CN107613774A - 用于动员土壤磷的协同细菌聚生体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细菌菌株的聚生体和包含本文公开的一种或多种细菌菌株的组合物。分离的细菌培养物的这些聚生体和包含所述培养物的组合物具有比对于各个细菌培养物和组合物观察到的更大的活性。本发明的组合物可以有利地用于增强土壤磷和其他大量营养素和/或微量营养素对植物的可用性，并且从而增强其生长和产量。
Description
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求于2014年11月25日提交的美国临时专利申请号62/084,303，以及于2015年6月5日提交的美国临时专利申请号62/171,643的优先权利益，所述美国临时专利申请通过引用全文并入本文。
序列表
以计算机可读形式提交的序列表通过引用并入本文。计算机可读文件命名为P253038us03_SynergisticBacteriaConsortia.TXT，于2015年9月8日创建，并且含有16千字节。
发明领域
本发明涉及分离的细菌培养物和包含所述培养物的组合物的组合，所述组合具有比对于各个细菌培养物观察到的更大的活性。本发明的组合物可以有利地用于增强土壤磷和其他大量营养素和/或微量营养素对植物的可用性，并且从而增强其生长和产量。
发明背景
在美国和全世界的大多数地区，许多农场具有低磷(P)利用效率的缺点，这意味着P投入(肥料或粪肥)大于作物中收获的P。即使将看起来足够的P肥料应用于土壤时，70-90％也可以很快变得不能用于植物摄取。这主要是因为P很容易吸收至土壤剖面中的风化矿物表面。随着时间过去，这产生了不能用于植物摄取的大量的残留土壤P。作为回应，农民经常应用超过植物需求的P肥料，这促进P径流到地下水内和水生生态系统的富营养化。
环境意识、资源约束和一般公众舆论正在增加对作为传统P肥料选项的有效绿色技术和产品的需要。这些绿色技术和产品是促进可持续性，并且对环境具有最低限度影响的那些技术和产品。用于开发绿色技术和产品的一个领域是微生物及其专门给性能的使用。虽然大多数土壤P对植物不能利用，但一些微生物具有增溶无机P和其他微量营养素的能力，并且将有机P矿化成可用于植物摄取的可溶性正磷酸盐。总之，这两个过程动员土壤磷，增加其对植物的可用性。
已报道了动员磷的细菌和真菌的其他分离物。尽管改善微生物P动员的潜力很大，但使微生物组合物商业化中的进展在很大程度上受到限制。在某些情况下，商业细菌接种体即使在高使用浓度下也不能显著增强P的可用性或植物生长，这是由于在某些条件如高温和高pH下的不稳定性，以及通过用于接种体中的传统培养技术的单一菌株鉴定。至少两种细菌分离物的组合的使用可以改善活性，扩大潜在应用，降低使用浓度和成本，并且降低对化肥投入的需要。由于功能冗余，不同细菌分离物的组合可以进一步在更广泛的土壤和气候范围内提供增强的性能。市场上还存在宣称可以刺激植物健康的许多其他微生物接种体。这些产品含有生长在有机废物上的未确定的微生物混合物，并且基本上是没有确定的机械功能性的堆肥茶。虽然这些产品提出了广泛的保护要求，但它们并不是非常有效的，并且只渗透到爱好者的小众市场。
因此，需要开发用于P动员的基于微生物的技术和产品，其在各种条件下是稳定的，具有可观的贮存期限，组合两种或更多种菌株，并且增加植物生长和健康，同时降低化学品投入和环境影响。
发明概述
微生物分离物和聚生体(两种或更多种不同的细菌菌株的混合物)可以用于改善微生物P的动员，因此增加土壤磷对植物的利用度，增加其磷摄取和生长。应用包括但不限于农作物和草坪草。
本发明涉及含有细菌分离物和群落的组合物，以及使用细菌分离物和聚生体的方法。特别地，本发明涉及含有来自如本文公开的特别是在表1中的细菌聚生体的一种或多种微生物或其混合物的组合物。在优选的实施方案中，组合物将包括来自表1中列出的那些的两种或更多种菌株。
微生物的特征可以在于鉴定16S核糖体基因序列，其与SEQ ID NO 1-4对应且至少97％相同，和/或与具有NRRL登记号：NRRL B-67136、NRRL B-67137、NRRL B-67138和NRRLB-67139的细菌的比较。
在某些实施方案中，除细菌聚生体之外，组合物还包括另外的组分，例如添加剂、助剂和赋形剂。这样的另外的组分可以支持细菌的生长，诱导通过细菌的特定代谢产物产生，增强组合物的稳定性，增加颜色，增加营养价值，和/或为本发明的组合物提供其他属性。合适的添加剂包括碳源、氮源、壳多糖、壳聚糖、葡糖胺、氨基酸、矿物质、维生素、盐、防腐剂以及本领域已知的支持生长、诱导特异性代谢产物产生或稳定组合物的其他添加剂。
本文公开的组合物可以是含水形式或干燥形式。组合物可以作为液体(其可以包括活的和/或休眠的培养物或提取物)、干燥的混合物、种子包衣或其他应用形式进行应用。组合物可以以稀释形式或浓缩形式提供。在一个实施方案中，组合物是浓缩的。在另一个实施方案中，组合物是稀释的。
本发明的方法包括使用所公开的组合物来富集土壤和/或植物。组合物可以应用于土壤、种子和幼苗或成熟植物。组合物可以以液体或干燥形式应用于土壤。可以使用本领域已知的方法，例如注射、耕作和/或犁耕，将组合物应用于土壤表面或混合到土壤内。在另一个方面，组合物可以用于富集植物。组合物可以应用于土壤或水或肥料源，包括水培系统和气培系统，然后将其以液体或干燥形式递送至土壤和/或植物。在另一个方面，组合物可以用于在种植之前富集种子。在各种实施方案中，植物或种子可以在各种环境包括田地和容器中生长。在许多实施方案中，植物或种子可以在天然土壤、合成土壤或其组合中生长。在一些实施方案中，土壤可以包含椰子纤维、岩棉和/或本领域众所周知的其他合适的介质。在一些实施方案中，种子可以浸泡在含有所公开的组合物的水溶液中，和/或种子可以用该组合物进行包被。土壤、种子和幼苗的处理也可以包括上述组合物的重复应用。
本发明的方法包括使用微生物组合物作为化学替代物或补充剂，以避免或降低含磷肥料的应用。
所公开的组合物的应用允许消除或显著降低在农业应用中使用的肥料、杀真菌剂和/或杀昆虫剂的量。在一些实施方案中，细菌制剂的使用导致温室气体排放量中的减少。
附图简述
图1.散点图显示了在液体苜蓿培养基中的菌落形成单位(cfu/ml)以时间作为函数测量的稳定细菌生长。
图2.散点图显示了具有或不具有添加的PO4缓冲液的液体苜蓿培养基中的稳定pH水平。
图3.频率直方图显示了微生物无机P增溶和从天然草原土壤中分离的细菌群落中的广泛变化性。
图4.从#1代逐渐快速改善后，最终到#27代达到平稳观察到的细菌P增溶能力；代表通过后续代就磷增溶速率中的改善而选择的日益优良的聚生体。
