CN103180453A - 高通量鉴别对抗病原体的微生物拮抗剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及筛选生物样品以鉴别具有作为生物防治剂的潜在效用的微生物的高通量方法。所述方法包括例如使用多重测试平台来同时鉴别具有生物防治活性的微生物，包括适用于改善植物、动物和人类健康的微生物。具体来说，本发明提供适合于鉴别在对抗由植物病原体引起的疾病中具有潜在应用的微生物的筛选方法。本公开还提供通过本文公开的筛选方法鉴别的具有生物防治活性的微生物。

Description

高通量鉴别对抗病原体的微生物拮抗剂的方法

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以下以.txt格式提交的序列表的内容以引用的方式全部并入本文。文件名称：“SGI1480-1WO_ST25.txt”，记录日期：2011年10月25日，大小：1.48KB。

发明领域

本发明涉及筛选生物样品的高通量方法。更具体来说，本公开涉及同时鉴别具有生物防治活性的微生物，包括适用于改善植物、动物和人类健康的微生物，特别是针对植物病原体具有拮抗活性的微生物。

发明背景

植物和动物的致病性感染，如真菌感染，在全世界引起生产能力的显著损失。例如，大量植物有害生物，包括有害昆虫、寄生杂草、真菌和细菌病原体，是对农产品造成严重损失和损害的其中最重要的生物因子。在全世界，农作物的致病性疾病引起的损失据估算达到约12%，并且由食品腐败造成的收获后损失据估算在10%与50%之间。仅在美国，这些数字据估算分别为12%和9%。在各种致病性疾病中，种传病原体和土传病原体常在农业和园艺行业造成严重经济损失。除农业外，致病性疾病还可以在湿地、森林或其它天然环境中以及其它植物系统中造成整株植物破坏。

已采用多种不同策略来应对和防治植物病原体。除良好的农艺学和栽培措施外，种植者通常严重依赖于化学农药的应用。实际上，防治病原体的化学农药在本领域中为众所周知的并且已在植物和动物的工业化生产中广泛使用多年。预防性和/或治疗性处理动物和植物的真菌和细菌感染的方法通常涉及应用抗真菌和抗细菌农化产品。然而，在农业领域化学品的广泛使用由于对环境和人体健康的潜在有害影响已获得越来越多的公众关注和审视。实际上，在农药的全部益处之外，还经常报道农化品潜在损害非目标生物体，如人、牲畜、野生生物和其它活生物体。包括出现农药抗体病原体在内的与农药使用相关的其它问题已导致逐渐排除和淘汰一些可用的农药。除上述问题外，天然生态系统中植物病原性疾病的传播可能因化学品应用所不得不应用的规模而妨碍化学品的成功应用。在近数十年，越来越多地认识到使用农药对环境和人体健康的影响已促成努力减少对利用化学方法来防治不希望的有害生物的依赖。另外，当前对使用化学农药存在严格的管理，并且某些政治压力也旨在将危害最大的化学品从市场上清除出去。因此，一些化学公司因与登记过程和成本相关的顾虑而越来越不愿意开发和测试新的化学品。

因此，对开发用于防治植物致病性疾病的非化学替代方法存在明显需要。例如，植物病原体的生物防治已越来越视为一种可行的防治植物疾病的替代方法。特别是，使用生物活性剂来防治植物有害生物和致病性疾病对于可能不需要使用合成化学品来应对有害生物的认证有机种植者来说已变得特别重要。

作为生物防治剂，已报道若干种对抗植物病原体的微生物。在过去数十年已出版了大量关于使用包含各种对抗植物病原体的酵母菌株或其它微生物的组合物的文件。已使用用微生物拮抗剂接种植物的方法针对若干种农作物的数种常见真菌变异体获得了良好结果。例如，已使用微生物拮抗剂来抑制番茄花叶病、针叶树的根和干基腐病、栗树疫病、柑橘腐根病和若干种作物的冠瘿病。在多种情况下，用微生物拮抗剂包覆了的作物种子显示病原体感染减少和植物生长增强。另外，通过使用拮抗性真菌和细菌可以防治数种收获后真菌疾病。收获后生物防治的一个实例是抑制储存时桃的褐腐病，这可以通过在包装过程中使用的蜡中并入拮抗性细菌枯草杆菌(Bacillus subtilis)在模拟商业条件下达成。

不幸的是，对于大多数变异体当前并不能获得有效的生物防治技术。尽管生物防治的概念很有吸引力，但仍对具有新颖生物防治能力的新颖微生物存在迫切需要。在一定程度上，这一需要是受到快速出现的对化学农药具有抗体的病原体菌株或农化农药使用受到限制驱使。此外，有害生物防治应用的广泛实施存在各种障碍，包括在自然环境中存在病原体的复杂混合物。另外，在其整个生命周期中，植物、微生物和病原体以多种多样的方式彼此相互作用。这些复杂的相互作用可以各种方式显著地影响这些生物体各自的发展。此外，植物病原体，尤其是真菌病原体极其多样并且其致病性对于不同的植物宿主也不同。另外，主要归因于生物防治剂在田间的不同环境条件下的性能不同，因此生物防治剂的商业性使用和应用的发展已变慢。因此，虽然生物防治的概念很有吸引力，但该技术仅在有限的情况下得到应用。

为了克服以上所论述的问题和限制，并且为了将生物防治技术应用于田间和提高生物防治剂的商业化，开发具有较高程度的稳定性和存活期的生物防治微生物的新型制剂是有必要的。出于此目的，有必要寻找具有不同作用模式的新型和新颖的生物防治微生物。实际上，由于生物防治依赖于微生物，所以需要鉴别出具有适于任务的生物化学和生理学特征的其它微生物。

为应对产生更具商业可行性的生物防治解决方案的压力，学术界和行业内的许多实验室已投入了大量资源去鉴别和评估可能适合以商业规模进行生物防治应用的新型候选微生物。微生物代表生活世界的最大的组成部分，并且广泛认为代表地球上进化和生物化学多样性的最大单一来源。实际上，地球上微生物细胞的总数据估算达至少10³⁰个。单独的原核生物占了个别生物的最大比例，包含10⁶至10⁸种单独基因种。然而，由于现有筛选方法的限制，具有极大生物多样性的这些自然资源是仍然大部分还没有得到开发利用的具有商业应用潜力的新颖物种、基因、酶活性和化合物的储库。当前，主要筛选步骤通常是发现微生物的生物防治能力的第一限速步骤。用于筛选商业上可行的微生物拮抗剂的当前可用的方法自这个领域开创以来并未发生大的变化，并且因此通常不能有效地应用于这些未充分开发的资源。在这些筛选中，通常从天然环境收集大量候选微生物，并随后经历各种选择技术，所述选择技术通常耗时、费力和/或相当慢。

有鉴于前述情况，非常需要提高发现和应用生物防治解决方案的速度。特别是，需要新颖方法来促进对具有对抗多种病原体的生物防治活性的微生物的快速有效的鉴别。本发明的一个方面提供了一种高通量筛选方法作为这种长期需要的解决方案，它通过提供一种快速有效地评估微生物群体的遗传多样性并由此鉴别出具有商业效益的新颖微生物来达成。

发明概述

本发明的一个方面涉及用于选择具有对抗病原体的拮抗活性的微生物的方法。所述方法包括(a)提供多重测试平台和多个微生物样品，其中所述多重测试平台包括一个或多个含有分散的病原体群体的固体微生物生长培养基；(b)分别和同时使各所述微生物样品与所述分散的病原体群体接触；(c)共培养所述微生物样品与所述分散的病原体群体以评估所述病原体对所述微生物样品各自的反应；和(d)选择一个或多个包含具有对抗所述病原体的拮抗活性的微生物的微生物样品。

根据此方面的选择方法的实施可以包括一个或多个以下特征。在某些实施方案中，所述多个微生物样品包括至少12、24、48、96、200、384、400、500、1000或1500个微生物样品。在一些实施方案中，一个或多个微生物样品可以是分离的微生物培养物。在一些其它实施方案中，至少一个微生物样品可以是两种或更多种分离的微生物的混合物。在一些其它实施方案中，一个或多个微生物样品可以直接自天然环境获得。

根据此方面的一些实施方案，病原体可以是植物病原体。在一些优选实施方案中，植物病原体是真菌。在一些其它特别优选的实施方案中，植物病原体可以选自由以下组成的组：炭疽菌属(Colletotrichumsp.)、镰刀菌属(Fusarium sp.)、赤霉菌属(Gibberella sp.)、明梭孢属(Monographella sp.)和壳多孢属(Stagnospora sp.)。在一些其它特别优选的实施方案中，植物病原体可以选自由以下组成的组：禾生炭疽菌(Colletotrichum graminicola)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、玉蜀黍赤霉菌(Gibberella zeae)、小麦霜霉菌(Monographella nivalis)和颖枯壳多孢(Stagnospora nodurum)。

在某些实施方案中，分散的病原体群体包括在固体微生物生长培养基的表面上形成细胞层的病原体的细胞。在一些其它实施方案中，分散的病原体群体包括在所述固体微生物生长培养基固化前与所述培养基混合并由此并入到所述培养基中的病原体的细胞。

在本文公开的选择方法的某些实施方案中，多重测试平台可以包括包含一个或多个单独的隔室的多隔室装置。各隔室能够充当固体微生物生长培养基的容器。在一些优选实施方案中，多重测试平台可以包括(a)一个或多个凹口，各凹口能够充当含有限定的病原体群体的固体微生物生长培养基的容器；或(b)一个凹口，其可以充当固体微生物生长培养基的容器；其中所述凹口被分成两个或更多个单独的隔室，和一个或多个用于将所述凹口分成单独的隔室的一体式分离元件。在此方面的一些优选实施方案中，多重测试平台的至少一个隔室或凹口与其它隔室或凹口的不同之处在于包含不同病原体的分散的群体。在一些其它优选实施方案中，共培养各所述微生物样品与所述分散的病原体群体是在多重测试平台的单独的隔室中进行。在其它优选实施方案中，多重测试平台可以是选自由以下组成的组的形式：微板、微量滴定板、多孔板、陪替氏培养皿、托盘、载玻片和试管。

根据某些实施方案，评估所述病原体对所述微生物样品各自的反应包括确定生长抑制区的存在、生长抑制区的直径、化合物的产生、病原体的形态学和/或生理学的变化，或其任何组合。

在一些其它实施方案中，本文公开的方法的实施可以进一步包括在使微生物样品与分散的病原体群体接触之前或同时将各微生物样品分选成细胞亚群的步骤。在一些优选实施方案中，分选步骤可以包括使用流式细胞仪细胞分选(FACS)技术。

在一些其它实施方案中，本文公开的本发明方法可以进一步包括确定微生物的分类学分类的步骤。确定分类学分类的步骤可以包括(a)使核酸探针与所选微生物的核酸分子杂交，(b)扩增所选微生物的核酸分子，(c)免疫检测所选微生物的分子，(d)对来源于所选微生物的核酸分子进行测序，或(e)其中两个或更多个步骤的组合。

根据本发明的另一方面，还提供通过根据本发明的筛选方法的方法选择的分离的微生物，其中所选微生物具有对抗病原体的拮抗活性。

本发明的这些和其它目的和特征将通过本发明的以下详细描述和权利要求书而变得更为显而易见。

发明详述

本公开涉及筛选生物样品以鉴别具有作为生物防治剂的效用的微生物的高通量方法。本文公开的方法的实施可以包括使用多重测试平台来快速并同时地鉴别具有生物防治活性的微生物，包括适用于改善植物、动物和人类健康的微生物。具体来说，本发明提供适于根据在对抗由植物病原体引起的疾病中的潜在应用来筛选微生物的筛选方法。本发明还提供通过本文公开的筛选方法鉴别的具有生物防治活性的微生物。

