JP4555650B2 - 細胞給排・捕捉装置及び細胞給排・捕捉方法 - Google Patents
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Description
図1参照
上記課題を解決するために、本発明は、細胞給排・捕捉装置において、細胞懸濁液2を供給する細胞供給機構1、細胞を含まない液体4を供給する送液機構3、細胞懸濁液2及び液体4を流す流路6と細胞懸濁液2中の細胞を捕捉する貫通孔7を備えた捕捉チップ5、捕捉チップ5に接続されて貫通孔7からの吸引量を制御する吸引機構8、貫通孔7で捕捉されなかった不要な細胞を回収する不要細胞回収機構9、及び、捕捉細胞を回収する捕捉細胞回収機構10とを少なくとも備え、記細胞を含まない液体4が細胞より比重の重い液体であることを特徴とする。
また、吸引により細胞を捕捉しているので、捕捉手段自体が細胞に化学的な悪影響を与えることがなく、さらに、装置構成が全体として小型であるのでサンプル数が少ない場合にも確実な捕捉を行うことができる。
特に、細胞を含まない液体4を、細胞より比重の重い液体4としているので、流路6の底に沈降している細胞を浮上させ、搬送を容易にすることができる。
なお、貫通孔7の径を細胞の通過できない大きさにすることで、細胞が貫通孔7を通過することなく、細胞の捕捉が可能となる。
(1)細胞供給機構より、捕捉チップの流入部に細胞懸濁液を供給する。
流入部への供給方法は、細胞供給機構にピペット状の細管を接続して、細胞懸濁液を流入部へ滴下しても、チューブを介して細胞供給機構を捕捉チップに接続して、細胞懸濁液を供給しても良い。
このとき、捕捉チップの流路を親水性、流路以外の部分を疎水性にすることにより、流路を密閉することなく、流路のみに細胞懸濁液を流すことができる。
(2)吸引機構を用いて、流路内の貫通孔に細胞を捕捉する。
貫通孔の出口は、吸引機構に接続されており、貫通孔からの吸引圧により細胞を捕捉するものであり、この場合、貫通孔の径を、細胞の通過できない大きさにすることで、細胞が貫通孔を通過することなく、細胞の捕捉が可能となる。
(3)送液機構を用いて、捕捉チップより、捕捉されていない細胞を除去する。
このとき、細胞と比重の異なる液体を送液機構より流入部へ供給し、捕捉されていない細胞を浮上させ捕捉チップの流出部まで搬送し、
(4)不要細胞回収機構を用いて、流出部まで流れてきた、捕捉されていない細胞を回収する。
(5)捕捉細胞に対して、インジェクション、経過観察等の作業を行い、作業が終わった後は、吸引機構を用いて、吸引圧を解除し、捕捉細胞を解放する。
(6)再び、送液機構を用いて、開放された細胞を捕捉チップの流出部へと搬送する。 このときも、細胞と比重の異なる液体を送液機構より流入部へ供給し、捕捉されていた細胞を浮上させ捕捉チップの流出部まで搬送し、
(7)捕捉細胞回収機構を用いて、搬送されてきた捕捉細胞を回収する。
図2参照
図2は、本発明の実施例1の細胞給排・捕捉装置の概念的構成図であり、ピペット状の細管12を備えるとともに細管12から培地14に細胞15を懸濁した細胞懸濁液13を捕捉チップ30に供給する細胞供給装置11、ピペット状の細管17を備えるとともに細管17から培地より比重の重いキャリア液18を捕捉チップ30に供給する送液装置16、供給された細胞懸濁液13中の細胞15を吸引装置23によって吸引して捕捉する捕捉チップ30、捕捉チップを収容するとともに吸引用の開口部20を有する容器19、容器19を保持するとともに吸引装置23との接続部22を有するチップ保持具21、細胞15を捕捉するための吸引装置23、捕捉した細胞15を観察する細胞観察装置40、捕捉されなかった細胞15を細管25を介して回収する不要細胞回収装置24、インジェクション等の作業を行った処置済み細胞15を細管27を介して回収する捕捉細胞回収装置26から基本構成が構成される。
図3は捕捉チップ30の概略的平面図であり、また、図4は捕捉チップ30の概略的断面図であり、通常のフォトリソグラフィー工程を利用してシリコン基板31の一端に流入部32、他端に流出部34を形成するとともに、流入部32と流出部34を結ぶ蛇行した流路33を形成する。
なお、この時、貫通孔35が樹脂で塞がれないように注意する必要がある。
また、この流路33の底部に設ける貫通孔35は、直径が例えば2μmであり、この貫通孔35を例えば、50μmの間隔で配置する。
図5は、捕捉チップ乃至チップ保持具の配置構成の説明図であり、捕捉チップ30は、例えば、容器19に対して開口部36が容器19に設けた開口部20と整合するように配置・固定する。
