CN107949280A - 用于获得种子处理耐受性微生物的高通量方法 - Google Patents

用于获得种子处理耐受性微生物的高通量方法 Download PDF

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Abstract

本文提供用于鉴定和获得在使用种子处理组分或种子处理过程以及储存之后维持活力的微生物的环境分离株的方法。

Description

用于获得种子处理耐受性微生物的高通量方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年8月20日提交的美国临时申请号62/207,868的权益，所述美国临时申请以引用的方式整体并入本文。
发明背景
发明领域
本文提供获得能够在种子处理过程之后保持活力的微生物的高通量方法。
相关技术的描述
农业作物生产常常利用对种子的化学处理。常常，依赖所述处理来对种子或所得植物赋予疾病或害虫抗性性质。在种植之前施加种子处理剂可降低在储存、发芽或种植期间对种子的损害，并且也保护出苗植物。这可帮助实现建立均一群丛，此不仅具有保护在种子自身方面的投资的益处，而且也使每单位土地的植物性能最大化。日益地，有益于种子和植物的微生物被包括在种子处理剂中，并且可赋予广泛范围的有益农艺学性状。微生物可例如适用作植物接种剂、土壤改良剂、生物控制剂或植物生长调节剂。
尽管在本领域中取得进步，但仍然需要鉴定用于植物种子处理中的额外微生物。
发明简述
在一个方面，本文提供一种用于获得微生物的高通量方法，其包括以下步骤：a)获得多种与生长环境中的作物植物相关的微生物；b)将多种微生物施加于种子或其替代物；c)将所述种子或其替代物储存在其中所述多种微生物的一个或多个成员变得没有活力的条件下；d)将所述种子或其替代物放置在溶液中；和e)从所述溶液鉴定在步骤(c)之后保持活力的至少第一微生物。在一个实施方案中，步骤a)包括从作物植物和/或生长环境产生微生物细胞混悬液。或者，方法可包括在步骤b)之前使微生物细胞混悬液浓缩。在特定实施方案中，步骤e)包括将溶液涂铺于生长培养基上，以及选择包含微生物的菌落。
在本发明的一特定方面，获得多种与生长环境中的作物植物相关的微生物包括i)从所述作物植物和/或所述生长环境产生微生物细胞混悬液；ii)将所述微生物细胞混悬液涂铺于生长培养基上；iii)选择微生物菌落；和iv)通过使在步骤iii)中选择的微生物菌落的成员组合来产生所述多种微生物。在本发明的一方法中，生长环境可包括来自农田的土壤，或可包括非农业环境。在特定实施方案中，与本发明一起使用的多种微生物来自作物植物根际、内球、叶圈或其任何组合。多种微生物也可从作物植物的组织获得。
在一特定实施方案中，本发明的一方法还包括鉴定微生物能够赋予作物植物物种的植物的至少第一有益性状的步骤。作物植物物种可属于或可不属于与用于本发明的方法中的种子相同的物种。作物植物物种可为双子叶植物物种，包括但不限于苜蓿、菜豆、甜菜、西兰花、卷心菜、胡萝卜、花椰菜、芹菜、大白菜、棉花、黄瓜、茄子、亚麻、莴苣、羽扇豆、甜瓜、豌豆、胡椒、花生、马铃薯、南瓜、萝卜、油菜籽、菠菜、大豆、倭瓜(squash)、糖用甜菜、向日葵、番茄和西瓜。作物植物物种也可为单子叶植物物种，包括但不限于大麦、玉米、韭菜、洋葱、稻米、高粱、甜玉米、小麦、黑麦、谷子、甘蔗、燕麦、黑小麦、柳枝黍和草坪草。
在本发明的一方法的其它实施方案中，保持活力的微生物是革兰氏阴性非芽孢形成性细菌，或革兰氏阳性芽孢形成性或非芽孢形成性细菌。在其它实施方案中，种子或其替代物的储存持续约1小时至约1年进行，在环境温度下进行，或在高于或低于环境温度下进行。
在本发明的其它实施方案中，将多种微生物施加于种子或其替代物，并且在施加所述多种微生物之前、同时或之后将种子处理剂施加于所述种子或其替代物。种子处理剂可包含或可不包含多种微生物。在一个实施方案中，在施加多种微生物之前或之后将种子处理剂施加于种子或其替代物。在另一实施方案中，种子处理剂包括杀真菌剂、杀生物剂、杀昆虫剂、除草剂、杀螨剂、杀啮齿类剂、杀线虫剂、植物生长调节剂和微量营养素或其组合。在另一实施方案中，种子处理剂包括聚合物、着色剂、粘合剂、粘着剂、粘附剂、分散剂、表面活性剂、营养素、涂布剂、湿润剂、缓冲剂、多糖和填充剂或其组合。
附图简述
图1.用于发现和分离种子处理耐受性微生物的高通量方法B1和方法B2的示意图。
图2A.根据分类目的通过方法B1发现的多样性的代表性直方图。
图2B.根据分类纲的通过方法B1发现的多样性的代表性直方图。
图2C.根据每个分类纲的属的数目的通过方法B1发现的多样性的代表性直方图。
图3A.根据分类目的通过方法B2发现的多样性的代表性直方图。
图3B.根据分类纲的通过方法B2发现的多样性的代表性直方图。
图3C.根据每个分类纲的属的数目的通过方法B2发现的多样性的代表性直方图。
图4A.根据分类目的通过方法B1和方法B2发现的多样性的代表性直方图。
图4B.根据分类纲的通过方法B1和方法B2发现的多样性的代表性直方图。
图4C.根据每个分类纲的属的数目的通过方法B1和方法B2发现的多样性的代表性直方图。
发明详述
本文提供用于获得能够定殖于目标植物，并且存活于与种子处理组分和种子处理过程相关的条件下的微生物的方法。本发明者已例如发现在不同微生物物种之间以及潜在地在相同物种的不同菌株之间，并入种子处理剂中的微生物的活力可不同。因此，迄今为止，哪些微生物或菌株将耐受种子处理组分或种子处理过程已通常不可预测。此外，至少一个月至数月甚至数年的滞后时间可存在于种子处理与它们的最终种植之间。由于一些菌株在种植之前丧失活力，所以这已显著影响鉴定可使农业受益的微生物的能力。这由于难以预测哪些菌株将提前展现活力丧失，以及需要在各个生长季节引入改进的有益微生物而更复杂。个别地测试各候选微生物是耗时的和不切实际的。
在先前研究中，本发明者个别地测试数百个与作物植物相关的革兰氏阴性细菌菌株的种子处理组分耐受性，并且结果指示当在每个种子106至107个菌落形成单位(CFU)下施加于种子时，大多数通常从植物-微生物群落分离的物种将不存活至在1-2周之后的检测点。此外，结果揭示无论施加于种子的微生物的浓度如何，根际中的一些最充足微生物在种子处理之后都经受接近完全活力丧失。本文提供的方法克服所述缺陷，从而容许在短暂时期内鉴定庞大微生物群体以及提供大量能够存活于种子处理组分和过程的情况下的微生物，所述微生物可被进一步测试对农业作物植物的微生物有益作用。
惊人地发现本文公开的方法不仅容许鉴定强适应性和快速生长微生物诸如芽孢形成性细菌，而且也容许鉴定一批不同的其它微生物诸如非芽孢形成性细菌。在一非限制性实例中，根据所公开方法从作物植物的根际分离多种常常不存活于种子处理过程或组分的情况下，或难以测试持久能力的革兰氏阴性细菌，并且加以筛选。
在一个实施方案中，提供分离、选择和鉴定甚至在储存在种子涂层内之后也能够有益用于农业中的种子处理耐受性微生物的高通量方法。在特定实施方案中，方法包括获得多种为一种或多种所选环境所特有的微生物，以及鉴定能够存活于种子处理组分和种子处理过程和试剂的情况下的那些微生物。在一个实施方案中，将微生物的汇合物在预定比率下施加于种子。在其它实施方案中，产生待直接施加于种子的含有不同微生物的汇合物的浓缩微生物细胞混悬液。混悬液可为存在于小型生物群中的所有细菌、真菌和古细菌(包括但不限于见于土壤、植物组织和水体中的那些)的代表性提取物。细胞混悬液也可源于先前培养的微生物的人工汇集汇合物。这些细胞混悬液可用于接种种子以鉴定能够存活于种子处理过程的情况下的那些。
在额外实施方案中，以类似方式将聚合物、着色剂、杀虫剂(包括杀真菌剂、杀生物剂、杀昆虫剂、除草剂、杀螨剂、杀啮齿类剂、杀线虫剂)或可用于种子处理制剂中的其它组分施加于种子以选择能够存活于各种种子处理组分和过程的情况下的微生物。在某些实施方案中，将存活于种子处理和培育的情况下的微生物菌株培养和存档以供未来用于关于对植物生长的有益作用进行的田野试验筛选中。
适于产生和施加具有特定成分的种子处理剂的方法和组合物在本领域中是已知的，所述成分诸如是以下中的一者或多者：杀虫剂(包括例如杀线虫剂、杀昆虫剂、杀真菌剂)、接种剂或配制组分(包括例如涂布剂或保护剂)，以便提供针对幼苗和种子疾病、早季昆虫和害虫等的保护。在储存和种植之前对种子进行预处理可使早季植物群丛、均一性和茁壮性最大化以例如达成较高产率潜力。
用于本发明中的种子处理组分的使用率可为本领域中标准用于将种植种子所处的特定地理区域或用于达成意图由处理实现的预定益处的那些。标准范围在本领域中是熟知的，并且常常受当地规章要求指导，所述要求可设置向商业种子进行施加的最小水平和最大水平。适于本文所述的种子处理耐受性方法中的特定杀虫产品的范围的一实例是在产品标签上给出的用于商业应用中的范围。或者，本文所述的高通量方法可使用增加量的可潜在影响微生物的活力的任何一种或多种种子处理组分以提供对在种子处理之后维持活力的能力的更严格或坚实测试。
涂布剂、微生物或保护剂的量可同样取决于各种因素，诸如采用的化合物、处理的种子类型、提议的种植条件和预期的气候条件。使用本文提供的指导，熟练人士将能够确定将适于根据本发明使用的特定量。常常，配制产品(与纯活性成分相对比)用于种子处理中。由于方便供给和容易使用，配制产品可有利地用于本文所述的方法中。
在一些实施方案中，对植物/土壤提取物中含有的一系列大量微生物—代表无数微生物物种和变体—进行分离、选择和任选鉴定，并且在单一测定中测试种子处理耐受性。在本发明的另一方面，直接用取自目标植物和土壤的提取物涂布种子以避免当进行微生物分离步骤时存在的培养基偏倚。在特定实施方案中，收割生长在多种土壤中的大量不同作物以便可将相关微生物施加于给定物种或其变种的种子，并且因此选择定殖于这些目标植物，并且存活于向种子上给料的过程的情况下的微生物。
本发明的方法首次容许从环境样品优先富集定殖于目标植物，并且也能够存活于并入种子处理剂中的情况下的菌株。建立的分离方案通常涉及发现展现特定生长样式，利用某些基质，或关于所需生物化学活性测试为阳性的微生物。描述的方法允许使用者改变微生物在种子处理组合物中花费的培育时间，此给与对所需稳定性程度的更大控制，并且更可适用于现实情况。当需要时，可使根据本发明分析的起始微生物朝向定殖于特定目标作物植物或其变种的物种进行富集。
将种子处理步骤插入分离程序中提供不必在田野测试之前个别地测试各微生物候选物的种子处理耐受性的优势，所述测试是当前用于确定特定微生物是否在商业上可行的范式。结果是效率超过传统方法而增加。本文公开的方法提供一种用于鉴定所述微生物，避免需要进行冗长或个别化尝试，以及节约大量资源的快速精简方法。
定义
除非另外指示，否则术语应由相关领域普通技术人员根据常规用法加以理解。
在一些情况下，具有通常理解含义的术语为明晰起见和/或为随时参考而在本文中定义，并且在本文中包括所述定义不应必定解释为代表与本领域中通常理解的定义具有实质性差异。本文描述或参照的许多技术和程序由本领域技术人员充分了解并通常使用常规方法加以采用。
除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一(a/an)”和“该/所述(the)”包括复数个(种)指示物。举例来说，术语“一细胞”包括一个(种)或多个(种)细胞，包括其混合物。
如本文所用，术语“高通量”是指其中来自任何微生物群落样品或来自多个不同样品(例如来自根际、内球或土壤的环境样品)的众多微生物(包括任何微生物物种和/或变体)在单一方案中进行测试的过程，例如代表众多微生物物种和变体的一系列微生物在单一测定中进行测试。
如本文所用，术语“病原体”是指能够在植物或动物中产生疾病的生物体，诸如像藻类、蛛形纲动物、细菌、真菌、昆虫、线虫、寄生植物、酵母、原虫或病毒。如本文所用的术语“植物病原体”是指感染植物的病原性生物体。
如本文所用，关于微生物的“变体”是具有它所属于的物种的识别特征，同时相对于亲本菌株具有至少一个核苷酸序列变化或可识别的不同性状的菌株，其中所述性状以遗传为基础(可遗传)。核苷酸序列变化包括取代、插入、缺失或所述变化的任何组合。
如本文所用，种子处理组分是至少一种如本文所述和本领域中已知的杀虫剂或种子处理配制组分。
高通量筛选方法
可筛选可直接从环境样品(包括例如土壤或植物材料)或从如本文所述的培养微生物的汇合样品分离的微生物混悬液以鉴定能够存活于与植物种子处理组合物和过程相关的条件下的微生物。可用于描述的方法中的培养、混悬和浓缩步骤中的众多培养基和缓冲液在本领域中是已知的。在各种实施方案中，可将微生物施加于种子(特别是作物植物种子)或种子替代物(包括例如粒子，诸如岩石、大理石、晶体等，或合成材料或表面)上。
在某些实施方案中，替代物可为不同植物物种的种子。举例来说，可通过施加于玉米种子来在本文方法中测试与生长大豆植物相关的微生物的种子处理耐受性。在一些实施方案中，可将所选微生物菌株以液体涂料形式或以粉尘形式施加于种子或种子替代物上。细菌混悬液例如可在溶液中稀释，并且直接用于涂布种子。或者，非细菌例如可以孢子制剂形式施加于种子。在另一实例中，可将活体培养物、发酵物或液体孢子培养物施加于种子。在另一实例中，可通过翻转和暴露于空气来使经处理种子干燥。也可使微生物与惰性载体混合，干燥，研磨成精细粉末，并且施加于种子。惰性载体材料的实例包括滑石、二氧化硅、冷杉皮、珍珠岩、润滑剂、蛭石、海藻酸盐和粘土。
在一个实施方案中，将植物相关微生物的汇合物在预定比率下施加于种子。特别关注的是施加大量微生物以允许在单一测定而非常规筛选方法中高效筛选不同类型的微生物，所述常规筛选方法包括在田野或生长室/测定测试中以分离株为基础对个别分离株测试可存活性和活力(常常是两年过程)。在一特定实施方案中，经微生物处理的种子具有每个种子约106至约109的孢子浓度或微生物细胞浓度。在额外实施方案中，种子可具有每个种子更多个孢子或微生物细胞，诸如像每个种子1010、1011或1012个或更多个微生物或孢子。例如通过在600nm(OD600)下测量微生物培养物的浊度和光密度，以及将所需相应CFU直接施加于种子，可易于调整浓度。
如本文所述的其它种子处理剂和配制组分可在微生物处理之前、同时或之后施加。对于例如聚合物的某些组分，应用在微生物处理之后施加可为优选的。在一些实施方案中，也将一种或多种杀虫剂(包括杀真菌剂、杀生物剂、杀昆虫剂、除草剂、杀螨剂、杀啮齿类剂和杀线虫剂)、植物生长调节剂(包括LCO、CO、几丁质化合物、类黄酮、茉莉酮酸、茉莉酮酸甲酯、亚油酸、亚麻酸和卡里金(karrikin))或微量营养素施加于种子。施加种子处理组分可发生在施加微生物之前、之后或同时。在一个实施方案中，将微生物施加于已用包含一种或多种选自种菌唑(ipconazole)、甲霜灵(metalaxyl)、肟菌酯(trifloxystrobin)和噻虫胺(clothianidin)的杀虫剂以及任选一种或多种先前分离的有益微生物(包括例如坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus))的组合物预处理的玉米种子。在另一实施方案中，将微生物施加于已用包含一种或多种选自吡唑醚菌酯(pyraclostrobin)、甲霜灵、氟苯吡菌胺(fluxapyroxad)和吡虫啉(imidacloprid)的杀虫剂的组合物预处理的大豆种子。在另一实施方案中，将微生物施加于已用包含一种或多种选自吡唑醚菌酯、甲霜灵、氟苯吡菌胺、腈菌唑(myclobutanil)、吡虫啉、种菌唑、噻虫嗪(thiamethoxam)、毒死蜱(chlorpyrifos)和阿维菌素(abamectin)的杀虫剂的组合物预处理的棉花种子。各种杀虫剂、植物生长调节剂和微量营养素在本领域中是已知的并在本文中加以描述，并且本领域技术人员可视例如作物种子和所需有益作用而改变这些化合物的组成和浓度。
在特定实施方案中，种子或种子替代物可使用常规混合方法、喷雾方法或其组合，通过使用被特定设计和制造以准确、安全和高效将种子处理产品施加于种子的处理剂施加设备来用根据本文方法获得的微生物混悬液均一涂布。
基于聚合物的种子整理剂(“外涂层”)可任选在施加微生物之后或同时添加。接着将种子在所需条件下储存一段时期，在所述时间期间，一些微生物能够被致使没有活力，从而使得能够鉴定在储存之后保持活力的至少第一微生物。储存条件可根据需要加以修改以获得为鉴定在施加给定种子处理剂之后保持活力的微生物所需的严格水平和性质。可改变的储存条件的非限制性实例包括例如储存时间、温度和湿度。在一个实施方案中，在种子行业中典型用于在向农民分配和销售之前储存种子的条件下进行储存。在特定实施方案中，以少于1小时至1年或更久的范围进行储存，包括约1小时、约6小时、约12小时、约24小时、约2天、约1周、约2周、约1个月、约2个月、约6个月和约1年或更久，并且包括可源于这些时间的所有范围。在其它实施方案中，储存在环境温度下进行，或可在高于或低于环境温度下进行，包括约0℃或更低、约4℃、约25℃、约37℃和约45℃或更高，包括可源于其的所有范围。
