JP3602775B2 - マイクロチャネルアレイ装置、粒子保持方法、細胞保持ならびに物質注入方法、及び細胞保持ならびに物質注入装置 - Google Patents

マイクロチャネルアレイ装置、粒子保持方法、細胞保持ならびに物質注入方法、及び細胞保持ならびに物質注入装置 Download PDF

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Description

【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、マイクロチャネルアレイ装置、粒子保持方法、細胞保持ならびに物質注入方法、及び細胞保持ならびに物質注入装置に関し、詳しくは細胞に遺伝子等の物質を注入するのに最も好適なマイクロインジェクション法の効率化を図るためのマイクロチャネルアレイ装置、粒子保持方法、細胞保持ならびに物質注入方法、及び細胞保持ならびに物質注入装置に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
細胞内に遺伝子を導入することのできる新技術の開発は、有用な特質を有する動植物種及び微生物種の育種効率を高める上で鍵となるものである。これまで種々の方法が開発されてきたが、確実性と効率性の両方を有する技術は未開発である。
【0003】
例えば、細胞保持用ガラスマイクロピペットと細胞刺入用ガラスマイクロピペットとを、マイクロマニピュレータを用いて操作し、細胞1個1個に遺伝子を注入するマイクロインジェクション法は最も確実な方法であるが、その操作に熟練と時間を要し、そのため処理能力が低いことが大きな欠点になっている。
しかしながら、貴重な細胞と遺伝子を処理する場合、確実性がより重視されることから、マイクロインジェクション法は現在でも唯一の選択肢である。
【0004】
そこで、このマイクロインジェクション法の効率化に関して、これまで多くの技術開発努力が行なわれてきた。
例えば、特開平1−112976号公報には、基板に貫通孔を規則的にあけ、そこに細胞をトラップして、基板の位置と注入針の位置をステップモーターとコンピューターにより自動的に制御することで注入を自動化する試みが記載されている。
本発明者も、多数の注入針を規則的に配列したマイクロキャピラリーアレイを作製する技術を開発し、これに対応した位置にチャンバーを有するマイクロチャンバーアレイを用いて、マイクロチャンバーアレイに保持された全ての細胞へのDNAの一括注入を可能とすることにより、さらに効率化を進めた(特開2000−23657号公報)。
【0005】
しかしながら、上記のいずれの発明も、細胞の形状、大きさ、弾力性をほぼ均一と仮定して装置開発を行ったものである。実際には、それらがほぼ一定であることは極めて希であり、殆どの場合、細胞の形状、大きさ、弾力性はそれぞれに大きなバラツキがあるのが普通である。
そのため、各細胞に対する注入針の位置操作を同一に行ったのでは、多くの細胞に対して針が刺さらないか、或いは、多くの細胞を破壊する結果になる。
従って、殆どの場合、確実性の点から、トラップされた1個1個の細胞に対して、顕微鏡で観察しながら針を刺入していくことが求められている。
【0006】
このように、現時点では、確実性の点から、トラップされた1個1個の細胞に対して、顕微鏡で観察しながら針を刺入していくことが求められていることから、顕微鏡で観察しながらの細胞のトラップや針の刺入などをより効率化する技術が要望されている。
【0007】
ところで、上記いずれの発明も含めて、これまで開発されたマイクロインジェクション装置は、いずれも基板表面に規則的に貫通孔をあけて、その開口端に細胞を保持することを行っており、基板の表面に細胞を保持するように構成されている。
【0008】
しかしながら、ガラス基板などの透明基板に微小な貫通孔をあけることは極めて難しいことから、実際には微小な貫通孔をあける基板としては、シリコン基板を用いざるを得ない。
その場合、シリコン基板は可視光を透過しないため、落射型反射照明方式で細胞を観察しなければならなくなる。
しかも、貫通孔部では光が反射されず、若しくは乱反射されて、その直上にある部分は暗部となって観察が困難になる。さらに、針の動く方向と顕微鏡観察方向がほぼ同じであるため、実際に顕微鏡観察を行うことは極めて難しく、特に、作業距離が短くなる高倍率での観察は実際上不可能である。
また、仮に顕微鏡観察できたとしても、針が顕微鏡の焦点深度の方向で動くため、動きと共に像がぼけて、その位置操作は極めて難しくなる。