尽管本发明的一些特别优选的实施方案涉及选择具有对抗常见植物病原体的生物防治能力的微生物，但应了解，本发明还涵盖选择具有多种其它生物防治活性，包括但不限于杀细菌、杀真菌、除草、杀虫、杀线虫等活性中的一种或多种的微生物。还预期本发明涵盖从任何来源选择微生物。

本说明书中提及的所有出版物和专利申请都以引用的方式并入本文，程度就仿佛每个个别的出版物或专利申请都是明确地并个别地指示以引用的方式并入一般。信息源包括例如科学期刊文章、专利文件、教科书和万维网浏览器不活动页面地址。提及这些信息源仅仅是出于提供在申请时本领域的一般状态的指示。尽管所述信息源各自和每一个的内容和教导都可以被本领域的技术人员信赖和使用用于制造和使用本发明的实施方案，但是特定信息源中的任何论述和评论绝不应视为承认所述评论被广泛公认为该领域的一般性意见。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语、标记法和其它技术和科学术语或专门名词意图具有本发明所属的领域的技术人员所通常理解的含义。本文描述或提及的许多技术和程序是熟知的并且通常可以由本领域的技术人员通过使用常规方法加以采用。出于本文所述的本发明的目的定义以下术语。在一些情况下，具有通常理解的含义的术语在本文中出于清楚和/或便于参考的目的加以定义，并且在本文中纳入所述定义应不必解释为代表与本领域中的通常理解有实质性差异。

除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一”和“该”包括复数个提及物。因此，例如，提及“一宿主细胞”包括多个所述宿主细胞，并且提及“一压力”是提及一种或多种压力和本领域的技术人员已知的其等同物，等等。

抗生素：出于本发明的目的，术语“抗生素”、“抗微生物”和“抗致病性”可以互换使用，表示能够抑制或消除微生物生长的任何物质、化合物或组合物。抗生素可以通过任一种或多种以下方式产生：1)微生物、2)合成方法或3)半合成方法。因而，抗生素可以是分泌挥发性有机化合物的微生物。此外，抗生素可以是由微生物分泌的挥发性有机化合物。

如本文所用，术语“拮抗性微生物”和“微生物拮抗剂”可以互换使用，表示起作用以预防、抑制、治疗或防治植物、动物或人的病原体或致病性疾病发展的微生物。例如，拮抗性微生物可以起作用以预防、抑制、治疗或防治植物，包括其果实和其它可收获部分的收获前或收获后疾病。如本文在其它地方所更详细地公开，微生物对抗病原体的拮抗活性可以通过多种机制达成。例如，拮抗性微生物可以借助于产生和释放某些生物活性材料(例如抗生素)来抑制防治对象的发展，所述生物活性材料通过提供抑制性或竞争性机制而对防治对象具有选择性毒性和/或破坏性。因而，意图拮抗性微生物涵盖古细菌、细菌、微藻、真菌(包括霉菌和酵母物种)、支原体、小孢子、纳米细菌、卵菌和原生动物。在一些情况下，拮抗性微生物可以对例如植物病原体具有拮抗性，所述植物病原体本身可以是细菌、真菌或其它类型的微生物。

杀细菌：如本文所用的术语“杀细菌”是指组合物或物质增加细菌的死亡率或抑制细菌的生长速率的能力。

生物学防治：如本文所用的术语“生物学防治”和其缩写形式“生物防治”定义为通过使用第二种生物体或其衍生物来防治病原体，如真菌、昆虫或任何其它不希望的生物体。在大多数情况下，生物学防治是使用另一生物体抑制一种生物体的生长、感染或繁殖。生物学防治的已知机制的一个实例是使用通过与真菌争夺根表面上的空间而防治根腐病的微生物或抑制病原体生长或杀死病原体的微生物。在生物学防治的上下文中的“宿主植物”是易患病原体引起的疾病的植物。在将微生物(如真菌物种)从其天然环境分离出来的上下文中，“宿主植物”是支持真菌生长的植物，例如真菌作为内寄生菌的植物物种。

发色化合物：如本文所用，术语“发色化合物”和“发色底物”是指因光吸收或发射特征而适用于检测系统的任何化合物。所述术语意图涵盖可视觉检测或利用光学机制检测的任何可溶性以及不可溶酶促裂解产物。名称“发色”中包括产生可根据颜色变化进行检测的终产物的任何酶底物。它包括但不限于在“颜色”的传统意义上使用的任何颜色，如靛蓝、蓝色、红色、黄色、绿色、橙色、棕色等，以及产生可利用荧光进行检测的颜色的产荧光或发荧光化合物(例如荧光素的黄绿色、若丹明的红色等)。意图此类其它指示剂，如染料(例如pH)和发光化合物涵盖在此定义内。

组合物：“组合物”欲意谓活性剂与另一惰性(例如可检测的试剂或标记或液体载剂)或活性(如农药)化合物、载剂或组合物的组合。

培养物、分离的培养物、生物纯培养物和富集培养物：如本文所用，分离的微生物菌株是已从其天然环境移出的菌株。“纯培养物”或“分离的培养物”是所存在的生物体仅仅是特定属和种的一种菌株的培养物。这与“混合培养物”不同，混合培养物是存在一种以上微生物属和/或种的培养物。在一些实施方案中，微生物和培养物没有经过遗传工程改造，而在其它实施方案中，微生物和培养物经过了遗传工程改造。

因而，术语“分离的”不必反映微生物的纯化程度。微生物菌株的“实质上纯的培养物”是指实质上不含除所要微生物菌株以外的其它微生物的培养物。换句话说，微生物菌株的实质上纯的培养物实质上不含其它污染物，所述污染物可以包括微生物污染物以及不希望的化学污染物。此外，如本文所用，“生物纯”菌株欲意谓与在自然界通常与其相关的物质分离的菌株。应注意，与在自然界通常未发现的其它菌株或化合物或物质相关的菌株仍定义为“生物纯”。特定菌株的单一培养物当然是“生物纯”的。如本文所用，术语分离的微生物菌株的“富集培养物”是指含有超过50%、60%、70%、80%、90%或95%的分离的菌株的微生物培养物。

培养：如本文所用的术语‘培养’是指在不同种类的培养基上或在所述培养基中繁殖生物体。

有效量：如本文所用的“有效量”是足以影响有益或所要结果的量。有效量可以在一次或多次施用中施用。就治疗、抑制或保护来说，有效量是足以缓解、稳定、逆转、减慢或延迟靶标感染或疾病病况的发展的量。

杀真菌：如本文所用，“杀真菌”是指组合物或物质降低真菌生长速率或增加真菌死亡率的能力。

高通量筛选(HTS)中的“高通量”(HT)是指设计用来优选以自动或半自动方式进行大量测定，包括对大量细胞的测定的过程。这个量有多大取决于特定测定的情形，但是例如在筛选遗传差异中，希望检验数百万个细胞。在其它情形中，HTS可以视为每天至少数十万个测定或筛选，并且在本发明的情形中，筛选相当低数量的细胞也仍视为高通量。术语“高通量”还涵盖超高通量(UHT)，“高内涵”(HC)是指HTS的一种变化形式，其中信息的量和品质具有较高优先权，有时以通量为代价，但仍处理大量测定。在本发明的上下文中，术语“高通量”也涵盖高内涵并且因此HTS也表示“高内涵筛选”(HCS)。

微生物样品：本说明书和权利要求书中的术语“微生物样品”以其最广泛意义使用。其意图包括含有微生物的生物和环境样品以及由其制备的样品。环境样品包括由例如有害废弃材料、表面物质、土壤、水、淤泥、废水和工业样品得到的材料，以及由食品和乳品加工器械、装置、设备、一次性和非一次性物品获得的材料。生物样品可以由植物、人或动物得到，包括真菌、人、流体或组织、食物产品和成分，如乳制品、蔬菜、肉和肉副产品、细胞培养物、生物体和废物。然而，不欲对适用于本发明的样品类型施加限制。

怀疑含有拮抗性微生物的生物或环境微生物样品可以首先经受或可以不首先经受富集手段以产生微生物的“分离的培养物”、“生物纯培养物”、“富集培养物”。对于“富集手段”或“富集处理”，本发明涵盖(i)用于借助于液体、固体、半固体或任何其它培养基和/或技术将相关特定微生物与其它微生物分离开的常规技术，和(ii)用于将特定微生物与其它微生物分离开的新颖技术。本发明不欲仅限于一个富集步骤或一种类型的富集手段。例如，在使样品经受常规富集手段后，使所产生的制剂经受进一步纯化以便产生相关物种菌株的纯或实质上纯培养物是在本发明的范围内。这种纯培养物可以接着利用本发明进行分析。

微生物：如本文所用，使用术语“微生物”来表示任何微生物物种或任何类型的微生物，包括但不限于古细菌、细菌、微藻、真菌(包括霉菌和酵母物种)、支原体、小孢子、纳米细菌、卵菌和原生动物。因而，该术语涵盖个别细胞(例如单细胞微生物)或多个细胞(例如多细胞微生物)。因此，“微生物群体”可以表示单一微生物的多个细胞或两种或更多种不同微生物的多个细胞，例如真菌细胞与细菌细胞的混合物。

微生物生长培养基：如本文所用，术语“微生物生长培养基”和“培养基”和“介质”是指用于微生物生长和繁殖的任何基质。当提及支持微生物生长的固体涂铺培养基时，可以使用“培养基”。此定义还涵盖半固体和液体微生物生长系统，包括并有活宿主生物体的系统，以及任何类型的生长培养基。表述“固体微生物生长培养基”或“半固体微生物生长培养基”在本文中可互换使用，并且表示允许微生物在其表面上形成菌落的生长培养基，如具有凝胶样外观或呈凝胶形式的培养基，凝胶是互联粒子的多孔网络贯穿液体培养基容积的胶态系统。应进一步理解，凝胶的组成大部分为液体并因此展现与特定液体的密度类似的密度，然而具有固体的结构连贯性。优选地，如本文所用的固体或半固体微生物生长培养基是通过向液体微生物生长培养基中添加足量的在加热时熔融并且在再次冷却时固化的物质(如明胶或琼脂)来制备。应理解，培养基中互联粒子的多孔网络将允许营养物和抗微生物剂在培养基内扩散以变得可由微生物获取。

微量滴定板：如本文所用，术语“微量滴定板”是指生物学或化学分析中所用的各种设计的有孔或有储槽的板。其意图意谓具有一个或多个适于容纳液体的分立腔室的基板。示例性微量滴定板包括例如“微板”、“多孔”板或“n孔”板，其中“n”为孔的数目，包括例如8孔、12孔、16孔、24孔、96孔、384孔或1536孔。微量滴定板可以具有截面为多种形状中的任一者的孔，包括例如圆柱形、方形、矩形、多边形、连锁形状，其中孔的底部为平坦的、锥形的、尖的或圆形的。术语“微量滴定板”意图涵盖本领域中常用的标准微量滴定板和微板，并且可以从众多科学供应来源购得，包括Corning(Corning,NY)、BD Bioscience(Bedford,MA)、Greiner Bio-One(Monroe,NC)。然而，本发明不欲限于任何特定形式类型。例如，具有384、96、48、24和12个孔的板适用于本发明，不过也可以使用具有不同数目的孔的板。孔的形状不限于圆形或实质上圆形的孔。例如，基本上呈方形的孔可以用于本发明，同样基本上呈矩形、三角形、卵形或不规则形状的孔也可以。微量滴定板本身的形状也不限于任何特定类型，不过其通常为实质上平坦的并且一般来说可以为矩形或方形。

