JP2010500921A

JP2010500921A - マイクロ流体インジェクションのための方法と装置

Info

Publication number: JP2010500921A
Application number: JP2009524687A
Authority: JP
Inventors: アンドレアアダモ，; ルイージアダモ，; クラブスエフ．ジェンセン，
Original assignee: マサチューセッツ・インスティテュート・オブ・テクノロジー
Priority date: 2006-08-17
Filing date: 2007-08-16
Publication date: 2010-01-14
Also published as: EP2054499A2; US20090209039A1; WO2008021465A3; AU2007284454A1; WO2008021465A2; WO2008021465A8; CA2662826A1

Abstract

液体の噴流または小滴を生成するための方法および装置が開示される。インジェクションデバイスは、ノズルと流体的に接続する貯蔵容器を含み得、液体の噴流をノズルから生成するために、貯蔵容器内に圧力勾配が生成され得る（例えば、圧電素子によって、噴流または小滴の放出方向に対して横向きの初期方向に）。液体の噴流または小滴は、細胞死を引き起こす細胞膜への損傷が避けられるような方法で、細胞膜を経由して細胞内部に導入され得る。はんだ等の液体材料を、貯蔵容器から電極チャネルの電極部分の中に、流体チャネルに隣接する位置にまで導くことによって、流体チャネルに隣接して電極が形成され得る。電極チャネルと流体チャネルとの間の通路は、電極形成中に液体電極材料が流体チャネル内に流入することを防ぎ得る。

Description

（関連出願の参照）
本出願は、米国予備特許出願第６０／８３８，３０３号（２００７年８月１７日出願）の利益を主張し、該予備特許出願は、その全体が本明細書によって参考として援用される。

（技術分野）
一部の局面において、本発明は、液体噴流および／または液体の小滴を生成するための装置および方法に関する。生成される噴流／小滴の一部の用途は、細胞内への材料のマイクロインジェクション、結晶化、ナノ／ピコ／フェムト小滴生成、およびナノ粒子合成を含む。一部の局面において、本発明は、液体の流れを導くために使用されるチャネルと共に使用される電極の形成に関する。

マイクロ流体は、生物学、化学工業、および他の分野におけるその潜在的用途のために注目されてきている。例えば、特許文献１は、パルス式マイクロ流体噴流を生成するためのデバイスを開示している。流体噴流は、チャンバから開口部を通じて流体を押し出す蒸気泡によって生成される。他の公知の構成は、（例えば、インクジェットプリンタ型の技術を使用して）気体環境下で流体の高速噴流および問題の溶液のナノ小滴を形成することができる。

米国特許第６，９１３，６０５号明細書

本発明の局面は、高度に制御可能な体積および／または流速を有する、液体噴流および／または小滴を生成するための方法および装置を提供する。例えば、一実施形態において、デバイスは、約０．０ｍ／秒から約４０ｍ／秒までの速度、および約０．０５ミクロンから２０ミクロンまでのストリーム径を有する、流体噴流を生成することができる。デバイスはまた、ナノリットル、ピコリットル、またはフェムトリットルの範囲の制御可能な体積を有する小滴を形成することができる。

例示的な一実施形態において、流体噴流／小滴発生器は、液体の貯蔵容器、および液体が押し出されるマイクロ加工されたノズルを含み得る。ノズルは、２０ミクロン以下の比較的小さい開口を形成するために、標準的なフォトリソグラフィまたはその他の技術を使用して加工され得る。デバイスはまた、圧電素子スタックおよび付随するダイヤフラム等の圧力発生器を含み得、それは、貯蔵容器内に圧力パルスを形成する。圧力パルスは、ノズルを通じて液体を押し出し、所望の噴流および／または小滴を形成し得、それは、他の液体の中に導入され得る。

本発明の局面は、生物学、化学工業、およびその他の様々な分野における用途を有し得る。例えば、制御された噴流によって、遺伝子片、薬剤、またはその他の材料が、細胞膜を通して細胞内に送達され得る。この特徴は、分子および細胞生物学研究における実験プロトコルにおいて重要なステップとなり得、かつ、遺伝子療法において有用となり得る。発明者らは、任意の種類の材料（例えば、脂質、タンパク質、炭水化物、核酸、化学薬品等）または構造（例えば、細胞内小器官、またはマイクロ加工／ナノ加工構造等）の、単細胞の中への効率的な導入を可能にする最も効果的な技術は、マイクロインジェクションであると考えている。しかしながら、現在のマイクロインジェクションデバイスおよび技術は、高価でかつ著しく遅い（例えば、熟練した操作者が１つの細胞に注入を実施するために２０分）。対照的に、本発明の局面は、細胞を穿刺する高速マイクロ流体噴流を使用し、それによって問題の化合物を既知の量で細胞内に送達する、安価で処理量が多く、定量的でかつ自動化された、細胞マイクロインジェクションを可能とするデバイスおよび方法を提供する。

本発明の局面はまた、化学工業の応用における用途を有する。例えば、化合物の結晶化は、時に、異なる結晶化条件下での数回の試行の後にのみ達成される、困難なプロセスとなり得る。現在では、結晶化条件スクリーニングの低い処理量およびそのような条件の厳密な制御の困難さが、その分野を停滞させている。さらに、現在の結晶化プロトコルは、大量の試薬を使用する。本発明のある特定の実施形態を用いて、ある溶液のピコリットルサイズの小滴を他の溶液に送達し、試薬の急速かつ密な接触を提供することが可能である。マイクロ流体システムに含まれる微小量は、結晶化条件の非常に良好な制御を可能にし、故に実験の再現性を高める。さらに、使用される試薬の量が少ないことは、コストを削減する。本発明の局面は、（例えば、多くのシステムを並行して稼動することにより）スクリーニングおよび／または生産の両方で使用され得る。問題の分子は、タンパク質から薬剤までの、任意の好適な種類のものであり得る。本発明の実施形態の微小小滴生成能力は、広範囲のナノ粒子の合成を可能にし得る。