【0009】
従って、基板の表面に細胞を保持するように構成されているこれまでのマイクロインジェクション装置では、確実性の点から求められている顕微鏡で細胞を観察しながらの針刺入を行うことは、殆ど不可能である。
【0010】
以上のような数々の問題点があったため、上記のマイクロインジェクション法において、顕微鏡で観察しながら細胞のトラップや針の刺入などをより効率化する技術は、その実用化が進んでいないのが現状である。
【0011】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、マイクロインジェクション法の実際の使用における種々の問題を解決し、顕微鏡で細胞を観察しながらの粒子のトラップや針の刺入などが容易であって、効率良く粒子(例えば、細胞)に物質を注入することのできる方法ならびにこの方法の実施に好適な装置の提供を目的とするものである。
【0012】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、マイクロインジェクション法の実施にあたり、基板表面に多数の貫通孔をあけてその開口端に細胞をトラップする方法、即ち、基板の表面に細胞をトラップするこれまでの方法に替えて、基板の端面(側面)に粒子トラップ用開口端を有するマイクロチャネルアレイ装置を用いて該開口端に細胞を吸入トラップすることにより、顕微鏡観察の方向とその焦点深度内でのマイクロピペット先端の移動を可能にし、それにより実際上効率良く物質の注入を行えることを見出し、この知見に基いて本発明を完成するに到った。
【0013】
本発明者は、これまでシリコン基板に加工した微細な溝のアレイをガラス基板で覆うことによりマイクロチャネルアレイを作成する方法を考案し、その血液成分測定への応用(特開平2−130471号公報、特許第2532707号公報)、粒子の濾過,分級への応用(特開平11−165062号公報)等を開発してきたが、マイクロチャネルアレイのマイクロインジェクション法への利用、第1基板と第2基板の密着部のマイクロチャネル開口端を利用して第1基板端面に粒子を保持するマイクロチャネルアレイ装置等は、本発明者が今回初めて発明したものである。
【0014】
即ち、請求項1に係る本発明は、基板を貫通する貫通孔を有する窪みと、該窪みと基板の端面の間を連通する多数の微細な溝とを該基板表面に有する第1基板と、透明な第2基板とからなり、前記第1基板の表面に前記第2基板を接合させることにより、前記第1基板と前記第2基板との接合部であって前記第1基板の端面に、前記溝によって形成される粒子トラップ用開口端が形成されていることを特徴とするマイクロチャネルアレイ装置を提供するものである。
【0015】
請求項2に係る本発明は、第1基板がシリコン基板であり、第2基板が透明なガラス基板である請求項1記載のマイクロチャネルアレイ装置を提供するものである。
【0016】
請求項3に係る本発明は、請求項1又は2記載のマイクロチャネルアレイ装置を用い、第1基板の貫通孔を通して引圧をかけ、それによって第1基板端面に形成されている粒子トラップ用開口端に粒子を吸引トラップすることを特徴とする粒子保持方法を提供するものである。
【0017】
請求項4に係る本発明は、吸引トラップされる粒子が、細胞である請求項3記載の粒子保持方法を提供するものである。
【0018】
請求項5に係る本発明は、第1基板端面に形成されている粒子トラップ用開口端の近傍を透過照明及び落射型反射照明の両方を用いて顕微鏡観察しながら、粒子を吸引トラップすることを特徴とする請求項4記載の粒子保持方法を提供するものである。
【0019】
請求項6に係る本発明は、請求項1又は2記載のマイクロチャネルアレイ装置、前記マイクロチャネルアレイ装置搭載用ステージ、透過照明と落射型照明のいずれか一方或いは両方を有する顕微鏡、マイクロピペット、前記マイクロピペットを操作するマイクロマニピュレータ、前記マイクロピペットから物質を押し出すための圧発生器、及び、吸引トラップ用引圧発生器からなることを特徴とする細胞保持ならびに物質注入装置を提供するものである。
【0020】
請求項7に係る本発明は、請求項6記載の細胞保持ならびに物質注入装置を用い、第1基板の貫通孔を通して引圧をかけ、それによって第1基板端面に形成されている粒子トラップ用開口端に細胞を吸引トラップし、次いで吸引トラップされた細胞に対して、マイクロピペットを刺入することにより、細胞内に物質を注入することを特徴とする細胞保持ならびに物質注入方法を提供するものである。
【0021】
