JPS6152276A - Ｌ―トリプトファンの製造法 - Google Patents
Ｌ―トリプトファンの製造法Info
- Publication number
- JPS6152276A JPS6152276A JP17004684A JP17004684A JPS6152276A JP S6152276 A JPS6152276 A JP S6152276A JP 17004684 A JP17004684 A JP 17004684A JP 17004684 A JP17004684 A JP 17004684A JP S6152276 A JPS6152276 A JP S6152276A
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- Japan
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- tryptophan
- strain
- bacillus
- microorganism
- anthranilic acid
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は５−フルオロトリプトファン耐性を有しかつア
ンスラニル酸要求性を有するバチルス属に属する菌株を
復帰変異せしめてアンスラニル酸非要求性としたＬ −
） ＩＪブトファン生産能を有する微生物及びそれを用
いたＬ−トリプトファンの製造法に関する。
ンスラニル酸要求性を有するバチルス属に属する菌株を
復帰変異せしめてアンスラニル酸非要求性としたＬ −
） ＩＪブトファン生産能を有する微生物及びそれを用
いたＬ−トリプトファンの製造法に関する。
Ｌ−）リゾトファンは必須アミノ酸として重要な化合物
であシ、医薬品或いは食品、飼料の添加剤として利用さ
れている。
であシ、医薬品或いは食品、飼料の添加剤として利用さ
れている。
前述の如＜、Ｌ−）リプトファンは必須アミノ酸として
重要な化合物であり、特に栄養学的に不足しやすい物質
であるためその経済的な工業的製造法の開発が強く望ま
れている。かかる観点から従来種々の化学的又は微生物
学的合成方法が提唱されている。そのようなＬ−トリプ
トファンの合成方法の一例として微生物を用いてアンス
ラニル酸やインドールなどの前駆物質からＬ−トリプト
ファンを製造する方法が知られている。
重要な化合物であり、特に栄養学的に不足しやすい物質
であるためその経済的な工業的製造法の開発が強く望ま
れている。かかる観点から従来種々の化学的又は微生物
学的合成方法が提唱されている。そのようなＬ−トリプ
トファンの合成方法の一例として微生物を用いてアンス
ラニル酸やインドールなどの前駆物質からＬ−トリプト
ファンを製造する方法が知られている。
しかしながら、この場合に比較的多量のアンスシェル酸
を培養系に添加すると、Ｌ−）リゾトファンの生合成が
阻害されるため高濃度のＬ −） ＩＪデトファン含有
培養液を得ることが困難であシ、実用化の障害と々って
いた。このような状況下にトリプトファンアナログ体、
例えば５−フルオロトリプトファンや５−メチルトリシ
トファンに耐性を有する変異菌株を用いて、Ｌ−トリプ
トファンによるトリプトファン生合成系酵素の生産抑制
を解除して直接醗酵法によｆｉＬ−）リプトファンを製
造する方法が提案されている。しかしながら、従来、ト
リシトファン生合成系酵素の一つであるアンスラニル酸
合成酵素へのＬ−）リゾトフ了ンによる活性阻害を解除
した例はなかった。
を培養系に添加すると、Ｌ−）リゾトファンの生合成が
阻害されるため高濃度のＬ −） ＩＪデトファン含有
培養液を得ることが困難であシ、実用化の障害と々って
いた。このような状況下にトリプトファンアナログ体、
例えば５−フルオロトリプトファンや５−メチルトリシ
トファンに耐性を有する変異菌株を用いて、Ｌ−トリプ