本発明の一局面において、細胞内に材料を導入する方法は、ノズルの出口付近の位置に細胞を提供するステップと、流体を含有し、かつ該ノズルと流体的に接続する貯蔵容器を提供するステップと、該貯蔵容器内の流体を該ノズルに向けて押し動かすために、該貯蔵容器内に圧力勾配を生成するステップと、材料を含む液体を、細胞膜を経由して細胞内部に導入するために、該液体の噴流を該ノズルから生成するステップと、を含む。細胞内部への液体の導入は、細胞死を引き起こす細胞膜への損傷を避けるように達成される。これは、細胞膜に大きな損傷を引き起こさずには細胞に材料を導入できない他のマイクロインジェクションデバイスとは対照的である。

本発明の別の局面において、流体インジェクションデバイスは、第１の経路に沿って細胞を運搬するように構成および配置されるチャネルと、液体の噴流または小滴を、出口からチャネル内に放出方向に放出するように構成および配置されるノズルと、液体を保持し、かつノズルと流体的に接続する貯蔵容器と、ノズルに液体の噴流または小滴を出口から放出させるために、貯蔵容器中に圧力勾配を形成するように適合される圧電素子等の圧力発生器と、を備える。液体の噴流または小滴は、細胞死を引き起こす細胞膜への損傷が避けられるような方法で、細胞膜を経由して細胞内部に液体を導入するために放出され得る。別の実施形態において、液体の噴流または小滴は、細胞の表面と、噴出された流体またはその内容物の一部との間の密な接触または急速な接近を発生するように放出され得る。本プロセスは、材料を細胞に送達するか、または問題の材料の、特定の細胞の直近傍への局在化を達成し得る。

本発明の別の局面において、流体インジェクションデバイスは、第１の経路に沿って材料を運搬するように構成および配置されるチャネルと、液体の噴流または小滴を、ノズルの出口から該チャネル内に放出方向に放出するように構成および配置されるノズルと、液体を保持し、かつノズルと流体的に接続する貯蔵容器と、ノズルに液体の噴流または小滴を出口から放出させるために、貯蔵容器中に圧力勾配を形成するように適合される圧力発生器と、を備える。圧力発生器、例えば圧電素子は、初めに放出方向に対して横方向に動く圧力波を、貯蔵容器内に生成し得る。

本発明の別の局面において、マイクロ流体デバイスは、基板と、基板に形成され、かつ流路に沿って液体を導くように構成および配置される流体チャネルと、基板に形成され、かつ電極部分と接続する少なくとも１つの導電材料貯蔵容器を有する電極チャネルと、を含む。電極チャネルの電極部分は、例えば、電極部分内の電極が流体チャネル内の電気特性を検出できるように、流体チャネルと流体的に接続し得る。一実施形態において、電極部分は、導電材料が液体状態のときに電極チャネルから流体チャネルに流入することを防ぐように配置されるが、しかし、電極チャネルと流体チャネルとの間の流体的および電気的接続を可能にするように構成され得る通路を介して、流体チャネルと接続し得る。この実施形態に従って、融解したはんだ等の液体材料を貯蔵容器から電極部分に流し込むことによって、電極が電極チャネル内に形成され得るが、しかし、通路は液体材料の流体チャネルへの流入を防ぎ得る。かくして、電極は、流体チャネルと（通路を介して）接続するが、しかし、流体チャネルの流量特性に干渉しないように形成され得る。

本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の発明を実施するための形態、および請求項から明らかとなる。

図１は、例示的な実施形態におけるインジェクションシステムの概略ブロック図を示す。図２は、例示的な実施形態におけるインジェクションシステムの正面図を示す。図３は、図２の実施形態の側面図を示す。図４は、例示的な実施形態における、付随する電極チャネルを有するマイクロ流体チャネルの平面図を示す。図５は、図４の付随する電極チャネルを有するマイクロ流体チャネルの拡大図を示す。図６は、別の例示的な実施形態における、マイクロ流体チャネルおよび付随する電極チャネルの図を示す。

本発明の局面が、インジェクションデバイスおよびマイクロ流体デバイスの例示的な実施形態を参照して以下に説明される。本発明の局面は、本明細書において説明される例示的な実施形態に限定されず、任意の好適な様式で実施され得ることが理解されるべきである。さらに、本発明の局面は、任意の好適な互いの組み合わせで、および／または単独で使用され得る。

図１は、本発明の様々な局面を組み込んだインジェクションシステムの概略図を示す。本実施形態において、インジェクションシステム１００は、複数のインジェクションデバイス１０を操作して、インジェクションデバイス１０のノズル３を通過した液体の流れを導くように配置されるそれぞれのチャネル５に、液体の噴流または小滴を導入するように配置される。チャネル５は、任意の好適な様式で配置され得、任意の好適な材料を運搬し得るが、本例示的な実施形態においては、チャネル５は、約１５ミクロン×１５ミクロンの断面サイズを有し、複数の細胞５１を含む液体の流れを導く。（結晶化またはナノ粒子合成または小滴生成の分野における用途では、インジェクションデバイスに使用されるチャネルまたは他の配置の断面は、数平方ミリメートル程度であり得る。）本実施形態におけるチャネル５は、細胞５１がチャネル５を一時に１つのみ通過できるように、すなわち、細胞５１が順番にノズル３に隣接し得るように配置される。そのようなチャネル５の動作および配置は、当該分野では周知であり、本明細書においてはこれ以上詳細に説明されない。しかしながら、本発明の局面は、チャネル５の配置および／またはその中に含有される材料に必ずしも限定されないことが理解されるべきである。

