CN103648284A - 有竞争力且有效的大豆慢生根瘤菌菌株 - Google Patents

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Abstract

根据本发明，新的细菌分离菌株已经显示出具有独特的特性。这些细菌菌株是植物生长促进菌（PGPR），在定殖豆科植物方面具有增强的竞争优势，并增强豆科植物生长的整体性能。此外，本发明公开了用于筛选和选择具有上述有益特征的细菌菌株的新方法。

Description

有竞争力且有效的大豆慢生根瘤菌菌株
对序列表的引用
本申请包含一个计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用的方式合并入本文。
对生物材料保藏的引用
本申请包含对生物材料保藏的引用，该保藏通过引用的方式合并入本文。关于完整信息，参见表1。
技术领域
本发明涉及分离的细菌菌株，以及用于选择具有增强竞争力和性能特性的细菌菌株的方法。
背景技术
为保持健康生长，植物必须从它们生长的土壤中提取多种元素。这些元素包括氮和所谓的微量营养素（例如，铜、铁和锌），但是很多土壤缺乏这些元素，或者仅以不容易被植物取得的形式含有它们（通常认为，必需元素不能容易地被植物取得，除非它们在土壤中以溶解的形式存在）。对于大多数植物来说，氮是必需元素，因为，它在氨基酸、蛋白质、核苷酸、核酸、叶绿素、辅酶的合成以及植物的整体生长和健康中起作用。为消除这些不足，通常将缺乏元素源施用至土壤，以改善生长速率以及增加从作物中获得的产量。例如，经常将硝酸盐和/或铵添加至土壤，以消除可得氮的缺乏。
在作物科学的领域中，众所周知，很多耕种的作物需要土壤向植物提供相当大量的氮。那些需要通过土壤获得氮的植物的显著例外是豆科植物。
具体地，豆科植物与非豆科植物的不同之处在于，它们能够将大气氮固定为氨。将大气氮固定为植物可用氮源的能力避免植物从土壤获得氮的需要。然而，氮固定需要豆科植物与土壤内天然（native）细菌的共生关系。这种共生关系中最广泛研究的合作伙伴之一是慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）或根瘤菌属（Rhizobium）的细菌。Gresshoff,P.(1999).Identification of Plant Genes Involved in Plant-MicrobeInteractions.Stacey G.&Keen T.(Ed.)Plant-Microbe Interactions(4thed.)(Ch.6).St.Paul：APS Press。
通常，通过植物与微生物之间以及微生物与植物之间的复杂双向信号转导的交换来达到共生。典型地，植物因素，例如黄酮类和类黄酮物质，诱导细菌定殖到豆科植物的根系节结中（Gresshoff,1999）。一旦细菌定殖根系节结，细菌作用于植物的形态学改变，即根毛卷曲以及新的根器官-根瘤的发展。（Gresshoff,1999）。根瘤可以对于定殖植物建立起适合于使根瘤诱导细菌分化成固氮共生菌或类菌体的新的生理环境。（Gresshoff,1999）。
众所周知，根瘤菌的运动性和趋化性是对于菌株竞争力的重要贡献。例如，Althabegoiti等人,2008,FEMS Microbiol.Lett.282：115-123讨论了从USDA 110获得自发突变体，与其野生型菌株比较时，这些自发突变体具有增加的运动性，增强结瘤。此外，Maier等人,1990,Appl.Environ.Microbiol.56(8)：2341-2346讨论了钼在生物固氮过程中的作用。此外，Alves等人,2003,Plant and Soil252：1-9讨论了在巴西使用的大豆接种菌、以及有效固氮竞争力的重要性。最后，Bloem,J.F.等人,2001,Bio Fertil.Soils33：181-189报道了竞争力在菌种选择中的重要性。在研究中，研究者使用遗传工程方法将报告基因（GUS）放入目标菌株内，以作为确定菌株竞争力的方式。（Bloem等人.2001）。因为所进行的研究（Bloem等人.2001）需要大量使用化学染色和显微镜技术，所报道的方法仍然是对于筛选大样本微生物为不可行的方法。
本发明的目的是提供用于定殖豆科植物的慢生根瘤菌属的超级有竞争力的细菌分离株，其超过市售菌株例如市售菌株USDA 532C的定殖能力。本发明的另一目的是提供用于定殖豆科植物的慢生根瘤菌属的超级有竞争力的细菌分离株，与菌株（例如，市售菌株USDA 532C）相比，能够增强在促进豆科植物生长方面的效力。
发明内容
为改善植物的整体健康和植物可用氮源的可得性，需要在定殖植物和增强植物整体生长方面表现较好的细菌菌株。本发明的分离菌株实现这些益处。
本发明涉及，与市售可得菌株例如市售菌株USDA 532C相比，至少具有以下增强特性的细菌分离株，其中增强的特性包括但不限于：
a.增强的定殖植物的竞争力；和
b.增强的促进植物生长的效力。
本发明针对大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobia japonicum）菌株的生物纯的培养物：
具有保藏序列号NRRL B-50592的菌株（也保藏为NRRLB-59571）；
具有保藏序列号NRRL B-50593的菌株（也保藏为NRRLB-59572）；
具有保藏序列号NRRL B-50586的菌株（也保藏为NRRLB-59565）；
具有保藏序列号NRRL B-50588的菌株（也保藏为NRRLB-59567）；
具有保藏序列号NRRL B-50587的菌株（也保藏为NRRLB-59566）；
具有保藏序列号NRRL B-50589的菌株（也保藏为NRRLB-59568）；
具有保藏序列号NRRL B-50591的菌株（也保藏为NRRLB-59570）；
具有保藏序列号NRRL B-50590的菌株（也保藏为NRRLB-59569）；
具有保藏序列号NRRL B-50594的菌株（也保藏为NRRLB-50493）；
具有保藏序列号NRRL B-50726的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50727的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50728的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50729的菌株；和
具有保藏序列号NRRL B-50730的菌株，或上述保藏菌株的至少两种或更多种的组合。
本发明还涉及，本发明的分离细菌菌株包括在16S rDNA序列同一性的基础上与上述任意菌株密切相关的菌株，以及在16S rDNA序列同一性的基础上与任意上述菌株为至少95％相同的菌株。
本发明还包括增强植物生长的方法，包括将含有至少一种本发明的菌株或至少两种或更多种上述保藏菌株的组合的组合物施用于植物、植物种子、或在植物或植物种子周围的土壤。
本发明还包括含有一种或多种本发明菌株的组合物，具有农艺上可接受的载体。
附图说明
图1A是示出对USDA 532C特异的独特引物209的PCR凝胶图。
图1B是示出使用USDA 532C和天然菌株时引物209的特异性的PCR凝胶图。
图2A是示出作为大豆结瘤的竞争优势菌株的大豆慢生根瘤菌菌株USDA 532C的PCR凝胶图。
图2B是示出作为大豆结瘤的竞争优势菌株的非大豆慢生根瘤菌菌株USDA 532C的菌株的PCR凝胶图。
图3A是分离菌株和USDA 532C的DNA指纹图谱树状图：
138-NRRL B-50589（也保藏为NRRL B-59568）；
13-NRRL B-50586（也保藏为NRRL B-59565）；
p140-USDA 532C；
184-NRRL B-50594（也保藏为NRRL B-50493）；
142-NRRL B-50590（也保藏为NRRL B-59569）；
130-NRRL B-50587（也保藏为NRRL B-59566）；
65-NRRL B-50588（也保藏为NRRL B-59567）；
198-NRRL B-50592（也保藏为NRRL B-59571）；
135-NRRL B-50591（也保藏为NRRL B-59570）；和
48-NRRL B-50593（也保藏为NRRL B-59572）。
图3B是分离菌株和USDA 532C的DNA指纹图谱树状图：
138-NRRL B-50589（也保藏为NRRL B-59568）；
13-NRRL B-50586（也保藏为NRRL B-59565）；
140-USDA532C；
184-NRRL B-50594（也保藏为NRRL B-50493）；
142-NRRL B-50590（也保藏为NRRL B-59569）；
130-NRRL B-50587（也保藏为NRRL B-59566）；
65-NRRL B-50588（也保藏为NRRL B-59567）；
198-NRRL B-50592（也保藏为NRRL B-59571）；
135-NRRL B-50591（也保藏为NRRL B-59570）；
48-NRRL B-50593（也保藏为NRRL B-59572）；
318-NRRL B-50727；
278-NRRL B-50726；
727-NRRL B-50730；
370-NRRL B-50728；和
518-NRRL B-50729。
具体实施方式
本发明提供，与市售可得的菌株例如市售菌株USDA 532C相比，至少具有下列增强特性的细菌分离菌株，其中增强的特性包括但不限于：
a.增强的定殖植物的竞争力；和
b.增强的促进植物生长的效力。
本文使用的“细菌菌株”是指固氮菌的细菌菌株。也就是说，是共生固氮细菌的细菌。用在本文中的细菌菌株的非限制性实例包括，但不限于，根瘤菌属（例如，解纤维素根瘤菌（R.cellulosilyticum）、大田市根瘤菌（R.daejeonense）、菜豆根瘤菌（R.etli）、山羊豆根瘤菌（R.galegae）、高卢根瘤菌（R.gallicum）、贾氏根瘤菌（R.giardinii）、海南根瘤菌（R.hainanense）、华特拉根瘤菌（R.huautlense）、木兰根瘤菌（R.indigoferae）、豌豆根瘤菌（R.leguminosarum）、黄土根瘤菌（R.loessense）、羽扇豆根瘤菌（R.lupini）、葡萄牙根瘤菌（R.lusitanum）、蒙古根瘤菌（R.mongolense）、汨罗江根瘤菌（R.miluonense）、冠状岩黄耆根瘤菌（R.sullae）、热带根瘤菌（R.tropici）、居水根瘤菌（R.undicola）、和/或杨凌根瘤菌（R.yanglingense））、慢生根瘤菌属（例如，B.bete、B.canariense、埃氏慢生根瘤菌（B.elkanii）、西表岛慢生根瘤菌（B.iriomotense）、大豆慢生根瘤菌、B.jicamae、辽宁慢生根瘤菌（B.liaoningense）、B.pachyrhizi和/或圆明慢生根瘤菌（B.yuanmingense））、固氮根瘤菌属（Azorhizobium spp.）（例如，茎瘤固氮根瘤菌（A.caulinodans）和/或德巴瑞纳固氮根瘤菌（A.doebereinerae））、中华根瘤菌属（Sinorhizobium spp.）（例如，S.abri、S.adhaerens、美洲中华根瘤菌（S.americanum）、木本树中华根瘤菌（S.aboris）、费氏中华根瘤菌（S.fredii）、S.indiaense、柯斯第中华根瘤菌（S.kostiense）、鸡眼草中华根瘤菌（S.kummerowiae）、苜蓿中华根瘤菌（S.medicae）、草木樨中华根瘤菌（S.meliloti）、墨西哥剑菌（S.mexicanus）、莫雷兰中华根瘤菌（S.morelense）、萨赫靳中华根瘤菌（S.saheli）、多宿主中华根瘤菌（S.terangae）、和/或新疆中华根瘤菌（S.xinjiangense））、中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium spp.）（骆驼刺中慢生根瘤菌（M.albiziae）、紫槐中慢生根瘤菌（M.amorphae）、查克中慢生根瘤菌（M.chacoense）、鹰嘴豆中慢生根瘤菌（M.ciceri）、华葵中慢生根瘤菌（M.huakuii）、百脉根中慢生根瘤菌（M.loti）、地中海中慢生根瘤菌（M.mediterraneum）、M.pluifarium、北方中慢生根瘤菌（M.septentrionale）、温带中慢生根瘤菌（M.temperatum）、天山中慢生根瘤菌（M.tianshanense））的细菌。在一个具体实施方式中，本发明的细菌菌株还包括具有保藏序列号NRRL B-50592（也保藏为NRRL B-59571）、NRRLB-50593（也保藏为NRRL B-59572）、NRRL B-50586（也保藏为NRRLB-59565）、NRRL B-50588（也保藏为NRRL B-59567）、NRRL B-50587（也保藏为NRRL B-59566）、NRRL B-50589（也保藏为NRRLB-59568）、NRRL B-50591（也保藏为NRRL B-59570）、NRRL B-50590（也保藏为NRRL B-59569）、NRRL B-50594（也保藏为NRRLB-50493）、NRRL B-50726、NRRL B-50727、NRRL B-50728、NRRLB-50729、NRRL B-50730的大豆慢生根瘤菌菌株或上述保藏菌株的至少两种或更多种的组合，包括两种上述菌株、至少三种上述菌株、至少四种上述菌株、至少五种上述菌株、至少六种上述菌株、至少七种上述菌株、至少八种上述菌株、至少九种上述菌株、至少十种上述菌株、至少十一种上述菌株、至少十二种上述菌株、至少十三种上述菌株、最高包括所有上述菌株。
