JP2018009025A - 競合的且つ有効な細菌株 - Google Patents
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Abstract
Description
リゾビウム(Rhizobium)の運動性及び走化性は、菌株の競合性との関連で重要な属性であることが知られている。例えば、Althabegoiti, et al., 2008, FEMS Microbiol. Lett. 282: 115-123(非特許文献2)は、USDA 110の自然発生突然変異菌株であって、野生型菌株と比べて運動性を向上させ、根粒形成能を改善した菌株を得たことを記載する。更に、Maier, et al., 1990, Appl. Environ. Microbiol. 56 (8): 2341-2346(非特許文献3)は、生物窒素固定プロセスにおけるモリブデンの役割について論じる。 更に、Alves, et al., 2003, Plant and Soil 252: 1-9(非特許文献4)は、ブラジルで用いられている大豆接種材料と、有効な窒素固定に対する競合性の重要性について論じる。最後に、Bloem, J.F., et al., 2001, Bio Fertil. Soils 33: 181-189(非特許文献5)は、菌株の選択における競合性の重要性を報告する。本研究では、研究者らは菌株間の競合性を決定する手段として、遺伝子工学による手法を用いて、レポーター遺伝子(GUS)をインデックス菌株に導入した(Bloem et al., 2001)。彼らが実施した実験(Bloem et al., 2001)では、化学染色及び顕微鏡技術の全面的な使用が必要であったように、本報告の方法は、微生物の大標本をスクリーニングする非現実的な方策の域を出ないものであった。
a.植物へのコロニー形成の競合性。
b.増強された植物成長促進効果。
但し、改善対象となる特性は、これらに限定されるものではない。
受託番号NRRL B-50592(別途 NRRL B-59571としても受託)の菌株;
受託番号NRRL B-50593(別途 NRRL B-59572としても受託)の菌株;
受託番号NRRL B-50586(別途 NRRL B-59565としても受託)の菌株;
受託番号NRRL B-50588(別途 NRRL B-59567としても受託)の菌株;
受託番号NRRL B-50587(別途 NRRL B-59566としても受託)の菌株;
受託番号NRRL B-50589(別途 NRRL B-59568としても受託)の菌株;
受託番号NRRL B-50591(別途 NRRL B-59570としても受託)の菌株;
受託番号NRRL B-50590(別途 NRRL B-59569としても受託)の菌株;
受託番号NRRL B-50594(別途 NRRL B-50493としても受託)の菌株;
受託番号NRRL B-50726の菌株;
受託番号NRRL B-50727の菌株;
受託番号NRRL B-50728の菌株;
受託番号NRRL B-50729の菌株;及び
受託番号NRRL B-50730の菌株、又は
上記寄託菌株のうち少なくとも2以上の菌株。
a.植物へのコロニー形成の競合性の亢進;及び
b.植物成長の促進効果の亢進
を挙げることができるが、但しそれらだけには限定されない。
a.土壌サンプルから細菌株を得ること;
b.前記再菌株及び市販菌株を、マメ科植物に供給すること;
c.マメ科植物の根粒を占有するために市販菌株よりもより競合性である細菌株を選択すること;
d.マメ科植物の根粒を占有するために市販菌株よりもより競合性である選択された菌株を、マメ科植物成長の促進効果の亢進のそれらの菌株について分析すること:及び
e.マメ科植物成長の促進効果の亢進を有する細菌株を単離することを包含する。
受託番号NRRL B-50592の菌株(また、NRRL B-59571としても寄託された);
受託番号NRRL B-50593の菌株;(また、NRRL B-59572としても寄託された)
受託番号NRRL B-50586の菌株;(また、NRRL B-59565としても寄託された)
受託番号NRRL B-50588の菌株;(また、NRRL B-59567としても寄託された)
受託番号NRRL B-50587の菌株;(また、NRRL B-59566としても寄託された)
受託番号NRRL B-50589の菌株;(また、NRRL B-59568としても寄託された)
受託番号NRRL B-50591の菌株;(また、NRRL B-59570としても寄託された)
受託番号NRRL B-50590の菌株;(また、NRRL B-59569としても寄託された)
受託番号NRRL B-50594の菌株;(また、NRRL B-50493としても寄託された)
受託番号NRRL B-50726の菌株;
受託番号NRRL B-50727の菌株;
受託番号NRRL B-50728の菌株;
受託番号NRRL B-50729の菌株;及び
受託番号NRRL B-50730の菌株、又は上記寄託された菌株のうち少なくとも2以上(2も含む)、例えば上記菌株のうち少なくとも3、上記菌株のうち少なくとも4、上記菌株のうち少なくとも5、上記菌株のうち少なくとも6、上記菌株のうち少なくとも7、上記菌株のうち少なくとも8、上記菌株のうち少なくとも9、上記菌株のうち少なくとも10、上記菌株のうち少なくとも11、上記菌株のうち少なくとも12、上記菌株のうち少なくとも13、上記菌株のうちすべて以下(すべても含む)の組合せから成る群から選択されるブラディリゾビウム・ジャポニウム(Bradyrhizobia japonicum)の培養物を単離することを包含する。
