CN101014697B - 微通道阵列 - Google Patents

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Abstract

本发明的微通道阵列，具有第一基板1、与该第一基板1接合的第二基板11。在该第一基板上具有如下两组，即，由第一贯通孔9、第一凹陷7和第一沟8构成的组，以及由第二贯通孔4、第二凹陷2和第二沟3构成的组。种类不同的组间，通过隔段5隔开。通过使用这样的微通道阵列，可在微注射操作后，加快细胞分化、增殖速度。

Description

微通道阵列
技术领域
本发明涉及微通道阵列，尤其是涉及吸引捕获细胞等粒子的微通道阵列。
背景技术
以微注射操作所代表的，将基因导入细胞内的技术开发，在提高具有有用特质的动植物物种和微生物物种的育种效率方面，尤为关键；到目前为止，基于准确性和有效性这两种观点，已开发出多种方法。
例如，为提高操作效率，本发明人开发了如下技术：使用规则排列有多个注入针的微毛细管阵列，和在其对应位置具有腔室的微腔室阵列，将DNA一并注入到微腔室阵列保持的所有细胞内(参照专利文献1)。然而，在采用该方法时，由于各种细胞的形状、大小和弹力等的不均一，很难充分对应，常常会发生如下情况：注入针不能刺入细胞，或者即使是刺入了，要么太浅、要么太深，因而不能很好地将DNA一并注入。此外，由于针的移动方向和显微镜的观察方向基本相同，因而，难以一边进行显微镜观察，一边进行操作；此外，即使能够进行显微镜观察，由于针是在显微镜焦点深度的方向移动，因此会存在图像在针移动的同时变模糊，造成其位置操作变难的问题。
于是，本发明人从操作准确性的观点，进一步研究，开发了在基板端面的开口端吸引捕获细胞等粒子的微通道阵列(参照专利文献2)。使用该微通道阵列，在进行微注射操作时，由于针的移动方向和显微镜的观察方向基本直交，因而可边进行显微镜观察边操作，可以更准确、更容易地将DNA等物质刺入到细胞内。
然而，在使用上述微通道阵列时，在吸引、捕获细胞时，常常会损伤细胞。此外，尽管该微通道阵列适用于微注射操作，但由于其并不适用于操作前的细胞培养、以及操作后的细胞分化和增殖，因而，在操作前必须在其它地方培养细胞，操作结束后还必须在其它地方进行细胞分化、增殖，就操作整体而言，会有效率低下的问题。更为深刻的问题是，不能加快细胞分化、增殖速度。
专利文献1：特开2000-23657号公报；
专利文献2：特开2002-27969号公报。
发明内容
发明要解决的问题
这样，以前的微通道阵列存在不能加快细胞分化、增殖速度的问题。鉴于上述问题，本发明的目的是提供能够加快细胞分化、增殖速度的微通道阵列。
解决问题的手段
上述目的通过如下微通道阵列实现：该微通道阵列是具有第一基板和与该第一基板接合的第二基板，借助形成于该第一基板接合面的沟，在该第一基板的端面形成粒子捕获用开口端的微通道阵列，其特征在于，在该第一基板的接合面具有(a)贯通上述第一基板的第一贯通孔，具有上述第一贯通孔的第一凹陷，连通上述第一凹陷和上述第一基板端面的多个第一沟；(b)贯通上述第一基板的第二贯通孔，具有上述第二贯通孔的第二凹陷，连通上述第二凹陷和上述第一基板端面的第二沟；以及(c)将上述第一凹陷和上述第二凹陷之间隔开的隔段；并且，设置使上述第二沟和相邻的上述多个第一沟之间由上述隔段隔开。
发明效果
根据本发明，可提供能够加快细胞分化、增殖速度的微通道阵列。
附图说明
图1是本发明微通道阵列A的构造的示意图。
图2是表示示本发明微通道阵列A的细胞吸引时的状态的断面图。
图3是本发明微通道阵列A的背面侧的构造的示意图。
图4是表示本发明微通道阵列A的外观的扫描电子显微镜(SEM)照片。
图5是表示本发明微通道阵列A的中心部的微细构造的SEM照片。
图6是表示本发明微通道阵列A的端部的微细构造的SEM照片。
图7是本发明微通道阵列C的构造的示意图。
图8是表示使用本发明微通道阵列A，通过微注射操作注入物质时的情况的显微镜照片。
图9是以前的微腔室阵列的构造的示意图。
图10是以前的微通道阵列的构造的示意图。
其中，1第一基板，2第二凹陷，3第二沟，4第二贯通孔，5隔段，6界面阻隔，7第一凹陷，8第一沟，9第一贯通孔，10端面，11第二基板，15第三沟，20细胞。
具体实施方式
以下参照附图，说明本发明的实施方式。以下说明表示本发明的优选实施方式，本发明范围并不局限于下述实施方式。在以下说明中，标有同一符号的地方表示实质上相同的部位。