在所需储存条件之后，可将经处理种子浸渍在缓冲液中以产生可被例如沉积于固体琼脂生长培养基上的细胞混悬液。形成的微生物菌落源于存活于种子处理和储存的情况下的菌株，并且可加以分离，使用微生物分类方法鉴定，并且存档以供未来用于田野试验或其它研究中。众多培养基和缓冲液在本领域中是已知的，并且可用于描述的方法中的培养、混悬和浓缩步骤中。
特别关注的是在本文所述的方法中使用用于商业种子处理制剂中的各种化合物。纳入所述化合物允许使商业种子处理条件再现，并且确保对将经受所述条件的处于进一步测试和商业应用下的微生物的选择。进一步测试可包括进一步在额外种子处理条件下筛选，以及在植物田野条件下测试可在商业性农业条件下对植物提供益处的微生物。
能够发芽以形成易受线虫、病原性真菌和/或病原性细菌攻击的植物(包括本文所述的那些)的任何植物种子都可用由本文所述的方法产生的微生物处理。
微生物
本文所述的方法可应用于任何微生物，包括任何原核或真核微生物。在一些实施方案中，微生物是来自至少一种具有以下属的细菌的生物杀真菌剂(“bf”)：放线菌属(Actinomycetes)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、节杆菌属(Arthrobacter)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、金杆菌属(Aureobacterium)、固氮菌属(Azobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、拜叶林克氏菌属(Beijerinckia)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、色杆菌属(Chromobacterium)、梭菌属(Clostridium)、棒形杆菌属(Clavibacter)、丛毛单胞菌属(Comomonas)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短小杆菌属(Curtobacterium)、肠杆菌属(Enterobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、噬氢菌属(Hydrogenophage)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、巴斯德氏芽菌属(Pasteuria)、鞘氨醇杆菌属(Phingobacterium)、发光杆菌属(Photorhabdus)、叶杆菌属(Phyllobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、根瘤菌属(Rhizobium)、沙雷氏菌属(Serratia)、窄食单胞菌属(Stenotrophomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、贪噬菌属(Variovorax)和致病杆菌属(Xenorhadbus)。在特定实施方案中，细菌选自由以下组成的组：解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、坚强芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(Bacillus lichenformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、穿刺巴斯德氏芽菌(Pasteuria penetrans)、Pasteuria usage、荧光假单胞菌(Pseudomona fluorescens)及其组合。
在各实施方案中，生物杀真菌剂(“bf”)可为具有以下属的真菌：链格孢属(Alternaria)、白粉寄生孢属(Ampelomyces)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、白僵菌属(Beauveria)、念珠菌属(Candida)、刺盘孢属(Colletotrichum)、盾壳霉属(Coniothyrium)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、镰刀菌属(Fusarium)、粘帚霉属(Gliocladium)、绿僵菌属(Metarhizium)、梅奇酵母属(Metschnikowia)、微座孢菌属(Microdochium)、麝香霉属(Muscodor)、拟青霉属(Paecilonyces)、Phlebiopsis、拟酵母属(Pseudozyma)、腐霉属(Pythium)、木霉属(Trichoderma)、核瑚菌属(Typhula)、细基格孢属(Ulocladium)和轮枝孢属(Verticilium)。在特定实施方案中，真菌是球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、小盾壳霉(Coniothyrium minitans)、绿粘帚霉(Gliocladium virens)、金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)(也可在本领域中称为绿僵菌(Metarrhizium anisopliae)、棕色绿僵菌(Metarhizium brunneum)或“绿色圆叶葡萄菌(green muscadine)”)、白麝香霉(Muscodoralbus)、淡紫色拟青霉(Paecilomyces lilacinus)、多孢木霉(Trichoderma polysporum)及其组合。
可适用于本文公开的方法中的生物杀真菌剂(“bf”)的非限制性实例包括白粉寄生孢(Ampelomyces quisqualis)(bf.1)(例如AQ(bf.1a)，来自Intrachem Bio GmbH&Co.KG,Germany)、黄曲霉(Aspergillus flavus)(bf.2)(例如(bf.2a)，来自Syngenta,CH)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)(bf.3)(例如(bf.3a)，来自bio-ferm GmbH,Germany)、短小芽孢杆菌(bf.4)、短小芽孢杆菌分离株AQ717，NRRL B-21662(bf.4a)(来自Fa.AgraQuest Inc.,USA)、短小芽孢杆菌分离株NRRLB-30087(bf.4b)(来自Fa.AgraQuest Inc.,USA)、芽孢杆菌属种分离株AQ175，ATCC 55608(bf.5)(来自Fa.AgraQuest Inc.,USA)、芽孢杆菌属种分离株AQ177，ATCC55609(bf.6)(来自Fa.AgraQuest Inc.,USA)、枯草芽孢杆菌(bf.7)、枯草芽孢杆菌分离株AQ713，NRRL B-21661(bf.7a)(在 MAX和ASO中)(来自Fa.AgraQuest Inc.,USA)、枯草芽孢杆菌分离株AQ743，NRRL B-21665(bf.7b)(来自Fa.AgraQuest Inc.,USA)、解淀粉芽孢杆菌(bf.8)、解淀粉芽孢杆菌FZB24(bf.8a)(例如(bf.8b)，来自Novozymes Biologicals,Inc.,USA)、解淀粉芽孢杆菌分离株NRRL B-50349(bf.8c)、解淀粉芽孢杆菌TJ1000(bf.8d)(即也称为1BE，分离株ATCC BAA-390)、苏云金芽孢杆菌(bf.9)、苏云金芽孢杆菌分离株AQ52，NRRL B-21619(bf.9a)(来自Fa.AgraQuest Inc.,USA)、嗜油念珠菌(Candida oleophila)(bf.10)、嗜油念珠菌I-82(bf.10a)(例如(bf.10b)，来自Ecogen Inc.,USA)、齐藤念珠菌(Candidasaitoana)(bf.11)(例如(bf.11a)(在与溶菌酶的混合物中)和(bf.11b)，来自Micro Flo Company,USA(BASF SE)和Arysta)、粉红粘帚霉(Clonostachysrosea f.catenulata)，也名为链孢粘帚霉(Gliocladium catenulatum)(bf.12)(例如分离株J1446：(bf.12a)，来自Verdera,Finland)、小盾壳霉(bf.13)(例如(bf.13a)，来自Prophyta,Germany)、寄生隐丛赤壳菌(Cryphonectriaparasitica)(bf.14)(例如寄生内座壳(Endothia parasitica)(bf.14a)，来自CNICM,France)、浅白隐球酵母(Cryptococcus albidus)(bf.15)(例如YIELD(bf.15a)，来自Anchor Bio-Technologies,South Africa)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)(bf.16)(例如(bf.16a)，来自S.I.A.P.A.,Italy，来自Natural Plant Protection,France)、核果梅奇酵母(Metschnikowia fructicola)(bf.17)(例如(bf.17a)，来自Agrogreen,Israel)、双胞微座孢菌(Microdochium dimerum)(bf.18)(例如(bf.18a)，来自Agrauxine,France)、白麝香霉(bf.19)、白麝香霉分离株NRRL 30547(bf.19a)(来自Fa.AgraQuest Inc.,USA)、粉红麝香霉(Muscodor roseus)(bf.20)、粉红麝香霉分离株NRRL 30548(bf.20a)(来自Fa.AgraQuest Inc.,USA)、大伏革菌(Phlebiopsis gigantea)(bf.21)(例如(bf.21a)，来自Verdera,Finland)、絮绒拟酵母(Pseudozyma flocculosa)(bf.22)(例如(bf.22a)，来自Plant Products Co.Ltd.,Canada)、寡雄腐霉(Pythiumoligandrum)(bf.23)、寡雄腐霉DV74(bf.23a)(例如(bf.23b)，来自Remeslo SSRO,Biopreparaty,Czech Rep.)、黄踝节菌(Talaromyces flavus)(bf.24)、黄踝节菌V117b(bf.24a)(例如(bf.24b)，来自Prophyta,Germany)、棘孢木霉(Trichoderma asperellum)(bf.25)、棘孢木霉SKT-1(bf.25a)(例如ECO-(bf.25b)，来自Kumiai Chemical Industry Co.,Ltd.,Japan)、深绿木霉(Trichodermaatroviride)(bf.26)、深绿木霉LC52(bf.26a)(例如(bf.26b)，来自AgrimmTechnologies Ltd,NZ)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)(bf.27)、哈茨木霉T-22(bf.27a)(例如(bf.27b)der Firma BioWorks Inc.,USA)、哈茨木霉TH-35(bf.27c)(例如ROOT(bf.27d)，来自Mycontrol Ltd.,Israel)、哈茨木霉T-39(bf.27e)(例如和TRICHODERMA(bf.27f)，来自Mycontrol Ltd.,Israel和Makhteshim Ltd.,Israel)、哈茨木霉ICC012(bf.27g)、哈茨木霉和绿色木霉(Trichoderma viride)(bf.28)(例如TRICHOPEL(bf.28a)，来自Agrimm TechnologiesLtd,NZ)、哈茨木霉ICC012和绿色木霉ICC080(bf.28b)(例如WP(bf.28c)，来自Isagro Ricerca,Italy)、多孢木霉和哈茨木霉(bf.29)(例如(bf.29a)，来自BINAB Bio-Innovation AB,Sweden)、子座木霉(Trichoderma stromaticum)(bf.30)(例如(bf.30a)，来自C.E.P.L.A.C.,Brazil)、绿木霉(Trichoderma virens)(bf.31)、绿木霉GL-21(bf.31a)(例如(bf.31b)，来自Certis LLC,USA)、绿木霉G1-3(bf.31c)(例如ATCC 58678，来自Novozymes BioAg,Inc.)、绿木霉G1-21(bf.31d)(可从Thermo Trilogy Corporation商购获得)、绿木霉和解淀粉芽孢杆菌(bf.32)、绿木霉G1-3和解淀粉芽孢杆菌FZB24(bf.32a)、绿木霉G1-3和解淀粉芽孢杆菌分离株NRRL B-50349(bf.32b)、绿木霉G1-3和解淀粉芽孢杆菌TJ1000(bf.32c)、绿木霉G1-21和解淀粉芽孢杆菌FZB24(bf.32d)、绿木霉G1-21和解淀粉芽孢杆菌分离株NRRLB-50349(bf.32e)、绿木霉G1-21和解淀粉芽孢杆菌TJ1000(bf.32f)、绿色木霉(bf.33)(例如(bf.33a)，来自Ecosense Labs.(India)Pvt.Ltd.,Indien，BIO-F，来自T.Stanes&Co.Ltd.,Indien)、绿色木霉TV1(bf.33b)(例如绿色木霉TV1，来自Agribiotec srl,Italy)、绿色木霉ICC080(bf.33c)、链霉菌属种分离株NRRL编号B-30145(bf.34)(来自Fa.AgraQuestInc.,USA)、链霉菌属种分离株M1064(bf.35)(来自Fa.AgraQuest Inc.,USA)、鲜黄链霉菌(Streptomycesgalbus)(bf.36)、鲜黄链霉菌分离株NRRL 30232(bf.36a)(来自Fa.AgraQuest Inc.,USA)、利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)(bf.37)、利迪链霉菌WYEC108(bf.37a)(例如分离株ATCC 55445，在来自IdahoResearch Foundation,USA的 ACTINOVATEACTINO-ACTINOVATE和中)、紫黑链霉菌(Streptomycesviolaceusniger)(bf.38)、紫黑链霉菌YCED 9(bf.38a)(例如分离株ATCC 55660，在来自Idaho Research Foundation,USA的DE-THATCH-DECOMP-和THATCH中)、链霉菌WYE 53(bf.39)(例如分离株ATCC 55750，在来自Idaho Research Foundation,USA的DE-THATCH-DECOMP-和THATCH中)和奥德曼细基格孢(Ulocladium oudemansii)(bf.40)、奥德曼细基格孢HRU3(bf.40a)(例如BOTRY-(bf.40b)，来自Botry-Zen Ltd,NZ)。
在一特定实施方案中，微生物是微生物杀昆虫剂、杀螨剂或杀线虫剂。可用于本文公开的方法中的真菌杀昆虫剂、杀螨剂或杀线虫剂的非限制性实例描述于McCoy,C.W.,Samson,R.A.和Coucias,D.G.“Entomogenous fungi.“CRC Handbook of NaturalPesticides.Microbial Pesticides,Part A.Entomogenous Protozoa and Fungi.”(C.M.Inoffo编),(1988):第5卷,151-236；Samson,R.A.,Evans,H.C.和Latge′,J.P.“Atlasof Entomopathogenic Fungi.”(Springer-Verlag,Berlin)(1988)；以及deFaria,M.R.和Wraight,S.P.“Mycoinsecticides and Mycoacaricides:A comprehensive list withworldwide coverage and international classification of formulation types.”Biol.Control(2007),doi:10.1016/j.biocontrol.2007.08.001中。
