JP2022022281A - ペン内アッセイの方法、システム及びキット - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書に開示される実施形態は、概して、定義されたエリア内に閉じ込められた微小物体の数量パラメータ又は品質パラメータを光学的に測定するシステム、装置及び方法に関する。より詳細には、マイクロ流体組立体内のチャンバに閉じ込められた微小物体によって生成される検体の数量を正確に特定することができる撮像システム又は方法が必要とされる。
一態様では、生物学的微小物体によって生成される検体の数量を特定するシステムが提供される。本システムは、画像取得ユニットを含み得る。画像取得ユニットは、マイクロ流体デバイスを固定可能なマイクロ流体デバイスホルダを含み得、マイクロ流体デバイスは、フロー領域及びフロー領域に流体的に接続される複数の隔離ペンを含む。複数の隔離ペンのそれぞれは、1つ又は複数の生物学的微小物体を保持することができる。画像取得ユニットは、マイクロ流体デバイスの複数の隔離ペン及びフロー領域の1つ又は複数のアッセイ画像を取得するように構成される撮像要素を更に含み得る。本システムは、画像取得ユニットに通信可能に接続される画像処理ユニットを更に含み得る。画像処理ユニットは、捕捉された各アッセイ画像を受信し、且つアッセイ画像に示される各隔離ペンの対象エリアを定義するように構成される対象エリア決定エンジンを含み得る。対象エリアは、検体濃度変動の測定について影響を最も受けやすく、検体変動が測定されるとき、隔離ペン内の生物学的微小物体の位置の影響を最も受けにくく、且つ隔離ペンとフロー領域との間で拡散軸に沿って延在する隔離ペン内のエリアに対応する画像エリアを含み得る。画像処理ユニットは、各隔離ペンの対象エリア内の画像エリアの少なくとも一部を分析して、各隔離ペン内の検体の数量を示すスコアを決定するように構成されるスコア付けエンジンを更に含み得る。
本明細書に開示される原理及びその利点をより詳細に理解するために、ここで、添付図面と併せて解釈される以下の説明が参照される。
本明細書は、本発明の例示的な実施形態及び用途を記載する。しかし、本発明は、これらの例示的な実施形態及び用途又は例示的な実施形態及び用途が動作する様式若しくは本明細書に記載される様式に限定されない。更に、図は、簡易化された図又は部分図を示し得、図中の要素の寸法は、強調されることもあれば、又は他の方法で一定の比率でないことがある。加えて、「上」、「付着される」、「接続される」、「結合される」又は同様の用語が本明細書において使用される場合、ある要素(例えば、材料、層、基板等)は、ある要素が他の要素の直接上にあるか、直接付着されるか、直接接続されるか、若しくは直接結合されるか否かに関係なく、又はある要素と別の要素との間に1つ若しくは複数の介在要素があるか否かに関係なく、別の要素の「上」にあり、別の要素に「付着」されるか、「接続」されるか、又は「結合」され得る。また、文脈により別のことが示される場合を除き、方向(例えば、上方、下方、上部、下部、横、上、下、の下、の上、上部の、下部の、横、縦、「x」、「y」、「z」等)は、提供される場合、相対的なものであり、単に例として例示及び考察を容易にするために提供され、限定として提供されるものではない。加えて、要素のリスト(例えば、要素a、b、c)が言及される場合、そのような言及は、リスト自体に列挙された要素のいずれか1つ、列挙された要素の全て未満の任意の組合せ及び/又は列挙された全ての要素の組合せを包含することが意図される。本明細書でのセクション分割は、検討を容易にすることのみを目的とし、考察されるいかなる要素の組合せも限定しない。
図1Aは、生物学的微小物体の維持、分離、アッセイ又は培養に使用することができるマイクロ流体デバイス100及びシステム150の例を示す。カバー110を一部切り欠き、マイクロ流体デバイス100内の部分図を提供するマイクロ流体デバイス100の斜視図を示す。マイクロ流体デバイス100は、一般に、流路106を含むマイクロ流体回路120を含み、流路106を通って流体培地180が流れることができ、任意選択的に1つ又は複数の微小物体(図示せず)をマイクロ流体回路120内及び/又はマイクロ流体回路120を通して搬送する。1つのマイクロ流体回路120が図1Aに示されているが、適するマイクロ流体デバイスは、複数(例えば、2又は3個)のそのようなマイクロ流体回路を含むことができる。それに関係なく、マイクロ流体デバイス100はナノ流体デバイスであるように構成され得る。図1Aに示されるように、マイクロ流体回路120は、複数のマイクロ流体隔離ペン124、126、128、及び130を含み得、ここで、各隔離ペンは、流路106に流体接続する1つ又は複数の開口部を有し得る。図1Aのデバイスの幾つかの実施形態では、隔離ペンは、流路106と流通する1つのみの開口部を有し得る。更に以下で考察するように、マイクロ流体隔離ペンは、培地180が流路106を通って流れているときであっても、マイクロ流体デバイス100等のマイクロ流体デバイスに微小物体を保持するように最適化された様々な特徴及び構造を含む。しかし、上記を参照する前に、マイクロ流体デバイス100及びシステム150の概説を提供する。
上述したように、システムの制御及び監視機器は、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体回路において微小物体又は液滴等の物体を選択し移動させる原動モジュールを含むことができる。マイクロ流体デバイスは、移動される物体のタイプ及び他の考慮事項に応じて様々な原動構成を有することができる。例えば、誘電泳動(DEP)構成を利用して、マイクロ流体回路において微小物体を選択し移動させることができる。したがって、マイクロ流体デバイス100の支持構造体104及び/又はカバー110は、マイクロ流体回路120内の流体培地180内の微小物体に対してDEP力を選択的に誘導し、それにより個々の微小物体又は微小物体群の選択、捕捉、及び/又は移動を行うDEP構成を含むことができる。代替的に、マイクロ流体デバイス100の支持構造体104及び/又はカバー110は、マイクロ流体回路120内の流体培地180内の液滴に対して電子ウェッティング(EW)力を選択的に誘導し、それにより個々の液滴又は液滴群の選択、捕捉、及び/又は移動を行う電子ウェッティング(EW)構成を含むことができる。
一般的な隔離ペン224、226、及び228の非限定的な例は、図2A~図2Cに示されるマイクロ流体デバイス230内に示されている。各隔離ペン224、226、及び228は、分離領域240と、分離領域240をチャネル122に流体接続する接続領域236とを画定する分離構造体232を含むことができる。接続領域236は、マイクロ流体チャネル122への基端開口部234及び分離領域240への先端開口部238を含むことができる。接続領域236は、マイクロ流体チャネル122から隔離ペン224、226、228内に流れる流体培地(図示せず)のフローの最大侵入深さが分離領域240内に及ばないように構成され得る。したがって、接続領域236に起因して、隔離ペン224、226、228の分離領域240内に配置された微小物体(図示せず)又は他の材料(図示せず)は、チャネル122内の培地180のフローから分離され、マイクロ流体チャネル122内の培地180のフローにより実質的に影響されないことができる。
理論による限定を意図せずに、マイクロ流体デバイス(例えば、DEP構成及び/又はEW構成マイクロ流体デバイス)内での生物学的微小物体(例えば、生体細胞)の維持は、マイクロ流体デバイスの少なくとも1つ又は複数の内面が、マイクロ流体デバイスと内部に維持される生物学的微小物体との間の主な界面を提供する有機分子及び/又は親水性分子の層を提示するように調整又は被覆される場合に促進し得る(すなわち、生物学的微小物体は、マイクロ流体デバイス内で生存率の増大、より大きい増殖、及び/又はより大きい可搬性を示す)。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの内面の1つ又は複数(例えば、DEP構成マイクロ流体デバイスの電極活性化基板の内面、マイクロ流体のカバー、及び/又は回路材料の表面)は、有機分子及び/又は親水性分子の所望の層を生成するように、被覆溶液及び/又は被覆剤により処理又は修飾し得る。
限定ではなく、血清又は血清因子、ウシ血清アルブミン(BSA)、ポリマー、洗剤、酵素、及びそれらの任意の組合わせを含む任意の従来の被覆剤/被覆溶液を使用することができる。
少なくとも1つの内面は、ポリマーを含む被覆材料を含み得る。ポリマーは、少なくとも1つの表面に共有結合又は非共有結合し得る(又は非特異的に付着し得る)。ポリマーは、ブロックポリマー(及びコポリマー)、星型ポリマー(星型コポリマー)、並びにグラフト又は櫛形ポリマー(グラフトコポリマー)に見られる等の多種多様な構造モチーフを有し得、これらは全て本明細書に開示される方法に適し得る。
幾つかの実施形態では、少なくとも1つの内面は、マイクロ流体デバイス内の生物学的微小物体の維持/増殖に適した有機分子及び/又は親水性分子の層を提供して、そのような細胞に調整面を提供する共有結合分子を含む。
調整された表面の組成以外で、疎水性材料の物理的厚さ等の他の要因がDEP力に影響し得る。調整された表面が基板に形成される様式(例えば、蒸着、液相堆積、スピンコーティング、フラッディング、及び静電コーティング)等の様々な要因が調整された表面の物理的厚さを変更し得る。幾つかの実施形態では、調整面は、約1nmから約10nm、約1nmから約7nm、約1nmから約5nm、又はそれらの間の任意の個々の値の厚さを有する。他の実施形態では、共有結合部分により形成される調整面は、約10nm~約50nmの厚さを有し得る。様々な実施形態では、本明細書において記載されるように準備される調整面は、10nm未満の厚さを有する。幾つかの実施形態では、調整面の共有結合部分は、マイクロ流体デバイスの表面(例えば、DEP構成基板表面)に共有結合した場合、単層を形成し得、10nm未満(例えば、5nm未満又は約1.5nm~3.0nm)の厚さを有し得る。これらの値は、例えば、約30nmの厚さを典型的には有する、スピンコーティングで用意された表面の厚さとは対照的である。幾つかの実施形態では、調整面は、DEP構成マイクロ流体デバイス内での動作に適宜機能的であるために、完全に形成された単層を必要としない。
共有結合被覆材料は、後述するように、マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持/増殖に適した有機分子及び/又は親水性分子の層を提供するように構成される部分を既に含む分子の反応により形成し得る。代替的には、共有結合被覆材料は、生物学的微小物体の維持/増殖に適した有機分子及び/又は親水性分子の層を提供するように構成される部分を、それ自体が表面に共有結合した表面修飾リガンドに結合することにより、2部シーケンスで形成し得る。
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの表面(例えば、隔離ペン及び/又はフロー領域の少なくとも1つの表面を含む)に共有結合した被覆材料は、式1又は式2の構造を有する。被覆材料は、表面に1ステップで導入される場合、式1の構造を有し、一方、被覆材料は、複数ステッププロセッサで導入される場合、式2の構造を有する。
細胞集団の成長及び/又は増殖を促進するために、システムの追加の構成要素により、機能的な細胞の維持を促す環境状況を提供し得る。例えば、そのような追加の構成要素は、栄養素、細胞成長シグナリング種、pH調整、ガス交換、温度制御、及び細胞からの老廃物の除去を提供することができる。