トファンによるトリプトファン生合成系酵素の生産抑制
を解除して直接醗酵法によｆｉＬ−）リプトファンを製
造する方法が提案されている。しかしながら、従来、ト
リシトファン生合成系酵素の一つであるアンスラニル酸
合成酵素へのＬ−）リゾトフ了ンによる活性阻害を解除
した例はなかった。
本発明者らは、前記した従来のＬ−）！Ｊデトファンの
微生物学的製造法においてアンスラニル酸合成酵素への
Ｌ −） ＩＪデトファンによる活性阻害を解除した例
が無い現状に鑑み、しかもＬ −） ＩＪデトファンの
生産性を更に向上させるためにはこの阻害を解除するこ
とが必須と考えて、鋭意研究を進めた結果、Ｌ−トリプ
トファンによるアンスラニル酸合成酵素への活性阻害を
解除したＬ−）リットファン生産性微生物菌株を取得す
ることに成功し、本発明をするに至った。
微生物学的製造法においてアンスラニル酸合成酵素への
Ｌ −） ＩＪデトファンによる活性阻害を解除した例
が無い現状に鑑み、しかもＬ −） ＩＪデトファンの
生産性を更に向上させるためにはこの阻害を解除するこ
とが必須と考えて、鋭意研究を進めた結果、Ｌ−トリプ
トファンによるアンスラニル酸合成酵素への活性阻害を
解除したＬ−）リットファン生産性微生物菌株を取得す
ることに成功し、本発明をするに至った。
即ち、本発明に従えば、５−フルオロトリプトファン耐
性を有しかつアンスラニル酸要求性を有するバチルス属
に属する菌株を復帰変異せしめてアンスラニル酸非要求
性とした、Ｌ−トリプトファン生産能を有するバチルス
・アミロリクイファシェンス５Ｄ−４３が提供される。
性を有しかつアンスラニル酸要求性を有するバチルス属
に属する菌株を復帰変異せしめてアンスラニル酸非要求
性とした、Ｌ−トリプトファン生産能を有するバチルス
・アミロリクイファシェンス５Ｄ−４３が提供される。
本発明に従えば、また、上記Ｌ−トリプトファン生産能
を有するバチルス・アミロリクイファシェンス５Ｄ−４
３を培地に培養して培養物中にＬ−トリプトファンを生
成せしめ、これを採取することから成るＬ−）リプトフ
ァンの製造法が提供される。
を有するバチルス・アミロリクイファシェンス５Ｄ−４
３を培地に培養して培養物中にＬ−トリプトファンを生
成せしめ、これを採取することから成るＬ−）リプトフ
ァンの製造法が提供される。
本発明に従った５−フルオロトリシトファン耐性及びア
ンスラニル酸要求性を有するバチルス属に属する菌株を
復帰変異せしめてアンスラニル酸非要求性とした、Ｌ−
）リゾトファン生産能を有するバチルス属に属する微生
物バチルス・アミロリクイファシェンス５Ｄ−４３は以
下のようにして取得した。
ンスラニル酸要求性を有するバチルス属に属する菌株を
復帰変異せしめてアンスラニル酸非要求性とした、Ｌ−
）リゾトファン生産能を有するバチルス属に属する微生
物バチルス・アミロリクイファシェンス５Ｄ−４３は以
下のようにして取得した。
すなわち、本発明者らは原株バチルス・アミロリクイフ
ァシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｒｒＩｙｌｏｌｉｑ
ｕｅｆａｃｉｅｎｓ ）ＩＡＭ１５２１を常法に従って
Ｎ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロソグアニジン（
ＮＴＧ）を用いて人工突然変異誘発処理し、この変異処
理法をトリプトファンアナログとして最低阻止濃度（Ｍ
ＩＣ）以上の５−フルオロトリプトファン（５−ＦＴ）
を添加した寒天平板培地（スピデイゼン培地）で生育さ
せて生育した数百のコロニーについてそれぞれＬ−）！
Ｊシトファンの生産性を調べ、最もＬ−トリプトファン
生産能の高い５−ＦＴ耐性（即ち、トリプトファン濃度
の蓄積による微生物固有のフィードバック抑制機構を解
除した）菌株を得る。
ァシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｒｒＩｙｌｏｌｉｑ
ｕｅｆａｃｉｅｎｓ ）ＩＡＭ１５２１を常法に従って
Ｎ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロソグアニジン（
ＮＴＧ）を用いて人工突然変異誘発処理し、この変異処
理法をトリプトファンアナログとして最低阻止濃度（Ｍ
ＩＣ）以上の５−フルオロトリプトファン（５−ＦＴ）
を添加した寒天平板培地（スピデイゼン培地）で生育さ
せて生育した数百のコロニーについてそれぞれＬ−）！
Ｊシトファンの生産性を調べ、最もＬ−トリプトファン
生産能の高い５−ＦＴ耐性（即ち、トリプトファン濃度
の蓄積による微生物固有のフィードバック抑制機構を解
除した）菌株を得る。
こノ菌株は５−フルオロトリプトファンに対し５０００
ｐｐｍ以上の耐性を有する。
ｐｐｍ以上の耐性を有する。
次に、この５−ＦＴ耐性及びＬ−）！Ｊデトファン生産
能を有する変異菌株を再び上と同様にしてＮＴＧを用い
て人工突然変異誘発処理し、処理後、遠心分離（１，０
ＯＯＯＧＸＳ分）し、菌体部Ｍ／１００トリス緩衝液（
ｐＨ７，０）に懸濁し遠心分離することを３回繰返し、
ＮＴＧを除去する。菌体部をアンスラニル酸２０〜５０
ｐｐｍを含むスビデイゼン培地のような枯草菌用最小
培地にて３０〜４０℃で１〜３時間培養する。
能を有する変異菌株を再び上と同様にしてＮＴＧを用い
て人工突然変異誘発処理し、処理後、遠心分離（１，０
ＯＯＯＧＸＳ分）し、菌体部Ｍ／１００トリス緩衝液（
ｐＨ７，０）に懸濁し遠心分離することを３回繰返し、
ＮＴＧを除去する。菌体部をアンスラニル酸２０〜５０
ｐｐｍを含むスビデイゼン培地のような枯草菌用最小
培地にて３０〜４０℃で１〜３時間培養する。
培養後、遠心分離によって集菌し、菌体部を上記トリス
緩衝液で洗浄し、更にトリス緩衝液中に再懸濁して３０
〜４０℃で１〜３時間振とりする。
緩衝液で洗浄し、更にトリス緩衝液中に再懸濁して３０
〜４０℃で１〜３時間振とりする。
振とり終了後、遠心分離によって集菌し、トリス緩衝液
で洗浄した後、アンスラニル酸要求性菌株を濃縮すべく
、ペニシリン５００〜２０００ ｐｐｍを含有する枯草
菌用最小培地中に懸濁し、３０〜４０℃で３０〜９０分
、好ましくは４０〜６０分間振とうする。振とり終了後
、上と同様に集菌洗浄し、前記ペニシリン含有枯草菌用
最小培地にて同様の操作を３〜１０回繰り返してアンス
ラニル酸２０〜５０ ｐｐｍ含有枯草菌用最小平板培地
では生育するが、アンスラニル酸無添加平板培地では生
育しないアンスラニル酸要求性菌株をスクリーニングす
る。最適条件では９０％以上に濃縮することが可能であ
る。
で洗浄した後、アンスラニル酸要求性菌株を濃縮すべく
、ペニシリン５００〜２０００ ｐｐｍを含有する枯草
菌用最小培地中に懸濁し、３０〜４０℃で３０〜９０分
、好ましくは４０〜６０分間振とうする。振とり終了後
、上と同様に集菌洗浄し、前記ペニシリン含有枯草菌用
最小培地にて同様の操作を３〜１０回繰り返してアンス
ラニル酸２０〜５０ ｐｐｍ含有枯草菌用最小平板培地
では生育するが、アンスラニル酸無添加平板培地では生
育しないアンスラニル酸要求性菌株をスクリーニングす
る。最適条件では９０％以上に濃縮することが可能であ
る。
次に、上で得たアンスラニル酸要求性菌株を前記したよ
うにしてＮＴＧを用いて再度人工突然変異誘発処理した
後、前記したようにして遠心分離により変異処理株を集
菌しトリス緩衝液で洗浄し、栄養培地で３０〜４０℃に
て３時間培養する。培養終了後、前記したようにして遠
心分離により集菌し、トリス緩衝液中に濃度１×１０
個／ＴＬＩＫなるように懸濁し、これを寒天１６ｇを加
えたスビザイゼン培地から成り、アンスラニル酸を含ま
ない枯草菌用最小平板培地に塗布し、３０〜４０℃で３
