CN112703059A - 针对抗病性状筛选植物原生质体 - Google Patents
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- B01L2400/0454—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces radiation pressure, optical tweezers
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2400/00—Moving or stopping fluids
- B01L2400/08—Regulating or influencing the flow resistance
- B01L2400/084—Passive control of flow resistance
- B01L2400/086—Passive control of flow resistance using baffles or other fixed flow obstructions
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- G—PHYSICS
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Abstract
提供了用于针对抗病性状筛选植物细胞(特别是植物原生质体)的方法，以及用于执行此类方法的试剂盒。该方法在微流体装置中进行，该微流体装置包括适于培养和筛选植物原生质体的至少一个生长室和流动区域。微流体芯片的生长室的至少一个表面可以包括共价连接的涂覆材料或表面改性配体。该试剂盒可以包括微流体芯片以及用于检测植物原生质体的活力的试剂(可选地，表面调理剂或表面改性剂)。
Description
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.119(e)要求于2019年7月12日提交的申请号为62/697,199的美国临时申请的权益，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
在生物科学和相关领域中，在允许对细胞进行监测和/或测定的条件下培养细胞(特别是单细胞)可能是有用的，使得感兴趣的细胞可以被隔离以进行进一步研究或使用。不幸的是，对于大多数类型的细胞，合适的培养条件仍然未知或未优化。本文公开的一些实施例包括在微流体装置中培养植物原生质体的过程。原生质体可以单独地或成组地培养。本文公开的其他实施例包括在微流体装置中培养原生质体的同时，针对期望性状(例如，抗病基因)筛选植物原生质体的过程。
发明内容
在一方面，公开了一种鉴别缺乏病原抗性的植物原生质体的方法。该方法可以包括：将包含一个或多个植物原生质体的第一流体介质引入微流体装置，该微流体装置包括具有流动区域和至少一个生长室的壳体；将一个或多个原生质体中的第一原生质体移入至少一个生长室中的第一生长室中；使第一原生质体与病原体接触；以及在使第一原生质体与病原体接触后，在第一时间段期间，监测第一原生质体的活力。第一时间段结束时的原生质体活力表明原生质体缺乏对病原体的抗性。这样的原生质体可以从其对应的生长室输出并从芯片外回收以进行进一步分析(例如，测序以确定缺乏病原抗性的分子基础)。在某些实施例中，该方法还包括将至少一个原生质体移入微流体装置中的多个生长室的每一个中，并对移入多个生长室中的所有原生质体进行该方法的其余步骤。
在某些实施例中，使用来自以下各项的原生质体进行该方法：大面积作物，例如，小麦、玉米、大豆或棉花植物；高价值或观赏性作物，例如，西红柿、生菜、胡椒或南瓜植物；草皮或饲料植物，例如，草或苜蓿植物；或实验植物，例如，拟南芥植物或金鱼草植物。
在某些实施例中，病原体是植物病原物或从其衍生的分子。植物病原物可以是病毒、细菌、真菌细胞等。在某些实施例中，病原体是从植物病原物派生的分子剂(例如，病毒衣壳蛋白、鞭毛蛋白、脂多糖、肽聚糖、几丁质蛋白)或其片段。
在另一方面，公开了一种用于执行鉴别缺乏病原抗性的植物原生质体的方法的试剂盒。该试剂盒可以包括微流体芯片和用于检测植物原生质体的活力的试剂。该微流体芯片可以具有根据本文公开的任何微流体芯片的配置。例如，该微流体芯片可以包括具有流动区域和至少一个生长室的壳体，并且可选地，生长室的至少一个表面可以包括表面改性配体或共价连接的涂覆材料。用于检测植物原生质体的活力的试剂可以是荧光染色剂，例如，二乙酸荧光素(FDA)、Hoechst、荧光增白剂、叶绿素染色剂等。
所公开的方法和试剂盒的这些和其他特征和优点将在随后的描述和所附权利要求中阐明或变得更加完全明显。特征和优点可以借助于在所附示例、实施例的部分清单和权利要求中特别指出的目的和组合来实现和获得。此外，所描述的方法的特征和优点可以通过实践来获知，或者根据下文阐述的描述将是显而易见的。
附图说明
图1A示出了根据本公开的一些实施例的微流体装置和具有关联的控制设备的系统。
图1B示出了根据本公开的实施例的具有隔绝围栏的微流体装置。
图2A-2B示出了根据本公开的一些实施例的具有隔绝围栏的微流体装置。
图2C示出了根据本公开的一些实施例的微流体装置的隔绝围栏。
图3示出了根据本公开的一些实施例的微流体装置的隔绝围栏。
图4A-4B示出了根据本公开的一些实施例的微流体装置的电动特征(electrokinetic feature)。
图5A示出了根据本公开的一些实施例的与微流体装置和关联的控制设备一起使用的系统。
图5B示出了根据本公开的一些实施例的成像装置。
图6是用于在微流体装置中灌注流体介质的过程的一个实施例的示例。
图7是在微流体装置中灌注流体介质的过程的另一个实施例的示例。
图8描绘了根据本文所述方法的一个实施例培养的葡萄原生质体的照片表示(photographic representation)。
图9描绘了根据本文所述方法的一个实施例培养的生菜原生质体的照片表示。
图10是根据本文所述方法对植物原生质体进行基因分型的方法的示意图。
图11是根据本文所述的方法鉴别抗病性状的方法的示意图。
具体实施例
本说明书描述了本公开的示例性实施例和应用。然而，本公开不限于这些示例性实施例和应用，也不限于示例性实施例和应用在本文中操作或被描述的方式。此外，附图可以示出简化或局部视图，并且附图中的要素的尺寸可能被夸大或者不成比例。另外，由于本文使用术语“在......上”、“附接到”、“连接到”、“耦接到”或类似的词，一个要素(例如，材料、层、基板等)可以“在另一要素上”、“附接到另一要素”、“连接到另一要素”或“耦接到另一要素”，而不论该一个要素是直接在该另一要素上、附接到该另一要素、连接到该另一要素或耦接到该另一要素，还是在该一个要素和该另一元素之间有一个或多个间隔要素。另外，除非上下文另有规定，否则方向(例如，在...上、在...下、顶部、底部、侧面、上、下、正下、正上、上方、下方、水平、垂直、“x”、“y”、“z”等)，如果提供的话，仅通过示例的方式并且为了便于说明和讨论而不是以限制的方式提供。在提及要素列表(例如，要素a、b、c)的情况下，这样的提及旨在包括所列要素本身中的任何一个、少于所有列出的要素的任何组合和/或所有列出的要素的组合。说明书中的章节划分仅为了便于审查，并不限制所描述要素的任何组合。
在微流体特征的尺寸被描述为具有宽度或面积的情况下，尺寸通常是相对于x轴和/或y轴尺寸来描述的，两者都位于平行于微流体装置的基板和/或盖的平面内。微流体特征的高度可相对于z轴方向来描述，z轴方向垂直于平行于微流体装置的基板和/或盖的平面。在一些情况下，微流体特征(诸如通道或过道)的横截面积可参考x轴/z轴，y轴/z轴或x轴/y轴面积。
本文使用的“基本上”意味着足以用于预期目的。因此术语“基本上”允许由绝对或完美状态、尺寸、测量、结果等的微小、不明显的变化，诸如本领域普通技术人员预期的但不明显地影响总体性能。当与数值或者可以表示为数值的参数或特性相关地使用时，“基本上”表示在百分之十内。
术语“多个”意味着不止一个。
本文使用的术语“多个”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多。
本文使用的μm是指微米，μm3是指立方微米，pL是指皮升，nL是指纳升，而μL(或uL)是指微升。
本文使用的术语“置于”在其含义内包括“位于”。
本文使用的“微流体装置”或“微流体设备”是包括被配置为保持流体的一个或多个离散微流体回路的装置，每个微流体回路包括流体互连的回路元件(包括但不限于区域、流动路径、通道、腔室和/或围栏)，以及被配置为允许流体(并且可选地，悬浮在流体中的微物体)流入和/或流出微流体装置的至少一个端口。通常，微流体装置的微流体回路将包括流动区域(其可以包括或是微流体通道)和至少一个腔室，并且将容纳小于约1mL容积(例如，小于约750、500、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3或2μL)的流体。在某些实施例中，微流体回路保持约1～2、1～3、1～4、1～5、2～5、2～8、2～10、2～12、2～15、2～20、5～20、5～30、5～40、5～50、10～50、10～75、10～100、20～100、20～150、20～200，50～200，50～250或50～300μL。微流体回路可以被配置为具有与微流体装置中的第一端口(例如，入口)流体连通的第一端以及与微流体装置中的第二端口(例如，出口)流体连通的第二端。
本文中使用的“纳流体装置”或“纳流体设备”是如下类型的微流体装置，其具有包含至少一个回路元件的微流体回路，该至少一个回路元件被配置为容纳小于约1μL(例如，小于约750、500、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1nL或更小)容积的流体。纳流体装置可以包括多个回路元件(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10,000或更多)。在某些实施例中，至少一个回路元件中的一个或多个(例如，全部)被配置为容纳约100pL至1nL、100pL至2nL、100pL至5nL、250pL至2nL、250pL至5nL、250pL至10nL、500pL至5nL、500pL至10nL、500pL至15nL、750pL至10nL、750pL至15nL、750pL至20nL、1至10nL、1至15nL、1至20nL、1至25nL或1至50nL容积的流体。在其他实施例中，所述至少一个回路元件中的一个或多个(例如，全部)被配置为容纳约20nL至200nL、100至200nL、100至300nL、100至400nL、100至500nL、200至300nL、200至400nL、200至500nL、200至600nL、200至700nL、250至400nL、250至500nL、250至600nL或250至750nL容积的流体。
微流体装置在本文中可被称为“微流体芯片”或“芯片”，纳流体装置在本文中可被称为“纳流体芯片”或“芯片”。
本文所使用的“微流体通道”或“流动通道”是指微流体装置的流动区域，该流动区域长度显著长于水平和垂直尺寸两者。例如，流动通道可以是水平或垂直尺寸的长度的至少5倍，例如长度的至少10倍、长度的至少25倍、长度的至少100倍、长度的至少200倍、长度的至少500倍、长度的至少1,000倍，长度的至少5,000倍或更长。在一些实施例中，流动通道的长度为约100,000微米至约500,000微米，包括100,000微米和500,000微米之间的任何值。在一些实施例中，水平尺寸为约100微米至约1000微米(例如，约150微米至约500微米)，并且垂直尺寸为约25微米至约200微米(例如，约40微米至约150微米)。应当注意，流动通道在微流体装置中可具有多种不同的空间配置，因此不限于完全线性的元件。例如，流动通道可以是或包括具有以下构造的一个或多个段：曲线、曲折、螺旋、倾斜、下降、分叉(例如，多个不同的流动路径)及其任何组合。此外，流动通道沿其路径可具有不同的横截面积，加宽和收缩以在其中提供所需的流体流动。流动通道可以包括阀，并且阀可以是微流体领域中已知的任何类型。美国专利6,408,878(Unger等人)和9,227,200(Chiou等人)中公开了包括阀的微流体通道的示例，这两个专利通过引用整体并入本文。
本文中关于流体介质所使用的“扩散”是指流体介质的组分沿浓度梯度下降的热力学运动。
短语“介质的流动”意味着流体介质主要由于除了扩散之外的任何机制的整体移动。例如，介质的流动可以涉及流体介质由于点之间的压差而从一个点移动到另一点。这种流动可以包括液体的连续的、波动的、周期性的、随机的、间歇的或往复的流动，或其任何组合。当一个流体介质流入另一流体介质时，可导致介质的湍动和混合。
短语“基本上不流动”指的是流体介质的流速随时间推移的平均速率小于材料(例如，目标分析物)的组分流入流体介质或在流体介质内的扩散速率。这种材料的组分的扩散速率可以取决于例如温度、组分的尺寸和组分与流体介质之间的相互作用的强度。
本文中关于微流体装置内的不同区域所使用的短语“流体连通”是指，当不同区域基本上充满有诸如流体介质的流体时，每个区域中的流体连通以形成单个流体主体。这并不意味着不同区域中的流体(或流体介质)在组成上一定是相同的。相反，微流体装置的不同流体连通区域中的流体可具有不同组成(例如，不同浓度的溶质，诸如蛋白质、碳水化合物、离子或其他分子)，当溶质沿着它们各自的浓度梯度移动和/或流体流动通过微流体装置时，这些组成是变化的。
本文所使用的“流动路径”是指限定并经历介质流的轨迹的一个或多个流体连通的回路元件(例如，通道、区域、腔室等)。因此，流动路径是微流体装置的扫掠区域(sweptregion)的示例。其他回路元件(例如，未扫掠区域)可以与包括流动路径的回路元件流体连通，而不经历流动路径中的介质的流动。
本文所使用的“隔离微物体”构成将微物体限制在微流体装置内的限定区域。
本文所使用的“隔离区域”是指微流体装置内的区域，被配置为容纳微物体，使得微物体不会由于流体流过微流体装置而被从该区域抽离。取决于上下文，术语“隔离区域”还可以指限定该区域的结构，该结构可以包括基部/基板、壁(例如，由微流体回路材料制成)和盖。
微流体(或纳流体)装置可以包括“扫掠”区域和“未扫掠”区域。本文所使用的“扫掠”区域包括微流体回路的一个或多个流体互连的回路元件，每个流体互连的回路元件在流体流过微流体回路时经历介质的流动。扫掠区域的回路元件可以包括例如区域、通道和全部或部分腔室。本文所使用的“未扫掠”区域包括微流体回路的一个或多个流体互连的回路元件，当流体流过微流体回路时，这些回路元件中的每一个基本上不经历流体的流动。未扫掠区域可以流体连通到扫掠区域，假定流体连通被配置为能够扩散但在扫掠区域和未扫掠区域之间基本上没有介质流动。因此，微流体装置可被构造成基本上使未扫掠区域隔离扫掠区域中的介质流，同时使得在扫掠区域和未扫掠区域之间基本上仅存在扩散流体连通。例如，微流体装置的流动通道是扫掠区域的示例，而微流体装置的隔离区域(以下进一步详细描述)是未扫掠区域的示例。
本文所使用的术语“透光的”是指允许可见光通过而在光通过时基本上不改变光的材料。
本文所使用的“明场”照射和/或图像是指来自广谱光源的微流体视场的白光照射，其中，对比度是通过视场中物体对光的吸收而形成的。
本文所使用的“结构化光”是投射光，其照射装置的表面的一部分而不照射表面的相邻部分。结构化光通常由结构化光调制器(例如，数字镜装置(DMD)、微光闸阵列系统(MSA)、液晶显示器(LCD)等)生成。可以针对表面不规则性以及与光投影本身相关联的不规则性(例如，图像在照射场边缘处脱落(fall-off))校正结构光。
本文所使用的透镜(或透镜组件)的“通光孔径”是可用于其预期目的的透镜(或透镜组件)的部分的直径或尺寸。在某些情况下，通光孔径可以基本上等于透镜(或透镜组件)的物理直径。然而，由于制造限制，可能难以产生等于透镜(或透镜组件)的实际物理直径的通光孔径。
本文所使用的术语“有效区域”是指图像传感器或结构化光调制器的可分别用于成像或向特定光学装置中的视场提供结构化光的部分。有效区域受到光学装置的约束，例如光学装置内光路的孔径光阑。尽管有效区域对应于二维表面，但是有效区域的测量结果通常对应于穿过具有相同面积的正方形的相对角的对角线的长度。
本文所使用的“图像光束”是从光学设备正在观察的装置表面、微物体或流体介质反射或发射的电磁波。该装置可以是本文所述的任何微流体装置。微物体和流体介质可以位于这种微流体装置内。
本文所使用的术语“微物体”通常是指可根据本公开被隔离和/或操纵的任何微观物体。微物体的非限制性示例包括：无生命的微物体，例如微粒、微珠(例如聚苯乙烯珠、LuminexTM珠等)、磁珠、微米棒、微丝、量子点等；生物微物体，例如细胞、生物细胞器、囊泡或重组物、合成囊泡、脂质体(例如，合成的或衍生自膜制剂)、脂质纳米筏等；或无生命的微物体和生物微物体的组合(例如，附着于细胞的微珠、脂质体包覆的微珠、脂质体包覆的磁珠等)。珠可以包括共价或非共价连接的部分/分子，例如荧光标记、核酸(例如，寡核苷酸)、蛋白质、碳水化合物、抗原、小分子信号部分或能够在测定中使用的其他化学/生物种类。脂质纳米筏已经在如Ritchieet al.(2009)“Reconstitution of Membrane Proteins inPhospholipid Bilayer Nanodiscs,”Methods Enzymol.,464：211-231中所述。
本文所使用的术语“细胞”与术语“生物细胞”可互换使用。生物细胞的非限制性示例包括真核细胞、植物细胞、动物细胞(例如哺乳动物细胞、爬行动物细胞、鸟类细胞、鱼类细胞等)；原核细胞、细菌细胞、真菌细胞、原生动物细胞等；从组织解离的细胞，如肌肉、软骨、脂肪、皮肤、肝脏、肺细胞、神经、胶质细胞等；免疫细胞，例如T细胞、B细胞、浆细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞等；胚胎(例如，合子)、生殖细胞，例如卵母细胞、OVA、精细胞等；融合细胞、杂交瘤、培养细胞、来自细胞株的细胞、癌细胞，受感染的细胞、转染的和/或转化的细胞、报告细胞等。哺乳动物细胞可以例如来自人、小鼠、大鼠、马、山羊、绵羊、牛、猪、灵长类动物等。
如果能够繁殖的集落中的所有活细胞是源自单个亲本细胞的子细胞，则生物细胞的集落是“克隆”。在某些实施例中，克隆集落中的所有子细胞源自单个亲本细胞不超过10个分裂。在其他实施例中，克隆集落中的所有子细胞源自单个亲本细胞不超过14个分裂。在其他实施例中，在克隆集落中的所有子细胞源自单个亲本细胞不超过17个分裂。在其他实施例中，在克隆集落中的所有子细胞源自单个亲本细胞不超过20个分裂。术语“克隆细胞”是指相同克隆集落的细胞。
本文所使用的生物细胞的“集落”是指2个或更多个细胞(例如，约2至约20、约4至约40、约6至约60、约8至约80、约10至约100、约20至约200、约40至约400、约60至约600、约80至约800、约100至约1000或大于1000个细胞)。
本文所使用的术语“维护细胞”是指提供包括流体和气体组分以及任选的表面的环境，其提供保持细胞存活和/或扩增所必需的条件。
本文所使用的术语“扩增”在涉及细胞时是指细胞数量的增加。
流体介质的“组分”是存在于介质中的任何化学或生物化学分子，包括溶剂分子、离子、小分子、抗生素、核苷酸和核苷，核酸、氨基酸、肽、蛋白质、糖、碳水化合物、脂质、脂肪酸、胆固醇、代谢物等。
本文所使用的“捕捉部分”是为微物体提供鉴别位点的化学或生物物种、功能或基序。所选择的一类微物体可鉴别原位产生的捕捉部分，并且可结合或具有对原位产生的捕捉部分的亲和力。非限制性示例包括抗原、抗体和细胞表面结合基序。
本文所用的“抗体”是指免疫球蛋白(Ig)并且包括多克隆和单克隆抗体；多链抗体，例如IgG、IgM、IgA、IgE和IgD抗体；单链抗体，例如骆驼科抗体；哺乳动物抗体，包括灵长类抗体(例如，人)、啮齿动物抗体(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠等)、兔类动物抗体(例如，兔)、有蹄类动物抗体(例如，牛、猪、马、驴、骆驼等)和犬科抗体(例如，狗)；灵长类化(例如，人源化)抗体；嵌合抗体，例如，小鼠-人，小鼠-灵长类动物抗体等；并且可以是完整分子或其片段(例如，轻链可变区(VL)、重链可变区(VH)、scFv、Fv、Fd、Fab、Fab′和F(ab′)2片段)、或完整分子和/或片段的多聚体或聚集体；并且可以在自然界中发生，或者例如通过免疫、合成或遗传工程来产生。本文所用术语“抗体片段”是指衍生自抗体或与抗体相关的片段，其结合抗原。在一些实施例中，抗体片段可被衍生化以表现出促进清除和吸收的结构特征，例如，通过加入半乳糖残基。可以在这种微流体装置中测定生物微物体(例如，生物细胞)产生特定生物材料(例如，蛋白质，例如抗体)的能力。在测定的具体实施例中，可将包含待测定用于生产目的分析物的生物微物体(例如细胞)的样本材料加载到微流体装置的扫掠区域中。可以选择生物微物体中的一些(例如，哺乳动物细胞，诸如人细胞)用于特定的特性并且设置在未扫掠的区域中。剩余的样本材料然后可以流出扫掠区域，并且可以是流入扫掠区域的分析材料。因为所选择的生物微物体在未扫掠区域中，所以所选择的生物微物体基本上不受剩余样品材料的流出或测定材料的流动的影响。所选择的生物微物体可被允许产生感兴趣的分析物，其可从未扫掠区域扩散到扫掠区域中，其中感兴趣的分析物可与分析材料反应以产生局部可检测反应，其中的每一个反应可以与特定的未扫掠区域相关。可以分析与检测到的反应相关的任何未扫掠区域，以确定未扫掠区域中的生物微物体中的哪一个(如果有的话)是感兴趣的分析物的足够的生产者。
本文所指的抗原是可以与另一个分子(例如抗原特定的受体)特异性结合的分子或其一部分。抗原可以是分子的任何部分，例如构象表位或线性分子片段，并且通常可以被适应性免疫系统的高度可变的抗原受体(B细胞受体或T细胞受体)鉴别。抗原可以包括肽、多糖或脂质。抗原的特征可以在于其结合抗体的可变Fab区的能力。不同的抗体具有区分抗原表面上存在的不同表位的潜力，其结构可以通过半抗原的存在来调节，该半抗原可以是小分子。
可以在微流体装置中测定生物微物体(例如，生物细胞)产生特定生物材料(例如，蛋白质，例如抗体)的能力。在测定的具体实施例中，可将包含待测定用于生产目的分析物的生物微物体(例如细胞)的样本材料加载到微流体装置的扫掠区域中。可以选择生物微物体中的一些(例如，植物细胞，例如植物原生质体)用于特定的特性并且设置在未扫掠的区域中。剩余的样本材料然后可以流出扫掠区域，并且可以是流入扫掠区域的分析材料。因为所选择的生物微物体在未扫掠区域中，所以所选择的生物微物体基本上不受剩余样品材料的流出或测定材料的流动的影响。所选择的生物微物体可被允许产生感兴趣的分析物，其可从未扫掠区域扩散到扫掠区域中，其中感兴趣的分析物可与分析材料反应以产生局部可检测反应，其中的每一个反应可以与特定的未扫掠区域相关。可以分析与检测到的反应相关的任何未扫掠区域，以确定未扫掠区域中的生物微物体中的哪一个(如果有的话)是感兴趣的分析物的足够的生产者。
微流体装置/系统特征交叉适用性。应当理解，本文所述的微流体装置、系统和动力技术的各种特征可以是可组合的或可互换的。例如，本文中参照微流体装置100、175、200、300、320、400、450、520描述的特征以及如图1A-5B中描述的系统属性可以是可组合的或可互换的。
微流体装置。图1A示出了微流体装置100的示例。微流体装置100的透视图被示出为切除了盖110的一部分以提供微流体装置100中的局部视图。微流体装置100通常包括微流体回路120，微流体回路120包括流动路径106，流体介质180可以流过该流动路径106，可选地将一个或多个微物体(未示出)携带到微流体回路120中和/或通过微流体回路120。
如图1A中大体所示，微流体回路120由壳体102限定。尽管壳体102可以以不同的配置物理地构造，但是在图1A所示的示例中，壳体102被描绘为包括支撑结构104(例如，基部)，微流体回路结构108和盖110。支撑结构104、微流体回路结构108和盖110可以彼此附接。例如，微流体回路结构108可以设置在支撑结构104的内表面109上，并且盖110可以设置在微流体回路结构108上方。微流体回路结构108可以与支撑结构104和盖110一起限定微流体回路120的元件，形成三层结构。
如图1A所示，支撑结构104可以位于微流体回路120的底部，盖110可以位于微流体回路120的顶部。可替代地，支撑结构104和盖110可以以其他取向进行配置。例如，支撑结构104可以位于微流体回路120的顶部，盖110可以位于微流体回路120的底部。无论如何，可以有一个或多个端口107，每个端口都包括进入或离开壳体102的通道。通道的示例包括阀、闸门、贯通孔等。如图所示，端口107是由微流体回路结构108中的间隙形成的通孔。然而，端口107可位于壳体102的其他组件(例如盖110)中。在图1A中仅示出了一个端口107，但是微流体回路120可以具有两个或更多个端口107。例如，可以存在用作流体进入微流体回路120的入口的第一端口107，并且存在用作流体离开微流体回路120的出口的第二端口107。端口107是用作入口还是出口可以取决于流体流过流动路径106的方向。
