CN1421527A - 新的突变谷氨酰胺合成酶和产生氨基酸的方法 - Google Patents

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Abstract

氨基酸，如L－谷氨酰胺、L－精氨酸、L－色氨酸、L－组氨酸和L－谷氨酸由具有突变谷氨酰胺合成酶基因的属于埃希氏菌属的细菌产生，在该突变谷氨酰胺合成酶中，对应于野生谷氨酰胺合成酶的397位的酪氨酸残基被任何氨基酸残基，优选被苯丙氨酸取代。

Description

新的突变谷氨酰胺合成酶和产生氨基酸的方法
技术领域
本发明涉及微生物工业，具体涉及产生氨基酸的方法。更具体地，本发明涉及一种新的酶的用途，该酶参与产氨基酸的大肠杆菌菌株的谷氨酰胺生物合成和氮素同化作用。更具体地，本发明涉及一种新的突变谷氨酰胺合成酶和一种用具有该酶的大肠杆菌菌株产生谷氨酰胺、精氨酸、色氨酸、组氨酸和谷氨酸等氨基酸的方法。
背景技术
谷氨酰胺合成酶(GS)在大肠杆菌中具有两种功能：谷氨酰胺的形成和当氨的获得受限时氨的同化作用。谷氨酰胺为嘌呤和嘧啶，以及一些氨基酸，如精氨酸、天冬酰胺、色氨酸、精氨酸、组氨酸和谷氨酸的合成提供氮。在精氨酸的生物合成中，谷氨酰胺起重要作用，因为谷氨酰胺是作为氨甲酰磷酸的生物合成的唯一生理性氨基供体，氨甲酰磷酸是精氨酸和嘧啶的常见前体。在色氨酸的形成中，谷氨酰胺被用于色氨酸生物合成途径的第一个反应中，该反应包括将分支酸和谷氨酰胺转化为邻氨基苯甲酸、谷氨酸和丙酮酸。谷氨酰胺依赖性天冬酰胺合成酶在天冬酰胺的生物合成的主要途径中使用谷氨酰胺和天冬氨酸。组氨酸的咪唑环的第三位的氮来源于谷氨酰胺。最后，谷氨酰胺被谷氨酸酮戊二酸氨基转移酶(GOGAT)在谷氨酸的生物合成中所使用。
由于GS在细胞代谢中的多种功能和重要性，它的催化活性和它的合成都得到了高度调节。
GS的总体结构由12个亚基组成，这些亚基排列为两个面对面的六聚物。GS的每个亚基的Tyr-397的腺苷酰化作用下调体内的酶活性。GS的腺苷酰化作用和去腺苷酰化作用都是由glnE基因编码的腺苷酰基转移酶(adenyltransferase)催化的。催化方向由调节蛋白PII(glnB)所规定，该蛋白的活性也是由可逆性修饰所调节：PII的未修饰形式激活腺苷酰化，其尿苷酰化形式激活GS的去腺苷酰化作用。特异性的尿苷酰基转移酶催化尿苷酰基从UTP转移到PII，而尿苷酰基去除活性逆转PII的尿苷酰化。这两种活性都取决于glnD基因。谷氨酰胺刺激尿苷酰基去除活性，2-酮戊二酸刺激PII的尿苷酰化作用。因此，谷氨酰胺最终导致GS的腺苷酰化，而2-酮戊二酸促进去腺苷酰化(活性形式)GS的形成(Escberichia coliand Salmonella，SecondEdition，Editor in Chief：F.C.Neidhardt，ASM Press，WashingtonD.C.，1996)。
已经描述过来自于不同物种的突变的不可腺苷酰化的谷氨酰胺合成酶。有来自于中华根瘤菌的突变GS(Arcondeguy等，FEMS Microbiol.Lett.，1996，145：1，33-40)，来自于深红红螺菌的Y398F突变GS(Zhang等，J.Bacteriol.，2000，182：4，938-92)和来自于维涅兰德固氮菌的Y407F突变GS(Colnaghi等，Microbiology，2001，147：5，1267-76)。这里提到的突变GS表现出天然酶的活性水平。但还没有报道用缺乏腺苷酰化能力的突变GS产生氨基酸。
发明内容
本发明涉及在大肠杆菌中构建在谷氨酰胺和精氨酸的生物合成中起关键作用的突变的和高活性的酶。
在本发明中，提出了用glnA基因中编码苯丙氨酸残基的TTT密码子取代编码GS蛋白中397位的酪氨酸的TAT密码子。氨基酸序列中氨基酸残基的取代导致了具有天然活性水平和无腺苷酰化的突变蛋白的表达。发现上述突变GS变得对谷氨酰胺的间接下调不敏感。然后本发明人发现用具有突变glnA基因的DNA转化的属于埃希氏菌属的产谷氨酸细菌变得可以产生谷氨酰胺。因此完成了本发明。
