CN1037927A - 生产l-赖氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

公开了一种生产L-赖氨酸的方法，该方法包括 在培养基中培养对伊枯草菌素相关物质有抗性并具 有产生L-赖氨酸能力的杆状谷氨酸生产微生物，在 培养物中积聚L-赖氨酸，以及从其中回收L-赖氨 酸。

Description

本发明涉及发酵生产L-赖氨酸的方法。
L-赖氨酸在动物饲料、医药、食品等领域有着多方面的用途。
在此之前，已知可使用杆状谷氨酸生产微生物的各种营养需要性菌株、各种抗药菌株、各种药物敏感性菌株生产L-赖氨酸。另外，使用抗生素抗性菌株的方法（美国专利3，687，810号），及使用对芽孢杆菌属微生物产生的抗菌物质有抗性之菌株的方法〔日本专利公开号169497/84〕也是已知的。
迄今尚未报导过对伊枯草菌素（iturin）相关物质有抗性的菌株。日本专利公开号169497/84中公开了使用对芽孢杆菌微生物产生的抗菌物质具有抗性的菌株的方法，但发明的目的不是提高赖氨酸生产微生物的生产能力，而是防止因芽孢杆菌微生物污染造成的对赖氨酸生产微生物的生长抑制作用。
本发明的目的旨在建立一种工业上以较低成本生产L-赖氨酸的方法。
本发明人对发酵生产L-赖氨酸的方法进行了广泛的研究，以期以工业上的低成本制得L-赖氨酸，结束发现通过赋予杆状谷氨酸生产微生物以抗伊枯草菌素相关物质的抗性，可提高L-赖氨酸生产微生物的生产能力。
本发明提供了一种生产L-赖氨酸的方法，其包括在培养基中培养对伊枯草菌素相关物质有抗性并能产生L-赖氨酸的杆状谷氨酸生产微生物、在培养物中积聚L-赖氨酸以及从中回收L-赖氨酸。
本文中所说的杆状谷氨酸生产微生物是指属于棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属或节细菌属的微生物。
本文所说的伊枯草菌素相关物质是指由芽孢杆菌属微生物产生的抗生素，并包括如伊枯草菌素A、伊枯草菌素C、抗霉枯草菌素（mycosubtilin）、杆菌抗霉素（bacillomycin）〔Biochim，Biophys，Acta552，558-562（1979），Biochim，Biophys。Acta684，207-211（1982）〕及其混合物。
作为各突变菌株的亲本菌株，可使用任何具有产生赖氨酸能力的、属于杆状谷氨酸生产微生物的菌株。特别是谷氨酸棒杆菌H-3149（FERMBP-158）和谷氨酸棒杆菌H-4412（FERMBP-1069）。
可于30℃用于250μg/ml    N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍处理上述亲本菌株30分钟，然后分离生长于含伊枯草菌素相关物质的基本培养基琼脂平皿上的菌株即得到对伊枯草菌素相关物质有抗性的突变菌株，其中培养基中所含伊枯草菌素的浓度应使亲本菌株不能生长。此外，可培养如此得到的对伊枯草菌素有抗性的突变菌株、比较根据提高了L-赖氨酸生产能力而筛选的各菌株之间产生赖氨酸的能力，从而得到本发明的突变菌株。
上述方法得到的对伊枯草菌素相关物质（伊枯草菌素A和伊枯草菌素C的1∶1混合物）有抗性的亲本菌株和突变菌株具有下列性质：
亲本菌株：谷氨酸棒    杆菌H-3149（FERM    BP-158）具有S-（2-氨乙基）半胱氨酸抗性、利福平抗性、链霉素抗性和6-氮尿嘧啶抗性。
突变菌株：谷氨酸棒状杆菌H-4933具有S-（2-氨乙基）半胱氨酸抗性、利福平抗性、链霉素抗性、6-氮尿嘧啶抗性和伊枯草菌素相关物质抗性。
亲代菌株：谷氨酸棒杆菌H-4412（FERM    BP-1069）具有S-（2-氨乙基）半胱氨酸抗性、利福平抗性、链霉素抗性、6-氮尿嘧啶抗生和β-萘喹啉抗性。
突变菌株：谷氨酸棒杆菌H-4934具有S-（2-氨乙基）半胱氨酸抗性、利福平抗性、链霉素抗性、6-氮尿嘧啶抗性、β-萘喹啉抗性和伊枯草菌素相关物质抗性。