請求項8に係る本発明は、第1基板端面に形成されている粒子トラップ用開口端の近傍を透過照明及び落射型反射照明の両方を用いて顕微鏡観察しながら、細胞を吸引トラップし、次いで吸引トラップされた細胞に対して、マイクロピペットを刺入することにより、細胞内に物質を注入する請求項7記載の細胞保持ならびに物質注入方法を提供するものである。
【0022】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態を示す。
まず請求項1に係る本発明は、マイクロチャネルアレイ装置に関し、基板を貫通する孔を有する窪みと、該窪みと基板の端面の間を連通する多数の微細な溝とを該基板表面に有する第1基板と、透明な第2基板とからなり、前記第1基板の表面に前記第2基板を接合させることにより、前記第1基板と前記第2基板との接合部であって前記第1基板の端面に、前記溝によって形成される粒子トラップ用開口端が形成されていることを特徴とするものである。
このような請求項1に係る本発明のマイクロチャネルアレイ装置について、図面を参照しつつ説明する。図1は、第1基板11の1例を示す正面図であり、第1基板11上に存在する窪みと溝のデザインの1例が示されている。図2は、図1のA部を拡大した説明図である。図3は、第1基板11と、透明な第2基板15とからなる、請求項1に係る本発明のマイクロチャネルアレイ装置の側面を一部拡大した図であって、細胞をトラップしている状態を示す説明図である。
【0023】
請求項1に係る本発明のマイクロチャネルアレイ装置は、下記に示すような第1基板11と第2基板15とを接合、密着させることにより得られる。
第1基板11は、平面形状が略長方形状をなす、薄板状のものであって、特に請求項2に記載したように、シリコン基板からなるものである。この第1基板11の表面には、該基板を貫通する孔14を有する窪み12と、該窪み12と基板の端面の間を連通する多数の微細な溝13とが設けられている。図1、図2中、窪み12の端とそれに平行する第1基板11の端をつなぐ多数の短い線分のそれぞれが溝13を示している。
ここで窪み12の平面形状は、図1では略「エ」字状とされているが、これに限定されるものではなく、例えば第1基板11の略全体をカバーする略長方形状をなすものとしてもよい。また、図1に示す第1基板11は、図2、図3では、周縁部にテーパー(勾配)を付けたものとされているが、このテーパーはなくとも差し支えない。
【0024】
第1基板11には、さらに基板の表裏面を貫通する貫通孔14が窪み12の中に設けられている。図1では、貫通孔14として、平面形状が円形のものが示されているが、これに限定されるものではなく、該貫通孔14を通して引圧をかけられるものであれば、平面形状が角形のものなどであっても差し支えない。また、図1では、貫通孔14は、第1基板11の中央部に設けられているが、1例を示したものであって、これに限定されるものでないことは、言うまでもない。
【0025】
さらに、第1基板11には、窪み12と基板の端面の間を連通する多数の微細な溝13が設けられている。
即ち、第1基板11には、図1、図2に示すように、窪み12の周囲の基板表面に、窪み12の端とそれに平行する第1基板11の端面の間を連通する(つなぐ)微細な溝13が、基板の端面に沿って(図1では上下の端面に沿って)多数設けられている。このように、窪み12の端とそれに平行する基板の端面の間を、多数の微細な溝13が連通するようになっている。
【0026】
このような第1基板11は、例えばフォトリソグラフィーとエッチングの技法を用いて、以下のようにウェーハー(シリコン単結晶からなる基板用薄板)を加工することにより得ることができる。
まず、1回目のフォトリソグラフィーとエッチングで、溝13を加工し、次に2回目のフォトリソグラフィーとエッチングで窪み12を加工する。さらに、貫通孔14をサンドブラスト法等で加工し、最後にウェーハーをカットすることにより、第1基板(チップ)11を作製することができる。
【0027】
ウェーハーのカットには、端面がきれいに仕上がることから、高密度プラズマによる異方性エッチングを用いることが望ましい。
ここで高密度プラズマによる異方性エッチングとは、基板表面に塗布したフォトレジストにフォトリソグラフィ工程によってカット部分を形成し、そのフォトレジストをマスクとして反応性イオンの高密度プラズマによるエッチングでカットする技術である。
この他に、ダイシングカットでも、端の欠けが最小限になるように注意して行うことで、実用に耐える端面を得ることができる。また、ある深さまでエッチングで彫り、それから残りをダイシングカットしても良い。