幾つかの実施形態では、本開示は、隔離ペン内に存在する生体分子を定量化する方法、システム及びデバイスを提供する。幾つかの実施形態では、生体分子は、生体細胞の分泌検体又は分泌検体を生成可能な任意の他の生物学的微小有機物である。
本明細書に記載されるように、生物学的微小物体の分泌検体量は、分泌検体に結合するリポーター分子を使用して定量化し得る。リポーター分子は、定量化される分泌検体に結合する結合成分と、リポーター分子量の検出に使用される信号成分とを含む。リポーター分子は、結合状態(例えば、分泌検体の1つ又は複数の分子に結合されている)よりも非結合状態(例えば、分泌検体に結合されていない)で高い拡散率を有する。幾つかの実施形態では、非結合リポーター分子と結合リポーター分子との拡散率との間の違いは、リポーター分子が結合する分泌検体分子のサイズの関数である。幾つかの実施形態では、リポーター分子は、拡散率を低くする配座で分泌検体に結合し得る。例えば、リポーター分子は、分泌検体が凝集する配座で、部分的にその配座に起因してゆっくりと拡散する分泌検体の複数のコピーと結合し得る。本明細書に記載される方法は、リポーター分子(非結合)と結合リポーター分子:検体複合体(RMSA)との間の拡散率の差を利用して分泌検体量を定量化する。
図4A~図4Cは、本開示の幾つかの実施形態によるアッセイを示す。図4Aでは、検出可能な標識をそれぞれ有するリポーター分子412は、フロー242内のある濃度のリポーター分子412を含む流体をマイクロ流体デバイス400のチャネル122に流すことにより、マイクロ流体チャネル122に導入される。隔離ペン424、426、428は、それぞれ生体検体410を分泌する様々な数の細胞402、404、406を含むマイクロ流体チャネル122に流体的に接続される。各隔離ペン424、426、428は、接続領域436及び分離領域440を含む(単に明確にするために、隔離ペン424は、そのように標識された唯一のペンである)。接続領域436及び分離領域440は、上述した特性を有し、チャネル122に導入された材料の接触を制限する(例えば、分離領域440内において、チャネル122内に流入した材料は、分離領域への直接フローではなく、拡散によってのみ分離領域に入り得る)。図4Aに示される時点では、分泌検体410の分子は、細胞の近くにある。
図5A~図5Cは、本開示の一実施形態によるアッセイを示す。図5Aでは、検出可能な標識をそれぞれ有するリポーター分子412が、ある濃度のリポーター分子412を含む流体をチャネル122に流すことにより、マイクロ流体デバイス500のマイクロ流体チャネル122に導入される。図5Aは、生物検体410を分泌している様々な数の細胞502、504、506を含むマイクロ流体チャネル122に流体的に接続される隔離ペン524、526、528も示す。各隔離ペン524、526、528は、接続領域536及び分離領域540を含む(単に明確にするために、隔離ペン524は、標識された唯一のペンである)。接続領域536及び分離領域540は、上述した特性を有し、チャネル122に導入された材料の接触を制限する(例えば、分離領域540内において、チャネル122内に流入した材料は、分離領域への直接フローではなく、拡散によってのみ分離領域に入り得る)。図5Aに示される時点では、分泌検体410の分子は、細胞の近くにある。
生物学的微小物体によって分泌される検体は、タンパク質、サッカリド、核酸、3Kd未満の分子量を有する有機分子、小胞、ウィルス及びそれらの任意の組合せであり得る。分泌検体は、天然発現検体(例えば、ネイティブ発現)であり得、又は遺伝子操作された検体(例えば、遺伝子挿入、遺伝子欠失、変更等から生じる産物)であり得る。核酸である分泌検体は、リボ核酸又はデオキシリボ核酸であり得、天然又は非天然ヌクレオチドを含み得る。ウィルスである分泌検体は、ウィルス粒子、ベクター又はフェーズであり得る。サッカリドである分泌検体は、モノ、ジ又はポリサッカリドであり得る。サッカリドの非限定的な例としては、グルコース、トレハロース、マンノース、アラビノース、フルクトース、リボース、キサンタン又はキトサンを挙げ得る。分泌小有機分子は、限定ではなく、バイオ燃料、オイル、ポリマー又はマクロライド系抗生材料等の薬剤を含み得る。タンパク質である分泌検体は、抗体又は抗体の断片であり得る。タンパク質である分泌検体は、アルブミン、グロブリン(例えば、アルファ2-マクログロブリン、ガンマグロブリン、ベータ2-マイクログロブリン、ハプトグロブリン)、補体タンパク質(例えば、補体成分3又は4)、トランスフェリン、プロトロンビン、アルファ1抗トリプシン等の血中タンパク質;インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、成長ホルモン、成長因子(例えば、FGF、HGF、NGF、EGF、PDGF、TGF、エリスロポエチン、IGF、TNF)、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、レプチン等のホルモン;絹又は細胞外基質タンパク質(例えば、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、エラスチン、ビトロネクチン、テネイシン、バーシカン、骨シアロタンパク質)等の線維性タンパク質;メタロプロテアーゼ(例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP))又は他のタイプのプロテアーゼ(例えば、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、アスパラギンペプチドリアーゼ)、アミラーゼ、セルラーゼ、カタラーゼ、ペクチナーゼ等の酵素;細菌性、酵母又は原生動物タンパク質;植物タンパク質;カプシド又はエンベロープタンパク質等のo又はaウィルスタンパク質であり得る。タンパク質である分泌検体は、抗体、抗体の断片、酵素(限定ではなく、タンパク質分解酵素を含む)、例えば、アルブミン等の遺伝子操作(通常、細胞内タンパク質)タンパク質及び/又は蚕絹又は蜘蛛の糸)を含むがこれに限定されない構造タンパク質であり得る。このリストは限定ではなく、分泌されるように遺伝子操作し得る任意のタンパク質を方法により評価し得る。分泌検体は、抗体薬物複合体であり得る。プロテイン、サッカリド、核酸、3Kd未満の分子量を有する有機分子及び/又はウィルスの組合せを有し得る分泌検体の非限定的な例としては、プロテオグリカン又は糖タンパク質を挙げることができる。
リポーター分子は、分泌検体に結合するように設計された結合成分を含み得ると共に、検出可能な標識を含み得る。結合成分は、分泌検体に結合するように構成された任意の適する結合相手であり得る。結合成分は、タンパク質、ペプチド、核酸又は3Kd未満の分子量を有する小有機分子であり得る。例えば、結合成分は、別の核酸配列に特異的に結合する核酸配列又はタンパク質に特異的に結合するペプチド(例えば、特定の抗体を認識するエピトープ)であり得る。幾つかの実施形態では、結合成分は、生物学的微小物体の分泌検体の群に非特異的に結合することができる。例えば、結合成分は、IgGドメインに特異的に結合するペプチド又は核酸配列の群に存在する領域に結合する核酸であり得る。幾つかの実施形態では、リポーター分子は、分泌検体の2つ以上のコピー又は分泌検体の群の2つ以上のメンバに結合する2つ以上の結合成分を含む多価であり得る。考察を容易にするために、本明細書で使用される分泌検体という用語は、特定の分泌検体分子又は分泌検体の群のいずれかを指すことができる。したがって、RMSA複合体の化学量論は、様々であり得る。例えば、分泌検体の1コピーに結語するリポーター分子は、1:1化学量論を有するRMSA複合体を有し得る。代替的に、RMSA複合体は、2:1、3:1、4:1、2:2、4:2又は他の化学量論のリポーター分子:分泌検体を有し得る。分子量に依存するリポーター分子:検体複合体の拡散特定により定義されるような見掛けの「サイズ」が、非結合リポーター分子とRMSA複合体との間で示差的な拡散を観測するのに十分にリポーター分子自体よりも「大きい」という規定の下、リポーター分子は、任意の適する分子量を有し得る。リポーター分子は、分泌検体の分子量の約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%又は同じ分子量を有し得る。幾つかの実施形態では、リポーター分子の分子量は、分泌検体の分子量の約50%未満、約40%未満、約30%未満、約20%未満、約10%未満である。RMSA複合体の分子量は、リポーター分子の分子量の少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍又はそれらの間の任意の倍数だけ大きい値であり得る。RMSA複合体の分子量は、非結合リポーター分子の分子量の2倍、4倍又は50倍であり得る。
抗体への結合に適するリポーター分子は、IgGの領域に結合するように構成されたタンパク質、ペプチド及びアプタマーが挙げられる。抗体を検出するためにリポーター分子内で使用されるのに適する結合成分の非限定的なリストを表1に示す。
リポーター分子は、可視、発光、リン光又は蛍光で検出可能な標識も含み得る。幾つかの実施形態では、検出可能な標識は、蛍光標識であり得る。限定ではなく、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、フェナントレン又は任意の他のクラスの蛍光顔料標識を含め、任意の適する蛍光標識を使用し得る。有用な蛍光顔料標識の幾つかの例としては、フルオレセイン(リポーター分子の結合成分の標識するチオイソシアネート活性種として利用可能)Alexa Fluor(登録商標)594((AF594、ThermoFisher Scientific、カタログ番号A20004(NHSエステル))MW819.8、Ex/Em590/617nm)又はHiLyte Fluor(商標)555(AnaSpec Inc.、カタログ番号AS-81250)MW869、Ex/Em550/566nm(Cy3フィルタ)が挙げられる。幾つかの実施形態では、アプタマー又は捕獲オリゴヌクレオチド等のリポーター分子は、FRET標識オリゴヌクレオチドを含み得、これは、限定ではなく、分子ビーコン、デュアルハイブリダイゼーションプローブ、Scorpion(登録商標)プローブ又はEclipse(登録商標)プローブを含み得る。FRET標識オリゴヌクレオチドプローブ又はプローブ対は、ハイブリダイゼーションイベントが発生するまで蛍光しない蛍光標識を含み得る。幾つかの実施形態では、検出可能な標識は、リポーター分子の結合成分に直接又は間接的に共有結合する。幾つかの他の実施形態では、捕獲オリゴヌクレオチドは、リポーター分子の結合成分であり得、内因性又は外因性のいずれかの蛍光顔料は、捕獲オリゴヌクレオチドが検体、例えばインターカレーター性顔料に結合するまで、リポーター分子の検出可能な標識が検出不可能であり得るような検出可能な標識であり得る。幾つかの実施形態では、リポーター分子の検出可能な標識は、RMSA複合体が形成された後まで検出可能でないことがあり得、なぜなら、検出可能な信号は、結合前に存在しなかった新しい波長にシフトするためである。幾つかの実施形態では、リポーター分子の結合成分に共有結合したインターカレーター性顔料等である。他の実施形態では、検出可能な標識は、同位体であり得る。
本明細書に記載される方法は、隔離ペンの分離領域からフロー領域(例えば、マイクロ流体チャネル)への分泌検体の示差的な拡散に関連するモデル及び感想を利用する。生物学的微小物体の分泌検体の挙動をモデリングするに当たり、COMSOL(登録商標)、MATLAB(登録商標)並びに/又は様々な数値モデリング及びコンピュータ支援設計ツールを含むがこれに限定されない幾つかのソフトウェアプログラムを利用し得る。