在各实施方案中，真菌杀昆虫剂、杀螨剂或杀线虫剂可为具有以下属的真菌：虫座孢属(Aegerita)、刺束梗孢属(Akanthomyces)、链格孢属(Alternaria)、节丛孢属(Arthrobotrys)、座壳孢属(Aschersonia)、球囊菌属(Ascophaera)、曲霉属(Aspergillus)、白僵菌属(Beauveria)、芽枝酵母属(Blastodendrion)、丽赤壳属(Calonectria)、雕蚀菌属(Coelemomyces)、腔壶菌属(Coelomycidium)、耳霉属(Conidiobolus)、虫草属(Cordyceps)、库奇霉属(Couchia)、蚊霉属(Culicinomyces)、指霉属(Dactylaria)、侧齿霉属(Engyodontium)、噬虫霉属(Entomophaga)、虫霉属(Entomophthora)、虫疫霉属(Erynia)、丝菌属(Filariomyces)、线黑粉菌属(Filobasidiella)、镰刀菌属(Fusarium)、球束梗孢属(Gibellula)、钩丝孢属(Harposporium)、海茨帕真菌属(Hesperomyces)、被毛孢属(Hirsutella)、层束梗孢属(Hymenostilbe)、亚肉座菌属(Hypocrella)、棒束孢属(Isaria)、蜡蚧菌属(Lecanicillium)、链壶菌属(Lagenidium)、细囊霉属(Leptolegnia)、团孢霉属(Massospora)、绿僵菌属(Metarhizium)、顶裂霉属(Meristacrum)、梅奇酵母属(Metschnikowia)、单顶孢属(Monacrosporium)、生膜菌属(Mycoderma)、蝇壶菌属(Myiophagus)、多腔菌属(Myriangium)、漆斑菌属(Myrothecium)、丛赤壳属(Nectria)、毒虫霉属(Nematoctonus)、新接霉属(Neozygites)、野村菌属(Nomuraea)、拟青霉属(Paecilomyces)、潘多拉属(Pandora)、羽束梗孢属(Paraisaria)、巴斯德氏芽菌属(Pasteuria)、侧链孢属(Pleurodesmospora)、普可尼亚菌属(Pochonia)、柄丛赤壳属(Podonectria)、多头霉属(Polycephalomyces)、拟球束梗孢属(Pseudogibellula)、隔担耳属(Septobasidium)、小团孢属(Sorosporella)、拟小孢霉属(Sporodiniella)、束梗孢属(Stillbella)、四臂壳孢属(Tetranacrium)、多头束霉属(Tilachlidium)、弯颈霉属(Tolypocladium)、锥壳属(Torrubiella)、特雷诺真菌属(Trenomyces)、木霉属(Trichoderma)、拟锈菌属(Uredinella)、轮枝孢菌属(Verticillium)、虫瘟霉属(Zoophthora)及其组合。
可在本文所述的方法中适用作真菌杀昆虫剂、杀螨剂或杀线虫剂的特定物种的非限制性实例包括决明链格孢(Alternaria cassia)(mian.A1)、指状节丛孢(Arthrobotrysdactyloides)(mian.A2)、少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)(mian.A3)、多孢节丛孢(Arthrobotrys superb)(mian.A4)、指状节丛孢(mian.A5)、寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)(mian.A6)、球孢白僵菌(mian.A7)、球孢白僵菌分离株ATCC-74040(mian.A7a)、球孢白僵菌分离株ATCC-74250(mian.A7b)、Dactylaria candida(mian.A8)、砖红镰刀菌(Fusarium lateritum)(mian.A9)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)(mian.A10)、醋线虫钩丝孢(Harposporium anguillulae)(mian.A11)、洛斯里被毛孢(Hirsutella rhossiliensis)(mian.A12)、明尼苏达被毛孢(Hirsutella minnesotensis)(mian.A13)、蜡蚧轮枝菌(Lecanicillium lecanii)(mian.A14)、金龟子绿僵菌(也可在本领域中称为绿僵菌、棕色绿僵菌或“绿色圆叶葡萄菌”)(mian.A15)、金龟子绿僵菌分离株F52(mian.A15a)(也称为金龟子绿僵菌菌株52、金龟子绿僵菌菌株7、金龟子绿僵菌菌株43、金龟子绿僵菌BIO-1020、TAE-001，并且寄存为DSM 3884、DSM 3885、ATCC 90448、SD 170和ARSEF 7711)(可从Novozymes Biologicals,Inc.,USA获得)、柱捕单顶孢(Monacrosporiumcionopagum)(mian.A16)、Nematoctonus geogenius(mian.A17)、滑孢毒虫霉(Nematoctonus leiosporus)(mian.A18)、星孢顶裂霉(Meristacrum asterospermum)(mian.A19)、疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)(mian.A20)、玫烟色拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)(mian.A21)、玫烟色拟青霉FE991(mian.A21a)(在来自FuturEco BioScience S.L.,Barcelona,Spain的中)、淡紫色拟青霉(mian.A22)、穿刺巴斯德氏芽菌(mian.A23)、Pasteuria usage(mian.A24)、厚垣孢普可尼亚菌(Pochonia chlamydopora)(mian.A25)、钩状木霉(Trichoderma hamatum)(mian.A26)、哈茨木霉(mian.A27)、绿木霉(mian.A28)、厚垣孢轮枝孢菌(Verticilliumchlamydosporum)(mian.A29)、蜡蚧轮枝孢菌(Verticillium lecanii)(mian.A30)及其组合。
在一特定实施方案中，微生物是细菌杀昆虫剂、杀螨剂或杀线虫剂。在各实施方案中，细菌杀昆虫剂、杀螨剂或杀线虫剂可为具有以下属的细菌：放线菌属、土壤杆菌属、节杆菌属、产碱杆菌属、金杆菌属、固氮菌属、芽孢杆菌属、拜叶林克氏菌属、伯克霍尔德氏菌属、色杆菌属、棒形杆菌属、梭菌属、丛毛单胞菌属、棒杆菌属、短小杆菌属、脱硫弧菌属(Desulforibtio)、肠杆菌属、黄杆菌属、葡糖杆菌属、噬氢菌属、克雷伯氏菌属、甲基杆菌属、类芽孢杆菌属、叶杆菌属、鞘氨醇杆菌属、发光杆菌属、假单胞菌属、红球菌属(Rhodococcus)、沙雷氏菌属、窄食单胞菌属(Stenotrotrophomonas)、链霉菌属、致病杆菌属、贪噬菌属及其组合。可在本文所述的方法中适用作细菌杀昆虫剂、杀螨剂或杀线虫剂的特定物种的非限制性实例包括坚强芽孢杆菌(mian.B1)、坚强芽孢杆菌分离株I-1582(mian.B1a)(在BioNeem、Votivo中)、蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)(mian.B2)、蕈状芽孢杆菌分离株AQ726，NRRL B-21664(mian.B2a)、伯克霍尔德氏菌属种(mian.B3)、伯克霍尔德氏菌属新种rinojensis(Burkholderia sp.nov.rinojensis)(mian.B3a)、伯克霍尔德氏菌属种A396新种rinojensis，NRRL B-50319(mian.B3b)、拾津贺色杆菌(Chromobacterium subtsugae)(mian.B4)、拾津贺色杆菌新种(mian.B4a)、拾津贺色杆菌新种分离株NRRL B-30655(mian.B4b)、越橘色杆菌(Chromobacterium vaccinii)(mian.B5),越橘色杆菌分离株NRRL B-50880(mian.B5a)、紫色色杆菌(Chromobacteriumviolaceum)(mian.B6)、黄杆菌属种(mian.B7)、黄杆菌属种分离株H492，NRRL B-50584(mian.B7a)、利迪链霉菌(mian.B8)、紫黑链霉菌(mian.B9)及其组合。
在一个实施方案中，本文所述的方法可还包括至少一种有益微生物(“bm”)。至少一种有益微生物可呈孢子形式、营养体形式或其组合。
在特定实施方案中，至少一种有益微生物(“bm”)是固氮生物(即是共生固氮细菌的细菌)。在各实施方案中，固氮生物是具有以下属的细菌：固氮根瘤菌属(Azorhizobium)、固氮螺菌属(Azospirillum)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、根瘤菌属(Rhizobium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)及其组合。可在本文所述的方法中适用作细菌固氮生物的特定物种的非限制性实例包括茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)(bm.A1)、德贝莱纳固氮根瘤菌(Azorhizobiumdoebereinerae)(bm.A2)、亚马逊固氮螺菌(Azospirillum amazonense)(bm.A3)、巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)(bm.A4)、巴西固氮螺菌分离株INTA Az-39(bm.A4a)(可从Novozymes获得)、加拿大固氮螺菌(Azospirillum canadense)(bm.A5)、德贝莱纳固氮螺菌(Azospirillum doebereinerae)(bm.A6)、台湾固氮螺菌(Azospirillum formosense)(bm.A7)、高盐固氮螺菌(Azospirillum halopraeferans)(bm.A8)、伊拉克固氮螺菌(Azospirillum irakense)(bm.A9)、大型移动式固氮螺菌(Azospirillum largimobile)(bm.A10)、生脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)(bm.A11)、糖蜜草固氮螺菌(Azospirillum melinis)(bm.A12)、水稻固氮螺菌(Azospirillum oryzae)(bm.A13)、煤焦固氮螺菌(Azospirillum picis)(bm.A14)、皱纹固氮螺菌(Azospirillum rugosum)(bm.A15)、嗜硫固氮螺菌(Azospirillum thiophilum)(bm.A16)、玉米固氮螺菌(Azospirillum zeae)(bm.A17)、贝特慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)(bm.A18)、加那利慢生根瘤菌(Bradyrhizobium canariense)(bm.A19)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumelkanii)(bm.A20)、埃氏慢生根瘤菌分离株SEMIA 587(bm.A20a)(可从Novozymes获得)、埃氏慢生根瘤菌分离株SEMIA 5019(bm.A20b)(可从Novozymes获得)、西表岛慢生根瘤菌(Bradyrhizobium iriomotense)(bm.A21)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)(bm.A22)、大豆慢生根瘤菌分离株SEMIA 5079(bm.A22a)(可从Novozymes获得)、大豆慢生根瘤菌分离株SEMIA 5080(bm.A22b)(可从Novozymes获得)、大豆慢生根瘤菌分离株NRRLB-50608(bm.A22c)(可从Novozymes获得)、大豆慢生根瘤菌分离株NRRL B-50609(bm.A22d)(可从Novozymes获得)、大豆慢生根瘤菌分离株NRRL B-50610(bm.A22e)(可从Novozymes获得)、大豆慢生根瘤菌分离株NRRL B-50611(bm.A22f)(可从Novozymes获得)、大豆慢生根瘤菌分离株NRRL B-50612(bm.A22g)(可从Novozymes获得)、大豆慢生根瘤菌分离株NRRL B-50592(也寄存为NRRL B-59571)(bm.A22h)(可从Novozymes获得)、大豆慢生根瘤菌分离株NRRL B-50593(也寄存为NRRL B-59572)(bm.A22i)(可从Novozymes获得)、大豆慢生根瘤菌分离株NRRL B-50586(也寄存为NRRL B-59565)(bm.A22j)(可从Novozymes获得)、大豆慢生根瘤菌分离株NRRL B-50588(也寄存为NRRL B-59567)(bm.A22k)(可从Novozymes获得)、大豆慢生根瘤菌分离株NRRL B-50587(也寄存为NRRL B-59566)(bm.A22l)(可从Novozymes获得)、大豆慢生根瘤菌分离株NRRL B-50589(也寄存为NRRL B-59568)(bm.A22m)(可从Novozymes获得)、大豆慢生根瘤菌分离株NRRL B-50591(也寄存为NRRL B-59570)(bm.A22n)(可从Novozymes获得)、大豆慢生根瘤菌NRRL B-50590(也寄存为NRRL B-59569)(bm.A22o)(可从Novozymes获得)、大豆慢生根瘤菌分离株NRRL B-50594(也寄存为NRRL B-50493)(bm.A22p)(可从Novozymes获得)、大豆慢生根瘤菌分离株NRRL B-50726(bm.A22q)(可从Novozymes获得)、大豆慢生根瘤菌分离株NRRL B-50727(bm.A22r)(可从Novozymes获得)、大豆慢生根瘤菌分离株NRRL B-50728(bm.A22s)(可从Novozymes获得)、大豆慢生根瘤菌分离株NRRL B-50729(bm.A22t)(可从Novozymes获得)、大豆慢生根瘤菌分离株NRRL B-50730(bm.A22u)(可从Novozymes获得)、大豆慢生根瘤菌分离株USDA 532C(bm.A22v)、大豆慢生根瘤菌分离株USDA 110(bm.A22w)、大豆慢生根瘤菌分离株USDA 123(bm.A22x)、大豆慢生根瘤菌分离株USDA 127(bm.A22y)、大豆慢生根瘤菌分离株USDA 129(bm.A22z)、豆薯慢生根瘤菌(Bradyrhizobium jicamae)(bm.A23)、辽宁慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumliaoningense)(bm.A24)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium pachyrhizi)(bm.A25)、圆明慢生根瘤菌(Bradyrhizobium yuanmingense)(bm.A26)、合欢中慢生根瘤菌(Mesorhizobium albiziae)(bm.A27)、紫穗槐中慢生根瘤菌(Mesorhizobium