JP6220040B2 - 競合的且つ有効な細菌株 - Google Patents

Description

本願はコンピューター読み取り可能な形態の配列表を含む。斯かるコンピューター読み取り可能な形態は引用により本明細書に組み込まれる。

本願は生物材料の寄託への言及を含む。斯かる寄託は引用により本明細書に組み込まれる。完全な情報については表１参照。

本発明は単離細菌株に関すると共に、優れた競合性及び性能特性を有する細菌株を選択する方法に関する。

植物が健全な成長を維持するには、植物が生育する土壌から、種々の元素を摂取しなければならない。斯かる元素としては窒素や、いわゆる微量栄養素（例えば銅、鉄、亜鉛等)が挙げられるが、土壌の多くには斯かる元素が不足しており、たとえ含まれている場合でも、植物が容易に摂取できない形態で存在している（概して、必須元素は溶解状態で土壌中に存在しない限り、植物が容易に摂取することはできないと考えられる）。 窒素は殆どの植物にとって必須元素であるが、これは窒素が、アミノ酸、タンパク質、ヌクレオチド、核酸、クロロフィル、補酵素等の合成や、植物の全体的な成長や健康に関与しているからである。斯かる不足を補償すべく、通常は不足元素源を土壌に加え、成長速度及び作物から得られる収率の改善を図っている。例えば、硝酸及び／又はアンモニウムを土壌に加えて、使用可能な窒素の不足を補う。

作物学の分野では、栽培作物の多くが、植物に比較的多くの窒素を提供できる土壌を必要とすることが知られている。斯かる土壌由来の窒素を要する植物の代表的な例外が、マメ科植物である。

具体的に、非マメ科植物と異なるマメ科植物の特徴は、大気窒素をアンモニアに固定する能力である。斯かる植物は大気窒素を、利用可能な窒素源に固定する能力を有するゆえに、土壌から窒素を得る必要がない。しかし、窒素固定には、マメ科植物と土壌内土着細菌との共生関係が必要である。このような共生関係にある組み合わせの中で最も広く研究されているのは、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）又はリゾビウム（Rhizobium）属の細菌である。Gresshoff, P. (1999). Identification of Plant Genes Involved in Plant-Microbe Interactions. Stacey, G. & Keen, T. (Ed.), Plant-Microbe Interactions (4th ed.) (Ch. 6). St. Paul: APS Press.（非特許文献１）

共生は通常、植物から微生物へ、及び、微生物から植物への、複雑な双方向的シグナル交換により達成される。通常は、フラボノイド類やフラボノイド様物質等の植物因子によって、マメ科植物の根粒への定着が誘導される（Gresshoff, 1999）。細菌が根粒に定着すると、細菌によって植物の形態変化、即ち根毛湾曲や、新たな根器官である根粒の発達が生じる（Gresshoff, 1999）。根粒によって確立された新たな生理環境の下で、根粒誘導性細菌は、定着対象植物に対する窒素固定内部共生菌、又はバクテロイドへと変化する（Gresshoff, 1999）。
リゾビウム（Rhizobium）の運動性及び走化性は、菌株の競合性との関連で重要な属性であることが知られている。例えば、Althabegoiti, et al., 2008, FEMS Microbiol. Lett. 282: 115-123（非特許文献２）は、USDA 110の自然発生突然変異菌株であって、野生型菌株と比べて運動性を向上させ、根粒形成能を改善した菌株を得たことを記載する。更に、Maier, et al., 1990, Appl. Environ. Microbiol. 56 (8): 2341-2346（非特許文献３）は、生物窒素固定プロセスにおけるモリブデンの役割について論じる。 更に、Alves, et al., 2003, Plant and Soil 252: 1-9（非特許文献４）は、ブラジルで用いられている大豆接種材料と、有効な窒素固定に対する競合性の重要性について論じる。最後に、Bloem, J.F., et al., 2001, Bio Fertil. Soils 33: 181-189（非特許文献５）は、菌株の選択における競合性の重要性を報告する。本研究では、研究者らは菌株間の競合性を決定する手段として、遺伝子工学による手法を用いて、レポーター遺伝子（ＧＵＳ）をインデックス菌株に導入した（Bloem et al., 2001）。彼らが実施した実験（Bloem et al., 2001）では、化学染色及び顕微鏡技術の全面的な使用が必要であったように、本報告の方法は、微生物の大標本をスクリーニングする非現実的な方策の域を出ないものであった。

Gresshoff, P. (1999). Identification of Plant Genes Involved in Plant-Microbe Interactions. Stacey, G. & Keen, T. (Ed.), Plant-Microbe Interactions (4th ed.) (Ch. 6). St. Paul: APS Press. Althabegoiti, et al., 2008, FEMS Microbiol. Lett. 282: 115-123 Maier, et al., 1990, Appl. Environ. Microbiol. 56 (8): 2341-2346 Alves, et al., 2003, Plant and Soil 252: 1-9 Bloem, J.F., et al., 2001, Bio Fertil. Soils 33: 181-189

本発明の目的は、市販の菌株、例えば市販菌株USDA 532Cのコロニー形成能と比較して、マメ科植物におけるコロニー形成の競合性に極めて優れた、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属由来の細菌単離株を提供することである。本発明の更なる目的は、市販の菌株、例えば市販菌株USDA 532Cのコロニー形成能と比較して、マメ科植物におけるコロニー形成の競合性に極めて優れ、マメ科植物成長促進効果の増強能を有する、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属由来の細菌単離株を提供することである。

植物の全般的な健康状態や、植物が利用可能な窒素源の可用性を改善するために、コロニー形成植物において優勢な、且つ植物の全体的な成長を促進し得る細菌株が、依然として求められている。本発明の菌株は斯かる利点を有するものである。

本発明は、市販の菌株、例えば市販菌株USDA 532Cと比較して、少なくとも以下の特性が改善された細菌の単離菌株に関する。
ａ．植物へのコロニー形成の競合性。
ｂ．増強された植物成長促進効果。
但し、改善対象となる特性は、これらに限定されるものではない。

本発明は、以下のブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株の生物学的に純粋な培養物に関する。
受託番号NRRL B-50592（別途 NRRL B-59571としても受託）の菌株；
受託番号NRRL B-50593（別途 NRRL B-59572としても受託）の菌株；
受託番号NRRL B-50586（別途 NRRL B-59565としても受託）の菌株；
受託番号NRRL B-50588（別途 NRRL B-59567としても受託）の菌株；
受託番号NRRL B-50587（別途 NRRL B-59566としても受託）の菌株；
受託番号NRRL B-50589（別途 NRRL B-59568としても受託）の菌株；
受託番号NRRL B-50591（別途 NRRL B-59570としても受託）の菌株；
受託番号NRRL B-50590（別途 NRRL B-59569としても受託）の菌株；
受託番号NRRL B-50594（別途 NRRL B-50493としても受託）の菌株；
受託番号NRRL B-50726の菌株；
受託番号NRRL B-50727の菌株；
受託番号NRRL B-50728の菌株；
受託番号NRRL B-50729の菌株；及び
受託番号NRRL B-50730の菌株、又は
上記寄託菌株のうち少なくとも２以上の菌株。

また、本発明は、16S rDNA配列同一性に基づいて本発明の上記菌株の何れかと近縁にある単離菌株であって、16S rDNA配列同一性に基づいて本発明の上記菌株の何れかと少なくとも９５％の配列同一性を有する菌株に関する。

更に、本発明は、植物成長を亢進する方法であって、植物、植物種子、又は植物周辺の土壌、又は植物種子に対して、本発明の菌株のうち少なくとも１つ、又は、上記寄託菌株のうち少なくとも２以上の組み合わせを含む組成物を施用することを含む方法に関する。

更に、本発明は、本発明の１又は２以上の菌株と、農薬学的に許容し得る担体とを含む組成物に関する。

図１Ａは、USDA 532Cに特異的な固有プライマーPrimer 209を示すＰＣＲゲルの画像であり、図１Ｂは、USDA 532C及び野生菌株を用いたプライマーPrimer 209の特異性を示すＰＣＲゲルの画像である。 図２Ａは、大豆根粒形成の優勢な競合菌株としてブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株USDA 532C を用いたＰＣＲゲルの画像であり、図２Ｂは、大豆根粒形成の優勢な競合菌株としてブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株USDA 532C 以外の競合菌株を用いたＰＣＲゲルの画像である。 図３Ａは、単離菌株及びUSDA 532C：138 - NRRL B-50589（別称 NRRL B-59568）；13 - NRRL B-50586（別称 NRRL B-59565）；p140 - USDA 532C；184 - NRRL B-50594（別称 NRRL B-50493）；142 - NRRL B-50590（別称 NRRL B-59569）；130 - NRRL B-50587（別称 NRRL B-59566）；65 - NRRL B-50588（別称 NRRL B-59567）；198 - NRRL B-50592（別称 NRRL B-59571）；135 - NRRL B-50591（別称 NRRL B-59570）；及び48 - NRRL B-50593（別称 NRRL B-59572）のＤＮＡフィンガープリントデンドログラムである。 図３Ｂは、単離菌株及びUSDA 532C：138 - NRRL B-50589（別称 NRRL B-59568）；13 - NRRL B-50586（別称 NRRL B-59565）；140 - USDA 532C；184 - NRRL B-50594（別称 NRRL B-50493）；142 - NRRL B-50590（別称 NRRL B-59569）；130 - NRRL B-50587（別称 NRRL B-59566）；65 - NRRL B-50588（別称 NRRL B-59567）；198 - NRRL B-50592（別称 NRRL B-59571）；135 - NRRL B-50591（別称 NRRL B-59570）；48 - NRRL B-50593（別称 NRRL B-59572）；318 - NRRL B-50727；278 - NRRL B-50726；727 - NRRL B-50730；370 - NRRL B-50728；及び518 - NRRL B-50729のＤＮＡフィンガープリントデンドログラムである。

本発明は、市販菌株、例えば市販菌株USDA 532Cと比較して、少なくとも次の亢進特性を有する細菌の単離株を提供し、ここで前記亢進特性は、
ａ．植物へのコロニー形成の競合性の亢進；及び
ｂ．植物成長の促進効果の亢進
を挙げることができるが、但しそれらだけには限定されない。

「細菌株（Bacterial Strain(s)）」とは、本明細書において使用される場合、ジアゾ栄養生物である細菌株を意味する。すなわち、共生窒素固定細菌である。本明細書において使用されるような細菌株の非制限的例は、次のものを挙げることができるが、但しそれらだけには制限されない：リゾビウム属（Rhizobium spp.）（例えば、R.セルロシリチクム（R. cellulosilyticum）、R.ダエジェオネンス（R. daejeonense）、R.エトリ（R. etli）、R.ガレガエ（R. galegae）、R.ガリクム（R. gallicum）、R.ギアルジニ（R. giardinii）、R.ハイナネンス（R. hainanense）、R.ヒューアウトレンス（R. huautlense）、R.インジゴフェラエ（R. indigoferae）、R.レグミノサリウム（R. leguminosarum）、R.ロエセンス（R. loessense）、R.ルピニ（R. lupini）、R.ルシタニウム（R. lusitanum）、R.モンゴレンス（R. mongolense）、R.ミルオネンス（R. miluonense）、R.スラエ（R. sullae）、R.トロピシ（R. tropici）、R.ウンジコラ（R. undicola）、及び／又はR.ヤングリンゲンス（R. yanglingense））、ブラディリゾビウム属（Bradyrhizobium spp.）（例えば、B. ベータ（B. bete）、B.カナリエンス（B. canariense）、B.エルカニ（B. elkanii）、B.イリオモテンス（B. iriomotense）、B.ジャポニクム（B. japonicum）、B.ジカマエ（B. jicamae）、B.リアオニンゲンス（B. liaoningense）、B.パキリヒジ（B. pachyrhizi）、及び／又はB.ユーアンミンゲンス（B. yuanmingense））、アゾリゾニウム属（Azorhizobium spp．）（例えば、A.カウリノデンス（A. caulinodans）及び／又はA.ドエベレイネラエ（A. doebereinerae））、シノリゾビウム属（Sinorhizobium spp.）（例えば、S.アブリ（S. abri）、S.アドアエレンス（S. adhaerens）、S.アメリカナム（S. americanum）、S.アボリス（S. aboris）、S.フレジ（S. fredii）、S.インディアエンス（S. indiaense）、S.コスチエンス（S. kostiense）、S.クメロワイエ（S. kummerowiae）、S.メディカエ（S. medicae）、S.メリロティ（S. meliloti）、S.メキシカヌス（S. mexicanus）、S.モレレンス（S. morelense）、S.サヘリ（S. saheli）、S.テランカエ（S. terangae）、及び／又はS.キシンジアンゲンス（S. xinjiangense））、及びメソリゾビウム属（Mesorhizobium spp.）（例えば、M.アルビジアエ（M. albiziae）、M.アモルファエ（M. amorphae）、M.カコエンス（M. chacoense）、M.シセリ（M. ciceri）、M.ヒュアクイ（M. huakuii）、M.ロティ（M. loti）、M.メジテラネウム（M. mediterraneum）、M.プルイファリウム（M. pluifarium）、M.セプテントリオナレ（M. septentrionale）、M.テムペラタム（M. temperatum）、及び／又はM.チアンシァネンス（M. tianshanense））。一つの特定の実施形態によれば、本発明の細菌株はさらに、受託番号NRRL B-50592（NRRL B-59571としても寄託されている）、NRRL B-50593 (NRRL B-59572としても寄託されている), NRRL B-50586 (NRRL B-59565としても寄託されている), NRRL B-50588 (NRRL B-59567としても寄託されている), NRRL B-50587 (NRRL B-59566としても寄託されている), NRRL B-50589 (NRRL B-59568としても寄託されている), NRRL B-50591 (NRRL B-59570としても寄託されている); NRRL B-50590 (NRRL B-59569としても寄託されている); NRRL B-50594 (NRRL B-50493としても寄託されている); NRRL B-50726; NRRL B-50727; NRRL B-50728; NRRL B-50729; NRRL B-50730を有するブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株、又は上記寄託された菌株のうち少なくとも２以上（２も含む）、上記菌株のうち少なくとも３、上記菌株のうち少なくとも４、上記菌株のうち少なくとも５、上記菌株のうち少なくとも６、上記菌株のうち少なくとも７、上記菌株のうち少なくとも８、上記菌株のうち少なくとも９、上記菌株のうち少なくとも１０、上記菌株のうち少なくとも１１、上記菌株のうち少なくとも１２、上記菌株のうち少なくとも１３、上記菌株のすべて以下及び上記菌株のすべての組合せを包含する。