本発明は、本発明の単離細菌株又は上記寄託された菌株のうち少なくとも2つ以上、例えば上記菌株のうち少なくとも3、上記菌株のうち少なくとも4、上記菌株のうち少なくとも5、上記菌株のうち少なくとも6、上記菌株のうち少なくとも7、上記菌株のうち少なくとも8、上記菌株のうち少なくとも9、上記菌株のうち少なくとも10、上記菌株のうち少なくとも11、上記菌株のうち少なくとも12、上記菌株のうち少なくとも13、上記菌株のうちすべてまで(すべても包含する)の組合せの少なくとも1つと、農薬学的に適切な担体とを含む組成物を包含する。
本発明の方法は、少なくとも1つの単離菌株及び/又は少なくとも1つの単離菌株を含む組成物を、種子、苗、根、植物、土壌又はそれらの組合せに施用するための処理段階を包含する。用語、「処理する(treating)」又は「処理(treatment)」とは、本明細書において及び当業界において使用される場合、植物へのコロニー形態の競合性及び植物成長の促進効果を亢進するのに有効量の処理組成物又は成分と種子、苗、根又は植物との接触をもたらすいずれかの施用を意味する。
本発明は、下記から成る群から選択されたブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobia japonicum)菌株の生物学的に純粋な培養物に向けられる:
受託番号NRRL B-50592の菌株(また、NRRL B-59571としても寄託された);
受託番号NRRL B-50593の菌株;(また、NRRL B-59572としても寄託された)
受託番号NRRL B-50586の菌株;(また、NRRL B-59565としても寄託された)
受託番号NRRL B-50588の菌株;(また、NRRL B-59567としても寄託された)
受託番号NRRL B-50587の菌株;(また、NRRL B-59566としても寄託された)
受託番号NRRL B-50589の菌株;(また、NRRL B-59568としても寄託された)
受託番号NRRL B-50591の菌株;(また、NRRL B-59570としても寄託された)
受託番号NRRL B-50590の菌株;(また、NRRL B-59569としても寄託された)
受託番号NRRL B-50594の菌株;(また、NRRL B-50493としても寄託された)
受託番号NRRL B-50726の菌株;
受託番号NRRL B-50727の菌株;
受託番号NRRL B-50728の菌株;
受託番号NRRL B-50729の菌株;及び
受託番号NRRL B-50730の菌株。
次の生物材料は、American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20108, USA, 及びthe Microbial Genomics and Bioprocessing Research Unit (NRRL) National Center for Agricultural Utilization Research 1815 N. University Street, Peoria, IL 61604, USAに、ブダペスト条約下で寄託されており、そして次の受託番号を付与された:
培地
YEM寒天 (YEMA): (10 g/Lの D-マンニトール; 0.50 g/L のOxoid 酵母抽出物; 0.10 g/Lの NaCl; 0.50 g/L のK2HPO4; 0.20 g/Lの MgSO4・7H2O; 12.0 g/Lの寒天; pH≒6.8)。液体YEM: (10 g/L のD-マンニトール; 0.50 g/L のOxoid酵母抽出物; 0.10 g/Lの NaCl; 0.50 g/Lの K2HPO4; 0.20 g/Lの MgSO4・7H2O; pH≒6.8)。
プレート上で増殖された菌株に関しては、プレートからの個々の菌株の1μlループを、Applied Biosystemsからの100μlのPrepMan(登録商標)Ultra DNA単離溶液にそれぞれ添加した。その溶液を100℃に10分間、加熱した。単離DNAをPCR分析のために使用した。
ポリメラーゼ鎖反応(PCR)を、Applied Biosystems Veriti(登録商標)96−ウェルFast Thermal Cyclerを用いて実施した。PCRは、個々の菌株に対して設定された。2μlのDNAを、0.5μlの3′プライマー、0.5μlの5′プライマー、0.5μlのTaq Polymerase (New England Biolabs, Inc.)及び21.5μlのPlatinum Blue PCR Supermix(登録商標) (Invitrogen)に添加した。PCR混合物を94℃まで4分間、加熱した。変性に続いて、PCRを次のプログラムを用いて35サイクル、実施した:94℃、1分、68℃又はプライマーアニーリング依存性温度、1分、及び72℃で1分の反応拡張。PCRプログラムの完結の後、5μlのPCR混合物を、Lonza(登録商標)FlashGel(登録商標)システム上で実行した。
菌株を単離するために、根粒を、10%家庭用漂白剤により2分間、表面殺菌した。根粒を無菌水によりすすぎ、そして次に、250μlの無菌水を含む微小遠心管に配置した。根粒を、無菌爪楊枝により粉砕し、そして根粒菌(Rhizobium)株を水中に開放した。2×10μlループの水を、単一コロニーのためにYEMAプレート上に画線培養した。すべてのプレートをパラフィン(登録商標)により包み、そしてEppendorf Innova(登録商標)42Rインキュベーター中で30℃で増殖した。増殖時間は、単離物ごとに異なった。
