JP2015149986A - 細胞捕捉用マイクロ流路 - Google Patents

Abstract

【課題】各種細胞、高分子、金属など微細個体を所定の位置に固定し、さらにその表面を容易に化学的に修飾できるマイクロ流路を提供することにある。また、細胞を用いた場合は、その培養、遺伝子導入実験も同時に行うことができるマイクロ流路を提供することを課題とする。【解決手段】流路内の所定の位置に微細個体を固定するためのカップ状の構造物を配置する。このカップ状構造物は周囲を流れる液体とカップ内を流れる液体の流速を近似せしめる為の液抜きの穴を具備している。この構造により微細個体を簡単にカップ内に導入することができる。【選択図】図１

Description

本発明は、微細個体として動植物細胞、バクテリア、ウイルスなどの細胞またはそれらの構成要素であるオルガネラなど生物粒子、さらには金属、高分子、無機、セラミック、金属酸化物、金属窒化物粒子を捕捉し、一定時間同一箇所にとどまらせることにより、動植物細胞であるなら培養、染色、遺伝子導入など各種トランスフェクション、分化誘導、さらには化学的、物理的修飾および処理、動植物細胞以外の粒子であるならその表面化学および物理修飾を応用可能とするマイクロ流路である。また、細胞スフェロイド形成足場の構築のため、足場剤をマイクロ流路に導入し、更に導入後放置、光照射などの処理を行い足場剤を固定した基板を剥がして足場基板として細胞培養に用いることも可能である。

金属、高分子、無機、セラミック、金属酸化物、金属窒化物粒子の表面修飾は、通常ある一定時間修飾分子が溶解もしくは分散した溶液に導入し、その後、洗浄などの方法で精製するのが一般的な方法である。この方法で修飾した粒子は免疫分析、ＤＮＡ、ペプチド、ポリマーの固相合成において重要である。動植物細胞において細胞表面で起こる膜たんぱく質分子の構造変化や細胞内でのシグナル伝達解析を検討する場合、細胞を一定時間特定の溶液に浸漬し、化学的もしくは物理的もしくは生理学的処理を施し、さらにその処理の停止をおこなう必要がある。さらに、細胞、オルガネラ、微生物の染色を定量的に行うことは例えばフローサイトメトリー解析に対して非常に重要なことである。

これら上記記載の表面修飾に関して従来、金属、高分子、無機、セラミック、金属酸化物、金属窒化物粒子の表面修飾は、目的とする例えば化学分子を懸濁させた溶液にこれら粒子を混合することで行われたが、粒子サイズが小さくなると粒子間の凝集が起こり、粒子の分散状態が悪化するなどの問題があった。また、これら凝集を抑制するために一般的に溶液の塩基性もしくは酸性を制御する（すなわちピーエイチ制御）方法があるが、この場合表面修飾する化学分子が変性するなどの問題が生じることが問題となっている。

細胞表面もしくはその内部の修飾や染色に関しては、例えば培養ビン、もしくは培養シャーレ内で細胞を所定のセルラインに従って培養し、その後、バッファーなどで洗浄した後に直接染色液や修飾分子含有溶液に細胞を所定時間浸し、染色もしくは修飾を完了する方法、もしくは培養した細胞をトリプシンなどの酵素により培養器からはがし、その後剥がした細胞のみをバッファー等に分散し、この細胞分散バッファー溶液に染色剤、化学修飾剤を添加して細胞表面の修飾もしくは染色を完了している。しかしながら前者の方法では特定細胞の経時的変化を追跡する場合には非常に手間がかかるなどの問題、また個々の細胞の特性による変異を細かくモニターすることが難しく、薬理動態など薬物試験において問題があり、また後者の方法ではトリプシンで処理された時点で細胞表面の改質が起こってしまい実細胞の表面と異なった状態になってしまうという問題があった。

近年、半導体産業を中心として急速に発展した微細加工技術を応用し作製したマイクロ流路を用いて細胞の染色、修飾、培養を行う技術が検討されている。この様に個々の細胞を捕捉することが出来れば、その細胞に対して例えばＲＣＡ法（ｉｎ ｓｉｔｕ ｐａｄｌｏｃｋ ｐｒｏｂｅ ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（非特許文献１参照。）等を行うことにより、その細胞が、特定のがん遺伝子を有しているか否かを調べることができる。一方、細胞捕捉を目的としたマイクロ流路も提案されている。例えば、捕捉すべき細胞の表面の抗原を標的とする抗体を固定化した円柱状ピラーをマイクロ流路内に分散して配置し、これらピラーと衝突した目的細胞を捕捉するものである（非特許文献２参照）。

