Ｒの一端が取り付けられ、このインジェクションホルダ
２１Ｒの他端には可とう性を有するチューブ（連結手
段）２２Ｒの一端が取り付けられる。このチューブ２２
Ｒの他端にはシリンジ（加圧手段）２３Ｒが取り付けら
れるとともに、このシリンジ２３Ｒから一端側に離れた
適所に連結管２４Ｒが設けられる。この連結管２４Ｒに
チューブ２５Ｒの一端が取り付けられ、このチューブ２
５Ｒの他端に圧力計２６Ｒが取り付けられる。そして、
前記シリンジ２３Ｒはピストン運動によって圧力を調節
するものであり、この圧力を伝達させる媒体として空気
Ａを利用する。マイクロピペット１が取り付けられるイ
ンジェクションホルダ２１Ｒは、マニピュレータ３Ｒに
保持され、このマニピュレータ３Ｒは倒立顕微鏡５のス
テージ５１に固定されている。なお、マニピュレータ３
Ｒは、前記マイクロピペット１を前後、左右および上下
に、精密に動かすことができる装置である。そして、こ
れらのインジェクション装置２Ｒやマニピュレータ３Ｒ
は、倒立顕微鏡５を挟んだ左側にも一つずつ配設され
る。この倒立顕微鏡５は、前記ステージ５１の上方に光
源ランプ５２、ランプハウス５３、視野絞り５４、開口
絞り５５および集光器５６を備え、その下方に対物レン
ズ５７を備えるものである。そして、前記ステージ５１
の左側の下部には、このステージ５１を動かすための十
字動つまみ５８が設けられている。左側のインジェクシ
ョンホルダ２１Ｌには、細胞を保持するためのホールド
用マイクロピペットＨが取り付けられる。このホールド
用マイクロピペットＨは、その先端の内径が保持すべき
細胞の外径よりも小さくなっている。なお、細胞を保持
する方法はホールド用マイクロピペットＨを使用しない
他の方法であってもよく、たとえば、細胞を容器の底に
貼り付ける方法や、２枚のカバーガラス片の間に挟む方
法などがある。そして、前記倒立顕微鏡５の十字動つま
み５８を操作すると、このステージ５１の中央に載置さ
れる容器Ｙとその両側に固定されるマニピュレータ３
Ｌ，３Ｒが一緒に動く。そのため、このマニピュレータ
３Ｌ，３Ｒにインジェクションホルダ２１Ｌ，２１Ｒを
介して取り付けられるホールド用マイクロピペットＨ、
マイクロピペット１がステージ５１を動かすことによっ
て、容器Ｙの中の試料と一緒に動くことになる。

【００１４】次に、顕微授精の実験における、マイクロ
ピペット１、インジェクション装置２Ｌ，２Ｒおよびマ
ニピュレータ３Ｌ，３Ｒの使用方法について、図２およ
び図３を参照して説明する。ここで、この顕微授精で使
用するマイクロピペット１の先端の内径は、このマイク
ロピペット１内に吸引すべき精子の外径より大きくなっ
ている。まず、ステージ５１の十字動つまみ５８を操作
してマイクロピペット１の先端部１２を倒立顕微鏡５の
視野内に持って来て、マニピュレータ３Ｒを操作して、
図３（ａ）に示すように、マイクロピペット１の先端か
らテーパ部１２ａを含む先端部１２を水平に保ったま
ま、培養液６の入った容器Ｙの中に入れる。このマイク
ロピペット１内の空気Ａの圧力をシリンジ２３Ｒにより
調節することで、図３（ａ）に示すような所定量の圧力
調節液としての培養液６をマイクロピペット１内にあら
かじめ吸引させておく。そして、マニピュレータ３Ｌ，
３Ｒを操作することにより、倒立顕微鏡５の視野内にマ
イクロピペット１の先端部１２とホールド用マイクロピ
ペットＨの先端を位置させる。まず、シリンジ２３Ｌを
操作して卵子Ｏをホールド用マイクロピペットＨの先端
に吸い付けて固定したのち、図３（ｂ）に示すように、
精子Ｓの浮遊液を容器Ｙに加える。そして、作業者は対
物レンズ５７を通して観察しながら、マニピュレータ３
Ｒを操作して、その先端を容器Ｙの培養液６の中に浮遊
している精子Ｓに近づけ、マイクロピペット１内の空気
Ａの圧力をシリンジ２３Ｒにより調節して、精子Ｓを培
養液６とともにマイクロピペット１内に吸引させる。そ
して、マニピュレータ３Ｒを操作して、図３（ｃ）に示
すように、マイクロピペット１の先端を卵子Ｏに近づ
け、このマイクロピペット１内の空気Ａの圧力をシリン
ジ２３Ｒにより高くして、精子Ｓを卵子Ｏに接触、ある
いは卵子Ｏ内に注入する。