术语“市售可得的菌株”是指市售可得的细菌菌株，例如，USDA532C、USDA 110、USDA 123、USDA 127、USDA 129等，Cregan,P.B.等人,1989,Appl.and Enviro.Microbiol.55(10)：2532-2536。
本文所使用的“增强的竞争力”和/或“增强的结瘤性”定义为，细菌菌株具有优势百分比的占瘤率，例如，至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99%、最高100％的占瘤率。“增强的竞争力”根据下面描述的详细检定法进行确定（参见材料和方法：“初步筛选操作指南”和“竞争研究操作指南”）。
本文所用的术语“根瘤（nodule）”定义为，包括但不意在限制于，有限生长的根瘤、无限生长的根瘤，或其组合。有限生长的根瘤和无限生长的根瘤的实例为本领域熟知，且在Denison,R.F.,2000,The Amer.Naturalist.156(6)：567-576中有过记载。有限生长的根瘤发现在大豆（Glycine）、百脉根（Lotus）、或菜豆（Phaseolus）物种中，且形状是圆形和球形。（Denison,2000）。有限生长的根瘤仅生长有限的时间段-通常为数周。（Denison,2000）。与有限生长的根瘤相比，无限生长的根瘤发现在苜蓿（Medicago）、车轴草（Trifolium）、和豌豆（Pisium）物种，具有细长的形状且持续生长。（Denison,2000）。
“占瘤率”是本领域已知的术语。McDermott T.R.&Graham,P.H.,Appl.and Environ.Microbiol.55(10)：2493-2498。本文中使用的“占瘤率”是指，除市售可得的慢生根瘤菌菌株（例如，USDA532C）外的细菌菌株所占有的根瘤百分比，和/或含有除市售可得慢生根瘤菌菌株（例如，USDA 532C）外的特定细菌菌株的根瘤数目除以含有所有细菌菌株的根瘤总数。“占瘤率”根据下面描述的详细检定法来确定（参见材料和方法：“初步筛选操作指南”和“竞争研究操作指南”），且可以根据温室或田间样本获得的植物根瘤的分析来确定。举例来说，占瘤百分比＝A/(A+B)，其中A是含有除市售可得的慢生根瘤菌菌株（例如，USDA532C）外的特定细菌菌株的根瘤数目，B含有市售可得慢生根瘤菌菌株（例如，USDA 532C）的根瘤数目。本领域众所周知的是，尽管存在很少的例外，单个根瘤将仅含有一种细菌菌株。Johnston,A.W.B.等人,1974,J.Gen.Microbiol87：343-350；Dunham,D.H.&Baldwin,I.L.,1931,Soil Science32：235-249；Johnson,H.W.等人,1963,Agrono.J.55：269-271；Dudman,W.F.&Brockwell,J.,1968,J.Agricul.Res.19：739-747；Nicol,H.&Thorton,H.G.,1941,Proc.Roy.Soc.B130,32-59；Hughes,D.Q.,&Vincent,J.M.,1942,Proc.of the Linnenan Soc.of NewSouth Wales67：142-152；和Vincent,J.M.&Waters,L.M.,1953,J.Gen.Microbiol.9：357-370。
本文所用的“在促进生长方面的增强的效力”包括以蒲式耳/英亩为单位测量的增加的植物产量、增加的果实数、增加的根数、增加的根长、增加的根质量、增加的根体积、增加的叶面积、增加的植物占地面积（stand）、增加的植物强健度、和/或增加的固氮（N2）能力中的至少一种。“在促进生长方面的增强的效力”根据下面描述的详细检定法进行确定（参见材料和方法：“初步筛选操作指南”和“性能研究操作指南”），且可以经由温室或野外样本获得的植物根瘤的分析加以确定。
本文使用的“增加的果实数”是指，大豆植物上增加的大豆豆荚总数，和/或大豆植物上增加的大豆豆荚的总干重。
本文所用的“总干重”是指，在80℃孵育特定时间段后，例如至少4小时、至少8小时、至少12小时、至少24小时、至少48小时等，或在需要用来干燥植物质的任何时间段后，植物质（例如，植物果实、植物豆荚、植物根系、植物根瘤、整个植物、部分植物等）的重量。应该理解的是，确定“总干重”的干燥时间取决于很多因素。可以影响干燥时间的非限制性因素包括所要干燥的材料、所要干燥的材料的质量、所要干燥的材料的量，和/或其组合。孵育可以在本领域使用的任何温度控制设备中进行。出于本发明的目的，使用Eppendorf
Figure BDA0000391436410000081
42R孵育箱来确定“总干重”。
本文所用的术语“增加的固氮（N2）能力”是指，分离的菌株可以增加氮（N2）的固定。根据下文提供的“性能研究操作指南”（材料和方法），可以通过使用本领域普通技术人员已知的标准氮量化方法（例如，凯氏定氮法等）来测量植物的总氮含量，从而量化细菌的相对固氮（N2）能力。参见Takahashi,M.等人,2007.Uptake,Assimilation,andNovel Metabolism of Nitrogen Dioxide in Plants,p.109-118。N.Willey(ed.),Phytoremediation：Methods and Reviews,vol.23.Humana Press,New York中，Bremner,J.M.1965.Total nitrogen,p.1149-1178。C.A.Black(ed.),Methods of soil analysis,vol.2.American Society forAgronomy,Madison中，Schank,S.C.等人,1981,App.and Enviro.Microbiol.,41(2)：342-345。
在本发明的另一方面，分离的细菌菌株具有增强的温度耐受性。“增强的温度耐受性”是指所分离的细菌菌株能够生长的温度范围，例如分离的慢生根瘤菌菌株能够生长的最大和最小温度。在一个方面，根据下文讨论的（材料和方法）“温度分布操作指南”来确定“增强的温度耐受性”。
在本发明的另一方面，分离的细菌菌株天然耐受于草甘膦。在一个方面，根据下文讨论的（材料和方法）“耐草甘膦情况操作指南”来确定“增强的温度耐受性”。
在另一个方面，本发明的分离细菌菌株包括在16S rDNA序列同一性的基础上与任意上述菌株密切相关的菌株。关于使用16S rDNA序列同一性以确定细菌关联性，参见Stackebrandt E等人,“Report of the adhoc committee for the re-evaluation of the species definition inbacteriology,”Int J Syst Evol Microbiol.52(3)：1043-7(2002)。在实施方式中，至少一种菌株在16S rDNA序列同一性的基础上与任意上述菌株为至少95％相同，在16S rDNA序列同一性的基础上与任意上述菌株为至少96％相同，在16S rDNA序列同一性的基础上与任意上述菌株为至少97％相同，在16S rDNA序列同一性的基础上与任意上述菌株为至少98％相同，在16S rDNA序列同一性的基础上与任意上述菌株为至少98.5％相同，在16S rDNA序列同一性的基础上与任意上述菌株为至少99％相同，或在16S rDNA序列同一性的基础上与任意上述菌株为至少99.5％相同。
在另一个实施方式中，本发明包括用于分离具有增强的占据豆科植物根瘤的竞争力以及增强的促进豆科植物生长的效力的细菌菌株的方法。本文所用的术语“分离、分离株和/或分离的等等”是指，所涉及的材料从其通常发现的环境去除。除其他方面外，本方法还包括，
a.从土壤样本获得细菌菌株；
b.使细菌菌株和市售可得菌株接触豆科植物；
c.选择比市售可得菌株在占据豆科植物根瘤方面更有竞争力的细菌菌株；
d.对于比市售可得菌株在占据豆科植物根瘤方面更有竞争力的所选择细菌菌株，分析出在促进豆科植物生长方面具有增强的效力的那些细菌菌株；以及
e.分离出在促进豆科植物生长方面具有增强的效力的细菌菌株。
在一个方面，分离的细菌菌株是慢生根瘤菌属的菌株。在另一方面，方法还包括，针对对市售可得慢生根瘤菌例如市售菌株USDA532C特定的特异性引物来筛选慢生根瘤菌菌株的步骤。
在另一个方面，方法包括分离出选自以下的大豆慢生根瘤菌的培养物：
具有保藏序列号NRRL B-50592的菌株（也保藏为NRRL B-59571）；
具有保藏序列号NRRL B-50593的菌株（也保藏为NRRL B-59572）；
具有保藏序列号NRRL B-50586的菌株（也保藏为NRRL B-59565）；
具有保藏序列号NRRL B-50588的菌株（也保藏为NRRL B-59567）；
具有保藏序列号NRRL B-50587的菌株（也保藏为NRRL B-59566）；
具有保藏序列号NRRL B-50589的菌株（也保藏为NRRL B-59568）；
具有保藏序列号NRRL B-50591的菌株（也保藏为NRRL B-59570）；
具有保藏序列号NRRL B-50590的菌株（也保藏为NRRL B-59569）；
具有保藏序列号NRRL B-50594的菌株（也保藏为NRRL B-50493）；
具有保藏序列号NRRL B-50726的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50727的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50728的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50729的菌株；和
具有保藏序列号NRRL B-50730的菌株，或至少两种或更多种上述保藏菌株的组合，包含超过两种，例如至少三种上述菌株、至少四种上述菌株、至少五种上述菌株、至少六种上述菌株、至少七种上述菌株、至少八种上述菌株、至少九种上述菌株、至少十种上述菌株、至少十一种上述菌株、至少十二种上述菌株、至少十三种上述菌株，最高包括所有上述菌株。
在另一个方面，方法包括分离出具有增强的温度耐受性的细菌菌株。参见材料和方法：“温度分布操作指南”。
此外，方法包括分离出具有天然的耐草甘膦的细菌菌株。参见材料和方法：“耐草甘膦情况操作指南。”
在另一个优选方面，方法包括分离出选自能够增强对豆科植物结瘤的根瘤菌属和慢生根瘤菌属中的细菌菌株。
组合物
本发明包括组合物，其含有至少一种本发明的分离细菌菌株或至少两种或更多种上述保藏菌株的组合以及农艺学上可接受的载体，菌株组合包括超过两种，例如至少三种上述菌株、至少四种上述菌株、至少五种上述菌株、至少六种上述菌株、至少七种上述菌株、至少八种上述菌株、至少九种上述菌株、至少十种上述菌株、至少十一种上述菌株、至少十二种上述菌株、至少十三种上述菌株，最高包括所有上述菌株。
在一些实施方式中，组合物可以是接种物组合物。本文和本领域使用的术语“接种物组合物”通常是指，将相容的细菌菌株引至种子的外表面或引入犁沟内的组合物或材料。
