CN107208038A - 用于产生l‑谷氨酰胺的微生物及使用其产生l‑谷氨酰胺的方法 - Google Patents

用于产生l‑谷氨酰胺的微生物及使用其产生l‑谷氨酰胺的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种对高浓度L‑谷氨酰胺具有抗性的谷氨酸棒杆菌突变菌株以及使用其产生L‑谷氨酰胺的方法。

Description

用于产生L-谷氨酰胺的微生物及使用其产生L-谷氨酰胺的 方法
技术领域
本发明涉及一种产生L-谷氨酰胺的微生物以及使用该微生物产生L-谷氨酰胺的方法。
背景技术
L-谷氨酰胺作为广泛用于药物、化妆品和保健食品中的氨基酸，主要使用化合物抗性或化合物敏感性微生物制备。例如，磺胺胍抗性菌株(JP 1978-17675)、重氮丝氨酸抗性微生物(JP 1980-148094)、青霉素敏感性微生物(JP1992-088994)和酪氨酸谷氨酸(tyr-glu)-抗性菌株(JP 1990-186994)已经用于这些目的。
在这些情况下，在开发具有改善的L-谷氨酰胺生产力的菌株的研究过程中，本发明人发现了对高浓度L-谷氨酰胺具有抗性的突变体和通过使用突变体生产高产量的L-谷氨酰胺的方法，从而完成本发明。
发明内容
[技术问题]
本发明提供一种具有改善的L-谷氨酰胺生产力的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)突变体。
本发明提供一种通过使用谷氨酸棒杆菌突变体产生L-谷氨酰胺的方法。
[技术方案]
根据本发明的一个方面，提供了一种对L-谷氨酰胺具有抗性的产生L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌突变体。
如本文所用，术语“L-谷氨酰胺”是指谷氨酸的单酰胺，其是构成蛋白质的氨基酸和具有式H2NCO-CH2CH2CH(NH2)COOH的L-氨基酸。
如本文所用，表述“对L-谷氨酰胺具有抗性”是指具有在具有高浓度L-谷氨酰胺的环境中能够生长或能够维持或增加产生L-谷氨酰胺活性的特性的微生物。
当L-谷氨酰胺在细胞中积累至某一浓度或更高浓度时，这可以通过反馈调节诱导抑制，导致禁止或抑制谷氨酰胺合成酶的活性，并因此抑制L-谷氨酰胺的生物合成。L-谷氨酰胺的反馈调节被释放，并且L-谷氨酰胺合成的抑制在对L-谷氨酰胺具有抗性的菌株中不起作用，使得L-谷氨酰胺抗性菌株可在高浓度L-谷氨酰胺的条件下产生L-谷氨酰胺。
突变体可以是谷氨酸棒杆菌KCCM 11553P或谷氨酸棒杆菌KCCM 11554P。
突变体可以对高浓度的L-谷氨酰胺具有抗性。例如，突变体可以具有约5g/L至约30g/L的L-谷氨酰胺的抗性，并且在一些实施方式中，具有约15g/L至约30g/L的L-谷氨酰胺的抗性，并且在一些其它实施方式中，具有约20g/L至约25g/L的L-谷氨酰胺的抗性。
突变体可以在含有约15g/L至约25g/L的L-谷氨酰胺的基本培养基中存活约6天或更长时间。例如，突变体可在含有约15g/L至约25g/L的L-谷氨酰胺、0.1％葡萄糖、0.04％硫酸镁(MgSO4·7H2O)、0.1％磷酸二氢钾(KH2PO4)、0.0001％硫胺素·HCl、200μg/L生物素和琼脂的基本培养基(pH 7.0)中在约30℃的培养下存活约6天或更长时间。
如本文所用，术语“产生L-谷氨酰胺的微生物”可以指固有地具有产生L-谷氨酰胺的能力的微生物或获得谷氨酰胺生产力的微生物(尽管其亲本菌株缺乏产生L-谷氨酰胺的能力)。
在一些实施方式中，具有改善的产生L-谷氨酰胺能力的谷氨酸棒杆菌突变体可以是通过突变亲本菌株获得的突变体。微生物的突变可以通过本领域广泛已知的多种方法中的任一种进行，例如物理诱变或化学诱变中的一个。例如，在本发明中，适当的化学突变诱导因子可以包括N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、二环氧丁烷、甲磺酸乙酯、芥子化合物、肼和亚硝酸盐(酯)。然而，实施方式不限于此。物理突变诱导因子的非限制性实例可以包括紫外线和γ射线。