用語「市販菌株（commercially available strain(s)）」とは、市販の細菌株、例えばUSDA 532C、USDA 110、USDA 123、USDA 127、USDA 129、等（Cregan, P.B., et al., 1989, Appl. and Enviro. Microbiol. 55 (10): 2532-2536）を意味する。

本明細書において使用される場合、「競合性の亢進（enhanced competitiveness）及び／又は「根粒形成の亢進（enhanced nodulation）」とは、支配的な％根粒占有率、例えば少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、１００％までの根粒占有率を有する細菌株を意味すると定義される。「競合性の亢進」は、下記に記載される詳細なアッセイに基づいて決定された（材料及び方法:「一次スクリーニングプロトコル」及び「競争研究プロトコル」を参照）。

本明細書において使用される場合、「根粒（nodule）」とは、確定根粒、不定根粒、又はその組合せを含むよう定義されるが、しかしそれに制限されるものではない。確定根粒及び不定根粒の例は、周知であり、そしてDenison, R. F., 2000, The Amer. Naturalist. 156 (6): 567-576に記載されている。確定根粒は、グリシン（Glycine）、ロータス（Lotus）又はインゲンマメ（Phaseolus）種に見出され、そして円形及び球形である。（Denison, 2000）確定根粒は、限定された期間、典型的には数週間のみ成長する。（Denison, 2000）確定根粒とは対照的に、不定根粒は、ウマゴヤシ（Medicago）、アカツメクサ（Trifolium）及びピシウム菌（Pisium）種上に見出され、拡張された形状を有し、そして連続的に成長する。

「根粒占有率（Nodule occupancy）」とは、周知の用語である。「McDermott T.R. & Graham ,P.H., Appl. and Environ. Microbiol. 55(10): 2493-2498」。本明細書において使用される場合、「根粒占有率」とは、市販ブラディゾビウム（Bradyrhizobium）菌株、例えばUSDA 532C以外の細菌株により占有される根粒の百分率、及び／又はすべての細菌株を含む根粒の総数で除算された、市販ブラディゾビウム（Bradyrhizobium）菌株、例えばUSDA 532C以外の特定細胞株を含む根粒の数を意味する。「根粒占有率」は、下記に記載される詳細なアッセイに基づいて決定され（材料及び方法：「一次スクリーニングプロトコル」及び「競争研究プロトコル」を参照）、そして温室又はフィールドサンプルのいずれかから得られた植物からの根粒の分析により決定され得る。一例として、％根粒占有率はA／（A+B）であり、ここでAは市販ブラディゾビウム（Bradyrhizobium）菌株、例えばUSDA 532C以外の特定菌株を含む根粒の数であり、そしてBは市販ブラディゾビウム（Bradyrhizobium）菌株、例えばUSDA 532Cを含む根粒の数である。まれな例外もあるが、単一の根粒は唯一の細菌株を含むであろうことは周知である。Johnston, A.W.B., et al., 1974, J. Gen. Microbiol 87: 343-350; Dunham, D. H. & Baldwin, I.L., 1931, Soil Science 32: 235-249; Johnson, H.W., et al., 1963, Agrono. J. 55: 269-271; Dudman, W.F. & Brockwell, J., 1968, J. Agricul. Res. 19: 739-747; Nicol, H. & Thorton, H.G., 1941, Proc. Roy. Soc. B 130, 32-59; Hughes, D.Q., & Vincent, J.M., 1942, Proc. of the Linnenan Soc. of New South Wales 67: 142-152; 及び Vincent, J.M. & Waters, L.M., 1953, J. Gen. Microbiol. 9: 357-370。

本明細書において使用される場合、「成長の促進効果の亢進（enhanced effectiveness at promoting growth）」とは、ブッシェル（bushels）／エーカー（acre）単位で測定される植物収率の向上、果実数の増加、根数の増加、根長の延長、根量の増大、根体積の増大、葉面積の拡大、植物群生の拡大、植物の活力増進、及び／又は、窒素（Ｎ_２）固定能の向上のうち少なくとも１つを含む。「成長の促進効果の亢進」は、下記に記載される詳細なアッセイに基づいて決定され（材料及び方法：「一次スクリーニングプロトコル」及び「性能研究プロトコル」を参照）、そして温室又はフィールドサンプルのいずれかから得られた植物の分析により決定され得る。

本明細書において使用される場合、「果実数の増加（increased fruit number）」とは、大豆植物上の大豆鞘の増加総数、及び／又は大豆植物上の大豆鞘の増加総乾燥重量を意味する。

本明細書において使用される場合、「総乾燥重量（total dry weight）」とは、８０℃での特定時間、例えば少なくとも４時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、等、又は植物体を乾燥するのに必要ないずれかの時間のインキュベーションに続いての植物体（例えば、果物、植物の鞘、植物の根、植物根粒、全体の植物、部分的植物、等）の重量を意味する。「総乾燥重量」を決定するための乾燥時間は、多くの要因に依存することが理解されるべきである。乾燥時間に影響を及ぼすことができる非制限的要因としては、乾燥されるべき材料、乾燥されるべき材料の質量、乾燥されるべき材料の量及び／又はそれらの組合せ挙げることができる。インキュベーションは、当業界において使用されるいずれかの温度調節された装置において行われ得る。本発明のためには、「総乾燥重量」は、Eppendorf Innova^{（登録商標）}42Rインキュベーターにより決定された。

用語「窒素（N₂）固定能の向上（increased nitrogen (N₂) fixing capability）」とは、本明細書において使用される場合、単離細胞が窒素（N₂）固定化を向上することができることを意味する。下記（材料及び方法）に提供される「性能研究プロトコル（Performance Study Protocol）」に基づいて、細菌の相対的窒素（N₂）固定能は、当業界に知られている標準窒素定量化法（例えば、Kjeldahl法、等）を用いて、植物中の総窒素含有量を測定することにより定量化され得る。Takahashi, M., et al., 2007. Uptake, Assimilation, and Novel Metabolism of Nitrogen Dioxide in Plants, p. 109-118. In N. Willey (ed.), Phytoremediation: Methods and Reviews, vol. 23. Humana Press, New York; Bremner, J. M. 1965. Total nitrogen, p. 1149-1178. In C.A. Black (ed.), Methods of soil analysis, vol. 2. American Society for Agronomy, Madison; Schank, S.C., et al., 1981, App. and Enviro. Microbiol., 41 (2): 342-345を参照。

本発明のさらなる別の側面によれば、単離細菌株は、耐温性の亢進を有する。「耐温性の亢進（Enhanced tempera tolerance）」とは、単離細菌株が増殖できる温度範囲、例えば単離ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）菌株が増殖できる最大〜最少温度を意味する。一つの側面によれば、「耐温性の亢進」は、下記に論じられる「温度プロフィールプロトコル」（材料及び方法）に従って決定され。

本発明のさらなる別の側面によれば、単離細菌株は、天然においてはグリホサートに対して耐性である。一つの側面によれば、「耐温性の亢進」は、下記に論じられる「グリホサート耐性プロフィールプロトコル」（材料及び方法）に従って決定された。

別の側面によれば、本発明の単離細菌株は、16S rDNA配列同一性に基づいて上記菌株のいずれかに密接に関連している菌株を包含する。細菌における関連性を決定するためへの16S rDNA配列同一性の使用に関する、Stackebrandt E, et al., “Report of the ad hoc committee for the re-evaluation of the species definition in bacteriology,” Int J Syst Evol Microbiol. 52(3):1043-7 (2002)を参照。一つの実施形態によれば、少なくとも１つの菌株は、16S rDNA配列同一性に基づいて、上記菌株のいずれかに対して少なくとも９５％同一であり、16S rDNA配列同一性に基づいて、上記菌株のいずれかに対して少なくとも９６％同一であり、16S rDNA配列同一性に基づいて、上記菌株のいずれかに対して少なくとも９７％同一であり、16S rDNA配列同一性に基づいて、上記菌株のいずれかに対して少なくとも９８％同一であり、16S rDNA配列同一性に基づいて、上記菌株のいずれかに対して少なくとも９８．５％同一であり、16S rDNA配列同一性に基づいて、上記菌株のいずれかに対して少なくとも９９％同一であり、又は16S rDNA配列同一性に基づいて、上記菌株のいずれかに対して少なくとも９９．５％同一である。

別の実施形態によれば、本発明は、マメ科植物の根粒の占有の競合性の亢進及びマメ科植物成長の促進効果の亢進を有する細菌株の単離法を包含する。本明細書において使用される場合、用語、「単離する（isolate）」、「単離する（isolates）」、「単離する（isolating）」及び／又は「単離された（isolated）」、等とは、参照材料が、それが通常見出される環境から除かれることを意味する。前記方法は、特に、
ａ．土壌サンプルから細菌株を得ること；
ｂ．前記再菌株及び市販菌株を、マメ科植物に供給すること；
ｃ．マメ科植物の根粒を占有するために市販菌株よりもより競合性である細菌株を選択すること；
ｄ．マメ科植物の根粒を占有するために市販菌株よりもより競合性である選択された菌株を、マメ科植物成長の促進効果の亢進のそれらの菌株について分析すること：及び
e．マメ科植物成長の促進効果の亢進を有する細菌株を単離することを包含する。

一つの側面によれば、単離細菌株は、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属からの菌株である。さらに別の側面によれば、前記方法はさらに、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）の市販菌株、例えば市販菌株USDA 532Cに固有の特異的プライマーに対するブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）菌株のスクリーニング段階を包含する。

さらに、別の側面によれば、前記方法は、
受託番号NRRL B-50592の菌株（また、NRRL B-59571としても寄託された）；
受託番号NRRL B-50593の菌株；（また、NRRL B-59572としても寄託された）
受託番号NRRL B-50586の菌株；（また、NRRL B-59565としても寄託された）
受託番号NRRL B-50588の菌株；（また、NRRL B-59567としても寄託された）
受託番号NRRL B-50587の菌株；（また、NRRL B-59566としても寄託された）
受託番号NRRL B-50589の菌株；（また、NRRL B-59568としても寄託された）
受託番号NRRL B-50591の菌株；（また、NRRL B-59570としても寄託された）
受託番号NRRL B-50590の菌株；（また、NRRL B-59569としても寄託された）
受託番号NRRL B-50594の菌株；（また、NRRL B-50493としても寄託された）
受託番号NRRL B-50726の菌株；
受託番号NRRL B-50727の菌株；
受託番号NRRL B-50728の菌株；
受託番号NRRL B-50729の菌株；及び
受託番号NRRL B-50730の菌株、又は上記寄託された菌株のうち少なくとも２以上（２も含む）、例えば上記菌株のうち少なくとも３、上記菌株のうち少なくとも４、上記菌株のうち少なくとも５、上記菌株のうち少なくとも６、上記菌株のうち少なくとも７、上記菌株のうち少なくとも８、上記菌株のうち少なくとも９、上記菌株のうち少なくとも１０、上記菌株のうち少なくとも１１、上記菌株のうち少なくとも１２、上記菌株のうち少なくとも１３、上記菌株のうちすべて以下（すべても含む）の組合せから成る群から選択されるブラディリゾビウム・ジャポニウム（Bradyrhizobia japonicum）の培養物を単離することを包含する。

さらに別の側面によれば、前記方法は、耐温性の亢進を有する細菌株の単離を包含する。材料及び方法：「温度プロフィールプロトコル」を参照。

さらにまた、前記方法は、グリホサートへの自然な耐性を有する細菌株の単離を包含する。材料及び方法：「グリホサート耐性プロフィールプロトコル」を参照。

別の好ましい側面によれば、前記方法は、マメ科植物の根粒形成を亢進できるリゾビウム（Rhizobium）及びブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）から成る属から選択される細菌株の単離を包含する。

組成物
本発明は、本発明の単離細菌株又は上記寄託された菌株のうち少なくとも２つ以上、例えば上記菌株のうち少なくとも３、上記菌株のうち少なくとも４、上記菌株のうち少なくとも５、上記菌株のうち少なくとも６、上記菌株のうち少なくとも７、上記菌株のうち少なくとも８、上記菌株のうち少なくとも９、上記菌株のうち少なくとも１０、上記菌株のうち少なくとも１１、上記菌株のうち少なくとも１２、上記菌株のうち少なくとも１３、上記菌株のうちすべてまで（すべても包含する）の組合せの少なくとも１つと、農薬学的に適切な担体とを含む組成物を包含する。

ある実施形態によれば、組成物は接種組成物（inoculant composition）であり得る。本明細書及び当業界において使用される場合、用語、「接種組成物（inoculant composition）」とは一般的に、種子の外表面上に又は種子溝に、適合できる細菌株を導入する組成物又は材料を意味する。

組成物は１又は２以上の農薬学的に許容できる担体を含むことができる。複数の農薬学的に許容できる担体が使用される場合、農薬学的に許容できる担体は同じであっても又は異なっていても良い。「担体（carrier）」に関して、本明細書において使用される場合、用語、「農薬学的に許容できる（agronomically acceptable）」とは、種子、土壌又は植物に活性成分を供給するために使用され得るいずれかの材料、及び植物成長、土壌構造、土壌排水又は同様のものに対して悪影響を与えないで添加され得る（種子、土壌又は植物に）担体を意味する。適切な担体は、小麦もみ殻、ふすま、地上麦わら、泥炭ベースの粉末又は顆粒、石膏ベースの顆粒及びクレー（例えば、カオリン、ベントナイト、モンモリロナイト）を含むが、但しそれらだけには制限されない。液体、泥炭又は水和剤のような製剤が種子のコーティングのために適切であろう。種子をコーティングするために使用される場合、材料は水と共に混合され、種子に施用され、そして乾燥される。さらなる他の担体の例としては、接着剤、例えばアラビアガムによりコーティングされる前、乾燥され、篩い分けされ、そして種子に施用される湿ったふすまを挙げることができる。活性成分の配合を必要とする実施形態によれば、農薬学的に許容できる担体は水性であり得る。液体担体が使用される場合、液体（例えば、水）担体は典型的には、細菌株を培養するための増殖培地を含むであろう。細菌株のための適切な増殖培地の非制限例としては、マンニトール酵母抽出物、グリセロール酵母抽出物、又は細菌株と適合でき、そして／又は細菌株に成長栄養物を供給する、周知のいずれかの培地を挙げることができる。