本发明提供了以下内容：(1)含有如序列表中的SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的谷氨酰胺合成酶，其中对应于SEQ ID NO：1的397位的酪氨酸残基被酪氨酸残基以外的氨基酸残基取代。(2)根据(1)的谷氨酰胺合成酶，包含一种在序列表中的SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的397位以外的一个或多个位置具有一个或几个氨基酸的缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列。(3)根据(1)或(2)的谷氨酰胺合成酶，其中对应于序列表中的SEQ IDNO：1的397位的残基被苯丙氨酸残基取代。(4)根据(1)-(3)的任意一项的谷氨酰胺合成酶，其中该谷氨酰胺合成酶分离自大肠杆菌。(5)编码根据(1)-(4)的任意一项的谷氨酰胺合成酶的DNA。(6)根据(5)的DNA，该DNA为以下(a)或(b)所定义，其中对应于397位的酪氨酸残基的密码子被酪氨酸以外的氨基酸的密码子替代：
(a)含有序列表中的SEQ ID NO：2的核苷酸序列的DNA；或
(b)在严格条件下可与序列表中的SEQ ID NO：2的核苷酸序列杂交的DNA，编码具有谷氨酰胺合成酶活性并对谷氨酰胺的间接下调作用不敏感的蛋白的DNA。(7)根据(6)的DNA，其中严格条件为在60℃，相当于1×SSC的盐浓度和0.1％的SDS的条件下进行洗涤。(8)一种用(5)-(7)的任一项的DNA转化的细菌。(9)根据(8)的细菌，该细菌属于埃希氏菌属。(10)根据(8)或(9)的细菌，该细菌具有产L-氨基酸的能力。(11)一种产生L-氨基酸的方法，该方法包括以下步骤：
在培养基中培养根据(8)-(10)的任意一项的细菌，以便在培养基中产生和聚集L-氨基酸，以及
从培养基中收集L-氨基酸。(12)根据(11)的方法，其中L-氨基酸选自L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-色氨酸、L-组氨酸、和L-谷氨酸。(13)根据(12)的方法，其中L-氨基酸为L-谷氨酰胺。
如上所述的对应于序列表中的SEQ ID NO：1的397位的酪氨酸残基处具有取代的GS可以称作“突变GS”，编码突变GS的DNA可以称作“突变glnA基因”，没有该取代的GS可以称作“野生型GS”。
在本说明书中，除非特别指出，氨基酸是L构型。
进一步，将详细解释本发明。(1)突变GS和突变glnA基因
已知397位的酪氨酸是GS的腺苷酰化作用位点(该酶的氨基酸残基编号根据G Colombo和JJ Villlafranca(J.Biol.Chem.，Vol.261，Issue 23，10587-10591，1986)而定位)。在野生型GS的氨基酸序列中用任意氨基酸，优选苯丙氨酸取代对应于397位的酪氨酸的氨基酸残基，导致具有天然活性水平和无腺苷酰化的突变蛋白的表达。突变GS变得对谷氨酰胺的间接下调作用不敏感。
可以通过用常规技术将突变引入野生型glnA基因而获得基于序列的突变GS。作为野生型glnA基因，可以提到大肠杆菌glnA基因(在GenBank编号AE000462 U00096：SEQ ID NO：2的序列中的6558-7967号核苷酸)。
突变GS可以包含在397位以外的一个或多个位置的一个或几个氨基酸的缺失、取代、插入或添加，前提是GS活性没有破坏。“GS活性”表示催化用ATP从谷氨酸和氨形成谷氨酰胺的反应的活性。
“几个”氨基酸根据在蛋白三维结构中氨基酸残基的位置或类型而不同。这是因为以下原因。即，一些氨基酸之间具有高度同源性，这种氨基酸的差别不显著影响蛋白的三维结构。所以，本发明的突变GS与构建GS的完整氨基酸残基相比可以具有不低于30-50％的同源性，优选具有50-70％的同源性，并且具有GS活性。
在本发明中，“对应于397位的氨基酸残基”表示对应于SEQ IDNO：1的氨基酸序列中的397位的氨基酸残基。氨基酸残基的位置可以改变。例如，如果在N端部分插入氨基酸残基，本来位于397位的氨基酸残基成为398位。在这种情况下，对应于原来的397位的氨基酸残基被指定为本发明的397位的氨基酸残基。
可以获得编码与上述突变GS基本相同的蛋白的DNA。例如，可通过如定点诱变法，使在特定位点的一个或多个氨基酸残基发生缺失、取代、插入或添加，从而修饰核苷酸序列。如上所述进行修饰的DNA可以通过常规的已知突变处理而获得。
上述核苷酸缺失、取代、插入或添加也包括天然存在的突变(突变体或变体)，例如基于具有GS的细菌个体差异或细菌种或属内差异的天然存在的突变。