图5是显示所有微生物分离物和分离物的组合使得正磷酸盐(PO4)更可获得的能力的图。这些发现证实改善的正磷酸盐(PO4)动员如何可以伴随多个细菌菌种的协同作用而发生。更具体而言，包括阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)(Ec)和弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter fruendii)(Cf)两个菌种的聚生体显示出PO4动员中最强的协同改善；但当包括恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)(Pp)时，也观察到略微更低程度的协同改善。当与聚生体效应相比时，细菌分离物并不证实改善PO4动员的相同添加剂益处。
图6A和6B是对于两种不同的小麦品种使用本发明的一个方面显示改善的小麦生物量的图。图6A Byrd和图6B Hatcher。在温室试验中，在生长季节结束时收集小麦生物量。结果显示与具有传统无机肥料(BioApt Inoc和Accomplish)的两种竞争微生物生物刺激剂产品相比，具有传统无机肥料的申请人的P动员微生物生物刺激剂(Elevate P；所公开的组合物的一个实施方案)证实更快的出苗和更多的生长。
图7A、7B和7C是显示来自用申请人的P动员微生物生物刺激剂(Elevate P)和传统无机肥料种植在8天和10天时的草高度的图。结果显示在多年生黑麦图7A、高羊茅图7B和草地早熟禾图7C中，与传统无机肥料(无机肥料)相比，申请人的P动员微生物生物刺激剂(Elevate P)证实更快的出苗和更多的生长。
图8A、8B和8C是显示使用申请人的P动员微生物生物刺激剂(Elevate P)和传统无机肥料，草地早熟禾图8A、高羊茅图8B和多年生黑麦8C的暗绿色的图。结果显示本发明的P动员微生物生物刺激剂(Elevate P)的一个实施方案证实相对于传统无机肥料(无机肥料)更绿的颜色。
图9A、9B、9C和9D是显示使用申请人的P动员微生物生物刺激剂(Elevate P)和传统无机肥料，对于蓝草图9B、草地早熟禾图9C、高羊茅图9A和多年生黑麦图9D，作为标准化的干g/cm2报告的植物生长的图。结果指示本发明的P动员微生物生物刺激剂(Elevate P)导致比传统无机肥料(无机肥料)更大的植物生长。
图10是显示使用申请人的P动员微生物生物刺激剂(Elevate P)和传统无机肥料，对于草地早熟禾，作为标准化的干g/cm2报告的植物生长的图。结果指示本发明的P动员微生物生物刺激剂(Elevate P)导致比传统无机肥料(MG＝Miracle Gro)更大的植物生长。
图11A、11B、11C、11D和11E是显示使用申请人的P动员微生物生物刺激剂(ElevateP)和传统无机肥料，关于草地早熟禾的植物组织营养素摄取的图。数据显示与传统无机肥料(无机肥料)相比，用本发明的P动员微生物生物刺激剂组合物(Elevate P)接种的种子证实增加的土壤钙(Ca，图11A)、镁(Mg，图11B)、钠(Na，图11C)、钾(K，图11D)和铁(Fe，图11E)摄取。
图12A、12B和12C是显示用申请人的P动员微生物生物刺激剂(Elevate P)和传统无机肥料，对于墨西哥辣椒植物，图11A第一次开花前的天数、图11B在3周后出苗的植物#和图11C产量的图。结果显示与传统无机肥料(MG＝Miracle Gro)相比，申请人的P动员微生物生物刺激剂(Elevate P)证实更快的出苗和开花。
图13A和13B是显示用申请人的P动员微生物生物刺激剂(Elevate P)和传统无机肥料，对于樱桃番茄植物，图13A在4个月后的番茄#和图13B在3周后出苗的植物#的图。结果显示与传统无机肥料(MG＝Miracle Gro)相比，申请人的P动员微生物生物刺激剂(ElevateP)证实更快的出苗。
图14A和14B是显示用申请人的P动员微生物生物刺激剂(Elevate P)和传统无机肥料，对于Brandywine番茄植物，图14A在3周后出苗的植物#和图14B产量的图。结果显示与传统无机肥料(MG＝Miracle Gro)相比，申请人的P动员微生物生物刺激剂(Elevate P)证实更快的出苗和更多的产量。
图15是显示用申请人的P动员微生物生物刺激剂(Elevate P)和传统无机肥料，对于罗勒植物，在3周后出苗的植物数目的图。结果显示与传统无机肥料(MG＝Miracle Gro)相比，申请人的P动员微生物生物刺激剂(Elevate P)证实更快的出苗。
图16是显示用申请人的P动员微生物生物刺激剂(Elevate P)和传统无机肥料，对于金盏花植物，在3周后出苗的植物#的图。结果显示与传统无机肥料(MG＝Miracle Gro)相比，申请人的P动员微生物生物刺激剂(Elevate P)证实更快的出苗。
图17是显示草坪草元素分析的表，表4.1。所呈现的数据证实当用生物刺激剂接种时，对于几种大量营养素和微量营养素更高的植物营养素摄取(较高的速率以粗体显示)。*T＝处理；M＝水分*；处理1是本发明的P动员微生物聚生体；处理2是不含微生物活性的对应于处理1(使用0.2μM)的无菌培养基；处理3是用于对照的常见营养素丰富的无机植物肥料(Hoagland氏溶液)。
图18是显示土壤营养素元素分析的表，表4.2，其证实当用生物刺激剂接种时，更高水平的大量营养素和微量营养素(较高的速率用粗体表示)。*T＝处理*；处理1是本发明的P动员微生物聚生体；处理2是不含微生物活性的对应于处理1(使用0.2μM)的无菌培养基；处理3是用于对照的常见营养素丰富的无机植物肥料(Hoagland氏溶液)。
图19显示了随着时间过去的植物生长的各种指标的图；伴随或不伴随所公开细菌的各种组合生长的种子的莲座叶数目、莲座叶直径和植物高度。
表格简述
表1.磷动员细菌命名法(97％相似性)
表2.1使用铁(FePO4)和铝(AlPO4)底物的确定成分培养基的实例
表2.2铁(FePO4)和铝(AlPO4)培养基中的营养素化学计量限制的实例
表3.1全因素设计以测试用于改善正磷酸盐(PO4)动员的四个靶菌种之间的交互作用。下方的值表示达到50μL的最终体积的相对比例(μL)，以在96孔深孔板的每个孔中加至950μL。每种培养物在混合时为109CFU。
表3.2关于我们的土壤PO4动员细菌聚生体的细菌群落结构、菌落形成单位(CFU)和相对丰度。
表4.3处理图例。
发明详述
除非另有说明，否则在本说明书和相关权利要求中使用的表示成分数量、性质如分子量、反应条件等等的所有数目都应被理解为在所有情况下被术语“约”修饰。相应地，除非有相反指示，否则在下文说明书中阐述的数目参数是近似值，其可以根据由本实施方案寻求获得的所需性质而变。至少并且并非作为将等价物的适用范围限制在权利要求的范围内的尝试，每个数目参数应该至少根据报告的有效数字的数目和通过应用普通舍入技术来解释。