１又は２以上のシグナル分子を含む組成物もまた、本発明の組成物により包含される。植物シグナル分子の非制限的例としては、nod因子（すなわち、脂肪キトオリゴ糖）、キトオリゴ糖、キチン性化合物、フラボノイド、ジャスモン酸又はその誘導体類、リノール酸又はその誘導体類、リノレン酸又はその誘導体類、カリキン、又はそれらの組合せを挙げることができる。

共生Nodシグナル又はNod因子としても当業界において知られている脂肪キトオリゴ糖化合物（LCO）は、非還元末端で縮合されるN−結合脂肪アシル鎖を有する、β−１，４−結合N−アセチル−D−グルコサミン（GIｃNAｃ）残基のオリゴ糖主鎖から成る。LCOは、主鎖におけるGIｃNAｃ残基の数、脂肪アシル鎖の長さ及び飽和度、及び還元及び非還元糖残基の置換において異なる。LCOの例としては、下記式Iにより提供される：

式中、Gは、窒素原子上のアセチル基、スルフェート基、アセチル基、及び／又は酸素上のエーテル基により置換され得るヘキソサミンであり、

R₁、R₂、R₃、R₅、R₆及びR₇は、同一であっても又は異なっていても良く、H、CH₃CO-、CxHyCO-（ここでｘは０〜１７の整数であり、そしてｙは１〜３５の整数である）、又はいずれか他のアシル基、例えばカルバミルを表し、

R₄は、少なくとも１２個の炭素原子を含む、モノ−、ジ−又はトリ不飽和脂肪族鎖を表し、そしてｎは１〜４の整数である。LCOは、細菌、例えばリゾビア（Rhizobia）、例えばリゾビウム属（Rhizobium spp.）、ブラディリゾビウム属（Bradyrhizobium spp.）、シノリゾビウム属（Sinorhizobium spp.）及びアゾリゾビウム属（Azorhizobium spp.）から得られる（単離され得、そして／又は精製され得る）。LCO構造は、個々のそのような細菌種に特徴的であり、そして個々の菌株は異なった構造を有する複数のLCOを生成できる。例えば、S.メリロティ（S. meliloty）からの特定のLCOがまた、下記式IIを有するものとして、米国特許第5,549,718号に記載されている：

式中、Rは、H又はCH₃CO−を表し、そしてｎは２又は３に等しい。

さらに具体的なLCOとして、NodRM、NodRM-1、NodRM-3を挙げることができる。アセチル化される場合（R=CH₃CO-）、それらはそれぞれ、AcNodRM-1及びAcNodRM-3になる（米国特許第5,545,718号）。

ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobium japonicum）からのLCOは、米国特許第5,175,149号及び米国特許第5,321,011号に記載されている。広く言えば、それらはメチルフコースを含む五糖植物ホルモンである。次の多くのそれらのB.ジャポニクム（B. Japonicum）由来のLCOは記載されている：BjNod-V (C_18:1); BjNod-V (A_C, C_18:1), BjNod-V (C_16:1); and BjNod-V (A_C, C_16:0)、ここで「V」は５個のN−アセチルグルコサミンの存在を示し；「Ac」はアセチル化を示し；「C」に続く数字は脂肪酸側鎖における炭素の数を示し；そして「：」に続く数字は二重結合の数を示す。

本発明の組成物に使用されるLCOは、LCOを生成する細菌株、例えばアゾリゾビウム（Azorhizobium）、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）（B. ジャポニクム（B. japonicum）を包含する）、メゾリゾビウム（Mesorhizobium）、リゾビウム（Rhizobium）（R.レグミノサルム（）R. leguminosarumを包含する）、シノリゾビウム（Sinorhizobium）（S.メリロチ（S. meliloti）を包含する）の菌株、及びLCOを生成するよう遺伝子操作された細菌株から得られる（すなわち、単離され、そして／又は精製され得る）。

菌根菌（mycorrhizal fungus）、例えばグロムス門の真菌、例えばグロムス・イントララジカス（Glomus intraradicus）から得られた（すなわち、単離され、そして／又は精製された）LCOを用いての組成物もまた、本発明により包含される。それらの真菌から得られる代表的LCOの構造は、国際公開第2010／049751号及び国際公開第2010／049751号（そこに記載されるLCOは、「Myc因子」としても言及されている）に記載される。

さらに、合成LCO化合物、例えば国際公開第2005／063784号に記載されるそれらの化合物、及び遺伝子工学を介して生成される組換えLCOの使用が本発明の組成物により包含される。天然に存在する塩基性LCO構造体は、天然に存在するLCO、例えばSpaink, Crit. Rev. Plant Sci. 54:257-288 (2000)及びD'Haeze, et al., Glycobiology 12:79R-105R (2002)に記載されるそれらに見出される修飾又は置換を含むことができる。LCOの構成のための前駆体オリゴ糖分子（下記に記載されるようなCOはまた、本発明における植物シグナル分子としても有用である）はまた、例えばSamain, et al., Carb. Res. 302:35-42 (1997); Samain, et al., J. Biotechnol. 72:33-47 (1999)におけるように、遺伝子操作された生物により合成され得る。

LCOは、種々の純度形で使用され得、そして単独で、又はLCO生成細菌又は真菌の培養物の形で使用され得る。実質的に純粋なLCOを提供する方法は、LCO及び微生物の混合物から微生物細胞を単純に除くか、又は米国特許第5,549,718号に記載されるように、LCO溶媒相分離、続くHPLCクロマトグラフィーを通してLCO分子を単離し、そして精製し続けることを包含する。精製は反復HPLCにより増強され得、そして精製されたLCO分子は長期貯蔵のために凍結乾燥され得る。

キトオリゴ糖（CO）は、キチンオリゴマーとして同定されるβ−１−４結合N−アセチルグルコサミン構造体として、またN−アセチルキトオリゴ糖として周知である。COは、固有の及び異なった側鎖装飾を有し、これが、キチン分子［(C₈-H₁₃NO₅)n、CAS No. 1398-61-4］及びキトカン分子［(C₅H₁₁NO₄)n、CAS No. 9012-76-4］とは異なったものにしている。COの構造及び生成を記載する代表的文献は次の通りである：Van der Holst, et al., Current Opinion in Structural Biology, 11:608-616 (2001); Robina, et al., Tetrahedron 58:521-530 (2002); Hanel, et al., Planta 232:787-806 (2010); Rouge, et al. Chapter 27, "The Molecular Immunology of Complex Carbohydrates" in Advances in Experimental Medicine and Biology, Springer Science; Wan, et al., Plant Cell 21:1053-69 (2009); PCT/F100/00803 (9/21/2000); 及びDemont-Caulet, et al., Plant Physiol. 120(1):83-92 (1999)。COは、合成であっても又は組換えであっても良い。組換えCOの調製方法は周知である。例えば、Samain, et al. (supra.); Cottaz, et al., Meth. Eng. 7(4):311-7 (2005) 及び Samain, et al., J. Biotechnol. 72:33-47 (1999)を参照。

本発明の組成物はまた、キチン性化合物（CO以外）、フラボノイド、ジャスモン酸、リノール酸及びリノレン酸並びにそれらの誘導体類、及びカリキンも含むことができる。

真菌の細胞壁及び昆虫及び甲殻類の外骨格の主要成分であるキチン及びキトサンはまた、GIｃNAｃ残基から構成される。キチン性化合物は、キチン（IUPAC: N−[5−[[3−アセチルアミノ−4,5−ジヒドロキシ−6−(ヒドロキシメチル)オキサン−2イル]メトキシメチル]−2−[[5−アセチルアミノ−4,6-ジヒドロキシ−2−(ヒドロキシメチル)オキサン−3−イル] メトキシメチル]−4−ヒドロキシ−6−(ヒドロキシメチル)オキサン−3−イル]エタンアミド）及びキトサン（IUPAC: 5−アミノ−6−[5−アミノ−6−[5−アミノ−4,6−ジヒドロキシ−2(ヒドロキシメチル) オキサン−3−イル]オキシ−4−ヒドロキシ−2−(ヒドロキシメチル) オキサン−3−イル]オキシ−2(ヒドロキシメチル) オキサン−3,4−ジオール）を包含する。それらの化合物は、Sigma-Aldrichから市販されており、又は昆中、甲殻類の殻、又は真菌細胞壁から調製され得る。キチン及びキトサンの調製方法は、周知であり、そして例えば米国特許第4,536,207号（甲殻類の殻からの調製）、Pochanavanich, et al., Lett. Appl. Microbiol. 35:17-21 (2002)（真菌細胞壁からの調製）、及び米国特許第5,965,545号（市販のキトサンの加水分解からの調製）に記載されている。３５％未満〜９０％以上の脱アセチル化の範囲であり、そして広範囲の分子量、例えば15ｋD未満の低分子量キトサンオリゴマー及び0.5〜2KDのキチンオリゴマー；約15KDの分子量を有する「実用的グレード」のキトサン；及び70KDまでの高分子量キトサンに及ぶ、脱アセチル化されたキチン及びキトサンが得られる。種子処理のために配合されるキチン及びキトサンもまた、市販されている。市販の製品としては、例えばELEXA（登録商標） (Plant Defense Boosters, Inc.) 及び BEYOND（登録商標） (Agrihouse, Inc.)を挙げることができる。

フラボノイドは、３個の炭素橋により連結される２つの芳香族環の一般構造を有するフェノール化合物である。フラボノイドは、植物により製造され、そして例えば、有益なシグナル分子として、及び昆虫、動物、真菌及び細胞に対する保護として、多くの機能を有する。フラボノイドの種類としては、カルゴン、アントシアニジン、クマリン、フラボン、フラバノール、フラボノール、フラバノン及びイソフラボンを挙げることができる。Jain, et al., J. Plant Biochem. & Biotechnol. 11:1-10 (2002); Shaw, et al., Environmental Microbiol. 11:1867-80 (2006)を参照。

本発明の組成物に有用である代表的フラボノイドとしては、ゲニステイン（genistein）、ダイゼイン（daidzein）、ホルモノネチン（formononetin）、ナリンゲニン（naringenin）、ヘスペレチン（hesperetin）、ルテオリン（luteolin）及びアピゲニン（apigenin）を挙げることができる。フラボノイド化合物は、例えばNatland International Corp., Research Triangle Park, NC; MP Biomedicals, Irvine, CA; LC Laboratories, Woburn MAから市販されている。フラボノイド化合物は、米国特許第5,702,752号；米国特許第5,990,291号及び米国特許第6,146,668号に記載されるように、植物又は種子から単離され得る。フラボノイド化合物はまた、Ralston, et al., Plant Physiology 137:1375-88 (2005)に記載されるように、遺伝子操作された生物、例えば酵母により生成され得る。

ジャスモン酸（JA、[1R−[1α,2β(Z)]] −3−オキソ−2−(ペンテニル)シクロペンタン酢酸）及びその誘導体、リノール酸（（Z, A）9, 12−オクタデカジエン酸）及びその誘導体、及びリノレン酸（（Z, Z, Z）−9, 12, 15−オクタデカトリエン酸）及びその誘導体もまた、本発明の組成物に使用され得る。ジャスモン酸及びそのメチルエステル、すなわち総称的にはジャスモネート（MeJA）は、天然において植物に存在するオクタデカノンノイド基材の化合物である。ジャスモン酸は、小麦苗の根により、及び真菌微生物、例えばボトリオジプロジア・テオブロマエ（Botryodiplodia theobromae）及びギブレラ・フジクロイ（Gibbrella fujikuroi）、酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae））及び大腸菌（E.コリ（Escherichia col:））の病原性及び非病原性菌株により製造される。リノール酸及びリノレン酸は、ジャスモン酸の生合成中に生成される。ジャスモネート、リノール酸及びリノレン酸（及びそれらの誘導体）は、根圏細胞（rhizobacteria）によるnod遺伝子発現又はLCO生成のインデューサーであることが報告されている。例えば、Mabood, Fazli, Jasmonates induce the expression of nod genes in Bradyrhizobium japonicum, May 17, 2001; 及び Mabood, Fazli, "Linoleic and リノレン酸 induce the expression of nod genes in Bradyrhizobium japonicum," USDA 3, May 17, 2001を参照。