Ｎ．Ｎｉｌｃｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５，１９９４． Ｓ．Ｎａｇｒａｔｈ ｅｔ． ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４５０，２００７

以上のような背景の下に、本発明は、所望の微細個体を破壊することなく効率よく単離捕捉することができ、捕捉された微細個体を顕微鏡等で観察することが容易であり、また、微細個体が細胞である場合捕捉位置での培養、染色、遺伝子導入など細胞操作を可能とするものである。

本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、マイクロ流路内に細胞捕捉用のカップ状壁を配置し、そのカップ状壁が捕捉すべき構造物の開口部のサイズが細胞サイズの５０％以上１００％未満でありさらにその構造体は数箇所液体が通り抜けられる流路を形成してあることでその構造体に細胞を導入することを可能とした。またこの構造体は予め数および位置が決められているため、例えば電動Ｘ−Ｙステージ付顕微鏡を用いれば、その形態観察等が全て自動で行えることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、一つの態様において、
（１）特定の微細個体を捕捉するためのマイクロ流路であって、シリコンゴムで形成されたブロック内にマイクロ流路を具備し、さらにそのマイクロ流路内に微細個体捕捉領域を所定の位置に有し、さらにその微細個体捕捉領域は周囲を流れる液体と捕捉領域を流れる液体の流速を近似せしめる為のいくつかの貫通領域を具備していることを特徴とするマイクロ流路。
（２）第１項において、微細個体が細胞もしくは高分子単粒子もしくはその凝集体もしくは金属粒子単体もしくはその凝集体であり、これら微粒子の大きさが少なくとも３μｍ以上、１００μｍ未満で、さらに流路内にこれら個体を捕捉可能な形態を具備しているマイクロ流路
（３）第１項において、微細個体捕捉領域がカップ状の形状をなし、その開口部の寸法が捕捉すべき微細個体のサイズの５０％以上２００％未満であるマイクロ流路。
（４）第１項において、マイクロ流路の流路深さが捕捉すべき微細個体のサイズの１．５倍から０．５倍であるマイクロ流路。
（５）第１項ないし第３項において、微細個体捕捉領域の平面的寸法が縦横何れも１００μｍ以下であるマイクロ流路。
（６）第１項において、微細個体捕捉領域の形状としてその捕捉領域外と捕捉領域内を流れる流速を近似せしめる為に微細個体捕捉領域に液抜きのための穴が具備されているマイクロ流路。
（７）第５項において、液抜きのための穴の幅が５μｍ以下であるマイクロ流路。
（８）微細個体捕捉領域は顕微鏡による自動観察ができるようにその位置が固定されているマイクロ流路。
（９）第１項において、マイクロ流路において薬剤導入口として微細個体の導入口、それを染色する薬剤の導入口、薬剤を洗い流す洗浄剤の導入口など少なくとも１つ以上の導入口を有するマイクロ流路。
（１０）第１項において、微細個体が細胞であって、個々の固定サイトに細胞を固定した後に細胞を培養することが可能であるマイクロ流路。
（１１）第１項及び第２項において、微細個体を捕捉領域はマイクロ流路内の液体の流れる方向に対して９０度をなす方向に開口する向きで少なくとも１箇所以上設置されており、さらにその微細個体の捕捉領域は少なくともマイクロ流路内において２００μｍに１個以上の割合で設置されるマイクロ流路。
（１２）第１項において、マイクロ流路において個体を捕捉可能な形態物を具備した流路の幅が少なくとも２０μｍ以上であるマイクロ流路。
（１３）第１項ないし第９項、及び第１１項ないし第１２項において、微細個体捕捉領域はマイクロ流路内の基板表面処理剤を導入し、その後、冷却もしくは常温もしくは加熱処理を行い、基板表面に所定形状の表面を処理を施して成るマイクロ流路。

本発明によれば、表面修飾を必要とする微細個体を凝集することなく個々に捕捉し、その捕捉した位置で所望の修飾剤を作用させることによって、かかる微細個体の表面を効率的に修飾することが可能となる。特に、細胞への遺伝子導入、染色に関しては蛍光標識等の検出部位を付与した抗体を含むキット等に応用することで、生体から採取した細胞や組織を測定対象とする簡便かつハイスループットな蛍光標識細胞の作製又は蛍光イメージングを行うことができる。また、細胞を予め定位置に具備させた捕捉領域に固定することで、顕微鏡等による自動観察を可能としている。さらに、本発明のマイクロ流路本体にシリコン樹脂を用いていることから従来のようにガラス等の無機基板にレーザーなどにより直接設置していたマイクロ流路とは異なり簡便に作製することできるという利点も有する。