编码这种变体的DNA可以通过分离与glnA基因或部分该基因在严格条件下杂交的DNA以及编码具有谷氨酰胺合成酶的蛋白的DNA而获得。名词“严格条件”在此处是指能够形成所说的特异性杂交，而不形成非特异性杂交的条件。例如，严格条件包括，具有高度同源性的DNA，例如相互间具有不小于70％的同源性的DNA能够杂交的条件。另外，杂交条件也可是以下示例性条件，它们包含在DNA杂交中的常规洗涤条件，如60℃，1×SSC，0.1％ SDS，优选0.1×SSC，0.1％ SDS。作为用于编码变体并与glnA基因杂交的DNA的探针，也可以使用SEQ IDNO：2的核苷酸序列。可以使用基于SEQ ID NO：2的核苷酸序列作为引物，以及含有SEQ ID NO：2的核苷酸序列的DNA片段作为模板所产生的寡核苷酸进行PCR，以便制备这种探针。当将长度为约300bp的DNA片段作为探针时，杂交的洗涤条件为例如，50℃，2×SSC，0.1％SDS。(2)本发明的属于埃希氏菌属的细菌
本发明的属于埃希氏菌属的细菌是一种引入了上述突变glnA基因的属于埃希氏菌属的细菌。属于埃希氏菌属的细菌例如为大肠杆菌。突变glnA基因的引入可以通过例如，用包含在属于埃希氏菌属的细菌中起作用的载体和突变glnA基因的重组DNA转化属于埃希氏菌属的细菌。突变glnA基因也可通过用突变glnA基因取代染色体上的glnA基因而引入。
用于引入突变glnA基因的载体的例子为质粒载体，如pMW118，pBR322，pUC19等，噬菌体载体如11059，1BF101，M13mp9等，以及转座子如Mu，Tn10，Tn5等。
将DNA引入属于埃希氏菌属的细菌可以通过如D.A.Morrison(Methods in Enzymology，68，326(1979))描述的方法或用氯化钙处理受体细胞以增加DNA通透性的方法(Mandel，M.，和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159，(1970))等。
目前还不知道具有产生大量L-谷氨酰胺的属于埃希氏菌属的细菌。已经注意到在营养培养基中培养大肠杆菌K-12菌株可以导致0.36mg/ml L-谷氨酰胺的聚集，所述培养基在每100重量份的碳中含有超过10重量份的氮(英国专利1,113,117)。因此，可以通过将突变的glnA基因引入分泌谷氨酸的野生型属于埃希氏菌属的细菌而增加L-谷氨酰胺的产量。
属于其它种的产L-谷氨酰胺的细菌的例子有，黄色短杆菌FERMP-4272，嗜乙酰棒杆菌ATCC 13870，黄色微杆菌FERM BP-664(AJ3684)，黄色短杆菌FERM-BP 662(AJ3409)，醋谷棒杆菌ATCC 13870，谷氨酸棒杆菌FERM BP-663(AJ3682)(美国专利5,164,307)。
可以将突变glnA基因引入产谷氨酸的属于埃希氏菌属的细菌，从而进一步增加L-谷氨酸的产量。
具有产L-谷氨酸活性的属于埃希氏菌属的细菌的例子为以下大肠杆菌菌株：具有天冬氨酸抗代谢物抗性的菌株，以及缺乏α-酮戊二酸脱氢酶活性的菌株，如AJ13199株(FERM BP-5807)(美国专利5,908,768)，或额外具有低L-谷氨酸分解能力的FERM P-12379株(美国专利5,393,671)；大肠杆菌AJ13138株(FERM BP-5565)(美国专利6,110,714)等。
具有产L-精氨酸活性的属于埃希氏菌属的细菌的例子为大肠杆菌237株(VKPM B-7925)(俄罗斯专利申请No.2000116481)，引入了编码N-乙酰谷氨酸合成酶的argA基因的产精氨酸菌株(日本公开No.57-5693)等。
具有产L-色氨酸活性的属于埃希氏菌属的细菌的例子为由携带色氨酸操纵子、大肠杆菌aroG基因和serA基因的Genencor株JB102/pBE7衍生的大肠杆菌菌株(美国专利5,939,295)，大肠杆菌菌株DSM10118，DSM10121，DSM10122，DSM10123(美国专利5,756,345)，大肠杆菌菌株SV164(pGH5)(EP1149911A2)，大肠杆菌菌株NRRL 13-12257-NRRL 13-12264(美国专利4,371,614)等。
具有产L-组氨酸活性的属于埃希氏菌属的细菌的例子为大肠杆菌菌株NRRL B-12116，NRRL B-12118，NRRL B-12119，NRRL B-12120，NRRL B-12121(美国专利4,388,405)等。(3)产生L-氨基酸的方法
本发明的方法包括产生L-氨基酸的方法，包括以下步骤：在培养基中培养本发明的细菌，允许产生L-氨基酸，并使其在培养基中聚集，并从培养基中收集L-氨基酸。
