JP4700003B2 - マイクロチャネルアレイ - Google Patents

Description

本発明は、マイクロチャネルアレイに関し、特に細胞等の粒子を吸引トラップするマイクロチャネルアレイに関する。

マイクロインジェクション操作に代表される、細胞内に遺伝子を導入する技術の開発は、有用な特質を有する動植物種及び微生物種の育種効率を高める上で鍵となるものであり、これまで確実性と効率性の両方の観点から種々の方法が開発されている。

例えば、本発明者は、作業の効率を高めるために、多数の注入針を規則的に配列したマイクロキャピラリーアレイと、これに対応した位置にチャンバーを有するマイクロチャンバーアレイとを用いて、マイクロチャンバーアレイに保持された全ての細胞へＤＮＡを一括注入する技術を開発した（特許文献１参照）。しかしながら、この方法では、各細胞の形状、大きさ、弾力等のバラツキに十分対応することは難しく、細胞に注入針が刺さらないか、又は、刺さっても浅すぎたり深すぎたりして、ＤＮＡの一括注入がうまくいかない場合がある。また、針の動く方向と顕微鏡の観察方向とがほぼ同じであるため、実際に顕微鏡観察しながら作業を行うことは難しく、また、仮に顕微鏡観察できたとしても、針が顕微鏡の焦点深度の方向で動くため、動きと共に像がぼけて、その位置操作が難しくなるという問題点があった。

そこで、本発明者は作業の確実性の観点から検討を重ね、基板端面の開口端で細胞等の粒子を吸引トラップするマイクロチャネルアレイを開発した（特許文献２参照）。このマイクロチャネルアレイを用いると、マイクロインジェクション操作において、針の動く方向と顕微鏡の観察方向とがほぼ直交するので、顕微鏡観察しながら操作を行うことができ、より確実、且つより容易にＤＮＡ等の物質を刺入することができる。

しかしながら、上記のマイクロチャネルアレイを用いた場合、細胞の吸引トラップの際に細胞を傷つけることがある。また、このマイクロチャネルアレイは、マイクロインジェクション操作を行うには適しているものの、操作前の細胞の培養や、操作後の細胞の分化・増殖の場としては適当でないので、操作の前に別の場で細胞の培養を行い、操作が終わるとまたさらに別の場で細胞の分化・増殖を行わなければならず、操作全体として効率が低いという問題がある。さらに深刻な問題は、細胞の分化・増殖速度を高めることができないことである。
特開２０００−２３６５７号公報 特開２００２−２７９６９号公報

このように、従来のマイクロチャネルアレイでは細胞の分化・増殖速度を高めることができないという問題点があった。本発明は、上述の問題点に鑑みてなされたものであり、細胞の分化・増殖速度を高めることができるマイクロチャネルアレイを提供することを目的とする。

上記の目的は、第１基板と、該第１基板と接合される第２基板とを有し、該第１基板の接合面に形成された溝によって該第１基板の端面に粒子トラップ用開口端が形成されるマイクロチャネルアレイであって、（ａ）該第１基板を貫通する第１の貫通孔と、該第１の貫通孔を有する第１の窪みと、該第１の窪みと該第１基板の端面とを連通する複数の第１の溝、（ｂ）該第１基板を貫通する第２の貫通孔と、該第２の貫通孔を有する第２の窪みと、該第２の窪みと該第１基板の端面とを連通する第２の溝、及び、（ｃ）該第１の窪みと該第２の窪みの間を隔てる仕切り、を該第１基板の接合面に有し、且つ、該第２の溝が、隣り合う該複数の第１の溝の間に該仕切りを隔てて配置されてなることを特徴とするマイクロチャネルアレイによって達成される。

本発明によれば、細胞の分化・増殖速度を高めることができるマイクロチャネルアレイを提供することができる。

図１は、本発明のマイクロチャネルアレイＡの構成を示す図である。 図２は、本発明のマイクロチャネルアレイＡの細胞吸引時の状態を示す側面断面図である。 図３は、本発明のマイクロチャネルアレイＡの裏面側の構成を示す図である。 図４は、本発明のマイクロチャネルアレイＡの外観を示す走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真である。 図５は、本発明のマイクロチャネルアレイＡの中央部の微細構造を示すＳＥＭ写真である。 図６は、本発明のマイクロチャネルアレイＡの端部の微細構造を示すＳＥＭ写真である。 図７は、本発明のマイクロチャネルアレイＣの構成を示す図である。 図８は、本発明のマイクロチャネルアレイＡを用いて、マイクロインジェクション操作によって物質を注入している時の様子を示す顕微鏡写真である。 図９は、従来のマイクロチャンバーアレイの構成を示す図である。 図１０は、従来のマイクロチャネルアレイの構成を示す図である。

符号の説明

１ 第１基板
２ 第２の窪み
３ 第２の溝
４ 第２の貫通孔
５ 仕切り
６ 境界ブロック
７ 第１の窪み
８ 第１の溝
９ 第１の貫通孔
１０ 端面
１１ 第２基板
１５ 第３の溝
２０ 細胞

本発明の実施の形態について以下に図面を参照して説明する。以下の説明は、本発明の好適な実施の形態を示すものであって、本発明の範囲が以下の実施の形態に限定されるものではない。以下の説明において、同一の符号が付されたものは実質的に同様の部位を示している。

本発明のマイクロチャネルアレイにおいては、第１基板端面に形成されている粒子トラップ用開口端に、細胞等の粒子が吸引トラップされる。これにより、マイクロインジェクション操作においては、マイクロピペットを動かす方向（ほぼ水平方向）と顕微鏡の観察方向（垂直方向）とがほぼ直交するので、高倍率での観察と焦点深度内でのマイクロピペット先端の操作が可能である。顕微鏡観察においては、透過照明及び落射型反射照明のいずれも使用可能で、細胞等の粒子を透過照明で観察できると同時に、窪みや溝が形成されているマイクロチャネル側も落射型反射照明で観察することができる。従って、より確実、且つより容易にＤＮＡ等の物質を刺入することが可能である。