マイクロ流路内に設置されている微細個体捕捉領域の模式図 マイクロ流路内に具備された微細固体補足領域１内に設置された微細固体補足を目的とした構造体の断面の模式図 マイクロ流路内に具備された微細固体補足領域２内に設置された微細固体補足を目的とした構造体の断面の模式図 マイクロ流路内に具備された微細固体補足領域３内に設置された微細固体補足を目的とした構造体の断面の模式図 マイクロ流路内に具備された微細固体補足領域４内に設置された微細固体補足を目的とした構造体の断面の模式図 マイクロ流路内に具備された微細固体補足領域５内に設置された微細固体補足を目的とした構造体の断面の模式図 微細固体補足領域５に補足された細胞の顕微鏡写真 微細固体補足領域５に補足された細胞から発せられる蛍光の顕微鏡写真

以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。

１．マイクロ流路
本願において「マイクロ流路」とは、ターゲットとなる微細個体を凝集することなく所定の捕捉領域に固定し、その固定位置で固定されている微細個体表面を各種表面修飾剤により染色もしくは遺伝子導入、さらには培養を行うことができる流路である。本発明に係わる微細個体としては細胞、ウイルス、バクテリアなど生態物質または高分子粒子または無機粒子であり、好ましくはその大きさが３μ以上、より好ましくは５μ以上、さらに好ましくは８μ以上であり、その流路内には上記微細個体を捕捉可能な形態を具備しており、さらにその具備された捕捉領域はその周りを流れる液体の流速と捕捉領域を流れる液体の流速を近似せしめる為に液体の貫通穴が設置してある。貫通穴は少なくとも１箇所、好ましくは３箇所、さらに好ましくは５箇所以上である。これは貫通穴が多いほど１つの貫通穴の幅を小さくすることができ、捕捉された微細個体が貫通穴から抜け出る恐れがなくなる。また、具備されている微細個体捕捉領域の開口部は微細個体のサイズの好ましくは５０％以上２００％未満、更に好ましくは５０％以上１５０％未満、より好ましくは５０％以上１００％未満であり、微細個体単体が１つの捕捉エリアに捕捉されるように設計されている。またマイクロ流路自体の深さは捕捉される微細個体のサイズの好ましくは１．５倍から０．５倍であり、さらに好ましくは１．２倍から０．７倍、モットの好ましくは１倍から０．８倍である。好ましい実施態様において、本発明にマイクロ流路内に具備されている。微細個体捕捉領域の平面的寸法が縦横何れも１００μｍ以下、好ましくは５０μｍ以下、更に好ましくは１５μｍ以下である。

これら捕捉領域の形態を図１に示す。捕捉領域の形状に関しては特に限定するものではないが、少なくとも微細個体を捕捉するためのカップ状の形態を有することが好ましい。
これら捕捉領域には液体を流すための貫通口（図１）が設けられている。この貫通口の開口部サイズは５μｍ以下、より好ましくは３μ以下である。また１つの捕捉領域に対して少なくとも１つ、より好ましくは３つ、さらに好ましくは５つ以上の貫通口を有している。この数は多いほど貫通口の開口部サイズを小さくすることが可能となり、それにより一度捕捉された微細個体がその貫通口から抜け出ることを抑制することが出来る。また、たとえば、細胞を染色する場合の染色液がこの微細領域に捕捉されている細胞等に接触しやすくするために貫通口を増やすことが望ましい。上記マイクロ流路は微細個体、染色等の薬剤、さらに洗浄剤を導入する導入口（１）を同一にしても構わないが、それぞれ別の導入口を設けることで、さまざまな染色など表面処理を行うことが可能となる。この導入口の数は少なくとも１箇所、好ましくは３箇所、更に好ましくは４箇所以上である。またこれら微細個体捕捉領域を有するマイクロ流路で、例えば細胞を捕捉した場合、そのまま、その場所で細胞を培養することも可能である。このことから、本マイクロ流路は細胞へのストレス試験、分化誘導にも適しているといえる。これら微細個体捕捉領域はマイクロ流路内の液体の流れる方向に対して９０度をなす方向に少なくとも１箇所以上設置されており、さらにその微細個体捕捉領域は少なくとも２００μｍに１個の割合で設置されることが望ましい。また、流路全体の幅は少なくとも２０μｍ以上であり、好ましくは２０００μｍ以上である。