如此得到的伊草菌素相关物质抗性突变菌株谷氨酸棒杆菌H-4934已于1988年1月14日寄存在Fermentation Research Institute，Agency of Industrial Science and Technology Japan（FRI），保藏号为FERM BP-1655。表1显示了上述菌株在含有200μg/ml伊枯草菌素（伊枯草菌素A和伊枯草菌素C的1∶1混合物）的基本琼脂培养皿〔葡萄糖10g/l、氯化铵：1g/l，尿素：2g/l、KH2PO4：1g/l、K2HPO4：3g/l、MgCl2·2H2O：0.4g/l、FeSO4·7H2O：10mg/l、MnSO4·4H2O：10mg/l、ZnSO4·7H2O：1mg/l、CuSO4·5H2O：1mg/l、（NH4）6MO7O24·4H2O：1mg/l、d-生物素：50μg/l、琼脂：20g/l、pH7.2）上培养24小时后的生长情况。
表1
++：充分生长    -：不生长
为了培养适用于本发明的微生物，可任用通常用于发酵生产氨基酸的培养基。只要其含有能被微生物同化的适当碳源、氮源、无机盐、生长因子等，任何合成的或天然的培养基均可使用。
作为碳源，可使用葡萄糖、果糖、蔗糖、废糖蜜、淀粉水解物等糖类物质，乙酸、富马酸、柠檬酸等有机酸，以及乙醇、甘油、甘露糖等醇类物质。
作为氮源，可使用氨、铵盐如氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、磷酸铵等各种无机或有机酸的铵盐、胺、其他含氮化合物、胨、肉汁、玉米浆、酪蛋水解物、大豆饼水解物、各种发酵细胞及其他消化的产物。
作为无机化合物，可使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。
另外，必要时还可加入生物素、硫胺素、烟酸、β-丙氨酸、泛酸等维生物，亮氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等氨基酸，以及链霉素等各种抗生素。
可在通气条件下进行振荡培养或通气搅拌深层培养，培养温度在20至40℃，最好为25至38℃。培养基的pH为5至9，最好接近于中性。可用碳酸钙、无机或有机酸、碱溶液、氨或pH缓冲溶液调整培养基的pH。
通常在培养1至7天后，即可产生并在培养物中积聚L-赖氨酸。
培养完成后，由培养物中除去细胞等沉淀物，并可用离子交换、浓缩、盐析、等电点沉淀等方法从中回收L-赖氨酸。
下面是本发明的实施例。
实施例1
将谷氨酸棒杆菌H-3149、H-4412、H-4933或H-4934接种于含20ml下述种子培养基的300ml锥形瓶内并于30℃振荡培养（220rpm）24小时。然后向含有20ml下述生产培养基的300ml锥形瓶内接种2ml种子培养物并于30℃振荡培养（220rpm）72小时。培养完成后，使用酸性茚三酮以比色法测定产生的L-赖氨酸量。发现培养物中产生的L-赖氨酸（盐酸盐）分别为44mg/ml、52mg/ml、53mg/ml和54mg/ml。离心用菌株H-4933制得的1000ml培养物并用硫酸将pH调到1.5，然后通过高酸性离子交换树脂Diaion SK-1B（H+型，Mitsubishi Kasei公司生产）以吸附L-赖氨酸。用水洗柱并用2N氨水洗脱以收集L-赖氨酸部分。浓缩收集到的洗脱物并用盐酸将浓缩的溶液调至pH2.0，然后冷却并向其中加入乙醇，从而得到结晶的L-赖氨酸盐酸盐。结晶的量为42g。
种子培养基    （pH7.2）    生产培养基    （pH7.2）
葡萄糖    40g/l    赤糖糊糖蜜    100g/l
胨    20g/l    （按葡萄糖量）
酵母浸膏 5g/l KH2PO40.5g/l
尿素    3g/l    硫酸铵    40g/l
KH2PO41.5g/l MgSO4.2H2O 0.5g/l
K2HPO4 0.5g/l 尿素 3g/l
MgSO4.2H2O 0.5g/l 碳酸钙 30g/l
生物素    50μg/l

Claims (5)

1、一种生产L一赖-氨酸的方法，其包括在培养基中培养对伊枯草菌素相关物质有抗性并具有产生L-赖氨酸能力的杆状谷氨酸生产微生物、然后在培养物中积聚并从中回收L-赖氨酸。
2、根据权利要求1的方法，其中伊枯草菌素选自伊枯草菌素A、伊枯草菌素C、抗霉枯草菌素、杆菌抗霉素L及其混合物。
3、一种生产L-赖氨酸的方法，其包括在培养基中培养谷氨酸棒状杆菌H-4933或谷氨酸棒状杆菌H-4934、然后在培养物中积聚并从中回收L-赖氨酸。
4、一种生物学纯的谷氨酸棒杆菌H-4933的培养物。
5、一种生物学纯的谷氨酸棒杆菌H-4934的培养物。
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