【００１５】以下に、本発明であるマイクロピペット１
内における圧力調節液としての培養液６が作動する原理
について詳細に説明する。このマイクロピペット１で
は、培養液６と空気Ａとの界面を挟んで発生するシリン
ジ２３Ｒによる圧力と培養液６内の圧力との圧力差によ
りこの界面に加えられる力と、この界面の表面張力によ
りこの界面に加えられる力とのバランスを利用してい
る。したがって、図４に示すように、シリンジ２３Ｒに
よる圧力Ｐｍと培養液６内の圧力Ｐｉとの圧力差により
この界面に加えられる力Ｆｐと、この界面の表面張力Ｔ
によりこの界面に加えられる力Ｆｔとの関係を以下の式
で表すことができる。Ｆｐ＝πＲ²（Ｐｍ−Ｐｉ）・・・（１）Ｆｔ＝２πＲＴｃｏｓ（α＋θ）・・・（２）（Ｒ：培養液６の界面の半径、Ｐｍ：シリンジ２３Ｒに
より培養液６の界面に加えられる圧力、Ｐｉ：培養液６
側から培養液６の界面に加えられる圧力、Ｔ：培養液６
の空気Ａに対する表面張力、α：培養液６とマイクロピ
ペット１の内壁との接触角、θ：マイクロピペット１の
中心軸と内壁との角度）ここで、培養液６と空気Ａとの界面が止まっている場合
には、力Ｆｐと力Ｆｔが釣り合っているので、前記
（１）および（２）式より以下の式が導かれる。 πＲ²（Ｐｍ−Ｐｉ）＝２πＲＴｃｏｓ（α＋θ）・・・（３）ここで、マイクロピペット１内に吸引する圧力調節液は
容器Ｙ内の培養液６であり、かつ、このマイクロピペッ
ト１の培養液６が入っている先端部１２が水平になって
いるので、マイクロピペット１のテーパ部１２ａに位置
する界面に培養液６側から加えられる圧力Ｐｉをゼロと
みなしても問題なくなる（厳密には、マイクロピペット
１の先端と容器Ｙ中の培養液６の表面のわずかなレベル
の差を考慮する必要があるが、これは一般に１ｍｍ以下
であり、無視することができる）。そのため、最終的に
以下の式が導かれる。Ｐｍ＝２Ｔｃｏｓ（α＋θ）／Ｒ・・・（４）シリンジ２３Ｒにより空気Ａの圧力Ｐｍを変化させる
と、培養液６の界面の位置が移動していき、この界面の
半径Ｒが所定値になったところ（Ｐｍ＝２Ｔｃｏｓ（α
＋θ）／Ｒとなったところ）で界面が止まることにな
る。

【００１６】前記の（４）式に基づいて、マイクロピペ
ット１内で起こる現象について、以下に説明する。精子
Ｓをマイクロピペット１内に吸引する場合では、図３
（ａ）に示すように、精子Ｓを吸引する前に培養液６の
界面をテーパ部１２ａの内径が小さい部分に位置させて
おく。そして、シリンジ２３Ｒによりマイクロピペット
１内の空気Ａの圧力Ｐｍを低くすると、（４）式の関係
がＰｍ＜２Ｔｃｏｓ（α＋θ）／Ｒとなり、培養液６の
界面が後方に向かって移動しようとする。この界面の後
方に移動しようとする力、すなわち吸引力により、図３
（ｂ）に示すように、精子Ｓがマイクロピペット１内に
吸引される。このとき、培養液６の界面は後方に向かう
につれて、その半径Ｒが大きくなっていき、（４）式の
関係がＰｍ＝２Ｔｃｏｓ（α＋θ）／Ｒとなった位置
で、この界面の動きが止まる。そのため、この界面が止
まった位置に対応したマイクロピペット１の先端近傍の
位置で精子Ｓも留まることになる。

【００１７】そして、マニピュレータ３Ｒを操作してマ
イクロピペット１の先端を卵子Ｏに近づけると、このマ
イクロピペット１内に吸引された精子Ｓがマイクロピペ
ット１の先端近傍の所定位置に留まったまま運ばれるこ
とになる。そして、シリンジ２３Ｒによりマイクロピペ
ット１内の空気Ａの圧力Ｐｍを高くすると、（４）式の
関係がＰｍ＞２Ｔｃｏｓ（α＋θ）／Ｒとなり、培養液
６の界面が前方に向かって移動する。この界面は、前方
に向かうにつれてその半径Ｒが小さくなっていき、
（４）式の関係がＰｍ＝２Ｔｃｏｓ（α＋θ）／Ｒとな
った位置で、図３（ｃ）に示すように、この界面の動き
が止まる。そのため、培養液６の界面が前方に移動して
いる間、マイクロピペット１内の精子Ｓが卵子Ｏ近傍に
排出され、この界面が止まったときに培養液６の動きも
止まり、所定量の精子Ｓが卵子Ｏに接触、あるいは卵子
Ｏ内に注入されることになる。ここで、実際には、精子
Ｓの大きさなどが図示したものより小さいため、培養液
６の界面がテーパ部１２ａの範囲内で移動するとマイク
ロピペット１の先端の微小範囲でこの精子Ｓが吸引また
は注入される。しかし、図３においては、説明の便宜
上、培養液６の界面の移動量や精子Ｓなどの移動量を大
きく表現している。以下の説明に用いる図面について
も、同様に表現している。

【００１８】次に、細胞から核を取り出す実験を行う場
合について、図２および図５を参照して説明する。ここ
で、この実験で使用するマイクロピペット１の先端の内
径は、細胞内から取り出すべき核の外径よりも大きくな
っている。さらに、細胞内の核を吸引するときには、細
胞の細胞膜を破る必要があるので、マイクロピペット１
の先端を鋭利な状態にしておくことが望ましい。したが
って、以下で説明する実験において、細胞の細胞膜を破
る必要がある実験では、マイクロピペット１の先端は鋭
利な状態になっているものとする。マイクロピペット１
内の空気Ａの圧力をシリンジ２３Ｒにより調節すること
で、図５（ａ）に示すような所定量の培養液６をマイク
ロピペット１内にあらかじめ吸引させておく。左側のマ
ニピュレータ３Ｌおよびシリンジ２３Ｌを操作して、図
５（ａ）に示すように、ホールド用マイクロピペットＨ
の先端に細胞Ｃ１を吸い付けて固定させる。右側のマニ
ピュレータ３Ｒを操作して、図５（ｂ）に示すように、
マイクロピペット１の先端を核Ｄに最も近い細胞表面か
ら細胞Ｃ１内に押し込んで、細胞Ｃ１の核Ｄ（微小固
体）近傍に位置させる。そして、マイクロピペット１内
の空気Ａの圧力をシリンジ２３Ｒにより低くして、図５
（ｃ）に示すように、細胞Ｃ１の核Ｄと細胞膜をマイク
ロピペット１内に吸い込む。この核Ｄと細胞膜をさらに
マイクロピペット１内に吸い込ませると、図５（ｄ）に
示すように、細胞膜が鋭いマイクロピペット１の先端で
破られ、今まで細胞膜に加えられていた吸引力が細胞Ｃ
１内の細胞質および核Ｄに作用するが、培養液６の界面
が所定位置で止まるため、核Ｄがマイクロピペット１内
の所定位置で留まることになる。以上により、細胞Ｃ１
から核Ｄを取り出す実験が終了する。