菌株を、主として、2種の異なったプロトコル、すなわち「大豆畑土壌プロトコル(Soybean Field Soil Protocol)(USDA 532C Treated Field)」及び「未処理(対照)フィールドプロトコル(Untreated (control)Field Protocol)」によりスクリーニングした。個々のプロトコルを記載する。
USDA 532Cによりコーティングされた大豆種子を、米国中の大豆産地、例えばサウスダコタ、ノースダコタ、ジョージア、アイオワ、ネバラスカ、イリノイ、インディアナ、テキサス、カンザス、ミネソタ州、等を通して種々の土壌に植えた。ブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobium japonicum)菌株USPA 532Cにより処理された大豆種を、それらの土壌で成長せしめ、収穫し、そして大豆根粒を、PCR分析により直接的に分析した。40個の根粒を、個々の土壌サンプルから集めた。個々の大豆根粒からのDNAを、前記方法(材料及び方法:DNA単離プロトコルを参照)に基づいて、根粒から直接的に単離した。
根粒を、USDA 532Cにより処理されていない、次の州の大豆畑から得た:アラスカ、ジョージア、イリノイ、インディアナ、アイオワ、オクラホマ、ネバラスカ、カンザス、ミズリー及びテキサス州。ブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobia japonicum)菌株を、前記プロトコル(材料及び方法:菌株単離プロトコル)に従って、それらの根粒から直接的に得た。単離された菌株を、「競争研究プロトコル」(材料及び方法:競争研究プロトコルを参照)に従って、ブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobia japonicum)菌株USDA 532Cとの直接的競争にゆだねた。ブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobia japonicum)菌株USDA 532Cに比較される場合、大豆根粒の70%以上占有する単離菌株を、性能評価(材料及び方法:性能研究プロトコルを参照)のために選択した。
光学密度を測定した(Nanodrop(登録商標)ND1000分光光度計)。USDA 532C:個々の単離菌株の1:1の接種比を得た。USDA 532Cを、600nmで0.5の光学密度まで希釈するか又は濃縮し、そして0.5mlのUSDA 532C接種物を、個々の単離物のために確保した。すべて単離菌株を、次の計算を用いて、600nmで0.5の光学密度まで濃縮するか又は希釈した:(0.5の光学密度のUSDA 532C)×(0.5mlのUSDA 532C)=(単離菌株の光学密度)×(単離菌株ml)。0.5mlのUSDA 532Cを、別々の処理として0.5mlの個々の単離物に添加した。大豆種子を、12個の大豆種子当たり0.5mlの接種混合物の割合で、接種混合物によりコーティングした。種子を30分間、吸収を可能にした。12の処理された大豆種子のうち5個を、1ガロンのポット中のFafard(登録商標)3Bポッティング混合物に植えた。手袋を着用し、種子を植え、そして処理間で交換した。植えた後、7個の残る処理された大豆種子を捨てた。
性質研究は、単一の単離菌株と市販のブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobia japonicum)菌株USDA 532Cとの間の直接的菌株〜菌株性能比較である。単離菌株及び対照菌株(ブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobia japonicum)菌株USDA 532C)を、別々のYENAプレート上に同時に画線培養した。単離菌株及び対照菌株を別々に、50mlのYEM液体培地中に接種し、個々の接種管(Nanodrop(登録商標)ND1000 分光光度計)において600nmで0.03の初期光学密度を得た。単離菌株及び対照菌株を別々に、30℃で30日間インキュベートした。インキュベーションに続いて、単離菌株及び対照菌株についての接種物を、個々の接種管(Nanodrop(登録商標)ND1000 分光光度計)において600nmで0.5の最終光学密度まで、さらに希釈するか又は濃縮し、試験処理物(単離菌株)及び対照処理物(対照菌株ブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobia japonicum)菌株USDA 532C)を得た。
単離ブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobia japonicum)菌株を、YEMAプレート(10 g/Lの D-マンニトール; 0.50 g/L のOxoid酵母抽出物; 0.10 g/Lの NaCl; 0.50 g/Lの K2HPO4; 0.20 g/Lの MgSO4・7H2O; 12.0 g/L の寒天; pH≒6.8)上に画線培養し、そしてそれぞれ30℃及び35℃で7日間インキュベートした。単離菌株を、単離コロニーを増殖するそれらの能力について分析した。