また、細胞等の粒子をトラップする第２の溝の両側に、仕切りを隔てて第１の溝が設けられており、例えば、第２の溝にトラップされた細胞等の粒子に、第１の貫通孔及び第１の窪みを経由して第１の溝から常に新鮮な培養液を供給することが可能である。これにより、細胞等の粒子を培養液中で吸引トラップし、マイクロインジェクション操作を行った後、そのまま細胞等の粒子を培養液中で培養することが可能になるため、一連の操作効率を飛躍的に高めることが可能となる。

この第１基板の構成を、図１を用いて説明する。図１は本発明のマイクロチャネルアレイの構成を示す図である。図１の上部には、本発明のマイクロチャネルアレイに用いられる第１基板１の上面図が示されている。図１の下部には、第１基板１と第２基板１１とを接合してマイクロチャネルアレイとするときの側面断面図が示されている。図１において、各部の寸法を示す数字の単位はμｍである。第１基板１の中央部には細胞の培養液を供給するための第１の貫通孔９が設けられている。この第１の貫通孔９は、第１の窪み７の中に設けられている。そして、第１の窪み７から第１基板１の端面１０まで第１の溝８が形成されている。これにより、第１の貫通孔９と、第１の窪み７と、第１の溝８とが連通する。第１の貫通孔９の裏面側から培養液を供給することにより、培養液は第１の窪み７を経由して第１の溝８に流入する。第１の溝８は第１基板１の端面１０まで設けられているため、培養液は端面１０から流出する。すなわち、第１の溝８は培養液を供給するためのマイクロチャネルとなる。第１の溝８は２つの溝を１組として、複数組形成されている。この第１の溝８の間隔は一定であり、そして隣り合う組の間隔もまた一定である。

上記の２つの第１の溝８と第１の窪み７とで囲まれた領域には略コの字状の仕切り５が設けられている。そして、該２本の第１の溝８の間には、細胞を吸引するための第２の溝３が、仕切り５を隔てて形成されている。この第２の溝３は細胞等の粒子を吸引するためのマイクロチャネルとして機能する。一方、仕切り５の中には、吸引に使用される第２の貫通孔４が設けられている。この第２の貫通孔４は、第２の窪み２の中に設けられている。すなわち、第２の貫通孔４と、第２の窪み２と、第２の溝３とが連通している。第２の貫通孔４の裏面側から吸引することによって、第２の溝３の先端に細胞等の粒子が吸引トラップされる。隣り合う組の第１の溝８の間には第１の溝８の幅を規制する境界ブロック６が設けられる。すなわち、仕切り５と境界ブロック６との間の幅が第１の溝８の幅となる。

この１組の第１の溝８とその間に配置された第２の溝３及び該第２の溝３に対応する第２の窪み２とが１つのマイクロチャネル群となり、複数のマイクロチャネル群が第１基板１の端面１０に沿って配列される。すなわち、１つのマイクロチャネル群にはマイクロチャネルとなる３つの溝が設けられている。そして、第２の溝３は１組の第１の溝８の中間に配置される。従って、１つのマイクロチャネル群は同軸マイクロチャネル構造となる。すなわち、第２の溝３の両側に第１の溝８が形成され、同軸構造となる。この構成を第１基板１の接合面上に繰り返し設けることによって、２種類のマイクロチャネルをそれぞれ複数持つ同軸マイクロチャネルアレイが形成される。マイクロチャネルアレイの第２の溝３に対し、１組の第１の溝８の位置関係は非対称であってもよく、片側の方の溝数が多い構造であってもよい。

ここで、仕切り５の端部は端面１０の内側に位置している。これにより、端面１０の近傍で第１の溝８と第２の溝３とが連通する構成となる。境界ブロック６の端部は端面１０まで設けられており、隣り合う組の第１の溝８を仕切っている。

この第１基板１の接合面と第２基板１１を対向配置して接合させる。通常、第２基板１１の端面が第１基板の端面１０とほぼ一致するように密着する。第２基板１１としては、例えば透明なガラス基板、アクリル樹脂基板等が用いられる。これにより、顕微鏡等での観察が容易になる。第１基板１と第２基板１１を密着させた状態では、隣り合う境界ブロック６の間が開口している。そして、第２の貫通孔４から吸引することにより、細胞等の粒子がトラップされる。すなわち、第２の溝３に対応する位置が粒子トラップ用開口端となる。仕切り５の端部が端面１０の内側に配置されるため、端面１０の周辺に細胞の分化・増殖のための空間が形成される。この空間は第１基板１の端面１０に設けられた凹部であり、その幅は隣り合う境界ブロック６の間隔で決定される。また、空間の奥行きは仕切り５から端面１０までの距離で決定され、高さは第１の溝８と第２の溝３とが連通する領域の深さで決定される。

この空間の高さは、吸引トラップする細胞等の粒子のサイズと同じであってもよいし、若干小さくても、また若干大きくてもよい。細胞を狭い空間のなかにトラップすることにより、短い培養期間で細胞を成長させることが可能となる。

細胞２０が端面１０でトラップされている様子を図２に示す。第１基板１と第２基板１１が密着した状態では、第２の溝３に対応する領域が端面１０において開口している。ここで、第２の貫通孔４の裏面側から吸引を行うと、前記開口端に細胞２０がトラップされ、保持される。すなわち、細胞の分化・増殖のための空間に細胞２０の一部が入り込む。しかし、第２の溝３の幅は細胞２０の大きさよりも若干小さいので、細胞２０は第２の溝３の先端である仕切り５の端部で確実にトラップされる。また、細胞２０の一部は第１基板１の端面１０の外側にはみ出しているため、顕微鏡により容易に観察を行うことができるのみならず、マイクロインジェクション操作により遺伝子等の物質の注入を正確に行うことができる。このとき、細胞２０の一部は、両側の仕切り５、第１基板１及び第２基板１１で囲まれた領域を塞いでいるので、第１の溝８からの培養液は第２の溝３には流入せず、第２の貫通孔４からの吸引の効果を阻害することはない。