掺入本文公开的特征的一个或多个举例说明性实施方案在下文给出。为了清楚起见，并非物理实现的所有特征都必须在本申请中描述或显示。应理解在发展掺入本发明的实施方案的物理实施方案中，可以作出许多实现特异性决定以实现开发者的目标，例如对系统相关的约束、业务有关的约束、政府相关的约束和其他约束的顺应性，所述约束因实施和时间而变化。虽然开发者的努力可能是耗时的，但这些努力对于受益于本发明的本领域普通技术人员将是常规任务。
本发明自始至终，目前公开的组合物和方法的各个方面可以以范围形式呈现。应当理解范围形式的描述仅为了方便和简洁起见，并且不应被解释为对本发明的范围的固定限制。相应地，范围的描述应被视为已具体公开所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，1至6的范围的描述应被视为已具体公开了子范围例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的各个数目，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范围的宽度如何，这都适用。
虽然组合物和方法在本文中以“包含”各种组分或步骤的方式描述，但组合物和方法也可以“基本上由各种组分和步骤组成”或“由各种组分和步骤组成”。
I.磷动员聚生体
一般可获得的商业细菌接种体并不显著增强P可用性或植物生长。这种无效性部分是由于接种体在诸如高温和高pH的各种条件下的不稳定性。相比之下，本文描述的是不同细菌分离物的组合，其在宽范围的土壤(例如天然和合成、以及水培和气培系统)、条件和气候中提供增强的性能。所公开的组合的增强性能部分是由于所选择的细菌分离物的功能冗余，以及鉴定和修饰细菌的选择过程导致该聚生体增强的磷动员活性，这依次又导致增强的植物生长。在许多情况下，所公开的组合提供了令人惊讶地增强的磷动员活性。
根据本发明的一个方面，产生了用于动员磷的细菌的聚生体(两种或更多种不同细菌菌株的混合物)。磷动员聚生体包括至多4种表1所列出的菌株。根据本发明的一个方面，表1的任何两种或更多种菌株的组合可以用于聚生体中，在其他实施方案中，所有4菌株都包括在聚生体中。在许多实施方案中，聚生体中的各种经修饰的细菌菌株通过其16S核糖体基因序列进行鉴定。
本发明考虑了单独使用或作为接种物组合物的部分使用的聚生体，所述接种物组合物包括添加剂、载体和其他组分。本发明还可以提供可以被植物直接吸收的氮、钾和磷酸盐化合物。本文聚生体修改土壤营养素和有机组成成分，使得植物可以更有效地利用周围土壤中可能已经存在的化合物和添加剂(即动员化合物如磷)。在本文公开的组合物内的活的有益微生物(以及由微生物产生的化合物、分子和酶)可以分解土壤中存在的有机物质，然后将其转换为可被植物吸收的形式。
本发明的组合物可以与氮、钾和磷化合物结合使用以处理植物。在一些实施方案中，在应用所公开的组合物之前、期间或之后加入氮、钾和磷化合物。在一些实施方案中，本文公开的组合物可以帮助允许植物更有效地吸收所应用的氮、钾和磷化合物。因此，需要较少的化学肥料和较低的应用频率。在另一个实施方案中，可以向本发明的组合物中加入少量的氮、钾和磷化合物，这可以帮助聚生体的有效性，即在所公开的组合物的应用期间添加氮、钾和磷化合物。
所公开的组合物可以用于帮助植物或种子的生长。在许多实施方案中，可以用各种方法监测植物的生长。在一些实施方案中，植物的生长可以通过测量植物的高度、重量、花或果实的产量(数目或重量)、以及化学属性(例如糖含量、营养素含量和从植物获得的蛋白质)来监测。
相对于不使用所公开的组合物而生长的植物，所公开的组合物的使用可以帮助增加植物的生长。在许多情况下，所公开的组合物的使用可以增强大于约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％或30％，且小于约40％、30％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％或2％的平均植物生长。所公开的生长增强可以在整个植物生长期间的各个阶段进行测量，例如从植物发芽到收获、其种子、花或果实。
II.组合物
在本发明中有用的组合物包括如表1中列出的一种或多种细菌微生物。在另一个方面，所公开的组合物包括通过与SEQ ID NO：1-4的16S核糖体序列具有至少95或更高同一性百分比的同源性可鉴定的至少两种或更多种细菌微生物。在许多实施方案中，16S序列的量小于约1.2kb、1.1kb、1.0kb、0.9kb、8kb、0.7kb、0.6kb、0.5kb、0.4kb、0.3kb、0.2kb或0.1kb，且大于约50nt、0.1kb、2kb、0.3kb、0.4kb、0.5kb、0.6kb、0.7kb、0.8kb、0.9kb、1.0kb或1.1kb。在许多实施方案中，16S核糖体序列同源性的量在约150nt和500nt之间，例如约250nt。
为了确定两个核酸的同一性百分比，序列为了最佳比较目的进行比对(例如，可以在第一核酸序列的序列中引入缺口用于与第二核酸序列的最佳比对)。然后比较在相应核苷酸位置处的核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的核苷酸占据时，则分子在该位置处是相同的。两个序列之间的同一性百分比是由序列共享的相同位置的数目的函数(即，同一性％＝相同位置#/位置的总#X100)。
表1.磷动员细菌命名法(97％相似性)
使用数学算法可以完成两个序列之间的同源性百分比。用于比较两个序列的数学算法的优选的非限制性实例是Karlin和Altschul(1990)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 87：2264-2268的算法，如在Karlin和Altschul(1993)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 90：5873-5877中修改的。这样的算法被并入Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410的NBLAST和XBLAST程序内。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST程序、得分＝100、字长＝12执行，以获得与本发明的核酸分子相似或同源的核苷酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，Gapped BLAST可以如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402中所述利用。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的缺省参数。这些算法可以用于将DNA与RNA比对，并且在某些情况下可以用于将蛋白质与翻译的核苷酸序列比对。