支撑结构104可以包括一个或多个电极(未示出)和基板(或多个互连的基板)。例如，支撑结构104可以包括一个或多个半导体基板，每个半导体基板电连接到电极(例如，所有半导体基板或半导体基板的子集可以电连接到单个电极)。支撑结构104还可以包括印刷电路板组件(“PCBA”)。例如，半导体基板可以安装在PCBA上。
微流体回路结构108可以限定微流体回路120的回路元件。这样的回路元件可以包括当微流体回路120被流体填充时可以流体地互连的空间或区域，诸如流动区域(其可以包括或可以是一个或多个流动通道)、腔室(该类别的回路元件还可以包括子类别，其包括隔绝围栏)、阱(trap)等。回路元件还可以包括栅栏等。在图1A所示的微流体回路120中，微流体回路结构108包括框架114和微流体回路材料116。框架114可以部分地或完全地包围微流体回路材料116。框架114可以是例如基本上围绕微流体回路材料116的相对刚性的结构。例如，框架114可以包括金属材料。然而，微流体回路结构不必包括框架114。例如，微流体回路结构可以由(或基本上由)微流体回路材料116组成。
可以对微流体回路材料116图案化有腔室或类似物以限定微流体回路120的回路元件和互连，例如，腔室、围栏和微流体通道。微流体回路材料116可以包括柔性材料，诸如柔性聚合物(例如，橡胶、塑料、弹性体、硅树脂、聚二甲基硅氧烷(“PDMS”)等)，其可以是透气的。可形成微流体回路材料116的材料的其他示例包括模制玻璃、诸如硅树脂(例如可光图案化的硅树脂或“PPS”)的可蚀刻材料、光致抗蚀剂(例如，SU8)等。在一些实施例中，这种材料(即微流体回路材料116)可以是刚性的和/或基本上不透气。无论如何，微流体回路材料116可设置在支撑结构104上且在框架114内。
微流体回路120可包括流动区域，在该流动区域中可设置一个或多个腔室和/或一个或多个腔室可以与流动区域流体连通。腔室可具有将其与一个或多个流动区域流体连通的一个或多个开口。在一些实施例中，流动区域包括或对应于微流体通道122。尽管在图1A中示出了单个微流体回路120，但是合适的微流体装置可以包括多个(例如，2或3)这种微流体回路。在一些实施例中，微流体装置100可以被配置为纳流体装置。如图1A所示，微流体回路120可以包括多个微流体隔绝围栏124、126、128和130，其中每个隔绝围栏可以具有一个或多个开口。在隔绝围栏的一些实施例中，隔绝围栏可仅具有与流动路径106流体连通的单个开口。在一些其他实施例中，隔绝围栏可具有与流动路径106流体连通的不止一个开口，例如，n个开口，但是其中n-1个带阀的开口，使得除一个开口外，其他所有开口都是可关闭的。当所有带阀的开口都关闭时，隔绝围栏将材料从流动区域到隔绝围栏的交换限制为仅通过扩散进行。在一些实施例中，隔绝围栏包括各种特征和结构(例如，隔离区域)，这些特征和结构被优化，使得甚至在介质180流过流动路径106时将微物体保持在隔绝围栏内(因此保留在诸如微流装置100的微流装置内)。
盖110可以是框架114和/或微流体回路材料116的组成部分。或者，如图1A所示，盖110可以是结构上不同的元件。盖110可以包括与框架114和/或微流体回路材料116相同或不同的材料。在一些实施例中，盖110可以是微流体回路材料116的组成部分。类似地，支撑结构104可以是与所示的框架114或微流体回路材料116分离的结构，或者是框架114或微流体回路材料116的组成部分。同样，框架114和微流体回路材料116可以是如图1A所示的单独结构或相同结构的组成部分。不管各种可能的组成如何，微流体装置都可以保留三层结构，该三层结构包括基体层和覆盖层，基体层和覆盖层将微流体回路120所位于的中间层夹在中间。
在一些实施例中，盖110可以包括刚性材料。刚性材料可以是玻璃或具有类似特性的材料。在一些实施例中，盖110可以包括可变形材料。可变形材料可以是聚合物，例如PDMS。在一些实施例中，盖110可以包括刚性和可变形材料。例如，盖110的一个或多个部分(例如，位于隔绝围栏124、126、128、130上方的一个或多个部分)可以包括可变形材料，该可变形材料与盖110的刚性材料对接。具有包括刚性和可变形材料的盖的微流体装置例如已经在美国专利第10,058,865号(Breinlinger等人)中进行了描述，其内容通过引用并入本文。在一些实施例中，盖110可以还包括一个或多个电极。一个或多个电极可以包括导电氧化物，诸如氧化铟锡(ITO)，其可涂覆在玻璃或类似绝缘材料上。可替代地，一个或多个电极可以是嵌入在可变形材料(诸如聚合物(例如，PDMS))中的柔性电极，例如单壁纳米管、多壁纳米管、纳米线、导电纳米颗粒簇或其组合。可在微流体装置中使用的柔性电极已在例如美国第9,227,200号专利(Chiou等人)中描述，其内容通过引用并入本文。在一些实施例中，盖110和/或支撑结构104是透光的。盖110还可以包括至少一种透气材料(例如，PDMS或PPS)。
在图1A所示的示例中，微流体回路120被示出为包括微流体通道122和隔绝围栏124、126、128、130。每个围栏包括通向通道122的开口，其余的被封闭，使得围栏可以将围栏内的微物体与通道122的流动路径106或其他围栏中的流体介质180和/或微物体基本上隔离。隔绝围栏的壁从基部的内表面109延伸到盖110的内表面以进行封闭。隔绝围栏对微流体通道122的开口被取向为与流体介质180的流动路径106成一角度，使得流106不被引导到围栏中。通道122中的大量流体流的矢量可以与隔绝围栏的开口平面相切或平行，并且不定向到围栏的开口中。在一些情况下，围栏124、126、128、130被配置为在微流体回路120内物理地隔离一个或多个微物体。如将在下面详细讨论和示出的，本公开的隔绝围栏可以包括各种形状、表面和特征，这些形状、表面和特征被优化以与DEP、OET、OEW、流动流体、磁力、向心力和/或重力一起使用。
微流体回路120可包括任何数量的微流体隔绝围栏。尽管示出了五个隔绝围栏，但是微流体回路120可以具有更少或更多的隔绝围栏。如图所示，微流体回路120的微流体隔绝围栏124、126、128和130各自包括不同的特征和形状，其可以提供一个或多个对于维持、分离、测定或培养生物微物体物来说有用的益处。在一些实施例中，微流体回路120包括多个相同的微流体隔绝围栏。
在图1A所示的实施例中，示出了包含单个通道122的单个流动路径106。然而，其他实施例可以在单个流动路径106内包含多个通道122，如图1B所示。微流体回路120还包括与流动路径106流体连通的入口阀或端口107，流体介质180可以通过入口阀或端口107进入流动路径106(和通道122)。在一些情况下，流动路径106包括基本上直的路径。在其它情况下，流动路径106以非线性或曲折的方式(例如Z字形图案)布置，由此流动路径106两次或更多次以例如交替的方向在微流体装置100上行进。流动路径106中的流动可以从入口行进到出口，或者可以反向并且从出口行进到入口。
图1B中示出了多通道装置(微流体装置175)的一个示例，其在其他方面类似于微流体装置100。微流体装置175及其组成回路元件(例如，通道122和隔绝围栏128)可具有本文讨论的任何尺寸。图1B所示的微流体回路具有两个入口端口/出口端口107和包含四个不同通道122的流动路径106。可以选择微流体回路被细分的通道数量以减小流体阻力。例如，微流体回路可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个通道，以提供选定范围的流体阻力。微流体装置175还包括在每个通道122打开的多个隔绝围栏，其中，每个隔绝围栏类似于图1A的隔绝围栏128，并且可以具有如本文所述的任何隔绝围栏的任何尺寸或功能。然而，微流体装置175的隔绝围栏可具有不同的形状，例如图1A的隔绝围栏124、126或130或如本文其他任何地方所述的任何形状。此外，微流体装置175可以包括具有不同形状的混合的隔绝围栏。在一些情况下，配置多个隔绝围栏(例如，相对于通道122)，使得隔绝围栏可以并行地加载目标微物体。
返回图1A，微流体回路120还可以包括一个或多个可选的微物体阱(trap)132。可选的阱132可以形成在形成通道122的边界的壁中，并且可以定位成与微流体隔绝围栏124、126、128、130中的一个或多个的开口对置。可选的阱132可以被配置为从流动路径106接收或捕捉单个微物体，或者可以被配置为从流动路径106接收或捕捉多个微物体。在一些情况下，可选的阱132包括与单个目标微物体的容积近似相等的容积。
隔绝围栏。本文所述的微流体装置可以包括一个或多个隔绝围栏，其中，每个隔绝围栏均适合于容纳一个或多个微物体(例如，生物细胞或关联在一起的成组的细胞)。隔绝围栏可以设置在流动区域内并向流动区域开放，该流动区域在一些实施例中是微流体通道。每个隔绝围栏可具有一个或多个开口，用于与一个或多个微流体通道流体连通。在一些实施例中，隔绝围栏可仅具有一个针对微流体通道的开口。
图2A-2C示出了微流体装置200的隔绝围栏224、226和228，其可以类似于图1A的隔绝围栏128。每个隔绝围栏224、226和228可以包括隔离区域240和连通区域236，连通区域236将隔离区域240流体连通到流动区域，该流动区域在一些实施例中可以包括微流体通道(例如，通道122)。连通区域236可包括通向流动区域(例如，微流体通道122)的近侧开口234和通向隔离区域240的远侧开口238。连通区域236可以被配置为使得流体通道122中流动的流体介质(未示出)通过隔绝围栏224、226和228的流动的最大穿透深度不延伸到隔离区域240中，如以下针对图2C所讨论的。在一些实施例中，来自微流体通道中的流动的流线不进入隔离区域。因此，由于连通区域236，隔绝围栏224、226和228的隔离区域240中设置的微物体(未示出)或其他材料(未示出)可以与流体通道122中的流体介质180流隔离，并且基本上不受流体介质180流的影响。
图2A-2C的隔绝围栏224、226和228均具有直接通向微流体通道122的单个开口。如图2A所示，隔绝围栏的开口可以从微流体通道122横向打开，图2A描绘了微流体装置200的垂直横截面。图2B示出了微流体装置200的水平横截面。电极活化基板206可以位于微流体通道122和隔绝围栏224、226和228两者的下面。形成隔绝围栏的底面的、隔绝围栏的壳体内的电极活化基板206的上表面可以设置在形成微流体装置的流动通道(或流动区)的底面的、微流体通道122(或者如果通道不存在则为流动区)内的电极活化基板206的上表面的相同高度或基本上相同的高度处。电极活化基板206可以是无特征的或者可以具有不规则或图案化的表面，该表面从其最高高度到最低的凹陷变化小于约3微米、2.5微米、2微米、1.5微米、1微米、0.9微米、0.5微米、0.4微米、0.2微米、0.1微米或更小。基板的上表面在微流体通道122(或流动区)和隔绝围栏上的高度的变化可等于或小于隔绝围栏壁的高度的约10％、7％、5％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.5％、0.3％或0.1％。可替代地，基板上表面在微流体通道122(或流动区域)和隔绝围栏上的高度变化可以等于或小于基板高度的约2％、1％、0.9％、0.8％、0.5％、0.3％、0.2％或0.1％。虽然详细描述了微流体装置200，但这也可以适用于本文所述的任何微流体装置。
微流体通道122和连通区域236可以是扫掠区域的示例，而隔绝围栏224、226和228的隔离区域240可以是未扫掠区域的示例。类似224、226、228等的隔绝围栏具有隔离区域，其中，每个隔离区域仅具有一个开口，该开口通向隔绝围栏的连通区域。流体介质交换进和交换出如此配置的隔离区域可被限制为基本上仅通过扩散发生。如所指出的，如上所述，微流体通道122和隔绝围栏224、226和228可以被配置为容纳一个或多个流体介质180。在图2A-2B所示的示例中，端口222连接到微流体通道122并且允许流体介质180被引入微流体装置200或从微流体装置230移除。在引入流体介质180之前，微流体装置可以用诸如二氧化碳气体的气体填装。一旦微流体装置200容纳流体介质180，可选择性地产生和停止微流体通道122中的流体介质180的流动242(参见图2C)。例如，如图所示，端口222可以设置在流动区域(例如，微流体通道122)的不同位置(例如，相对端)处，并且可以造成从用作入口的一个端口222到用作出口的另一个端口222的流体介质流动242。
图2C示出了根据一些实施例的隔绝围栏224的示例的详细视图，该隔绝围栏224可以容纳一个或多个微物体246。微流体通道122中的流体介质180的流动242经过隔绝围栏224的连通区域236的近侧开口234可引起流体介质180进入和/或离开隔绝围栏224的辅助流动244。为了将隔绝围栏224的隔离区域240中的微物体246与辅助流动244分隔，隔绝围栏224的连通区域236的长度Lcon(即，从近侧开口234到远侧开口238)应该大于辅助流动244进入连通区域236的穿透深度Dp。穿透深度Dp取决于许多因素，包括：微流体通道122的形状，其可以由连通区域236在近侧开口234处的宽度Wcon限定；微流体通道122在近侧开口234处的宽度Wch；通道122在近侧开口234处的高度Hch；以及连通区域236的远侧开口238的宽度。在这些因素中，连通区域236在近侧开口234处的宽度Wcon和通道122在近侧开口234处的高度Hch往往是最重要的。另外，穿透深度Dp可能受到通道122中的流体介质180的速度和流体介质180的粘度的影响。然而，这些因素(即，速度和粘度)可能变化很大而不会显著地改变穿透深度Dp。例如，对于微流体芯片200，连通区域236在近侧开口234处的宽度Wcon为约50微米，通道122在近侧开口234处的高度Hch为约40微米，微流体通道122在近侧开口234处的宽度Wch为约150微米，辅助流动244的穿透深度Dp从0.1微升/秒流速时的小于Wcon的1.0倍(即，小于50微米)变化到20微升/秒流速时的Wcon的2.0倍(即，约100微米)，这表示相对于流体介质180的速度的200倍的增加，Dp仅增加2.5倍。
在一些实施例中，微流体通道122和隔绝围栏224、226或228的壁可以相对于微流体通道122中的流体介质180的流动242的矢量如下地定向：微流体通道宽度Wch(或微流体通道122的横截面)可以基本垂直于介质180的流动242；连通区域236在开口234处的宽度Wcon(或横截面面)可以基本平行于微流体通道122中的介质180的流动242；和/或连通区域的长度Lcon可以基本垂直于微流体通道122中的介质180的流动242。前述仅是示例，微流体通道122与隔绝围栏224、226和228的相对位置可以相对于彼此处于不同的取向。
在一些实施例中，对于给定的微流体装置，微流体通道122和开口234的构造可以是固定的，而微流体通道122中的流体介质180的流动242的速率可以是可变的。因此，对于每个隔绝围栏224，可以鉴别通道122中的流体介质180的流动242的最大速度Vmax，其确保辅助流动244的穿透深度Dp不超过连通区域236的长度Lcon。当不超过Vmax时，所产生的辅助流动244可以被完全容纳在连通区域236内，并且不进入隔离区域240。因此，防止流体介质180在微流体通道122(扫掠区域)中的流动242将微物体246拉出隔离区域240(其为微流体回路的未扫掠区域)，从而导致微物体246被保留在隔离区域240中。因此，微流体回路元件尺寸的选择和操作参数的进一步选择(例如，流体介质180的速度)可以防止来自微流体通道122或另一隔绝围栏226或228的材料污染隔绝围栏224的隔离区域240。然而，应该注意的是，对于许多微流体芯片构造，不需要担心Vmax本身，因为在实现Vmax之前，芯片将从与高速流动的流体介质180相关联的压力中破裂。
微流体通道122中第一流体介质180中的组分(未示出)基本上仅可以如下方式与隔离区域240中的第二流体介质248混合：第一介质180的组分从微流体通道122扩散通过连通区域236，并进入隔离区域240中的第二流体介质248。类似地，隔离区域240中的第二介质248的组分(未示出)基本上仅可以通过如下方式与微流体通道122中的第一介质180混合：第二介质248的组分从隔离区域240扩散通过连通区域236，并进入微流体通道122中的第一介质180。在一些实施例中，隔绝围栏的隔离区域与流动区域之间通过扩散进行的流体介质交换程度大于流体交换的约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大于约99％。
在一些实施例中，第一介质180可以是与第二介质248相同的介质或不同的介质。在一些实施例中，第一介质180和第二介质248可以开始是相同的，然后变得不同(例如，通过隔离区域240中的一个或多个细胞对第二介质248的调节，或者通过改变流过微流体通道122的介质180)。
如图2C所示，连通区域236的宽度Wcon从近侧开口234到远侧开口238可以是均匀的。连通区域236在远侧开口238处的宽度Wcon可以是本文为连通区域236在近侧开口234处的宽度Wcon所标识的任何值。在一些实施例中，隔离区域240在远侧开口238处的宽度可以与连通区域236在近侧开口234处的宽度Wcon基本相同。可替代地，连通区域236在远侧开口238处的宽度可以不同于(例如，大于或小于)连通区域236在近侧开口234处的宽度Wcon。在一些实施例中，连通区域236的宽度Wcon可以在近侧开口234和远侧开口238之间变窄或变宽。例如，连通区域236可以使用各种不同的几何形状(例如倒角连通区域，斜切连通区域)而在近侧开口和远侧开口之间变窄或变宽。此外，连通区域236的任何部分或子部分(例如，连通区域与近侧开口234相邻的一部分)可以变窄或变宽。
图3描绘了包含微流体回路结构308的微流体装置300的另一个示例性实施例。微流体装置300包括通道322和隔绝围栏324。隔绝围栏324具有本文所述的针对微流体装置100、175、200、400、520和本文所述的任何其他微流体装置的任何隔绝围栏类似的特征和特性。
图3的示例性微流体装置包括微流体通道322，其具有如本文所述的宽度Wch，并且容纳第一流体介质302的流动310和一个或多个隔绝围栏324(仅在图3中示出)。隔绝围栏324均具有长度Ls、连通区域336和隔离区域340，其中，隔离区域340容纳第二流体介质304。连通区域336具有宽度为Wcon1并且通向微流体通道322的近侧开口334和宽度为Wcon2并且通向隔离区域340的远侧开口338。如本文所述，宽度Wcon 1可以与Wcon 2相同或不同。每个隔绝围栏324的壁可以由微流体回路材料316形成，微流体回路材料316还可以形成连通区域的壁330。连通区域的壁330可以对应于相对于近侧开口334横向定位并且至少部分地延伸到隔绝围栏324的封闭部分中的结构。在一些实施例中，连通区域336的长度Lcon至少部分地由连通区域的壁330的长度Lwall限定。连通区域的壁330可以具有被选择为大于辅助流动344的穿透深度Dp的长度Lwall。因此，辅助流动344可以被完全容纳在连通区域内而不延伸到隔离区域340中。
连通区域的壁330可以限定钩形区域352，钩形区域352是隔绝围栏324的隔离区域340的子区域。由于连通区域的壁330延伸到隔绝围栏的内部腔室中，在选择长度Lwall的情况下，连通区域的壁330可以充当物理栅栏来对钩形区域352屏蔽辅助流动344，构成钩形区域。在一些实施例中，连通区域的壁330的长度Lwall越长，钩形区域352越被遮挡。
在类似于图2A-2C和图3的那些配置的隔绝围栏中，隔离区域可以具有任何类型的形状和尺寸，并且可以被选择为调节营养物、试剂和/或介质向隔绝围栏中的扩散以到达隔绝围栏的远壁，例如，与连通区域到流动区域(或微流体通道)的近侧开口相对。可以进一步选择隔离区域的尺寸和形状，以调节废产物和/或生物微物体的分泌产物经由隔绝围栏的连通区域的近侧开口从隔离区域到流动区域的扩散。通常，隔离区域的形状对于隔绝围栏将微物体与流动区域中的直接流动隔离的能力并不关键。
在隔绝围栏的一些其他实施例中，隔离区域可以具有多于一个的开口，这些开口将隔离区域与微流体装置的流动区域流体连通。但是，对于具有将隔离区域流体连通到流动区域(或两个或更多个流动区域)的数量为n的开口的隔离区域，n-1个开口可以被阀控。当关闭n-1个带阀的开口时，隔离区域只有一个有效的开口，因此仅通过扩散进行材料进出隔离区域的交换。
具有其中可以放置、培养和/或监测生物微物体的围栏的微流体装置的示例已经在例如以下文献中进行了描述：第9,857,333号美国专利(Chapman等人)，第10,010,882号美国专利(White等)和第9,889,445号美国专利(Chapman等人)，其每一个均通过引用整体并入本文。
隔绝围栏尺寸。如本文所述，可以选择隔绝围栏和隔绝围栏通向的微流体通道的各种尺寸和/或特征，以限制污染物或不需要的微物体从流动区域/微流体通道引入隔绝围栏的隔离区域；将来自通道或来自隔离区域的流体介质中的组分的交换限制为基本上为扩散交换；促进微物体进出隔绝围栏的传送；和/或促进生物细胞的生长或扩增。对于本文所述的任何实施例，微流体通道和隔绝围栏可以具有尺寸的任何合适的组合，可以由本领域的技术人员根据以下的本公开的教导进行选择。
隔绝围栏的连通区域的近侧开口可以具有如下宽度(例如，Wcon或Wcon1)：该宽度至少与隔绝围栏旨在用于的微物体(例如，生物细胞，其可以是植物细胞(例如，植物原生质体))的最大尺寸一样大。在一些实施例中，近侧开口具有约20微米、约40微米、约50微米、约60微米、约75微米、约100微米、约150微米、约200微米或约300微米的宽度(例如，Wcon或Wcon1)。前述仅是示例，近侧开口的宽度(例如，Wcon或Wcon1)可以被选择为在以上列出的任何值之间的值(例如，约20-200微米、约20-150微米、20-100微米、约20-75微米、约20-60微米、约50-300微米、约50-200微米、约50-150微米、约50-100微米、约50-75微米、约75-150微米、约75-100微米、约100-300微米、约100-200微米或约200-300微米)。
在一些实施例中，隔绝围栏的连通区域可以具有从近侧开口到通向隔绝围栏的隔离区域的远侧开口的长度(例如，Lcon)，其是近侧开口的宽度(例如，Wcon或Wcon1)的至少0.5倍、至少0.6倍、至少0.7倍、至少0.8倍、至少0.9倍、至少1.0倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.75倍、至少2.0倍、至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍、至少3.0倍、至少3.5倍、至少4.0倍、至少4.5倍、至少5.0倍、至少6.0倍、至少7.0倍、至少8.0倍、至少9.0倍或至少10.0倍。因此，例如，隔绝围栏的连通区域的近侧开口可以具有约20微米至约200微米(例如，约50微米至约150微米)的宽度(例如，Wcon或Wcon1)，并且连通区域的长度Lcon可以为近侧开口的宽度的至少1.0倍(例如，至少1.5倍或至少2.0倍)。作为另一示例，隔绝围栏的连通区域的近侧开口可以具有约20微米至约100微米(例如，约20微米至约60微米)的宽度(例如，Wcon或Wcon1)，并且连通区域的长度Lcon可以为近侧开口的宽度的至少1.0倍(例如，至少1.5倍或至少2.0倍)。
隔绝围栏通向的微流体装置的微流体通道可以具有指定的尺寸(例如，宽度或高度)。在一些实施例中，近侧开口处微流体通道到隔绝围栏的连通区域的高度(例如，Hch)可以在以下范围中的任何一个范围内：20-100微米、20-90微米、20-80微米、20-70微米、20-60微米、20-50微米、30-100微米、30-90微米、30-80微米、30-70微米、30-60微米、30-50微米、40-100微米、40-90微米、40-80微米、40-70微米、40-60微米或40-50微米。以上仅是示例，并且微流体通道(例如122)的高度(例如，Hch)可以被选择为在上面列出的任何值之间。此外，在微流体通道的除隔绝围栏的近侧开口处之外的区域中，微流体通道122的高度(例如，Hch)可以被选择为在这些高度的任何一个。
