CN112080387B - 一种基于细胞核位置动态漂移建模的细胞核操作方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于细胞核位置动态漂移建模的细胞核操作方法，包括以下步骤：离线标定细胞核相对于极体的三维分布；通过三维有限元建模获得细胞核相对于微针位置的动态漂移轨迹；利用因析设计法确定细胞核位置动态漂移的主导影响因素；对微针胞内移动参数与细胞核位置动态漂移轨迹参数的关系进行拟合，确定接近细胞核所需的微针轨迹，由控制器控制微针沿确定的轨迹在胞内移动并接近细胞核并完成相应操作。利用本发明所述的细胞核操作方法，进行去核操作，可自动控制胞内运动轨迹及胞质去除量。相较人工去核操作，相同去核成功率下胞质去除量减少60％，家猪克隆胚胎卵裂率提升近一倍。

Description

一种基于细胞核位置动态漂移建模的细胞核操作方法
技术领域
本发明属于细胞级别的显微操作领域，具体涉及一种基于细胞核位置动态漂移建模的细胞核操作方法。
背景技术
卵母细胞核操作被广泛应用于动物克隆和核转基因注射等操作中。进行卵母细胞核操作的前提为：将操作工具如微针移动到细胞核附近适合操作细胞核的位置，再进行后续操作。然而这一任务由于卵母细胞核一般不可见，并且微针在细胞内移动会造成细胞变形引起细胞核位置动态漂移而难以完成。
通过细胞核染色的方法对细胞核进行操作，虽然可以使细胞核可见，但是以此进行细胞核定位和微针的运动控制，由于荧光场下带来的光漂白，不仅会损害细胞活性，而且存在微针无法定位的问题，继而严重限制了荧光染色技术在细胞核操作中的应用。因此，确定一个不需要对细胞核染色，即可完成估计卵母细胞核位置及微针操作时细胞核动态漂移过程，进而确定微针在细胞内的运动轨迹并移动到细胞核附近适合位置对细胞核进行操作的方法十分有必要。
发明内容
本发明针对现有细胞核操作方法中存在的难以控制微针移动至细胞核附近适宜位置对细胞核进行操作的问题，提出了一种基于细胞核位置动态漂移建模的细胞核操作方法，该方法利用离线标定的方式确定细胞核相对极体的三维分布范围，来估计细胞核的初始位置范围，通过三维有限元建模与因析设计获得细胞核位置动态漂移轨迹及其主导影响因素，拟合微针胞内移动轨迹参数与细胞核位置动态漂移轨迹参数的曲线关系，确定移动微针至细胞核附近适宜位置操作细胞核所需要的微针轨迹，最后对胞内微针进行运动控制使其沿设定轨迹运动到既定位置完成细胞核操作。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种基于细胞核位置动态漂移建模的细胞核操作方法，该方法包括以下步骤：
S1，在离线条件下对荧光染色细胞核进行三维定位，并与在明场下确定的极体三维位置进行对比，确定细胞核相对于极体的三维分布；
具体地，在进行极体定位之前，对胞质进行轮廓检测，并计算轮廓区域的聚焦测度F，公式如下：
Figure GDA0002741945220000021
其中，μ为胞质轮廓区域的平均灰度值，N为胞质轮廓区域的像素数量，I(x,y)为坐标(x,y)处像素的灰度值，焦平面的高度由聚焦测度的极大值确定；通过细胞拨动将极体从不可见的初始位置转动到焦平面上来，拨动过程中通过极体轮廓检测算法获得极体的轮廓，极体轮廓面积取得极大值时认为极体已经移动到焦平面上，此时极体的轮廓中心被定义为极体在水平方向的位置，焦平面的高度为极体在深度方向上的位置。
