CN115418357A - 改良植物性状的方法及组合物 - Google Patents

Abstract

本申请涉及改良植物性状的方法及组合物。本文公开了增加非豆科植物中固氮的方法。所述方法可包括将所述植物暴露于多种细菌。多种细菌的每一个成员均包含引入到细菌固氮或同化遗传调节网络的一个或多个基因或非编码多核苷酸中的一种或多种遗传变异，使得所述细菌能够在外源氮的存在下固定大气氮。所述细胞并非属间微生物。此外，植物中的所述细菌在该植物中产生1％或更多的固定氮。

Description

改良植物性状的方法及组合物

本申请是申请日为2016年07月13日，申请号为201680052710.6， 发明名称为“改良植物性状的方法及组合物”的申请的分案申请。

交叉引用

本申请要求2015年7月13日提交的美国临时专利申请号 62/192,009和2015年9月2日提交的美国临时专利申请号62/213,567的 权益，两份申请各自均通过引用全部并入于此。

背景技术

植物是通过共享的代谢物组与微生物组联系起来的。特定作物性 状与潜在代谢物组之间的多维关系的特征在于具有许多局部极大值的景 象。通过改变微生物组对代谢物组的影响来将较差局部最大值优化到另 一个代表较佳性状的局部极大值可能由于各种原因(诸如，作物优化)是 可取的。需要农业和粮食生产的经济、环境及社会均可持续的方法来满 足日益增长的全球人口的需求。到2050年，联合国粮农组织(he United Nations’Food and Agriculture Organization)预计粮食总产量必须增加 70％才能满足日益增长的人口需求，而这种挑战又因许多因素而加剧， 其包括淡水资源减少、对耕地的竞争加剧、能源价格上涨，投入成本增 加，以及需要作物能够适应更干燥、更炎热以及更极端的全球气候的压 力。

一个值得关注的领域是固氮的改善。氮气(N₂)是地球大气的主要 部分。此外，元素氮(N)是构成生物体的许多化合物的重要组成部分。然 而，许多生物体不能利用N₂直接合成生理过程(如生长和繁殖)中使用的 化学物质。为了利用N₂，N₂必须与氢结合。氢与N₂的结合被称为固氮。 无论是化学固氮还是生物固氮，固氮都需要耗费大量的能源。在生物系统中，称为固氮酶的酶催化导致固氮的反应。固氮研究的一个重要目标 是将表型扩展到非豆科植物，特别是诸如小麦、稻和玉米等重要的农业 禾本科植物。尽管在了解根瘤菌与豆科植物之间的固氮共生关系的发展 方面取得了巨大进展，但是利用这一知识在非豆科作物上诱导固氮结节 的途径尚不清楚。同时，随着日益增长的粮食生产需求，提供充足的补充氮源(如肥料)的挑战将继续增加。

发明内容

鉴于上述情况，需要改良相关微生物组赋予的植物性状。本公开 解决了这个需要，并且还提供了额外的益处。在一些情况下，组成微生 物组的物种及其基础遗传学二者是调节微生物对代谢物组的影响的目标。

一方面，本公开提供了一种增加非豆科植物中固氮的方法，所述 方法包括将所述植物暴露于多种细菌，该多种细菌中的每一个成员均包 含引入到细菌固氮或同化遗传调节网络的一个或多个基因或非编码多核 苷酸的一种或多种遗传变异，使得所述细菌能够在外源氮的存在下固定 大气氮；其中所述细菌并非属间微生物；并且其中植物中(inplanta)的细 菌在植物中产生1％或更多的固定氮。

在一些实施方案中，植物中的所述细菌在植物中产生5％或更多的 固定氮。在一些实施方案中，植物中的所述细菌在植物中产生10％或更 多的固定氮。

在一些实施方案中，所述一种或多种遗传变异包含可操作地连接 至固氮或同化遗传调节网络的所述一个或多个基因的经引入的控制序列。 在进一步的实施方案中，该控制序列是启动子。在进一步的实施方案中， 该启动子是诱导型启动子。在一些实施方案中，所述细菌不包含可操作 地连接至固氮或同化遗传调节网络的基因的组成型启动子。在一些实施 方案中，该细菌不包含可操作地连接至nif基因簇中的基因的组成型启 动子。

在一些实施方案中，植物中的所述细菌排出固氮的含氮产物。在 一些实施方案中，暴露于植物的所述多种细菌不刺激外源非大气氮摄取 的增加。

在一些实施方案中，所述植物在每英亩施用约50lbs含氮肥料的 田间土壤中生长，并且其中所述含氮肥料包含按重量计至少5％的氮。 在进一步的实施方案中，该含氮肥料包含铵或含铵分子。在一些实施方 案中，外源氮选自包含谷氨酰胺、氨、铵、尿素、硝酸盐、亚硝酸盐、 含铵分子、含硝酸盐分子和含亚硝酸盐分子中的一种或多种的肥料。

在一些实施方案中，所述多种细菌包括至少两种不同种类的细菌。 在一些实施方案中，该多种细菌包括相同种类细菌的至少两种不同的菌 株。在一些实施方案中，该多种细菌来自包含肠杆菌属、拉恩氏菌属、 Kosakonia、伯克霍尔德氏菌属或克雷伯氏菌属的属。在一些实施方案中， 该多种细菌为肠杆菌属。在一些实施方案中，该多种细菌是内生植物的、 附生植物的或根际的。在一些实施方案中，该多种细菌在植物中定植 (colonize)，使得细菌以每克植物鲜重至少10⁵cfu存在于植物中。

在一些实施方案中，细菌固氮或同化遗传调节网络的所述一个或 多个基因或非编码多核苷酸选自：nifA、nifL、ntrB、ntrC、编码谷氨酰 胺合成酶的多核苷酸、glnA、glnB、glnK、drat、amtB、编码谷氨酰胺 酶的多核苷酸、glnD、glnE、nifJ、nifH、nifD、nifK、nifY、nifE、nifN、 nifU、nifS、nifV、nifW、nifZ、nifM、nifF、nifB和nifQ。在一些实施方 案中，所述一种或多种遗传变异是导致以下一项或多项结果的突变： NifA或谷氨酰胺酶的表达或活性增加；NifL、NtrB、谷氨酰胺合成酶、 GlnB、GlnK、DraT、AmtB的表达或活性降低；GlnE的腺苷酰去除活 性降低；或GlnD的尿苷酰去除活性降低。在一些实施方案中，该一种 或多种遗传变异(A)是敲除突变；(B)改变或消除靶基因的调节序列；或 (C)包含异源调节序列的插入。

在一些实施方案中，所述植物是农作物植物。在进一步的实施方 案中，该农作物植物选自高粱、油菜、番茄、草莓、大麦、稻、玉米和 小麦。在进一步的实施方案中，该植物是遗传修饰的生物体。在进一步 的实施方案中，该植物并非遗传修饰的生物体。在一些实施方案中，该 植物已经进行了遗传工程或繁殖用于有效的氮利用。

一方面，本公开提供了一个包含细菌的细菌种群，该细菌含有引 入到细菌固氮或同化基因调节网络的一个或多个基因或非编码多核苷酸 的一种或多种遗传变异，使得所述细菌能够在外源氮的存在下固定大气 氮；其中所述细菌并非属间微生物；并且其中植物中的细菌在存在细菌 种群的情况下在植物中产生1％或更多的固定氮。

在一些实施方案中，植物中的所述细菌在植物中产生5％或更多的 固定氮。在一些实施方案中，植物中的所述细菌在植物中产生10％或更 多的固定氮。

在一些实施方案中，所述一种或多种遗传变异包含可操作地连接 至固氮或同化遗传调节网络的所述一个或多个基因的经引入控制序列。 在进一步的实施方案中，该控制序列是启动子。在进一步的实施方案中， 该启动子是诱导型启动子。在一些实施方案中，所述细菌不包含可操作 地连接至固氮或同化遗传调节网络的基因的组成型启动子。在一些实施 方案中，该细菌不包含可操作地连接至nif基因簇中的基因的组成型启 动子。

在一些实施方案中，植物中的所述细菌排出固氮的含氮产物。在 一些实施方案中，暴露于植物的所述多种细菌不刺激外源非大气氮摄取 的增加。在一些实施方案中，外源氮选自包含谷氨酰胺、氨、铵、尿素、 硝酸盐、亚硝酸盐、含铵分子、含硝酸盐分子和含亚硝酸盐分子中的一 种或多种的肥料。

在一些实施方案中，所述细菌种群包含至少两种不同种类的细菌。 在一些实施方案中，该细菌种群包含相同种类细菌的至少两种不同的菌 株。在一些实施方案中，该多种细菌来自包含肠杆菌属、拉恩氏菌属、 Kosakonia、伯克霍尔德氏菌属或克雷伯氏菌属的属。在一些实施方案中， 所述多种细菌为肠杆菌属。在一些实施方案中，该多种细菌是内生植物 的、附生植物的或根际的。在一些实施方案中，该多种细菌在植物中定 植，使得细菌以每克植物鲜重至少10⁵cfu存在于该植物中。

在一些实施方案中，细菌固氮或同化遗传调节网络的所述一个或 多个基因或非编码多核苷酸选自：nifA、nifL、ntrB、ntrC、编码谷氨酰 胺合成酶的多核苷酸、glnA、glnB、glnK、drat、amtB、编码谷氨酰胺 酶的多核苷酸、glnD、glnE、nifJ、nifH、nifD、nifK、nifY、nifE、nifN、 nifU、nifS、nifV、nifW、nifZ、nifM、nifF、nifB和nifQ。在一些实施方 案中，所述一种或多种遗传变异是导致以下一项或多项结果的突变： NifA或谷氨酰胺酶的表达或活性增加；NifL、NtrB、谷氨酰胺合成酶、 GlnB、GlnK、DraT、AmtB的表达或活性降低；GlnE的腺苷酰去除活 性降低；或GlnD的尿苷酰去除活性降低。在一些实施方案中，该一种 或多种遗传变异(A)是敲除突变；(B)改变或消除靶基因的调节序列；或 (C)包含异源调节序列的插入。

在一些实施方案中，所述植物是农作物植物。在进一步的实施方 案中，该农作物植物选自高粱、油菜、番茄、草莓、大麦、稻、玉米和 小麦。在进一步的实施方案中，该植物是遗传修饰的生物体。在进一步 的实施方案中，该植物并非遗传修饰的生物体。在一些实施方案中，该 植物已经进行了遗传工程或繁殖用于有效的氮利用。

一方面，本公开提供了一种包含本公开的细菌种群的组合物。在 一些实施方案中，该组合物包含涂覆在种子表面上的细菌种群。在一些 实施方案中，该组合物被配制成液体或粉末。

一方面，本公开提供了以ATCC保藏号PTA-122293保藏的分离 的细菌(水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)；CM011；保藏于美国弗吉 尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(

)；保藏日期2015 年7月14日)或以ATCC保藏号PTA-122294保藏的分离的细菌(甘蔗 肠杆菌(Enterobacter sacchari)；CM013；保藏于美国弗吉尼亚州马纳 萨斯的美国典型培养物保藏中心(

)；保藏日期2015年7月14 日)。

一方面，本公开提供了一种非基因间细菌，其包含引入到细菌固 氮或同化遗传调节网络的一个或多个基因或非编码多核苷酸的一种或多 种遗传变异，使得该细菌能够在外源氮的存在下固定大气氮。

在一些实施方案中，所述一种或多种遗传变异包含可操作地连接 至固氮或同化遗传调节网络的所述一个或多个基因的经引入控制序列。 在进一步的实施方案中，该控制序列是启动子。在进一步的实施方案中， 该启动子是诱导型启动子。在一些实施方案中，细菌不包含可操作地连 接至固氮或同化遗传调节网络的基因的组成型启动子。在一些实施方案 中，细菌不包含可操作地连接至nif基因簇中的基因的组成型启动子。

在一些实施方案中，细菌固氮或同化遗传调节网络的所述一个或 多个基因或非编码多核苷酸选自：nifA、nifL、ntrB、ntrC、编码谷氨酰 胺合成酶的多核苷酸、glnA、glnB、glnK、drat、amtB、编码谷氨酰胺 酶的多核苷酸、glnD、glnE、nifJ、nifH、nifD、nifK、nifY、nifE、nifN、 nifU、nifS、nifV、nifW、nifZ、nifM、nifF、nifB和nifQ。在一些实施方 案中，所述一种或多种遗传变异是导致以下一项或多项结果的突变： NifA或谷氨酰胺酶的表达或活性增加；NifL、NtrB、谷氨酰胺合成酶、 GlnB、GlnK、DraT、AmtB的表达或活性降低；GlnE的腺苷酰去除活 性降低；或GlnD的尿苷酰去除活性降低。在一些实施方案中，该一种 或多种遗传变异(A)是敲除突变；(B)改变或消除靶基因的调节序列；或 (C)包含异源调节序列的插入。

在一些实施方案中，该细菌来自包含肠杆菌属、拉恩氏菌属、 Kosakonia、伯克霍尔德氏菌属或克雷伯氏菌属的属。在一些实施方案中， 所述细菌来自肠杆菌属。在一些实施方案中，该细菌是内生植物的、附 生植物的或根际的。

一方面，本公开提供了一种产生一种或多种细菌的方法。在一个 实施方案中，所述方法包括(a)从第一植物的组织或土壤中分离细菌；(b) 将遗传变异(例如，一种或多种遗传变异)引入到一种或多种细菌中以产 生一种或多种变异细菌；(c)将多种植物暴露于所述变异细菌；(d)从所述 多种植物其中之一的组织或土壤中分离细菌，其中细菌从中分离的所述 植物相对于多种植物中的其他植物具有改良的性状；以及(e)用步骤(d) 中分离的细菌重复步骤(b)至(d)。改良的性状可以是在细菌从中分离的植 物中和/或在暴露于细菌的植物中增强的固氮。所述遗传变异是选自以下 基因的变异：nifA、nifL、ntrB、ntrC、glnA、glnB、glnK、draT、amtB、 glnD、glnE、nifJ、nifH、nifD、nifK、nifY、nifE、nifN、nifU、nifS、 nifV、nifW、nifZ、nifM、nifF、nifB和nifQ。该遗传变异是编码具有选 自以下项之功能的蛋白质的基因的变异：谷氨酰胺合成酶、谷氨酰胺酶、 谷氨酰胺合成酶腺苷酰转移酶、转录激活因子、抗转录激活因子、丙酮 酸黄素氧还蛋白氧化还原酶、黄素氧还蛋白或NAD+-双氮还原酶 ADP-D-核糖转移酶。在一些实施方案中，该遗传变异是导致以下一项或 多项结果的突变：NifA或谷氨酰胺酶的表达或活性增加；NifL、NtrB、 谷氨酰胺合成酶、GlnB、GlnK、DraT、AmtB的表达或活性降低；GlnE 的腺苷酰去除活性降低；或GlnD的尿苷酰去除活性降低。该遗传变异 可以是敲除突变，导致蛋白质结构域活性的消除或停止；改变或消除靶 基因的调节序列；以及/或者包含异源调节序列的插入。在一些实施方案 中，该遗传变异包括在细菌物种或属的基因组内发现的调节序列插入， 该细菌物种或属对应于引入遗传变异的细菌。所述调节序列可任选地基 于细菌培养或植物组织内基因的表达水平来选择。遗传变异可以是随机 位置处的随机突变、靶位点处的随机突变或特异性引入到靶位点的预定 遗传变异。该遗传变异可包括一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代， 或它们的任何组合。该遗传变异可通过化学诱变产生。在一些实施方案 中，所述方法进一步包括将植物暴露于生物应激物或非生物应激物。在 一些实施方案中，在重复步骤(b)至(d)一次或多次后分离的细菌在与第一 植物类型相同的第二植物中或在暴露于细菌的植物中产生1％或更多(例 如，至少2％、5％、10％或更多)的氮。当所述第二植物在补充有谷氨酰 胺、氨或其他化学氮源的肥料的存在下生长时，仍然可以实现这种生产。 在一些实施方案中，所述第二植物在补充有谷氨酰胺、氨或其他化学氮 源的肥料的存在下生长。在一些实施方案中，在重复步骤(b)至(d)一次或 多次后分离的细菌与从所述第一植物分离的细菌相比，在固氮方面显示 了至少2倍的增加(例如，至少5倍的增加)。所述第一植物或多种植物 中的植物可以是农作物植物，诸如选自大麦、稻、玉米、小麦、高粱、 甜玉米、甘蔗、洋葱、番茄、草莓或芦笋的植物。所述第一植物或多种 植物中的植物可以是模式植物，诸如选自狗尾草属、短柄草属或拟南芥 属的植物。在一些实施方案中，遗传变异是特异性引入到靶位点的预定 遗传变异。在一些实施方案中，遗传变异是靶位点内的随机突变。在一 些实施方案中，步骤(a)进一步包括对分离的细菌进行遗传分析。在一些 实施方案中，步骤(b)进一步包括施加选择压力以富集包含遗传变异的细 菌，并且任选地分离在选择压力下存活的细菌。该选择压力可包括切割 缺乏引入到靶位点的遗传变异的基因组，其中切割发生在靶位点的100 个核苷酸内。该切割可由诸如选自锌指核酸酶、CRISPR核酸酶、TALE 核酸酶或大范围核酸酶的核酸酶的位点特异性核酸酶引导。在一些实施 方案中，该切割由选自反选择标记物、锌指核酸酶、CRISPR核酸酶、 TALE核酸酶或大范围核酸酶的位点特异性核酸酶引导。在一些情况下， 可优选CRISPR核酸酶。在一些实施方案中，所述遗传变异是一个或多个核苷酸的插入或缺失。在重复步骤(b)至(d)一次或多次后分离的细菌是 内生植物的、附生植物的或根际的。该细菌可从植物组织(例如，种子) 中分离。该细菌可包含多种不同的细菌分类群。在一些实施方案中，在 步骤(a)中分离细菌包括从所述第一植物的种子中分离细菌。

