JP2010500921A - マイクロ流体インジェクションのための方法と装置 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国予備特許出願第60/838,303号(2007年8月17日出願)の利益を主張し、該予備特許出願は、その全体が本明細書によって参考として援用される。
一部の局面において、本発明は、液体噴流および/または液体の小滴を生成するための装置および方法に関する。生成される噴流/小滴の一部の用途は、細胞内への材料のマイクロインジェクション、結晶化、ナノ/ピコ/フェムト小滴生成、およびナノ粒子合成を含む。一部の局面において、本発明は、液体の流れを導くために使用されるチャネルと共に使用される電極の形成に関する。
デバイスの加工は、他の方法によっても同様に実行され得る。例えば、デバイスは、マイクロ加工技術のみを使用して、または、上述の実施形態のように、マクロ加工(例えば、標準的な機械工場の技術および道具等)とマイクロ加工技術(例えば、微小部品に対するフォトリソグラフィ、レーザアブレーション、および/もしくは化学エッチング等)とを組み合わせて、加工され得る。
(本発明の局面に従った実施形態の見込まれる利点と用途)
高処理量の定量的単細胞マイクロインジェクションが、少なくとも以下の領域において使用され得、新たな可能性と先端的分野とを開く。
・病気を治療するために細胞への遺伝子挿入を含む遺伝子療法。本発明の局面に従った実施形態は、細胞内に遺伝子を送達するための迅速で効果的な手法を提供し得、血液の病気(白血病等)に対する療法や、(癌治療のための)樹枝状細胞ベース免疫療法等の、ある種の遺伝子療法を可能とし得る。
・「困難な」細胞株のトランスフェクションのための、細胞内へのDNA送達
・非常に大きなDNA分子(潜在的にはさらに全染色体)のトランスフェクションのための、細胞内へのDNA送達
・異なる条件下での対象遺伝子の発現レベルを研究する(プロモータにおける配列を変えて、それが生体内の遺伝子発現にどのように影響するかを観察する)ための、既知量の遺伝子コンストラクトの細胞内への送達
・より容易な/より効率的な安定トランスフェクション、相同体組み換え、および部位特異的変異誘発を達成するための、既知量のDNA配列、およびDNA組み換えを促進する既知量の酵素の送達
(RNAおよびRNA干渉(RNAi))
・より効率的/容易なRNAi(マイクロインジェクションベースのRNAi)のための、既知量のRNAの送達
・リポソームを必要としないRNAサイレンシングのための、細胞内へのRNAの送達(リポソームによる細胞の治療は、膜組成を変え、カルシウム依存信号カスケードの活性を改変し、遺伝子発現実験において数多くの偏りを導入する)
・各実験に使用されるコンストラクトの量を減少させるための、RNA干渉のための既知量のRNAコンストラクトの、細胞内への効率的な送達(RNA干渉に使用されるRNAコンストラクトは非常に高価である)
・複数の細胞株にわたり、かつ異なる条件下での、標準化された効率的なRNAiを達成するための、既知量のRNA分子および既知量のDicer分子の送達
・転写後レベルでの遺伝子発現規則の一部の局面を研究するための、既知量のmRNAの細胞内への送達(現在では、この種の研究は不可能か、または極めて困難である)
・RNAの半減期を生体内で研究するための、既知量の標識RNAの送達
(プロテオミクス)
・プロテオミクス、つまり細胞タンパク質機能の研究は、現在、タンパク質を生細胞の中に直接送達することが困難であることから停滞している。現在の方法は、細胞を死滅させるかまたは遺伝子操作すること無しに、またアーチファクト生成の危険を冒すこと無しに、タンパク質の動力学、局在化、相互作用、および発現を研究することを困難にしている。
・半減期を生体内で研究するための、既知量の標識タンパク質の送達