本発明の一局面に従って、インジェクションデバイス１０は、液体の噴流または小滴を、細胞５１のそれぞれに導入するように操作され得る（例えば、液体が、溶液、懸濁された固体、またはその他を問わず、標識化合物、薬剤、または他の好適な材料を含む場合）。本実施形態において、インジェクションデバイス１０は、細胞５１の死を引き起こす細胞膜への損傷が避けられるような方法で、細胞５１の膜を経由して細胞内部に液体を導入し得る。液体が導入されるときに、細胞５１は必ずしも「生きている」必要はないことが理解されるべきである。その代わりに、細胞５１は、死んでいても、他の「生きていない」状態であってもよいが、その細胞膜は無傷である。従って、死んでいるか生きているかを問わず、細胞への液体の導入は、細胞膜が液体により穿刺されるものの、細胞（生きている場合）の死を引き起こす細胞膜への損傷が避けられるような方法で行われ得る。

本発明のこの局面は、液体が細胞膜を貫通し得るものの、細胞死を引き起こす膜への損傷を引き起こさない液体の噴流または小滴を形成する能力を有さないマイクロ流体噴流または小滴デバイスを超える、大きな進歩である。以下により詳細に説明されるように、本発明者らは、２０ミクロン未満の直径を有するノズル３から、約０ｍ／秒から４０ｍ／秒までの間の速度で放出され、約１フェムトリットルから数ピコリットルまでの間の体積を有する液体の噴流または小滴が、好適な様式で細胞内に液体を導入するために有効であり得ることを発見した。

本実施形態において、複数のインジェクションデバイス１０は、制御器１０１の制御下で動作し、制御器１０１は、１つ以上の汎用コンピュータ、コンピュータのネットワーク、データ処理機能を実行するための１つ以上のマイクロプロセッサ等、データおよび／または操作命令を格納するためのメモリ、有線または無線通信のための通信バスあるいは他の通信デバイス、ソフトウェアまたは他のコンピュータで実行可能な命令、電力供給または他の電源（例えば電気コンセントに適合するプラグ等）、リレー、機械的連結部、１つ以上のセンサまたはデータ入力デバイス、ユーザデータ入力デバイス（例えば、ボタン、タッチスクリーン、またはその他）、情報表示デバイス（例えば、ＬＣＤディスプレイ、表示灯、プリンタ、等）、ならびに／あるいは、所望の入力／出力および制御機能を提供するための他の構成要素を含み得る。制御器１０１はまた、ポンプまたはチャネル５を通過する流れを制御する他のデバイス等、システム１００の他の機能を制御し得る。

本実施形態において、制御器１０１は、１つ以上のセンサ１０２から、チャネル５内の細胞５１の存在、その移動速度、および／または他の特性に関する情報を受信する。センサ１０２は、任意の好適な形態をとり得るが、しかし本実施例では、チャネル５の中の局所的な状況に関する電気容量および／または抵抗の情報（センサ１０２の近くの細胞５１の存在／不在を示すことができる）を提供する、１つ以上の電極を含む。使用可能な他のセンサの種類は、（例えば、カメラまたは他の画像感知デバイスを使用して）チャネル５の１つ以上の部分を画像化し、例えば、細胞５１の位置および／または速度を特定する適切なソフトウェアを使用して、画像の分析を実施するための画像分析デバイスを含む。別のセンサ手法は、細胞５１およびその周りの流体の光散乱または他の光学特性を分析する光学的方法を含み得る。この手法では、（例えば、導波管によって）光がチャネル５内の選択された場所に導かれ、細胞５１によって散乱された光が分析される。この技術は、現在、一部の生物学的システム（蛍光活性化細胞分類等）において使用されており、しばしば、抗体または細胞特異的な染料を使用した細胞の蛍光標識と組み合わされる。細胞の不均一集団においては、標識は、異なる特性を有する細胞５１ごとに異なり得る（例えば、異なる細胞は異なる抗体と結合し、異なる蛍光特性を取得し得る）。したがって、システム１００は、この種類の標識を使用して、チャネル５を通じて提供される細胞の不均一集団内で、インジェクションされるべき標的細胞のサブセットの選択を可能にすることができる。すなわち、センサ１０２は、材料をインジェクションされるべき細胞５１と、インジェクションされるべきではない細胞５１とを特定し、それに従ってインジェクションデバイス１０を制御し得る。

細胞の位置および／または速度情報に基づいて、制御器１０１はインジェクションデバイス１０を制御し得、細胞５１がノズル３に対して好適な位置にあるときに液体の好適な噴流または小滴を放出し、それによって液体を細胞５１内に導入する。インジェクションデバイス１０は、ノズル３に続く貯蔵容器２を有する本体１を含み得る。貯蔵容器２は、好適な液体、例えば、核酸（例えば遺伝子片、ＲＮＡ分子）、タンパク質（例えば、抗体、生体外合成ペプチド）、脂質、炭水化物、薬物分子、または他の問題の化合物もしくは構造等、１つ以上の化合物を含む溶液で満たされ得る。一実施形態において、貯蔵容器２は、例えば、ガスで満たされた空隙が存在しないように、液体で完全に満たされ得る。圧力発生器４は、貯蔵容器２内に圧力勾配を導入するために、貯蔵容器２に付随し得る。本実施形態において、圧力発生器４は、貯蔵容器２の体積を効果的に変化させるか、さもなくば貯蔵容器２内に圧力変化または圧力波を導入するために十分な動きを示すことができる、１つ以上の圧電素子を含む。