一般に、細胞培養・組織化試験において、細胞の分化・増殖速度は、分化・増殖のための空間のサイズに依存することが知られている。したがって、細胞をトラップする空間は、吸引トラップする細胞のサイズとほぼ同じであることが好ましい。これにより、細胞の分化・増殖速度を高めることが可能となる。

仕切り５の端部は第１基板の端面１０の内側に設けられることが好ましい。一方、境界ブロック６の端部は、仕切り５の端部よりも端面１０側に配置することが好ましい。例えば、図１に示す構成では、仕切り５の間の幅が８０μｍとなっている。そのため、例えば、１００μｍ程度の細胞は両側の仕切り５によって塞き止められ、第２の溝３に吸引トラップされる。この後、細胞が安定化してサイズが第２の溝３よりも大きくなると、細胞が第１基板１と第２基板１１との間に挟まれる。さらにサイズが大きくなると、境界ブロック６がガイドとなって、細胞の位置が固定される。この状態では、吸引トラップの吸引力を低くしても、細胞の位置がゆらぐおそれはなく、吸引トラップによる細胞の外殻等の損傷を防止することが可能となる。その上、細胞の分化・増殖速度が大きくなる。

細胞の安定化・分化・増殖のための空間の高さは第１の溝８及び第２の溝３の深さに基づいて定められ、空間の幅は隣り合う境界ブロック６の間隔に基づいて定められ、また、空間の奥行きは端面１０から仕切り５の端部までの距離に基づいて定められる。一般的には、空間の高さ、幅及び奥行きは、それぞれ０．１〜３００μｍの範囲であることことが好ましく、１〜２００μｍの範囲がより好ましい。

マイクロチャネルの第１の溝８及び第２の溝３の幅及び深さは、それぞれ０．１〜３００μｍの範囲であることが好ましく、１〜２００μｍの範囲がより好ましい。また、前記溝の幅と深さの比は、対象とする細胞等の粒子の形状、変形能に応じて、１：１０〜１０：１の範囲で適宜選択することが好ましい。

第１基板１と第２基板１１とを密着させて使用する場合、細胞試料の他に細胞断片等の不純物が混在しているため、吸引口に該不純物が吸引されて閉塞するおそれがある。これを防ぐためには、両基板を超音波、レーザー、熱等によって完全に接着する代わりに、単に重ね合わせて密着させればよい。これにより、使用後、基板を取り外して洗浄することが可能となり、容易に詰まりを取り除き、再使用に供することができる。

本発明のマイクロチャネルアレイは、前記第１基板の接合面の溝構造が、その端面１０に沿って複数並列に並んでいる構造を有する。このような構造とすることで、マイクロインジェクション操作の効率をさらに高めることが可能となる。すなわち、一部の吸引口が細胞断片等の不純物によって閉塞しても、他の部分で細胞等の粒子が吸引トラップされていれば、マイクロインジェクション操作を続行することができる。

本発明のマイクロチャネルアレイにおいて、図１に示す構成のように、複数並列に並んだ第１の溝８と接続された第１の窪み７を形成することで相互に第１の溝８が連通される。この第１の窪み７は、第１の貫通孔９を有する。第１の貫通孔９の数は複数であってもよいが、マイクロチャネルアレイの作製コストの観点からは少ない方が好ましい。また、第１の貫通孔９から培養液等を供給する場合、培養液の供給口と第１の貫通孔９との位置を合わせる必要があるので、この観点からも第１の貫通孔９の数は少ない方が好ましく、ただ１つであることがより好ましい。このとき、第１の貫通孔９の大きさは、それぞれのチャネルに十分な培養液を供給するのに必要な大きさであることが好ましい。

一方、第２の窪み２に含まれる第２の貫通孔４は、通常仕切り５で囲まれた領域毎に形成する。この場合、第２の貫通孔４の数は複数である。図３は第１基板１の接合面の反対側の面（裏面）の構成を示す平面図である。図３に示すように第１基板１の裏面には第１の貫通孔９及び第２の貫通孔４が設けられている。第２の貫通孔４は第２の溝３の本数に対応して、複数設けられている。そして、隣り合う第２の貫通孔４が第３の溝１５によって連通している。この形態以外にも、例えば、第２の貫通孔４を第３の窪みの中に形成して、複数の第２の貫通孔４を接続してもよい。これにより、複数の第２の貫通孔４に均等な吸引力がかかり、過度の吸引による細胞の外殻等の損傷を防止することができる。また、吸引に際して吸引口と第２の貫通孔４との位置を合わせる必要があるので、この観点からも第２の貫通孔が互いに接続されていることが好ましい。

第２の貫通孔４の直径又は幅は、マイクロチャネルの数、必要とされる吸引力に応じて、１０〜２０００μｍの範囲で適宜選択することが好ましく、２０〜１０００μｍがより好ましい。

本発明のマイクロチャネルアレイを製造する方法としては、金属構造体を用いた樹脂成形、精密機械切削、ウェットエッチング、ドライエッチング、レーザー加工、放電加工等が挙げられる。用途、要求される加工精度、コスト等を考慮し、これらの製造方法を適宜選択することが好ましい。

金属構造体を型として用い、樹脂成形によって樹脂成形品を製造する方法は、金属構造体の形状を高い精度で樹脂成形品に再現することを可能とし、高い寸法精度を満足する点で優れている。また、汎用の樹脂材料を使用することにより材料コストを低くできるので、大量生産に適している。上記金属構造体は、そのまま金属型として用いてもよいし、予め用意した金属型内部にセットして用いてもよい。

上記金属構造体の製造方法は、フォトリソグラフ法によって作製されたレジストパターンへのメッキ処理、精密機械切削、ウェットエッチング、ドライエッチング、レーザー加工、放電加工等が挙げられ、用途、要求される加工精度、コスト等を考慮し、適宜選択することが好ましい。