本発明の組成物に有用であり得る、リノール酸、リノレン酸及びジャスモン酸の有用な誘導体としては、エステル、アミド、グリコシド及び塩を挙げることができる。代表的エステルは、リノール酸、リノレン酸又はジャスモン酸のカルボキシル基が、−COR基（Rは−OR¹基であり、R¹は、アルキル基、例えばC₁-C₈枝なし又は枝分れのアルキル基、例えばメチル、エチル又はプロピル基である）、アルケニル基、例えばC₂-C₈枝なし又は枝分れのアルケニル基；アルキニル基、例えばC₂-C₈枝なし又は枝分れのアルキニル基；例えば６〜１０個の炭素原子を有するアリール基；又は例えば、４〜９個の炭素原子を有するヘテロアリール基（ヘテロアリール基中のヘテロ原子は例えば、N, O, P又はSであり得る）により置換されている化合物である。代表的なアミドは、リノール酸又はジャスモン酸のカルボキシル基が、−COR基（Rは、NR²R³基であり、R²及びR³は独立して、水素、アルキル基、例えばC₁-C₈枝なし又は枝分れアルキル基、例えばメチル、エチル又はプロピル基である）；アルケニル基、例えばC₂-C₈枝なし又は枝分れのアルケニル基；アルキニル基、例えばC₂-C₈枝なし又は枝分れのアルキニル基；例えば６〜１０個の炭素原子を有するアリール基；又は例えば、４〜９個の炭素原子を有するヘテロアリール基（ヘテロアリール基中のヘテロ原子は例えば、N, O, P又はSであり得る）により置換されている化合物である。エステルは、既知方法、例えば酸触媒された求核付加により調製され得、ここでカルボン酸が触媒量の無機酸の存在下でアルコールと反応される。アミドはまた、既知方法、例えば中性条件下で、カップリング剤、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）の存在下でカルボン酸と適切なアミンとを反応せしめることにより調製され得る。リノール酸、リノレン酸及びジャスモン酸の適切な塩としては、例えば塩基付加塩を挙げることができる。それらの化合物の代謝的に許容できる塩基塩を調製するために試薬として使用され得る塩基として、カチオン、例えばアルカリ金属カチオン（例えば、カリウム及びナトリウム）及びアルカリ土類金属カチオン（例えば、カルシウム及びマグネシウム）由来のそれらの塩基を挙げることができる。それらの塩は、リノール酸、リノレン酸又はジャスモン酸の溶液と塩基の溶液とを一緒に混合することにより容易に調製され得る。塩は、溶液から沈殿され、そして濾過により集められるか、又は他の手段、例えば溶媒の蒸発により回収され得る。

カリキンは、ビニル性４H−ピロン、例えば２H−フロ「２，３−C」ピラン−２−オン（その誘導体及び類似体も含む）である。それらの化合物の例は、下記構造により表される化合物、又は生物学的に許容できるその塩である：

式中、ZはO、S又はNR₅であり；R₁、R₂、R₃及びR₄はお互い独立して、H、アルキル、アルケニル、アルキニル、フェニル、ベンジル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、フェニルオキシ、ベンジルオキシ、CN、COR₆、COOR=、ハロゲン、NR₆R₇又はNO₂であり；そしてR₅、R₆及びR₇はお互い独立して、H、アルキル又はアルケニルである。それらの化合物の生物学的に許容できる塩の例としては、生物学的に許容できる酸により形成される酸付加塩を挙げることができ、それらの塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩又は重硫酸塩、リン酸塩又はリン酸水素塩、酢酸塩、安息香酸塩、琥珀酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、グルコン酸塩；メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩及びｐ−トルエンスルホン酸塩を列挙できる。追加の生物学的に許容できる金属塩は、塩基により形成されるアルカリ金属塩を包含し、その例としては、ナトリウム及びカリウム塩を挙げることができる。構造により包含され、そして本発明への使用のために適切である化合物の例は、次のものを包含する：3−メチル−2H−フロ[2,3−c]ピラン−2−オン (ここで、R₁=CH₃、R₂、R₃、R₄=H)、2H−フロ[2,3−c]ピラン−2−オン (ここで、R₁、R₂、R₃、R₄=H)、7−メチル−2H−フロ[2,3−c]ピラン−2−オン (ここで、R₁、R₂、R₄=H、R₃=CH₃)、5−メチル−2H−フロ[2,3−c]ピラン−2−オン (ここで、R₁、R₂、R₃=H、R₄=CH₃)、3,7−ジメチル−2H−フロ[2,3−c]ピラン−2−オン (ここで、R₁、R₃=CH₃、R₂、R₄=H)、3,5−ジメチル−2H−フロ[2,3−c]ピラン−2−オン (ここで、R₁、R₄=CH₃、R₂、R₃=H)、3,5,7−トリメチル−2H−フロ[2,3−c]ピラン−2−オン (ここで、R₁、R₃、R₄=CH₃、R₂=H)、5−メトキシメチル−3−メチル−2H−フロ[2,3−c]ピラン−2−オン (ここで、R₁=CH₃、R₂、R₃=H、R₄=CH₂OCH₃)、4−ブロモ−3,7−ジメチル−2H−フロ[2,3−c]ピラン−2−オン (ここで、R₁、R₃=CH₃、R₂=Br、R₄=H)、3−メチルフロ[2,3−c]ピリジン−2(3H)−オン (ここで、Z=NH、R₁=CH₃、R₂、R₃、R₄=H)、3,6−ジメチルフロ[2,3−c]ピリジン−2(6H)−オン (ここで、Z=N−−CH₃, R₁=CH₃, R₂, R₃, R₄=H)。米国特許第7,576,213号を参照。それらの分子はまた、カリキンとしても知られている。Halford、前記を参照。

本発明の組成物はさらに、農業的に／農薬学的に有益な剤も含むことができる。本発明の実施において有用であり得るそのような剤の非制限例としては、除草剤、殺菌剤及び殺虫剤を挙げることができる。

適切な除草剤としては次のものを挙げることができる：ベンタゾン（bentazon）、アシフルオルフェン（acifluorfen）、クロリムロン（chlorimuron）、ラクトフェン（lactofen）、クロマゾン（clomazone）、フルアジホップ（fluazifop）、グルホシネート（glufosinate）、グリホサート（glyphosate）、セトキシジム（sethoxydim）、イマゼタピル（imazethapyr）、イマザモックス（imazamox）、フォメサフェ（fomesafe）、フルシクロラック（flumiclorac）、イマザキン（imazaquin）及びクレトジム（clethodim）。それらの個々の化合物を含む市販の製品は容易に入手できる。組成物中の除草剤濃度は一般的に、特定の除草剤についてのラベルの付いた使用率に対応するであろう。

「殺菌剤（fungicide）」は、本明細書及び当業界において使用される場合、真菌を殺すか、又は真菌増殖を阻害する剤である。本明細書において使用される場合、殺菌剤による処理が、未処理集団に比較して、真菌集団（例えば、土壌中の）の殺害又はその増殖阻害をもたらす場合、殺菌剤は特定真菌種「に対する活性を示す」。本発明に従っての効果的殺菌剤は、広範囲の病原体、例えばフラセリーモミ疫病（Phytophthore）、リゾクトニア（Rhizoctonia）、フザリウム（Fusarium）、ピシウム（Pythium）、属菌（Phomopsis）又はセレロチニア（Selerotinia）及びファコプソラ（Phakopsora）、及びそれらの組合せ（但し、それらだけには限定されない）に対する活性を適切に示すであろう。

市販の殺菌剤は、本発明への使用のために適切である。適切な市販の殺菌剤は、次のものを挙げることができる：PROTEGE、RIVAL 又はALLEGIANCE FL又はLS (Gustafson, Plano, TX)、WARDEN RTA (Agrilance, St. Paul, MN)、APRON XL、APRON MAXX RTA 又は RFC、MAXIM 4FS 又は XL (Syngenta, Wilmington, DE)、CAPTAN (Arvesta, Guelph, Ontario) 及び PROTREAT (Nitragin Argentina, Buenos Ares, Argentina)。それらの及び他の殺菌剤中の活性成分は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：フルジオキソニル（fludioxonil）、メフェノキサム（mefenoxam）、アゾキシストロビン（azoxystrobin）及びメタラキシル（metalaxyl）。市販の殺菌剤は、製造元の説明書に従って、その推薦される濃度で、最も適切には使用される。

本明細書において使用される場合、殺虫剤による処理が、未処理集団に比較して、昆虫集団の殺害又はその増殖阻害をもたらす場合、殺虫剤は特定昆虫種「に対する活性を示す」。本発明に従っての効果的殺虫剤は、広範囲の昆虫、例えばハリガネムシ（wireworms）、ヨトウムシ（cutworms）、地虫（grubs）、トウモロコシルートワーム（corn rootworm）、種子トウモロコシウジ（seed corn maggots）、ノミ甲虫類（flea beetles）、トコジラミ虫（chinch bugs）、アブラムシ（aphids）、葉甲虫類（leaf beetles）及びカメムシ（stink bugs）（但し、それらだけには制限されない）に対する活性を適切に示すであろう。

市販の殺虫剤は、本発明への使用のために適切である。適切な市販の殺虫剤としては、CRUISER (Syngenta, Wilmington, DE)、GAUCHO及び PONCHO (Gustafson, Plano, TX)を挙げることができる。それらの及び他の市販の殺虫剤中の活性成分としては、チアメトキサム（thiamethoxam）、クロチアニジン（clothianidin）及びイミダクロプリド（imidacloprid）を挙げることができる。市販の殺虫剤は、製造元の説明書に従って、推薦される濃度で、最も適切には使用される。

本発明の組成物はまた、１又は２以上のリン酸溶解剤の使用も意図される。本明細書において使用される場合、リン酸溶解剤としては、リン酸溶解微生物を挙げることができるが、但しそれだけには限定されない。本明細書において使用される場合、「リン酸溶解微生物（phosphate solubilizing microorganism）」とは、植物のために利用できるリンの量を高めることができる微生物である。リン酸溶解微生物としては、真菌及び細菌株を挙げることができる。ある実施形態によれば、リン酸溶解微生物は、胞子形成微生物である。

リン酸溶解微生物の非制限的例としては、次のものを列挙することができる：アシネトバクター（Acinetobacter）、アルスロバクター（Arthrobacter）、アルスロボトリス（Arthrobotrys）、アスペルギラス（Aspergillus）、アゾスピリルム（Azospirillum）、バチルス（Bacillus）、バークホルデリア（Burkholderia）、カンジダ（Candida）、クリセオモナス（Chryseomonas）、エンテロバクター（Enterobacter）、ユーペニシリウム（Eupenicillium）、エキシグオバクテリウム（Exiguobacterium）、クレブシエラ（Klebsiella）、クルイベラ（Kluyvera）、ミクロバクテリウム（Microbacterium）、ムコル（Mucor）、パエシロミセス（Paecilomyces）、パエニバシラス（Paenibacillus）、ペニシリウム（Penicillium）、シュードモナス（Pseudomonas）、セラチア（Serratia）、ステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）、ストレプトミセス（Streptomyces）、ストレプトスポランギウム（Streptosporangium）、スワミナタニア（Swaminathania）、チオバチルス（Thiobacillus）、トルロスポラ（Torulospora）、ビブリオ（Vibrio）、キサントバクター（Xanthobacter）及びキサントモナス（Xanthomonas）から成る群から選択された属からの種。

リン酸溶解微生物の非制限的例は、次のものから成る群から選択される：アシネネトバクター・カルコアセチカス（Acinetobacter calcoaceticus）、アシネートバクター属（Acinetobacter spp.）、アルスロバクター属（Arthrobacter spp.）、アルスロボトリス・オロゴスポラ（Arthrobotrys oligospora）、アスペルギラス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギラス属（Aspergillus spp.）、アゾスピリルム・ハロプラエフェランス（Azospirillum halopraeferans）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・アトロフェウス（Bacillus atrophaeus）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）、バークホルデリア、ビエトナミエンシス（Burkholderia vietnamiensis）、カンジタ・クリシ（Candida krissi）、クリセオモナス・ルテオラ（Chryseomonas luteola）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター・アスブリアエ（Enterobacter asburiae）、エンテロバクター属（Enterobacter spp.）、エンテロバクター・タイロラエ（Enterobacter taylorae）、ユーペニシリウム・ペルビウム（Eupenicillium parvum）、エキシグオバクテリウム属（Exiguobacterium spp.）、クリブシエラ属（Klebsiella spp.）、クルイベラ・クリオクレスセンス（Kluyvera cryocrescens）、ミクロバクテリウム属（Microbacterium spp.）、ムコル・ラモシシムス（Mucor ramosissimus）、パエシロミセス・ヘピラリド（Paecilomyces hepialid）、パエシロミセス・マルクアンジ（Paecilomyces marquandii）、パエニバチルス・マセランス（Paenibacillus macerans）、パエニバチルス・ムシラギノサス（Paenibacillus mucilaginosus）、パントエア・アグロメランス（Pantoea aglomerans）、ペニシリウム・エクスパンスム（Penicillium expansum）、シュードモナス・コルゲート（Pseudomonas corrugate）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescen）、シュードモナス・ルテア（Pseudomonas lutea）、シュードモナス・ポアエ（Pseudomonas poae）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・スツツゼリ（Pseudomonas stutzeri）、シュードモナス・トリビアリス（Pseudomonas trivialis）、セラチア・マルセスセンス（Serratia marcescens）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）、ストレプトミセス属（Streptomyces spp.）、ストレプトスポランギウム属（Streptosporangium spp.）、スワミナタニア・サリトレランス（Swaminathania salitolerans）、チオバチルス・フェロオキシダンス（Thiobacillus ferrooxidans）、トルロスポラ・グロボサ（Torulospora globosa）、ビブリオ・プロテオリチカス（Vibrio proteolyticus）、キサントバクター・アギリス（Xanthobacter agilis）及びキサントモナス・カムペストリス（Xanthomonas campestris）。

一つの実施形態によれば、リン酸溶解微生物は、真菌ペニシリウムの菌株である。本発明の実施において有用である真菌ペニシリウムの菌株としては、次のものを列挙することができる：P．ビライアエ（P. bilaiae）（以前は P.ビライ（P. bilaii）として知られていた)、P.アルビダム（P. albidum）、P.アウランチオグリセウム（P. aurantiogriseum）、P.クリソゲナム（P. chrysogenum）、P.シトレオニグラム（P. citreonigrum）、P.シトリナム（P. citrinum）、P.ディジタタム（P. digitatum）、P.フリクエンタス（P. frequentas）、P.フスカム（P. fuscum）、P.ガエストリボラス（P. gaestrivorus）、P.グラブラム（P. glabrum）、P.グリセオフルバム（P. griseofulvum）、P.インプリカタム（P. implicatum）、P.ジャンチネラム（P. janthinellum）、P.リラシナム（P. lilacinum）、P.ミニオラテウム（P. minioluteum）、P.モンタネンス（P. montanense）、P.ニグリカンズ（P. nigricans）、P.オキサリカム（P. oxalicum）、P.ピネトラム（P. pinetorum）、P.ピネフィラム（P. pinophilum）、P.プルプロゲナム（P. purpurogenum）、P.ラディカンス(P. radicans)、P. ラディカム（P. radicum）、P.ライストリキイ（P. raistrickii）、P.ルグロサム（P. rugulosum）、P.シンプリシシウム（P. simplicissimum）、P.ソリタム（P. solitum）、P.バリアビレ（P. variabile）、P.ベルチナム（P. velutinum）、P.ビリディカタム（P. viridicatum）、P.グラウカム（P. glaucum）、P.フシポラス（P. fussiporus）及びP.エクスパンサム（P. expansum）。