【００１９】次に、マイクロピペット１内の先端近傍で
保持する核Ｄを別の細胞に移植する方法について、図２
および図６を参照して説明する。まず、前記のように、
あらかじめマイクロピペット１内に細胞Ｃ１から核Ｄを
取り出しておく（図５参照）。そして、左側のマニピュ
レータ３Ｌおよびシリンジ２３Ｌを操作して、図６
（ａ）に示すように、ホールド用マイクロピペットＨの
先端に、あらかじめ核が取り出されている細胞Ｃ２を吸
い付けて固定させる。再び右側のマニピュレータ３Ｒを
操作して、マイクロピペット１の先端を細胞Ｃ２内に押
し込む。そして、マイクロピペット１内の空気Ａの圧力
をシリンジ２３Ｒにより低くして、図６（ｂ）に示すよ
うに、細胞Ｃ２の細胞膜を破る。この細胞膜が破れたと
き、今まで細胞膜に加えられていた吸引力が細胞Ｃ２内
の細胞質に作用するため、核Ｄとその周りにある細胞質
が細胞Ｃ２の細胞質とともに、マイクロピペット１内の
先端より後方に離れた位置まで勢いよく吸引される。し
かし、培養液６の界面はマイクロピペット１内のテーパ
部１２ａの所定位置で止まるため、核Ｄなども所定位置
で止まることになる。そして、マイクロピペット１内の
空気Ａの圧力を高くして、図６（ｃ）に示すように、マ
イクロピペット１内の核Ｄとその周りの細胞質をマイク
ロピペット１の先端付近まで押し出し、この核Ｄを細胞
Ｃ２内に移植したのち、図６（ｄ）に示すように、マイ
クロピペット１を徐々に引き抜くことにより核移植の実
験が終了する。なお、ここでは、あらかじめ細胞Ｃ２の
核をマイクロピペット１により取り出しておいてから核
移植を行う方法を説明したが、他の方法として、核が取
り出されていない細胞Ｃ２内に細胞Ｃ１の核Ｄをマイク
ロピペット１により移植したあとに、細胞Ｃ２内の核を
取り出す方法がある。この方法には、マイクロピペット
１を細胞Ｃ２内に差し込む操作を一回だけ行えばよいと
いう利点がある。

【００２０】次に、マイクロインジェクションの実験に
ついて説明する。均質の液体を注射するマイクロインジ
ェクションの実験においては、核や精子のような小固体
と違って液の動きを顕微鏡で直接観察することができな
いから、液の動きを制御する別の工夫が必要である。マ
イクロインジェクションの実験では、細胞内に注入しよ
うとする液と細胞自体の入っている媒体（通常は培養
液）とは一般に異なるから、図７（ａ）および（ｂ）に
示すように、それらを別の容器Ｙ１およびＹ２に入れ、
倒立顕微鏡５のステージ５１の上に置く。容器Ｙ１中の
培養液６の中にはホールド用マイクロピペットＨに保持
された細胞Ｃ３を入れ、容器Ｙ２中のインジェクション
液７の中にはマイクロピペット１の先端部１２を入れ
る。インジェクション液７は毛管現象によってマイクロ
ピペット１の中に入ってくるが、空気Ａとの界面がテー
パ部１２ａの内径が大きい部分の所定位置に止まってい
るようにシリンジ２３Ｒを使って空気Ａの圧力を調節し
ておく。容器Ｙ１および容器Ｙ２の液面のレベル（高
さ）を等しくしておく。次に、図７（ｃ）に示すよう
に、マイクロピペット１の先端を容器Ｙ１の中でホール
ド用マイクロピペットＨに保持されている細胞Ｃ３のす
ぐ近くに持ってくる。以上の操作は倒立顕微鏡５で観察
しながら行う。容器Ｙ１と容器Ｙ２の位置やマイクロピ
ペット１の先端とテーパ部１２ａ内の界面の位置などは
顕微鏡的にはかなり離れているが、ステージ５１の十字
動つまみ５８やマニピュレータ３Ｒ，３Ｌを適当に使っ
て視野の中央に置いて容易に操作することができる。イ
ンジェクション液７が培養液６と混ざらないような場合
は、マイクロピペット１の先端のところでインジェクシ
ョン液７と培養液６との間に界面ができ、それを隔てて
圧力差が発生するため、空気Ａの圧力を調節して界面を
マイクロピペット１の先端で動かないようにするが、両
液とも水溶液の場合には一般に界面はできず、圧力差も
発生しないから両液の接触は先端部に限られている（た
だし、長時間のうちには両液は拡散によって、多少は混
じると考えられる）。また、マイクロピペット１の先端
を容器Ｙ２から容器Ｙ１中に移す際に先端の位置（レベ
ル）の変化のため、微量の液の混合が起こる可能性もあ
る。インジェクション液７に対する培養液６の混合を完
全に避けるには、マイクロピペット１の先端を培養液６
中に入れる直前に空気Ａの圧力をわずか（水柱１ｍｍ圧
程度）あげて、マイクロピペット１の先端が培養液６中
にある間、インジェクション液７を少量ずつ培養液６内
に放出する方法もある。液体をマイクロインジェクショ
ンするためのマイクロピペット１は核移植などのように
先端の太いものでなく、先端が細く鋭利なものが使用で
きるから、先端を細胞Ｃ３内に差し込んだだけで細胞膜
や細胞外被を破壊できる場合が多い。通常は、先端を細
胞Ｃ３内に差し込んだのち、空気Ａの圧力を上げればイ
ンジェクション液７は細胞Ｃ３内に注入される。マイク
ロピペット１の先端を細胞Ｃ３内に差し込んだだけでは
細胞膜や細胞外被が破壊されないような場合には核移植
の場合と同様な方法で細胞膜や細胞外被を破壊したのち
に空気Ａの圧力を上げてインジェクション液７を注入す
る。細胞Ｃ３内がその周りの培養液６中より圧力が高い
場合には、マイクロピペット１を細胞Ｃ３内に差し込む
と細胞質がマイクロピペット１の中に押し出されようと
する。この場合には、まず、空気Ａの圧力を調節して細
胞質がマイクロピペット１の方に流れないようにし、そ
の後でさらに圧力を加えてマイクロインジェクションす
る。このように、細胞Ｃ３内にマイクロインジェクショ
ンされるインジェクション液７の界面はテーパ部１２ａ
の内径が小さい部分の所定位置で止まるため、この界面
が止まったときにインジェクション液７の注入も終了す
る。

