JP7104988B2 - 粒子捕捉装置及び粒子捕捉方法 - Google Patents
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Description
例えば、細胞は、さまざまな大きさの脂質二重膜に覆われた細胞外小胞顆粒を分泌している。細胞外小胞顆粒は、大きさの違いにより分類されており、エクソソーム(大きさ:50~200 nm)やマイクロベシクル(大きさ:200~1000 nm)などがある。その中でも、エクソソームは、様々なタンパク質や、mRNA、microRNAが含まれており、癌の転移においても重要な役割を果たすことが近年明らかになってきた。このため、エクソソームは各種疾患の非侵襲性のバイオマーカー・治療ツールとなると期待されている(例えば、特許文献1参照)。
一方、ウィルス感染症は、人や動物に甚大な健康被害を与える。感染症の早期診断、その治療方針の決定などには、感染したウィルスを同定する必要がある。ウィルスの大きさは20nm~300nm程度であり、一般的には遠心分離法を用いて回収及び濃縮が行われる(例えば、特許文献2参照)。
また、流路内に設けた突起部により溶液中の粒子を捕捉するマイクロチップが知られている(例えば、特許文献3参照)。
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、捕捉対象粒子を粒子捕捉用開口の内部に閉じ込めることができ、捕捉対象粒子を個別に観察、解析などすることができる粒子捕捉装置を提供する。
本発明の粒子捕捉装置に含まれる矩形流路の第3内壁面と第4内壁面との間の幅は、捕捉対象粒子の平均粒径の1.04倍以上5倍以下であることが好ましい。このことにより、捕捉対象粒子を一列に並べて矩形流路を流すことができ、捕捉対象粒子が粒子捕捉用開口に侵入する確率を高くすることができる。
本発明の粒子捕捉装置に含まれる粒子捕捉用開口は、捕捉対象粒子の平均粒径の1.04倍以上3倍以下の大きさを有することが好ましい。このことにより、矩形流路を流れてきた捕捉対象粒子が粒子捕捉用開口の内部に侵入することができ、かつ、粒子捕捉用開口に侵入した捕捉対象粒子が粒子捕捉用開口から脱離することを抑制することができる。
さらに、補助流路から粒子捕捉用開口に向かって液体を流すことにより、粒子捕捉用開口に捕捉した捕捉対象粒子を回収することが可能になる。
本発明の粒子捕捉装置は矩形流路の上流側に設けられた導入流路を備えることが好ましい。このことにより、捕捉対象粒子を含む液体を導入流路を介して矩形流路に供給することができる。
前記扁平流路の厚さは、第1内壁面と第2内壁面との間の幅又は第3内壁面と第4内壁面との間の幅と実質的に同じであることが好ましく、前記扁平流路は、扁平流路の上面及び下面のうちどちらか一方が第1又は第3内壁面と実質的に一致し、上面及び下面のうち他方が第2又は第4内壁面と実質的に一致するように設けられることが好ましい。このことにより、扁平流路を流れる捕捉対象粒子が液体と共に容易に矩形流路に流入することができる。
本発明の粒子捕捉装置は矩形流路と導入流路との間に設けられた細胞捕捉室をさらに備えることが好ましい。この細胞捕捉室に細胞を捕捉し、捕捉した細胞から細胞外小胞を分泌させることができる。この細胞外小胞を扁平流路及び矩形流路に流入させることができ、粒子捕捉用開口で細胞外小胞を捕捉することができる。
本発明の粒子捕捉装置は粒子捕捉用開口の内部に捕捉された捕捉対象粒子を含むことが好ましい。
前記捕捉対象粒子は、小胞、細胞小器官、細胞外小胞、ウィルス、リポソーム、金属粒子、有機粒子、無機粒子、大気汚染微粒子、又は花粉であることが好ましい。