【0028】
このような第1基板11の大きさは特に限定されないが、粒子、特に細胞のトラップに用いられることから、通常、縦8〜12mm、横16〜24mm、厚さ0.4〜0.6mm程度のものであって、溝13の幅が0.002〜0.02mm、長さが0.05〜0.2mm程度のものである。
【0029】
次に、上記第1基板11と接合、密着させられる第2基板15は、透明な基板であって、請求項2に記載したように、通常は、透明なガラス基板からなるものである。
従って、第1基板と第2基板とは、請求項2に記載したように、それぞれシリコン単結晶からなるシリコン基板と、透明なガラスからなる透明なガラス基板とであることが好ましい。
この第2基板15は、通常、上記第1基板11と略同様の平面形状を有するものであって、第1基板11より大きいものとすると、図3に示されるように、第1基板11の端面と第2基板15の表面とで形成されるコーナー部に、粒子(細胞)16を確実に保持することができる。第1基板11より大きければ、第2基板15は勿論円盤形状であってもよい。
【0030】
請求項1に係る本発明のマイクロチャネルアレイ装置は、上記第1基板11の表面に、即ち窪み12や溝13などが設けられている側に、上記第2基板15を接合、密着させたものである。
上記第1基板11の表面に上記第2基板15を接合、密着させることにより、第1基板11と第2基板15との接合部であって第1基板11の端面に、溝13によって形成される粒子トラップ用開口端Bがいわば自動的に形成される。この粒子トラップ用開口端Bに粒子(細胞)16をトラップ(捕捉)する。
【0031】
上記したように、平面形状が第1基板11より大きい第2基板15を用いると、図3に示されるように、粒子トラップ用開口端B付近に、第1基板11の端面と第2基板15の表面とでコーナー部が形成され、このコーナー部に、粒子(細胞)16を確実に保持することができる。
【0032】
第1基板11の表面に上記第2基板15を接合、密着させる方法としては、例えば陽極接合法を用いることもできるが、好ましくは必要に応じて取り外し可能とするため、ホルダー等を用いて機械的に両者を圧着させるとよい。
【0033】
図4、図5に、第1基板11の表面に上記第2基板15を、ホルダーを用いて機械的に接合、密着させた状態を示す。図4は、その正面図であり、図5はその平面図である。この図4、図5は、第2基板15として、円盤状のガラス基板を用いた例である。
図中、符号17はホルダーを示しており、押しネジ18、樹脂ブロック19、Oリング20、載置台21などから構成されている。このようなホルダー17の押しネジ18で樹脂ブロック19を押すことにより、Oリング20を介して、第1基板11が第2基板15に押しつけられ、接合、密着させられる。
通常、第2基板15上にセンターガイド用基板15aを載せ、該センターガイド用基板15aの中央に第1基板11が丁度入る大きさの円形の孔を開けておく。そうすることで、第1基板11を第2基板15の中央に容易に置くことができる。該センターガイド用基板15aは、プラスチック基板でよい。
この場合、第1基板11の元の表面(溝13、窪み12以外の部分であって、第2基板15と密着する部分)を光学研磨しておくと共に、第2基板15の表面も光学研磨されたものを用いることにより、両者の密着度を十分に高くし、漏れを防ぐことができる。
【0034】
一般に、細胞試料を調製するとき、一部の細胞が壊れ、その断片等が混在することが一般的である。また、その混在物を取り除けない場合が多い。
そのため、第1基板11端面の開口部Bに粒子(細胞)16を吸引トラップするときにも、混在物が吸引されることがあり、しばしばマイクロチャネルを構成している一部の溝13が詰まる結果になる。
上記の如く、図4、図5に示すように、第1基板11と第2基板15とを機械的に圧着させた場合には、使用後、これら基板を取り外して洗浄し、再度両者を圧着させることにより、容易に詰まりを取り除くことができ、従って再使用が可能となる。一方、溶着により接着させた場合には、詰まりを取り除くことは困難であり、再使用が難しくなる。
【0035】
請求項1に係る本発明のマイクロチャネルアレイ装置は、このように第1基板11の表面に第2基板15を接合、密着させることにより、第1基板11と第2基板15との接合部であって第1基板11の端面に、溝13によって形成される粒子トラップ用開口端Bが形成されており、この粒子トラップ用開口端Bに粒子(細胞など)16をトラップ(捕捉)する。
