CN1058615A - 生产l-谷氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了生产L-谷氨酸的方法，其包括在 培养基中培养对青霉素有敏感性的棒状谷氨酸生产 菌直到培养基中积聚L-谷氨酸，然后由其中回收 L-谷氨酸。可在不进行添加抗生素等操作，并且不 会因培养基中存在过量生物素而抑制L-谷氨酸产 率的情况下，有效地产生用作药物和食品添加剂的 L-谷氨酸。

Description

本发明涉及发酵生产L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸可在食品、医药等广泛领域用于多种目的。
发酵生产L-谷氨酸时，L-谷氨酸生产菌的生长需要生物素，故其L-谷氨酸产率在很大程度上取决于培养基中的生物素浓度。可在生产菌生长所需之特定极限浓度的生物素中生产L-谷氨酸。另一方面，用来作为廉价培养基之粗原料的赤糖糊糖蜜（blackstrap  molasses）、淀粉水解物等都含有过量的生物素。在这种含有过量生物素的培养基中生产L-谷氨酸，需要进行添加抗生素（如青霉素）、表面活性剂，或在培养期间提高培养温度等操作。为了实现在不进行上述操作的情况下在含过量生物素的培养基中经培养微生物生产L-谷氨酸，已知有利用溶菌酶敏感性菌株的方法（日本已公开之已审查专利申请NO.27798/87）、及利用对有维生素P活性之化合物有抗性的菌株的方法（日本已公开之未审查专利申请NO.164792/81）等。
为了利用廉价粗原料工业化生产L-谷氨酸，一直期望发展一种在不进行添加青霉素、表面活性剂等，或提高培养温度等操作的情况下，有效地生产L-谷氨酸的方法。
根据本发明，可使用对青霉素有敏感性的棒状谷氨酸生产菌以高产率生产L-谷氨酸。
本发明中，只要是属于所谓棒状谷氨酸生产菌的微生物，如属于棒状杆菌属（Corynebacterium）、短杆菌属（Brevibacterium）等的微生物，且对青霉素有敏感性并只要不会因培养基中存在过量生物素而抑制用微生物生产L-谷氨酸，则任何上述各属微生物均可使用。一般说来，这种对青霉素有敏感性的菌株是选自于经突变属于棒状杆菌属或短杆菌属的、并能够产生L-谷氨酸的亲代菌株所得到的突变菌株。这里所说的青霉素是指包括青霉素G、F、K、O、V、X等及其盐的青霉素类。
可用常规突变方法，如用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍等处理来诱导产生用于本发明的青霉素敏感性菌株。为了从突变诱导的菌株中选择适用于本发明的突变株，可选择那些在其亲代菌株能生长的青霉素浓度下，生长得不好或不能生长的菌株。本文所说的青霉素敏感性是指青霉素的最小生长抑制浓度小于亲代菌株的最小生长抑制浓度。L-谷氨酸的生产没有因培养基中存在过量生物素而受到抑制，意味着培养基中存在过量生物素对L-谷氨酸生产造成的抑制作用基本上可以忽略不计。更具体地说，可在不受过量生物素影响的情况下生产L-谷氨酸。对于棒状谷氨酸生产菌，一般当培养基中存在10μg/L或更多生物素时即可抑制L-谷氨酸的生产。因此，过量生物素是指培养基中存在之生物素的量在1μg/L或更多。
得到本发明之突变株的亲代菌株可包括棒状谷氨酸生产菌，如谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium  glutamicum）ATCC  13032、嗜醋酸棒杆菌（Corynebacterium  acetoacidophilum）ATCC  13870、利郎棒杆菌（C.lilium）ATCC  15990、黄色短杆菌（Brevibacterium  flavum）ATCC  14067、乳酸发酵短杆菌（B.lactofermentum）ATCC  13869、二岐短杆菌（B.divaricatum）ATCC14020等。另外，也可使用由上述野生菌株诱导产生的、改善了L-谷氨酸产率的各种突变菌株。在许多情况下，可以赋予本发明的突变株以通常已知适于增加其L-谷氨酸生产能力的特性，来进一步提高产率。
下文具体描述获得本发明突变株的特定方法，并将如此诱导产生之突变株的青霉素敏感性程度列示如下。
按常规方法，以10g个细胞/ml的密度分别将谷氨酸棒杆菌ATCC13032和黄色短杆菌ATCC14067菌株的细胞悬浮于10ml  Tris-马来酸盐缓冲溶液（pH6.0）中，并向悬液内加入500μg/ml的N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍。将混合物于30℃下放置30分钟。收集细胞后，用Tris-马来酸盐缓冲液彻底洗涤细胞并涂布在培养基A（1%蛋白胨、0.5%肉汁、0.5%酵母浸膏、0.25%Nacl、2%琼脂，pH7.2）上，然后于30℃下培养48小时。将如此得到的突变株重复接种于培养基A和向培养基中添加0.01U/ml青霉素G（钾盐）制得的培养基B中。30℃培养48小时后，收获在添加了青霉素的培养基（培养基B）中生长差或不生长，但在未添加青霉素的培养基（培养基A）中生长良好的突变株、此即青霉素敏感性菌株。亲代菌株在各培养基均生长良好。分别在培养基A和培养基B中将本发明收获的突变菌株和其亲代菌株培养48小时，以比较各菌株的生长程度。结果示于表1中。