多路和多重测试平台：如本文所用，术语“多重测试平台”意图涵盖用于容纳一种或多种反应混合物、悬浮液或微生物生长培养基的任何适合手段。因而，多个筛选事件的结果可以组合到一个表面上，从而得到具有多个元件或部分或由多个元件或部分组成的“多重测试平台”以进行一个以上实验。术语“多重测试平台”意图涵盖微量滴定板、多孔板、微卡、试管、陪替氏培养皿、具有内部分隔物用于将板内的空间分隔成两个或更多个独立隔室并且各隔室适于容纳单独的微生物生长培养基的陪替氏培养皿。如本文所用的术语“多路”欲意谓在一个或多个多重测试平台上同时和分别进行多个测定。多路可以进一步包括在多个单独的样品中的每一个中同时进行多个筛选事件。例如，所分析样品的数目可以基于多孔板中孔的数目和各孔中所进行的测试的数目。例如，24孔、48孔、96孔、384孔或1536孔微量滴定板可以适用于本发明，不过本领域的技术人员应了解，并不是每一个微量滴定孔都需要容纳个别微生物菌株。根据微量滴定板的尺寸和各孔中个别微生物的数量，可以同时进行极高数量的测试。尽管在实施例3-4中已关于微量滴定板例示了多路，但应理解，其它形式也可以用于多路。

杀线虫：如本文所用的术语“杀线虫”是指组合物或物质增加线虫的死亡率或抑制线虫的生长速率的能力。

病原体：如本文所用的术语“病原体”是指能够在动物中产生疾病或抑制生长/产率的生物体，如藻类、蜘蛛类动物、细菌、真菌、昆虫、线虫、酵母、原生动物或病毒。如本文所用的术语“植物病原体”是指感染植物的致病性生物体。

转基因生物体：如本文所用，“转基因生物体”是指在基因组内包含异源多核苷酸的生物体。一般来说，异源多核苷酸是稳定整合在基因组内，使得该多核苷酸传递到后代。异源多核苷酸可以单独整合到基因组内或作为重组表达序列盒的一部分整合到基因组内。“转基因”在本文中用于包括基因型已因异源核酸的存在而改变的任何细胞、细胞系、愈合组织、组织。术语转基因包括最初就如此改变的转基因体以及通过有性杂交或无性繁殖从最初的转基因体产生的转基因体。如本文所用的术语转基因并不涵盖通过常规植物育种方法或通过天然存在的事件(如随机交叉受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变)使基因组(染色体或染色体外)改变。

本说明书中提及的所有出版物和专利申请都以引用的方式并入本文，程度就仿佛每个个别的出版物或专利申请都是明确地并个别地指示以引用的方式并入一般。

并不承认任何参考文献构成现有技术。参考文献的论述陈述其作者所声称的内容，并且本申请人保留质疑所引用文件的准确性和相关性的权利。应清楚了解，尽管在本文提及了多个现有技术公布；但这一提及并不造成承认任何这些文件构成本领域的普通常识的一部分。

本文给出的一般性方法的论述意图仅用于说明性目的。其它替代性方法和实施方案对于本领域的技术人员来说在回顾了本公开后将显而易见。

生物学防治的机制

一般来说，生物学防治是微生物、病原体和宿主植物之间多种不同类型的相互作用的结果。然而，病原体经常被其所遭遇到的其它微生物的存在和/或活性所拮抗[关于评述，请参见Heydari和Pessarakli,Journal of Biological Sciences,10(4):273-290,2010]。出于本发明的目的，如本文所用的术语“相互作用”是指至少两个细胞(或生物体)之间的直接或间接相互作用。“直接相互作用”是指细胞或生物体之间的物理接触。直接相互作用的实例包括细胞壁或细胞膜的直接接触(在一些情况下由特定受体介导)，或者甚至这些结构融合或者一个细胞进入另一细胞，或者通过细胞表面结构(如菌毛)发生的相互作用。“间接相互作用”是指细胞之间的间接接触，如通过由一个细胞分泌到培养基中的代谢物或信号传导化合物或核酸或酶或其它分子，其中仅代谢物与其它细胞(或生物体)产生物理接触。此外，“细胞间相互作用”是指相同物种的细胞或微生物之间的相互作用以及不同物种的细胞或微生物之间的相互作用，包括在复杂群落如生物膜中。

生物防治微生物的拮抗活性可以是直接或间接的。直接拮抗作用由生物防治活性微生物所表达的机制对病原体的物理接触和/或高度选择产生。在此类型的相互作用中，植物病原体的必要寄生物的“重寄生态”将被认为是最直接类型的机制，因为不需要其它生物体的活性来发挥抑制作用。换句话说，病原体受到杀死它或其繁殖体的特定生物防治剂的直接攻击。相反，间接拮抗作用是由并不涉及生物防治活性微生物靶向病原体的活性产生。迄今所研究的最有效的生物防治活性微生物似乎通过采用若干种作用模式的组合来拮抗植物病原体。在一些情况下，单一真菌病原体可以受到多种重寄生物的攻击。例如，互生枝顶孢(Acremonium alternatum)、杯形顶齿霉(Acrodontiumcrateriforme)、白粉寄生孢(Ampelomyces quisqualis)、洋葱枝孢(Cladosporium oxysporum)和绿粘帚霉(Gliocladium virens)是仅有的数种具有寄生白粉病病原体的能力的真菌。

多种微生物产生和释放或分泌一种或多种具有抗生素活性的化合物。已显示，微生物产生的一些抗生素对抗植物病原体和其所引起的疾病特别有效。一般来说，有效的抗生素必须在病原体附近以足够的量(剂量)产生。多种抗生素已显示对于在活体外和/或原位条件下抑制和/或拮抗靶标病原体的生长特别有效。多种生物防治微生物已显示产生多种可以抑制一种或多种病原体的抗生素。产生若干种抗生素的这种能力可能导致抑制多种微生物竞争者和植物病原体。

多种生物防治活性微生物产生可以干扰病原体生长和活性的其它代谢物。溶解酶是这些代谢物之一，它可以分解聚合化合物，包括壳多糖、蛋白质、纤维素、半纤维素和DNA。例如，已显示产生溶解酶的溶杆菌属(Lysobacter)和粘细菌属(Myxobacteria)有效对抗一些植物致病性真菌(参见例如Bull等,Plant Diseases,86:889-896,2002)。处上述代谢物外，其它微生物副产物也可以在植物疾病的生物防治中起重要作用(参见例如Phillips等,Plant Physiol.136:2887-2894,2004)。例如，氰化氢(HCN)有效阻断细胞色素氧化酶路径并且在皮摩尔浓度下对所有需氧微生物都具有高度毒性。认为某些荧光假单胞菌属(Pseudomonas)产生HCN有效对抗植物病原体。其它研究报道有机挥发性化合物也有效对抗一些植物病原体。

用于测定微生物的拮抗活性的技术

在过去数十年，已开发了多种测定并且用于发现和开发具有对抗病原体的拮抗活性的新型微生物。活体外测定微生物的拮抗活性的常用方法通常涉及在琼脂生长培养基上手动沉积或划线测试微生物和靶标病原体。例如，在许多研究实验室中已利用双重培养技术(参见例如美国专利申请号US20060029576；Sadfi等,J.Plant Pathology,83,101-118,2001；Getha和Vikineswary,J.Industrial.Microbiol.Biotech.,28,303-310,2002)、琼脂盘方法或十字塞方法(参见例如Baniasadi等,J.Agri.Biological.Sci.4,146-151,2009；Aghighi等,Biotechnology,3,90-97,2004)、用于微生物拮抗剂所产生的活性酶的酶测定(参见例如美国专利申请号US20060029576；Sadfi等,2001,同上)获得了一定程度的成功。

然而，已报道了与当前用于发现和开发新型微生物拮抗剂的这些传统方法相关的若干限制。例如，这些方法最初开发的主要目的是用于测定微生物的拮抗活性而非用于大规模筛选的目的。因此，通过使用这些传统测定来选择和/或鉴别潜在生物防治微生物通常耗时并且费力。此外，可以定量分析的菌株的数目较低。通常，生物防治剂的开发者首先必需对微生物候选者进行分选以发现有前景者并接着对有前景的微生物候选者进行分选以了解它们如何影响病原体生理学的其它方面以及它们如何与可以同时使用的其它病原体相互作用。因此，这些低通量测定/筛选方法不适于大规模筛选项目。实际上，归因于这些限制，至今只有极少数用于筛选对抗病原体的新型微生物拮抗剂和使用这些微生物来快速开发可供商业应用的生物防治剂的系统性尝试。

在实践中，当需要大规模筛选时，候选微生物通常需要在不同条件下并且针对一系列不同病原体物种进行测试，因此所欲测试的样品的数量通常达数百个，有时甚至达到数千个。为提高发现和应用生物防治技术的速率，需要开发和应用用于发现对广泛病原体具有提高的生物防治特征的微生物的其它方法。因为筛选步骤通常为发现微生物的生物防治能力的第一限速步骤，所以强烈感觉到需要开发用于高通量筛选具有商业应用重要性的拮抗性微生物的快速且可缩放的方法。

最近，已开发出更新的筛选方法来尝试以相对较高的通量鉴别微生物拮抗剂(参见例如Kawai等,Biosci.Biotech.Biochem.,61,179-182,1997)。然而，如下文所详细论述，这些更新的方法通常依赖于使靶标病原体暴露于无微生物细胞的溶胞物或由在不存在病原体下生长的测试微生物得到的无细胞培养物上清液。因此，这些活体外测定通常并不能重复天然环境中的复杂物种间相互作用，其中植物疾病的发展通常涉及植物与微生物两者，并且导致生物学防治的相互作用通常以多种程度的规模发生(Bull等,2002,同上；Fitter和Garbaye,Plant Soil,159:123-1321994；和Katska,Biol.Plant.,36:99-104,1994)。

本发明的一个方面提供用于快速且可缩放地鉴别具有对抗病原体的拮抗活性的微生物的高通量筛选方法。在此方面的一些实施方案中，本发明的方法使用多重测试平台(即多路测试平台)来对测试微生物的拮抗活性进行有效的且基于生理学的分析。在某些实施方案中，使测试微生物与靶标病原体的细胞直接接触，这可能有助于更好地重复天然环境中的复杂物种间相互作用。如上文所论述，拮抗性微生物中许多抗致病性物质或化合物的产生和后续释放或分泌通常由微生物与靶标病原体之间的复杂物种间相互作用所引发。微生物拮抗剂产生抗生素化合物通常需要因存在病原体引起的刺激或诱导。因此，不同于许多现有的筛选技术，这些技术通常依赖于使靶标病原体暴露于无细胞微生物溶胞物或无细胞培养物上清液，本发明方法的测试结果有助于更好地重复天然物种间相互作用，即仅测试微生物回应于病原体的存在所产生并分泌至环境中的化合物和/或物质。

