CN107858376B - 一种去核量的测量方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种去核量的测量方法。该方法的特点是在盲吸法去核过程中，发现注射针中的胞质释放到操作液中一段时间后，胞质会由最初的条状自动聚集成一个形状规则的球体。通过对胞质球体积的测量，可以准确得到去核量。解决了在盲吸法去核过程中去核量估计不准确的问题。

Description

一种去核量的测量方法
技术领域
本发明涉及体细胞核移植技术领域。特别是涉及一种去核量的测量方法。
背景技术
去核是将卵母细胞内主要遗传物质彻底清除干净，从而保证由移入的细胞核所发育的个体具有与供核动物最高的相似遗传特性(克隆动物)。去核量的多少直接影响细胞后期发育结果。如果去核不完全，可导致重组胚染色体的非整倍性，造成多倍体，卵裂异常，发育受阻和胚胎早期死亡。如果去核太多，会加速重组胚的异常分化，影响胚胎发育。盲吸法作为目前常用的一种去核方法，在第一极体附近吸取极体及其下方1/4-1/3的胞质来达到去核目的，去核量范围很笼统并且没有给出去核量的具体测量方法，去核量具有很大的随机性，导致细胞后期发育结果一致性很差，克隆操作效率较低。因此提供一种去核量的测量方法十分必要。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种去核量的测量方法，能够解决盲吸法去核操作中去核量的不确定而对细胞发育造成较大损伤的问题。注射针中的胞质释放到操作液中一段时间后，胞质会由最初的条状自动聚集成一个形状规则的球体。通过胞质球体积的测量，准确得到去核量。
具体技术方案
一种去核量的测量方法，主要包括以下三部分：1)胞质球的形成；2)去核量测量，
第1、用盲吸法去核，将注射针中抽取的胞质释放到操作液中一段时间后，胞质会由最初的条状自动聚集成一个形状规则的球体；
第2、计算形成的规则胞质球体的体积V1，计算未去核前卵母细胞细胞质体积V2，由抽取的胞质形成的胞质球体积与未去核前卵母细胞细胞质体积之比，来准确测量去核量。
本发明的优点和积极效果：
本发明通过对抽出的胞质聚集成球状的体积计算，可以准确的得到去核量，解决了盲吸法去核过程中由于去核量的不确定而造成的细胞发育损伤问题，能够有效的提高去核效率。
附图说明
图1为卵母细胞胞质在操作过程中的形态图，其中，(a)为未去核前的猪卵母细胞，(b)为注射针中的胞质，(c)为注射针中的胞质刚刚释放到操作液中的形态，(d)为注射针中的胞质释放到培养液中一段时间后形成球状的形态。
图2为不同去核量下的去核实验图，其中，(a),(b),(c),(d)分别为去核量由少至多设计的去核实验。
具体实施方式
本实施实例所使用的细胞是从当地屠宰场所取的家猪卵母细胞。卵母细胞的获取方法如下：
卵巢从屠宰场取出后，在两个小时之内用装有35°到37°的生理盐水的保温瓶运送到实验室。然后立刻用37°的含有100IU/L的盘尼西林和50mg/L的链霉素的无菌生理盐水清洗两次。卵母细胞从卵巢上的2到6毫米直径的小囊中抽取，将抽出的细胞用TL-Hepes-PVA冲洗三次后在39°、二氧化碳浓度5％的培养箱内体外成熟培养(IVM)42小时。经过IVM后，将细胞用0.1％的透明质酸酶进行脱卵。最后用M199将细胞清洗三次，得到所用细胞。
本发明实验操作基于自主研发的微操作系统NK-MR601进行，将相机连接到显微镜提供视觉反馈。显微镜视觉反馈用于提供位置信息以控制操作臂和X-Y平台，形成基于图像的视觉伺服控制系统。协同控制操作臂和X-Y平台，控制微针和细胞的位置来对细胞进行操作。气动注射器提供压强来吸持固定卵母细胞以及进行去核操作。其中固定家猪卵母细胞所用微针直径为40到60微米，去核操作所用微针的直径为20微米。
本发明提供的一种去核量的测量方法具体实施方式如下：
一、吸持针固定卵母细胞，测得卵母细胞胞质直径,计算未去核前胞质的体积为V2，如图1(a)所示。用注射针拨动卵母细胞直至极体出现在视野中，再将极体拨动到盲吸法去核所需的两点钟或四点钟方向，将注射针移动至细胞中部，控制注射针以50μm/s的速度刺入卵母细胞，减小气动注射器压强，吸取胞质进入注射针内。抽出适量胞质后，控制注射针以100μm/s的速度退出卵母细胞。增大气动注射器压强，将胞质移动到针尖位置，如图1(b)所示，然后将胞质释放到操作液中，由于表面张力的作用，一段时间(10分钟)后操作液中的胞质会由条状逐渐聚集成形状规则的球状，如图1(c),(d)所示。应用球体计算公式，得到胞质球体积V1。根据去除的胞质形成胞质球的体积与未去核前胞质体积之比即V1/V2，准确得到去核量。
二、设置不同去核量实验，将待测的各试验组MII期卵母细胞移入含5μg/mlHoechst33342的TCM199中孵育15min，对卵母细胞进行染色。设定一个去核量的一个较小值作为初始值，去核量为未去核前卵母细胞胞质量的4.2％，在此基础上逐步增加去核量设计不同去核量实验，如图2(a),(b),(c),(d)所示。用盲吸法去核，用上述测量方法准确测得每组去核量，每组实验30个猪卵母细胞。在荧光显微镜下检验去核效果，如无荧光，证明卵母细胞内的染色质已被完全去除，若有荧光，证明染色质未被去除或部分被去除。

Claims (3)

1.一种去核量的测量方法，其特征在于：1）胞质球的形成；2）去核量测量，
第1、用盲吸法去核，将注射针中抽取的胞质释放到操作液中一段时间后，胞质会由最初的条状自动聚集成一个形状规则的球体；
第2、计算形成的规则胞质球体的体积V1，计算未去核前卵母细胞细胞质体积V2，由抽取的胞质形成的胞质球体积与未去核前卵母细胞细胞质体积之比，即V1/V2来准确测量去核量；
形成球体的胞质是细胞核及其周围的胞质，卵母细胞内其它部位的胞质在吸入注射针内呈分散的颗粒状,不能聚集成球形。
2.根据权利要求1所述的去核量的测量方法，其特征在于还包括以下步骤：
对细胞在培养箱内体外成熟培养（IVM）的步骤、将细胞进行脱卵的步骤、对细胞清洗的步骤；
具体包括：将抽出的细胞用TL-Hepes-PVA冲洗三次后在39℃、二氧化碳浓度5%的培养箱内体外成熟培养（IVM）42小时；经过IVM后，将细胞用0.1%的透明质酸酶进行脱卵；最后用M199将细胞清洗三次，得到所用细胞。
3.根据权利要求1所述的去核量的测量方法，其特征在于：第1步中所述的一段时间为10分钟。
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