JPH03500486A

JPH03500486A - Ｌ‐アラニンの調製方法

Info

Publication number: JPH03500486A
Application number: JP1505194A
Authority: JP
Inventors: アジジアン，アスミク　ゲボルコフナ; アムバルツミアン，アルトゥル　アルベルトビチ; コチャリアン，シャバルシ　ミカエロビチ; アナニキアン，マリツァ　アナニコフナ
Priority date: 1988-04-26
Filing date: 1989-04-25
Publication date: 1991-02-07
Also published as: CN1038669A; EP0369029A4; EP0369029A1; HU205389B; SU1719433A1; YU85489A; WO1989010408A1; US5124257A; HUT53940A; HU894784D0; FI896231A0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】Ｌ−アラニンのｉ、′１　法発明の分野本発明は、微生物学的産業、より詳しくは、アミノ酸の調製方法、より特定にはＬ−アラニンの調製のための発酵方法に関する。

従来の技術 β−デカルボキシラーゼ活性を有する微生物の固定化細胞を用いてアスパラギン酸から転換方法によりＬ−アラニンを調製するための方法は、当業界において既知である（ＵＳ、Ａ。

３８９８１２Ｂ）。

たとえば第１段階において、アスパルターゼの使用による転換によりアンモニウムフマレートからし一アスパラギン酸の生成、及び第２段階において、Ｌ−アスパラギン酸−β−デカルボキシラーゼにより前記得られたし一アスパラギン酸のＬ−アラニンへの転換の必要性に関連する多段階方法は、既知の方法である（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＋第２４巻、１９８６、Ｔｏｋｙｏ、Ｊ、Ｃｈｉｂａｔａ、Ｔ、Ｔｏｓａ、　Ｔ、Ｋａｋｉｍｏｔｏ“Ａｌａｎ−ｉｎｅ″、２２４〜２３２ページ）。

Ｄ、Ｌ−アラニンをアセチル化にゆだね、そして次に、酵素−アミノアシラーゼにより、アチチルーし一アラニンを選択的に加水分解し、Ｌ−アニニンを付与する、ラセミ混合物からＬ−アラニンを回収するための方法も当業界において既知である。その後、Ｌ−アラニンが、アセチル−Ｄ−アラニンから分離される（ｔｌｓ、　Ａ、　３３８６８８８）。

これは、中間体、Ｄ、Ｌ−アラニン、アセチル−Ｄ、Ｌ−アラニン、アミノアセラーゼ酵素の調製を必要として、そして従って工程をより複雑且つ高価にする多段階方法である。

発明の開示本発明は、培養液体中に所望する生成物の市販的に許容できる収量で所望する生成物を得るための方法を簡単にすることができる、Ｌ−アラニンを調製するための方法を、新規のタイプの微生物の突然変異体を用いて提供することに基づかれている。

この問題は、炭素、窒素、無機塩及び有機化合物の同化できる源を含む栄養培地上でブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ−ｉｕｍ）及びコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の微生物の培養、培養液体にＬ− アラニンが蓄積するまで、前記微生物の増殖の刺激及び続（所望する生成物の回収の手段によりＬ−アラニンを調製するための方法において、微生物として、それらの増殖のためにＤ−アラニンを必要とするブレビバクテリウム及びコリネバクテリウム属の微生物の突然変異体が使用されることにより解決される。

本発明によれば、ラセミ混合物からのし一アラニンの回収・に関係する前記不可欠な段階を回避して、培養液体に光学的に純粋なし一アラニンを調製することが可能であり、そしてその培養液体中の所望する生成物の含有率は、２８　ｇ　／　ｆに達Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ　Ｇｅｎｅｔｉｋｉ　ｉ　５ｅｌｅｋｔｓｉｉ　Ｐｒｏｍｙｓｈｌｅｎｎｙｋｈ　Ｍｉｋｒｏｏｒ−ｇａｎｉｚｍｏｖ（ＶＮＩＩＧｅｎｅｔｉｋａ）、Ｍｏｓｃｏｗ、Ｄｏｒｏｚｈｎｙ　ｐｒｏｅｚｄ、１（Ａｌｌ −ＩＪｎｉｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　５ｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｎ＋ｓ　（ＶＮＩＩＧｅｎｅｔｉｋａ）　）に寄託されたプレビバクテリウムフラビウム（Ｂ、ｆｌａｖｕｍ）種の微生物の突然変異体、すなわち１９８４年４月５日にＢ−３０６１として登録されたフレビバクテリウムフラビウムＡＡＩ株及び１９８４年４月５日にＢ−３０６２として登録されたプレビバクテリウムフラビウムＡＡ２株の微生物の突然変異体の使用が好ましい。