细胞核三维位置在荧光场下进行定位，细胞核的深度位置通过细胞核自动聚焦方法确定，聚焦过程中实时计算荧光场中细胞核轮廓面积，在聚焦状态下由于离焦导致的轮廓虚影最小，轮廓面积的极小值用来确定细胞核的深度位置，细胞核的水平位置由聚焦时细胞核轮廓中心点的坐标确定。
最后，根据测得的细胞核与极体的三维位置获得细胞核相对极体的三维分布。细胞核相对极体的三维分布范围以通过覆盖分布区域90％以上的采样点的外接椭球边界确定；由于极体在焦平面上，细胞核相对于极体分布在Y方向和Z方向是对称的，因此用细胞核中心到细胞中心-极体中心的连线的距离作为除了X方向之外的细胞核相对于极体分布的另一个变量，将细胞核关于极体的分布转化为二维分布，从而用曲面拟合获得其概率分布函数。
S2，通过三维有限元建模获得微针在细胞内的移动时，由细胞形变导致的细胞核相对于微针位置的动态漂移轨迹(以下简称：细胞核位置动态漂移)；
具体地，完整的细胞核膜在减数第二次分裂间期已经解体，细胞内不存在完整的细胞核，染色体散步在细胞质之中，细胞核被建模为与胞质机械特性完全相同，各向同性的线性弹性体；透明带建模为比胞质更硬的各项同性线性弹性体；卵周隙被建模为弓形的区域，其大小由对应的圆心角决定；极体被建模为卵周隙内球形物体中心；玻璃的刚度较细胞质大7个数量级以上，微针被建模为刚性体，微针开口为45°便于刺入细胞；注射针从3点钟方向刺入细胞，并沿X轴后退使针口停在原细胞膜所在的位置，之后开始在细胞内的移动；在移动过程中细胞与注射针以及吸持针之间均认为不存在打滑现象；根据产生的细胞变形与设定的微针轨迹获得细胞核中心相对于微针针口的动态漂移轨迹。
S3，利用二值因析设计法确定微针在细胞内移动时，影响细胞核位置动态漂移轨迹的主导因素。
具体地，微针在细胞内的移动产生的细胞变形及细胞核位置动态漂移受到细胞弹性参数，细胞几何参数，微针几何参数和运动参数的影响，以及细胞位置的影响。其中，本发明考察的细胞弹性参数为透明带与胞质的杨氏模量之比；细胞的几何参数包括两个：透明带厚度与胞质半径之比以及卵周隙的尺寸；微针的几何参数为微针直径；微针的运动参数为微针移动距离与移动方向，以上参数均选用其上限和下限作为参数+值和－值，当参数由+转－时以细胞核位置动态漂移轨迹长度和方向的变化量用来考察各个因素对细胞核位置动态漂移的影响。
本发明考察的细胞核位置为细胞核相对极体位置，通过细胞核相对极体分布的三维分布椭球的六个顶点和中心点处细胞核位置动态漂移轨迹的长度和方向判断，细胞核分布位置对细胞核位置动态漂移的影响。通过对比各个参数的对细胞核位置动态漂移轨迹的主影响的大小，以此决定哪些参数是细胞核位置动态漂移轨迹的主导影响因素。
S4，拟合微针胞内轨迹参数与细胞核位置动态漂移轨迹参数的关系曲线。
具体地，根据步骤S3确定的主导影响因素，对细胞核相对极体分布椭球的6个顶点和中心点处细胞核位置动态漂移轨迹参数与微针胞内轨迹参数进行曲线拟合，其余分布区域内点的细胞核位置动态漂移轨迹参数与微针胞内移动参数的关系曲线由以上7个点结果线性插值获得。
S5，确定对细胞核进行操作时，接近细胞核的微针胞内运动轨迹。
具体地，根据细胞核操作的具体需求设定操作前对微针与细胞核相对位置相关变量期望，例如：距离的期望。系统首先建立该变量与细胞核相对微针三维位置的函数，利用步骤S1和步骤S4中确定的细胞核三维分布椭球与微针运动参数与细胞核位置动态漂移轨迹参数的关系曲线，计算出任何微针胞内运动轨迹下细胞核分布椭球每个点新的位置与相应的函数期望；通过遍历微针运动轨迹，寻找满足该期望的接近细胞核的微针运动轨迹。
S6，控制器控制微针沿设定的胞内运动轨迹接近细胞核并完成细胞核操作。