図5に示したように、粒子トラップ用開口端Bが形成されている第1基板11の端面22は、外部から自由にアクセスできる構造になっており、また、その上部には障害物がないようになっているので、透過照明での顕微鏡観察が可能となっている。
【0036】
このような請求項1又は2に係る本発明のマイクロチャネルアレイ装置を用いた粒子保持方法を提供するのが、請求項3に係る本発明である。
請求項3に係る本発明は粒子保持方法に関し、請求項1又は2記載のマイクロチャネルアレイ装置を用い、第1基板の貫通孔を通して引圧をかけ、それによって第1基板端面に形成されている粒子トラップ用開口端に粒子を吸引トラップすることを特徴とするものである。
なお、後述する図6は、請求項6に係る本発明の細胞保持ならびに物質注入装置の1例を用いて、細胞保持ならびに物質注入を行っている模様を示す説明図であるが、粒子16を吸引トラップするところまでの装置は、この請求項3に係る本発明の方法でも利用されるものであるので、適宜、これを参照して説明することとする。
【0037】
請求項3に係る本発明では、請求項1又は2記載のマイクロチャネルアレイ装置を用いる。これについては、上記した通りである。
請求項3に係る本発明では、このような請求項1又は2記載のマイクロチャネルアレイ装置を用い、第1基板11の貫通孔14を通して引圧をかけ、それによって第1基板11端面に形成されている粒子トラップ用開口端Bに粒子16を吸引トラップする。
【0038】
例えば、まず初めに、粒子トラップ用開口端B付近であって、第1基板11の端面と第2基板15の表面とで形成されるコーナー部近傍に、粒子(細胞など)16を置いて、粒子16を粒子トラップ用開口端Bに吸引トラップする準備をする。
なお、粒子16をコーナー部近傍に置く手段は、特に限定されないが、先端径が大きいマイクロピペットとそれを操作するためのマイクロマニピュレータを別に用意し、そのマイクロピペット内に粒子浮遊液を予め入れておき、マイクロマニピュレータでマイクロピペット先端位置をコーナー部近傍に持っていき、粒子浮遊液をマイクロピペットより押出せばよい。粒子を粒子トラップ用開口端Bにさらに近付けるには、請求項6に係る本発明において示すような粒子(細胞)刺入用のマイクロピペット27をマイクロマニピュレータ28を用いてマイクロピペット先端で粒子を押す等の操作をすればよい。しかし、吸引すれば周りの液体と共に粒子が動いて開口端に来るので、一般にその操作は不要である。その際、センターガイド用基板15aの中央に開けられている孔は液溜め15bになる。次に、第1基板11に設けられている貫通孔14を通じて、例えば別途設置した細胞などの粒子16を吸引トラップするための引圧を発生させる、吸引トラップ用引圧発生器30などを用いて、引圧をかける。
すると、第1基板11に設けられている窪み12を経由して、粒子トラップ用開口端Bにも引圧がかかり、粒子16は前記コーナー部近傍から粒子トラップ用開口端Bに吸引トラップされ、そのまま保持される。
【0039】
なお、吸引トラップの対象となる粒子としては、例えば請求項4に記載したように、マイクロインジェクション法において、DNA等の物質が注入される対象となる細胞などが挙げられる。
【0040】
ここで、請求項5に記載したように、第1基板11の端面に形成されている粒子トラップ用開口端Bの近傍を、透過照明及び落射型反射照明の両方を用いて顕微鏡観察しながら、粒子16を吸引トラップすると、粒子16に対して透過照明による顕微鏡観察が可能となり、同時に、落射型反射照明を用いて、窪み12や溝13が形成されている、マイクロチャネルアレイ側も同時に顕微鏡観察することができる。従って、より確実に細胞などの粒子16を保持することができる。
【0041】
次に、請求項6に係る本発明は細胞保持ならびに物質注入装置に関し、請求項1又は2記載のマイクロチャネルアレイ装置、前記マイクロチャネルアレイ装置搭載用ステージ、透過照明と落射型照明のいずれか一方或いは両方を有する顕微鏡、マイクロピペット、前記マイクロピペットを操作するマイクロマニピュレータ、前記マイクロピペットから物質を押し出すための圧発生器、及び、吸引トラップ用引圧発生器からなることを特徴とするものである。
【0042】
図6は、請求項6に係る本発明の細胞保持ならびに物質注入装置の1例を用いて、細胞保持ならびに物質注入を行っている模様を示す説明図である。