【００２１】前述の方法においては、図７（ｃ）に示す
ように、マイクロピペット１のテーパ部１２ａは水平に
なっているため、空気Ａの圧力と界面による吸引力が釣
り合っていて液の動きのない状態では、先端と界面の先
端側との圧力差（図４に示す圧力Ｐｉ）はゼロである。
したがって、このマイクロピペット１内でも前記（４）
式の関係（Ｐｍ＝２Ｔｃｏｓ（α＋θ）／Ｒ）が成り立
つことになる。このマイクロピペット１では、表面張力
Ｔおよび接触角αは一定と考えられるから、角度θが一
定ならば空気Ａの圧力Ｐｍは界面の半径Ｒに反比例す
る。図８（ａ）に示すように、マイクロピペット１の空
気Ａの圧力Ｐｍと毛管現象による吸引力とのバランスに
よって決まる界面の位置と１／Ｐｍの関係を調べた場
合、１／Ｐｍが軸に沿って直線的に変化する範囲があれ
ば半径Ｒもその範囲で直線的に変わっている。すなわ
ち、テーパが一定であることが分かる。このテーパが一
定の範囲内で圧力Ｐｍを変化させて界面の位置を動かし
た場合に、マイクロピペット１の先端を通って押し出さ
れるインジェクション液７の量は次のようにして求める
ことができる。界面が平面であると仮定すれば押し出さ
れるインジェクション液７の量は、図８（ｂ），（ｃ）
に示すように、切断直円錐の体積（π／３）（Ｒ₁ ³−Ｒ
₂ ³）（１／ｔａｎθ）に等しい。ここに、Ｒ₁およびＲ₂
はそれぞれ界面を動かす前、および動かした後のマイク
ロピペット１の内面の半径（内径）である。界面の動い
た距離Δｘは顕微鏡を通して測定できる。したがって、
ｔａｎθは（Ｒ₁−Ｒ₂）／Δｘとして求めることができ
る。界面の形は実際には平面ではなく、図８（ｂ），
（ｃ）に示すように、球面の一部と考えられるから、そ
のための補正を行えば界面の動きによって動いたインジ
ェクション液７の量Ｖは次式で求められる。Ｖ＝（π／３）（Ｒ₁ ³−Ｒ₂ ³）[（１／ｔａｎθ）−２＋３ｔａｎ（α＋θ）− １．５ｔａｎ²（α＋θ）＋０．５ｔａｎ³（α＋θ）] ・・・（５）