组合物可以包含一种或更多种农艺学上可接受的载体。在使用多个农艺学上可接受的载体的实例中，农艺学上可接受的载体可以是相同的或不同的。本文中与“载体”联合使用的术语“农艺学上可接受的”是指，任何能够用于将活性物递送至种子、土壤或植物的材料，优选为能够添加至（种子、土壤或植物）而对植物生长、土壤结构、土壤排水等没有不利作用的材料。适当的载体包括，但不限于，麦壳、糠、磨碎的麦秸、泥炭类粉末或颗粒、石膏类颗粒、和黏土（例如，高岭土、斑脱土、蒙脱石）。作为液体、泥炭、或可湿性粉剂的配方将适合于种子的涂覆。当用于涂覆种子时，材料可以与水混合，施用于种子，且使其干燥。其他载体的实例包括弄湿的糠，在用粘合剂（例如，阿拉伯树胶）涂覆之前，使其干燥，过筛，施用于种子。在活性物配方必需的实施方式中，农艺学上可接受的载体可以是含水的。如果使用液体载体，液体（例如，水）载体将通常包含生长介质，以培养细菌菌株。用于细菌菌株的合适生长介质的非限制性实例包括甘露醇酵母提取物、丙三醇酵母提取物、或任何本领域技术人员已知的与细菌菌株相容和/或向细菌菌株提供生长营养素的介质。
本发明的组合物也包括，含有一种或更多种信号分子的组合物。植物信号分子的非限制性实例包括结瘤因子（即，脂壳寡糖）、壳寡糖、壳质化合物、黄酮类、茉莉酸或其衍生物、亚油酸或其衍生物、亚麻酸或其衍生物、烟中化合物（karrikin）或其组合。
脂壳寡糖化合物（LCO），在本领域中也被称为共生结瘤（Nod）信号或结瘤因子，由β-1,4-连接的N-乙酰基-D-葡萄糖胺（“GlcNAc”）残基的寡糖骨架组成，在非还原端具有缩合的N-连接的脂肪酰链。LCO骨架中的GlcNAc残基数目、脂肪酰链的长度和饱和度、以及还原和非还原糖残基的取代将会不同。LCO的实例在以下呈现为式Ⅰ：
其中：
G是氮可以被例如乙酰基取代且氧可以被硫酸基、乙酰基和/或醚基取代的己糖胺。
R1、R2、R3、R5、R6、和R7，可以相同或不同，代表H、CH3CO--、CxHyCO--（其中x是0和17之间的整数，且y是1和35之间的整数）或任何其他酰基例如氨甲酰基。
R4代表含有至少12个碳原子的单不饱和、双不饱和或三不饱和脂肪链，且n是1和4之间的整数。
LCO可以从细菌例如根瘤菌，例如根瘤菌、慢生根瘤菌、中华根瘤菌和固氮根瘤菌获得（分离的和/或纯化的）。LCO结构的特征因这些细菌种类而异，并且各个菌株可以产生多种不同结构的LCO。例如，草木樨中华根瘤菌的具体LCO已经在美国专利5,549,718中有过记载，具有式Ⅱ结构：
Figure BDA0000391436410000131
其中R代表H或CH3CO--，且n等于2或3。
甚至更具体的LCO包括NodRM、NodRM-1、NodRM-3。当乙酰化时（R=CH3CO--），它们分别变成AcNodRM-1和AcNodRM-3（美国专利5,545,718）。
大豆慢生根瘤菌的LCO在美国专利5,175,149和5,321,011中有过描述。广义地，它们是包含甲基岩藻糖的戊多糖植物激素。多种这些大豆慢生根瘤菌来源的LCO有过记载：BjNod-V（C18：1）；BjNod-V（AC,C18：1）、BjNod-V（C16：1）、和BjNod-V（AC,C16：0），“V”表明五个N-乙酰葡糖胺的存在；“Ac”是乙酰化；“C”后面的数字指示脂肪酸侧链中碳的数目；“：”后面的数字是双键的数目。
用在本发明组合物中的LCO可以得自（即，分离和/或纯化）产生LCO的细菌菌株，例如固氮根瘤菌、慢生根瘤菌（包括大豆慢生根瘤菌）、中慢生根瘤菌、根瘤菌（包括豌豆根瘤菌）、中华根瘤菌（包括草木樨中华根瘤菌），以及生产LCO的基因工程细菌菌株。
本发明也包括使用得自（即，分离和/或纯化）菌根真菌的LCO的组合物，菌根真菌为例如球囊菌门（Glomerocycota）的真菌，例如根内球囊霉（Glomus intraradicus）。得自这些真菌的代表性LCO的结构在WO2010/049751和WO2010/049751中有过描述（本文描述的LCO也称为“Myc因子”）。
此外，包括在本发明组合物中的是使用合成性LCO化合物例如在WO2005/063784中记载的那些，以及经遗传工程产生的重组LCO。基础的、天然存在的LCO结构可以包括在天然存在LCO中发现的修饰或取代，例如在Spaink,Crit.Rev.Plant Sci.54：257-288(2000)和D'Haeze等人,Glycobiology12：79R-105R(2002)中描述的那些。构造LCO的前体寡糖分子（在下面描述的CO，也用作本发明中的植物信号分子）也可以通过遗传工程有机体来合成，例如如Samain等人,Carb.Res.302：35-42(1997);Samain等人,J.Biotechnol.72：33-47(1999)中所述的。
LCO可以以多种纯度形式进行使用，且可以单独使用或以LCO-产生细菌或真菌的培养物形式使用。提供大体纯的LCO的方法包括从LCO与微生物的混合物中简单去除微生物细胞，或通过LCO溶剂相分离然后紧接HPLC层析法来继续分离和纯化LCO分子，如美国专利5,549,718中描述的。纯化可以通过重复的HPLC进行增强，并且纯化的LCO分子可以冷冻干燥以长期储存。
在本领域中，壳寡糖（CO）是被确定为壳质寡聚糖的β-1-4连接的N-乙酰基葡糖胺结构，也称为N-乙酰基壳寡糖。CO具有独特且不同的侧链装饰，使得它们不同于壳质分子[(C8H13NO5)n,CAS No.1398-61-4]及壳聚糖分子[(C5H11NO4)n,CAS No.9012-76-4]。描述CO的结构和生产的代表性文献如下：Van der Holst等人,Current Opinion in StructuralBiology,11：608-616(2001);Robina等人,Tetrahedron58：521-530(2002);Hanel等人,Planta232：787-806(2010);Rouge等人，Chapter27,"TheMolecular Immunology of Complex Carbohydrates"in Advances inExperimental Medicine and Biology,Springer Science;Wan等人,PlantCell21：1053-69(2009);PCT/F100/00803(9/21/2000);和Demont-Caulet等人,Plant Physiol.120(1)：83-92(1999)。CO可以是合成的或重组的。重组CO的制备方法为本领域已知。参见，例如，Samain等人，(同上);Cottaz等人,Meth.Eng.7(4)：311-7(2005)和Samain等人,J.Biotechnol.72：33-47(1999)。
本发明的组合物也可以包含壳质化合物（非CO）、黄酮类、茉莉酸、亚油酸和亚麻酸及其衍生物，以及烟中化合物karrikin。
壳质和壳聚糖，即真菌的细胞壁以及昆虫和甲壳纲动物的外骨骼的主要成分，也由GlcNAc残基组成。壳质化合物包含壳质，（IUPAC：N-[5-[[3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-(羟甲基)环氧乙烷-2基（oxan-2yl）]甲氧基甲基]2-[[5-乙酰氨基-4,6-二羟基-2-(羟甲基)环氧乙烷-3-基]甲氧基甲基]-4-羟基-6-(羟甲基)环氧乙烷-3-基]乙酰胺）、和壳聚糖，（IUPAC：5-氨基-6-[5-氨基-6-[5-氨基-4,6-二羟基-2(羟甲基)环氧乙烷-3-基]氧-4-羟基-2-(羟甲基)环氧乙烷-3-基]氧-2(羟甲基)噁烷-3,4-二醇（oxane-3,4-diol））。这些化合物市售可得，例如从Sigma-Aldrich，或从昆虫、甲壳纲动物壳、或真菌细胞壁制备而来。制备壳质和壳聚糖的方法为领域内已知，并且已经在例如美国专利4,536,207（从甲壳纲壳制备）、Pochanavanich等人,Lett.Appl.Microbiol.35：17-21(2002)（从真菌细胞壁制备）、和美国专利5,965,545（从螃蟹壳制备，从市售壳聚糖的水解进行制备）中记载。脱乙酰化壳质和壳聚糖可以获得为，从少于35％至大于90％的脱乙酰化，且涵盖广谱分子量，例如低于15kD的低分子量壳聚糖寡聚物和0.5至2kD的壳质寡聚物；分子量为约15kD的“可用级别”壳聚糖；和高达70kD的高分子量壳聚糖。配制用于种子处理的壳质和壳聚糖组合物也市售可得。市售产品包括，例如，
Figure BDA0000391436410000151
（Plant Defense Boosters,Inc.）和BEYONDTM（Agrihouse,Inc.）。
黄酮类是基本结构为由三碳桥连接的两个芳香环的酚类化合物。黄酮类由植物产生，且具有很多功能，例如，作为有益的信号转导分子，以及对昆虫、动物、真菌和细菌进行保护。黄酮类的分类包括查耳酮、花青素、香豆素、黄酮、黄烷醇、黄酮醇、黄烷酮、和异黄酮。参见，Jain等人,J.Plant Biochem.&Biotechnol.11：1-10(2002)；Shaw等人,Environmental Microbiol.11：1867-80(2006)。
可用于本发明组合物的代表性黄酮类包括染料木黄酮、黄豆苷元、芒柄花素、柚皮素、橙皮素、木犀草素、和芹菜素。黄酮类化合物例如可以从Natland International Corp.,Research Triangle Park,NC;MPBiomedicals,Irvine,CA；LC Laboratories,Woburn MA购买。黄酮类化合物可以从植物或种子中分离，例如，如美国专利5,702,752；5,990,291；和6,146,668中所记载。黄酮类化合物也可以通过遗传工程有机体（例如酵母）来产生，如Ralston等人,Plant Physiology137：1375-88(2005)中所记载的。
茉莉酸（JA,[1R-[1α,2β(Z)]]-3-氧代-2-(戊烯基)环戊乙酸）及其衍生物、亚油酸（(Z,Z)-9,12-十八碳二烯酸）及其衍生物、以及亚麻酸（(Z,Z,Z)-9,12,15-十八碳三烯酸）及其衍生物，也可以用于本发明的组合物中。茉莉酸及其甲酯、茉莉酮酸甲酯（MeJA）（统称为茉莉酮酸酯），是植物中天然存在的十八烷（octadecanoid）类化合物。茉莉酸通过小麦幼苗的根进行制备，以及通过真菌微生物例如香蕉黑腐病菌（Botryodiplodia theobromae）和Gibbrella fujikuroi、酵母（酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae））、和大肠杆菌（Escherichia coli）的致病和非致病菌株而制备。亚油酸和亚麻酸在茉莉酸的生物合成期间产生。茉莉酮酸酯、亚油酸和亚麻酸（及其衍生物）已报道为根际菌节瘤基因表达或LCO生产的诱导物。参见，例如，Mabood,Fazli,Jasmonatesinduce the expression of nod genes in Bradyrhizobium japonicum,May17,2001；和Mabood,Fazli,"Linoleic and linolenic acid induce the expressionof nod genes in Bradyrhizobium japonicum,"USDA3,May17,2001。
可用于本发明组合物中的亚油酸、亚麻酸、和茉莉酸的有用衍生物包括酯、酰胺、配糖类和盐。代表性的酯是亚油酸、亚麻酸、或茉莉酸的羧基被—COR基团取代的化合物，其中R是--OR1基团，其中R1是：烷基，例如C1～C8非支链或支链烷基，例如，甲基、乙基或丙基；烯基，如C2～C8非支链或支链烯基；炔基，如C2～C8非支链或支链炔基；例如，碳原子为6至10个的芳基；或碳原子为例如4至9个的杂芳基，其中杂芳基中的杂原子可以是，例如，N、O、P、或S。代表性酰胺是亚油酸、亚麻酸、或茉莉酸的羧基被—COR基团取代的化合物，其中R是NR2R3基团，其中R2和R3独立地为：氢；烷基，如C1～C8非支链或支链烷基，例如甲基、乙基或丙基；烯基，例如C2～C8非支链或支链烯基；炔基，例如C2～C8非支链或支链炔基；例如，碳原子为6至10个的芳基；或碳原子为例如4至9个的杂芳基，其中杂芳基中的杂原子可以是，例如，N、O、P、或S。酯可以通过已知的方法制备，例如酸催化的亲核加成反应，其中在催化剂量的无机酸的存在下，使羧酸与醇反应。酰胺也可以通过已知的方法制备，例如通过在中性条件下，在偶联剂例如二环己基碳二亚胺（DCC）的存在下，使羧酸与适当的胺反应。亚油酸、亚麻酸、和茉莉酸的适当的盐包括，例如碱加成盐。可以用作制备这些化合物的代谢上可接受的碱盐的试剂的碱包括来源于阳离子例如碱金属阳离子（例如，钾和钠）和碱土金属阳离子（例如，钙和镁）的那些。这些盐可以通过将亚油酸、亚麻酸、或茉莉酸的溶液与碱溶液混合在一起而容易地制备。盐可以从溶液中沉淀出，并通过过滤来收集或可以通过其他方法如通过溶剂蒸发来回收。
烟中化合物karrikin是插烯4H-吡喃酮，例如，2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮，包括其衍生物和类似物。这些化合物的实例通过下列结构表示：