・タンパク質局在化の生体内研究を行うための、標識タンパク質の送達
・タンパク質の過剰発現を必要とせずに、生体内でのその効果を研究するための、既知量のタンパク質の送達(タンパク質の過剰発現は、細胞内でどれ程のタンパク質が発現したかに関する情報を提供しない。タンパク質が過剰発現すると、滴定が不可能となり、したがって、結果はしばしば定性的となる)
・過剰発現を必要とせずに、生体内での他のタンパク質との相互作用を研究するための、既知量の標識タンパク質の送達
・生体内免疫染色および生体内蛍光ベースウエスタンブロット法のための、生細胞の中への標識抗体の送達
・細胞膜を通したナノ粒子の送達
(創薬)
・細胞膜を通した既知量の薬剤の送達。本用途は、創薬および薬剤開発に極めて有用である
(療法)
・循環血液の特定のサブセットへの、薬物の細胞内送達
(細胞冷凍保存)
・細胞、特に卵母細胞の冷凍保存を改善するための、細胞の中への糖の高処理量マイクロインジェクション
(幹細胞およびトランスジェニック生物)
・トランスジェニック幹細胞株の開発のための、胚幹細胞の中へのDNAおよび/またはDNA+組換え酵素の送達
・トランスジェニック生物の開発のための、接合体の中へのDNAおよび/またはDNA+組換え酵素の送達
(マイクロ流体システムにおける結晶化)
結晶化は、様々な結晶化条件下での複数回の試行の後に達成される、困難なプロセスであり、反応条件に極めて依存する。現在、結晶化条件のスクリーニングの低い処理量および結晶化条件の厳密な制御の困難さが、その分野を停滞させている。さらに、現在の結晶化プロトコルは、大量の試薬を使用する。本発明のある特定の実施形態を用いて、ある溶液のピコリットルサイズの小滴を他の溶液に送達することが可能となる。例えば、結晶化を開始するために、逆溶剤中に小滴を注入することによって、または冷却された液体中に温かい小滴を注入することによって、結晶化を実施することができる。
・マイクロ粒子加工
・ピコおよびサブピコ小滴生成
様々な例示的実施形態を参照して、本発明の局面が説明されてきたが、本発明は、説明された実施形態に限定されない。このように、説明された実施形態の多くの代替形態、修正形態、および変形形態が、当業者に明らかであることは明白である。したがって、本明細書に記載された本発明の実施形態は、例示を意図するものであり、限定を意図しない。本発明から逸脱することなく、様々な変更が行われ得る。
Claims (37)
- 第1の経路に沿って材料を運搬するように構成および配置される、マイクロ流体チャネルと、
ノズルの出口から該チャネル内に、流体の噴流または小滴を放出方向に放出するように構成および配置される、ノズルと、
液体を保持し、かつ該ノズルと流体的に接続する、貯蔵容器と、
該ノズルに、液体の該噴流または小滴を該出口から放出させるために、該貯蔵容器内に圧力勾配を形成するように適合される、圧力発生器と、
を備える、マイクロ流体インジェクションデバイス。 - 前記圧力発生器は、初めに前記放出方向に対して横方向に動く圧力波を前記貯蔵容器内に生成する、請求項1に記載のデバイス。
- 前記圧力発生器と前記貯蔵容器との間に位置する可撓膜をさらに備える、請求項1に記載のデバイスであって、
該圧力発生器は圧電素子を含む、
デバイス。 - 前記デバイスは、約0m/秒から約40m/秒までの速度で、前記ノズルから噴流を放出するように配置され、該ノズルは20ミクロン未満の直径を有する、請求項1に記載のデバイス。
- 前記チャネル内の標的の存在を検出するために配置される、該チャネルに付随する検出器をさらに備える、請求項1に記載のデバイス。
- 前記デバイスは、細胞死を引き起こす細胞膜への損傷を避けて細胞内部への液体の導入が達成されるように、該細胞膜を経由して該細胞内部に該液体を導入するために、前記ノズルから液体の噴流を生成するように配置される、請求項1に記載のデバイス。