圧力発生器４が作動すると、貯蔵容器２に含有される流体が加圧され（および／または好適な圧力波が生成され）、ノズル３から排出され得、例えば、ノズル３はミクロンサイズの孔を含み得、その結果として、高速噴流が生成され得る。インジェクションデバイス１０は、所望の動作に応じて流体の噴流または小滴を形成し得る。生成される噴流または小滴は、直径がミクロンサイズ（または他の寸法）であり得、噴流および／または小滴の排出体積および速度は、例えば、圧力発生器が作動する時間の長さおよび／または貯蔵容器２内で圧力が生成される様式を変えることによって、変更され得る。インジェクションデバイス１０によって生成される噴流は、約０ｍ／秒と約４０ｍ／秒との間の速度を有し得る。噴流および／または小滴の排出体積は、フェムトリットルから数ピコリットル以上までの範囲内であり得る。このサイズ／速度／体積の範囲内の噴流／小滴は、細胞死につながる細胞膜への損傷をもたらすことなく、細胞への液体の導入に効果的であることが判明している。例えば、一実験において、細胞内部と接触するときにのみ蛍光を発する（したがって、染料の蛍光発光により、細胞内部への染料の導入が成功したかどうかを示す）染料が細胞に注入された。実験の結果は成功であり、高倍の光学顕微鏡法によって評価されたように、細胞構造を改変することなく、細胞内部への染料の安定した導入が得られた。実験は、１５０ｍＭＮ−メチル−Ｄ−グルタミン（ＮＭＤＧ）クロライド、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１０ｍＭグルコース（ｐＨはＨＣｌにより７．４に調整され、オスモル濃度は２９５ｍＯｓｍに調整された）の中に懸濁されたＨｅｌａ細胞の使用を含んだ。懸濁された細胞はインジェクションデバイスの中に流入され、約６ｍ／ｓの速度を有する噴流を使用して注入された。注入された溶液は、上述の緩衝液に溶解された１００マイクロモルのカリウム標識ＰＢＦＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であった。

インジェクションデバイス１０は、図示されるように、マイクロ流体チャネル５内の細胞５１の中に噴流または小滴を放出し得るが、デバイス１０は、任意の液体または気体の環境の中に液体を導入するために使用され得る。例えば、インジェクションデバイス１０は、液体試料をマイクロウェルプレートまたは他の試料ホルダに堆積するためや、液体試料を結晶化媒体の中に導入するため等、他の目的のために噴流または小滴を堆積するために使用され得ることが理解される。さらに、噴流は、望ましい場合には、細胞死を引き起こすために十分大きな噴流の速度を使用して、細胞を選択的に死滅させるために使用され得る。

図２および図３は、それぞれ、本発明に従ったインジェクションデバイス１０の例示的な実施形態の、正面図および側面図を示す。この例示的な実施形態において、インジェクションデバイス１０は、互いに接合される第１の部分１ａおよび第２の部分１ｂを有する本体１を含み、それらは、例えば、それぞれアルミニウム、ステンレス鋼、または他の好適な材料（単数または複数）で作製され、ネジ、接着剤、または他のファスナーによって取り付けられる。圧電素子４は、第１の部分１ａに装着され、例えば、柔軟シリコーンゴム、金属、または他の好適な材料のシート等の膜８によって、貯蔵容器２から隔てられる。圧力センサ１１は、第２の部分１ｂに装着され、貯蔵容器２内の圧力を感知するように配置され、例えば、制御器１０１によるデバイス１０の制御に使用される。図３に見られるように、１対のライン７が貯蔵容器２と接続し、例えば、流体がノズル３から放出された後に、流体を貯蔵容器２に提供し、例えば、空気溜りを除去または貯蔵容器２に呼び水を差すために貯蔵容器２を洗浄するときに、貯蔵容器２からの流体の流出を可能にする。弁７１は、ライン７を開閉し得、流体源および／または廃棄物貯蔵容器（図示せず）と接続し得る。例えば、貯蔵容器２の充填および貯蔵容器２からの空気または他の気体の排除を確実にするために、一方のライン７の中に、また他方のライン７から外に流れが提供され得る。ライン７およびノズル３は、例えば、機械加工、リソグラフィ、または他の任意の好適な技術によって、第２の部分１ｂに形成され得る。代替案として、ノズル３は、別個の部分として形成され、次いで、第１および第２の部分１ａおよび１ｂに適切な位置に固定され得る。これは、例えば、２０ミクロン程度以下の微小オリフィスの形成を必要とし得る、ノズル３のより容易な製造を可能にし得る。

本発明の一局面に従って、圧力発生器（この場合、圧電素子を含む）は、初めにノズルが液体の噴流または小滴を放出する方向に対して横方向に配向する圧力波または圧力勾配を形成する。すなわち、この例示的な実施形態では、圧電素子４は、初めに、図２に見られる左から右の方向に、貯蔵容器２内の液体を移動させるように動作する。しかしながら、この圧力勾配は、ノズル３に、図２に見られる上から下の方向に、液体の噴流または小滴を放出させる。そのような配置は、デバイスサイズの縮小、製造上の複雑性の低減、および／または、例えばセンサ１１による、貯蔵容器２内の圧力特性のより効果的なセンシング等の利点を提供し得る。この実施形態では、圧力発生器は、初めに、ノズル放出方向に対して垂直な方向に配向する圧力波または圧力勾配を形成するが、圧力波の最初の方向は、ノズル放出方向に対して０度と９０度との間の他の横方向に配置され得る。

この実施形態において、インジェクションデバイス１０には、液体材料が細胞内に導入され得るように、ノズル３の近傍に細胞または他の対象を運搬するために使用される、少なくとも１つのマイクロ流体チャネル（図１の実施形態におけるチャネル５のような）を有するプレート６が付随する。そのようなプレート６は、例えば、当該分野で公知のマイクロ流体チップを形成するために使用される技術および材料を使用して、任意の好適な材料と任意の好適な方法で形成され得る。ノズル３がチャネル５またはプレート６の他の機能に対して好適に配置されるように、プレート６は、例えば、エポキシを使用して、デバイス１０に好適に封着され得る。はんだ付けまたは圧着または真空等の他の種類の接着剤または結合技術が、プレート６とデバイス１０とを接合するために使用され得る。当然ながら、プレート６は、ポンプ、貯蔵容器、弁、粒子検出器、材料選択機能（例えば、細胞誘導器、または細胞を相互に選択的に分類することができる他のデバイス）、などの、任意の好適な機能を含み得ることが理解される。この実施形態において、インジェクションデバイス１０は、プレート６とは別個に作製されるが、インジェクションデバイス１０およびプレート６は、チャネル５を含んで、例えば、同じチップまたは他の基板に作製される等、一体として作製され得ることが理解されるべきである。加工技術は、特定の設計に従って様々であり、ＭＥＭＳ（微小電気機械システム）加工技術を含み得る。例えば、インジェクションデバイス１０の部分、例えば、貯蔵容器２、ノズル３、等は、基板に組み込まれる圧電素子のような他の構成要素と共に、好適な基板（シリコン等）にエッチングされるか、または他の方法で形成され得る。１つ以上のチャネル５がまた、基板に形成され得、それによって、例えば、試験または他の処理のために一回使用された後に廃棄され得る、単一デバイスを形成し得る。

