CN105002157A - 一种猪体细胞核移植融合方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及克隆技术领域，具体公开了一种猪体细胞核移植融合方法。所述的融合方法，包含如下步骤：S1.将重构胚放入融合液中平衡，然后用融合液洗涤，再放入铺满融合液的融合槽中；S2.拨动重构胚，使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行放置，同时使重构胚在融合槽中成曲线排列；S3.用细胞融合仪施加直流电脉冲诱导融合并同时激活，S4.接着用胚胎培养液洗涤，立即转入矿物油覆盖的胚胎培养液中或辅助激活液中，然后置于培养箱中培养，再在体视显微镜下判定融合情况。所述方法一次性可以操作融合15~20个重构胚，大幅度提升了融合效率。
Description
技术领域
本发明涉及克隆技术领域，具体涉及一种猪体细胞核移植融合方法。
背景技术
1997年克隆羊--"Dolly"出生，开启了动物体细胞核移植技术的新篇章。随后多种哺乳动物如牛、小鼠、山羊、猪、兔等被相继克隆成功。体细胞核移植技术即克隆技术，通常是通过显微操作的方法将受体卵母细胞的细胞核去除，然后将供体细胞注入到已去核的卵母细胞内，形成一个新的重构胚，再通过融合技术将重构胚的供体细胞核导入到去核卵母细胞胞质中，使移入的核在受体胞质的作用下激活发生发育程序重编，使得重构胚能与正常受精胚一样细胞分裂、分化，经过手术移植到代孕母体内发育成一个新的个体，其获得的个体与亲本具有相同遗传性状。从第一例克隆猪(Onishi,2002)诞生至今已有13年，但是整体效率依然没有突破只有1％-2％。如何提高整体的克隆效率，许多实验室进行了大量的研究，包括提高卵母细胞质量、融合激活方法与参数研究、供体细胞处理、胚胎处理、移植方法等。
将供体细胞的细胞核导入到卵母细胞质中，这个过程称之为融合。如果没有细胞融合技术，著名的克隆羊—“Dolly”可能就无法诞生。最早使用的融合技术是使用灭活的仙台病毒(HVJ)(McGrath and Solter，1983)介导细胞融合，获得了成功，但是效果很不稳定而且毒性大。Willadsen等(1986)在利用胚胎细胞克隆羊试验中采用的是直流电介导融合的方法，简便而且高效，电融合技术也是从这个时候开始发展起来的，其原理是通过电流的刺激使紧密接触的细胞膜磷脂双分子层发生结构改变，进而形成细胞间的孔道，随着孔道逐渐扩大使胞质交融在一起。克隆羊“Dolly”就是运用电融合技术，目前已经成为动物克隆中普遍采用的融合方法。若融合率越高，操作速度越快，单位时间生产的胚胎数就越多，体细胞核移植效率也就相应的提高了。
然而，由于技术操作上的差异、融合激活参数、供体细胞类型和操作人员熟练程度等因素导致融合率不稳定，是影响克隆效率的因素之一。由于是在体视显微镜下直接操作，受到视野范围大小的影响，在保证可以看见体细胞的情况下尽可能多操作一些。在实际操作过程中普遍的操作是：将一批重构胚5～10个成一条直线放入融合槽内后(图1)，使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行后即施加直流电脉冲诱导融合。一次性操作数量较少，会影响到整体的融合速度。特别对于猪而言，每次需要移植300左右的重构胚，才能有效维持猪的妊娠。一次性操作这么多胚胎，体外融合速度就成了很重要的影响因素。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有猪体细胞核移植融合操作过程中，一次性操作数量少，整体融合速度慢的缺点，提供一种猪体细胞核移植融合方法。
本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：
一种猪体细胞核移植融合方法，包含如下步骤：
S1.将构建好的重构胚放入融合液中平衡，然后用融合液洗涤，再放入铺满融合液的融合槽中；