相反，许多现有的筛选技术需要将靶标病原体与怀疑具有抗致病性活性的微生物的无细胞溶胞物一起长时间孵育(参见例如Bonjar,Asian Journal of Plant Science,2003)。这些技术通常包括为从微生物细胞释放抗致病性化合物而需要的破坏细胞的步骤。与此手段相关的一个主要问题在于无细胞溶胞物通常含有无数种可以以许多种方式彼此相互作用的不同蛋白质和其它分子，这些作用方式可以是拮抗性的或协同性的。这些分子和化合物当同时存在于测试培养基中时，可以影响靶标病原体的其它生理学和发育方面，并由此可能影响测试结果。

一些其它现有筛选技术涉及将候选微生物与病原体细胞在液体培养基中共同培养(参见例如Misaghi等,Biocontrol Science andTechnology,1995)，其中在多路测定中溢出的风险一般较高，并且可以引起孔间的污染。此外，经过了若干个小时或数天的孵育期，液体培养物中的细胞通常下沉到测试孔的底部和/或与其它细胞粘附或凝集，导致细胞在孔内的悬浮不均一。这种不均一性可以导致孔中病原体细胞的不均一反应。因此采用固体和半固体生长培养基的根据本发明的筛选方法呈现出相对于现有筛选技术的显著优势。

如下文所进一步详细论述，拮抗性微生物可以组合测定，即可以先混合分离的菌株的培养物，然后进行拮抗作用测定。所述测定的实施特别适用于评估多种拮抗剂的活体内相互作用。例如，在一些情况下，某些微生物组合施加有害的或拮抗性相互作用，而在一些其它情况下，一些微生物组合协同作用，从而对生物防治程序提供额外益处。

因为成本通常在新型微生物农药和治疗方案的开发加以考虑，所以根据本发明的筛选方法对于微生物农药的发现和开发来说呈现显著的时间和成本节约。有效鉴别和表征新型微生物候选者以及在发现过程的早期去除不满意的候选者的能力可以为农业公司节省不菲的花费。

微生物的来源

为实施本发明的方法，最初提供多种微生物，这对应于欲测试拮抗靶标病原体的发展的能力的起始微生物细胞群体。根据分析目的，起始细胞群体可以变化。

例如，在本发明的某些实施方案中，起始微生物细胞群体可以来自任何环境，特别是通常发现微生物的个别种或菌株的天然(例如非实验室)环境。所述环境包括例如海洋或其它水体，包括淡水湖或池塘、河流、溪流、咸水湖和地下水含水层；非水生陆地环境，包括土壤、工业现场和人造结构，和生物学样本，如动物或植物体表、体内或与动物或植物相关，包括腐烂的动物或植物。在其它实施方案中，起始细胞群体可以是天然环境中发现的微生物的混合物。

“极端”环境也可以用作可以在本文公开的筛选方法中用作起始细胞群体的微生物的来源；所述极端环境包括高温区(例如火山内部或附近、熔岩或汽孔上、水下熔岩位置、温泉中或在某些加热工业现场)、低温区(例如极地附近或在冰箱或蓄冷装置中)、极端盐度区(例如某些天然盐泉、蒸发量大的海或在污染位置)等。

或者，样品可以是人造组合物，如农业制剂，或将用于制备农业制剂的组合物。类似地，可以测试突变或重组微生物文库(例如利用如重组DNA操纵、遗传操纵、诱变或选择等技术产生的生物体)。此外，可以测试常用于研究或制备农业、园艺、药用或营养组合物的单一菌株或分离株。这些微生物也可以是在分离的培养物或富集培养物中生长的个别分离株和菌株，可以对它进行测试以确定其是否具有对抗病原体的拮抗活性。原则上，可以使用任何起始细胞或微生物群体。

最初可以将起始群体在例如液体培养物中培养以增加细胞数量。例如，如果欲测定真菌的单孢子分离株的病原体抑制活性，那么可以首先培养单孢子分离株以提供多个由其获得的细胞。同样，可以在接触靶标病原体群体之前使用本领域中已知的方法(例如通过过滤或离心或使用荧光活化细胞分选器)来纯化或部分纯化起始群体。

起始微生物群体的实例将在本文别处另外提供，因为分析目的是确定用何种细胞起始。例如，如果目的是测试某一菌株是否是同源并稳定的，将用此菌株的多个细胞起始。

起始细胞或微生物可以是单一物种或物种的混合物。类似地，如果起始微生物是单一物种，那么其可以是单一菌株(例如单一克隆或菌株)或者其可以是菌株的混合物。

如上文所论述，根据本发明的方法原则上可以应用于选择和鉴别对抗任何病原体的拮抗性微生物。本发明不欲限于特定微生物属、种或病原体或细胞的特定群组。除常见微生物外，可以使用本发明的方法和组合物测试的细胞类型的范围包括经历复杂形式的分化、纤丝形成、孢子形成等的细胞。实际上，本发明也意图可用于任何类型的细胞。本发明的组合物和方法特别针对一些最具经济重要性的微生物，以及具有病理学、工业、医学和环境重要性的物种。因为可以使用本发明的方法来表征各种细胞，所以主要分离或培养基的选择不欲限于特定配方。

可以根据本发明的方法作为靶标病原体分析的病原体物种的实例包括但不限于动物病原体，如嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、单核细胞增多性李氏杆菌(Listeria monocytogenes)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、致病性大肠杆菌(E.coli)菌株、沙门氏菌属(Salmonella ssp.)、克雷伯氏菌属(Klehsiella spp.)、蜂房哈夫尼亚菌(Hafnia alvei)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、变形杆菌属(Proteus spp.)、沙雷氏菌属(Serratia spp.)、志贺氏菌属(Shigella spp.)、弧菌属(Vibrio spp.)、芽孢杆菌(Bacillus)物种(包括炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)和蜡样芽孢杆菌(B.cereus))、空肠弯曲菌(Campylohacterjejuni)、耶尔森氏菌属(Yersinia spp.)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、肠球菌(Enterococcal)物种如粪肠球菌(E.faecalis)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides)或淋球菌(N.gonhorrhea)、链球菌属(Streptococcus ssp.)(包括酿脓链球菌(S.pyogenes)和肺炎链球菌(S.pneumoniae))、葡萄球菌(Staphylococcal)物种如金黄色葡萄球菌(S.aureus)(包括MRSA)、结核分枝杆菌(Mycohacterium tuherculosis)、肠杆菌(Enterohacter)(例如阴沟肠杆菌(Enterohacter cloacae))等。另外，致病性真菌如酵母，例如念珠菌(Candida)物种，包括白念珠菌(C.albicans)、克鲁斯氏念珠菌(C.krusei)和热带念珠菌(C.tropicalis)，以及丝状真菌，如烟曲霉(Aspergillus fumigatus)或马耳尼菲青霉(Penicillium marneffei)，包括皮肤真菌，如红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)。另外，还可以分析自由活动的原生动物，如致病性自由活动变形虫，或者携带细菌病原体如军团杆菌的原生动物。

本文公开的方法特别适用于鉴别具有对抗植物有害生物和植物病原体，特别是植物致病性真菌的拮抗活性的微生物。因此，本发明方法可以用于筛选能够抑制由广泛真菌引起的植物致病性疾病的发展的拮抗性微生物。本发明方法优选是对于农业、园艺、用于制造生物燃料分子和其它化学品的植物生物量和/或林业来说重要或有益的对抗致病性真菌的微生物拮抗剂。特别相关的是致病性假单胞菌(Pseudomonas)物种(例如茄科假单胞菌(Pseudomonas solanacearum))、苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)；茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、解淀粉欧文氏菌(Erwiniaamylovora)、镰刀菌(Fusarium)物种、疫霉(Phytophthora)物种(例如致病疫霉(P.infestans))、葡萄孢(Botrytis)物种、小球腔菌(Leptosphaeria)物种、白粉病(变形菌(Ascomycota))和锈病(担子菌(Basidiomycota))等。

相关植物病原体的非限制性实例包括例如直立顶孢霉(Acremonium strictum)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、交链孢霉(Alternaria alternata)、茄链孢霉(Alternaria solani)、根腐丝囊霉(Aphanomyces euteiches)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、罗氏阿太菌(Athelia rolfsii)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)、玉米平脐蠕孢(Bipolaris zeicola)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、京都丽赤壳菌(Calonectria kyotensis)、玉蜀黍头孢霉(Cephalosporium maydis)、苜蓿尾孢菌(Cercospora medicaginis)、褐斑病菌(Cercospora sojina)、马铃薯炭疽菌(Colletotrichum coccodes)、草莓炭疽菌(Colletotrichum fragariae)、禾生炭疽菌(Colletotrichum graminicola)、葡萄白腐病菌(Conielladiplodiella)、小麦雪霉病菌(Coprinopsis psychromorbida)、黄瓜褐斑病菌(Corynespora cassiicola)、苍白弯孢霉(Curvularia pallescens)、茶花根腐病菌(Cylindrocladium crotalariae)、苹果褐斑病菌(Diplocarponearlianum)、棉铃腐烂病菌(Diplodia gossyina)、色二孢属(Diplodia spp.)、黑附球菌(Epicoccum nigrum)、黄瓜白粉病菌(Erysiphe cichoracearum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、马铃薯尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.tuberosi)、多育镰刀菌多育变种(Fusarium proliferatum var.proliferatum)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、轮枝样镰刀菌(Fusarium verticillioides)、狭长孢灵芝(Ganoderma boninense)、白地霉(Geotrichum candidum)、甘蔗红腐病菌(Glomerella tucumanensis)、葡萄黑腐病菌(Guignardia bidwellii)、玉蜀黍球梗孢霉(Kabatiella zeae)、苜蓿小光壳孢(Leptosphaerulinabriosiana)、苜蓿黄斑病菌(Leptotrochila medicaginis)、壳球孢属(Macrophomina)、菜豆壳球孢(Macrophomina phaseolina)、禾谷瘟病菌(Magnaporthe grisea)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、东北叉丝壳(Microsphaera manshurica)、褐腐病菌(Monilinia fructicola)、蔓枯小球壳(Mycosphaerella fijiensis)、草莓球腔菌(Mycosphaerella fragariae)、穗黑孢霉(Nigrospora oryzae)、榆长喙壳(Ophiostoma ulmi)、胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)、水稻纹枯病菌(Pelliculariasasakii)(立枯丝核菌(Rhizoctonia solani))、东北霜霉病菌(Peronosporamanshurica)、大豆锈病菌(Phakopsora pachyrhizi)、马铃薯坏疽病菌(Phoma foveata)、苜蓿茎点霉(Phoma medicaginis)、大豆拟茎点种腐病菌(Phomopsis longicolla)、黄褐疫霉(Phytophthora cinnamomi)、红腐疫霉(Phytophthora erythroseptica)、草莓疫霉(Phytophthora fragariae)、致病疫霉(Phytophthora infestans)、苜蓿疫霉(Phytophthora medicaginis)、大豆疫霉(Phytophthora megasperma)、棕榈疫霉(Phytophthorapalmivora)、苹果白粉病菌(Podosphaera leucotricha)、苜蓿假盘菌(Pseudopeziza medicaginis)、禾柄锈菌小麦亚种(Puccinia graminis subsp.Tritici(UG99))、普通锈病菌(Puccinia sorghi)、灰色梨孢(Pyriculariagrisea)、水稻梨孢(Pyricularia oryzae)、终极腐霉(Pythium ultimum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、玉蜀黍丝核菌(Rhizoctonia zeae)、炭豆菌属(Rosellinia sp.)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、三叶草菌核菌(Sclerotinina trifoliorum)、齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)、褐纹病菌(Septoria glycines)、番茄斑枯病菌(Septoria lycopersici)、玉米毛球腔菌(Setomelanomma turcica)、草莓白粉病菌(Sphaerotheca macularis)、马铃薯粉痂病菌(Spongospora subterranea)、葡柄霉属(Stemphylium sp)、马铃薯癌肿病菌(Synchytrium endobioticum)、楔孢黑粉菌属(Thecaphora)(被色黑粉菌(Angiosorus))、根串珠霉属(Thielaviopsis)、印度腥黑粉菌(Tilletia indica)、绿色木霉(Trichoderma viride)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)、黄萎轮枝孢(Verticillium albo-atrum)、大丽轮枝孢(Verticillium dahliae)、大丽轮枝孢(Verticillium dahliae)、柑橘溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis)、水稻黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonasoryzae pv.oryzae)。