本実施形態の粒子捕捉装置25は、導入流路10と、導入通路10の下流側に設けられた扁平流路12と、扁平流路12の下流側に設けられた矩形流路4と、矩形流路4の少なくとも内壁面8aに設けられた粒子捕捉用開口5と、を備え、導入流路10は、扁平流路12の流路断面よりも広い流路断面を有し、扁平流路12は、横幅の広い扁平な流路断面を有し、矩形流路4は、矩形の流路断面を有し、かつ、内壁面8aと内壁面8bとが対向し、内壁面8cと第4内壁面8dとが対向するように設けられ、導入流路10、扁平流路12、矩形流路4及び粒子捕捉用開口5は、導入流路10を流れる捕捉対象粒子6を含む液体の一部が、扁平流路12に流入し、扁平流路12を流れた捕捉対象粒子6が前記液体と共に矩形流路4に流入し、矩形流路4を流れた捕捉対象粒子6が粒子捕捉用開口5の内部に侵入し捕捉されるように設けられていることを特徴とする。
以下、本実施形態の粒子捕捉装置25及び粒子捕捉方法について説明する。
捕捉対象粒子6は、粒子捕捉装置25が捕捉対象とするある粒径範囲を有する粒子である。捕捉対象粒子6の平均粒径は、この粒径範囲の平均値である。例えば、捕捉対象とする粒子が90nm以上110nm以下の粒径範囲の粒子である場合、捕捉対象粒子6の平均粒径は100nmとなる。また、粒子捕捉装置25は、粒径範囲の異なる複数の捕捉対象粒子6を有してもよい。
捕捉対象粒子6は、例えば、小胞、細胞小器官、細胞外小胞(エクソソーム、マイクロベジクルなど)、ウィルス、リポソーム、金属粒子、有機粒子、無機粒子、大気汚染微粒子(浮遊粒子状物質、PM2.5など)、花粉などである。
また、細胞外小胞(捕捉対象粒子6)を含む液体20は、例えば、血清、血漿、尿、培養上清、唾液、羊水、悪性腹水、脳脊髄液(CSF)、胃腸液(GI)、炎症性液、リンパ液、肺胞洗浄液などである。
捕捉対象粒子6の平均粒径は、例えば、5nm以上100μm以下であり、好ましくは50nm以上2μm以下であり、より好ましくは80nm以上1μm以下である。
第1基板2または第2基板3は、例えば、ガラス基板(石英ガラス基板など)、半導体基板(シリコン基板など)、セラミックス基板などである。特に第1基板2および第2基板3にガラス基板を用いることが好ましい。ガラスの表面には通常水酸基(-OH)が存在するため、矩形流路4などの内表面を親水性にすることができる。このため、水、緩衝溶液又は水溶液(液体20)を毛管現象により矩形流路4などに流すことができる。また、ガラス基板は透光性を有するため、粒子捕捉用開口5の内部に閉じ込めた捕捉対象粒子6を光学的に観察することができる。また、捕捉対象粒子6に光学的処理を施すことも可能である。
第1基板2と第2基板3とは、熱接合により接着されてもよく、融着されてもよい。また、第1基板2と第2基板3とにプラズマ処理を施し、第1基板2のプラズマ処理された表面と第2基板3のプラズマ処理された表面とを接触させることにより第1基板2と第2基板3とを接着してもよい。
なお、第1基板2と第2基板3の両方に溝を形成して第1基板2と第2基板3との間に流路や開口を形成してもよい。
導入流路10は、注入口18aから流入した液体20が導入流路10を流れ排出口19aから排出されるように設けることができる。また、導入流路10は、導入流路10を流れる液体20の一部が扁平流路12に流入するように設けることができる。このように導入流路10を設けることにより、液体20中の粒子のうち扁平流路12の厚さよりも大きい粒径の粒子は、扁平流路12に流入せずに排出口19aに向かって流れ、扁平流路12の厚さよりも小さい粒径の粒子は、扁平流路12に流入することができる。従って、扁平流路12の流入口において液体20と共に扁平流路12に流入する粒子をフィルタリングすることができる。
導入流路10は、第1基板2に設けられてもよく、第2基板3に設けられてもよいが、第2基板3に設けることが好ましい。例えば、導入流路10は、図1、図2、図3(a)に示した粒子捕捉装置25のように設けることができる。