S2.拨动重构胚，使供体细胞与受体卵细胞膜接触面与电极平行放置，同时使重构胚在融合槽中成非直线排列；
S3.用细胞融合仪施加直流电脉冲诱导融合并同时激活，
S4.接着用胚胎培养液洗涤，然后置于培养箱中培养，再在体视显微镜下判定融合情况。
本发明的方法在进行融合操作时，使供体细胞与受体卵细胞膜接触面与电极平行同时使重构胚在融合槽中成曲线排列(图2)，然后施加直流电脉冲诱导融合，在同样的视野下可以增加一次性操作的数量，提高整体融合速度而不会影响克隆胚胎的后期发育。
优选地，S1.所述的融合液的含有0.25mol/L甘露醇(Mannitol)、0.1mmol/LCaCl2·2H2O、0.1mmol/L MgCl2·6H2O、0.5mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、0.01％聚乙烯醇(PVA)(w/v)。
优选地，S1.中平衡所用的时间为1～5min，用融合液洗涤的次数为2～5次。
优选地，S2.所述的非直线排列为曲线排列。
优选地，S3.中所述的细胞融合仪的型号为BLS-150B融合仪。
优选地，S3.中所述的直流电脉冲80-100v/mm,80-100μs，脉冲次数为2～3次。
优选地，S4.中所述的胚胎培养液为PZM-3培养液。
优选地，S4.中置于培养箱中培养的条件为39℃，5％CO2，饱和湿度，培养4h。
有益效果：(1)本发明克服了现有猪体细胞核移植操融合操作过程中，一次性操作数量少，整体融合速度慢的缺点，提供了一种新的猪体细胞核移植融合方法；(2)本发明所述的猪体细胞核移植融合方法一次性可以操作融合15～20个重构胚，相对于现有技术一次性只能操作5～10个重构胚而言，大幅度提升了融合效率。
附图说明
图1为重构胚呈直线排列的猪体细胞核移植融合方法图。
图2为重构胚呈曲线排列的猪体细胞核移植融合方法图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。
实验研究所用试剂未经特殊说明均购自SIGMA公司。胎牛血清(GIBCO)，生理盐水(紫光古汉集团衡阳制药有限公司)；细胞培养相关耗材为Corning公司产品；卵母细胞成熟及细胞、胚胎培养耗材为NUNC公司产品。洗卵液为DPBS+PVA液,操作液为无钙的H-NCSU-23，卵母细胞成熟培养液为添加体积分数10％猪卵泡液的TCM-199液，胚胎培养液为PZM-3。按照常规的体细胞核移植技术构建克隆胚胎。
实施例1
1、卵母细胞收集及体外成熟培养
猪卵巢采至广州天河屠宰场，用剪刀去除输卵管等组织后将卵巢置于含抗生素的37℃生理盐水中，用保温瓶3h内运回实验室。用含抗生素的生理盐水冲洗3-5次后，用配有18G针头的10mL注射器抽取直径为2mm～6mm的卵泡。在体视显微镜下用自制捡卵针捡取胞质完整及包裹3层以上卵丘细胞的卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus oocyte complexes，COCs)。用洗卵液冲洗3次，再用成熟培养液冲洗2次，然后放入已在二氧化碳培养箱内平衡4h以上的成熟培养液中。在39℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中成熟培养42h～44h。
2、供体细胞培养
采集猪耳样，经含有双抗的生理盐水冲洗，保存到含双抗的DMEM培养液中，用冰盒带回实验室。耳样按照常规体细胞建系方法建立成纤维细胞系，冷冻保存。在做核移植操作前1-2周，将供体细胞复苏培养。将传代至3-6代的成纤维细胞培养至100％汇合，再接触抑制2天后，常规消化，离心洗涤，最后用操作液将细胞沉淀重悬，用作核供体。
3、体细胞核移植操作
将成熟培养42-44h后的卵母细胞与1mg/mL透明质酸酶混合，用移液枪反复吹打除去卵丘细胞，以胞质均匀、第一极体排出为成熟标志挑选出成熟的卵母细胞，放到操作液滴中备用。采用盲吸去核法构建体细胞克隆胚胎(重构胚)：在显微操作仪用固定针将卵母细胞固定，去核针拨动使极体处于5点钟位置，用去核针把卵母细胞内的极体及附近1/3胞质去除并将体细胞注进透明带内，使其与胞质紧密贴近。