在本发明的一个优选实施方案中，本发明的方法适用于筛选对抗以下植物病原体的拮抗性微生物：烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、甜菜褐斑病菌(Cerpospora betae)、弯孢霉属(Curvularia spp.)、狭长孢灵芝(Ganoderma boninense)、白地霉(Geotrichum candidum)、蔓枯小球壳(Mycosphaerella fijiensis)、棕榈疫霉(Phytophthora palmivora)、栎树疫霉(Phytophthora ramorum)、终极腐霉(Pythium ultimum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、丝核菌属(Rhizopus spp.)、裂褶菌属(Schizophyllum spp.)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)、大丽轮枝孢(Verticillium dahliae)或柑橘溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis)。在一个特别优选的实施方案中，本发明方法可以用于鉴别能够抑制若干种具有商业重要性的植物病原体的发育的微生物拮抗剂，包括禾生炭疽菌(Colletotrichum graminicola)、禾生镰刀菌(Fusarium graminearum)、玉蜀黍赤霉菌(Gibberella zeae)、小麦霜霉菌(Monographella nivalis)和颖枯壳多孢(Stagnospora nodurum)。

一旦微生物细胞群体与包含致病性细胞的固体生长培养基发生了接触，就孵育微生物生长培养基以共同培养微生物细胞与病原体。所使用的培养基可以包含以下一种或多种：营养物、矿物质、其它化合物如细胞过程的化学诱导剂或抑制剂、参与呼吸代谢(例如电子接受体)或细胞能量代谢或转换的化合物、抗生素或毒素、蛋白质或肽、碳水化合物或核酸、可以影响细胞相互作用或粘附的化合物、酶底物、报道分子等。优选培养基是均质的，不过对于某些应用也设想沿生长表面包含一种或多种培养基成分的梯度的生长培养基。例如，生长培养基中两种最重要成分的二维梯度可以用于测试拮抗性菌株在生长中所遭遇到的多种条件下是否稳定。此外，梯度可以用于界定促进例如微生物拮抗剂与病原体之间的细胞-细胞相互作用的信号传导化合物的浓度。

生长培养基可以是固体或半固体。例如，可以使用适于维持细胞活力、生长、细胞分裂和/或分化的简单琼脂培养基。pH可以根据所测试的微生物和病原体进行改适。这种培养基在本领域中是熟知的。培养基也可以是允许一种或多种微生物物种选择性生长或诱导特定变化(例如孢子形成或萌芽)的培养基。

如下文所更详细论述，本领域中已知的多种技术可以用于评估由病原体与各候选微生物样品之间的接触所产生的效果。因此，孵育条件(和生长培养基)还可以根据将要分析的微生物和表型特征而变化。因此，所选孵育温度可以变化，孵育期可以变化、湿度可以变化，可以使用有氧或无氧条件(例如对于兼性厌氧生物，需要无氧条件)等。优选地，当孵育细菌时，孵育时间是至少约20分钟，这允许形成微菌落，例如每个微菌落平均包含2、3、4、5、6、7、8或更多个细胞。孵育时间可以在20分钟到若干小时直至约8小时的范围内。

多重测试平台：如本文所用，术语“多重测试平台”意图涵盖用于容纳一种或多种反应混合物、悬浮液或微生物生长培养基的任何适合手段。因而，多个筛选事件的结果可以组合到一个表面上，从而得到具有多个元件或部分或由多个元件或部分组成的“多重测试平台”以进行一个以上实验。术语“多重测试平台”意图涵盖微量滴定板、多孔板、微卡、试管、陪替氏培养皿、具有内部分隔物用于将板内的空间分隔成两个或更多个独立隔室并且各隔室适于容纳单独的微生物生长培养基的陪替氏培养皿。尽管可以涵盖多种适用设计，但根据本发明的多重测试平台优选呈封闭或开放容器形式，如微板、微量滴定板、多孔板、陪替氏培养皿、托盘、载玻片和试管。

在一些实施方案中，根据本发明的多重测试平台尤其可以由塑料/聚合物基材制造，如聚氯乙烯基材、聚乙烯基材、聚丙烯基材、聚碳酸酯基材、丙烯腈丁二烯苯乙烯基材、聚甲基丙烯酸甲酯基材或聚苯乙烯基材，由玻璃基材制造或由金属基材制造。

出于本发明的目的，术语“微量滴定板”是指生物学或化学分析中所用的各种设计的有孔或有储槽的板。其意图意谓具有一个或多个适于容纳液体的分立腔室的基板。示例性微量滴定板包括例如“微板”、“多孔”板或“n孔”板，其中“n”为孔的数目，包括例如8孔、12孔、16孔、24孔、96孔、384孔或1536孔。微量滴定板可以具有截面为多种形状中的任一者的孔，包括例如圆柱形、方形、矩形、多边形、连锁形状，其中孔的底部为平坦的、锥形的、尖的或圆形的。术语“微量滴定板”意图涵盖本领域中常用的标准微量滴定板和微板，并且可以从众多科学供应来源购得，包括Corning(Corning,NY)、BD Bioscience(Bedford,MA)、Greiner Bio-One(Monroe,NC)。然而，本发明不欲限于任何特定形式类型。例如，具有384、96、48、24和12个孔的板适用于本发明，不过也可以使用具有不同数目的孔的板。孔的形状不限于圆形或实质上圆形的孔。例如，基本上呈方形的孔可以用于本发明，同样基本上呈矩形、三角形、卵形或不规则形状的孔也可以。微量滴定板本身的形状也不限于任何特定类型，不过其通常为实质上平坦的并且一般来说可以为矩形或方形。

根据本发明的一些实施方案的多重测试平台可以具有至少3个隔室、至少4个、至少5个、至少6个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少40个、至少60个或至少90个隔室。

此外，在根据本发明的一些实施方案的多重测试平台中，根据某些实施方案，各隔室可以分成至少3个凹口、至少4个、至少5个、至少6个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少40个、至少60个或至少90个凹口。

如本文所用的术语“多路”欲意谓在一个或多个多重测试平台上同时和分别进行多个测定。多路可以进一步包括在多个单独的样品中的每一个中同时进行多个筛选事件。例如，所分析样品的数目可以基于多孔板中孔的数目和各孔中所进行的测试的数目。所述多孔板的非限制性实例包括可以适用于本发明的24孔、48孔、96孔、384孔或1536孔微量滴定板，不过本领域的技术人员应了解，并不是每一个微量滴定孔都需要容纳个别微生物菌株。根据微量滴定板的尺寸和各孔中个别微生物的数量，可以同时进行极高数量的测试。尽管在实施例3-4中已关于微量滴定板例示了多路，但应理解，其它形式也可以用于多路。

可以手动或在包括多通道吸移管管理器、微量滴定板相关技术(例如96孔或384孔)和机器人在内的技术协助下进行系统性筛选。预期机器人可以用于使用本发明的方法来筛选微生物以发现具有新的或更有效的生物防治能力者。使用机器人技术存在多种优点，包括可缩放性、高通量、一致并长期的性能、高可靠性、成本有效性和错误减少。因此，利用机器人技术来进行筛选相对于现有手动方法具有另一实质性优势，即它们可以在极端或异常的物理和化学条件下利用(例如无氧、还原或氧化氛围，或当处理有毒或有危害的化学品时，包括放射性核素、毒性挥发性有机化合物)。在处理病原体时，这些考虑因素非常重要，因为机器人系统能够在极端和有危害条件下工作，在这些条件下使用人类工作人员可能是不安全的或不符合要求的。

筛选可以利用任何适当的分析方法。其可以包括光谱分析(包括比色测定和通过测量光学密度来测量生物量)、荧光测定法、电泳法、色谱法(包括高效液相色谱(HPLC)、FPLC、气相色谱(GC)、气相色谱质谱(GC/MS))、原子吸收光谱法、感应耦合等离子体以及使用放射性化合物和放射性核素的测定。

本发明筛选方法的用途

本文公开的高通量筛选方法可以用于多种筛选用途。在一个具体的但非限制性的例证中，可以收集大量的微生物候选者并且随后使其经受筛选程序，其中对微生物作为对抗单一靶标病原体的拮抗剂的潜力进行测试，目标在于鉴别能够抑制或预防相关靶标病原体的发展的微生物。

或者，在另一个非限制性例证中，还预期根据本公开的筛选方法可以用在反向筛选策略中，其中针对许多病原体来筛选单一微生物或一组预定组的微生物，目标在于鉴别其发展或致病活性受所述预定微生物抑制或预防的病原体。因此，本发明的反向筛选是来筛选靶标病原体而非针对其进行筛选。

在又一个非限制性例证中，拮抗性微生物可以组合测定，即可以先混合分离的菌株的培养物，然后进行拮抗作用测定。所述测定的实施当在评估多种拮抗剂的活体内相互作用时是特别适用的。例如，在一些情况下，某些微生物组合施加有害的或拮抗性相互作用，而在其它情况下，一些微生物组合协同作用，从而对生物防治程序提供额外益处。

本发明中公开的方法还可以用于鉴别为获得增强的生物学防治的生理条件。彻底筛选是至关重要的，因为在生物防治方法中应该使用对于特定应用和条件具有最佳生物防治活性的微生物，以便实现生物学防治的完全经济性的有益环保的潜力。具有更高效率的微生物的应用直接转化为更低的生物防治成本。此外，使用本发明的新的或更有效率的系统的发现将会允许对当前被认为难以得到生物防治的情况应用新的生物学防治策略。

此外，如下文更详细地讨论，本领域的技术人员将随即了解，可以使用本发明的筛选方法同时地测试广泛范围的筛选条件、微生物、病原体及其组合，从而允许筛选方法的快速和方便的按比例扩大。总体而言，使用多孔微量滴定板形式的多种自动化的、可扩缩的技术是容易得到的并且可以用来按比例扩大根据本发明的筛选方法。现有自动化技术的以下实例以说明的方式而非以限制的方式来提供。

可以用机器人来执行筛选数据的快速收集和随后的计算，从而有利于适合的微生物生物体在生物防治应用领域中的快速部署。机器人筛选提供了对于给定病原体、宿主植物和/或生长条件而言找到微生物菌株的最佳集合的一种通用解决方案。为了有效率的生物防治应用，一旦病原体群体、宿主植物和现场条件得到表征，可以产生文库，这个文库可以由主要优先病原体来编排索引，并接着由现场环境条件和测试的条件来编排交叉索引。最佳的微生物拮抗剂可以接着使用机器人自动化在模拟实际现场条件(包括共病原体混合物)的条件下进行测试，以便进一步鉴别文库中对于在具体现场的生物防治应用的最佳微生物和条件。