D=(1/f)kT (式1)
として定義され、式中、fは、摩擦係数であり、kは、ボルツマン定数であり、Tは、絶対温度である。摩擦係数fは、分泌検体が拡散している溶媒の粘度(η)並びに分泌検体のサイズ及び形状に依存する。球形を有する分泌検体が最小化された摩擦係数を有するが、抗体又は定義された構造制約を有する他のタンパク質等の非対称形状を有する分泌検体のfは大きくなる。更に、分泌検体が、分泌検体に関連する水素結合又は水和水等の溶媒との相互作用を有する場合にも、摩擦係数は大きくなる。幾つかの一般的な拡散係数を表2に示す。
<x2>=qiDt (式2)
により表すことができ、式中、<x2>は、平均二乗変位であり、xは、時間tにわたる、選択された移動開始点からの平均距離である。qiの値は、拡散が1次元、2次元又は3次元で評価されているかに依存する。
図9A及び図9B並びに図10A及び図10Bは、アッセイ画像から定量測定(相対又は絶対のいずれか)を抽出する領域を特定するのに使用されるモデリング実験を示す。図9A及び図9Bでは、拡散フロー及びRMSA複合体から生成された蛍光信号強度のモデリングを実行して、隔離ペン424、524、624と同様のマイクロ流体デバイス900の隔離ペン924内の生体細胞902、904、906の位置の影響を考慮した。影響は、チャネル122への隔離ペン924の開口部から離れた隔離ペンのベース(0μm)から約25μmにある細胞902の位置を使用してモデリングされ、細胞904は、隔離ペン924のベースから約100μmの距離でモデリングされ、細胞906は、隔離ペン924のベースから約180μmの距離でモデリングされた(図9A及び図9Bの横軸を参照されたい)。各細胞は、モデリングを簡単にするために、線952で示された隔離ペンの開口部に向かう拡散軌道の中心軸に沿ってあるようにモデリングされる。これらの各位置は、隔離ペンの分離領域940内にあり、且つ隔離ペンの接続領域936から離れており、したがって、分離領域940内で細胞902、904、906から検出される信号強度がチャネル122内のフロー242からのフローの影響を受けないことを保証する。図9Aのy軸は、リポーター分子の正規化濃度を表す(又は等しくRMSA複合体、この実験は、検出される蛍光強度のみに依拠するため)。図9Aに示されるように、蛍光信号の強度(モデリングは、902、904、906が全て同じ率で分泌検体を産出しているという制約を含む)は、細胞902で最高であり、なぜなら、隔離ペン924のベースに近い位置に起因して、904、906よりも高い単一方向性で拡散しているためである。細胞904、906は、標識されたRMSA複合体を全方向に拡散させるより大きい容量を有する。このモデルにより特定されるのは、標識された種の濃度(例えば、RMSA複合体)変化に起因して、信号強度が蛍光信号強度変化の影響を最も受けやすく、且つ細胞902、904、906の厳密な位置の影響を最も受けにくい領域を識別し得ることであり、それは、図9A及び図9Bの両方に示されるように、隔離ペン924とチャネル122との間の拡散軸に沿って存在する領域944である。細胞位置の影響をあまり受けない領域944は、隔離ペン924内の生物学的微小物体の分泌検体の相対量又は絶対量の評価に使用される対象エリア(AOI)の少なくとも一部である。幾つかの実施形態では、AOIは、隔離ペン924及び/又はチャネル122の追加の部分を含み得る。
図10A及び図10Bは、構成の異なる隔離ペン1024での図9A及び図9Bに示されるのと同様に構築されたモデリング実験を示す。マイクロ流体デバイス1000の隔離ペン1024(隔離ペン224、226、228と同様)内の生体細胞1002、1004、1006の位置の影響が示される。影響は、チャネル122への隔離ペン1024の開口部から離れた隔離ペンのベース(0μm)から約25μmにある細胞1002の位置を使用してモデリングされ、細胞1004は、隔離ペン1024のベースから約100μmの距離でモデリングされ、細胞1006は、隔離ペン1024のベースから約180μmの距離でモデリングされた(図10A及び図10Bの横軸を参照されたい)。各細胞は、モデリングを簡単にするために、線1052で示された隔離ペンの開口部に向かう拡散軌道の中心軸に沿ってあるようにモデリングされる。これらの各位置は、隔離ペンの分離領域1040内にあり、且つ隔離ペンの接続領域1036から離れており、したがって、分離領域1040内で細胞1002、1004、1006から検出される信号強度がチャネル122内のフロー242からのフローの影響を受けないことを保証する。図10Aのy軸は、リポーター分子の正規化濃度を表し(又は等しくRMSA複合体、この実験は、検出される蛍光強度のみに依拠するため)、示される濃度の考察は、図9Aについて上述したものと同様である。このモデルにより特定されるのは、標識された種の濃度(例えば、RMSA複合体)変化に起因して、信号強度が蛍光信号強度変化の影響を最も受けやすく、且つ細胞1002、1004、1006の厳密な位置の影響を最も受けにくい領域を識別し得ることであり、それは、図10A及び図10Bの両方に示されるように、隔離ペン1024とチャネル122との間の拡散軸に沿って存在する領域1044である。細胞位置の影響をあまり受けない領域1044は、隔離ペン1024内の生物学的微小物体の分泌検体の相対量又は絶対量の評価に使用されるAOIの少なくとも一部である。幾つかの実施形態では、AOIは、隔離ペン1024とチャネルとの間の拡散軸に沿って位置する隔離ペン1024及び/又はチャネル122の追加の部分を含み得る。
図12Aは、生物学的微小物体からの分泌検体の相対量又は絶対量を特定するためにデータが抽出されるAOIの概略表現を示す。AOI1250は、分離領域1240内の領域、接続領域1236(マイクロ流体デバイス1200内の隔離ペン1224の)内の領域及びチャネル122の一部を包含するように選択され、これらは、全て隔離ペン1224からチャネル122への拡散軸に沿って整列する。この実施形態では、フロー242は、マイクロ流体チャネル122内に存在し、AOI内に組み込まれるチャネルの部分内の任意の検出可能信号を低減する。隔離ペン内の、AOIが終了するポイントの選択は、検体を分泌し、検出可能な信号が発せられる生物学的物体1202との重複を回避するように行われる。図12Aに示されるように、拡散線1210は、接続領域1236に向けられ、接続領域1236に入る際、拡散軸と整列するようになる。接続勾配線1220も同様に示される。
アッセイ画像を処理して、分泌検体の相対量又は絶対量を評価することができるようになる前に生のアッセイ画像を正規化し得る。図13Aは、光源、光変調サブシステム(例えば、DMD)、画像捕捉デバイス(例えば、カメラ)等のシステム構成要素の変動及び非線形性等のエラーを示す生のアッセイ画像を示す。
一実施形態では、生のアッセイ画像は、暗基準画像及び信号基準画像両方の補正を生のアッセイ画像における各ピクセルから以下の式に従って減算することにより正規化し得る。
正規化の最初のステップとして、上述したように、暗基準画像が、結合リポーター分子及び非結合リポーター分子が存在するマイクロ流体デバイスの画像から減算されて、「暗基準減算画像」を生成した。
結合RMSA複合体よりも高い拡散率に起因して、チャネル内の実質的に均一濃度の非結合リポーター分子に応じて、画像を正規化する別の方法を使用し得る。チャネルの輝度を使用して画像を正規化し、上述したエラーを補正し得る。
幾つかの実施形態では、RMPCの拡散プロファイルを使用して、隔離ペン内に存在するRMPC量を定量化し得る。拡散プロファイルは、ソースからチャネルに拡散する際のRMPCの濃度を表す一連の値(「濃度値」)を提供する。
生物学的微小物体又はそれから生成される生物学的微小物体の集団の検体の分泌のレベルを評価する方法が提供され、この方法は、生物学的微小物体をマイクロ流体デバイスの隔離ペンに導入することであって、マイクロ流体デバイスは、フロー領域を有するエンクロージャを含み、隔離ペンは、フロー領域に流体的に接続され、隔離ペンは、第1の流体媒体を含む、導入することと、生物学的微小物体又はそれから生成される生物学的微小物体の集団に、隔離ペン内の第1の流体媒体内に検体を分泌させることと、第2の流体媒体をフロー領域に導入することであって、第2の流体媒体は、複数のリポーター分子を含み、各リポーター分子は、分泌検体に結合するように構成される結合成分、及び検出可能な標識を含む、導入することと、複数のリポーター分子の一部を隔離ペン内に拡散させ、且つそこに分泌された検体に結合させ、それにより、複数のリポーター分子:分泌検体(RMSA)複合体を生成することと、マイクロ流体デバイス内の対象エリア内に位置するリポーター分子を検出することであって、対象エリアは、隔離ペンの少なくとも一部を含む、検出することとを含む。
幾つかの実施形態では、拡散の理論モデルを使用して、ペンの1つ内の生物学的微小物体の分泌検体の1つ又は複数の濃度値及び/又は既知の数量に基づいて絶対値を生成し得る。実施形態に応じて、異なる拡散理論モデルを使用して、1つ又は複数の濃度値に基づいて検体の絶対値を計算し得る。実施形態に応じて、理論モデルは、様々な現象をモデリングし、様々な仮定を評価し得る。
生物学的微小物体又はそれから生成される生物学的微小物体の集団によって分泌される検体のレベルを評価するキットが提供され得、キットは、フロー領域及び隔離ペンを有するエンクロージャを含むマイクロ流体デバイスであって、隔離ペンは、フロー領域に流体的に接続され、フロー領域及び隔離ペンは、流体媒体を含むように構成される、マイクロ流体デバイスと、検出可能な標識及び検体に結合するように構成される結合成分を含むリポーター分子とを含む。
図25は、本教示の実施形態を実施し得るコンピュータシステム3100を示すブロック図である。本教示の様々な実施形態では、コンピュータシステム3100は、情報を通信するバス3102又は他の通信機構と、バス3102と結合されて情報を処理するプロセッサ3104とを含み得る。様々な実施形態では、コンピュータシステム3100は、メモリ3106も含み得、メモリは、バス3102に結合されて、プロセッサ3104により実行する命令を決定するランダムアクセスメモリ(RAM)又は他の動的記憶装置であり得る。メモリ3106は、命令の実行中、プロセッサ3104により実行される一時変数又は他の中間情報を記憶するのに使用することもできる。様々な実施形態では、コンピュータシステム3100は、バス3102に結合され、プロセッサ3104の静的情報及び命令を記憶する読み取り専用メモリ(ROM)3108又は他の静的記憶装置を更に含み得る。情報及び命令を記憶するために、磁気ディスク又は光ディスク等の記憶装置3110を提供し、バス3102に結合することができる。
様々な実施形態によれば、微小物体によって生成される検体の数量を特定するシステム及び方法が開示される。検体は、例えば、微小物体からの分泌物を含み得、微小物体は、生物学的微小物体であり得る。検体は、例えば、タンパク質、サッカリド、核酸、抗体、抗原、タンパク質、サッカリド若しくは核酸以外の有機分子、小胞又はウィルスを含み得る。検体の数量は、後述するように相対数量であり得る。
(4)(ICorrected)(x,y)=G(x,y)(IOriginal(x,y)-a(x,y))