樹脂成形品の製造方法としては、例えば射出成形、プレス成形、モノマーキャスト成形、溶剤キャスト成形、ホットエンボス成形、押出成形によるロール転写法等を挙げることができ、生産性、型転写性の観点から射出成形が好ましく用いられる。射出成形の場合、１枚の金属構造体で１万枚〜５万枚、場合によっては２０万枚もの樹脂成形品を得ることができ、金属構造体の製作にかかる費用負担を大幅に軽減することが可能である。また、射出成形１サイクルに必要な時間は５秒〜３０秒と短く、生産性の面で極めて有利である。多数個取りの金属構造体を使用すれば、さらに生産性を向上することが可能となる。

使用する樹脂材料としては特に限定されないが、例えば、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、メタクリル・スチレン系共重合樹脂（ＭＳ樹脂）、ポリカーボネート系樹脂、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール共重合樹脂、スチレン系エラストマー等の熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、ポリジメチルシロキサン等のシリコーン樹脂、ポリビニルブチラール系樹脂等が挙げられる。これらの樹脂は必要に応じて滑剤、光安定剤、熱安定剤、防曇剤、顔料、難燃剤、帯電防止剤、離型剤、ブロッキング防止剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤等の１種又は２種以上を含有することができる。

細胞等の粒子を吸引トラップする際、第１基板及び第２基板の端面が粗いと、細胞が接触した際に外殻等が損傷する可能性があるため、これらの端面はできるだけ平滑にしておくことが望ましい。平滑にするための方法は、基板材料によって適宜選択される。基板材料にシリコンを用いた場合には、レーザーカット、粗いダイシング刃と緻密なダイジング刃による２段階の研磨処理等が挙げられ、基板材料に樹脂を用いた場合には、熱刃による溶断、レーザーカット、ダイシング、機械切削による面取り、研磨処理等が挙げられる。

第１の貫通孔９及び第２の貫通孔４を形成する方法もまた、基板材料によって適宜選択される。基板材料にシリコンを用いた場合には、レーザーカット、ウェットエッチング、ドライエッチング、サンドブラスト等が挙げられ、基板材料に樹脂を用いた場合には、レーザーカット、レーザーアブレーション、機械切削等が挙げられる。
本発明のマイクロチャネルアレイの表面の水に対する接触角は、０．５°以上７０°以下であることが好ましく、１°以上５０°以下がより好ましい。

本発明のマイクロチャネルアレイの窪み及び溝によって形成される空間が流路として機能するには、細胞培養液、生理食塩水、血液試料、試薬等の水系液体との親和性があること、すなわち親水性であることが好ましい。親水性でない場合、前記の水系液体が流路を流れなくなるか、流れにくくなるおそれがある。また、気泡が混入して前記の水系液体の流れを阻害するおそれがある。

特に、血液試料を用いる場合は親水化が必要となる。血液成分における血球細胞（赤血球、白血球、血小板）は、疎水表面に粘着しやすいので、流路の表面が疎水性であると、流路内に固定化し、流路を閉塞させるおそれがある。

例えば、基板材料として一般に使用されるポリメチルメタクリレートの、水に対する接触角は約６８°、ポリカーボネート樹脂では約７０°、またポリスチレン樹脂では８４°であり、場合によっては親水化処理を施して接触角を小さくすることが必要となる。

材料表面を親水化する方法は、化学的処理と物理的処理に大別される。化学的処理としては、薬品処理、溶剤処理、カップリング剤処理、モノマーコーティング、ポリマーコーティング、無機材料コーティング、蒸気処理、表面グラフト化、電気化学的処理、陽極酸化等が挙げられる。物理的処理としては、紫外線照射処理、プラズマ接触処理、プラズマジェット処理、プラズマ重合処理、蒸着重合処理、熱酸化処理、イオンビーム処理、機械的処理等が挙げられる。以下に、適用可能な処理方法について説明する。

コーティングは、例えば水溶液中の親水性ポリマー（ポバール等）をディッピング法、スピンコート法等によって材料表面にコートし、乾燥させる方法である。マイクロチャネルアレイの疎水性が高い等の場合には、コーティング材料が表面にはじかれて均一なコーティング膜厚が得られず、改質効果にバラツキを生じるおそれがあるので、コーティング材料の選択が必要な場合がある。疎水性表面へのコーティングが可能な材料としては、例えば、日本油脂株式会社（NOF Corporation）製の「リピジュアーピーエムビー」（Lipidure-PMB）（リン脂質極性基を有するＭＰＣポリマーとブチルアクリレートの共重合ポリマー）等が挙げられる。この方法は、大型装置を必要とせず、比較的簡便な工程で効果が得られる反面、超音波洗浄等によってコートがはがれるおそれがある。この場合は、再使用の前に再度コーティングを施すか、ディスポーザブル用途に使用することが好ましい。

真空蒸着は蒸気処理のひとつで、真空中（１０^−２Ｐａ以下の圧力）で薄膜化しようとする物質を加熱して蒸発させ、その蒸気を適当な材料表面に付着させる方法である。この方法は、大型装置を必要とせず、比較的低い真空度で処理が可能であり、コスト面で有利である。

スパッタリングはプラズマ処理のひとつで、低気圧グロー放電で生じた陽イオンを電界で加速して陰極に衝突させ、陰極側の物質を叩き出して、陽極側に堆積させる方法である。この方法は、使用される材料が豊富であり、例えば、ＳｉＯ₂、Ｓｉ₃Ｎ₄等の無機材料を用いることができる。また、超音波洗浄等にも耐えられるので、繰り返して複数回使用することができる。さらに、耐溶剤性にも優れているので、溶出物が細胞等を害することがなく、バイオエンジニアリング用途にも使用可能である。

またさらに、スパッタリングを用いると、堆積膜の厚みを容易に均一にすることができ、例えば、ＳｉＯ₂、Ｓｉ₃Ｎ₄等の無機材料を１０ｎｍ〜３００ｎｍ堆積することで材料表面の親水化が可能となる。さらに、ＳｉＯ₂膜を１０ｎｍ〜５０ｎｍ堆積すれば、透明性と親水化の両立も可能である。

スパッタリングを用いて材料表面と堆積膜との密着性を改善するには、事前に材料の水分を十分に除くことが重要である。その他、材料表面のアルゴンガス等によるエッチング処理、又は、クロム等の密着性のよい無機材料の予備堆積も有効である。