微流体通道在通向隔绝围栏的连通区域的近侧开口处的宽度(例如，Wch)可以在以下范围中的任何一个范围内：约20-500微米、20-400微米、20-300微米、20-200微米、20-150微米、20-100微米、20-80微米、20-60微米、30-400微米、30-300微米、30-200微米、30-150微米、30-100微米、30-80微米、30-60微米、40-300微米、40-200微米、40-150微米、40-100微米、40-80微米、40-60微米、50-1000微米、50-500微米、50-400微米、50-300微米、50-250微米、50-200微米、50-150微米、50-100微米、50-80微米、60-300微米、60-200微米、60-150微米、60-100微米、60-80微米、70-500微米、70-400微米、70-300微米、70-250微米、70-200微米、70-150微米、70-100微米、80-100微米、90-400微米、90-300微米、90-250微米、90-200微米、90-150微米、100-300微米、100-250微米、100-200微米、100-150微米、100-120微米、200-800微米、200-700微米或200-600微米。前述仅是示例，微流体通道的宽度(例如，Wch)可以被选择为在以上列出的任何值之间的值。而且，在微流体通道的除隔绝围栏的近侧开口处之外的区域中，微流体通道122的宽度(例如，Wch)可以被选择为在这些宽度中的任何一个。
微流体通道在通向隔绝围栏的连通区域的近侧开口处的横截面积可以是约500-50,000平方微米、500-40,000平方微米、500-30,000平方微米、500-25,000平方微米、500-20,000平方微米、500-15,000平方微米、500-10,000平方微米、500-7,500平方微米、500-5,000平方微米、1,000-25,000平方微米、1,000-20,000平方微米、1,000-15,000平方微米、1,000-10,000平方微米、1,000-7,500平方微米、1,000-5,000平方微米、2,000-20,000平方微米、2,000-15,000平方微米、2,000-10,000平方微米、2,000-7,500平方微米、2,000-6,000平方微米、3,000-20,000平方微米、3,000-15,000平方微米、3,000-10,000平方微米、3,000-7,500平方微米或3,000至6,000平方微米。前述仅仅是示例，微流体通道在近侧开口处的横截面积可以被选择为在以上列出的任何值之间。在各个实施例中，在除近侧开口处之外的区域处，微流体通道的横截面面积也可以被选择为在以上列出的任何值之间。在一些实施例中，横截面积被选择为对于微流体通道的整个长度是基本一致的值。
在一些实施例中，微流体芯片被配置成使得隔绝围栏的连通区域的近侧开口(例如，234或334)可具有约20微米到约200微米(例如，约50微米至约150微米)的宽度(例如，Wcon或Wcon1)，连通区域可以具有为近侧开口的宽度的至少1.0倍(例如，至少1.5倍或至少2.0倍)的长度Lcon(例如，236或336)，并且微流体通道在近侧开口处可具有约30微米至约60微米的高度(例如，Hch)。作为另一示例，隔绝围栏的连通区域的近侧开口(例如，234或334)可以具有约20微米至约100微米(例如，约20微米至约60微米)的宽度(例如，Wcon或Wcon1)，连通区域可以具有为近侧开口的宽度的至少1.0倍(例如，至少1.5倍或至少2.0倍)的长度Lcon(例如，236或336)，并且微流体通道在近侧开口处可具有约30微米至约60微米的高度(例如，Hch)。前述仅是示例，近侧开口(例如，234或274)的宽度(例如，Wcon或Wcon1)、连通区域的长度(例如，Lcon)和/或微流体通道(例如，122或322)的宽度(例如，Wch)可以为被选择为在以上列出的任何值之间的值。
在一些实施例中，隔绝围栏的连通区域的近侧开口(例如，234或334)可以具有为近侧开口处的流动区域/微流体通道的高度(例如，Hch)的2.0倍或更小(例如，2.0倍、1.9倍、1.8倍、1.5倍、1.3倍、1.0倍、0.8倍、0.5倍或0.1倍)的宽度(例如，Wcon或Wcon1)，或者具有位于由上述值中的任意两个限定的范围内的值。
在一些实施例中，隔绝围栏的连通区域的近侧开口(例如，234或334)的宽度Wcon1可以与隔绝围栏的隔离区域的远侧开口(例如，238或338)的宽度Wcon2相同。在一些实施例中，近侧开口的宽度Wcon1可以不同于远侧开口的宽度Wcon2，并且Wcon1和/或Wcon2可以从针对Wcon或Wcon1描述的任何值中选择。在一些实施例中，限定近侧开口和远侧开口的壁(包括连通区域的壁)可以相对于彼此基本平行。在一些实施例中，限定近侧开口和远侧开口的壁可以被选择为相对于彼此不平行。
连通区域的长度(例如，Lcon)可以是约1-600微米、5-550微米、10-500微米、15-400微米、20-300微米、20-500微米、40-400微米、60-300微米、80-200微米、约100-150微米、约20-300微米、约20-250微米、约20-200微米、约20-150微米、约20-100微米、约30-250微米、约30-200微米、约30-150微米、约30-100微米、约30-80微米、约30-50微米、约45-250微米、约45-200微米、约45-100微米、约45-80微米、约45-60微米、约60-200微米、约60-150微米、约60-100微米或约60-80微米。前述仅是示例，连通区域的长度(例如，Lcon)可以被选择为在以上列出的任何值之间的值。
隔绝围栏的连通区域的壁的长度(例如，Lwall)可以为隔绝围栏的连通区域的近侧开口的宽度(例如，Wcon或Wcon1)的至少0.5倍、至少0.6倍、至少0.7倍、至少0.8倍、至少0.9倍、至少1.0倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.75倍、至少2.0倍、至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍、至少3.0倍或至少3.5倍。在一些实施例中，连通区域的壁可具有约20-200微米、约20-150微米、约20-100微米、约20-80微米或约20-50微米的长度Lwall。前述仅是示例，连通区域的壁可以具有被选择为在上面列出的任何值之间的长度Lwall。
隔绝围栏可以具有约40-600微米、约40-500微米、约40-400微米、约40-300微米、约40-200微米、约40-100微米或约40-80微米的长度Ls。前述仅是示例，隔绝围栏可以具有被选择为在以上列出的任何值之间的长度Ls。
根据一些实施例，隔绝围栏可以具有指定的高度(例如，Hs)。在一些实施例中，隔绝围栏具有约20微米至约200微米(例如，约20微米至约150微米、约20微米至约100微米、约20微米至约60微米、约30微米至约150微米、约30微米至约100微米、约30微米至约60微米、约40微米至约150微米、约40微米至约100微米或约40微米至约60微米)的高度Hs。前述仅是示例，隔绝围栏可以具有被选择为在以上列出的任何值之间的高度Hs。
连通区域在隔绝围栏的近侧开口处的高度Hcon可以是以下高度中的任何一个：20-100微米、20-90微米、20-80微米、20-70微米、20-60微米、20-50微米、30-100微米、30-90微米、30-80微米、30-70微米、30-60微米、30-50微米、40-100微米、40-90微米、40-80微米、40-70微米、40-60微米或40-50微米。前述仅为示例，连通区域的高度Hcon可以被选择为在上面列出的任何值之间。通常，连通区域的高度Hcon被选择为与微流体通道在连通区域的近侧开口处的高度Hch相同。另外，隔绝围栏的高度Hs通常被选择为与连通区域的高度Hcon和/或微流体通道的高度Hch相同。在一些实施例中，Hs、Hcon和Hch可以被选择为与上面针对所选择的微流体装置列出的任何值相同的值。
隔离区域可以被配置为仅容纳一个、两个、三个、四个、五个或类似的相对少量的微物体。在其他实施例中，隔离区域可以容纳多于10个、多于50个或多于100个的微物体。因此，隔离区域的容积可以是例如至少1x104、1x105、5x105、8x105、1x106、2x106、4x106、6x106、1x107、3x107、5x107、1x108、5x108或8x108立方微米或更大。前述仅是示例，隔离区域可以被配置为容纳各种数量的微物体，并且容积被选择为在上面列出的任何值之间(例如，在1x105立方微米和5x105立方微米之间的容积、在5x105立方微米和1x106立方微米之间的容积、在1x106立方微米和2x106立方微米之间的容积、或中2x06立方微米和1x07立方微米之间的容积)。
根据一些实施例，微流体装置的隔绝围栏可具有指定的容积。可以选择隔绝围栏(或隔绝围栏的隔离区域)的指定的容积，使得单个细胞或少量(例如2-10或2-5个)细胞可以快速调节介质，从而获得有利(或最佳)的生长条件。在一些实施例中，隔绝围栏具有约5x105、6x105、8x105、1x106、2x106、4x106、8x106、1x107、3x107、5x107或约8x107立方微米或更大的容积。在一些其他实施例中，隔绝围栏具有约1纳升至约50纳升、2纳升至约25纳升、2纳升至约20纳升、约2纳升至约15纳升或约2纳升至约10纳升的容积。前述仅是示例，隔绝围栏可以具有被选择为在上面列出的任何值之间的任何值的容积。
根据一些实施例，微流体通道内的流体介质的流动(例如，122或322)可以具有指定的最大速度(例如，Vmax)。在一些实施例中，最大速度(例如，Vmax)可以设置为约0.2、0.5、0.7、1.0、1.3、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.7、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20微升/秒。前述仅是示例，微流体通道内的流体介质的流动可具有被选择为在上面列出的任何值之间的值的最大速度(例如，Vmax)。
在各个实施例中，微流体装置具有如本文讨论的任何实施例中配置的隔绝围栏，其中微流体装置具有约5至约10个隔绝围栏、约10至约50个隔绝围栏、约25至约200个隔绝围栏、约100至约500个隔绝围栏；约200至约1000个隔绝围栏、约500至约1500个隔绝围栏、约1000至约2500个隔绝围栏、约2000至约5000个隔绝围栏、约3500至约7000个隔绝围栏、约5000至约10000个隔绝围栏、约7,500至约20,000隔绝围栏、约12,500至约25,000隔绝围栏、约20,000至约30,000隔绝围栏、约25,000至约35,000隔绝围栏、约30,000至约40,000个隔绝围栏、约35,000至约45,000个隔绝围栏或约40,000至约50,000个隔绝围栏。隔绝围栏不需要全部具有相同的尺寸，并且可以包括多种配置(例如，隔绝围栏内的不同宽度、不同特征)。
涂覆溶液和涂覆剂。在一些实施例中，微流体装置的至少一个内表面包括涂覆材料，该涂覆材料提供适合于维持、扩增和/或移动生物微物体(即，该生物微物体在该微流体装置内展现出增加的活力、更大的扩增和/或更大的可移植性)的层。调节过的表面可以减少表面结垢，参与提供水合层，和/或以其他方式保护生物微物体免于与微流体装置内部的非有机材料接触。
在一些实施例中，微流体装置的基本上所有内表面都包括涂覆材料。涂覆的内表面可包括流动区域(例如，通道)、腔室或隔绝围栏的表面，或其组合。在一些实施例中，多个隔绝围栏中的每一个具有至少一个涂覆有涂覆材料的内表面。在其他实施例中，多个流动区域或通道中的每一个具有至少一个涂覆有涂覆材料的内表面。在一些实施例中，多个隔绝围栏中的每一个的至少一个内表面和多个通道中的每一个都涂覆有涂覆材料。涂覆可以在引入生物微物体之前或之后施加，或者可以与生物微物体同时引入。在一些实施例中，生物微物体可以在包含一种或多种涂层剂的流体介质中输入微流体装置中。在其他实施例中，微流体装置(例如，具有电极活化基板的微流体装置，例如但不限于包括介电泳(DEP)电极的装置)的内表面在将生物微物体引入微流体装置之前可以用包含涂层剂的涂覆溶液处理或“涂底漆”。可以使用任何方便的涂层剂/涂覆溶液，包括但不限于：血清或血清因子、牛血清白蛋白(BSA)、聚合物、去污剂、酶及其任何组合。
基于合成聚合物的涂覆材料。至少一个内表面可包括包含聚合物的涂覆材料。聚合物可以与至少一个表面非共价结合(例如，其可以非特异性地粘附)。聚合物可具有多种结构基序，例如，嵌段聚合物(和共聚物)、星形聚合物(星形共聚物)和接枝或梳形聚合物(接枝共聚物)中发现的所有结构基序，所有这些都可适用于本文公开的方法。多种含亚烷基醚的聚合物可适用于本文所述的微流体装置，包括但不限于诸如
L44、L64、P85和F127(包括F127NF)等
聚合物。合适的涂覆材料的其他示例在US2016/0312165中描述，其内容通过引用整体并入本文。
共价连接的涂覆材料。在一些实施例中，至少一个内表面包括共价连接的分子，其提供适于维持/扩增微流体装置内的生物微物体的有机和/或亲水分子层。共价连接的分子包括连接基团，其中，该连接基团共价连接到微流体装置的一个或多个表面，如下所述。该连接基团还与被配置为提供适于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的表面改性部分连接。
在一些实施例中，被配置成提供适于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的共价连接部分可包括烷基或氟代烷基(包括全氟烷基)部分；单糖或多糖(可包括但不限于葡聚糖)；醇类(包括但不限于炔丙醇)；多元醇，包括但不限于聚乙烯醇；亚烷基醚，包括但不限于聚乙二醇；聚电解质(包括但不限于聚丙烯酸或聚乙烯膦酸)；氨基(包括其衍生物，例如但不限于烷基化胺、羟烷基化氨基、胍基和含有未芳香化的氮环原子的杂环基，例如但不限于吗啉基或哌嗪基)；羧酸，包括但不限于丙炔酸(可提供羧酸盐阴离子表面)；膦酸，包括但不限于乙炔基膦酸(可提供膦酸盐阴离子表面)；磺酸根阴离子；羧基甜菜碱；磺酸甜菜碱；氨基磺酸；或氨基酸。
在各个实施例中，配置成提供适于维持/扩增微流体装置中的生物微物体的有机和/或亲水分子层的共价连接部分可包括非聚合部分，例如烷基部分、氨基酸部分、醇部分、氨基部分、羧酸部分、膦酸部分、磺酸部分、氨基磺酸部分或糖部分。或者，共价连接的部分可包括聚合部分，其可以包括这些部分中的任何一个。
在一些实施例中，微流体装置可以在基部的内表面上具有疏水层，该疏水层包括共价连接的烷基部分。共价连接的烷基部分可以包括形成直链的碳原子(例如，至少10个碳或至少14、16、18、20、22或更多个碳的直链)并且可以是无支链的烷基部分。在一些实施例中，烷基可包括取代烷基(例如，烷基中的一些碳可被氟化或全氟化)。在一些实施例中，烷基可包括连接到第二片段的第一片段，第一片段可包括全氟烷基，第二片段可包括未取代烷基，其中第一片段和第二片段可直接或间接连接(例如，通过醚键的方式)。烷基的第一片段可位于连接基团的远端，并且烷基的第二片段可位于连接基团的近端。
在其他实施例中，共价连接部分可包括至少一个氨基酸，其可包括多于一种类型的氨基酸。因此，共价连接部分可包括肽或蛋白质。在一些实施例中，共价连接部分可包括氨基酸，其可提供两性离子表面以支持细胞生长、活力、可移植性或其任何组合。
在其他实施例中，共价连接的部分还可以包括链霉亲和素或生物素部分。在一些实施例中，改性的生物部分(例如，生物素化的蛋白质或肽)可以被引入承载有共价连接的链霉亲和素的微流体装置的内表面，并经由共价连接的链霉亲和素偶联至表面，从而提供呈现蛋白质或肽的改性的表面。
在其他实施例中，共价连接部分可包括至少一个环氧烷烃部分，并且可包括如上所述的任何环氧烷烃聚合物。一类有用的含亚烷基醚的聚合物是聚乙二醇(PEG Mw<100,000Da)或者聚环氧乙烷(PEO，Mw>100,000)。在一些实施例中，PEG可具有约1000Da、5000Da、10,000Da或20,000Da的Mw。在一些实施例中，PEG聚合物还可以被亲水或带电的部分取代，例如但不限于醇官能度(alcohol functionality)或羧酸部分。
共价连接部分可包括一种或更多种糖。共价连接的糖可以是单糖、二糖或多糖。可以改性共价连接的糖以引入反应性配对部分，其允许偶联或精制以附着于表面。一种示例性的共价连接的部分可以包括葡聚糖多糖，其可以通过未支化的接头(linker)间接地偶联到表面。
提供经调理的表面的涂覆材料可以仅包含一种共价连接部分，或者可以包括多于一种的不同种类的共价连接部分。例如，聚乙二醇调节的表面可以具有共价连接的环氧烷烃部分，其具有指定数量的全部相同的环氧烷烃单元，例如，具有相同的连接基团和与表面的共价附着、相同的总长度和相同数量的环氧烷烃单元。或者，涂覆材料可具有附着于表面的多于一种的共价连接部分。例如，涂覆材料可包括具有共价连接的环氧烷烃部分(具有指定数量的环氧烷烃单元的分子，并且还可包括另一成组的分子，其具有例如连接到具有更多数量的环氧烷烃单元的共价附着的环氧烷烃连接部分的蛋白质或肽的大到部分。不同类型的分子可以以任何合适的比率变化以获得所需的表面特性。例如，具有第一分子和第二分子的混合物的经调理的表面可具有约99：1；约90：10；约75：25；约50：50；约30：70；约20：80；约10：90的第一分子：第二分子的比率或被选择为在这些值之间的任何比率，该第一分子的化学结构具有第一指定数量的环氧烷烃单元，该第二分子包括肽或蛋白质部分，该肽或蛋白质部分可经由生物素/链霉亲和素结合对偶联至共价附着的亚烷基连接部分。在这种情况下，具有不同的、空间要求较低的末端和较少的主链原子的第一组分子可以帮助使整个基板表面功能化，从而防止与构成基板本身的硅/氧化硅、氧化铪或氧化铝的不期望的粘附或接触。第一分子与第二分子的混合物比率的选择还可以调节由承载有肽或蛋白质部分的第二分子引入的表面改性。
经调理的表面特性。各种因素可以改变经调理的表面的物理厚度，例如在基板上形成经调理的表面的方式(例如，气相沉积、液相沉积、旋涂、浸渍和静电涂覆)。在一些实施例中，经调理的表面可以具有约1nm至约10nm的厚度。在一些实施例中，经调理的表面的共价连接部分可在共价连接到微流体装置(其可以包括具有介电泳(DEP)或电润湿(EW)电极的电极活化基板)的表面时形成单层，并且可具有小于10nm的厚度(例如，小于5nm，或约1.5至3.0nm)。这些值与通过旋涂制备的表面的厚度(其通常可具有约30nm的厚度)形成鲜明对比。在一些实施例中，经调理的表面不需要完美形成的单层，以适于在DEP配置的微流体装置内的操作。在其他实施例中，由共价连接的部分形成的经调理的表面可以具有约10nm至约50nm的厚度。
单一或多部分经调理的表面。共价连接涂覆材料可以通过已经含有以下部分的分子的反应来形成，该部分配置成提供适于维持/扩增微流体装置中的生物微物体的有机和/或亲水分子层，并且可以具有式I的结构，如下所示。或者，共价连接涂覆材料可以通过将被配置成提供适于维持和/或扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分偶联至本身已与表面共价连接的表面改性配体而形成为两部分序列，并具有式II的结构。在一些实施例中，表面可以以两部分或三部分序列形成，包括链霉亲和素/生物素结合对，以引入蛋白质、肽或混合的改性表面。
涂覆材料可以共价连接到DEP配置或EW配置的基板的表面的氧化物。涂覆材料可以通过连接基团(“LG”)与氧化物附接，该连接基团可以是由硅氧烷或膦酸基团与氧化物反应形成的甲硅烷氧基或膦酸酯基团。配置成在微流体装置中提供适于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分可以是本文所述的任何部分。连接基团LG可以直接或间接连接到配置成提供适于维持/扩增微流体装置中的生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分。当连接基团LG直接连接到该部分时，不存在任选的接头(“L”)且n为0。当连接基团LG间接连接到该部分时，存在接头L并且n为1。接头L可以具有线性部分，其中线性部分的主链可以包括1至200个选自硅、碳、氮、氧、硫和/或磷原子的任何组合的非氢原子，其受到化学键合限制，如在本领域中已知的。它可以被一个或多个部分的任意组合中断，一个或多个部分可以从醚、氨基、羰基、酰氨基或膦酸酯基团、亚芳基、亚杂芳基和/或杂环基团中选择。在一些实施例中，偶联基团CG表示来自反应部分Rx和反应配对部分Rpx(即，配置为与反应部分Rx反应的部分)的反应的所得基团。CG可以是羧酰胺基、亚三唑基、取代的亚三唑基、甲酰胺基、硫代酰胺基、肟基、巯基、二硫化物、醚或烯基，或可在反应部分与其各自的反应配对部分反应时形成的任何其它合适的基团。在一些实施例中，CG还可以表示链霉亲和素/生物素结合对。
合适的涂覆处理和改性以及制备方法的进一步细节可以在公开号为US2016/0312165(Lowe，Jr.等人)的美国专利申请、公开号为US2017/0173580的美国专利申请(Lowe，Jr.等人)、公开号为WO2017/205830的国际专利申请(Lowe，Jr.等人)和公开号为WO2019/01880的国际专利申请(Beemiller等人)中找到，其每一个所公开的内容通过引用整体并入本文。
微流体装置动力技术。本文所述的微流体装置可以与任何类型的动力技术一起使用。如本文所述，系统的控制和监测设备可以包括动力模块，其用于在微流体装置的微流体回路中选择和移动诸如微物体或液滴之类的物体。动力技术可以包括例如介电泳(DEP)、电润湿(EW)和/或其他动力技术。取决于要移动的物体的类型和其他考虑因素，微流体装置可以具有多种动力配置。返回到图1A，例如，微流体装置100的支撑结构104和/或盖110可以包括DEP电极活化基板，其用于选择性地在微流体回路120中的流体介质180中的微物体上诱导动力，从而选择、捕捉和/或移动单个微物体或成组的微物体。
在一些实施例中，经由一个或多个电极(未示出)在(例如，流动路径中和/或隔绝围栏中的)流体介质180上施加动力以操纵、运送、分离和分类位于其中的微物体。例如，在一些实施例中，对微流体回路120的一个或多个部分施加动力，以便将单个微物体从流动路径106转移到期望的微流体隔绝围栏中。在一些实施例中，动力用于防止隔绝围栏中的微物体从其中移出。此外，在一些实施例中，动力用于根据本公开的实施例将先前收集的微物体从隔绝围栏中选择性地移除。
在一些实施例中，微流体装置被配置为光学致动的电动装置，例如在光电子镊(OET)和/或光-电润湿(OEW)配置的装置中。合适的OET配置的装置(例如，包含光学致动的介电泳电极活化基板)的示例可以包括在以下文献中说明的那些：第RE 44,711号美国专利(Wu等人)(最初作为第7,612,355号美国专利公开)、第7,956,339号美国专利(Ohta等人)、第9,908,115号美国专利(Hobbs等人)和第9,403,172号美国专利(Short等人)，其每一个均通过引用整体并入本文。合适的OEW配置的装置的示例可以包括在以下文献中说明的那些：第6,958,132号美国专利(Chiou等人)和第9,533,306号美国专利申请(Chiou等人)，其每一个均通过引用整体并入本文。包括组合的OET/OEW配置的装置的合适的光学致动的电动装置的示例可以包括在以下文献中说明的那些：公开号为2015/0306598的美国专利申请(Khandros等人)、公开号为2015/0306599的美国专利申请(Khandros等人)和公开号为2017/0173580的美国专利申请(Lowe等人)，其每一个均通过引用整体并入本文。
应当理解，出于简化的目的，图1-5B的各个示例可以示出微流体装置的一部分，而未描绘出其他部分。此外，图1-5B可以是一个或多个微流体系统的一部分，并且可以实现为一个或多个微流体系统。在一个非限制性示例中，图4A和图4B分别示出了具有区域/腔室402的微流体装置400的壳体102的一部分的侧截面图和俯截面图，该区域/腔室402可以是具有更详细结构的流体回路元件的一部分，例如生长室、隔绝围栏(可以与本文所述的任何隔绝围栏类似)、流动区域或流动通道。例如，微流体装置400可以类似于微流体装置100、175、200、300、520或本文所述的任何其他微流体装置。此外，微流体装置400可以包括其他流体回路元件，并且可以是包括如上所述的包括控制和监测设备152的系统的一部分，该控制和监测设备152具有介质模块160、动力模块162、成像模块164、可选的倾斜模块166和其他模块168中的一个或多个。微流体175、200、300、520和本文所述的任何其他微流体装置可以类似地具有针对图1A-1B和4A-4B详细描述的任何特征。