【００２２】マイクロピペット１が、液の中に入ってい
るときには、液とマイクロピペット１の外面の境界で光
が屈折するために、顕微鏡観察によってマイクロピペッ
ト１の内面の半径Ｒ₁，Ｒ₂や接触角αを測定するために
は特別の工夫が必要である。接触角αはマイクロピペッ
ト１の内面のガラスとそれに接している液の種類によっ
て決まるから、たとえばインジェクション液７とマイク
ロピペット１との接触角αを知るためには、次のような
方法によって知ることができる。図９に示すように、マ
イクロピペット１と同じ種類のガラスででき、一端を封
じた毛細管Ｇの中ほどにインジェクション液７を入れ、
空気相Ａ１を残したまま全体を屈折率がガラスと等しい
液Ｌ（たとえば、グリセロールと水とを混合して屈折率
をガラスのものと等しくした液）の中に入れる。顕微鏡
で観察すると液Ｌとガラスとの境界は全く見えず、図９
のように封じられた端の部分に残された空気相Ａ１と、
それに接して管内に入れたインジェクション液７とが見
える。毛細管壁と液Ｌとの境界での光の屈折がないか
ら、接触角αをそのまま観察測定できる。マイクロピペ
ット１の半径（内径）は顕微鏡観察によって測定する
が、外液とマイクロピペットの外面の境界で起こる光の
屈折を考慮する必要がある。その場合、顕微鏡で観察、
測定される見掛け上の値に一定の係数を掛けることによ
って算出する。その係数は、外液の屈折率、マイクロピ
ペット１のガラスの屈折率およびマイクロピペット１の
内径と外径の比によって決まるから、あらかじめマイク
ロピペット１の素材と同じガラスでできたガラス管でさ
まざまな内径と外径の比を持ったものを使ってそれぞれ
について外液の中につけたときの見掛け上の内径と外径
の比を調べておき、見掛けの内径から真の内径を求める
補正係数を決める。以上のような方法によって、インジ
ェクション液７の空気Ａとの界面の半径Ｒ ₁，Ｒ₂、接触
角α、およびテーパ角θ（または、ｔａｎθ）を求める
ことによって（５）式から空気Ａの圧力を変えた場合の
インジェクション液７の動いた量、すなわちマイクロピ
ペット１の先端から押し出される液量を求めることがで
きる。細胞Ｃ３内にインジェクションする場合には、マ
イクロピペット１の先端を細胞Ｃ３内に入れてから、ス
テージ５１の十字動つまみ５８を動かしてテーパ部１２
ａを倒立顕微鏡５の視野内に入れて、空気Ａの圧力をシ
リンジ２３Ｒによって変えて界面の半径をＲ₁からＲ₂ま
で（距離にしてΔｘだけ）動かせば量Ｖのインジェクシ
ョン液７がマイクロピペット１の先端から押し出され
る。なお、ｔａｎθ（すなわちテーパ）が一定の範囲で
はＲ₁，Ｒ₂を別の値にしても、押し出される液量を
（５）式を使って算出することができる。この方法で
は、細胞Ｃ３の位置がテーパ部１２ａの位置から離れて
いるので、細胞Ｃ３内にインジェクション液７が注入さ
れるのを直接顕微鏡で観察することができないが、次の
方法を使えばマイクロピペット１を差し込んだ細胞Ｃ３
を顕微鏡の視野内に入れたままインジェクションができ
る。すなわち、（４）式に示すように、空気Ａの圧力Ｐ
ｍによってバランスされている界面の半径Ｒは圧力Ｐｍ
に反比例する。したがって、半径Ｒ₁，Ｒ₂のうちの一方
が前記の方法で測定されているならば、他方は圧力比か
ら求めることができる。すなわち、Ｒ₂＝Ｒ₁（Ｐ₁／
Ｐ₂）、Ｒ₁＝Ｒ₂（Ｐ₂／Ｐ₁）である。ここに、Ｐ₁，Ｐ
₂はそれぞれ界面の半径がＲ₁およびＲ₂の位置で安定し
ているときの圧力である。以上のことから、細胞Ｃ３に
マイクロインジェクションするのに先立ってインジェク
ション液７の中に水平に置いたマイクロピペット１を使
って得られた結果から、空気Ａの圧力をＰ₁からＰ₂に変
えれば（５）式で示されたＶの量のインジェクション液
７が細胞Ｃ３内に注入される。次に、あらかじめ決めら
れた量のインジェクション液７をマイクロインジェクシ
ョンする簡単な方法について説明する。この方法は、圧
力計２６Ｒを見ながらシリンジ２３Ｒで調節するだけ
で、所定の液量Ｖａとなるインジェクション液７を細胞
内に注入させる方法であり、以下に、その原理について
説明する。前記で説明した操作によって、液量Ｖのイン
ジェクション液７をインジェクションすることが可能で
あることがマイクロピペット１をインジェクション液７
中に水平に置いた位置で確かめられた場合、所定の液量
Ｖａのインジェクション液７を注入するためには、同じ
マイクロピペット１の中でインジェクトする前の界面の
半径がＲ₁の（Ｖａ／Ｖ）^1/3倍になるように、インジェ
クションした後の界面の半径がＲ₂の（Ｖａ／Ｖ）^1/3倍
になるように設定すればよいことが（５）式からわか
る。半径Ｒ₁の位置に界面がある場合の空気Ａの圧力は
Ｐ₁であり、ＲはＰに反比例するから、半径Ｒ₁（Ｖａ／
Ｖ）^1/3の場合には、圧力はＰ₁／[（Ｖａ／Ｖ）^1/3]に
なる。同様にして、半径Ｒ₂（Ｖａ／Ｖ）^1/3の場合には
圧力はＰ₂／[（Ｖａ／Ｖ）^1/3]になる。すなわち、空気
Ａの圧力を圧力計２６を使ってインジェクションする前
に圧力をＰ₁（Ｖ／Ｖａ）^1/3に設定し、インジェクショ
ンした後には圧力をＰ₂（Ｖ／Ｖａ）^1/3に設定すればＶ
ａの液量が注入されることになる。また、界面の位置を
顕微鏡で観察しながら空気Ａの圧力をシリンジ２３Ｒで
調整することによってＶａの液をインジェクトする場合
には、次のような手順で行う。まず、ステージ５１の十
字動つまみ５８を使ってマイクロピペット１のテーパ部
１２ａを顕微鏡の視野内に移動させる。次に、シリンジ
２３Ｒによって空気Ａの圧力をＰ₁（Ｖ／Ｖａ）^1/3に設
定する。この操作によって界面の半径はＲ₁（Ｖａ／
Ｖ）^1/3になっている。空気Ａの圧力をＰ₂（Ｖ／Ｖａ）
^1/3に設定すればＶａの量の液がインジェクトされる。
界面の動きを顕微鏡で観察しながら空気Ａの圧力を上げ
て、界面をΔｘ（Ｖａ／Ｖ）^1/3だけ動かしても同じく
Ｖａ量の液がインジェクトされる。以上のように、マイ
クロピペット１は個々のものでテーパ角θや接触角αが
一定とみなすことのできる範囲を調べておけば、顕微鏡
による観察、測定、空気Ａの圧力の測定調節によってイ
ンジェクトする液の量を定量的に制御できる。

【００２３】以上は細胞Ｃ３内の圧力がゼロと仮定した
場合のことであるが、細胞Ｃ３内の圧力が培養液内の圧
力と異なる場合には細胞Ｃ３内にマイクロピペット１を
差し込んだ後に空気Ａの圧力を細胞Ｃ３内の圧力とバラ
ンスさせたのち、上記のようにして求めた圧力をさらに
加えれば（５）式で示されたＶの量の液が細胞Ｃ３内に
注入されるはずである。しかし、これはインジェクショ
ン液７を細胞Ｃ３内に注入しても細胞Ｃ３の内圧は変わ
らないと仮定したものである。細胞膜や細胞上被に弾性
があって細胞の体積が増加すると内圧が高くなるような
場合には細胞膜や細胞上被の弾性に関する情報が必要で
あり、圧力の大きさだけではインジェクトした量を求め
ることができない。一方、前記のようなマイクロピペッ
ト１のテーパ部１２ａにある界面の動きを直接顕微鏡で
観察測定しながら（５）式を使って注入量を決定する方
法を使えば、細胞膜や細胞上被の弾性値には無関係に細
胞内に入った液の量を求めることができる。