优选地，在本发明的组合物中包括至少两种或更多种微生物。考虑当两种或更多种微生物形成组合物时，可以共同培养微生物以产生所公开的组合物。在其他实施方案中，所公开的组合物可以通过组合两种或更多种菌株的各个培养物而形成。微生物可以通过本领域已知的方法繁殖。例如，微生物可以在厌氧或需氧条件下在液体培养基中繁殖。用于生长微生物的合适液体培养基包括本领域已知的那些，例如营养肉汤和胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)等。在最优选的实施方案中，组合物包括表1所列出的4种菌株的整个列表。
在一个方面，组合物包括约1至约100亿菌落形成单位(CFU)/毫升的微生物总数目。优选地，组合物包括约100,000至约800,000CFU/毫升的微生物总数目。更优选地，组合物包括约250,000至约600,000CFU/毫升的微生物总数目。最优选地，组合物包括约300,000CFU/毫升的微生物总数目。
在一个方面，组合物包括存活微生物和非存活微生物。在另一个方面，组合物包括存活微生物或非存活微生物。含有非存活微生物的组合物可以含有微生物的提取物，例如表1的微生物的提取物或其他细菌。微生物的提取物包括例如酶、代谢产物、蛋白质和由微生物产生并能够引发对环境的作用的其他物质。在一些实施方案中，提取物可以是一种或多种微生物例如表1的那些的液体发酵产物。在一些实施方案中，提取物可以使用标准化生物化学纯化方案进行纯化。
在一个方面，使组合物发酵以产生发酵产物。组合物可以发酵约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多天。优选地，使组合物发酵至少约1至约5天。更优选地，使组合物发酵至少3天。
组合物还可以包括添加剂。合适的添加剂包括本领域已知的物质，其可以支持生长、由微生物产生特定代谢产物、改变pH、富集靶代谢产物、增强杀昆虫效应及其组合。示例性添加剂包括碳源、氮源、磷源、无机盐、有机酸、生长培养基、维生素、矿物质、乙酸、氨基酸等等。
合适碳源的实例包括但不限于淀粉、蛋白胨、酵母提取物、氨基酸、糖如蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡糖胺、麦芽糖、甘蔗、苜蓿提取物、糖蜜、朗姆酒等等；有机酸如乙酸、富马酸、己二酸、丙酸、柠檬酸、葡糖酸、苹果酸、丙酮酸、丙二酸等等的盐；醇如乙醇、甘油等等；油或脂肪如大豆油、米糠油、橄榄油、玉米油和芝麻油。所添加的碳源的量根据碳源的种类而变，并且通常为1至100克/升培养基。组合物中碳源的重量分数可以为组合物总重量的约98％或更少、约95％或更少、约90％或更少、约85％或更少、约80％或更少、约75％或更少、约70％或更少、约65％或更少、约60％或更少、约55％或更少、约50％或更少、约45％或更少、约40％或更少、约35％或更少、约30％或更少、约25％或更少、约20％或更少、约15％或更少、约10％或更少、约5％或更少、约2％或者约1％或更少。优选地，苜蓿作为主要碳源以约1至20％(w/v)的浓度包含在培养基中。更优选地，苜蓿为约5至12％(w/v)的浓度。
合适氮源的实例包括但不限于氨基酸、酵母提取物、苜蓿提取物、胰蛋白胨、牛肉提取物、蛋白胨、硝酸钾、硝酸铵、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、氨或其组合。氮源的量根据氮源而变，通常为0.1至30克/升培养基。组合物中氮源的重量分数可以为组合物总重量的约98％或更少、约95％或更少、约90％或更少、约85％或更少、约80％或更少、约75％或更少、约70％或更少、约65％或更少、约60％或更少、约55％或更少、约50％或更少、约45％或更少、约40％或更少、约35％或更少、约30％或更少、约25％或更少、约20％或更少、约15％或更少、约10％或更少、约5％或更少、约2％或者约1％或更少。
合适无机盐的实例包括但不限于磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、氯化镁、硫酸铁、硫酸亚铁、氯化铁、氯化亚铁、硫酸锰、氯化锰、硫酸锌、氯化锌、硫酸铜、氯化钙、氯化钠、碳酸钙、碳酸钠及其组合。组合物中无机盐的重量分数可以为组合物总重量的约98％或更少、约95％或更少、约90％或更少、约85％或更少、约80％或更少、约75％或更少、约70％或更少、约65％或更少、约60％或更少、约55％或更少、约50％或更少、约45％或更少、约40％或更少、约35％或更少、约30％或更少、约25％或更少、约20％或更少、约15％或更少、约10％或更少、约5％或更少、约2％或者约1％或更少。
在另一个实施方案中，本发明的组合物可以进一步包含乙酸或羧酸。合适的乙酸包括本领域任何已知的，包括但不限于甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、3-甲基丁酸、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、乙酸异丁酯和乙酸2-甲基丁酯。在一个实施方案中，乙酸通过使用醋而包括。组合物中乙酸的重量分数可以为组合物总重量的约98％或更少、约95％或更少、约90％或更少、约85％或更少、约80％或更少、约75％或更少、约70％或更少、约65％或更少、约60％或更少、约55％或更少、约50％或更少、约45％或更少、约40％或更少、约35％或更少、约30％或更少、约25％或更少、约20％或更少、约15％或更少、约10％或更少、约5％或更少、约2％或者约1％或更少。
本发明的组合物可以是液体或干燥形式。组合物可以包含组分的水性悬浮液。该水性悬浮液可以作为在应用之前稀释的浓缩原液或作为即用型稀释溶液提供。另外，组合物可以是粉末、颗粒剂、粉尘、丸剂或胶体浓缩物。这样的干燥形式可以配制成在润湿后立即溶解，或者以受控释放、缓释或其他时间依赖性方式溶解。另外，组合物可以是不依赖于润湿或溶解而有效的干燥形式。组合物可以另外在能够喷雾的制剂中提供。喷雾可以是液体或气溶胶。
在一些实施方案中，本发明的组合物可以包含至少一种任选的赋形剂。合适赋形剂的非限制性实例包括抗氧化剂、添加剂、稀释剂、粘合剂、填料、缓冲剂、矿物盐、pH调节剂、崩解剂、分散剂、调味剂、营养剂、膨胀剂和渗透剂、稳定剂、防腐剂、风味性增强剂和着色剂。用于形成组合的赋形剂的量和类型可以根据已知的科学原理来选择。