一方面，本公开提供了一种修饰细菌物种细胞的基因组的方法。 在一些实施方案中，所述方法包括：(a)提供包含由细菌物种的序列组 成的子序列的多核苷酸，其中所述子序列在5'至3'方向包含第一同源 序列、启动子和第二同源序列；和(b)诱导基因组的靶基因座与多核苷 酸之间的同源重组以产生重组序列，其中(i)所述靶基因座包含侧翼为 所述第一和第二同源序列的靶序列，并(ii)增强与所述靶基因座相邻的 一个或多个第二基因的表达。在一些实施方案中，所述方法进一步包 括：(b)(iii)同源重组破坏包含所述靶序列的第一基因的表达。在一些 实施方案中，所述方法进一步包括：(c)分离包含所述重组序列的细菌 细胞。在一些实施方案中，该启动子是基于环境条件下高于阈值水平 的表达活性来选择的。在一些实施方案中，该环境条件选自：养分有 效性，营养缺乏，氮应激，增加的氮暴露，热、冷、渗透应激，干旱， 淹水，盐度，存在或缺乏种间信号传导化合物，存在或缺乏病原体， 以及农药、除草剂、杀虫剂、杀线虫剂、杀真菌剂或杀细菌剂的存在 或缺乏，其中增加或减少暴露是相对于基准条件。在一些实施方案中， 选择所述启动子包括：(a)使细菌种类的细胞暴露于环境条件，(b)测量 细胞转录物的表达水平，以及(c)鉴定高于阈值水平的水平内的转录物 的启动子驱动表达。在一些实施方案中，所述子序列不编码所述细菌物种的蛋白质。在一些实施方案中，所述子序列不编码选择性标记物。 在一些实施方案中，分离细菌细胞包括对缺乏重组序列的细胞应用阴 性选择。在一些实施方案中，阴性选择包括切割缺乏所述重组序列的 基因组，其中切割发生在所述靶序列的100个核苷酸内。在一些实施 方案中，所述切割由选自反选择标记物、锌指核酸酶、CRISPR核酸 酶、TALE核酸酶或大范围核酸酶的位点特异性核酸酶来指导。在一 些实施方案中，所述位点特异性核酸酶是CRISPR核酸酶。在一些实 施方案中，所述第一基因是所述一个或多个第二基因的负调节蛋白。 在一些实施方案中，所述第一基因、所述一个或多个第二基因或者两 者均是固氮途径的成员。在一些实施方案中，所述第一基因选自：NifL、 NtrB、谷氨酰胺合成酶、GlnB、GlnK、DraT和AmtB。在一些实施 方案中，所述一个或多个第二基因选自：NifA和谷氨酰胺酶。在一些 实施方案中，所述分离的细菌细胞是内生植物的、附生植物的或根际 的。在一些实施方案中，所述分离的细菌细胞在宿主植物的细胞中产 生5％或更多的氮。在一些实施方案中，所述分离的细菌在补充有谷 氨酰胺、氨或其他化学补充氮源的肥料的存在下产生氮。在一些实施 方案中，所述方法进一步包括：(b)(iii)同源重组破坏包含所述靶序列的第一基因的表达；和(c)分离包含所述重组序列的细菌细胞。

一方面，本公开提供了一种用于破坏细菌物种细胞中的靶基因 的多核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含由源自所述细菌 物种的序列组成的子序列，其中：(a)所述子序列在5'至3'方向包含第 一同源序列、启动子和第二同源序列；(b)所述第一和第二同源序列对 应于在所述子序列和包含所述靶序列的靶基因座之间的同源重组时 缺失的靶序列侧翼的序列；(c)所述靶序列包含至少第一基因的第一蛋 白质编码部分；和(d)所述子序列不编码所述细菌物种的蛋白质。在一 些实施方案中，所述子序列不编码选择性标记物。在一些实施方案中， 所述启动子是在环境条件下具有高于阈值水平的表达活性的基因的 启动子。在一些实施方案中，所述环境条件是增加的氮暴露，并且其 中增加的暴露是相对于基准条件。在一些实施方案中，所述靶序列与 一个或多个第二基因相邻。在一些实施方案中，所述第一基因、所述 一个或多个第二基因或者两者均是固氮途径的成员。在一些实施方案 中，所述第一基因选自：NifL、NtrB、谷氨酰胺合成酶、GlnB、GlnK、 DraT和AmtB。在一些实施方案中，所述细胞是内生植物的、附生植 物的或根际的细菌。

一方面，本公开提供了一种包含上文所述的多核苷酸的表达载 体。

一方面，本公开提供了一种包含上文所述的表达载体的细胞。 一方面，本公开提供了一种增加植物中固氮的方法。在一个实施方案中， 所述方法包括将植物暴露于包含一种或多种遗传变异的细菌，该遗传变 异引入到一个或多个调节固氮的基因中，其中该细菌在植物中产生1％ 或更多(例如，至少2％、5％、10％或更多)的氮。该细菌可在补充有谷氨酰胺、氨或其他化学补充氮源的肥料的存在下产生氮。在一些实施方案 中，遗传变异是选自以下基因的变异：nifA、nifL、ntrB、ntrC、谷氨酰 胺合成酶、glnA、glnB、glnK、draT、amtB、谷氨酰胺酶、glnD、glnE、 nifJ、nifH、nifD、nifK、nifY、nifE、nifN、nifU、nifS、nifV、nifW、 nifZ、nifM、nifF、nifB和nifQ。该遗传变异可以是导致以下一项或多项 结果的突变：nifA或谷氨酰胺酶的表达或活性增加；nifL、ntrB、谷氨 酰胺合成酶、glnB、glnK、draT、amtB的表达或活性降低；GlnE的腺 苷酰去除活性降低；或GlnD的尿苷酰去除活性降低。在一些实施方案 中，该遗传变异(a)是敲除突变；(b)改变或消除靶基因的调节序列；或(c)包含异源调节序列的插入。该细菌可以是内生植物的、附生植物的或根 际的。在一些情况下，该细菌是肠杆菌属或拉恩氏菌属。该细菌可包含 多种不同的细菌分类群。在一些实施方案中，该植物为农作物植物，诸 如选自高粱、油菜、番茄、草莓、大麦、稻、玉米和小麦的植物。该植 物可以是非豆科植物。该植物可以是遗传修饰的生物体(GMO；例如具 有改变为携带异源基因的基因组的植物)、非遗传修饰的生物体(非GMO)， 或者已经进行基因改造或繁殖用于有效的氮利用。

一方面，本公开提供了细菌种群。在一个实施方案中，该细菌种 群包含细菌，该细菌包含引入到一个或多个调节固氮的基因的一种或多 种遗传变异，其中该细菌在存在细菌种群的情况下生长的植物中产生1％ 或更多(例如，至少2％、5％、10％或更多)的氮。该细菌在补充有谷氨酰 胺、氨或其他化学补充氮源的肥料的存在下产生氮。在一些实施方案中， 该遗传变异是选自以下基因的变异：nifA、nifL、ntrB、ntrC、谷氨酰胺 合成酶、glnA、glnB、glnK、draT、amtB、谷氨酰胺酶、glnD、glnE、 nifJ、nifH、nifD、nifK、nifY、nifE、nifN、nifU、nifS、nifV、nifW、 nifZ、nifM、nifF、nifB和nifQ。该遗传变异可以是导致以下一项或多项 结果的突变：nifA或谷氨酰胺酶的表达增加；nifL、ntrB、谷氨酰胺合 成酶、glnB、glnK、draT、amtB的表达降低；GlnE的腺苷酰去除活性 降低；或GlnD的尿苷酰去除活性降低。在一些实施方案中，该遗传变 异(a)是敲除突变；(b)改变或消除靶基因的调节序列；或(c)包含异源调节 序列的插入。该细菌可以是内生植物的、附生植物的或根际的。在一些情况下，该细菌是肠杆菌属或拉恩氏菌属。该细菌可包含多种不同的细 菌分类群。

一方面，本公开提供了一种包含细菌种群(如本文所述的细菌种群) 的组合物。该组合物可包含涂覆在种子表面上的细菌种群。在一些实施 方案中，该组合物被配制为液体或粉末。

一方面，本公开提供了ATCC保藏号为PTA-122293的细菌。一 方面，本公开提供了ATCC保藏号为PTA-122294的细菌。

援引并入

本说明书中提到的所有出版物、专利及专利申请均通过引用并入 本文，其程度如同特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利 申请均通过引用而并入。

附图说明

本发明的新颖特征在所附的权利要求书中予以具体阐述。通过参 考以下对其中利用了本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述 以及附图，将获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在以下附图中：

图1A-图1B描述了固氮细菌的富集和分离。(图1A)用Nfb琼脂板 分离固氮细菌的单菌落。(图1B)在Balch管中浇注的半固体Nfb琼脂。 箭头指向富含固氮细菌的薄膜。

图2描绘了代表性的nifH PCR筛选。在该筛选中，在～350bp处 观察到两个菌落的阳性条带。较低的条带代表引物二聚体。

图3描绘了来自CRISPR-Cas选择诱变的菌落的PCR筛选的实例。 用对nifL基因座特异性的引物筛选CI006菌落。预期野生型PCR产物约 2.2kb，而突变体预计约1.1kb。筛选出的10个菌落中有7个明确地显 示出所需的缺失。

图4A-图4D描绘了各个菌株的体外表型。在补充有0至10mM 谷氨酰胺的固氮培养基中生长的菌株CI010的突变体(图4A)和菌株 CI006的突变体(图4B)的乙炔还原测定(ARA)活性。其他菌株的ARA活 性示于图4C中，并且两种菌株随时间推移的铵排出曲线示于图4D中。

图5描绘了参与固氮微生物固氮的菌株CI006中9种不同基因的 培养表达谱。数字代表每个转录物的计数。指出了各种条件(0mM、1mM、 10mM谷氨酰胺和N₂中0％、10％、20％的大气)。

图6描绘了玉米根部的CI006定植。用含有RFP表达质粒的CI006 接种玉米幼苗。通过用合适的抗生素浇灌使生长和质粒维持两周后，收 获根并通过荧光显微镜成像。观察根细胞间隙的定植。

图7描绘了源自WT(CI050)和优化(CM002)菌株中微生物水平的 氮。

图8示出了用于Micro-Tom果实质量测定的实验装置。

图9示出了10株用于增加Micro-Tom植物果实质量的菌株的筛选。 展示了六个重复的结果。对于第3列，p＝0.07。对于第7列，p＝0.05。

图10A-图10C描绘了在补充有0至10mM谷氨酰胺的固氮培养 基中生长的候选微生物和配对候选突变体的ARA活性的另外结果。

图11描绘了显示比其衍生的单一突变体更高的氨排出的双突变 体。

图12描绘了通过15N气体摄取实验获得的NDFA(使用暴露的天 数外推)以测量施肥条件下玉米植物中的NDFA。

图13描绘了通过15N气体摄取实验获得的NDFA值(使用暴露的 天数外推)以测量施肥条件下狗尾草属植物中的NDFA。

图14A描绘了15N气体的掺入率。与未接种的植物相比，接种有 进化菌株的植物显示15N气体掺入增加。

图14B描绘了在种植后4周，接种了进化菌株的植物中高达7％ 的氮源自微生物固氮。

图14C描绘了与未接种或野生型接种的植物相比，在接种进化菌 株的植物中叶面积(和其他生物量度，数据未显示)增加。

图15A描绘了通过在植物中转录物组研究中测量的进化菌株，其 在根组织中显示出明显更高的nifH产量。

图15B描绘了在植物组织中发现的固氮速率与特定植物通过 HoME优化菌株定植的速率相关。

图16的A图描绘了测试定植的各个田间土壤的土壤质地图。一 些微生物最初来源的土壤以星号指示。

图16的B图描述了通过四种不同的土壤类型(圆圈)测试的菌株1 和菌株5的定植率(colonization rate)。两种菌株在不同的土壤类型中表现 出相对稳定的定植特征。

图16的C图描绘了在田间试验中在生长季节跨度上测试的菌株1 的定植。在种植后，菌株1在玉米组织中持续至第12周，并且在那之后 开始显示出定植下降。

具体实施方式

术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸” 可互换使用。它们是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是脱氧核糖 核苷酸还是核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构， 并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例： 基因或基因片段的编码区或非编码区、由连锁分析定义的基因座(基因 座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体 RNA(rRNA)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA (miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、 任何序列分离的DNA、任何序列分离的RNA、核酸探针和引物。多核 苷酸可包含一个或多个修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。 如果存在，则可以在组装聚合物之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核 苷酸序列可以被非核苷酸组分中断。聚合后如通过与标记组分缀合可进 一步修饰多核苷酸。

“杂交”是指此类反应，即其中一个或多个多核苷酸反应以通过核 苷酸残基的碱基之间的氢键形成稳定的复合体。可通过Watson Crick碱 基配对、Hoogstein结合或根据碱基互补性以任何其他序列特异性方式进 行氢键结合。所述复合体可包含形成双链结构的两条链、形成多链复合 体的三条链或更多条链、单一自我杂交链或它们的任何组合。杂交反应 可构成更广泛过程中的步骤，诸如PCR的启动或核酸内切酶对多核苷酸 的酶促切割。与第一序列互补的第二序列称为第一序列的“互补体”。应 用于多核苷酸的术语“可杂交的”是指多核苷酸通过杂交反应中核苷酸残 基的碱基之间的氢键结合而形成稳定的复合体的能力。

“互补性”是指核酸通过传统Watson-Crick或其他非传统类型的方 式与另一核酸序列形成氢键的能力。互补性百分比表示可与第二核酸序 列形成氢键(例如，Watson-Crick碱基配对)的核酸分子中的残基的百分 比(例如，10中有5、6、7、8、9、10个则分别为50％、60％、70％、80％、 90％和100％互补)。“完全互补”是指核酸序列的所有连续残基将与第二 核酸序列中相同数量的连续残基氢键结合。如本文所使用的“基本互补” 是指在8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、 17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30 个、35个、40个、45个、50个或更多个核苷酸区域内互补程度至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或 100％，或指在严格条件下杂交的两个核酸。例如为了评估互补性百分 比，序列同一性可以通过任何合适的比对算法测量得到，包括但不限于 Needleman-Wunsch算法(参见例如，可从 www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html获得的EMBOSS Needle对准器，可选地使用默认设置)、BLAST算法(参见例如，可从 blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi获得的BLAST对齐工具，可选地使用默 认设置)或Smith-Waterman算法(参见例如，可从 www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html获得的EMBOSS Water对准器，可选地使用默认设置)。可以使用所选算法的任何合适参 数(包括默认参数)来评估最佳对准。

通常，针对杂交的“严格条件”是指与靶序列具有互补性的核酸主 要与靶序列杂交且基本上不与非靶序列杂交的条件。严格条件通常是序 列相关的，并且取决于许多因素。通常，序列越长，序列与其靶序列特 异性杂交的温度越高。严格条件的非限制性实例详细描述于Tijssen (1993),Laboratory Technniques In Biochemistry And MolecularBiology-Hybridization With Nucleic Acid Probes第I部分，第二章 “Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay”,Elsevier,N.Y.中。

如本文所使用的，“表达”是指多核苷酸从DNA模板转录(如转录 成mRNA和其他RNA转录物)的过程，和/或转录的mRNA随后翻译成 肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可以统称为“基因产物”。 如果多核苷酸来源于基因组DNA，则表达可包括mRNA在真核细胞中 的剪接。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换使用，是指任何长度的 氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨 基酸，并且可以被非氨基酸中断。该术语还包括已被修饰的氨基酸聚合 物；例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作， 如与标记组分缀合。如本文所使用的，术语“氨基酸”包括天然和/或非天然或合成氨基酸，包括甘氨酸和D或L光学异构体，以及氨基酸类似物 和模拟肽。

如本文所使用的，术语“约”与术语“近似”同义使用。说明性地， 关于量的术语“约”的使用表示略微超出引用值，例如正或负0.1％至10％ 的数值。

术语“生物纯培养物”或“基本纯培养物”是指本文所述的细菌物种 的培养物，其不含其他细菌物种，其量足以干扰培养物的复制或者通过 正常的细菌学技术检测得到。

“植物生产力”通常是指植物生长或发育的任何方面，这是植物生 长的原因。对于粮食作物，如谷物或蔬菜，“植物生产力”可以指从特定 作物收获的谷物或水果的产量。如本文所使用的，提高的植物生产力广 义地指为了各种目的提高所收获的谷物、果实、花或其他植物部分的产 量、改善植物部分(包括茎、叶和根)的生长、促进植物生长、维持叶片中高叶绿素含量、增加果实或种子数、增加果实或种子单位重量、由于 氮肥用量减少降低NO₂排放、以及类似改善植物的生长和发育。

粮食作物内外的微生物可影响这些作物的性状。可能受微生物影 响的植物性状包括：产量(例如，谷物生产、生物量生成、果实发育、花 卉)；营养(例如，氮、磷、钾、铁、微量营养素获得)；非生物应激管理(例 如，耐旱性、耐盐性、耐热性)；和生物应激管理(例如，害虫、杂草、 昆虫、真菌和细菌)。改变作物性状的策略包括：增加关键代谢物浓度； 改变微生物对关键代谢物影响的时间动态；将微生物代谢物的产生/降解 与新的环境线索联系起来；减少负性代谢物；以及改善代谢物或潜在蛋 白质的平衡。