日間静置培養し、生育するコロニーの中からＩ、−）リ
デトフ了ン生産能の高い菌株バチルス・アミロリクイフ
ァシェンス５Ｄ−４３を選択した。
うにしてＮＴＧを用いて再度人工突然変異誘発処理した
後、前記したようにして遠心分離により変異処理株を集
菌しトリス緩衝液で洗浄し、栄養培地で３０〜４０℃に
て３時間培養する。培養終了後、前記したようにして遠
心分離により集菌し、トリス緩衝液中に濃度１×１０
個／ＴＬＩＫなるように懸濁し、これを寒天１６ｇを加
えたスビザイゼン培地から成り、アンスラニル酸を含ま
ない枯草菌用最小平板培地に塗布し、３０〜４０℃で３
日間静置培養し、生育するコロニーの中からＩ、−）リ
デトフ了ン生産能の高い菌株バチルス・アミロリクイフ
ァシェンス５Ｄ−４３を選択した。
この菌株は昭和５９年８月１４日に工業技術院≠微生物
工業技術研究所にバチルス・アミロリクイファシェンス
（Ｂａｃｆｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅ
ｎｓ）ＳＤ−４３（微工研菌寄第７７７２号）として寄
託した。この菌株の菌学的性質は、原株バチルス・アミ
ロリクイファシェンスＩＡＭ１５２１のＶｉ学的性質と
、５−ＦＴ耐性を有しかつＬ−）リプトファンによるア
ンスラニル酸合成酵素へのフィードバック阻害が解除さ
れて、Ｌ −） ！Ｊデトファン生産性の非常に高いこ
とを除けば同じであった。
工業技術研究所にバチルス・アミロリクイファシェンス
（Ｂａｃｆｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅ
ｎｓ）ＳＤ−４３（微工研菌寄第７７７２号）として寄
託した。この菌株の菌学的性質は、原株バチルス・アミ
ロリクイファシェンスＩＡＭ１５２１のＶｉ学的性質と
、５−ＦＴ耐性を有しかつＬ−）リプトファンによるア
ンスラニル酸合成酵素へのフィードバック阻害が解除さ
れて、Ｌ −） ！Ｊデトファン生産性の非常に高いこ
とを除けば同じであった。
本発明に従ってＬ −） ＩＪデトファンを製造するニ
ハ、バチルス・アミロリクイファシェンス５Ｄ−４３を
培地中に培養することによシ実施する。
ハ、バチルス・アミロリクイファシェンス５Ｄ−４３を
培地中に培養することによシ実施する。
本発明方法において使用することのできる培地としては
、前記微生物が培養によシ増殖し得るものであれば任意
のものでよく、例えば炭素源としてはブドウ糖、糖蜜、
蔗糖、デン粉、デン粉塘化液、セルロース分解物などの
糖類、酢酸、エタノール等が用いられる。窒素源として
はアンモニア、硫安、塩安、硝安、燐安などのアンモニ
ウム塩や尿素、硝酸塩等が適宜用いられる。無機塩とし
てハ燐酸、カリウム、マグネシウム、マンガン等の塩類
、例えば燐酸アンモニウム、燐酸カリ、燐酸ソーダ、硫
酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンがン、苛性カリ
等の通常の工業用薬品で良く、他に微量元素としてカル
シウム、亜鉛、硼素、銅、コバルト、モリブデン等の塩
類を加えても良い。
、前記微生物が培養によシ増殖し得るものであれば任意
のものでよく、例えば炭素源としてはブドウ糖、糖蜜、
蔗糖、デン粉、デン粉塘化液、セルロース分解物などの
糖類、酢酸、エタノール等が用いられる。窒素源として
はアンモニア、硫安、塩安、硝安、燐安などのアンモニ
ウム塩や尿素、硝酸塩等が適宜用いられる。無機塩とし
てハ燐酸、カリウム、マグネシウム、マンガン等の塩類
、例えば燐酸アンモニウム、燐酸カリ、燐酸ソーダ、硫
酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンがン、苛性カリ
等の通常の工業用薬品で良く、他に微量元素としてカル
シウム、亜鉛、硼素、銅、コバルト、モリブデン等の塩
類を加えても良い。
また微量有機栄養素としてビタミン、アミノ酸、核酸関
