JP6483253B2 - Ｌ−グルタミンを生産する微生物、及びそれを利用したｌ−グルタミン生産方法 - Google Patents

Ｌ−グルタミンを生産する微生物、及びそれを利用したｌ−グルタミン生産方法 Download PDF

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Description

本発明は、Ｌ−グルタミンを生産する微生物、及びそれを利用してＬ−グルタミンを生産する方法に関する。
Ｌ−グルタミンは、医薬品、化粧品、健康食品などに汎用されるアミノ酸であり、主に化合物に対する耐性または敏感性の微生物を利用して、Ｌ−グルタミンを生産してきた。例えば、スルファグアニジン（sulfaguanidine）耐性菌株（日本特許公報１９７８−１７６７５）、アザセリン（azaserine）耐性微生物（日本特許公開１９８０−１４８０９４）、ペニシリン感受性微生物（日本特許公開１９９２−０８８９９４）、チロシン−グルタミン酸（ｔｙｒ−ｇｌｕ）耐性株（日本特許公開１９９０−１８６９９４）などが利用されてきた。
かような背景下、本発明者らは、Ｌ−グルタミンの生産能が向上した菌株を開発するために研究を行っている最中、高濃度Ｌ−グルタミンに対する耐性を有する変異株を獲得し、そこから得られた変異株が、高収率でＬ−グルタミンを生産することを確認することにより、本発明を完成した。
本発明の目的は、Ｌ−グルタミンを生産する、向上したＬ−グルタミン生産用コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）変異株を提供することである。
本発明の他の目的は、前記コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）変異株を利用して、Ｌ−グルタミンを生産する方法を提供することである。
本発明の一様態において、Ｌ−グルタミンに対して耐性を有するコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）であって、Ｌ−グルタミンを生産するコリネバクテリウムグルタミカム変異株を提供する。
本発明におけるコリネバクテリウムグルタミカム変異株を利用すれば、Ｌ−グルタミンが高濃度で含まれた培地でも、Ｌ−グルタミンを生産することができる。従って、産業的生産が可能になるように、高効率及び高収率でＬ−グルタミンを生産することができる。
本発明の一様態で、Ｌ−グルタミンに対して耐性を有するコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）であって、Ｌ−グルタミンを生産するコリネバクテリウムグルタミカム変異株を提供する。
本発明において、用語「Ｌ−グルタミン」は、タンパク質を構成するアミノ酸の一種であり、グルタミン酸のモノアミドであり、Ｈ2ＮＣＯ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨの化学式を有するＬ−アミノ酸を意味する。
本発明において、用語「Ｌ−グルタミンに対する耐性」は、高濃度のＬ−グルタミンが存在する環境において、微生物が生育可能であるか、あるいはＬ−グルタミンを生産する活性が維持されるか、あるいは増大する特性を意味する。
細胞内において、一定濃度以上のＬ−グルタミンが蓄積されれば、グルタミンによって、グルタミン合成酵素（gultamine synthetase）の活性が阻害されるか、あるいは抑制されるフィードバック阻害を誘発し、Ｌ−グルタミン生合成が阻害される。従って、Ｌ−グルタミンに対して耐性を有する菌株は、Ｌ−グルタミンによるフィードバックが解除されることにより、高濃度のＬ−グルタミンを含む条件でも、Ｌ−グルタミンを生成することができる。
前記変異株は、コリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ １１５５３ＰまたはコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ １１５５４Ｐでもある。
前記変異株は、高濃度のＬ−グルタミンに対して耐性を有することができる。前記変異株は、具体的には、５ｇ／Ｌないし３０ｇ／Ｌ、さらに具体的には、１５ｇ／Ｌないし３０ｇ／Ｌ、一層さらに具体的には、２０ｇ／Ｌないし２５ｇ／ＬのＬ−グルタミン濃度に対して耐性を有することができる。