スパッタリングを用いる場合は、耐熱温度として５０℃〜１１０℃程度が必要であるので、熱可塑性樹脂を材料として用いた場合には、１）それ以上のガラス転移温度を有する熱可塑性樹脂、例えば、ポリカーボネート等を選択する、２）スパッタリング処理時間を短くする（膜厚を薄くする）等の条件を選択することが重要である。

インプランテーション処理はプラズマ処理のひとつで、熱可塑性樹脂を材料として用いた場合に、プラズマによって材料表面の分子を活性化し、生成したラジカルを再結合させて、新しい官能基を材料表面に導入する方法である。この方法によれば、親水性のみならず、他の性質を材料表面に付与することができる。

プラズマ重合処理はプラズマ処理のひとつで、高分子材料の原料となる単量体を気化させて気相輸送し、プラズマ中での電子衝突励起により単量体を活性化させて重合反応を起こすことにより高分子膜を材料表面に成膜する方法である。この方法は、膜厚の制御が容易であるのみならず、未反応の単量体や溶媒が残存しないので、これらが細胞等を害することがなく、バイオエンジニアリング用途にも使用可能である。

蒸着重合処理は、熱により単量体を活性化させて重合反応を起こす点で、上記のプラズマ重合処理と異なるが、それ以外の点はほぼ同じである。

熱酸化処理は、シリコン等の無機材料を使用した場合に、高温度条件下に材料を暴露することにより、材料表面を酸化する方法である。通常、真空装置内で材料を酸素プラズマ雰囲気下に暴露して熱酸化を促進する。

エキシマＵＶ処理は紫外線照射処理のひとつで、熱可塑性樹脂を材料として用いた場合に、アルゴン、クリプトン、キセノン等の放電ガスを使用したエキシマランプを使用して、発光中心波長１２０ｎｍ〜３１０ｎｍの範囲の紫外線を照射することによって、材料表面の分子を解離させ、軽い水素原子を引き抜いて、親水性の高い水酸基等の官能基を形成する方法である。この方法は、熱可塑性樹脂の親水化において、必要とされる耐熱温度が低く、ガラス転移温度が１００℃のポリメチルメタクリレートにも適用が可能である。

エキシマＵＶ処理は、紫外線の露光量の増加に伴い親水性が高くなる一方、同時に表面に接着性が付与される場合もあり、別の問題を生じるおそれがあるので、必要とされる親水性の程度に応じて適宜露光量を調節することが必要である。

親水化の他の方法としては、材料を適宜選択する方法が挙げられる。例えば、血球細胞を取り扱う場合は、血球細胞の疎水性表面への固定のみならず、血小板の血液凝固作用による表面への付着をも抑制する必要がある。好適な材料としては、血小板を凝固させないヘパリンを含有する材料、血小板由来の血栓を溶かす酵素ウロキナーゼを固定化した材料、血小板やタンパク質の表面への付着を阻害する、ポリビニルアルコール、アクリルアミド、ポリエチレングリコール等の含水率の高い高分子を表面に有する材料、血小板の活性化を防ぐミクロ相分離構造等を表面に有する材料等が挙げられる。最後のミクロ相分離構造の分離サイズは、通常２０ｎｍ〜２０μｍの範囲であり、均一なミクロドメイン構造を有する材料が好ましい。このような構造は、例えば、アモルファス・アモルファス、親水・疎水性、結晶・非結晶、ガラス状態・液状状態等の素材の組み合わせによって実現される。具体的には、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）−スチレン共重合体、ＨＥＭＡ−ブタジエン共重合体、ＨＥＭＡ−スチレンブロック共重合体、結晶性のナイロン６１０と非晶性のポリプロピレンオキサイドとのブレンド物等が挙げられる。

他にも、材料として株式会社クラレ（Kuraray）製の「エクセバール」（EXCEVAL）、ポリビニルブチラール系樹脂等を選択すると好適な場合がある。この場合は、微細な溝形状を保持するため、使用する水溶液の温度は７０℃以下とし、長期間の水への浸漬を避けることが必要である。

本発明のマイクロチャネルアレイは、第１基板１、第２基板１１のいずれか、又は両方を透明とすることが好ましい。これにより、細胞等の粒子及びマイクロチャネルアレイの溝や窪みを、透過照明や落射型反射照明を用いて顕微鏡観察することが可能となり、マイクロインジェクション操作の効率を高めることができる。基板の透明性を規定する光学物性としては、厚さ１ｍｍ板において、全光線透過率８０％以上、ヘイズ値１０％以下が好ましい。

また、顕微鏡観察において高い紫外線透過率が必要な場合、材料としてガラス、特に石英ガラスを使用することが好ましく、熱可塑性樹脂を使用する場合は、紫外線吸収剤の添加されていない材料や、分子構造に環構造のような紫外線吸収能を有する構造を含まない材料を使用することが好ましい。

本発明のマイクロチャネルアレイの外形寸法は、製造コストを考慮して、縦、横ともに各々１００ｍｍ以下とし、用途に応じて適宜選択することが好ましい。マイクロチャネルアレイの平面度は、工業的な再現性の観点から１μｍ以上であることが好ましく、また、後述するマイクロチャネルアレイの積層を想定すると２００μｍ以下であることが好ましい。マイクロチャネルアレイの厚さは特に規定されないが、取り扱い時の破損、変形、歪みを考慮し、０．２〜１０ｍｍの範囲であることが好ましい。造形部の寸法精度は、工業的な再現性の観点から厚さの±０．５〜１０％の範囲であることが好ましい。

本発明のマイクロチャネルアレイは、複数の第１基板の向きを揃えて密着して積み重ねることによって、縦方向に複数のトラップ用開口端が形成される。すなわち、第１基板１の、第２基板１１の接合面と反対側の面にさらに第１基板１を積み重ねることができる。このとき、２枚目の第１基板１の溝が形成された面が第２基板側に配置されるようにする。これにより、第１の溝８が第１基板１の縦方向に配置され、トラップ用開口端が接合面と垂直方向に形成される。このように、端面１０の構造を多数形成することによって、マイクロインジェクション操作の効率をさらに高めることが可能となる。第１基板１は２層に限らず、３層以上の積層構造としてもよい。