如图4A的示例所示，微流体装置400包括具有底部电极404和覆盖底部电极404的电极活化基板406的支撑结构104以及具有顶部电极410的盖110，顶部电极410与底部电极404间隔开。顶部电极410和电极活化基板406限定区域/腔室402的相对表面。因此，容纳在区域/腔室402中的流体介质180提供顶部电极410和电极活化基板406之间的电阻连接。还示出了电源412，被配置为连接到底部电极404和顶部电极410，并在电极之间产生偏置电压，偏置电压是在区域/腔室402中产生DEP力所需的。电源412可以是例如交流(AC)电源。
在某些实施例中，图4A和图4B中所示的微流体装置200可以具有光学致动的DEP电极活化基板。因此，可以由动力模块162控制的来自光源416的光418的改变图案可以选择性地激活和停用在电极活化基板406的内表面408的区域414处的DEP电极的改变图案。(在下文中，具有DEP电极活化基板的微流体装置的区域414被称为“DEP电极区域”。)如图4B所示，指向电极活化基板406的内表面408的光图案418可以照射为诸如正方形等图案的选定的DEP电极区域414a(以白色示出)。在下文中，未被照射的DEP电极区域414(阴影线)被称为“暗”DEP电极区域414。在每个暗DEP电极区域414处，通过DEP电极活化基板406(即，从底部电极404直到电极活化基板406的与流动区域106中的流体介质180交界的内表面408)的相对电阻抗大于通过区域/腔室402中的流体介质180(即，从电极活化基板406的内表面408到盖110的顶部电极410)的相对电阻抗。但是，在每个被照射的DEP电极区域414a处，被照射的DEP电极区域414a展现出通过电极活化基板406的相对减小的阻抗，其小于通过区域/腔室402中的流体介质180的相对阻抗。
在激活电源412的情况下，前述DEP构造在被照射的DEP电极区域414a和相邻的暗DEP电极区域414之间在流体介质180中产生电场梯度，这又进而产生吸引或排斥流体介质180中的附近的微物体(未示出)的局部DEP力。因此，通过改变从光源416投射到微流体装置400中的光图案418，可以在区域/腔室402的内表面408处的许多不同的这种DEP电极区域414处被选择性地激活和停用吸引或排斥流体介质180中的微物体的DEP电极。DEP力是吸引还是排斥附近的微物体可以取决于诸如电源412的频率和流体介质180和/或微物体(未示出)的介电特性之类的参数。取决于施加到DEP配置的功率的频率以及流体介质(例如，诸如PBS之类的高导电性介质或适合于维持生物细胞的其他介质)的选择，可能产生负DEP力。负DEP力可能排斥微物体，使其远离感应的非均匀电场的位置。在一些实施例中，结合DEP技术的微流体装置可产生负DEP力。
图4B中所示的被照射的DEP电极区域414a的正方形图案420仅是示例。通过投射到微流体装置400中的光418的图案可以照射(并从而激活)任何图案的DEP电极区域414，并且可以通过改变或移动光图案418来重复地改变被照射/激活的DEP电极区域414的图案。
在一些实施例中，电极活化基板406可以包括光电导材料或由光电导材料组成。在这样的实施例中，电极活化基板406的内表面408可以是无特征的。例如，电极活化基板406可以包括包括氢化非晶硅(a-Si：H)层或由其组成。a-Si：H可以包含例如约8％至40％的氢(按100*氢原子数/氢原子和硅原子的总数计算)。a-Si：H层可具有约500nm至约2.0μm的厚度。在这样的实施例中，根据光图案418，DEP电极区域414可以在电极活化基板406的内表面408上的任何地方以任何图案形成。因此，DEP电极区域214的数量和图案不需要是固定的，而是可以对应于光图案418。例如在第RE44,711号美国专利(Wu等人)(最初作为第7,612,355号美国专利公开)中已经描述了具有包括如上所述的光电导层的DEP配置的微流体装置的示例，其全部内容通过引用并入本文。
在其他实施例中，电极活化基板406可以包括基板，该基板包括多个掺杂层、电绝缘层(或区域)和形成半导体集成电路的导电层，诸如在半导体领域中已知的。例如，电极活化基板406可以包括多个光电晶体管，例如包括横向双极光电晶体管，其中每个光电晶体管对应于DEP电极区域414。或者，电极活化基板406可以包括由光电晶体管开关控制的电极(例如，导电金属电极)，每个这样的电极对应于DEP电极区域414。电极活化基板406可以包括这种光电晶体管或光电晶体管控制电极的图案。例如，该图案可以是排列成行和列的基本上正方形的光电晶体管或光电晶体管控制电极的阵列。或者，该图案可以是形成六方点阵的基本上六边形的光电晶体管或光电晶体管控制电极的阵列。不管何种图案，回路元件可以在电极活化基板406的内表面408处的DEP电极区域414与底部电极404之间形成电连接，并且可以由光图案418选择性地激活和停用那些电连接(即，光电晶体管或电极)，如上所述。
具有包括光电晶体管的电极活化基板的微流体装置的示例已经例如在以下文献中进行了描述：第7,956,339号美国专利(Ohta等人)和第9,908,115号美国专利(Hobbs等人)，其全部内容通过引用并入本文。具有包括由光电晶体管开关控制的电极的电极活化基板的微流体装置的示例已经在例如第9,403,172号美国专利(Short等人)中描述，其全部内容通过引用并入本文。
在DEP配置的微流体装置的一些实施例中，顶部电极410是壳体402的第一壁(或盖110)的一部分，并且电极活化基板406和底部电极404是壳体102的第二壁(或支撑结构104)的一部分。区域/腔室402可位于第一壁和第二壁之间。在其他实施例中，电极410是第二壁(或支撑结构104)的一部分，并且电极活化基板406和/或电极410中的一者或两者是第一壁(或盖110)的一部分。此外，光源416可以替代地用于从下方照射壳体102。
利用图4A-4B的具有DEP电极活化基板的微流体装置400，如本文针对图1A所述的控制和监测设备152的动力模块162可以通过将光图案418投射到微流体装置400中来选择区域/腔室402中的流体介质180中的微物体(未示出)，以在围绕并捕捉微物体的图案(例如，正方形图案420)中激活电极活化基板406的内表面408的DEP电极区域414a处的第一组一个或多个DEP电极。然后，动力模块162可以通过相对于微流体装置400移动光图案418来移动原位生成的捕捉的微物体以激活在DEP电极区域414处的第二组一个或多个DEP电极。或者，微流体装置400可以相对于光图案418移动。
在其他实施例中，微流体装置400可以是不依赖于在电极活化基板406的内表面408处的DEP电极的光激活的DEP配置的装置。例如，电极活化基板406可以包括与包括至少一个电极的表面(例如，盖110)相对设置的选择性可寻址和可激励电极。可以选择性地打开和闭合开关(例如，半导体基板中的晶体管开关)，以激活或停用DEP电极区域414处的DEP电极，从而在激活的DEP电极附近的区域/腔室402内的微物体(未示出)上产生净DEP力。取决于诸如电源412的频率和介质(未示出)和/或区域/腔室402中的微物体的介电特性的这样的特性，DEP力可以吸引或排斥附近的微物体。通过选择性地激活和停用成组的DEP电极(例如，在形成正方形图案420的成组的DEP电极区域414处)，区域/腔室402中的一个或多个微物体可被选择并在区域/腔室402内移动。图1A中的动力模块162可以控制这样的开关并因此激活和停用DEP电极中的单独的DEP电极，以选择和移动围绕区域/腔室402的特定微物体(未示出)。具有包括选择性可寻址和可激励电极的DEP电极活化基板的微流体装置在本领域中是已知的，并且已经在第6,294,063号(Becker等)美国专利和第6,942,776号(Medoro)美国专利中描述，其每一个通过引用整体并入本文。
不管微流体装置400是否具有介电泳电极活化基板、电润湿电极活化基板或介电泳和电润湿活化基板两者的组合，电源412均可以用于提供向微流体装置400的电路供电的电势(例如，AC电压电势)。电源412可以与图1A中参考的电源192相同或者是其组件。电源412可以被配置为向顶部电极410和底部电极404提供AC电压和/或电流。对于AC电压，电源412可以提供频率范围和平均或峰值功率(例如，电压或电流)范围，其足以产生足够强的净DEP力(或电润湿力)以选择和移动区域/腔室402中的各个微物体(未示出)，如上所述，和/或改变区域/腔室202中支撑结构104的内表面408的润湿性质，也如上所述。这种频率范围和平均或峰值功率范围在本领域中是已知的。例如参见第6,958,132号美国专利(Chiou等人)、第RE44,711号美国专利(Wu等人)(最初作为第7,612,355号美国专利公布)以及公开号为2014/0124370(Short等人)、2015/0306598(Khandros等人)、US2015/0306599(Khandros等人)以及2017/0173580(Lowe，Jr.等人)的美国专利申请，其每一个的公开内容通过引用整体并入本文。
可以单独地或组合地在微流体装置内利用其他力来移动选择的微物体。微流体通道内的大量流体流动可在流动区域内移动微物体。可以在微流体通道内、隔绝围栏内、或另一种腔室(例如，储存器)内操作的局部流体流也可以用于移动选择的微物体。局部流体流动可用于将选择的微物体从流动区域移出到非流动区域(例如，隔绝围栏)或进行反向操作，即，从非流动区域移入流动区域。局部流动可通过使微流体装置的可变形壁变形来被致动，如第10,058,865号美国专利(Breinlinger等人)所述，其通过引用整体引入本文。
重力可用于将微流体通道中的微物体移入隔绝围栏和/或移出隔绝围栏或其他腔室，如第9,744,533号美国专利(Breinlinger等)所述，其通过引用整体引入本文。重力的使用(例如，通过倾斜微流体装置和/或微流体装置附接到其的支撑件)对于使细胞从流动区域进入隔绝围栏或从隔绝围栏进入流动区域的大量移动是有用的。可以采用磁力来移动包括顺磁性材料的微物体，该微物体可以包括附接到生物微物体或与生物微物体相关联的磁性微物体。替代地或另外地，向心力可用于使微流体通道内的微物体移动，以及使其移入或移出隔绝围栏或微流体装置中的其他腔室。
在移动微物体的另一种替代方案中，激光产生的移动力可用于输出微物体或帮助从隔绝围栏或微流体装置中的任何其他腔室输出微物体，如公开号WO2017/117408的国际专利(Kurz等人)中所描述的，其通过引用整体引入本文。
在一些实施例中，DEP力与其他力结合，诸如流体流动(例如，通道中的整体流体流动或通过微流体装置的可变形表面的变形而致动的局部流体流动、激光产生的移动力和/或重力)，以便在微流体回路120内操纵、运送、分离和分类微物体和/或液滴。在一些实施例中，DEP力可以在其他力之前施加。在其他实施例中，DEP力可以在其他力之后施加。在其他情况下，DEP力可以与其他力同时施加或与其他力交替施加。
系统。返回到图1A，示出了用于操作和控制微流体装置(例如，用于控制微流体装置100)的系统150。电源192可以向微流体装置100提供电功率，根据需要提供偏置电压或电流。电源192可以例如包括一个或多个交流(AC)和/或直流(DC)电压源或电流源。
系统150还可以包括介质源178。介质源178(例如容器、储存器等)可以包括多个部分或容器，每个部分或容器用于容纳不同的流体介质180。因此，如图1A所示，介质源178可以是位于微流体装置100之外并与微流体装置100分离的装置。可替代地，介质源178可全部或部分位于微流体装置100的壳体102内。例如，介质源178可以包括作为微流体装置100的一部分的储存器。
图1A还示出了构成系统150的一部分并且可以与微流体装置100结合使用的控制和监测设备152的示例的简化框图描绘。如图所示，这种控制和监测设备152的示例包括主控制器154，包括用于控制介质源178的介质模块160、用于控制微流体回路120中的微物体(未示出)和/或介质(例如，介质的液滴)的移动和/或选择的动力模块162、用于控制用于捕捉图像(例如数字图像)的成像装置(例如，照相机、显微镜、光源或其任何组合)的成像模块164、以及用于控制微流体装置100的倾斜的可选的倾斜模块166。控制设备152还可以包括用于控制、监测或执行关于微流体装置100的其他功能的其他模块168。如图所示，监测设备152还可以包括显示装置170和输入/输出装置172。
主控制器154可以包括控制模块(CM)156和数字存储器158。控制模块156可以包括例如数字处理器，该数字处理器被配置为根据存储为存储器158中的非暂时性数据或信号的机器可执行指令(例如，软件、固件、源代码等)进行操作。可替代地地或另外地，控制模块156可以包括硬连线数字电路和/或模拟电路。介质模块160、动力模块162、成像模块164、可选的倾斜模块166和/或其他模块168可以类似地进行配置。因此，可以由如上配置的主控制器154、介质模块160、动力模块162、成像模块164、可选的倾斜模块166和/或其他模块168中的任何一个或多个来执行本文所讨论的针对微流体装置100或任何其他微流体装置所执行的功能、过程动作、动作或过程步骤。类似地，主控制器154、介质模块160、动力模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其他模块168可以通信地耦接，以发送和接收本文讨论的任何功能、过程、动作、行动或步骤中所使用的数据。
介质模块160控制介质源178。例如，介质模块160可以控制介质源178以将选定的流体介质180输入到壳体102中(例如，通过入口端口107)。介质模块160还可以控制从壳体102中去除介质(例如，通过输出端口(未示出))。因此可将一个或多个介质选择性地输入到微流体回路120中或从微流体回路120移除。介质模块160还可以控制微流体回路120内的流动路径106的流体介质180的流动。介质模块160还可以向介质源178提供调节气体条件，例如，提供包含5％(或更高)的CO2的环境。介质模块160还可以控制介质源的壳体的温度，例如，为介质源中的饲养细胞提供适当的温度控制。
动力模块。可以被配置为控制微流体回路120中的微物体的选择和移动。微流体装置100的壳体102可以包括一个或多个电动机构，该电动机构包括介电泳(DEP)电极活化基板、光电子镊(OET)电极活化基板、电润湿(EW)电极活化基板和/或光-电润湿(OEW)电极活化基板，其中，动力模块162可以控制电极和/或晶体管(例如，光电晶体管)的激活，以选择和移动流动路径106和/或隔绝围栏124、126、128和130内的微物体和/或液滴。电动机构可以是任何合适的单个或组合机构，如本文描述了在微流体装置中使用的动力技术的段落所述。DEP配置的装置可以包括一个或多个电极，其在微流体回路120中施加足以在微流体回路120中的微物体上施加介电泳力的非均匀电场。OET配置的装置可以包括光可激活的电极，用于经由光诱导的介电泳提供对微流体回路120中的微物体的移动的选择性控制。
成像模块164可以控制成像装置。例如，成像模块164可以接收并处理来自成像装置的图像数据。来自成像装置的图像数据可以包括由成像装置194捕捉的任何类型的信息(例如，微物体的存在或不存在、介质的液滴、标签(诸如荧光标签等)的积聚)。使用由成像装置捕捉的信息，成像模块164可以进一步计算物体(例如，微物体、介质液滴)的位置和/或这些物体在微流体装置100内的运动速率。
成像装置(下面讨论的成像模块164的一部分)可以包括用于捕捉微流体回路120内的图像的装置，例如数码相机。在一些情况下，成像装置还包括具有快速帧速率和/或高灵敏度的检测器(例如，用于低光照应用)。成像装置还可以包括用于将受激辐射和/或光束引导到微流体回路120中并且收集从微流体回路120(或其中容纳的微物体)反射或发射的辐射和/或光束的机构。发射的光束可以在可见光谱中，并且可以例如包括荧光发射。反射光束可以包括源自LED或宽光谱灯(例如汞灯(例如高压汞灯)或氙弧灯)的反射的发射。成像装置可以进一步包括显微镜(或光学系列)，其可以包括或不包括目镜。
支撑结构。系统150还可以包括支撑结构190，被配置为支撑和/或保持包括微流体回路120的壳体102。在一些实施例中，可选的倾斜模块166可以被配置为使支撑结构190活动以使微流体装置100围绕一或多个旋转轴旋转。可选的倾斜模块166可以被配置为将微流体装置100支撑和/或保持在水平方位(即相对于x轴和y轴成0°)、垂直方位(即相对于x轴和/或y轴成90°)或其间的任何方位。微流体装置100(和微流体回路120)相对于轴线的方位在本文中被称为微流体装置100(和微流体回路120)的“倾斜”。例如，支撑结构190可以可选地用于将微流体装置100倾斜(例如，如由可选的倾斜模块166控制的)至相对于x轴倾斜0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、90°或其间的任何角度。当微流体装置以大于约15°的角度倾斜时，可以执行倾斜以产生微物体从流动区域(例如，微流体通道)进入隔绝围栏/从隔绝围栏进入流动区域的大量移动。在一些实施例中，支撑结构190可以以相对于x轴(水平)的0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°或10°的固定角度保持微流体装置100，只要DEP是将微物体从隔绝围栏移出进入微流体通道的有效力即可。由于电极活化基板的表面基本上是平坦的，因此即使当隔绝围栏的与其通向微流体通道的开口相对的远端在垂直方向上比微流体通道设置得位置更低，也可以使用DEP力。
在微流体装置相对于水平倾斜或保持成固定的角度的一些实施例中，微流体装置100可以被设置成一定方位，使得流动路径106的基部的内表面以在水平地通向流动路径的一个或多个隔绝围栏的基部的表面的上方或下方的角度定位。如本文所用，术语“上方”表示流动路径106在由重力限定的垂直轴线上定位成高于一个或多个隔绝围栏(即，位于流动路径106上方的隔绝围栏中的物体将具有比流动区/通道中的物体更高的重力势能)，并且相反，用于将流动路径106定位在一个或多个隔绝围栏下方。在一些实施例中，支撑结构190可以以小于相对于x轴(水平)的约5°、约4°、约3°或约2°的固定角度保持，从而相对于流动路径以较低的势能放置隔绝围栏。在一些其他实施例中，当在微流体装置内进行长期培养(例如，持续超过约2、3、4、5、6、7或更多天)时，在长期培养期中，该装置可以被支撑在培养载体上并且可以以约10°、15°、20°、25°、30°或其间的任何角度的更大的角度倾斜，以将生物微物体保留在隔绝围栏内。在培养期结束时，包含培养的生物微物体的微流体装置可以被返回到系统150内的支撑件190，在该支撑件中，倾斜的角度减小到如上所述的值，从而提供DEP的使用以将生物微物体移出隔绝围栏。在第9,744,533号美国专利(Breinlinger等人)中描述了利用由倾斜引起的重力的其他例子，其全部内容通过引用并入本文。
巢。现在转到图5A，系统150可以包括被配置为保持微流体装置520(其可以类似于微流体装置100、200或本文所述的任何其他微流体装置)的结构(也称为“巢”)500。巢500可以包括能够与微流体装置520(例如，光致动电动装置100、200等)接口并提供从电源192到微流体装置520的电连接的插座502。巢500还可以包括集成的电信号生成子系统504。电信号生成子系统504可以被配置为向插座502提供偏置电压，使得当微流体装置520由插座502保持时，偏置电压被施加在微流体装置520中的一对电极上。因此，电信号生成子系统504可以是电源192的一部分。向微流体装置520施加偏置电压的能力并不意味着当微流体装置520由插座502保持时将始终施加偏置电压。而是，在大多数情况下，将间歇地(例如，仅在需要时)施加偏置电压，以便于微流体装置520中的电动力(例如介电泳或电润湿)的产生。
如图5A所示，巢500可以包括印刷电路板组件(PCBA)522。电信号生成子系统504可以安装在并且电集成到PCBA 522中。示例性支撑件还包括安装在PCBA 522上的插座502。
在一些实施例中，巢500可以包括电信号生成子系统504，其被配置成测量微流体装置520处的放大电压，然后根据需要调整其自己的输出电压，使得微流体装置520处的测量电压是期望值。在一些实施例中，波形放大电路可具有由安装在PCBA 322上的一对DC-DC转换器产生的+6.5V至-6.5V电力供应，从而在微流体装置500处产生高达13Vpp的信号。
在某些实施例中，巢500还包括控制器508，诸如用于感测和/或控制电信号生成子系统504的微处理器。合适的微处理器的示例包括ArduinoTM微处理器，例如ArduinoNanoTM。控制器508可以用于执行功能和分析，或者可以与外部主控制器154(在图1A中示出)通信以执行功能和分析。在图3A所示的实施例中，控制器308通过接口(例如插头或连接器)与(图1A的)主控制器154通信。
如图5A所示，支撑结构500(例如，巢)可以进一步包括热控制子系统506。热控制子系统506可以被配置成调节由支撑结构500保持的微流体装置520的温度。例如，热控制子系统506可以包括帕尔贴(Peltier)热电装置(未示出)和冷却单元(未示出)。在图5A所示的实施例中，支撑结构500包括入口516以及出口518，以接收来自冷却单元的外部储存器(未示出)的冷却流体，将冷却流体引入流体路径514并通过冷却块，然后将冷却流体返回到外部储存器。在一些实施例中，帕尔贴热电装置、冷却单元和/或流体路径514可以安装在支撑结构500的壳体512上。在一些实施例中，热控制子系统506被配置为调节帕尔贴热电成装置的温度，以便实现微流体装置520的目标温度。帕尔贴热电成装置的温度调节可以例如通过诸如PololuTM热电电源(Pololu机器人技术和电子集团)的热电电源来实现。热控制子系统506可以包括反馈电路，诸如由模拟电路提供的温度值。或者，反馈电路可以由数字电路提供。
巢500可以包括串行端口524，其允许控制器508的微处理器经由接口与外部主控制器154通信。另外，控制器508的微处理器可以与电信号生成子系统504和热控制子系统506通信(例如，经由Plink工具(未示出))。因此，通过控制器508、接口和串行端口524的组合，电信号生成子系统504和热控制子系统506可以与外部主控制器154通信。以这种方式，主控制器154尤其可以通过执行用于输出电压调整的缩放计算来辅助电信号生成子系统504。经由耦接到外部主控制器154的显示成装置170提供的图形用户界面(GUI)(未示出)可以被配置为绘制分别从热控制子系统506和电信号生成子系统504获得的温度和波形数据。可替代地或另外地，GUI可以允许更新控制器508、热控制子系统506和电信号生成子系统504。
光学子系统。图5B是具有光学装置510的光学子系统550的示意图，该光学装置510用于对微流体装置520中的微物体进行成像和操纵，该微流体装置520可以是本文所述的任何微流体装置。光学装置510可以被配置为执行微流体装置520的壳体内的一个或多个微物体的成像、分析和操纵。
光学装置510还可以具有第一光源552、第二光源554和第三光源556。第一光源552可以将光传输到结构化光调制器560，该结构化光调制器560可以包括数字镜成装置(DMD)或微型快门阵列系统(MSA)，其中的任一个都可以被配置为接收来自第一光源552的光并且将所接收的光的子组选择性地传输到光学装置510中。或者，结构化光调制器560可以包括产生其自己的光(并因此不需要光源552)的成装置，例如有机发光二极管显示器(OLED)、硅基液晶(LCOS)成装置、铁电液晶硅成装置(FLCOS)或透射式液晶显示器(LCD)。结构化光调制器560可以是例如投影仪。因此，结构化光调制器560能够发射结构化光和非结构化光。在某些实施例中，系统的成像模块和/或动力模块可以控制结构化光调制器560。
在实施例中，当结构化光调制器560包括反射镜时，调制器可以具有多个反射镜。多个反射镜中的每个反射镜可具有约5微米×5微米至约10微米×10微米或其间的任何值的尺寸。结构化光调制器560可以包括2000×1000、2580×1600、3000×2000或其间的任何值的反射镜(或像素)的阵列。在一些实施例中，仅使用结构化光调制器560的照射区域的一部分。结构化光调制器560可以将选定的光的子组传输到第一二向色分束器558，该第一二向色分束器558可以将该光反射到第一镜筒透镜562。
第一镜筒透镜562可具有大的通光孔径，例如，直径大于约40mm至约50mm或更大，从而提供大的视场。因此，第一镜筒透镜5621可具有足够大的孔径以捕捉从结构化光调制器560发出的所有(或基本上所有)光束。
可替代地或附加地，具有约400nm至约710nm的波长的结构化光515可以向微流体装置提供荧光激发照射。
第二光源554可以提供非结构化的明场照射。明场照射光525可以具有任何合适的波长，并且在一些实施例中，可以具有约400nm至约760nm的波长。第二光源554可以将光传输到第二二向色分束器564(其也可以接收来自第三光源556的光535)，并且第二光明场照射525可以从其传输到第一二向色分束器558。然后，第二光明场照射525可以从第一分束器558传输到第一镜筒透镜562。