この例示的な実施形態において、ノズル３の一部は、第２の部分１ｂから別個に形成され、後に第２の部分１ｂに取り付けられる、末端ノズル部分（プレート６に最も近い部分）を含む。この実施形態における末端ノズル部分を形成するために、例えば、深掘り反応性イオンエッチングによる標準的なマイクロマシニング技術によって、ミクロンサイズの孔がシリコン基板にエッチングされた。

この実施形態において、貯蔵容器２は、約８ｍｍの直径（他の実施形態において、直径は、約２〜３ｍｍから約１５〜２０ｍｍ以上までの範囲内にあり得る）、および約１ｍｍの深さ（図２の左から右への方向の寸法）を有するが、特定の実験に対してどれ程の流体が蓄えられるべきかに依存して、約１００ミクロンから数ｍｍまでの間であり得る。大きな貯蔵容器体積は、コンプライアンスを形成し得（正しい設計のために液体は圧縮性であるとみなされる）、それ故に望ましくない可能性がある。貯蔵容器体積は、約０．００１ｍｌから１〜２ｍｌまでの範囲をとり得、この実施形態では、体積は約０．１ｍｌである。当然ながら、必要に応じて様々な寸法が調整され得る。

この実施形態において、圧力発生器は、それぞれ約２０ミクロンの変位量と、約１８ｍｍの厚さおよび５ｍｍ四方の外部寸法とを有する、いくつかの圧電素子を含む。しかしながら、圧電素子は、異なる寸法および／または変位距離、例えば、５〜１５０ミクロンの変位を有し得る。この実施形態における膜は、薄い金属シートにより形成される。ノズル３は、貯蔵容器２に最近傍の末端では、約５００ミクロンの内径および数ミリメートルの長さの、本体１に固定される第１の部分を有する。ノズルは、プレート６に向かって、直径約１００ミクロン、長さ約６３０ミクロンにまで狭まる。ノズル３は、終端部に向かって再び狭まり、ノズル３の出口側では直径約４ミクロン、長さ約７０ミクロンとなる。入口側での大きな孔の使用は、圧力降下を制限するという利点を有し得るが、決定的ではなく、一定の直径またはその他の配置の貫通孔がまた使用され得る。この実施形態では、出口におけるノズルのサイズは約４ミクロンであるが、例えば、０．０５ミクロンから２０ミクロンまでの範囲の、他の出口サイズを有するノズルが、他の実施形態において使用され得る。

使用時には、インジェクションデバイス１０は、噴流の速度に応じて、約１マイクロ秒から数ミリ秒までの持続時間を有する噴流を形成し得る。噴流の速度および／または持続時間を変更することは、噴流の排出体積を調整することを可能とする。異なる細胞の種類は、非常に異なる機械的挙動を有し得るために、細胞を穿刺するために使用される噴流速度は、細胞の種類に応じて変動し得る。

この例示的実施形態の構築のために、特定の材料、サイズ、および他の機能が、加工の容易性の理由から選択された。しかしながら、インジェクションデバイスを加工するために、他の材料（例えば、他の金属、および／または、例えば、拡張可能で安価なポリマーマイクロ加工技術を使用した、ポリマー）が使用され得る。一部の実施形態では、貯蔵容器２で使用される流体との化学的適合性の必要性、および／または、圧電アクチュエータもしくは他の圧力発生器によって生成される圧力波の減衰を避けるための十分な機械的剛性、および／または、液体が注入される対象（例えば、細胞等）への損傷に基づいて、材料が選択され得る。滅菌可能なポリマーの使用は、生物学関連用途のための安価な単一回使用型の試料取扱システムの開発を可能とする。（圧電式アクチュエータは、性能を失うことなく、使い捨てのポリマー薄膜によって貯蔵容器から分離され得る。）
デバイスの加工は、他の方法によっても同様に実行され得る。例えば、デバイスは、マイクロ加工技術のみを使用して、または、上述の実施形態のように、マクロ加工（例えば、標準的な機械工場の技術および道具等）とマイクロ加工技術（例えば、微小部品に対するフォトリソグラフィ、レーザアブレーション、および／もしくは化学エッチング等）とを組み合わせて、加工され得る。

上述のように、本発明の局面に従った実施形態は、上述されていない他の特徴を含み得る。例えば、マイクロ加工されたチップの流体操作能力を高めるために、弁が含まれて、プレート６のチャネル５の流体設計が変更され得る。

本発明の一局面によれば、プレートまたは他の基板は、流路に沿って液体を導くための流体チャネル（チャネル５等）と、流体チャネルと流体的および電気的に接続する電極チャネルとを含み得る。電極チャネルは、流体チャネル内の電気的特性、例えば、流体チャネル内の電気容量および／または抵抗を検出するための電極として機能する、はんだまたは他の金属等の導電材料を含み得る。上述のように、そのような特性は、チャネル５内の細胞５１または他の材料の存在／不在を検出するうえで、センサ１０２によって利用され得る。電極チャネルは、流体チャネルと流体的および電気的に接続する電極チャネルの部分である、電極部分と接続する導電材料貯蔵容器を含み得る。一実施形態において、電極チャネルの電極部分は、通路を介して流体チャネルと接続し得、その通路は、電極を形成するために使用される液体状の導電材料、例えば溶融したはんだが、導電材料貯蔵容器から電極部分に流入するときに、通路を通過して流れないようにサイズ設定される。したがって、導電性電極は、流体チャネルの流体流量特性に影響を与える危険性がほとんどない／全くない状態で、電極チャネルに形成され得る。本発明のこの局面は、流体チャネルと接続する電極のより容易な製造を可能にし得、それは一部には、チャネル５内の流れを損なうか、または他の様式で影響する危険性を最小限に留めながら、効果的な電極が提供され得ることによる。