なお、この場合の容器19は、周囲への液の飛散を防ぐとともに取り回しを簡便にするためのものであり、また、培養に使用するシャーレと同様に耐薬品性に優れたポリスチレン製とする。
図6は、本発明の実施例1の細胞給排・捕捉装置の動作フロー図であり、また、図7は細胞の捕捉・搬送、開放・搬送状態の説明図であり、まず、
A.細胞供給装置11より、捕捉チップ30に設けた流入部32に細胞懸濁液13を供給する。
この場合、細胞供給装置11により細胞懸濁液13の送液量及び液圧を制御してピペット状の細管12から滴下させる。
B.吸引装置23を用いて、流路33内に設けた複数の貫通孔35において細胞15を捕捉する。
この場合、貫通孔35の径は例えば、2μmであり、細胞の径10〜15μmに対して十分小さいの貫通孔35から外に排出されることはない。
C.送液装置16を用いて、細管17から捕捉チップ30の流入部32にキャリア液18を供給して、捕捉されていない細胞15を浮上させて流出部34まで搬送する。
なお、ここでは、キャリア液18として培地14として用いる平衡塩類溶液(BBS)の塩分濃度を高めて細胞15の比重より重くした液体を用いる。
D.流出部34まで搬送された細胞15を不要細胞回収装置24を用いて細管25から回収する。
E.捕捉した細胞15に対して、細胞分裂の状態等の経過観察を行ったのち、吸引装置23による吸引圧を解除し、捕捉した細胞15を解放する。
F.再び、送液装置16を用いて、細管17から捕捉チップ30の流入部32にキャリア液18を供給して、開放された細胞15を流出部34まで搬送する。
G.流出部34まで搬送された観察済みの細胞15を捕捉細胞回収装置26を用いて細管27から回収することで、一連のフローが終了する。
以降は、回収した観察済みの細胞15を、例えば、ポリカーボネート製の基板に96個の凹部を二次元マトリクス状に設けた96穴プレートに分注して少量ずつの保管・培養を行う。
図8参照
図8は、本発明の実施例2の細胞給排・捕捉装置に用いる捕捉チップ50の概略的平面図であり、通常のフォトリソグラフィー工程を利用してシリコン基板51の一端の中央部に流入部52、他端の中央部に流出部56を形成するとともに、流入部52と流出部56との間に複数本の平行に走る流路54を形成し、流入部52と複数の流路54を分岐流路53で接続するとともに、複数の流路54と流出部56を合流流路55で接続する。
また、この流路54の底部に設ける貫通孔57は、直径が例えば2μmであり、この貫通孔57を例えば、50μmの間隔で配置する。
図9は、本発明の実施例3のマイクロインジェクション装置の概念的構成図であり、ピペット状の細管12を備えるとともに細管12から培地14に細胞15を懸濁した細胞懸濁液13を捕捉チップ30に供給する細胞供給装置11、ピペット状の細管17を備えるとともに細管17から培地より比重の重いキャリア液18を捕捉チップ30に供給するで送液装置16、供給された細胞懸濁液13中の細胞15を吸引装置23によって吸引して捕捉する捕捉チップ30、捕捉チップを収容するとともに吸引用の開口部20を有する容器19、容器19を保持するとともに吸引装置との接続部22を有するチップ保持具21、細胞15を捕捉するための吸引装置23、捕捉した細胞15を観察する細胞観察装置40、捕捉した細胞15に対して薬液或いは遺伝子を注入する注入装置60、捕捉されなかった細胞15を細管25を介して回収する不要細胞回収装置24、インジェクション作業を行った物質注入済み細胞を細管27を介して回収する捕捉細胞回収装置26から基本構成が構成される。
この様な構成は、送液装置における溶液の供給装置に関しても同様である。
再び図1参照
(付記1) 細胞懸濁液2を供給する細胞供給機構1、細胞を含まない液体4を供給する送液機構3、前記細胞懸濁液2及び液体4を流す流路6と前記細胞懸濁液2中の細胞を捕捉する貫通孔7を備えた捕捉チップ5、前記捕捉チップ5に接続されて前記貫通孔7からの吸引量を制御する吸引機構8、前記貫通孔7で捕捉されなかった不要な細胞を回収する不要細胞回収機構9、及び、捕捉細胞を回収する捕捉細胞回収機構10とを少なくとも備え、記細胞を含まない液体4が細胞より比重の重い液体であることを特徴とする細胞給排・捕捉装置。
(付記2) 上記捕捉チップ5が、上記流路6の一方の端部に前記流路6に上記細胞懸濁液2及び液体4を流す流入部と、前記流路6の他方の端部に前記流路6から前記細胞懸濁液2及び液体4を回収する回収部とを有し、且つ、上記貫通孔7が上記細胞懸濁液2中の細胞が通過できない径の複数の貫通孔7からなるとともに、前記流路6に沿うように設けられたことを特徴とする付記1記載の細胞給排・捕捉装置。
(付記3) 上記流路6が蛇行した一本の流路6からなることを特徴とする付記2記載の細胞給排・捕捉装置。