第三光源556可以通过匹配的对中继透镜(未示出)将光传输到反射镜566。第三光照射535可以从其反射到第二二向色分束器5338，并从其传输到第一分束器5338，并向前延伸到第一镜筒透镜5381。第三照射光535可以是激光，并且可以具有任何合适的波长。在一些实施例中，激光照射535可具有约350nm至约900nm的波长。激光照射535可以被配置为加热微流体装置内的一个或多个隔绝围栏的部分。激光照射535可以被配置为加热流体介质、隔绝围栏的壁或壁的一部分、设置在微流体通道或微流体通道的隔绝围栏中的金属靶、或微流体装置中的光可逆的物理栅栏，并且在公开号为2017/0165667(Beaumont等人)和2018/0298318(Kurz等人)的美国申请中有更详细的描述，其每一个的公开内容通过引用整体并入本文。在其他实施例中，激光照射535可以被配置为启动微流体装置的改性表面的表面改性部分的光裂解或为微流体装置内的隔绝围栏内的微物体提供粘附功能的部分的光裂解。使用激光进行光裂解的更多细节可以在公开号为WO2017/205830的国际申请(Lowe，Jr.等人)中找到，其公开内容通过引用整体并入本文。
来自第一光源、第二光源和第三光源(552、554、5560)的光穿过第一镜筒透镜562，并传输到第三二向色分束器568和滤色镜转换器572。第三二向色分束器568可以反射一部分光，并且通过滤色镜转换器572中的一个或多个滤色镜将光传输到物镜570，该滤色镜转换器572可以是具有可以根据需要切换的多个不同物镜的物镜改变器。某些光(515、525和/或535)可以穿过第三二向色分束器568，并被光束块(未示出)终止或吸收。从第三二向色分束器568反射的光穿过物镜570以照射样品平面574，该样品平面可以是微流体装置520(例如本文所述的隔绝围栏)的一部分。
如图5A所示，巢500可以与光学装置510集成在一起，并且可以作为装置510的一部分。巢500可以提供与壳体的电连接，并且还可以被配置为提供与壳体的流体连通。用户可以将微流体装置520加载到巢500中。在一些其他实施例中，巢500可以是独立于光学装置510的独立组件。
光可以从样品平面574反射和/或发射，以通过物镜570、通过滤色镜转换器572，并且通过第三二向色分束器568回到第二镜筒透镜576。光可以通过第二镜筒透镜576(或成像镜筒透镜576)并从反射镜578反射到成像传感器580。杂散光挡板(未示出)可以放置在第一镜筒透镜562和第三二向色分束器568之间、在第三二向色分束器568和第二镜筒透镜576之间、以及在第二镜筒透镜576和成像传感器580之间。
物镜。光学装置可以包括物镜570，其被专门设计和配置为用于观察和操纵微流体装置520中的微物体。例如，常规的显微镜物镜被设计成观察载玻片上的微物体或通过5mm的水流体(aqueous fluid)观察微物体，而微流体装置520中的微物体在观察平面574内的多个隔绝围栏内部时，其深度为20、30、40、50、60、70、80微米或其间的任何值。在一些实施例中，透明盖520a(例如，具有约750微米的厚度的玻璃或ITO盖)可以被放置在多个隔绝围栏的顶部上，这些隔绝围栏设置在微流体基板520c上方。因此，通过使用常规的显微镜物镜获得的微物体的图像可能具有大的像差(例如，球差和色差)，这会降低图像的质量。光学装置510的物镜570可以被配置为校正光学装置1350中的球差和色差。物镜570可以具有一个或多个可用的放大倍率，例如4X、10X、20X。
照射模式。在一些实施例中，结构化光调制器560可以被配置为调制从第一光源552接收到的光束，并且将作为结构化光束的多个照射光束515传输到微流体装置的壳体中，例如，包含隔绝围栏的区域。结构化光束可以包括多个照射光束。可以选择性地激活多个照射光束以产生多个照射图案。在一些实施例中，结构化光调制器560可以被配置为产生照射图案，类似于针对图4A-4B所描述的，该照射图案可以被移动和调节。光学装置560还可以包括控制单元(未示出)，该控制单元被配置为调节照射图案以选择性地激活基板520c的多个DEP电极中的一个或多个，并产生DEP力以移动微流体装置520内的多个隔绝围栏中的一个或多个微物体。例如，可以随着时间以受控的方式调节多个照射图案，以操纵微流体装置520中的微物体。多个照射图案中的每一个可以被偏移以偏移产生的DEP力的位置，并将结构化光从一个位置移动到另一位置，以便移动微流体装置520的壳体内的微物体。
在一些实施例中，光学装置510可以被配置为使得在视场内的样本平面574中的多个隔绝围栏中的每一个同时聚焦在图像传感器580和结构化光调制器560处。在一些实施例中，结构化光调制器560可以设置在图像传感器580的共轭平面处。在各个实施例中，光学装置510可以具有共焦配置或共焦特性。光学装置510还可以被配置为使得仅流动区域的每个内部区域和/或视场内的样本平面574中的多个隔绝围栏中的每一个被成像到图像传感器580上，以减少整体噪声，从而提高图像的对比度和分辨率。
在一些实施例中，第一镜筒透镜562可以被配置为生成准直光束并且将准直光束传输到物镜570。物镜570可以接收来自第一镜筒透镜562的准直光束并将其聚焦在流动区域的每个内部区域中以及图像传感器580或光学装置510的视场内的样品平面574中的多个隔绝围栏的每一个中。在一些实施例中，第一镜筒透镜562可以被配置为生成多个准直光束并且将多个准直光束传输到物镜570。物镜570可以从第一镜筒透镜562接收多个准直光束并将该多个准直光束会聚在图像传感器580或光学装置510的视场内的样本平面574中的多个隔绝围栏的每一个中。
在一些实施例中，光学装置510可以被配置为利用多个照射点照射隔绝围栏的至少一部分。物镜570可以接收来自第一镜筒透镜562的多个准直光束，并将可以形成照射图案的多个照射点投射到视场内的样本平面574中的多个隔绝围栏的每一个中。例如，多个照射点中的每一个可以具有约5微米×5微米、10微米X10微米、10微米X 30微米、30微米X 60微米、40微米X 40微米、40微米X 60微米、60微米X 120微米、80微米X 100微米、100微米X140微米以及其间的任何值的尺寸。照射点可以分别具有圆形、正方形或矩形的形状。可替代地，照射点可以在多个照射点(例如，照射图案)内被分组以形成较大的多边形形状，例如矩形、正方形或楔形。照射图案可以包围(例如，围绕)可能是正方形、矩形或多边形的未被照射的空间。例如，多个照射点中的每一个可以具有约150至约3000、约4000至约10000或5000至约15000平方微米的面积。照射图案可具有约1000至约8000、约4000至约10000、7000至约20000、8000至约22000、10000至约25000平方微米以及其间的任何值的面积。
光学系统510可用于确定如何将微物体重新定位到微流体装置的隔绝围栏中以及如何将微物体重新定位到微流体装置的隔绝围栏的外部，以及计算存在于装置的微流体回路中的微物体的数量。重新定位和计数微物体的更多细节在以下文献中发现：公开号为2016/0160259的美国申请(Du)、第9,996,920号美国专利(Du等人)和公开号为WO2017/102748的国际申请(Kim等人)。光学系统510也可以用在测定方法中以确定试剂/测定产物的浓度，并且进一步的细节在以下文献中发现：第8,921,055号美国专利(Chapman)、第10,010,882号美国专利(White等人)、第9,889,445号美国专利(Chapman等人)、公开号为WO2017/181135的国际申请(Lionberger等人)、序列号为PCT/US2018/055918的国际申请(Lionberger等人)。如本文所述的适用于在观察和操纵微流体装置内的微物体的系统内使用的光学装置的特征的进一步细节可以在WO2018/102747(Lundquist等人)中找到，其公开内容通过引用整体并入本文。
细胞。能够在本公开的系统和方法中使用的细胞可以是任何类型的植物原生质体。例如，原生质体可以来自用于农业的任何类型的植物。农业植物的非限制性示例包括：大面积作物，例如小麦、玉米、大豆或棉花植物；高价值作物，例如烟草、西红柿、生菜、胡椒或南瓜植物；芸苔属植物，例如西兰花、芥菜、抱子甘蓝、卷心菜、菜花、羽衣甘蓝、大头菜、油菜、大头菜、芜菁或拟南芥植物；观赏性植物，例如，玫瑰、矮牵牛、罂粟、礼来、薰衣草、银草或仙人掌植物；果树、灌木或藤本植物，例如，葡萄、苹果、橙子、草莓、黑莓、蓝莓、覆盆子、李子、丝瓜、杏植物等；或草皮或饲料植物，例如，草或苜蓿植物。获得原生质体的方法是本领域已知的，并且已在例如以下文献中进行了描述：Giles、Kenneth，编辑，PlantProtoplasts:International Review of Cytology(植物原生质体：国际细胞学评论)，第16卷，Academic Press 1983；Yoo等人(2007)，Nature Protocols，第2(7)卷，1565-72；以及Danon(2014)，Bio-Protocol，第4(12)卷，e1149。
在一些实施例中，细胞可以来自在培养中活跃生长的细胞群体或从新鲜的组织样品(例如，通过分离固体组织样品，例如植物叶、茎、根、花、等等)获得。可选地，一个或多个生物细胞可以来自先前冷冻的其他样品的培养物。
取决于实验的特定目标，仅一个或多个细胞可以被引入微流体装置的生长室(例如，隔绝围栏)中以进行培养和/或克隆。当仅一个细胞被引入系统的生长室并根据本文所述的方法孵育时，所得到的扩增群体是最初引入生长室的细胞的克隆集落。
方法。提供了一种用于在包括具有至少一个生长室和流动区域的微流体装置的系统中培养和测定至少一个细胞(特别是植物原生质体)的方法。在具有纳升规模的容积的微流体生长室中培养细胞可以促进原本无法培养的细胞的培养。例如，在1纳升容积的腔室中的单个细胞的有效浓度为1x106细胞/mL。由于腔室的容积很小，释放到培养物中的蛋白质和其他分子可以迅速调节腔室中的介质，从而确保细胞接收到支持细胞活力所需的信号。此外，在具有流动区域的微流体装置的生长室中培养细胞可以允许在选定的时间段内特定地引入营养素、生长因子或其他细胞信号传导物种，以实现对细胞生长、活力或可移植性参数的控制。通过本文描述的方法使得可能的细胞放置/移除以及营养/信号/环境刺激的精确控制难以或不可能通过大规模培养或其他微流体培养方法来实现。
至少一个生物细胞(例如，植物原生质体)可以被引入具有至少一个经调理的表面的生长室，在生长室中，如上所述，经调理的表面支持细胞生长、活力、可移植性或其任何组合。在一些实施例中，经调理的表面支持微流体装置内的细胞可移植性。在一些实施例中，可移植性包括防止细胞对微流体装置的非特异性粘附。至少一个经调理的表面可以是本文所述的任何经调理的表面。经调理的表面可以共价连接到微流体装置。在一些实施例中，经调理的表面可以包括与该表面共价连接的连接基团，并且该连接基团还可以连接到被配置为支持微流体装置中的一个或多个生物细胞的细胞生长、活力、可移植性或其任何组合的部分。在一些实施例中，具有经调理的表面的微流体装置可在导入一个或多个生物细胞之前提供。如本文所述，可以使用许多不同的动力来完成生物细胞的引入，其中一些动力可以允许精确控制将特定生物细胞放置在微流体装置上的特定位置中，例如预先选定的生长室中。
放置后，然后将至少一个生物细胞孵育至少足够长的时间段以使至少一个生物细胞扩增以产生生物细胞集落。当生物细胞(例如，植物原生质体)被引入单独的生长室中时，可以精确地鉴别所得到的扩增集落，以进一步用作可分离的生物细胞群。当仅一个生物细胞被引入生长室并允许其扩增时，所得到的集落是生物细胞的克隆种群。该方法中可以使用任何合适的细胞，包括但不限于如上所述的细胞。
微流体装置可以是本文所述的微流体装置100、300、400、500A-E或600中的任何一个，并且微流体装置可以是具有本文所述的任何组件的系统的一部分。至少一个生长室可以包括多个生长室，并且可以使用本文讨论的任何合适数量的生长室。
引入至少一个生物细胞。在一些实施例中，将至少一个生物细胞(例如，植物原生质体)引入到至少一个生长室中可以包括使用具有足够强度的介电泳(DEP)力来移动至少一个生物细胞。DEP力可以使用电子镊(例如，光电子镊(OET))产生。在一些其他实施例中，将一个或多个生物细胞引入至少一个生长室中可以包括使用流体流动和/或重力(例如，通过倾斜微流体装置以使细胞落入位于细胞下方的生长室中)。
在一些实施例中，至少一个生物细胞(例如，植物原生质体)通过入口端口124被引入微流体装置的流动区域(例如，流动通道)中。流动通道中的介质的流动可以将细胞运送到接近生长室的开口的位置。在处于接近生长室的开口位置之后，然后可以使用本文所述的任何动力(包括介电泳或重力)，将生物细胞移入生长室。介电泳力可以包括电致动力或光学致动力，并且DEP力还可以由光电子镊(OET)提供。至少一个生物细胞可以通过流动通道移动到至少一个生长室的连通区域的近侧开口，其中，连通区域直接通向流动通道/区域并且流体连通到流动通道/区域。至少一个生长室的连通区域也流体连通到至少一个生长室的隔离区域。至少一个生物细胞还可以移动通过连通区域并进入至少一个生长室的隔离区域。至少一个生长室的隔离区域可具有足以支持细胞扩增的尺寸。然而，通常，生长室的尺寸将这种扩增限制为在培养中不超过约1x102、50、25、15甚至少至10个细胞。在一些实施例中，隔离区域可具有足以支持培养中细胞扩增至不超过约1×102、50、25、15或10个细胞的尺寸。令人惊奇地发现，在容积不超过1.5×106立方微米或1.0×106立方微米的隔离区域中可以成功地进行多达约20个或更多个细胞的原生质体的孵育和/或扩增。根据原生质体的类型，细胞直径可能差异很大。因此，具有约5×105立方微米的容积的生长室可以仅允许几个具有大直径(例如，直径约30微米至约50微米)的原生质细胞扩增，而相同的小生长室(容积为约5×105立方微米)可允许具有较小直径(例如，直径约10微米至约30微米)的原生质体更大的扩增。
该方法还可以包括将第一流体介质引入微流体装置的流动区域的微流体通道中。在一些实施例中，在引入至少一个植物原生质体之前进行第一流体介质的引入。当在引入至少一个植物原生质体之前引入第一流体介质时，可以选择流速，以使得第一流体介质以任何合适的速度从微流体装置的流动通道流入生长室。或者，如果微流体装置已经填装有包含有过量的一个或多个调理剂的介质，则第一流体介质以一定速率流入微流体通道，使得第一流体介质替代流动区域中任何剩余的包含有过量的调理剂的介质。
当在将至少一个植物原生质体引入生长室之后引入第一流体介质的流动时，可以选择第一流体介质的流速以不扫掠隔离区域，这将不会使至少一个植物原生质体离开隔离区域。至少一个生长室的隔离区域中围绕至少一个植物原生质体的流体介质是第二流体介质，第二流体介质可以与第一流体介质相同或不同。在一些实施例中，第二流体介质可以与第一流体介质相同，但是在孵育步骤期间，细胞废物和耗尽的介质组分可以使第二流体介质不同于第一流体介质。
孵育细胞。在本文所述的方法中，至少一个植物原生质体被孵育至少足以使细胞扩增以产生生物细胞集落的时间段。该时间段可以被选择为约1天到约14天。在其他实施例中，孵育期可以延长超过14天，并且可以持续任何期望的时段。由于在生长室的隔离区域中的细胞被提供了营养，并且通过流体介质的灌注去除了废物，因此细胞可以无限定地生长。由于隔离区域充满了扩增的细胞群体，因此任何额外的扩增都将导致扩增的植物原生质体居住在生长室的连通区域，该区域是生长室的扫掠区域。灌注的介质可以是适合于培养或维持植物原生质体的任何介质。合适的原生质体介质是本领域已知的。参见例如Giles、Kenneth，编辑，Plant Protoplasts:International Review of Cytology(植物原生质体：国际细胞学评论)，第16卷，Academic Press 1983；Yoo等人(2007)，Nature Protocols，第2(7)卷，1565-72；以及Danon(2014)，Bio-Protocol，第4(12)卷，e1149。
灌注的介质可以将扩增的原生质体扫掠出生长室的连通区域，然后扫掠出微流体装置。因此，存在于生长室的隔离区域中的原生质体的数量可以稳定在最大数量，最大数量取决于原生质体的尺寸和生长室的隔离区域的尺寸。稳定隔离的细胞群体中最大细胞数量的能力提供了优于其他当前可用的细胞培养方法的优势，因为可以消除繁琐的细胞群体分离。
在一些实施例中，孵育可以进行约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更长时间。孵育期的范围可以为约1天至约6天、约1天至约5天、约1天至约4天、约1天至约3天或约1天至约2天。在其他实施例中，孵育可以进行少于约5天、少于约4天、少于约3天或少于约2天。在一些实施例中，孵育可以进行少于约3天或少于约2天。在其他实施例中，孵育可以进行约3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时或约23小时。
在培养步骤期间，可以在整个培养步骤的一个或多个时间点监测至少一个生长室和其中容纳的任何细胞的图像。图像可以存储在系统的处理组件的存储器中。
灌注细胞。在孵育步骤期间，存在于生长室隔离区域内的第二流体介质可能耗尽营养、生长因子或其他生长刺激剂。第二流体介质可积聚细胞废物。另外，随着至少一个细胞(例如，植物原生质体)在孵育期间继续生长，可能需要将营养、生长因子或其他生长刺激剂改变为不同于孵育开始时的第一或第二介质的营养、生长因子或其他生长刺激剂。如本文所述，在微流体装置的生长室中进行培养可以提供引入和改变由至少一个植物原生质体感测到的化学梯度的特异性和选择性能力，化学梯度可以更接近地接近体内条件。或者，将由至少一个生物细胞感测到的化学梯度改变为有目的的非优化条件组可以允许细胞在设计用于探索疾病或治疗途径的条件下扩增。因此，该方法可以包括在孵育步骤期间灌注第一流体介质，其中，经由微流体装置的至少一个入口124引入第一流体介质，并且其中，可选地包括来自第二流体介质的组分的第一流体介质经由微流体装置的至少一个出口输出。
交换第一流体介质的组分，从而提供新鲜的营养、可溶性生长因子等，和/或隔离区域内细胞周围的介质的废物组分的交换基本上在扩散条件下发生在生长室的扫掠区域和未扫掠区域的界面处。令人惊奇地发现，在基本上没有流动的条件下产生有效的交换。因此，令人惊讶地发现，成功的孵育不需要持续的灌注。因此，灌注可以是不连续的。在一些实施例中，灌注是周期性的，而在一些实施例中，灌注是不定期的。灌注循环之间的中断可以具有足够的持续时间，以允许隔离区域中的第二流体介质的组分扩散到流动通道/区域中的第一流体介质中和/或第一流体介质的组分扩散到第二流体介质，而基本上所有第一介质都没有流入隔离区域。
在另一个实施例中，还可以采用低灌注速率来获得在生长室的未扫掠区域内外的流体介质的组分的有效交换。
因此，图6中示出了在微流体装置的至少一个生长室中灌注至少一个生物细胞的一种方法，该方法包括灌注步骤6002，其中，第一流体介质以第一灌注速率R1流入与生长室流体连通的流动区域并持续第一灌注时间D1，而通过微流体装置的流动区域。如本文所述，R1可以选择为未扫掠流速。方法600还包括步骤6004，其中，停止流体介质的流动达第一灌注停止时间S1。重复进行步骤6002和6004W次，其中，W可以是从1到约1000中选择的整数，于是灌注过程700完成。在一些实施例中，W可以是2至约1000的整数。
图7中示出了在微流体装置的至少一个生长室中灌注至少一个生物细胞的另一种方法700，该方法包括第一灌注循环，该第一灌注循环包括步骤7002，其中，使流体介质以第一灌注速率R1流入流体连通到生长室的流动区域、持续第一灌注时间D1而通过微流体装置的流动区域。如本文所述，R1可以被选择为未扫掠流速。第一灌注循环包括停止流体介质的流动达第一灌注停止时间S1的步骤7004。可以重复进行第一灌注循环W次，其中，W是从1到约1000中选择的整数。在完成第一灌注循环的第W次重复之后，方法700还包括第二灌注循环，其包括使第一流体介质以第二灌注速率R2流动达第二灌注时间D2的步骤7006，其中，R2被选择为未扫掠流速。方法700的第二灌注循环还包括使流体介质的流动停止达第二灌注停止时间S2的步骤7008。此后，该方法返回到第一灌注循环的步骤7002和7004，并且重复进行组合的两个周期灌注过程V次，其中，V是1到约5000的整数。可以选择W和V的组合来满足所需的孵育期终点。
在方法600或700的各个实施例中，灌注速率R1可以是如上文针对流量控制器配置所述的流体介质的任何未扫掠流速。在一些实施例中，R1可以为约0.009、0.010、0.020、0.030、0.040、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20，0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.00、1.10、1.20、1.30、1.40、1.50、1.60、1.70、1.80、1.90、2.00、2.10、2.20、2.40、2.50、2.60、2.70、2.80、2.90或3.00微升/秒。
在方法700的各个实施例中，第二灌注速率R2可以是如上文针对流量控制器配置所述的流体介质的任何未扫掠流速。在一些实施例中，R2可以是0.009、0.010、0.020、0.030、0.040、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20，0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.00、1.10、1.20、1.30、1.40、1.50、1.60、1.70、1.80、1.90、2.00、2.10、2.20、2.40、2.50、2.60、2.70、2.80、2.90或3.00微升/秒。流速R1和/或R2可以以任意组合选择。通常，灌注速率R2可以大于灌注速率R1，并且可以是R1的约5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更大。在一些实施例中，R2比R1快至少十倍。在其他实施例中，R2比R1快至少二十倍。在又一个实施例中，R2是R1的速率的至少100倍。
在方法600或700的各个实施例中，第一灌注时间Dl可以是如上文针对流量控制器配置所述的任何合适的灌注持续时间。在各个实施例中，D1可以是约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170或180秒。在其他实施例中，D1可以是时间范围，例如，约10秒至约40秒，如上所述。在一些实施例中，D1可以是约30秒至约75秒。在其他实施例中，D1可以是约100秒。在其他实施例中，D1可以在从约60秒到约150秒的范围内。在其他实施例中，D1可以是约20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、80分钟、90分钟、110分钟、120分钟、140分钟、160分钟、180分钟、200分钟、220分钟、240分钟、250分钟、260分钟、270分钟、290分钟或300分钟。在一些实施例中，D1为约40分钟至约180分钟。
在方法600或700的各个实施例中，第二灌注时间D2可以是如上文针对流量控制器配置所述的任何合适的灌注持续时间。在各个实施例中，D2可以是约5秒、10秒、15秒、20秒、25秒、30秒、35秒、40秒、45秒、50秒、55秒、60秒、65秒、70秒、80秒、90秒或约100秒。在其他实施例中，D2可以是时间范围，例如，约5秒至约20秒，如上所述。在其他实施例中，D2可以是约30秒至约70秒。在其他实施例中，D2可以是约60秒。
在方法600或700的各个实施例中，第一灌注时间D1可以与第二灌注时间D2相同或不同。D1和D2可以以任意组合选择。在一些实施例中，灌注D1和/或D2的持续时间可以被选择为短于停止时间段S1和/或S2。
在方法600或700的各个实施例中，第一灌注停止时间S1可以被选择为如上针对流量控制器配置的灌注时间段之间的时间间隔所述的任何合适的时间段。在一些实施例中，S1可以是约0分钟、5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约60分钟、约65分钟、约80分钟、约90分钟、约100分钟、约120分钟、约150分钟、约180分钟、约210分钟、约240分钟、约270分钟或约300分钟。在各个实施例中，S1可以是如上针对灌注之间的流量控制器配置间隔所述的任何适当的时间范围，例如约20至60分钟。在一些实施例中，S1可以是约10分钟至约30分钟。在其他实施例中，S1可以是约15分钟。在其他实施例中，S1可以是约0秒、5秒、10秒、20秒、30秒、40秒、50秒、60秒、70秒、80秒或约90秒。在一些实施例中，S1为约0秒。