本发明的微通道阵列，将细胞等粒子吸引捕获于形成于第一基板端面的粒子捕获用开口端。由此，在微注射操作中，移动微量移液管(micropipette)的方向(基本上是水平方向)和显微镜观察方向(垂直方向)基本直交，因此，可在高倍率下进行观察，并在焦点深度内进行微移液器前端的操作。在显微镜观察时，由于透射照明和落射型反射照明都能够使用，因此不但能以透射照明观察细胞等粒子，同时还能以落射型反射照明观察形成有凹陷和沟的微通道侧。因此，可更准确、更容易地将DNA等物质刺入到细胞内。
此外，在捕获细胞等粒子的第二沟的两侧，以隔段隔开，设有第一沟，例如，可通过第一贯通孔和第一沟，从第一沟不断向第二沟内捕获的细胞等粒子供给新鲜的培养液。通过这种方法在培养液中吸引捕获细胞等粒子，并进行微量注射操作后，可直接在培养液中培养细胞等粒子，因此，可飞跃性提高一系列操作效率。
以图1说明该第一基板的构造。图1是本发明微通道阵列构造的示意图。图1上部显示的是本发明微通道阵列使用的第一基板1的俯视图。图1下部显示的是第一基板1和第二基板11相接合构成微通道阵列时的断面图。图1中，表示各部分大小的数字的单位是μm。第一基板1中心部设置有用于供给细胞培养液的第一贯通孔9。该第一贯通孔9位于第一凹陷7中。并且，从第一凹陷7到第一基板1的端面10形成第一沟8。由此，第一贯通孔9、第一凹陷7和第一沟8之间连通。通过从第一贯通孔9背面侧供给培养液，培养液经由第一凹陷7流入第一沟8。由于第一沟8一直延伸到第一基板1的端面10，所以培养液从端面10流出。即，第一沟8成为供给培养液的微通道。第一沟8以两个沟为一组，形成多个组。上述第一沟8之间的间隔是固定的，因此，相邻组之间的间隔也恒定是固定的。
大致呈“コ”字状的隔段5位于上述两个第一沟8和第一凹陷7所包围的区域。并且，在上述两条第一沟8之间，以隔段5隔开，形成为吸引细胞的第二沟3。该第二沟3作为吸引细胞等粒子的微通道，发挥作用。另一方面，隔段5中，设有吸引用的第二贯通孔4。该第二贯通孔4位于第二凹陷2中。即，第二贯通孔4、第二凹陷2和第二沟3之间连通。通过从第二贯通孔4背面侧吸引细胞等粒子，将其吸引捕获于第二沟3的前端。相邻组的第一沟8之间，设有界面阻隔6，限制第一沟8宽度。即，隔段5和界面阻隔6之间的宽度就是第一沟8的宽度。
上述一组第一沟8和其间设置的第二沟3，以及该第二沟3所对应的第二凹陷2，构成一个微通道群，多个微通道群沿第一基板1的端面10排列。即，一个微通道群中，设有3个构成微通道的沟。并且，第二沟3位于一组第一沟8之间。由此，一个微通道群形成同轴微通道结构。即，在第二沟3两侧，形成第一沟8，构成同轴结构。通过将该结构在第一基板1的接合面上重复设置，形成分别具有多个2种微通道的同轴微通道阵列。一组第一沟8相对于微通道阵列的第二沟3的位置关系，既可以是非对称关系，也可以是单侧有多条沟的结构。
其中，隔段5的端部位于端面10的内侧。由此，在端面10的附近形成第一沟8和第二沟3相互连通的结构。界面阻隔6的端部直达端面10，将相邻组的第一沟隔开。
上述第一基板1的接合面和第二基板11对置接合。通常，对第二基板11的端面和第一基板的端面10进行贴合使其基本上一致。第二基板11，例如可以使用透明玻璃基板、丙烯酸树脂基板等。由此，容易用显微镜等进行观察。在第一基板1和第二基板11贴合的状态下，相邻界面阻隔6之间呈开口状。于是，通过从第二贯通孔4吸引细胞等粒子，将其捕获。即，第二沟3的对应位置成为粒子捕获用开口端。由于隔段5的端部位于端面10的内侧，使得在端面10的周边形成供细胞分化、增殖的空间。该空间是设置于第一基板1的端面10的凹部，其宽度取决于相邻界面阻隔6的间隔。此外，该空间向深度方向的距离取决于隔段5到端面10的距离，高度取决于第一沟8和第二沟3之间连通区域的深度。
该空间的高度，可以和吸引捕获的细胞等粒子的大小一样，也可以小一些或大一些。通过将细胞捕获于狭小空间中，有可能在短的培养期内使细胞生长。
细胞20在端面10被捕获的情形如图2所示。在第一基板1和第二基板11贴合的状态下，第二沟3所对应的区域在端面10中处于开口状态。这时，若从第二贯通孔4的背面侧进行吸引，细胞20就会被捕获并保持于上述开口端。即，细胞20的一部分进入细胞分化、增殖的空间。然而，由于第二沟3的宽度要比细胞20小一些，所以细胞20可在第二沟3的前端的隔段5的端部被准确捕获。此外，由于细胞20的一部分伸出到第一基板1的端面10的外侧，因此不仅可以容易地进行显微镜观察，而且也可通过微注射操作准确地注入基因等物质。此时，由于细胞20的一部分将两侧的隔段5、第一基板1和第二基板11所包围的区域阻塞，所以来自第一沟8的培养液无法流入到第二沟3中，因此不会影响从第二贯通孔4吸引的效果。