前記変異株は、１５ないし２５濃度（ｇ／Ｌ）のＬ−グルタミンを含む最小培地において、６日以上生存することができる。具体的には、前記変異株は、１５ないし２５濃度（ｇ／Ｌ）のＬ−グルタミンを含む、ｐＨ７．０のブドウ糖０．１％、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）０．０４％、リン酸第１カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）０．１％、チアミン（thiamine・ＨＣｌ）０．０００１％、ビオチン（biotin）２００μｇ／Ｌ、及び寒天（agar）含有の最小培地において３０℃で培養する場合、６日以上生存することができる。
本発明において使用される用語「Ｌ−グルタミンを生産する微生物」とは、自然にＬ−グルタミン生産能を有している微生物、またはＬ−グルタミンの生産能がない親菌株に、グルタミンの生産能が付与された微生物を意味する。
本発明のＬ−グルタミンの生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミカム変異株は、親菌株を突然変異させ、所望する変異株にもなる。微生物の突然変異誘発は、当該分野で周知の多様な手段によって行われ、物理的あるいは化学的な突然変異発生の二つのうち１つの方法を使用することができる。例えば、本発明に適する化学的突然変異誘発要因として、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ：Ｎ−methyl−Ｎ’−nitro−Ｎ−nitrosoguanidine）、ジエポキシブタン、エチルメタンスルホネート、マスタード化合物、ヒドラジン及び亜硝酸を含んでもよいが、それらに制限されるものではない。また、物理的突然変異誘発要因は、紫外線及びガンマ放射線を含んでもよいが、それらに制限されるものではない。
詳細には、本発明のＬ−グルタミンの生産能が向上した変異株を作製するために、従来のグルタミン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ １０６８０（Corynebacterium glutamicum ＫＦＣＣ １０６８０、大韓民国登録特許第１０−００４８４４０号）を親菌株として使用することができる。前記親菌株コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ １０６８０にＮＴＧを処理し、ランダム突然変異を行った後、Ｌ−グルタミンが添加された培地で培養し、菌株間のＬ−グルタミン生産能を比較選別することにより、Ｌ−グルタミンに耐性を有する変異株２種を獲得し、それらをＧｌｎ０９６（ＫＣＣＭ １１５５３Ｐ）及びＧｌｎ２６５（ＫＣＣＭ １１５５４Ｐ）と命名した。前記コリネバクテリウムグルタミカムＧｌｎ０９６及びコリネバクテリウムグルタミカムＧｌｎ２６５が、親菌株対比で、約１０％レベル向上した高収率のＬ−グルタミン生産能をそれぞれ有するということを確認した。
本発明の他の様態において、前記コリネバクテリウムグルタミカム変異株を培地で培養する段階を含むＬ−グルタミン生産方法を提供する。
前記コリネバクテリウムグルタミカム変異株については、前述の通りである。
前記培養は、当業界に公知の適切な培地及び培養条件によって行われる。また、当業者であるならば、培地及び培養条件を容易に調整して使用することができるであろう。具体的には、前記培地は、液体培地でもあるが、それに限定されるものではない。培養方法は、例えば、回分式培養（batch culture）、連続式培養（continuous culture）、流加式培養（fed-batch culture）、またはそれらの組み合わせ培養を含んでもよいが、それらに限定されるものではない。
前記培地は、適切な方式で、特定菌株の要件を満足しなければならず、当業者によって適切に変形されもする。コリネバクテリア菌株に係わる培養培地は、公知文献（Manualof Methods for General Bacteriology, American Society for Bacteriology, Washington D. C., USA, 1981）を参照することができるが、それに限定されるものではない。また、培地に、多様な炭素源、窒素源及び微量元素成分を含んでもよい。使用される炭素源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、澱粉、セルロースのような糖；炭水化物、大豆油、ひまわり油、ひまし油、ココナッツ油のようなオイル；脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸；グリセロール、エタノールのようなアルコール；酢酸のような有機酸が含まれる。それら物質は、個別的にまたは混合物としても使用されるが、それらに限定されるものではない。