在方法600或700的各个实施例中，第二灌注停止时间S2可以被选择为如上针对流量控制器配置的灌注时间段之间的时间间隔所述的任何合适的时间段。在一些实施例中，S2可以是约0分钟、5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约45分钟、约50分钟、约60、约90分钟、约120分钟、约180分钟、约240分钟、约270分钟或约300分钟。在各个实施例中，S2可以是如上针对灌注之间的流量控制器配置间隔所述的任何适当的时间范围，例如约15至45分钟。在一些实施例中，S2可以为约10分钟至约30分钟。在其他实施例中，S2可以是约8分钟或9分钟。在其他实施例中，S2为约0分钟。
在方法600或700的各个实施例中，第一灌注停止时间S1和第二灌注停止时间S2可以独立地选择为任何合适的值。S1可以与S2相同或不同。
在方法700的各个实施例中，W次重复的次数可以选择与V次重复的次数相同或不同。
在方法600或700的各个实施例中，W可以是约1、约4、约5、约6、约8、约10、约12、约15、约18、约20、约24、约30、约36、约40、约45或约50。在一些实施例中，W可以选择为约1到约20。在一些实施例中，W可以是1。
在方法700的各个实施例中，V可以为约5、约10、约20、约25、约30、约35、约40、约50、约60、约80、约100、约120、约240、约300、约350、约400、约450、约500、约600、约750、约900或约1000。在一些实施例中，V可以选择为约10至约120。V可以为约5至约24。在一些实施例中，V可以为约30至约50或可以为约400至约500。
在方法700的各个实施例中，W次重复的次数可以选择与V次重复的次数相同或不同。
在方法600或700的各个实施例中，灌注的第一步骤(由步骤7002/7004或8002/8004表示)的总时间为约1h至约10h，并且W为整数1。在各个实施例中，灌注的第一步骤的总时间为约9分钟至约15分钟。
在方法700的各个实施例中，灌注循环的第二步骤(由步骤8006/8008表示)的总时间为约1分钟至约15分钟或约1分钟至约20分钟。
在方法600或700中的任何方法中，灌注方法可在生物细胞的整个孵育期间持续进行，例如，持续约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10天或更长时间。
在图7的方法700的另一个非限制性实施例中，控制器可以被配置为在灌注步骤7002期间在具有更长灌注循环D1的流动区域中灌注流体介质。控制器可以以第一速率灌注流体介质持续时段约45分钟、约60分钟、约75分钟、约90分钟、约105分钟、约120分钟、约2.25小时、约2.5小时、约2.45小时、约3.0小时的时间、约3.25小时、约3.5小时、约3.75小时、约4.0小时、约4.25小时、约4.5小时、约4.75小时、约5小时或约6小时。在第一灌注时段D1结束时，流体介质的流动可以停止达停止时间段S1，该停止时间段S1可以为约0秒、15秒、30秒、约45秒、约1分钟、约1.25分钟、约1.5分钟、约2.0分钟、约3.0分钟、约4分钟、约5分钟或约6分钟。在一些实施例中，第一流速R1可以选择为约0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4或约0.5微升/秒。流体介质的流动可以被选择为停止持续小于约1分钟的灌注停止时段S1，或者S1可以是0秒。可选地，S1可以是约30秒、约1.5分钟、约2.0分钟、约2.5分钟或约3分钟。可以使用不同的灌注速率随之进行第二灌注循环D2。在一些实施例中，第二灌注速率可以高于第一灌注速率。在一些实施例中，第二灌注速率R2可以选自约1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.7、1.9、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、6.0、7.0、8.0或约9.0微升/秒。第二灌注循环D2可以是约1秒、约2秒、约3秒、约4秒、约5秒、约6秒、约10秒、约15秒、约30秒、约45秒、约60秒、约65秒、约75秒、约80秒或约90秒。然后可以停止灌注持续第二灌注停止时段S2，该第二灌注停止时段S2可以是约0秒、10秒、约20秒、约30秒、约40秒、约50秒、约60秒、约1.5分钟、约1.75分钟、约2.0分钟、约2.5分钟、约2.75分钟、约3.0分钟或约4.0分钟。在一些实施例中，D1可以是约2小时、约3小时或约4小时。在各个实施例中，D1可以是约4小时。在各个实施例中，S1可以是0秒或小于约一分钟。第二灌注循环D2可以是约1秒至约6秒。在一些实施例中，第二灌注停止时段S2可以是约40秒至约1.5分钟。
因此，提供了一种用于在微流体装置的至少一个生长室中灌注至少一个生物细胞的方法，该方法包括使用包括以下步骤的第一灌注步骤来灌注至少一个生物细胞(例如，植物原生质体)的步骤：使第一流体介质以第一灌注速率R1流过微流体装置的流动区域持续第一灌注时间D1，其中，该流动区域流体连通到生长室，其中，R1被选择为未扫掠流速；停止第一流体介质的流动持续一灌注停止时间S1；以及对第一灌注步骤进行W次重复，其中W是选自1至1000的整数。该方法还可以包括使用包括以下步骤的第二灌注步骤灌注至少一个生物细胞的步骤：使第一流体介质以第二灌注速率R2流动持续第二灌注时间D2，其中，R2被选择为未扫掠流速；停止第一流体介质的流动持续第二灌注停止时间S2；以及对第一灌注步骤以及随之的第二灌注步骤进行V次重复，其中，V是1到1000的整数。
第二灌注速率R2可以大于第一灌注速率R1。第一灌注时间D1可以与第二灌注时间D2相同或不同。第一灌注停止时间S1可以与第二灌注停止时间S2相同或不同。当执行第二灌注步骤时，W次重复的次数可以与V次重复的次数相同或不同。R2可以比R1快至少十倍。可替代地，R2可以比R1快至少二十倍。R2可以比R1快至少100倍。D1可以是约30秒至约75秒。在其他实施例中，D1可以是约40分钟至约180分钟或约180分钟至约300分钟。在一些其他实施例中，D1可以是约60秒至约150秒。S1可以为约10分钟至约30分钟。在其他实施例中，S1可以是约5分钟至约10分钟。在其他实施例中，S1可以为零。在一些实施例中，D1可以是约40分钟至约180分钟，并且S1可以是零。在其他实施例中，D1可以为约60秒至约150秒，并且S1可以为约5分钟至约10分钟。在其他实施例中，D1可以为约180分钟至约300分钟，并且S1可以为零。第一灌注步骤的总时间可以为约1小时至约10小时。在其他实施例中，第一灌注步骤的总时间可以为约2小时至约4小时。在一些实施例中，W可以是大于2的整数。在一些实施例中，W可以是约1至约20。在一些实施例中，D2可以是约10秒至约25秒。在其他实施例中，D2可以是约10秒至约90秒。在一些实施例中，S2可以为约10分钟至约30分钟。在其他实施例中，S2可以是约15分钟。在一些实施例中，V可以为约10至约120。在一些实施例中，V可以为约30至约50或可以为约400至约500。在一些实施例中，D2可以为约1秒至约6秒。S2可以是0秒。在一些实施例中，D2可以是约10秒至约90秒，并且S2可以是约40秒至约1.5分钟。在一些实施例中，第二灌注步骤的一次重复的总时间可以为约1分钟至约15分钟。
调节介质。为了提供维持和增强至少一个植物原生质体的生长和/或活力的介质(例如，第一介质或第二介质)，第一流体介质可以包含液体和气体组分(例如，气体组分可以溶解在液体组分中)。另外，流体介质可以包括其他组分，例如，溶解在液体组分中的生物分子、维生素和矿物质。如技术人员已知的，可以在流体介质中使用任何合适的组分。以上讨论了一些非限制性示例，但是在不脱离本文描述的方法的情况下，可以使用许多其他介质组成。在一些实施例中，流体介质可以包括化学组分确定的介质(至少在接触细胞或包含细胞的流体之前)，并且还可以是无蛋白质或无肽的化学组分确定的介质。
在将第一流体介质引入微流体装置之前，可以通过利用溶解的气态分子使初始流体介质饱和来制备第一流体介质。另外，可以一直利用溶解的气态分子使初始流体介质饱和至到第一流体介质被引入微流体装置中的时间点为止。使初始流体介质饱和可以包括使微流体装置与能够利用溶解的气态分子使初始流体介质饱和的气体环境接触。可以使初始流体介质饱和的气态分子包括但不限于氧气、二氧化碳和氮气。
第一流体介质还可以包括调节第一流体介质的pH。调节第一流体介质的pH可以例如在引入溶解的气态分子之前和/或期间发生。这种调节可以通过添加缓冲物质来实现。合适的缓冲物质的一个非限制性示例是HEPES。其他缓冲物质可以存在于介质中，并且可能取决于或可能不取决于二氧化碳(例如，碳酸缓冲系统)的存在，并且可以由技术人员选择。细胞生长所需的盐、蛋白质、碳水化合物、脂质、维生素和其他小分子也可以形成第一流体介质组成的一部分。
在一些实施例中，在经由入口端口进行引入之前，可以在储存器中执行利用气态组分使第一流体介质饱和。在其他实施例中，通过气态组分使第一流体介质饱和可以在储存器与入口之间的气体可渗透的连接导管中进行。在其他实施例中，利用气态组分使第一流体介质饱和可以经由微流体装置的盖的气体可渗透的部分进行。在一些实施例中，流体介质的气态饱和还包括保持气体交换环境中的湿度，使得微流体装置内的流体介质在孵育期期间不会改变渗透压重量摩尔浓度(osmolality)。
第一流体介质的组分还可包括来自饲养细胞培养物的至少一种分泌组分。分泌的饲养细胞组分可包括生长因子、激素、细胞因子、小分子、蛋白聚糖等。来自饲养细胞培养物中的至少一种分泌组分的引入可以在其中进行利用气态组分使第一流体介质饱和的同一储存器中进行，或者在饱和步骤之前进行来自饲养细胞培养物中的至少一种分泌组分到第一流体介质的引入。
在一些其他实施例中，第一介质的组分还可包括添加剂，其被设计为提供改变的流体介质以测试细胞对添加剂的响应。这样的添加剂可以例如增加或减少细胞活力或生长。
在一些实施例中，该方法可包括在经由至少一个入口引入第一流体介质时检测第一流体介质的pH。检测pH可以在紧邻入口的位置处进行。在一些实施例中，该方法可以包括在经由出口输出第一流体介质时，检测第一流体介质的pH。检测pH可以在紧邻出口的位置处进行。用于检测pH的检测器中的一个或两个可以是光学传感器。在一些实施例中，如果pH偏离可接受的范围，则检测器能够提供警报。在一些其他实施例中，当由检测器测得的pH值偏离可接受的范围时，则可以改变第一流体介质的组分。
在孵育步骤期间，可以监测至少一个生长室和其中容纳的任何细胞的图像。
筛选植物原生质体。可以通过使原生质体与病原体或其片段接触并监测植物原生质体以确定其是否保持活力来针对抗病性筛选植物原生质体。示例性筛选在下面的示例3中以及所列的实施例和权利要求中进行了描述。植物免疫通常在例如以下文献中进行了描述：Boutrot和Zipfel(2017)，Annu.Rev.Phytopathol.55:257-86；Boyd等人(2012)，Trendsin Genetics(遗传学趋势)，第29(4)卷，233-40；以及Smith和Heese(2014)，Plant Methods(植物方法)，第10：6卷。另外，本领域已知病原抗性性状的筛选。参见例如Gomez-Gomez和Boller(2000)，Molecular Cell(分子细胞)，第5：1003-11卷；以及Steuernagel等人(2016)，Nature Biotechnology(自然生物技术)，第34(6)卷，652-655。
输出至少一个生物细胞。孵育步骤完成后，至少一个生物细胞或细胞集落可以输出到生长室或其隔离区域的外部。输出可包括使用足够强的介电泳(DEP)力以移动一个或多个生物细胞/细胞集落。DEP力可以是光学致动的或电子致动的。例如，微流体装置可以包括具有DEP配置的基板，例如，光电子镊(OET)配置。在其他实施例中，可以使用流体流动和/或重力将至少一个生物细胞或细胞集落从生长室或隔离区域输出。在其他实施例中，可以使用生长室或其隔离区域上方的可变形盖区域上的压缩力将至少一个生物细胞或细胞集落从生长室或隔离区域输出，从而引起流体从生长室或隔离区域流出的局部流动。
至少一个生物细胞或细胞集落从生长室或隔离区域输出之后，细胞可从流动区域(例如，通道)输出到微流体装置外。在一些实施例中，从流动区域输出细胞包括使用足够强的DEP力以移动一个或多个生物细胞/细胞集落。如上所述，可以产生DEP力。在一些其他实施例中，将细胞从流动区域输出到微流体装置外包括使用流体流动和/或重力来移动细胞。
在输出步骤期间，可以监测至少一个生长室和其中容纳的任何细胞的图像。
调理至少一个表面。在一些实施例中，微流体装置设置有处于经调理的状态的至少一个生长室的至少一个表面。在其他实施例中，在引入至少一个生物细胞(例如，植物原生质体)之前调理至少一个生长室的表面，并且可以作为培养一个或多个生物细胞的方法的一部分进行。调理表面可以包括利用调理剂(例如，聚合物)处理表面。
在一些实施例中，提供了一种用于处理微流体装置(100、300、400、500A-E和600)的至少一个生长室的至少一个表面的方法，该方法包括以下步骤：使包括过量的调理剂的流体介质流入流动流道(图1A-1C、2、3、4A-C)；孵育微流体装置持续选定的时间段；以及更换通道中的介质。在其他实施例中，一种用于填装微流体装置的方法包括以下步骤：使包含调理剂的填装溶液流入流动通道；孵育装置持续选定的时间段，从而调理生长室的至少一个表面；以及用流体介质替代通道中的溶液。填装溶液可包含本文所述的任何流体介质。替代调理溶液的流体介质或具有过量的调理剂的流体介质可以是本文所述的任何介质，并且可以另外包含细胞。
在一些实施例中，至少一个表面可以通过包括亚烷基醚部分的聚合物调理剂进行处理。具有亚烷基醚部分的聚合物调理剂可包括任何合适的含亚烷基醚的聚合物，包括但不限于上述任何含亚烷基醚的聚合物。在一个实施例中，生长室的表面可以通过两亲性非离子嵌段共聚物进行处理，该两亲性非离子嵌段共聚物包括聚合物链内不同比例和位置的聚环氧乙烷(PEO)和聚环氧丙烷(PPO)亚单元的嵌段(例如，
聚合物)。可用于产生经调理的表面的特定的
聚合物包括L44、L64、P85、F68和F127(包括F127NF)。
在其他实施例中，表面可以通过包括羧基部分的聚合物调理剂进行处理。上面讨论了合适的含羧酸的聚合物调理剂的非限制性示例，因此可以使用任何合适的含羧酸的聚合物调理剂来处理表面。
在其他实施例中，表面可以通过包括糖部分的聚合物调理剂进行处理。上面讨论了合适的含糖聚合物调理剂的非限制性示例，因此可以使用任何合适的含糖聚合物调理剂来处理表面。
在其他实施例中，表面可以通过包括磺酸部分的聚合物调理剂进行处理。上面讨论了合适的含磺酸的聚合物调理剂的非限制性示例，因此可以使用任何合适的含磺酸的聚合物调理剂来处理表面。
在其他实施例中，表面可以通过包括氨基酸部分的聚合物调理剂进行处理。上面讨论了合适的含氨基酸的聚合物调理剂的非限制性示例，因此可以使用任何合适的含氨基酸的聚合物调理剂来处理表面。含氨基酸的聚合调理剂可以包括蛋白质。
在其他实施例中，表面可以通过包括核酸部分的聚合调理剂进行处理。上面讨论了合适的含核酸的聚合物调理剂的非限制性示例，因此可以使用任何合适的含核酸的聚合物调理剂来处理表面。
在一些实施例中，可以使用多于一个的聚合调理剂的混合物来处理生长室的表面。
在其他实施例中，调理包括将生长室的表面加热至约30℃的温度。在一些实施例中，该方法包括将表面加热到至少约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或约35℃的温度。在一些实施例中，该方法包括将表面加热到约25℃的温度。在其他实施例中，该方法包括将表面加热至从约20-30℃、约22℃至约28℃或约24℃至约26℃的范围内的温度。在一些实施例中，该方法包括将表面加热到至少约22℃的温度。在一些实施例中，加热表面包括通过利用聚合物处理该表面来调节的至少一个表面。
克隆群。这里描述的方法还包括其中仅将一个生物细胞(例如，植物原生质体)引入至少一个生长室的方法。提供了一种用于在包括微流体装置的系统中克隆生物细胞的方法，该微流体装置具有被配置为容纳第一流体介质的流动的流动区域；以及包括隔离区域和连通区域的至少一个生长室，该隔离区域与连通区域流体连通，并且连通区域包括通向流动区域的近侧开口，该方法包括以下步骤：将生物细胞引入至少一个生长室，其中，至少一个生长室被配置为具有至少一个经调理以支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的表面；以及将生物细胞孵育至少足以使生物细胞扩增以产生生物细胞的克隆群的时间段。在一些实施例中，该系统可以是本文所述的任何系统。微流体装置可以是本文所述的任何微流体装置。
在克隆生物细胞的方法的一些实施例中，至少一个经调理的表面可以包括与该表面共价连接的连接基团，并且该连接基团可以与被配置为支持微流体装置内的一个或多个生物细胞的细胞生长、活力或可移植性的部分连接。在一些实施例中，连接基团可包括甲硅烷氧基连接基团。在其他实施例中，连接基团可包括膦酸酯连接基团。在一些实施例中，连接基团可以间接连接到被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任何组合的部分。在其他实施例中，连接基团可以直接连接到被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任何组合的部分。连接基团可以经由到接头的连接而间接连接到被配置为支持细胞生长、活力或移动性的部分。在一些实施例中，连接基团可经由到接头的第一端部的连接而间接连接到被配置为支持细胞生长、活力或移动性的部分。在一些实施例中，接头还可包括线性部分，其中，线性部分的主链包含1至200个选自硅、碳、氮、氧、硫和磷原子的任何组合的非氢原子。在一些实施例中，线性部分的主链可包括一个或多个亚芳基部分。在其他实施例中，接头可以包括亚三唑基部分。在一些实施例中，亚三唑基部分可中断接头的线性部分或可在第二端部连接到接头的线性部分。在各个实施例中，被配置为支持细胞生长和/或活力和/或可移植性的部分可包括烷基或氟代烷基(包括全氟烷基)部分；单糖或多糖(可包括但不限于葡聚糖)；醇类(包括但不限于炔丙醇)；多元醇，包括但不限于聚乙烯醇；亚烷基醚，包括但不限于聚乙二醇；聚电解质(包括但不限于聚丙烯酸或聚乙烯膦酸)；氨基(包括其衍生物，例如但不限于烷基化胺、羟烷基化氨基、胍基和含有未芳香化的氮环原子的杂环基，例如但不限于吗啉基或哌嗪基)；羧酸，包括但不限于丙炔酸(可提供羧酸盐阴离子表面)；膦酸，包括但不限于乙炔基膦酸(可提供膦酸盐阴离子表面)；磺酸根阴离子；羧基甜菜碱；磺酸甜菜碱；氨基磺酸；或氨基酸。在一些实施例中，至少一个经调理的表面包括烷基或全氟烷基部分。在其他实施例中，至少一个经调理的表面包括亚烷基醚部分或葡聚糖部分。
在各个实施例中，该方法还可以包括调理至少一个生长室的至少一个表面的步骤。在一些实施例中，调理包括通过一个或多个支持微流体装置内的细胞可移植性的的试剂处理至少一个表面。在一些实施例中，调理可包括通过包括聚合物的调理剂处理至少一个生长室的至少一个表面。在一些实施例中，聚合物可包括亚烷基醚部分。在一些实施例中，聚合物可包括羧酸部分。在一些实施例中，聚合物可包括糖部分。在其他实施例中，聚合物可包括磺酸部分。在其他实施例中，聚合物可包括氨基酸部分。在其他实施例中，聚合物可以包括核酸部分。
在各个实施例中，调理可包括将至少一个生长室的至少一个表面加热至约30℃的温度。
在各个实施例中，该方法还可以包括将第一流体介质引入微流体装置的流动区域的微流体通道中的步骤。在一些实施例中，可在引入生物细胞(例如，植物原生质体)之前引入第一流体介质。在一些实施例中，将生物细胞引入至少一个生长室中可以包括使用具有足够强度的介电泳(DEP)力移动生物细胞。在一些实施例中，DEP力可以是光学致动的。在一些实施例中，DEP力可以由光电子镊(OET)产生。在一些其他实施例中，将生物细胞引入至少一个生长室可以包括使用流体流动和/或重力。
在一些实施例中，将生物细胞引入至少一个生长室中还可以包括将生物细胞引入至少一个生长室的隔离区域中。在一些实施例中，至少一个生长室的隔离区域可具有足以支持细胞扩增至不超过1×102个细胞的尺寸。在一些实施例中，隔离区域可以至少基本上填充有第二流体介质。在一些实施例中，流动区域可以流体连通到至少一个生长室的连通区域的近侧开口，并且进一步地，其中连通区域也可以流体连通到生长室的隔离区域。
在各个实施例中，该方法还可以包括在孵育步骤期间灌注第一流体介质的步骤，其中，第一流体介质可以经由微流体装置的至少一个入口端口引入，并且其中第一流体介质(可选地，包括来自第二流体介质的组分)可以经由微流体装置的至少一个出口输出。在一些实施例中，灌注可以是不连续的。在一些其他实施例中，灌注可以是周期性的。在其他实施例中，灌注可以是不定期的。在一些实施例中，第一流体介质的灌注可以以足以允许隔离区域中的第二流体介质的组分扩散到流动区域中的第一流体介质中和/或第一流体介质的组分扩散到隔离区域中的第二流体介质；并且第一介质可以基本上不流入隔离区域。在一些实施例中，进行第一流体介质的灌注可以约每10分钟至约每30分钟持续约45秒至约90秒的持续时间。在一些实施例中，灌注第一流体介质可以进行约2h至约4h的持续时间。在一些实施例中，至少一种生物细胞被孵育的时间段可以是约1天至约14天，或更长时间。
在一些实施例中，第一流体介质的组分可以包括液体组分和气体组分。在各个实施例中，该方法还可以包括以下步骤：在将第一流体介质引入微流体装置之前，通过溶解的气态分子使第一流体介质饱和。在各个实施例中，该方法还可以包括以下步骤：使微流体装置与能够通过溶解的气态分子使第一流体介质或第二流体介质饱和的气态环境接触。在各个实施例中，该方法还可以包括以下步骤：在引入溶解的气态分子时调节第一流体介质的pH。在一些实施例中，通过气态分子使第一流体介质饱和可以在经由入口端口在储存器中进行，在储存器和入口端口之间的气体可渗透的连接器中进行，或经由微流体装置的盖的气体可渗透的部分进行。在一些实施例中，第一流体介质的组分可以包括来自饲养细胞培养物的至少一个分泌组分。
在各个实施例中，该方法还可以包括在第一流体介质经由至少一个出口输出时检测第一流体介质的pH的步骤。在一些实施例中，检测步骤可以在紧邻至少一个出口的位置处执行。在各个实施例中，该方法还可以包括在第一流体介质经由至少一个入口引入时检测第一流体介质的pH的步骤。在一些实施例中，传感器可以是光学传感器。在各个实施例中，该方法还可以包括改变第一流体介质的组分的步骤。
在各个实施例中，该方法还可以包括监测至少一个生长室和其中容纳的任何细胞的图像的步骤。
在各个实施例中，生物细胞可以是植物细胞，例如原生质体。植物可以是任何类型的植物，例如用于农业的植物，其非限制性示例包括生菜、西红柿、玉米、小麦、烟草等。
在一些实施例中，生物细胞可以是多个生物细胞，并且至少一个生长室是多个生长室。在各个实施例中，该方法还可以包括以下步骤：将不超过多个生物细胞中的一个移动到多个生长室的每一个中。
在克隆生物细胞的方法的一些实施例中，经调理的表面还可以包括可分裂的(cleavable)部分。该方法可以包括在将一个或多个克隆群体的生物细胞从生长室或其隔离区域输出之前分裂可裂解的部分的步骤。
在各个实施例中，该方法还可以包括将克隆群的一个或多个生物细胞输出到生长室或其隔离区域外部的步骤。在一些实施例中，输出可包括使用足够强的介电泳(DEP)力以移动一个或多个生物细胞。在一些实施例中，DEP力是光学致动的。在一些实施例中，DEP力可以由光电子镊(OET)产生。在一些实施例中，输出可以包括使用流体流动和/或重力。在一些实施例中，输出可包括使用生长室或其隔离区域上方的可变形盖区域上的压缩力。在各个实施例中，该方法还可以包括将克隆群的一个或多个生物细胞从流动区域输出到微流体装置外部的步骤。在一些实施例中，输出可包括使用足够强的DEP力来移动一个或多个生物细胞。在一些实施例中，DEP力是光学致动的。在一些实施例中，DEP力可以由光电子镊(OET)产生。在一些实施例中，输出可包括使用流体流动和/或重力。