連物質等は菌の生育上は特別に必要とするものではガい
が、これらを添加したり、コーンスチープリカー、肉エ
キス、酵母エキス、ペプトン等の有機物を加えても良い
。また、本発明の微生物はその生育にアンスラニル酸を
必要とし々いため、通常はアンスラニル酸無添加培地に
て培養されるが、Ｌ−トリプトファンの生産性の向上の
ため、培地中にアンスラニル酸を添加してもその生育上
は同等差支えはなく、その場合には、アンスラニル酸は
ソーダ塩、カリウム塩、アンモニウム塩の水溶液や遊離
酸のエチルアルコールまたメチルアルコール溶液として
添加すれば良い。
連物質等は菌の生育上は特別に必要とするものではガい
が、これらを添加したり、コーンスチープリカー、肉エ
キス、酵母エキス、ペプトン等の有機物を加えても良い
。また、本発明の微生物はその生育にアンスラニル酸を
必要とし々いため、通常はアンスラニル酸無添加培地に
て培養されるが、Ｌ−トリプトファンの生産性の向上の
ため、培地中にアンスラニル酸を添加してもその生育上
は同等差支えはなく、その場合には、アンスラニル酸は
ソーダ塩、カリウム塩、アンモニウム塩の水溶液や遊離
酸のエチルアルコールまたメチルアルコール溶液として
添加すれば良い。
本発明方法における培養は好気的条件下に、例えば通気
攪拌や往復振盪方法によって培養することができる。培
養条件は、特に限定はないが、一般的に言えば、温度３
０〜４０℃、ｐＨ６，０〜８．０及び１８〜７２時間程
度の条件で実施する。
攪拌や往復振盪方法によって培養することができる。培
養条件は、特に限定はないが、一般的に言えば、温度３
０〜４０℃、ｐＨ６，０〜８．０及び１８〜７２時間程
度の条件で実施する。
培養液又は培養物からの目的のＬ −） ＩＪデトファ
ンの採取方法は慣用方法に従って行うことができる。例
えば、遠心分離により菌体部を除いた培養液上清からイ
オン交換樹脂処理法、活性炭処理法等の操作を適宜組み
合せてＬ −） ＩＪデトフ了ンを単離晶析することが
できる。
ンの採取方法は慣用方法に従って行うことができる。例
えば、遠心分離により菌体部を除いた培養液上清からイ
オン交換樹脂処理法、活性炭処理法等の操作を適宜組み
合せてＬ −） ＩＪデトフ了ンを単離晶析することが
できる。
実施例
以下に本発明の詳細な説明するが、本発明の範囲をこれ
らの実施例に限定するものでないことはいうまでもない
。
らの実施例に限定するものでないことはいうまでもない
。
例１（実施例）
下記組成の液体培地２ノを５１！のジャーファーメンタ
−に入れ、１１５℃で１５分間加熱滅菌した。
−に入れ、１１５℃で１５分間加熱滅菌した。
液体培地組成
グルコース１０％、硫安０．３チ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１
２Ｈ２００，５％、ＫＨ２ＰＯ４０，２俤、ＭｇＳＯ４
・７Ｈ２００，１％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０５ｐｐｍ
、 及びＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２０１ｐｐｍ 次いで、この培養槽に、予じめ肉汁寒天培地にて３０℃
で１６時間培養したバチルス・アミロリクイファシェン
ス５Ｄ−４３を滅菌水１０ｍ１に懸濁して接種し、５昏
存酸素量を０．５ｐｐｍ以上に、グルコース濃度を２チ
に、そしてｐＨを７．０に保ちながら、３０時間通気攪
拌培養を行なった。
２Ｈ２００，５％、ＫＨ２ＰＯ４０，２俤、ＭｇＳＯ４
・７Ｈ２００，１％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０５ｐｐｍ
、 及びＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２０１ｐｐｍ 次いで、この培養槽に、予じめ肉汁寒天培地にて３０℃