如下面实施例中所详细解释，本发明的方法包括产生L-谷氨酰胺的方法，包括以下步骤：在培养基中培养本发明的细菌，允许产生L-谷氨酰胺，并使其在培养基中聚集，并从培养基中收集L-谷氨酰胺。
谷氨酰胺为嘌呤和嘧啶，以及一些氨基酸，如L-精氨酸、L-色氨酸、L-组氨酸和L-谷氨酸的合成提供氮。谷氨酰胺在L-精氨酸的生物合成中起重要作用，因为谷氨酸是氨甲酰磷酸合成中的唯一生理性氨基供体，而氨甲酰磷酸是L-精氨酸和嘧啶的常见前体。在L-色氨酸的形成中，谷氨酰胺被用于色氨酸生物合成途径的第一个反应中，该反应包括将分支酸和谷氨酰胺转化为邻氨基苯甲酸、谷氨酸和丙酮酸。组氨酸的咪唑环的第三位的氮来源于谷氨酰胺。最后，谷氨酰胺被谷氨酸酮戊二酸氨基转移酶(GOGAT)在谷氨酸的生物合成中所使用。当上述氨基酸生物合成中的其它途径可以为大量产生而最优化时，谷氨酰胺的可获得性成为限制性因子之一。从上面的内容可以看出，改进在微生物中产生L-谷氨酰胺的能力也可以导致改进在微生物中产生L-精氨酸、L-色氨酸、L-组氨酸和L-谷氨酸的能力。所以，本发明的方法包括产生L-精氨酸方法，包括以下步骤：在培养基中培养本发明的细菌，允许产生L-精氨酸，并使其在培养基中聚集，并从培养基中收集L-精氨酸。同样，本发明的方法包括产生L-色氨酸方法，包括以下步骤：在培养基中培养本发明的细菌，允许产生L-色氨酸，并使其在培养基中聚集，并从培养基中收集L-色氨酸。同样，本发明的方法包括产生L-组氨酸方法，包括以下步骤：在培养基中培养本发明的细菌，允许产生L-组氨酸，并使其在培养基中聚集，并从培养基中收集L-组氨酸。而且，本发明的方法包括产生L-谷氨酸方法，包括以下步骤：在培养基中培养本发明的细菌，允许产生L-谷氨酸，并使其在培养基中聚集，并从培养基中收集L-谷氨酸。
在本发明的方法中，培养属于埃希氏菌属的细菌、从液体培养基中收集和纯化L-谷氨酰胺的进行方式可以类似于利用细菌通过发酵产生L-谷氨酰胺的常规方法。同样，在本发明的方法中，培养属于埃希氏菌属的细菌、从液体培养基中收集和纯化L-精氨酸的进行方式可以类似于利用细菌通过发酵产生L-精氨酸的常规方法。同样，在本发明的方法中，培养属于埃希氏菌属的细菌、从液体培养基中收集和纯化L-色氨酸的进行方式可以类似于利用细菌通过发酵产生L-色氨酸的常规方法。同样，在本发明的方法中，培养属于埃希氏菌属的细菌、从液体培养基中收集和纯化L-组氨酸的进行方式可以类似于利用细菌通过发酵产生L-组氨酸的常规方法。而且，在本发明的方法中，培养属于埃希氏菌属的细菌、从液体培养基中收集和纯化L-谷氨酸的进行方式可以类似于利用细菌通过发酵产生L-谷氨酸的常规方法。
用于培养的培养基可以是合成培养基或天然培养基，只要该培养基包含碳源和氮源以及矿物质，并且在必要时，包含适量的细菌生长所要求使用的营养物。碳源可以包含各种糖，如葡萄糖和蔗糖，以及各种有机酸，这取决于所使用细菌的同化能力。可以使用包括乙醇和甘油的醇。氮源采用氨、各种铵盐如硫酸铵，其它含氮化合物，如胺，天然氮源如胨、大豆水解产物和消化的发酵微生物。矿物质采用磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、碳酸钙。如果必要，可以向培养基中加入额外的营养物。例如，如果微生物的生长要求异亮氨酸(异亮氨酸营养缺陷)，可以向培养基中加入足量的异亮氨酸。
培养优选在需氧条件如振荡培养、通气培养和搅拌培养下进行。培养通常在20-40℃，优选30-38℃下进行。培养通常在pH5-9，优选6.2-7.2下进行。培养基的pH可以用氨、碳酸钙、各种酸、各种碱和缓冲液进行调节。通常，1-3天的培养导致化合物在培养基中的聚集。
氨基酸分离可以按以下步骤进行：在培养后通过离心或膜过滤从培养基中除去固体物质，如细胞，然后通过离子交换、浓缩和晶体分馏(crystalline fraction)法等收集并这些化合物。
附图说明
图1表示引物SEQ ID NO：3，4和5的相对位置。
具体实施方式
本发明将通过以下实施例加以具体解释。实施例1.克隆突变glnA基因