试剂盒。可以提供试剂盒，用于培养和筛选植物细胞，特别是植物原生质体，其中，试剂盒包括：微流体装置，其具有被配置为容纳第一流体介质的流动的流动区域和至少一个生长室；表面调理剂；和测定剂。在该实施例中，未对至少一个生长室进行预处理以调理至少一个生长室的至少一个表面，并且经调理的表面通过在引入细胞之前通过表面调理剂进行处理来产生。还提供了用于培养植物细胞(例如，植物原生质体)的其他试剂盒，其中，该试剂盒包括：微流体装置，该微流体装置具有被配置为容纳第一流体介质的流动的流动区域以及包括隔离区域和连通区域的至少一个生长室，其中，该隔离区域与该连通区域流体连通，并且该连通区域包括通向流动区域的近侧开口；表面调理剂；以及测定剂，其中，表面调理剂在被应用于微流体装置的内表面时，产生支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的表面。还提供了用于培养和筛选植物细胞(例如，植物原生质体)的其他试剂盒，其包括：微流体装置，其包括被配置为容纳第一流体介质的流动的流动区域以及包括隔离区域和连通区域的至少一个生长室，其中，该隔离区域与该连通区域流体连通，并且该连通区域包括通向流动区域的近侧开口，并且至少一个生长室具有包括共价结合的表面改性配体的至少一个表面；以及表面。可替代地，可以提供用于培养生物细胞的试剂盒，其中，该试剂盒包括：微流体装置，该微流体装置具有被配置为容纳第一流体介质的流动的流动区域以及具有至少一个经调理的表面的至少一个生长室，其中，至少一个经调理的表面可以支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合；以及表面调理剂。任何试剂盒的微流体装置可以是微流体装置100、200、240、290、400、500A-E或600中的任何一个，并具有上述任何特征。
任何试剂盒的微流体装置还可以包括微流体通道，该微流体通道包括至少一部分的流动区域，并且该装置还可以包括生长室，该生长室具有直接通向微流体通道的连通区域。生长室还可以包括隔离区域。隔离区域可以流体连通到连通区域，并且可以被配置成容纳第二流体介质，其中当流动区域和至少一个生长室分别基本上填充有第一流体介质和第二流体介质时，则第二流体介质的组分扩散到第一流体介质中和/或第一流体介质的组分扩散到第二流体介质中；第一介质基本不流入隔离区域。
在任何试剂盒的各个实施例中，可以将生长室配置成类似于图1A-1C，2、3和4A-4C的生长室124、126、128、130、244、246、248或436，其中，生长室的隔离区域的容积可被配置为支撑不超过约1x103、5x102、4x102、3x102、2x102、1x102、50、25、15或10个细胞。在其他实施例中，生长室的隔离区域具有可以支持多达约10、50或1×102个细胞的容积。如上所述的生长室的任何配置都可以在试剂盒的微流体装置的生长室中使用。
在任何试剂盒的各个实施例中，生长室的尺寸可以被配置为维持不超过1x102个生物细胞，其中，生长室的容积可以不超过1x107立方微米。在其他实施例中，其中，可以维持不超过1×102个生物细胞，生长室的容积可以不超过5×106立方微米。在其他实施例中，可以维持不超过50个生物细胞，并且生长室的容积可以不超过1×106立方微米，或者不超过5×105立方微米。在试剂盒中，微流体装置可以具有如上所述的任何数量的生长室。
任何试剂盒的微流体装置还可包括至少一个入口端口和至少一个出口端口，至少一个入口端口被配置为将流体介质(例如，第一流体介质或第二流体介质)输入到流动区域中，至少一个出口端口被配置为在流体介质从流动区域离开时接收流体介质(例如，废第一流体介质)。
任何试剂盒的微流体装置还可包括具有多个DEP电极的基板，其中该基板的表面形成生长室和流动区域的表面。多个DEP电极可以被配置为产生足够强的介电泳(DEP)力，以将一个或多个生物细胞(例如，克隆群)移入生长室或其隔离区域或将生物细胞培养物中的一个或多个细胞移出生长室或其隔离区域。DEP电极，并且因此DEP力可以被光学地致动。这种光学致动的DEP电极可以是虚拟电极(例如，由于入射光而具有增加的导电性的非晶硅基板的区域)、光电晶体管或由对应的光电晶体管接通或断开的电极。替代地，DEP电极，并且因此DEP力可以被电致动。在一些其他实施例中，微流体装置还可以包括具有多个晶体管的基板，其中，基板的表面形成生长室和流动区域的表面。多个晶体管能够产生足够强的介电泳(DEP)力以引入生物细胞或将生物细胞培养物中的一个或多个细胞移出生长室或其隔离区域。多个晶体管中的每一个可以被光学致动，并且DEP力可以由光电子镊产生。
任何试剂盒的微流体装置还可包括在至少一个生长室或其隔离区域上方的可变形盖区域，由此，按下可变形盖区域施加力以将一个或多个生物细胞(例如，克隆群)从生长区域输出到流动区域。
任何试剂盒的微流体装置可以被配置为具有基本上不透气体的盖。替代地，盖的所有部分可以被配置为气体可渗透的。盖的可渗透部分可以对二氧化碳、氧气和氮气中的至少一个是可渗透的。在一些实施例中，盖(或其一部分)可以对于二氧化碳、氧气或氮气中的多于一个的组合是可渗透的。
任何试剂盒还可以包括被配置为容纳流体介质的储存器。储存器可以流体连通到本文描述的任何微流体装置。储存器可以被配置为使得存在于储存器中的流体介质可以与能够通过溶解的气态分子使流体介质饱和的气体环境接触。储存器还可以被配置为容纳与流体介质流体接触的饲养细胞群。
任何试剂盒可以包括至少一个连接导管，被配置为连接到微流体装置的入口端口和/或出口端口。连接导管还可以被配置为连接到储存器或流量控制器(例如，泵组件)。连接导管可以是气体可渗透的。气体可渗透的连接导管可以对二氧化碳、氧气和氮气中的至少一个是可渗透的。在一些实施例中，气体可渗透的导管可以对于二氧化碳、氧气或氮气中的多于一个的组合是可渗透的。
任何试剂盒还可以包括被配置为检测第一流体介质的pH的传感器。传感器可以连接到(或可连接到)微流体装置的入口或附接到其的连接导管。替代地，传感器可以与微流体装置集成在一起。传感器可以被连接到流体介质进入微流体装置的点的近端。该试剂盒可以包括传感器，被配置为检测微流体装置的出口处的流体介质的pH。传感器可以连接到(或可连接到)微流体装置的出口或附接到其的连接导管。替代地，传感器可以与微流体装置集成在一起。传感器可以被连接到流体介质进入微流体装置的点的近端。该试剂盒可以包括传感器，该传感器被配置为检测微流体装置的出口处的流体介质的pH。传感器可以连接到(或可连接到)微流体装置的出口或附接到其的连接导管。替代地，传感器可以与微流体装置集成在一起。传感器可以被连接到流体介质离开微流体装置的点的近端。传感器，无论是否附接到微流体装置的入口和/或出口，都可以是光学传感器。光学传感器可以包括LED和集成的比色(colorimetric)传感器，该集成的比色传感器可以可选地是色敏光电晶体管。该试剂盒还可以包括驱动电子部件以控制pH传感器并从中接收输出。试剂盒还可以包括pH检测试剂。pH检测试剂可以是可以在可见光下检测的pH敏感染料。
任何试剂盒还可以包括具有能够增强微流体装置上的生物细胞活力的组分的培养介质。这些组分可以是本领域已知的任何合适的培养介质组分，包括以上针对流体介质组分所讨论的任何组分。
任何试剂盒还可以包括至少一个试剂，以检测生物细胞或细胞群的状态。被配置为检测细胞状态的试剂在本领域中是众所周知的，并且可以例如用于检测细胞是存活的还是死亡的；筛选例如抗体、细胞因子或生长因子等感兴趣的物质；或者具有感兴趣的细胞表面标记。这样的试剂可以不受限制地在本文所述的试剂盒和方法中使用。
对于本文提供的任何试剂盒，试剂盒的组分可以在单独的容器中。对于溶液中提供的试剂盒的任何组分，组分可以以本公开的方法中使用的浓度的约1X、5X、10X、100X或约1000X的浓度存在。
对于未对微流体装置的至少一个生长室进行预处理以调理至少一个生长室的至少一个表面并且通过利用表面调理剂进行处理来产生经调理的表面的试剂盒，或者对于包括微流体装置和表面调理剂的试剂盒，生长室的表面可以通过表面调理剂进行预调理，上述微流体装置具有被配置为容纳第一流体介质的流动的流动区域和具有至少一个经调理的表面的至少一个生长室，至少一个经调理的表面可以支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合。表面调理剂可包括聚合物，其可以是上述用作表面调理剂的聚合物中的任何一个或多个。在一些实施例中，表面调理剂可包括具有亚烷基醚部分、羧酸部分、磺酸部分、氨基酸部分、核酸部分、糖部分或其任何组合的聚合物。表面调理剂可包括PEO-PPO嵌段共聚物，例如，
聚合物(例如，L44、L64、P85或F127)。
可替代地，用于调理生长室表面的表面调理剂可以包括在试剂盒中，与微流体装置分开。在试剂盒的其他实施例中，预调理的微流体装置与不同于用于调理生长室表面的表面调理剂的表面调理剂包括在一起。不同的表面调理剂可以是以上讨论的任何表面调理剂。在一些实施例中，试剂盒中包括多于一个的表面调理剂。
在具有微流体装置的试剂盒的各个实施例中，其中微流体装置的至少一个生长室尚未经过预处理以调理至少一个表面，该试剂盒还可以包括适合于培养一个或多个生物细胞的培养介质。在一些实施例中，试剂盒还可包括培养介质添加剂，其包括能够补充生长室表面的调理的试剂。培养介质添加剂可以包括如上所述的调理剂或增强至少一个生长室的至少一个表面支持细胞生长、活力、可移植性或其任何组合的能力的另一种化学物质。这可以包括生长因子、激素、抗氧化剂或维生素等。
试剂盒还可以包括被配置为灌注至少第一流体介质的流量控制器，该流量控制器可以是微流体装置的单独的组件，或者可以被并入为微流体装置的一部分。控制器可以被配置为不连续地灌注流体介质。因此，控制器可以被配置为以周期性或不定期方式灌注流体介质。
在另一方面，提供了一种用于培养生物细胞(例如，植物原生质体)的试剂盒，该试剂盒包括：微流体装置，该微流体装置具有被配置为容纳第一流体介质的流动的流动区域以及包括隔离区域和连通区域的至少一个生长室，其中，该隔离区域与该连通区域流体连通，并且该连通区域包括通向流动区域的近侧开口；进一步地，其中至少一个生长室包括用于细胞生长、活力、可移植性或其任何组合的至少一个经调理的表面。微流体装置可以是本文所述的任何微流体装置，并且可以具有本文所述的任何生长室。该微流体装置可以具有具有本文描述的任何种类的DEP配置的基板。可选地，DEP配置可以是光学致动的。微流体装置的基板可以具有包括如本文所述的式1或式2的基板组成的表面，并且具有如上所述的所有特征。
试剂盒的微流体装置的至少一个经调理的表面可以包括糖部分、亚烷基醚部分、氨基酸部分、烷基部分、氟代烷基部分(其可以包括全氟烷基部分)、阴离子部分、阳离子部分和/或两性离子部分。在一些实施例中，微流体装置的经调理的表面可包括糖部分、亚烷基醚部分、烷基部分、氟代烷基部分或氨基酸部分。烷基或全氟烷基部分可以具有大于10个碳的主链长度。在一些实施例中，支持细胞生长、存活力、可移植性或其任何组合的经调理的表面可包括烷基或氟代烷基(包括全氟烷基)部分；单糖或多糖(可包括但不限于葡聚糖)；醇类(包括但不限于炔丙醇)；多元醇，包括但不限于聚乙烯醇；亚烷基醚，包括但不限于聚乙二醇；聚电解质(包括但不限于聚丙烯酸或聚乙烯膦酸)；氨基(包括其衍生物，例如但不限于烷基化胺、羟烷基化氨基、胍基和含有未芳香化的氮环原子的杂环基，例如但不限于吗啉基或哌嗪基)；羧酸，包括但不限于丙炔酸(可提供羧酸盐阴离子表面)；膦酸，包括但不限于乙炔基膦酸(可提供膦酸盐阴离子表面)；磺酸根阴离子；羧基甜菜碱；磺酸甜菜碱；氨基磺酸；或氨基酸。
在试剂盒的一些实施例中，经调理的表面可以包括与微流体装置的表面共价连接的连接基团，并且该连接基团可以与被配置为支持微流体装置内的一个或多个生物细胞的细胞生长、活力、可移植性或其任何组合的部分连接。连接基团可以是甲硅烷氧基连接基团。或者，连接基团可以是膦酸酯连接基团。在试剂盒的一些实施例中，经调理的表面的连接基团可以直接连接到被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任何组合的部分。
在其他实施例中，连接基团可以经由接头而间接连接到被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任何组合的部分。连接基团可以经由到接头的第一端部的连接而间接连接到被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任何组合的部分。接头还可包括线性部分，其中，线性部分的主链包含1至200个选自硅、碳、氮、氧、硫和磷原子的任何组合的非氢原子。在试剂盒的一些实施例中，经调理的表面的接头还亚三唑基部分。可裂解的部分被配置为允许破坏经调理的表面，从而促进生物细胞的可移植性。试剂盒还包括被配置为分裂经调理的表面的可裂解的部分的试剂。
在试剂盒的各个实施例中，试剂盒还可以包括表面调理剂。在一些实施例中，表面调理剂可包括聚合物，该聚合物包括亚烷基醚部分、羧酸部分、磺酸部分、膦酸部分、氨基酸部分、核酸部分或糖部分中的至少一个。在一些其他实施例中，表面调理剂包括聚合物，该聚合物包括亚烷基醚部分、氨基酸部分或糖部分中的至少一个。在一些其他实施例中，经调理的表面可以包括可裂解的部分。
在试剂盒的其他实施例中，表面调理剂包括至少一个细胞粘附阻断分子。在一些实施例中，至少一个细胞粘附阻断分子可以破坏肌动蛋白丝的形成，阻断整联蛋白受体或减少细胞与DNA结垢表面的结合。在一些实施例中，至少一个细胞粘附阻断分子可以是细胞松弛素B、含RGD的肽、DNase1蛋白、纤连蛋白抑制剂或整联蛋白的抗体。在一些实施例中，至少一个细胞粘附阻断分子可以包括多于一种类型的细胞粘附阻断分子的组合。
在试剂盒的各个实施例中，试剂盒还可以包括适合于培养一个或多个生物细胞的培养介质。在一些实施例中，试剂盒可以包括培养介质添加剂，其包括被配置为补充生长室的至少一个表面的调理的试剂。培养介质添加剂可以包括如上所述的调理剂或增强至少一个生长室的至少一个表面支持细胞生长、活力、可移植性或其任何组合的能力的另一种化学物质。这可以包括生长因子、激素、抗氧化剂或维生素等。
在试剂盒的各个实施例中，试剂盒可包括用于检测一个或多个生物细胞的状态的至少一个试剂。
在另一方面，一种用于培养生物细胞的试剂盒，其包括用于培养一个或多个生物细胞的微流体装置，该微流体装置包括被配置为容纳第一流体介质的流动的流动区域；以及包括隔离区域和连通区域的至少一个生长室，其中，该隔离区域与连通区域流体连通，并且连通区域具有通向流动区域的近侧开口；并且至少一个生长室具有至少一个表面，其具有表面改性配体。微流体装置可以是本文所述的任何微流体装置。表面可以包括具有介电泳(DEP)配置的基板。DEP配置可以是本文描述的任何DEP配置。DEP配置可以是光学致动的。基板是具有本文所述的表面改性配体的任何基板，并且可以具有式3的结构，并且可以包括如上所述的所有特征：
在具有微流体装置(其具有包括表面改性配体的至少一个表面)的试剂盒的各个实施例中，表面改性配体可以共价连接到基板的表面的氧化物部分。表面改性配体可包括反应性部分。表面改性配体的反应性部分可以是叠氮基、氨基、溴、硫醇、活化的酯、琥珀酰亚胺基或炔基部分。表面改性配体可经由连接基团共价连接到氧化物部分。在一些实施例中，连接基团可以是甲硅烷氧基部分。在其他实施例中，连接基团可以是膦酸酯部分。连接基团可以经由接头间接连接到表面改性配体的反应性部分。接头可包括线性部分，其中，线性部分的主链包含1至100个选自硅、碳、氮、氧、硫和磷原子的任何组合的非氢原子。在一些实施例中，表面改性配体可包括一个或多个可裂解的部分。一个或多个可裂解的部分可以被配置为允许一旦形成微流体装置的经调理的表面就将其破坏，从而促进培养后一个或多个生物细胞的可移植性。
在具有微流体装置(其具有包括表面改性配体的至少一个表面)的试剂盒的一些实施例中，该试剂盒还可包括调理改性剂，其包括被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任何组合的第一部分和被配置为与表面改性配体的反应性部分反应的第二部分，该表面改性配体可以具有式5的结构，并具有本文所述的任何特征：
第二部分可以被配置为在与试剂盒的微流体装置的表面改性配体的反应性部分反应后时将表面改性配体转变为被配置为支持生长室内的一个或多个生物细胞的细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的的经调理的表面。第一部分可以包括环氧烷烃部分、糖部分；烷基部分、全氟烷基部分、氨基酸部分、阴离子部分、阳离子部分或两性离子部分。在一些实施例中，第一部分可包括烷基或氟代烷基(包括全氟烷基)部分；单糖或多糖(可包括但不限于葡聚糖)；醇类(包括但不限于炔丙醇)；多元醇，包括但不限于聚乙烯醇；亚烷基醚，包括但不限于聚乙二醇；聚电解质(包括但不限于聚丙烯酸或聚乙烯膦酸)；氨基(包括其衍生物，例如但不限于烷基化胺、羟烷基化氨基、胍基和含有未芳香化的氮环原子的杂环基，例如但不限于吗啉基或哌嗪基)；羧酸，包括但不限于丙炔酸(可提供羧酸盐阴离子表面)；膦酸，包括但不限于乙炔基膦酸(可提供膦酸盐阴离子表面)；磺酸根阴离子；羧基甜菜碱；磺酸甜菜碱；氨基磺酸；或氨基酸。第二部分可以是氨基、羧酸、炔、叠氮化物、醛、溴或硫醇部分。在一些实施例中，调理改性剂的第一部分或接头L'(如以上对式5所述)可包括可裂解的部分。可裂解的部分可以被配置成允许破坏经调理的表面，从而促进生物细胞的可移植性。在一些实施例中，试剂盒还可以包括被配置成裂解经调理的表面的可裂解的部分的试剂。
在具有微流体装置(其具有包括表面改性配体的至少一个表面)的试剂盒的一些实施例中，该试剂盒还可包括表面调理剂。
在具有微流体装置(其具有包括表面改性配体的至少一个表面)的试剂盒的一些实施例中，表面调理剂可包括聚合物，该聚合物包括亚烷基醚部分、羧酸部分、磺酸部分、膦酸部分、氨基酸部分、核酸部分或糖部分中的至少一个。在一些其他实施例中，表面调理剂包括聚合物，该聚合物包括亚烷基醚部分、氨基酸部分或糖部分中的至少一个。在一些其他实施例中，经调理的表面可以包括可裂解的部分。
在具有微流体装置(其具有包括表面改性配体的至少一个表面)的试剂盒的一些实施例中，表面调理剂包括至少一个细胞粘附阻断分子。在一些实施例中，至少一个细胞粘附阻断分子可以破坏肌动蛋白丝的形成，阻断整联蛋白受体或减少细胞与DNA结垢表面的结合。在一些实施例中，至少一个细胞粘附阻断分子可以是细胞松弛素B、含RGD的肽、DNase1蛋白、纤连蛋白抑制剂或整联蛋白的抗体。在一些实施例中，至少一个细胞粘附阻断分子可以包括多于一种类型的细胞粘附阻断分子的组合。
在具有微流体装置(其具有包括表面改性配体的至少一个表面)的试剂盒的一些实施例中，该试剂盒还可以包括适合于培养一个或多个生物细胞的培养介质。在一些实施例中，试剂盒还可以包括培养介质添加剂，其包括被配置为补充生长室的至少一个表面的调理的试剂。培养介质添加剂可以包括如上所述的调理剂或增强至少一个生长室的至少一个表面支持细胞生长、活力、可移植性或其任何组合的能力的另一种化学物质。这可以包括生长因子、激素、抗氧化剂或维生素等。
在具有微流体装置(其具有包括表面改性配体的至少一个表面)的试剂盒的一些实施例中，该试剂盒还可包括用于检测一个或多个生物细胞的状态的至少一个试剂。
示例
示例1.葡萄和生菜原生质体在微流体装置中的培养和生长。
系统和微流体装置：该系统包括
仪器(Berkeley Lights，Inc.)和OptoSelectTM3500和1750微流体芯片(Berkeley Lights，Inc)。该仪器包括流量控制器、温度控制器、流体介质调理和泵组件、用于光激活的DEP配置的结构光源、安装台/座和摄像头。微流体芯片包括具有在第一电极上搁置的光电晶体管阵列的基板以及在其内表面上具有ITO电极的盖；硅酮微流体回路材料被夹在基板和盖之间，并且与基板和盖共同限定出微流体回路，该微流体回路包括入口、出口、以及多个微流体通道。OptoSelectTM3500芯片包括约3500个隔绝围栏，每个围栏的容积约为5x105立方微米(即，～0.5nL)；OptoSelectTM1750芯片包括约1750个隔绝围栏，每个围栏的容积约为1.1x106立方微米(即，～1.1nL)。微流体芯片的内表面包括共价连接的聚乙烯(PEG)聚合物的涂层。
首先，根据标准程序制备葡萄原生质体，将其装载到标准原生质体介质中的OptoSelectTM3500微流体芯片中，使用重力(即，通过将微流体芯片直立置于其侧面持续一段时间)将其引入生长室(在这种情况下，为隔绝围栏)，然后在标准原生质体介质中孵育(即，培养)约48小时的时段，并进行连续灌注。原生质体在实验过程中显示出持续的活力，这是通过延时成像确定的，延时成像示出了原生质体中的内部结构的连续运动。图8示出了在实验过程中采集到的葡萄原生质体的明场图像，其中示出了每个隔绝围栏中存在1-3个原生质体。作为重力装载的替代方案，可以使用DEP力(例如，光激活的DEP或OEPTM)将葡萄原生质体装载到隔绝围栏中。
接下来，根据标准程序制备生菜原生质体，将其装载到标准原生质体介质中的OptoSelectTM1750微流体芯片中，使用重力(即，通过将微流体芯片直立置于其侧面持续一段时间)将其引入生长室(在这种情况下，为隔绝围栏)，然后在标准原生质体介质中孵育约14天的时段，并每隔三天间歇性灌注新鲜原生质体介质(包括如下所述的荧光标记的染料)。在培养期间，生菜原生质体用各种染料染色，包括(i)二乙酸荧光素，用于检测细胞活力，(ii)叶绿素染色剂，(iii)荧光增白剂，用于检测细胞壁，以及(iv)赫斯特(Hoechst)，用于检测细胞核。图9示出了在十四天培养期结束时容纳生菜原生质体的两种不同的隔绝围栏的示例性图像，包括用Hoechst、叶绿素染色剂染色的原生质体的明场图像和荧光图像，或具有Hoechst和叶绿素染色剂的合并的图像。如所预期的，荧光素和荧光增白剂染色剂的图像(未示出)揭示出细胞壁重建与活力相关。
作为重力装载的替代方案，进行了生菜原生质体的实验，其中使用DEP力(例如，光激活的DEP或OEPTM)将原生质体装载到隔绝围栏中。使用用于哺乳动物细胞的标准DEP力设置，实现了很高的围栏化百分比(>90％)。此外，DEP围栏化的生菜原生质体的活力相对于重力装载的原生质体没有显示出明显的变化。
在十四天的培养期过程中，生菜原生质体开始粘附到隔绝围栏的表面上。为了从微流体芯片中导出和回收原生质体，将温和的激光处理(即，40％的功率持续400毫秒)应用于隔绝围栏的右上角的基板的表面。激光处理使原生质体脱落，足以允许DEP力用于选择性地输出原生质体克隆并将其从芯片回收。输出后，原生质体克隆可以通过标准方法进行处理，以再生完整的植物。
示例2.对原生质体进行基因分型
基本上如以上示例1中所述，在微流体装置中培养植物原生质体以产生克隆集落。原生质体可以是葡萄原生质体、生菜原生质体或本文所述的任何其他植物原生质体。形成集落后，利用新鲜的培养介质灌注纤维素酶，然后孵育足以允许使原生质体彼此分离(可以目视监测以确认分离)的时间。对于一个或多个选定的原生质体集落(例如，基于活力标记和/或外观进行选择)中的每一个，使用DEP力将集落中的原生质体的子组分别从其对应的隔绝围栏中输出，可选地通过施加激光脉冲进行。然后，通过使包含输出的原生质体的介质从微流体芯片中流出，将输出的细胞在标准的组织培养板中从芯片外回收。处理输出的原生质体以获得核酸(例如，用于转录组分析的RNA和/或用于基因组分析的DNA)，对其进行测序并用于从芯片上残留的集落中对活的原生质体进行基因分型。图10提供了该工作流程的示意图。
示例3.在微流体装置中鉴别抗病性状
基本上如以上示例1中所述，在微流体装置中培养植物原生质体以产生克隆集落。原生质体可以是葡萄原生质体、生菜原生质体或本文所述的任何其他植物原生质体。
在培养原生质体持续第一时间之后，将原生质体暴露于病原体/与病原体接触持续第二时间。病原体可以是病原物本身，例如病毒、细菌细胞、真菌细胞等。或者，病原体可以是病原物中具有触发植物免疫力的能力的一部分。例如，病原体可以是鞭毛蛋白(例如，细菌鞭毛蛋白)、脂多糖(例如，LPS A)、肽聚糖、几丁质蛋白、衣壳蛋白(例如，病毒衣壳蛋白)等。为了使原生质体与病原体接触，病原体流入微流体装置，并允许其扩散到隔绝围栏中，在隔绝围栏中，它可以接触原生质体的表面。可替代地，在发光到微流体装置中之后，可以使用诸如DEP、局部流动等力将病原体主动地移动到隔绝围栏中。病原体的主动运动倾向于与完整的病原物更好地起作用，而病原体的被动运动则倾向于与分子制剂更好地起作用。
在第二时间段期间，监测原生质体活力的变化。可以通过明场观察、荧光活力染色剂(例如，二乙酸荧光素、Hoechst、荧光增白剂、叶绿素染色剂等)来监测活力。如果植物原生质体对病原物具有抗性，则将植物原生质体暴露于病原物将会在原生质体中诱导细胞死亡途径，从而导致活力明显下降。但是，如果原生质体在与病原体接触后仍保持活力，则可以将其输出进行基因分型，以鉴别缺乏病原抗性的遗传起源。基因分型可以集中在例如已知的植物免疫基因上，例如效应子触发的免疫(ETI)基因、效应子触发的易感性(ETS)基因和/或病原体相关分子模式(PAMP)基因，以及可选地，可以基于原生质体暴露的病原体来选择已知的植物免疫基因。
在将原生质体引入微流体装置中之前，可以用诱变剂(例如，化学诱变剂或通过核酸靶向构建体(例如，基因编辑构建体)转染)处理原生质体。或者，可通过使诱变剂流入微流体装置并使隔绝围栏内的原生质体与诱变剂接触(例如，通过允许诱变剂朝向原生质体扩散进入隔绝围栏中)来在芯片上诱变原生质体。
图11提供了用于鉴别抗病性状的前述工作流程的示意图。