在一些实施方式中，为了构建具有改善的产生L-谷氨酰胺能力的突变体，可以使用常规的谷氨酰胺生产菌株谷氨酸棒杆菌KFCC 10680(公开于KR10-0048440)作为亲本菌株。在亲本菌株谷氨酸棒杆菌KFCC 10680中用NTG诱导随机突变后，将所得菌株在含有L-谷氨酰胺的培养基中培养，并比较不同菌株的产生L-谷氨酰胺的能力，以筛选两种对L-谷氨酰胺具有抗性的突变体。这两种突变体分别命名为Gln096(KCCM 11553P)和Gln265(KCCM11554P)。发现这些谷氨酸棒杆菌突变体Gln096和Gln265具有改善的L-谷氨酰胺生产能力，具有比亲本菌株高约10％以上的产量。
根据本发明的另一方面，提供了一种产生L-谷氨酰胺的方法，所述方法包括在培养基中培养根据任一上述实施方式的谷氨酸棒杆菌突变体。
谷氨酸棒杆菌突变体可以与上述相同，并且本文不再描述。
培养可以使用合适的培养基在本领域熟知的合适培养条件下进行。培养基和培养条件可以由本领域普通技术人员改变。例如，培养基可以是液体培养基。然而，实施方式不限于此。培养的实例方法可以包括分批培养、连续培养、补料分批培养或其组合。然而，实施方式不限于此。
培养基对于特定选择的菌株需要具有适当的条件，并且本领域普通技术人员还可以适当地改变。例如，培养基可以选自在例如“一般细菌学方法手册”(美国细菌学学会，华盛顿特区，美国，1981)中公开的棒杆菌菌株的各种培养基。然而，实施方式不限于此。培养基可以包括各种碳源、氮源和痕量元素。可用于培养基的碳源的非限制性实例可以包括：糖和碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油和脂肪，例如大豆油、向日葵油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇，例如乙二醇和乙醇；以及有机酸，例如乙酸，其中，这些碳源可以单独使用或组合使用。可用于培养基的氮源的非限制性实例是有机化合物，例如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆(CSL)、大豆粉和尿素；以及无机化合物，例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵，其中这些氮源可以单独使用或组合使用。可用于培养基的磷源的非限制性实例可以包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和相应的含钠盐。在一些实施方式中，培养基可以包括生长必需的金属盐，例如硫酸镁或硫酸铁。然而，实施方式不限于此。在一些实施方式中，除了上述成分之外，培养基还可以包括生长必需的氨基酸和维生素。在一些实施方式中，培养基还可以包括合适的前体。培养基或单个成分可以以适当的方式，例如以间歇或连续方式加入培养溶液中。然而，实施方式不限于此。
在一些实施方式中，在培养期间，培养溶液的pH可以通过向所选择的微生物的培养物溶液中以适当的方式加入化合物，例如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸或硫酸来调节。在一些实施方式中，在培养期间，可以使用消泡剂例如脂肪酸聚乙二醇酯抑制培养溶液中的发泡。为了将培养溶液保持在好氧条件下，可以向培养液中供应氧气或含氧气体(例如，空气)。例如，培养溶液的温度可以保持在约20℃至约45℃的温度范围内，并且在一些实施方式中，在约25℃至约40℃的温度下。例如，可以进行培养直至获得目标量的L-谷氨酰胺，例如，培养时间为约10小时至160小时。
可以在含有高浓度的L-谷氨酰胺，例如约15g/L至约25g/L的L-谷氨酰胺，并在一些实施方式中为约20g/L至约25g/L的L-谷氨酰胺的培养基中进行培养。
产生L-谷氨酰胺的方法可以包括从培养的微生物或培养的培养基中回收L-谷氨酰胺。从微生物或培养基中回收L-谷氨酰胺可以根据所使用的培养方法使用本领域中已知的适当方法进行，从而从培养基收集或回收所产生的L-谷氨酰胺。回收所产生的L-谷氨酰胺的方法的非限制性实例可以包括离心分离、过滤、阴离子交换色谱、结晶和高效液相色谱(HPLC)。
[本发明的有益效果]
如上所述，根据一个或多个实施方式，即使在含有高浓度的L-谷氨酰胺的培养基中，也可以利用谷氨酸棒杆菌突变体产生L-谷氨酰胺。因此，可以在工业生产规模上以高效率生产高产率的L-谷氨酰胺。