請求項6に係る本発明の細胞保持ならびに物質注入装置は、請求項1又は2記載のマイクロチャネルアレイ装置を有している。このようなマイクロチャネルアレイ装置は、前記したように、基板を貫通する貫通孔14を有する窪み12と、該窪み12と基板の端面の間を連通する多数の微細な溝13とを該基板表面に有する第1基板と、この第1基板の表面に接合される透明な第2基板15とからなり、前記第1基板11の表面に前記第2基板15を接合させることにより、第1基板11と第2基板15との接合部であって第1基板11の端面に、溝13によって形成される粒子トラップ用開口端Bが形成されているものである。この粒子トラップ用開口端Bに粒子(細胞)16をトラップ(捕捉)する。
【0043】
請求項6に係る本発明の細胞保持ならびに物質注入装置は、請求項1又は2記載のマイクロチャネルアレイ装置の他に、まず前記マイクロチャネルアレイ装置搭載用ステージ23を有している。このマイクロチャネルアレイ装置搭載用ステージ23としては、マイクロチャネルアレイ装置を搭載しうるものであればよく、特に制限されない。
【0044】
請求項6に係る本発明の細胞保持ならびに物質注入装置は、次に透過照明と落射型照明のいずれか一方或いは両方を有する顕微鏡24を有している。図6中、符号25は透過照明用の光源を示しており、符号26は落射型照明用の光源を示している。これらは、既知のものを用いることができる。
【0045】
請求項6に係る本発明の細胞保持ならびに物質注入装置は、さらに粒子(細胞)刺入用のマイクロピペット27、前記マイクロピペットを操作するマイクロマニピュレータ28、前記マイクロピペット27から物質を押し出すための圧発生器29、及び、吸引トラップ用引圧発生器30とを有している。これらについても、既知のものを用いることができる。さらに、図4、図5に示すようなホルダー17を用いて、第1基板11と第2基板15とを機械的に密着させることがより好ましい。
【0046】
このような請求項6に係る本発明の細胞保持ならびに物質注入装置によれば、顕微鏡で細胞を観察しながらの粒子のトラップや針の刺入などが容易であって、効率良く粒子(例えば、細胞)に物質を注入することができる。
請求項6に係る本発明の細胞保持ならびに物質注入装置を用いた、そのような効率のよい細胞保持ならびに物質注入方法を提供するのが、請求項7と請求項8に係る本発明である。
【0047】
即ち、請求項7に係る本発明は細胞保持ならびに物質注入方法に関し、請求項6記載の細胞保持ならびに物質注入装置を用い、第1基板の貫通孔を通して引圧をかけ、それによって第1基板端面に形成されている粒子トラップ用開口端に細胞を吸引トラップし、次いで吸引トラップされた細胞に対して、マイクロピペットを刺入することにより、細胞内に物質を注入することを特徴とするものである。
【0048】
請求項7に係る本発明において、粒子トラップ用開口端に細胞を吸引トラップするところまでは、請求項3、4に係る本発明と同様である。
即ち、まず初めに、粒子トラップ用開口端B付近であって、第1基板11の端面と第2基板15の表面とで形成されるコーナー部近傍に、細胞などの粒子16を置いて、細胞などの粒子16を粒子トラップ用開口端Bに吸引トラップする準備をする。なお、この操作は、細胞などの粒子浮遊液をコーナー部近傍に注げば充分である。
次に、第1基板11に設けられている貫通孔14を通じて、吸引トラップ用引圧発生器30から引圧をかける。
すると、第1基板11に設けられている窪み12を経由して、粒子トラップ用開口端Bにも引圧がかかり、細胞などの粒子16は前記コーナー部近傍から粒子トラップ用開口端Bに吸引トラップされ、そのまま保持される。
【0049】
このように吸引トラップされた細胞などの粒子16に対して、粒子(細胞)刺入用のマイクロピペット27を刺入することにより、細胞内に物質を注入する。
【0050】
細胞内に物質を注入するにあたっては、透過照明用の光源25などを用いることにより、細胞などの粒子16に対して透過照明による顕微鏡観察が可能となる。このため、透過照明により第1基板11の端面に形成されている粒子トラップ用開口端Bの近傍を顕微鏡24で観察しながら、粒子(細胞)刺入用のマイクロピペット27により容易にDNA等の物質を刺入することが可能である。
【0051】
さらに、請求項8に記載したように、透過照明用の光源25と共に、落射型反射照明用の光源26を用いることにより、透過照明及び落射型反射照明の両方を用いての顕微鏡観察ができ、細胞などの粒子16に対して透過照明による顕微鏡観察が可能となると同時に、落射型反射照明を用いて、窪み12や溝13が形成されている、マイクロチャネルアレイ側も顕微鏡観察することができる。従って、より確実、かつより容易にDNA等の物質を刺入することが可能である。