如果现场条件，包括化学和微生物生态学是已知的，那么机器人辅助筛选可以适用于鉴别修正，这些修正是扩大天然微生物丛或附加的拮抗性菌株以获得最优生物防治效率所需要的。可以对来自目标天然环境的环境微生物分离株进行筛选并接着在数据库中查找相关的生物体。相关微生物菌株表现如何的知识可以用来“蛙式跳过(leapfrog)”以限定用于环境分离株的初始操作参数。机器人辅助筛选接着可以用于针对特定现场条件来调谐这些操作参数，并且可以再引入拮抗性微生物或者可以修正现场条件来改进生物防治效率。

众多机器人系统可以结合到本发明的筛选方法中，包括具有机器人臂的追踪系统，如Tecan Robotic Assay Composer(Tecan,N.C)，或具有3-轴机器人臂的追踪系统，如Zymate Microplate Management System(Zymark Corp.,Mass.)。本发明的优选实施方案结合了BioMek FX P计算机控制的机器人工作站。

使用根据本发明的高通量筛选产生的数据(例如，生长模式、生长相互作用模式、种子产率、种子质量、植物产率以及浸染严重性)可以使用计算机化的系统进行分析。例如，微生物-病原体相互作用的影响可以通过计算机化的“阅读器”或扫描器来评估，并且可以使用计算机算法来定量在测试平台上的生长抑制或探针至个别微生物样品的结合。同样，可以使用阅读器来检测已经进行测定的培养物中细胞生长的存在(或不存在)所述测定的这种分析可以被称为“自动化检测”，原因在于数据是由自动化的阅读器系统采集的。

例如，在使用分子标记技术来评估和/或检测微生物拮抗剂对病原体发展的拮抗作用的情况下，发射可检测电磁波或粒子的标记(例如，杂交标记)、所发射的光(例如，荧光或发光)或放射线可以通过灵敏摄像机、共焦扫描仪、图像分析装置、放射性膜或PhosphorImager(其从阵列中捕捉信号(如彩色图像))来检测。具有图像分析软件的计算机接着检测这个图像，并对于多重测试平台中的每个微生物样品位置(斑点)分析信号的强度。可以在单一测试平台上的斑点之间或者可以在测试平台之间比较信号(例如，用多个不同的探针分子依序地探测单一平台)。

也可以使用计算机算法来进行单一测试平台上或在多个测试平台上的斑点之间的比较。此外，来自筛选的数据可以存储在计算机可读形式中。

此外，自动化阅读器(扫描器)可以通过计算机和软件来控制，所述软件被编程来指导阅读器的个别部件(例如，机械部件如电动机、分析部件如信号解释和本底扣除)。任选地，软件还可以被提供来控制图形用户界面和所述阅读器的用于分选、分类、存储、分析或以其它方式处理数据输出的一个或多个系统。

举例来说，为了“阅读”已经采用能够抑制病原体发展的微生物样品进行测定的根据本发明的多重测试平台的结果(例如，抑制模式)，可以将测试平台放入阅读器之中(或放在其上、或放在其下方等等，这取决于检测器系统的位置)，并且可以由阅读器来检测指示测试微生物样品的生长抑制能力的可检测信号。在微生物样品已经抑制了病原体生长之处的那些斑点产生指示生长抑制能力的可检测信号。这些可检测信号可以与斑点鉴别器信号相关联，从而鉴别复合物的位置。阅读器采集来自每个斑点的信息、将它与所述斑点鉴别器信号相关联、并且辨别具有可检测信号的斑点，这些斑点不同于不产生这种信号的那些斑点。某些阅读器还能够检测处于完全无信号与高信号之间的中间水平信号，从而使得能够定量个别斑点处的信号。

某些阅读器可以用于收集来自本发明的测试平台的数据，“阅读”已经采用可检测探针进行测定以产生结合的根据本发明的阵列(例如，结合模式)。在探针已经结合至固定的多肽或多核苷酸样品之处的那些斑点提供可检测信号，例如呈电磁辐射形式，其可以接着由阅读器检测。

可以用于收集来自根据本发明的多重测试平台(尤其是可以使用荧光标记分子探测的那些)的数据的某些其它阅读器，将包括用于光学辐射发射的光源。激发光的波长通常将处于UV或可见光范围中，但在一些情况下可以延伸至红外线范围内。光束分离器可以将阅读器发射的激发束引导到物镜中，所述物镜例如可以被安装为使得它可以相对于阵列基板的表面在x、y和z方向上移动。物镜将激发光聚焦在阵列上，并且更具体地说聚焦在阵列上的(微生物细胞)靶标上。波长比激发光长的光被从阵列上含有荧光标记探针分子的地址(即，含有探针所结合至的分子的那些地址)中发射出来。

在本发明的某些实施方案中，多重测试平台在其正被阅读时可以可移动地设置在阅读器内，以使得在阅读器检测来自每个斑点的信息时多重测试平台自身发生移动。或者，多重测试平台在阅读器内可以是固定的，而阅读器检测系统横过多重测试平台移动或在其上方或在其周围移动以便检测来自阵列斑点的信息。特定可移动形式的阵列阅读器是已知的并且被描述，例如在美国专利号5,922,617中。用于产生光学数据存储聚焦和追踪信号的方法的实例也是已知的(参见，例如，美国专利号5,461,599)。

在一些优选实施方案中，本发明的方法进一步包括以下步骤：在使微生物样品与病原体群体接触之前或同时，将每个微生物样品分离成单细胞群体。在一些优选实施方案中，分离步骤包括微生物样品的连续稀释。在一些其它优选实施方案中，分离步骤包括使用流式细胞仪细胞分选(FACS)技术，其中微生物细胞的非均匀混合物可以物理地分离成具有高纯度的两个或更多个细胞亚群用于进一步的分析。所分选的细胞可以接着在与病原体接触之前或同时，通过FACS、有限稀释或本领域中已知的其它细胞纯化技术进行分离、扩增并进一步富集。多种FACS技术是本领域中熟知的，这些技术可以按高通量形式使用，从而可以适用于本发明的方法。

用于评估和/或检测微生物拮抗剂对抗病原体发展的拮抗活性的方 法

本领域中已知的多种技术可以用于评估在病原体与每种候选微生物样品之间接触所造成的影响，例如用于评估某些化学化合物、群体感应化合物或代谢产物的产生和/或分泌的方法。在一方面，某些化学化合物的产生可以通过本领域中已知的酶法、发荧光和/或发色测定来评估。在本发明的背景下，术语“发色底物”或“发色物质”或“色原”可以互换地使用，来指代生化色素的前体。还应理解的是，具体地说，所述色原可以是底物、物质或化合物，其当被微生物代谢时产生可用作微生物检测和/或鉴别的手段的特征颜色或色素。举例来说，木霉属，是一种产生一系列酶的真菌拮抗剂，这些酶针对于致病真菌的细胞壁。酶法测定可以部署在高通量形式中以用于检测由含有木霉属微生物的微生物样品进行的抗生素产生。由对其而言酶法测定可容易地获得来部署在高通量形式中的微生物拮抗剂所产生的酶的其它非限制性实例包括壳多糖酶(芽孢杆菌属，Sadfi等,2001,同上)和特定蛋白酶(豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)，美国专利申请号US US20060029576)在另一个实例中，在高通量形式中可以包括被工程化来产生绿色荧光蛋白(GFP)或作为与生物防治微生物相互作用的应答可容易地检测和/或定量的“标记物”化合物的病原体，以使得将容易地检测和/或定量微生物样品对病原体生长的干扰。

本发明的另一个方面提供这样的方法，其中将微生物的至少一个培养菌株(称为报道菌株)添加到培养基中，以使得由微生物样品进行的至少一种化合物的产生由所述报道菌株的生长或遗传反应来展现。

在所公开方法的一些具体实例中，将细胞从复杂的天然群体中分离出来并且在个别隔室(例如，微量滴定盘或容器)中测定。在某些实施方案中，将细胞分离为使得在每个隔室中仅沉积约一个或几个细胞，例如通过流式细胞仪细胞分选(FACS)或稀释。个别隔室(例如微量滴定盘的孔)含有适合于微生物生长的培养基，如马玲薯葡萄糖琼脂或可以含有可能支持微生物生长的添加化合物的培养基。将生长隔室(例如，微量滴定盘)孵育足够的时间以允许候选微生物的生长，并且检测并可以定量微生物生长对病原体发展的影响。例如可以使用荧光或光散射的变化来检测和/或定量细胞生长。举例来说，流式细胞术或显微镜术可以用作这些荧光和光散射信号的检测手段。

当直接显微镜术用作细胞检测/定量的手段时，可以首先将细胞沉积在细胞微阵列中或细胞微阵列上。这些细胞微阵列可以通过使用细胞微阵列化程序来建造，这种程序是本领域中熟知的并且包括将细胞按二维阵列沉积在阵列基板上，例如聚碳酸酯、玻璃或某些其它材料的过滤器。

可以进一步对选择的微生物细胞进行表征。例如，可以使用核酸探针与所选细胞的核酸含量的杂交、使用以标签(例如荧光标签或其它化学或物理标记)做标记的探针分子，来鉴别所选微生物细胞的分类学。或者，可以通过用于从以低密度悬浮在含水培养基中的非常少的细胞获得基因序列的程序来鉴别微生物细胞。此基因测序程序还可以用来鉴别含有特定基因的细胞。

用于分类学鉴别的方法

一旦微生物被本发明公开的筛选方法选择，往往有益于在分类学上鉴别它们。本领域技术人员将了解，微生物分离株的分类学分类可以通过多种技术来确定，这些技术包括但不限于：(1)核酸探针与所述微生物分离株的核酸分子的杂交；(2)所述微生物分离株的核酸分子的扩增；(3)所述微生物分离株的分子的免疫检测；(4)来源于所述微生物分离株的核酸分子的测序；或这些技术中两种或更多种的组合。

生物体鉴别因此可以涉及高达数种不同水平的分析，并且每种分析可以基于生物体的不同特征。这些分析可以包括基于核酸的分析(例如，个别特定基因的分析，关于它们的存在或它们的确切序列，或特定基因的或基因家族的表达)、基于蛋白质的分析(例如，在功能水平上使用直接或间接酶测定，或在结构水平上使用免疫检测技术)，等等。

在进行分离的培养物的透彻分子分析之前，可能有用的是确认微生物培养物是由单一细胞产生并且因此是纯培养物(除了如本公开中在别处讨论的，微生物被有意进行混合)。微生物经常是基于直接显微镜分析(检测时样品中的所有细胞看起来一样)、染色特征、简单分子分析(例如，简单的限制性片段长度多态性(RFLP)测定)等等来辨认。然而，在本发明的某些实施方案中，不是绝对需要来执行这个纯度确认步骤，因为在随后分析中混合的微生物培养物将是显然的。

a.基于核酸的分析：在本发明的某些实施方案中，被提供用于鉴别微生物的方法包括对来自非常少数量细胞的基因进行扩曾和测序。所提供的程序因此克服了从稀释的悬浮液中浓缩细胞和它们的DNA的问题。所提供的程序可以用于通过基因序列鉴别细胞或者用于鉴别具有特定基因或基因家族的细胞。

术语“核酸扩增”通常是指增加样品或样本中核酸分子的拷贝数的技术。适用于核酸扩增的技术是本领域中熟知的。核酸扩增的实例是聚合酶链反应(PCR)，其中使从受试者收集的生物样品与一对寡核苷酸引物接触，接触条件是允许这些引物与样品中的核酸模板杂交。将引物在合适条件下延伸、从模板解离、并接着再退火、延伸并解离，以扩增核酸的拷贝数。活体外扩增技术的其它实例包括链置换扩增；无转录等温扩增；修复链反应扩增；连接酶链反应；缺口填充连接酶链反应扩增；联合的连接酶检测和PCR；以及无RNA转录的扩增。