已知细胞培养、组织化试验中，细胞分化、增殖速度通常依赖于分化、增殖空间的大小。因而，捕获细胞的空间，优选和待吸引捕获的细胞的大小基本相同。由此可加快细胞分化、增殖速度。
隔段5的端部优选位于第一基板的端面10的内侧。此外，界面阻隔6的端部优选比隔段5的端部更靠近端面10侧。例如，在图1所示构造中，隔段5之间的宽度为80μm。因此，例如，100μm左右的细胞可被两侧的隔段5阻滞，并吸引捕获于第二沟3。此后，细胞稳定化，其大小变得比第二沟3还大，细胞即被挟持于第一基板1和第二基板11之间。当细胞进一步变大时，界面阻隔6即成为定向装置，将细胞的位置固定。在该状态下，即使降低吸引捕获的吸引力，也不用担心细胞的位置会动摇，可防止因吸引捕获所致的细胞外壁等的损伤。而且，细胞分化、增殖速度加快。
用于细胞稳定化、分化和增殖空间的高度根据第一沟8和第二沟3的深度来定，空间的宽度根据相邻界面阻隔6的间隔来定，此外，该空间的深度根据从端面10到隔段5端部的距离来定。一般而言，该空间的高度、宽度以及深度，优选分别在0.1～300μm范围，更优选在1～200μm范围。
微通道的第一沟8和第二沟3的宽度和深度，分别优选在0.1～300μm范围，更优选在1～200μm范围。此外，上述沟的宽度和深度比，根据对象细胞等粒子的形状、变形能，优选在1∶10～10∶1的范围内适当选择。
在将第一基板1和第二基板11贴合使用时，由于除细胞试料外，还混杂有细胞碎片等不纯物，因此，存在该不纯物被吸引阻塞在吸引口而引起堵塞的危险。为防止其发生，可以简单地将两基板重叠贴合，来替代通过超声波、激光、加热等方法完全粘接在一起。由此，使用后，可将基板取出洗净，能够很容易地去除阻塞，供再次使用。
本发明地微通道阵列，具有多个前述第一基板的接合面沟：沿基板端面10并排排列。通过采用这样的构造，可进一步提高微注射操作的效率。即，即使有一部分吸引口被细胞碎片等不纯物阻塞，只要其他部分能吸引捕获细胞等粒子，就可以继续进行微注射操作。
本发明的微通道阵列中，如图1所示构造，通过形成和多个并排排列的第一沟8相连接的第一凹陷7，而使第一沟8相互连通。该第一凹陷7具有第一贯通孔9。尽管第一贯通孔9的数量可以有多个，但从微通道阵列制作成本的观点看，优选第一贯通孔9的数目少一些。另外，从第一贯通孔供给培养液时，必需使培养液的供给口与第一贯通孔9的位置合在一起，所以从这一观点考虑，优选第一贯通孔9的数量少，更优选只有一个。此时，第一贯通孔9的大小，优选为提供给各通道足够培养液所必需的大小。
此外，包含在第二凹陷2中的第二贯通孔4，通常形成于每个由隔段5包围的区域。此时，第二贯通孔4的数量为多个。图3为第一基板1的接合面的对侧面(背面)的构造的平面图。如图3所示，第一基板1的背面，设有第一贯通孔9和第二贯通孔4。对应第二沟3的条数，设置多个第二贯通孔4。并且相邻的第二贯通孔4通过第三沟15连通。除该形式以外，例如，还可在第三凹陷中形成第二贯通孔4，使得多个第二贯通孔4连接。由此，可以对多个第二贯通孔4施加均等的吸引力，可防止过度吸引造成的细胞外壁损伤。此外，由于吸引时需要将吸引口和第二贯通孔4的位置对合，从该观点看，也优选第二贯通孔相互连接。
根据微通道的数目和所需吸引力，第二贯通孔4的直径或宽度优选在10～2000μm范围内适当选择，更优选20～1000μm。
作为本发明的微通道阵列的制造方法，可以举出采用金属结构体的树脂成型、精密机械切削、湿式蚀刻、干式蚀刻、激光加工、放电加工等方法。考虑到用途和要求的加工精度、成本等因素，优选适当选择上述制造方法。
使用金属结构体作为模具，通过树脂成型制造树脂成型品的方法，能以高精度将金属结构体的形状再现于树脂成型品，在满足高尺寸精度方面，具有优势。此外，由于通过使用通用树脂材料，可降低材料成本，适用于大量生产。上述金属结构体，可以直接作为金属模具使用，也可以组合在预先准备的金属模具内部使用。
上述金属结构体的制造方法，可以举出对采用光刻法制作的光致抗蚀图(resist pattern)进行电镀处理、精密机械切削、湿式蚀刻、干式蚀刻、激光加工、放电加工等方法，考虑到用途和要求的加工精度、成本等因素，优选适当选择。