Figure BDA0000391436410000171
或其生物学上可接受的盐，
其中，Z是O、S或NR5；R1、R2、R3、和R4各自独立地为H、烷基、烯基、炔基、苯基、苄基、羟基、羟烷基、烷氧基、苯氧基、苄氧基、CN、COR6、COOR=、卤素、NR6R7、或NO2；且R5、R6、和R7各自独立地为H、烷基或烯基。这些化合物的生物学上可接受的盐的实例可以包括，与生物学上可接受的酸形成的酸加成盐，其实例包括氢氯化物、氢溴酸盐、硫酸盐或重硫酸盐、磷酸盐或磷酸氢盐、醋酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、延胡索酸盐、顺丁烯二酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、葡糖酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐和对甲苯磺酸。其他生物学上可接受的金属盐可以包括具有碱性的碱金属盐，其实例包括钠盐和钾盐。包含在结构内且适合用于本发明的化合物的实例包括：3-甲基-2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮（其中R1=CH3，R2、R3、R4=H）、2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮（其中R1、R2、R3、R4=H）、7-甲基-2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮（其中R1、R2、R4=H，R3=CH3）、5-甲基-2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮（其中R1、R2、R3=H，R4=CH3）、3,7-二甲基-2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮（其中R1、R3=CH3，R2、R4=H）、3,5-二甲基-2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮（其中R1、R4=CH3，R2、R3=H)、3,5,7-三甲基-2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮（其中R1、R3、R4=CH3，R2=H)、5-甲氧基甲基-3-甲基-2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮（其中R1=CH3，R2、R3=H，R4=CH2OCH3)、4-溴-3,7-二甲基-2H-呋喃并[2,3-c]吡喃-2-酮（其中R1、R3=CH3，R2=Br，R4=H)、3-甲基呋喃并[2,3-c]吡啶-2(3H)-酮（其中Z=NH，R1=CH3，R2、R3、R4=H)、3,6-二甲基呋喃并[2,3-c]吡啶-2(6H)-酮（其中Z=N--CH3，R1=CH3，R2、R3、R4=H)。参见美国专利7,576,213。这些分子也被称为烟中化合物。参见，Halford（同上）。
本发明的组合物还可以包含农业上/农艺学上有益的试剂。可以用于本发明的实践中的试剂的非限制性实例包括除草剂、杀真菌剂和杀虫剂。
适当的除草剂包括苯达松、氟锁草醚、氯嘧磺隆、乳氟禾草灵、广灭灵、吡氟禾草灵、草铵膦、草甘膦、稀禾定、咪唑乙烟酸、甲氧咪草烟、氟磺胺草醚、氟烯草酸、灭草喹、和烯草酮。含有这些化合物中的每一种的市售产品容易可得。组合物中除草剂的浓度将通常与所标记的对于特定除草剂的使用率相对应。
本文和本领域所用的“杀真菌剂”是杀死或抑制真菌生长的试剂。如果相对于未处理的群，使用杀真菌剂的处理会杀死（例如，土壤中的）真菌群或抑制真菌种群的生长，则本文所用的杀真菌剂针对特定真菌物种表现出活性。根据本发明的有效杀真菌剂将适当地针对较广范围的病原体表现出活性，包括但不限于疫霉属（Phytophthora）、丝核菌属（Rhizoctonia）、镰刀菌属（Fusarium）、腐霉菌属（Pythium）、拟茎点霉属（Phomopsis）或核盘菌属（Selerotinia）、层锈菌属（Phakopsora）及其组合。
市售杀真菌剂可以适用于本发明。适当的市售可得的杀真菌剂包括
Figure BDA0000391436410000181
、RIVAL或ALLEGIANCE FL或LS（Gustafson,Plano,TX）、WARDEN RTA（Agrilance,St.Paul,MN）、APRON XL、APRON MAXXRTA或RFC、MAXIM4FS或XL（Syngenta,Wilmington,DE）、CAPTAN（Arvesta,Guelph,Ontario）和PROTREAT（Nitragin Argentina,BuenosAres,Argentina）。在这些和其他市售杀真菌剂中的活性成分包括，但不限于，咯菌腈、精甲霜灵、嘧菌酯和甲霜林。市售杀真菌剂最适合根据制造商的说明在推荐的浓度进行使用。
如果相对于未处理的群，使用杀虫剂的处理引起昆虫群的杀死或抑制，则本文所用的杀虫剂针对特定昆虫物种“表现出活性”。根据本发明的有效杀虫剂将适当地针对较广范围的昆虫表现出活性，包括但不限于，线虫、切根虫、蛴螬、玉米根虫、种蝇、跳甲、麦长蝽、蚜虫、叶壳、和椿象。
市售杀虫剂可以适用于本发明。合适的市售可得的杀虫剂包括CRUISER（Syngenta,Wilmington,DE）、GAUCHO和PONCHO（Gustafson,Plano,TX）。在这些和其他市售杀虫剂中的活性成分包括噻虫嗪、噻虫胺、和吡虫啉。市售杀虫剂最适合根据制造商的说明以推荐浓度进行使用。
本发明的组合物也意在包括使用一种或多种磷酸盐增溶剂。本文所用的磷酸盐增溶剂包括但不限于，磷酸盐增溶微生物。本文使用的“磷酸盐增溶微生物”是能够增加植物可利用的磷的量的微生物。磷酸盐增溶微生物包括真菌和细菌菌株。在实施方式中，磷酸盐增溶微生物是孢子形成微生物。
磷酸盐增溶微生物的非限制性实例包括选自不动杆菌属（Acinetobacter）、节细菌属（Arthrobacter）、节丛孢属（Arthrobotrys）、曲霉属（Aspergillus）、固氮螺菌属（Azospirillum）、芽孢杆菌（Bacillus）、伯克氏菌属（Burkholderia）、假丝酵母属（Candida）、华丽单胞菌属（Chryseomonas）、肠杆菌属（Enterobacter）、正青霉属（Eupenicillium）、微小杆菌属（Exiguobacterium）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、克吕沃氏菌属（Kluyvera）、细杆菌属（Microbacterium）、毛霉属（Mucor）、拟青霉属（Paecilomyces）、类芽孢杆菌（Paenibacillus）、青霉属（Penicillium）、假单胞菌属（Pseudomonas）、沙雷氏菌属（Serratia）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、链霉菌属（Streptomyces）、链孢囊菌属（Streptosporangium）、Swaminathania、硫杆菌属（Thiobacillus）、孢圆酵母属（Torulospora）、弧菌属（Vibrio）、黄色杆菌属（Xanthobacter）、和黄单胞菌属（Xanthomonas）的物种。
磷酸盐增溶微生物的非限制性实例选自乙酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）、不动杆菌属、节杆菌属、少孢节丛孢菌（Arthrobotrys oligospora）、黑曲霉（Aspergillus niger）、曲霉属、Azospirillum halopraeferans、解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）、萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）、环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）、越南伯克氏菌（Burkholderia vietnamiensis）、克瑞斯假丝酵母（Candidakrissii）、浅黄金色单胞菌（Chryseomonas luteola）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、阿氏肠杆菌（Enterobacter asburiae）、肠杆菌属、Enterobacter taylorae、微细正青霉（Eupenicillium parvum）、微小杆菌属、克雷伯氏菌属、栖冷克吕沃尔菌（Kluyvera cryocrescens）、细杆菌属、分支毛霉（Mucor ramosissimus）、蝙蝠蛾拟青霉菌（Paecilomyces hepialid）、马昆得拟青霉菌（Paecilomyces marquandii）、浸麻类芽孢杆菌（Paenibacillus macerans）、胶质类芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginosus）、成团泛菌（Pantoea aglomerans）、扩展青霉菌（Penicillium expansum）、Pseudomonas corrugate、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、Pseudomonas lutea、草假单胞菌（Pseudomonas poae）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）、斯氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）、平凡假单胞菌（Pseudomonas trivialis）、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）、嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）、链霉菌属、链孢囊菌属、Swaminathania salitolerans、氧化亚铁硫杆菌（Thiobacillusferrooxidans）、球有孢圆酵母（Torulospora globosa）、解蛋白弧菌（Vibrioproteolyticus）、Xanthobacter agilis、和野油菜黄单胞菌（Xanthomonascampestris）。
在一个实施方式中，磷酸盐增溶微生物是真菌青霉属的菌株。可用于本发明实践中的真菌青霉素的菌株包括比莱青霉（P.bilaiae）（以前称为拜莱青霉（P.bilaii））、微白青霉（P.albidum）、橘灰青霉（P.aurantiogriseum）、产黄青霉（P.chrysogenum）、黄暗青霉（P.citreonigrum）、桔青霉（P.citrinum）、指状青霉（P.digitatum）、P.frequentas、褐青霉（P.fuscum）、P.gaestrivorus、光孢青霉（P.glabrum）、灰黄青霉（P.griseofulvum）、纠缠青霉（P.implicatum）、微紫青霉（P.janthinellum）、淡紫青霉（P.lilacinum）、朱黄青霉（P.minioluteum）、蒙大拿青霉（P.montanense）、黑青霉（P.nigricans）、草酸青霉（P.oxalicum）、P.pinetorum、嗜松青霉（P.pinophilum）、产紫青霉（P.purpurogenum）、P.radicans、放射青霉（P.radicum）、雷斯青霉（P.raistrickii）、皱褶青霉（P.rugulosum）、简青霉（P.simplicissimum）、离生青霉（P.solitum）、变幻青霉（P.variabile）、毡毛青霉（P.velutinum）、鲜绿青霉（P.viridicatum）、灰绿青霉（P.glaucum）、P.fussiporus、和扩展青霉（P.expansum）。
在另一实施方式中，磷酸盐增溶微生物青霉素物种是比莱青霉（P.bilaiae）、P.gaestrivorus、和/或其组合。在另一个实施方式中，比莱青霉菌株选自ATCC 20851、NRRL 50169、ATCC 22348、ATCC 18309、NRRL 50162（Wakelin等人,2004.Biol Fertil Soils40：36-43）且P.gaestrivorus菌株是NRRL50170（参见，Wakelin（同上））。