導入流路10は、注入口18aから流入する液体20に含まれる粒子のうち最大径を有する粒子の粒径の10倍以上の大きさの流路断面を有することができる。このことにより、導入流路10に粒子が詰まり、導入流路10の流れが遮断されることを抑制することができる。例えば、液体20に粒径が1000nm以下の様々な粒子が含まれている場合、導入流路10は10μm以上の大きさを有することができる。
導入流路10の大きさとは、導入流路10の流路断面が矩形である場合、流路断面の各辺の大きさであり、導入流路10の流路断面が円形である場合、流路断面の直径である。
液体20に含まれる粒子のうち最大径を有する粒子の粒径は、液体20を注入口18aに注入する前に行うフィルタリング処理に用いるフィルターのろ過精度の粒子径とすることができる。例えば、液体20を0.45μmフィルターでフィルタリング処理した場合、液体20に含まれる粒子のうち最大径を有する粒子の粒径は、450nmとすることができる。
導入流路10では、全体として液体20及び液体20に含まれる粒子は液体20の流れ方向に動いているが、粒子は三次元的な動きをする。例えば、図4(a)に示したように、導入流路10では、粒子は上下左右前後方向に流れることが可能である。
導入流路10は、ポンプを利用して捕捉対象粒子6を含む液体20が導入流路10を流れるように設けられてもよい。このことのより、導入流路10に安定して液体20を流すことができ、矩形流路4に安定して液体20を供給することができる。また、導入流路10にはポンプを利用して洗浄液を流すこともできる。また、導入流路10、矩形流路4などの液体を除去する場合には、導入流路10に空気などの気体を流すこともできる。
細胞捕捉室14は、例えば、図7に示した粒子捕捉装置25のように設けることができる。
液体20が導入流路10から扁平流路12に流入する流入口は、扁平流路12の流路断面と同様の形状を有することができる。
扁平流路12は、例えば、図1、図2、図3(a)(b)に示した粒子捕捉装置25のように設けることができる。
例えば、粒子捕捉装置25により90nm以上110nm以下の粒径範囲の粒子を捕捉したい場合、捕捉対象粒子6の平均粒径は100nmとなる。この場合、扁平流路12の厚さW3は、110nm以上220nm以下とすることができる。また、粒子捕捉装置25により950nm以上1050nm以下の粒径の粒子を捕捉したい場合、捕捉対象粒子6の平均粒径は1000nmとなる。この場合、扁平流路12の厚さW3は、1100nm以上2200nm以下とすることができる。
扁平流路12では、扁平流路12の上側内壁面(上面)及び下側内壁面(下面)により捕捉対象粒子6の動きが制限され、捕捉対象粒子6の流れは、二次元的な流れになる。例えば、扁平流路12では図4(b)に示したように捕捉対象粒子6が流れる。
また、粒子捕捉装置25は、図8のように、複数の扁平流路12を有することもできる。この場合、それぞれの扁平流路12に矩形流路4が接続することができ、扁平流路12の厚さW3は、接続した矩形流路4の幅W1又はW2と同じ厚さもしくはこのW1又はW2より小さい厚さとすることができる。
粒子捕捉装置25は、複数の矩形流路4を備えることができる。このことにより、より多くの捕捉対象粒子6を捕捉することが可能になる。例えば、図1~3に示した粒子捕捉装置25は、4本の矩形流路4を備える。
粒子捕捉用開口5は、捕捉対象粒子6の平均粒径S1の1.04倍以上3倍以下の大きさを有することができる。このことにより、矩形流路4を流れてきた捕捉対象粒子6が粒子捕捉用開口5の内部に侵入することができ、かつ、粒子捕捉用開口5に侵入した捕捉対象粒子6が粒子捕捉用開口5から脱離することを抑制することができる。従って、捕捉対象粒子6を粒子捕捉用開口5の内部に捕捉することができる。また、粒子捕捉用開口5は、捕捉対象粒子6の平均粒径S1の1.1倍以上2.2倍以下の大きさを有することもできる。
粒子捕捉用開口5の深さD1は、捕捉対象粒子6の平均粒径S1よりも大きくすることができる。また、粒子捕捉用開口5の深さD1は、捕捉対象粒子6の平均粒径S1の1倍以上2.2倍以下とすることができる。