4、猪体细胞核移植融合
将构建好的重构胚分批转移到融合液中平衡2min，用融合液洗涤3遍后，每批15-20个重构胚放入已经铺满融合液的融合槽内，用拉制的很细的实心玻璃针拨动重组胚，使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行同时使重构胚在融合槽中成曲线排列(图2)，用BLS-150B融合仪(匈牙利)施加不同参数的的直流电脉冲诱导融合同时激活，接着胚胎培养液洗涤3遍，立即转入矿物油覆盖的胚胎培养液中，39℃，5％CO2，饱和湿度的培养箱中培养。融合液的配方为0.25mol/LMannitol、0.1mmol/L CaCl2·2H2O、0.1mmol/L MgCl2·6H2O、0.5mmol/L HEPES、0.01％PVA(w/v)。融合参数为80-100v/mm,80-100μs,2-3次电脉冲。
5、重构胚的体外发育观察
胚胎培养至48h和168h时记录卵裂数和囊胚数。同时对囊胚染色记录囊胚细胞数，因为囊胚细胞数是反映囊胚优劣的一个必要条件。具体方法为：取出第6d的囊胚，在含有3.7％多聚甲醛的DPBS中洗涤2遍后固定10min，将固定好的囊胚转移到含10μg/ml的Hoechst33342的DPBS中避光染色5min，将好的囊胚用操作液洗3遍，转移到载玻片上，再轻轻压盖玻片。然后在Olympus荧光显微镜下紫外光激发下观察拍照，细胞计数。
实施例2
用上述实验方法和参数，每次对300枚猪体细胞核移植胚胎进行融合实验，实验重复4次。每次实验将核移植胚胎分成2组，一组采用常规的直线排列，一组采用改进的曲线排列，结果发现，全部胚胎做完融合时，曲线排列比直线排列快30分钟。将得到的克隆胚胎部分进行体外培养，观察排列方式对后期发育的影响。结果表明：呈曲线排列时，融合率、卵裂率、囊胚率、囊胚细胞数之间差异都不显著，说明改变操作方法不会影响到克隆胚的后期发育，但是提高了融合操作速度，有效提高了核移植操作效率。
表1 融合操作对核移植效率的影响
注：同列肩标相同小写字母者表示差异不显著(P>0.05)。
Claims (8)
1.一种猪体细胞核移植融合方法，其特征在于，包含如下步骤：
S1.将构建好的重构胚放入融合液中平衡，然后用融合液洗涤，再放入铺满融合液的融合槽中；
S2. 拨动重构胚，使供体细胞与受体卵细胞膜接触面与电极平行放置，同时使重构胚在融合槽中成非直线排列；
S3. 用细胞融合仪施加直流电脉冲诱导融合并同时激活，
S4. 接着用胚胎培养液洗涤，然后置于培养箱中培养，再在体视显微镜下判定融合情况。
2.根据权利要求1所述的融合方法，其特征在于，S1.所述的融合液的含有0.25mol/L Mannitol、0.1mmol/L CaCl2·2H2O、0.1mmol/L MgCl2·6H2O、0.5mmol/L HEPES、0.01% PVA(w/v)。
3.根据权利要求1所述的融合方法，其特征在于，S1.中平衡所用的时间为1~5min，用融合液洗涤的次数为2~5次。
4.根据权利要求1所述的融合方法，其特征在于，S2.所述的非直线排列为曲线排列。
5.根据权利要求1所述的融合方法，其特征在于，S3.中所述的细胞融合仪的型号为BLS-150B融合仪。
6.根据权利要求1所述的融合方法，其特征在于，S3.中所述的直流电脉冲80-100v/mm, 80-100μs，脉冲次数为2~3次。
7.根据权利要求1所述的融合方法，其特征在于，S4.中所述的胚胎培养液为PZM-3培养液。
8.根据权利要求1所述的融合方法，其特征在于，S4.中置于培养箱中培养的条件为39℃，5%CO2，饱和湿度，培养4h。
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