培養液体中に所望する生成物の含有率をさらに高めるにはＣ４４ｇ／ｌに達するほど）、本発明によれば、Ｄ、Ｌ−α−アミノ酪酸に対して耐性のブレビバクテリウム属の微生物の本発明によれば、Ｖｓｅｓｏｊｕｚｎｙ　Ｎａｕｃｈｎｏ− １ｓｓｌｅｄｏｖａｔｅｌ’５ｋｙＩｎｓｔｉｔｕｔ　Ｇｅｎｅｔｉｋｉ　ｉ　５ｅｌｅｋｔｓｉｉ　Ｐｒｏｍｙｓｈｌｅｎｎｙｋｈ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａ−ｎｉｚｍｏｖ（ＶＮＩＩＧｅｎｅｔｉｋａ）に寄託された下記プレビバクテリウムフラビウム種の微生物の突然変異体の使用が好ましい：１９８７年４月１日にＢ −３９９１として登録されたプレビバクテリウムフラビウムＡＡＳ株；１９８７年４月１日にＢ−３９９２として登録されたプレビバクテリウムフラビウムＡＡＳ株。

さらに、本発明によれば、Ｖｓｅｓｏｊｕｚｎｙ　Ｎａｕｃｈｎｏ−１ｓｓｌｅｄｏ、ｖａ−ｔｅｌ’ｓｋｙ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ　Ｇｅｎｅｔｉｋｉ　ｉ　５ｅｌｅｋｔｓｉｉ　ＰｒｏｍｙｓｈｌｅｎｎｙｋｈＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｚｏ＋ｖ　（ＶＮｒ　ＩＧｅｎｅｔｉｋａ）に寄託された下記コリネ、ｐ（クテリウムダルタミニカム種の微生物の突然変異体の使用が好ましい：１９８５年３月２５日、Ｂ−３３２１として登録されたコリネバクテリウムダルタミニカムＡＡ４１株；１９８５年３月２５日、Ｂ−３３２３として登録されたコリネバクテリウムダルタミニカムＡＡＩＩ株。

さらに、本発明の目的及び利点は、Ｌ−アラニンを調製するための方法の次の詳細な説明及びこの方法の特定の態様を示す特定な例からより十分に明らかになるであろう。

発明を実施するための最良の態様本発明のし一アラニンを調製するための方法は、Ｌ−アラニンを生成し、そして栄養培地中で培養される微生物の使用に基づかれている。

本発明によれば、それらの増殖のためにＤ−アラニンを必要とするブレビバクテリウム及びコリネバクテリウム属の微生物の突然変異体が使用される。そのような微生物の特定の例は、下記株である：Ｌ−アラニンの生成体−Ｖｓｅｓｏｊｕｚｎｙ　Ｎａｕｃｈｎｏ−Ｔｓｓｌｅｄｏｖａｔｅｌ−ｓｋｙ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ　Ｇｅｎｅｔｉｋｉ　ｉ　５ｅｌｅｋｔｓｉｉ　Ｐｒｏｏ＋ｙｓｈｌｅｎｎｙｋｈ　Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｚｍｏｖ（ＶＮＩＩＧｅｎｅｔｉｋａ）に寄託され、そして１９８４年４月５日、Ｂ− ３０６１として登録されたプレビバクテリウムフラビウムＡＡＩ株；Ｌ−アラニンの生成体−Ｖｓｅｓｏｊｕｚｎｙ　Ｎａｕｃｈｎｏ−Ｉｓｓｌｅｄｏｖａｔｅｌ−ｓｋｙ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ　Ｇｅｎｅｔｉｋｉ　ｉ　５ｅｌｅｋｔｓｉｉ　Ｐｒｏｍｙｓｈｌｅｎｎｙｋｈ　Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｚｍｏｖ（ＶＮＩＩＧｅｎｅｔｉｋａ）に寄託され、そして１９８４年４月５日、Ｂ−３０６２として登録されたブレビバクテリうムフラビウムＡＡ２株；Ｌ−アラニン生成体−Ｖｓｅｘｏｊｕｚｎｙ　Ｎａｕｃｈｎｏ−Ｉｓｓｌｅｄｏｖａｔｅｌ−ｓｋｙ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ　Ｇｅｎｅｔｉｋｉ　ｉ　５ｅｌｅｋｔｓｉｉ　Ｐｒｏｏ＋ｙｓｈｌｅｎｎｙｋｈ　Ｍｉｋｒ−ｏｏｒｇａｎｉｚｌＩｌｏｖ（ＶＮＩＩＧｅｎｅｔｉｋａ）に寄託され、そして１９８５年３月２５日、Ｂ−３３２１として登録されたコリネバクテリウムグルタミニカムＡＡ４１株；及びＬ−アラニン生成体−Ｖｓｅｓｏｊｕｚｎｙ　Ｎａｕｃｈｎｏ−Ｉｓｓｌｅｄｏｖａｔｅｌ−ｓｋｙ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ　Ｇｅｎｅｔｉｋｉ　ｉ　５ｅｌｅｋｔｓｉｉ　Ｐｒｏｍｙｓｈｌｅｎｎｙｋｈ　Ｍｉｋ−ｒｏｏｒｇａｎ　ｉ　ｚｍｏｖ　（ＶＮ　ＩＩ　Ｇｅｎｅ　ｔｉ　ｋａ）に寄託され、そして１９８５年３月２５日、Ｂ−３３２３として登録されたコリネバクテリウムダルタミニカムＡＡＩＩ株。