具体地，利用PID控制器对微针胞内运动进行控制。PID控制器根据步骤S5中确定的微针运动轨迹，并按照实际检测微针位置与设定位置的差值对微针运动进行修正，使之沿设定轨迹运动接近细胞核；其中，所述微针的实际位置由微针内气液交界面顶点确定。
进一步地，在步骤S6中所述的细胞核操作为细胞去核操作，当微针由PID控制器控制沿设定轨迹运动至接近细胞核之后，通过在微针内施加负压定量抽取胞质进行去核操作。
本发明同现有技术相比具有以下优点及效果：
1、本发明在进行细胞核操作时无需再对细胞核进行染色，也无需确定每一个卵母细胞核的确切位置，根据细胞核与极体的三维分布范围，通过有限元建模分析获得细胞核位置动态漂移轨迹与微针移动轨迹的关系，即可将微针移动到适合操作卵母细胞核的位置，这就避免了荧光染色带来的光漂白和黑暗的荧光场对微针运动控制和胞质去除量控制带来的困难。
2、本发明确定的细胞核分布区域和微针胞内运动轨迹可适用于尺寸不同的卵母细胞；本发明可以根据对卵母细胞核的不同操作要求离线确定相应的微针胞内运动轨迹，无需依赖操作者经验。
3、本发明对实验设备要求简单，使用常规微针即可对细胞核进行操作，无需人工介入不影响后续对细胞的操作。
4、相较人工去核操作，使用本发明获得轨迹控制微针接近家猪卵母细胞核进行去核操作，相同去核成功率下胞质去除量减少60％，家猪克隆胚胎卵裂率提升近一倍。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明所述基于细胞核位置动态漂移建模的细胞核操作方法的流程图。
图2为本发明实施例建立的坐标系图。
图3为本发所述细胞核相对极体三维分布标定示意图及获得的细胞核相对极体的三维分布图。
图4为本发明有限元建模微针胞内运动示意图。
图5为本发明二值因析设计法中细胞核位置动态漂移轨迹图；
图6为本发明拟合微针胞内轨迹参数与细胞核位置动态漂移轨迹参数的关系曲线。
图7、图8为本发明细胞去核操作过程及结果示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
实施例1：如图1的流程框图所示，一种基于细胞核位置动态漂移建模的细胞核操作方法，该方法包括以下步骤：
S1，在离线条件下对荧光染色细胞核进行三维定位，并与在明场下确定的极体三维位置进行对比，确定细胞核相对于极体的三维分布；
S2，通过三维有限元建模获得微针在细胞内的移动时，由细胞形变导致的细胞核相对于微针位置的动态漂移轨迹；
S3，利用二值因析设计法确定微针在细胞内移动时，影响细胞核位置动态漂移轨迹的主导因素；
S4，拟合微针胞内轨迹参数与细胞核位置动态漂移轨迹参数的关系曲线；
S5，确定对细胞核进行操作时，接近细胞核的微针胞内运动轨迹；
S6，控制器控制微针沿设定的胞内运动轨迹接近细胞核并完成细胞核操作。
在本实施例1中，所用细胞为家猪卵母细胞。对于需要染色的卵母细胞，将待测的各试验组MII期卵母细胞移入含5μg/ml Hoechst33342的TCM199中孵育15min完成细胞核与极体染色。
如图2所示，在本实施例1中，首先需要建立坐标系用于确定细胞核相对于极体的三维分布和细胞核相对于微针的位置动态漂移。
世界坐标系OWXWYWZW：中心OW为摄像机中心，ZW与光轴重合，XW和YW分别平行于微动平台的X和Y运动；
图像坐标系OPXPYP：OP定义为图像的左上角，XP和YP分别平行于图像的上边缘和左边缘。
细胞坐标系OCXCYCZC：OC为胞质中心，XC和YC分别与XW和YW平行；ZC垂直于XCYC平面。细胞坐标系和图像坐标系的关系如下式确定.