本文描述的实施例本质上是示例性的，绝不旨在限制整个说明书中描述的方法和试剂盒的范围。
实施例的列表
实施例1.一种用于培养一个或多个植物原生质体的微流体装置，该装置包括：流动区域，被配置为容纳第一流体介质的流动；以及至少一个生长室，其包括隔离区域和连通区域，所述隔离区域与所述连通区域流体连通，并且所述连通区域包括通向所述流动区域的近侧开口，其中，至少一个生长室还包括至少一个表面，所述至少一个表面被调理为在所述微流体装置中支持细胞生长、活力、可移植性或其任何组合。
实施例2.根据实施例1的微流体装置，其中，至少一个经调理的表面通过所述微流体装置内的支持细胞可移植性的一个或多个试剂被调理。
实施例3.根据实施例1或2的微流体装置，其中，至少一个经调理的表面通过包括亚烷基醚部分的聚合物被调理。
实施例4.根据实施例1-3中任一项的微流体装置，其中，至少一个经调理的表面通过包括糖部分的聚合物被调理。
实施例5.根据实施例1-4中任一项的微流体装置，其中，至少一个经调理的表面通过包括氨基酸部分的聚合物被调理。
实施例6.根据实施例1-5中任一项的微流体装置，其中，所述微流体装置的至少一个经调理的表面通过包括羧酸部分、磺酸部分、核酸部分或膦酸部分的聚合物被调理。
实施例7.根据实施例1至6中任一项的微流体装置，其中，至少一个经调理的表面包括与所述微流体装置的表面共价连接的连接基团，并且其中，所述连接基团与所述微流体装置内被配置为持细胞生长、活力、可移植性或其任何组合的部分连接。
实施例8.根据实施例7的微流体装置，其中，所述连接基团是甲硅烷氧基连接基团。
实施例9.根据实施例7或8的微流体装置，其中，至少一个经调理的表面包括烷基或氟代烷基部分。
实施例10.根据实施例9的微流体装置，其中，烷基或氟代烷基部分具有大于10个碳的主链长度。
实施例11.根据实施例7至10中任一项的微流体装置，其中，所述连接基团经由接头间接连接到被配置为支持细胞生长、活力、可移植性或其任何组合的部分。
实施例12.根据实施例11的微流体装置，其中，接头包括亚三唑基部分。
实施例13.根据实施例1至12中任一项的微流体装置，其中，至少一个经调理的表面包括糖部分。
实施例14.根据实施例1至13中任一项的微流体装置，其中，至少一个经调理的表面包括亚烷基醚部分。
实施例15.根据实施例1至14中任一项的微流体装置，其中，至少一个经调理的表面包括氨基酸部分。
实施例16.根据实施例7至15中任一项的微流体装置，其中，至少一个经调理的表面包括两性离子。
实施例17.根据实施例1至16中任一项的微流体装置，其中，经调理的表面包括可裂解的部分。
实施例18.根据实施例1至17中任一项的微流体装置，其中，所述微流体装置还包括具有介电泳(DEP)配置的基板。
实施例19.根据实施例18的微流体装置，其中，所述DEP配置是光学致动的。
实施例20.根据实施例1至19中任一项的微流体装置，其中，至少一个生长室包括至少一个表面，所述至少一个表面被调理为支持哺乳动物细胞的细胞生长、活力、可移植性或其任何组合。
实施例21.根据实施例1至20中任一项的微流体装置，其中，至少一个生长室包括至少一个表面，所述至少一个表面被调理为支持植物原生质体的细胞生长、活力、可移植性或其任意组合。
实施例22.根据实施例21的微流体装置，其中，所述植物原生质体来自农业植物。
实施例23.根据实施例22的微流体装置，其中，所述植物原生质体来自生菜、西红柿、玉米、小麦或烟草植物。
实施例24.根据实施例1至23中任一项的微流体装置，其中，至少一个生长室包括至少一个表面，所述至少一个表面被调理为支持单个植物细胞和植物细胞的对应的克隆集落的细胞生长、活力、可移植性或其任意组合。
实施例25.一种在微流体装置中培养至少一个植物原生质体细胞的方法，所述微流体装置具有被配置成容纳第一流体介质的流动的流动区域和至少一个生长室，该方法包括以下步骤：将至少一个植物原生质体细胞引入所述至少一个生长室中，其中，所述至少一个生长室被配置为具有至少一个表面，所述至少一个表面被调理为支持细胞的生长、活力、可移植性或其任意组合；以及将所述至少一个植物原生质体细胞孵育一段时间，该段时间至少足够长以扩增所述至少一个植物原生质体细胞来产生植物原生质体细胞集落。
实施例26.根据实施例25的方法，其中，所述微流体装置是实施例1至24中任一项的微流体装置。
实施例27.根据实施例25或26的方法，还包括：调理所述至少一个生长室的至少一个表面。
实施例28.根据实施例27的方法，其中，调理包括用包括聚合物的调理剂处理至少一个生长室的至少一个表面。
实施例29.根据实施例25至28中任一项的方法，其中，将至少一个植物原生质体细胞引入至少一个生长室中包括使用具有足够强度的介电泳(DEP)力来移动至少一个植物原生质体细胞。
实施例30.根据实施例29的方法，其中，所述DEP力是光学致动的。
实施例31.根据实施例25至30中任一项的方法，还包括：在孵育步骤期间灌注第一流体介质，其中，所述第一流体介质经由微流体装置的至少一个入口端口引入，并经由微流体装置的至少一个出口输出，其中，在输出时，所述第一流体介质可选地包括来自第二流体介质的组分。
实施例32.根据实施例25至31中任一项的方法，还包括：在孵育步骤之后裂解经调理的表面的一个或多个可裂解的部分，从而促进将一个或多个植物原生质体细胞从生长室或其隔离区域输出并进入流动区域。
实施例33.根据实施例25至32中任一项的方法，还包括：将一个或多个植物原生质体细胞从所述生长室或其隔离区域输出并进入所述流动区域。
实施例34.根据实施例25至33中任一项的方法，其中，所述原生质体来自生菜、西红柿、玉米、小麦或烟草植物。
实施例35.根据实施例25至34中任一项的方法，其中，将至少一个植物原生质体细胞引入至少一个生长室中包括将单个植物原生质体细胞引入生长室中，并且其中，通过孵育步骤生成的植物原生质体细胞集落是克隆集落。
实施例36.根据实施例25至35中任一项的方法，其中，所述第一流体介质是支持原生质体生长的生长介质。
实施例37.一种鉴别缺乏病原抗性的植物原生质体的方法，该方法包括：将包含一个或多个原生质体的第一流体介质引入微流体装置，所述微流体装置包括具有流动区域和至少一个生长室的壳体；将所述一个或多个原生质体中的第一原生质体移入所述至少一个生长室中的第一生长室中；使所述第一原生质体与病原体接触；以及在所述第一原生质体与所述病原体接触后，在第一时间段期间监测所述第一原生质体的活力，其中，在所述第一时间段结束时原生质体的活力表明所述原生质体缺乏对所述病原体的抗性。
实施例38.根据实施例37的方法，其中，所述一个或多个原生质体来自大面积作物。
实施例39.根据实施例38的方法，其中，所述大面积作物是小麦、玉米、大豆或棉花植物。
实施例40.根据实施例37的方法，其中，所述一个或多个原生质体来自高价值或观赏性作物。
实施例41.根据实施例40的方法，其中，所述高价值作物是西红柿、生菜、胡椒或南瓜植物。
实施例42.根据实施例37的方法，其中，所述一个或多个原生质体来自草皮或饲料植物。
实施例43.根据实施例42的方法，其中，所述草皮或饲料植物是草或苜蓿植物。
实施例44.根据实施例37的方法，其中，所述一个或多个原生质体来自实验植物(例如，拟南芥植物或金鱼草植物)。
实施例45.根据实施例37至44中任一项的方法，其中，所述病原体是植物病原物或从植物病原物衍生的分子。
实施例46.根据实施例45的方法，其中，所述植物病原物是病毒、细菌或真菌细胞。
实施例47.根据实施例45或46的方法，其中，所述病原体是分子剂(例如，病毒衣壳蛋白、鞭毛蛋白、脂多糖、肽聚糖、几丁质蛋白)或其片段。
实施例48.根据实施例37至47中任一项的方法，其中，使所述第一原生质体与所述病原体接触包括使包含所述病原体的第二流体介质流入所述微流体装置的流动区域。
实施例49.根据实施例48的方法，其中，使所述第一原生质体与所述病原体接触还包括将所述病原体移入所述第一生长室的隔离区域中或者允许所述病原体从所述流动区域扩散到所述第一生长室的隔离区域。
实施例50.根据实施例37至49中任一项的方法，其中，所述壳体还包括基部、设置在所述基部上的微流体回路结构以及盖。
实施例51.根据实施例50的方法，其中，所述盖和所述基部是介电泳(DEP)机构的一部分，所述介电泳DEP机构用于选择性地在微物体上感应DEP力，并且其中将所述第一原生质体移入所述第一生长室包括在所述第一原生质体上施加DEP力。
实施例52.根据实施例37至51中任一项的方法，其中，所述微流体装置还包括第一电极、电极活化基板和第二电极，其中，所述第一电极是所述壳体的第一壁的一部分，所述电极活化基板和所述第二电极是所述壳体的第二壁的一部分，其中，所述电极活化基板包括光电导材料、半导体集成电路或光电晶体管，并且其中将所述第一原生质体移入该第一生长室包括在所述第一原生质体上施加DEP力。
实施例53.根据实施例52的方法，其中，所述第一壁是所述盖，并且其中，所述第二壁是所述基部。
实施例54.根据实施例52或53的方法，其中，所述电极活化基板包括光电晶体管。
实施例55.根据实施例50或53的方法，其中，所述盖和/或所述基部对透光的。
实施例56.根据实施例37至55中任一项的方法，其中，所述第一生长室是隔绝围栏，所述隔绝围栏包括隔离区域和所述隔离区域流体连通到所述流动区域的连通区域，并且其中，所述隔离区域是所述微流体装置的未扫掠区域。
实施例57.根据实施例56的方法，其中，所述壳体还包括微流体通道，所述微流体通道包括所述流动区域的至少一部分，其中，所述隔绝围栏的所述连通区域包括进入所述微流体通道的近侧开口和进入所述隔离区域的远侧开口，所述近侧开口的宽度Wcon为约50微米至约150微米，并且其中，所述连通区域从所述近侧开口到所述远侧开口的长度Lcon是所述连通区域的近侧开口的宽度Wcon的至少1.0倍。
实施例58.根据实施例57的方法，其中，所述连通区域从所述近侧开口到所述远侧开口的长度Lcon是所述连通区域的近侧开口的宽度Wcon的至少1.5倍。
实施例59.根据实施例57的方法，其中，所述连通区域从所述近侧开口到所述远侧开口的长度Lcon是所述连通区域的近侧开口的宽度Wcon的至少2.0倍。
实施例60.根据实施例57至59中任一项的方法，其中，所述连通区域的近侧开口的宽度Wcon为约50微米至约100微米。
实施例61.根据实施例57至60中任一项的方法，其中，所述连通区域从所述近侧开口到所述远侧开口的长度Lcon为约50微米至约500微米。
实施例62.根据实施例57至61中任一项的方法，其中，所述微流体通道在所述连通区域的近侧开口处的高度Hch在20微米至100微米之间(例如，在约30微米至60微米之间))。
实施例63.根据实施例57至62中任一项的方法，其中，所述微流体通道在所述连通区域的近侧开口处的宽度Wch在约50微米至约500微米之间(例如，在约100微米至约250微米之间)。
实施例64.根据实施例56至63中任一项的方法，其中，所述隔绝围栏的隔离区域的容积为约5×105至约5×106立方微米。
实施例65.根据实施例56至64中任一项的方法，其中，所述隔绝围栏的隔离区域的容积为约1×106至约2×106立方微米。
实施例66.根据实施例56至65中任一项的方法，其中，所述连通区域的近侧开口平行于所述流动区域中的整体流动的方向。
实施例67.根据实施例37至66中任一项的方法，其中，在所述第一时间段期间监测所述第一原生质体的活力包括监测所述第一原生质体的细胞分裂，并且其中所述第一原生质体的细胞分裂表明所述原生质体缺乏对所述病原体的抗性。
实施例68.根据实施例37-67中任一项的方法，其中，在所述第一时间段期间监测所述第一原生质体的活力包括在所述第一时间段期间将所述微流体芯片维持在约20℃至约30℃(例如，约24℃至约26℃)的温度和/或最小化该第一时间段期间所述第一原生质体被暴露的光量(例如，通过将微流控芯片保持在黑暗环境中或基本阻挡仪器外部的光进入隔绝围栏)。
实施例69.根据实施例37-68中任一项的方法，其中，在所述第一时间段期间监测该第一原生质体的活力包括在所述第一时间段期间周期性地灌注原生质体生长介质通过所述微流体装置的流动区域。
实施例70.根据实施例69的方法，其中，每天不超过一次地灌注(例如，每两、三、四、五、六、七或更多天不超过一次)所述原生质体生长介质通过所述流动区域。
实施例71.根据实施例37至70中任一项的方法，其中，在所述第一时间段期间监测所述第一原生质体的活力包括通过细胞活力染料(例如，二乙酸荧光素(即，FDA)或Hoechst)对所述第一原生质体进行染色。
实施例72.根据实施例37至71中任一项的方法，其中，在所述第一时间段期间监测所述第一原生质体的活力包括通过叶绿素染色剂和/或细胞壁染色剂(例如，荧光增白剂)对所述第一原生质体进行染色。
实施例73.根据实施例37至72中任一项的方法，其中，所述第一时间段为至少12小时。
实施例74.根据实施例74的方法，其中，所述第一时间段是至少24、48、72、96、120小时或更多(例如，7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天或更多)。
实施例75.根据实施例37至74中任一项的方法，还包括：确定所述第一原生质体缺乏对所述病原体的抗性；以及从所述第一生长室和所述微流体装置输出所述第一原生质体。
实施例76.根据实施例37至75中任一项的方法，还包括：确定所述第一原生质体缺乏对所述病原体的抗性；以及对所述第一原生质体的一个或多个抗病基因进行测序。
实施例77.根据实施例37-76中任一项的方法，还包括：确定所述第一原生质体缺乏对所述病原体的抗性；以及对所述第一原生质体的转录组进行测序。
实施例78.根据实施例37至77中任一项的方法，还包括：确定所述第一原生质体缺乏对所述病原体的抗性；以及对所述第一原生质体的基因组进行测序。
实施例79.根据实施例76至78中任一项的方法，还包括：鉴别与缺乏病原抗性相关联的一个或多个抗病基因、转录组和/或基因组中的分子变化或缺陷的序列。
实施例80.根据实施例37至79中任一项的方法，该方法还包括：将至少一个原生质体移入所述微流体装置中的多个生长室的每一个中；以及对移入所述多个生长室中的每个原生质体进行该方法的其余步骤。
实施例81.一种用于针对抗病性状筛选植物原生质体的试剂盒，所述试剂盒包括：微流体芯片，其中，所述微流体芯片包括具有流动区域和至少一个生长室的壳体；以及试剂，用于检测该植物原生质体的活力。
实施例82.根据实施例81的试剂盒，包括表面调理剂。
实施例83.根据实施例81或82的试剂盒，还包括调理改性剂，并且其中所述生长室的至少一个表面包括表面改性配体。
实施例84.根据实施例81或82的试剂盒，其中，所述生长室的至少一个表面包括共价连接的涂覆材料。
实施例85.根据实施例81至84中任一项的试剂盒，其中，用于检测植物原生质体的活力的试剂是荧光染色剂(例如，二乙酸荧光素(FDA)、Hoechst、荧光增白剂、叶绿素染色剂等)。
Claims (49)
1.一种鉴别缺乏病原抗性的植物原生质体的方法，所述方法包括：
将包含一个或多个原生质体的第一流体介质引入微流体装置，所述微流体装置包括具有流动区域和至少一个生长室的壳体；
将所述一个或多个原生质体中的第一原生质体移入所述至少一个生长室中的第一生长室中；
使所述第一原生质体与病原体接触；以及
在使所述第一原生质体与所述病原体接触之后，在第一时间段期间监测所述第一原生质体的活力，
其中，所述第一时间段结束时的原生质体活力表明所述原生质体缺乏对所述病原体的抗性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一个或多个原生质体来自大面积作物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述大面积作物是小麦、玉米、大豆或棉花植物。
4.根据权利要求1的方法，其中，所述一个或多个原生质体来自高价值作物或观赏性作物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述高价值作物是西红柿、生菜、胡椒或南瓜植物。
6.根据权利要求1的方法，其中，所述一个或多个原生质体来自草皮或饲料植物。
7.根据权利要求6的方法，其中，所述草皮或饲料植物是草或苜蓿植物。
8.根据权利要求1的方法，其中，所述一个或多个原生质体来自实验植物。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述病原体是植物病原物或从植物病原物衍生的分子。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述植物病原物是病毒、细菌或真菌细胞。
11.根据权利要求9所述的方法，其中，所述病原体是分子药剂或分子药剂的片段。
12.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，使所述第一原生质体与所述病原体接触包括使包含所述病原体的第二流体介质流入所述微流体装置的所述流动区域。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，使所述第一原生质体与所述病原体接触还包括将所述病原体移入所述第一生长室的隔离区域中或者允许所述病原体从所述流动区域扩散到所述第一生长室的隔离区域。
14.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述壳体还包括基部、设置在所述基部上的微流体回路结构以及盖。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述盖和所述基部是介电泳DEP机构的一部分，所述介电泳DEP机构用于选择性地在微小物体上感应DEP力，并且其中将所述第一原生质体移入所述第一生长室包括在所述第一原生质体上施加DEP力。
16.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述微流体装置还包括第一电极、电极活化基板和第二电极，其中，所述第一电极是所述壳体的第一壁的一部分，并且所述电极活化基板和所述第二电极是所述壳体的第二壁的一部分，其中，所述电极活化基板包括光电导材料、半导体集成电路或光电晶体管，并且其中将所述第一原生质体移入所述第一生长室包括在所述第一原生质体上施加DEP力。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述第一壁是盖，并且其中，所述第二壁是基部。
18.根据权利要求16所述的方法，其中，所述电极活化基板包括光电晶体管。
19.根据权利要求16所述的方法，其中，所述盖和/或所述基部透光。
20.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述第一生长室为隔绝围栏，所述隔绝围栏包括隔离区域和连通区域，所述连通区域将所述隔离区域流体连通到所述流动区域，并且其中，所述隔离区域是所述微流体装置的未扫掠区域。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述壳体还包括微流体通道，所述微流体通道包括所述流动区域的至少一部分，其中，所述隔绝围栏的所述连通区域包括通往所述微流体通道的近侧开口和通往所述隔离区域的远侧开口，所述近侧开口的宽度Wcon为约50微米至约150微米，并且其中，所述连通区域从所述近侧开口到所述远侧开口的长度Lcon是所述连通区域的所述近侧开口的宽度Wcon的至少1.0倍。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述连通区域从所述近侧开口到所述远侧开口的长度Lcon是所述连通区域的所述近侧开口的宽度Wcon的至少1.5倍。
23.根据权利要求21所述的方法，其中，所述连通区域从所述近侧开口到所述远侧开口的长度Lcon是所述连通区域的所述近侧开口的宽度Wcon的至少2.0倍。
24.根据权利要求21所述的方法，其中，所述连通区域的所述近侧开口的宽度Wcon为约50微米至约100微米。
25.根据权利要求21所述的方法，其中，所述连通区域从所述近侧开口到所述远侧开口的长度Lcon在约50微米至约500微米之间。
26.根据权利要求21所述的方法，其中，所述微流体通道在所述连通区域的所述近侧开口处的高度Hch在20微米至100微米之间。
27.根据权利要求21所述的方法，其中，所述微流体通道在所述连通区域的所述近侧开口处的宽度Wch在约50微米至约500微米之间。
28.根据权利要求20所述的方法，其中，所述隔绝围栏的所述隔离区域的容积为约5×105至约5×106立方微米。
29.根据权利要求20所述的方法，其中，所述隔绝围栏的所述隔离区域的容积为约1×106至约2×106立方微米。
30.根据权利要求20所述的方法，其中，所述连通区域的所述近侧开口平行于所述流动区域中的整体流动的方向。
31.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，在所述第一时间段期间监测所述第一原生质体的活力包括监测所述第一原生质体的细胞分裂，并且其中所述第一原生质体的细胞分裂表明所述原生质体缺乏对所述病原体的抗性。
32.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，在所述第一时间段期间监测所述第一原生质体的活力包括：在所述第一时间段期间将微流体芯片维持在约20℃至约30℃的温度，和/或最小化所述第一时间段期间所述第一原生质体的曝光量。
33.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，在所述第一时间段期间监测所述第一原生质体的活力包括：在所述第一时间段期间周期性地灌注原生质体生长介质通过所述微流体装置的流动区域。
34.根据权利要求33所述的方法，其中，每三天不超过一次地灌注所述原生质体生长介质通过所述流动区域。
35.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，在所述第一时间段期间监测所述第一原生质体的活力包括：通过细胞活力染料对所述第一原生质体进行染色。
36.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，在所述第一时间段期间监测所述第一原生质体的活力包括：通过叶绿素染色剂和/或细胞壁染色剂对所述第一原生质体进行染色。
37.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述第一时间段为至少12小时。
38.根据权利要求37所述的方法，其中，所述第一时间段为至少96小时。
39.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，还包括：
确定所述第一原生质体缺乏对所述病原体的抗性；以及
从所述第一生长室和所述微流体装置输出所述第一原生质体。
40.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，还包括：
确定所述第一原生质体缺乏对所述病原体的抗性；以及
对所述第一原生质体的一个或多个抗病基因进行测序。
41.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，还包括：
确定所述第一原生质体缺乏对所述病原体的抗性；以及
对所述第一原生质体的转录组进行测序。
42.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，还包括：
确定所述第一原生质体缺乏对所述病原体的抗性；以及
对所述第一原生质体的基因组进行测序。
43.根据权利要求40所述的方法，还包括：
鉴别如下序列中的分子变化或缺陷：与缺乏病原抗性相关联的一个或多个抗病基因、转录组和/或基因组的序列。
44.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，所述方法还包括：
将至少一个原生质体移入所述微流体装置中的多个生长室的每一个中；以及
对移入所述多个生长室中的每个原生质体进行所述方法的其余步骤。
45.一种用于针对抗病性状筛选植物原生质体的试剂盒，所述试剂盒包括：
微流体芯片，其中，所述微流体芯片包括具有流动区域和至少一个生长室的壳体；以及
试剂，用于检测所述植物原生质体的活力。
46.根据权利要求45所述的试剂盒，还包括表面调理剂。
47.根据权利要求45所述的试剂盒，还包括调理改性剂，并且其中所述生长室的至少一个表面包括表面改性配体。
48.根据权利要求45所述的试剂盒，其中，所述生长室的至少一个表面包括共价连接的涂覆材料。
49.根据权利要求45至48中任一项所述的试剂盒，其中，用于检测所述植物原生质体的活力的所述试剂是荧光染色剂。
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