本発明の方法においては、Ｄ−アラニンを必要とし、そしてり、Ｌ−α−アミノ酪酸に対して耐性であるブレビバクテリウム属の微生物の突然変異体もまた使用され得る。そのような微生物の例は、Ｖｓｅｓｏｊｕｚｎｙ　Ｎａｕｃｈｎｏ− ＩｓｓｌｅｄｏｖａｔｅｌｓｋｙＩｎｓｔｉｔｕｔ　Ｇｅｎｅｔｉｋｉ　ｉ　５ｅｌｅｋｔｓｉｉ　Ｐｒｏａ＋ｙｓｈｌｅｎｎｙｋｈ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａ−ｎｉｚｍｏｖ（ＶＮＩＩＧｅｎｅｔｉｋａ）に寄託され、そして１９８７年４月１日、それぞれＢ　−３９９１Ｂ−３９９２として登録されたし一アラニンーブレビバクテリウムフラビウムＡＡ５又はプレビバクテリウムフラビウムＡＡＳ株である。

Ｄ−アラニンに関する栄養要求性変異は、いずれかの従来の方法（たとえば、Ｎ −メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンによる又はＵＶ照射による）による微生物の処理により誘発され得る。Ｄ、Ｌ−α−アミノ酪酸に対する耐性の突然変異は、自発的であるか、又はいずれか従来の方法による微生物の処理の結果として誘発され得る。微生物のゲノムにおける、Ｄ、Ｌ−α−アミノ酪酸に対する耐性の突然変異及びＤ−アラニンに関する栄養要求性突然変異の組合せが、いずれかの配列にもたらされ得る。

Ｄ−アラニンを必要とする突然変異体の選択のための親株として、ラセミ体の形でアラニンを生成する天然の微生物が使用され得る。上記新規の株、プレビバクテリウムフラビウムＡＡＩ、　ＡＡ２．　ＡＡ　６及びＡＡ５は、Ｖｓｅｓｏｊｕｚｎｙ　Ｎａｕｃｈｎｏ−１ｓｓｌｅｄｏｖａ−ｔｅｌｓｋｙ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ　Ｇｅｎｅｔｉｋｉ　ｉ　５ｅｌｅｋｔｓｉｉ　ＰｒｏｍｙｓｈｌｅｎｎｙｋｈＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｚｍｏｖ（νＮＩ　ＩＧｅｎｅｔｉｋａ）に寄託され、そして１９６９年１月１６日、Ｂ−４２として登録されたプレビバクテリウムフラビウムＡＴＣＣ１４０６７株から遺伝子工学的方法により得られた。