例えば、捕捉対象粒子6の平均粒径S1が100nmである場合、粒子捕捉用開口5の大きさは110nm以上300nm以下とすることができ、粒子捕捉用開口5の深さD1は100nm以上とすることができる。また、捕捉対象粒子6の平均粒径が1000nmである場合、粒子捕捉用開口5の大きさは1100nm以上3000nm以下とすることができ、粒子捕捉用開口5の深さD1は1000nm以上とすることができる。
粒子捕捉用開口5が方形開口の場合、粒子捕捉用開口5の大きさは開口5の少なくとも1つの辺の長さW4又はW5である。粒子捕捉用開口5が円形開口の場合、粒子捕捉用開口5の大きさは開口5の直径又は長径W6である。また、開口5の幅W4、W5の両方が捕捉対象粒子6の平均粒径S1の1.1倍以上3倍以下であってもよい。
また、W1をこのような範囲とすることにより、捕捉対象粒子6の粒径範囲よりも小さい粒径を有する粒子が粒子捕捉用開口5に侵入する確率を小さくすることができる。
例えば、捕捉対象粒子6の平均粒径S1が100nmである場合、内壁面8aと内壁面8bとの間の幅W1は、110nm以上220nm以下とすることができる。また、捕捉対象粒子6の平均粒径S1が1000nmである場合、内壁面8aと内壁面8bとの間の幅W1は、1100nm以上2200nm以下とすることができる。
また、粒子捕捉用開口5は、方形の開口であってもよく円形の開口であってもよい。図1~3、図4(d)に示した粒子捕捉装置25では、開口5は第1基板2の溝の底面に設けた方形の開口である。図5(a)では、開口5は第1基板2の溝の底面に設けた円形の開口である。また、図5(b)、図6(b)では、開口5は第1基板2の溝の側面に設けた方形の開口である。
なお、流路幅がナノサイズ又はマイクロサイズになると重力よりも表面張力が大きくなるため、開口5を矩形流路4の側面に設けても粒子6は開口5に侵入する。
粒子捕捉用開口5は、複数の矩形流路4から捕捉対象粒子6が侵入するように設けられてもよい。例えば、図6(d)に示した粒子捕捉装置25では、矩形流路4aと矩形流路4bとを連通するように粒子捕捉用開口5が設けられており、粒子捕捉用開口5には、矩形流路4aを流れる捕捉対象粒子6も、矩形流路4bを流れる捕捉対象粒子6も侵入することができる。
連通流路22は、捕捉対象粒子6が通過することができない流路断面を有することができる。例えば、連通流路22は、捕捉対象粒子6の平均粒径よりも小さい幅を有することができる。このことにより、矩形流路4から粒子捕捉用開口5に侵入した粒子6が補助流路21に流入することを防止することができ、粒子捕捉用開口5に粒子6を捕捉することができる。また、粒子捕捉用開口5に侵入した粒子で、捕捉対象粒子6よりも小さい粒子を補助流路21に流すことができ、捕捉対象粒子6よりも小さい粒子が粒子捕捉用開口5に留まることを抑制することができる。従って、連通流路22を利用してフィルタリング処理を行うことができる。
例えば、図6(e)に示した粒子捕捉装置25では、粒子捕捉用開口5の底面と補助流路21とを繋ぐ連通流路22が設けられている。
例えば図6(f)に示した粒子捕捉装置25のように、矩形流路4を設けることができる。
このように粒子捕捉装置25を設けることにより、導入流路10に流す液体20に含まれる様々な粒径の粒子6を、各粒径範囲に分けて各矩形流路4の粒子捕捉用開口5に捕捉することができる。
図8、図9に示した粒子捕捉装置25に含まれる扁平流路12a、矩形流路4a及び粒子捕捉用開口5aは、捕捉対象粒子6aに対応した幅や大きさを有している。扁平流路12b、矩形流路4b及び粒子捕捉用開口5bは、捕捉対象粒子6bに対応した幅や大きさを有している。扁平流路12c、矩形流路4c及び粒子捕捉用開口5cは、捕捉対象粒子6cに対応した幅又は大きさを有している。扁平流路12d、矩形流路4d及び粒子捕捉用開口5dは、捕捉対象粒子6dに対応した幅又は大きさを有している。図8、9では、それぞれの矩形流路4に対応する扁平流路12を設けているが、扁平流路12を1つにして、それぞれの矩形流路4に対応するように扁平流路12の厚さが段階的に変化するように扁平流路12を設けてもよい。