Figure GDA0002741945220000061
其中，T为标定的做换矩阵,(xC,yC)为图像坐标系中的细胞中心,fx和fy为显微分辨率。
极体坐标系OPBXPBYPBZPB:OPB为焦平面的中心；XPB轴与OC和OPB的连线重合，YPB在焦平面内与XPB垂直,ZPB垂直于焦平面，OPBXPBYPBZPB和OCXCYCZC满足如下的几何关系
Figure GDA0002741945220000062
其中，θ为XC与XPB的夹角,(xPBC,yPBC,zPBC)为极体在图像坐标系中的坐标。
微针坐标系OIXIYIZI：OI为微针坐标系斜口中心，XI为微针轴心，YI在焦平面内垂直于XI,ZI垂直于焦平面，OIXIYIZI和OCXCYCZC的关系如下
Figure GDA0002741945220000063
其中，(xIC,yIC,zIC)为微针中心在细胞坐标系中的位置。综合(2)与(3),OIXIYIZI和OPBXPBYPBZPB满足如下关系
Figure GDA0002741945220000064
如图3所示，本实施例1步骤S1中，离线标定细胞核相对于极体的三维分布的具体过程如下：
本实施例中使用OTSU二值化方法获得胞质的轮廓，通过Hough圆检测确定胞质区域，如图3(a)绿色圆圈区域所示。通过自动聚焦确定焦平面，胞质聚焦状态如图3(a)所示。本实施例通过细胞拨动将极体移动焦平面上，极体处于焦平面上的极体定位结果如图3(a)所示。共100个MII卵母细胞的细胞核通过自动聚焦方式获得三维位置，当通过轮廓检测获得的细胞核轮廓(如图3(b)所示)面积取得极小值时(如图3(c)所示)认为细胞核处于聚焦状态并确定细胞核的深度信息。聚焦状态下的细胞核轮廓的中心作为细胞核的水平位置。最终获得的细胞核相对于极体的分布范围如图3(d)所示。为了排除细胞尺寸对分布的影响，实施例中的分布对胞质半径做了归一化处理。本实施例中，93％的细胞核中心分布在由
Figure GDA0002741945220000071
规定的椭球体内(如图3(c))。考虑yPB和zPB关于XPB轴中心对称，因此取细胞核到XPB轴的距离dN＝(y2 PB+z2 PB)1/2与xPB一起作为评价细胞核相对于极体三维分布的两个变量，通过四次曲面拟合获得其概率密度函数
f(xPB,dN)＝p00+p10xPB+p01dN+p20xPB 2+p11xPBdN+p02dN 2+p30xPB 3+p21xPB 2dN+p12xPBdN 2+p03dN 3+p40xPB 4+p31xPB 3dN+p22xPB 2dN 2+p13xPBdN 3+p04dN 4 (6)
其中，p00＝29.27,p10＝720.5,p01＝3.158,p20＝6458,p11＝48.95,p02＝233.5,p30＝24870,p21＝237.4,p12＝3050,p03＝-10.49,p40＝34840,p31＝375.2,p22＝8577,p13＝-93.13,p04＝1150。
如图4所示，在本实施例所述步骤S2中，通过三维有限元建模模拟微针在细胞内运动时细胞核位置动态漂移轨迹具体方法如下：
本实施例中细胞核被建模为与胞质机械特性完全相同，各向同性的线性弹性体；透明带建模为比胞质更硬的各项同性线性弹性体；卵周隙被建模为弓形的区域，其大小由对应的圆心角αPE决定；极体被建模为卵周隙内球形物体中心；注射针被建模为刚体，注射针开口为45°便于刺入细胞；如图4(a)所示，注射针从3点钟方向刺入细胞，并沿X轴后退使针口停在原细胞膜所在的位置；之后沿直线轨迹在细胞内的移动；在移动过程中细胞与注射针以及吸持针之间均认为不存在打滑现象；根据产生的细胞变形与设定的注射针轨迹获得细胞核中心相对于微针针口的动态漂移轨迹，其中焦平面上的细胞变形如图4(b)所示。
如图5所示，在本实施例所述步骤S3中，利用二值因析设计法确定细胞核位置动态漂移轨迹的主导影响因素的具体分析过程如下：
主要考量参数为透明带与胞质的杨氏模量之比EZP/EC；胞质半径与透明带厚度之比RC/h；为卵周隙对应的圆心角αPE，微针的直径d，微针的移动角度定义为微针轨迹与XI的夹角αIM和移动距离dIM。以上参数二值设置如表I所示。
表1二值因析设计中的参数设置