別の実施形態によれば、リン酸溶解微生物ペニシリウム種は、P．ビライアエ（P.bilaiae）、P. ガエストリボラス（P. gaestrivorus）及び／又はそれらの組合せである。さらに別の実施形態によれば、P.ビライアエ（P. bilaiae）菌株は、ATCC 20851, NRRL 50169、ATCC 22348、ATCC 18309、NRRL 50162から成る群から選択され（Wakelin, et al., 2004. Biol Fertil Soils 40:36-43）、そしてP. ガエストリボラス（P. gaestrivorus）菌株はNRRL 50170である（Wakelin, 上記を参照）。

本発明の組成物によれば、１以上のリン酸溶解微生物、例えば少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６（いずれの組合せでも含む）のアシネトバクター（Acinetobacter）、アルスロバクター（Arthrobacter）、アルスロボトリス（Arthrobotrys）、アスペルギラス（Aspergillus）、アゾスピリルム（Azospirillum）、バチルス（Bacillus）、バークホルデリア（Burkholderia）、カンジダ（Candida）、クリセオモナス（Chryseomonas）、エンテロバクター（Enterobacter）、ユーペニシリウム（Eupenicillium）、エキシグオバクテリウム（Exiguobacterium）、クレブシエラ（Klebsiella）、クルイベラ（Kluyvera）、ミクロバクテリウム（Microbacterium）、ムコル（Mucor）、パエシロミセス（Paecilomyces）、パエニバシラス（Paenibacillus）、ペニシリウム（Penicillium）、シュードモナス（Pseudomonas）、セラチア（Serratia）、ステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）、ストレプトミセス（Streptomyces）、ストレプトスポランギウム（Streptosporangium）、スワミナタニア（Swaminathania）、チオバチルス（Thiobacillus）、トルロスポラ（Torulospora）、ビブリオ（Vibrio）、キサントバクター（Xanthobacter）及びキサントモナス（Xanthomonas）が使用され得、この場合、アシネネトバクター・カルコアセチカス（Acinetobacter calcoaceticus）、アシネートバクター属（Acinetobacter spp.）、アルスロバクター属（Arthrobacter spp.）、アルスロボトリス・オロゴスポラ（Arthrobotrys oligospora）、アスペルギラス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギラス属（Aspergillus spp.）、アゾスピリルム・ハロプラエフェランス（Azospirillum halopraeferans）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・アトロフェウス（Bacillus atrophaeus）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）、バークホルデリア、ビエトナミエンシス（Burkholderia vietnamiensis）、カンジタ・クリシ（Candida krissi）、クリセオモナス・ルテオラ（Chryseomonas luteola）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター・アスブリアエ（Enterobacter asburiae）、エンテロバクター属（Enterobacter spp.）、エンテロバクター・タイロラエ（Enterobacter taylorae）、ユーペニシリウム・ペルビウム（Eupenicillium parvum）、エキシグオバクテリウム属（Exiguobacterium spp.）、クリブシエラ属（Klebsiella spp.）、クルイベラ・クリオクレスセンス（Kluyvera cryocrescens）、ミクロバクテリウム属（Microbacterium spp.）、ムコル・ラモシシムス（Mucor ramosissimus）、パエシロミセス・ヘピラリド（Paecilomyces hepialid）、パエシロミセス・マルクアンジ（Paecilomyces marquandii）、パエニバチルス・マセランス（Paenibacillus macerans）、パエニバチルス・ムシラギノサス（Paenibacillus mucilaginosus）、パントエア・アグロメランス（Pantoea aglomerans）、ペニシリウム・エクスパンスム（Penicillium expansum）、シュードモナス・コルゲート（Pseudomonas corrugate）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescen）、シュードモナス・ルテア（Pseudomonas lutea）、シュードモナス・ポアエ（Pseudomonas poae）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・スツツゼリ（Pseudomonas stutzeri）、シュードモナス・トリビアリス（Pseudomonas trivialis）、セラチア・マルセスセンス（Serratia marcescens）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）、ストレプトミセス属（Streptomyces spp.）、ストレプトスポランギウム属（Streptosporangium spp.）、スワミナタニア・サリトレランス（Swaminathania salitolerans）、チオバチルス・フェロオキシダンス（Thiobacillus ferrooxidans）、トルロスポラ・グロボサ（Torulospora globosa）、ビブリオ・プロテオリチカス（Vibrio proteolyticus）、キサントバクター・アギリス（Xanthobacter agilis）及びキサントモナス・カムペストリス（Xanthomonas campestris）から成る群から選択された１つの種も使用され得る。

別の実施形態によれば、本発明は、植物成長の亢進方法を包含し、ここで前記方法は、１又は２以上の本発明の細菌株（少なくとも１つの本発明の単離細菌株及び農薬学的に許容できる担体を含む組成物も包含する）を、植物、植物種子、又は植物を取囲む土壌に施用することを包含する。前記１又は２以上の細菌株は、わずか１つの細菌株、又は本発明の菌株のうち少なくとも２以上（２も含む）、例えば上記菌株のうち少なくとも３、上記菌株のうち少なくとも４、上記菌株のうち少なくとも５、上記菌株のうち少なくとも６、上記菌株のうち少なくとも７、上記菌株のうち少なくとも８、上記菌株のうち少なくとも９、上記菌株のうち少なくとも１０、上記菌株のうち少なくとも１１、上記菌株のうち少なくとも１２、上記菌株のうち少なくとも１３、上記株のうちすべてまでの（すべても含む）組合せを含むことができる。

施用
本発明の方法は、少なくとも１つの単離菌株及び／又は少なくとも１つの単離菌株を含む組成物を、種子、苗、根、植物、土壌又はそれらの組合せに施用するための処理段階を包含する。用語、「処理する（treating）」又は「処理（treatment）」とは、本明細書において及び当業界において使用される場合、植物へのコロニー形態の競合性及び植物成長の促進効果を亢進するのに有効量の処理組成物又は成分と種子、苗、根又は植物との接触をもたらすいずれかの施用を意味する。

有効量及び／又は適切な施用率は、土壌のタイプ、植物のタイプ、土壌に存在するか又はそれに添加される微量栄養素源の量、等に従って変化し、そして適切な施用率は個々の特定の場合についての単純な試行錯誤の実験により容易に見出され得る。通常、少なくとも１つの単離菌株及び／又は少なくとも1つの単離菌株を含む組成物の施用率は、種子（コーチングされた種子が使用される場合）１つ当たり１×１０^２〜１×１０^８コロニー形成単位（ｃｆｕ）の範囲ある。顆粒状担体上への施用率は、１ヘクタール当たり１×１０^８〜１×１０^１３ｃｆｕの範囲にある。特定の実施形態によれば、顆粒状担体上への施用率は、１ヘクタール当たり２×１０^１１〜６×１０^１１ｃｆｕの範囲にある。本発明に従って使用される接種組成物及び／又は組成物が少なくとも２以上の異なった細菌株の混合物／組合せを含むことができたとしても、それは、本明細書を通して言及される組合された混合物におけるコロニー形成単位の合計量である。直接的に種子を処理するために本発明の組成物に使用されるＬＣＯ及び／又はＣＯの有効量は、濃度単位で表され、そして一般的には、約１０^−５〜約１０^−１４Ｍ（モル濃度）、及びある実施形態によれば、約１０^−５〜約１０^−１１Ｍ、及びある他の実施形態によれば、約１０^−７〜約^−８Ｍの範囲である。重量単位で表される場合、有効量は、一般的に、約１〜約４００μｇ／１００の種子重量（ｃｗｔ）、及びある実施形態によれば、約２〜約７０μｇ／ｃｗｔ種子、及びある他の実施形態によれば、約２．５〜約３．０μｇ／ｃｗｔ種子の範囲である。

間接的種子処理、すなわち畝間処理に関しては、ＬＣＯ又はＣＯの有効量は一般的に、１μｇ／エーカー〜約７０μｇ／エーカー、及びある実施形態によれば、５０μｇ／エーカー〜約６０μｇ／エーカーの範囲である。植物への施用に関しては、ＬＣＯ又はＣＯの有効量は一般的に、１μｇ／エーカー〜約３０μｇ／エーカー、及びある実施形態によれば、約１１μｇ／エーカー〜約２０μｇ／エーカーの範囲である。

処理は、直接的に、すなわち種子、苗、根又は植物（葉も包含する）上への直接的な施用により達成され得るか、又は間接的に、すなわち土壌（畝間も包含する）への施用により達成され得る。

理解されるように、個々の成分による処理は、連続的に又は同時に達成され得る。例えば、液体担体が使用される場合、成分は市販の処理器混合タンクにおいて同時スラリー化され得、そしていずれかの適切なコーティング工程、例えばフィルムコーチングにより種子に連続的に施用され得る。フィルムコーチング工程においては、スラリーが連続コーティング工程下で種子上に噴霧される。他方では、例えば微粒子又は粉末担体が使用される場合、成分は連続的に施用され得る。従って、処理はまた、葉への施用及び／又は畝間への組成物の施用も包含することができる。

単離菌株及び／又は単離菌株のうち少なくとも１つを含む組成物により処理される植物の非制限例としては、マメ科作物を挙げることができる。マメ科作物の非制限例としては、大豆、アルファルファ、ピーナッツ、エンドウ豆、レンズ豆、豆及びクローバーのような植物を挙げることができるが、但しそれらだけには限定されない。理解されるように、用語「作物（crop）」とは、収穫され得るいずれかの食物材料を包含する。

培養物
本発明は、下記から成る群から選択されたブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株の生物学的に純粋な培養物に向けられる：
受託番号NRRL B-50592の菌株（また、NRRL B-59571としても寄託された）；
受託番号NRRL B-50593の菌株；（また、NRRL B-59572としても寄託された）
受託番号NRRL B-50586の菌株；（また、NRRL B-59565としても寄託された）
受託番号NRRL B-50588の菌株；（また、NRRL B-59567としても寄託された）
受託番号NRRL B-50587の菌株；（また、NRRL B-59566としても寄託された）
受託番号NRRL B-50589の菌株；（また、NRRL B-59568としても寄託された）
受託番号NRRL B-50591の菌株；（また、NRRL B-59570としても寄託された）
受託番号NRRL B-50590の菌株；（また、NRRL B-59569としても寄託された）
受託番号NRRL B-50594の菌株；（また、NRRL B-50493としても寄託された）
受託番号NRRL B-50726の菌株；
受託番号NRRL B-50727の菌株；
受託番号NRRL B-50728の菌株；
受託番号NRRL B-50729の菌株；及び
受託番号NRRL B-50730の菌株。

本明細書において使用される場合、用語「生物学的に純粋な培養物（biologically pure culture）」とは、生物学的汚染を実質的に有さず、そして遺伝的均一性を有する培養物を意味し、結果的に、それからの異なった継代培養は実質的に同一の遺伝子型及び表現型を示すであろう（例えば、培養物は少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、100%までの純度を有する）。そのような培養物は、大規模発酵において、又は他の商業的目的のために有用であり得る。従って、受託番号NRRL B-50592 (NRRL B-59571としても寄託された)、NRRL B-50593 (NRRL B-59572としても寄託された)、NRRL B-50586 (NRRL B-59565としても寄託された)、NRRL B-50588 (NRRL B-59567としても寄託された)、NRRL B-50587 (NRRL B-59566としても寄託された)、NRRL B-50589 (NRRL B-59568としても寄託された)、NRRL B-50591 (NRRL B-59570としても寄託された); NRRL B-50590 (NRRL B-59569としても寄託された); NRRL B-50594 (NRRL B-50493としても寄託された); NRRL B-50726; NRRL B-50727; NRRL B-50728; NRRL B-50729; NRRL B-50730のブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobium japonicum）菌株由来の変異体、トランス接合体（transconjugants）、組換え体及び遺伝子操作された変異体、及びそれらの培養物は、本発明の範囲内にある。

一つの実施形態によれば、培養物は受託番号NRRL B-500592（NRRL B-59571としても寄託されている）の菌株である。別の実施形態によれば、培養物は受託番号NRRL B-50593（NRRL B-59572としても寄託されている）の菌株である。別の実施形態によれば、培養物は受託番号NRRL B-50586（NRRL B-59565としても寄託されている）の菌株である。別の実施形態によれば、培養物は受託番号NRRL B-50588（NRRL B-59567としても寄託されている）の菌株である。別の実施形態によれば、培養物は受託番号NRRL B-50587（NRRL B-59566としても寄託されている）の菌株である。別の実施形態によれば、培養物は受託番号NRRL B-50589（NRRL B-59568としても寄託されている）の菌株である。別の実施形態によれば、培養物は受託番号NRRL B-50591（NRRL B-59570としても寄託されている）の菌株である。別の実施形態によれば、培養物は受託番号NRRL B-50590（NRRL B-59569としても寄託されている）の菌株である。別の実施形態によれば、培養物は受託番号NRRL B-50594（NRRL B-50493としても寄託されている）の菌株である。別の実施形態によれば、培養物は受託番号NRRL B-50726の菌株である。別の実施形態によれば、培養物は受託番号NRRL B-50727の菌株である。別の実施形態によれば、培養物は受託番号NRRL B-50728の菌株である。別の実施形態によれば、培養物は受託番号NRRL B-50729の菌株である。別の実施形態によれば、培養物は受託番号NRRL B-50730の菌株である。