排出側流路16は、注入口18bから流入した液体が排出側流路16を流れ排出口19bから排出されるように設けることができる。また、排出側流路16は、矩形流路4を流れた後の液体20が排出側流路16に流入するように設けることができる。
排出側流路16は、第1基板2に設けられてもよく、第2基板3に設けられてもよいが、第2基板3に設けられることが好ましい。例えば、排出側流路16は、図1、図2、図3(a)に示した粒子捕捉装置25のように設けることができる。
このようにして、導入流路10に供給した粒子6を含む液体20から、捕捉対象粒子6を分離して粒子捕捉用開口5に捕捉することができる。
なお、ここでは、洗浄用液体を排出側流路16から導入流路10に向かって矩形流路4を流したが、洗浄用液体は、導入流路10から排出側流路16に向かって矩形流路4を流してもよい。
まず、上記の方法のように、粒子捕捉用開口5にエクソソームを捕捉する。次に、矩形流路4に一次抗体を含む液体を流し、エクソソームの特定のタンパク質(抗原)に一次抗体を特異的に結合させる。次に、矩形流路4に洗浄用液体を流し、余分な一次抗体を除去した後、蛍光色素を結合させた二次抗体を含む液体を矩形流路4に流し、一次抗体に二次抗体を特異的に結合させる。次に、矩形流路4に洗浄用液体を流し、余分な二次抗体を除去する。
このようにして、蛍光色素を結合させたエクソソームを蛍光顕微鏡で観察することにより、エクソソームの脂質二重膜に存在する特定のタンパク質を解析することができる。
ここでは、脂質二重膜のタンパク質の解析について説明したが、脂質二重膜の内部のタンパク質やRNA、及び脂質などを解析することも可能である。
また、粒子捕捉装置25を用いると、エクソソームを1個ずつ解析することが可能である。粒子捕捉装置25を用いると、1つの細胞が分泌したエクソソームを網羅的に解析することも可能である。
図1~3に示したような粒子捕捉装置(1)を作製した。第1基板及び第2基板には石英ガラス板を用いた。
第1基板の表面上にレジストを塗布した後、電子ビームによりレジストの一部を除去しレジストにパターンを形成した。その後、レジストをマスクとしてエッチングを行い第1基板の一部を除去し溝を形成した。このようなエッチング処理を数回繰り返し、第1基板に扁平流路、矩形流路、粒子捕捉用開口などとなる溝を形成した。また、フォトリソグラフィとエッチング技術により、第2基板に導入流路及び排出側流路となる溝を形成した。その後、洗浄した第1基板及び第2基板を接触させて真空炉内に入れ、1060℃で熱処理することにより第1基板と第2基板とを融着させた。このようにして、第1基板と第2基板との間に導入流路、扁平流路、矩形流路、粒子捕捉用開口、排出流路などが形成された粒子捕捉装置(1)を製造した。
扁平流路の厚さW3及び矩形流路(ナノ流路)の幅W1は、500nmとし、矩形流路の幅W2は800nmとした。また、粒子捕捉用開口(ナノウェル)の大きさW4、W5は500nmとし、粒子捕捉用開口の深さD1は330nmとした。また、矩形流路は、50本形成し、1本の矩形流路につき160個の粒子捕捉用開口を形成した。
図11(b)、図12(a)~(f)、図13、図14は、第1基板に設けた溝(矩形流路)の側面に粒子捕捉用開口を形成した第1基板のSEM画像である。図11(b)、図12(a)~(f)、図13、図14のSEM画像のような第1基板を備えた粒子捕捉装置もそれぞれ作製した。これらの粒子捕捉装置は、粒子捕捉装置(1)と同様の方法で製造した。