単離ブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobia japonicum)菌株を、1mMのグリホサート及び2mMのグリホサートのYEMAプレート(10 g/Lの D-マンニトール; 0.50 g/L のOxoid酵母抽出物; 0.10 g/Lの NaCl; 0.50 g/Lの K2HPO4; 0.20 g/Lの MgSO4・7H2O; 12.0 g/L の寒天; pH≒6.8)上に画線培養した。プレートを30℃で7日間インキュベートし、そして菌株を、単離コロニーを増殖するそれらの能力について分析した。
単離ブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobia japonicum)菌株を、ゲンタマイシン(50mg/L)YEMA、クロラムフェニコール(50mg/L)YEMA、ポリミキシンB(100mg/L)YEMA、カルベニシリン(100mg/L)YEMA、ネオマイシン(50mg/L)YEMA及びナリジクス酸(50mg/L)YEMA上にT−画線培養した。プレートを30℃で7日間インキュベートし、そして菌株を、単離コロニーを増殖するそれらの能力について分析した。
Diversilab(登録商標)PCRを、BioMerieuxからのDiversilab Pseudomonas Kit(登録商標)を用いて設定した。このキットは、複数のDNA増幅のフィンガープリントを生成するためにゲノムの種々の部分を増幅するよう企画された独自のプライマーを含んだ。個々の菌株はユニークフィンガープリントを有し、そして菌株間の%類似性は、Diverilabソフトウェアを用いて測定することができる。
市販のブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobia japonicum)菌株USDA 532Cについてのユニークプライマー企画
遺伝的同定方法を開発し、フィールドにおける生来の菌株に対する市販ブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobia japonicum)菌株USDA 532Cの競合性を評価した。USDA 523Cに対して特異的なプライマーを同定し、そしてPCR技法を用いて、フィールドにおけるUSDA 532Cの競合性を効果的に評価した。
配列番号1 - P209p5-TTGGGTTGAGCATGCCCACCCGGACGG、
配列番号2 - P209p3-gtctcagttgccgagcccacggcgc
25のプライマーを、USDA 532Cの陽性同定について個々に試験した。さらに、プライマーを、比較のためにUSDA 532C及びB.ジャポリクム(B. japonicum)の5種の異なった生来の菌株(P152、Br173、Br187、P190及びP194)を用いて、PCRによりUSDA 532C特異性について試験した。ゲノム配列決定は、Br187及びUSDA 532Cが遺伝的に同じであることを示した。
新規菌株の分析及び単離
プライマー209をマーカーとして使用し、大豆植物の根粒へのブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobia japonicum)菌株USDA 532Cによるコロニー形成の有無を示した。プライマー209の存在を示すバンド(すなわち、0.9kbのバンド)は、ブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobia japonicum)菌株USDA 532Cの陽性同定を表す。図2Aを参照。図2Aは、ブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobia japonicum)菌株USDA 532Cが、他の生来の根粒菌株(Rhizobial strains)に比較される場合、大豆植物根粒のコロニー形成のための優性的競争菌株である場合の例示である。図2Bにおいては、プライマー209についての陽性同定及び従って、ブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobia japonicum)菌株USDA 532Cの存在を示すバンド数が、図2Aにおけるプライマー209のために存在するバンド総数に比較して、低められる。図2A及び図2Bは、プライマーの有無が、USDA 532Cが大豆植物の根粒における優性的競争菌株であるかどうかを決定するために使用され得ることを示す。
接戦(head-to-head)競争評価
すべての単離された菌株は、根粒コロニー形成能力の点で、ブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobia japonicum)菌株USDA 532Cに対する単離物の競合性を直接的に問題にするよう企画されたスクリーニングプログラム中に置かれた(材料及び方法:競争研究プロトコルを参照)。
性能評価
性能研究は、USDA 532Cに対する単離菌株の直接的な菌株対菌株比較である。増強された性能は、鞘乾燥重量(g)の関数として測定される。材料及び方法:性能研究プロトコルを参照。結果は、表3A−3Dに提供される。
特性研究
さらに、単離ブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobia japonicum)菌株を、温度、グリホサート耐性及び抗生物質プロフィールに基づいて特徴づけた(材料及び方法:温度プロフィール、グリホサート耐性プロフィール及び抗生物質プロフィールプロトコルを参照)。結果は表4に提供される。
DNAフィンガープリント開発