システム及びデバイス:Berkeley Lights, Inc.製であり、これもBerkeley Lights, Inc.製の光学機器により制御されるナノ流体デバイスであるOptoSelect(商標)デバイスを利用した。この機器は、温度コントローラに結合されたチップの搭載ステージ、ポンプ及び流体媒体調整構成要素並びにカメラ及びチップ内のフォトトランジスタのアクティブ化に適した構造光源を含む光学列を含む。OptoSelectデバイスは、フォトトランジスタアクティブ化OET力を提供するOptoElectroPositioning(OEP(商標))が構成された基板を含む。チップは、複数のマイクロ流体チャネルも含み、各チャネルは、流体的に接続される複数のNanoPen(商標)チャンバ(又は隔離ペン)をそれぞれ有した。各隔離ペンの容積は、約1×106立方μmである。
1. 0.01μL/秒で2時間灌流し、2μL/秒で64秒間灌流し且つ繰り返す。
2. 0.02μL/秒で100秒間灌流し、フローを500秒間停止し、2μL/秒で64秒間灌流し且つ繰り返す。
リポーター分子:HiLyte Fluor(商標)555NHSエステル(AnaSpec Inc.カタログ番号AS-81251、869da(遊離酸のMW)、Ex/Em550/566nm(Cy3フィルタ))でN末端標識された、分子量2.4Kdを有するIgG結合ペプチド。
幅約20ピクセル及び長さ約200ピクセルのエリアを包含した、NanoPenチャンバ内からの拡散軸に沿った対象エリア(AOI)を各NanoPenチャンバ内で識別し、AOIの下端部(第1)は、細胞が配置されない、マイクロ流体チャネル内への開口部から遠いNanoPenチャンバのベースから選択された距離にある分離領域内にあるように選択された。AOIの長さの第2(上端部)は、マイクロ流体チャネル自体内にあるように選択され、AOI内及びチャネル内にあるピクセルが実質的に信号を有さないことを保証した。AOIの幅は、NanoPenチャンバの分離領域からOptoSelectデバイスのチャネルへの予期される拡散の軌道に沿ってセンタリングされる。本明細書に記載されるように、AOIは20のサブ領域(ビン)に細分され、各サブ領域は、幅20ピクセル及び予期される拡散軌道に沿って長さ10ピクセルを有する。
システム及びデバイス:上記と同様。
細胞:実験1と同様のCHO細胞。
媒体:実験1と同様。
リポーター分子:実験1と同様。
システム及びデバイス:上記と同様。
細胞:実験1と同様のCHO細胞。
媒体:実験1と同様。
リポーター分子:ヒト免疫グロブリンGのアプタマー(Apta-Index(商標)、Apt 8、ID#44、23-mer、MW.7.4Kd、Fc領域への親和性、Aptagen L.L.C.配列:5’-rGp-rGp-rAp-rGp-rGp-fUp-fCp-fCp-rGp-rAp-rAp-rAp-rGp-rGp-rAp-fCp-fUp-fCp-fCp-3’。配列表記中、接頭辞r-は、リボヌクレオチドを示し、接頭辞f-は、2-フルオロヌクレオチドを示し、接尾辞-pは、リン酸塩を示し、G、A、C、Uは、標準ヌクレオチド略称である。Alexa Fluor(登録商標)594(AF594、ThermoFisher Scientific、カタログ番号A20004(NHSエステル))MW819.8、Ex/Em590/617nm)で標識された。
実施形態1
生物学的微小物体によって生成される検体の数量を特定するシステムであって、画像取得ユニットであって、マイクロ流体デバイスを固定可能なマイクロ流体デバイスホルダであって、マイクロ流体デバイスは、フロー領域及びフロー領域に流体的に接続される複数の隔離ペンを含み、複数の隔離ペンのそれぞれは、1つ又は複数の生物学的微小物体を保持することができる、マイクロ流体デバイスホルダ、及びマイクロ流体デバイスの複数の隔離ペン及びフロー領域の1つ又は複数のアッセイ画像を取得するように構成される撮像要素を含む画像取得ユニットと、画像取得ユニットに通信可能に接続される画像処理ユニットであって、捕捉された各アッセイ画像を受信し、且つアッセイ画像に示される各隔離ペンの対象エリアを定義するように構成される対象エリア決定エンジンであって、対象エリアは、検体濃度変動の測定について影響を最も受けやすく、検体変動が測定されるとき、隔離ペン内の生物学的微小物体の位置の影響を最も受けにくく、且つ隔離ペンとフロー領域との間で拡散軸に沿って延在する隔離ペン内のエリアに対応する画像エリアを含む、対象エリア決定エンジン、及び各隔離ペンの対象エリア内の画像エリアの少なくとも一部を分析して、各隔離ペン内の検体の数量を示すスコアを決定するように構成されるスコア付けエンジンを含む画像処理ユニットとを含むシステム。
背景ノイズに起因し、且つ/又はアッセイ画像捕捉中に導入される画像歪みについて、各隔離ペンの対象エリアの少なくとも画像エリアを正規化するように構成される較正エンジンを更に含む、実施形態1に記載のシステム。
撮像要素は、1つ又は複数の対応する背景画像及び1つ又は複数の対応する信号基準画像を捕捉するように更に構成される、実施形態1又は2に記載のシステム。
較正エンジンは、対応する背景ノイズをアッセイ画像から減算することにより、画像歪みについて各隔離ペンの対象エリアの少なくとも画像エリアを正規化するように構成され、及び/又は較正エンジンは、対応する信号基準画像において捕捉された画像取得歪みを考慮することにより、画像歪みについて各隔離ペンの対象エリアの少なくとも画像エリアを正規化するように構成される、実施形態3に記載のシステム。
スコア付けエンジンは、各隔離ペンの対象エリアの正規化画像エリアの少なくとも一部を分析して、各隔離ペン内の検体の数量を示すスコアを決定するように構成される、実施形態2~4のいずれかに記載のシステム。
スコア付けエンジンは、各隔離ペンの対象エリアの正規化画像エリアの少なくとも一部にわたる光強度値に線形回帰分析を適用して、各隔離ペン内の検体の数量を示すスコアを決定するように構成される、実施形態5に記載のシステム。
スコア付けエンジンは、各隔離ペンの正規化対象エリアの一部にわたる光強度値を積分して、各隔離ペン内の検体の数量を示すスコアを決定するように構成される、実施形態5に記載のシステム。
画像取得ユニット及び画像処理ユニットは、別個に向けられる、実施形態1~7のいずれかに記載のシステム。
画像取得ユニット及び画像処理ユニットは、単一のユニットに統合される、実施形態1~7のいずれかに記載のシステム。
対象エリア及び/又は対象エリアの画像エリアは、画像処理ユニットによって自動的に定義される、実施形態1~9のいずれかに記載のシステム。
マイクロ流体デバイスは、生物学的微小物体によって生成される検体に結合し、且つ検出可能な標識を含む結合剤のフローを受け取るように構成され、スコア付けエンジンは、アッセイ画像から特定されるように、結合剤の検出可能な標識によって発せられる光の量に基づいて、各隔離ペン内の検体の数量を特定するように構成される、実施形態1~10のいずれかに記載のシステム。
生物学的微小物体によって生成される検体の数量を特定する方法であって、フロー領域及びフロー領域に流体的に接続される複数の隔離ペンを含むマイクロ流体デバイスの撮像データを受信することであって、撮像データは、検体アッセイ画像と、背景ノイズ画像及び信号基準画像の一方又は両方とを含む、受信することと、各隔離ペンの対象エリアを定義することであって、対象エリアは、検体濃度変動の測定について影響を最も受けやすく、検体変動が測定されるとき、隔離ペン内の生物学的微小物体の位置の影響を最も受けにくく、且つ隔離ペンとフロー領域との間で拡散軸に沿って延在する隔離ペン内の画像エリアを含む、定義することと、各隔離ペンの対象エリアの画像エリアの少なくとも一部を分析することにより、各隔離ペン内の検体の数量を示すスコアを決定することとを含む方法。
撮像データは、生物学的微小物体によって生成される検体に結合するリポーター分子から発せられる光から特定される発光データを含む、実施形態12に記載の方法。
背景ノイズ画像において捕捉された背景ノイズを減算することにより、検体アッセイ画像内の隔離ペンのそれぞれの対象エリアの少なくとも画像エリアを正規化し、且つ/又は信号基準画像において捕捉された画像取得歪みを考慮することにより、検体アッセイ画像内の隔離ペンのそれぞれの対象エリアの少なくとも画像エリアを正規化することを更に含む、実施形態12又は13に記載の方法。
各隔離ペン内の検体の数量を示すスコアを決定することは、各隔離ペンの対象エリアの正規化画像エリアの少なくとも一部を分析することを更に含む、実施形態14に記載の方法。
各隔離ペン内の検体の数量を示すスコアを決定することは、各隔離ペンの対象エリアの正規化画像エリアの少なくとも一部にわたる発光データに線形回帰分析を適用することを更に含む、実施形態14に記載の方法。
各隔離ペン内の検体の数量を示すスコアを決定することは、各隔離ペンの対象エリアの正規化画像エリアの少なくとも一部にわたる発光データを積分することを更に含む、実施形態14に記載の方法。
検体は、タンパク質、サッカリド、核酸、タンパク質、サッカリド若しくは核酸以外の有機分子、小胞又はウィルスを含む、実施形態12~17のいずれかに記載の方法。
生物学的微小物体によって生成される検体の数量を特定する画像処理方法をコンピュータに実行させるプログラムが記憶される非一時的コンピュータ可読媒体であって、方法は、フロー領域及びフロー領域に流体的に接続される複数の隔離ペンを含むマイクロ流体デバイスの撮像データを受信することであって、撮像データは、検体アッセイ画像と、背景ノイズ画像及び信号基準画像の一方又は両方とを含む、受信することと、各隔離ペンの対象エリアを定義することであって、対象エリアは、検体濃度変動の測定について影響を最も受けやすく、検体変動が測定されるとき、隔離ペン内の生物学的微小物体の位置の影響を最も受けにくく、且つ隔離ペンとフロー領域との間で拡散軸に沿って延在する隔離ペン内の画像エリアを含む、定義することと、各隔離ペンの対象エリアの画像エリアの少なくとも一部を分析することにより、各隔離ペン内の検体の数量を示すスコアを決定することとを含む、非一時的コンピュータ可読媒体。
撮像データは、生物学的微小物体によって生成される検体に結合するリポーター分子から発せられる光から特定される発光データを含む、実施形態19に記載の方法。
背景ノイズ画像において捕捉された背景ノイズを減算することにより、検体アッセイ画像内の隔離ペンのそれぞれの対象エリアの少なくとも画像エリアを正規化し、且つ/又は信号基準画像において捕捉された画像取得歪みを考慮することにより、検体アッセイ画像内の隔離ペンのそれぞれの対象エリアの少なくとも画像エリアを正規化することを更に含む、実施形態19又は20に記載の方法。
各隔離ペン内の検体の数量を示すスコアを決定することは、各隔離ペンの対象エリアの正規化画像エリアの少なくとも一部を分析することを更に含む、実施形態21に記載の方法。
各隔離ペン内の検体の数量を示すスコアを決定することは、各隔離ペンの対象エリアの正規化画像エリアの少なくとも一部からの発光データに線形回帰分析を適用することを更に含む、実施形態21に記載の方法。
各隔離ペン内の検体の数量を示すスコアを決定することは、各隔離ペンの対象エリアの正規化画像エリアの少なくとも一部にわたる発光データを積分することを更に含む、実施形態21に記載の方法。
検体は、タンパク質、サッカリド、核酸、タンパク質、サッカリド若しくは核酸以外の有機分子、小胞又はウィルスを含む、実施形態19~24のいずれかに記載の方法。