図13のSEM画像のような第1基板を備えた粒子捕捉装置は、図6(e)の粒子捕捉装置25のように、補助流路と連通流路を備えている。この粒子捕捉装置では、長さ400μm、幅960nm、深さ350nmの矩形流路を10μm間隔で36本形成している。また、各矩形流路と平行に、幅510nm、深さ350nmの補助流路を36本形成している。各矩形流路には、680nm×680nmの粒子捕捉用開口を5μm間隔で110個形成している。また粒子捕捉用開口と補助流路とを繋ぐ幅350nmの連通流路(ネック構造)を形成している。
また、図14のSEM画像のような第1基板を備えた粒子捕捉装置(2)をエクソソーム捕捉実験で用いた。
作製した粒子捕捉装置(1)の導入流路の注入口に、平均粒径が250nmの蛍光ポリスチレン粒子(以下、PS粒子という)を含む水(濃度:6.0×109個/ml)を滴下し、毛管現象により導入流路、扁平流路、矩形流路にPS粒子及び水を流した。その後、矩形流路に水を流し、矩形流路に残ったPS粒子を粒子捕捉装置から排出した。その後、粒子捕捉用開口に捕捉されたPS粒子を蛍光顕微鏡により観察した。図15は、観察された蛍光顕微鏡像であり、白い点が粒子捕捉用開口に捕捉されたPS粒子である。図15からわかるように、PS粒子を含む水を矩形流路に流すことにより、PS粒子を粒子捕捉用開口に捕捉できることがわかった。
作製した粒子捕捉装置(1)の矩形流路に水を流し続け、粒子捕捉用開口に捕捉したPS粒子が粒子捕捉用開口から脱離するか否かを調べた。具体的には、矩形流路に24時間水を流し続けた後、粒子捕捉用開口に捕捉されたPS粒子を蛍光顕微鏡により観察した。図16の上の写真は、水を流す前の粒子捕捉用開口に捕捉されたPS粒子の蛍光顕微鏡像であり、図16の下の写真は24時間水を流し続けた後の粒子捕捉用開口に捕捉されたPS粒子の蛍光顕微鏡像である。この結果から、矩形流路に24時間水を流し続けてもPS粒子は、粒子捕捉用開口から脱離することはないことがわかった。また、水が流れなくても、PS粒子は、粒子捕捉用開口から脱離することはないことも他の実験でわかった。
また、粒子捕捉用開口に捕捉したPS粒子の温度安定性の評価も行った。粒子捕捉装置を100℃まで昇温してもPS粒子が粒子捕捉用開口から脱離することはなかった。
これは、PS粒子が一旦粒子捕捉用開口の内部に捕捉されると、PS粒子と粒子捕捉用開口(ナノウェル)の壁面との相互作用により、PS粒子のブラウン運動が抑制され、PS粒子が粒子捕捉用開口の内部に制限されるためと考えられる。
これらの結果から、複数のナノ粒子を1粒子精度で長時間安定的にアレイ化することができることがわかった。
平均粒径が250nmの赤色蛍光ポリスチレン粒子(以下、赤色PS粒子という)と、平均粒径が250nmの緑色蛍光ポリスチレン粒子(以下緑色PS粒子という)との混合比率が赤色PS粒子:緑色PS粒子=1:1、赤色PS粒子:緑色PS粒子=1:5又は赤色PS粒子:緑色PS粒子=1:10として、赤色PS粒子と緑色PS粒子とを粒子捕捉用開口に捕捉する実験をそれぞれ行った。具体的には、作製した粒子捕捉装置(1)の導入流路の注入口に、上記の混合比率で赤色PS粒子と緑色PS粒子を含む水(濃度:6.0×109個/ml)を滴下し、毛管現象により導入流路、扁平流路、矩形流路に赤色PS粒子、緑色PS粒子及び水を流した。その後、矩形流路に水を流し、矩形流路に残ったPS粒子を粒子捕捉装置から排出した。その後、粒子捕捉用開口に捕捉された赤色PS粒子及び緑色PS粒子を蛍光顕微鏡により観察し、検出された赤色PS粒子と緑色PS粒子の割合を算出した。算出された割合を図17に示す。この結果から、粒子捕捉装置に注入した水に含まれる赤色PS粒子と緑色PS粒子との混合比と、検出された赤色PS粒子と緑色PS粒子との割合がほぼ同じであることがわかった。従って、作製した粒子捕捉装置により、液体に含まれるナノ粒子の混合比を簡単に同定できることがわかった。