各基板の位置合わせを行う方法としては、該基板の表面、裏面に凹凸パターンを形成し、重ね合わせ時に位置精度よく密着させる方法、該基板の外形端部を治具により固定化する方法、貫通穴に位置決めピンを用いて固定する方法、ＣＣＤカメラ、レーザー系の光学装置を用いて観察、位置調整する方法等が挙げられる。

２枚目の第１基板１は、最初の第１基板１に含まれる第２の貫通孔４より大きい第２の貫通孔４を有することが好ましい。

マイクロチャネルアレイの高密度化に伴い、第２の貫通孔４の直径は小さくすることが必要になる。この場合、マイクロインジェクション操作において、細胞等の粒子を吸引するのに必要な吸引力が得られない可能性がある。１枚目の第１基板１の第２の貫通孔４より大きい径の第２の貫通孔４を有する第１基板を貫通孔の位置が重なるように位置合わせして積み重ねることにより、高密度化されたマイクロチャネルアレイにおいても、細胞等の粒子を吸引トラップするのに必要な吸引力を得ることが可能となる。

本発明のマイクロチャネルアレイは、材料として熱可塑性樹脂を使用することにより、人工透析、血漿交換等の血液浄化治療で使用されている血液回路等の熱可塑性樹脂と同様、感染性廃棄物として焼却処理が可能である。このようなマイクロチャネルアレイは、ディスポーザブル化による廃棄数量の増大に対しても、焼却処理にて対応が可能であり、重ね合わせに使用する基板も樹脂製とすることで、分別処理を必要とせず、一括した焼却廃棄が可能である。また、ハロゲンを含まないポリメチルメタクリレート等の熱可塑性樹脂を使用することにより、有害物質であるダイオキシンの発生を避けることができ、一般廃棄物の焼却で使用される通常温度の焼却炉にて、容易に焼却ができ、熱資源として再利用が可能である。

本発明のマイクロチャネルアレイは、開口端から細胞培養液、生理食塩水、血液試料、試薬等の流体を出し入れすることにより、バイオテクノロジー分野、医療分野、農業分野、工業分野等において展開が期待できる。

本発明のマイクロチャネルアレイを、細胞又は粒子を出し入れする用途に使用する場合は、細胞、血液成分等の分級、工業用途においては反応、合成等の用途に展開が期待できる。

本発明のマイクロチャネルアレイを用いて、細胞又は粒子をトラップする用途に使用する場合は、バイオテクノロジー分野、特にマイクロインジェクション操作においてその効果を発揮することができる。

本発明のマイクロチャネルアレイを用いて、農業分野、医療分野、食品分野、工業分野等において展開が期待できる、粒子径の揃った水中油単分散微粒子、又は油中水単分散微粒子を製造することができる。

粒子となる分散相は、第２の貫通孔４から第２の溝３を経由して端面１０に導入される。基板表面と分散相のぬれ性の差によって、粒子径の揃った微粒子を作製することができる。水中油単分散微粒子を作製するには基板表面を親水化することが必要であり、一方、油中水単分散微粒子を作製するには疎水化することが必要であり、前述の水に対する接触角を制御する方法にしたがって適宜選択することが望ましい。

本発明のマイクロチャネルアレイを用いて、コアシェル型多層構造微粒子を製造することができる。内側粒子となる分散相を、第２の貫通孔４から第２の溝３を経由して端面１０に導入する。同時に、外側粒子となる分散相を、第１の貫通孔９から第１の溝８を経由して端面１０に導入する。これにより、粒子径の揃ったコアシェル型多層構造微粒子を効率よく製造することができる。

（実施例）
次に、従来のマイクロチャンバーアレイ及びマイクロチャネルアレイと、本発明の同軸マイクロチャネルアレイとを比較して説明する。

作製例１：マイクロチャンバーアレイの作製
アルカテル（Alcatel）社製のドライエッチング装置を用い、縦２０ｍｍ×横２０ｍｍ、厚さ０．２ｍｍのシリコン基板上に、直径６０μｍの貫通穴を１００個作製した。このマイクロチャンバーアレイを比較例として用いる。マイクロチャンバーアレイの外観図を図９に示す。

作製例２：マイクロチャネルアレイの作製
アルカテル（Alcatel）社製のドライエッチング装置を用い、縦１０ｍｍ×横２０ｍｍ、厚さ０．３ｍｍのシリコン基板上に、幅８０μｍ、深さ１００μｍ、長さ５０００μｍのチャネルを１４本作製し、各チャネルを溝で連通した後、溝の中に直径３ｍｍの貫通孔をサンドブラストにより作製した。そして、シリコン基板と同じ寸法のアクリル製基板を密着させ、マイクロチャネルアレイを作製した。マイクロチャネルアレイの外観図を図１０に示す。

作製例３：同軸マイクロチャネルアレイＡの作製
まず、ガラス製の原板にフォトリソグラフ法によってレジストパターンを作製し、該レジストパターンにメッキ処理を施すことによって金属構造体を作製した。次に、該金属構造体を型として用い、材料として株式会社クラレ（Kuraray）製アクリル樹脂（パラペット（PARAPET） Ｇ−ＨＳ）を使用し、射出成形によって同軸マイクロチャネルアレイＡの第１基板を作製した。さらに、該基板上に細胞等を吸引するための直径０．３ｍｍの貫通孔（第２の貫通孔４）をマシニングセンターによって作製し、最後に、基板に略同じ寸法のアクリル製基板（第２基板）を密着させ、図１に示す同軸マイクロチャネルアレイＡを作製した。