除本文提供的说明性实例引物之外，对于个别物种或系统发育组的微生物，已经设计了引物并且新的正在不断被设计。这些被狭窄靶向的引物可以与本文所述的方法一起使用，以仅特异性地筛选和/或鉴别相关微生物。

用于制备和使用核酸引物的方法被描述，例如在Sambrook等(InMolecular Cloning:A Laboratory Manual,CSHL,New York,1989),Ausubel等(编著)(In Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,1998)中。扩增引物对可以来源于已知的序列，例如通过使用预期用于这一目的的计算机程序(例如，Primer(WhiteheadInstitute for Biomedical Research,Cambridge,Mass.))。本领域的技术人员将了解，特定探针或引物的特异性随着它的长度而增加。因此，例如，包含rRNA编码核苷酸或其侧接区域的30个连续核苷酸的引物将退火至比仅具有15个核苷酸的对应引物的特异性更高的靶标序列。因此，为了获得更高特异性，可以选择包含如16S rRNA的靶标核苷酸序列的至少20、25、30、35、40、45、50或更多连续核苷酸的探针和引物。

用于制备适用于核酸应用(例如，PCR)的核酸的常见技术包括苯酚/氯仿提取或者使用在市场上可获得的许多DNA提取试剂盒之一。可以进行DNA扩增的另一种方式是通过将细胞直接添加至核酸扩增反应混合液中并且依赖于扩增的变性步骤来裂解细胞并释放DNA。

核酸扩增反应的产物可以通过本领域中熟知的一种或多种标准技术来进一步表征，这些技术包括电泳、限制性核酸内切酶酶切图谱、寡核苷酸杂交或连接，和/或核酸测序。当杂交技术用于细胞鉴别目的时，多种探针标记方法可以是有用的，包括荧光标记法、放射性标记法和非放射性标记法。

b.基于蛋白质的分析：除核酸的分析之外，可以直接基于特定蛋白质的存在(或不存在)来表征和鉴别使用本发明的方法选择的微生物。这种分析可以是基于规定蛋白质的活性，例如通过酶测定或通过共培养的生物体的反应，或通过规定蛋白质的仅有存在(其例如可以使用免疫学方法如原位免疫荧光抗体染色来测定)。

酶测定：举例来说，可以将荧光或发色底物类似物包括进生长培养基中(例如，微量滴定板培养物)，接着进行孵育并针对反应产物进行筛选，从而基于它们的酶活性来鉴别培养物。

共培养反应：在本发明的一些实施方案中，可以基于共培养生物体(例如报道生物体)的反应(或反应程度)来测定由微生物分离株携带的酶的活性。

还可以使用多种方法用于通过将至少一种抗体或抗体来源分子结合至微生物的分子或更具体地分子的表位来鉴别从源环境中选择和分离的微生物。

抗微生物蛋白质抗体可以使用描述于许多教科书中的标准程序来产生，这些教科书包括Harlow和Lane(Antibodies,A Laboratory Manual,CSHL,New York,1988)。可以通过使用常规程序或通过改编常规程序来容易地确定特定试剂大体上仅结合至所需微生物的蛋白质。一种适合的活体外测定利用了蛋白质印迹程序(描述于许多标准教科书，包括Harlow和Lane(Antibodies,A Laboratory Manual,CSHL,New York,1988))。

更短的抗体片段(抗体来源分子，例如FAbs、Fvs和单链Fvs(SCFvs))也可以用作特异性结合试剂。制备这些片段的方法是常规的。

结合至本发明阵列上的细胞的抗体的检测可以使用标准技术进行，所述标准技术例如ELISA测定，这些测定提供可检测的信号，如荧光或发光信号。

本文给出的一般性方法的论述意图仅用于说明性目的。其它替代性方法和实施方案对于本领域的技术人员来说在回顾了本公开后将显而易见。提供以下实施例来说明、但非限制本发明。

已经描述了本发明的许多实施方案。尽管如此，将理解的是本文描述的实施方案的元素可以组合来形成另外的实施方案并且可以做出各种修改而不脱离本发明的精神和范围。因此，其它实施方案、替代方案和等效物处于本发明的和本文要求的范围之内。申请书内的标题仅仅是为了方便读者，并且不以任何方式限制本发明或其实施方案的范围。

本说明书中提及的所有出版物和专利申请都以引用的方式并入本文，程度就仿佛每个个别的出版物或专利申请都是明确地并个别地指示以引用的方式并入一般。

实施例

实施例1：从环境样品中的微生物分离

细菌分离：为了细菌分离，将由土壤、植物组织或两者组成的每个子样品添加至20mL无菌的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，并且在冰上以8瓦特使用超声细胞粉碎仪(Fisher Scientific Sonic Dismembrator)超声波处理两个1分钟的间隔时间。将所产生的细胞悬浮液稀释至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和10^-7的浓度，并且将100μL的每个10倍稀释液涂布在培养板上，这些培养板含有用琼脂固化的微生物生长培养基和100mg/L环己酰亚胺以抑制真菌生长。选择的生长培养基通常是通用的、非选择性的培养基，如R2A[Reasoner等,Appl.Environ.Microbiol.38(2):229-236)]，或以靶向特定类型微生物(如能够在氮缺乏下生长的那些微生物)为目的而使用的培养基。将培养板孵育长达7天并且将分离的菌落挑选到液体生长培养基中并允许其生长至可见浊度。将纯的分离株培养物布阵至96孔板中以允许针头(pin tool)转移至生物防治测定板上。

真菌分离：将环境样品分别置于6%(w/v)NaCl琼脂的表面上并且在28°C下孵育7至10天。在形成成熟菌落后，将来自单一分生孢子梗的孢子点接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上并且如上所述在28°C下生长。每天观察板上污染物的存在并且为了培养物纯度进行再分离。一旦纯菌落成熟，就将孢子点接种到标准培养基(包括麦芽提取物琼脂、察氏(Czapek)酵母琼脂和察氏琼脂)上，用于使用标准形态学方法进行曲霉菌种的识别。

内寄生菌分离：将植物样品切成5至10cm小段，浸没在70%乙醇中20秒，并用火焰短暂燃烧来杀菌。制备具有不同选择性特性的多达三个品种的琼脂板(Water Agar；0.1x PDA；以及GAM(Gifu厌气培养基)营养丰富的培养基，补充有庆大霉素]。从最外层(树皮)开始，系统地且无菌地移除植物组织层。将3至5cm小片的组织层(内侧向下)置于生长培养基板上。通过浸入EtOH中并用火焰燃烧来在层之间对器具杀菌。将植物组织的连续层(外核和内核)移除并涂在生长培养基板上(通常在同一板上等间隔)。一旦将每个组织层涂在每个品种的生长培养基上，就将这些板包裹在Parafilm^TM中并转移至16-L

Box中，其中添加小块卫生球或萘球(约5mg)以防止螨虫生长。通常，3天后监测内寄生菌生长，并且此后每天进行，直到45天。

实施例2：病原体生长和制备

使用相关病原体接种含有6.0g马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)混合物和250mL MilliQ H₂O的500-mL烧瓶，接着在振荡器上孵育，并且当其达到高浊度时(OD₆₀₀≈1.0)进行收获。此孵育对于细菌培养物通常只进行一个晚上，但对于一些真菌分离株长达两周。

在真菌病原体的情况下，在液体培养物中形成的菌丝体在其添加至PDA培养基之前通常需要进行匀化和过滤(strained)，以便确保在整个测定体积或板中均匀的浓度。与20至30个无菌4mm玻璃珠一起将二十毫升以上培养物添加至50mL Falcon管中，接着重复进行涡旋(1min或更久)以便将菌丝体打破成小片。接着使匀化的培养物穿过无菌的40-μm筛目细胞过滤器(cell strainer)进入新的50-mL Falcon管中以便移除大块。有时需要在低速下离心以促进过滤。所得滤液的OD₆₀₀通过使用分光光度计来测定并使用无菌PDB调整至OD₆₀₀=0.05。当用细菌病原体操作时，通常绕过匀化步骤。

实施例3：制备病原体板用于高通量拮抗作用测定

对于大约30个生物防治测定板通常需要五百毫升生长培养基，所述测定板足以筛选约2800个分离株。将此配方相应地缩小以用于更小的筛选，因为这些测定板优选地在它们被制备的同一天使用。与大的磁性搅拌棒一起将十二克PDB和10g琼脂添加至1升的烧瓶，接着用MilliQ H₂O将体积调整至500mL。接着将烧瓶热压处理并且将约15mLPDA分配至单孔OmniTray^TM板(Nalge Nunc International,Rochester,NY)，确保涂覆板的整个底部。使板冷却，优选地在层流净化罩中，以便保持无菌并减少凝结。将处于OD₆₀₀0.05的一毫升病原体细胞悬浮液倾倒至每个板上。使用无菌珠或曲棍球棒式细胞涂布器来用病原体细胞均匀地覆盖琼脂的表面。使板在层流净化罩中彻底干燥，在继续进行下一步之前移除盖子。

当需要时，在培养基固化之前将病原体细胞与温热的PDA培养基混合，并从而均匀地并入生长培养基中。

实施例4：高通量拮抗作用测定

使用无菌针头将分离株从96孔细菌培养板转移至生物防治测定板上。接着将被覆盖的测定板用Parafilm^TM包裹并在室温下孵育。大部分细胞分离株将在1至2个晚上后在测定板上形成菌落，而对于一些细菌分离株有时花费3个晚上或更久来变得可见。每天检测这些板，并且注意看似抑制在其紧邻处的病原体生长的微生物样品。病原体生长的微生物抑制可以被观察为围绕微生物菌落的清除区(clear zone)。偶尔地，弱抑制剂在初期显示一些生物防治活性，但最终将被病原体覆盖。然而，强微生物抑制剂无限地在其菌落周围展现相当大的清除区。

针对抑制几种植物病原体的发展的能力筛选了总共大约3500个微生物分离株，所述植物病原体包括禾生炭疽菌、禾谷镰刀菌、玉蜀黍赤霉菌、小麦霜霉菌和颖枯壳多孢。表1是当用六种常见植物病原体的每一种进行测试时，针对其拮抗能力选择的候选微生物数量的总结。通过将微生物分离株培养物分别点样或划线在单独的测定板上，进一步评价具有阳性生物防治活性的候选微生物。另外，在PDA上显示可能干扰此测定的高运动性的分离株，也进一步单独地进行评价。

表1：

病原体	选择的候选微生物的数量
		禾谷镰刀菌NRRL5883	109
小麦霜霉菌ATCC MYA-3968	642
		玉蜀黍赤霉菌ATCC16106	196
颖枯壳多孢ATCC26369	587
		禾生炭疽菌ATCC34167	426

实施例5：预分选的微生物细胞的高通量拮抗作用筛选

此实施例描述拮抗作用测定的细节，其进一步包括以下步骤：在使微生物样品与病原体群体接触之前或同时，将每个微生物样品分选成单细胞或细胞亚群。

在一些实验中，分选步骤是使用流式细胞术细胞分选(FACS)技术进行，其中将微生物细胞的非均匀混合物物理地分离成具有高纯度的细胞亚群，之后用于拮抗活性的进一步分析。