作为树脂成型品的制造方法，例如，可以举出注塑成型(射出成形)、加压成型、单体浇铸成型、溶剂浇铸成型、热压花成型、通过挤塑成型的辊压转印法等方法，从生产性、模具复制性的观点看，优选采用注塑成型法。在采用注塑成型法时，一枚金属结构体可生产1万到5万枚，甚至20万枚树脂成型品，可大幅度减轻金属结构体制作所需的费用负担。此外，1个注塑成型周期所需时间短到5～30秒，在生产性方面极其有利。若使用多腔的金属结构体，可进一步提高生产性。
作为使用的树脂材料，没有特殊限定，例如可以举出，丙烯酸类树脂、聚乳酸、聚羟基乙酸、苯乙烯类树脂、甲基丙烯酸-苯乙烯类共聚树脂(MS树脂)、聚碳酸酯类树脂、聚对苯二甲酸乙二酯等聚酯类树脂、聚乙烯醇类树脂、乙烯-乙烯醇共聚树脂、苯乙烯类弹性体等热可塑性弹性体、聚氯乙烯类树脂、聚二甲基硅氧烷等硅酮树脂、聚乙烯醇缩丁醛类树脂等。根据需要，这些树脂可含有滑润剂、光稳定剂、热稳定剂、防雾剂、颜料、阻燃剂、防带电剂、脱模剂、防阻塞剂、紫外线吸收剂、抗氧化剂等中的1种或2种或2种以上。
在吸引捕获细胞等粒子时，若第一基板和第二基板的端面粗糙，细胞接触时有损伤外壁等的可能性，因而，优选这些端面尽可能平滑。使界面平滑的方法，根据基板材料适当选择。在以硅作为基板材料时，可举出激光切削、采用粗切割刀片(dicing blade)和细切割刀片(dicingblade)的两步抛光处理等方法；在将树脂作为基板材料时，可以举出由热刀熔断、激光切削、切片(dicing)、通过机械切削进行倒棱，抛光处理等方法。
形成第一贯通孔9和第二贯通孔4的方法，也可根据基板材料适当选择。当采用硅作为基板材料时，可举出激光切削、湿式蚀刻、干式蚀刻、喷砂等方法；当采用树脂作为基板材料时，可举出激光切削、激光烧蚀、机械切削等方法。
本发明的微通道阵列的表面和对水的接触角优选为0.5°以上且在70°以下，更优选为1°以上且50°以下。
由本发明的微通道阵列的凹陷和沟形成的空间，若要作为流路发挥作用，优选与细胞培养液、生理盐水、血液样品、试剂等水性液体具有亲和性，即为亲水性。当为非亲水性时，存在前述水性液体不再流过流路，抑或流动变难的危险。此外，还有可能混入气泡，阻碍上述水性液体流动。
尤其是在使用血液样品时，必需亲水化。由于血液成分中的血细胞(红细胞、白细胞、血小板)容易粘附于疏水表面，若流路表面为疏水性，则有血细胞固定于流路内、阻塞流路的危险。
例如，基板材料常使用的聚甲基丙烯酸甲酯与水的接触角约为68°，聚碳酸酯树脂与水的接触角约为70°，而聚苯乙烯树脂为84°，根据情况，有必要进行亲水化处理，减小接触角。
材料表面亲水化方法，大致分为化学处理和物理处理法。作为化学处理，可以举出化学品处理、溶剂处理、耦合剂处理、单体涂层、聚合物涂层、无机材料涂层、蒸气处理、表面接枝化、电化学处理、阳极氧化等。作为物理处理，可举出紫外线照射处理、等离子体接触处理、等离子体喷射处理、等离子体聚合处理、蒸镀聚合处理、热氧化处理、离子束处理、机械处理等。以下，对可使用的处理方法进行说明。
涂层法是例如，通过浸渍法、旋涂法将水溶液中的亲水性聚合物(波瓦尔(Poval)等)涂于材料表面，使之干燥的方法。在微通道阵列的疏水性较高等情况下，有涂层材料被表面排斥，无法得到均一厚度的涂膜，致使变性效果参差不齐的危险，因而常常需要挑选涂层材料。作为可用于疏水性表面的涂层材料，例如，可举出日本油脂株式会社(NOF公司)生产的“利辟多”(Lipidure-PMB)(具有磷脂极性基的MPC聚合物和丙烯酸丁酯的共聚物)等。该方法无需使用大型装置，采用较简单的工序即可达到效果，然而却有涂层会因超声波清洗而脱落的危险。此时，优选在再次使用前，再次施以涂层，或者作为一次性使用。
真空蒸镀是蒸气处理的一种，方法如下：对要在真空(10-2Pa以下的压力)中实现薄膜化的物质加热，使其蒸发，并使该蒸气附着于适当的材料表面。该方法无需使用大型装置，可在较低的真空度下进行处理，具有成本优势。
溅射(Sputtering)是等离子体处理的一种，方法如下：使低压辉光放电产生的阳离子在电场中加速并撞击阴极，将阴极侧的物质击出，使其沉积于阳极侧。该方法可使用的材料众多，例如，可使用SiO2、Si3N4等无机材料。此外，由于能够耐受超声波清洗等，可反复多次使用。进而，由于具有优良的耐溶剂性，因而不会发生溶出物损伤细胞等情况，也可用于生物工程用途。