用PCR程序进行扩增，获得野生型glnA基因，并克隆至载体pMW118，产生质粒pMWglnA12。将大肠杆菌K12株的染色体DNA作为模板，SEQ ID NO：3和4中描述的寡核苷酸用作引物。PCR程序的进行如下：在94℃预处理5分钟，然后55℃下30秒，进行40轮，72℃下2分钟，然后93℃下30秒。将由此得到的PCR产物用XbaI和HindIII限制酶进行处理，并与用同样的限制酶预先处理的载体pMW118质粒连接，产生质粒pMWglnA12。为了用编码苯丙氨酸的TTT密码子替代在GS肽中编码Tyr-397的TAT密码子，采用了用于定位诱变的PCR程序。将携带野生型glnA基因的pMWglnA12质粒用作模板，SEQ ID NO：4和5中描述的寡核苷酸用作引物。PCR程序的进行如下：在55℃下30秒，72℃下1分钟，然后94℃下30秒，进行25轮。将由此得到的PCR产物用NcoI和HindIII限制酶进行处理，并与用同样的限制酶预先处理的pMWglnA12质粒连接，产生质粒pMWglnAphe-4。实施例2.构建来自于具有ilvA基因突变的由野生型大肠杆菌K12株得到的ilvA缺陷衍生物
VL334株(VKPM B-1641)是一种异亮氨酸营养缺陷和苏氨酸营养缺陷株，在thrC和ilvA基因具有突变(美国专利4,278,765)。通过常规转导方法，用在野生型大肠杆菌K12株(VKPM B-7)的细胞上生长的噬菌体P1转移thrC基因的野生型等位基因。由此获得了异亮氨酸缺陷菌株VL334thrc+。
然后，将质粒pMWglnAphe-4引入菌株VL334thrc+的细胞中，得到菌株VL334thrc+/pMWglnAphe-4。作为对照，也将质粒pMWglnA12引入菌株VL334thrc+的细胞中，得到菌株VL334thrc+/pMWglnA12。实施例3.通过具有突变glnA基因的菌株在试管发酵中产生谷氨酰胺和谷氨酸
试管发酵中的培养条件如下：发酵培养基含60g/l的葡萄糖，35g/l的硫酸铵，2g/l的KH2PO4，1g/l的MgSO4，0.1mg/l的硫胺，50mg/l的L-异亮氨酸，5g/l的酵母提取物Difco，25g/l的白垩(pH7.2)。分别消毒葡萄糖和白垩。将2ml培养基放在试管中，接种一圈实验微生物，在37℃下振荡培养两天。通过TLC(异丙醇∶乙酸乙酯∶氨∶水＝16∶8∶5∶10(V/V))测量产生的谷氨酸和谷氨酰胺量。结果见表1。
                             表1
菌株   谷氨酸聚集g/l  谷氨酰胺聚集g/l
 VL334thrC+     12.0     0
 VL334thrC+/pMWglnA12     7.5     0
 VL334thrC+/pMWglnAphe-4     1.3     1.3
如表1所示，携带突变gln基因的VL334thrC+/pMWglnAphe-4菌株可以产生谷氨酰胺。
                  序列表<110>味之素株式会社<120>新的突变谷氨酰胺合成酶和产生氨基酸的方法<130>OP1434<140><141>2002-11-<150>RU 2001132473<151>2001-11-30<160>5<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>468<212>PRT<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>1Ser Ala Glu His Val Leu Thr Met Leu Asn Glu His Glu Val Lys Phe1               5                 10                  15Val Asp Leu Arg Phe Thr Asp Thr Lys Gly Lys Glu Gln His Val Thr
         20                 25                  30Ile Pro Ala His Gln Val Asn Ala Glu Phe Phe Glu Glu Gly Lys Met
     35                 40                  45Phe Asp Gly Ser Ser Ile Gly Gly Trp Lys Gly Ile Asn Glu Ser Asp
 50                  55                 60Met Val Leu Met Pro Asp Ala Ser Thr Ala Val Ile Asp Pro Phe Phe65                  70                 75                  80Ala Asp Ser Thr Leu Ile Ile Arg Cys Asp Ile Leu Glu Pro Gly Thr