上記新規の株、コリネバクテリウムグルタミニカムＡＡ４１及びＡＡＩＩは、Ｖｓｅｓｏｊｕｚｎｙ　Ｎａｕｃｈｎｏ４ｓｓｌｅｄｏｖａｔｅｌｓｋｙ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔＧｅｎｅｔｉｋｉ　５ｅｌｅｋｔｓｉｉ　Ｐｒｏｍｙｓｈｌｅｎｎｙｋｈ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｔｚｍｏｖ（ＶＮＩＩＧｅｎｅｔｉｋａ）に寄託され、そして１９６９年１月１６日、Ｂ−４１として登録された、良く知られているコリネバクテリウムグルタミニカＡＴＣＣ１３０３２株から遺伝的選択の方法により生成された。

しかしながら、本発明の方法に使用される微生物の選択のための親株として又はＤ−アラニンを必要とし、そしてり。

Ｌ−α−アミノ酪酸に対してできる限り耐性である突然変異体として、ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属に関係する微生物のいずれかの株を使用することができる。

ＡＡＩ、ＡＡ２．ＡＡ４１．ＡＡ１１株は、それらの特徴（但し、Ｄ−アラニン及びＬ−アラニン産生能力に関する栄養要求性を除く）において、それぞれ、親株、プレビバクテリウムフラビウムＡＴＣＣ１４０６７及びコリネバクテリウムグルタミニカムＡＴＣＣ１３０３２と異ならない。

本発明のし一アラニンを産生ずる株−ブレビバクテリウムフラビウムＡＡＩ及びＡＡ２は、次の形態学的且つ培養的及び生理学的且つ生化学的特徴を有する。

細胞は、長円形でわずかに長く、活動的でなく、非胞子形成性でゲノム陽性である。４８時間のインキュベーションの後、肉汁−ペプトン寒天上でのコロニーは、滑らかな円形であり、ひじょうにしばしばではあるが、わずかに荒い表面を有し、黄色で、直径２肛に達する。

通性嫌気性細菌である。ゼラチンを液化しない。発酵物はグルコース及びサッカロースである。硝酸アンモニウムを同化する。最適増殖温度は３０〜３２゛Ｃであり、そして最適ｐＨは７．２〜７．８である。最少培地上でのそれらの増殖のためにはビオチン及びチアミンが必要である。

プレビバクテリウムフラビウムＡＡＩ及びＡＡ２株の調製は、次の態様でもたらされる：ＡＴＣＣ１４０６７株を、１０９個の細胞／ｄの力価が得られるまで、好気条件下で肉汁−ペプトンブイヨン中において３０°Ｃで増殖せしめる。細胞をすすぎ、遠心分離により肉汁−ペプトンブイヨンを除去し、そしてクエン酸緩衝液（ＫｐＨ＝５．５）中に再懸濁する。その得られた懸濁液に、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを添加し、３００ｘ／Ｉｄの最終濃度にし、３０゛Ｃで２０分間、好気性条件下でインキュベートする。次に、細胞をすすぎ、冷却された肉汁−ペプトンブイヨンにより変異原物質を除去し、肉汁−ペプトンブイヨン１０成を含む試験管中に移し、３０°Ｃで１８時間、好気性条件下でインキュベーションし、そして次に寒天−寒天２重量％を含む肉汁−ペプトンブイヨン培地の表面上に接種する。この培地上で増殖されたコロニーを、３０°Ｃでの４８時間のインキュベーションの後、次の組成物の２種の培地上で増殖される能力についてインプリント方法により試験する：培地１（■／１ｎｆｔ）　ニゲルコース−２０，０、ＮａｚＳＯａ−２，０、Ｋ、ＨＰＯ４−１，０、Ｎ）１．Ｃｆ −３，０、ＮＨ４Ｎ０！−１，０、ＭｇＳＯ４４ＨｚＯ−０，１、Ｍｎ５Ｏａ・５８ｚＯ−Ｉ　Ｘｌ０−’、Ｆｅ５Ｏａ・７８ｚＯ−Ｉ　Ｘｌ０−’、ビオチン −５Ｘ１０−’、塩化チアミン−Ｉ　Ｘｌ０−’、寒天−寒天−２０，０、ｐＨ＝１．４゜培地２の組成物は、それが１ＯＯｎ／４２のＤ−アラニンを含む点で培地１の組成物と異なる。プレビバクテリウムフラビウムＡＡＩ及びＡＡ２の突然変異体を、３０°Ｃで４８時間のインキュベーションの後、培地ｌ上で増殖することができないが、しかし培地２上では増殖するコロニー間から選択する。