【００２４】以上により、本実施形態において、次のよ
うな効果を得ることができる。（i）精子Ｓをマイクロピペット内に吸引させる場合、
培養液６の界面は（４）式の関係がＰｍ＝２Ｔｃｏｓ
（α＋θ）／Ｒとなった位置で止まるので、マイクロピ
ペット１内に吸引した精子Ｓをマイクロピペット１内の
先端の所定位置に留めておくことができる。したがっ
て、培養液６の界面の位置を圧力で調節するだけで、マ
イクロピペット１内での精子Ｓの位置を調節することが
できる。（ii）精子Ｓを卵子Ｏ内に注入する場合、培養液６の界
面は（４）式の関係がＰｍ＝２Ｔｃｏｓ（α＋θ）／Ｒ
となった位置で止まるので、卵細胞Ｏ内に精子Ｓのみを
注入させることができる。（iii）マイクロピペット１内に細胞Ｃ１内の核Ｄを吸
引する場合、シリンジ２３Ｒによる圧力で移動する培養
液６の界面が所定位置で止まるので、この位置に対応し
た位置で核Ｄや細胞質も止まる。そのため、従来のよう
に核や細胞質を吸い込み続けることがなくなる。したが
って、培養液６の界面の位置を圧力で調節するだけで、
マイクロピペット１内での核Ｄなどの位置を調節するこ
とができる。（iv）細胞Ｃ２内に核Ｄを注入する場合、シリンジ２３
Ｒによる圧力で移動する培養液６の界面が所定位置で止
まる。したがって、マイクロピペット１内の核Ｄととも
に所定量の細胞質だけが細胞Ｃ２内に注入されるので、
従来のように不要な培養液が細胞内に注入され続けるこ
とがなくなる。（v）インジェクション液７の界面がテーパ部１２ａの
内径が小さい部分の所定位置で止まることで、インジェ
クション液７の注入も終了するため、所定量のインジェ
クション液７を細胞内に注入することができる。したが
って、インジェクション液７の界面の位置を圧力で調節
するだけで、細胞内に注入させるインジェクション液７
の量を調節することができる。（vi）所定量のインジェクション液７を細胞内に注入す
るには、あらかじめマイクロピペット１内の圧力をＰ₁
からＰ₂に変化させたときに排出する体積Ｖを算出して
おくことにより、圧力計２６Ｒを見ながらシリンジ２３
Ｒでマイクロピペット１内の圧力をＰ₁（Ｖ／Ｖａ）^1/3
からＰ₂（Ｖ／Ｖａ）^1/3に変化させるだけで、所定の体
積Ｖａとなるインジェクション液７を細胞内に注入させ
ることができる。したがって、作業者が圧力計２６Ｒを
見ながらシリンジ２３Ｒを操作するだけで、容易に所定
量のインジェクション液７を細胞内に注入させることが
できる。

【００２５】以上、本発明は、本実施形態に限定される
ことなく様々な形態で実施される。（I）本実施形態では圧力調節液として培養液またはイ
ンジェクション液を利用したが、本発明はこれに限定さ
れるものではない。たとえば、インジェクション液の後
側に接するように、このインジェクション液と混合しな
いパラフィン油を封入して、このパラフィン油を圧力調
節液として利用してもよい。この場合は、パラフィン油
と空気Ａとの界面の位置を圧力で調節するだけで、細胞
内に注入させるインジェクション液の量を調節すること
ができる。さらに、この場合は、インジェクション液と
パラフィン油との界面が位置する部分のテーパ形状が緩
やかであるため、この界面の面積と移動距離とを倒立顕
微鏡を通して測定すれば、注入したインジェクション液
の量を精密に知ることができる。また、インジェクショ
ン液とパラフィン油との界面の面積をあらかじめ測定し
ておけば、マイクロインジェクションを行うときに、倒
立顕微鏡でこの界面を観察しながら、その移動距離を測
定することにより、所定量のインジェクション液を注入
することができる。また、インジェクション液の後側に
接するようにパラフィン油を封入し、このパラフィン油
の後側に接するように水を封入して、この水を圧力調節
液として利用してもよい。この場合は、水の界面の位置
を圧力で調節するだけで、細胞内に注入させるインジェ
クション液の量を調節することができる。さらに、水と
インジェクション液との間に介在するパラフィン油の断
面積や移動距離を倒立顕微鏡を通して測定することによ
り、注入したインジェクション液の量を精密に知ること
ができる。また、マイクロピペット内に水、パラフィン
油およびインジェクション液といった三相の液体を封入
させることにより、水とインジェクション液との間に介
在するパラフィン油が目印の役割を果たす。そのため、
二相の液体の界面を観察することに比べて、著しく観察
が容易になる。さらに、パラフィン油を挟んで水とイン
ジェクション液が分離しているため、たとえば、水をさ
らに表面張力の高い別の液体にするなど、圧力調節液と
して利用する液体を自由に設定することができる。 (II)本実施形態ではシリンジから圧力を伝える媒体を空
気としたが、本発明はこれに限定されず、たとえば、媒
体が空気以外の気体であってもよい。 (III)本実施形態ではマイクロピペットの先端部を先細
りのテーパ形状としたが、本発明はこれに限定されず、
たとえば、先端部が円管状になっていてもよい。この場
合においても、その先端から後方に離れた所定位置のテ
ーパ部で細胞内に注入させるインジェクション液の量の
調節を行うことができる。さらに、マイクロピペットの
テーパ形状となる先端部の先端の内径を大きな径にして
も同様にテーパ部で注入および吸引の調節が行うことが
できるので、様々な細胞の核の大きさに対応させること
ができる。 (IV)また、テーパ部の先細り度の形状などは、適宜に変
更が可能であることは言うまでもない。たとえば、テー
パ部の傾斜を緩やかなものにすると、インジェクション
装置の圧力により細胞内に注入される液体の量が多くな
り、逆にテーパ部の傾斜を急なものにすると、この圧力
により細胞内に注入される液体の量が少なくなる。した
がって、このテーパ部の先細り度が異なるマイクロピペ
ットを選択するだけで、細胞内に液体を注入させる量や
細胞内の核などをマイクロピペット内に吸引させるため
にマイクロピペット内の液体を吸引する量を調節でき
る。また、テーパが一定でも、そのテーパ部内の界面の
位置を広い範囲で変えることができるので、細胞内に液
体を注入させる量などを広い範囲で調節することができ
る。 (V)また、本発明のマイクロピペットは、本実施形態で
示したような細胞から核を取り出す実験などに利用され
るだけでなく、たとえば、バイオプシー（生検）で組織
の中に埋もれている細胞や組織の一部を採取したり、細
胞膜や細胞外皮を破壊したりする実験などのいろいろな
実験に利用することができる。さらに、生命科学以外の
分野で、１マイクロリットルから１フェムトリットルオ
ーダーの微量の液体の注入や吸引にも利用することがで
きる。