図４は、例えば、上述の図１の実施形態で説明されるものと類似の、流体チャネル５を含むプレート６または他の基板の一部分の上面図を示す。流体チャネル５は、図４の上から下に延在して示されており、例えば、１つ以上の細胞５１および／または他の材料を含む液体等の、液体の流れを導くように構成され得る。１対の電極チャネル９がまた示されており、電極チャネル９はそれぞれ、電極部分９２によって接続される電極チャネル９の末端に、導電材料貯蔵容器９１を含む。この実施形態では、２つの導電材料貯蔵容器９１が各電極チャネル９に含まれているが、他の実施形態では、１つの貯蔵容器９１のみが含まれ得る。この実施形態において、１対の電極チャネル９は、電極部分９２にはんだ等の導電材料を含み得、その結果として、チャネル５の両側の、電極部分９２がチャネル５に隣接する場所に、電極が形成される。電極を形成するときには、はんだまたは他の好適な材料が、（液体状か固体状かを問わず）貯蔵容器９１の１つに提供され得、液体導電材料は、貯蔵容器９１から電極部分９２に流入する。第２の貯蔵容器９１が提供される場合には、導電材料は、電極部分９２を通過して第２の貯蔵容器９１に流入し得、完全な電極形成を確保する。

図５は、図４の実施形態の電極部分９２の、電極部分９２がチャネル５に隣接する位置における拡大図を示す。この図において、電極部分９２の１つ（左側の）は、電極チャネル９の電極部分９２内に導電材料（この場合、はんだ）を有する。この図の右側の電極部分９２は、まだ導電材料がその中に置かれていないが、通路９３が形成されている。本発明の一局面に従って、通路９３は、導電材料が電極部分９２に流入する前に、電極部分９２とチャネル５との間に形成される。しかしながら、通路９３は、液体導電材料（例えば、溶融はんだ等）が通路９３を通ってチャネル５に流入しないように構成され、例えばそれは、通路９３のサイズまたは他の特徴が、液体導電材料が流れることを防ぐからである。例えば、通路９３は、液体導電材料の表面での表面張力が、通路９３への材料の流入を防ぐようにサイズ設定され得る。その結果として、電極が形成されるときに電極材料をチャネル５に流入させる危険性がほとんどないか、または全くない状態で、通路９３を介してチャネル５と流体的および電気的に接続する電極が形成され得る。この実施形態において、電極部分９２は、約６０ミクロン×約１５ミクロンのサイズを有し、通路９３は、約１０ミクロン×約１５ミクロンのサイズを有するが、他のサイズおよび構成が可能である。

上記実施形態では、電極部分９２が、チャネル５の流路に対して横方向に、導電材料貯蔵容器９１から流体チャネルに向かって、電極チャネルが流体チャネルに隣接する位置にまで延在し、次いで、流体チャネルから離れる方向に延在するように、電極部分９２は配置されているが、電極部分９２は他の方法で配置され得る。例えば、図６は、電極部分９２がチャネル５に対して横方向に延在し、チャネル５に隣接する位置で終端する実施形態を示す。（この図では、下方の電極部分９２は導電材料を含み、しかるに、上方の電極部分９２は導電材料を含まない。）
（本発明の局面に従った実施形態の見込まれる利点と用途）
高処理量の定量的単細胞マイクロインジェクションが、少なくとも以下の領域において使用され得、新たな可能性と先端的分野とを開く。

（ゲノム科学）
・病気を治療するために細胞への遺伝子挿入を含む遺伝子療法。本発明の局面に従った実施形態は、細胞内に遺伝子を送達するための迅速で効果的な手法を提供し得、血液の病気（白血病等）に対する療法や、（癌治療のための）樹枝状細胞ベース免疫療法等の、ある種の遺伝子療法を可能とし得る。
・「困難な」細胞株のトランスフェクションのための、細胞内へのＤＮＡ送達
・非常に大きなＤＮＡ分子（潜在的にはさらに全染色体）のトランスフェクションのための、細胞内へのＤＮＡ送達
・異なる条件下での対象遺伝子の発現レベルを研究する（プロモータにおける配列を変えて、それが生体内の遺伝子発現にどのように影響するかを観察する）ための、既知量の遺伝子コンストラクトの細胞内への送達
・より容易な／より効率的な安定トランスフェクション、相同体組み換え、および部位特異的変異誘発を達成するための、既知量のＤＮＡ配列、およびＤＮＡ組み換えを促進する既知量の酵素の送達
（ＲＮＡおよびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ））
・より効率的／容易なＲＮＡｉ（マイクロインジェクションベースのＲＮＡｉ）のための、既知量のＲＮＡの送達
・リポソームを必要としないＲＮＡサイレンシングのための、細胞内へのＲＮＡの送達（リポソームによる細胞の治療は、膜組成を変え、カルシウム依存信号カスケードの活性を改変し、遺伝子発現実験において数多くの偏りを導入する）
・各実験に使用されるコンストラクトの量を減少させるための、ＲＮＡ干渉のための既知量のＲＮＡコンストラクトの、細胞内への効率的な送達（ＲＮＡ干渉に使用されるＲＮＡコンストラクトは非常に高価である）
・複数の細胞株にわたり、かつ異なる条件下での、標準化された効率的なＲＮＡｉを達成するための、既知量のＲＮＡ分子および既知量のＤｉｃｅｒ分子の送達
・転写後レベルでの遺伝子発現規則の一部の局面を研究するための、既知量のｍＲＮＡの細胞内への送達（現在では、この種の研究は不可能か、または極めて困難である）
・ＲＮＡの半減期を生体内で研究するための、既知量の標識ＲＮＡの送達
（プロテオミクス）
・プロテオミクス、つまり細胞タンパク質機能の研究は、現在、タンパク質を生細胞の中に直接送達することが困難であることから停滞している。現在の方法は、細胞を死滅させるかまたは遺伝子操作すること無しに、またアーチファクト生成の危険を冒すこと無しに、タンパク質の動力学、局在化、相互作用、および発現を研究することを困難にしている。
・半減期を生体内で研究するための、既知量の標識タンパク質の送達
・タンパク質局在化の生体内研究を行うための、標識タンパク質の送達
・タンパク質の過剰発現を必要とせずに、生体内でのその効果を研究するための、既知量のタンパク質の送達（タンパク質の過剰発現は、細胞内でどれ程のタンパク質が発現したかに関する情報を提供しない。タンパク質が過剰発現すると、滴定が不可能となり、したがって、結果はしばしば定性的となる）
・過剰発現を必要とせずに、生体内での他のタンパク質との相互作用を研究するための、既知量の標識タンパク質の送達
・生体内免疫染色および生体内蛍光ベースウエスタンブロット法のための、生細胞の中への標識抗体の送達
・細胞膜を通したナノ粒子の送達
（創薬）
・細胞膜を通した既知量の薬剤の送達。本用途は、創薬および薬剤開発に極めて有用である
（療法）
・循環血液の特定のサブセットへの、薬物の細胞内送達
（細胞冷凍保存）
・細胞、特に卵母細胞の冷凍保存を改善するための、細胞の中への糖の高処理量マイクロインジェクション
（幹細胞およびトランスジェニック生物）
・トランスジェニック幹細胞株の開発のための、胚幹細胞の中へのＤＮＡおよび／またはＤＮＡ＋組換え酵素の送達
・トランスジェニック生物の開発のための、接合体の中へのＤＮＡおよび／またはＤＮＡ＋組換え酵素の送達
（マイクロ流体システムにおける結晶化）
結晶化は、様々な結晶化条件下での複数回の試行の後に達成される、困難なプロセスであり、反応条件に極めて依存する。現在、結晶化条件のスクリーニングの低い処理量および結晶化条件の厳密な制御の困難さが、その分野を停滞させている。さらに、現在の結晶化プロトコルは、大量の試薬を使用する。本発明のある特定の実施形態を用いて、ある溶液のピコリットルサイズの小滴を他の溶液に送達することが可能となる。例えば、結晶化を開始するために、逆溶剤中に小滴を注入することによって、または冷却された液体中に温かい小滴を注入することによって、結晶化を実施することができる。