            85                  90                  95Leu Gln Gly Tyr Asp Arg Asp Pro Arg Ser Ile Ala Lys Arg Ala Glu
        100                 105                110Asp Tyr Leu Arg Ser Thr Gly Ile Ala Asp Thr Val Leu Phe Gly Pro
    115                120                125Glu Pro Glu Phe Phe Leu Phe Asp Asp Ile Arg Phe Gly Ser Ser Ile
130                 135                140Ser Gly Ser His Val Ala Ile Asp Asp Ile Glu Gly Ala Trp Asn Ser145                 150                155                160Ser Thr Gln Tyr Glu Gly Gly Asn Lys Gly His Arg Pro Ala Val Lys
           165                 170                175Gly Gly Tyr Phe Pro Val Pro Pro Val Asp Ser Ala Gln Asp Ile Arg
        180                185                 190Ser Glu Met Cys Leu Val Met Glu Gln Met Gly Leu Val Val Glu Ala
    195                200                 205His His His Glu Val Ala Thr Ala Gly Gln Asn Glu Val Ala Thr Arg
210                215                 220Phe Asn Thr Met Thr Lys Lys Ala Asp Glu Ile Gln Ile Tyr Lys Tyr225                 230                235                 240Val Val His Asn Val Ala His Arg Phe Gly Lys Thr Ala Thr Phe Met
           245                 250                 255Pro Lys Pro Met Phe Gly Asp Asn Gly Ser Gly Met His Cys His Met
        260                265                 270Ser Leu Ser Lys Asn Gly Val Asn Leu Phe Ala Gly Asp Lys Tyr Ala
    275                280                 285Gly Leu Ser Glu Gln Ala Leu Tyr Tyr Ile Gly Gly Val Ile Lys His
290                295                 300Ala Lys Ala Ile Asn Ala Leu Ala Asn Pro Thr Thr Asn Ser Tyr Lys305                 310                315                 320Arg Leu Val Pro Gly Tyr Glu Ala Pro Val Met Leu Ala Tyr Ser Ala
            325                330                 335Arg Asn Arg Ser Ala Ser Ile Arg Ile Pro Val Val Ser Ser Pro Lys
        340                345                 350Ala Arg Arg Ile Glu Val Arg Phe Pro Asp Pro Ala Ala Asn Pro Tyr