此外，若采用溅射，还可容易地实现沉积膜厚度的均一化，例如，通过沉积10nm～300nm的SiO2、Si3N4等无机材料，可实现材料表面的亲水化。进而，若沉积10nm～50nm的SiO2膜，则透明性和亲水化均可实现。
事先充分去除材料中的水分，对于采用溅射改善材料表面和沉积膜之间的附着性而言，非常重要。此外，以氩气等对材料表面进行蚀刻处理，或者预先沉积铬等附着性好的无机材料，都是有效的。
采用溅射时，由于耐热温度需要控制在50～110℃左右，因而在使用热可塑性树脂作为材料时，1)选择玻璃转化温度高于上述耐热温度的热可塑性树脂，例如，聚碳酸酯等；2)选择缩短溅射处理时间(减小膜厚)等条件，是很重要的。
植入处理是等离子体处理的一种，其方法如下：在使用热可塑性树脂作为材料的情况下，借助等离子体活化材料表面分子，使生成的自由基再次结合，从而在材料表面导入新官能团。根据该方法，不仅可以赋予亲水性，还可赋予材料表面其它性质。
等离子体聚合处理是等离子体处理的一种，其方法如下：使作为高分子材料的原料单体气化，气相输送，通过在等离子体中的电子碰撞激发，活化单体，发生聚合反应，由此，在材料表面形成高分子膜。该方法不仅容易控制膜厚，而且由于未反应的单体、溶剂不残留，因此它们不会损伤细胞等，也可用于生物工程。
蒸镀聚合处理，除了通过加热使单体活化，发生聚合反应这一点，与上述等离子体聚合处理不同，其它方面基本上一样。
热氧化处理是，在使用硅等无机材料的情况下，通过在高温条件下暴露材料，氧化材料表面的方法。通常，在真空装置内，将材料暴露于氧等离子体气氛中，促进热氧化。
受激准分子(excimer)UV处理是紫外线照射处理的一种，方法如下：在使用热可塑性树脂作为材料的情况下，通过使用以氩、氪、氙等作为放电气体的受激准分子灯，照射发光中心波长为120nm～310nm范围的紫外线，使材料表面的分子分解，脱去轻的氢原子，从而形成亲水性高的羟基等官能团。该方法，在热可塑性树脂的亲水化过程中，所需的耐热温度低，还可适用于玻璃转化温度为100℃的聚甲基丙烯酸甲酯。
受激准分子UV处理，在亲水性随着紫外线曝光量的增加而增强的同时，也常常会产生表面粘附性，因而有出现其它问题的危险，因此，有必要根据所需亲水性的程度，适当调节曝光量。
作为亲水化的其它方法，可以举出，适当选择材料的方法。例如，在使用血细胞时，不仅需要将血细胞固定于疏水性表面，还需要抑制因血小板对血液的凝固作用所致的表面粘附。作为适宜的材料，可以举出含有抗血小板凝固的肝素的材料，固定有溶解血小板源性血栓的尿激酶的材料，表面含有聚乙烯醇、丙烯酰胺、聚乙二醇等含水率高的可阻碍血小板、蛋白质向表面粘附的高分子的材料，表面含有可抑制血小板活化的微相分离结构等的材料等。微相分离结构的最终分离大小，通常在20nm～20μm范围，优选具有均一微域结构的材料。该构造，例如可通过无定形·无定形、亲水·疏水性、结晶·非结晶、玻璃态·液态等原材料的组合实现。具体而言，可以举出羟乙基甲基丙烯酸酯(HEMA)-苯乙烯共聚物、HEMA-丁二烯共聚物、HEMA-苯乙烯嵌段共聚物、结晶性尼龙610和非结晶性聚环氧丙烷的混合物等。
此外，有时优选株式会社クラレ(Kuraray)生产的“エクセバ一ル”(EXCEVAL)、聚乙烯醇缩丁醛类树脂等作为材料。此时，为保持微细沟的形状，使用的水溶液的温度需要控制在70℃以下，并避免长时间浸渍于水中。
本发明的微通道阵列，优选第一基板1或第二基板11的任意一方，或者两者均为透明。由此，可采用透射照明、落射型反射照明，对细胞等粒子以及微通道阵列的沟和凹陷进行显微镜观察，可提高微注射操作的效率。作为决定基板透明性的光学物性，优选在1mm厚的板上的全光透过率大于等于80％，混浊度(haze)小于等于10％。
此外，显微镜观察时，当需要高紫外线透过率时，优选使用玻璃尤其是石英玻璃作为材料，在使用热塑性树脂的情况下，优选使用未添加紫外线吸收剂的材料、分子结构中不含像环状结构那样具有紫外线吸收能结构的材料。
本发明的微通道阵列的外形大小，考虑到制造成本，优选长、宽均小于等于100mm，根据用途，适宜选择。微通道阵列的平面度，从工业再现性的观点，优选大于等于1μm，此外，若考虑到后述微通道阵列的层合，优选小于等于200μm。微通道阵列的厚度，尽管没有特殊规定，但考虑到使用时的破损、变形、应力，优选在0.2～10mm范围。造型部的大小精度，从工业再现性的观点出发，优选在厚度的±0.5～10％范围。