具体实施方式
现在将参考以下实施例详细描述本发明的一个或多个实施方式。然而，这些实施例仅用于说明性目的，并且不旨在限制本发明的一个或多个实施方式的范围。
实施例1：产生L-谷氨酰胺的突变体筛选
为了获得具有改善的产生谷氨酰胺能力的微生物突变体，以下述方式在微生物中诱导突变。
特别地，将作为亲本菌株的谷氨酸棒杆菌KFCC 10680(谷氨酸棒杆菌KFCC10680，参见KR10-0048440)在活化培养基中培养约16小时(所述活化培养基含有1％牛肉提取物、1％聚胨、0.5％氯化钠(NaCl)、0.5％酵母提取物和2％琼脂，pH为7.2，其中，实施例中使用的每种活化培养基具有与本实施例中使用的相同组成，百分比单位(％)表示w/v％，其适用于所有实施例)。将得到的活化菌株在预先在约121℃下灭菌15分钟的种子培养基中培养约14小时，所述种子培养基(pH7.0)含有5.0％葡萄糖、1％细菌蛋白胨、0.25％氯化钠(NaCl)、1％酵母提取物、3μg/L生物素和0.4％尿素，其中实施例中使用的每种“种子培养基”具有与本实施例中使用的相同组成。将5mL培养溶液加入试管中，以约8000rpm离心分离约5分钟，并除去上清液。然后，向试管中加入100mM柠檬酸盐缓冲液以重新悬浮细胞团块，然后在与上述相同的条件下对试管进行离心分离，并从中除去上清液，从而洗涤细胞。将5mL 100mM柠檬酸盐缓冲液加入试管中以重新悬浮细胞团块，然后向其中加入N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG)至终浓度为约200mg/L，并在室温下放置约20分钟。接着，将NTG处理的细胞以约8000rpm离心分离约5分钟，并除去上清液，加入100-mM磷酸盐缓冲液以重新悬浮细胞团块，然后在与上述相同的条件下进行离心分离，并除去上清液，从而洗涤细胞。接着，将5mL种子培养基加入到所得NTG处理的细胞团块中以使其再悬浮。将该悬浮液涂布在含有基本培养基的板上，所述基本培养基(pH 7.0)含有0.1％葡萄糖、0.04％硫酸镁(MgSO4·7H2O)、0.1％磷酸二氢钾(KH2PO4)、0.0001％硫胺素·HCl、200μg/L生物素和1.5％琼脂，其中实施例中使用的每种“基本培养基”具有与本实施例中使用的相同组成，并在约30℃下培养约6天。然后测量活细胞的OD600值。作为计数细胞数的结果，发现细胞死亡率为约85％。
将洗过的NTG处理的菌株涂布在含有基本培养基的板上，所述基本培养基含有L-谷氨酰胺(终浓度：15g/L)，并在约30℃下培养约6天。选择活细胞集落以筛选L-谷氨酰胺抗性突变体。在用于振动的锥形瓶中，将筛选的L-谷氨酰胺抗性突变体用接种环接种到25mL谷氨酰胺生产培养基(pH 6.8)(含有4.0％葡萄糖、3.0％氯化铵(NH4Cl)、0.3％大豆蛋白酸水解产物、5％碳酸钙(CaCO3)、0.1％氯化钙(CaCl2)、0.05％硫酸镁(MgSO4·7H2O)、0.15％磷酸二氢钾(KH2PO4)、0.15％磷酸氢二钾(K2HPO4)、0.3％尿素、2mg/L硫胺素(硫胺素·HCl)、5μg/L生物素、20mg/L的硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)、20mg/L硫酸锰(MnSO4·H2O)和12mg/L硫酸锌(ZnSO4·7H2O)，其中实施例中使用的每种“谷氨酰胺生产培养基”具有该相同的组成))上，然后在约30℃下同时以约200rpm振荡培养约48小时。作为对照组，在相同条件下培养亲本菌株。从培养产物中选择产生比亲本菌株谷氨酸棒杆菌KFCC-10680高10％以上的谷氨酰胺产量的两种类型的L-谷氨酰胺抗性突变体。
所选择的突变体分别命名为谷氨酸棒杆菌Gln096和谷氨酸棒杆菌Gln265，并且于2014年7月3日保藏在韩国微生物保藏中心(KCCM)，保藏号为KCCM11553P和KCCM11554P。
实施例2：产生L-谷氨酰胺的突变体之间对L-谷氨酰胺的抗性的比较