在一个实施方案中，赋形剂可以包括至少一种稀释剂。合适稀释剂的非限制性实例包括微晶纤维素(MCC)、纤维素衍生物、纤维素粉末、纤维素酯(即乙酸酯和丁酸酯混合酯)、乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、玉米淀粉、磷酸化玉米淀粉、预胶化玉米淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、淀粉-乳糖、淀粉-碳酸钙、淀粉羟乙酸钠、葡萄糖、果糖、乳糖、乳糖一水合物、蔗糖、木糖、乳糖醇(lacitol)、甘露醇、麦芽糖醇(malitol)、山梨糖醇、木糖醇、麦芽糖糊精和海藻糖。
在另一个实施方案中，赋形剂可以包含粘合剂。合适的粘合剂包括但不限于淀粉、预胶化淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯基噁唑烷酮、聚乙烯醇、C12-C18脂肪酸醇、聚乙二醇、多元醇、糖、寡糖、多肽、寡肽及其组合。
在另一个实施方案中，赋形剂可以包括填料。合适的填料包括但不限于碳水化合物、无机化合物和聚乙烯吡咯烷酮。作为非限制性实例，填料可以是二和三碱式硫酸钙、淀粉、碳酸钙、碳酸镁、微晶纤维素、二碱式磷酸钙、碳酸镁、氧化镁、硅酸钙、滑石、改性淀粉、乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇。
在另外一个实施方案中，赋形剂可以包含缓冲剂。合适缓冲剂的代表性实例包括但不限于MOPS、HEPES、TAPS、Bicine、Tricine、TES、PIPES、MES、Tris缓冲液或缓冲盐水(例如Tris缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)。
在进一步的实施方案中，赋形剂可以包括崩解剂。合适的崩解剂包括但不限于淀粉例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、其预胶化淀粉和改性淀粉，甜味剂，粘土例如膨润土，微晶纤维素，海藻酸盐，淀粉羟乙酸钠，树胶如琼脂、瓜尔胶、槐豆胶、刺梧桐树胶、果胶(pecitin)和黄蓍胶。
在另外一个实施方案中，赋形剂可以包括分散增强剂。合适的分散剂可以包括但不限于淀粉、海藻酸、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、高岭土、膨润土、纯化木纤维素、淀粉羟乙酸钠、异晶硅酸盐(isoamorphous silicate)和微晶纤维素。
在进一步的实施方案中，赋形剂可以包括润滑剂。合适润滑剂的非限制性实例包括矿物质如滑石或二氧化硅；以及脂肪如植物硬脂精、硬脂酸镁或硬脂酸。
组合中赋形剂的重量分数可以为组合总重量的约98％或更少、约95％或更少、约90％或更少、约85％或更少、约80％或更少、约75％或更少、约70％或更少、约65％或更少、约60％或更少、约55％或更少、约50％或更少、约45％或更少、约40％或更少、约35％或更少、约30％或更少、约25％或更少、约20％或更少、约15％或更少、约10％或更少、约5％或更少、约2％或者约1％或更少。
本发明的组合物作为液体或干燥形式在各种条件下就细菌菌落形成单位(cfu/ml)浓度(图1)和随着时间过去的pH水平(图2)而言是稳定的。优选地，本发明的组合物在室温下是稳定的。
在本发明的另一个方面，可以将聚生体保持在降低的温度用于贮存和运输而不显著损害活微生物的活力。聚生体或包含其的组合物可以被冷藏、冷冻或冻干。组合物可以在32°F至44°F之间冷藏。
在本发明的另一个方面，聚生体或包含其的组合物可以在冷冻状态下贮存和运输。一旦组合物解冻并且达到环境温度，优选伴随曝气和/或搅拌，活的有益微生物可以快速复生。
在本发明的另外一个方面，可以将聚生体冻干。聚生体首先被冷冻。然后在真空下清除水。这个过程进一步降低了用于贮存和运输的组合物的重量。包含其的组合物的聚生体可以在应用前重构并且复生。
在本发明的另一个方面，在应用于种子、植物、土壤等等之前，浓缩的聚生体或包含其的组合物可以用水稀释。稀释的组合物可以贮存延长的时间段，例如长达30天，而不丧失活力。为了将活的有益微生物维持在基本上需氧的状态，本发明的稀释组合物中的溶解氧优选保持在最佳水平。优选通过缓慢曝气向稀释的组合物供应最佳量的氧。
III.方法
本文公开的组合物可用于农业中，以及用作化学/肥料替代物用于增加植物的可用磷。本文公开的组合物可用于农业方法中。本发明的方法包括土壤富集和植物富集。
土壤处理方法包括将组合物应用于待富集的土壤。组合物可以是液体或干燥形式，并且通过本领域已知的方法应用于土壤。示例性方法包括喷雾、滴落、散射和轻撒靶土壤。另外，组合物可以应用于供给靶土壤的水源。
在另一个方面，组合物可以用于植物富集。植物富集的方法包括将本发明的组合物应用于如本文所述的植物的土壤或水源。在另一个方面，种子可以在种植之前浸泡在本发明的组合物中。应认识到组合本文所述的任何方法用于土壤和植物富集可能是有益的。
微生物组合物可以以干燥或液体形式提供。微生物组合物可以以就土壤或植物的重量而言的各种量提供。在一些方面，微生物组合物以范围为土壤或植物总重量的约0.5至50重量％的量提供。在另一个方面，微生物组合物以范围为土壤或植物总重量的约1至约3重量％的量提供。
微生物可以以干燥形式、液体形式或通过喷雾提供。处理废物的方法包括但不限于喷雾、轻撒、喷洒、液体接种、雾化、熏蒸、气溶胶化和本领域已知的其他方法。
为了促进本发明的实施方案的更好理解，给出下述实施例。下述实施例决不应被视为限制或限定本发明的范围。
实施例
实施例1
申请人从代表广泛范围的气候、土壤特征和植被类型(包括主要生产作物(大豆、小麦和玉米))的农业和天然草原以及森林地点，从跨越美国的土壤中提取天然土壤微生物群落。微生物在类似不同P限制条件的确定成分培养基中繁殖。培养基提供了独特的环境，这允许申请人控制营养素的化学计量学，以使土壤微生物的生长适应许多不同的环境条件。例如，为了在典型的酸性土壤中生长微生物，通过使用在三价铁(FePO4)和铝(AlPO4)底物本发明2.1；2.2中发现的不溶性P来控制营养素化学计量学。
表2.1使用三价铁(FePO4)和铝(AlPO4)底物的确定成分培养基的实例
表2.2三价铁(FePO4)和铝(AlPO4)培养基中的营养素化学计量学限制的实例