本発明のし一アラニン産生株、すなわちコリネバクテリウムグルタミニカムＡＡ４１及びＡＡＩＩは、次の形態学的且つ培養的並びに生理学的且つ生化学的特徴を有する：細胞は、長円形で、短く、非胞子形成性でダラム陽性である。肉汁− ペプトン寒天上での４８時間のインキュベーションの後、コロニーは円形で光沢があり、クリーム色であり；縁は滑らかで２〜３−の直径に達する。

通性嫌気性細菌である。ミルクを凝集しない。ゼラチンを液化しない。発酵物はグルコース及びサッカロースである。

硝酸アンモニウム及び尿素を同化する。最適増殖温度は３０〜３２°Ｃであり、そして最適ｐＨは７．２〜７．８である。最少培地上でのそれらの増殖のためにはチアミンが必要である。

ＡＡ５及びＡＡ６株は、それらの特徴（但し、Ｄ、Ｌ−α−アミノ酪酸に対する耐性、Ｄ−アラニンに対する栄養要求性及びＬ−アラニン産生能力を除く）において、親株プレビバクテリウムフラビウムＡＴＣＣ１４０６７と異ならない。

本発明のＬ−アラニン産生株−ブレビバクテリウムフラビウムＡＡ５及びＡＡ６は、次の培養的且つ形態学的特徴を有する：形態学的特徴：細胞は、長円形で、１．７〜２．５μの長さであり、非胞子形成性であり、不活性であり、ダラム陽性である。

培養的特徴：それらは、２日間の増殖の後、肉汁−ペプトン寒天上でコロニーを形成し；直径２−で円形で、滑らかであり、色は黄色である。

肉汁−ペプトン寒天上でひっかくことができる。２日日、増殖は適度になり、縁は均等で、表面は滑らかで、密生しており、光沢があり、クリーム色の黄色がかった色を有する。

肉汁−ペプトン寒天上で増殖する。主に培地表面上で適度に増殖する。

グルコースを含むグロバー（（＋１ｏｖｅｒ）の鉱物培地。増殖のためには、ビオチン、チアミン及びＤ−アラニンが必要である。

３０゛Ｃで２日間の増殖後、コロニーは薄いクリーム色の直径１＝の大きさである。ポテト上で増殖し、そして黄色の陰を有する色素を形成する。ゼラチンを液化しない。

炭素源に関係する。それらはグルコース、サッカロース、マンノース、フルクトース、マルトースを発酵する。ガラスドース、ラムノース、ソルボース、ソルビトール、アンモニウム及び酢酸のナトリウム塩、エタノールに対する発酵活性はほとんどなく、そしてラクトースは発酵しない。

窒素源に関係する。硫酸アンモニウム及び塩化アンモニウム、尿素を同化する。

最適増殖温度は３０〜３２°Ｃであり、そしてｐ）Ｉは７．２〜７．８である。

プレビバクテリウムフラビウムＡＡＳ株を、次の態様で調製する：プレビバクテリウムフラビウムＡＴＣＣ１４０６７株を、１０９個の細胞／ｉの力価に達するまで、３０°Ｃで好気条件下で肉汁−ペプトンブイヨン中において増殖する。細胞をすすぎ、遠心分離により肉汁−ペプトンブイヨンを除き、そしてｐ）１５．５のクエン酸緩衝液中に再懸濁する。その得られた懸濁液に、Ｎ− メチル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロソグアニジンを添加し、最終濃度を３００ｔｒｇ／ｉｔ！にし、そして３０°Ｃで２０分間、好気条件下でインキュベーションする。次に、細胞を、冷却された肉汁−ペプトンブイヨンにより変異誘発物質からすすぎ、肉汁−ペプトンブイヨン１０ｍを含む試験管中に移し、３０°Ｃで１８時間インキュベートし、そして次に、次の組成物（■／ｄ）を有するＮ（Ｌ　１培地の表面上に接種するニゲルコース−２０、Ｎａ、ＳＯ，−２、Ｋ、ＨＰＯ４−１、ＮＨ２Ｏｆ−３、ＮＨ４Ｎ０３−１、Ｍｇ５Ｏａ４ＨｚＯ−０，１、ＭｎＳＯ４・５ＨｚＯ−Ｉ　Ｘｌ０−’、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０−Ｉ　Ｘｌ０− ’、ビオチン−５Ｘ１０−’、塩化チアミン−Ｉ　Ｘｌ０−’、寒天−寒天−２０、Ｄ、Ｌ−α−アミノ酪酸−３０、ｐＨ＝７．４゜３０°Ｃで４〜５日間のインキュベーション後、Ｎｏｌ培地上で増殖されたコロニーを、きれいにし、そしてそれらのアラニン産生能力について試験する。多量のり、Ｌ−アラニンを産生ずるこのようにし選択された突然変異体の１つを、再び、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンにより変異誘発し、そしてそれらの増殖のためにＤ−アラニンを必要とする突然変異体を選択する。Ｌ−アラニンを産生するプレビバクテリウムフラビウムＡＡ５株は、このようにして選択された変異誘発物質の１つである。