この同軸マイクロチャネルアレイＡの形状は、横１６ｍｍ×縦８ｍｍ、厚さ１．０ｍｍの基板上に、マイクロチャネルを２０組有するものであり、各マイクロチャネルは、第１の貫通孔と第２の貫通孔、第１の窪みと第２の窪み、及び第１の窪みと基板端面を連通する第１の溝と第２の溝を有する。細胞等を吸引するための第２の溝３は幅８０μｍ、深さ１５０μｍ、仕切りで隔てた第２の溝３の両側の培養液を供給するための第１の溝８は、幅１００μｍ、深さ１５０μｍである。端面１０における同軸マイクロチャネル間の境界ブロック６の先端と仕切り５の先端との位置関係は、端面１０と境界ブロック６の先端が同位置であるのに対し、仕切り５の先端は境界ブロック６の先端よりも５０μｍ後部に位置する。

接触角測定装置（協和界面科学（Kyowa Interface Science）株式会社製、ＣＡ−ＤＴ・Ａ型）を用い、この同軸マイクロチャネルアレイＡの水に対する接触角を空気中にて測定したところ、７０°であった。また、この同軸マイクロチャネルアレイＡのＳＥＭ観察を行った。外観を図４、微細構造の中央部を図５、端部を図６にそれぞれ示す。

作製例４：同軸マイクロチャネルアレイＢの作製
第１基板と第２基板とを密着させる前に、スパッタリング装置（株式会社アルバック（ULVAC）製、ＳＶ）を用い、両基板にＳｉＯ_２膜を１００ｎｍ堆積させて表面改質を施した以外は、作製例３と同様にして同軸マイクロチャネルアレイＢを作製した。この同軸マイクロチャネルアレイＢの水に対する接触角を空気中にて測定したところ、１１°であった。

作製例５：同軸マイクロチャネルアレイＣの作製
まず、ガラス製の原板に直径１００μｍの微細バイトによる精密機械切削を施して金属構造体を作製した。次に、該金属構造体を型として用い、材料として株式会社クラレ（Kuraray）製アクリル樹脂（パラペット（PARAPET） Ｇ−ＨＳ）を使用し、射出成形によって同軸マイクロチャネルアレイＣの第１基板を作製した。さらに、該基板上に細胞等を吸引するための直径０．３ｍｍの貫通孔（第２の貫通孔４）をマシニングセンターによって作製し、さらに、上記の第１基板と、略同じ寸法のアクリル製基板（第２基板）とに対して、スパッタリング装置（株式会社アルバック（ULVAC）製、ＳＶ）を用い、ＳｉＯ_２膜を１００ｎｍ堆積させて表面改質を施し、最後に、両基板を密着させ、図７に示す同軸マイクロチャネルアレイＣを作製した。

この同軸マイクロチャネルアレイＣの形状は、作製例３の同軸マイクロチャネルアレイＡの形状に似ているが、以下の点で異なる。すなわち、細胞等を吸引するための第２の溝３の深さ、及び仕切りで隔てた第２の溝３の両側の培養液を供給するための第１の溝８の深さはいずれも２００μｍである。

この同軸マイクロチャネルアレイＣの水に対する接触角を空気中にて測定したところ、１５°であった。

（比較例１）
マイクロチャンバーアレイを用いたマイクロインジェクション操作
作製例１で得られたマイクロチャンバーアレイを使用し、培養液中のマイクロチャンバーアレイの表面にウシ卵子細胞を保持し、マイクロインジェクション操作を行った。シリコンを材料としたマイクロチャンバーアレイでは、可視光を透過しないため、落射型反射照明方式で細胞観察を試みたが、貫通孔部では光が反射されず、観察は困難であった。

さらに、針の動く方向と顕微鏡の観察方向とがほぼ同じ（垂直方向）であり、針が顕微鏡の焦点深度の方向で動くため、動きと共に像がぼけて、その位置操作は極めて困難であった。

（比較例２）
マイクロチャネルアレイを用いたマイクロインジェクション操作
作製例２で得られたマイクロチャネルアレイを使用し、培養液中のマイクロチャネルアレイの端面にウシ卵子細胞を保持し、マイクロインジェクション操作を行った。基板端面の開口端で細胞等の粒子を吸引トラップするマイクロチャネルアレイにおいては、粒子トラップ用開口端は、外部から自由にアクセスできる構造になっており、透過照明及び落射型反射照明の両方を用いての顕微鏡観察が可能となった。また、マイクロピペットを動かす方向（ほぼ水平方向）と顕微鏡の観察方向（垂直方向）とがほぼ直交するので、マイクロピペットの移動中であっても細胞を高倍率で観察することができた。

しかしながら、このマイクロインジェクション操作は、細胞等の培養液中での吸引トラップ、マイクロインジェクション操作、細胞等の培養液中での培養といった一連のプロセスの一部分であり、効率が低い。培養液中での細胞の分化・増殖速度も従来と同じであり、１００μｍの卵子細胞が約２００μｍのサイズに分化・増殖するのに５日間程度要した。また、粒子開口端に細胞等の粒子を吸引トラップする際、トラップに必要な吸引力を細胞に与えると細胞外殻が損傷してしまう課題は残されたままである。

（実施例１）
同軸マイクロチャネルアレイＡを用いたマイクロインジェクション操作
作製例３で得られた同軸マイクロチャネルアレイＡを使用し、ウシ卵子細胞を有する培養液中にて、ウシ卵子細胞の固定化を試みた。透過照明による顕微鏡観察によって、２０組の同軸マイクロチャネルアレイ中、４組の同軸マイクロチャネルの開口部（第２の溝３）に、ウシ卵子細胞がトラップされていることが観察された。第２の溝３、及び第１の溝８の一部に気泡の混入が見られたが、吸引及び培養液の供給には影響がなかった。採取直後の卵子細胞であったため、２日間、第１の溝８から新鮮な培養液を供給しながら安定化させた。

次に、マイクロインジェクション操作を、透過照明による顕微鏡観察によって行った。マイクロピペットを動かす方向（ほぼ水平方向）と顕微鏡の観察方向（垂直方向）とがほぼ直交するので、細胞を高倍率で観察することができ、卵子細胞を破壊することなく、一つの卵子細胞の外殻の硬さ等に最適な針操作を行うことができた。このマイクロインジェクション操作時の細胞及び同軸マイクロチャネルアレイＡの顕微鏡写真を図８に示す。下側の第１基板１に設けられた第２の溝３から細胞を吸引することができた。そして、その両側の第１の溝８からは培養液を供給することができた。この細胞に細胞刺入用ガラスマイクロピペットを用いて遺伝子等の物質を注入することができた。