生物学的微小物体又はそれから生成される生物学的微小物体の集団による検体の分泌のレベルを評価する方法であって、生物学的微小物体をマイクロ流体デバイスの隔離ペンに導入することであって、マイクロ流体デバイスは、フロー領域を有するエンクロージャを含み、隔離ペンは、フロー領域に流体的に接続され、隔離ペンは、第1の流体媒体を含む、導入することと、生物学的微小物体又はそれから生成される生物学的微小物体の集団に、隔離ペン内の第1の流体媒体内に検体を分泌させることと、第2の流体媒体をフロー領域に導入することであって、第2の流体媒体は、複数のリポーター分子を含み、各リポーター分子は、分泌検体に結合するように構成される結合成分、及び検出可能な標識を含む、導入することと、複数のリポーター分子の一部を隔離ペン内に拡散させ、且つそこに分泌された検体に結合させ、それにより、複数のリポーター分子:分泌検体(RMSA)複合体を生成することと、マイクロ流体デバイス内の対象エリア内に位置するリポーター分子を検出することであって、対象エリアは、隔離ペンの少なくとも一部を含む、検出することとを含む方法。
隔離ペンは、分離領域及び分離領域をフロー領域に流体的に接続する接続領域を有し、分離領域及び接続領域は、分離領域内の流体媒体の成分が、実質的に拡散によってのみフロー領域内の流体媒体の成分と交換されるように構成される、実施形態26に記載の方法。
隔離ペン内の生物学的微小物体を増殖させて、生物学的微小物体のクローン集団にすることを更に含む、実施形態27に記載の方法。
培養媒体でフロー領域を灌流させることを更に含み、灌流は、生物学的微小物体を隔離ペンに導入した後且つ第2の流体媒体をフロー領域に導入する前に行われる、実施形態28に記載の方法。
培養媒体は、可溶性フィーダ細胞成分、定義された溶解酸素成分、定義されたpH成分、排出成長媒体成分及び/又は可溶性刺激成分の1つ又は複数を含む、実施形態29に記載の方法。
第2の流体媒体をフロー領域に導入することは、第1の時間期間にわたり、フロー領域を通して第2の流体媒体を流すことを含む、実施形態26~30のいずれかに記載の方法。
第1の時間期間は、約30分から約60分である、実施形態31に記載の方法。
第3の流体媒体をフロー領域に導入することであって、第3の流体媒体は、リポーター分子を含まない、導入することと、非結合リポーター分子の少なくとも一部を隔離ペンから拡散させることとを更に含み、対象エリア内のリポーター分子を検出することは、隔離ペンから拡散した非結合リポーター分子の量が、隔離ペンから拡散したRMSA複合体の量の少なくとも2倍だけ大きいように選択された時間において行われる、実施形態26~32のいずれかに記載の方法。
第3の流体媒体をフロー領域に導入することは、第2の時間期間にわたり、フロー領域を通して第3の流体媒体を流すことを含む、実施形態33に記載の方法。
第2の時間期間は、非結合リポーター分子及びRMSA複合体の拡散プロファイルのモデリングに基づいて選択される、実施形態34に記載の方法。
第2の時間期間は、約20分から約50分である、実施形態34に記載の方法。
対象エリアは、隔離ペン内からフロー領域への拡散軸に沿って整列された隔離ペンの少なくとも一部を含む、実施形態26~36のいずれかに記載の方法。
対象エリア内に位置するリポーター分子を検出することは、対象エリアから到来する検出可能な信号の強度を測定することを含み、検出可能な信号の少なくとも幾つかは、対象エリア内に位置するリポーター分子の検出可能な標識から発せられる、実施形態26~37のいずれかに記載の方法。
対象エリア内に位置するリポーター分子を検出することは、検出可能な信号の測定された強度から背景信号の強度を減算することにより、背景減算信号強度を特定することを更に含む、実施形態38に記載の方法。
生物学的微小物体を隔離ペンに導入する前の時間において、対象エリア内の背景信号の強度を測定することを更に含む、実施形態39に記載の方法。
検出可能な信号の測定された強度又は背景減算信号強度は、隔離ペン内で観測された細胞数について正規化される、実施形態38~40のいずれかに記載の方法。
検体の分泌のレベルを定量化することを更に含む、実施形態26~41のいずれかに記載の方法。
隔離ペンの分泌スコアを提供することを更に含む、実施形態26~42のいずれかに記載の方法。
分泌スコアは、請求項12~18のいずれかに記載の方法に従って決定される、実施形態43に記載の方法。
分泌検体は、リポーター分子の分子量の少なくとも2倍の大きさの分子量を有する、実施形態26~44のいずれかに記載の方法。
分泌検体は、リポーター分子の分子量の少なくとも4倍だけ大きい分子量を有する、実施形態26~44のいずれかに記載の方法。
分泌検体は、リポーター分子の分子量の少なくとも10倍だけ大きい分子量を有する、実施形態26~44のいずれかに記載の方法。
リポーター分子の結合成分は、少なくとも1つのアミノ酸及び/又は少なくとも1つ核酸を含む、実施形態26~47のいずれかに記載の方法。
リポーター分子の結合成分は、ペプチド又はタンパク質を含む、実施形態48に記載の方法。
リポーター分子の結合成分は、配列番号1から10のいずれか1つの配列を有するペプチドを含む、実施形態49に記載の方法。
リポーター分子の結合成分は、タンパク質A、タンパク質G又はタンパク質A若しくはタンパク質GのIgG結合断片を含む、実施形態49に記載の方法。
リポーター分子の結合成分は、アプタマーを含む、実施形態26~51のいずれかに記載の方法。
検出可能な標識は、可視標識、発光標識、リン光標識又は蛍光標識を含む、実施形態26~52のいずれかに記載の方法。
検出可能な標識は、蛍光標識である、実施形態26~52のいずれかに記載の方法。
生物学的微小物体によって分泌される検体は、タンパク質、サッカリド、核酸、タンパク質、サッカリド若しくは核酸以外の有機分子、小胞又はウィルスを含む、実施形態26~54のいずれかに記載の方法。
生物学的微小物体によって分泌される検体は、抗体である、実施形態26~55のいずれかに記載の方法。
生物学的微小物体によって分泌される検体は、抗体以外のタンパク質である、実施形態26~55のいずれかに記載の方法。
マイクロ流体デバイスは、複数の隔離ペンを含み、生物学的微小物体は、複数のうちの少なくとも2つの隔離ペンに導入され、方法の残りは、少なくとも2つの隔離ペンのそれぞれに対して実行される、実施形態26~57のいずれかに記載の方法。
複数のうちの少なくとも2つの隔離ペンの隔離ペンの分泌のレベルを比較することを更に含む、実施形態58に記載の方法。
複数の隔離ペンのうちの2つ以上の隔離ペンの分泌スコアを比較することを更に含む、実施形態58に記載の方法。
少なくとも2つの隔離ペンのうちの1つ又は複数を選択することと、選択された隔離ペンのそれぞれから1つ又は複数の生物学的微小物体を搬出することとを更に含む、実施形態58~60のいずれかに記載の方法。
選択された隔離ペンのそれぞれからの1つ又は複数の生物学的微小物体は、マイクロ流体デバイスから更に搬出される、実施形態61に記載の方法。
選択された隔離ペンは、個々に搬出される、実施形態61又は62に記載の方法。
クローン株成長の方法であって、個々の生物学的微小物体をマイクロ流体デバイスの複数の隔離ペンのそれぞれに導入することであって、マイクロ流体デバイスは、フロー領域を有するエンクロージャを更に含み、複数のうちの隔離ペンのそれぞれは、フロー領域に流体的に接続され、且つ第1の流体媒体を含む、導入することと、各生物学的微小物体又はそれから生成される生物学的微小物体のクローン集団に、対応する隔離ペンに含まれる第1の流体媒体に検体を分泌させることと、第2の流体媒体をフロー領域に導入することであって、第2の流体媒体は、複数のリポーター分子を含み、各リポーター分子は、分泌検体に結合するように構成される結合成分、及び検出可能な標識を含む、導入することと、複数のリポーター分子の一部を複数のうちの各隔離ペンに拡散させ、且つそこで分泌された検体の少なくとも一部に結合させ、それにより、複数の隔離ペンのそれぞれにおいて複数のリポーター分子:分泌検体(RMSA)複合体を生成することと、複数のうちの各隔離ペンについて、対応する対象エリアから発せられる信号の強度を検出することであって、対象エリアは、対応する隔離ペンの少なくとも一部を含み、対象エリアから発せられる信号の少なくとも一部は、対象エリア内に位置するリポーター分子の検出可能な標識から発せられる、検出することと、複数のうちの各隔離ペンについて、対応する対象エリアから発せられた検出された信号強度に基づいてスコアを決定することと、複数の隔離ペンから隔離ペンの組を選択することであって、その組の各隔離ペンは、それに含まれる生物学的微小物体又はクローン集団がトップ検体生成者であることを示すスコアを有する、選択することと、マイクロ流体デバイスから、選択された隔離ペンの組の各隔離ペン内に含まれる1つ又は複数の生物学的微小物体を搬出することと、対応する反応容器内において、選択された隔離ペンの組の各隔離ペンからの搬出された1つ又は複数の生物学的微小物体を増殖させることと、それぞれの対応する反応容器内で分泌された検体のレベルを特定し、それにより、各生物学的微小物体又はクローン集団の分泌のレベルを特定することとを含む方法。
複数のうちの各隔離ペンは、分離領域及び分離領域をフロー領域に流体的に接続する接続領域を有し、分離領域及び接続領域は、分離領域内の流体媒体の成分が、実質的に拡散によってのみフロー領域内の流体媒体の成分と交換されるように構成される、実施形態64に記載の方法。
複数のうちの幾つか又は全ての隔離ペン内の個々の生物学的微小物体を増殖させて、生物学的微小物体のクローン集団にすることを更に含む、実施形態65に記載の方法。
培養媒体でフロー領域を灌流させることを更に含み、灌流は、個々の生物学的微小物体を複数の隔離ペンに導入した後且つ第2の流体媒体をフロー領域に導入する前に行われる、実施形態66に記載の方法。
培養媒体は、可溶性フィーダ細胞成分、定義された溶解酸素成分、定義されたpH成分、排出成長媒体成分及び/又は可溶性刺激成分の1つ又は複数を含む、実施形態67に記載の方法。
第2の流体媒体をフロー領域に導入することは、第1の時間期間にわたり、フロー領域を通して第2の流体媒体を流すことを含む、実施形態64~68のいずれかに記載の方法。
第1の時間期間は、約30分から約60分である、実施形態69に記載の方法。
第3の流体媒体をフロー領域に導入することであって、第3の流体媒体は、リポーター分子を含まない、導入することと、非結合リポーター分子の少なくとも一部を隔離ペンから拡散させることとを更に含み、複数のうちの各隔離ペンの対応する対象エリアから発せられる信号の強度を検出することは、隔離ペンから拡散した非結合リポーター分子の量が、隔離ペンから拡散したRMSA複合体の量の少なくとも2倍だけ大きいように選択される時間において行われる、実施形態64~70のいずれかに記載の方法。
第3の流体媒体をフロー領域に導入することは、第2の時間期間にわたり、フロー領域を通して第3の流体媒体を流すことを含む、実施形態71に記載の方法。
第2の時間期間は、非結合リポーター分子及びRMSA複合体の拡散プロファイルのモデリングに基づいて選択される、実施形態72に記載の方法。
第2の時間期間は、約20分から約50分である、実施形態73に記載の方法。
対象エリアは、隔離ペン内からフロー領域への拡散軸に沿って整列された隔離ペンの少なくとも一部を含む、実施形態64~74のいずれかに記載の方法。
複数のうちの各隔離ペンの対応する対象エリアから発せられた信号の強度を検出することは、検出可能信号の測定された強度から背景信号の強度を減算して、背景減算信号強度を特定することを含む、実施形態64~75のいずれかに記載の方法。
生物学的微小物体を隔離ペンに導入する前の時間において、複数のうちの各隔離ペンの対応する対象エリア内の背景信号の強度を測定することを更に含む、実施形態76に記載の方法。