２．微細個体の自動観察システム
本微細個体捕捉領域を付帯したマイクロ流路はその捕捉領域が固定であるため、電動Ｘ−Ｙステージを具備した顕微鏡を用いることにより指定した捕捉領域に捕捉されている細胞等の状態を経時的に自動で観察することができる。このため本システムは細胞に対する薬理動態、分化誘導の経時的変化、培養状態のチェックなどに応用することができる。また、マイクロ流路を用いているため、培地を継続的に流すことが可能で交換する必要がなく、また、一定期間の後細胞を回収する場合、トリプシンなどの剥離剤を導入した後、リバース側に培地やバッファーを流すことで簡単に細胞を回収できる。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。

マイクロ流路の作製：マイクロ流路は通常のソフトリソグラフィー法によって作製が可能である。その工程を以下に示す。
１） ＣＡＤによるマイクロパターンの作製
２） リソグラフィー用マスクの作製
３） リソグラフィーによる型の作製
４） 型にシリコン樹脂を流し、マイクロパターンを転写しレプリカを作製
５） 所定の大きさに切り出し、導入口を開けた後に平面基板へ貼り付ける。
より詳細な実験手順は、以下のとおりである。

フォトマスクの作成：キャドソフトにより作製したマイクロパターンを図１から図６に示す。これらマイクロパターンは石英ガラスに転写されフォトマスクとして使用される。

型の作成：ネガ型レジンエスユーエイト３０１０をシリコンウエハー上に滴下し振り切り回転速度３０００回転で３０秒間スピンコートする。シリコン基板上におよそ１０μｍの膜が形成される。その後、９５℃に設定されたホットプレート上に３分間放置してソフトベークを行う。表面のベタつきがほぼなくなるまで冷却した後、ネガ型レジン用フォトマスクを介して紫外線を照射する。使用する紫外線ランプは３５０ｎｍの波長であり、積算光量として２００ｍＪ／ｃｍ^２を照射する。照射したレジン付きシリコンウエハーは９５℃に設定されたホットプレート上で２分間加熱される。この時、レジン上にパターンが浮かび上がる。この焼成をポストベークと呼ぶ。ポストベーク後シリコンウエハーをエスユーエイト３０１０の剥離剤であるマイクロケムエスユーエイトデベロッパーを用いて未照射部を剥離する。剥離後ウエハーを純粋でよく洗浄し、その後１５０℃焼成炉で２時間焼成する。

レプリカの作成：上記作成した型をガラスシャーレに入れ、これにシリコンレジンシリガード１８４と硬化剤を１：１で混合した粘性液体を流し込み、減圧下で脱泡した後に８０℃炉に３時間放置し硬化させる。硬化後手術用メスを用いて流路相当部に切り込みを入れ、その端部からピンセットを用いて慎重にシリコンウエハーから剥がしとる。

マイクロ流路の作成：上記方法で作成したレプリカのドレイン及び薬剤導入部にパンチで穴を開ける。ガラス基板との貼り合わせはプラズマを用いるが、貼り合わされる面にプラズマが照射する。プラズマはおよそ３０秒程度照射する。プラズマガスは空気もしくは酸素を用いる。プラズマ照射後レプリカとガラス基板を貼り合わせる。この時貼り合わせ面に空気が残らないように張り合わせる。その後８０℃炉に３０分放置し接着を完了する。接着後導入口及びドレイン口にそれぞれピンを立て、その根元をシリコン接着剤で必要に応じて硬化する。

細胞の固定及び染色実験：直径３０ｍｍの小型シャーレに培養したマウス大腸がん細胞（細胞濃度 ２．５×１０^５ｃｅｌｌ／ｍＬ）の培地を吸い出し、燐酸バッファーを用いて洗浄を３回行う。タカラバイオ株式会社より購入したリブアンドデッド試薬を次の書式に従って調整する。
１）２ｍＭ ＥｒｇＤ−１溶液の２０μＬを１０ｍＬ燐酸バッファーに添加し攪拌する。この状態で濃度はおよそ４μＭ溶液となる。
２）１）で調整した溶液に４ｍＭ カルセインＡＭ溶液の５μＬを添加し攪拌する。
３）直径３０ｍｍの小型シャーレにバッファー２００μＬを添加し、これに１００μＬの２）で調整した染色試薬を添加して３７℃インキュベーター内で３０分放置する。その後、トリプシンを用いて細胞をシャーレから剥離した後、遠心により燐酸バッファーで洗浄し、十分に燐酸バッファーに分散した後にシリンジに充填し、マイクロ流路に０．５ｍＬ／ｍｉｎの速度で流し込む。
４）流し込みながら蛍光顕微鏡を用いて流路内に固定される細胞を観察し、その固定細胞から発せられる蛍光を観察する。
流路内の微細固体補足領域５に補足された細胞の顕微鏡写真を図７に示す。また、その細胞から発せられる蛍光の顕微鏡写真を図８に示す。