本发明的微通道阵列，通过使多个第一基板的方向一致，紧贴重叠放置，可以在纵向上形成多个捕获用开口端。即，可在第一基板1的与第二基板11的接合面的对侧面，再重叠第一基板1。此时，将两个第一基板1的形成有沟的面设置于第二基板侧。由此，第一沟8位于第一基板1的纵向，在与接合面垂直的方向上形成捕获用开口端。这样，通过形成多个端面10的结构，可进一步提高微注射操作的效率。第一基板1并不限于2层，也可以是3层或3层以上的积层结构。
作为各基板的位置契合的方法，可以举出，在上述基板表面、背面形成凹凸图案，使得叠合时能以很高的位置精度紧贴的方法；以夹具将上述基板的外形端部固定化的方法；贯通穴中用定位销进行固定的方法；用CCD照相机、激光类光学装置观察，进行位置调整的方法等。
优选第二个第一基板1的第二贯通孔4比第一个第一基板1中的第二贯通孔4大。
随着微通道阵列的高密度化，有必要缩小第二贯通孔4的直径。此时，在进行微注射操作时，有可能得不到吸引细胞等粒子的必要吸引力。通过对准具有直径比第一个第一基板1的第二贯通孔4大的第二贯通孔4的第一基板的位置，使得贯通孔位置重叠，即使是高密度化的微通道阵列，也可获得吸引捕获细胞等粒子所需的吸引力。
本发明的微通道阵列，通过使用热塑性树脂作为材料，可和人工透析、血浆交换等血液净化治疗中使用的血流通道等的热可塑性树脂一样，作为感染性废弃物，进行焚烧处理。这种微通道阵列，即使是由于一次性使用而导致废弃物增多，也可通过焚烧处理予以解决；叠合使用的基板，也可采用树脂制造，从而可一并焚烧予以废弃，无需分类处理。此外，通过使用不含卤素的聚甲基丙烯酸甲酯等热可塑性树脂，可避免产生有害物质二英(dioxin)，在一般废弃物焚烧使用的通常温度的焚烧炉中，即可容易地焚烧，也可作为热能再利用。
本发明的微通道阵列，通过从开口端流出和流入细胞培养液、生理盐水、血液样品、试剂等流体，在生物技术领域、医疗领域、农药领域、工业领域等的进一步拓展值得期待。
本发明的微通道阵列在用于细胞或粒子的出入时，其在细胞、血液成分等的分级，反应、合成等工业用途的拓展，值得期待。
本发明的微通道阵列，在用于捕获细胞或粒子用途时，可在生物技术领域，尤其是微注射操作中发挥作用。
在农业领域、医疗领域、食品领域、工业领域等，本发明的微通道阵列的应用拓展值得期待，可制造粒径一致的水包油单分散微粒，或油包水单分散微粒。
作为粒子的分散相，从第二贯通孔4经由第二沟3导入到端面10。根据基板表面和分散相的润湿性差异，可制备粒径一致的微粒。若要制备水包油单分散微粒，则基板表面需要亲水化；另一方面，若要制备油包水分散微粒，疏水化是必要的，优选依据前述控制与水的接触角的方法，适当选择。
使用本发明的微通道阵列，可制造核壳(core-shell)型多层结构微粒。将作为内侧粒子的分散相，从第二贯通孔4，经由第二沟3导入到端面10。同时，将作为外侧粒子的分散相，从第一贯通孔9，经由第一沟8导入到端面10。由此，可高效制造粒径一致的核壳型多层结构微粒。
实施例
接着，比较说明以前的微腔室阵列和微通道阵列，以及本发明的同轴微通道阵列。
制作例1：微腔室阵列的制作
使用Alcatel公司生产的干式蚀刻装置，在长20mm、宽20mm、厚0.2mm的硅基板上，制作100个直径60μm的贯通穴。将该微腔室阵列作为比较例。把微腔室阵列的外观图示于图9。
制作例2：微通道阵列的制作
使用Alcatel公司生产的干式蚀刻装置，在长10mm、宽20mm、厚0.3mm的硅基板上，制作14条宽80μm、深100μm、长5000μm的通道，将各通道用沟连通后，在沟中通过喷砂(sandblast)制作直径3mm的贯通孔。接着，使硅基板和相同大小的丙烯酸基板紧贴，制作微通道阵列。微通道阵列的外观图示于图10。
制作例3：同轴微通道阵列A的制作
首先，在玻璃原板上由光刻法制作光致抗蚀图，通过对该光致抗蚀图进行电镀处理，制作金属结构体。接着，以该金属结构体作为模具，以株式会社Kuraray生产的丙烯酸树脂(PARAPET G-HS)作为材料，由注塑成型制作同轴微通道阵列A的第一基板。进而，利用加工中心在上述基板上制作用于吸引细胞等的直径0.3mm的贯通孔(第二贯通孔4)，最后，使该基板和大小基本相同的丙烯酸树脂制基板(第二基板)紧贴，制作图1所示同轴微通道阵列A。