生物材料の寄託
次の生物材料は、American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20108, USA, 及びthe Microbial Genomics and Bioprocessing Research Unit (NRRL) National Center for Agricultural Utilization Research 1815 N. University Street, Peoria, IL 61604, USAに、ブダペスト条約下で寄託されており、そして次の受託番号を付与された：

菌株は、培養物へのアクセスが37 C.F.R. §1.14 and 35 U.S.C. §122下で権利を与えられている特許商標長官により決定される、本特許出願の係属の間、利用できるであろうことを保証する条件下で寄託されている。寄託物は寄託された菌株の純粋培養物を表す。寄託物は、対象出願又はその後代の対応部分が出願されている国々において外国特許法により必要とされる場合、入手できる。しかしながら、寄託物の可用性は政府指令により許される特許権の逸脱下で本発明を実施するための実施許諾を構成しないことは理解されるべきである。

次の実施例は、例示目的のためであって、本発明の範囲を限定するものではない。

材料及び方法
培地
YEM寒天 (YEMA): (１０ g/Lの D-マンニトール; ０．５０ g/L のOxoid 酵母抽出物; ０．１０ g/Lの NaCl; ０．５０ g/L のK₂HPO₄; ０．２０ g/Lの MgSO₄・7H₂O; １２．０ g/Lの寒天; pH≒6.8)。液体YEM: (１０ g/L のD-マンニトール; ０．５０ g/L のOxoid酵母抽出物; ０．１０ g/Lの NaCl; ０．５０ g/Lの K₂HPO₄; ０．２０ g/Lの MgSO₄・7H₂O; pH≒６．８)。

DNA単離プロトコル
プレート上で増殖された菌株に関しては、プレートからの個々の菌株の１μlループを、Applied Biosystemsからの１００μlのPrepMan（登録商標）Ultra DNA単離溶液にそれぞれ添加した。その溶液を１００℃に１０分間、加熱した。単離DNAをPCR分析のために使用した。

根粒から単離されたDNAに関しては、根粒を大豆根からピンセットにより除き、そして蒸留水によりすすいだ。根粒を、Applied Biosystemsからの１００μlのPrepMan（登録商標）Ultra DNA単離溶液にそれぞれ配置し、ばらばらにし、そして１００℃で１０分間、Applied Biosystemsからの９６−ウェルPCRプレートを用いて加熱した。使い捨て爪楊枝を用いて、根粒をこじ開け、交差汚染を回避した。

PCRプロトコル
ポリメラーゼ鎖反応（PCR）を、Applied Biosystems Veriti（登録商標）９６−ウェルFast Thermal Cyclerを用いて実施した。PCRは、個々の菌株に対して設定された。２μlのDNAを、０．５μlの３′プライマー、０．５μlの５′プライマー、０．５μlのTaq Polymerase (New England Biolabs, Inc.)及び２１．５μlのPlatinum Blue PCR Supermix（登録商標） (Invitrogen)に添加した。PCR混合物を９４℃まで４分間、加熱した。変性に続いて、PCRを次のプログラムを用いて３５サイクル、実施した：９４℃、１分、６８℃又はプライマーアニーリング依存性温度、１分、及び７２℃で１分の反応拡張。PCRプログラムの完結の後、５μlのPCR混合物を、Lonza（登録商標）FlashGel（登録商標）システム上で実行した。

菌株単離プロトコル
菌株を単離するために、根粒を、１０％家庭用漂白剤により２分間、表面殺菌した。根粒を無菌水によりすすぎ、そして次に、２５０μlの無菌水を含む微小遠心管に配置した。根粒を、無菌爪楊枝により粉砕し、そして根粒菌（Rhizobium）株を水中に開放した。２×１０μlループの水を、単一コロニーのためにYEMAプレート上に画線培養した。すべてのプレートをパラフィン（登録商標）により包み、そしてEppendorf Innova（登録商標）４２Rインキュベーター中で３０℃で増殖した。増殖時間は、単離物ごとに異なった。

一次スクリーニングプロトコル
菌株を、主として、２種の異なったプロトコル、すなわち「大豆畑土壌プロトコル（Soybean Field Soil Protocol）（USDA 532C Treated Field）」及び「未処理（対照）フィールドプロトコル（Untreated (control)Field Protocol）」によりスクリーニングした。個々のプロトコルを記載する。

大豆畑土壌プロトコル（USDA 532C処理フィールド）
USDA 532Cによりコーティングされた大豆種子を、米国中の大豆産地、例えばサウスダコタ、ノースダコタ、ジョージア、アイオワ、ネバラスカ、イリノイ、インディアナ、テキサス、カンザス、ミネソタ州、等を通して種々の土壌に植えた。ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobium japonicum）菌株USPA 532Cにより処理された大豆種を、それらの土壌で成長せしめ、収穫し、そして大豆根粒を、PCR分析により直接的に分析した。４０個の根粒を、個々の土壌サンプルから集めた。個々の大豆根粒からのDNAを、前記方法（材料及び方法：DNA単離プロトコルを参照）に基づいて、根粒から直接的に単離した。

USDA 532C特異的プライマー209を用いてのPCR分析を、96ウェルプレート上で直接的に実施した（材料及び方法：PCRプロトコルを参照）。４０個の根粒からのプライマー２０９（０．９kbバンド）の増幅を計算し、％増幅率を決定した。0.9kbのDNA増幅が３０％以下か又は３０％に等しい場合（すなわち、PCRの７０％以上か又は７０％は、プライマー２０９増幅のためには陰性であった）、その土壌サンプルは、ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株を含み、そしてUSDA 532C菌株より高い競合性を有した。３０％以下か又は３０％に等しい増幅を有する大豆根粒は、記載される方法（材料及び方法：菌株単離プロトコルを参照）に基づいて、USDA 532Cよりもより競合性のあるものとして同定された生来の菌株を含んだ。

大豆根粒の３０％以上がブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株USDA 532Cによりコロニー形成される場合

未処理フィールド（対照）プロトコル
根粒を、USDA 532Cにより処理されていない、次の州の大豆畑から得た：アラスカ、ジョージア、イリノイ、インディアナ、アイオワ、オクラホマ、ネバラスカ、カンザス、ミズリー及びテキサス州。ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株を、前記プロトコル（材料及び方法：菌株単離プロトコル）に従って、それらの根粒から直接的に得た。単離された菌株を、「競争研究プロトコル」（材料及び方法：競争研究プロトコルを参照）に従って、ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株USDA 532Cとの直接的競争にゆだねた。ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株USDA 532Cに比較される場合、大豆根粒の７０％以上占有する単離菌株を、性能評価（材料及び方法：性能研究プロトコルを参照）のために選択した。

競争研究プロトコル
光学密度を測定した（Nanodrop（登録商標）ND1000分光光度計）。USDA 532C：個々の単離菌株の１：１の接種比を得た。USDA 532Cを、600nmで０．５の光学密度まで希釈するか又は濃縮し、そして０．５mlのUSDA 532C接種物を、個々の単離物のために確保した。すべて単離菌株を、次の計算を用いて、６００nmで０．５の光学密度まで濃縮するか又は希釈した：（０．５の光学密度のUSDA 532C）×（０．５mlのUSDA 532C）＝（単離菌株の光学密度）×（単離菌株ml）。０．５mlのUSDA 532Cを、別々の処理として０．５mlの個々の単離物に添加した。大豆種子を、１２個の大豆種子当たり０．５mlの接種混合物の割合で、接種混合物によりコーティングした。種子を３０分間、吸収を可能にした。１２の処理された大豆種子のうち５個を、１ガロンのポット中のFafard（登録商標）３Bポッティング混合物に植えた。手袋を着用し、種子を植え、そして処理間で交換した。植えた後、７個の残る処理された大豆種子を捨てた。

発芽時に、ポットは３植物まで間伐した。植物は室温で６〜７週間、成長し、そして散水工程の間の交差汚染を回避した。温度は約２３℃〜３２℃の間であった。散水は、必要に応じて実施された。根粒を個々の処理から収穫し、そしてUSDA 532C特異的プライマ−209を用いて、DNA単離及びPCR分析のために使用した。材料及び方法：DNA単離プロトコル及びPCRプロトコルを参照。

性能研究プロトコル
性質研究は、単一の単離菌株と市販のブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株USDA 532Cとの間の直接的菌株〜菌株性能比較である。単離菌株及び対照菌株（ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株USDA 532C）を、別々のYENAプレート上に同時に画線培養した。単離菌株及び対照菌株を別々に、50ｍｌのYEM液体培地中に接種し、個々の接種管（Nanodrop（登録商標）ND1000 分光光度計）において６００nmで０．０３の初期光学密度を得た。単離菌株及び対照菌株を別々に、３０℃で３０日間インキュベートした。インキュベーションに続いて、単離菌株及び対照菌株についての接種物を、個々の接種管（Nanodrop（登録商標）ND1000 分光光度計）において６００nmで０．５の最終光学密度まで、さらに希釈するか又は濃縮し、試験処理物（単離菌株）及び対照処理物（対照菌株ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株USDA 532C）を得た。

0.75mlの試験処理物を、３２個の大豆種子に添加した。処理された種子を３０分間、吸収を可能にした。３０分後、２つの種子を、Fafard（登録商標）３Bポッティング混合物を含む15個の別々の（4”x4”x6”）ポット中に植えた。手袋は種を植えるために着用され、処理の間で変えた。植え付けに続いて、２つの残る処理された大豆種子を捨てた。この工程を、対照処理のために反復した。

発芽時、試験処理物及び対照処理物ポットを、単一の植物まで間伐した。植物を温室で８〜１０週間、成長せしめ、そして散水工程の間、交差汚染を回避した。温度は約２３℃〜３２℃の範囲であった。散水は「必要に応じて」、実施された。８〜１０週後、鞘を収穫し、そして８０℃で一晩、乾燥した。JMP（登録商標）統計ソフトフェア（SAA Institute, Inc.）による分析を用いて、ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株USDA 532Cに比較して統計学的に有意な性能亢進を決定した。

温度プロフィールプロトコル
単離ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株を、YEMAプレート（１０ g/Lの D-マンニトール; ０．５０ g/L のOxoid酵母抽出物; ０．１０ g/Lの NaCl; ０．５０ g/Lの K₂HPO₄; ０．２０ g/Lの MgSO₄・7H₂O; １２．０ g/L の寒天; pH≒６．８）上に画線培養し、そしてそれぞれ３０℃及び３５℃で７日間インキュベートした。単離菌株を、単離コロニーを増殖するそれらの能力について分析した。

グリホサート耐性プロフィールプロトコル
単離ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株を、１mMのグリホサート及び２mMのグリホサートのYEMAプレート（１０ g/Lの D-マンニトール; ０．５０ g/L のOxoid酵母抽出物; ０．１０ g/Lの NaCl; ０．５０ g/Lの K₂HPO₄; ０．２０ g/Lの MgSO₄・7H₂O; １２．０ g/L の寒天; pH≒６．８）上に画線培養した。プレートを３０℃で７日間インキュベートし、そして菌株を、単離コロニーを増殖するそれらの能力について分析した。

抗生物質プロフィールプロトコル
単離ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株を、ゲンタマイシン（５０mg／L）YEMA、クロラムフェニコール（５０mg／L）YEMA、ポリミキシンB（１００mg／L）YEMA、カルベニシリン（１００mg／L）YEMA、ネオマイシン（５０mg／L）YEMA及びナリジクス酸（５０mg／L）YEMA上にＴ−画線培養した。プレートを３０℃で７日間インキュベートし、そして菌株を、単離コロニーを増殖するそれらの能力について分析した。

Diversilab（登録商標）PCRプロトコル
Diversilab（登録商標）PCRを、BioMerieuxからのDiversilab Pseudomonas Kit（登録商標）を用いて設定した。このキットは、複数のDNA増幅のフィンガープリントを生成するためにゲノムの種々の部分を増幅するよう企画された独自のプライマーを含んだ。個々の菌株はユニークフィンガープリントを有し、そして菌株間の％類似性は、Diverilabソフトウェアを用いて測定することができる。

PCRを、それに応じて設定した。２μlのDNAを、１８．０ μLのRe-PCR MM1、２．０ μL のプライマー混合物、０．５ μLのTaq ポリメラーゼ (New England Biolabs, Inc.)に添加し、合計体積を２５μlにした。PCRを９４℃に２分間、加熱し、そして次に、次の通りに３５サイクル実施した：９４℃、０．５分、次に５０℃、０．５分、及び最終的に７０℃、１．５分。３５サイクルの完結の後、全反応を７０℃で３分間、維持した。PCR分析の完結に続いて、PCR生成物をAgilent（登録商標）2100 Series Bioanalyzer上で実行した。BioMerieuxからのDiversilab（登録商標）DNA Reagents & Suppliesキットを用いて、Diversilab（登録商標）Systemチップ上にPCR生成物を負荷した。キットは説明書に従って維持された。使用の前、キットは、Diversilab（登録商標）チップを負荷する前、室温で３０分静置された。Diversilab（登録商標）チップを、提供するすべてのプロトコル及び説明書に完全に従って負荷した。Diversilab（登録商標）の負荷の完結の後、そのチップをAgilent（登録商標）2100 Series Bioanalyzer中に負荷し、そして分析を、完結まで実施した。

実施例１
市販のブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株USDA 532Cについてのユニークプライマー企画
遺伝的同定方法を開発し、フィールドにおける生来の菌株に対する市販ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株USDA 532Cの競合性を評価した。USDA 523Cに対して特異的なプライマーを同定し、そしてPCR技法を用いて、フィールドにおけるUSDA 532Cの競合性を効果的に評価した。

USDA 532Cの完全なゲノム配列決定を、Novozymes Davisで行った。２５の異なったDNA断片は、ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）の公開配列と低い相同性を有することが見出された。上記方法（材料及び方法：DNA単離プロトコルを参照）に従って、プレート上で増殖されたB.ジャポニクム（B. Japonicum）の菌株（USDA 532C, P152, Br173, Br187, P190及びP194）から、DNAを単離した。追加の配列分析を、それらの２５のDNA断片に対して実施した。USDA 532C菌株についての推定上のユニークプライマーを選択し、そしていくつかの代表的ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株に対するPCRによるUSDA 532C−特異的プライマースクリーニングのために使用した。PCR評価の後、USDA 532Cのための単一のユニークプライマーを同定し、そしてｐ２０９として命名した。