根据本发明的组合物，应该预见，可以使用超过一种的磷酸盐增溶微生物，例如，至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种，包括不动杆菌属、节杆菌属、节丛孢属、曲霉属、固氮螺菌属、芽孢杆菌、伯克氏菌属、假丝酵母属、华丽单胞菌属、肠杆菌属、正青霉属、微小杆菌属、克雷伯氏菌属、克吕沃氏菌属、细杆菌属、毛霉属、拟青霉属、类芽孢杆菌属、青霉属、假单胞菌属、沙雷氏菌属、寡养单胞菌属、链霉菌属、链孢囊菌属、Swaminathania、硫杆菌属、孢圆酵母属、弧菌属、黄色杆菌属和黄单胞菌属的任意组合，包括选自乙酸钙不动杆菌、不动杆菌属、节杆菌属、少孢节丛孢菌、黑曲霉、曲霉属、Azospirillum halopraeferans、解淀粉芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、越南伯克氏菌、克瑞斯假丝酵母、浅黄金色单胞菌、产气肠杆菌、阿氏肠杆菌、肠杆菌属、Enterobacter taylorae、微细正青霉、微小杆菌属、克雷伯氏菌属、栖冷克吕沃氏菌、细杆菌属、分支毛霉、蝙蝠蛾拟青霉菌、马昆得拟青霉菌、浸麻类芽孢杆菌、胶质类芽孢杆菌、成团泛菌、扩展青霉菌、Pseudomonas corrugate、荧光假单胞菌、Pseudomonaslutea、草假单胞菌、恶臭假单胞菌、斯氏假单胞菌、平凡假单胞菌、粘质沙雷氏菌、嗜麦芽窄食单胞菌、链霉菌属、链孢囊菌属、Swaminathania salitolerans、氧化亚铁硫杆菌、球有孢圆酵母、解蛋白弧菌、Xanthobacter agilis、和野油菜黄单胞菌的任意组合。
在另一实施方式中，本发明包括增强植物生长的方法，包括将本发明的一种或多种细菌菌株（包括含有本发明的至少一种分离细菌菌株和农艺学上可接受的载体的组合物）应用于植物、植物种子、或环绕植物或植物种子的土壤。一种或多种细菌菌株可以仅包括一种细菌菌株或至少两种或更多种本发明菌株的组合，包括超过两个，例如至少三种上述菌株、至少四种上述菌株、至少五种上述菌株、至少六种上述菌株、至少七种上述菌株、至少八种上述菌株、至少九种上述菌株、至少十种上述菌株、至少十一种上述菌株、至少十二种上述菌株、至少十三种上述菌株、最高包括所有上述菌株。
应用
本发明的方法包括将至少一种分离菌株和/或含有至少一种分离菌株的组合物施用于种子、幼苗、根系、植物、土壤或其组合的处理步骤。本文和本领域中使用的术语“处理”是指，使种子、幼苗、根系、或植物与有效量的处理组合物或成分进行接触，以增强定殖植物的竞争力和促进植物生长的效力的任何应用。
有效量和/或适当的施用率根据土壤的类型、植物的类型、土壤中存在的或添加到其中的微量营养物的来源量等而变化，且适当的比率可以通过对于各个具体情况的简单尝试和错误实验而容易地发现。通常地，施用至少一种分离菌株和/或含有至少一种分离菌株的组合物的比率落在每个种子1×102～1×108菌落形成单位（cfu）的范围内（当使用涂覆的种子时）。在具体实施方式中，施用率落在每个种子1×104～1×105菌落形成单位（cfu）的范围内（当使用涂覆的种子时）。当在颗粒状载体上时，施用率落在每公顷1×108～1×1013cfu的范围内。在具体实施方式中，颗粒状载体的施用率落在每公顷2×1011～6×1011cfu的范围内。尽管接种物组合物和/或根据本发明使用的组合物可以包含至少两种或更多种不同细菌菌株的混合/组合，在说明书中涉及的是合并混合物中菌落形成单位的总量。用在本发明的组合物中以直接处理种子的LCO和/或CO的有效量以浓度单位表示并通常在约10-5至约10-14M（摩尔浓度）的范围中，在一些实施方式中为约10-5至约10-11M，在一些其他实施方式中为约10-7至约10-8M。以重量单位表达，有效量通常在约1至约400μg/英担（cwt）种子，在一些实施方式中为约2至约70μg/cwt，在一些其他实施例中为约2.5至约3.0μg/cwt种子。
出于间接处理种子的目的，即，犁沟内处理，LCO或CO的有效量通常在1μg/英亩至约70μg/英亩的范围内，在一些实施方式中为约50μg/英亩至约60μg/英亩的范围内。出于应用于植物的目的，LCO或CO的有效量通常在1μg/英亩至约30μg/英亩的范围内，在一些实施方式中为约11μg/英亩至约20μg/英亩。
处理可以直接完成，也就是，直接应用于种子、幼苗、根系、或植物（包括树叶），或可以间接完成，也就是，通过应用于土壤（包括在犁沟内）。
将要理解的是，各个成分的处理可以按顺序进行或同时进行。例如，如果使用液体载体，成分可以在市售处理混合罐中共同成浆，并在随后通过任何适当的涂覆工艺，例如，薄膜涂覆，施用于种子。在薄膜涂覆工艺中，浆体在连续涂覆过程中喷洒至种子。或者，例如，如果使用尘埃或粉末载体，成分可以按顺序施用。因此，处理也可以包括叶片的施用和/或组合物在犁沟内的施用。
将要通过分离菌株和/或含有至少一种分离菌株的组合物进行处理的植物的非限制性实例包括豆科作物。豆科作物的非限制性实例包括，但不限于，植物例如大豆、苜蓿、花生、豌豆、小扁豆、菜豆、和三叶草。应当明白，术语“作物”包括可以收获的任何植物材料。
培养物
本发明针对大豆慢生根瘤菌菌株的生物纯的培养物。
具有保藏序列号NRRL B-50592的菌株（也保藏为NRRL B-59571）；
具有保藏序列号NRRL B-50593的菌株（也保藏为NRRL B-59572）；
具有保藏序列号NRRL B-50586的菌株（也保藏为NRRL B-59565）；
具有保藏序列号NRRL B-50588的菌株（也保藏为NRRL B-59567）；
具有保藏序列号NRRL B-50587的菌株（也保藏为NRRL B-59566）；
具有保藏序列号NRRL B-50589的菌株（也保藏为NRRL B-59568）；
具有保藏序列号NRRL B-50591的菌株（也保藏为NRRL B-59570）；
具有保藏序列号NRRL B-50590的菌株（也保藏为NRRL B-59569）；
具有保藏序列号NRRL B-50594的菌株（也保藏为NRRL B-50493）；
具有保藏序列号NRRL B-50726的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50727的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50728的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50729的菌株；和
具有保藏序列号NRRL B-50730的菌株。
本文中所用的短语“生物纯的培养物”是指，基本上不含生物污染且具有遗传均一性的培养物，从而从其取得的不同的继代培养物将表现出基本相同的基因型和表现型（例如，培养物具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、最高100％纯的纯度）。这些培养物可以用于大规模的发酵或用于其他商业目的。因此，得自具有保藏序列号NRRL B-50592（也保藏为NRRL B-59571）、NRRL B-50593（也保藏为NRRL B-59572）、NRRL B-50586（也保藏为NRRL B-59565）、NRRLB-50588（也保藏为NRRL B-59567）、NRRL B-50587（也保藏为NRRLB-59566）、NRRL B-50589（也保藏为NRRL B-59568）、NRRL B-50591（也保藏为NRRL B-59570）、NRRL B-50590（也保藏为NRRLB-59569）、NRRL B-50594（也保藏为NRRL B-50493）、NRRL B-50726、NRRL B-50727、NRRL B-50728、NRRL B-50729、NRRL B-50730的大豆慢生根瘤菌菌株的突变体、转移接合子、重组子和遗传工程变体及其培养物，均在本发明的范围内。
在一个实施方式中，培养物是具有保藏序列号NRRL B-50592（也保藏为NRRL B-59571）的菌株。在另一实施方式中，培养物是具有保藏序列号NRRL B-50593（也保藏为NRRL B-59572）的菌株。在另一实施方式中，培养物是具有保藏序列号NRRL B-50586（也保藏为NRRLB-59565）的菌株。在另一实施方式中，培养物是具有保藏序列号NRRLB-50588（也保藏为NRRL B-59567）的菌株。在另一实施方式中，培养物是具有保藏序列号NRRL B-50587（也保藏为NRRL B-59566）的菌株。在另一实施方式中，培养物是具有保藏序列号NRRL B-50589（也保藏为NRRL B-59568）的菌株。在另一实施方式中，培养物是具有保藏序列号NRRL B-50591（也保藏为NRRL B-59570）的菌株。在另一实施方式中，培养物是具有保藏序列号NRRL B-50590（也保藏为NRRLB-59569）的菌株。在另一实施方式中，培养物是具有保藏序列号NRRLB-50594（也保藏为NRRL B-50493）的菌株。在另一实施方式中，培养是具有保藏序列号NRRL B-50726的菌株。在另一实施方式中，培养物是具有保藏序列号NRRL B-50727的菌株。在另一实施方式中，培养物是具有保藏序列号NRRL B-50728的菌株。在另一实施方式中，培养物是具有保藏序列号NRRL B-50729的菌株。在另一实施例中，培养物是具有保藏序列号NRRL B-50730的菌株。
生物材料的保藏
以下生物材料已经根据布达佩斯条约保藏在美国典型培养物保藏中心（ATCC）（10801 University Blvd.,Manassas,VA20108,USA）和农业利用研究微生物基因组和生物操作研究单位（NRRL）国家中心（1815N,University Street,Peoria,IL61604,USA），并给出以下登录号：
表1：生物材料的保藏
Figure BDA0000391436410000251
*NRRL表明保藏在农业研究服务保藏中心，Peoria,IL。
已经在在以下条件下保藏了菌株，该条件确保，在本专利申请的悬而未决期间，对于专利和商标委员会根据37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122授权的人可以接触到培养物。保藏品代表所保藏菌株的纯培养物。在提交本申请或其后续申请对等物的国家中，如果外国专利法需要，包藏品是可得的。然而，应当理解的是，包藏品的可得性并不构成对于破坏由政府行政批准的专利权来实施本发明的许可。
以下实施例的包括仅为示例说明性目的，且并不意在限制本发明的范围。
实施例
材料和方法
培养基
YEM琼脂（YEMA）：（10g/L D-甘露醇；0.50g/L Oxoid酵母提取物；0.10g/L NaCl；0.50g/L K2HPO4；0.20g/L MgSO4·7H2O；12.0g/L琼脂；pH≈6.8）。
液体YEM：（10g/L D-甘露醇；0.50g/L Oxoid酵母提取物；0.10g/LNaCl；0.50g/L K2HPO4；0.20g/L MgSO4·7H2O；pH≈6.8）。
DNA分离操作指南
对于生长在平板上的菌株，分别将1μL接种环的各个平板菌株加入到100 μL Applied Biosystems公司的
Figure BDA0000391436410000262
Ultra DNA分离溶液中。将溶液加热到100℃，持续10分钟。分离的DNA用于PCR分析。
对于从根瘤中分离出DNA，用钳子从大豆根去除根瘤，并用去离子水（diH2O）冲洗。使用Applied Biosystems的96孔PCR板，将根瘤分别放置在Applied Biosystems的100uL
Figure BDA0000391436410000271
Ultra DNA分离溶液中，使其分散开，并在100℃加热10分钟。使用一次性牙签将根瘤破开，以避免交叉污染。分离的DNA用于PCR分析。
PCR操作指南
使用Applied Biosystems
Figure BDA0000391436410000272
96-孔快速热循环仪进行聚合酶链式反应（PCR）。针对各个菌株设定PCR。将2μL DNA加到0.5μL3’引物、0.5μL5’引物、0.5μL Taq聚合酶（New England Biolabs,Inc.）和21.5μL Platinum Blue PCR
Figure BDA0000391436410000273
（Invitrogen）中。将PCR混合物加热到94℃，持续4分钟。在变性后，按以下程序进行35个循环的PCR：94℃1分钟，68℃或引物退火依赖的温度1分钟，以及72℃的反应延伸1分钟。在完成PCR程序之后，在