Figure GDA0002741945220000081
根据以上参数设置获得的细胞核分布椭球中心P0位置动态漂移轨迹如图5(a)所示。图中结果表明，当微针在胞内沿直线运动时，产生的细胞核动态漂移轨迹也是直线(R2>0.98)，可以由轨迹的长度dNI和轨迹与XI轴所成的角αNI确定。利用显著性分析获得以上六个参数对αNI和dNI的主影响和交叉影响，其中主影响，即只改变单一参数时产生的影响，如表2所示，从中看出αNI的主导影响因素为αIM其余参数对它的影响均较之小一个数量级，相比之下其影响可以忽略。对于dNI主导影响因素为αIM和dIM其余参数对它的影响较之明显偏小可以忽略。
表2不同参数对αNI和dNI主影响汇总
影响因素 E<sub>ZP</sub>/E<sub>C</sub> R<sub>C</sub>/h α<sub>PE</sub> d α<sub>IM</sub> d<sub>IM</sub>
α<sub>NI</sub> -3.72 -1.86 0.12 -2.52 53.72 0.07
d<sub>NI</sub>(R<sub>C</sub>) -0.01 0.01 0.03 -0.03 -0.30 0.14
此外，细胞核分布椭球上的六个顶点P1-P6和分布椭球的中心P0在相同微针胞内移动轨迹αIM＝70°和dIM＝RC下的位置动态漂移轨迹如图5(b)所示。其中P5和P6关于焦平面对称，细胞三维有限元模型也关于焦平面对称，注射针的运动轨迹也在焦平面内，因此，P5和P6的位置动态漂移轨迹必然关于焦平面对称，因此二者之中只有P5进行了测试。图5(b)中的轨迹基本平行于焦平面，与焦平面的夹角小于2°，也可以用αNI和dNI唯一确定。六个点的αNI和dNI值如表III所示。表中数据表明不同点处的αNI和dNI变化显著，说明细胞核的位置也是其动态漂移轨迹的主导影响因素。
表3细胞分布椭球内边界点和中间点处对应的细胞核位置动态偏移轨迹参数
细胞核位置 P<sub>0</sub> P<sub>1</sub> P<sub>2</sub> P<sub>3</sub> P<sub>4</sub> P<sub>5</sub>
α<sub>NI</sub>(°) 30.85 23.93 36.30 32.78 29.61 31.38
d<sub>NI</sub>(R<sub>C</sub>) 0.15 0.015 0.16 0.11 0.18 0.15
如图6所示，本实施例步骤S4中，微针胞内轨迹参数与细胞核位置动态漂移轨迹参数的关系曲线拟合方法如下：
(1)细胞核位置动态漂移轨迹方向角αNI的主导影响因素为微针胞内轨迹方向角αIM，用反正切函数：
αNI＝a1*atan(a2*αIM+a3)+a4 (7)
拟合二者的关系(R2>0.99)，如图6(a)所示。表4中汇总了P0-P5对应式(6)的参数
表4 P0-P5处拟合αNI与αIM的关系函数相关参数汇总
参数 P<sub>0</sub> P<sub>1</sub> P<sub>2</sub> P<sub>3</sub> P<sub>4</sub> P<sub>5</sub>
a1 60.00362 59.052287 61.426672 59.11255946 60.7291 60.2683
a2 0.0958453 0.1314132 0.0707767 0.128217266 0.08124 0.0895
a3 -10.11246 -13.60049 -7.6116136 -13.2882515 -8.7356 -9.4709
a4 72.705196 77.036794 70.109819 68.37221238 74.9858 72.8599
(2)细胞核位置动态漂移轨迹长度dNI与微针胞内轨迹长度dIM成正比(R2>0.99)，(如图6(b)所示)二者比值dR＝dNI/dIM与αIM的关系曲线通过正弦函数
dR＝a1*sin(b1*αIM+c1)+a2*sin(b2*αIM+c2)+a3*sin(b3*αIM+c3)+a4*sin(b4*αIM+c4)(8)拟合获得(R2>0.95)。表5中汇总了P0-P5处对应式(8)的参数。
表5 P0-P5处拟合dR与αIM的关系函数相关参数汇总