为了比较实施例1中选择的突变体之间对L-谷氨酰胺的抗性，将亲本菌株(KFCC10680)、谷氨酸棒杆菌Gln096(KCCM11553P)和谷氨酸棒杆菌Gln265(KCCM11554P)中的每一个涂抹在含有分别含有2.5g/L、10g/L、15g/L、20g/L和25g/L的L-谷氨酰胺(基于终浓度)的基本培养基的板上，并在约30℃下培养约6天。
作为结果，如表1中所示，亲本菌株在L-谷氨酰胺浓度为15g/L时表现出差的生长，并且在L-谷氨酰胺浓度为20g/L以上时不生长，而突变体谷氨酸棒杆菌Gln096(KCCM11553P)和谷氨酸棒杆菌Gln265(KCCM11554P)在L-谷氨酰胺浓度为15g/L时仍显示高生长，甚至在L-谷氨酰胺浓度为20g/L以上时也生长，表明突变体对高浓度的L-谷氨酰胺具有抗性。
[表1]对L-谷氨酰胺抗性的比较
+：生长/-：不生长；在约30℃下培养6天后
实施例3：产生L-谷氨酰胺的突变体的L-谷氨酰胺生产力评价
为了评价实施例1中获得的突变体谷氨酸棒杆菌Gln265(KCCM11554P)和谷氨酸棒杆菌Gln096(KCCM11553P)的L-谷氨酰胺生产力，将这些突变体以下列方式培养以产生L-谷氨酰胺。
将20mL发酵培养基(pH 6.8)(含有10％葡萄糖、4.5％氯化铵(NH4Cl)、0.5％大豆蛋白酸水解产物、5％碳酸钙(CaCO3)、0.1％氯化钙(CaCl2)、0.05％硫酸镁(MgSO4·7H2O)、0.15％磷酸二氢钾(KH2PO4)、0.15％磷酸氢二钾(K2HPO4)、0.3％尿素、2mg/L硫胺素(硫胺素·HCl)、5μg/L生物素、20mg/L硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)、20mg/L硫酸锰(MnSO4·H2O)和12mg/L硫酸锌(ZnSO4·7H2O)，其中在实施例中使用的每种“发酵培养基”具有相同的组成)加入250mL锥形瓶中进行振荡，并在约121℃下灭菌约15分钟。将亲本菌株谷氨酸棒杆菌KFCC10680以及突变体谷氨酸棒杆菌Gln265(KCCM11554P)和谷氨酸棒杆菌Gln096(KCCM11553P)分别在约30℃下在活化培养基中培养约16小时。将每种所得活化菌株(KFCC10680、Gln096和Gln265)用接种环接种到发酵培养基中，并在约30℃下以约200rpm振荡培养约48小时。培养完成后，使用YSI 7100多参数生物分析系统(可得自YSI Inc.)测量去除细胞的每种培养基的上清液中存在的L-谷氨酰胺的浓度。结果示于表2。
[表2]
菌株 L-谷氨酰胺浓度(g/L)
KFCC10680 12.6
Gln096(突变体) 13.8
Gln265(突变体) 14.1
参考表2，根据一个实施方式，亲本菌株谷氨酸棒杆菌KFCC10680产生约12.6g/L的L-谷氨酰胺，而突变谷氨酸棒杆菌Gln096产生约13.8g/L的L-谷氨酰胺，与亲本菌株相比，L-谷氨酰胺生产力提高约9.5％以上。根据一个实施方式，突变谷氨酸棒杆菌Gln265产生约14.1g/L的L-谷氨酰胺，与亲本菌株相比，L-谷氨酰胺生产力提高约11％以上。
保藏机构：韩国微生物保藏中心(KCCM)(国际保藏机构)
登录号：KCCM11553P
保藏日期：20140703
保藏机构：韩国微生物保藏中心(KCCM)(国际保藏机构)
登录号：KCCM11554P
保藏日期：20140703
PCT/RO/134表

Claims (3)

1.谷氨酸棒杆菌突变体KCCM11553P或KCCM11554P，其产生L-谷氨酰胺并且对L-谷氨酰胺具有抗性。
2.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌突变体KCCM11553P或KCCM11554P，其中，所述谷氨酸棒杆菌突变体KCCM11553P或KCCM11554P能够在含有约15g/L至约25g/L的L-谷氨酰胺的培养基中存活约6天或更长。
3.一种产生L-谷氨酰胺的方法，所述方法包括：
在培养基中培养根据权利要求1或2所述的谷氨酸棒杆菌突变体；和
从所述突变体或所述培养基中回收L-谷氨酰胺。
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