(付記4) 上記流路6が複数の平行に配置された流路6からなるとともに、各流路6の一端で共通の流入部に接続する接続流路6を有するとともに、前記各流路6の他端で共通の回収部に接続する接続流路6を有することを特徴とする付記2記載の細胞給排・捕捉装置。
(付記5) 上記捕捉チップ5に設けた上記流路6の内壁を前記捕捉チップ5の基材より親水性にするとともに、前記捕捉チップ5の流路6の内壁以外の面を前記基材より疎水性にすることを特徴とする付記1乃至4のいずれか1に記載の細胞給排・捕捉装置。
(付記6) 上記流路6の内壁を上記捕捉チップ5の基材より親水性の樹脂でコートするとともに、前記捕捉チップ5の流路6の内壁以外の面を前記基材より疎水性の樹脂でコートしたことを特徴とする付記5記載の細胞給排・捕捉装置。
(付記7) 上記細胞を含まない液体4が、上記細胞懸濁液2を構成する培地と同じ成分からなるとともに、前記培地より塩分濃度を高めた液体4であることを特徴とする付記1乃至6のいずれか1に記載の細胞給排・捕捉装置。
(付記8) 上記捕捉した細胞に物質を注入する注入機構を備えたことを特徴とする付記1乃至7のいずれか1に記載の細胞給排・捕捉装置。
(付記9) 細胞懸濁液2を複数の貫通孔7を備えた流路6の一端から流し前記細胞懸濁液2中の細胞を前記貫通孔7で吸引により捕捉する工程、前記流路6の一端から前記細胞より比重の重い液体4を流し捕捉しきれなかった細胞を浮上させて前記流路6の他端で回収する工程、前記捕捉した細胞に物質を注入するインジェクション或いは経過観察のいずれかを行う工程、前記インジェクション或いは経過観察後に吸引を解除するとともに前記流路6の一端から前記細胞より比重の重い液体4を流し細胞を浮上させて前記流路6の他端で回収する工程とを順次行うことを特徴とする供給する細胞給排・捕捉方法。
2 細胞懸濁液
3 送液機構
4 液体
5 捕捉チップ
6 流路
7 貫通孔
8 吸引機構
9 不要細胞回収機構
10 捕捉細胞回収機構
11 細胞供給装置
12 細管
13 細胞懸濁液
14 培地
15 細胞
16 送液装置
17 細管
18 キャリア液
19 容器
20 開口部
21 チップ保持具
22 接続部
23 吸引装置
24 不要細胞回収装置
25 細管
26 捕捉細胞回収装置
27 細管
28 接続部材
30 捕捉チップ
31 シリコン基板
32 流入部
33 流路
34 流出部
35 貫通孔
36 開口部
37 親水性の樹脂
38 疎水性の樹脂
40 細胞観察装置
41 光源
42 対物レンズ
43 画像処理装置
50 捕捉チップ
51 シリコン基板
52 流入部
53 分岐流路
54 流路
55 合流流路
56 流出部
57 貫通孔
58 開口部
60 注入装置
61 物質導入用針
62 物質導入用針制御装置
Claims (4)
- 細胞懸濁液を供給する細胞供給機構、細胞を含まない液体を供給する送液機構、前記細胞懸濁液及び液体を流す流路と前記細胞懸濁液中の細胞を捕捉する貫通孔を備えた捕捉チップ、前記捕捉チップに接続されて前記貫通孔からの吸引量を制御する吸引機構、前記貫通孔で捕捉されなかった不要な細胞を回収する不要細胞回収機構、及び、捕捉細胞を回収する捕捉細胞回収機構とを少なくとも備え、前記細胞を含まない液体が前記細胞より比重の重い液体であることを特徴とする細胞給排・捕捉装置。
- 上記捕捉チップが、上記流路の一方の端部に前記流路に上記前記細胞懸濁液及び液体を流す流入部と、前記流路の他方の端部に前記流路から前記細胞懸濁液及び液体を回収する回収部とを有し、且つ、上記貫通孔が上記細胞懸濁液中の細胞が通過できない径の複数の貫通孔からなるとともに、前記流路に沿うように設けられたことを特徴とする請求項1記載の細胞給排・捕捉装置。
- 上記捕捉チップに設けた上記流路の内壁を前記捕捉チップの基材より親水性にするとともに、前記捕捉チップの流路の内壁以外の面を前記基材より疎水性にすることを特徴とする請求項1または2に記載の細胞給排・捕捉装置。
- 細胞懸濁液を複数の貫通孔を備えた流路の一端から流し前記細胞懸濁液中の細胞を前記貫通孔で吸引により捕捉する工程、前記流路の一端から前記細胞より比重の重い液体を流し捕捉しきれなかった細胞を浮上させて前記流路の他端で回収する工程、前記捕捉した細胞に物質を注入するインジェクション或いは経過観察のいずれかを行う工程、前記インジェクション或いは経過観察後に吸引を解除するとともに前記流路の一端から前記細胞より比重の重い液体を流し細胞を浮上させて前記流路の他端で回収する工程とを順次行うことを特徴とする供給する細胞給排・捕捉方法。
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