CN107794281B - 基于增强现实的定点去核方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于增强现实的定点去核方法。该方法的特点是通过在荧光显微镜下，统计体外刚成熟的猪卵母细胞极体和细胞核的相对位置关系，计算得到细胞核相对于极体的位置模型。利用增强现实技术在卵母细胞上标记细胞核位置，辅助去核操作。在盲吸法去核过程中，通过标记细胞核的位置来调整注射针针口的位置。解决了盲吸法去核过程中细胞核位置不可见问题，实现了细胞核“可视化”效果。提高了去核成功率以及实验操作的一致性和可重复性。

Description

基于增强现实的定点去核方法
技术领域
本发明涉及体细胞核移植技术领域。特别是涉及盲吸法定点去核方法。
背景技术
卵母细胞去核是细胞核移植过程中的一个非常重要的步骤，也是核移植成功的关键。去核过程中，细胞核的定位决定了去核是否完全。目前去核的方法主要有：Hoechst染色去核法，化学试剂去核法，挤压法，盲吸法，半卵法，末期去核法，离心去核法等。由于盲吸法不借助其他化学物质，可以减少某些化学物质可能给卵母细胞造成的损伤和其操作简捷、迅速而被普遍采用。盲吸法存在的最大问题是细胞核位置不可见，去核操作时不能保证是否去掉细胞核，操作者只能凭借经验进行去核操作，不同技术熟练度操作人员的去核率存在较大差异，去核操作的一致性与可重复性比较差。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种基于增强现实的定点去核方法，通过荧光下统计体外刚成熟的猪卵母细胞极体和细胞核的相对位置关系，构建细胞核位置模型。应用增强现实技术标记细胞核位置，将细胞核位置“可视化”来辅助去核操作。能够解决盲吸法去核操作中细胞核位置不可见问题，提高去核操作的成功率。
具体技术方案
基于增强现实的定点去核方法，主要包括三部分：1)统计极体与细胞核的相对位置关系；2)构建细胞核位置模型；3)细胞核定位标记。
第1、将卵母细胞染色，在荧光显微镜下，统计极体与细胞核的相对位置关系。包括极体与卵母细胞的位置关系与相角关系。
第2、由极体与细胞核相对位置关系统计数据，构建细胞核位置模型，得到细胞核相对于极体的位置区域。
第3、用标定块标定相机，将细胞核与极体位置的实际值转化为在实际操作时，视觉反馈界面所对应的像素值。在盲吸法去核操作中，根据构建的细胞核位置模型，应用增强现实的方法，通过在极体质心处点击鼠标，显示细胞核的位置区域，根据细胞核的位置来调整注射针斜口的位置，使注射针斜口接近细胞核位置进行去核操作。
本发明的优点和积极效果：
本发明通过统计猪卵母细胞极体和细胞核的相对位置关系，量化了细胞核的分布范围，构建细胞核位置模型。利用计算机视觉反馈，应用增强现实技术，在实验操作中标记细胞核位置，实现细胞核定位效果，解决了盲吸法去核过程中细胞核位置不可见问题，提高了去核成功率以及去核操作的一致性和可重复性。
附图说明
图1为本发明方法的流程框图。
图2为荧光显微镜下极体与细胞核。
图3为细胞核位置模型示意图。
图4为细胞核定位标记图，其中，(a)细胞核定位标记明场图，(b)细胞核定位标记荧光图。其中，黑色弧线代表细胞核内外边缘(相对于极体位置)，白色虚线弧线代表细胞核外边缘标准差。圆弧角度代表极体与细胞核的夹角。
具体实施方式
本实施实例所使用的细胞是从当地屠宰场所取的家猪卵母细胞。卵母细胞的获取方法如下：
卵巢从屠宰场取出后，在两个小时之内用装有35°到37°的生理盐水的保温瓶运送到实验室。然后立刻用37°的含有100IU/L的盘尼西林和50mg/L的链霉素的无菌生理盐水清洗两次。卵母细胞从卵巢上的2到6毫米直径的小囊中抽取，将抽出的细胞用TL-Hepes-PVA冲洗三次后在39°、二氧化碳浓度5％的培养箱内体外成熟培养(IVM)42小时。经过IVM后，将细胞用0.1％的透明质酸酶进行脱卵。最后用M199将细胞清洗三次，得到所用细胞。将待测的各试验组MII期卵母细胞移入含5μg/ml Hoechst33342的TCM199中孵育15min。
本发明实验操作基于自主研发的微操作系统NK-MR601进行，将相机连接到显微镜提供视觉反馈。显微镜视觉反馈用于提供位置信息以控制操作臂和X-Y平台，形成基于图像的视觉伺服控制系统。协同控制操作臂和X-Y平台，控制微针和细胞的位置来对细胞进行操作。气动注射器提供压强来吸持固定卵母细胞以及进行去核操作。其中固定家猪卵母细胞所用微针直径为40到60微米，去核操作所用微针的直径为20微米。
参见附图1，本发明提供的基于增强现实的定点去核方法主要包括以下步骤：1)统计极体与细胞核的相对位置关系；2)构建细胞核位置模型；3)细胞核定位标记，具体实施方式如下：
一、统计极体与细胞核的相对位置关系。对卵母细胞进行染色，在明场下用微操作系统拨动卵母细胞直至极体出现在视野中。在荧光显微镜下观察并统计极体与细胞核的相对位置关系，如图2所示。极体与细胞核的相对位置关系由以下两部分组成：(1)极体与细胞核之间的距离。统计极体质心与细胞核内外边缘距离的平均值以及极体质心与细胞核外边缘距离的标准差，得到极体与细胞核的距离关系。其中，细胞核的内外边缘是相对于极体位置近和远而言的。(2)极体与细胞核之间的夹角。将极体质心与卵母细胞质心的连线作为起始角，极体质心与细胞核质心的连线作为终止角，得到极体与细胞核的角度关系。实验中统计了50个体外刚成熟家猪卵母细胞极体与细胞核的相对位置关系。由统计结果构建细胞核位置模型，如图3所示。
二、细胞核定位标记。实验操作在10倍镜下进行，用标定块对相机进行标定，获得图像像素值与实际距离的对应关系。将统计得到的细胞核和极体相对位置关系数据的实际值转化为在实验操作时视觉反馈图像对应的像素值。用增强现实技术在实验操作界面上标定细胞核位置来辅助去核操作，如图4(a)所示。用吸持针固定卵母细胞，根据注射针斜口的方向，我们将极体拨动至两点钟或者四点钟方向，因此在增强现实时细胞核位置的标定也由极体位置的不同，分为两种情况。在极体质心处点击鼠标，显示细胞核的位置区域，根据细胞核的位置来调整注射针斜口的位置，使注射针斜口接近细胞核位置进行去核操作。荧光下统计细胞核位置是否标定成功。在实验中，对120个家猪卵母细胞的细胞核位置进行标定，如图4(b)所示，其中标定成功的有116个，成功率达到96.7％。并通过设置有细胞核定位标记和无细胞核定位标记去核实验，来验证基于增强现实定点去核方法的有效性。