検出可能な信号の測定された強度又は背景減算信号強度は、対応する隔離ペン内で観測された細胞数について正規化される、実施形態76又は77に記載の方法。
複数の隔離ペンのスコアは、請求項12~18のいずれかに記載の方法に従って決定される、実施形態64に記載の方法。
分泌検体は、リポーター分子の分子量の少なくとも2倍の大きさの分子量を有する、実施形態64~79のいずれかに記載の方法。
分泌検体は、リポーター分子の分子量の少なくとも4倍だけ大きい分子量を有する、実施形態64~79のいずれかに記載の方法。
分泌検体は、リポーター分子の分子量の少なくとも10倍だけ大きい分子量を有する、実施形態64~79のいずれかに記載の方法。
リポーター分子の結合成分は、少なくとも1つのアミノ酸及び/又は少なくとも1つ核酸を含む、実施形態64~82のいずれかに記載の方法。
リポーター分子の結合成分は、ペプチド又はタンパク質を含む、実施形態83に記載の方法。
リポーター分子の結合成分は、配列番号1から10のいずれか1つの配列を有するペプチドを含む、実施形態84に記載の方法。
リポーター分子の結合成分は、タンパク質A、タンパク質G又はタンパク質A若しくはタンパク質GのIgG結合断片を含む、実施形態84に記載の方法。
リポーター分子の結合成分は、アプタマーを含む、実施形態64~86のいずれかに記載の方法。
検出可能な標識は、可視標識、発光標識、リン光標識又は蛍光標識を含む、実施形態64~87のいずれかに記載の方法。
検出可能な標識は、蛍光標識である、実施形態64~87のいずれかに記載の方法。
生物学的微小物体によって分泌される検体は、タンパク質、サッカリド、核酸、タンパク質、サッカリド若しくは核酸以外の有機分子、小胞又はウィルスを含む、実施形態64~89のいずれかに記載の方法。
生物学的微小物体によって分泌される検体は、抗体である、実施形態64~90のいずれかに記載の方法。
生物学的微小物体によって分泌される検体は、抗体以外のタンパク質である、実施形態64~90のいずれかに記載の方法。
反応容器は、ウェルプレート内のウェル、振とうフラスコ又はバイオリアクタである、実施形態64~92のいずれかに記載の方法。
生物学的微小物体又はそれから生成される生物学的微小物体の集団によって分泌される検体のレベルを評価するキットであって、フロー領域及び複数の隔離ペンを有するエンクロージャを含むマイクロ流体デバイスであって、各隔離ペンは、フロー領域に流体的に接続され、フロー領域及び隔離ペンは、流体媒体を含むように構成される、マイクロ流体デバイスと、検出可能な標識及び検体に結合するように構成される結合成分を含むリポーター分子とを含むキット。
複数のうちの各隔離ペンは、分離領域及び分離領域をフロー領域に流体的に接続する接続領域を有し、分離領域及び接続領域は、分離領域内の流体媒体の成分が、実質的に拡散によってのみフロー領域内の流体媒体の成分と交換されるように構成される、実施形態94に記載のキット。
リポーター分子の結合成分は、少なくとも1つのアミノ酸及び/又は少なくとも1つ核酸を含む、実施形態94又は95に記載のキット。
リポーター分子の結合成分は、ペプチド又はタンパク質を含む、実施形態96に記載のキット。
リポーター分子の結合成分は、配列番号1から10のいずれか1つの配列を有するペプチドを含む、実施形態97に記載のキット。
リポーター分子の結合成分は、タンパク質A、タンパク質G又はタンパク質A若しくはタンパク質GのIgG結合断片を含む、実施形態97に記載のキット。
リポーター分子の結合成分は、アプタマーを含む、実施形態96に記載のキット。
検出可能な標識は、可視標識、発光標識、リン光標識又は蛍光標識を含む、実施形態94~100のいずれかに記載のキット。
検出可能な標識は、蛍光標識である、実施形態94~100のいずれかに記載のキット。
流体媒体を更に含む、実施形態94~102のいずれかに記載のキット。
流体媒体は、生物学的微小物体又はそれから生成される生物学的微小物体の集団を維持するか、増殖させるか、又はそれに選択的圧力を提供するように構成される、実施形態103に記載のキット。
マイクロ流体デバイスの1つ又は複数の表面を調整するように構成される試薬を更に含む、実施形態94~104のいずれかに記載のキット。
試薬は、マイクロ流体デバイスの1つ又は複数の表面を共有結合的に修飾するように構成される、実施形態105に記載のキット。
対象エリアは、検体濃度変動の測定について影響を最も受けやすく、検体変動が測定されるとき、隔離ペン内の生物学的微小物体の位置の影響を最も受けにくく、且つ隔離ペンとフロー領域との間で拡散軸に沿って延在する隔離ペン内のエリアに対応する画像エリアを含む、実施形態26~63のいずれかに記載の方法。
対象エリアは、基本的に画像エリアからなる、実施形態107に記載の方法。
自動化される、実施形態26~63、107又は108のいずれかに記載の方法。
コンピュータに、生物学的微小物体によって生成される検体の数量を特定する方法を実行するようにシステムに指示させるプログラムが記憶される非一時的コンピュータ可読媒体であって、方法は、実施形態26~63、107又は108のいずれかに記載の方法である、非一時的コンピュータ可読媒体。
システムは、実施形態1~11に記載のシステムである、実施形態110に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
対象エリアは、検体濃度変動の測定について影響を最も受けやすく、検体変動が測定されるとき、隔離ペン内の生物学的微小物体の位置の影響を最も受けにくく、且つ隔離ペンとフロー領域との間で拡散軸に沿って延在する隔離ペン内のエリアに対応する画像エリアを含む、実施形態64~93のいずれかに記載の方法。
対象エリアは、基本的に画像エリアからなる、実施形態112に記載の方法。
自動化される、実施形態64~93、112又は113のいずれかに記載の方法。
コンピュータに、クローン株成長の方法の少なくとも一部を実行するようにシステムに指示させるプログラムが記憶される非一時的コンピュータ可読媒体であって、方法は、実施形態64~93、112又は113のいずれかに記載の方法であり、システムは、少なくとも、選択された隔離ペンの組の各隔離ペン内に含まれる1つ又は複数の生物学的微小物体をマイクロ流体デバイスから搬出するまでの且つそれを含むステップを実行する、非一時的コンピュータ可読媒体。
システムは、実施形態1~11のいずれかに記載のシステムである、実施形態115に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
Claims (116)
- 生物学的微小物体によって生成される検体の数量を特定するシステムであって、
画像取得ユニットであって、
マイクロ流体デバイスを固定可能なマイクロ流体デバイスホルダであって、前記マイクロ流体デバイスが、フロー領域及び前記フロー領域に流体的に接続される複数の隔離ペンを含み、前記複数の隔離ペンのそれぞれが、1つ又は複数の生物学的微小物体を保持することができる、マイクロ流体デバイスホルダ、及び
前記マイクロ流体デバイスの前記複数の隔離ペン及び前記フロー領域の1つ又は複数のアッセイ画像を取得するように構成される撮像要素
を含む画像取得ユニットと、
前記画像取得ユニットに通信可能に接続される画像処理ユニットであって、
捕捉された各アッセイ画像を受信し、且つ前記アッセイ画像に示される各隔離ペンの対象エリアを定義するように構成される対象エリア決定エンジンであって、前記対象エリアが、検体濃度変動の測定について影響を最も受けやすく、検体変動が測定されるとき、前記隔離ペン内の生物学的微小物体の位置の影響を最も受けにくく、且つ前記隔離ペンと前記フロー領域との間で拡散軸に沿って延在する前記隔離ペン内のエリアに対応する画像エリアを含む、対象エリア決定エンジン、及び
各隔離ペンの前記対象エリア内の前記画像エリアの少なくとも一部を分析して、各隔離ペン内の前記検体の数量を示すスコアを決定するように構成されるスコア付けエンジン
を含む画像処理ユニットと、
を含むシステム。 - 背景ノイズに起因し、且つ/又はアッセイ画像捕捉中に導入される画像歪みについて、各隔離ペンの前記対象エリアの少なくとも前記画像エリアを正規化するように構成される較正エンジンを更に含む、請求項1に記載のシステム。
- 前記撮像要素が、1つ又は複数の対応する背景画像及び1つ又は複数の対応する信号基準画像を捕捉するように更に構成される、請求項2に記載のシステム。
- 前記較正エンジンが、前記対応する背景画像を前記アッセイ画像から減算することにより、画像歪みについて各隔離ペンの前記対象エリアの少なくとも前記画像エリアを正規化するように構成され、及び/又は前記較正エンジンが、前記対応する信号基準画像において捕捉された画像取得歪みを考慮することにより、画像歪みについて各隔離ペンの前記対象エリアの少なくとも前記画像エリアを正規化するように構成される、請求項3に記載のシステム。
- 前記スコア付けエンジンが、各隔離ペンの前記対象エリアの前記正規化画像エリアの少なくとも一部を分析して、各隔離ペン内の前記検体の数量を示すスコアを決定するように構成される、請求項2~4のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記スコア付けエンジンが、各隔離ペンの前記対象エリアの前記正規化画像エリアの一部にわたる光強度値に線形回帰分析を適用して、各隔離ペン内の前記検体の数量を示すスコアを決定するように構成される、請求項5に記載のシステム。
- 前記スコア付けエンジンが、各隔離ペンの前記正規化対象エリアの一部にわたる光強度値を積分して、各隔離ペン内の前記検体の数量を示すスコアを決定するように構成される、請求項5に記載のシステム。
- 前記画像取得ユニット及び前記画像処理ユニットが、別個に向けられる、請求項1に記載のシステム。
- 前記画像取得ユニット及び前記画像処理ユニットが、単一のユニットに統合される、請求項1に記載のシステム。
- 前記対象エリア及び/又は前記対象エリアの前記画像エリアが、前記画像処理ユニットによって自動的に定義される、請求項1に記載のシステム。
- 前記マイクロ流体デバイスが、前記生物学的微小物体によって生成される検体に結合し、且つ検出可能な標識を含む結合剤のフローを受け取るように構成され、前記スコア付けエンジンが、前記アッセイ画像から特定されるように、前記結合剤の前記検出可能な標識によって発せられる光の量に基づいて、各隔離ペン内の検体の数量を特定するように構成される、請求項1に記載のシステム。
- 生物学的微小物体によって生成される検体の数量を特定する方法であって、
フロー領域及び前記フロー領域に流体的に接続される複数の隔離ペンを含むマイクロ流体デバイスの撮像データを受信することであって、前記撮像データが、検体アッセイ画像と、背景ノイズ画像及び信号基準画像の一方又は両方とを含む、受信することと、
各隔離ペンの対象エリアを定義することであって、前記対象エリアが、検体濃度変動の測定について影響を最も受けやすく、検体変動が測定されるとき、前記隔離ペン内の生物学的微小物体の位置の影響を最も受けにくく、且つ前記隔離ペンと前記フロー領域との間で拡散軸に沿って延在する前記隔離ペン内の画像エリアを含む、定義することと、
各隔離ペンの前記対象エリアの前記画像エリアの少なくとも一部を分析することにより、各隔離ペン内の前記検体の数量を示すスコアを決定することと、
を含む方法。 - 前記撮像データが、前記生物学的微小物体によって生成される前記検体に結合するリポーター分子から発せられる光から特定される発光データを含む、請求項12に記載の方法。