如本文所使用的，“控制序列”是指操纵基因、启动子、沉默基因 或终止子。

如本文所使用的，“植物中”是指在植物中，并且其中所述植物还 包括叶、根、茎、种子、胚珠、花粉、花、果实等。

在一些实施方案中，将本公开的基因的天然或内源控制序列替换 为一个或多个属内控制序列。

如本文所使用的，“引入”是指通过现代生物技术引入，而不是自 然发生的引入。

在一些实施方案中，本公开的细菌已被修饰，使得它们不是天然 存在的细菌。

在一些实施方案中，本公开的细菌以每克植物鲜重或干重至少10³ cfu、10⁴cfu、10⁵cfu、10⁶cfu、10⁷cfu、10⁸cfu、10⁹cfu、10¹⁰cfu、10¹¹ cfu或10¹²cfu的量存在于植物中。在一些实施方案中，本公开的细菌以 每克植物鲜重或干重至少约10³cfu、约10⁴cfu、约10⁵cfu、约10⁶cfu、 约10⁷cfu、约10⁸cfu、约10⁹cfu、约10¹⁰cfu、约10¹¹cfu或约10¹²cfu 的量存在于植物中。在一些实施方案中，本公开的细菌以每克植物鲜重 或干重至少10³至10⁹、10³至10⁷、10³至10⁵、10⁵至10⁹、10⁵至10⁷、10⁶至10¹⁰、10⁶至10⁷cfu的量存在于植物中。

本公开的肥料和外源氮可包括以下含氮分子：铵、硝酸盐、亚硝 酸盐、氨、谷氨酰胺等。本公开的氮源可包括无水氨、硫酸铵、尿素、 磷酸氢二铵、尿素形式、磷酸一铵、硝酸铵、氮溶液、硝酸钙、硝酸钾、 硝酸钠等。

如本文所使用的，“外源氮”是指在非氮限制条件下存在的土壤、 田地或生长介质中容易获得的非大气氮，包括氨、铵、硝酸盐、亚硝酸 盐、尿素、尿酸、铵酸等。

如本文所使用的，“非氮限制条件”是指在土壤、田地、介质中可 获得的浓度大于约4mM氮的非大气氮，如Kant等人(2010.J.Exp.Biol. 62(4):1499-1509)所描述的，其通过引用并入于此。

如本文所使用的，“属间微生物”是通过有意组合由最初从不同分 类学属的生物体分离的遗传物质而形成的微生物。“属间突变体”可与“属 间微生物”互换使用。示例性的“属间微生物”包括含有首先在微生物中鉴 定的不同于受体微生物的属的移动遗传元件的微生物。进一步的解释尤 其可以在40C.F.R.§725.3中找到。

如本文所使用的，“属内微生物”是通过有意组合由最初从相同分 类学属的生物体分离的遗传物质而形成的微生物。“属内突变体”可与“属 内微生物”互换使用。

如本文所使用的，“引入的遗传物质”是指添加到受体的基因组的 遗传物质，并且保持为受体基因组的组分。

在一些实施方案中，固氮和同化遗传调节网络包含编码指导、调 节和/或控制微生物固氮和/或同化的基因和非编码序列的多核苷酸，并 且可包含nif簇(例如，nifA、nifB、nifC、.......nifZ)的多核苷酸序列、编 码氮调节蛋白C的多核苷酸、编码氮调节蛋白B的多核苷酸、gln簇(例 如，glnA和glnD)的多核苷酸序列、draT和氨转运蛋白/通透酶。

在一些实施方案中，本公开的肥料包含按重量计至少5％、6％、 7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、 19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、 30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、 41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、 52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、 63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、 74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％的氮。

在一些实施方案中，本公开的肥料包含按重量计至少约5％、约 6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约 14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、 约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、 约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、 约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、 约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、 约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、 约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、 约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、 约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、 约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的氮。

在一些实施方案中，本公开的肥料包含按重量计约5％-50％、约 5％-75％、约10％-50％、约10％-75％、约15％-50％、约15％-75％、约 20％-50％、约20％-75％、约25％-50％、约25％-75％、约30％-50％、约30％-75％、约35％-50％、约35％-75％、约40％-50％、约40％-75％、约 45％-50％、约45％-75％或约50％-75％的氮。

在一些实施方案中，相对于尚未暴露于本公开的细菌的对照植物， 测量植物中固氮的增加和/或1％或更多的氮的产生。相对于对照细菌， 测量细菌中的所有增加或降低。相对于对照植物，测量植物中的所有增 加或降低。

如本文所使用的，“组成型启动子”是在大多数条件下和/或在大多 数发育阶段期间有活性的启动子。在生物技术中使用的表达载体中使用 组成型启动子有几个优点，如：用于选择转基因细胞或生物体的蛋白质 的高水平生产；报道蛋白或可评分的标记物的高水平表达，易于检测和 定量；调节转录系统部分的转录因子的高水平生产；在生物体中需要普 遍存在活性的化合物的生产；以及所有发育阶段所需的化合物的生产。 非限制性的示例性组成型启动子包括CaMV 35S启动子、冠瘿碱启动子、 遍在蛋白启动子、醇脱氢酶启动子等。

如本文所使用的，“非组成型启动子”是在某些条件下、某些类型 细胞中和/或在某些发育阶段期间有活性的启动子。例如，组织特异性的、 组织优选的、细胞类型特异的、细胞类型优选的诱导型启动子和处于发 育控制下的启动子是非组成型启动子。处于发育控制下的启动子的实例 包括优先在某些组织中启动转录的启动子。

如本文所使用的，“诱导型”或“可抑制型”启动子是在化学或环境 因素控制下的启动子。可通过诱导型启动子影响转录的环境条件的实例 包括厌氧条件、某些化学品、光的存在、酸性或碱性条件等。

如本文所使用的，“组织特异性”启动子是仅在某些组织中启动转 录的启动子。与基因的组成型表达不同，组织特异性表达是若干个基因 调节的相互作用水平的结果。如此，在本领域中，有时优选使用来自同 源或紧密相关物种的启动子以实现转基因在特定组织中有效且可靠的表 达。这是在科学文献和专利文献两者中找到的从特定组织分离的大量组 织特异性启动子的主要原因之一。

如本文所使用的，术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上的核 酸序列的结合，使得一个核酸序列的功能由另一个调节。例如，当启动 子能够调节编码序列的表达(即，编码序列处于启动子的转录控制之下) 时，启动子与编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义或反义方向 可操作地连接至调节序列。在另一个实例中，本公开的互补RNA区域 可直接或间接地可操作地连接至靶mRNA的5'或靶mRNA的3'或在靶 mRNA内部，或者第一互补区域位于靶mRNA的5'而其互补体位于靶 mRNA的3'。

可以通过本文所述的方法靶向调节的一个性状是固氮。氮肥是农 场最大的运营费用，也是玉米和小麦等行栽作物产量提高的最大动力。 本文描述了可以在非豆科作物中递送可再生形式氮的微生物产品。虽然 一些内生菌具有固定纯培养物中氮所必需的遗传基础，但是根本的技术 挑战是谷类和禾类的野生型内生菌停止在施肥田中固氮。化肥施用及田 间土壤中残留的氮素水平表明微生物关闭固氮的生化途径。

需要改变固氮调节网络的转录水平和翻译后水平，以研发能够在 肥料的存在下将氮固定并转移至玉米的微生物。为此，本文描述了用于 精确演变调节网络并引发新型表型的宿主-微生物演化(HoME)技术。本 文还描述了从玉米分离的固氮内生菌的独特的专有文库，与在不同环境 条件(如氮应激和过量条件下)围绕微生物和宿主植物的相互作用的大量 组学数据配对。这使得内生菌遗传调节网络的精确进化能够产生即使在 田间施肥的情况下也能主动固氮的微生物。本文还描述了对在玉米根组 织中定植并对施肥植物产生氮的进化微生物的技术潜力的评估，以及评 估内生菌与标准制剂实践和不同土壤的相容性，以确定将微生物整合到 现代氮管理策略中的可行性。

为了利用元素氮(N)进行化学合成，生物将大气中可得的氮气(N₂) 与氢气合并，该过程称为固氮。由于生物固氮的能量密集性质，固氮生 物(固定大气氮气的细菌和古菌)已经进化出nif基因簇响应于环境氧和可 用氮的复杂且严密的调节。Nif基因编码参与固氮的酶(如固氮酶复合体) 并调节固氮的蛋白质。Shamseldin(2013.GlobalJ.Biotechnol.Biochem. 8(4):84-94)公开了对nif基因及其产物的详细描述，并通过引用并入于此。 本文描述了生产具有改良性状的植物的方法，其包括从第一植物分离细 菌，将遗传变异引入到分离细菌的nif基因，将第二植物暴露于变异细 菌，从相对于第一植物具有改良性状的第二植物分离细菌，以及用从第 二植物分离的细菌重复所述步骤。

在变形菌门中，调节围绕σ₅₄-依赖性增强子结合蛋白NifA的固氮 中心，nif簇的阳性转录调节子。活性NifA的细胞内水平受两个关键因 素控制：nifLA操纵子的转录以及通过蛋白质-蛋白质与NifL的相互作用 抑制NifA的活性。这两个过程都是通过PII蛋白信号级联放大响应于细 胞内谷氨酰胺水平。该级联反应由GlnD介导，GlnD直接感测谷氨酰胺并催化两种PII调节蛋白(GlnB和GlnK)的尿苷酰化或去尿苷酰化，GlnB 和GlnK分别响应于结合的谷氨酰胺的缺乏或存在。在氮过量的条件下， 未修饰的GlnB表明nifLA启动子失活。然而，在氮限制的条件下，GlnB 翻译后修饰，抑制其活性并导致nifLA操纵子的转录。通过这种方式， nifLA转录通过PII蛋白信号级联放大严格控制对环境氮的响应。在NifA 调节的翻译后水平上，根据细胞内游离GlnK的整体水平，GlnK抑制 NifL/NifA相互作用。

NifA由nifLA操纵子转录，其启动子由磷酸化的NtrC(另一种σ₅₄- 依赖性调节子)激活。NtrC的磷酸化状态由组氨酸激酶NtrB介导，NtrB 与去尿苷酰化的GlnB相互作用，但不与尿苷酰化的GlnB相互作用。在 氮过量的条件下，细胞内高水平的谷氨酰胺导致GlnB去尿苷酰化，然 后与NtrB相互作用以使其磷酸化活性失活并激活其磷酸酶活性，导致 NtrC去磷酸化及nifLA启动子的失活。然而，在氮限制的条件下，低水 平的细胞内谷氨酰胺导致GlnB尿苷酰化，抑制其与NtrB的相互作用并 允许NtrC磷酸化及nifLA操纵子的转录。通过这种方式，响应于环境氮 而经由PII蛋白信号级联放大来严格控制nifLA表达。nifA、ntrB、ntrC 和glnB均是可以在本文所述的方法中突变的基因。

NifA的活性在翻译后也响应于环境氮而调节，最典型地通过NifL 介导的NifA活性的抑制。一般而言，尽管GlnK与NifL/NifA之间的相 互作用的性质在不同的固氮生物之间明显不同，但NifL与NifA的相互 作用经由GlnK受到PII蛋白信号级联放大的影响。在肺炎克雷伯氏菌中， 两种形式的GlnK均抑制NifL/NifA相互作用，并且GlnK与NifL/NifA 之间的相互作用由细胞内游离GlnK的总水平来决定。在氮过量的条件 下，去尿苷酰化的GlnK与铵转运蛋白AmtB相互作用，用于阻断AmtB 对铵的吸收并将GlnK与膜隔离，从而允许NifL抑制NifA。另一方面， 在棕色固氮菌中，NifL/NifA相互作用和NifA抑制需要与去尿苷酰化的 GlnK相互作用，而GlnK的尿苷化则抑制其与NifL的相互作用。在缺 乏nifL基因的固氮生物中，有证据表明在氮过量条件下，NifA活性直接 受到GlnK和GlnB的去尿苷酰化形式的相互作用的抑制。与机制无关， NifA的翻译后抑制是大多数已知固氮生物中nif簇的重要调节剂。另外， nifL、amtB和glnK均是可以在本文所述的方法中突变的基因。

除了调节nif基因簇的转录之外，许多固氮生物还发展了直接翻译 后修饰及抑制固氮酶本身的机制，称为固氮酶关闭。这是由铁蛋白(NifH) 在氮过量的条件下ADP-核糖基化介导的，这破坏其与MoFe蛋白复合体 (NifDK)的相互作用并消除固氮酶活性。DraT催化Fe蛋白的ADP-核糖 基化并关闭固氮酶，而DraG催化ADP-核糖的去除和固氮酶的再活化。与nifLA转录和NifA抑制一样，固氮酶关闭也通过PII蛋白信号级联放 大来调节。在氮过量的条件下，去尿苷酰化的GlnB与DraT相互作用并 激活DraT，而去尿苷酰化的GlnK与DraG和AmtB相互作用形成复合 体，将DraG与膜隔离。在氮限制的条件下，GlnB和GlnK的尿苷酰化形式分别不与DraT和DraG相互作用，导致DraT的失活及DraG向Fe 蛋白的扩散，从而除去ADP-核糖并激活固氮酶。本文所述的方法也考 虑将遗传变异引入到nifH、nifD、nifK和draT基因中。

尽管一些内生菌具有体外固氮的能力，但是通常高水平的外源化 学肥料使该遗传学在田间沉默。可以将外源氮的感测与固氮酶的表达分 开以促进基于田间的固氮。提高固氮酶活性随时间的积分进一步用于增 加氮的产生以供作物利用。利用本文所述的方法促进基于田间的固氮的 遗传变异的具体靶标包括选自以下项的一个或多个基因：nifA、nifL、ntrB、 ntrC、glnA、glnB、glnK、draT、amtB、glnD、glnE、nifJ、nifH、nifD、nifK、nifY、nifE、nifN、nifU、nifS、nifV、nifW、nifZ、nifM、nifF、nifB 和nifQ。

利用本文所述的方法促进基于田间的固氮的遗传变异的额外靶标 是NifA蛋白质。NifA蛋白质通常是用于固氮基因表达的激活剂。增加 NifA的产量(组成性地或在高氨条件下)避开了天然氨感测途径。另外， 降低NifL蛋白(一种已知的NifA抑制剂)的产生也导致游离活性NifA的 水平增加。另外，提高nifAL操纵子的转录水平(组成性地或在高氨条件 下)也导致整体上更高水平的NifA蛋白。通过改变启动子本身或通过降 低NtrB的表达(在高氮条件下最初会导致关闭nifAL操纵子的ntrB和 ntrC信号级联放大的一部分)来实现nifAL表达水平提高。通过本文所述 的这些方法或任何其他方法实现的高水平的NifA提高了内生菌的固氮 活性。

利用本文所述的方法促进基于田间的固氮的遗传变异的额外靶标 是GlnD/GlnB/GlnK PII信号级联放大。通过GlnD/GlnB/GlnK PII信号级 联放大感测细胞内谷氨酰胺水平。GlnD中的活性位点突变消除了GlnD 的尿苷酰去除活性，破坏了氮感测级联反应。另外，GlnB浓度的降低使 谷氨酰胺感测级联反应短路。这些突变“诱使”细胞感知氮限制状态，从而增加固氮水平活性。

amtB蛋白也是利用本文所述的方法促进基于田间的固氮的遗传 变异的靶标。通过降低amtB蛋白的表达水平可以降低从环境摄取氨。 没有细胞内氨，内生菌不能感知高水平的氨，阻止了固氮基因的下调。 设法进入细胞内隔室的任何氨都被转化成谷氨酰胺。细胞内谷氨酰胺水 平是氮感测的主要指标。降低细胞内谷氨酰胺水平防止了细胞感测环境中的高铵水平。这可以通过增加谷氨酰胺酶(一种将谷氨酰胺转化为谷氨 酸的酶)的表达水平来完成。另外，细胞内谷氨酰胺也可以通过减少谷氨 酰胺合酶(一种将氨转化为谷氨酰胺的酶)来降低。在固氮生物中，固定 氨很快吸收到谷氨酰胺和谷氨酸中，用于细胞过程。氨同化的中断可能 导致要作为氨从细胞输出的固定氮的转移。固定氨主要被glnA编码的谷 氨酰胺合成酶(GS)同化到谷氨酰胺中，随后被谷氨酰胺氧化戊二酸转氨 酶(GOGAT)同化到谷氨酰胺中。在一些实例中，glnS编码谷氨酰胺合成 酶。GS由GS腺苷酰转移酶(GlnE)翻译后调节，GlnE是由glnE编码的 双功能酶，其分别通过其腺苷酰转移酶(AT)和腺苷酰去除(AR)结构域的 活性来催化GS的腺苷酰化和去腺苷酰化。在氮限制的条件下，表达glnA、 GlnE的AR结构域去腺苷酰化GS，使其活跃。在氮过量的条件下，关 闭glnA表达，GlnE的AT结构域被谷氨酰胺变构活化，导致GS的腺苷 酰化及失活。

此外，draT基因也是利用本文所述的方法促进基于田间的固氮的 遗传变异的靶标。一旦氮固定酶由细胞产生，则关闭固氮酶代表另一个 水平，其中细胞在高氮条件下下调固定活性。该关闭可通过降低DraT 的表达水平来消除。

赋予新微生物表型的方法可以在转录、翻译和翻译后水平下进行。 转录水平包括启动子的改变(如改变σ因子亲和性或转录因子的结合位 点，包括全部或部分启动子的缺失)或改变转录终止子和弱化子。翻译水 平包括核糖体结合位点的改变和改变的mRNA降解信号。翻译后水平包 括突变酶的活性位点及改变蛋白质-蛋白质相互作用。这些变化可以通过 多种方式实现。通过以较低的强度/效率将天然核糖体结合位点(RBS)或 启动子与另一个进行交换来实现表达水平的降低(或完全消除)。ATG起 始位点可以交换成GTG、TTG或CTG起始密码子，这导致编码区翻译 活性的降低。通过敲除(删除)基因的编码区可以完全消除表达。将开放 阅读框(ORF)移码可能会导致沿ORF提前终止密码子，从而产生非功能性截短产物。框内终止密码子的插入也将类似地产生非功能性截短产物。 还可以在N或C末端添加降解标签以降低特定基因的有效浓度。