Figure BDA0000391436410000274
Figure BDA0000391436410000275
系统上运行5μL的PCR混合物。
菌株分离操作指南
为分离菌株，用10％家用漂白剂将根瘤表面灭菌2分钟。根瘤在无菌水中冲洗，然后放置在具有250uL无菌水的微量离心管中。用无菌牙签压碎根瘤，将根瘤菌菌株释放到水中。将两个10uL接种环的水划线接种，以得到YEMA平板上的单个菌落。所有平板用
Figure BDA0000391436410000276
包裹，并在30℃的Eppendorf
Figure BDA0000391436410000277
42R孵育箱中生长。每个分离菌的生长时间不同。
初级筛选操作指南
首先，通过两个不同的操作指南筛选菌株，也就是说，“大豆田间土壤操作指南”（USDA 532C处理的田地）和“未处理的（对照）田间操作指南”。以下描述各个操作指南。
大豆田间土壤操作指南（USDA 532C处理的田地）
将用USDA 532C涂覆的大豆种子种植在遍及美国的大豆生长区域（例如，南达科塔、北达科塔、乔治亚洲、爱荷华州、内布拉斯加州、伊利诺斯州、因地安那州、德克萨斯州、堪萨斯州、明尼苏达州等）的多种土壤中。用大豆慢生根瘤菌菌株USDA 532C处理的大豆种子在这些土壤中生长，收获，并使用PCR分析来直接分析大豆根瘤。从各个土壤样品中收集四十个（40）根瘤。将单个大豆根瘤装载在96孔微量滴定板的单孔中。基于上文描述的方法（参见材料和方法：DNA分离操作指南），直接从根瘤中分离来自那些单个大豆根瘤的DNA。
直接在96孔板上进行使用USDA532C特异性引物209的PCR分析（参见材料和方法：PCR操作指南）。计算40个根瘤的引物209的扩增（0.9kb带），以确定扩增百分比。如果0.9kb的DNA扩增小于或等于30％（也就是大于或等于70％的PCR对引物209扩增是阴性的），那么，土壤样品含有具有比USDA 532C菌株更高的竞争力的大豆慢生根瘤菌菌株。基于所描述的方法（参见材料和方法：菌株分离操作指南），具有少于或等于30％扩增的大豆根瘤含有被确定为比USDA 532C更有竞争力的天然菌株。
如果超过30％的大豆根瘤被大豆慢生根瘤菌USDA 532C定殖，那么，认为土壤不适于新的菌株分离菌，并终止土壤样品操作。
未处理的田间（对照）操作指南
从阿肯色州、乔治亚州、伊利诺斯州、印地安那州、爱荷华州、俄克拉荷马州、内布拉斯加州、堪萨斯州、密苏里州和德克萨斯州的未用USDA 532C处理的大豆田地获得根瘤。按照上文描述的方法（参见材料和方法：菌株分离操作指南），直接从这些根瘤中分离大豆慢生根瘤菌菌株。按照“竞争研究操作指南”（参见材料和方法：竞争研究操作指南），使分离的菌株直接与大豆慢生根瘤菌菌株USDA 532C竞争。将与大豆慢生根瘤菌菌株USDA 532C比较时占据超过70％大豆根瘤的分离菌株选择来进行性能评估（参见材料和方法：性能研究操作指南）。
竞争研究操作指南
确定光密度。（
Figure BDA0000391436410000281
ND1000分光光度计）。获得USDA 532C与各个分离菌株的1：1接种比率。将USDA 532C稀释或浓缩成600nm下0.5的光密度，并将0.5mL的USDA 532C接种物相对于各个分离菌而设定。利用下式计算：（0.5光密度USDA 532C）×（0.5mLUSDA 532C）＝（分离菌光密度）×（分离菌mL），将所有分离菌株浓缩或稀释成600nm下0.5的光密度。将0.5mL的USDA 532C加入到0.5mL的各个分离菌中，作为单独的处理。大豆种子用接种物混合物涂覆，以每12个大豆种子为0.5mL接种物混合物的比率。使种子吸收30分钟。将12个处理大豆种子中的5个种植在1加仑罐子的
Figure BDA0000391436410000291
3B盆栽混合中。将手套弄破以种植种子，且在处理之间变换手套。在种植之后，丢弃7个剩余的所处理大豆种子。
在发芽时，将罐子稀化，剩3个植物。使植物在温室中生长6～7周，避免浇水过程中的交叉污染。温度范围为约23℃至32℃。在“按需进行”的基础上进行浇水。从各个处理中收获根瘤，并用于DNA分离以及使用USDA 532C特异性引物209的PCR分析。参见材料和方法：DNA分离操作指南和PCR操作指南。
性能研究操作指南
性能研究是单个分离菌株与市售可得大豆慢生根瘤菌菌株USDA532C之间的菌株对菌株的直接性能比较。分离菌株和对照菌株（大豆慢生根瘤菌菌株USDA 532C）同时划线接种在分开的YEMA平板上。分离菌株和对照菌株分别接种到5mL的YEM液体培养基中，以在各个接种管中获得600nm下0.03的初始光密度。（
Figure BDA0000391436410000292
ND1000分光光度计）。分离菌株和对照菌株分别在30℃孵育3天。在孵育之后，所分离菌株和对照菌株的接种物在各个接种管中进一步稀释或浓缩成600nm下0.5的最终光密度（
Figure BDA0000391436410000293
ND1000分光光度计），以得到测试处理（分离菌株）和对照处理（对照菌株大豆慢生根瘤菌菌株USDA532C）。
将0.75mL的测试处理加入到32个大豆种子中。使处理种子吸收30分钟。在30分钟之后，将2种种子种植到
Figure BDA0000391436410000294
3B盆栽混合物的15个独立（4”×4”×6”）罐子中。将手套弄破以种植种子，且处理间变换手套。在种植之后，丢弃2个剩余的所处理的大豆种子。对于对照处理，重复这个过程。
在发芽时，将测试处理和对照处理的罐子稀化成剩单个植物。植物在温室中生长8～10周，并避免浇水过程中的交叉污染。温度范围为约23℃至32℃。在“按需进行”的基础上进行浇水。在8～10周之后，收获豆荚，并在80℃干燥过夜。使用
Figure BDA0000391436410000295
统计软件（SAS Institute,Inc.）的分析来确定与大豆慢生根瘤菌USDA 532C相比在统计上显著的性能增强。
温度分布操作指南
将分离的大豆慢生根瘤菌菌株划线接种于YEMA平板（10g/L D-甘露醇;0.50g/L Oxoid酵母提取物;0.10g/L NaCl;0.50g/L K2HPO4;0.20g/L MgSO4·7H2O;12.0g/L琼脂;pH≈6.8），并分别在30℃和35℃孵育7天。分析分离菌株的长成分离菌落的能力。
耐草甘膦情况操作指南
将分离的大豆慢生根瘤菌菌株划线接种于1mM草甘膦和2mM草甘膦的YEMA平板（10g/L D-甘露醇;0.50g/L Oxoid酵母提取物;0.10g/L NaCl;0.50g/L K2HPO4;0.20g/L MgSO4·7H2O;12.0g/L琼脂;pH≈6.8）。平板在30℃孵育7天，分析菌株长成分离菌落的能力。
抗生素情况操作指南
将分离的大豆慢生根瘤菌菌株以T-字型划线接种于庆大霉素（50mg/L）YEMA、氯霉素（50mg/L）YEMA、多粘菌素B（100mg/L）YEMA、羧苄青霉素（100mg/L）YEMA、新霉素（50mg/L）YEMA、和萘啶酸（50mg/L）YEMA。平板在30℃孵育7天，分析它们长成分离菌落的能力。
Figure BDA0000391436410000301
操作指南
使用BioMerieux的Diversilab假单胞菌试剂盒
Figure BDA0000391436410000302
来设定
Figure BDA0000391436410000303
PCR。该试剂盒含有设计成扩增基因组各个部分的专有引物，以产生多个DNA扩增的指纹图谱。各个菌株具有独特的指纹图谱，且菌株之间的相似百分比可以使用Diverilab软件进行确定。
从而创建PCR。将2μL DNA加至18.0μL Re-PCR MM1、2.0μL引物混合物、0.5μL Taq聚合酶（New England Biolabs,Inc.）和2.5μL Taq聚合酶缓冲液（New England Biolabs,Inc.）中，总体积为25uL。将PCR加热到94℃，持续2分钟，然后根据下列程序运行35个循环：94℃0.5分钟，然后50℃0.5分钟，以及最后70℃1.5分钟。在完成35个循环之后，整个反应在70℃保持3分钟。在完成PCR分析之后，PCR产物在
Figure BDA0000391436410000304
2100系列生物分析仪上运行。来自BioMerieux的
Figure BDA0000391436410000305
DNAReagents&Supplies试剂盒用于将PCR产物装载到
Figure BDA0000391436410000306
系统芯片上。根据说明书来保持试剂盒。在使用之前，在装入
Figure BDA0000391436410000307
芯片之前，使试剂盒在室温下保持30分钟。完全根据所提供的所有操作指南和说明书来装载
Figure BDA0000391436410000311
芯片。在完成
Figure BDA0000391436410000312
芯片的装载时，将芯片装载至
Figure BDA0000391436410000313
2100系列生物分析仪，并进行分析直到完成。
实施例1
市售慢生根瘤菌菌株USDA 532C的独特引物的设计
使用遗传鉴定法来评价市售大豆慢生根瘤菌菌株USDA 532C相对于田地天然菌株的竞争力。鉴别出对USDA 532C特异的引物，并使用PCR技术来有效评价USDA 532C在田间的竞争力。
在Novozymes Davis进行USDA 532C的完整基因组测序。发现，二十五个不同的DNA片段与大豆慢生根瘤菌的公开序列具有低同源性。根据上文描述的方法（参见材料和方法：DNA分离操作指南），从在平板上生长的大豆慢生根瘤菌（USDA 532C、P152、Br173、Br187、P190和P194）的菌株中分离DNA。在那二十五个DNA片段上进行另外的序列分析。选择USDA 532C菌株的假定独特引物，并通过PCR针对某些代表性大豆慢生根瘤菌菌株进行USDA 532C特异性引物的筛选。在PCR评价之后，识别出USDA 532C的单一独特引物，并指定为p209。
引物209序列如下：
SEQ ID NO：1-P209p5-TTGGGTTGAGCATGCCCACCCGGACGG，
SEQ ID NO：2-P209p3-GTCTCAGTTGCCGAGCCCACGGCGC
引物特异性
分别对二十五个引物检测USDA 532C的阳性鉴定。引物还用来进一步经由PCR检测USDA 532C的特异性，使用USDA 532C和5种不同的大豆慢生根瘤菌天然菌株（P152、Br173、Br187、P190、和P194）以进行比较。基因组测序表明，Br187和USDA 532C在遗传学上是相同的。
表2：引物筛选小结
Figure BDA0000391436410000314
Figure BDA0000391436410000321
表2总结了发现（“+”表明凝胶中PCR扩增带的阳性鉴定，“-”表明没有DNA扩增）。
参考图1A，表明分离的引物209对于USDA 532C和Br187特异。进一步的遗传检测显示，USDA 532C和大豆慢生根瘤菌菌株P187是相同的（没有示出结果）。孔内容物（从左到右）指示出下列的天然菌株USDA532C、P152、Br173、Br187、Br190、Br194和对照的分子量标准物。参见图1A。
针对天然菌株P152、Br173、Br187、Br190、Br194、和USDA532C，检测引物209的特异性。参见图1B。根据上述方法（参见材料和方法：未处理（对照）田间操作指南），对于100个得自田间试验中未处理区的菌株进行使用引物209的PCR，其中不将大豆慢生根瘤菌菌株USDA532C加入到这些区。在所测试的菌株中，仅有3％的天然菌株能够扩增出对引物209特异的0.9kb条带。这个结果证明，引物209可以用于USDA532C的特异性检测。
实施例2
分析并分离新的菌株
将引物209用作标记物来指示是否有大豆慢生根瘤菌菌株USDA532C进入大豆植物根系节结进行定殖。表明引物209扩增的存在的条带（即，0.9kb条带）代表大豆慢生根瘤菌菌株USDA 532C的阳性鉴定。参见图2A。图2A是大豆慢生根瘤菌菌株USDA 532C与其他天然根瘤菌菌株比较时成为大豆植物节结定殖的优势竞争菌株的情况示例。在图2B中，与图2A中因引物209而存在的条带总数相比，表明引物209的阳性鉴定的存在以及进而表明大豆慢生根瘤菌菌株USDA 532C的存在的条带数减少。图2A和2B表明，引物209扩增的存在与否可以用于确定USDA 532C是否是大豆植物节瘤中的优势竞争菌株。
根据两种筛选方法（参见材料和方法：初级筛选操作指南），从节瘤中选择分离的大豆慢生根瘤菌菌株。根据分离步骤（参见材料和方法：菌株分离操作指南），从节瘤中分离所选定的菌株。