最高の特性を有する単離物を、DNA Diversilab(登録商標)フィンガープリント分析に供した(材料及び方法:Diversilab(登録商標)PCRプロトコルを参照)。DNAを、既報の方法(材料及び方法:DNA単離プロトコルを参照)に従って個々の菌株から単離した。単離DNAをPCR分析に使用した。
[項1]
受託番号NRRL B-50592の菌株;
受託番号NRRL B-50593の菌株;
受託番号NRRL B-50586の菌株;
受託番号NRRL B-50588の菌株;
受託番号NRRL B-50587の菌株;
受託番号NRRL B-50589の菌株;
受託番号NRRL B-50591の菌株;
受託番号NRRL B-50590の菌株;
受託番号NRRL B-50594の菌株;
受託番号NRRL B-50726の菌株;
受託番号NRRL B-50727の菌株;
受託番号NRRL B-50728の菌株;
受託番号NRRL B-50729の菌株;及び
受託番号NRRL B-50730の菌株
からなる群より選択されるブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobia japonicum)の生物学的に純粋な培養物。
[項2]
前記菌株が植物における窒素固定を促進し得る、項1に記載のブラディリゾビウム(Bradyrhizobium)菌株。
[項3]
前記菌株が実質的に35℃の温度での生育に耐性を有する、項1又は2に記載のブラディリゾビウム(Bradyrhizobium)菌株。
[項4]
前記菌株が:
受託番号NRRL B-50591の菌株;
受託番号NRRL B-50589の菌株;
受託番号NRRL B-50586の菌株;
受託番号NRRL 50594の菌株;及び
前記菌株のうちの少なくとも2以上の組み合わせ
からなる群より選択される、項1〜3の何れかに記載のブラディリゾビウム(Bradyrhizobium)菌株。
[項5]
前記ブラディリゾビウム(Bradyrhizobium)菌株が天然でグリホサートに耐性を有する、項1〜4の何れかに記載のブラディリゾビウム(Bradyrhizobium)菌株。
[項6]
前記菌株が:
受託番号NRRL B-50590の菌株;
受託番号NRRL B-50594の菌株;及び
前記菌株のうちの少なくとも2以上の組み合わせ
からなる群より選択される、項1〜5の何れかに記載のブラディリゾビウム(Bradyrhizobium)菌株。
[項7]
前記菌株による植物へのコロニー形成の競合性(competitiveness for colonizing a plant)が亢進されてなる、項1〜6の何れかに記載のブラディリゾビウム(Bradyrhizobium)菌株。
[項8]
前記菌株による植物成長の促進効果(effectiveness at promoting plant growth)が亢進されてなる、項1〜7の何れかに記載のブラディリゾビウム(Bradyrhizobium)菌株。
[項9]
亢進された競合性が、少なくとも51%の根粒占有率、例えば、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の根粒占有率を含む、項1〜8の何れかに記載のブラディリゾビウム(Bradyrhizobium)菌株。
[項10]
植物成長の促進効果の亢進が、市販菌株(例えばUSDA 532C等)と比較した場合に、ブッシェル(bushels)/エーカー(acre)単位で測定される植物収率の向上、果実数の増加、根数の増加、根長の延長、根量の増大、根体積の増大、葉面積の拡大、植物群生の拡大、植物の活力増進、及び/又は、窒素(N2)固定能の向上のうち少なくとも1つを含む、項1〜9の何れかに記載のブラディリゾビウム(Bradyrhizobium)菌株。
[項11]
大豆成長の促進効果の亢進が、市販菌株(例えば市販菌株USDA 532C等)に供した大豆植物の大豆鞘の総乾燥重量と比較した場合における、大豆植物の大豆鞘の総乾燥重量の増加を含む、項1〜10の何れかに記載のブラディリゾビウム(Bradyrhizobium)菌株。
[項12]
受託番号NRRL B-50592の菌株;
受託番号NRRL B-50593の菌株;
受託番号NRRL B-50586の菌株;
受託番号NRRL B-50588の菌株;
受託番号NRRL B-50587の菌株;
受託番号NRRL B-50589の菌株;
受託番号NRRL B-50591の菌株;
受託番号NRRL B-50590の菌株;
受託番号NRRL B-50594の菌株;
受託番号NRRL B-50726の菌株;
受託番号NRRL B-50727の菌株;
受託番号NRRL B-50728の菌株;
受託番号NRRL B-50729の菌株;
受託番号NRRL B-50730の菌株;及び
前記菌株のうちの少なくとも2以上の組み合わせ
からなる群より選択されるブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobia japonicum)の菌株と、農薬学的に適切な担体とを含む組成物。
[項13]
前記組成物が、1又は2以上のシグナル分子を含む、項12に記載の組成物。
[項14]
植物シグナル分子が、脂肪キトオリゴ糖(LCO)である、項13に記載の組成物。
[項15]
LCOが合成である、項13又は14に記載の組成物。
[項16]
LCOが組換である、項13〜15の何れかに記載の組成物。
[項17]
LCOが天然である、項13〜16の何れかに記載の組成物。
[項18]
LCOが、リゾビウム(Rhizobium)種、ブラディリゾビウム(Bradyrhizobium)種、シノリゾビウム(Sinorhizobium)種、及びアゾリゾビウム(Azorhizobium)種から選択されるリゾビウム属(Rhizobia)の種から得られる、項13〜17の何れかに記載の組成物。