病原体板的制备是通过：首选取得相关靶标病原体的用珠粒破碎的(bead-beaten)真菌菌丝体、个别细胞或孢子,并使它们穿过70μM尼龙网过滤器。接着将滤液的细胞浓度调整到大约0.01的OD₆₀₀。将250μL滤液涂布在含有合适的琼脂微生物生长培养基的单孔微量滴定板(如“Nunc OmniTray”)上。接着使病原体板在预先杀菌的生物安全柜中干燥，直至无残留液体剩余在琼脂表面上。在一些情况中，可将悬浮液在琼脂生长培养基处于熔融状态时直接并入其中，即在琼脂生长培养基固化之前。

从环境样品中取得土壤和根际提取物的等份试样并将其调整至适当浓度和纯度以用于使用FACS技术的分选步骤中。使用“BDFACSAria^TM”细胞分选器系统(BD Biosciences,Bedford,MA)，接着将个别细胞直接分选至病原体板上并允许其在适当温度和持续时间下孵育，以便允许视觉检测靶标病原体和从分选的单细胞得到的微生物菌落的生长。通常，能够抑制给定靶标病原体的微生物菌株可以鉴别为对应于展现围绕微生物菌落的生长抑制区的微生物菌落的那些菌株。

在其它一些实验中，代替使用FACS技术进行直接细胞分选，使用标准陪替氏培养皿而非OmniTrays同样如上所述制备病原体板，使用100μL而非250μL的滤液悬浮液涂布在琼脂表面上。在这些情况中，通常将环境细胞悬浮液稀释至1CFU/μL的浓度并且将100μL涂布在干燥的病原体板之上。如在FACS分选的板上所见，出现了清除区。

实施例6：在生长室条件中生长的小麦上，对赤霉病的致病因子禾谷镰刀菌的生物学防治

对于根据实施例4中所述的筛选方法在微量滴定板上从共培养测定选择的几种候选微生物，进一步考察其降低春小麦中赤霉病(FHB)的发病率的能力。将两克易感小麦品种的小麦种子(Hank,WestBred,Bozeman,MT)播种在含有消毒土壤的1升罐子中。对于每种候选微生物，制备十六个重复罐子并按完全随机化设计排列。对照组通常包括(1)感染的种子，(2)未感染的种子，和(3)被感染并随后用不同基准测试化学杀真菌剂如Banner Maxx^TM(Syngenta)处理的种子。使微生物拮抗剂生长在适当培养基上并且接着将细胞团粒重悬在适当的缓冲溶液中。通常，将微生物悬浮液的浓度调整至10⁹cfu/罐并且在播种之时施用悬浮液。在其它一些实验中，在播种之前用微生物拮抗剂涂覆种子。接着使种子在荧光灯下以14小时光周期发芽和生长，直至开花。单独地，将真菌病原体禾谷镰刀菌NRRL5883细胞在恒定光下在PDA培养基上生长五天，以诱导分生孢子形成。通过将无菌水(0.05%Tween20)倾倒在板上、接着用无菌刮刀刮擦来收获分生孢子。在开花期(通常在Feekes10.5.1期)，通过在麦穗上喷洒10⁶cfu/ml的分生孢子悬浮液至饱和，使麦穗感染禾生镰刀菌孢子。房间用雾化器加湿到95%相对湿度(RH)持续48小时的时间。在小麦种子完全发育之后，收获植物部分并针对以下度量收集数据：(1)麦穗总数，(2)感染严重性，(3)总种子数，(4)总种子质量，和(5)真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol(DON))含量。结果透露，当与在相同条件下生长的未处理对照组相比时，根据本发明方法选择的几种微生物拮抗剂显著降低了禾生镰刀菌对小麦的浸染。在这些微生物的至少一种情况中，所述拮抗剂实现的对小麦从镰刀霉浸染中的保护与所述商业化学杀真菌剂实现的保护具有统计学可比性。

实施例7：所选择的微生物的系统发育表征

此实施例提供一种用于识别从本发明的高通量筛选方法中选择的生物体的方法。总体来说，可以使用已知的技术对从培养的生物体扩增的靶标核酸分子进行测序，并且可以将所得到的序列与来自已知生物体的靶标基因的已知序列进行比较。接着将这些序列放在系统发育树中，以建立分离的生物体与已知的和/或先前培养的微生物物种的关联性。

获取16S,ITS-5.8S rDNA序列信息：在适当培养基上生长的靶标微生物的新鲜培养物用作DNA源。通过用移液吸头扫掠过生长的微生物群体的表面来收集微生物的生物质。将生物质转移至含有50μl的100mM Tris,pH8.0的100μl PCR胶条管(strip tube)中。经由重复的上下吸液来匀化生物质。接着将微生物匀浆的2-μl试样与2μl的2x裂解缓冲液混合，所述裂解缓冲液由100mM Tris HCL,pH8.0、2mMEDTA、1%SDS、和20μl/ml蛋白酶K组成(Goldenberger等,1995,PCRMethods Appl.4:368-370)。裂解反应在PTC-200personal thermocycler(MJ-Research,MA,USA)中如下进行：55℃下60分钟、接着95℃下10分钟。将裂解产物的2μl试样用作模板DNA源用于PCR扩增。对于细菌物种，使用引物M13-2716s Bac(5’-TGTAAAACGACGGCCAGTTAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，SEQ ID NO:1)和M13-149216s Bac(5’-CAGGAAACAGCTATGACCGGTTACCTTGTTACGACTT-3’，SEQID NO:2)，经由PCR来扩增16S序列。

对于真核物种，使用引物M13-Euk1195R(5’-CAGGAAACAGCTATGACCGGGCATCACAGACCTG-3’，SEQ ID NO:3)和M13-Euk515F(5’-TGTAAAACGACGGCCAGTGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’，SES IDNO:4)，经由PCR来扩增16S序列。ITS rDNA序列是使用引物M13-ITS1(5’-TGTAAAACGACGGCCAGTTTCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，SEQID NO:5)和M13-ITS4(5’-CAGGAAACAGCTATGACCTCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，SEQID NO:6)，经由PCR来扩增。

每种PCR混合物在50μl体积中制备，并且由2μl来自真菌裂解反应的DNA、0.5μl正向引物和0.5μl反向引物、5μl10%Tween-20和42μl Platinum PCR SuperMix(Invitrogen,CA,USA)组成。PCR在PTC-200personal thermocycler(MJ-Research,MA,USA)中如下进行：94℃下10分钟，接着30个循环：94℃下30秒、52℃下30秒和72℃下1分钟,15秒，接着72℃下循环10分钟。将稀释于10μl ddH2O中的PCR产物的10μl试样在具有溴化乙锭(Invitrogen,CA,USA)的预先浇注的1.0%琼脂糖E-Gel96上跑胶10分钟，使用Mother E-Base(Invitrogen,CA,USA)作为动力源。使用ChemiImager Ready系统(AlphaInnotech,Calif.)，通过UV荧光成像获得凝胶图像。通过凝胶电泳确认400-500bp PCR产物的存在。使用6μl ExoSAP-IT清洁混合液(USB,OH,USA)清洁剩余的40μl PCR产物。纯化反应在PTC-200personalthermocycler(MJ-Research,MA,USA)中进行：37℃下30分钟，接着80℃下30分钟。将纯化的产物冷冻并提交用于PCR测序。测序由加州圣地亚哥的J.Craig Venter Institute使用454种技术在正向和反向启动方向上进行。

为了系统发育重建，在BioEdit(在万维网(World Wide Web)上)比对核苷酸序列并接着进行人工细化。使用最大似然率、HKY替代模型和默认设置，在PHYML(在万维网上)上构建系统发育树。通过bootstrapping(100次重复)获得分支支持。

实施例8：微生物拮抗剂的生长和储存

真菌拮抗剂：使用数种方法来储存作为纯培养物的分离的真菌，其中之一是滤纸技术。也允许真菌在PDA上生长，并接着将它切成小方块，将这些方块放入含有15%甘油的小瓶中并储存在-70℃下。还使用蒸馏水而非甘油，通过类似方法将真菌储存在4℃下。然而，优选的储存方法之一是在-80℃下的浸染的无菌大麦种子上。

细菌拮抗剂：将分离的细菌储存为纯培养物。将细菌菌落转移至含有R2A肉汤液体培养基(BD Difco^TM)的小瓶中并使其在250rpm下的振荡下在30℃生长两天。接着将培养物转移至含有15%甘油的小瓶中并储存在-80℃下。

已经描述了本发明的许多实施方案。尽管如此，将理解的是本文描述的实施方案的元素可以组合来形成另外的实施方案并且可以做出各种修改而不脱离本发明的精神和范围。因此，其它实施方案、替代方案和等效物处于本文所述的和所要求的本发明的范围之内。

申请书内的标题仅仅是为了方便读者，并且不以任何方式限制本发明或其实施方案的范围。

Claims (19)

1.一种用于选择具有对抗病原体的拮抗活性的微生物的方法，所述方法包括：

a)提供多重测试平台和多个微生物样品，其中所述多重测试平台包括一个或多个含有所述病原体的分散群体的固体微生物生长培养基；

b)分别和同时使所述微生物样品各自与所述分散的病原体群体接触；

c)共培养所述微生物样品与所述分散的病原体群体以评估所述病原体对每个所述微生物样品的反应；和

d)选择一个或多个包含具有对抗所述病原体的拮抗活性的所述微生物的微生物样品。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个微生物样品包括至少12、24、48、96、200、384、400、500、1000或1500个微生物样品。

3.根据权利要求1所述的方法，其中一个或多个所述微生物样品是分离的微生物培养物。

4.根据权利要求1所述的方法，其中至少一个所述微生物样品包含两种或更多种分离的微生物的混合物。

5.根据权利要求1所述的方法，其中一个或多个所述微生物样品是直接从自然环境获得。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述病原体是植物病原体。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述植物病原体是真菌。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述植物病原体选自由以下组成的组：炭疽菌属、镰刀菌属、赤霉菌属、明梭孢属和壳多孢属。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述分散的病原体群体包括在所述固体微生物生长培养基的表面上形成细胞层的所述病原体的细胞。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述分散的病原体群体包括在所述固体微生物生长培养基固化前与所述培养基混合并由此并入到所述培养基中的所述病原体的细胞。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述多重测试平台包括包含一个或多个单独隔室的多隔室装置，并且其中每个隔室能够充当固体微生物生长培养基的容器。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述多重测试平台的所述隔室中的至少一个与其它隔室的不同之处在于包含不同病原体的分散群体。

13.根据权利要求11所述的方法，其中共培养每个所述微生物样品与所述分散的病原体群体是在所述多重测试平台的单独隔室中进行的。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述多重测试平台是选自由以下组成的组的形式：微板、微量滴定板、多孔板、陪替氏培养皿、托盘、载玻片和试管。

15.根据权利要求1所述的方法，其中评估所述病原体对每个所述微生物样品的反应包括确定生长抑制区的存在、生长抑制区的直径、化学化合物的产生、所述病原体的形态学和/或生理学的变化，或其任何组合。

16.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括在使所述微生物样品与所述分散的病原体群体接触之前或同时，将每个所述微生物样品分选成单细胞或细胞亚群的步骤。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述分选步骤包括使用流式细胞仪细胞分选技术。

18.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括确定所述微生物的分类学分类的步骤。

19.一种通过根据权利要求1所述的方法选择的分离的微生物，其中所述微生物具有对抗病原体的拮抗活性。