实施例3
面对面竞争评价
将所有分离的菌株放入设计成直接挑战分离菌株在节结定殖能力方面针对大豆慢生根瘤菌菌株USDA 532C的竞争力的筛选程序中（参见材料和方法：竞争研究操作指南）。
对USDA 532C特异的分离引物209被用作标记物来标示大豆慢生根瘤菌菌株USDA 532C是否进入大豆植物根系节结进行定殖。引物209的阳性鉴定表明大豆慢生根瘤菌菌株USDA 532C进入大豆植物的根系节结进行定殖。相反，标示引物209的阳性鉴定的条带的缺失则表明，非大豆慢生根瘤菌菌株USDA 532C的天然菌株进入大豆植物的根系节结进行定殖。表现出大于70％的对所分析节瘤进行定殖的分离菌株被选择，以进行二次评价进行证实。使菌株接受至少两轮的竞争评价。通过这个程序，使多于1000个的分离菌进行增强竞争力的筛选。
实施例4
性能评价
性能研究是分离菌株相对USDA 532C的菌株对菌株的直接比较。增强的性能测量为豆荚干重(g)的函数。参见材料和方法：性能研究操作指南。结果提供在表3A～3D中。
表3A：作为豆荚干重(g)的函数的增强性能
菌株 定殖百分比 豆荚干重(g)
NRRL B-59571 85 5.92
NRRL B-59567 80 6.12
NRRL B-59572 85 6.05
NRRL B-59565 80 5.87
USDA532-C - 5.72
对于所有菌株，定殖百分比在三组平行实验中证实，并且增加的豆荚干重在两组平行实验中证实。
表3B：作为豆荚干重(g)的函数的增强性能
菌株 百分比定殖 豆荚干重(g)
NRRL B-50493 75 4.86
NRRL B-59570 80 5.30
USDA532-C - 5.45
对于所有菌株，定殖百分比在三组平行实验中证实，并且增加的豆荚干重在两组平行实验中证实。
表3C：作为豆荚干重(g)的函数的增强性能
菌株 百分比定殖 豆荚干重(g)
NRRL B-59566 85 5.30
NRRL B-59569 85 5.50
NRRL B-59568 95 5.69
USDA532-C - 4.69
对于所有菌株，定殖百分比在三组平行实验中证实，并且增加的豆荚干重在两组平行实验中证实。
表3D：作为豆荚干重(g)的函数的增强性能
菌株 百分比定殖 豆荚干重(g)
NRRL B-50726 95 5.79
NRRL B-50727 85 5.02
NRRL B-50728 83 5.78
NRRL B-50729 83 5.94
NRRL B-50730* 90 5.94
USDA532-C - 5.45
除NRRL B-50730*仅进行一轮测试外，所有菌株的定殖百分比和增加的豆荚干重在两组平行实验中证实。
市售可得的菌株USDA532C用作各个评价的对照。表3A～3D的结果表明，与对照USDA532C相比，除一个之外的所有分离菌株具有增强的性能。
实施例5
特征研究
进一步基于温度、耐草甘膦性、和抗生素情况来表征所分离的大豆慢生根瘤菌菌株（参见材料和方法：温度分布、耐草甘膦情况、和抗生素情况操作指南）。结果提供在表4。
Figure BDA0000391436410000361
表4总结了结果（“＋”表示具有分离菌落的生长，“-”表示没有生长，且“＋-”表示少数分离菌落/极少的和零散的生长）。结果表明，菌株NRRL B-59570、NRRL B-59568、NRRL B-59565、NRRL B-59566和NRRL B-50493耐受于大致35℃的温度。结果还表明，分离的菌株NRRLB-59569、NRRL B-59568、NRRL B-59565、和NRRL B-50493天然耐草甘膦。发现菌株NRRL B-59566和NRRL B-59569耐萘啶酸。
实施例5
DNA指纹图谱的发生
将表现最好的分离菌进行
Figure BDA0000391436410000371
指纹图谱分析（参见材料和方法：
Figure BDA0000391436410000372
PCR操作指南）。根据所讨论的方法，从各个菌株分离出DNA（参见材料和方法：DNA分离操作指南）。分离的DNA用于PCR分析。
Diversilab DNA指纹图谱分析的结果标示在图3A～3B中。结果表明，分离的菌株是独特的菌株以及是不同于USDA 532C的菌株。
通过下列编号的段落，至少部分地描述本发明：
1.一种大豆慢生根瘤菌的生物纯的培养物，选自以下：
具有保藏序列号NRRL B-50592的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50593的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50586的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50588的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50587的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50589的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50591的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50590的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50594的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50726的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50727的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50728的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50729的菌株；和
具有保藏序列号NRRL B-50730的菌株。
2.根据段1的慢生根瘤菌菌株，其中菌株能够促进植物中的氮固定。
3.根据段1～2中任意段的慢生根瘤菌菌株，其中菌株耐受于大致35℃温度的生长。
4.根据段1～3中任意段的慢生根瘤菌菌株，其中菌株选自：
具有保藏序列号NRRL B-50591的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50589的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50586的菌株；
具有保藏序列号NRRL50594的菌株；以及至少两种或更多种菌株的组合。
5.根据段1～4中任意段的慢生根瘤菌菌株，其中慢生根瘤菌的菌株天然耐草甘膦。
6.根据段5的慢生根瘤菌菌株，其中菌株选自：
具有保藏序列号NRRL B-50590的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50594的菌株；以及至少两种或更多种菌株的组合。
7.根据段1～6中任意段的慢生根瘤菌菌株，其中菌株具有增强的定殖植物的竞争力。
8.根据段1～7中任意段的慢生根瘤菌菌株，其中菌株在促进植物生长方面具有增强的效力。
9.根据段1～8中任意段的慢生根瘤菌菌株，其中增强的竞争力包括至少51％的占瘤率，例如至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99%、或100％的占瘤率。
10.根据段1～9中任意段的慢生根瘤菌菌株，其中，在促进植物生长方面的增强的效力包括，与市售可得菌株例如USDA 532C相比，以蒲式耳/英亩为单位测量的增加的植物产量、增加的果实数、增加的根数、增加的根长、增加的根质量、增加的根体积、增加的叶面积、增加的植物占地面积、增加的植物强健度和/或增加的固氮（N2）能力中的至少一种。
11.根据段1～10中任意段的慢生根瘤菌菌株，其中在促进大豆生长方面的增强的效力包括，当大豆豆荚的总干重与接触市售可得菌株例如市售菌株USDA 532C的大豆植物上的大豆豆荚总干重相比时，大豆植物上大豆豆荚总干重的增加。
12.一种组合物，含有大豆慢生根瘤菌菌株和农艺学上合适的载体，其中大豆慢生根瘤菌菌株选自：
具有保藏序列号NRRL B-50592的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50593的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50586的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50588的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50587的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50589的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50591的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50590的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50594的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50726的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50727的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50728的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50729的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50730的菌株；以及至少两种或更多种菌株的组合。
13.根据段12的组合物，其中组合物包含一种或多种信号分子。
14.根据段13的组合物，其中植物信号分子是脂壳寡糖（LCO）。
15.根据段13～14中任意段的组合物，其中LCO是合成的。
16.根据段13～15中任意段的组合物，其中LCO是重组的。
17.根据段13～16中任意段的组合物，其中LCO是天然存在的。
18.根据段13～17中任意段的组合物，其中从选自根瘤菌属、慢生根瘤菌属、中华根瘤菌属和固氮根瘤菌属中的根瘤菌物种获得LCO。
19.根据段13～18中任意段的组合物，其中从大豆慢生根瘤菌获得LCO。
20.根据段13～19中任意段的组合物，其中从丛枝菌根真菌获得LCO。
21.根据段13的组合物，其中植物信号分子是壳质化合物。
22.根据段22的组合物，其中壳质化合物是壳寡糖（CO）。
23.根据段21～22中任意段的组合物，其中CO是合成的。
24.根据段21～23中任意段的组合物，其中CO是重组的。
25.根据段21-24中任意段的组合物，其中CO是天然存在的。
26.根据段13的组合物，其中植物信号分子是黄酮类。
27.根据段13的组合物，其中植物信号分子是茉莉酸或其衍生物。
28.根据段13的组合物，其中植物信号分子是亚油酸或其衍生物。
29.根据段13的组合物，其中植物信号分子是亚麻酸或其衍生物。
30.根据段13的组合物，其中植物信号分子是烟中化合物。
31.根据段12～30中任意段的组合物，其中组合物包含至少两种不同的植物信号分子。
32.根据段12～31中任意段的组合物，其中组合物包含至少一种农艺学上有益的试剂。
33.根据段32的组合物，其中农艺学上有益的试剂是除草剂、杀虫剂或杀真菌剂。
34.根据段33的组合物，其中农艺学上有益的试剂是至少一种磷酸盐增溶微生物。
35.根据段34的组合物，其中至少一种磷酸盐增溶微生物包括真菌青霉素的菌株。
36根据段35的组合物，其中至少一种磷酸盐增溶微生物包括比莱青霉的菌株。
37.根据段36的组合物，其中比莱青霉的菌株选自NRRL50162、NRRL 50169、ATCC 20851、ATCC 22348、和ATCC 18309。
38.根据段34的组合物，其中至少一种磷酸盐增溶微生物包括P.gaestrivorus的菌株。
39.根据段38的组合物，其中P.gaestrivorus的菌株是NRRL 50170。
40.一种用于分离选自根瘤菌属和慢生根瘤菌属并且具有定殖豆科植物的增强竞争力和在促进豆科植物生长方面具有增强效力的细菌菌株的方法，包括：
a.从土壤样本获得细菌菌株；