相反，本文所述基因的表达水平可以通过使用更强的启动子来实 现。为了在高氮水平条件(或任何其他条件)下确保高启动子活性，可以 获得在高氮水平条件下全基因组的转录概况，并且可以从该数据集中选 择具有期望转录水平的活性启动子以代替弱启动子。弱起始密码子可以 替换为ATG起始密码子以获得更好的翻译起始效率。弱核糖体结合位 点(RBS)也可以用不同的具有较高翻译起始效率的RBS换掉。另外，也 可以进行位点特异性诱变以改变酶的活性。

增加植物中固氮水平可导致作物生产所需的化学肥料的量降低， 并减少温室气体排放(例如，一氧化二氮)。

连续传代

通过连续传代可以产生细菌以改良植物性状(例如，固氮)。除了鉴 定能够将一种或多种改良性状赋予一种或多种植物的细菌和/或组合物 之外，这可以通过选择受微生物菌丛影响的、具有特定改良性状的植物 来完成。一种产生细菌以改良植物性状的方法，其包括以下步骤：(a)从 第一植物的组织或土壤中分离细菌；(b)将遗传变异引入到一种或多种细 菌中以产生一种或多种变异细菌；(c)将多种植物暴露于所述变异细菌； (d)从所述多种植物其中之一的组织或土壤中分离细菌，其中分离细菌的 植物相对于多种植物中的其他植物具有改良的性状；以及(e)用从具有改 良性状的植物中分离的细菌(步骤(d))重复步骤(b)至(d)。步骤(b)至(d)可以 重复任意次数(例如，一次、两次、三次、四次、五次、十次或更多次)， 直到植物中改良的性状达到期望的水平。此外，所述多种植物可以是多 于两种植物，如，10种至20种植物，或者20种或更多种、50种或更多 种、100种或更多种、300种或更多种、500种或更多种、或1000种或 更多种植物。

除了获得具有改良性状的植物之外，还获得了包含细菌的细菌种 群，该细菌包含引入到一个或多个基因(例如，调节固氮的基因)的一种 或多种遗传变异。通过重复上述步骤，可以获得包括群体中与感兴趣的 植物性状相关的最合适的成员的细菌种群。可以鉴定该种群中的细菌， 并通过诸如遗传和/或表型分析确定其有益性质。可对步骤(a)中分离的细 菌进行遗传分析。可以使用以下技术获得表型和/或基因型信息：植物来 源的化学成分的高通量筛选、包括遗传物质的高通量测序的测序技术、 差异显示技术(包括DDRT-PCR和DD-PCR)、核酸微阵列技术、RNA-seq (全转录物组鸟枪测序法)和qRT-PCR(定量实时PCR)。所获得的信息可 用于获得关于存在的细菌的身份和活性的群落概况分析信息，如编码rRNA操纵子组分或其他分类学信息基因座的核酸的系统发育分析或基 于微阵列的筛选。分类学信息基因座的实例包括16S rRNA基因、23S rRNA基因、5S rRNA基因、5.8S rRNA基因、12S rRNA基因、18S rRNA 基因、28S rRNA基因、gyrB基因、rpoB基因、fusA基因、recA基因、 coxl基因、nifD基因。在US20140155283中描述了确定群体中存在的分 类群的分类学概况分析的示例过程。细菌鉴定可包括表征一个或多个基 因或一个或多个信号传导途径的活性，如与固氮途径相关的基因。在细 菌群体中还可存在不同细菌物种之间的协同相互作用(其中两个组分由 于其组合而增加的所需效果超过添加量)。

所述遗传变异可以是选自以下的基因：nifA、nifL、ntrB、ntrC、 glnA、glnB、glnK、draT、amtB、glnD、glnE、nifJ、nifH、nifD、nifK、 nifY、nifE、nifN、nifU、nifS、nifV、nifW、nifZ、nifM、nifF、nifB和nifQ。 该遗传变异可以是编码具有选自以下项的功能的蛋白质的基因的变异： 谷氨酰胺合成酶、谷氨酰胺酶、谷氨酰胺合成酶腺苷酰转移酶、转录激 活因子、抗转录激活因子、丙酮酸黄素氧还蛋白氧化还原酶、黄素氧还 蛋白或NAD+-双氮还原酶aDP-D-核糖转移酶。该遗传变异可以是导致 以下一些或多项的突变：NifA或谷氨酰胺酶的表达或活性增加；NifL、 NtrB、谷氨酰胺合成酶、GlnB、GlnK、DraT、AmtB的表达或活性降低；GlnE的腺苷酰去除活性降低；或GlnD的尿苷酰去除活性降低。引入遗 传变异可包括在靶位点处一个或多个核苷酸(如，1个、2个、3个、4个、 5个、10个、25个、50个、100个、250个、500个或更多个核苷酸)的 插入和/或缺失。引入到本文公开的方法的一种或多种细菌中的遗传变异 可以是敲除突变(例如，启动子的缺失、产生过早终止密码子的插入或缺 失、整个基因的缺失)，或者可以是消除或停止蛋白质结构域的活性(例 如，影响活性位点的点突变、或编码蛋白质产物相关部分的基因的一部 分缺失)，或者可以是改变或消除靶基因的调节序列。还可以插入一个或 多个调节序列，包括在对应于引入了遗传变异的细菌的细菌物种或属的 基因组内发现的异源调节序列和调节序列。此外，调节序列可基于细菌 培养或植物组织内基因的表达水平来选择。该遗传变异可以是特异性引 入到靶位点的预定遗传变异。该遗传变异可以是靶位点内的随机突变。 该遗传变异可以是一个或多个核苷酸的插入或缺失。在一些情况下，在 将细菌暴露于植物以评估性状改良之前，将多种(例如，2种、3种、4 种、5种、10种或更多种)不同的遗传变异引入到一种或多种分离的细菌 中。多种遗传变异可以是上述类型(相同或不同类型)中的任何一种以及 任何组合。在一些情况下，连续引入多种不同的遗传变异，在第一次分 离步骤之后引入第一遗传变异，在第二次分离步骤之后引入第二遗传变 异等等，从而在细菌中累积多种遗传变异，进而逐步改良相关植物的性 状。

通常，术语“遗传变异”是指相对于参考多核苷酸(如，参照基因组 或其部分，或者参照基因或其部分)引入到多核苷酸序列中的任何变化。 遗传变异可称为“突变”，并且包含遗传变异的序列或生物体可称为“遗传 变体”或“突变体”。遗传变异可具有许多影响，诸如某些生物活性的增加 或减少，包括基因表达、代谢和细胞信号传导。遗传变异可以特定地引 入到靶位点或者随机引入。有多种分子工具和方法可用于引入遗传变异。 例如，可通过聚合酶链反应诱变、寡核苷酸定向诱变、饱和诱变、片段 改组诱变、同源重组、CRISPR/Cas9系统、化学诱变及其组合来引入遗 传变异。引入遗传变异的化学方法包括将DNA暴露于化学诱变剂，例 如甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)、N-亚硝基脲(EN U)、N-甲基 -N-硝基-N'-亚硝基胍、4-硝基喹啉N-氧化物、硫酸二乙酯、苯并芘、环 磷酰胺、博来霉素、三乙基三聚氰胺、丙烯酰胺单体、氮芥子气、长春 新碱、二环氧烷烃(例如，二环氧丁烷)、ICR-170、甲醛、盐酸甲基苄肼、 环氧乙烷、二甲基亚硝胺、7,12二甲基苯丙(a)蒽、苯丁酸氮芥、六甲基 磷酰胺、二硫烷(bisulfan)等。辐射诱变剂包括紫外辐射、γ辐照、X射 线和快速中子轰击。还可以使用例如紫外线的三甲基补骨脂素将遗传变 异引入到核酸中。移动DNA元件(例如，转座因子)的随机或靶向插入是 产生遗传变异的另一种合适方法。可以例如使用聚合酶链反应(PCR)技 术如易错PCR，在无细胞体外系统扩增期间将遗传变异引入到核酸中。 可使用DNA改组技术(例如，外显子改组、结构域交换等)在体外将遗传 变异引入到核酸中。由于细胞中DNA修复酶的缺乏，也可将遗传变异 引入到核酸中，例如，在细胞中存在编码突变DNA修复酶的突变基因 预期在细胞基因组中产生高频率突变(即，约1个突变/100个基因-1个突 变/10,000个基因)。编码DNA修复酶的基因的实例包括但不限于Mut H、 MutS、Mut L和Mut U，以及其他物种中的同源物(例如，MSH 16、PMS 1 2、MLH 1、GTBP、ERCC-1等)。用于引入遗传变异的各种方法的示 例性描述在例如Stemple(2004)Nature 5:1-7；Chiang等人(1993)PCR Methods Appl 2(3):210-217；Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91: 10747-10751；和美国专利号6,033,861和6,773,900中提供。

作为循环扩增技术，聚合酶链反应(PCR)诱变使用诱变引物来引入 所需的突变。PCR通过变性、退火和延伸的循环来进行。通过PCR扩 增后，突变DNA的选择和亲本质粒DNA的去除可通过以下步骤完成： 1)在PCR期间用羟甲基化-dCTP置换dCTP，然后用限制酶消化仅除去 非羟甲基化亲本DNA；2)同时诱变抗生素抗性基因和所研究的将质粒改 变为不同的抗生素抗性的基因，新的抗生素抗性促进其后选择所需的突 变；3)在引入期望的突变后，通过限制酶DpnI消化亲本甲基化模板DNA， 限制性酶Dpn1仅裂解甲基化DNA，由此恢复诱变的非甲基化链；或4) 在另外的连接反应中使突变的PCR产物环化以提高突变DNA的转化效 率。示例性方法的进一步描述可以在例如US7132265、US6713285、 US6673610、US6391548、US5789166、US5780270、US5354670、 US5071743和US20100267147中找到。

寡核苷酸定向诱变(也称为定向诱变)通常使用合成的DNA引物。 该合成引物含有所需的突变，并且与突变位点周围的模板DNA互补， 从而可以与感兴趣的基因中的DNA杂交。突变可以是单个碱基改变(点 突变)、多个碱基改变、删除或插入，或它们的组合。然后使用DNA聚 合酶延伸单链引物，该DNA聚合酶复制基因的其余部分。如此复制的 基因含有突变位点，然后可以作为载体引入到宿主细胞并克隆。最后， 可通过DNA测序选择突变体来检查它们是否含有所需的突变。

可以使用易错PCR来引入遗传变异。在该技术中，在缺乏序列复 制保真度的条件下，使用DNA聚合酶扩增感兴趣的基因。结果是该扩 增产物在序列中包含至少一个错误。当基因扩增并且与模板分子相比， 所得到的反应产物含有一个或多个序列改变时，所得产物相比于模板被 诱变。另一种引入随机突变的手段是将细胞暴露于化学诱变剂，如亚硝 基胍或甲磺酸乙酯(Nestmann，Mutat Res 1975年6月；28(3)：323-30)， 然后从宿主中分离含有该基因的载体。

饱和诱变是随机诱变的另一种形式，其中人们试图在特定位点或 基因的狭窄区域内产生全部或几乎所有可能的突变。一般意义上，饱和 诱变包括在待诱变的多核苷酸序列(其中待诱变的序列的长度例如为15 至100,000个碱基)中诱变一套完整的诱变盒(其中每个盒的长度为例如 1-500个碱基)。因此，将一组突变(例如，1至100个突变)引入到每个盒 中以进行诱变。待引入到一个盒中的一组突变可以与在一轮饱和诱变应 用期间引入到第二盒中的第二组突变不同或相同。这样的分组通过缺失、 添加、特定密码子的分组和特定核苷酸盒的分组来例举。

片段改组诱变也称为DNA改组，是快速传播有益突变的一种方式。 在改组过程的实例中，使用DNAse将一组亲本基因片段化成例如长度约 50-100bp的片。然后是无引物的聚合酶链反应(PCR)-具有足够重叠的同 源序列的DNA片段将彼此退火，并然后通过DNA聚合酶延伸。在一些 DNA分子达到亲本基因的尺寸之后，允许发生数轮PCR延伸。然后可 以用另一个PCR来扩增这些基因，将该加入设计为补足链末端的引物。 引物可以在其5'端添加额外的序列，如连接到克隆载体所需的限制酶识 别位点的序列。在US20050266541中提供了改组技术的其他示例。

同源重组诱变涉及外源DNA片段与靶向多核苷酸序列之间的重 组。发生双链断裂后，断裂5'端周围的DNA部分被切除，该过程称为 切除。在随后的链侵入步骤中，破裂DNA分子的突出3'端然后“侵入” 未破裂的相似或相同DNA分子。所述方法可用于删除基因、去除外显 子、添加基因以及引入点突变。同源重组诱变可以是永久的或有条件的。 通常还提供重组模板。重组模板可以是另一种载体的组分，其包含在单 独的载体中，或作为单独的多核苷酸提供。在一些实施方案中，将重组 模板设计作为同源重组(如在由位点特异性核酸酶切开或切割的靶序列 内或附近)中的模板。模板多核苷酸可以具有任何合适的长度，如长度约 或大于约10个、15个、20个、25个、50个、75个、100个、150个、 200个、500个、1000个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，模板多 核苷酸与包含靶序列的多核苷酸的一部分互补。当最佳比对时，模板多 核苷酸可与靶序列的一个或多个核苷酸(例如，约或大于约1个、5个、 10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60 个、70个，80个、90个、100个或更多个核苷酸)重叠。在一些实施方 案中，当模板序列和包含靶序列的多核苷酸最佳比对时，模板多核苷酸 的最近核苷酸是约1个、5个、10个、15个、20个、25个、50个、75 个、100个、200个、300个、400个、500个、1000个、5000个、10000 个或更多个来自靶序列的核苷酸。用于同源重组方法的定点核酸酶的非 限制性实例包括锌指核酸酶、CRISPR核酸酶、TALE核酸酶和大范围核 酸酶。关于使用此类核酸酶的进一步描述，参见例如US8795965和US20140301990。

CRISPR/Cas9(成簇规律间隔短回文重复)/CRISPR相关(Cas)系统 通过使用CRISPR RNA(crRNA)为细菌和古菌提供针对病毒和质粒的适 应性免疫，以指导入侵核酸的沉默。Cas9蛋白质(或其功能等同物和/或 变体，即，Cas9样蛋白)天然含有DNA核酸内切酶活性，其依赖于蛋白 质与称为crRNA和tracrRNA(也称为引导RNA)的两种天然存在的或合成的RNA分子之间的相关性。在一些情况下，两个分子共价连接形成 单个分子(也称为单个指导RNA(“sgRNA”))。因此，Cas9或Cas9样蛋 白质与DNA靶向的RNA(该术语包括两分子指导RNA构型和单分子指 导RNA构型)相关联，其激活Cas9或Cas9样蛋白质并将该蛋白质引导至靶核酸序列。如果Cas9或Cas9样蛋白质保留其天然的酶功能，则其 将切割靶DNA以产生双链断裂，这可导致基因组改变(即，编辑：缺失、 插入(当供体多核苷酸存在时)、替换等)，从而改变基因表达。Cas9的某 些变体(其中变体包含在术语Cas9样中)已被改变，使得它们具有降低的 DNA切割活性(在一些情况下，它们切割单链而不切割靶DNA的两条链， 而在其他情况下，它们已经剧烈降低至不具有DNA切割活性)。用于引 入遗传变异的CRISPR系统的其他示例性描述可以在例如US8795965中 找到。

主要产生点突变和短缺失、插入、颠换和/或转换的诱变剂(包括化 学诱变剂或辐射)可用于产生遗传变异。诱变剂包括但不限于甲磺酸乙酯、 甲基甲磺酸、N-乙基-N-亚硝基脲，三乙基三聚氰胺、N-甲基-N-亚硝基 脲、丙卡巴肼、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、硫酸二乙酯、丙烯酰胺单体、 苯丙氨酸氮芥、氮芥子气、长春新碱、二甲基亚硝胺、N-甲基-N'-硝基-亚硝基胍、亚硝基胍、2-氨基嘌呤，7,12二甲基-苯丙蒽、环氧乙烷、六 甲基磷酰胺、二硫烷、二环氧烷(二环氧辛烷、二环氧丁烷等)、2-甲氧 基-6-氯-9-[3-(乙基-2-氯-乙基)氨丙基氨基]吖啶二盐酸和甲醛。

引入遗传变异可能是一个不完整的过程，使得处理的细菌群体中 的一些细菌携带期望的突变，而其他细菌则不携带。在一些情况下，希 望施加选择压力以富集携带期望遗传变异的细菌。传统上，选择成功的 遗传变异体包括选择或抵抗由遗传变异赋予或消除的一些功能，如插入 抗生素抗性基因或消除能将非致死性化合物转化为致死性代谢物的代谢 活动。也可以基于多核苷酸序列本身施加选择压力，使得仅需要引入期 望的遗传变异(例如，也不需要选择性标记物)。在这种情况下，选择压 力可包括切割缺乏引入到靶位点的遗传变异的基因组，使得选择有效地 针对力图待引入遗传变异的参考序列。通常，切割发生在靶位点的100 个核苷酸内(例如，在离靶位点75个、50个、25个、10个或更少核苷酸内，包括靶位点处或靶位点内的切割)。切割由选自锌指核酸酶、 CRISPR核酸酶、TALE核酸酶(TALEN)或大范围核酸酶的位点特异性核 酸酶来指导。除了未提供用于同源重组的模板之外，这样的过程类似于 用于增强靶位点处的同源重组的过程。因此，缺乏所需遗传变异的细菌 更可能经历分裂、未修复，从而导致细胞死亡。然后可以分离在选择下 存活的细菌，用于暴露于植物以评估改良的性状。

CRISPR核酸酶可用作位点特异性核酸酶以指导对靶位点的切割。 通过使用Cas9可获得突变微生物的改进选择以杀死未突变的细胞。然后 用突变微生物接种植物以重新确认共生并产生进化压力以选择有效的共 生体。然后可以从植物组织中重新分离微生物。除了未提供用于同源重 组的模板，用于针对非变体选择的CRISPR核酸酶系统可以使用与上文 关于引入遗传变异所描述的相似的元件。定向至靶位点的切割因此增强 了受影响的细胞的死亡。