プライマー209配列は、次の通りである：
配列番号1 - P209p5-TTGGGTTGAGCATGCCCACCCGGACGG、
配列番号2 - P209p3-gtctcagttgccgagcccacggcgc

プライマー特異性
２５のプライマーを、USDA 532Cの陽性同定について個々に試験した。さらに、プライマーを、比較のためにUSDA 532C及びB.ジャポリクム（B. japonicum）の５種の異なった生来の菌株（P152、Br173、Br187、P190及びP194）を用いて、PCRによりUSDA 532C特異性について試験した。ゲノム配列決定は、Br187及びUSDA 532Cが遺伝的に同じであることを示した。

表２は、調査結果を要約する（「＋」は、ゲルにおけるPCR増幅バンドの陽性同定を示し、「−」はDNA増幅がなかったことを示す）。

図１Aを参照すると、単離されたプライマー209がUSDA 532C及びBr187に対して特異的であることが示されている。さらに、遺伝子検査は、USDA 532C及びブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株P187が同一である（結果は示されていない）ことを示した。ウェル内容物（左から右）は、次の生来の菌株USDA 532C、P152、Br173、Br187、Br190、Br194及び対照ラダーを示す。図１Aを参照。

プライマー209の特異性を、生来の菌株P152、Br173、Br187、Br190、Br194及びUSDA 532Cに対して試験した。図１Bを参照。プライマー209によるPCRを、上記方法（材料及び方法：未処理（対照）フィールドプロトコルを参照）に従って、フィールド試験において未処理プロットから得られた１００の菌株に対して実施した。ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株USDA 532Cを、それらのプロットに添加しなかった。試験された菌株のうち、生来の菌株のわずか３％が、プライマー209に対して特異的な０．９kbバンドのために増幅され得た。この結果は、プライマー209がUSDA 532Cの特異的検出のために使用され得たことを示した。

実施例２
新規菌株の分析及び単離
プライマー209をマーカーとして使用し、大豆植物の根粒へのブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株USDA 532Cによるコロニー形成の有無を示した。プライマー209の存在を示すバンド（すなわち、０．９ｋｂのバンド）は、ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株USDA 532Cの陽性同定を表す。図２Aを参照。図２Aは、ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株USDA 532Cが、他の生来の根粒菌株（Rhizobial strains）に比較される場合、大豆植物根粒のコロニー形成のための優性的競争菌株である場合の例示である。図２Bにおいては、プライマー209についての陽性同定及び従って、ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株USDA 532Cの存在を示すバンド数が、図２Aにおけるプライマー209のために存在するバンド総数に比較して、低められる。図２A及び図２Bは、プライマーの有無が、USDA 532Cが大豆植物の根粒における優性的競争菌株であるかどうかを決定するために使用され得ることを示す。

単離ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株を、両スクリーニングプロトコル（材料及び方法：一次スクリーニングプロトコルを参照）に従って、根粒から選択した。選択された菌株を、単離方法（材料及び方法：菌株卵理プロトコルを参照）に従って、根粒から単離した。

実施例３
接戦（head-to-head）競争評価
すべての単離された菌株は、根粒コロニー形成能力の点で、ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株USDA 532Cに対する単離物の競合性を直接的に問題にするよう企画されたスクリーニングプログラム中に置かれた（材料及び方法：競争研究プロトコルを参照）。

USDA 532Cに対して特異的な単離プライマー209をマーカーとして使用し、大豆植物の根粒中へのブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株USDA 532Cによるコロニー形成の有無を示した。プライマー209の陽性同定は、大豆植物の根粒中へのブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株USDA 532Cのコロニー形成を示した。逆に、プライマー209についての陽性同定を示すバンドの不在は、大豆植物の根粒中へのブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株USDA 532C以外の生来の菌株のコロニー形成を示した。分析された根粒の７０％以上のコロニー形成を示した単離菌株を、確認のための第２評価のために選択した。菌株を、少なくとも２回の競争評価にゆだねた。この方法を通して、1000以上の単離物が、競合性の亢進のためにスクリーニングされた。

実施例４
性能評価
性能研究は、USDA 532Cに対する単離菌株の直接的な菌株対菌株比較である。増強された性能は、鞘乾燥重量（ｇ）の関数として測定される。材料及び方法：性能研究プロトコルを参照。結果は、表３A−３Dに提供される。

％コロニー形成率を、三重反復研究により確認し、そして増加された鞘乾燥重量をすべての菌株について、二重反復研究により確認した。

％コロニー形成率を、三重反復研究により確認し、そして増加された鞘乾燥重量をすべての菌株について、二重反復研究により確認した。

％コロニー形成率を、三重反復研究により確認し、そして増加された鞘乾燥重量をすべての菌株について、二重反復研究により確認した。

％コロニー形成率及び増加された鞘乾燥重量を、単に１回の試験により実施されたNRRL−B−50730^＊を除く、すべての菌株について二重反復研究により確認した。

市販の菌株USDA 532Cを、個々の評価のための対照として使用した。表３Ａ−３Ｄの結果は、１つを除くすべての単離菌株が、対照USDA 532Cに比較される場合、増強された性能を有したことを示す。

実施例５
特性研究
さらに、単離ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株を、温度、グリホサート耐性及び抗生物質プロフィールに基づいて特徴づけた（材料及び方法：温度プロフィール、グリホサート耐性プロフィール及び抗生物質プロフィールプロトコルを参照）。結果は表４に提供される。

表４は、結果を要約する（「＋」は、単離コロニーによる増殖を示し、「−」は増殖なしを示し、そして「＋−」とは少数の単離コロニー／最少及び散発的増殖を示す）。結果は、菌株NRRL B-59570、NRRL B-59568、NRRL B-59565、NRRL B-59566 及び NRRL B-50493が、実質的に３５℃の温度に対して耐性であることを示す。結果はさらに、単離菌株NRRL B-59569、NRRL B-59568、NRRL B-59565及びNRRL B-50493がグリホサートに対して天然においては耐性であることを示す。菌株NRRL B-59566 及び NRRL B-59569は、ナリジクス酸に対する耐性を有することが見出された。

実施例５
ＤＮＡフィンガープリント開発
最高の特性を有する単離物を、DNA Diversilab^{（登録商標）}フィンガープリント分析に供した（材料及び方法：Diversilab^{（登録商標）}ＰＣＲプロトコルを参照）。ＤＮＡを、既報の方法（材料及び方法：ＤＮＡ単離プロトコルを参照）に従って個々の菌株から単離した。単離ＤＮＡをＰＣＲ分析に使用した。

Diversilab ＤＮＡフィンガープリント分析の結果を図３Ａ、３Ｂに示す。その結果は、単離菌株が独自の菌株であり、USDA 532Cとは異なる菌株であることを示す。

本発明の少なくとも一部を、以下の項に番号を付して記載する。
［項１］
受託番号NRRL B-50592の菌株；
受託番号NRRL B-50593の菌株；
受託番号NRRL B-50586の菌株；
受託番号NRRL B-50588の菌株；
受託番号NRRL B-50587の菌株；
受託番号NRRL B-50589の菌株；
受託番号NRRL B-50591の菌株；
受託番号NRRL B-50590の菌株；
受託番号NRRL B-50594の菌株；
受託番号NRRL B-50726の菌株；
受託番号NRRL B-50727の菌株；
受託番号NRRL B-50728の菌株；
受託番号NRRL B-50729の菌株；及び
受託番号NRRL B-50730の菌株
からなる群より選択されるブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）の生物学的に純粋な培養物。
［項２］
前記菌株が植物における窒素固定を促進し得る、項１に記載のブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）菌株。
［項３］
前記菌株が実質的に35℃の温度での生育に耐性を有する、項１又は２に記載のブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）菌株。
［項４］
前記菌株が：
受託番号NRRL B-50591の菌株；
受託番号NRRL B-50589の菌株；
受託番号NRRL B-50586の菌株；
受託番号NRRL 50594の菌株；及び
前記菌株のうちの少なくとも２以上の組み合わせ
からなる群より選択される、項１〜３の何れかに記載のブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）菌株。
［項５］
前記ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）菌株が天然でグリホサートに耐性を有する、項１〜４の何れかに記載のブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）菌株。
［項６］
前記菌株が：
受託番号NRRL B-50590の菌株；
受託番号NRRL B-50594の菌株；及び
前記菌株のうちの少なくとも２以上の組み合わせ
からなる群より選択される、項１〜５の何れかに記載のブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）菌株。
［項７］
前記菌株による植物へのコロニー形成の競合性（competitiveness for colonizing a plant）が亢進されてなる、項１〜６の何れかに記載のブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）菌株。
［項８］
前記菌株による植物成長の促進効果（effectiveness at promoting plant growth）が亢進されてなる、項１〜７の何れかに記載のブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）菌株。
［項９］
亢進された競合性が、少なくとも５１％の根粒占有率、例えば、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の根粒占有率を含む、項１〜８の何れかに記載のブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）菌株。
［項１０］
植物成長の促進効果の亢進が、市販菌株（例えばUSDA 532C等）と比較した場合に、ブッシェル（bushels）／エーカー（acre）単位で測定される植物収率の向上、果実数の増加、根数の増加、根長の延長、根量の増大、根体積の増大、葉面積の拡大、植物群生の拡大、植物の活力増進、及び／又は、窒素（Ｎ_２）固定能の向上のうち少なくとも１つを含む、項１〜９の何れかに記載のブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）菌株。
［項１１］
大豆成長の促進効果の亢進が、市販菌株（例えば市販菌株USDA 532C等）に供した大豆植物の大豆鞘の総乾燥重量と比較した場合における、大豆植物の大豆鞘の総乾燥重量の増加を含む、項１〜１０の何れかに記載のブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）菌株。
［項１２］
受託番号NRRL B-50592の菌株；
受託番号NRRL B-50593の菌株；
受託番号NRRL B-50586の菌株；
受託番号NRRL B-50588の菌株；
受託番号NRRL B-50587の菌株；
受託番号NRRL B-50589の菌株；
受託番号NRRL B-50591の菌株；
受託番号NRRL B-50590の菌株；
受託番号NRRL B-50594の菌株；
受託番号NRRL B-50726の菌株；
受託番号NRRL B-50727の菌株；
受託番号NRRL B-50728の菌株；
受託番号NRRL B-50729の菌株；
受託番号NRRL B-50730の菌株；及び
前記菌株のうちの少なくとも２以上の組み合わせ
からなる群より選択されるブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）の菌株と、農薬学的に適切な担体とを含む組成物。
［項１３］
前記組成物が、１又は２以上のシグナル分子を含む、項１２に記載の組成物。
［項１４］
植物シグナル分子が、脂肪キトオリゴ糖（ＬＣＯ）である、項１３に記載の組成物。
［項１５］
ＬＣＯが合成である、項１３又は１４に記載の組成物。
［項１６］
ＬＣＯが組換である、項１３〜１５の何れかに記載の組成物。
［項１７］
ＬＣＯが天然である、項１３〜１６の何れかに記載の組成物。
［項１８］
ＬＣＯが、リゾビウム（Rhizobium）種、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）種、シノリゾビウム（Sinorhizobium）種、及びアゾリゾビウム（Azorhizobium）種から選択されるリゾビウム属（Rhizobia）の種から得られる、項１３〜１７の何れかに記載の組成物。
［項１９］
ＬＣＯがブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobium japonicum）から得られる、項１３〜１８の何れかに記載の組成物。
［項２０］
ＬＣＯがアーバスキュラー菌根菌（arbuscular mycorrhizal fungus）から得られる、項１３〜１９の何れかに記載の組成物。
［項２１］
植物シグナル分子がキチン性化合物である、項１３に記載の組成物。
［項２２］
キチン性化合物がキト−オリゴマー（ＣＯ）である、項２２に記載の組成物。
［項２３］
ＣＯが合成である、項２１又は２２に記載の組成物。
［項２４］
ＣＯが組換である、項２１〜２３の何れかに記載の組成物。
［項２５］
ＣＯが天然である、項２１〜２４の何れかに記載の組成物。
［項２６］
植物シグナル分子がフラボノイドである、項１３に記載の組成物。
［項２７］
植物シグナル分子がジャスモン酸又はその誘導体である、項１３に記載の組成物。
［項２８］
植物シグナル分子がリノール酸又はその誘導体である、項１３に記載の組成物。
［項２９］
植物シグナル分子がリノレン酸又はその誘導体である、項１３に記載の組成物。
［項３０］
植物シグナル分子がカリキンである、項１３に記載の組成物。
［項３１］
組成物が少なくとも２種の異なる植物シグナル分子を含む、項１２〜３０の何れかに記載の組成物。
［項３２］
組成物が少なくとも１つの農薬学的に有用な剤を含む、項１２〜３１の何れかに記載の組成物。
［項３３］
農薬学的に有用な剤が除草剤、殺虫剤又は殺真菌剤である、項３２に記載の組成物。
［項３４］
農薬学的に有用な剤が、少なくとも１つのリン酸可溶化微生物である、項３３に記載の組成物。
［項３５］
少なくとも１つのリン酸可溶化微生物が、ペニシリウム（Penicillium）属の真菌株を含む、項３４に記載の組成物。
［項３６］
少なくとも１つのリン酸可溶化微生物が、Ｐ．ビライエ（P. bilaiae）の菌株を含む、項３５に記載の組成物。
［項３７］
Ｐ．ビライエ（P. bilaiae）の菌株が、NRRL 50162、NRRL 50169、ATCC 20851、ATCC 22348及びATCC 18309からなる群より選択される、項３６に記載の組成物。
［項３８］
少なくとも１つのリン酸可溶化微生物が、Ｐ．ゲストリボラス（P. gaestrivorus）の菌株を含む、項３４に記載の組成物。
［項３９］
Ｐ．ゲストリボラス（P. gaestrivorus）の菌株が、NRRL 50170である、項３８に記載の組成物。
［項４０］
ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）及びリゾビウム（Rhizobium）からなる属から選択される細菌株であって、マメ科植物へのコロニー形成の競合性（competitiveness for colonizing a leguminous plant）、及び、マメ科植物の成長促進効果（effectiveness at promoting leguminous plant growth）が亢進された細菌株を単離する方法であって：
ａ．土壌サンプルから細菌株を取得し；
ｂ．前記細菌株及び市販の菌株（例えば市販菌株USDA 532C）をマメ科植物に供し；
ｃ．前記細菌株から、マメ科植物の根粒の占有性に基づいて、前記市販の菌株よりも高い競合性を有する細菌株を選択し；
ｄ．選択された、マメ科植物の根粒の占有性について前記市販の菌株よりも高い競合性を有する細菌株において、マメ科植物成長の促進効果が亢進されているかを分析し；
ｅ．マメ科植物成長の促進効果が亢進されている細菌株を単離する
ことを含む方法。
［項４１］
前記細菌株がブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）の菌株である、項４０に記載の単離細菌株。
［項４２］
前記ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）菌株が、ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobium japonicum）菌株である、項４１に記載の単離細菌株。
［項４３］
前記菌株が：
受託番号NRRL B-50592の菌株；
受託番号NRRL B-50593の菌株；
受託番号NRRL B-50586の菌株；
受託番号NRRL B-50588の菌株；
受託番号NRRL B-50587の菌株；
受託番号NRRL B-50589の菌株；
受託番号NRRL B-50591の菌株；
受託番号NRRL B-50590の菌株；
受託番号NRRL B-50594の菌株；
受託番号NRRL B-50726の菌株；
受託番号NRRL B-50727の菌株；
受託番号NRRL B-50728の菌株；
受託番号NRRL B-50729の菌株；
受託番号NRRL B-50730の菌株；及び
前記菌株のうちの少なくとも２以上の組み合わせ
からなる群より選択されるブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株である、項４１又は４２に記載の単離細菌株。
［項４４］
単離ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株が、植物における窒素固定を促進し得る、項４１〜４３の何れかに記載の方法。
［項４５］
単離ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株が、実質的に35℃の温度での生育に耐性を有する、項４１〜４４の何れかに記載の方法。
［項４６］
単離ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株が：
受託番号NRRL B-50591の菌株；
受託番号NRRL B-50589の菌株；
受託番号NRRL B-50586の菌株；
受託番号NRRL 50594の菌株；及び
前記菌株のうちの少なくとも２以上の組み合わせ
からなる群より選択される、項４５に記載の方法。
［項４７］
ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株が、天然でグリホサートに対する耐性を有する、項４０〜４６の何れかに記載の方法。
［項４８］
単離ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株が：
受託番号NRRL B-50590の菌株；
受託番号NRRL B-50594の菌株；及び
前記菌株のうちの少なくとも２以上の組み合わせ
からなる群より選択される、項４７に記載の方法。
［項４９］
植物成長を促進する方法であって、種子、苗、根、植物、土壌、又はこれらの組み合わせを、項１〜３９の何れかに記載の組成物で処理することを含む方法。
［項５０］
種子、苗、根、又は植物がマメ科である、項４９に記載の方法。
［項５１］
種子、苗、根、又は植物が、大豆の種子、苗、根、又は植物である、項５０に記載の方法。
［項５２］
組成物を土壌に対して、１ヘクタール当たり１×１０^８〜１×１０^１３コロニー形成単位、好ましくは１ヘクタール当たり２×１０^１１〜６×１０^１１コロニー形成単位となるように加える、請求項４９〜５１の何れか一項に記載の方法。
［項５３］
前記組成物を、種子１つ当たり１×１０^２〜１×１０^８、好ましくは１×１０^４〜１×１０^５コロニー形成単位を含む種子コーティングとして導入する、請求項４９〜５２の何れか一項に記載の方法。