amorphae)(bm.A28)、查科中慢生根瘤菌(Mesorhizobium chacoense)(bm.A29)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(Mesorhizobium ciceri)(bm.A30)、华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)(bm.A31)、百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)(bm.A32)、地中海中慢生根瘤菌(Mesorhizobium mediterraneum)(bm.A33)、普卢伊中慢生根瘤菌(Mesorhizobiumpluifarium)(bm.A34)、北方中慢生根瘤菌(Mesorhizobium septentrionale)(bm.A35)、温带中慢生根瘤菌(Mesorhizobium temperatum)(bm.A36)、天山中慢生根瘤菌(Mesorhizobium tianshanense)(bm.A37)、解纤维素根瘤菌(Rhizobiumcellulosilyticum)(bm.A38)、大田市根瘤菌(Rhizobium daejeonense)(bm.A39)、艾利特根瘤菌(Rhizobium etli)(bm.A40)、山羊豆根瘤菌(Rhizobium galegae)(bm.A41)、高卢根瘤菌(Rhizobium gallicum)(bm.A42)、贾氏根瘤菌(Rhizobium giardinii)(bm.A43)、海南根瘤菌(Rhizobium hainanense)(bm.A44)、胡特兰根瘤菌(Rhizobium huautlense)(bm.A45)、木兰根瘤菌(Rhizobium indigoferae)(bm.A46)、豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)(bm.A47)、豌豆根瘤菌分离株SO12A-2-(IDAC 080305-01)(bm.A47a)、黄土根瘤菌(Rhizobium loessense)(bm.A48)、羽扇豆根瘤菌(Rhizobium lupini)(bm.A49)、葡萄牙根瘤菌(Rhizobium lusitanum)(bm.A50)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)(bm.A51)、内蒙根瘤菌(Rhizobium mongolense)(bm.A52)、泊罗江根瘤菌(Rhizobiummiluonense)(bm.A53)、苏拉根瘤菌(Rhizobium sullae)(bm.A54)、热带根瘤菌(Rhizobiumtropici)(bm.A55)、安迪克拉根瘤菌(Rhizobium undicola)(bm.A56)、杨陵根瘤菌(Rhizobium yanglingense)(bm.A57)、阿布里中华根瘤菌(Sinorhizobium abri)(bm.A58)、附着剑中华根瘤菌(Sinorhizobium adhaerens)(bm.A59)、美洲中华根瘤菌(Sinorhizobium americanum)(bm.A60)、木本树中华根瘤菌(Sinorhizobium aboris)(bm.A61)、费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)(bm.A62)、印度中华根瘤菌(Sinorhizobium indiaense)(bm.A63)、柯斯第中华根瘤菌(Sinorhizobium kostiense)(bm.A64)、鸡眼草中华根瘤菌(Sinorhizobium kummerowiae)(bm.A65)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium medicae)(bm.A66)、草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)(bm.A67)、墨西哥中华根瘤菌(Sinorhizobium mexicanus)(bm.A68)、莫雷兰中华根瘤菌(Sinorhizobium morelense)(bm.A69)、撒哈拉中华根瘤菌(Sinorhizobium saheli)(bm.A70)、好客中华根瘤菌(Sinorhizobium terangae)(bm.A71)、新疆中华根瘤菌(Sinorhizobium xinjiangense)(bm.A72)及其组合。
在特定实施方案中，至少一种有益微生物(“bm”)是溶磷微生物。在各实施方案中，至少一种溶磷微生物是具有以下属的真菌：青霉属(Penicillium)、踝节菌属(Talaromyces)及其组合。可在本文所述的方法中适用作溶磷真菌的特定物种的非限制性实例包括发白青霉(Penicillium albidum)(bm.B1)、黄灰青霉(Penicilliumaurantiogriseum)(bm.B2)、拜赖青霉(Penicillium bilaiae)(先前称为拜莱青霉(Penicillium bilaii)和拜拉吉青霉(Penicillium bilaji))(bm.B3)、拜赖青霉分离株ATCC 20851(bm.B3a)、拜赖青霉分离株ATCC 22348(bm.B3b)、拜赖青霉分离株V08/021001(也寄存为NRRL B-50612)(bm.B3c)、拜赖青霉分离株NRRL B-50776(bm.B3d)、拜赖青霉分离株NRRL B-50777(bm.B3e)、拜赖青霉分离株NRRL B-50778(bm.B3f)、拜赖青霉分离株NRRL B-50779(bm.B3g)、拜赖青霉分离株NRRL B-50780(bm.B3h)、拜赖青霉分离株NRRL B-50781(bm.B3i)、拜赖青霉分离株NRRL B-50782(bm.B3j)、拜赖青霉分离株NRRL B-50783(bm.B3k)、拜赖青霉分离株NRRL B-50784(bm.B3l)、拜赖青霉分离株NRRL B-50785(bm.B3m)、拜赖青霉分离株NRRL B-50786(bm.B3n)、拜赖青霉分离株NRRL B-50787(bm.B3o)、拜赖青霉分离株NRRL B-50788(bm.B3p)、拜赖青霉分离株NRRL B-50169(bm.B3q)、拜赖青霉分离株ATCC 18309(bm.B3r)、短密青霉(Penicilliumbrevicompactum)(bm.B4)、短密青霉分离株AgRF18(bm.B4a)、灰白青霉(Penicilliumcanescens)(bm.B5)、灰白青霉分离株ATCC 10419(bm.B5a)、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)(bm.B6)、黄暗青霉(Penicillium citreonigrum)(bm.B7)、桔青霉(Penicillium citrinum)(bm.B8)、指状青霉(Penicillium digitatum)(bm.B9)、扩展青霉(Penicillium expansum)(bm.B10)、扩展青霉分离株ATCC 24692(bm.B10a)、扩展青霉分离株YT02(bm.B10b)、瘿青霉(Penicillium fellutanum)(bm.B11)、瘿青霉分离株ATCC 48694(bm.B11a)、常见青霉(Penicillium frequentas)(bm.B12)、褐青霉(Penicillium fuscum)(bm.B13)、菲西氏青霉(Penicillium fussiporus)(bm.B14)、加斯特氏青霉(Penicilliumgaestrivorus)(bm.B15)、加斯特氏青霉分离株NRRL50170(bm.B15a)、平滑青霉(Penicillium glabrum)(bm.B16)、平滑青霉分离株DAOM 239074(bm.B16a)、平滑青霉分离株CBS 229.28(bm.B16b)、灰绿青霉(Penicillium glaucum)(bm.B17)、灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)(bm.B18)、纠缠青霉(Penicillium implicatum)(bm.B19)、微紫青霉(Penicillium janthinellum)(bm.B20)、微紫青霉分离株ATCC 10455(bm.B20a)、Penicillium lanosocoeruleum(bm.B21)、Penicillium lanosocoeruleum分离株ATCC48919(bm.B21a)、淡紫青霉(Penicillium lilacinum)(bm.B22)、朱黄青霉(Penicilliumminioluteum)(bm.B23)、蒙大拿青霉(Penicillium montanense)(bm.B24)、黑青霉(Penicillium nigricans)(bm.B25)、草酸青霉(Penicillium oxalicum)(bm.B26)、松木青霉(Penicillium pinetorum)(bm.B27)、嗜松青霉(Penicillium pinophilum)(bm.B28)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)(bm.B29)、放射青霉(Penicillium radicum)(bm.B30)、放射青霉分离株N93/47267(bm.B30a)、放射青霉分离株FRR 4717(bm.B30b)、放射青霉分离株ATCC 201836(bm.B30c)、放射青霉分离株FRR 4719(bm.B30d)、雷斯青霉(Penicillium raistrickii)(bm.B31)、雷斯青霉分离株ATCC 10490(bm.B31a)、皱褶青霉(Penicillium rugulosum)(bm.B32)、简青霉(Penicillium simplicissimum)(bm.B33)、离生青霉(Penicillium solitum)(bm.B34)、变幻青霉(Penicillium variabile)(bm.B35)、毡毛青霉(Penicillium velutinum)(bm.B36)、鲜绿青霉(Penicillium viridicatum)(bm.B37)、棘孢踝节菌(Talaromyces aculeatus)(bm.B38)、棘孢踝节菌分离株ATCC 10409(bm.B38a)及其组合。
在特定实施方案中，至少一种有益微生物(“bm”)是菌根。合适的菌根包括内菌根(也称为囊泡丛枝状菌根、VAM、丛枝状菌根或AM)、外菌根、石南型菌根(ericoidmycorrhiza)及其组合。在各实施方案中，菌根是具有以下属的真菌：巨孢囊霉属(Gigaspora)、球囊霉属(Glomus)、膜盘菌属(Hymenoscyphous)、蜡蘑属(Laccaria)、树粉孢属(Oidiodendron)、类球囊霉属(Paraglomus)、豆马勃属(Pisolithus)、丝核菌属(Rhizoctonia)、须腹菌属(Rhizopogon)、硬皮马勃属(Scleroderma)及其组合。可适用于本文所述的组合物中的特定菌根物种的非限制性实例包括珠状巨孢囊霉(Gigasporamargarita)(bm.C1)、聚丛球囊霉(Glomus aggregatum)(bm.C2)、巴西球囊霉(Glomusbrasilianum)(bm.C3)、明球囊霉(Glomus clarum)(bm.C4)、沙漠球囊霉(Glomusdeserticola)(bm.C5)、幼套球囊霉(Glomus etunicatum)(bm.C6)、聚生球囊霉(Glomusfasciculatum)(bm.C7)、根内球囊霉(Glomus intraradices)、(bm.C8)、单孢球囊霉(Glomus monosporum)(bm.C9)、摩西球囊霉(Glomus mosseae)(bm.C10)、灰斑膜盘菌(Hymenoscyphous ericae)(bm.C11)、双色蜡蘑(Laccaria bicolor)(bm.C12)、漆蜡蘑(Laccaria laccata)(bm.C13)、树粉孢属种(bm.C14)、巴西类球囊霉(Paraglomusbrazilianum)(bm.C15)、彩色豆马勃(Pisolithus tinctorius)(bm.C16)、丝核菌属种(bm.C17)、阿米尔氏须腹菌(Rhizopogon amylopogon)(bm.C18)、富尔维氏须腹菌(Rhizopogon fulvigleba)(bm.C19)、浅黄根须腹菌(Rhizopogon luteolus)(bm.C20)、长毛须腹菌(Rhizopogon villosuli)(bm.C21)、光硬皮马勃(Scleroderma cepa)(bm.C22)、橙黄硬皮马勃(Scleroderma citrinum)(bm.C23)、(珠状巨孢囊霉、聚丛球囊霉、巴西球囊霉、明球囊霉、沙漠球囊霉、幼套球囊霉、根内球囊霉、单孢球囊霉、摩西球囊霉、双色蜡蘑、漆蜡蘑、彩色豆马勃、阿米尔氏须腹菌、富尔维氏须腹菌、浅黄根须腹菌、长毛须腹菌、光硬皮马勃和橙黄硬皮马勃)(bm.C24)(可从Novozymes获得)、(珠状巨孢囊霉、聚丛球囊霉、明球囊霉、沙漠球囊霉、幼套球囊霉、根内球囊霉、单孢球囊霉、摩西球囊霉、双色蜡蘑、漆蜡蘑、巴西类球囊霉、彩色豆马勃、阿米尔氏须腹菌、富尔维氏须腹菌、浅黄根须腹菌、长毛须腹菌、光硬皮马勃和橙黄硬皮马勃)(bm.C25)(可从Novozymes获得)、(珠状巨孢囊霉、聚丛球囊霉、巴西球囊霉、明球囊霉、沙漠球囊霉、幼套球囊霉、根内球囊霉、单孢球囊霉和摩西球囊霉)(bm.C26)(可从Novozymes获得)及其组合。
待在本文提供的方法中关于存活于种子处理组分和过程的情况下的能力加以筛选的微生物可从许多环境获得。在一个实施方案中，从环境土壤样品获得微生物，所述土壤样品包括从非农业场所获得的土壤或来自当前或先前用于农业例如用于商业或小规模农作的场所的土壤。当例如从以最小程度扰动的非农业场所获得土壤样品时，本文所述的方法可导致对与现代农业环境无关的微生物的分离、选择和鉴定。土壤可从支持微生物生长的任何环境获得，并且可包括例如砂质土壤、粘性土壤、草原土壤、泥炭土壤和壤质土壤。
在一个实施方案中，发现的是在测试对种子处理组分和方法的耐受性之前与给定目标植物相关的在本文所述的方法中测试的微生物。举例来说，微生物可与生长在农田中的作物植物相关，所述农田即在其中载培作物植物的田野，如与未在其中载培作物植物的未开垦环境相区分。或者，可收集来自目标环境的土壤样品，并且将作物植物种子种植在土壤中并使其在受控环境(包括例如植物生长室或温室)中生长。当使植物在受控环境中生长时，可使环境土壤样品与无机或有机植物生长材料混合以使植物生长条件最优化，包括诸如蛭石、珍珠岩、泥煤等的材料。无论是使植物在农田中还是在受控环境中生长，都可收集植物和根际，并且从样品提取相关微生物。可在许多植物生长阶段收集植物和土壤，但优先在出现第一真叶之后收割植物。也可在更迟生长阶段收割植物，包括例如早期营养阶段(V3-V4)、晚期营养阶段，或甚至在成熟期。
植物相关的微生物的初始来源不限于可受益于施加所鉴定的微生物的植物。举例来说，可显示与一个植物物种相关的微生物会提供有益于来自相同或不同物种的作物植物的生长的性质。
在一个实施方案中，可由作物植物根和从其分离的微生物产生根际微生物细胞混悬液，例如通过搅拌植物材料和/或细胞混悬液(例如声波处理)以使根相关的微生物释放至溶液中。在其它实施方案中，内球/叶圈细胞混悬液可通过将植物嫩芽、茎干、叶、花或果实浸没至溶液中，以及通过剧烈掺合和/或珠粒击打使它们浸软以达到某一浆液稠度来产生。在某些实施方案中，使微生物细胞混悬液浓缩以增加每体积制剂的微生物数目。在一个实施方案中，使用于本文方法中的微生物混悬液浓缩以提供具有每毫升混悬液106至109CFU的混悬液。在其它实施方案中，使用为本领域技术人员所知的方法(例如过滤、差速离心和/或密度-梯度离心)纯化所得微生物细胞混悬液以移除植物/土壤碎片，并且提供更加浓缩的微生物混悬液。在一个实施方案中，进一步纯化用于提供来自多个植物(包括相同或不同物种的植物)的汇合细菌混悬液。在其它实施方案中，细胞混悬液可为存在于微生物丛中的所有细菌、真菌和古细菌(包括但不限于见于土壤、植物组织和水体中的那些)的代表性样品。在使用培养微生物的其它实施方案中，例如可如本文所述或如本领域中所知产生由培养物保藏物获得的各批已知微生物，无论所述微生物先前与生长植物相关还是仅从环境样品分离；并且使用本文所述的方法加以筛选。