使用される窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、とうもろこし浸漬液、大豆ミール及び尿素、または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが含まれてもよい。窒素源も、個別的にまたは混合物として使用することができるが、それらに限定されるものではない。使用されるリンの供給源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウム、または相応するナトリウム含有塩が含まれてもよいが、それらに限定されるものではない。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含んでもよいが、それらに限定されるものではない。それ以外に、アミノ酸及びビタミンのような必須成長物質が含まれてもよい。また、培養培地に、適切な前駆体が使用される。前記培地または個別成分は、培養過程で培養液に、適切な方式によって、回分式でまたは連続式で添加されるが、それらに限定されるものではない。
また、培養中に、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸及び硫酸のような化合物を微生物培養液に適切な方式で添加し、培養液のｐＨを調整することができる。また、培養内に、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して、気泡生成を抑制することができる。さらには、培養液の好気状態を維持するために、培養液内に、酸素または酸素含有気体（例えば、空気）を注入することができる。培養液の温度は、一般的に２０℃ないし４５℃、例えば、２５℃ないし４０℃でもある。培養期間は、所望のキノリン酸の生成量が得られるまで持続することができ、例えば、１０ないし１６０時間でもある。
前記培養は、高濃度のＬ−グルタミン、例えば、１５ないし２５ｇ／Ｌ、または２０ないし２５ｇ／ＬのＬ−グルタミン濃度を含む培地内で培養することでもある。
本発明のＬ−グルタミン生産方法は、培養した微生物または培地からＬ−グルタミンを回収する段階を含んでもよい。前記微生物または培地からＬ−グルタミンを回収する方法は、培養方法によって、当該分野に公知された適する方法を利用して、培地から生産されたＬ−グルタミンを収集または回収することができる。例えば、遠心分離、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィ、結晶化及びＨＰＬＣ（high-performance liquid chromatography）などが使用されるが、それら例に限定されるものではない。
以下、本発明について、実施例によってさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例によって制限されるものではない。
実施例１：Ｌ−グルタミン生産用変異株選別
Ｌ−グルタミンの生産能が向上した微生物変異株を得るために、下記のような方法を使用して微生物の変異を誘導した。
具体的には、親菌株であるコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ １０６８０（Corynebacterium glutamicum ＫＦＣＣ １０６８０、大韓民国特許登録番号第１０−００４８４４０号）を、活性化培地（肉汁（beef extract）１％、ポリペプトン（polypeptone）１％、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）０．５％、酵母エキス（yeast extract）０．５％及び寒天（agar）２％、ｐＨ７．２：以下「活性化培地」は、同一組成を有する）（％は、ｗ／ｖ％を示し、以下、実施例の全ての％について同一である）において、１６時間培養して得た活性化された菌株を、１２１℃で１５分間滅菌した種培地（ブドウ糖５．０％、バクトペプトン（bactopeptone）１％、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）０．２５％、酵母エキス（yeast extract）１％、ビオチン（biotin）３μｇ／Ｌ及び尿素（urea）０．４％、ｐＨ７．０：以下「種培地」は、同一組成を有する）で１４時間培養した。培養液５ｍｌを試験管内に取り、８，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄み液を除去した後、１００ｍＭシトレート緩衝溶液（citrate buffer）を添加し、再浮遊させた後、同一に遠心分離して上澄み液を除去することにより、細胞を洗浄した。