该同轴微通道阵列A的形状是，在宽16mm、长8mm、厚1.0mm的基板上，具有20组微通道，各微通道具有连通第一贯通孔和第二贯通孔、第一凹陷和第二凹陷、以及连通第一凹陷和基板端面的第一沟和第二沟。用于吸引细胞等的第二沟3，宽80μm、深150μm；以隔段隔开的、为供给第二沟3两侧的培养液的第一沟8，宽100μm、深150μm。端面10中，同轴微通道之间的界面阻隔6的前端和隔段5的前端之间的位置关系如下，与界面阻隔6的前端和端面10处于同一位置相反，隔段5的前端位于距界面阻隔6的前端50μm的后部。
接触角测定装置(协和界面科学(Kyowa Interface Science)株式会社生产，CA-DT·A型)，在空气中测定该同轴微通道阵列A与水的接触角为70°。此外，对该同轴微通道阵列A进行SEM观察。将其外观、微细构造的中心部、端面分别示于图4、图5和图6。
制作例4：同轴微通道阵列B的制作
在将第一基板和第二基板紧贴之前，用溅射装置(株式会社ULVAC生产SV)，在两基板上沉积100nm厚的SiO2膜，进行表面改性处理，除此之外，其余均和制作例3一样，制作同轴微通道阵列B。在空气中测定该同轴微通道阵列B与水的接触角为11°。
制作例5：同轴微通道阵列C的制作
首先，以直径100μm的精细刀具对玻璃原板进行精密机械切削，制作金属结构体。接着，以该金属结构体为模具，使用株式会社Kuraray生产的丙烯酸树脂(PARAPET G-HS)为材料，由注塑成型制作同轴微通道阵列C的第一基板。进而，利用加工中心(machining center)在上述基板上制作用于吸引细胞等的直径0.3mm的贯通孔(第二贯通孔4)，再用溅射装置(株式会社ULVAC生产，SV)，在上述第一基板和大小基本相同的丙烯酸基板(第二基板)，沉积100nm厚的SiO2膜，进行表面改性处理，最后，将两基板紧贴，制作图7所示的同轴微通道阵列C。
该同轴微通道阵列C的形状，尽管和制作例3的同轴微通道阵列A的形状相似，但也有如下不同。即，用于吸引细胞等的第二沟3的深度，以及以隔段隔开的为供给第二沟3两侧的培养液的第一沟8的深度，均为200μm。
在空气中测定该同轴微通道阵列C与水的接触角为15°。
(比较例1)
使用微腔室阵列进行微注射操作
使用制作例1所得的微腔室阵列，将牛卵细胞留置于培养液中的微腔室阵列的表面，进行微注射操作。由于微腔室阵列以硅为材料，因而不能透过可见光，尽管试着用落射型反射照明方式进行细胞观察，但光在贯通孔部并不能被反射，观察困难。
进而，由于针的移动方向和显微镜的观察方向基本一致(垂直方向)，并且针在显微镜的焦点深度方向移动，在移动的同时，图像也变模糊，因而，该位置操作极其困难。
(比较例2)
使用微通道阵列进行微注射操作
使用制作例2所得的微通道阵列，将牛卵细胞留置于培养液中的微通道阵列的端面，进行微注射操作。在以基板端面的开口端吸引捕获细胞等粒子的微通道阵列中，粒子捕获用开口端，形成可自由从外部接近的结构，可使用透射照明和落射型反射照明这两种方式进行显微镜观察。此外，由于微移液器的移动方向(基本水平方向)和显微镜的观察方向(垂直方向)基本直交，因此，即使是在微移液器移动过程中，也能够以高倍率观察细胞。
然而，该微注射操作是，细胞等在培养液中的吸引捕获、微注射操作、细胞等在培养液中的培养等一系列过程中的一部分，效率低下。细胞在培养液中的分化、增殖速度也和以前一样，100μm的卵细胞要分化、增殖为约200μm大小，需要5天左右。此外，当将细胞等粒子吸引捕获于粒子开口端的过程中，若给细胞施加捕获所需的吸引力，仍不能解决细胞外壁受损的问题。
(实施例1)
使用同轴微通道阵列A进行的微注射操作
使用制作例3得到的同轴微通道阵列A，在含有牛卵细胞的培养液中，试着将牛卵细胞固定化。通过透射照明，用显微镜观察，观察到在20组同轴微通道阵列中，牛卵细胞捕获于4组同轴微通道的开口部(第二沟3)的情况。尽管在一部分第二沟3和第一沟8的中观察到混有气泡，但并没有影响到吸引和培养液的供给。由于是刚采集的卵细胞，因此一边从第一沟8供给新鲜培养液，一边经过2天使其稳定化。
接着，通过以透射照明进行的显微镜观察，进行微注射操作。由于微移液器的移动方向(基本水平方向)和显微镜的观察方向(垂直方向)基本直交，因此可在高倍率下观察细胞，不会损伤卵细胞，对一个卵细胞的外壁的硬度等进行最为适宜的针操作。把该微注射操作时的细胞以及同轴微通道阵列A的显微镜照片示于图8。可从位于下侧第一基板上的第二沟3吸引细胞。并且可从其两侧的第一沟8供给培养液。可用细胞刺入用玻璃微移液器将基因等物质注入该细胞。