种子处理组分
本文所述的筛选方法中的种子处理组分可包括至少一种杀虫剂。种子处理剂可包括例如杀真菌剂(“f”)。适用杀真菌剂可为生物杀真菌剂(“bf”)、化学杀真菌剂(“cf”)或其组合。可选择杀真菌剂以便提供对广谱植物病原性真菌的有效控制，所述真菌包括土壤携带的真菌，其尤其源于以下纲：根肿菌纲(Plasmodiophoromycetes)、霜霉卵菌纲(Peronosporomycetes)(同义词卵菌纲(Oomycetes))、壶菌纲(Chytridiomycetes)、接合菌纲(Zygomycetes)、子囊菌纲(Ascomycetes)、担子菌纲(Basidiomycetes)和半知菌纲(Deuteromycetes)(同义词不完全菌纲(Fungi imperfecti))。可被有效靶向的更常见的真菌病原体包括疫霉属(Pytophthora)、丝核菌属、镰刀菌属、腐霉属(Pythium)、拟茎点霉属(Phomopsis)或核盘菌属(Selerotinia)和层锈菌属(Phakopsora)及其组合。
在某些实施方案中，杀真菌剂是化学杀真菌剂(“cf”)。可适用于本公开中的适用化学杀真菌剂(“cf”)的代表性实例包括芳族烃、苯并咪唑、苯并噻二唑、羧酰胺、羧酸酰胺、吗啉、苯基酰胺、膦酸酯、醌外部抑制剂(例如嗜球果伞素(strobilurin))、噻唑烷、托布津(thiophanate)、噻吩羧酰胺和三唑：
A)嗜球果伞素(cf.A)：
嘧菌酯(azoxystrobin)(cf.A1)、甲香菌酯(coumethoxystrobin)(cf.A2)、丁香菌酯(coumoxystrobin)(cf.A3)、醚菌胺(dimoxystrobin)(cf.A4)、烯肟菌酯(enestroburin)(cf.A5)、氟嘧菌酯(fluoxastrobin)(cf.A6)、醚菌酯(kresoxim-methyl)(cf.A7)、苯氧菌胺(metominostrobin)(cf.A8)、肟醚菌胺(orysastrobin)(cf.A9)、啶氧菌酯(picoxystrobin)(cf.A10)、吡唑醚菌酯(cf.A11)、唑胺菌酯(pyrametostrobin)(cf.A12)、唑菌酯(pyraoxystrobin)(cf.A13)、吡菌苯威(pyribencarb)(cf.A14)、肟菌酯(cf.A15)、2-[2-(2,5-二甲基-苯氧基甲基)-苯基]-3-甲氧基-丙烯酸甲酯(cf.A16)和2-(2-(3-(2,6-二氯苯基)-1-甲基-亚烯丙基氨基氧基甲基)-苯基)-2-甲氧基亚氨基-N-甲基-乙酰胺(cf.A17)；
B)羧酰胺(cf.B)：
羧酰苯胺(carboxanilide)(cf.B1)：苯霜灵(benalaxyl)(cf.B1a)、精苯霜灵(benalaxyl-M)(cf.B1b)、麦锈灵(benodanil)(cf.B1c)、联苯吡菌胺(bixafen)(cf.B1d)、啶酰菌胺(boscalid)(cf.B1d)、萎锈灵(carboxin)(cf.B1e)、甲呋酰胺(fenfuram)(cf.B1f)、环酰菌胺(fenhexamid)(cf.B1g)、氟酰胺(flutolanil)(cf.B1h)、氟苯吡菌胺(cf.B1i)、呋吡菌胺(furametpyr)(cf.B1j)、吡唑萘菌胺(isopyrazam)(cf.B1k)、异噻菌胺(isotianil)(cf.B1l)、精苯霜灵(kiralaxyl)(cf.B1m)、灭锈胺(mepronil)(cf.B1n)、甲霜灵(cf.B1o)、精甲霜灵(metalaxyl-M/mefenoxam)(cf.B1p)、呋酰胺(ofurace)(cf.B1q)、噁霜灵(oxadixyl)(cf.B1r)、氧化萎锈灵(oxycarboxin)(cf.B1s)、戊苯吡菌胺(penflufen)(cf.B1t)、吡噻菌胺(penthiopyrad)(cf.B1u)、氟唑环菌胺(sedaxane)(cf.B1v)、叶枯酞(tecloftalam)(cf.B1w)、噻呋酰胺(thifluzamide)(cf.B1x)、噻酰菌胺(tiadinil)(cf.B1y)、2-氨基-4-甲基-噻唑-5-甲酰苯胺(cf.B1z)、N-(4'-三氟甲基硫基联苯基-2-基)-3-二氟甲基-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺(cf.B1aa)和N-(2-(1,3,3-三甲基丁基)-苯基)-1,3-二甲基-5-氟-1H-吡唑-4-甲酰胺(cf.B1ab)；
羧酸酰吗啉(cf.B2)：烯酰吗啉(dimethomorph)(cf.B2a)、氟吗啉(flumorph)(cf.B2b)、丁吡吗啉(pyrimorph)(cf.B2c)；苯甲酸酰胺(CF.B3)：氟酰菌胺(flumetover)(cf.B3a)、氟吡菌胺(fluopicolide)(cf.B3b)、氟吡菌酰胺(fluopyram)(cf.B3c)、苯酰菌胺(zoxamide)(cf.B3d)；其它羧酰胺(cf.B4)：环丙酰菌胺(carpropamid)(cf.B4a)、双氯氰菌胺(dicyclomet)(cf.B4b)、双炔酰菌胺(mandiproamid)(cf.B4c)、氧四环素(oxytetracyclin)(cf.B4d)、硅噻菌胺(silthiofam)(cf.B4e)和N-(6-甲氧基-吡啶-3-基)环丙烷甲酸酰胺(cf.B4f)；
C)唑(cf.C)：
三唑(cf.C1)：阿扎康唑(azaconazole)(cf.C1a)、联苯三唑醇(bitertanol)(cf.C1b)、糠菌唑(bromuconazole)(cf.C1c)、环丙唑醇(cyproconazole)(cf.C1d)、苯醚甲环唑(difenoconazole)(cf.C1e)、烯唑醇(diniconazole)(cf.C1f)、精烯唑醇(diniconazole-M)(cf.C1g)、氟环唑(epoxiconazole)(cf.C1h)、腈苯唑(fenbuconazole)(cf.C1i)、氟喹唑(fluquinconazole)(cf.C1j)、氟硅唑(flusilazole)(cf.C1k)、粉唑醇(flutriafol)(cf.C1l)、己唑醇(hexaconazole)(cf.C1m)、亚胺唑(imibenconazole)(cf.C1n)、种菌唑(cf.C1o)、叶菌唑(metconazole)(cf.C1p)、腈菌唑(cf.C1q)、噁咪唑(oxpoconazole)(cf.C1r)、多效唑(paclobutrazole)(cf.C1s)、戊菌唑(penconazole)(cf.C1t)、丙环唑(propiconazole)(cf.C1u)、丙硫菌唑(prothioconazole)(cf.C1v)、硅氟唑(simeconazole)(cf.C1w)、戊唑醇(tebuconazole)(cf.C1x)、氟醚唑(tetraconazole)(cf.C1y)、粉锈宁(triadimefon)(cf.C1z)、三唑醇(triadimenol)(cf.C1aa)、灭菌唑(triticonazole)(cf.C1ab)、烯效唑(uniconazole)(cf.C1ac)；咪唑(cf.C2)：氰霜唑(cyazofamid)(cf.C2a)、抑霉唑(imazalil)(cf.C2b)、稻瘟酯(pefurazoate)(cf.C2c)、咪鲜胺(prochloraz)(cf.C2d)、氟菌唑(triflumizol)(cf.C2e)；
D)杂环化合物(cf.D)：
吡啶(cf.D1)：氟啶胺(fluazinam)(cf.D1a)、啶斑肟(pyrifenox)(cf.D1b)、3-[5-(4-氯-苯基)-2,3-二甲基-异噁唑烷-3-基]-吡啶(cf.D1c)、3-[5-(4-甲基-苯基)-2,3-二甲基-异噁唑烷-3-基]-吡啶(cf.D1d)；嘧啶(cf.D2)：乙嘧酚磺酸酯(bupirimate)(cf.D2a)、嘧菌环胺(cyprodinil)(cf.D2b)、二氟林(diflumetorim)(cf.D2c)、氯苯嘧啶醇(fenarimol)(cf.D2d)、嘧菌腙(ferimzone)(cf.D2e)、嘧菌胺(mepanipyrim)(cf.D2f)、氯啶(nitrapyrin)(cf.D2g)、氟苯嘧啶醇(nuarimol)(cf.D2h)、嘧霉胺(pyrimethanil)(cf.D2i)；哌嗪(cf.D3)：嗪氨灵(triforine)(cf.D3a)；吡咯(cf.D4)：拌种咯(fenpiclonil)(cf.D4a)、氟咯菌腈(fludioxonil)(cf.D4b)；吗啉(cf.D5)：杀螟丹(aldimorph)(cf.D5a)、吗菌灵(dodemorph)(cf.D5b)、乙酸吗菌灵(dodemorph-acetate)(cf.D5c)、丁苯吗啉(fenpropimorph)(cf.D5d)、克啉菌(tridemorph)(cf.D5e)；哌啶(cf.D6)：苯锈啶(fenpropidin)(cf.D6a)；二羧酰亚胺(cf.D7)：氟菌安(fluoroimid)(cf.D7a)、异菌脲(iprodione)(cf.D7b)、腐霉利(procymidone)(cf.D7c)、烯菌酮(vinclozolin)(cf.D7d)；非芳族5元杂环(cf.D8)：噁唑菌酮(famoxadone)(cf.D8a)、咪唑菌酮(fenamidone)(cf.D8b)、氟噻菌净(flutianil)(cf.D8c)、辛噻酮(octhilinone)(cf.D8d)、噻菌灵(probenazole)(cf.D8e)、5-氨基-2-异丙基-3-氧代-4-邻甲苯基-2,3-二氢-吡唑-1-硫代酸S-烯丙酯(cf.D8f)；其它(cf.D9)：阿拉酸式苯-S-甲基(acibenzolar-S-methyl)(cf.D9a)、唑嘧菌胺(ametoctradin)(cf.D9b)、安美速(amisulbrom)(cf.D9c)、敌菌灵(anilazin)(cf.D9d)、杀稻瘟菌素-S(blasticidin-S)(cf.D9e)、敌菌丹(captafol)(cf.D9f)、克菌丹(captan)(cf.D9g)、灭螨猛(chinomethionat)(cf.D9h)、棉隆(dazomet)(cf.D9i)、咪菌威(debacarb)(cf.D9j)、哒菌清(diclomezine)(cf.D9k)、野燕枯(difenzoquat)(cf.D9l)、甲基硫酸野燕枯(difenzoquat-methylsulfate)(cf.D9m)、氰菌胺(fenoxanil)(cf.D9n)、灭菌丹(Folpet)(cf.D9o)、噁喹酸(oxolinic acid)(cf.D9p)、粉病灵(piperalin)(cf.D9q)、丙氧喹啉(proquinazid)(cf.D9r)、咯喹酮(pyroquilon)(cf.D9s)、喹氧灵(quinoxyfen)(cf.D9t)、咪唑嗪(triazoxide)(cf.D9u)、三环唑(tricyclazole)(cf.D9v)、2-丁氧基-6-碘-3-丙基色烯-4-酮(cf.D9w)、5-氯-1-(4,6-二甲氧基-嘧啶-2-基)-2-甲基-1H-苯并咪唑(cf.D9x)和5-氯-7-(4-甲基哌啶-1-基)-6-(2,4,6-三氟苯基)-[1,2,4]三唑并-[1,5-a]嘧啶(cf.D9y)；
E)苯并咪唑(cf.E)：多菌灵(carbendazim)(cf.E1)。
F)其它活性物质(cf.F)：
胍(cf.F1)：胍(cf.F1a)、多果定(dodine)(cf.F1b)、多果定游离碱(cf.F1c)、双胍辛(guazatine)(cf.F1d)、乙酸双胍辛(cf.F1e)、双胍辛胺(iminoctadine)(cf.F1f)、三乙酸双胍辛胺(cf.F1g)、双胍三辛烷基苯磺酸盐(iminoctadine-tris(albesilate))(cf.F1h)；抗生素(cf.F2)：春雷霉素(kasugamycin)(cf.F2a)、盐酸春雷霉素水合物(cf.F2b)、链霉素(streptomycin)(cf.F2c)、多氧霉素(polyoxine)(cf.F2d)、有效霉素A(validamycin A)(cf.F2e)；硝基苯基衍生物(cf.F3)：乐杀螨(binapacryl)(cf.F3a)、氯硝胺(dicloran)(cf.F3b)、消螨通(dinobuton)(cf.F3c)、敌螨普(dinocap)(cf.F3d)、酞菌酯(nitrothal-isopropyl)(cf.F3e)、四氯硝基苯(tecnazen)(cf.F3f)、有机金属化合物(cf.F4)：三苯基锡盐(fentin salt)(cf.F4a)，诸如三苯基乙酸锡(cf.F4b)、三苯基氯化锡(cf.F4c)或三苯基氢氧化锡(cf.F4d)；含硫杂环基化合物(cf.F5)：二噻农(dithianon)(cf.F5a)、稻瘟灵(isoprothiolane)(cf.F5b)；有机磷化合物(cf.F6)：克瘟散(edifenphos)(cf.F6a)、藻菌磷(fosetyl)(cf.F6b)、乙膦铝(fosetyl-aluminum)(cf.F6c)、异稻瘟净(iprobenfos)(cf.F6d)、磷酸和它的盐(cf.F6e)、定菌磷(pyrazophos)(cf.F6f)、甲基立枯磷(tolclofos-methyl)(cf.F6g)；有机氯化合物(cf.F7)：百菌清(chlorothalonil)(cf.F7a)、抑菌灵(dichlofluanid)(cf.F7b)、二氯芬(dichlorophen)(cf.F7c)、磺菌胺(flusulfamide)(cf.F7d)、六氯苯(hexachlorobenzene)(cf.F7e)、戊菌隆(pencycuron)(cf.F7f)、五氯酚(pentachlorphenole)和它的盐(cf.F7g)、苯酞(phthalide)(cf.F7h)、五氯硝基苯(quintozene)(cf.F7i)、甲基托布津(thiophanate-methyl)(cf.F7j)、托布津(thiophanate)(cf.F7k)、对甲抑菌灵(tolylfluanid)(cf.F7l)、N-(4-氯-2-硝基-苯基)-N-乙基-4-甲基-苯磺酰胺(cf.F7m)；无机活性物质(cf.F8)：波尔多混合物(Bordeaux mixture)(cf.F8a)、乙酸铜(cf.F8b)、氢氧化铜(cf.F8c)、碱式氯化铜(copper oxychloride)(cf.F8d)、碱式硫酸铜(cf.F8e)和硫(cf.F8f)。
含有杀真菌剂的商业产品是可易于获得的。杀真菌剂在方法中的浓度将通常对应于特定杀真菌剂的标记使用比率。
在一个实施方案中，用于本文所述的方法中的种子处理组分可包括至少一种除草剂(“h”)。
除草剂的类型的非限制性实例包括乙酰辅酶A羧化酶(ACC酶)抑制剂(h.A)、乙酰乳酸合酶(ALS)(h.B)或乙酰羟酸合酶(AHAS)抑制剂(h.C)、光系统II抑制剂(h.D)、光系统I抑制剂(h.E)、原卟啉原氧化酶(PPO或Protox)抑制剂(h.F)、类胡萝卜素生物合成抑制剂(h.G)、烯醇丙酮酰基莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶抑制剂(h.H)、谷氨酰胺合成酶抑制剂(h.I)、二氢蝶呤合成酶抑制剂(h.J)、有丝分裂抑制剂(h.K)、4-羟苯基-丙酮酸-双加氧酶(4-HPPD)抑制剂(h.L)、合成生长素(h.M)、生长素除草剂盐(h.N)、生长素转运抑制剂(h.O)和核酸抑制剂(h.P)、其盐和酯；其外消旋混合物和拆分异构体；及其组合。