- 前記デバイスは、マイクロ/ナノ粒子の合成または結晶化に適した液体の噴流または小滴を生成するように配置される、請求項1に記載のデバイス。
- 前記デバイスは、前記液体中に存在する材料が、前記細胞膜を穿刺することなく該細胞膜に衝突するように、前記チャネル内に位置する細胞に向けて該液体を動かすために、前記ノズルから液体の噴流を生成するように配置される、請求項1に記載のデバイス。
- 前記液体中の前記材料は、粒子、リポソーム、張力活性剤、化学薬品、染料または抗体のうちの1つ以上を含む、請求項8に記載のデバイス。
- 細胞内に材料を導入する方法であって、
ノズルの出口付近の位置に細胞を提供するステップであって、該細胞は、細胞膜および該細胞膜に囲まれた細胞内部を有する、ステップと、
流体を含有し、かつ該ノズルと流体的に接続する、貯蔵容器を提供するステップと、
該貯蔵容器内の流体を該ノズルに向けて押し動かすために、該貯蔵容器内に圧力勾配を生成するステップと、
該材料を含む液体を、該細胞膜を経由して該細胞内部に導入するために、該材料を含む液体の噴流を該ノズルから生成するステップであって、該細胞内部への該液体の導入は、細胞死を引き起こす該細胞膜への損傷を避けるように達成される、ステップと、
を包含する、方法。 - 前記液体中に存在する材料が前記細胞膜を穿刺することなく該細胞膜に衝突するように、前記ノズルから液体の噴流または小滴を生成するステップをさらに包含する、請求項10に記載の方法。
- 圧力勾配を生成する前記ステップは、前記貯蔵容器内の流体を動かすために圧電素子を操作するステップを包含する、請求項10に記載の方法。
- 前記材料は、リポソーム、張力活性剤、化学薬品、粒子、化学薬品、染料または抗体を含む、請求項10に記載の方法。
- 前記ノズルから生成される液体の前記噴流は、約0m/秒から約40m/秒までの速度を有する、請求項10に記載の方法。
- 前記細胞内部に導入される液体の量は、約1フェムトリットルから数ピコリットルまでの体積を有する、請求項10に記載の方法。
- 細胞を提供する前記ステップは、前記ノズルと流体的に接続するチャネルに沿って該細胞を動かすステップを含む、請求項10に記載の方法。
- 第1の経路に沿って細胞を運搬するように構成および配置されるチャネルであって、該細胞は、細胞膜および細胞内部を有する、チャネルと、
出口から該チャネル内に、液体の噴流または小滴を放出方向に放出するように構成および配置される、ノズルと、
液体を保持し、かつ該ノズルと流体的に接続する、貯蔵容器と、
該ノズルに、液体の該噴流または小滴を該出口から放出させるために、該貯蔵容器内に圧力勾配を形成するように適合される、圧力発生器と、
を備える、流体インジェクションデバイスであって、
該細胞膜を経由して該細胞内部に該液体を導入するために、液体の該噴流または小滴が放出され、該細胞内部への該液体の導入は、細胞死を引き起こす該細胞膜への損傷を避けるように達成される、
デバイス。 - 前記圧力発生器は、初めに前記放出方向に対して横方向に動く圧力波を前記貯蔵容器内に生成する、請求項17に記載のデバイス。
- 前記圧力発生器と前記貯蔵容器との間に位置する可撓膜をさらに備える、請求項17に記載のデバイス。
- 前記圧力発生器は圧電素子を含む、請求項17に記載のデバイス。
- 前記デバイスは、約0m/秒から約40m/秒までの速度で前記ノズルから噴流を放出するように配置される、請求項17に記載のデバイス。
- 前記細胞内部に導入される液体の量は、約1フェムトリットルから数ピコリットルまでの体積を有する、請求項17に記載のデバイス。
- 前記デバイスは、前記液体中に存在する材料が、前記細胞膜を穿刺することなく該細胞膜に衝突するように、該流体を細胞に向けて加速するために、液体の噴流を前記ノズルから生成するように配置される、請求項17に記載のデバイス。