【００２６】

【発明の効果】請求項１に記載の発明によれば、表面張
力と圧力差のバランスにより、マイクロピペットの圧力
調節部での圧力調節液の界面の位置が自由に調節できる
ので、細胞内にインジェクション液を注入する量や細胞
内の核などをマイクロピペット内に吸引させたときの位
置を調節できる。また、マイクロピペットの先端から後
方に離れた所定位置に圧力調節部が設けられるので、マ
イクロピペットの先端の太さを自由に設定することがで
きる。

【００２７】請求項２に記載の発明によれば、請求項１
に記載の発明による効果に加え、加圧手段の操作によ
り、細胞内にインジェクション液を注入する量や細胞内
の核などをマイクロピペット内に吸引させたときの位置
を調節できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明を適用したマイクロピペットを示した側
面図（ａ）と、図１（ａ）の破線で囲まれる部分の要部
拡大図（ｂ）である。

【図２】図１のマイクロピペットを使用する実験に必要
な各装置の全体を示した概略図（ａ）と、この各装置を
上から見た平面図（ｂ）である。

【図３】本発明のマイクロピペット内に精子を吸引する
前の状態を示した要部拡大図（ａ）と、マイクロピペッ
ト内に精子を吸引した状態を示した要部拡大図（ｂ）
と、マイクロピペットから精子を排出した状態を示した
要部拡大図（ｃ）である。

【図４】本発明のマイクロピペットで微量の液体や微小
固体を定量的に注入または吸引させる原理を示した要部
拡大図である。

【図５】マイクロピペット内に細胞内の核を吸引する前
の状態を示した要部拡大図（ａ）と、マイクロピペット
の先端を細胞内に押し込んだ状態を示した要部拡大図
（ｂ）と、マイクロピペットで細胞の核と細胞膜を吸引
した状態を示した要部拡大図（ｃ）と、マイクロピペッ
トで細胞膜を破るとともに細胞内の核などを吸引した状
態を示した要部拡大図（ｄ）である。

【図６】本発明のマイクロピペットの先端近傍で核を保
持しながら、その先端を細胞内に押し込んだ状態を示し
た要部拡大図（ａ）と、マイクロピペットで細胞の細胞
膜を破った状態を示した要部拡大図（ｂ）と、マイクロ
ピペット内から核などを細胞内に注入する過程を示した
要部拡大図（ｃ）と、細胞内に核などを注入する作業が
完了した状態を示した要部拡大図（ｄ）である。

【図７】マイクロインジェクションの実験における倒立
顕微鏡のステージ上の培養液を入れる容器を示した平面
図（ａ）と、インジェクション液を入れる容器を示した
平面図（ｂ）と、細胞が入った培養液中にマイクロピペ
ットを入れた状態を示した断面図（ｃ）である。

【図８】圧力の逆数と位置の関係を示した図（ａ）と、
マイクロインジェクション前後の界面の状態を示した断
面図（ｂ）と、断面図（ｂ）の要部拡大図（ｃ）であ
る。

【図９】接触角を測定する方法を示した平面図である。

【符号の説明】

１マイクロピペット１１基部１２先端部１２ａテーパ部（圧力調節部）２Ｌ，２Ｒインジェクション装置２１Ｌ，２１Ｒインジェクションホルダ２２Ｌ，２２Ｒチューブ（連結手段）２３Ｌ，２３Ｒシリンジ（加圧手段）３Ｌ，３Ｒマニピュレータ５倒立顕微鏡６培養液（圧力調節液）７インジェクション液（圧力調
節液）Ａ空気Ａ１空気相Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３細胞Ｓ精子（微小固体）Ｄ核（微小固体）Ｏ卵子Ｙ，Ｙ１，Ｙ２，Ｙ３容器Ｇ毛細管