可用于本文所述的种子处理方法中的可能除草剂(“h”)的特定实例包括2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)(h.1)、2,4,5-三氯苯氧乙酸(2,4,5-T)(h.2)、莠灭净(ametryn)(h.3)、氨唑草酮(amicarbazone)(h.4)、氯丙嘧啶酸(aminocyclopyrachlor)(h.5)、乙草胺(acetochlor)(h.6)、三氟羧草醚(acifluorfen)(h.7)、草不绿(alachlor)(h.8)、莠去津(atrazine)(h.9)、唑啶草酮(azafenidin)(h.10)、灭草松(bentazon)(h.11)、吡草酮(benzofenap)(h.12)、治草醚(bifenox)(h.13)、除草定(bromacil)(h.14)、溴苯腈(bromoxynil)(h.15)、去草胺(butachlor)(h.16)、氟丙嘧草酯(butafenacil)(h.17)、丁苯草酮(butroxydim)(h.18)、唑草酮乙酯(carfentrazone-ethyl)(h.19)、氯嘧黄隆(chlorimuron)(h.20)、绿麦隆(chlorotoluron)(h.21)、烯草酮(clethodim)(h.22)、炔草酸(clodinafop)(h.23)、异噁草酮(clomazone)(h.24)、草净津(cyanazine)(h.25)、噻草酮(cycloxydim)(h.26)、氰氟草酸(cyhalofop)(h.27)、甜菜安(desmedipham)(h.28)、敌草净(desmetryn)(h.29)、麦草畏(dicamba)(h.30)、禾草灵(diclofop)(h.31)、噁唑隆(dimefuron)(h.32)、敌草隆(diuron)(h.33)、氟硫草定(dithiopyr)(h.34)、噁唑禾草灵(fenoxaprop)(h.35)、吡氟禾草灵(fluazifop)(h.36)、精吡氟禾草灵(fluazifop-P)(h.37)、伏草隆(fluometuron)(h.38)、氟哒嗪草酮乙酯(flufenpyr-ethyl)(h.39)、氟烯草酸戊酯(flumiclorac-pentyl)(h.40)、丙炔氟草胺(flumioxazin)(h.41)、乙羧氟草醚(fluoroglycofen)(h.42)、嗪草酸甲酯(fluthiacet-methyl)(h.43)、氟磺草(fomesafe)(h.44)、氟磺胺草醚(fomesafen)(h.45)、草甘膦(glyphosate)(h.46)、草铵膦(glufosinate)(h.47)、吡氟氯禾灵(haloxyfop)(h.48)、环嗪酮(hexazinone)(h.49)、甲氧咪草烟(imazamox)(h.50)、灭草喹(imazaquin)(h.51)、咪草烟(imazethapyr)(h.52)、碘苯腈(ioxynil)(h.53)、异丙隆(isoproturon)(h.54)、异噁唑草酮(isoxaflutole)(h.55)、乳氟禾草灵(lactofen)(h.56)、利谷隆(linuron)(h.57)、甲氯丙酸(mecoprop)(h.58)、精甲氯丙酸(mecoprop-P)(h.59)、硝磺草酮(mesotrione)(h.60)、苯嗪草酮(metamitron)(h.61)、吡唑草胺(metazochlor)(h.62)、甲基苯噻隆(methibenzuron)(h.63)、异丙甲草胺(metolachlor)(h.64)(和精异丙甲草胺(S-metolachlor)(h.65))、甲氧隆(metoxuron)(h.66)、嗪草酮(metribuzin)(h.67)、绿谷隆(monolinuron)(h.68)、丙炔噁草酮(oxadiargyl)(h.69)、噁草酮(oxadiazon)(h.70)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)(h.71)、苯敌草(phenmedipham)(h.72)、丙草胺(pretilachlor)(h.73)、环苯草酮(profoxydim)(h.74)、扑灭通(prometon)(h.75)、扑草净(prometryn)(h.76)、毒草安(propachlor)(h.77)、敌稗(propanil)(h.78)、喔草酯(propaquizafop)(h.79)、异丙草胺(propisochlor)(h.80)、吡草醚乙酯(pyraflufen-ethyl)(h.81)、杀草敏(pyrazon)(h.82)、吡唑特(pyrazolynate)(h.83)、苄草唑(pyrazoxyfen)(h.84)、哒草特(pyridate)(h.85)、喹禾灵(quizalofop)(h.86)、精喹禾灵(quizalofop-P)(h.87)(例如喹禾灵乙酯(quizalofop-ethyl)(h.88)、精喹禾灵乙酯(quizalofop-P-ethyl)(h.89)、炔草酸丙炔酯(clodinafop-propargyl)(h.90)、氰氟草酸丁酯(cyhalofop-butyl)(h.91)、禾草灵甲酯(diclofop-methyl)(h.92)、精噁唑禾草灵乙酯(fenoxaprop-P-ethyl)(h.93)、精吡氟禾草灵丁酯(fluazifop-P-butyl)(h.94)、吡氟氯禾灵甲酯(haloxyfop-methyl)(h.95)、高效吡氟氯禾灵甲酯(haloxyfop-R-methyl)(h.96))、苯嘧磺草胺(saflufenacil)(h.97)、稀禾定(sethoxydim)(h.98)、环草隆(siduron)(h.99)、西玛津(simazine)(h.100)、西草净(simetryn)(h.101)、磺草酮(sulcotrione)(h.102)、甲磺草胺(sulfentrazone)(h.103)、丁噻隆(tebuthiuron)(h.104)、环磺酮(tembotrione)(h.105)、吡喃草酮(tepraloxydim)(h.106)、特草定(terbacil)(h.107)、甲氧去草净(terbumeton)(h.108)、特丁津(terbuthylazine)(h.109)、萨托明(thaxtomin)(例如如美国专利号：7,989,393中所述的萨托明)(h.110)、噻吩草胺(thenylchlor)(h.111)、肟草酮(tralkoxydim)(h.112)、三氯吡氧乙酸(triclopyr)(h.113)、草达津(trietazine)(h.114)、苯吡唑草酮(tropramezone)(h.115)及其盐和酯；其外消旋混合物和拆分异构体、及其组合。
含有除草剂的商业产品是可易于获得的。除草剂在组合物中的浓度将通常对应于特定除草剂的标记使用比率。
可适用于本文公开的方法中使用的种子处理组分中的化学杀昆虫剂、杀螨剂和杀线虫剂(“cian”)的非限制性实例包括氨基甲酸酯(cian.A)、二酰胺(cian.B)、大环内酯(cian.C)、新烟碱类(neonicotinoid)(cian.D)、有机磷酸酯(cian.E)、苯基吡唑(cian.F)、除虫菊酯(pyrethrin)(cian.G)、多杀菌素(spinosyn)(cian.H)、合成拟除虫菊酯(cian.I)、季酮酸(tetronic acid)(cian.J)和季胺酸(tetramic acid)(cian.K)。
在特定实施方案中，适用的化学杀昆虫剂、杀螨剂和杀线虫剂包括氟丙菊酯(acrinathrin)(cian.1)、α-氯氰菊酯(alpha-cypermethrin)(cian.2)、高效氟氯氰菊酯(betacyfluthrin)(cian.3)、氯氟氰菊酯(cyhalothrin)(cian.4)、氯氰菊酯(cypermethrin)(cian.5)、溴氰菊酯(deltamethrin)(cian.6)、高氰戊菊酯(csfenvalcrate)(cian.7)、依芬普司(etofenprox)(cian.8)、甲氰菊酯(fenpropathrin)(cian.9)、氰戊菊酯(fenvalerate)(cian.10)、氟氰戊菊酯(flucythrinat)(cian.11)、噻唑膦(fosthiazate)(cian.12)、λ-氯氟氰菊酯(lambda-cyhalothrin)(cian.13)、γ-氯氟氰菊酯(gamma-cyhalothrin)(cian.14)、苄氯菊酯(permethrin)(cian.15)、τ-氯氟胺氰戊菊酯(tau-fluvalinate)(cian.16)、四氟苯菊酯(transfluthrin)(cian.17)、ζ-氯氰菊酯(zeta-cypermethrin)(cian.18)、氟氯氰菊酯(cyfluthrin)(cian.19)、联苯菊酯(bifenthrin)(cian.20)、七氟菊酯(tefluthrin)(cian.21)、硅白灵(eflusilanat)(cian.22)、苄螨醚(fubfenprox)(cian.23)、除虫菊酯(pyrethrin)(cian.24)、灭虫菊(resmethrin)(cian.25)、吡虫啉(cian.26)、啶虫脒(acetamiprid)(cian.27)、噻虫嗪(cian.28)、烯啶虫胺(nitenpyram)(cian.29)、噻虫啉(thiacloprid)(cian.30)、呋虫胺(dinotefuran)(cian.31)、噻虫胺(cian.32)、氯噻啉(imidaclothiz)(cian.33)、定虫隆(chlorfluazuron)(cian.34)、除虫脲(diflubenzuron)(cian.35)、氯芬奴隆(lufenuron)(cian.36)、伏虫脲(teflubenzuron)(cian.37)、杀铃脲(triflumuron)(cian.38)、双苯氟脲(novaluron)(cian.39)、氟虫脲(flufenoxuron)(cian.40)、氟铃脲(hexaflumuron)(cian.41)、双三氟虫脲(bistrifluoron)(cian.42)、多氟脲(noviflumuron)(cian.43)、稻虱净(buprofezin)(cian.44)、赛灭净(cyromazine)(cian.45)、甲氧虫酰肼(methoxyfenozide)(cian.46)、虫酰肼(tebufenozide)(cian.47)、氯虫酰肼(halofenozide)(cian.48)、环虫酰肼(chromafenozide)(cian.49)、硫丹(endosulfan)(cian.50)、芬普尼(fipronil)(cian.51)、乙虫腈(ethiprole)(cian.52)、吡嗪氟虫腈(pyrafluprole)(cian.53)、吡啶氟虫腈(pyriprole)(cian.54)、氟虫酰胺(flubendiamide)(cian.55)、氯虫苯甲酰胺(chlorantraniliprole)(cian.56)(例如氯虫酰胺(Rynaxypyr)(cian.56a))、溴氰虫酰胺(cyazypyr)(cian.57)、埃玛菌素(emamectin)(cian.58)、苯甲酸埃玛菌素(emamectin benzoate)(cian.59)、阿维菌素(cian.60)、伊维菌素(ivermectin)(cian.61)、密灭汀(milbemectin)(cian.62)、雷皮菌素(lepimectin)(cian.63)、吡螨胺(tebufenpyrad)(cian.64)、唑螨酯(fenpyroximate)(cian.65)、哒螨灵(pyridaben)(cian.66)、喹螨醚(fenazaquin)(cian.67)、嘧螨醚(pyrimidifen)(cian.68)、唑虫酰胺(tolfenpyrad)(cian.69)、三氯杀螨醇(dicofol)(cian.70)、唑螨氰(cyenopyrafen)(cian.71)、丁氟螨酯(cyflumetofen)(cian.72)、灭螨醌(acequinocyl)(cian.73)、嘧螨酯(fluacrypyrin)(cian.74)、联苯肼酯(bifenazate)(cian.75)、丁醚脲(diafenthiuron)(cian.76)、乙螨唑(etoxazole)(cian.77)、四螨嗪(clofentezine)(cian.78)、刺糖菌素(spinosad)(cian.79)、苯螨噻(triarathen)(cian.80)、四氯二苯砜(tetradifon)(cian.81)、克螨特(propargite)(cian.82)、噻螨酮(hexythiazox)(cian.83)、溴螨酯(bromopropylate)(cian.84)、灭螨猛(chinomethionat)(cian.85)、阿米曲拉(amitraz)(cian.86)、氟虫吡喹(pyrifluquinazon)(cian.87)、吡甲嗪(pymetrozine)(cian.88)、氟啶虫酰胺(flonicamid)(cian.89)、蚊蝇醚(pyriproxyfen)(cian.90)、苯虫醚(diofenolan)(cian.91)、溴虫腈(chlorfenapyr)(cian.92)、氰氟虫腙(metaflumizone)(cian.93)、茚虫威(indoxacarb)(cian.94)、毒死蜱(cian.95)、螺螨酯(spirodiclofen)(cian.96)、螺甲螨酯(spiromesifen)(cian.97)、螺虫乙酯(spirotetramat)(cian.98)、啶虫丙醚(pyridalyl)(cian.99)、spinctoram(cian.100)、高灭磷(acephate)(cian.101)、三唑磷(triazophos)(cian.102)、丙溴磷(profenofos)(cian.103)、杀线威(oxamyl)(cian.104)、乙基多杀菌素(spinetoram)(cian.105)、克线磷(fenamiphos)(cian.106)、fenamipclothiahos(cian.107)、4-{[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基}呋喃-2(5H)-酮(cian.108)、硫线磷(cadusaphos)(cian.109)、西维因(carbaryl)(cian.110)、克百威(carbofuran)(cian.111)、灭线磷(ethoprophos)(cian.112)、硫双卡(thiodicarb)(cian.113)、涕灭威(aldicarb)(cian.114)、氧涕灭威(aldoxycarb)(cian.115)、甲胺磷(metamidophos)(cian.116)、灭虫威(methiocarb)(cian.117)、氟啶虫胺腈(sulfoxaflor)(cian.118)、溴氰虫酰胺(cyantraniliprole)(cian.119)、tioxazofen(cian.120)及其组合。
在一些实施方案中，种子处理剂可包括商业种子处理制剂诸如中的那些。这些成分可作为单独层添加在种子上，或替代地，可作为种子涂布组合物的一部分加以添加。在一个实施方案中，当将微生物混悬液施加于玉米种子时，种子处理组分包括种菌唑、甲霜灵、肟菌酯和噻虫胺。在一个实施方案中，当将微生物混悬液施加于大豆种子时，种子处理组分包括吡唑醚菌酯、甲霜灵、氟苯吡菌胺、吡虫啉、氟吡菌酰胺、噻虫胺、坚强芽孢杆菌。在一个实施方案中，当将微生物混悬液施加于棉花种子时，种子处理组分包括甲霜灵、腈菌唑(mycobutanil)、肟菌酯、吡唑醚菌酯、吡虫啉、种菌唑、噻虫嗪、阿维菌素、硫双卡、种菌唑和氟苯吡菌胺。
在一些实施方案中，可将种子处理杀虫剂和微生物组合物配制于种子处理剂中。可将多种添加剂添加至包含经分离、选择和鉴定的微生物的种子处理制剂中。可添加粘合剂，并且其包括由可为天然或合成的粘性聚合物组成，对待涂布的种子不具有植物毒性作用的那些。粘合剂可选自聚乙酸乙烯酯；聚乙酸乙烯酯共聚物；乙烯乙酸乙烯酯(EVA)共聚物；聚乙烯醇；聚乙烯醇共聚物；纤维素，包括乙基纤维素、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素和羧甲基纤维素；聚乙烯吡咯烷酮；多糖，包括淀粉、改性淀粉、糊精、麦芽糖糊精、海藻酸盐和壳聚糖；脂肪；油；蛋白质，包括明胶和玉米蛋白；阿拉伯胶；虫胶；偏二氯乙烯和偏二氯乙烯共聚物；木素磺酸钙；丙烯酸共聚物；聚丙烯酸乙烯酯；聚氧化乙烯；丙烯酰胺聚合物和共聚物；聚丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酰胺单体；和聚氯丁烯。