試験管内の細胞ペレットに、５ｍｌ １００ｍＭシトレート緩衝溶液（citrate buffer）を添加して再浮遊させ、ここにＮＴＧ（Ｎ−methyl−Ｎ’−nitro−Ｎ−nitrosoguanidine）を最終濃度２００ｍｇ／Ｌになるように添加した後、２０分間室温で放置した。その後、ＮＴＧで処理された細胞を、８，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上澄み液を除去した後、１００ｍＭリン酸緩衝溶液（phosphate buffer）を添加して再浮遊させた後、同一に遠心分離して上澄み液を除去することにより、細胞を洗浄した。次に、得られたＮＴＧで処理された菌株ペレットに種培地５ｍｌを添加して再浮遊させ、それを最小培地（ブドウ糖０．１％、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）０．０４％、リン酸第１カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）０．１％、チアミン（thiamine・ＨＣｌ）０．０００１％、ビオチン（biotin）２００μｇ／Ｌ及び寒天（agar）（１．５％）、ｐＨ７．０：以下「最小培地」は、同一組成を有する）含有プレートに塗抹し、３０℃で６日間培養した後、生存細胞をＯＤ６００値で測定した。細胞数を測定した結果、細胞死滅率は、８５％であった。
また、前記洗浄されたＮＴＧで処理された菌株を、Ｌ−グルタミン（最終濃度１５ｇ／Ｌ）が添加された最小培地含有プレートに塗抹し、３０℃で６日間培養し、生存細胞コロニーを選択することにより、Ｌ−グルタミン耐性変異株を選別した。選別された耐性変異株を、グルタミン生産培地（ブドウ糖４．０％、塩化アンモニウム（ＮＨ4Ｃｌ）３．０％、大豆酸加水分解物（soy protein acid hydrolysate）０．３％、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ3）５％、塩化カルシウム（ＣａＣｌ2）０．１％、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）０．０５％、リン酸第１カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）０．１５％、リン酸第２カリウム（Ｋ2ＨＰＯ4）０．１５％、尿素（urea）０．３％、チアミン（thiamine・ＨＣｌ）２ｍｇ／Ｌ、ビオチン（biotin）５μｇ／Ｌ、硫酸鉄（ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）２０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン（ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ）２０ｍｇ／Ｌ及び硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）１２ｍｇ／Ｌ、ｐＨ６．８：以下「グルタミン生産培地」は、同一組成を有する）２５ｍｌを含んだ振盪用三角フラスコに１ループ接種し、３０℃で２００ｒｍｐで振盪しながら、４８時間それぞれ培養した。対照群として、親菌株を同一条件で培養した。それらのうち親菌株であるコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１０６８０よりグルタミン生産収率が約１０％以上向上したＬ−グルタミン耐性変異株２種を選別した。
前記選別された変異株をコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ｇｌｎ０９６及びＧｌｎ２６５と命名し、それらを２０１４年７月３日付けで韓国微生物保存センターに寄託し、それぞれ受託番号ＫＣＣＭ １１５５３Ｐ及びＫＣＣＭ １１５５４Ｐを受けた。
実施例２：Ｌ−グルタミン生産用変異株のＬ−グルタミンに対する耐性比較
実施例１で選別された変異株のＬ−グルタミンに対する耐性を比較するために、親菌株（ＫＦＣＣ １０６８０）、コリネバクテリウムグルタミカムＧｌｎ０９６（ＫＣＣＭ １１５５３Ｐ）及びＧｌｎ２６５（ＫＣＣＭ １１５５４Ｐ）を、それぞれＬ−グルタミンの最終濃度が２．５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ及び２５ｇ／Ｌで添加された最小培地含有プレートに塗抹し、３０℃で６日間培養した。