矩形流路の幅W1及び扁平流路の厚さW3を変化させた7つの粒子捕捉装置を作製して、PS粒子のトラップ率へのW1、W3の影響を調べた。作製した7つの粒子捕捉装置では、図11(b)、図12(a)、図14に示した第1基板のように、第1基板の溝の一方の側面に複数の粒子捕捉用開口を設けた。また、作製した7つの粒子捕捉装置では、W2とW3は同じであり、W1は、それぞれ260nm、380nm、470nm、580nm、680nm、800nm、900nmとした。その他の構成や製造方法は、上述の粒子捕捉装置作製実験と同じである。これらの粒子捕捉装置の矩形流路に平均粒径が250nmの蛍光ポリスチレン粒子(PS粒子)を含む水を流した後、粒子捕捉用開口に捕捉されたPS粒子を蛍光顕微鏡で観察した。そして、トラップ率=(検出されたPS粒子の数)/(粒子捕捉装置に含まれる粒子捕捉用開口の数)を算出した。算出したトラップ率を図18に示す。
矩形流路の幅W1を580nm(PS粒子の粒径の2.32倍)以上にすると、粒子捕捉用開口にPS粒子は捕捉されないことがわかった。また、矩形流路の幅W1を260nm(PS粒子の粒径の1.04倍)としても、粒子捕捉用開口にPS粒子を捕捉できることがわかった。また、矩形流路の幅W1を380nm(PS粒子の粒径の1.52倍)とすると、PS粒子のトラップ率が最も高いことがわかった。
このように、矩形流路の幅W1を変えると、トラップ率が大きく変わることがわかった。W1が小さくなると、PS粒子が矩形流路の内壁に沿って流れるため、PS粒子が粒子捕捉用開口に入りやすくなりトラップ率が大きくなると考えられる。また、W1が小さいとPS粒子が電荷を帯び、静電相互作用によりPS粒子が粒子捕捉用開口に入りやすくなることも考えられる。また、W1が小さすぎると、PS粒子が矩形流路を流れにくくなり流路抵抗が大きくなるため、トラップ率が低下すると考えられる。また、W1が大きすぎると、PS粒子が矩形流路を流れやすくなり流路抵抗が低下するため、PS粒子が粒子捕捉用開口に侵入しなくなると考えられる。
作製した粒子捕捉装置(2)を用いてエクソソーム捕捉実験を行った。粒子捕捉装置(2)において、矩形流路の幅は410nmであり、矩形流路の深さ(第1基板の溝の深さ)は410nmとした。また、平行に並ぶ隣接する2つの矩形流路の間隔は5μmである。また、粒子捕捉用開口(ナノウェル)の大きさは320nm×320nmであり深さは420nmである。また、隣接する2つの粒子捕捉用開口の間隔は1.3μmである。
次に、フィルタリング後の培養上清を作製した粒子捕捉装置(2)の注入口に滴下し、毛管現象により導入流路、扁平流路、矩形流路に培養上清を流し、粒子捕捉用開口にエクソソームを捕捉した。その後、矩形流路に水を流し、矩形流路に残った培養上清を粒子捕捉装置(2)から排出した。その後、矩形流路及び粒子捕捉用開口の明視野観察及び蛍光観察を行った。図20に矩形流路及び粒子捕捉用開口の明視野像、蛍光像、マージドイメージを示す。図20の明視野像の横に伸びる白い線が矩形流路及び粒子捕捉用開口である。図20の蛍光像の発光点(発光点を円で囲んでいる)がGFPを含むエクソソームと考えられる。また、図20のマージドイメージに示したように、エクソソームが粒子捕捉用開口に捕捉されていることが確認された。
粒子捕捉用開口に捕捉したエクソソームについて解析を行うことにより、エクソソームの表面のRNAやタンパク質、エクソソームの内部のRNAやタンパク質などについての情報を得ることができる。
本発明の粒子捕捉装置を用いると、簡単な操作でエクソソームを粒子捕捉用開口に捕捉し解析できることがわかった。
Claims (13)
- 導入流路と、
前記導入流路の下流側に設けられた扁平流路と、
前記扁平流路の下流側に設けられた矩形流路と、
前記矩形流路の少なくとも第1内壁面に設けられた粒子捕捉用開口と、を備え、
前記導入流路は、前記扁平流路の流路断面よりも広い流路断面を有し、
前記扁平流路は、横幅の広い扁平な流路断面を有し、