１ 導入口 直径２ｍｍ、 ２ 濾過エリア、
３ 微細固体補足領域１、 ４ 濾過エリア、
５ 微細固体補足領域２、 ６ 濾過エリア、
７ 微細固体補足領域３、 ８ 濾過エリア、
９ 微細固体補足領域４、 １０ 濾過エリア、
１１ 微細固体補足領域５、 １２ 濾過エリア、
１３ ドレイン口、 １４ 開口部 ７．５ μｍ、
１５ 貫通口 ２．０ μｍ、 １６ 貫通口 ２．０ μｍ、
１７ 貫通口 ４．０ μｍ、 １８ 微細固体補足用ピラー、
１９ 開口部 ７．５ μｍ、 ２０ 貫通口 ４．０ μｍ、
２１ 開口部 ２０ μｍ、 ２２ 貫通口 ３ μｍ、
２３ 貫通口 ３ μｍ、 ２４ 貫通口 １０ μｍ、
２５ 貫通口 ５ μｍ、 ２６ 閉塞用構造体、
２７ 閉塞用構造体、 ２８ 閉塞用構造体間隔 １５μｍ、
２９ 開口部 １０ μｍ、 ３０ 貫通口 ３．５μｍ、
３１ 誘導用構造体

Claims (13)

1. 特定の微細個体を捕捉するためのマイクロ流路であって、シリコンゴムで形成されたブロック内にマイクロ流路を具備し、さらにそのマイクロ流路内に微細個体捕捉領域を所定の位置に配置し、さらにその微細個体捕捉領域は周囲を流れる液体と捕捉領域を流れる液体の流速を近似せしめる為のいくつかの貫通領域を具備していることを特徴とするマイクロ流路。
2. 請求項１において、該微細個体が細胞もしくは高分子単粒子もしくはその凝集体もしくは金属粒子単体もしくはその凝集体であり、これら微粒子の大きさが少なくとも３μｍ以上、１００μｍ未満で、さらに流路内にこれら個体を捕捉可能な形態を具備しているマイクロ流路。
3. 請求項１において、該微細個体捕捉領域がカップ状の形状をなし、その開口部の寸法が捕捉すべき微細個体のサイズの５０％以上２００％未満であるマイクロ流路。
4. 請求項１において、該マイクロ流路の流路深さが捕捉すべき微細個体のサイズの１．５倍から０．５倍であるマイクロ流路。
5. 請求項１ないし請求項３において、該微細個体捕捉領域の平面的寸法が縦横何れも１００μｍ以下であるマイクロ流路。
6. 請求項１において、該微細個体捕捉領域の形状としてその捕捉領域外と捕捉領域内を流れる流速を近似せしめる為に微細個体捕捉領域に液抜きのための穴が具備されているマイクロ流路。
7. 請求項５において、該液抜きのための穴の幅が５μｍ以下であるマイクロ流路。
8. 請求項１において、該微細個体捕捉領域は顕微鏡による自動観察ができるようにその位置が固定されているマイクロ流路。
9. 請求項１において、該マイクロ流路において薬剤導入口として微細個体を導入口、それを染色する薬剤の導入口、薬剤を洗い流す洗浄剤を導入口など少なくとも１つ以上の導入口を有するマイクロ流路。
10. 請求項１において、該微細個体が細胞であって、個々の固定サイトに細胞を固定した後に細胞を培養することが可能であるマイクロ流路。
11. 請求項１及び請求項２において、該微細個体捕捉領域はマイクロ流路内の液体の流れる方向に対して９０度をなす方向に開口する向きで少なくとも１箇所以上設置されており、さらにその微細個体捕捉領域は少なくともマイクロ流路内において２００μｍに１個以上の割合で設置されるマイクロ流路。
12. 請求項１において、該マイクロ流路において個体を捕捉可能な形態物を具備した流路の幅が少なくとも２０μｍ以上であるマイクロ流路。
13. 請求項１ないし請求項９、及び請求項１１ないし請求項１２において、該微細個体捕捉領域はマイクロ流路内の基板表面処理剤を導入し、その後、冷却もしくは常温もしくは加熱処理を行い、基板表面に所定形状の表面を処理を施して成るマイクロ流路。