b.使该细菌菌株和市售可得菌株例如市售菌株USDA532C接触豆科植物；
c.选择在占据豆科植物根瘤方面比市售可得菌株更有竞争力的细菌菌株；
f.对于在占据豆科植物根瘤方面比市售可得菌株更有竞争力的所选细菌菌株，分析出在促进豆科植物生长方面具有增强效力的那些细菌菌株；以及
d.分离出在促进豆科植物生长方面具有增强效力的细菌菌株。
41.根据段40的分离的细菌菌株，其中细菌菌株是慢生根瘤菌属的菌株。
42.根据段41的分离的慢生根瘤菌菌株，其中该慢生根瘤菌属的菌株是大豆慢生根瘤菌菌株。
43.根据段41～42中任意段的分离的慢生根瘤菌菌株，其中该菌株是选自以下的大豆慢生根瘤菌菌株：
具有保藏序列号NRRL B-50592的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50593的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50586的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50588的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50587的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50589的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50591的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50590的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50594的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50726的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50727的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50728的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50729的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50730的菌株；以及至少两种或更多种菌株的组合。
44.根据段40～43中任意段的方法，其中分离的大豆慢生根瘤菌菌株能够在植物中固氮。
45.根据段40～44中任意段的方法，其中分离的大豆慢生根瘤菌菌株耐受于大致35℃的生长温度。
46.根据段45的方法，其中所分离的大豆慢生根瘤菌菌株选自：
具有保藏序列号NRRL B-50591的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50589的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50586的菌株；
具有保藏序列号NRRL 50594的菌株；以及至少两种或更多种菌株的组合。
47.根据段40～46中任意段的方法，其中大豆慢生根瘤菌菌株天然耐草甘膦。
48.根据段47的方法，其中分离的大豆慢生根瘤菌菌株选自：
具有保藏序列号NRRL B-50590的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50594的菌株；以及至少两种或更多种菌株的组合。
49.一种增强植物生长的方法，包括使用段1～39中任意段的组合物来处理种子、幼苗、根系、植物、土壤、或其组合。
50.根据段49的方法，其中种子、幼苗、根系、或植物是豆科的。
51.根据段50的方法，其中种子、幼苗、根系、或植物是大豆种子、大豆幼苗、大豆根系、或大豆植物。
52.根据段49～51中任意段的方法，其中组合物以每公顷1×108至1×1013菌落形成单位的量施加至土壤，优选每公顷为2×1011至6×1011菌落形成单位。
53.根据段49～52中任意段的方法，其中组合物作为含有每个种子1×102至1×108、优选为1×104至1×105菌落形成单位的种子涂覆物而引入。
所描述的并在本文中要求保护的本发明不限制在本文公开的具体实施方式中，因为这些实施方式意在作为本发明数个方面的示例说明。任何等同的实施方式意在包括于本发明范围内。确实，基于以上描述，除已经在本文示出且描述的那些外，本发明的多种修饰对于本领域技术人员将是显然的。这些修饰也意在落于所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，包括定义的当前公开将做出控制。
多个参考文献引用在本文中，其公开通过引用的方式全部合并入本文。
Figure IDA0000391436490000011

Claims (22)

1.一种大豆慢生根瘤菌的生物纯的培养物，选自：
具有保藏序列号NRRL B-50592的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50593的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50586的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50588的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50587的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50589的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50591的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50590的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50594的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50726的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50727的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50728的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50729的菌株；和
具有保藏序列号NRRL B-50730的菌株。
2.根据权利要求1所述的慢生根瘤菌菌株，其中所述菌株能够促进植物中的氮固定。
3.根据权利要求1～2中任意项所述的慢生根瘤菌菌株，其中所述菌株在大致35℃的温度耐受生长。
4.根据权利要求1～3中任意一项所述的慢生根瘤菌菌株，其中所述菌株选自：
具有保藏序列号NRRL B-50591的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50589的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50586的菌株；
具有保藏序列号NRRL 50594的菌株；以及至少两种或更多种菌株的组合。
5.根据权利要求1～4中任意项所述的慢生根瘤菌菌株，其中所述慢生根瘤菌菌株天然耐草甘膦。
6.根据权利要求5所述的慢生根瘤菌菌株，其中所述菌株选自：
具有保藏序列号NRRL B-50590的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50594的菌株；以及至少两种或更多种菌株的组合。
7.根据权利要求1～6中任意项所述的慢生根瘤菌菌株，其中所述菌株对于定殖植物具有增强的竞争力。
8.根据权利要求1～7中任意项所述的慢生根瘤菌菌株，其中所述菌株在促进植物生长方面具有增强的效力。
9.根据权利要求1～8中任意项所述的慢生根瘤菌菌株，其中增强的竞争力包括至少51％的占瘤率，例如至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99%、或100％的占瘤率。
10.根据权利要求1～9中任意项所述的慢生根瘤菌菌株，其中在促进植物生长方面的增强的效力包括：与市售可得菌株例如USDA532C相比时，以蒲式耳/英亩为单位测量的增加的植物产量、增加的果实数、增加的根数、增加的根长、增加的根质量、增加的根体积、增加的叶面积、增加的植物占地面积、增加的植物强健度和/或增加的固氮（N2）能力中的至少一种。
11.根据权利要求1～10中任意项所述的慢生根瘤菌菌株，其中在促进大豆生长方面的增强的效力包括：当大豆豆荚的总干重与市售可得菌株例如市售菌株USDA 532C的大豆植物上的大豆豆荚总干重相比时，该大豆植物上大豆豆荚总干重的增加。
12.一种组合物，包含大豆慢生根瘤菌的菌株和农艺学上合适的载体，所述大豆慢生根瘤菌的菌株选自：
具有保藏序列号NRRL B-50592的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50593的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50586的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50588的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50587的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50589的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50591的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50590的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50594的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50726的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50727的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50728的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50729的菌株；
具有保藏序列号NRRL B-50730的菌株；以及至少两种或更多种菌株的组合。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述组合物包含一种或更多种信号分子。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述植物信号分子是脂壳寡糖、壳质化合物、黄酮类或烟中化合物。
15.根据权利要求13所述的组合物，其中所述植物信号分子是茉莉酸、亚油酸、亚麻酸或其衍生物。
16.根据权利要求12～15中任意项所述的组合物，其中所述组合物包含至少一种农艺学上有益的试剂。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述农艺学上有益的试剂是至少一种磷酸盐增溶微生物。
18.一种增强植物生长的方法，包括使用权利要求1～17中任意项所述的组合物来处理种子、幼苗、根系、植物、土壤或其组合。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述种子、幼苗、根系、或植物是豆科的。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述种子、幼苗、根系或植物是大豆种子、大豆幼苗、大豆根系或大豆植物。
21.根据权利要求18～20中任意项所述的方法，其中所述组合物以每公顷1×108至1×1013菌落形成单位、优选为每公顷为2×1011至6×1011菌落形成单位的量施加至土壤。
22.根据权利要求18～21中任意项所述的方法，其中所述组合物作为含有每个种子1×102至1×108菌落形成单位、优选为1×104至1×105菌落形成单位的种子涂覆物而引入。
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