parameter P<sub>0</sub> P<sub>1</sub> P<sub>2</sub> P<sub>3</sub> P<sub>4</sub> P<sub>5</sub>
a1 0.4588 0.4573 0.5569 0.3541 0.6244 0.6015
b1 0.01605 0.01545 0.02032 0.01522 0.01751 0.01908
c1 0.02347 0.7056 -0.3163 0.7072 -0.2889 -0.4196
a2 0.3365 0.2817 0.4116 0.2129 0.4833 0.4851
b2 0.03544 0.03989 0.0356 0.03827 0.03345 0.03328
c2 1.086 1.483 1.165 1.556 1.131 1.212
a3 0.02634 0.1077 0.02498 0.07021 0.02378 0.02132
b3 0.09365 0.06315 0.08856 0.06558 0.103 0.1054
c3 0.9375 3.751 0.9856 3.592 -0.1278 -0.2167
a4 0.004749 0.01138 -0.001826 0.008251 -0.004 0.00379
b4 0.1648 0.1468 0.1564 0.15 0.1797 0.1841
c4 0.09398 2.467 -2.312 2.109 1.201 -2.077
进一步地，在本实施例步骤S5中，确定卵母细胞核操作所需要的接近细胞核的微针胞内运动轨迹的具体算法如下：
微针在胞内运动之前，在极体坐标系OPBXPBYPBZPB中细胞中心坐标为(xPB,yPB,zPB)的细胞核在微针坐标系OI-XIYIZI中的初始位置如下：
Figure GDA0002741945220000101
当微针沿胞内直线轨迹(dIM,αIM)移动之后细胞核在微针坐标系中的新位置(xI,yI,zI)由下下式确定。
Figure GDA0002741945220000102
根据细胞核操作要求确立对微针与细胞核相对位置的需求函数fd(xI,yI,zI)，例如：在去核操作中操作者希望细胞核离注射针的钝角顶点近一些，以使得细胞核更容易被吸入针管，此时
fd(xI,yI,zI)＝((xI-d/2)2+(yI-d/2)2+z2 I)1/2 (11)
将式(10)带入可得
Figure GDA0002741945220000111
此时该需求函数的数学期望为
Figure GDA0002741945220000112
其中，f(xI0,yI0,zI0)是细胞核在分布椭球中的概率密度函数，由式(6)通过蒙特卡洛法采样近似求取。通过遍历(αIM,dIM)确定特定期望值对应的接近细胞核的微针胞内运动轨迹。
进一步地，本实施例步骤S6中，利用PID控制器对微针胞内运动进行控制。PID控制器根据步骤S5中确定的微针运动轨迹，并按照实际检测微针位置与设定位置的差值对微针运动进行修正，使之沿设定轨迹运动接近细胞核。在这一过程中微针针尖的位置由与微针基本保持恒定相对位置的微针内气液交界面来确定，PID控制器按照控制律：
Figure GDA0002741945220000113
调整微针的运动速度，使之沿设定轨迹运动接近细胞核，其中VIn为输出微针速度，V’In为设定微针速度，PIn为检测到的实际微针位置，P’In为设定微针位置。
进一步地，如图7、8所示，利用上述方法进行细胞去核操作时，以分布椭球不碰到微针且距离钝角针口距离最短的(αIM,dIM)＝(110°,1.2*RC)为微针运动轨迹，细胞核分布椭球产生的位置动态漂移轨迹如图7(a)所示。
基于该微针胞内运动轨迹获得的针对去核操作的微针运动轨迹如图7(b)所示，该轨迹共分为刺入段，返回段，接近段和撤出段共四部分。其中刺入段注射针从三点钟方向刺入细胞；返回段注射针沿XC方向撤回，使针口移动到原细胞膜所在的位置；接近段注射针沿本实施例得到的轨迹接近细胞核分布椭球，在胞质抽取完成后沿XC方向撤回细胞。