- 液体の噴流または小滴が、リポソーム、張力活性剤、化学薬品、粒子、化学薬品、染料または抗体を含む、請求項25に記載のデバイス。
- 基板と、
該基板に形成され、かつ流路に沿って液体を導くように構成および配置される、流体チャネルと、
該基板に形成され、かつ電極部分と接続する少なくとも1つの導電材料貯蔵容器を有する電極チャネルであって、該電極チャネルの該電極部分は、該流体チャネルと流体的に接続する、電極チャネルと、
を備える、マイクロ流体デバイス。 - 液体状の導電材料が前記電極チャネルから前記流体チャネルに流入することを防ぐように、かつ該電極チャネルと該流体チャネルとの間の流体的および電気的接続を許容するように配置される通路を介して、該電極チャネルの前記電極部分が該流体チャネルと接続する、請求項25に記載のデバイス。
- 前記電極チャネルは、前記流路に対して横方向に、前記導電材料貯蔵容器から前記流体チャネルに向かって、該電極チャネルが該流体チャネルに隣接する位置にまで延在し、かつ該位置から、該流体チャネルから離れるように延在する、請求項25に記載のデバイス。
- 前記電極チャネルは前記流体チャネルに隣接する位置に通路をさらに備える、請求項27に記載のデバイスであって、該通路は、該電極チャネルと該流体チャネルとの間の流体的および電気的接続を可能にする、デバイス。
- 前記電極チャネル内の導電材料をさらに備える、請求項25に記載のデバイス。
- 前記電極チャネル内の前記導電材料は、前記流体チャネル内の抵抗の変化を検出するように適合される電極を形成する、請求項29に記載のデバイス。
- 前記電極は、前記流体チャネル内の細胞の存在を検出するように適合される、請求項30に記載のデバイス。
- 基板を提供するステップと、
流路に沿って液体を導くように構成および配置される流体チャネルを、該基板に形成するステップと、
電極部分と接続する少なくとも1つの導電材料貯蔵容器を有する電極チャネルを、該基板に形成するステップであって、該電極チャネルの該電極部分は、該流体チャネルと流体的に接続する、ステップと、
該導電材料貯蔵容器に導電材料を提供するステップと、
液体状の該導電材料を、該導電材料貯蔵容器から該電極部分の中に、該電極チャネルが該流体チャネルと流体的に接続する位置にまで、流入させるステップと、
を包含する、マイクロ流体デバイスを形成する方法。 - 前記流体チャネルと前記電極チャネルとの間に通路を形成するステップであって、該通路は、液体導電材料が該電極チャネルから該流体チャネルに流入することを防ぐように配置され、かつ該電極チャネルと該流体チャネルとの間の流体的および電気的接続を可能とするように配置される、ステップをさらに包含する、請求項32に記載の方法。
- 前記電極チャネルは、前記流路に対して横方向に、前記導電材料貯蔵容器から前記流体チャネルに向かって、該電極チャネルが該流体チャネルに隣接する位置にまで延在し、かつ該位置から、該流体チャネルから離れるように延在する、請求項32に記載の方法。
- 前記電極チャネルが前記流体チャネルに隣接する位置に通路を提供するステップをさらに包含する、請求項34に記載の方法であって、該通路は、該電極チャネルと該流体チャネルとの間の流体的および電気的接続を可能にするが、液体導電材料が該電極チャネルから該流体チャネルに流入することを防ぐように配置される、方法。
- 前記電極チャネル内の前記導電材料は、前記流体チャネル内の抵抗の変化を検出するように適合される電極を形成する、請求項32に記載の方法。
- 前記電極は、前記流体チャネル内の細胞の存在を検出するように適合される、請求項36に記載の方法。
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