次に、同軸マイクロチャネル内でウシ卵子細胞の分化・増殖を試みたところ、１００μｍの卵子細胞が、３日目には約２００μｍのサイズに達していることが確認された。第１の溝８から常に新鮮な培養液が供給される環境の下、高さ１５０μｍ、奥行き５０μｍの狭い空間で細胞を培養することによって、細胞の分化・増殖速度を速くすることに成功したものと推測される。

同軸マイクロチャネルアレイを使用することにより、安定化、マイクロインジェクション操作、培養液中での細胞の分化・増殖の一連の操作を連続して行うことができ、マイクロインジェクション操作の効率を飛躍的に高めることが可能となった。また、数日間、トラップした卵子細胞の外殻を破壊することなく保持できたのは、空間によって、必要最小限の吸引力で卵子細胞を固定化できたためである。

（実施例２）
同軸マイクロチャネルアレイＢを用いたマイクロインジェクション操作
作製例４で得られた同軸マイクロチャネルアレイＢを使用し、実施例１と同様にして、安定化、マイクロインジェクション操作、培養液中での細胞の分化・増殖の一連の操作を行ったところ、同軸マイクロチャネルアレイＡと同様に、マイクロインジェクション操作の効率を飛躍的に高めることが可能となったのみならず、実施例１で見られた気泡の混入が本実施例では見られず、親水化処理による完全な気泡の排除が確認された。

（実施例３）
同軸マイクロチャネルアレイＣを用いたマイクロインジェクション操作
作製例５で得られた同軸マイクロチャネルアレイＣを使用し、実施例１と同様にして、安定化、マイクロインジェクション操作、培養液中での細胞の分化・増殖の一連の操作を行ったところ、同軸マイクロチャネルアレイＢと同様に、マイクロインジェクション操作の効率を飛躍的に高めることが可能となったのみならず、親水化処理による完全な気泡の排除が確認された。一方、１００μｍの卵子細胞が約２００μｍのサイズに分化・増殖するのに、実施例１及び２よりも１日長い４日間必要であった。空間の高さを２００μｍと大きくしたことに起因すると予測され、対象とする細胞のサイズに応じて、最適な空間のサイズを選択することが必要であると考えられる。

本発明によれば、細胞の分化・増殖速度を高めることができるマイクロチャネルアレイを提供することができる。

Claims (14)

1. 第１基板と、該第１基板と接合される第２基板とを有し、該第１基板の接合面に形成された溝によって該第１基板の端面に粒子トラップ用開口端が形成されるマイクロチャネルアレイであって、（ａ）該第１基板を貫通する第１の貫通孔と、該第１の貫通孔を有する第１の窪みと、該第１の窪みと該第１基板の端面とを連通する複数の第１の溝、（ｂ）該第１基板を貫通する第２の貫通孔と、該第２の貫通孔を有する第２の窪みと、該第２の窪みと該第１基板の端面とを連通する第２の溝、及び、（ｃ）該第１の窪みと該第２の窪みの間を隔てる仕切り、を該第１基板の接合面に有し、且つ、該第２の溝が、隣り合う該複数の第１の溝の間に該仕切りを隔てて配置されてなることを特徴とするマイクロチャネルアレイ。
2. 前記第１の溝の幅及び深さが０．１〜３００μｍであり、且つ、前記第１の溝の幅と深さの比が１：１０〜１０：１である、請求項１に記載のマイクロチャネルアレイ。
3. 前記第２の溝の幅及び深さが０．１〜３００μｍであり、且つ、前記第２の溝の幅と深さの比が１：１０〜１０：１である、請求項１又は２に記載のマイクロチャネルアレイ。
4. 前記隣り合う複数の第１の溝と、その間に前記仕切りを隔てて配置されてなる前記第２の溝と、該第２の溝に対応する前記第２の窪みと、を１組のマイクロチャネル群として、前記１組のマイクロチャネル群が前記第１基板の端面に沿って複数配列されてなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のマイクロチャネルアレイ。
5. 前記複数のマイクロチャネル群中の、前記第２の窪みに含まれる前記第２の貫通孔のそれぞれが、前記第１基板の裏面において接続されている、請求項４に記載のマイクロチャネルアレイ。
6. 表面の水に対する接触角が、０．５°以上７０°以下である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のマイクロチャネルアレイ。
7. 前記第１基板及び前記第２基板の少なくとも一方の基板が透明である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のマイクロチャネルアレイ。
8. さらに前記第１基板と接合される少なくとも１つの別の第１基板を有し、複数の該第１基板の端面に粒子トラップ用開口端が前記接合面と垂直方向に複数形成される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のマイクロチャネルアレイ。
9. 前記別の第１基板に含まれる前記第２の貫通孔が、前記第１基板に含まれる前記第２の貫通孔よりも大きい、請求項８に記載のマイクロチャネルアレイ。
10. 請求項１〜９のいずれか１項に記載のマイクロチャネルアレイの、前記第１の溝及び前記第２の溝の少なくとも一方を介して、前記第１基板の端面から流体を出し入れする方法。
11. 請求項１〜９のいずれか１項に記載のマイクロチャネルアレイの、前記第１の溝及び前記第２の溝の少なくとも一方を介して、前記第１基板の端面から粒子を出し入れする方法。
12. 請求項１〜９のいずれか１項に記載のマイクロチャネルアレイの、前記第１の貫通孔及び前記第２の貫通孔の少なくとも一方から吸引し、前記第１基板の端面に粒子をトラップする方法。
13. 請求項１〜９のいずれか１項に記載のマイクロチャネルアレイの、前記第２の溝から分散相を導入する、水中油分散微粒子又は油中水単分散微粒子の製造方法。
14. 請求項１〜９のいずれか１項に記載のマイクロチャネルアレイの、前記第２の溝から分散相を導入して内側粒子とし、前記第１の溝から別の分散相を導入して外側粒子とする、コアシェル型多層構造微粒子の製造方法。