で１６時間培養したバチルス・アミロリクイファシェン
ス５Ｄ−４３を滅菌水１０ｍ１に懸濁して接種し、５昏
存酸素量を０．５ｐｐｍ以上に、グルコース濃度を２チ
に、そしてｐＨを７．０に保ちながら、３０時間通気攪
拌培養を行なった。
このようにして得られた培養液中（ではＬ−トリプトフ
ァン１３ ｇ／１１が蓄積していた。
ァン１３ ｇ／１１が蓄積していた。
例２（比較例）
例１においてバチルス・アミロリクイファシェンス５Ｄ
−４３に代えて、バチルス・アミロクイファシェンス５
Ｄ−４３の親株である５−ＦＴ耐性菌株を用いた以外は
例１と同様にして３０時間通気攪拌培養した。このよう
にして得られた培養液中にはＬ−トリプトファン９ ｇ
／Ｉｔが蓄積していた。
−４３に代えて、バチルス・アミロクイファシェンス５
Ｄ−４３の親株である５−ＦＴ耐性菌株を用いた以外は
例１と同様にして３０時間通気攪拌培養した。このよう
にして得られた培養液中にはＬ−トリプトファン９ ｇ
／Ｉｔが蓄積していた。
発明の効果
本発明に従えば、Ｌ−ト！７グト７アン合成酵素系の生
産抑制と活性阻害解除によって培地中に高濃度のＬ−ト
リプトファンの蓄積が達成される。
産抑制と活性阻害解除によって培地中に高濃度のＬ−ト
リプトファンの蓄積が達成される。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、５−フルオロトリプトファン耐性を有しかつアンス
ラニル酸要求性を有するバチルス属に属する菌株を復帰
変異せしめてアンスラニル酸非要求性としたＬ−トリプ
トファン生産能を有するバチルス・アミロリクイファシ
エンスＳＤ−４３。 ２、５−フルオロトリプトファン耐性を有しかつアンス
ラニル酸要求性を有するバチルス属に属する菌株を復帰
変異せしめてアンスラニル酸非要求性としたＬ−トリプ
トファン生産能を有するバチルス・アミロリクイファシ
エンスＳＤ−４３を培地に培養して培養物中にＬ−トリ
プトファンを生成せしめ、これを採取することを特徴と
するＬ−トリプトファンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17004684A JPS6152276A (ja) | 1984-08-16 | 1984-08-16 | Ｌ―トリプトファンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17004684A JPS6152276A (ja) | 1984-08-16 | 1984-08-16 | Ｌ―トリプトファンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6152276A true JPS6152276A (ja) | 1986-03-14 |
| JPH0352959B2 JPH0352959B2 (ja) | 1991-08-13 |
Family
ID=15897609
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17004684A Granted JPS6152276A (ja) | 1984-08-16 | 1984-08-16 | Ｌ―トリプトファンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6152276A (ja) |
-
1984
- 1984-08-16 JP JP17004684A patent/JPS6152276A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0352959B2 (ja) | 1991-08-13 |
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