（化学／化学工業）
・マイクロ粒子加工
・ピコおよびサブピコ小滴生成
様々な例示的実施形態を参照して、本発明の局面が説明されてきたが、本発明は、説明された実施形態に限定されない。このように、説明された実施形態の多くの代替形態、修正形態、および変形形態が、当業者に明らかであることは明白である。したがって、本明細書に記載された本発明の実施形態は、例示を意図するものであり、限定を意図しない。本発明から逸脱することなく、様々な変更が行われ得る。

Claims

第１の経路に沿って材料を運搬するように構成および配置される、マイクロ流体チャネルと、
ノズルの出口から該チャネル内に、流体の噴流または小滴を放出方向に放出するように構成および配置される、ノズルと、
液体を保持し、かつ該ノズルと流体的に接続する、貯蔵容器と、
該ノズルに、液体の該噴流または小滴を該出口から放出させるために、該貯蔵容器内に圧力勾配を形成するように適合される、圧力発生器と、
を備える、マイクロ流体インジェクションデバイス。
前記圧力発生器は、初めに前記放出方向に対して横方向に動く圧力波を前記貯蔵容器内に生成する、請求項１に記載のデバイス。
前記圧力発生器と前記貯蔵容器との間に位置する可撓膜をさらに備える、請求項１に記載のデバイスであって、
該圧力発生器は圧電素子を含む、
デバイス。
前記デバイスは、約０ｍ／秒から約４０ｍ／秒までの速度で、前記ノズルから噴流を放出するように配置され、該ノズルは２０ミクロン未満の直径を有する、請求項１に記載のデバイス。
前記チャネル内の標的の存在を検出するために配置される、該チャネルに付随する検出器をさらに備える、請求項１に記載のデバイス。
前記デバイスは、細胞死を引き起こす細胞膜への損傷を避けて細胞内部への液体の導入が達成されるように、該細胞膜を経由して該細胞内部に該液体を導入するために、前記ノズルから液体の噴流を生成するように配置される、請求項１に記載のデバイス。
前記デバイスは、マイクロ／ナノ粒子の合成または結晶化に適した液体の噴流または小滴を生成するように配置される、請求項１に記載のデバイス。
前記デバイスは、前記液体中に存在する材料が、前記細胞膜を穿刺することなく該細胞膜に衝突するように、前記チャネル内に位置する細胞に向けて該液体を動かすために、前記ノズルから液体の噴流を生成するように配置される、請求項１に記載のデバイス。
前記液体中の前記材料は、粒子、リポソーム、張力活性剤、化学薬品、染料または抗体のうちの１つ以上を含む、請求項８に記載のデバイス。
細胞内に材料を導入する方法であって、
ノズルの出口付近の位置に細胞を提供するステップであって、該細胞は、細胞膜および該細胞膜に囲まれた細胞内部を有する、ステップと、
流体を含有し、かつ該ノズルと流体的に接続する、貯蔵容器を提供するステップと、
該貯蔵容器内の流体を該ノズルに向けて押し動かすために、該貯蔵容器内に圧力勾配を生成するステップと、
該材料を含む液体を、該細胞膜を経由して該細胞内部に導入するために、該材料を含む液体の噴流を該ノズルから生成するステップであって、該細胞内部への該液体の導入は、細胞死を引き起こす該細胞膜への損傷を避けるように達成される、ステップと、
を包含する、方法。
前記液体中に存在する材料が前記細胞膜を穿刺することなく該細胞膜に衝突するように、前記ノズルから液体の噴流または小滴を生成するステップをさらに包含する、請求項１０に記載の方法。
圧力勾配を生成する前記ステップは、前記貯蔵容器内の流体を動かすために圧電素子を操作するステップを包含する、請求項１０に記載の方法。
前記材料は、リポソーム、張力活性剤、化学薬品、粒子、化学薬品、染料または抗体を含む、請求項１０に記載の方法。
前記ノズルから生成される液体の前記噴流は、約０ｍ／秒から約４０ｍ／秒までの速度を有する、請求項１０に記載の方法。
前記細胞内部に導入される液体の量は、約１フェムトリットルから数ピコリットルまでの体積を有する、請求項１０に記載の方法。
細胞を提供する前記ステップは、前記ノズルと流体的に接続するチャネルに沿って該細胞を動かすステップを含む、請求項１０に記載の方法。
第１の経路に沿って細胞を運搬するように構成および配置されるチャネルであって、該細胞は、細胞膜および細胞内部を有する、チャネルと、
出口から該チャネル内に、液体の噴流または小滴を放出方向に放出するように構成および配置される、ノズルと、
液体を保持し、かつ該ノズルと流体的に接続する、貯蔵容器と、
該ノズルに、液体の該噴流または小滴を該出口から放出させるために、該貯蔵容器内に圧力勾配を形成するように適合される、圧力発生器と、
を備える、流体インジェクションデバイスであって、