可以使用其他选择来特异性诱导靶位点处的切割，如锌指核酸酶、 TALE核酸酶(TALEN)系统和大范围核酸酶。锌指核酸酶(ZFN)是通过将 锌指DNA结合域与DNA切割结构域融合而产生的人工DNA核酸内切 酶。可将ZFN工程化为靶向期望的DNA序列，并且这使得锌指核酸酶 能够切割独特的靶序列。当引入到细胞时，ZFN可用于通过诱导双链断 裂来编辑细胞中的靶DNA(例如，细胞的基因组)。转录激活剂样效应物 核酸酶(TALEN)通过将TAL(转录激活剂样)效应物DNA结合域与DNA 切割结构域融合而产生人工DNA核酸内切酶。TALENS可快速工程化 以实际结合任何所需的DNA序列，并且当引入到细胞时，TALEN可通过诱导双链断裂来编辑细胞中的靶DNA(例如，细胞的基因组)。大范围 核酸酶(寻靶核酸内切酶)是以大识别位点为特征的脱氧核糖核酸内切酶 (12至40个碱基对的双链DNA序列)。大范围核酸酶可用于以高度靶向 的方式取代、消除或修饰序列。通过蛋白质工程修饰它们的识别序列， 可以改变靶序列。大范围核酸酶可用于修饰所有的基因组类型，无论是 细菌、植物还是动物，通常分为四个家族：LAGLIDADG家族、GIY-YIG 家族，His-Cyst box家族和HNH家族。示例性的寻靶核酸内切酶包括 I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、 I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。

可采用本公开的方法来引入或改良各种期望性状中的一种或多种。 可引入或改良的性状的实例包括：根系生物量、根长、高度、枝条长度、 叶数、水分利用效率、总生物量、产量、果实大小、粒度、光合速率、 对干旱的耐受性、耐热性、耐盐性、对线虫应激的抗性、对真菌病原体 的抗性、对细菌病原体的抗性、对病毒病原体的抗性、代谢物水平和蛋 白质组表达。所需的性状(包括：高度、总生物量、根/枝条生物量、种 子萌发、幼苗存活、光合效率、蒸腾速率、种子/果实数或质量、植物籽 粒或果实产量、叶片叶绿素含量、光合速率、根长或其任何组合)可用于 测定生长，并与在相同条件下生长的参照农业植物(例如，未改良性状的 植物)的生长速率进行比较。如本文所述，待引入或改良的优选性状是固 氮。在一些情况下，由本文所述方法得到的植物表现出性状差异，其比 相同条件下在土壤中生长的参照农业植物大至少约5％(例如至少约5％、 至少约8％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至 少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约75％、至少约80％、至少约80％、至少约90％、或至少100％、至少约200％、至少 约300％、至少约400％)或更大。

可以在包括施用一种或多种生物或非生物应激物的条件下评估待 改良的性状。应激物的实例包括非生物应激(如热应激、盐应激、干旱应 激、低温应激和低营养应激)和生物应激(如线虫应激、昆虫食草性应激、 真菌病原体应激、细菌病原体应激和病毒病原体应激)。

通过本公开的方法和组合物改良的性状可以是固氮，包括在之前 不能固氮的植物中固氮。在一些情况下，根据本文所述的方法分离的细 菌产生1％或更多(例如，2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、 15％、20％或更多)的植物氮，这可表示与引入任何遗传变异之前从第一 植物分离的细菌相比，固氮能力增加至少2倍(例如，3倍、4倍、5倍、 6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍或更多 倍)。在一些情况下，细菌会产生5％或更多的植物氮。可将引入遗传变 异、暴露于多种植物以及从具有改良性状的植物中分离细菌的步骤重复 一次或多次(例如，1、2、3、4、5、10、15、25次或更多次)后，实现所 期望的固氮水平。在一些情况下，在补充有谷氨酰胺、氨或其他化学氮 源的肥料的存在下可实现固氮水平的提高。评估固氮程度的方法是已知 的，其实例在本文中描述。

固氮

本文描述了增加植物中固氮的方法，其包括将该植物暴露于包含 一种或多种遗传变异的细菌，所述一种或多种遗传变异引入到调节固氮 的一个或多个基因中，其中所述细菌在植物中产生1％或更多(例如，2％、5％、10％或更多)的氮，这表示所述植物的氮固定能力可为不存在细菌的 植物的至少2倍。该细菌可在补充有谷氨酰胺、氨的肥料的存在下产生 氮。遗传变异可以是任何数目的本文所述任何遗传变异及任何组合，包 括以上提供的实例。该遗传变异可以引入到选自以下项的基因中：nifA、 nifL、ntrB、ntrC、谷氨酰胺合成酶、glnA、glnB、glnK、draT、amtB、 谷氨酰胺酶、glnD、glnE、nifJ、nifH、nifD、nifK、nifY、nifE、nifN、 nifU、nifS、nifV、nifW、nifZ、nifM、nifF、nifB和nifQ。该遗传变异 可以是导致以下一项或多项的突变：nifA或谷氨酰胺酶的表达或活性增 加；nifL、ntrB、谷氨酰胺合成酶、glnB、glnK、draT、amtB的表达或 活性降低；GlnE的腺苷酰去除活性降低；或GlnD的尿苷酰去除活性降 低。引入到本文公开的方法的一种或多种细菌的遗传变异可以是敲除突变，或者其可消除靶基因的调节序列，或者其可包含异源调节序列的插 入，例如在相同细菌物种或属的基因组内发现的调节序列的插入。该调 节序列可基于细菌培养或植物组织内基因的表达水平来选择。该遗传变 异可通过化学诱变产生。步骤(c)中生长的植物可暴露于生物或非生物应 激物。

本文所述的植物中发生的固氮量可以以若干种方式进行测量，例 如通过乙炔还原(AR)测定。乙炔还原测定可在体外或体内进行。特定细 菌为植物提供固定的氮的证据可包括：1)总植物N在接种后显著增加， 优选伴随植物中N浓度增加；2)接种后在N限制条件下(应该包括干物 质增加)，缺氮症状得以缓解；3)通过使用¹⁵N方法(其可以是同位素稀释 实验、¹⁵N₂还原测定或¹⁵N天然丰度测定)记录N₂固定；4)固定的N掺 入到植物蛋白质或代谢物中；以及5)在未接种的植物或用接种菌株的突 变体接种的植物中未看到所有这些作用。

野生型固氮调节级联反应可以表示为数字逻辑电路，其中输入O₂和NH₄ ⁺通过或非门，其输出除了ATP之外还进入与门。在一些实施方 案中，本文公开的方法在调节级联反应中的多个点处破坏NH₄ ⁺对该回路 的影响，使得甚至在施肥田间中微生物也可产生氮。然而，本文公开的 方法还设想改变ATP或O₂对电路的影响，或用细胞中的其他调节级联 反应替代该电路，或改变除固氮以外的遗传电路。基因簇可被重新工程 化以在异源调节系统的控制下产生功能性产物。通过消除基因簇编码序 列之外和之内的天然调节因子，并用替代的调节系统取代它们，复杂的 遗传操纵子和其他基因簇的功能性产物可被控制并且/或者移动到异源 细胞(包括衍生天然基因的物种之外的不同物种的细胞)。一旦重新设计， 合成基因簇可通过遗传电路或其他诱导型调节系统来控制，从而根据需 要控制产物的表达。可将表达盒设计成逻辑门、脉冲发生器、振荡器、 开关或存储设备。控制表达盒可以与启动子连接，使得表达盒用作环境 传感器，如氧气、温度、触觉、渗透应力、膜应力或氧化还原传感器。

举例来说，nifL、nifA、nifT和nifX基因可从nif基因簇中消除。 可通过密码子随机化编码每个氨基酸序列的DNA来设计合成基因。进 行密码子选择，指定密码子使用与天然基因中密码子使用尽可能不同。 针对任何不希望的特征(如，限制酶识别位点、转座子识别位点、重复序 列、σ54和σ70启动子、隐蔽核糖体结合位点和rho独立终止子)扫描推 荐的序列。选择合成的核糖体结合位点以匹配每个相应的天然核糖体结 合位点的强度，如通过构建荧光报告质粒，其中围绕基因起始密码子的 150bp(-60至+90)与荧光基因融合。该嵌合体可在Ptac启动子的控制下 表达，并通过流式细胞术测量荧光。为了产生合成的核糖体结合位点， 使用150bp(-60至+90)的合成表达盒产生报告质粒文库。简而言之，合 成表达盒可以由随机DNA间隔区、编码RBS文库的简并序列和针对每 个合成基因的编码序列组成。筛选多个克隆以鉴定与天然核糖体结合位 点最佳匹配的合成核糖体结合位点。因此构建由与天然操纵子的相同基 因组成的合成操纵子并对功能互补进行测试。US20140329326中提供了 合成操纵子的进一步示例性描述。

细菌物种

可用于本文公开的方法和组合物的微生物可通过从天然植物的表 面或组织提取微生物来获得；研磨种子以分离微生物；将种子种植在不 同的土壤样品中并从组织中回收微生物；或用外源微生物接种植物并确 定哪些微生物出现在植物组织中。植物组织的非限制性实例包括种子、 幼苗、叶、切片、植物、球茎或块茎。在一些情况下，从种子分离细菌。处理样品的参数可以变化，以分离不同类型的缔合微生物，如根际、附 生植物或内生菌。细菌也可能来自储存库(如环境应变集合)，而不是从 第一植物最初分离的。通过测序分离微生物的基因组，微生物可以是基 因型和表型；对植物中群落的组成进行概况分析；表征群落或分离的微 生物的转录功能；或使用选择性或表型培养基(例如，固氮或溶磷表型) 筛选微生物特征。选定的候选菌株或种群可以通过序列数据；表型数据； 植物数据(例如，基因组、表型和/或产量数据)；土壤数据(例如，pH、 N/P/K含量和/或非根际土生物群落)；或它们的任何组合来获得。

本文所述的细菌及产生细菌的方法可适用于能够在叶表面、根表 面或植物组织内部有效地自我繁殖而不诱导有害植物防御反应的细菌或 对植物防御反应具有抗性的细菌。本文所述的细菌可以通过在未添加氮 的培养基中培养植物组织提取物或叶表面洗涤剂来分离。然而，细菌可 能是不可培养的，也就是说，使用本领域已知的标准方法不能培养或难 以培养。本文所述的细菌可以是内生菌或附生植物或居住在植物根际的 细菌(根际细菌)。将引入遗传变异、暴露于多种植物以及从具有改良性 状的植物中分离细菌的步骤重复一次或多次(例如，1、2、3、4、5、10、 15、25次或更多次)后获得的细菌可以是内生植物的、附生植物的或根 际的。内生菌是进入植物内部而没有引起疾病症状或引起共生结构形成 的生物体，并且由于它们可以增强植物生长并改善植物的营养(例如，通 过固氮)，因此具有农学价值。细菌可以是种子携带的内生菌。种子携带 的内生菌包括与草或植物的种子相关或源自其的细菌，如在成熟、干燥、 未受损(例如，无裂纹、可见真菌感染或过早萌发)的种子中发现的种子 携带的细菌内生菌。种子携带的细菌内生菌可与种子表面相关联或来源 于种子表面；备选地或另外地，它可与内部种子隔室(例如，表面灭菌的 种子)关联或来源于内部种子隔室。在一些情况下，种子携带的细菌内生 菌能够在植物组织内(例如，在种子内部)复制。此外，在一些情况下， 种子携带的细菌内生菌能够在干燥的条件下存活。

根据本公开的方法分离的细菌可包括多种不同的细菌分类群的组 合。举例来说，所述细菌可包括变形菌门(如假单胞菌属、肠杆菌属、寡 养单胞菌属、伯克霍尔德氏菌属、根瘤菌属、草螺菌属、泛菌属、沙雷 氏菌属、拉恩氏菌属、固氮螺菌属、固氮根瘤菌属、固氮菌属、杜氏藻 属(Duganella)、代尔夫特菌属(Delftia)、慢生根瘤菌属、中华根瘤菌属和盐单胞菌属)、厚壁菌门(如芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、乳杆菌属、枝 原体属和Acetabacterium)和放线菌门(如链霉菌属、红球菌属 (Rhodacoccus)、微杆菌属和短小杆菌属(Curtobacterium))。可通过本文公 开的方法产生的细菌包括固氮菌种、慢生根瘤菌种、克雷伯氏菌种和中 华根瘤菌种。所述细菌可选自：棕色固氮菌、大豆慢生根瘤菌，肺炎克 雷伯氏菌和苜蓿中华根瘤菌。细菌可以是肠杆菌属和拉恩氏菌属。

所述细菌可从任何一般的陆地环境(包括其土壤、植物、真菌、动 物(包括无脊椎动物)和其他生物；包括湖泊和河流的沉积物、水和生物)； 海洋环境，其生物和沉积物(例如，海水、海泥、海洋植物、海洋无脊椎 动物(例如，海绵)、海洋脊椎动物(例如，鱼类))；陆地和海洋地圈(表土 和岩石，例如地下碎石、沙子和粘土)；冰冻圈及其融水；大气(例如，过滤的空中尘埃、云雾和雨滴)；城市、工业和其他人造环境(例如，在 混凝土、路边排水沟、屋顶表面和路面上堆积的有机和矿物质)中获得。

从中获得细菌的植物可以是具有一种或多种所需性状的植物，例 如在特定环境或在特定感兴趣的条件下天然生长的植物。举例来说，某 种植物可自然生长在高盐度的沙质土壤或沙地中，或者在极端温度下， 或者几乎没有水，或者它可以抵抗环境中存在的某些害虫或疾病，并且 它对于在这种条件下生长经济作物是所需的，特别是如果这些条件是例 如在特定地理位置可获得的唯一条件。作为进一步的实例，可从在这样 的环境中生长的经济作物中收集细菌，或者更具体地从在任何特定环境 下生长的作物中显示出最感兴趣的性状的单个作物中收集：例如，在盐 限制土壤中生长的作物中生长速度最快的植物、或受到严重昆虫损害或 疾病流行的作物中受损最小的植物、或具有期望量的某些代谢物和其他 化合物(包括纤维含量、含油量等)的植物、或展现所需颜色、味道或气 味的植物。可从感兴趣的植物或在感兴趣的环境中存在的任何物质(包括 真菌和其他动物和植物生物、土壤、水、沉积物和前面提到的环境的其 他元素)中收集细菌。

所述细菌可从植物组织中分离。该分离可以发生在植物的任何合 适的组织中，包括例如根、茎和叶以及植物再生组织。举例来说，用于 从植物分离的常规方法通常包括无菌切除感兴趣的植物材料(例如，根或 茎长、叶)、用合适的溶液(例如，2％的次氯酸钠)进行表面灭菌，之后将 植物材料放置在营养培养基上用于微生物生长。或者，表面灭菌的植物 材料可在无菌液体(通常为水)和液体悬浮液中粉碎，包括小片的植物材 料散布在合适的固体琼脂培养基或培养基的表面上，这可以是或可以不 是有选择性的(例如，只含有植酸作为磷的来源)。这种方法对于细菌是 特别有用的，该细菌可形成分离的菌落，并且可以单独地挑取以分离营 养培养基平板，并通过众所周知的方法进一步纯化成单一物种。或者， 未对植物根部或叶子样品进行表面杀菌，而只是在分离过程中温和地洗 涤(包括表面居住的附生微生物)，或者通过在琼脂培养基的表面上压印 及提取植物根、茎或叶，然后如上所述分离单菌落，可以分别分离附生 微生物。例如，该方法对细菌特别有用。或者，可以处理根部而不洗掉 附着在根上的少量土壤，包括在植物根际定植的微生物。另外，可去除粘附于根部的土壤、稀释并散布在合适的选定和非选定培养基的琼脂上 以分离根际细菌的单菌落。

水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)和Enterobacter sacchari的生 物学纯培养物于2015年7月14日保藏在美国弗吉尼亚州马纳萨斯的美 国典型培养物保藏中心(ATCC；国际保藏机构)，并且分别具有ATTC专 利保藏号PTA-122293和PTA-122294。这些保藏是根据“国际承认用于 专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约”和“细则”(布达佩斯条约)的规定 进行的。

组合物

包含根据本文所述方法所产生和/或具有本文所述特征的细菌或 细菌种群的组合物还可用于改良植物性状。包含细菌种群的组合物可包 覆在种子的表面上，并且可以是液体形式。该组合物包括商业上的重要 农作物(例如，高粱、油菜、番茄、草莓、大麦、稻、玉米和小麦)的种 子包衣。还可以将该组合物喷洒在植物的地上部分，或者通过插入种植 植物种子的犁沟中、向土壤浇水、或将根浸入组合物的悬浮液中而施用 于根部。该组合物可以以维持细胞活力及人工接种并定植宿主植物的能 力的合适方式脱水。细菌种类可以以10⁸-10¹⁰CFU/ml的浓度存在于组合 物中。该组合物可补充有痕量金属离子，例如钼离子、铁离子、锰离子 或这些离子的组合。本文所述组合物中的离子浓度可在约0.1mM至约 50mM之间。该组合物还可以与载体(如β-葡聚糖、羧甲基纤维素(CMC)、 细菌胞外聚合物质(EPS)、糖、动物乳或其他合适的载体)一起配制。或 者，可以使用泥炭或种植材料作为载体，或者其中组合物被包埋在生物 聚合物中的生物聚合物可用作载体。包含本文所述的细菌种群的组合物 可改良植物性状，如促进植物生长、维持叶片中高叶绿素含量、增加果 实或种子数量以及增加果实或种子单位重量。