[項19]
LCOがブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobium japonicum)から得られる、項13〜18の何れかに記載の組成物。
[項20]
LCOがアーバスキュラー菌根菌(arbuscular mycorrhizal fungus)から得られる、項13〜19の何れかに記載の組成物。
[項21]
植物シグナル分子がキチン性化合物である、項13に記載の組成物。
[項22]
キチン性化合物がキト−オリゴマー(CO)である、項22に記載の組成物。
[項23]
COが合成である、項21又は22に記載の組成物。
[項24]
COが組換である、項21〜23の何れかに記載の組成物。
[項25]
COが天然である、項21〜24の何れかに記載の組成物。
[項26]
植物シグナル分子がフラボノイドである、項13に記載の組成物。
[項27]
植物シグナル分子がジャスモン酸又はその誘導体である、項13に記載の組成物。
[項28]
植物シグナル分子がリノール酸又はその誘導体である、項13に記載の組成物。
[項29]
植物シグナル分子がリノレン酸又はその誘導体である、項13に記載の組成物。
[項30]
植物シグナル分子がカリキンである、項13に記載の組成物。
[項31]
組成物が少なくとも2種の異なる植物シグナル分子を含む、項12〜30の何れかに記載の組成物。
[項32]
組成物が少なくとも1つの農薬学的に有用な剤を含む、項12〜31の何れかに記載の組成物。
[項33]
農薬学的に有用な剤が除草剤、殺虫剤又は殺真菌剤である、項32に記載の組成物。
[項34]
農薬学的に有用な剤が、少なくとも1つのリン酸可溶化微生物である、項33に記載の組成物。
[項35]
少なくとも1つのリン酸可溶化微生物が、ペニシリウム(Penicillium)属の真菌株を含む、項34に記載の組成物。
[項36]
少なくとも1つのリン酸可溶化微生物が、P.ビライエ(P. bilaiae)の菌株を含む、項35に記載の組成物。
[項37]
P.ビライエ(P. bilaiae)の菌株が、NRRL 50162、NRRL 50169、ATCC 20851、ATCC 22348及びATCC 18309からなる群より選択される、項36に記載の組成物。
[項38]
少なくとも1つのリン酸可溶化微生物が、P.ゲストリボラス(P. gaestrivorus)の菌株を含む、項34に記載の組成物。
[項39]
P.ゲストリボラス(P. gaestrivorus)の菌株が、NRRL 50170である、項38に記載の組成物。
[項40]
ブラディリゾビウム(Bradyrhizobium)及びリゾビウム(Rhizobium)からなる属から選択される細菌株であって、マメ科植物へのコロニー形成の競合性(competitiveness for colonizing a leguminous plant)、及び、マメ科植物の成長促進効果(effectiveness at promoting leguminous plant growth)が亢進された細菌株を単離する方法であって:
a.土壌サンプルから細菌株を取得し;
b.前記細菌株及び市販の菌株(例えば市販菌株USDA 532C)をマメ科植物に供し;
c.前記細菌株から、マメ科植物の根粒の占有性に基づいて、前記市販の菌株よりも高い競合性を有する細菌株を選択し;
d.選択された、マメ科植物の根粒の占有性について前記市販の菌株よりも高い競合性を有する細菌株において、マメ科植物成長の促進効果が亢進されているかを分析し;
e.マメ科植物成長の促進効果が亢進されている細菌株を単離する
ことを含む方法。
[項41]
前記細菌株がブラディリゾビウム(Bradyrhizobium)の菌株である、項40に記載の単離細菌株。
[項42]
前記ブラディリゾビウム(Bradyrhizobium)菌株が、ブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobium japonicum)菌株である、項41に記載の単離細菌株。
[項43]
前記菌株が:
受託番号NRRL B-50592の菌株;
受託番号NRRL B-50593の菌株;
受託番号NRRL B-50586の菌株;
受託番号NRRL B-50588の菌株;
受託番号NRRL B-50587の菌株;
受託番号NRRL B-50589の菌株;
受託番号NRRL B-50591の菌株;
受託番号NRRL B-50590の菌株;
受託番号NRRL B-50594の菌株;
受託番号NRRL B-50726の菌株;
受託番号NRRL B-50727の菌株;
受託番号NRRL B-50728の菌株;
受託番号NRRL B-50729の菌株;
受託番号NRRL B-50730の菌株;及び
前記菌株のうちの少なくとも2以上の組み合わせ
からなる群より選択されるブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobia japonicum)菌株である、項41又は42に記載の単離細菌株。
[項44]
単離ブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobia japonicum)菌株が、植物における窒素固定を促進し得る、項41〜43の何れかに記載の方法。
[項45]
単離ブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobia japonicum)菌株が、実質的に35℃の温度での生育に耐性を有する、項41〜44の何れかに記載の方法。