定量来自这些土壤的产生可溶性正磷酸盐的微生物群落的微生物生长速率，并且结果显示于图3中。这些微生物群落在其正磷酸盐矿化速率和微生物生物量中的P累积中差异很大，我们测定了使用磷酸盐检测系统方案(Taylor等人2013)测定这点。使用这种方法，申请人能够随后选择显示出比平均P-增溶速率或有机PO4矿化性状多五-十倍的稀有微生物聚生体，包括具有P增溶和矿化的最快速率和/或更高幅度的那些(图3)。
接下来，为了改善由这些微生物聚生体证实的优良的P增溶和矿化，将高通量表征平台(以评估微生物性状)与定向人工选择的使用相组合，其中细菌通过育种过程进行修饰，所述育种过程导致增强的磷动员活性。定向微生物群落正磷酸盐增溶和矿化选择通过首先将优良聚生体接种到含有我们的选择培养基的96孔深孔板内来完成，所述优良聚生体显示增强的动员(在微生物聚生体P功效的表征和筛选期间鉴定的)。因为相对小的“种子”聚生体加入96个重复各自中，所以通过在聚生体装配期间起作用的自然变异性和随机生态因素，在每个重复中实现了聚生体组合物中的轻微偏移(McGrady-Steed等人，1997；VanDer Gast等人，2008；Nemergut等人，2013)。在每个后续代中，基于其增溶或矿化正磷酸盐的能力来鉴定期望的聚生体(图4)。另外，在定向选择期间，微生物突变和水平基因转移经由UV暴露或诱变剂得到加速。选择具有最高P增溶速率的聚生体作为用于接种下一代的种子群落。所得的聚生体由细菌菌株的新组合组成，所述细菌菌株显著不同于天然土壤中发现的群落，并且证实令人惊讶地增强的P动员。
与本发明的聚生体一起使用的细菌公开于表1(磷动员聚生体)中。菌株可通过在表中报告的其操作分类单位的16S核糖体代表序列来鉴定。根据本发明，这些鉴定的菌株中的两种或更多种可以用于增加土壤中植物可用的磷。在优选的实施方案中，菌株是包括以至少超过约0.2kb的16S序列的97％相似性的代表性OTU的那些(表1)。一旦优化，我们就使用培养基，所述培养基使用三价铁(FePO4)和铝(AlPO4)底物表2.1模拟酸性土壤中通常发现的不溶性P条件。
我们已能够用几种不同的培养基制剂如苜蓿培养基在初始发酵期后成功地稳定细菌生长。对于这些实验，通过使用热和水提取方案产生苜蓿培养基。简言之，将约80g苜蓿底物(包含在细网状尼龙煮沸袋中)与约1加仑的水组合，并且在不锈钢酿造釜中煮沸(～100℃)约60分钟。热和水帮助从苜蓿中提取碳化合物和营养素，这可以帮助生长所公开的细菌聚生体。热和水提取方法还作用于至少部分地灭菌苜蓿提取物。在煮沸60分钟后，将水-苜蓿混合物保持覆盖在酿造釜中，从加热元件中取出，并且允许经过接下来的12小时缓慢冷却(至～60℃)。在冷却期后，将苜蓿-液体提取物无菌转移到无菌玻璃瓶内，并且在4℃下贮存直至使用。
其他方法已能够在初始发酵期后稳定细菌生长。在这些方法的许多中，将各种稳定制剂混合，高压灭菌，冷却，然后以范围为0.001％-50％总体积的不同浓度和体积掺入细菌接种物内。制剂添加剂可以包括：山梨糖醇、葡萄糖、乳糖、海藻糖、甘油、PEG、甘氨酸和/或脯氨酸。
实施例2-用于动员磷的细菌聚生体改善的评估
我们进行了体外测定，以定量与其他细菌分离物(即在纯培养物中)相比，我们的细菌聚生体动员正磷酸盐(PO4)的能力中的改善。令人惊讶的是，所公开的聚生体显示超出预期量的增强动员。实际上，当两种或更多种个别细菌菌株被包括在聚生体中时，观察到协同效应。这是令人惊讶的，因为不同的细菌菌株通常预期彼此抑制。
为了比较细菌分离物(表1中列出的)，制备作为聚生体一起发挥作用的各种分离物组合。细菌从各种细菌菌种分离物的冷冻储备样品生长(先前在我们的铁和铝培养基中生长(上文列出的)，然后在-80℃下在2mL无菌微量离心管中作为子样品冷冻贮存)。通过将总体积1mL的浓缩细菌接种到19mL无菌苜蓿培养基(如上文公开的制备的)内，使细菌分离物样品生长用于该实验。通过将1mL冷冻细菌储备培养物(对于每个菌种独立地)接种到19mL苜蓿培养基内，使20mL每种细菌分离物(表1)生长。每个分离的细菌菌种培养物在苜蓿培养基中在培养箱中生长3天(在25℃下)，直到分离的培养物各自为109CFU/mL的浓度。
然后，我们对于每个因子组使用四个重复进行全因子设计(表3.1)，以使用96深孔板形式测试细菌菌种动员PO4的交互能力。对于细菌分离物，我们将50ul总成熟培养物接种到950uL苜蓿培养基内。然而，为了将分离物组合成不同的细菌聚生体集合，我们使用了相同的总接种物比率(50ul总成熟培养物进入950μl苜蓿培养基内)，但基于细菌相对比例将多种细菌分离物重组成聚生体，如在高通量分子群落分析中观察到的(表3.1；表3.2)。细菌培养物在96孔深孔板中生长3天(在25℃的培养箱中)，直到分离的培养物各自达到109CFU/mL的浓度。在三天生长期后，就增加的PO4可用性同时评估所有样品(代表不同的聚生体集合的细菌分离物和细菌组合)。
该温育研究中的发现证实如何可以实现改善的正磷酸盐(PO4)动员以及在聚生体中包括多个细菌菌种的协同效应。这些数据证实通过添加两种或更多种所公开的细菌菌种极大改善动员磷的能力，使得磷动员速率对于聚生体大于分离的聚生体成员的附加速率。更具体而言，对于两个菌种聚生体(包括阴沟肠杆菌(E)和弗氏柠檬酸杆菌(C))和三个菌种聚生体(包括阴沟肠杆菌(E)和弗氏柠檬酸杆菌(C)和恶臭假单胞菌(P))观察到的PO4动员中最强的协同改善(图5)。这个结果是出乎意料的。相反，在大多数情况下，一个细菌菌种将抑制同一培养物中第二细菌菌种的生长和代谢。
表3.1全因素设计以测试用于改善正磷酸盐(PO4)动员的四个靶菌种之间的交互作用。下方的值表示达到50μL的最终体积的相对比例(μL)，以在96孔深孔板的每个孔中加至950μL。每种培养物在混合时为109CFU。
表3.2关于我们的土壤PO4动员细菌聚生体的细菌群落结构、菌落形成单位(CFU)和相对丰度。
在所公开的组合物的一些实施方案中，聚生体中的各个菌株的相对丰度可以在0.05和0.95之间。在许多实施方案中，一个菌株的相对丰度可以大于约0.01、0.05、0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、96、0.97、0.98或0.99，且小于约0.99、0.98、0.97、0.96、0.95、0.90、0.85、0.80、0.75、0.70、0.65、0.60、0.55、0.50、0.45、0.40、0.35、0.30、0.25、0.20、0.15、0.10、0.05、0.04、0.03、0.02或0.01。因此，例如，聚生体中的细菌菌种的比率可以是但不限于0.5∶0.5、0.1∶0.9等(对于具有两个菌株/菌种的聚生体)，0.33∶0.33∶0.33、0.1∶0.4∶0.5、0.2∶0.6∶0.2等(对于具有三个菌株/菌种的聚生体)，0.1∶0.4∶0.4∶0.1、0.4∶0.3∶0.2∶0.1等(对于具有四个菌株/菌种的聚生体)。