【0052】
なお、図6では、粒子(細胞)刺入用のマイクロピペット27は、第2基板15に対し約45度の傾きで描かれているが、これに限定されるものではなく、本発明では、細胞等の粒子が第1基板11と第2基板15との接合部であって第1基板11の端面に形成された粒子トラップ用開口端Bにトラップされるため、水平に近い角度まで持ってきた状態での操作も可能である。このようにすることにより、粒子(細胞)刺入用のマイクロピペット27を動かす方向(水平方向)と顕微鏡24の観察方向(垂直方向)とがほぼ直交することとなる。従って、高倍率で観察することができ、かつ、粒子(細胞)刺入用のマイクロピペット27の先端をほぼ顕微鏡24の焦点深度内で動かすことができ、位置操作をより容易に行うことができる。
【0053】
なお、上記した如き請求項6に係る本発明の細胞保持ならびに物質注入装置を用いてポプラプラストを吸引トラップし、細胞刺入用のマイクロピペット(針)を刺したところの顕微鏡画像からの参考図を図7に示す。
ポプラプラスト31の大きさ、形状、弾力性等は極めて不均一であり、またプロトプラスト浮遊液調製試料は膜破片や葉緑体等の不純物をも含む。
このような不揃いな粒子を対象としてマイクロインジェクションを行う場合には、顕微鏡で観察しながら注入操作を効率良く行うことができる本発明が不可欠である。
【0054】
【発明の効果】
本発明は、以上説明したように構成されるので、以下に記載するような効果を有する。
(1)請求項1、2に係る本発明のマイクロチャネルアレイ装置は、従来のように基板の表面に細胞を保持するのではなく、第1基板端面に形成されている粒子トラップ用開口端に細胞等の粒子を吸引トラップするため、粒子トラップ用開口端Bが形成されている第1基板11の端面22は、外部から自由にアクセスできる構造になっており、しかも、その上部には障害物がないようになっているので、透過照明での顕微鏡観察が可能である。
請求項3、4、5に係る本発明の粒子保持方法によれば、透過照明で顕微鏡観察しながら粒子をトラップするすることが可能である。
【0055】
(2)請求項6に係る本発明の細胞保持ならびに物質注入装置は、従来のように基板の表面に細胞を保持するのではなく、第1基板端面に形成されている粒子トラップ用開口端に細胞等の粒子を吸引トラップするため、粒子トラップ用開口端Bが形成されている第1基板11の端面22は、外部から自由にアクセスできる構造になっており、しかも、その上部には障害物がないようになっているので、透過照明及び落射型反射照明の両方を用いての顕微鏡観察ができ、細胞などの粒子に対して透過照明による顕微鏡観察が可能となると同時に、落射型反射照明を用いて、窪みや溝が形成されている、マイクロチャネルアレイ側も顕微鏡観察することができる。従って、より確実、かつより容易にDNA等の物質を刺入することが可能である。
【0056】
(3)また、請求項6に係る本発明の細胞保持ならびに物質注入装置は、第1基板端面に形成されている粒子トラップ用開口端に細胞等の粒子を吸引トラップするため、粒子にDNA等の物質を注入する際、粒子(細胞)刺入用のマイクロピペットの動く方向を水平に近くすることができることから、高倍率での観察と焦点深度内でのマイクロピペット先端の操作が可能である。従って、細胞へのDNA等の物質の注入を、粒子(細胞)刺入用のマイクロピペットを顕微鏡で観察しながら行うことが可能である。
即ち、細胞に粒子(細胞)刺入用のマイクロピペットでDNA等の物質を注入するにあたり、マイクロピペットを動かす方向(ほぼ水平方向)と顕微鏡の観察方向(垂直方向)とがほぼ直交するので、細胞を高倍率で観察することができ、また、マイクロピペット先端を顕微鏡の焦点深度の中で動かすことができる。
【0057】
(4)さらに、請求項6に係る本発明の細胞保持ならびに物質注入装置によれば、形状、大きさ、弾力性に大きなバラツキのある複数の細胞であっても、顕微鏡で観察しながら物質の注入を行えるので、確実に物質を注入することができる。
【0058】
(5)また、請求項1、2に係る本発明のマイクロチャネルアレイ装置と、請求項6に係る本発明の細胞保持ならびに物質注入装置とにおいて、第1基板と第2基板とを機械的に取り外し自在に接合、密着させた場合には、細胞試料に混在する細胞断片等の混在物が吸引されてたとしても、使用後、基板同士を取り外して洗浄し、再度接合、密着させることにより、容易に詰まりを取り除き、再使用に供することができる。
【0059】