該細胞膜を経由して該細胞内部に該液体を導入するために、液体の該噴流または小滴が放出され、該細胞内部への該液体の導入は、細胞死を引き起こす該細胞膜への損傷を避けるように達成される、
デバイス。
前記圧力発生器は、初めに前記放出方向に対して横方向に動く圧力波を前記貯蔵容器内に生成する、請求項１７に記載のデバイス。
前記圧力発生器と前記貯蔵容器との間に位置する可撓膜をさらに備える、請求項１７に記載のデバイス。
前記圧力発生器は圧電素子を含む、請求項１７に記載のデバイス。
前記デバイスは、約０ｍ／秒から約４０ｍ／秒までの速度で前記ノズルから噴流を放出するように配置される、請求項１７に記載のデバイス。
前記細胞内部に導入される液体の量は、約１フェムトリットルから数ピコリットルまでの体積を有する、請求項１７に記載のデバイス。
前記デバイスは、前記液体中に存在する材料が、前記細胞膜を穿刺することなく該細胞膜に衝突するように、該流体を細胞に向けて加速するために、液体の噴流を前記ノズルから生成するように配置される、請求項１７に記載のデバイス。
液体の噴流または小滴が、リポソーム、張力活性剤、化学薬品、粒子、化学薬品、染料または抗体を含む、請求項２５に記載のデバイス。
基板と、
該基板に形成され、かつ流路に沿って液体を導くように構成および配置される、流体チャネルと、
該基板に形成され、かつ電極部分と接続する少なくとも１つの導電材料貯蔵容器を有する電極チャネルであって、該電極チャネルの該電極部分は、該流体チャネルと流体的に接続する、電極チャネルと、
を備える、マイクロ流体デバイス。
液体状の導電材料が前記電極チャネルから前記流体チャネルに流入することを防ぐように、かつ該電極チャネルと該流体チャネルとの間の流体的および電気的接続を許容するように配置される通路を介して、該電極チャネルの前記電極部分が該流体チャネルと接続する、請求項２５に記載のデバイス。
前記電極チャネルは、前記流路に対して横方向に、前記導電材料貯蔵容器から前記流体チャネルに向かって、該電極チャネルが該流体チャネルに隣接する位置にまで延在し、かつ該位置から、該流体チャネルから離れるように延在する、請求項２５に記載のデバイス。
前記電極チャネルは前記流体チャネルに隣接する位置に通路をさらに備える、請求項２７に記載のデバイスであって、該通路は、該電極チャネルと該流体チャネルとの間の流体的および電気的接続を可能にする、デバイス。
前記電極チャネル内の導電材料をさらに備える、請求項２５に記載のデバイス。
前記電極チャネル内の前記導電材料は、前記流体チャネル内の抵抗の変化を検出するように適合される電極を形成する、請求項２９に記載のデバイス。
前記電極は、前記流体チャネル内の細胞の存在を検出するように適合される、請求項３０に記載のデバイス。
基板を提供するステップと、
流路に沿って液体を導くように構成および配置される流体チャネルを、該基板に形成するステップと、
電極部分と接続する少なくとも１つの導電材料貯蔵容器を有する電極チャネルを、該基板に形成するステップであって、該電極チャネルの該電極部分は、該流体チャネルと流体的に接続する、ステップと、
該導電材料貯蔵容器に導電材料を提供するステップと、
液体状の該導電材料を、該導電材料貯蔵容器から該電極部分の中に、該電極チャネルが該流体チャネルと流体的に接続する位置にまで、流入させるステップと、
を包含する、マイクロ流体デバイスを形成する方法。
前記流体チャネルと前記電極チャネルとの間に通路を形成するステップであって、該通路は、液体導電材料が該電極チャネルから該流体チャネルに流入することを防ぐように配置され、かつ該電極チャネルと該流体チャネルとの間の流体的および電気的接続を可能とするように配置される、ステップをさらに包含する、請求項３２に記載の方法。
前記電極チャネルは、前記流路に対して横方向に、前記導電材料貯蔵容器から前記流体チャネルに向かって、該電極チャネルが該流体チャネルに隣接する位置にまで延在し、かつ該位置から、該流体チャネルから離れるように延在する、請求項３２に記載の方法。
前記電極チャネルが前記流体チャネルに隣接する位置に通路を提供するステップをさらに包含する、請求項３４に記載の方法であって、該通路は、該電極チャネルと該流体チャネルとの間の流体的および電気的接続を可能にするが、液体導電材料が該電極チャネルから該流体チャネルに流入することを防ぐように配置される、方法。
前記電極チャネル内の前記導電材料は、前記流体チャネル内の抵抗の変化を検出するように適合される電極を形成する、請求項３２に記載の方法。
前記電極は、前記流体チャネル内の細胞の存在を検出するように適合される、請求項３６に記載の方法。