实施例3-温室研究中的生物刺激剂性能的评估
申请人已在温室实验中测试了微生物P动员生物刺激剂改善小麦(图64)、草坪草(图7-11)、墨西哥辣椒(图12)、番茄(图13-15)、罗勒(图15)和金盏花(图16)的早期出苗、绿色和一般健康的有效性和功效。这些实验在Colorado State University校园(FortCollins，Colorado)的植物生长设施温室处进行，该校园提供受控的16小时光周期，以模拟植物生长的阳光。温室白天温度设定为23℃并且在夜间设定为17℃。
例如，在评价微生物生物刺激剂对草坪草健康特征的有效性的初步试点研究中，我们在全尺寸播种盘(尺寸为53.34cm L x 27.94cm W x 5.84cm H)中生长了四种不同的草种，所述播种盘由再生聚丙烯制成，在底部具有排水孔。播种盘填充3/4满的收集土壤。将土壤加入播种盘后，使用烧杯将土壤用150mL水预浇水。然后将推荐的种子密度分散在土壤顶部(对于草地早熟禾1.6g，并且对于多年生黑麦、高羊茅和翦股颖2.66g)。该实验中使用的土壤的特征在于具有混合的冲积土和/或风成沉积母质(细壤质、混合的、栖温地弱发育干润淋溶土(Haplustalfs))(NRCS，2012)的Stoneham壤土。干旱弱发育干润淋溶土分类在土纲淋溶土下，通常经历延长的干燥条件，并且广泛应用于农业生态系统中，且占据地球陆地表面的大约十分之一。这些土壤具有富含粘土的底土，并且在全世界许多地方具有缺乏可用磷的特征。通常，淋溶土具有高铝(Al)和铁(Fe)含量，提示这些土壤具有较高的P吸附亲和力。一旦收集，就使用4mm筛子筛分土壤以去除大物体(岩石、根等)，然后用2mm筛子更好地均化聚集体尺寸。将均化的田间土壤以1∶1的比率与无菌砂混合物混合，以使土壤孔隙度达到最大，同时维持合理量的田间土壤用于其营养素和微生物性质。在产生土壤-砂混合物之前，先将砂(Quikrete；Atlanta，GA)在121℃和17PSI下在高压釜中灭菌30分钟，然后用无菌DI水(～30分钟间隔)饱和直到实现～8.0的pH，以匹配原地土壤pH条件(田间土壤pH平均值±SE＝8.3±0.05)。
参考表4.1和4.2(在图17和18中呈现)，在该实验中应用不同的处理，包括：处理1)来自我们的P动员微生物聚生体的微生物聚生体；处理2)不含微生物活性的对应于处理1(使用0.2μM)的无菌培养基；和处理3)用于对照的常见营养素丰富的无机植物肥料(Hoagland氏溶液)，代表用于草生长的非限制性营养素来源。使用喷雾瓶将每种草处理(100mL)直接应用于草种子。一旦应用处理，就加入1cm的顶部土壤层以覆盖种子，随后为400mL水，使用500mL烧杯将所述水应用至每个种子盒。
与所有其他处理相比，在播种8天后，用处理1接种的四个草种中的三个(包括多年生黑麦、高羊茅和草地早熟禾)中观察到更快的出苗、更高的草生长和更绿的草(图6)。如通过草地早熟禾(图8-9)证实的，与所有其他处理方式(包括无机肥料添加剂)相比，大部分草更绿(使用DGCI指数评价的)(图7)，并且当用我们的P动员生物刺激剂接种时，草坪草掺入更多的生物量。此外，对于几种大量营养素和微量营养素增加的土壤营养素可用性和后续植物摄取对应于微生物生物刺激剂应用(图11)。例如，与传统无机肥料(无机肥料)相比，用本发明的P动员微生物生物刺激剂组合物(Elevate P)接种的种子证实增加的土壤钙(Ca)、镁(Mg)、钠(Na)、钾(K)和铁(Fe)摄取(图11)。申请人细菌接种体还增加了其他几种营养素的可用性和摄取，分别显示于表4.1和4.2，图17和18中。
因此，本发明非常适用于达到所提到的目的和优点以及其中固有的那些。上面公开的特定实施方案仅是举例说明性的，因为本发明可以以对本领域技术人员显而易见的不同但等价的方式进行修改和实践，这具有本文教导的利益。此外，除如下文权利要求中所述外，本文所示的结构或设计的细节不受限制。因此显而易见的是上文公开的特定举例说明性实施例可以被改变、组合或修改，并且所有这些变化都被视为在本发明的范围和精神内。本文举例说明性公开的本发明适当地可以在不存在本文未具体公开的任何元件和/或本文公开的任何可选元件的情况下进行实践。
实施例4-聚生体对植物生长的作用
研究了本发明要求保护的细菌对拟南芥(Arabidopsis thaliana)生长的作用，因为其生长已知受到土壤接种影响(Swenson等人，2000)。将每个盆两个拟南芥野生型种子(来自Evotek Inc.，Washington DC，USA)种植在填充有约一品脱高压灭菌土壤(50％农业表层土和50％盆栽土)的四英寸盆中。将播种的盆维持在70°F下，具有16小时/天的补充阳光，在雾化台下约两周以确保发芽。在种植种子之后，立即将5mL培养基(先前描述的苜蓿茶)加入每个盆中。
一些培养基包含一个或多个细菌菌种。如果培养基包括细菌，则培养基中的细菌总浓度为6.5±2.1x 108cfu/ml。一组植物接受单独的培养基(“培养基”或“0ssp”)。一组植物接受包含所有四个细菌菌株的培养基(“4ssp”)：睾丸酮丛毛单胞菌(Ce)、弗氏柠檬酸杆菌(Cf)、阴沟肠杆菌(Ec)和恶臭假单胞菌(Pp)。四组植物接受各自含有Ce、Cf、Ec或Pp的一个菌种的培养基(“1ssp”)。六组植物接受含有等价量的两个细菌菌种的培养基(“2ssp”)，各自选自Ce、Cf、Ec和Pp；Ce+CF、Ce+Ec、Ce+Pp、Cf+Ec、Cf+Pp和Ec+Pp。四组植物接受含有等价量的三个细菌菌种的培养基(“3ssp”)，各自选自Ce、Cf、Ec和Pp；Ce+Cf+Ec、Ce+Ec+Pp、Ce+Cf+Pp和Cf+Ec+Pp。
如果两个种子均发芽，则将两个中的较小者从盆中取出。在发芽后，第二次接种盆，再次使用含有适当细菌混合物或无细菌(0ssp)的5mL培养基。通过在雾台中每天浇水将盆子保持湿润共两周以确保发芽。播种两周后，将植物从雾台取出，但维持每天浇水。
测量三个变量以评价每个植物的生长：莲座叶数目、最大莲座叶直径和植物高度。每周两次进行测量并记录。在32天后不能抽苔(bolt-in)(长大)的植物被排除在分析之外。无法抽苔在所有处理中同等分配。
图19显示了来自这些实验的结果，特别是关于用包含不同数目菌种的培养基接种的种子的拟南芥生长指标。表5-9呈现了用于在图19中创建图形的数据。图19中绘制的点表示平均值，并且误差条指示6-8个重复的平均值的标准误。符号指示来自4个菌种处理的数据4ssp在p＜0.05(ΦΦ)或p＜0.1(Φ)下显著大于0个菌种，并且4个菌种在p＜0.05(**)或p＜0.1(*)下大于所有其他处理。令人惊讶的是，并且对于测量的每个变量，当培养基包括所有四个菌种，4ssp时，植物生长显示最大的增强。这个结果在植物的整个发育期间是一致的；早期(莲座叶叶数目)、早中期(最大莲座叶直径)和中晚期(植物高度)。