可采用多种着色剂中的任一者，包括分类为以下的有机发色团：亚硝基；硝基；偶氮基，包括单偶氮基、双偶氮基和多偶氮基；吖啶、蒽醌、吖嗪、二苯基甲烷、吲达胺、靛酚、次甲基、噁嗪、酞菁、噻嗪、噻唑、三芳基甲烷、氧杂蒽。可添加的其它添加剂包括微量营养素诸如铁盐、锰盐、硼盐、铜盐、钴盐、钼盐和锌盐。可施加聚合物或其它粉尘控制剂以使处理剂保持在种子表面上。
在特定实施方案中，除微生物细胞或孢子之外，涂层可还包括粘附剂层。粘附剂应为无毒、可生物降解和具有粘性的。此类材料的实例包括但不限于聚乙酸乙烯酯；聚乙酸乙烯酯共聚物；聚乙烯醇；聚乙烯醇共聚物；纤维素，诸如甲基纤维素、羟甲基纤维素和羟甲基丙基纤维素；糊精；海藻酸盐；糖；糖蜜；聚乙烯吡咯烷酮；多糖；蛋白质；脂肪；油；阿拉伯胶；明胶；糖浆；和淀粉。
也可在种子处理制剂中包括各种添加剂，诸如粘附剂、分散剂、表面活性剂以及营养素和缓冲剂成分。其它常规种子处理添加剂包括但不限于涂布剂、湿润剂、缓冲剂和多糖。可将至少一种农业上可接受的载体添加至种子处理制剂中，诸如水、固体或干燥粉末。干燥粉末可源于多种材料，诸如碳酸钙、石膏、润滑剂、蛭石、滑石、腐殖质、活性木炭和各种磷化合物。
在一些实施方案中，种子涂布组合物可包含使活性组分与其组合以有助于将它施加于种子上的至少一种填充剂，其是有机或无机、天然或合成组分。有利的是，填充剂是惰性固体诸如粘土、天然或合成硅酸盐、二氧化硅、树脂、蜡、固体肥料(例如铵盐)、天然土壤矿物质诸如高岭土、粘土、滑石、石灰、石英、硅镁土、蒙脱石、膨润土或硅藻土，或合成矿物质诸如二氧化硅、氧化铝或硅酸盐，特别是硅酸铝或硅酸镁。
种子涂布组合物和过程
预期的是使用常规混合方法、喷雾方法或其组合，通过使用被特定设计和制造以准确、安全和高效将种子处理产品施加于种子的处理剂施加设备，种子可被大致上均一地涂布有一层或多层种子处理剂和由本文方法获得的测试微生物组合物。所述设备使用各种类型的涂布技术，诸如旋转涂布机、鼓式涂布机、流化床技术、喷动床、旋转喷雾或其组合。可通过当种子移动穿过喷洒散布面时将种子处理剂均匀分布于种子上的旋转“雾化器”盘或喷嘴来施加液体种子处理剂，诸如本文所述的方法的那些液体种子处理剂。有利的是，接着再使种子混合或翻转一段时期以实现额外处理分布和干燥。种子在用本发明组合物涂布之前可加以引发或未引发以增加发芽和显露的均一性。在一替代性实施方案中，可将干燥粉末制剂计量提供于移动种子上，并且使其混合直至完全分布。
通常，用于种子处理中的经分离、选择和鉴定的微生物或其它成分的量不应抑制种子的发芽，或对种子导致植物毒性损害。
经微生物和种子处理剂处理的种子也可进一步用薄膜外涂层包裹以保护涂层。所述外涂层在本领域中是已知的，并且可使用流化床和鼓式薄膜涂布技术来施加。
适于本发明方法的植物
在原则上，根据本发明的方法可用于鉴定与任何植物物种相关以及适用于对任何植物物种的种子进行种子处理的种子处理耐受性微生物。单子叶以及双子叶植物物种是特别适合的。方法和组合物常常与对于农业、园艺、在生产液体燃料分子和其它化学物质时使用的生物质的产生、和/或林业重要或有意义的植物一起使用。
因此，本文所述的方法对广泛范围的植物有用，包括属于被子植物纲(Angiospermae)和裸子植物纲(Gymnospermae)的高等植物。双子叶植物亚纲和单子叶植物亚纲的植物是特别适合的。双子叶植物属于以下目：马兜铃目(Aristochiales)、菊目(Asterales)、肉穗果目(Batales)、桔梗目(Campanulales)、白花菜目(Capparales)、石竹目(Caryophyllales)、木麻黄目(Casuarinales)、卫矛目(Celastrales)、山茱萸目(Cornales)、岩梅目(Diapensales)、五桠果目(Dilleniales)、川续断目(Dipsacales)、柿树目(Ebenales)、杜鹃花目(Ericales)、杜仲目(Eucomiales)、大戟目(Euphorbiales)、豆目(Fabales)、壳斗目(Fagales)、龙胆目(Gentianales)、牻牛儿苗目(Geraniales)、小二仙草目(Haloragales)、金缕梅目(Hamamelidales)、八角目(Illiciales)、胡桃目(Juglandales)、唇形目(Lamiales)、樟目(Laurales)、玉蕊目(Lecythidales)、莱脱纳目(Leitneriales)、木兰目(Magniolales)、锦葵目(Malvales)、杨梅目(Myricales)、桃金娘目(Myrtales)、睡莲目(Nymphaeales)、罂粟目(Papeverales)、胡椒目(Piperales)、车前草目(Plantaginales)、蓝雪目(Plumbaginales)、川草目(Podostemales)、花葱目(Polemoniales)、远志目(Polygalales)、蓼目(Polygonales)、报春花目(Primulales)、山龙眼目(Proteales)、大花草目(Rafflesiales)、毛茛目(Ranunculales)、鼠李目(Rhamnales)、薔薇目(Rosales)、茜草目(Rubiales)、杨柳目(Salicales)、檀香目(Santales)、无患子目(Sapindales)、瓶子草科(Sarraceniaceae)、玄参目(Scrophulariales)、山茶目(Theales)、昆栏树目(Trochodendrales)、伞形目(Umbellales)、荨麻目(Urticales)和董菜目(Violales)。单子叶植物属于以下目：泽泻目(Alismatales)、天南星目(Arales)、槟榔目(Arecales)、凤梨目(Bromeliales)、鸭跖草目(Commelinales)、环花目(Cyclanthales)、莎草目(Cyperales)、谷精草目(Eriocaulales)、水鳖目(Hydrocharitales)、灯芯草目(Juncales)、百合目(Lilliales)、茨藻目(Najadales)、蓝目(Orchidales)、露兜树目(Pandanales)、禾本目(Poales)、帚灯草目(Restionales)、霉草目(Triuridales)、香蒲目(Typhales)和姜目(Zingiberales)。属于裸子植物纲(Gymnospermae)的植物是苏铁目(Cycadales)、银杏目(Ginkgoales)、买麻藤目(Gnetales)和松目(Pinales)。
合适的物种可包括以下属的成员：秋葵属(Abelmoschus)、冷杉属(Abies)、槭属(Acer)、剪股颖属(Agrostis)、葱属(Allium)、六出花属(Alstroemeria)、凤梨属(Ananas)、穿心莲属(Andrographis)、须芒草属(Andropogon)、艾属(Artemisia)、芦竹属(Arundo)、颠茄属(Atropa)、小檗属(Berberis)、甜菜属(Beta)、红木属(Bixa)、芸苔属(Brassica)、金盏花属(Calendula)、山茶属(Camellia)、喜树属(Camptotheca)、大麻属(Cannabis)、辣椒属(Capsicum)、红花属(Carthamus)、长春花属(Catharanthus)、粗榧属(Cephalotaxus)、菊属(Chrysanthemum)、金鸡纳属(Cinchona)、西瓜属(Citrullus)、咖啡属(Coffea)、秋水仙属(Colchicum)、鞘蕊花属(Coleus)、黄瓜属(Cucumis)、南瓜属(Cucurbita)、狗牙根属(Cynodon)、曼陀罗属(Datura)、石竹属(Dianthus)、毛地黄属(Digitalis)、薯蓣属(Dioscorea)、油棕属(Elaeis)、麻黄属(Ephedra)、蔗茅属(Erianthus)、高根属(Erythroxylum)、桉属(Eucalyptus)、羊茅属(Festuca)、草莓属(Fragaria)、雪花莲属(Galanthus)、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、向日葵属(Helianthus)、橡胶树属(Hevea)、大麦属(Hordeum)、莨菪属(Hyoscyamus)、麻风树属(Jatropha)、莴苣属(Lactuca)、亚麻属(Linum)、黑麦草属(Lolium)、羽扇豆属(Lupinus)、番茄属(Lycopersicon)、石松属(Lycopodium)、木薯属(Manihot)、苜蓿属(Medicago)、薄荷属(Mentha)、芒属(Miscanthus)、芭蕉属(Musa)、烟草属(Nicotiana)、稻属(Oryza)、黍属(Panicum)、罂粟属(Papaver)、银胶菊属(Parthenium)、狼尾草属(Pennisetum)、碧冬茄属(Petunia)、蔌草属(Phalaris)、梯牧草属(Phleum)、松属(Pinus)、早熟禾属(Poa)、大戟属(Poinsettia)、杨属(Populus)、萝芙木属(Rauwolfia)、蓖麻属(Ricinus)、蔷薇属(Rosa)、蔗属(Saccharum)、柳属(Salix)、血根草属(Sanguinaria)、东莨菪属(Scopolia)、黑麦属(Secale)、茄属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、米草属(Spartina)、菠菜属(Spinacea)、菊蒿属(Tanacetum)、紫杉属(Taxus)、可可属(Theobroma)、小黑麦属(Triticosecale)、小麦属(Triticum)、北美穗草属(Uniola)、藜芦属(Veratrum)、长春花属(Vinca)、葡萄属(Vitis)和玉蜀黍属(Zea)。
本文所述的方法可用于鉴定关于来自对于农业、园艺、用于生产生物燃料分子和其它化学物质的生物质、和/或林业重要或有意义的植物的种子具有种子处理耐受性的微生物。非限制性实例包括例如柳枝稷(Panicum virgatum)(柳枝黍)、二色高粱(Sorghumbicolor)(高粱、苏丹草)、巨芒(Miscanthus giganteus)(芒草)、蔗属种(能源甘蔗)、大叶钻天杨(Populus balsamifera)(白杨)、玉米(Zea mays)(玉米(corn))、大豆(Glycinemax)(大豆(soybean))、芜菁甘蓝(Brassica napus)(加拿大油菜)、普通小麦(Triticumaestivum)(小麦)、陆地棉(Gossypium hirsutum)(棉花)、水稻(Oryza sativa)(稻)、向日葵(Helianthus annuus)(向日葵(sunflower))、紫苜蓿(Medicago sativa)(苜蓿)、甜菜(Beta vulgaris)(糖用甜菜)、珍珠狼尾草(Pennisetum glaucum)(珍珠稗)、黍属种、高粱属种、芒草种、蔗属种、蔗茅属种、杨属种、杰氏须芒草(Andropogon gerardii)(大须芒草)、紫狼尾草(Pennisetum purpureum)(象草)、鹬草(Phalaris arundinacea)(草芦)、狗牙根(Cynodon dactylon)(百慕大草(bermudagrass))、苇状羊茅(Festuca arundinacea)(牛尾草)、草原网茅(Spartina pectinata)(草原索草)、芦竹(Arundo donax)(芦竹(giantreed))、黑麦(Secale cereale)(黑麦(rye))、柳属种(柳树)、桉属种(桉树)、小黑麦属种(小麦--小麦X黑麦)、竹、红花(Carthamus tinctorius)(红花)、麻风树(Jatropha curcas)(麻风树(Jatropha))、蓖麻(Ricinus communis)(蓖麻(castor))、油棕(Elaeisguineensis)(油棕(oil palm))、海枣(Phoenix dactylifera)(椰枣)、紫花假槟榔(Archontophoenix cunninghamiana)(国王棕(king palm))、金山葵(syagrusromanzoffiana)(王后棕(queen palm))、亚麻(Linum usitatissimum)(亚麻(flax))、芥菜(Brassica juncea)、木薯(Manihot esculenta)(木薯(cassaya))、番茄(Lycopersiconesculentum)(番茄(tomato))、莴苣(Lactuca saliva)(莴苣(lettuce))、香蕉(Musaparadisiaca)(香蕉(banana))、马铃薯(Solanum tuberosum)(马铃薯(potato))、甘蓝(Brassica oleracea)(西兰花、花椰菜、球芽甘蓝)、茶树(Camellia sinensis)(茶树(tea))、草莓(Fragaria ananassa)(草莓(strawberry))、可可树(Theobroma cacao)(可可树(cocoa))、小果咖啡(Coffea arabica)(咖啡(coffee))、欧洲葡萄(Vitis vinifera)(葡萄)、菠萝(Ananas comosus)(菠萝(pineapple))、辣椒(Capsicum annum)(辣椒和甜椒)、洋葱(Allium cepa)(洋葱(onion))、甜瓜(Cucumis melo)(甜瓜(melon))、黄瓜(Cucumissativus)(黄瓜(cucumber))、笋瓜(Cucurbita maxima)(倭瓜)、南瓜(Cucurbitamoschata)(倭瓜)、菠菜(Spinacea oleracea)(菠菜(spinach))、西瓜(Citrulluslanatus)(西瓜(watermelon))、秋葵(Abelmoschus esculentus)(秋葵(okra))、茄子(Solanum melongena)(茄子(eggplant))、罂粟(Papaver somniferum)(罂粟(opiumpoppy))、东方罂粟(Papaver orientale)、浆果紫杉(Taxus baccata)、短叶紫杉(Taxusbrevifolia)、黄花蒿(Artemisia annua)、大麻(Cannabis saliva)、喜树(Camptothecaacuminate)、长春花(Catharanthus roseus)、长春花(Vinca rosea)、正鸡纳树(Cinchonaofficinalis)、秋水仙(Coichicum autumnale)、加州藜芦(Veratrum californica)、狭叶毛地黄(Digitalis lanata)、紫花毛地黄(Digitalis purpurea)、薯蓣属种、穿心莲(Andrographis paniculata)、颠茄(Atropa belladonna)、曼陀罗(Datura stomonium)、小檗属种、粗榧属种、草麻黄(Ephedra sinica)、麻黄属种、古柯(Erythroxylum coca)、雪花莲(Galanthus wornorii)、东莨菪属种、蛇足石松(Lycopodium serratum)(蛇足石杉(huperzia serrata))、石松属种、印度萝芙木(Rauwolfia serpentina)、萝芙木属种、血根草(Sanguinaria canadensis)、莨菪属种、金盏花(Calendula officinalis)、小白菊(Chrysanthemum parthenium)、毛喉鞘蕊花(Coleus forskohlii)、短舌菊蒿(Tanacetumparthenium)、灰白银胶菊(Parthenium argentatum)(银胶菊)、橡胶树属种(橡胶)、留兰香(Mentha spicata)(薄荷)、椒样薄荷(Mentha piperita)(薄荷)、红木(Bixa orellana)、六出花属种、蔷薇属种(玫瑰)、香石竹(Dianthus caryophyllus)(康乃馨)、碧冬茄属种(碧冬茄)、一品红(Poinsettia pulcherrima)(一品红(poinsettia))、烟草(Nicotianatabacum)(烟草(tobacco))、白羽扇豆(Lupinus albus)(羽扇豆)、海滨燕麦草(Uniolapaniculata)(燕麦)、翦股颖(剪股颖属种)、美洲山杨(Populus tremuloides)(颤杨(aspen))、松属种(松树)、冷杉属种(冷杉)、槭属种(枫树)、大麦(Hordeum vulgare)(大麦)、草地早熟禾(Poa pratensis)(早熟禾)、黑麦草属种(黑麦草)、梯牧草(Phleumpratense)(猫尾草)和针叶树。