本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載の発明は、本明細書に開示の具体的な態様に限定されるものではない。これらの態様は本発明が有する一部の側面を例示することを意図したものに過ぎない。任意の均等な態様も、本発明の範囲内に含めることが意図される。実際に、本明細書に記載の態様に加えて、種々の変形を本発明に加えることが可能であることは、上記記載から当業者には明らかである。斯かる変形も、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。

もし矛盾ある場合には、本明細書に含まれる定義が優先される。

本明細書では種々の文献を引用したが、その開示内容はその全体が引用により本明細書に組み込まれる。

Claims (54)

1. ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobia japonicum）菌株の生物学的に純粋な培養物と、農薬学的に適切な担体とを含む、種子の被覆に適した接種組成物であって、
   前記菌株が、
   受託番号NRRL B-50592の菌株；
   受託番号NRRL B-50593の菌株；
   受託番号NRRL B-50586の菌株；
   受託番号NRRL B-50588の菌株；
   受託番号NRRL B-50587の菌株；
   受託番号NRRL B-50589の菌株；
   受託番号NRRL B-50591の菌株；
   受託番号NRRL B-50590の菌株；
   受託番号NRRL B-50594の菌株；
   受託番号NRRL B-50726の菌株；
   受託番号NRRL B-50727の菌株；
   受託番号NRRL B-50728の菌株；
   受託番号NRRL B-50729の菌株；及び
   受託番号NRRL B-50730の菌株
   からなる群より選択される少なくとも１種である、接種組成物。
2. 前記菌株が実質的に35℃の温度での生育に耐性を有する、請求項１に記載の接種組成物。
3. 前記菌株が1.0ｍＭのグリフォサートの存在下での生育に耐性を有する、請求項１又は２に記載の接種組成物。
4. 前記菌株が2.0ｍＭのグリフォサートの存在下での生育に耐性を有する、請求項１又は２に記載の接種組成物。
5. 前記菌株が50ｍｇ／Ｌのナリジクス酸の存在下での生育に耐性を有する、請求項１〜４の何れか一項に記載の接種組成物。
6. 前記菌株による植物へのコロニー形成能の競合性が、菌株USDA532Cと比較して亢進されてなる、請求項１〜５の何れか一項に記載の接種組成物。
7. 前記競合性の亢進が、少なくとも51％の根粒占有率を含む、請求項６に記載の接種組成物。
8. 前記菌株による植物の成長促進効果が、菌株USDA532Cと比較して亢進されてなる、請求項１〜５の何れか一項に記載の接種組成物。
9. 前記成長促進効果が、菌株USDA532Cとの比較における、ブッシェル（bushels）／エーカー（acre）単位で測定される植物収率の向上、果実数の増加、根数の増加、根長の延長、根量の増大、根体積の増大、葉面積の拡大、植物群生の拡大、植物の活力増進、及び／又は、窒素（N₂）固定能の向上のうち少なくとも１つを含む、請求項８に記載の接種組成物。
10. 前記植物が大豆であり、前記成長促進効果が、菌株USDA532Cで処理した大豆植物の大豆鞘の総乾燥重量との比較における、大豆植物の大豆鞘の総乾燥重量の増加を含む、請求項８に記載の接種組成物。
11. 前記菌株が、
    受託番号NRRL B-50591の菌株、
    受託番号NRRL B-50589の菌株、
    受託番号NRRL B-50586の菌株、及び／又は
    受託番号NRRL B-50594の菌株
    を含む、請求項１〜１０の何れか一項に記載の接種組成物。
12. 前記菌株が、
    受託番号NRRL B-50590の菌株、及び／又は
    受託番号NRRL B-50594の菌株
    を含む、請求項１〜１１の何れか一項に記載の接種組成物。
13. 前記菌株が、
    受託番号NRRL B-50728の菌株；
    を含む、請求項１〜１２の何れか一項に記載の接種組成物。
14. 少なくとも１種のシグナル分子を更に含む、請求項１〜１３の何れか一項に記載の接種組成物。
15. 前記シグナル分子が、少なくとも１種の脂肪キトオリゴ糖（ＬＣＯ）を含む、請求項１４に記載の接種組成物。
16. 前記ＬＣＯが、少なくとも１種の合成ＬＣＯを含む、請求項１５に記載の接種組成物。
17. 前記ＬＣＯが、少なくとも１種の組換ＬＣＯを含む、請求項１５又は１６に記載の接種組成物。
18. 前記ＬＣＯが、少なくとも１種の天然ＬＣＯを含む、請求項１５〜１７の何れか一項に記載の接種組成物。
19. 前記ＬＣＯが、アゾリゾビウム（Azorhizobium）、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）、メゾリゾビウム（Mesorhizobium）、リゾビウム（Rhizobium）、及び／又はシノリゾビウム（Sinorhizobium）に由来する少なくとも１種のＬＣＯを含む、請求項１５〜１８の何れか一項に記載の接種組成物。
20. 前記ＬＣＯが、ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobium japonicum）菌株に由来する少なくとも１種のＬＣＯを含む、請求項１５〜１９の何れか一項に記載の接種組成物。
21. 前記ＬＣＯが、シノリゾビウム・メリロチ（Sinorhizobium meliloti）菌株に由来する少なくとも１種のＬＣＯを含む、請求項１５〜２０の何れか一項に記載の接種組成物。
22. 前記ＬＣＯが、リゾビウム・レグミノサルム（Rhizobium leguminosarum）菌株に由来する少なくとも１種のＬＣＯを含む、請求項１５〜２１の何れか一項に記載の接種組成物。
23. 前記ＬＣＯが、菌根菌（mycorrhizal fungus）菌株に由来する少なくとも１種のＬＣＯを含む、請求項１５〜２２の何れか一項に記載の接種組成物。
24. 前記ＬＣＯが、グロムス門（Glomeromycota）菌株に由来する少なくとも１種のＬＣＯを含む、請求項１５〜２３の何れか一項に記載の接種組成物。
25. 前記ＬＣＯが、グロムス・イントララジカス（Glomus intraradicus）菌株に由来する少なくとも１種のＬＣＯを含む、請求項１５〜２４の何れか一項に記載の接種組成物。
26. 前記ＬＣＯが、以下の構造
    

    

    （式中、ＲはＨ又はＣＨ_３ＣＯ−を表し、ｎは２又は３である）
    を有する少なくとも１種のＬＣＯを含む、請求項１５〜２５の何れか一項に記載の接種組成物。
27. 前記ＬＣＯが、10^-5〜10^-14モル濃度で存在する、請求項１５〜２６の何れか一項に記載の接種組成物。
28. 前記ＬＣＯが、10^-5〜10^-11モル濃度で存在する、請求項１５〜２６の何れか一項に記載の接種組成物。
29. 前記ＬＣＯが、10^-7〜10^-8モル濃度で存在する、請求項１５〜２６の何れか一項に記載の接種組成物。
30. 前記シグナル分子が、少なくとも１種のキトオリゴ糖（ＣＯ）を含む、請求項１４〜２９の何れか一項に記載の接種組成物。
31. 前記ＣＯが、10^-5〜10^-14モル濃度で存在する、請求項３０に記載の接種組成物。
32. 前記ＣＯが、10^-5〜10^-11モル濃度で存在する、請求項３０の何れか一項に記載の接種組成物。
33. 前記ＣＯが、10^-7〜10^-8モル濃度で存在する、請求項３０の何れか一項に記載の接種組成物。
34. 前記シグナル分子が、少なくとも１種のキチン性化合物を含む、請求項１４〜３３の何れか一項に記載の接種組成物。
35. 前記キチン性化合物が、キチンを含む、請求項３４に記載の接種組成物。
36. 前記キチン性化合物が、キトサンを含む、請求項３４又は３５に記載の接種組成物。
37. 前記シグナル分子が、少なくとも１種のフラボノイドを含む、請求項１４〜３６の何れか一項に記載の接種組成物。
38. 前記フラボノイドが、ゲニステイン（genistein）を含む、請求項３７に記載の接種組成物。
39. 前記シグナル分子が、ジャスモン酸又はその塩、リノール酸又はその塩、リノレン酸又はその塩、及び／又は、カリキンを含む、請求項１４〜３８の何れか一項に記載の接種組成物。
40. 少なくとも１種の除草剤、殺虫剤及び／又は殺真菌剤を更に含む、請求項１〜３９の何れか一項に記載の接種組成物。
41. 少なくとも１種のリン酸可溶化微生物を更に含む、請求項１〜４０の何れか一項に記載の接種組成物。
42. 前記リン酸可溶化微生物が、少なくとも１種のペニシリウム（Penicillium）属真菌株を含む、請求項４１に記載の接種組成物。
43. 前記リン酸可溶化微生物が、少なくとも１種のペニシリウム・ビライエ（Penicillium bilaiae）菌株を含む、請求項４１に記載の接種組成物。
44. 前記ペニシリウム・ビライエ（Penicillium bilaiae）菌株が、
    受託番号NRRL 50162の菌株、
    受託番号NRRL 50169の菌株、
    受託番号ATCC 20851の菌株、
    受託番号ATCC 22348の菌株、及び／又は
    受託番号ATCC 18309の菌株
    を含む、請求項４３に記載の接種組成物。
45. 前記リン酸可溶化微生物が、少なくとも１種のペニシリウム・ガエストリボラス（Penicillium gaestrivorus）菌株を含む、請求項４１〜４３の何れか一項に記載の接種組成物。
46. 前記ペニシリウム・ガエストリボラス（Penicillium gaestrivorus）菌株が、受託番号NRRL 50170の菌株を含む、請求項４５に記載の接種組成物。
47. 前記リン酸可溶化微生物が、少なくとも１種のストレプトミセス（Streptomyces）属菌株を含む、請求項４１に記載の接種組成物。
48. 請求項１〜４７の何れか一項に記載の接種組成物を含むコーディングで被覆された種子。
49. 前記種子がマメ科作物の種子である、請求項４８に記載の種子。
50. 前記種子が非マメ科作物の種子である、請求項４８に記載の種子。
51. 前記種子が大豆（soybean）の種子である、請求項４８に記載の種子。
52. 前記種子がエンドウ豆（pea）の種子である、請求項４８に記載の種子。
53. 前記種子がレンズ豆（lentil）の種子である、請求項４８に記載の種子。
54. 前記種子が豆（bean）の種子である、請求項４８に記載の種子。

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