    355                 360                365Leu Cys Phe Ala Ala Leu Leu Met Ala Gly Leu Asp Gly Ile Lys Asn
370                375                 380Lys Ile His Pro Gly Glu Ala Met Asp Lys Asn Leu Tyr Asp Leu Pro385                390                 395                 400Pro Glu Glu Ala Lys Glu Ile Pro Gln Val Ala Gly Ser Leu Glu Glu
            405                410                 415Ala Leu Asn Glu Leu Asp Leu Asp Arg Glu Phe Leu Lys Ala Gly Gly
        420                425                 430Val Phe Thr Asp Glu Ala Ile Asp Ala Tyr Ile Ala Leu Arg Arg Glu
    435                440                 445Glu Asp Asp Arg Val Arg Met Thr Pro His Pro Val Glu Phe Glu Leu
450                455                 460Tyr Tyr Ser Val465<210>2<211>1410<212>DNA<213>大肠杆菌(Escheriehia coli)<400>2atgtccgctg aacacgtact gacgatgctg aacgagcacg aagtgaagtt tgttgatttg 60cgcttcaccg atactaaagg taaagaacag cacgtcacta tccctgctca tcaggtgaat 120gctgaattct tcgaagaagg caaaatgttt gacggctcct cgattggcgg ctggaaaggc 180attaacgagt ccgacatggt gctgatgcca gacgcatcca ccgcagtgat tgacccgttc 240ttcgccgact ccaccctgat tatccgttgc gacatccttg aacctggcac cctgcaaggc 300tatgaccgtg acccgcgctc cattgcgaag cgcgccgaag attacctgcg ttccactggc 360attgccgaca ccgtactgtt cgggccagaa cctgaattct tcctgttcga tgacatccgt 420ttcggatcat ctatctccgg ttcccacgtt gctatcgacg atatcgaagg cgcatggaac 480tcctccaccc aatacgaagg tggtaacaaa ggtcaccgtc cggcagtgaa aggcggttac 540ttcccggttc caccggtaga ctcggctcag gatattcgtt ctgaaatgtg tctggtgatg 600gaacagatgg gtctggtggt tgaagcccat caccacgaag tagcgactgc tggtcagaac 660gaagtggcta cccgcttcaa taccatgacc aaaaaagctg acgaaattca gatctacaaa 720tatgttgtgc acaacgtagc gcaccgcttc ggtaaaaccg cgacctttat gccaaaaccg 780atgttcggtg ataacggctc cggtatgcac tgccacatgt ctctgtctaa aaacggcgtt 840aacctgttcg caggcgacaa atacgcaggt ctgtctgagc aggcgctgta ctacattggc 900ggcgtaatca aacacgctaa agcgattaac gccctggcaa acccgaccac caactcttat 960aagcgtctgg tcccgggcta