前記矩形流路は、矩形の流路断面を有し、かつ、第1内壁面と第2内壁面とが対向し、第3内壁面と第4内壁面とが対向するように設けられ、
前記導入流路、前記扁平流路、前記矩形流路及び前記粒子捕捉用開口は、前記導入流路を流れる捕捉対象粒子を含む液体の一部が、前記扁平流路に流入し、前記扁平流路を流れた前記捕捉対象粒子が前記液体と共に前記矩形流路に流入し、前記矩形流路を流れた前記捕捉対象粒子が前記粒子捕捉用開口の内部に侵入し捕捉されるように設けられ、
前記扁平流路は、前記捕捉対象粒子の平均粒径の1.04倍以上2.3倍以下の厚さを有することを特徴とする粒子捕捉装置。 - 前記扁平流路と前記導入流路との間に設けられた細胞捕捉室をさらに備える請求項1に記載の粒子捕捉装置。
- 排出側流路と、補助流路と、連通流路とをさらに備え、
前記排出側流路は、前記矩形流路の下流側に設けられており、
前記補助流路は、前記矩形流路と実質的に平行に延びる流路であり、前記補助流路の一端は前記排出側流路に接続しており、
前記連通流路は、前記粒子捕捉用開口と前記補助流路とを連通するように設けられ、かつ、前記捕捉対象粒子が通過することができない流路断面を有する請求項1又は2に記載の粒子捕捉装置。 - 前記粒子捕捉用開口は、第1内壁面及び第2内壁面にそれぞれ設けられていることを特徴とする請求項1~3のいずれか1つに記載の粒子捕捉装置。
- 前記矩形流路の第1内壁面と第2内壁面との間の幅は、前記捕捉対象粒子の平均粒径の1.04倍以上2.3倍以下である請求項1~4のいずれか1つに記載の粒子捕捉装置。
- 前記矩形流路の第3内壁面と第4内壁面との間の幅は、前記捕捉対象粒子の平均粒径の1.04倍以上5倍以下である請求項1~5のいずれか1つに記載の粒子捕捉装置。
- 前記粒子捕捉用開口は、前記捕捉対象粒子の平均粒径の1.04倍以上3倍以下の大きさを有する請求項1~6のいずれか1つに記載の粒子捕捉装置。
- 前記粒子捕捉用開口は、捕捉対象粒子の平均粒径よりも大きいことを特徴とする請求項1~4のいずれか1つに記載の粒子捕捉装置。
- 前記扁平流路の厚さは、第1内壁面と第2内壁面との間の幅又は第3内壁面と第4内壁面との間の幅と実質的に同じであり、
前記扁平流路は、前記扁平流路の上面及び下面のうちどちらか一方が第1又は第3内壁面と実質的に一致し、前記上面及び前記下面のうち他方が第2又は第4内壁面と実質的に一致するように設けられた請求項1~8のいずれか1つに記載の粒子捕捉装置。 - 第1基板と第2基板とを備え、
前記矩形流路は、第1基板に設けられた溝が第2基板により覆われる構造を有する請求項1~9のいずれか1つに記載の粒子捕捉装置。 - 前記粒子捕捉用開口の内部に捕捉された前記捕捉対象粒子を含む請求項1~10のいずれか1つに記載の粒子捕捉装置。
- 前記捕捉対象粒子は、小胞、細胞小器官、細胞外小胞、ウィルス、リポソーム、金属粒子、有機粒子、無機粒子、大気汚染微粒子、又は花粉である請求項1~11のいずれか1つに記載の粒子捕捉装置。
- 捕捉対象粒子を含む液体を導入流路に流すステップと、
前記捕捉対象粒子を含む液体の一部が前記導入流路から扁平流路に流入するステップと、
前記捕捉対象粒子を含む液体が前記扁平流路から矩形流路に流入するステップと、
前記捕捉対象粒子が、前記矩形流路の第1内壁面に設けられた粒子捕捉用開口に侵入し捕捉されるステップと、を備え、
前記導入流路は、前記扁平流路の流路断面の流路断面よりも広い流路断面を有し、
前記扁平流路は、横幅の広い扁平な流路断面を有し、
前記扁平流路は、前記捕捉対象粒子の平均粒径の1.04倍以上2.3倍以下の厚さを有し、
前記矩形流路は、第1内壁面と第2内壁面とが対向し、第3内壁面と第4内壁面とが対向するように設けられていることを特徴とする粒子捕捉方法。
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