当微针由PID控制器控制沿设定轨迹运动至接近细胞核之后，通过在微针内施加负压定量抽取胞质进行去核操作。如图8所示，通过荧光下检测染色细胞核是否存在，如不存在则去核成功。按照本发明的方法对60个卵母细胞去核进行去核，结果显示：只需要去除8％左右的细胞质去核成功率可达95％(57/60)以上；而手动盲吸法即微针刺入细胞后不接近细胞核直接抽取胞质，发现要达到93％(56/60)以上的去核率就需要去除的胞质量要达到20％以上，使用本发明的方法进行去核操作可以减少60％以上的胞质去除量，对所有120个卵母细胞注入供体细胞形成克隆胚胎，后续胚胎培养结果表明，使用本发明方法获得的克隆胚胎卵裂率为85％(51/60)是人工方法获得的胚胎卵裂率43％(26/60)的近两倍。
此外，需要说明的是，本说明书中所描述的具体实施例，其零、部件的形状、所取名称等可以不同。凡依本发明专利构思所述的构造、特征及原理所做的等效或简单变化，均包括于本发明专利的保护范围内。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种基于细胞核位置动态漂移建模的细胞核操作方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1，在离线条件下对荧光染色细胞核进行三维定位，并与在明场下确定的极体三维位置进行对比，确定细胞核相对于极体的三维分布，具体为：
对极体的三维位置进行确定时：以极体移动到焦平面上，焦平面的高度为极体在深度方向上的位置，极体的轮廓中心为极体在水平方向的位置，所述极体的轮廓由极体轮廓检测算法获得；细胞核的三维位置由细胞核自动聚焦方法确定，在聚焦过程中实时计算荧光场中细胞核轮廓面积，以轮廓面积的极小值来确定细胞核的深度位置，细胞核的水平位置由聚焦时细胞核轮廓中心点的坐标确定；细胞核相对极体的三维分布通过高次曲面拟合确定，分布范围通过覆盖分布区域90％以上的采样点的外接椭球边界来表示；
S2，通过三维有限元建模获得微针在细胞内移动时，由细胞形变导致的细胞核相对于微针位置的动态漂移轨迹；其中：进行三维有限元建模的具体方法为：将细胞核建模为细胞质的一部分，微针建模为刚性体，在三点钟方向刺入细胞后针口撤退至原来胞质边缘后再开始在细胞内进行运动；细胞核的整体位置动态漂移由细胞核中心位置动态漂移代表，细胞核相对于微针斜口中心的轨迹用来表示细胞核位置动态漂移；
S3，利用二值因析设计法确定微针在细胞内移动时，影响细胞核位置动态漂移轨迹的主导因素；
S4，拟合微针胞内轨迹参数与细胞核位置动态漂移轨迹参数的关系曲线；
S5，确定对细胞核进行操作时，接近细胞核的微针胞内运动轨迹；
S6，控制器控制微针沿设定的胞内运动轨迹接近细胞核并完成细胞核操作。
2.根据权利要求1所述的一种基于细胞核位置动态漂移建模的细胞核操作方法，其特征在于，在步骤S3中，所述二值因析设计法用于分析各种参数对于细胞核动态漂移的轨迹长度以及轨迹方向的影响，具体考量的参数为：透明带与胞质杨氏模量之比、透明带厚度与胞质半径之比、卵周隙尺寸、微针直径、微针移动距离、微针移动方向、细胞核相对于极体位置。
3.根据权利要求2所述的一种基于细胞核位置动态漂移建模的细胞核操作方法，其特征在于，所述细胞核相对于极体位置这一参数对细胞核位置动态漂移轨迹的影响通过步骤S1中确定的细胞核分布椭球体的六个顶点以及中心点来确定。
4.根据权利要求3所述的一种基于细胞核位置动态漂移建模的细胞核操作方法，其特征在于，步骤4具体为：根据步骤S3确定的主导影响因素，对细胞核相对极体分布椭球的6个顶点和中心点处细胞核位置动态漂移轨迹参数与微针胞内轨迹参数进行曲线拟合，其余分布区域内点的细胞核位置动态漂移轨迹参数与微针胞内移动参数的关系曲线由以上7个点结果线性插值获得。
5.根据权利要求4所述的一种基于细胞核位置动态漂移建模的细胞核操作方法，其特征在于，步骤S5具体为：根据细胞核操作要求确立微针与细胞核相对位置的需求函数，利用步骤S1和步骤S4中确定的细胞核三维分布椭球与微针运动参数与细胞核位置动态漂移轨迹参数的关系曲线，计算出任何微针胞内运动轨迹下细胞核分布椭球每个点新的位置与相应的函数期望；通过遍历微针运动轨迹，获得满足该需求的接近细胞核的微针运动轨迹。