tgaagcaccg gtaatgctgg cttactctgc gcgtaaccgt 1020tctgcgtcta tccgtattcc ggtggtttct tctccgaaag cacgtcgtat cgaagtacgt 1080ttcccggatc cggcagctaa cccgtacctg tgctttgctg ccctgctgat ggccggtctt 1140gatggtatca agaacaagat ccatccgggc gaagccatgg acaaaaacct gtatgacctg 1200ccgccagaag aagcgaaaga gatcccacag gttgcaggct ctctggaaga agcactgaac 1260gaactggatc tggaccgcga gttcctgaaa gccggtggcg tgttcactga cgaagcaatt 1320gatgcgtaca tcgctctgcg tcgcgaagaa gatgaccgcg tgcgtatgac tccgcatccg 1380gtagagtttg agctgtacta cagcgtctaa                                  1410<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>3attctagatt tcgttaccac gacgacc                                    27<210>4<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>4ataagcttca cgttggagag cgactc                                     26<210>5<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>5gcgaagccat ggacaaaaac ctgtttgacc tgccgc                          36

Claims (13)

1.含有如序列表中的SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的谷氨酰胺合成酶，其中对应于SEQ ID NO：1的397位的酪氨酸残基被酪氨酸残基以外的氨基酸残基取代。
2.根据权利要求1的谷氨酰胺合成酶，包含一种在序列表中的SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列的397位以外的一个或多个位置具有一个或几个氨基酸的缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2的谷氨酰胺合成酶，其中对应于序列表中的SEQID NO：1的397位的残基被苯丙氨酸残基取代。
4.根据权利要求1-3的任意一项的谷氨酰胺合成酶，其中该谷氨酰胺合成酶分离自大肠杆菌。
5.编码根据权利要求1-4的任意一项的谷氨酰胺合成酶的DNA。
6.根据权利要求5的DNA，该DNA为以下(a)或(b)所定义，其中对应于397位的酪氨酸残基的密码子被酪氨酸以外的氨基酸的密码子替代：
(a)含有序列表中的SEQ ID NO：2的核苷酸序列的DNA；或
(b)在严格条件下可与序列表中的SEQ ID NO：2的核苷酸序列杂交的DNA，编码具有谷氨酰胺合成酶活性并对谷氨酰胺的间接下调作用不敏感的蛋白的DNA。
7.根据权利要求6的DNA，其中严格条件为在60℃，相当于1×SSC的盐浓度和0.1％的SDS的条件下进行洗涤。
8.一种用权利要求5-7的任一项的DNA转化的细菌。
9.根据权利要求8的细菌，该细菌属于埃希氏菌属。
10.根据权利要求8或9的细菌，该细菌具有产L-氨基酸的能力。
11.一种产生L-氨基酸的方法，该方法包括以下步骤：
在培养基中培养根据权利要求8-10的任意一项的细菌，并且在培养基聚集L-氨基酸，以及
从培养基中收集L-氨基酸。
12.根据权利要求11的方法，其中L-氨基酸选自L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-色氨酸、L-组氨酸、和L-谷氨酸。
13.根据权利要求12的方法，其中L-氨基酸为L-谷氨酰胺。
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