包含本文所述的细菌种群的组合物可以涂覆到种子的表面上。如 此，也考虑包含用本文所述的一种或多种细菌包覆的种子的组合物。种 子包衣可通过将细菌种群与多孔的、化学惰性的粒状载体混合而形成。 或者，可将该组合物直接插入到种植种子的犁沟中，或喷洒到植物叶子 上，或通过将根浸入组合物的悬浮液中而施用。可以使用有效量的组合物来填充邻近具有活细菌生长的植物根部的土壤下部分，或者填充具有 活细菌生长的植物叶子。通常，有效量是足以使植物具有改良的性状(例 如，期望的固氮水平)的量。

本文所述的细菌组合物可使用农业上可接受的载体来配制。可用 于这些实施方案的制剂可包括选自增粘剂、微生物稳定剂、杀真菌剂、 抗菌剂、除草剂、杀线虫剂、杀虫剂，植物生长调节剂、肥料、灭鼠剂、 干燥剂和营养素中的至少一种。例如，本文所述的任何组合物可包括农 业上可接受的载体，例如，一种或多种肥料(如非天然存在的肥料)、粘 合剂(如非天然存在的粘合剂)以及杀虫剂(如非天然存在的杀虫剂)。非天 然存在的粘合剂可以是例如聚合物、共聚物或合成蜡。例如，本文所述 的任何包衣的种子、幼苗或植物可在种子包衣中含有此类农业上可接受 的载体。在本文所述的任何组合物或方法中，农业上可接受的载体可以 是或可包括非天然存在的化合物(例如，非天然存在的肥料、非天然存在的粘合剂(如聚合物、共聚物或合成蜡)或非天然存在的杀虫剂)。下面描 述农业上可接受的载体的非限制性实例。农业上可接受的载体的其他实 例是本领域已知的。

在一些情况下，细菌与农业上可接受的载体混合。该载体可以是 固体载体或液体载体，并且可以包括微球、粉末、乳剂等各种形式。载 体可以是赋予各种性质(如，增加的稳定性、润湿性或分散性)的许多载 体中的任何一种或多种。润湿剂如天然或合成表面活性剂(其可以是非离 子型或离子型表面活性剂)或其组合可以包括在该组合物中。油包水乳液 也可用于配制包含分离的细菌的组合物(参见例如美国专利号7,485,451)。 可以制备的合适制剂包括可湿性粉剂、颗粒剂、凝胶剂、琼脂条或丸剂、 增稠剂等、微囊化颗粒等、诸如水流动剂的液体、水性悬液、油包水乳 剂等。该制剂可包括谷物或豆类产品，例如磨碎的谷物或豆类、由谷物 或豆类得到的汤或面粉、淀粉、糖或油。

在一些实施方案中，农业载体可以是土壤或植物生长培养基。可 以使用的其他农业载体包括水、肥料、基于植物的油、保湿剂或其组合。 或者，该农业载体可以是固体，如硅藻土、壤土、二氧化硅、藻酸盐、 粘土、膨润土、蛭石、果皮、其他植物和动物产品或其组合，其包括颗 粒剂、丸剂或悬浮液。还可考虑将任何上述成分的混合物作为载体，诸 如但不限于pesta(面粉和高岭土)，在壤土、沙子或粘土等中的琼脂或基 于粉状物的丸块。制剂可包括细菌的食品来源(如大麦、稻或其他生物材 料(如种子、植物部分、蔗渣))、来自谷物加工的外壳或茎秆、来自建筑 工地废物的磨碎的植物材料或木材、来自再循环纸、织物或木材的锯屑 或小纤维。

例如，肥料可有助于促进生长或为种子、幼苗或植物提供营养素。 肥料的非限制性实例包括氮、磷、钾、钙、硫、镁、硼、氯化物、锰、 铁、锌、铜、钼和硒(或其盐)。肥料的其他实例包括氨基酸、盐、碳水 化物、维生素、葡萄糖、NaCl、酵母提取物，NH₄H₂PO₄、(NH₄)₂SO₄、甘油、缬氨酸、L-亮氨酸、乳酸、丙酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、KH 酒石酸、木糖、来苏糖和卵磷脂中的一种或多种。在一个实施方案中， 该制剂可包含增粘剂或粘附剂(被称为粘合剂)以帮助将其他活性剂与物 质(例如，种子的表面)结合。此类试剂可用于将细菌与可含有其他化合 物的载体(例如，非生物控制剂)组合以产生涂层组合物。此类组合物有 助于在植物或种子周围产生涂层，以保持微生物和其他试剂与植物或植 物部分之间的接触。在一个实施方案中，粘合剂选自藻酸盐、树胶、淀 粉、卵磷脂、芒柄花素(formononetin)、聚乙烯醇、芒柄花碱(alkali formononetinate)、橙皮素、聚醋酸乙烯酯、脑磷脂、阿拉伯树胶、黄原 胶、矿物油，聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、阿拉伯半乳聚糖、 甲基纤维素、PEG400、壳聚糖、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚丙烯腈、 甘油、三甘醇、乙酸乙烯酯、吉兰糖胶、聚苯乙烯、聚乙烯、羧甲基纤 维素、印度胶和聚氧乙烯-聚氧丁烯嵌段共聚物。

在一些实施方案中，粘合剂可以是例如，蜡(如巴西棕榈蜡、蜂蜡、 中国蜡、紫胶蜡、鲸蜡、小烛树蜡、蓖麻蜡、小冠巴西棕蜡和米糠蜡)、 多糖(例如，淀粉、糊精、麦芽糖糊精、藻酸盐和壳聚糖)、脂肪、油、 蛋白质(例如，明胶和玉米)、浮胶(gum arables)和虫胶。粘合剂可以是非 天然存在的化合物，例如聚合物、共聚物和蜡。例如，可用作粘合剂的 聚合物的非限制性实例包括：聚醋酸乙烯酯、聚醋酸乙烯酯共聚物、乙 烯醋酸乙烯酯(EVA)共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯醇共聚物、纤维素(例如， 乙基纤维素、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素和羧甲基纤维 素)、聚乙烯吡咯烷酮，氯乙烯、偏二氯乙烯共聚物、木质素磺酸钙、丙 烯酸共聚物、聚乙烯丙烯酸酯、聚环氧乙烷、酰胺聚合物和共聚物、聚 羟乙基丙烯酸酯、甲基丙烯酰胺单体和聚氯丁烯。

在一些实例中，粘合剂、抗真菌剂、生长调节剂和杀虫剂(例如， 杀虫剂)中的一种或多种是非天然存在的化合物(例如，以任何组合)。农 业上可接受的载体的其他实例包括分散剂(例如，聚乙烯吡咯烷酮/乙酸 乙烯酯PVPIVA S-630)、表面活性剂、粘结剂和填充剂。

所述制剂还可包含表面活性剂。表面活性剂的非限制性实例包括 诸如Prefer 28(Cenex)、Surf-N(US)、Inhance(Brandt)、P-28(Wilfarm) 和Patrol(Helena)的氮-表面活性剂混合物；酯化的种子油包括Sun-It II (AmCy)、MSO(UAP)、Scoil(Agsco)、Hasten(Wilfarm)和Mes-100(Drexel)； 以及有机硅表面活性剂包括Silwet L77(UAP)、Silikin(Terra)、Dyne-Amic (Helena)、Kinetic(Helena)、Sylgard 309(Wilbur-Ellis)和Century(Precision)。 在一个实施方案中，该表面活性剂以0.01％v/v至10％v/v的浓度存在。 在另一个实施方案中，该表面活性剂以0.1％v/v至1％v/v的浓度存在。

在某些情况下，所述制剂包含微生物稳定剂。此类试剂可包括干 燥剂，该干燥剂可包含可以分类为干燥剂的任何化合物或化合物的混合 物，而不管所述化合物是否以其实际上对液体接种剂具有干燥作用的浓 度使用。此类干燥剂理想地与所使用的细菌种群相容，并且应该促进微 生物种群在种子上施用以及在干燥下存活的能力。合适的干燥剂的实例 包括海藻糖、蔗糖、甘油和甲二醇中的一种或多种。其他合适的干燥剂 包括但不限于非还原糖和糖醇(例如，甘露醇或山梨糖醇)。引入到制剂 中的干燥剂的量按重量计可为每体积约5％至约50％，例如，约10％至 约40％、约15％至约35％、或约20％至约30％。在一些情况下，制剂含 有诸如杀真菌剂、抗菌剂、除草剂、杀线虫剂、杀虫剂，植物生长调节 剂、灭鼠剂或营养素等试剂是有利的。生长调节剂的非限制性实例包括 油菜素类固醇、细胞激动素(例如，激动素和玉米素)、植物生长激素(例 如，吲哚乙酸和吲哚乙酰天冬氨酸)、类黄酮和异类黄酮(例如，芒柄花 素和香叶木素)、植物抗毒素(phytoaixins)(例如，大豆抗毒素(glyceolline)) 和植物抗毒素诱导的寡糖(例如，果胶、角素、壳聚糖、多聚半乳糖醛酸 和寡聚半乳糖醛酸)以及gibellerins。此类试剂理想地与在其上施用该制 剂的农业种子或幼苗相容(例如，它不应该对植物的生长或健康有害)。 此外，理想地，所述试剂是不会引起人类、动物或工业用途的安全性问 题的试剂(例如，没有安全问题，或者所述化合物非常不稳定以至于源自 植物的商品植物产品只含有可忽略量的化合物)。

以液体例如溶液或悬浮液的形式，可将细菌种群混合或悬浮于水 中或水溶液中。合适的液体稀释剂或载体包括水、水溶液、石油馏出物 或其他液体载体。

固体组合物可通过将细菌种群分散在适当分开的固体载体如泥炭、 小麦、麸、蛭石、粘土、滑石、膨润土、硅藻土、漂白土，巴氏杀菌的 土壤等中来制备得到。当此类制剂用作可湿性粉剂时，可使用生物相容 的分散剂，如非离子型、阴离子型、两性或阳离子型分散剂和乳化剂。

配制时使用的固体载体例如包括诸如高岭土、叶蜡石、膨润土、 蒙脱石、硅藻土，酸性白土、蛭石和珠光体等矿物载体，以及诸如硫酸 铵、磷酸铵、硝酸铵、尿素、氯化铵和碳酸钙等无机盐。另外，可使用 诸如小麦粉、麦麸、米糠等有机细粉。液体载体包括植物油(如大豆油和 棉籽油)、甘油、乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、聚丙二醇等。

植物品种

本文所述的方法和细菌适用于多种植物中的任何一种，如大麦属、 稻属、玉米属和小麦属中的植物。合适的植物的其他非限制性实例包括 苔藓、地衣和藻类。在一些情况下，诸如粮食作物、纤维作物、油料作 物、林业或造纸工业中的植物、生物燃料生产的原料和/或观赏植物等植 物具有经济、社会和/或环境价值。作物的非限制性实例包括玉米、稻、小麦、大麦、高粱、小米、燕麦、黑小麦、荞麦、甜玉米、甘蔗、洋葱、 番茄、草莓和芦笋。

可使用本文公开的方法和组合物获得或改良的植物还包括菠萝、 香蕉、椰子、百合和禾；以及双子叶植物，诸如豌豆、苜蓿、绿番茄、 甜瓜、鹰嘴豆、菊苣、三叶草、羽衣甘蓝、小扁豆、大豆、烟草、土豆、 甘薯、萝卜、卷心菜、油菜(rape)、苹果树、葡萄、棉花、向日葵、拟南 芥、油菜(canola)、柑橘(包括橙、橘、金橘、柠檬、酸橙、葡萄柚、橘 子、橘柚、香橼和柚子)、胡椒、豆和莴苣。

在一些情况下，待改良的植物不适合实验条件。例如，作物可能 花费太长的时间生长以实际上在多次迭代中连续评估改良的性状。因此， 最初分离细菌的第一植物和/或施加了基因操作细菌的多种植物可以是 模式植物，如在所需条件下更易于评价的植物。模式植物的非限制性实 例包括狗尾草属、短柄草属和拟南芥属。然后可根据本公开的方法将使 用模式植物分离细菌的能力应用于另一类型的植物(例如，作物)，以确 认赋予的改良性状。

可通过本文公开的方法改良的性状包括植物的任何可观察特征， 包括例如生长速率、高度、重量、颜色、味道、气味、由植物产生的一 种或多种化合物的变化(包括例如，代谢物、蛋白质、药物、碳水化物、 油和任何其他化合物)。也设想基于基因型信息选择植物(例如，包括响 应于细菌的植物基因表达模式，或鉴定诸如与固氮提高相关的那些遗传 标记物的存在)。也可以基于与某种特征或性状(诸如不希望的特征或性 状)的存在相反的某种特征或性状(诸如期望的特征或性状)的缺乏、抑制 或限制来选择植物。

实施例

本文提供的实施例描述了细菌分离、细菌和植物分析以及植物性 状改良的方法。这些实施例仅用于说明的目的，无论如何不应被解释为 对本发明的限制。

实施例1：从植物组织中分离微生物

表土是从加利福尼亚州中部的各个农业区获得的。收集了20块具 有不同质地特征的土壤，包括重粘土、泥炭粘土壤土、粉质粘土和砂壤 土。如表1所示，将各种田间玉米、甜玉米、传统玉米和番茄的种子种 植到每种土壤中。

表1：种植在具有不同特征的土壤中的作物类型和品种

在生长2-4周后将植物拔除，并且用去离子水除去根表面上的过 量土壤。去除土壤后，用漂白剂对植物进行表面灭菌，并在无菌水中猛 力冲洗。从植物上切下清洁过的1厘米根段，并置于含有3mm钢珠的 磷酸盐缓冲盐水溶液中。通过用Qiagen TissueLyser II剧烈摇动溶液产生 浆液。

将根部和盐水浆液稀释并接种到各种类型的生长培养基上以分离 根际的、内生植物的、附生植物的和其他植物相关的微生物。使用R2A 和Nfb琼脂培养基获得单菌落，并且使用半固体Nfb培养基斜面来获得 固氮细菌种群。在半固体Nfb培养基斜面中温育2-4周后，收集微生物 种群并划线，以获得R2A琼脂上的单菌落，如图1A-图1B所示。将单 菌落重悬于R2A和甘油的混合物中，进行PCR分析，并在-80℃下冷冻 以备后续分析。获得大约1000个单菌落，并指定为“分离的微生物”。

然后对隔离群进行菌落PCR筛选以检测nifH基因的存在以鉴定固 氮生物。上述引物集Ueda 19F/388R(已经显示在筛选中检测到90％以上 的固氮生物)用于探测每个隔离群中nif簇的存在(Ueda等人1995；J. Bacteriol.177:1414–1417)。如图2所示，挑取纯化的隔离群的单菌落， 重悬于PBS中，并用作菌落PCR的模板。给出阳性PCR条带的隔离群 的菌落被重新划线，重复菌落PCR和重复划线过程两次以防止固氮生物 的假阳性鉴定。然后将纯化的隔离群命名为“候选微生物”。

实施例2：分离的微生物的表征

测序、分析和系统发育表征

使用用515f-806r引物集进行的16S rDNA测序以产生分离的微生 物和候选微生物的初步系统发育特性(参见例如Vernon等人；BMC Microbiol.2002Dec 23；2:39)。如表2所示，微生物包括不同的属，包括： 肠杆菌属、伯克霍尔德氏菌属、克雷伯氏菌属、慢生根瘤菌属、拉恩氏 菌属、黄单胞菌属、拉乌尔菌属(Raoultella)、泛菌属、假单胞菌属、短 波单胞菌属、土壤杆菌属和类芽孢杆菌属。

表2：通过深16S rDNA测序确定的从番茄植物中分离的微生物的多样 性。

随后，使用Illumina Miseq平台对39个候选微生物的基因组进行 测序。使用QIAmp DNA微型试剂盒(QIAGEN)提取来自纯培养物的基因 组DNA，并且通过第三方供应商(SeqMatic，Hayward)制备用于测序的 总DNA文库。然后通过A5管线进行基因组组装(Tritt等人，2012；PLoS One 7(9):e42304)。鉴定且注释基因，并且将与固氮调节和表达相关的基因指定为诱变的靶标。

候选微生物的转录物组概况分析

进行菌株CI010的转录物组概况分析来鉴定在环境氮存在下有活 性的启动子。在补充有10mM谷氨酰胺的确定的无氮培养基中培养菌株 CI010。从这些培养物(QIAGENRNeasy试剂盒)中提取总RNA并通过 Illumina HiSeq(SeqMatic，Fremont CA)进行RNAseq测序。使用Geneious 将测序读取映射到CI010基因组数据，并鉴定在近端转录启动子控制下 的高表达基因。表3A-C列出了通过总RNA的RNASeq测序测量的基因 及其相对表达水平。记录近端启动子的序列用于nif途径、氮利用相关 途径或其他具有所需表达水平的基因的诱变。

遗传可追溯性评估

基于可转化性和遗传性对候选微生物进行表征。首先，通过在相 关培养基的小板上生长以及在无氮培养基和富培养基中的生长曲线来确 定最佳的碳源利用率。其次，每种菌株的天然抗生素抗性通过点滴板及 在含有一组用作诱变的选择性标记物的抗生素的液体培养基中生长来确 定。第三，通过质粒集合的电穿孔测试每个菌株的可转化性。质粒集合 包括七个复制起点(即，p15a、pSC101、CloDF、colA、RK2、pBBR1和 pRO1600)和四个抗生素抗性标记物(即，CmR、KmR、SpecR和TetR) 的组合扩增。对来源和抗性标记物相容性的这种系统性评估用于鉴定候 选微生物中基于质粒诱变的载体。

实施例3：候选微生物的诱变

λ-Red介导的敲除

使用质粒pKD46或含有卡那霉素抗性标记物的衍生物产生候选 微生物的几种突变体(Datsenko等人，2000；PNAS 97(12)：6640-6645)。 敲除盒用靶基因侧翼的250bp同源进行设计，并通过重叠延伸PCR产 生。用pKD46转化候选微生物，在阿拉伯糖存在下培养以诱导λ-Red机 器表达，准备用于电穿孔，并用敲除盒转化以产生候选诱变菌株。如表 4所示，使用四种候选微生物和一种实验室菌株产酸克雷伯氏菌M5A1 以产生固氮调节基因nifL、glnB和amtB的十三种候选突变体。