- 前記背景ノイズ画像において捕捉された背景ノイズを減算することにより、前記検体アッセイ画像内の前記隔離ペンのそれぞれの前記対象エリアの少なくとも前記画像エリアを正規化し、且つ/又は前記信号基準画像において捕捉された画像取得歪みを考慮することにより、前記検体アッセイ画像内の前記隔離ペンのそれぞれの前記対象エリアの少なくとも前記画像エリアを正規化することを更に含む、請求項12又は13に記載の方法。
- 各隔離ペン内の前記検体の数量を示すスコアを決定することが、各隔離ペンの前記対象エリアの前記正規化画像エリアの少なくとも一部を分析することを更に含む、請求項14に記載の方法。
- 各隔離ペン内の前記検体の数量を示すスコアを決定することが、各隔離ペンの前記対象エリアの前記正規化画像エリアの少なくとも一部にわたる発光データに線形回帰分析を適用することを更に含む、請求項14に記載の方法。
- 各隔離ペン内の前記検体の数量を示すスコアを決定することが、各隔離ペンの前記対象エリアの前記正規化画像エリアの少なくとも一部にわたる発光データを積分することを更に含む、請求項14に記載の方法。
- 前記検体が、タンパク質、サッカリド、核酸、タンパク質、サッカリド若しくは核酸以外の有機分子、小胞又はウィルスを含む、請求項12又は13に記載の方法。
- 生物学的微小物体によって生成される検体の数量を特定する画像処理方法をコンピュータに実行させるプログラムが記憶される非一時的コンピュータ可読媒体であって、前記方法が、
フロー領域及び前記フロー領域に流体的に接続される複数の隔離ペンを含むマイクロ流体デバイスの撮像データを受信することであって、前記撮像データが、検体アッセイ画像と、背景ノイズ画像及び信号基準画像の一方又は両方とを含む、受信することと、
各隔離ペンの対象エリアを定義することであって、前記対象エリアが、検体濃度変動の測定について影響を最も受けやすく、検体変動が測定されるとき、前記隔離ペン内の生物学的微小物体の位置の影響を最も受けにくく、且つ前記隔離ペンと前記フロー領域との間で拡散軸に沿って延在する前記隔離ペン内の画像エリアを含む、定義することと、
各隔離ペンの前記対象エリアの前記画像エリアの少なくとも一部を分析することにより、各隔離ペン内の前記検体の数量を示すスコアを決定することとと、
を含む、非一時的コンピュータ可読媒体。 - 前記撮像データが、前記生物学的微小物体によって生成される前記検体に結合するリポーター分子から発せられる光から特定される発光データを含む、請求項19に記載の方法。
- 前記背景ノイズ画像において捕捉された背景ノイズを減算することにより、前記検体アッセイ画像内の前記隔離ペンのそれぞれの前記対象エリアの少なくとも前記画像エリアを正規化し、且つ/又は前記信号基準画像において捕捉された画像取得歪みを考慮することにより、前記検体アッセイ画像内の前記隔離ペンのそれぞれの前記対象エリアの少なくとも前記画像エリアを正規化することを更に含む、請求項19又は20に記載の方法。
- 各隔離ペン内の前記検体の数量を示すスコアを決定することが、各隔離ペンの前記対象エリアの前記正規化画像エリアの少なくとも一部を分析することを更に含む、請求項21に記載の方法。
- 各隔離ペン内の前記検体の数量を示すスコアを決定することが、各隔離ペンの前記対象エリアの前記正規化画像エリアの少なくとも一部からの発光データに線形回帰分析を適用することを更に含む、請求項21に記載の方法。
- 各隔離ペン内の前記検体の数量を示すスコアを決定することが、各隔離ペンの前記対象エリアの前記正規化画像エリアの少なくとも一部にわたる発光データを積分することを更に含む、請求項21に記載の方法。
- 前記検体が、タンパク質、サッカリド、核酸、タンパク質、サッカリド若しくは核酸以外の有機分子、小胞又はウィルスを含む、請求項19又は20に記載の方法。
- 生物学的微小物体又はそれから生成される生物学的微小物体の集団による検体の分泌のレベルを評価する方法であって、
前記生物学的微小物体をマイクロ流体デバイスの隔離ペンに導入することであって、前記マイクロ流体デバイスが、フロー領域を有するエンクロージャを含み、前記隔離ペンは、前記フロー領域に流体的に接続され、前記隔離ペンは、第1の流体媒体を含む、導入することと、
前記生物学的微小物体又はそれから生成される前記生物学的微小物体の集団に、前記隔離ペン内の前記第1の流体媒体内に前記検体を分泌させることと、
第2の流体媒体を前記フロー領域に導入することであって、前記第2の流体媒体が、複数のリポーター分子を含み、各リポーター分子が、
前記分泌検体に結合するように構成される結合成分、及び
検出可能な標識
を含む、導入することと、
前記複数のリポーター分子の一部を前記隔離ペン内に拡散させ、且つそこに分泌された前記検体に結合させ、それにより、複数のリポーター分子:分泌検体(RMSA)複合体を生成することと、
前記マイクロ流体デバイス内の対象エリア内に位置するリポーター分子を検出することであって、前記対象エリアが、前記隔離ペンの少なくとも一部を含む、検出することとと、
を含む方法。 - 前記隔離ペンは、分離領域及び前記分離領域を前記フロー領域に流体的に接続する接続領域を有し、前記分離領域及び前記接続領域は、前記分離領域内の流体媒体の成分が、実質的に拡散によってのみ前記フロー領域内の流体媒体の成分と交換されるように構成される、請求項26に記載の方法。
- 前記隔離ペン内の前記生物学的微小物体を増殖させて、生物学的微小物体のクローン集団にすることを更に含む、請求項27に記載の方法。
- 培養媒体で前記フロー領域を灌流させることを更に含み、前記灌流が、前記生物学的微小物体を前記隔離ペンに導入した後且つ前記第2の流体媒体を前記フロー領域に導入する前に行われる、請求項28に記載の方法。
- 前記培養媒体が、可溶性フィーダ細胞成分、定義された溶解酸素成分、定義されたpH成分、排出成長媒体成分及び/又は可溶性刺激成分の1つ又は複数を含む、請求項29に記載の方法。
- 前記第2の流体媒体を前記フロー領域に導入することが、第1の時間期間にわたり、前記フロー領域を通して前記第2の流体媒体を流すことを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記第1の時間期間が、約30分から約60分である、請求項31に記載の方法。
- 第3の流体媒体を前記フロー領域に導入することであって、前記第3の流体媒体が、リポーター分子を含まない、導入することと、
非結合リポーター分子の少なくとも一部を前記隔離ペンから拡散させることと
を更に含み、
前記対象エリア内の前記リポーター分子を検出することが、前記隔離ペンから拡散した非結合リポーター分子の量が、前記隔離ペンから拡散したRMSA複合体の量の少なくとも2倍だけ大きいように選択された時間において行われる、請求項26に記載の方法。 - 前記第3の流体媒体を前記フロー領域に導入することが、第2の時間期間にわたり、前記フロー領域を通して前記第3の流体媒体を流すことを含む、請求項33に記載の方法。
- 前記第2の時間期間が、非結合リポーター分子及びRMSA複合体の拡散プロファイルのモデリングに基づいて選択される、請求項34に記載の方法。
- 前記第2の時間期間が、約20分から約50分である、請求項34に記載の方法。
- 前記対象エリアが、前記隔離ペン内から前記フロー領域への拡散軸に沿って整列された前記隔離ペンの少なくとも一部を含む、請求項26に記載の方法。
- 前記対象エリア内に位置する前記リポーター分子を検出することが、前記対象エリアから到来する検出可能な信号の強度を測定することを含み、前記検出可能な信号の少なくとも幾つかが、前記対象エリア内に位置するリポーター分子の前記検出可能な標識から発せられる、請求項26に記載の方法。
- 前記対象エリア内に位置する前記リポーター分子を検出することが、前記検出可能な信号の前記測定された強度から背景信号の強度を減算することにより、背景減算信号強度を特定することを更に含む、請求項38に記載の方法。
- 前記生物学的微小物体を前記隔離ペンに導入する前の時間において、前記対象エリア内の背景信号の強度を測定することを更に含む、請求項39に記載の方法。
- 前記検出可能な信号の前記測定された強度又は前記背景減算信号強度が、前記隔離ペン内で観測された細胞数について正規化される、請求項38に記載の方法。
- 前記検体の前記分泌のレベルを定量化することを更に含む、請求項26に記載の方法。
- 前記隔離ペンの分泌スコアを提供することを更に含む、請求項26に記載の方法。
- 前記分泌スコアが、請求項12に記載の方法に従って決定される、請求項43に記載の方法。
- 前記分泌検体が、前記リポーター分子の分子量の少なくとも2倍の大きさの分子量を有する、請求項26に記載の方法。
- 前記分泌検体が、前記リポーター分子の分子量の少なくとも4倍だけ大きい分子量を有する、請求項26に記載の方法。
- 前記分泌検体が、前記リポーター分子の分子量の少なくとも10倍だけ大きい分子量を有する、請求項26に記載の方法。
- 前記リポーター分子の前記結合成分が、少なくとも1つのアミノ酸及び/又は少なくとも1つ核酸を含む、請求項26に記載の方法。
- 前記リポーター分子の前記結合成分が、ペプチド又はタンパク質を含む、請求項48に記載の方法。
- 前記リポーター分子の前記結合成分が、配列番号1から10のいずれか1つの配列を有するペプチドを含む、請求項49に記載の方法。
- 前記リポーター分子の前記結合成分が、タンパク質A、タンパク質G又はタンパク質A若しくはタンパク質GのIgG結合断片を含む、請求項49に記載の方法。
- 前記リポーター分子の前記結合成分が、アプタマーを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記検出可能な標識が、可視標識、発光標識、リン光標識又は蛍光標識を含む、請求項26に記載の方法。
- 前記検出可能な標識が、蛍光標識である、請求項26に記載の方法。
- 前記生物学的微小物体によって分泌される前記検体が、タンパク質、サッカリド、核酸、タンパク質、サッカリド若しくは核酸以外の有機分子、小胞又はウィルスを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記生物学的微小物体によって分泌される前記検体が、抗体である、請求項26に記載の方法。
- 前記生物学的微小物体によって分泌される前記検体が、抗体以外のタンパク質である、請求項26に記載の方法。
- 前記マイクロ流体デバイスが、複数の隔離ペンを含み、生物学的微小物体が、前記複数のうちの少なくとも2つの隔離ペンに導入され、前記方法の残りは、前記少なくとも2つの隔離ペンのそれぞれに対して実行される、請求項26に記載の方法。
- 前記複数のうちの前記少なくとも2つの隔離ペンの隔離ペンの分泌のレベルを比較することを更に含む、請求項58に記載の方法。
- 前記複数の隔離ペンのうちの2つ以上の隔離ペンの分泌スコアを比較することを更に含む、請求項58に記載の方法。
- 前記少なくとも2つの隔離ペンのうちの1つ又は複数を選択することと、
前記選択された隔離ペンのそれぞれから1つ又は複数の生物学的微小物体を搬出することと
を更に含む、請求項58に記載の方法。 - 前記選択された隔離ペンのそれぞれからの前記1つ又は複数の生物学的微小物体が、前記マイクロ流体デバイスから更に搬出される、請求項61に記載の方法。
- 前記選択された隔離ペンが、個々に搬出される、請求項61に記載の方法。
- クローン株成長の方法であって、
個々の生物学的微小物体をマイクロ流体デバイスの複数の隔離ペンのそれぞれに導入することであって、前記マイクロ流体デバイスが、フロー領域を有するエンクロージャを更に含み、前記複数のうちの前記隔離ペンのそれぞれが、前記フロー領域に流体的に接続され、且つ第1の流体媒体を含む、導入することと、