[項46]
単離ブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobia japonicum)菌株が:
受託番号NRRL B-50591の菌株;
受託番号NRRL B-50589の菌株;
受託番号NRRL B-50586の菌株;
受託番号NRRL 50594の菌株;及び
前記菌株のうちの少なくとも2以上の組み合わせ
からなる群より選択される、項45に記載の方法。
[項47]
ブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobia japonicum)菌株が、天然でグリホサートに対する耐性を有する、項40〜46の何れかに記載の方法。
[項48]
単離ブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobia japonicum)菌株が:
受託番号NRRL B-50590の菌株;
受託番号NRRL B-50594の菌株;及び
前記菌株のうちの少なくとも2以上の組み合わせ
からなる群より選択される、項47に記載の方法。
[項49]
植物成長を促進する方法であって、種子、苗、根、植物、土壌、又はこれらの組み合わせを、項1〜39の何れかに記載の組成物で処理することを含む方法。
[項50]
種子、苗、根、又は植物がマメ科である、項49に記載の方法。
[項51]
種子、苗、根、又は植物が、大豆の種子、苗、根、又は植物である、項50に記載の方法。
[項52]
組成物を土壌に対して、1ヘクタール当たり1×108〜1×1013コロニー形成単位、好ましくは1ヘクタール当たり2×1011〜6×1011コロニー形成単位となるように加える、請求項49〜51の何れか一項に記載の方法。
[項53]
前記組成物を、種子1つ当たり1×102〜1×108、好ましくは1×104〜1×105コロニー形成単位を含む種子コーティングとして導入する、請求項49〜52の何れか一項に記載の方法。
Claims (54)
- ブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobia japonicum)菌株の生物学的に純粋な培養物と、農薬学的に適切な担体とを含む、種子の被覆に適した接種組成物であって、
前記菌株が、
受託番号NRRL B-50592の菌株;
受託番号NRRL B-50593の菌株;
受託番号NRRL B-50586の菌株;
受託番号NRRL B-50588の菌株;
受託番号NRRL B-50587の菌株;
受託番号NRRL B-50589の菌株;
受託番号NRRL B-50591の菌株;
受託番号NRRL B-50590の菌株;
受託番号NRRL B-50594の菌株;
受託番号NRRL B-50726の菌株;
受託番号NRRL B-50727の菌株;
受託番号NRRL B-50728の菌株;
受託番号NRRL B-50729の菌株;及び
受託番号NRRL B-50730の菌株
からなる群より選択される少なくとも1種である、接種組成物。 - 前記菌株が実質的に35℃の温度での生育に耐性を有する、請求項1に記載の接種組成物。
- 前記菌株が1.0mMのグリフォサートの存在下での生育に耐性を有する、請求項1又は2に記載の接種組成物。
- 前記菌株が2.0mMのグリフォサートの存在下での生育に耐性を有する、請求項1又は2に記載の接種組成物。
- 前記菌株が50mg/Lのナリジクス酸の存在下での生育に耐性を有する、請求項1〜4の何れか一項に記載の接種組成物。
- 前記菌株による植物へのコロニー形成能の競合性が、菌株USDA532Cと比較して亢進されてなる、請求項1〜5の何れか一項に記載の接種組成物。
- 前記競合性の亢進が、少なくとも51%の根粒占有率を含む、請求項6に記載の接種組成物。
- 前記菌株による植物の成長促進効果が、菌株USDA532Cと比較して亢進されてなる、請求項1〜5の何れか一項に記載の接種組成物。
- 前記成長促進効果が、菌株USDA532Cとの比較における、ブッシェル(bushels)/エーカー(acre)単位で測定される植物収率の向上、果実数の増加、根数の増加、根長の延長、根量の増大、根体積の増大、葉面積の拡大、植物群生の拡大、植物の活力増進、及び/又は、窒素(N2)固定能の向上のうち少なくとも1つを含む、請求項8に記載の接種組成物。
- 前記植物が大豆であり、前記成長促進効果が、菌株USDA532Cで処理した大豆植物の大豆鞘の総乾燥重量との比較における、大豆植物の大豆鞘の総乾燥重量の増加を含む、請求項8に記載の接種組成物。
- 前記菌株が、
受託番号NRRL B-50591の菌株、
受託番号NRRL B-50589の菌株、
受託番号NRRL B-50586の菌株、及び/又は
受託番号NRRL B-50594の菌株
を含む、請求項1〜10の何れか一項に記載の接種組成物。 - 前記菌株が、
受託番号NRRL B-50590の菌株、及び/又は
受託番号NRRL B-50594の菌株
を含む、請求項1〜11の何れか一項に記載の接種組成物。 - 前記菌株が、
受託番号NRRL B-50728の菌株;
を含む、請求項1〜12の何れか一項に記載の接種組成物。 - 少なくとも1種のシグナル分子を更に含む、請求項1〜13の何れか一項に記載の接種組成物。
- 前記シグナル分子が、少なくとも1種の脂肪キトオリゴ糖(LCO)を含む、請求項14に記載の接種組成物。
- 前記LCOが、少なくとも1種の合成LCOを含む、請求項15に記載の接種組成物。