以上のように、本発明によれば、マイクロインジェクション法の実際の使用において、顕微鏡で細胞を観察しながらの粒子のトラップや針の刺入などが容易であって、効率良く粒子(例えば、細胞)に物質を注入することが可能であり、マイクロインジェクション法の効率を著しく高めることができる。
従って、本発明は、マイクロインジェクション法の効率を大幅に高めることができるので、医学、生化学、遺伝子工学等の各分野で有用である。
【図面の簡単な説明】
【図1】第1基板の1例を示す正面図である。
【図2】図1のA部を拡大した説明図である。
【図3】第1基板と、透明な第2基板とからなる、請求項1に係る本発明のマイクロチャネルアレイ装置の側面を一部拡大した図であって、細胞をトラップしている状態を示す説明図である。
【図4】第1基板の表面に第2基板を、ホルダーを用いて機械的に接合、密着させた状態を示す正面図である。
【図5】図4の平面図である。
【図6】請求項6に係る本発明の細胞保持ならびに物質注入装置の1例を用いて、細胞保持ならびに物質注入を行っている模様を示す説明図である。
【図7】請求項6に係る本発明の細胞保持ならびに物質注入装置を用いてポプラプラストを吸引トラップし、細胞刺入用のマイクロピペット(針)を刺したところの顕微鏡画像からの参考図である。
【符号の説明】
11 第1基板(シリコン基板)
12 窪み
13 溝
14 貫通孔
15 第2基板(ガラス基板)
15a センターガイド用基板
15b 液溜め
16 粒子(細胞)
17 ホルダー
18 押しネジ
19 樹脂ブロック
20 Oリング
21 載置台
22 粒子トラップ用開口端Bが形成されている第1基板の端面
23 マイクロチャネルアレイ装置搭載用ステージ
24 顕微鏡
25 透過照明用の光源
26 落射型照明用の光源
27 粒子(細胞)刺入用のマイクロピペット
28 マイクロピペットを操作するマイクロマニピュレータ
29 マイクロマニピュレータから物質を押し出すための圧発生器
30 吸引トラップ用引圧発生器
31 ポプラプロトプラスト
A 拡大されて図2として示されている部分
B 粒子トラップ用開口端

Claims (8)

  1. 基板を貫通する貫通孔を有する窪みと、該窪みと基板の端面の間を連通する多数の微細な溝とを該基板表面に有する第1基板と、透明な第2基板とからなり、前記第1基板の表面に前記第2基板を接合させることにより、前記第1基板と前記第2基板との接合部であって前記第1基板の端面に、前記溝によって形成される粒子トラップ用開口端が形成されていることを特徴とするマイクロチャネルアレイ装置。
  2. 第1基板がシリコン基板であり、第2基板が透明なガラス基板である請求項1記載のマイクロチャネルアレイ装置。
  3. 請求項1又は2記載のマイクロチャネルアレイ装置を用い、第1基板の貫通孔を通して引圧をかけ、それによって第1基板端面に形成されている粒子トラップ用開口端に粒子を吸引トラップすることを特徴とする粒子保持方法。
  4. 吸引トラップされる粒子が、細胞である請求項3記載の粒子保持方法。
  5. 第1基板端面に形成されている粒子トラップ用開口端の近傍を透過照明及び落射型反射照明の両方を用いて顕微鏡観察しながら、粒子を吸引トラップすることを特徴とする請求項4記載の粒子保持方法。
  6. 請求項1又は2記載のマイクロチャネルアレイ装置、前記マイクロチャネルアレイ装置搭載用ステージ、透過照明と落射型照明のいずれか一方或いは両方を有する顕微鏡、マイクロピペット、前記マイクロピペットを操作するマイクロマニピュレータ、前記マイクロピペットから物質を押し出すための圧発生器、及び、吸引トラップ用引圧発生器からなることを特徴とする細胞保持ならびに物質注入装置。
  7. 請求項6記載の細胞保持ならびに物質注入装置を用い、第1基板の貫通孔を通して引圧をかけ、それによって第1基板端面に形成されている粒子トラップ用開口端に細胞を吸引トラップし、次いで吸引トラップされた細胞に対して、マイクロピペットを刺入することにより、細胞内に物質を注入することを特徴とする細胞保持ならびに物質注入方法。
  8. 第1基板端面に形成されている粒子トラップ用開口端の近傍を透過照明及び落射型反射照明の両方を用いて顕微鏡観察しながら、細胞を吸引トラップし、次いで吸引トラップされた細胞に対して、マイクロピペットを刺入することにより、細胞内に物質を注入する請求項7記載の細胞保持ならびに物質注入方法。
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