在其它实施方案中，使用于本文方法中的植物生长以产生能源，即所谓能源作物，诸如基于纤维素的能源作物，如柳枝稷(柳枝黍)、二色高粱(高粱、苏丹草)、巨芒(芒草)、蔗属种(能源甘蔗)、大叶钻天杨(白杨)、杰氏须芒草(大须芒草)、紫狼尾草(象草)、鹬草(草芦)、狗牙根(百慕大草)、苇状羊茅(牛尾草)、草原网茅(草原索草)、紫苜蓿(苜蓿)、芦竹(Arundo donax)(芦竹(giant reed))、黑麦(Secale cereale)(黑麦(rye))、柳属种(柳树)、桉树种(桉树)、小黑麦属种(小麦-小麦X黑麦)和竹；和基于淀粉的能源作物如玉蜀黍(玉米)和木薯(Manihot esculenta)(木薯(cassava))；和基于糖的能源作物如蔗属种(甘蔗)、甜菜(糖用甜菜)和高粱(Sorghum bicolor(L.)Moench)(甜高粱)；和生产生物燃料的能源作物如大豆(Glycine max)(大豆(soybean))、芜菁甘蓝(加拿大油菜)、向日葵(Helianthus annuus)(向日葵(sunflower))、红花(Carthamus tinctorius)(红花(safflower))、麻风树(Jatropha curcas)(麻风树(Jatropha))、蓖麻(Ricinuscommunis)(蓖麻(castor))、油棕(Elaeis guineensis)(非洲油棕)、美洲油棕(Elaeisoleifera)(美洲油棕(American oil palm))、椰子(Cocos nucifera)(椰子(coconut))、亚麻荠(Camelina sativa)(野生亚麻)、水黄皮(pongamia pinnata)(水黄皮(Pongam))、油橄榄(Olea europaea)(橄榄)、亚麻(Linum usitatissimum)(亚麻(flax))、海甘蓝(crambeabyssinica)(阿比西尼亚甘蓝(Abyssinian-kale))和芥菜(Brassica juncea)。
在整篇本公开中，各种信息来源被提及，并且以引用的方式并入本文。信息来源包括例如科学期刊文章、专利文件和教科书。对所述信息来源的提及仅出于提供对在提交时的一般技术状态的指示的目的。尽管各个和每一信息来源的内容和教义可由本领域技术人员依赖和使用来进行和使用本发明的实施方案，但在特定信息来源中的任何讨论和评论都决不应被视为认可所述评论被广泛接受为本领域中的一般观点。
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现已详细描述本发明，将显而易知的是在不脱离随附权利要求中限定的本发明的范围下，修改、变化和等效实施方案是可能的。此外，应了解本公开中的所有实施例都作为非限制性实施例加以提供。
实施例
以下实施例仅具有说明性，并且不以任何方式限制本公开。
实施例1
实施例1A
这个实施例使用微生物细胞混悬液作为来源材料。细胞混悬液是存在于微生物丛中的所有细菌、真菌和古细菌(包括但不限于见于土壤、植物组织和水体中的那些)的代表性提取物(图1的方法B1)。这些细胞混悬液用于接种种子以鉴定能够存活于种子处理过程的情况下的那些。
细胞混悬液源于在500RCF下离心以使碎片集结的50mL起始微生物细胞混悬液。将上清液从样品轻轻倒出，并且使其穿过过滤器以进一步移除碎片。接着在16K RCF下离心经过滤上清液20分钟以产生主要由细胞材料组成的集结块。将上清液丢弃，并且将所得集结块再混悬至1mL无菌PBS中以使细胞部分浓缩。
通过将1mL转移至1.5mL微型离心管中，以及使样品在14K RCF下旋转10分钟来进一步浓缩所得细胞混悬液。移除850μL上清液，并且将集结块再混悬至剩余上清液中。将100μL这个高度浓缩样品添加至含于无菌50mL离心管中的40个玉米种子(DKC62-61)中。
剧烈振荡种子和浓缩细胞混悬液，并且涡旋30秒。接着将65μL于水中1/5稀释的Precise Seed1006添加至种子/细胞混悬液混合物中，并且振荡/涡旋30秒以确保均一覆盖。将用微生物混悬液处理的玉米种子转移至无菌培养皿中，并且使其在生物安全柜内部干燥20分钟。使经处理和干燥的种子在室温(约22℃)下储存过夜，并且接着将单一种子添加至含于50mL离心管中的10mL无菌PBS中，从而产生1/10稀释的含于种子上的材料。将重复样品涡旋30秒，使其静置1小时，接着再次涡旋30秒以确保移除粘附于种子的所有细胞。将混悬液以1/10和1/100进一步稀释，并且将100μL各个微生物种子处理重复和稀释系列散布于150mm皮氏培养皿(Petri dish)中的R2A琼脂生长培养基上并在室温下孵育。历经1-10天的过程在琼脂上出现微生物菌落，并且将这些菌落挑选至各孔含有150μL R2B+YT生长培养基的96孔微量滴定板中。
在达到浊度之后，使96孔板中含有的个别培养物经受对经分离菌株的PCR和分类学鉴定。这些微生物菌株被视为“种子处理存活者”。接着如下使菌株去重复。使用基于对数期望的多重序列比较(MUSCLE)比对和系统发生树将序列彼此比较以仅选择样品内独特的那些菌株用于存档。通常，跨越基因长度彼此相差0.5％或更多的序列被视为独特。可使用为本领域技术人员所知的许多方法进行去重复，即快速鉴定混合物中的已知生物体。
这个研究的结果在图2A-C中给出。在图2A-C中标记为“方法A”的数据代表涉及未用于处理种子的细胞混悬液的非高通量方法。标记为“方法B”的数据代表方法B1产生的数据。如可见，使用这个方法，多个芽孢形成性细菌物种被鉴定为在种子处理后有活力，同时方法成功移除“非存活者”，从而富集种子处理耐受性微生物。出乎意料的是，也鉴定一批不同的非芽孢形成性微生物。
实施例1B
这个实施例使用微生物细胞混悬液作为来源材料。细胞混悬液是源于先前培养的微生物的人工汇集汇合物的细胞混悬液(图1的方法B2)。这些细胞混悬液用于接种种子以鉴定能够存活于种子处理过程的情况下的那些。
将现有微生物培养物汇合在一起，并且产生微生物细胞混悬液，如方法B2中所阐述。剧烈振荡种子和浓缩的细胞混悬液，并且涡旋30秒。接着将65μL于水中1/5稀释的Precise Seed1006添加至种子/细胞混悬液混合物中，并且振荡/涡旋30秒以确保均一覆盖。将用微生物混悬液处理的玉米种子转移至无菌培养皿中，并且使其在生物安全柜内部干燥20分钟。使经处理和干燥的种子在室温(约22℃)下储存过夜，并且接着将单一种子添加至含于50mL离心管中的10mL无菌PBS中，从而产生1/10稀释的含于种子上的材料。将重复样品涡旋30秒，使其静置1小时，接着再次涡旋30秒以确保移除粘附于种子的所有细胞。将混悬液以1/10和1/100进一步稀释，并且将100μL各个微生物种子处理重复和稀释系列散布于150mm皮氏培养皿中的R2A琼脂生长培养基上并在室温下孵育。历经1-10天的过程在琼脂上出现微生物菌落，并且将这些菌落挑选至各孔含有150μL R2B+YT生长培养基的96孔微量滴定板中。
在达到浊度之后，使96孔板中含有的个别培养物经受对经分离菌株的PCR和分类学鉴定。这些微生物菌株被视为“种子处理存活者”。接着如下使菌株去重复。使用基于对数期望的多重序列比较(MUSCLE)比对和系统发生树将序列彼此比较以仅选择样品内独特的那些菌株用于存档。通常，跨越基因长度彼此相差0.5％或更多的序列被视为独特。可使用为本领域技术人员所知的许多方法进行去重复，即快速鉴定混合物中的已知生物体。
这个研究的结果在图3A-3C中给出。在图3A-3C中标记为“方法A”的数据代表涉及未用于处理种子的细胞混悬液的非高通量方法。标记为“方法B”的数据代表使用方法B2产生的复合数据。如可见，使用这个方法，多个芽孢形成性细菌物种被鉴定为在种子处理后有活力，同时方法成功移除“非存活者”，从而富集种子处理耐受性微生物。出乎意料的是，也鉴定一批不同的非芽孢形成性微生物。
将实施例1A和1B的结果合并，并且在图4A-C中给出。在图2A-C中标记为“方法A”的数据代表未用于处理种子的非高通量细胞混悬液。标记为“方法B”的数据代表来自实施例1A和1B的数据的组合。如可见，使用这个方法，多个芽孢形成性细菌物种被鉴定为在种子处理后有活力，同时方法成功移除“非存活者”，从而富集种子处理耐受性微生物。出乎意料的是，也鉴定一批不同的非芽孢形成性微生物。
实施例2
这个实施例使用微生物细胞混悬液作为它的来源材料。细胞混悬液可为存在于微生物丛中的所有细菌、真菌和古细菌(包括但不限于见于土壤、植物组织和水体中的那些)的代表性提取物(方法B1)，或细胞混悬液也可源于先前培养的微生物的人工汇集汇合物(方法B2)。
使50mL或更多样品在500RCF下离心以使碎片集结。将上清液从样品轻轻倒出，并且使其穿过过滤器以进一步移除碎片。接着在16K RCF下离心经过滤上清液20分钟以产生主要由细胞材料组成的集结块。将上清液丢弃，并且将所得集结块再混悬至1mL无菌PBS中以使细胞部分浓缩。经培养微生物的人工汇集细胞混悬液可不需要这个浓缩和过滤步骤。
通过将1mL转移至1.5mL微型离心管中，以及使样品在14K RCF下旋转10分钟来进一步浓缩所得细胞混悬液。移除850μL上清液，并且将集结块再混悬至剩余上清液中。将100μL这个高度浓缩样品添加至含于无菌50mL离心管中的40个用化学种子处理剂处理的玉米种子(下文称为“种子”)中。剧烈振荡种子和浓缩的细胞混悬液，并且涡旋30秒。接着将65μL于水中1/5稀释的Precise Seed1006添加至种子/细胞混悬液混合物中，并且振荡/涡旋30秒以确保均一覆盖。将用微生物混悬液处理的玉米种子转移至无菌培养皿中，并且使其在生物安全柜内部干燥20分钟。
使经处理和干燥的种子在室温(约22℃)下储存过夜，并且接着将单一种子添加至含于50mL离心管中的10mL无菌PBS中，从而产生1/10稀释的含于种子上的材料。将重复样品涡旋30秒，使其静置1小时，接着再次涡旋30秒以确保移除粘附于种子的所有细胞。将混悬液以1/10和1/100进一步稀释，并且将100μL各个微生物种子处理重复和稀释系列散布于150mm皮氏培养皿中的R2A琼脂生长培养基上并在室温下孵育。历经1-10天的过程在琼脂上出现微生物菌落，并且将这些菌落挑选至各孔含有150μL R2B+YT生长培养基的96孔微量滴定板中。
在达到浊度之后，使96孔板中含有的个别培养物经受对经分离菌株的PCR和分类学鉴定。这些微生物菌株被视为“种子处理存活者”。接着如下使菌株去重复。使用基于对数期望的多重序列比较(MUSCLE)比对和系统发生树将序列彼此比较以仅选择样品中独特的那些菌株用于存档。通常，跨越基因长度彼此相差0.5％或更多的序列被视为独特。可使用为本领域技术人员所知的许多方法进行去重复，即快速鉴定混合物中的已知生物体。
实施例3
可使如上文所述的对经分离微生物细胞混悬液的纯化和浓缩改进以回收丰度较小的微生物。举例来说，将经声波处理的根提取物稀释，并且其含有大量植物/土壤碎片。因此，并入种子处理中以进行分离的初始CFU的数目低下，并且这可影响在种子处理后有多少微生物可被回收。然而，由多量植物的多个重复样产生汇合的微生物细胞混悬液可使分离的环境微生物的数目增加。可接着使用密度梯度离心纯化这个多量微生物细胞混悬液以改进在从环境分离的野生型微生物群体中丰度较小的那些微生物的种子处理后回收率。

Claims (27)

1.一种用于获得微生物的高通量方法，其包括以下步骤：
a)获得多种微生物；
b)将所述多种微生物施加于种子或其替代物；
c)将所述种子或其替代物储存在其中所述多种微生物的一个或多个成员变得没有活力的条件下；
d)将所述种子或其替代物放置在溶液中；和
e)从所述溶液鉴定在所述步骤(c)之后保持活力的至少第一微生物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤(a)包括使来自生长环境的所述多种微生物与作物植物相关联。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤(a)包括从所述多种微生物产生微生物细胞混悬液。
4.如权利要求3所述的方法，其包括在所述步骤(b)之前使所述微生物细胞混悬液浓缩。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤(e)包括将所述溶液涂铺于生长培养基上，并选择包含所述微生物的菌落。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤(a)包括：
i)产生微生物细胞混悬液；
ii)将所述微生物细胞混悬液涂铺于生长培养基上；
iii)选择微生物菌落；和
iv)通过使在步骤iii)中选择的微生物菌落的成员组合来产生所述多种微生物。
7.如权利要求2所述的方法，其中所述生长环境包括来自农田的土壤。
8.如权利要求2所述的方法，其中所述生长环境是非农业环境。
9.如权利要求1所述的方法，其还包括以下步骤：
f)鉴定所述微生物能够赋予作物植物物种的植物的至少第一有益性状。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述种子属于与所述作物植物物种相同的物种。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述多种微生物来自作物植物根际、内球、叶圈或其任何组合。
12.如权利要求3所述的方法，其中所述微生物细胞混悬液从所述作物植物的组织获得。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述作物植物是双子叶植物。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述双子叶植物选自由以下组成的组：苜蓿、菜豆、甜菜、西兰花、卷心菜、胡萝卜、花椰菜、芹菜、大白菜、棉花、黄瓜、茄子、亚麻、莴苣、羽扇豆、甜瓜、豌豆、胡椒、花生、马铃薯、南瓜、萝卜、油菜籽、菠菜、大豆、倭瓜、糖用甜菜、向日葵、番茄和西瓜。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述作物植物是单子叶植物。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述单子叶植物选自由以下组成的组：大麦、玉米、韭菜、洋葱、稻米、高粱、甜玉米、小麦、黑麦、谷子、甘蔗、燕麦、黑小麦、柳枝黍和草坪草。
17.如权利要求1所述的方法，其中保持活力的所述微生物是革兰氏阴性非芽孢形成性细菌。
18.如权利要求1所述的方法，其中保持活力的所述微生物是革兰氏阳性芽孢形成性或非芽孢形成性细菌。
19.如权利要求1所述的方法，其中储存所述种子或其替代物持续约1小时至约1年进行。
20.如权利要求1所述的方法，其中储存所述种子或其替代物在环境温度下进行。
21.如权利要求1所述的方法，其中储存所述种子或其替代物在高于或低于环境温度下进行。
22.如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)还包括在施加所述多种微生物之前、同时或之后将种子处理剂施加于所述种子或其替代物。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述种子处理剂包括所述多种有益微生物。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述种子处理剂包括化学杀虫剂。
25.如权利要求22所述的方法，其中在施加所述多种微生物之前或之后将所述种子处理剂施加于所述种子或其替代物。
26.如权利要求22所述的方法，其中所述种子处理剂包括杀真菌剂、杀生物剂、杀昆虫剂、除草剂、杀螨剂、杀啮齿类剂、杀线虫剂、植物生长调节剂和微量营养素或其组合。
27.如权利要求22所述的方法，其中所述种子处理剂包括聚合物、着色剂、粘合剂、粘着剂、粘附剂、分散剂、表面活性剂、营养素、涂布剂、湿润剂、缓冲剂、多糖和填充剂或其组合。
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