Claims (3)

1.一种基于增强现实的定点去核方法，其特征在于：1）统计极体与细胞核的相对位置关系；2）构建细胞核位置模型；3）细胞核定位标记，
第1、将卵母细胞染色，在荧光显微镜下，统计极体与细胞核的相对位置关系，包括极体与卵母细胞的位置关系与相角关系；
第2、由极体与细胞核相对位置关系统计数据，构建细胞核位置模型，得到细胞核相对于极体的位置区域；
第3、用标定块标定相机，将细胞核与极体位置的实际值转化为在实际操作时，视觉反馈界面所对应的像素值，在盲吸法去核操作中，根据构建的细胞核位置模型，应用增强现实的方法，通过在极体质心处点击鼠标，显示细胞核的位置区域，根据细胞核的位置来调整注射针斜口的位置，使注射针斜口接近细胞核位置进行去核操作；
极体与细胞核的相对位置关系由以下两部分组成：（1）极体与细胞核之间的距离，统计极体质心与细胞核内外边缘距离的平均值以及极体质心与细胞核外边缘距离的标准差，得到极体与细胞核的距离关系，其中，细胞核的内外边缘是相对于极体位置近和远而言的；（2）极体与细胞核之间的夹角，将极体质心与卵母细胞质心的连线作为起始角，极体质心与细胞核质心的连线作为终止角，得到极体与细胞核的角度关系。
2.根据权利要求1所述的基于增强现实的定点去核方法，其特征在于：首先将卵母细胞用TL-Hepes-PVA冲洗三次后在39℃、二氧化碳浓度5%的培养箱内体外成熟培养（IVM）42小时；经过IVM后，将细胞用0.1%的透明质酸酶进行脱卵；最后用M199将细胞清洗三次，得到所用细胞；将待测的各试验组MII期卵母细胞移入含5µg/ml Hoechst33342的TCM199中孵育15min。
3.根据权利要求1所述的基于增强现实的定点去核方法，其特征在于：统计刚成熟卵母细胞的极体和细胞核的相对位置关系。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112080387B (zh) * 2020-08-25 2021-10-01 南开大学 一种基于细胞核位置动态漂移建模的细胞核操作方法
CN111944852B (zh) * 2020-08-25 2022-06-07 南开大学 一种基于细胞朝向的定量去核方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998029532A1 (en) * 1997-01-02 1998-07-09 Monash University A method of oocyte enucleation and production of reconstituted embryos
CN201451045U (zh) * 2009-07-22 2010-05-12 北京顺通虹鳟鱼养殖中心 一种虹鳟鱼三倍体制种装置
CN103074296A (zh) * 2013-01-21 2013-05-01 安徽农业大学 小鼠裸卵体外成熟方法及小鼠裸卵体外成熟培养液

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7371922B2 (en) * 2002-07-31 2008-05-13 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Nuclear transfer with porcine embryonic stem cells

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998029532A1 (en) * 1997-01-02 1998-07-09 Monash University A method of oocyte enucleation and production of reconstituted embryos
CN201451045U (zh) * 2009-07-22 2010-05-12 北京顺通虹鳟鱼养殖中心 一种虹鳟鱼三倍体制种装置
CN103074296A (zh) * 2013-01-21 2013-05-01 安徽农业大学 小鼠裸卵体外成熟方法及小鼠裸卵体外成熟培养液

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
猪卵母细胞第1极体与核相对位置变化对去核率的影响;剧世强等;《江苏农业学报》;20101231;第26卷(第3期);第527页右栏第1段、第527页左栏第2段、第527页左栏倒数第3段、第530页右栏第2段 *
面向自动化去核的视觉检测关键技术研究;陈迪;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20170315;第9页前3段、第36页倒数第2段 *

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