具体地，在第一个植物开始抽苔(生长茎)之后的前五天的生长速率，全部四个菌种处理导致比仅添加不含微生物的培养基大超过五倍的高度生长速率。有趣的是，加入1至3个菌种不导致超过只添加培养基的任何显著效应。最后，培养基中的四个细菌菌种的存在帮助将数据的可变性降低2倍(相对于ssp 1、ssp 2和ssp 3)和3倍(相对于0ssp，培养基对照)。
表5显示了通过处理中菌种数目的拟南芥生产力。表中的值之后的字母指示给定列中的值之间的关系，特别是显著差异(p＜0.1；例如“a”类似于“a”和“ab”而不是“b”)。接受的所有处理都指示肥料应用。对于评价的三个生产力量度，处理ssp 4(Mammoth P)使生产力增加了25％、71％和58％。在14天后评价莲座叶叶数目；在25天后评价最大莲座叶直径；在种植后39天评价植物高度。
表5
表6显示了针对量度特定峰时间点通过特定处理的拟南芥生产力。在14天后评价莲座叶叶数目；在25天后评价最大莲座叶直径；在种植后39天评价植物高度。
表6
表7显示了对于所有处理和取样时间通过高度(mm)的拟南芥生长。数目指示平均值±SE。Mammoth P具有所有四个菌种；Cf＝弗氏柠檬酸杆菌；Ec＝阴沟肠杆菌；Pp＝恶臭假单胞菌；Ce＝睾丸酮丛毛单胞菌。
表7
表8显示了对于所有处理和取样时间通过最大直径(mm)的拟南芥生长。数目指示平均值±SE。Mammoth P具有所有四个菌种；Cf＝弗氏柠檬酸杆菌；Ec＝阴沟肠杆菌；Pp＝恶臭假单胞菌；Ce＝睾丸酮丛毛单胞菌。
表8
表9显示了对于所有处理和取样时间通过莲座叶叶数目的拟南芥生长。数目指示平均值±SE。Mammoth P具有所有四个菌种；Cf＝弗氏柠檬酸杆菌；Ec＝阴沟肠杆菌；Pp＝恶臭假单胞菌；Ce＝睾丸酮丛毛单胞菌。
表9
保藏
申请人的磷动员聚生体和申请人的矿化聚生体的聚生体保藏是在本申请的提交日期之前，并且由Colorado State University维持。对该保藏物的接近在申请的未决期间对于专利与商标局局长和由局长决定给予权力的人员在请求后可获得。在申请中的任何权利要求允许后，申请人由美国农业部的国家农业利用研究中心的ARS菌种保藏中心(ARSCulture Collection of the U.S.Department of Agriculture’s National Center ForAgricultural Utilization Research)(NRRL；“保藏处”)，Peoria，Illinois，61604不受限制地向公众提供聚生体细菌的保藏物。如上所述，所保藏的细菌将得自在Colorado StateUniversity维持的相同保藏物。另外，申请人将满足37 C.F.R.§1.801-1.809的所有要求，包括当制备保藏物时提供样品活力的指示。聚生体细菌的一个实施方案的登录号为：睾丸酮丛毛单胞菌，NRRL B-67136；弗氏柠檬酸杆菌，NRRL B-67137；阴沟肠杆菌，NRRL B-67138；恶臭假单胞菌，NRRL B-67139。
上述细菌的这种保藏将在保藏处(其为公共保藏处)维持30年，或在最近的请求之后5年，或在专利的可实施的寿命(以较长者为准)，并且如果在此期间变得无法存活，则将被替换。申请人不会对保藏材料的可用性施加任何限制；但是，申请人无权放弃由法律对生物材料转移或其商业运输施加的任何限制。
Claims (21)
1.一种组合物，其用于增强有机土壤磷转换为正磷酸盐的速率，所述组合物包含选自表2.1中鉴定的两种或更多种分离的细菌菌株和载体。
2.权利要求1的组合物，其中所述两种或更多种细菌菌株包括与SEQ ID NO：1-4之一具有97％同一性的大于200个核苷酸的序列。
3.权利要求1至2中任一项的组合物，其中细菌选自基本上由阴沟肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、睾丸酮丛毛单胞菌、恶臭假单胞菌及其组合组成。
4.权利要求1至3中任一项的组合物，其包含磷动员聚生体和/或矿化聚生体，其中所述两种或更多种细菌选自具有NRRL登录号NRRL B-67136、NRRL B-67137、NRRL B-67138和NRRL B-67139的细菌。
5.权利要求1至4中任一项的组合物，其中所述载体包含从苜蓿提取的一种或多种化合物。
6.权利要求1至5中任一项的组合物，其中所述组合物是液体。
7.权利要求1至6中任一项的组合物，其中所述组合物被浓缩以去除水。
8.权利要求7的组合物，其中所述组合物在使用前用水稀释。
9.一种用于增强有机土壤磷转换为正磷酸盐的速率的方法，其包括：
使选自表2.1中鉴定的组的两个或更多个细菌菌种与土壤接触。
10.权利要求9的方法，其中所述两个或更多个细菌菌种各自包含与SEQ ID NO：1-4之一具有至少97％同一性的大于约200个核苷酸的rRNA 16S序列。
11.权利要求9至10中任一项的方法，其中所述土壤包括种子或植物。
12.权利要求9至11中任一项的方法，其中所述两种或更多种细菌选自具有NRRL登录号NRRL B-67136、NRRL B-67137、NRRL B-67138和NRRL B-67139的细菌。
13.权利要求9至12中任一项的方法，其还包括允许土壤内的种子或植物生长的步骤。
14.权利要求9至13中任一项的方法，其中在使所述土壤与所述两种或更多种细菌接触之后，将种子或植物加入所述土壤中。
15.权利要求9至14中任一项的方法，其中通过用所述两种或更多种细菌喷涂所述土壤而使之接触所述土壤。
16.权利要求9至15中任一项的方法，其中所述两种或更多种细菌包含在应用于所述土壤的粉末或颗粒组合物中。
17.权利要求9至16中任一项的方法，其中所述两种或更多种细菌在接触所述土壤之前与水混合。
18.一种增加植物的生长速率的方法，其包括：
使土壤与选自NRRL登录号NRRL B-67136、NRRL B-67137、NRRL B-67138和NRRL B-67139的两个或更多个细菌菌种接触；
允许所述两个或更多个细菌菌种增溶一种或多种磷化合物；
允许所述植物吸收所述增溶的磷，从而增加所述植物的生长速率。
19.权利要求18的方法，所述土壤与所有四个细菌菌种接触。
20.权利要求18至19中任一项的方法，其中测量所述植物的高度、重量、颜色或产量以确定生长。
21.权利要求18至20中任一项的方法，其中所述植物的生长比在未被所述两个或更多个细菌菌种接触的土壤中生长的类似植物大至少2％。
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