CN109491409B - 一种用于体外自动化提取目标细胞线粒体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于自动化提取目标细胞线粒体的方法，属于微纳机器人辅助控制系统，实现自动化细胞位姿操控和二维细胞活检操作。本发明包括：通过接连荧光显微镜的CCD相机采集细胞图像，通过图像处理算法识别出待提取目标线粒体的位置和姿态角；通过光镊处于不同的操作模式分别实现细胞位置和姿态角的精确控制；通过微流控芯片外接泵加负压，使得目标细胞牢牢固定在微流控芯片通道中保持位姿不变；利用视觉反馈控制策略将玻璃微管尖端移动到待提取目标线粒体附近；通过玻璃微管外接的泵施加的负压将待提取线粒体抽取出目标细胞。
Description
技术领域
本发明属于微纳机器人辅助控制系统，尤其涉及一种用于体外自动化提取目标细胞线粒体的方法。
背景技术
单细胞层面的生物分析能够获得细胞异质性，近几年获得广泛的关注。细胞活检作为一项单细胞层面活检技术，通过提取和分析亚细胞层面的组织或细胞器达到疾病诊断和治疗。因此必须开发能够操纵和提取细胞器及细胞内组件的高度精确的微操作工具，以利于新的基于单细胞的医学疗法的快速发展，从而促进对细胞动力学、细胞组分功能和疾病机理的深入理解。
在过去的几十年中，已经开发了多种用于细胞内层面操作的微/纳米操纵工具，如基于扫描离子电导-显微镜的纳米活检系统，AFM，碳纳米管，采样探针，半封闭微芯片等。这些操作系统和工具普遍采用开环手动方法实现，对操作熟练度要求很高，需要花费大量的时间进行操作练习培训，实验可重复性差，操作精度低。细胞活检操作任务，如定位微管尖端相对于细胞的位置，刺穿细胞后在细胞内特定位置定位玻璃微管，并从细胞中提取微量组织，非常繁琐和费时。
发明内容
本发明提供了一种用于体外自动化提取目标细胞线粒体的方法，建立一套基于玻璃微管和光镊的微纳机器人控制系统，实现自动化细胞位姿操控和二维细胞活检操作。
为实现以上目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于体外自动化提取目标细胞线粒体的方法，包括以下步骤：
(1)通过接连荧光显微镜的CCD相机采集细胞图像，通过图像处理算法识别出待提取目标线粒体的位置和姿态角；
(2)通过光镊处于不同的操作模式分别实现细胞位置和姿态角的精确控制；
(3)通过微流控芯片外接泵加负压，使得目标细胞牢牢固定在微流控芯片通道中保持位姿不变；
(4)利用视觉反馈控制策略将玻璃微管尖端移动到待提取目标线粒体附近；
(5)通过玻璃微管外接的泵施加的负压将待提取线粒体抽取出目标细胞。
以上所述步骤中，步骤(1)中，步骤(1)通过利用细胞特征点在显微镜像平面xy上的投影变化实时获取目标细胞的姿态角；通过荧光显微镜外连的CCD结合以下图像处理算法实时获得细胞的姿态角，所述算法为：
其中，长轴L，短轴l，角度θ和φ分别表示细胞内特征点的经度和维度，
表示长轴L和xy平面的夹角，Lxy表示长轴在xy平面上的投影距离；
表示细胞质心在xy平面上的投影向量，φ角是向量
相对于x轴的夹角。
步骤(2)所述目标细胞的旋转姿态角精度小于2度，位置误差小于0.5微米；光镊不同的操作模式为利用受控的光镊作用在细胞旋转模式，使得目标细胞旋转，使得待提取目标线粒体靠近玻璃微管尖端一侧；或利用受控的光镊作用在细胞平动模式，使得目标细胞平动到微流控芯片的通道。
步骤(3)通过设计微流控芯片通道的尺寸实现细胞位姿的固定，避免细胞器提取过程中细胞位姿变动。
本发明有益效果：本发明提供了一种用于体外自动化提取目标细胞线粒体的方法，建立了一套基于玻璃微管和光镊的微纳机器人控制系统，可实现自动化细胞位姿操控和二维细胞活检操作，操作精度高，姿态角精度小于2度，位置误差小于0.5微米，而且实验可重复性好，避免了试验样品如生物细胞样品的损耗，节省了大量人力物力，在单细胞层面实现细胞位置和姿态角精确可控，有利于推动细胞活检技术的发展。
附图说明
图1为本发明提取目标细胞线粒体的方法操作流程图。
图2为本发明通过提取细胞核特征信息来获取细胞位姿变化；其中，(a)为重构模型，(b)为荧光染料标定的细胞核在荧光显微镜下的二维投影信息。
图3为本发明对偶光镊进行多自由度细胞位置控制；其中，(a)为三维示意图，(b)为顶视图。
图4为本发明对偶光镊进行多自由度细胞姿态角控制；其中，(a)为前视图，(b)为顶视图。
图5为本发明用于细胞活检的操控方法。
图6为本发明微纳机器人辅助细胞活检过程图；其中，(a)为细胞位姿调控，(b)为玻璃微管定位和细胞器提取，(c)为细胞器进入玻璃微管，(d)为完成细胞活检操作。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明：
一种用于目标细胞活检的操控方法，包括以下步骤：
(1)通过接连荧光显微镜的CCD相机采集细胞图像，通过图像处理算法识别出待提取目标线粒体的位置和姿态角；
(2)通过光镊处于不同的操作模式分别实现细胞位置和姿态角的精确控制；
(3)通过微流控芯片外接泵加负压，使得目标细胞牢牢固定在微流控芯片通道中保持位姿不变；