その結果、下記表１で示されているように、親菌株は、１５ｇ／ＬのＬ−グルタミン濃度において、生育程度が低く、２０ｇ／Ｌ以上のＬ−グルタミン濃度では、生育することができない一方、変異株であるコリネバクテリウムグルタミカムＧｌｎ０９６（ＫＣＣＭ １１５５３Ｐ）及びＧｌｎ２６５（ＫＣＣＭ １１５５４Ｐ）は、１５ｇ／ＬのＬ−グルタミン濃度でも、依然として生育程度が高く、２０ｇ／Ｌ以上のＬ−グルタミン濃度でも、生育可能であり、変異株が高濃度のＬ−グルタミンに対する耐性を有するということを確認することができた。
実施例３：Ｌ−グルタミン生産用変異株のＬ−グルタミン生産性評価
前記実施例１で得られた変異株コリネバクテリウムグルタミカムＧｌｎ２６５（ＫＣＣＭ １１５５４Ｐ）と、変異株コリネバクテリウムグルタミカムＧｌｎ０９６（ＫＣＣＭ １１５５３Ｐ）のＬ−グルタミン生産性を確認するために、下記のような方法で培養し、Ｌ−グルタミンを生産した。
発酵培地（ブドウ糖１０％、塩化アンモニウム（ＮＨ4Ｃｌ）４．５％、大豆酸加水分解物（soy protein acid hydrolysate）０．５％、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ3）５％、塩化カルシウム（ＣａＣｌ2）０．１％、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）０．０５％、リン酸第１カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）０．１５％、リン酸第２カリウム（Ｋ2ＨＰＯ4）０．１５％、尿素（urea）０．３％、チアミン（thiamine・ＨＣｌ）２ｍｇ／Ｌ、ビオチン（biotin）５μｇ／Ｌ、硫酸鉄（ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）２０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン（ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ）２０ｍｇ／Ｌ及び硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）１２ｍｇ／Ｌ、ｐＨ６．８：以下「発酵培地」は、同一組成を有する）２０ｍｌを、２５０ｍｌ振盪用三角フラスコに分注し、１２１℃で１５分間滅菌した後、３０℃活性化培地で１６時間培養し、活性化された菌株（ＫＦＣＣ １０６８０、Ｇｌｎ０９６及びＧｌｎ２６５）を、前記発酵培地にそれぞれ１ループずつ接種し、３０℃で４８時間２００ｒｐｍで撹拌しながら培養した。培養終了後、細胞を除去した培地上澄み液中に存在するＬ−グルタミンを、ＹＳＩ ７１００ Multiparameter Bioanalytical System（ＹＳＩ Ｉｎｃ）を使用して測定し、その結果を下記表２に示した。
前記表２から分かるように、親菌株であるコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ １０６８０は、１２．６ｇ／Ｌの濃度でＬ−グルタミンを生産したが、本発明による変異株コリネバクテリウムグルタミカムＧｌｎ０９６は、１３．８ｇ／Ｌの濃度でＬ−グルタミンを生産し、親菌株に比べ、約９．５％以上Ｌ−グルタミン生産性が上昇したということを確認した。また、変異株コリネバクテリウムグルタミカムＧｌｎ２６５は、１４．１ｇ／Ｌの濃度でＬ−グルタミンを生産し、親菌株に比べ、約１１％以上Ｌ−グルタミン生産性が上昇したということを確認した。
寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ １１５５３Ｐ
受託日時：２０１４０７０３

寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ １１５５４Ｐ
受託日時：２０１４０７０３

Claims (3)

  1. Ｌ−グルタミンに対して耐性を有するコリネバクテリウムグルタミカムであって、Ｌ−グルタミンを生産するコリネバクテリウムグルタミカム変異株ＫＣＣＭ １１５５３Ｐまたはコリネバクテリウムグルタミカム変異株ＫＣＣＭ １１５５４Ｐ。
  2. １５ないし２５濃度（ｇ／Ｌ）のＬ−グルタミンを含む、培養培地で６日以上生存することを特徴とする、請求項１に記載のコリネバクテリウムグルタミカム変異株ＫＣＣＭ １１５５３Ｐまたはコリネバクテリウムグルタミカム変異株ＫＣＣＭ １１５５４Ｐ。
  3. 請求項１または２に記載のコリネバクテリウムグルタミカム変異株を培養する段階、及び前記変異株または培地からＬ−グルタミンを回収する段階を含む、Ｌ−グルタミンを生産する方法。
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