【手続補正書】

【提出日】平成１４年１０月３日（２００２．１０．
３）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２２】インジェクション液７の空気Ａとの界面の
半径Ｒ₁，Ｒ₂、接触角α、およびテーパ角θ（または、
ｔａｎθ）を求めることによって（５）式から空気Ａの
圧力を変えた場合のインジェクション液７の動いた量、
すなわちマイクロピペット１の先端から押し出される液
量を求めることができる。細胞Ｃ３内にインジェクショ
ンする場合には、マイクロピペット１の先端を細胞Ｃ３
内に入れてから、ステージ５１の十字動つまみ５８を動
かしてテーパ部１２ａを倒立顕微鏡５の視野内に入れ
て、空気Ａの圧力をシリンジ２３Ｒによって変えて界面
の半径をＲ₁からＲ₂まで（距離にしてΔｘだけ）動かせ
ば量Ｖのインジェクション液７がマイクロピペット１の
先端から押し出される。なお、ｔａｎθ（すなわちテー
パ）が一定の範囲ではＲ₁，Ｒ₂を別の値にしても、押し
出される液量を（５）式を使って算出することができ
る。この方法では、細胞Ｃ３の位置がテーパ部１２ａの
位置から離れているので、細胞Ｃ３内にインジェクショ
ン液７が注入されるのを直接顕微鏡で観察することがで
きないが、次の方法を使えばマイクロピペット１を差し
込んだ細胞Ｃ３を顕微鏡の視野内に入れたままインジェ
クションができる。すなわち、（４）式に示すように、
空気Ａの圧力Ｐｍによってバランスされている界面の半
径Ｒは圧力Ｐｍに反比例する。したがって、半径Ｒ₁，
Ｒ₂のうちの一方が前記の方法で測定されているなら
ば、他方は圧力比から求めることができる。すなわち、
Ｒ₂＝Ｒ₁（Ｐ₁／Ｐ₂）、Ｒ₁＝Ｒ₂（Ｐ₂／Ｐ₁）である。
ここに、Ｐ₁，Ｐ₂はそれぞれ界面の半径がＲ₁およびＲ₂
の位置で安定しているときの圧力である。以上のことか
ら、細胞Ｃ３にマイクロインジェクションするのに先立
ってインジェクション液７の中に水平に置いたマイクロ
ピペット１を使って得られた結果から、空気Ａの圧力を
Ｐ₁からＰ₂に変えれば（５）式で示されたＶの量のイン
ジェクション液７が細胞Ｃ３内に注入される。次に、あ
らかじめ決められた量のインジェクション液７をマイク
ロインジェクションする簡単な方法について説明する。
この方法は、圧力計２６Ｒを見ながらシリンジ２３Ｒで
調節するだけで、所定の液量Ｖａとなるインジェクショ
ン液７を細胞内に注入させる方法であり、以下に、その
原理について説明する。前記で説明した操作によって、
液量Ｖのインジェクション液７をインジェクションする
ことが可能であることがマイクロピペット１をインジェ
クション液７中に水平に置いた位置で確かめられた場
合、所定の液量Ｖａのインジェクション液７を注入する
ためには、同じマイクロピペット１の中でインジェクト
する前の界面の半径がＲ₁の（Ｖａ／Ｖ）^1/3倍になるよ
うに、インジェクションした後の界面の半径がＲ₂の
（Ｖａ／Ｖ）^1/3倍になるように設定すればよいことが
（５）式からわかる。半径Ｒ₁の位置に界面がある場合
の空気Ａの圧力はＰ₁であり、ＲはＰに反比例するか
ら、半径Ｒ₁（Ｖａ／Ｖ）^1/3の場合には、圧力はＰ₁／
[（Ｖａ／Ｖ）^1/3]になる。同様にして、半径Ｒ₂（Ｖａ
／Ｖ）^1/3の場合には圧力はＰ₂／[（Ｖａ／Ｖ）^1/3]に
なる。すなわち、空気Ａの圧力を圧力計２６を使ってイ
ンジェクションする前に圧力をＰ₁（Ｖ／Ｖａ）^1/3に設
定し、インジェクションした後には圧力をＰ₂（Ｖ／Ｖ
ａ）^1/3に設定すればＶａの液量が注入されることにな
る。また、界面の位置を顕微鏡で観察しながら空気Ａの
圧力をシリンジ２３Ｒで調整することによってＶａの液
をインジェクトする場合には、次のような手順で行う。
まず、ステージ５１の十字動つまみ５８を使ってマイク
ロピペット１のテーパ部１２ａを顕微鏡の視野内に移動
させる。次に、シリンジ２３Ｒによって空気Ａの圧力を
Ｐ₁（Ｖ／Ｖａ）^1/3に設定する。この操作によって界面
の半径はＲ₁（Ｖａ／Ｖ）^1/3になっている。空気Ａの圧
力をＰ₂（Ｖ／Ｖａ）^1/3に設定すればＶａの量の液がイ
ンジェクトされる。界面の動きを顕微鏡で観察しながら
空気Ａの圧力を上げて、界面をΔｘ（Ｖａ／Ｖ）^1/3だ
け動かしても同じくＶａ量の液がインジェクトされる。
以上のように、マイクロピペット１は個々のものでテー
パ角θや接触角αが一定とみなすことのできる範囲を調
べておけば、顕微鏡による観察、測定、空気Ａの圧力の
測定調節によってインジェクトする液の量を定量的に制
御できる。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図９

【補正方法】削除

【手続補正３】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図９

【補正方法】削除

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】微量の液体や微小固体を注入または吸引
するためのマイクロピペットであって、マイクロピペットの先端から後方に離れた所定位置に、
圧力調節液が入り、かつ、後方に行くにしたがって拡幅
するテーパを有する圧力調節部が設けられ、この圧力調節部に接触する前記圧力調節液の界面の面積
が増減することにより、微量の液体や微小固体の注入ま
たは吸引を調節することを特徴とするマイクロピペッ
ト。
【請求項２】マイクロピペット内の圧力を連結手段を
介して加圧手段で調節することにより微量の液体や微小
固体を注入または吸引させるインジェクション装置であ
って、前記マイクロピペットとして請求項１に記載のマイクロ
ピペットを使用したことを特徴とするインジェクション
装置。
【請求項３】請求項１に記載のマイクロピペットを用
いて微量の液体や微小固体を注入または吸引するマイク
ロインジェクションの方法であって、前記マイクロピペットの基部側の圧力を変化させて前記
圧力調節部のテーパの範囲内において前記圧力調節液の
界面を移動させることにより、この移動する界面が前記
圧力と毛管現象による吸引力とが釣り合った位置で停止
して、微量の液体や微小固体が所定量だけ注入または吸
引されることを特徴とするマイクロインジェクションの
方法。