- 前記LCOが、少なくとも1種の組換LCOを含む、請求項15又は16に記載の接種組成物。
- 前記LCOが、少なくとも1種の天然LCOを含む、請求項15〜17の何れか一項に記載の接種組成物。
- 前記LCOが、アゾリゾビウム(Azorhizobium)、ブラディリゾビウム(Bradyrhizobium)、メゾリゾビウム(Mesorhizobium)、リゾビウム(Rhizobium)、及び/又はシノリゾビウム(Sinorhizobium)に由来する少なくとも1種のLCOを含む、請求項15〜18の何れか一項に記載の接種組成物。
- 前記LCOが、ブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyrhizobium japonicum)菌株に由来する少なくとも1種のLCOを含む、請求項15〜19の何れか一項に記載の接種組成物。
- 前記LCOが、シノリゾビウム・メリロチ(Sinorhizobium meliloti)菌株に由来する少なくとも1種のLCOを含む、請求項15〜20の何れか一項に記載の接種組成物。
- 前記LCOが、リゾビウム・レグミノサルム(Rhizobium leguminosarum)菌株に由来する少なくとも1種のLCOを含む、請求項15〜21の何れか一項に記載の接種組成物。
- 前記LCOが、菌根菌(mycorrhizal fungus)菌株に由来する少なくとも1種のLCOを含む、請求項15〜22の何れか一項に記載の接種組成物。
- 前記LCOが、グロムス門(Glomeromycota)菌株に由来する少なくとも1種のLCOを含む、請求項15〜23の何れか一項に記載の接種組成物。
- 前記LCOが、グロムス・イントララジカス(Glomus intraradicus)菌株に由来する少なくとも1種のLCOを含む、請求項15〜24の何れか一項に記載の接種組成物。
- 前記LCOが、10-5〜10-14モル濃度で存在する、請求項15〜26の何れか一項に記載の接種組成物。
- 前記LCOが、10-5〜10-11モル濃度で存在する、請求項15〜26の何れか一項に記載の接種組成物。
- 前記LCOが、10-7〜10-8モル濃度で存在する、請求項15〜26の何れか一項に記載の接種組成物。
- 前記シグナル分子が、少なくとも1種のキトオリゴ糖(CO)を含む、請求項14〜29の何れか一項に記載の接種組成物。
- 前記COが、10-5〜10-14モル濃度で存在する、請求項30に記載の接種組成物。
- 前記COが、10-5〜10-11モル濃度で存在する、請求項30の何れか一項に記載の接種組成物。
- 前記COが、10-7〜10-8モル濃度で存在する、請求項30の何れか一項に記載の接種組成物。
- 前記シグナル分子が、少なくとも1種のキチン性化合物を含む、請求項14〜33の何れか一項に記載の接種組成物。
- 前記キチン性化合物が、キチンを含む、請求項34に記載の接種組成物。
- 前記キチン性化合物が、キトサンを含む、請求項34又は35に記載の接種組成物。
- 前記シグナル分子が、少なくとも1種のフラボノイドを含む、請求項14〜36の何れか一項に記載の接種組成物。
- 前記フラボノイドが、ゲニステイン(genistein)を含む、請求項37に記載の接種組成物。
- 前記シグナル分子が、ジャスモン酸又はその塩、リノール酸又はその塩、リノレン酸又はその塩、及び/又は、カリキンを含む、請求項14〜38の何れか一項に記載の接種組成物。
- 少なくとも1種の除草剤、殺虫剤及び/又は殺真菌剤を更に含む、請求項1〜39の何れか一項に記載の接種組成物。
- 少なくとも1種のリン酸可溶化微生物を更に含む、請求項1〜40の何れか一項に記載の接種組成物。
- 前記リン酸可溶化微生物が、少なくとも1種のペニシリウム(Penicillium)属真菌株を含む、請求項41に記載の接種組成物。
- 前記リン酸可溶化微生物が、少なくとも1種のペニシリウム・ビライエ(Penicillium bilaiae)菌株を含む、請求項41に記載の接種組成物。
- 前記ペニシリウム・ビライエ(Penicillium bilaiae)菌株が、
受託番号NRRL 50162の菌株、
受託番号NRRL 50169の菌株、
受託番号ATCC 20851の菌株、
受託番号ATCC 22348の菌株、及び/又は
受託番号ATCC 18309の菌株
を含む、請求項43に記載の接種組成物。 - 前記リン酸可溶化微生物が、少なくとも1種のペニシリウム・ガエストリボラス(Penicillium gaestrivorus)菌株を含む、請求項41〜43の何れか一項に記載の接種組成物。
- 前記ペニシリウム・ガエストリボラス(Penicillium gaestrivorus)菌株が、受託番号NRRL 50170の菌株を含む、請求項45に記載の接種組成物。
- 前記リン酸可溶化微生物が、少なくとも1種のストレプトミセス(Streptomyces)属菌株を含む、請求項41に記載の接種組成物。
- 請求項1〜47の何れか一項に記載の接種組成物を含むコーディングで被覆された種子。
- 前記種子がマメ科作物の種子である、請求項48に記載の種子。
- 前記種子が非マメ科作物の種子である、請求項48に記載の種子。
- 前記種子が大豆(soybean)の種子である、請求項48に記載の種子。
- 前記種子がエンドウ豆(pea)の種子である、請求項48に記載の種子。
- 前記種子がレンズ豆(lentil)の種子である、請求項48に記載の種子。
- 前記種子が豆(bean)の種子である、請求項48に記載の種子。
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