表4：通过λ-Red诱变产生的单个敲除突变体的列表

用Cas9选择的寡核苷酸定向诱变

寡核苷酸定向诱变用于靶向大肠杆菌DH10B中rpoB基因的基因 组变化，并用CRISPR-Cas系统选择突变体。将诱变的寡核苷酸(ss1283: “G*T*T*G*ATCAGACCGATGTTCGGACCTTCcaagGTTTCGATCGGA CATACGCGACCGTAGTGGGTCGGGTGTACGTCTCGAACTTCAAAG CC”，其中*表示硫代磷酸键)设计成通过4-bp突变赋予rpoB基因利福平 抗性。诱导含有编码Cas9的质粒的细胞用于Cas9表达，准备用于电穿 孔，然后用诱变寡核苷酸和编码靶向WT rpoB序列的Cas9切割的指导 RNA(gRNA)的组成型表达的质粒两者进行电穿孔。电穿孔的细胞在非 选择性培养基中回收过夜，以使得到的突变体染色体充分分离。在选择 编码gRNA的质粒上进行平板接种后，筛选的十个菌落中有两个显示出 含有所需的突变，而其余显示为通过gRNA质粒中的前间隔区 (protospacer)突变或Cas9质粒丢失产生的逃逸突变体。

用Cas9选择的λ-Red诱变

候选微生物CI006和CI010的突变体通过具有CRISPR-Cas选择 的λ-Red诱变来产生。敲除盒含有通过转录概况分析(如实施例2中所述 及表3中所述)鉴定的内源性启动子和位于缺失靶标侧翼的约250bp同 源性区域。用在阿拉伯糖诱导型启动子控制下编码λ-Red重组系统(exo、 β、gam基因)和在IPTG诱导型启动子控制下编码Cas9的质粒转化CI006和CI010。在所得到的转化体中诱导Red重组和Cas9系统，并制备用于 电穿孔的菌株。随后将敲除盒和质粒编码的选择gRNA转化到感觉态细 胞中。如图3所示，在对Cas9质粒和gRNA质粒均有选择性的抗生素 上进行平板接种后，筛选的10个菌落中有7个显示出预期的敲除突变。

实施例4：候选分子的体外表型

评估了外源氮对各种突变体中固氮酶生物合成和活性的影响。乙 炔还原分析(ARA)(Temme等人2012；109(18):7085–7090)用于测量纯培 养条件下的固氮酶活性。菌株在气密测试管中生长，并用Agilent 6890 气相色谱仪对乙炔还原成乙烯进行定量。在补充有0至10mM谷氨酰胺 的固氮培养基中生长的候选微生物和对应候选突变体的ARA活性示于图4A-4B和图10A-10C中。

在厌氧培养条件下，测试一系列谷氨酰胺和氨浓度以量化对固氮 活性的影响。在野生型细胞中，随着谷氨酰胺浓度增加，活性迅速降低。 然而，在一系列初始敲除突变中，确认了一类突变，从而能够在谷氨酰 胺的浓度下表达固氮基因，否则会关闭野生型中的活性。如图4C所示， 产生了四种不同的固氮生物物种的图谱。此外，通过使用已经确定的遗传部分重新连接调节网络，可预期调整固氮活性水平。这在图4B中可 见，其图示了菌株CM023、CM021、CM015和CI006。菌株CM023是 低级进化菌株；菌株CM021是高级进化菌株；菌株CM015是中级进化 菌株；菌株CI006则为野生型(菌株2)。使用基于酶的测定法(MEGAZYME)测试排出到培养上清液中的氨。该测定测量在340nm的 吸光度下消耗的NADPH的量。该测定是在无氮、厌氧环境下生长的细 菌培养物以1E9 CFU/ml的起始密度进行的。如图4D所示，在一组六个 进化菌株中，一个菌株在48小时期间内排出高达100μM的氨。此外， 如图11所示，双突变体显示出比其衍生的单突变体更高的氨排出量。这 证明了产生超过其生理需求的氨的微生物生产力。

纯培养物的转录概况分析

使用Nanostring Elements平台测定CI006的转录活性。细胞在无 氮培养基中生长，并且温育4小时后收集10E8个细胞。使用Qiagen RNeasy试剂盒提取总RNA。如图5所示，将纯化的RNA提交给位于加 利福尼亚州帕洛阿尔托的Core Diagnostics进行探针杂交和数字分析仪 分析。

实施例5：候选微生物的植物中表型

候选微生物对植物的定植

通过短期植物生长实验定量候选微生物对所需宿主植物的定植。 玉米植物用表达来自质粒或来自Tn5整合的RFP表达盒的RFP的菌株 接种。植物在灭菌的沙子和有菌泥炭培养基中生长，并且通过在萌发后 三天将1mL细胞培养物直接移液到正在出芽的植物胚芽鞘上进行接种。 通过用含有适当抗生素的溶液浇灌植物来维持质粒。三周后，收集植物 根部，在无菌水中冲洗三次以除去可见的土壤，并分成两个样品。通过 荧光显微镜分析一个根样品以鉴定候选微生物的定位模式。如图6所示， 在10mm长的最细的完整植物根上进行显微镜检查。

开发第二种定量评估定植的方法。对来自接种内生菌的植物的根 的全部DNA制剂 进行定量PCR测定。玉米种子(Dekalb DKC-66-40)在 先前高压灭菌的沙中在2.5英寸×2.5 英寸×10英寸的罐中发芽。种植一 天后，将1ml内生菌过夜培养物(SOB培养基)在种子所在 的地方浸透。 1mL该过夜培养物大约相当于约10^9cfu，取决于使用哪种菌株，在彼 此的3 倍内变化。用补充有2.5mM或0.25mM硝酸铵的50mL改良 Hoagland溶液，每周给每株幼苗施 肥3次。种植四周后，收集根部样品 进行DNA提取。使用加压水喷雾将土壤碎片冲走。然后使 用QIAGEN Tissuelyzer使这些组织样品匀浆化，然后使用QIAmp DNA微型试剂盒 (QIAGEN) 根据推荐的方案来提取DNA。使用Stratagene Mx3005P RT-PCR，在这些DNA提取物上利用对 每种内生菌基因组中的基因座特 异性的经设计的引物(使用NCBI的Primer BLAST)进行 qPCR测定。定 量内生菌的基因组拷贝的存在。为了进一步确认内生菌的身份，对PCR 扩增 产物进行测序并证实具有正确的序列。表5中显示了来自候选微生 物的菌株CI006和CI008 的定植概况。在菌株CI008中证实了根的定植 率高达10^7x cfu/g fw。

菌株	定植率(CFU/g fw)
		CI006	1.45x 10^5
CI008	1.24x 10^7

表5：通过qPCR测定的玉米的定植

植物中RNA的概况分析

通过测量nif基因的转录来估计植物中nif途径组分的生物合成。 从接种CI006的植物(如前所述的种植方法)的根部植物组织中获得总 RNA。根据推荐方案(QIAGEN)使用RNEasy微型试剂盒进行RNA提取。 然后使用Nanostring Elements试剂盒(NanoStringTechnologies，Inc.)利用 对菌株CI006的基因组中的nif基因特异性的探针来测定来自这些植物 组织的总RNA。植物中nif基因表达的数据总结在表6中。在由CM013 菌株接种的植物中检测到nifH基因的表达，而在接种CI006的植物中则 未检测到nifH的表达。菌株CM013是菌株CI006的衍生物，其中nifL 基因已被敲除。

在施肥条件下在植物中测量高度表达的CM011基因，其按照每百 万个千碱基的转 录物(TPM)进行排序。控制这些高度表达的基因中的一 些表达的启动子用作同源重组到靶 向固氮和同化基因座的模板。从温室 生长的、接种CM011的植物提取RNA样品，使用Ribo- Zero试剂盒去 除rRNA，使用Illumina的Truseq平台进行测序并将其映射回CM011 的基因 组。表7中列出了来自CM011的高度表达的基因。

菌株	相对转录物表达
		CI006	9.4
CM013	103.25

表6：nifH在植物中的表达

表7

¹⁵N测定

显示固氮的主要方法是使用氮同位素15N，它在大气中以相对于 14N的设定比率而被发现。通过补充富含15N的肥料或气氛，可以直接 观察到在15N2(Yoshida 1980)气体补充的大气中固定的15N的固氮提高 量，或者相反，通过将富集肥料用大气N₂气体在植物组织中稀释(Iniguez 2004)而固氮。稀释法允许在植物生长过程中观察累积的固定氮，而15N₂气体法限于测量植物在所含气氛中生长的短时间间隔内出现的固定(比 率测量)。因此，气体法在特异性方面较优越(因为植物中高于大气比率 的任何升高的15N₂水平都可以毫无疑义地归因于固定)，但无法显示累 积活性。

已经进行了两种类型的测定以测量相对于野生型和未接种的玉米 植物的改良菌株的固定活性，并且针对几种改良菌株在植物中观察到升 高的固定率(图12、图14A和图14B)。这些测定法有助于证明体外观察 到的菌株的活性转化为体内结果。此外，这些测定方法允许测量肥料对 菌株活性的影响，表明在农业环境中具有适宜的功能。当狗尾草属植物 接种野生型和改良菌株时观察到类似的结果(图13)。在图14A-14C中显 示的植物中的固定活性进一步由转录物组数据支持。相对于野生型对应 物，进化菌株则表现出增加的nifH转录物水平。此外，植物中的微生物 衍生的氮水平也与植物基础上植物的定植水平相关。这些结果(图12、 图13、图14A-14C、图15A和图15B)支持此类假设，即通过nif基因簇 的改善调节，微生物是在植物组织中所见的大气衍生的氮增加的可能原 因。除了直接测量固定之外，还测量了在氮应激植物生物量测定中接种 具有改良菌株的植物的影响。虽然植物生物量可能与许多可能的微生物 与植物的相互作用相关，但是人们预期，当氮限制时，添加固定氮将影 响植物表型。接种的植物在完全不存在氮的情况下生长，并且相对于未 处理的对照组，观察到接种植物的叶面积、枝条鲜重和干重以及根鲜重 和干重显著增加(图14C)。尽管这些差异不能完全归因于固氮，但它们 支持这样的结论，即改良菌株向植物积极提供氮。如上所述使玉米和狗 尾草属植物生长并接种。含有1.2％¹⁵N的肥料通过浇灌定期供给植物。 通过测量植物组织中的¹⁵N水平来量化通过微生物的固氮。在种植后4 周收集第四片叶组织并进行干燥。将干燥的叶样品用珠(QIAGEN Tissuelyzer)匀浆，并等分到用于IRMS(MBL Stable Isotope Laboratory at The Ecosystems Center,Woods Hole,MA)的锡胶囊中。计算来自大气 (NDFA)的氮，并且由CI050和CM002得到的氮产量示于图7中。

植物激素产生测定

矮小的番茄(番茄)栽培品种“Micro-Tom”以前已经用于通过体外 测定来研究吲哚-3-乙酸对果实成熟的影响(Cohen 1996；J Am Soc Hortic Sci 121：520-524)。为了评估候选微生物的植物激素产生和分泌，开发 了使用未成熟的Micro-Tom果实的基于平板的筛选测定法。如图8所示， 12孔组织培养测试板通过用琼脂培养基填充孔使其固化，并将10μL过 夜微生物培养物点在琼脂表面上来制备得到。将含有增加量的赤霉酸 (GA)但不含细菌培养物的琼脂培养皿用作阳性对照和标准。开花后一天， 将从生长的Micro-Tom植物中脱落的花于细菌性斑点培养点处插入(先 插茎)到琼脂中。监测这些花2-3周，之后收获果实并称重。如图9所示， 若干次重复的植物果实质量的增加表明接种微生物产生植物激素。

实施例6：周期性宿主-微生物的进化

用CM013接种玉米植物并生长4周至大约V5生长阶段。连根拔 出经由¹⁵N分析证实来自微生物源的氮积累得到改善的那些植物，并且 使用加压水清洗根部以除去大块土壤。切割0.25g根段并用PBS溶液冲 洗以除去细土壤颗粒和非粘附微生物。使用QIAGENTissueLyser II中的 3mm钢珠将组织样品匀浆。将匀浆稀释并铺在SOB琼脂培养基上。将单菌落重悬于液体培养基中，并对16s rDNA和对接种菌株特有的突变 进行PCR分析。微生物分离、诱变、接种和再分离的过程可以重复进行 以改良微生物性状、植物性状和微生物的定植能力。

实施例7：跨地理的相容性

改良的微生物定植接种植物的能力对于在田间条件下植物的成功 至关重要。尽管所描述的分离方法被设计用于从与玉米等作物密切相关 的土壤微生物中进行选择，但许多菌株可能不能有效地在一定范围的植 物基因型、环境、土壤类型或接种条件下定植。由于定植是一个复杂的 过程，需要微生物菌株与宿主植物之间的一系列相互作用，因此筛选定 植能力已经成为选择优先菌株以进一步开发的核心方法。评估定植的早 期努力使用了菌株的荧光标记，这是有效的，但耗时且不能在每株菌株 基础上扩展。由于定植活动不适合简单的改进，所以从自然定植菌株中 选择潜在的候选产品势在必行。

设计测定法使用qPCR及设计成在群落样品中具有菌株特异性的 引物来测试任何给定宿主植物中野生型菌株的稳定定植。该测定旨在快 速测量来自玉米组织样品的微生物定植率。使用荧光显微镜和基于平板 的技术评估为可能定植的菌株的初始测试表明qPCR方法将是定量和可 扩展的。

典型的测定如下进行：植物，主要为玉米和小麦品种，在温室中 的泥炭盆栽混合物中生长，每种菌株6个副本。在种植后的第四天或第 五天，吸取1mL稀释至OD590为0.6-1.0(约5E+08CFU/mL)的细菌早 期固定相培养物浸液到新出芽的胚芽鞘上。植物只用自来水浇灌，并生 长达四周时采样，其时将植物连根拔起，并且彻底清洗根部以除去大部 分泥炭残留物。将干净的根样品切下并匀浆化以产生植物细胞碎片和相 关细菌细胞的浆液。我们开发了高通量的DNA提取方案，有效地产生 了用作qPCR模板的植物和细菌DNA的混合物。基于细菌细胞刺突实 验，该DNA提取过程提供了相对于根鲜重的定量细菌DNA样品。使用Primer BLAST(Ye 2012)设计的菌株特异性引物评估每个菌株，并与来自 未接种植物的背景扩增进行比较。由于一些引物在未接种的植物中表现 出脱靶扩增，因此通过扩增的存在或与背景水平相比正确产物增加的扩 增来确定定植。

该测定用于测量微生物产物在不同土壤地理学上的相容性。田间 土壤质量和田间条件可以对微生物产品的效果具有巨大的影响。土壤的 pH、保水能力和竞争性微生物只是土壤中可影响接种物存活和定植能力 的几个示例而已。使用从加利福尼亚的农田采样的三种不同的土壤类型 作为植物生长培养基来进行定植测定(图16的A图)。使用中间接种密度 来接近现实农业条件。在3周内，菌株5以1E+06到1E+07CFU/g FW 定植所有植物。植物生长7周后，进化型菌株1在所有土壤类型中表现 出高定植率(1E+06CFU/g FW)。(图16的B图)。

此外，为了评估田间条件复杂度的定植，2015年6月在圣路易斯 奥比斯波开始1英亩田间试验，以评估7种野生型菌株在两种玉米田中 的影响和定植情况。试验的农艺设计和执行由合同田间研究机构Pacific Ag Research进行。为了接种，采用在接种方法实验中测试的相同的泥炭 培养种子包衣技术。在生长季期间，收集植物样品以评估在根和茎内部的定植。在种植后四周和八周，从每次处理的三块重复土地中收集样品， 在16周收获前不久，从每次处理的所有六个重复土地中收集样品。在 12周时从用菌株1和菌株2接种的处理的所有六块重复土地中以及未处 理的对照组中收集另外的样品。与用qPCR和菌株特异性引物进行的其 他定植测定一起评估每克经洗涤的根鲜重的细胞数目。两个菌株，菌株 1和菌株2表现出一致且大面积的根部定植，其在12周时达到峰值，然 后急剧下降(图16的C图)。虽然菌株2出现的数量比菌株1的数量低一 个数量级，但发现植物之间的数量较为一致。似乎没有菌株有效地定植 于茎内部。为了支持qPCR定植数据，使用平板接种和16S测序从根样 品成功地重新分离两种菌株以鉴定匹配序列的分离。

除非本文另外说明或明显与上下文矛盾，否则在描述本发明的上 下文(特别是在所附权利要求的上下文中)中使用的术语“一”、“一个”和 “该”以及类似的指代应解释为涵盖单数和复数两者。除非另有说明，否 则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”将被解释为开放式术语(即，意 指“包括但不限于”)。除非本文另外说明，否则本文中数值范围的叙述仅 仅旨在作为个别引用落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个 单独的值并入说明书，犹如其在本文中单独列举一样。例如，如果公开 了范围10-15，则还公开了11、12、13和14。除非本文另外说明或者与 上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序执行。 除非另外声明，否则本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“诸 如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对本发明的范围进行限制。 说明书中的任何表述都不应被解释为将任何未要求保护的元素指示为实 施本发明所必需的。

尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本 领域技术人员显而易见的是这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域 技术人员在不脱离本发明的情况下现将想到多种变化、改变和替代。应 当理解本文中所述的本发明实施方案的各种替代方案均可用于实施本发 明。旨在由所附权利要求来限定本发明的范围，并由其涵盖这些权利要 求范围内的方法和结构及其等同物。

表3A

表3B

表3C

菌株表

菌株表(续)