接着，试着检测同轴微通道内牛卵细胞的分化、增殖后发现，100μm的卵细胞在第三天达到约200μm大小。于是推测，在不断从第一沟8供给新鲜培养液的情况下，通过在高150μm、深为50μm的狭小空间内培养细胞，可成功实现细胞分化、增殖速度的加快。
通过使用同轴微通道阵列，可连续进行稳定化、微注射操作、细胞在培养液中的分化和增殖等一系列操作，可飞跃性提高微注射操作效率。此外，能够在数天内保持不损伤捕获的卵子细胞的外壁，之所以能如此是由于助空间，可在所需的最小吸引力下固定卵子细胞。
(实施例2)
使用同轴微通道阵列B进行的微注射操作
使用制作例4得到的同轴微通道阵列B，和实施例1一样，进行稳定化、微注射操作、细胞在培养液中的分化和增殖等一系列操作后确认，不仅和同轴微通道阵列A一样，可飞跃性的提高微注射操作效率，而且，本实施例没有观察到实施1例所观察到的气泡混入现象，证实通过亲水化处理，可将气泡完全排除。
(实施例3)
使用同轴微通道阵列C进行的微注射操作
使用制作例5得到的同轴微通道阵列C，和实施例1一样，进行稳定化、微注射操作、细胞在培养液中的分化和增殖等一系列操作后确认，和同轴微通道阵列B一样，不仅可飞跃性的提高微注射操作效率，而且还证实通过亲水化处理，可将气泡完全排除。另一方面，100μm的卵细胞若要分化、增殖到约200μm大小，需要4天，比实施例1和2还多一天。推测这是由于空间的高度被增大到200μm所致，因此认为，需要根据对象细胞的大小，选择最适空间大小。
产业上的可利用性
根据本发明，可提供能够加快细胞分化、增殖速度的微通道阵列。

Claims (13)

1.一种微通道阵列，其是具有第一基板和与该第一基板的接合面对置接合的第二基板，借助形成于该第一基板的接合面的沟，在该第一基板的端面形成粒子捕获用开口端的微通道阵列；其特征在于，在该第一基板的接合面具有(a)贯通该第一基板的第一贯通孔，具有上述第一贯通孔的第一凹陷，连通上述第一凹陷和上述第一基板端面的多个第一沟；和(b)贯通该第一基板的第二贯通孔，具有上述第二贯通孔的第二凹陷，连通上述第二凹陷和上述第一基板端面的第二沟；以及(c)将上述第一凹陷和上述第二凹陷之间隔开的隔段，并且，以上述相邻的多个第一沟，其间由上述隔段隔开而设置的上述第二沟，和对应于上述第二沟的上述第二凹陷作为1组微通道群，沿上述第一基板的端面排列设置多组上述1组微通道群，所述隔段的端部位于端面内侧。
2.根据权利要求1所述微通道阵列，其中，上述第一沟的宽度和深度为0.1～300μm，并且，上述第一沟的宽度和深度的比为1∶10～10∶1。
3.根据权利要求1所述微通道阵列，其中，上述第二沟的宽度和深度为0.1～300μm，并且，上述第二沟的宽度和深度的比为1∶10～10∶1。
4.根据权利要求1所述的微通道阵列，其中，上述多个微通道群中的位于上述第二凹陷内的上述第二贯通孔，分别在上述第一基板的背面连接。
5.根据权利要求1所述微通道阵列，其中，表面与水的接触角大于等于0.5°且小于等于70°。
6.根据权利要求1所述微通道阵列，其中，上述第一基板和上述第二基板的至少一个基板是透明的。
7.根据权利要求1所述微通道阵列，其中，还具有至少一个和上述第一基板接合的其它第一基板，在多个该第一基板的端面，在与上述接合面垂直的方向上形成有多个粒子捕获用开口端。
8.根据权利要求7所述微通道阵列，其中，上述其它的第一基板中所含的上述第二贯通孔，比上述第一基板中所含的上述第二贯通孔大。
9.通过权利要求1所述微通道阵列的上述第一沟和上述第二沟的至少一方，使含粒子的流体从上述第一基板的端面进出的方法。
10.通过权利要求1所述微通道阵列的上述第一沟和上述第二沟的至少一方，使粒子从上述第一基板的端面进出的方法。
11.从权利要求1所述微通道阵列的上述第一贯通孔和上述第二贯通孔的至少一方吸引粒子，并将其捕获于上述第一基板端面的方法。
12.从权利要求1所述微通道阵列的上述第二沟导入分散相，制造水包油分散微粒或油包水单分散微粒的方法。
13.从权利要求1所述微通道阵列的上述第二沟导入分散相，作为内侧粒子；从上述第一沟导入其它分散相，作为外侧粒子，制造核壳型多层构造微粒的方法。
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