各生物学的微小物体又はそれから生成される生物学的微小物体のクローン集団に、前記対応する隔離ペンに含まれる前記第1の流体媒体に検体を分泌させることと、
第2の流体媒体を前記フロー領域に導入することであって、前記第2の流体媒体が、複数のリポーター分子を含み、各リポーター分子が、
前記分泌検体に結合するように構成される結合成分、及び
検出可能な標識
を含む、導入することと、
前記複数のリポーター分子の一部を前記複数のうちの各隔離ペンに拡散させ、且つそこで分泌された前記検体の少なくとも一部に結合させ、それにより、前記複数の隔離ペンのそれぞれにおいて複数のリポーター分子:分泌検体(RMSA)複合体を生成することと、
前記複数のうちの各隔離ペンについて、対応する対象エリアから発せられる信号の強度を検出することであって、前記対象エリアは、前記対応する隔離ペンの少なくとも一部を含み、前記対象エリアから発せられる前記信号の少なくとも一部が、前記対象エリア内に位置するリポーター分子の前記検出可能な標識から発せられる、検出することと、
前記複数のうちの各隔離ペンについて、前記対応する対象エリアから発せられた前記検出された信号強度に基づいてスコアを決定することと、
前記複数の隔離ペンから隔離ペンの組を選択することであって、前記組の各隔離ペンが、それに含まれる前記生物学的微小物体又はクローン集団がトップ検体生成者であることを示すスコアを有する、選択することと、
前記マイクロ流体デバイスから、前記選択された隔離ペンの組の各隔離ペン内に含まれる1つ又は複数の生物学的微小物体を搬出することと、
対応する反応容器内において、前記選択された隔離ペンの組の各隔離ペンからの前記搬出された1つ又は複数の生物学的微小物体を増殖させることと、
それぞれの対応する反応容器内で分泌された検体のレベルを特定し、それにより、各生物学的微小物体又はクローン集団の分泌のレベルを特定することとと、
を含む方法。 - 前記複数のうちの各隔離ペンが、分離領域及び前記分離領域を前記フロー領域に流体的に接続する接続領域を有し、前記分離領域及び前記接続領域が、前記分離領域内の流体媒体の成分が、実質的に拡散によってのみ前記フロー領域内の流体媒体の成分と交換されるように構成される、請求項64に記載の方法。
- 前記複数のうちの幾つか又は全ての隔離ペン内の前記個々の生物学的微小物体を増殖させて、生物学的微小物体のクローン集団にすることを更に含む、請求項65に記載の方法。
- 培養媒体で前記フロー領域を灌流させることを更に含み、前記灌流が、前記個々の生物学的微小物体を前記複数の隔離ペンに導入した後且つ前記第2の流体媒体を前記フロー領域に導入する前に行われる、請求項66に記載の方法。
- 前記培養媒体は、可溶性フィーダ細胞成分、定義された溶解酸素成分、定義されたpH成分、排出成長媒体成分及び/又は可溶性刺激成分の1つ又は複数を含む、請求項67に記載の方法。
- 前記第2の流体媒体を前記フロー領域に導入することが、第1の時間期間にわたり、前記フロー領域を通して前記第2の流体媒体を流すことを含む、請求項64に記載の方法。
- 前記第1の時間期間が、約30分から約60分である、請求項69に記載の方法。
- 第3の流体媒体を前記フロー領域に導入することであって、前記第3の流体媒体は、リポーター分子を含まない、導入することと、
非結合リポーター分子の少なくとも一部を前記隔離ペンから拡散させることと
を更に含み、
前記複数のうちの各隔離ペンの前記対応する対象エリアから発せられる前記信号の前記強度を検出することが、前記隔離ペンから拡散した非結合リポーター分子の量が、前記隔離ペンから拡散したRMSA複合体の量の少なくとも2倍だけ大きいように選択される時間において行われる、請求項64に記載の方法。 - 前記第3の流体媒体を前記フロー領域に導入することが、第2の時間期間にわたり、前記フロー領域を通して前記第3の流体媒体を流すことを含む、請求項71に記載の方法。
- 前記第2の時間期間が、非結合リポーター分子及びRMSA複合体の拡散プロファイルのモデリングに基づいて選択される、請求項72に記載の方法。
- 前記第2の時間期間が、約20分から約50分である、請求項73に記載の方法。
- 前記対象エリアが、前記隔離ペン内から前記フロー領域への拡散軸に沿って整列された前記隔離ペンの少なくとも一部を含む、請求項64に記載の方法。
- 前記複数のうちの各隔離ペンの前記対応する対象エリアから発せられた前記信号の強度を検出することが、前記検出可能信号の前記測定された強度から背景信号の強度を減算して、背景減算信号強度を特定することを含む、請求項64に記載の方法。
- 前記生物学的微小物体を前記隔離ペンに導入する前の時間において、前記複数のうちの各隔離ペンの前記対応する対象エリア内の背景信号の強度を測定することを更に含む、請求項76に記載の方法。
- 前記検出可能な信号の前記測定された強度又は前記背景減算信号強度が、前記対応する隔離ペン内で観測された細胞数について正規化される、請求項76に記載の方法。
- 前記複数の隔離ペンの前記スコアが、請求項12に記載の方法に従って決定される、請求項64に記載の方法。
- 前記分泌検体が、前記リポーター分子の分子量の少なくとも2倍の大きさの分子量を有する、請求項64に記載の方法。
- 前記分泌検体が、前記リポーター分子の分子量の少なくとも4倍だけ大きい分子量を有する、請求項64に記載の方法。
- 前記分泌検体が、前記リポーター分子の分子量の少なくとも10倍だけ大きい分子量を有する、請求項64に記載の方法。
- 前記リポーター分子の前記結合成分が、少なくとも1つのアミノ酸及び/又は少なくとも1つ核酸を含む、請求項64に記載の方法。
- 前記リポーター分子の前記結合成分が、ペプチド又はタンパク質を含む、請求項83に記載の方法。
- 前記リポーター分子の前記結合成分が、配列番号1から10のいずれか1つの配列を有するペプチドを含む、請求項84に記載の方法。
- 前記リポーター分子の前記結合成分が、タンパク質A、タンパク質G又はタンパク質A若しくはタンパク質GのIgG結合断片を含む、請求項84に記載の方法。
- 前記リポーター分子の前記結合成分が、アプタマーを含む、請求項64に記載の方法。
- 前記検出可能な標識が、可視標識、発光標識、リン光標識又は蛍光標識を含む、請求項64に記載の方法。
- 前記検出可能な標識が、蛍光標識である、請求項64に記載の方法。
- 前記生物学的微小物体によって分泌される前記検体が、タンパク質、サッカリド、核酸、タンパク質、サッカリド若しくは核酸以外の有機分子、小胞又はウィルスを含む、請求項64に記載の方法。
- 前記生物学的微小物体によって分泌される前記検体が、抗体である、請求項64に記載の方法。
- 前記生物学的微小物体によって分泌される前記検体が、抗体以外のタンパク質である、請求項64に記載の方法。
- 前記反応容器が、ウェルプレート内のウェル、振とうフラスコ又はバイオリアクタである、請求項64に記載の方法。
- 生物学的微小物体又はそれから生成される生物学的微小物体の集団によって分泌される検体のレベルを評価するキットであって、
フロー領域及び複数の隔離ペンを有するエンクロージャを含むマイクロ流体デバイスであって、各隔離ペンは、フロー領域に流体的に接続され、前記フロー領域及び前記隔離ペンは、流体媒体を含むように構成される、マイクロ流体デバイスと、
検出可能な標識及び前記検体に結合するように構成される結合成分を含むリポーター分子と、
を含むキット。 - 前記複数のうちの各隔離ペンが、分離領域及び前記分離領域を前記フロー領域に流体的に接続する接続領域を有し、前記分離領域及び前記接続領域が、前記分離領域内の流体媒体の成分が、実質的に拡散によってのみ前記フロー領域内の流体媒体の成分と交換されるように構成される、請求項94に記載のキット。
- 前記リポーター分子の前記結合成分が、少なくとも1つのアミノ酸及び/又は少なくとも1つ核酸を含む、請求項94に記載のキット。
- 前記リポーター分子の前記結合成分が、ペプチド又はタンパク質を含む、請求項96に記載のキット。
- 前記リポーター分子の前記結合成分が、配列番号1から10のいずれか1つの配列を有するペプチドを含む、請求項97に記載のキット。
- 前記リポーター分子の前記結合成分が、タンパク質A、タンパク質G又はタンパク質A若しくはタンパク質GのIgG結合断片を含む、請求項97に記載のキット。
- 前記リポーター分子の前記結合成分が、アプタマーを含む、請求項96に記載のキット。
- 前記検出可能な標識が、可視標識、発光標識、リン光標識又は蛍光標識を含む、請求項94に記載のキット。
- 前記検出可能な標識が、蛍光標識である、請求項94に記載のキット。
- 流体媒体を更に含む、請求項94に記載のキット。
- 前記流体媒体が、前記生物学的微小物体又はそれから生成される前記生物学的微小物体の集団を維持するか、増殖させるか、又はそれに選択的圧力を提供するように構成される、請求項103に記載のキット。
- 前記マイクロ流体デバイスの1つ又は複数の表面を調整するように構成される試薬を更に含む、請求項94に記載のキット。
- 前記試薬が、前記マイクロ流体デバイスの前記1つ又は複数の表面を共有結合的に修飾するように構成される、請求項105に記載のキット。
- 前記対象エリアが、検体濃度変動の測定について影響を最も受けやすく、検体変動が測定されるとき、前記隔離ペン内の生物学的微小物体の位置の影響を最も受けにくく、且つ前記隔離ペンと前記フロー領域との間で拡散軸に沿って延在する前記隔離ペン内のエリアに対応する画像エリアを含む、請求項26~63のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象エリアが、基本的に前記画像エリアからなる、請求項107に記載の方法。
- 自動化される、請求項26~63のいずれか一項に記載の方法。
- コンピュータに、生物学的微小物体によって生成される検体の数量を特定する方法を実行するようにシステムに指示させるプログラムが記憶される非一時的コンピュータ可読媒体であって、前記方法が、請求項107に記載の方法である、非一時的コンピュータ可読媒体。
- 前記システムが、請求項1に記載のシステムである、請求項110に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
- 前記対象エリアが、検体濃度変動の測定について影響を最も受けやすく、検体変動が測定されるとき、前記隔離ペン内の生物学的微小物体の位置の影響を最も受けにくく、且つ前記隔離ペンと前記フロー領域との間で拡散軸に沿って延在する前記隔離ペン内のエリアに対応する画像エリアを含む、請求項64~93のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象エリアが、基本的に前記画像エリアからなる、請求項112に記載の方法。
- 自動化される、請求項64~93又は112若しくは113のいずれか一項に記載の方法。
- コンピュータに、クローン株成長の方法の少なくとも一部を実行するようにシステムに指示させるプログラムが記憶される非一時的コンピュータ可読媒体であって、前記方法が、請求項112に記載の方法であり、前記システムが、少なくとも、前記選択された隔離ペンの組の各隔離ペン内に含まれる前記1つ又は複数の生物学的微小物体を前記マイクロ流体デバイスから搬出するまでの且つそれを含む前記ステップを実行する、非一時的コンピュータ可読媒体。
- 前記システムは、請求項1に記載のシステムである、請求項115に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
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