尽管有所附权利要求书，在此阐述的公开内容也由以下条目限定：

1.一种生产一种或多种细菌的方法，其包括：

(a)从第一植物的组织或土壤中分离细菌；

(b)将遗传变异引入到一种或多种所述细菌中，以产生一种或多种 变异细菌；

(c)将多种植物暴露于所述变异细菌；

(d)从所述多种植物其中之一的组织或土壤中分离细菌，其中分离 出细菌的所述植物相对于所述多种植物中的其他植物具有改良的性状； 以及

(e)用步骤(d)中分离的细菌重复步骤(b)至(d)。

2.如条目1所述的方法，其中所述改良的性状是增强分离出细菌 的植物中的固氮。

3.如条目1所述的方法，其中所述遗传变异是选自以下基因中的 变异：nifA、nifL、ntrB、ntrC、glnA、glnB、glnK、draT、amtB、glnD、 glnE、nifJ、nifH、nifD、nifK、nifY、nifE、nifN、nifU、nifS、nifV、 nifW、nifZ、nifM、nifF、nifB和nifQ。

4.如条目1所述的方法，其中所述遗传变异是编码具有选自以下 项的功能的蛋白质的基因中的变异：谷氨酰胺合成酶、谷氨酰胺酶、谷 氨酰胺合成酶腺苷酰转移酶、转录激活因子、抗转录激活因子、丙酮酸 黄素氧还蛋白氧化还原酶、黄素氧还蛋白或NAD+-双氮还原酶ADP-D- 核糖转移酶。

5.如条目1所述的方法，其中所述遗传变异是导致以下一项或多 项结果的突变：NifA或谷氨酰胺酶的表达或活性增加；NifL、NtrB、谷 氨酰胺合成酶、GlnB、GlnK、DraT、AmtB的表达或活性降低；GlnE 的腺苷酰去除活性降低；或GlnD的尿苷酰去除活性降低。

6.如条目1所述的方法，其中所述遗传变异是敲除突变。

7.如条目1所述的方法，其中所述遗传变异导致蛋白质结构域活 性的消除或停止。

8.如条目1所述的方法，其中所述遗传变异改变或消除靶基因的 调节序列。

9.如条目1所述的方法，其中所述遗传变异包含异源调节序列的 插入。

10.如条目1所述的方法，其中所述遗传变异包括在细菌物种或属 的基因组内发现的调节序列插入，所述细菌物种或属对应于引入所述遗 传变异的细菌。

11.如条目10所述的方法，其中所述调节序列基于细菌培养或植 物组织内基因的表达水平来进行选择。

12.如条目1所述的方法，其中所述遗传变异通过化学诱变产生。

13.如条目1所述的方法，其中步骤(c)进一步包括将植物暴露于生 物应激物或非生物应激物。

14.如条目2所述的方法，其中在重复步骤(b)至(d)一次或多次后分 离的细菌在与所述第一植物类型相同的第二植物中产生1％或更多的氮。

15.如条目2所述的方法，其中在重复步骤(b)至(d)一次或多次后分 离的细菌与从所述第一植物分离的细菌相比，在固氮方面表现出至少2 倍的增加。

16.如条目14所述的方法，其中所述第二植物在补充有谷氨酰胺、 氨或其他化学氮源的肥料的存在下生长。

17.如条目1所述的方法，其中所述第一植物是农作物植物。

18.如条目17所述的方法，其中所述农作物植物选自大麦、稻、 玉米、小麦、高粱、甜玉米、甘蔗、洋葱、番茄、草莓或芦笋。

19.如条目1所述的方法，其中所述第一植物或多种植物中的植物 是模式植物。

20.如条目19所述的方法，其中所述模式植物选自狗尾草属、短 柄草属或拟南芥属。

21.如条目1所述的方法，其中所述遗传变异是特异性引入到靶位 点的预定遗传变异。

22.如条目1所述的方法，其中所述遗传变异是靶位点内的随机突 变。

23.如条目1所述的方法，其中步骤(a)进一步包括对分离的细菌进 行遗传分析。

24.如条目1所述的方法，其中步骤(b)进一步包括施加选择压力以 富集包含遗传变异的细菌。

25.如条目24所述的方法，其中所述选择压力包括切割缺乏引入 到靶位点的遗传变异的基因组，其中切割发生在靶位点的100个核苷酸 内。

26.如条目24所述的方法，其进一步包括分离在选择压力下存活 的细菌。

27.如条目25所述的方法，其中切割由选自锌指核酸酶、CRISPR 核酸酶、TALE核酸酶或大范围核酸酶的位点特异性核酸酶引导。

28.如条目27所述的方法，其中所述位点特异性核酸酶是CRISPR 核酸酶。

29.如条目1所述的方法，其中所述遗传变异是一个或多个核苷酸 的插入或缺失。

30.如条目1所述的方法，其中在重复步骤(b)至(d)一次或多次后分 离的细菌是内生植物的、附生植物的或根际的。

31.如条目1所述的方法，其中在重复步骤(b)至(d)一次或多次后分 离的细菌包括多种不同的细菌分类群。

32.如条目1所述的方法，其中所述细菌从植物组织中分离。

33.如条目1所述的方法，其中在步骤(a)中分离细菌包括从所述第 一植物的种子分离细菌。

34.一种增加植物中固氮的方法，其包括将植物暴露于包含一种或 多种遗传变异的细菌，所述遗传变异引入到一个或多个调节固氮的基因 中，其中所述细菌在植物中产生1％或更多的氮。

35.如条目34所述的方法，其中所述细菌在植物中产生5％或更多 的氮。

36.如条目34所述的方法，其中所述细菌在植物中产生10％或更 多的氮。

37.如条目34所述的方法，其中所述细菌在补充有谷氨酰胺、氨 或其他化学补充氮源的肥料的存在下产生氮。

38.如条目34所述的方法，其中所述遗传变异是选自以下基因的 变异：nifA、nifL、ntrB、ntrC、谷氨酰胺合成酶、glnA、glnB、glnK、 dra、amtB、谷氨酰胺酶、glnD、glnE、nifJ、nifH、nifD、nifK、nifY、 nifE、nifN、nifU、nifS、nifV、nifW、nifZ、nifM、nifF、nifB和nifQ。

39.如条目34所述的方法，其中所述遗传变异是导致以下一项或 多项结果的突变：NifA或谷氨酰胺酶的表达或活性增加；nifL、ntrB、 谷氨酰胺合成酶、glnB、glnK、draT、amtB的表达或活性降低；GlnE 的腺苷酰去除活性降低；或GlnD的尿苷酰去除活性降低。

40.如条目34所述的方法，其中所述遗传变异(a)是敲除突变；(b) 改变或消除靶基因的调节序列；或(c)包含异源调节序列的插入。

41.如条目34所述的方法，其中所述细菌是肠杆菌属。

42.如条目34所述的方法，其中所述细菌是拉恩氏菌属。

43.如条目34所述的方法，其中所述细菌是内生植物的、附生植 物的或根际的。

44.如条目34所述的方法，其中所述细菌包括多种不同的细菌分 类群。

45.如条目34所述的方法，其中所述植物是农作物植物。

46.如条目34-45中任一项所述的方法，其中所述植物是非豆科植 物。

47.如条目45所述的方法，其中所述农作物植物选自高粱、油菜、 番茄、草莓、大麦、稻、玉米和小麦。

48.如条目45所述的方法，其中所述植物是遗传修饰的生物体 (GMO)。

49.如条目45所述的方法，其中所述植物并非遗传修饰的生物体 (GMO)。

50.如条目45所述的方法，其中所述植物已经进行了遗传工程或 繁殖用于有效的氮利用。

51.包含细菌的细菌种群，所述细菌包含引入到一个或多个调节固 氮的基因的一种或多种遗传变异，其中所述细菌在细菌种群存在下生长 的植物中产生1％或更多的氮。

52.如条目51所述的细菌种群，其中所述细菌在补充有谷氨酰胺、 氨或其他化学补充氮源的肥料的存在下产生氮。

53.如条目51所述的细菌种群，其中所述遗传变异是选自以下基 因中的变异：nifA、nifL、ntrB、ntrC、谷氨酰胺合成酶、glnA、glnB、 glnK、draT、amtB、谷氨酰胺酶、glnD、glnE、nifJ、nifH、nifD、nifK、 nifY、nifE、nifN、nifU、nifS、nifV、nifW、nifZ、nifM、nifF、nifB和 nifQ。

54.如条目51所述的细菌种群，其中所述遗传变异是导致以下一 项或多项结果的突变：nifA或谷氨酰胺酶的表达增加；nifL、ntrB、谷 氨酰胺合成酶、glnB、glnK、draT、amtB的表达降低；GlnE的腺苷酰 去除活性降低；或GlnD的尿苷酰去除活性降低。

55.如条目51所述的细菌种群，其中所述遗传变异(a)是敲除突变； (b)改变或消除靶基因的调节序列；或(c)包含异源调节序列的插入。

56.如条目51所述的细菌种群，其中所述细菌是肠杆菌属。

57.如条目51所述的细菌种群，其中所述细菌是拉恩氏菌属。

58.如条目51所述的细菌种群，其中所述细菌是内生植物的、附 生植物的或根际的。

59.如条目51所述的细菌种群，其中所述细菌包括多种不同的细 菌分类群。

60.一种包含如条目51-59中任一项所述的细菌种群的组合物。

61.如条目60所述的组合物，其中所述组合物包含涂覆在种子表 面上的细菌种群。

62.如条目60所述的组合物，其中所述组合物被配制为液体或粉 末。

63.ATCC保藏号为PTA-122293或PTA-122294的细菌。

Claims (9)

1.一种增加非豆科植物中的固氮的方法，所述方法包括：

将所述植物暴露于多种固氮生物，所述多种固氮生物的每一个成员均包含引入到固氮生物固氮或同化遗传调节网络的一个或多个基因或非编码多核苷酸中的一种或多种遗传变异，其中所述一种或多种遗传变异增加NifA的表达或活性，所述一种或多种遗传变异包含启动子的插入，或者所述一种或多种遗传变异是在编码谷氨酰胺合成酶腺苷酰转移酶/腺苷酰去除酶(GlnE)的基因中的导致以下一项或多项结果的遗传变异：双功能谷氨酰胺合成酶活性降低、腺苷酰转移酶活性降低或腺苷酰去除酶活性降低，使得所述固氮生物能够在外源氮的存在下固定大气氮；其中所述固氮生物并非属间微生物；并且其中植物中的所述固氮生物在所述植物中产生1％或更多的固定氮，其中所述固氮生物还包含改变选自由以下组成的组的基因的活性或表达的遗传变异：ntrB、glnA、glnK、glnD、nifB和nifQ。

2.一种增加非豆科植物中的固氮的方法，所述方法包括：

将所述植物暴露于多种固氮生物，所述多种固氮生物的每一个成员均包含引入到固氮生物固氮或同化遗传调节网络的一个或多个基因或非编码多核苷酸中的一种或多种遗传变异，其中所述一种或多种遗传变异增加NifA的表达或活性，所述一种或多种遗传变异包含启动子的插入，或者所述一种或多种遗传变异是在编码谷氨酰胺合成酶腺苷酰转移酶/腺苷酰去除酶(GlnE)的基因中的导致以下一项或多项结果的遗传变异：双功能谷氨酰胺合成酶活性降低、腺苷酰转移酶活性降低或腺苷酰去除酶活性降低，使得所述固氮生物能够在外源氮的存在下固定大气氮；其中所述固氮生物并非属间微生物；并且其中植物中的所述固氮生物在所述植物中产生1％或更多的固定氮，其中所述固氮生物还包含导致AmtB的表达或活性增加的突变。

3.一种增加非豆科植物中的固氮的方法，所述方法包括：

将所述植物暴露于多种固氮生物，所述多种固氮生物的每一个成员均包含引入到固氮生物固氮或同化遗传调节网络的一个或多个基因或非编码多核苷酸中的一种或多种遗传变异，其中所述一种或多种遗传变异增加NifA的表达或活性，所述一种或多种遗传变异包含启动子的插入，或者所述一种或多种遗传变异是在编码谷氨酰胺合成酶腺苷酰转移酶/腺苷酰去除酶(GlnE)的基因中的导致以下一项或多项结果的遗传变异：双功能谷氨酰胺合成酶活性降低、腺苷酰转移酶活性降低或腺苷酰去除酶活性降低，使得所述固氮生物能够在外源氮的存在下固定大气氮；其中所述固氮生物并非属间微生物；并且其中植物中的所述固氮生物在所述植物中产生1％或更多的固定氮，其中所述一种或多种遗传变异(A)是敲除突变；(B)改变或消除靶基因的调节序列；或(C)包含异源调节序列的插入。

4.一种包含固氮生物的固氮生物种群，所述固氮生物包含引入到所述固氮生物固氮或同化遗传调节网络的一个或多个基因或非编码多核苷酸中的一种或多种遗传变异，其中所述一种或多种遗传变异增加NifA的表达或活性，所述一种或多种遗传变异包含启动子的插入，或者所述一种或多种遗传变异是在编码谷氨酰胺合成酶腺苷酰转移酶/腺苷酰去除酶(GlnE)的基因中的导致以下一项或多项结果的遗传变异：双功能谷氨酰胺合成酶活性降低、腺苷酰转移酶活性降低或腺苷酰去除酶活性降低，使得所述固氮生物能够在外源氮的存在下固定大气氮；其中所述固氮生物并非属间微生物；并且其中植物中的所述固氮生物在存在所述固氮生物种群的情况下生长的植物中产生1％或更多的固定氮，其中所述固氮生物还包含改变选自由以下组成的组的基因的活性或表达的遗传变异：ntrB、glnA、glnK、glnD、nifB和nifQ。

5.一种包含固氮生物的固氮生物种群，所述固氮生物包含引入到所述固氮生物固氮或同化遗传调节网络的一个或多个基因或非编码多核苷酸中的一种或多种遗传变异，其中所述一种或多种遗传变异增加NifA的表达或活性，所述一种或多种遗传变异包含启动子的插入，或者所述一种或多种遗传变异是在编码谷氨酰胺合成酶腺苷酰转移酶/腺苷酰去除酶(GlnE)的基因中的导致以下一项或多项结果的遗传变异：双功能谷氨酰胺合成酶活性降低、腺苷酰转移酶活性降低或腺苷酰去除酶活性降低，使得所述固氮生物能够在外源氮的存在下固定大气氮；其中所述固氮生物并非属间微生物；并且其中植物中的所述固氮生物在存在所述固氮生物种群的情况下生长的植物中产生1％或更多的固定氮，其中所述固氮生物还包含导致AmtB的表达或活性增加的突变。

6.一种包含固氮生物的固氮生物种群，所述固氮生物包含引入到所述固氮生物固氮或同化遗传调节网络的一个或多个基因或非编码多核苷酸中的一种或多种遗传变异，其中所述一种或多种遗传变异增加NifA的表达或活性，所述一种或多种遗传变异包含启动子的插入，或者所述一种或多种遗传变异是在编码谷氨酰胺合成酶腺苷酰转移酶/腺苷酰去除酶(GlnE)的基因中的导致以下一项或多项结果的遗传变异：双功能谷氨酰胺合成酶活性降低、腺苷酰转移酶活性降低或腺苷酰去除酶活性降低，使得所述固氮生物能够在外源氮的存在下固定大气氮；其中所述固氮生物并非属间微生物；并且其中植物中的所述固氮生物在存在所述固氮生物种群的情况下生长的植物中产生1％或更多的固定氮，其中所述一种或多种遗传变异(A)是敲除突变；(B)改变或消除靶基因的调节序列；或(C)包含异源调节序列的插入。

7.一种非属间固氮生物，所述固氮生物包含引入到所述固氮生物固氮或同化遗传调节网络的一个或多个基因或非编码多核苷酸中的一种或多种遗传变异，其中所述一种或多种遗传变异增加NifA的表达或活性，所述一种或多种遗传变异包含启动子的插入，或者所述一种或多种遗传变异是在编码谷氨酰胺合成酶腺苷酰转移酶/腺苷酰去除酶(GlnE)的基因中的导致以下一项或多项结果的遗传变异：双功能谷氨酰胺合成酶活性降低、腺苷酰转移酶活性降低或腺苷酰去除酶活性降低，使得所述固氮生物能够在外源氮的存在下固定大气氮，其中所述固氮生物还包含改变选自由以下组成的组的基因的活性或表达的遗传变异：ntrB、glnA、glnK、glnD、nifB和nifQ。

8.一种非属间固氮生物，所述固氮生物包含引入到所述固氮生物固氮或同化遗传调节网络的一个或多个基因或非编码多核苷酸中的一种或多种遗传变异，其中所述一种或多种遗传变异增加NifA的表达或活性，所述一种或多种遗传变异包含启动子的插入，或者所述一种或多种遗传变异是在编码谷氨酰胺合成酶腺苷酰转移酶/腺苷酰去除酶(GlnE)的基因中的导致以下一项或多项结果的遗传变异：双功能谷氨酰胺合成酶活性降低、腺苷酰转移酶活性降低或腺苷酰去除酶活性降低，使得所述固氮生物能够在外源氮的存在下固定大气氮，其中所述固氮生物还包含导致AmtB的表达或活性增加的突变。

9.一种非属间固氮生物，所述固氮生物包含引入到所述固氮生物固氮或同化遗传调节网络的一个或多个基因或非编码多核苷酸中的一种或多种遗传变异，其中所述一种或多种遗传变异增加NifA的表达或活性，所述一种或多种遗传变异包含启动子的插入，或者所述一种或多种遗传变异是在编码谷氨酰胺合成酶腺苷酰转移酶/腺苷酰去除酶(GlnE)的基因中的导致以下一项或多项结果的遗传变异：双功能谷氨酰胺合成酶活性降低、腺苷酰转移酶活性降低或腺苷酰去除酶活性降低，使得所述固氮生物能够在外源氮的存在下固定大气氮，其中所述一种或多种遗传变异(A)是敲除突变；(B)改变或消除靶基因的调节序列；或(C)包含异源调节序列的插入。

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