表1
培养基 生长程度
ATCC13032   H-7684   ATCC14067   H-7685
AB 卄       卄          卄        卄卄        －        卄        －  
卄：生长良好;一：不生长
上述青霉素敏感性菌株已于1990年7月12日分别以下列登记号保藏在Fermentation  Research  Institute，Agency  of  Industrial  Science  and  Technology，Japan：谷氨酸棒杆菌H-7684（FERM  BP-3004）和黄色短杆菌H-7685（FERM  BP-3005）。
为了培养用于本发明的微生物，一般可使用适于发酵生产氨基酸的培养基。即可使用含有能被微生物同化之碳源、氮源、无机盐、生长因子等的合成培养基或天然培养基。作为碳源可使用糖如葡萄糖、果糖、蔗糖、废糖蜜、淀粉、淀粉水解物等;且可使用乙酸、富马酸、柠檬酸等各种有机酸;乙醇、甲醇、甘油等醇类物质。最好是选用赤糖糊糖蜜。作为氮源，可使用氨，氯化铵、硫酸铵、乙酸铵、磷酸铵等各种无机酸盐，富马酸铵等有机酸铵盐，乙胺等胺，尿素等含氮化合物，蛋白胨、肉汁、酵母浸膏、玉米浆、酪蛋白水解物、大豆饼或其水解物，用于氨基酸和核酸发酵的各种微生物细胞及其消化产物等。作为无机矿物质，可使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。作为生长因子，可使用生物素、硫胺素、烟酸、β-丙氨酸等维生素以及谷氨酸等氨基酸。
可在通气条件下进行培养，如振荡培养，搅拌深层培养等。培养温度为20至40℃，较好是25至38℃。培养基的pH为5至9，且较好保持在中性pH左右。可用尿素、碳酸钙、无机或有机酸、碱溶液、氨水、pH缓冲溶液等调整pH。一般在1至7天完成培养过程，从而产生并在培养液中积聚L-谷氨酸。
培养完成后，由培养液中除去细胞等沉淀物。单独或联合使用离子交换处理、浓缩、盐析、等电沉积等方法从培养液中回收L-谷氨酸。
下面以实施例进一步阐述本发明。
实施例1
首先，在2升锥形瓶内制备250ml由50g/L赤糖糊糖蜜（按葡萄糖量计算）、10g/L硫酸铵、2g/L尿素、0.5g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4·2H2O和30g/L CaCO3组成的生产培养基（pH7.2）。在由20g/L葡萄糖、10g/L蛋白胨、10g/L酵母浸膏和5g/L Nacl组成的种子培养基（pH7.2）中将谷氨酸棒杆菌ATCC13032或H-7684菌株于30℃下培养24小时。然后将20ml种子培养液接种到上述250ml生产培养基中。在ATCC13032菌株的培养液中未见有L-谷氨酸积聚，而在H-7684菌株的培养液中产生并积聚了25.0mg/ml的L-谷氨酸。
从H-7684菌株的培养液中离心得到1升上清液，并通过装有强酸性阳离子交换树脂〔Dowex  50×8（Na型），Dow  Chemical有限公司生产〕的柱。用氨水洗脱L-谷氨酸、分离、纯化、浓缩并结晶，得到20.0g  L-谷氨酸结晶。
实施例2
按实施例1所述的相似方法培养黄色短杆菌ATCC14067或H-7685菌株。结果如表2所示。
表2
菌株 积聚的L－谷氨酸量(g/L)
ATCC 14067H-7685 微量17.0

Claims (6)

1、生产L-谷氨酸的方法，其包括在培养基中培养中对青霉素有敏感性的棒状谷氨酸生产菌直到培养中积聚L-谷氨酸，并由其回收L-谷氨酸。
2、根据权利要求1的方法，其中细菌是属于棒状杆菌属或短杆菌属的微生物。
3、根据权利要求2的方法，其中微生物属于谷氨酸棒杆菌或黄色短杆菌菌种。
4、根据权利要求3的方法，其中微生物是谷氨酸棒杆菌H-7684（FERM  BP-3004）或黄色短杆菌H-7685（FERM  BP-3005）。
5、根据权利要求1的方法，其中培养是在20至40℃下进行1至7天。
6、微生物谷氨酸棒杆菌H-7684（FERM  BP-3004）或黄色短杆菌H-7685（FERM  BP-3005）的生物学纯的培养物。
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