6.根据权利要求1所述的一种基于细胞核位置动态漂移建模的细胞核操作方法，其特征在于，步骤S6中，利用PID控制器对微针胞内运动进行控制，具体为：PID控制器根据步骤S5中确定的微针胞内运动轨迹，并按照实际检测微针位置与设定位置的差值对微针运动进行修正，使之沿设定轨迹运动接近细胞核；其中，所述微针的实际位置由微针内气液交界面顶点确定。
7.根据权利要求6所述的一种基于细胞核位置动态漂移建模的细胞核操作方法，其特征在于，步骤S6中，所述的细胞核操作为细胞去核操作时，微针由PID控制器控制沿设定轨迹运动至接近细胞核之后，通过在微针内施加负压定量抽取胞质进行去核操作。
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Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20010005423A (ko) * 1999-06-30 2001-01-15 황우석 체세포 복제동물의 생산을 위한 난자의 탈핵방법
JP2003125750A (ja) * 2001-07-10 2003-05-07 Narishige:Kk マイクロピペット、インジェクション装置およびマイクロインジェクションの方法
CN1807616A (zh) * 2006-01-13 2006-07-26 山东大学 一种细胞核移植的方法
CN101074869A (zh) * 2007-04-27 2007-11-21 东南大学 基于相位法的三维轮廓测量方法
CN104493825A (zh) * 2014-10-29 2015-04-08 北京理工大学 微纳米操作机器人协同操作装置及其用于显微注射的操作方法
CN107423479A (zh) * 2017-05-18 2017-12-01 哈尔滨工业大学 针刺预制体单胞的有限元建模方法
CN107794281A (zh) * 2017-11-10 2018-03-13 南开大学 基于增强现实的定点去核方法
CN107858376A (zh) * 2017-11-10 2018-03-30 南开大学 一种去核量的测量方法
CN110157742A (zh) * 2019-05-28 2019-08-23 南开大学 一种基于微流道的机器人化体细胞核移植操作方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20010005423A (ko) * 1999-06-30 2001-01-15 황우석 체세포 복제동물의 생산을 위한 난자의 탈핵방법
JP2003125750A (ja) * 2001-07-10 2003-05-07 Narishige:Kk マイクロピペット、インジェクション装置およびマイクロインジェクションの方法
CN1807616A (zh) * 2006-01-13 2006-07-26 山东大学 一种细胞核移植的方法
CN101074869A (zh) * 2007-04-27 2007-11-21 东南大学 基于相位法的三维轮廓测量方法
CN104493825A (zh) * 2014-10-29 2015-04-08 北京理工大学 微纳米操作机器人协同操作装置及其用于显微注射的操作方法
CN107423479A (zh) * 2017-05-18 2017-12-01 哈尔滨工业大学 针刺预制体单胞的有限元建模方法
CN107794281A (zh) * 2017-11-10 2018-03-13 南开大学 基于增强现实的定点去核方法
CN107858376A (zh) * 2017-11-10 2018-03-30 南开大学 一种去核量的测量方法
CN110157742A (zh) * 2019-05-28 2019-08-23 南开大学 一种基于微流道的机器人化体细胞核移植操作方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《核移植中的卵母细胞自动拨动研究》;赵启立等;《控制工程》;《控制工程》;20120531;第19卷(第3期);389-393 *

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