(4)利用视觉反馈控制策略将玻璃微管尖端移动到待提取目标线粒体附近；
(5)通过玻璃微管外接的泵施加的负压将待提取线粒体抽取出目标细胞。
以上所述步骤中，步骤(1)中细胞内组织识别和提取，利用如图2所示的方法提取和识别荧光染料标定的细胞器，通过荧光显微镜外连的CCD结合以下图像处理算法实时获得细胞的姿态角。
其中，长轴L，短轴l，角度θ和φ分别表示细胞内特征点的经度和维度，
表示长轴L和xy平面的夹角，Lxy表示长轴在xy平面上的投影距离；
表示细胞质心在xy平面上的投影向量，φ角是向量
相对于x轴的夹角。
步骤(2)中，光镊不同的操作模式为利用受控的光镊作用在细胞旋转模式，使得目标细胞旋转，使得待提取目标线粒体靠近玻璃微管尖端一侧；或利用受控的光镊作用在细胞平动模式，使得目标细胞平动到微流控芯片的通道；多自由度细胞位置和姿态角精确控制，首先以基于光镊捕获细胞广义动力学方程为基础，建立视觉反馈控制系统实现细胞位置和姿态角精确控制。
其中
和
分别是细胞位置坐标和角速度；m是细胞的质量，
是相对于惯性坐标系的转动惯量；从广义动力学模型可以看出，细胞在单光镊捕获作用下存在着平动和转动耦合情况。
图3为对偶光镊进行多自由度细胞位置控制；(a)三维示意图(b)顶视图。
图4对偶光镊进行多自由度细胞姿态角控制(a)前视图(b)顶视图。
所述目标细胞的旋转姿态角精度小于2度，位置误差小于0.5微米。
步骤(3)通过设计微流控芯片通道的尺寸实现细胞位姿的固定，避免细胞器提取过程中细胞位姿变动。
步骤(4)中，细胞内玻璃微管精确定位。基于玻璃微管机动平台三自由度动力学模型，设计了鲁棒控制策略自动化实现玻璃微管的精确定位。
其中，
是系统的惯性矩阵，
是玻璃微管位置坐标，
是阻尼系数，
是重力，τ＝[τx,τy,τz]T是平台输入力矩。其中M和B均为对角方阵。
设计的玻璃微管定位鲁棒控制策略如下：
τ＝τ0+τs，
其中
τs＝-KTanh(Sr),
Tanh(Sr)＝[tanh(Sr1),tanh(Sr2),tanh(Sr3)]T,
其中M0,B0,和G0是系统参数M,B,和G的标称值，为已知部分。K＝diag{k1,k2,k3}是正定的增益矩阵，Tanh(·)是标准的双曲正切函数，qe＝q-qd是位置跟踪误差。其中Sr定义如下：
α为正常数。
同样的方法也可以应用于其他细胞器的提取。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种用于体外自动化提取目标细胞线粒体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)通过接连荧光显微镜的CCD相机采集细胞图像，通过图像处理算法识别出待提取目标线粒体的位置和姿态角，所述图像处理算法为：
其中，长轴L，短轴l，角度θ表示细胞内特征点的经度，
表示长轴L和xy平面的夹角，Lxy表示长轴在xy平面上的投影距离；
表示细胞质心在xy平面上的投影向量；
(2)通过光镊处于不同的操作模式分别实现细胞位置和姿态角的精确控制；
(3)通过微流控芯片外接泵加负压，使得目标细胞牢牢固定在微流控芯片通道中保持位姿不变；
(4)利用视觉反馈控制策略将玻璃微管尖端移动到待提取目标线粒体附近，基于玻璃微管机动平台三自由度动力学模型，设计了鲁棒控制策略自动化实现玻璃微管的精确定位：
其中，
是系统的惯性矩阵，
是玻璃微管位置坐标，
是阻尼系数，
是重力，τ＝[τx,τy,τz]T是平台输入力矩； 其中M和B均为对角方阵，
设计的玻璃微管定位鲁棒控制策略如下：
τ＝τ0+τs，
其中
τs＝-KTanh(Sr),
Tanh(Sr)＝[tanh(Sr1),tanh(Sr2),tanh(Sr3)]T,
其中M0,B0,和G0是系统参数M,B,和G的标称值，为已知部分； K＝diag{k1,k2,k3}是正定的增益矩阵，Tanh(·)是标准的双曲正切函数，qe＝q-qd是位置跟踪误差； 其中Sr定义如下：
α为正常数；
(5)通过玻璃微管外接的泵施加的负压将待提取线粒体抽取出目标细胞。
2.根据权利要求1所述的用于体外自动化提取目标细胞线粒体的方法，其特征在于，步骤(1)通过利用细胞特征点在显微镜像平面xy上的投影变化实时获取目标细胞的姿态角。
3.根据权利要求1所述的用于体外自动化提取目标细胞线粒体的方法，其特征在于，步骤(2)光镊不同的操作模式为利用受控的光镊作用在细胞旋转模式，使得目标细胞旋转，使得待提取目标线粒体靠近玻璃微管尖端一侧；或利用受控的光镊作用在细胞平动模式，使得目标细胞平动到微流控芯片的通道。
4.根据权利要求1或3所述的用于体外自动化提取目标细胞线粒体的方法，其特征在于，步骤(2)所述目标细胞的旋转姿态角精度小于2度，位置误差小于0.5微米。
5.根据权利要求1所述的用于体外自动化提取目标细胞线粒体的方法，其特征在于，步骤(3)中通过设计微流控芯片通道的尺寸实现细胞位姿的固定。
6.权利要求1所述的用于体外自动化提取目标细胞线粒体的方法能够运用于其他细胞器的提取。
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