プレビバクテリウムフラビウムＡＡＳ株を、次の態様で調製する：プレビバクテリウムフラビウムＡＴＣＣ１４０６７株を、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンにより変異誘発し、そしてその増殖のためにＤ− アラニンを必要とする突然変異体を選択する。その増殖のためにＤ−アラニンを必要とするその得られた突然変異体を再び、Ｎ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロソグアニジンにより変異誘発し、そしてり。

Ｌ−α−アミノ酪酸に対して耐性の突然変異体を、プレビバクテリウムフラビウムＡＡＳ株の調製について記載された方法に類似する態様で選択するが、しかしＮα１培地の組成物中に、Ｄ−アラニンをまた、０．１■／ｉの濃度で導入する。多量のＬ〜アラニンを産生ずるこのようにして選択された突然変異体の１つを、プレビバクテリウムフラビウムＡＡ６として命名する。

コリネバクテリウムグルタミニカムＡＡＩＩ及びＡＡ４１株を、プレビバクテリウムフラビウムＡＡＩ及びＡＡＺ株のプレビバクテリウムフラビウムＡＴＣＣ１４０６７株から調製のために前記に特定された方法にＭｉｌｄする選択技術により、コリネバクテリウムグルタミニカムＡＴＣＣ１３０３２株から調製する。

それぞれのプレビバクテリウムフラビウムＡＴＣＣ１４０６７及びコリネバクテリウムグルタミニカム１３０３２親株と比較しての本発明の株の明確な特徴が、次の表に示される。

表上記表に言及された株を増殖するためにＤ−アラニンの要求性を決定するために、これらの株の懸濁液を、Ｎｏｌ及びＮ０２（それらの組成は前記に特定されている）培地の表面上にループにより適用し、そして３０゛Ｃで４０時間、インキュベーションする。増殖の出現を、“＋”により、そしてその不在を“−”により示す。

親株ＡＴＣＣ１４０６７及びＴＣＣ１３０３２に比べて、ＡＡＩ、　ＡＡ２．　ＡＡ５．　ＡＡ６゜ＡＡＩＩ及びＡＡ４１株は、Ｎｏｌ培地上で増殖しない。

表中に特定された残りの株と異なってＡＡ５及びＡＡＳ株は、組成がＮα２培地の組成に類似している培地上で増殖することができるが、その組成の差異は、その培地が３０■／ｄのり。

Ｌ−α−アミノ酪酸を含むことである。

Ｄ−及びＬ−アラニン鏡像異性体を合成する株の能力を決定するために、これらの株の懸濁液を、次の組成物（ｇ　／　１　）の殺菌培地５Ｉｄを含む試験管中に充填するニゲルコース−５０％、（ＮＨ，）　ｚｓｏａ−３ｏ、ｏ、ＸＨｚＰＯａ−３，０、Ｍｇ５０４４ＨｚＯ−１，０、Ｄ−アラニン−０，１、Ｆｅ５０４４Ｈ２０−０，０１、ＭｎＳＯ４−５ＨｚＯ−０，０１、ビオチン−０，００２、臭化チアミン−ｏ、ｏｏ６ｏｓ、ＣａＣ０！−３０，０（微生物の濃度が１０７個の細胞／ｄに等しくなるような割合で）。試験管を、３０°Ｃで４０時間、振りながらインキュベートする。得られた培養液体におけるり、Ｌ−アラニンの含有量（アラニンのＤ−及びＬ−形の合計含有量）を、濾紙クロマトグラフィーの方法により、そしてニンヒドリンによる染色により又はアミノ酸分析器により決定する。Ｄ−アラニンの含有量を、ブタ腎臓からのＤ−アミノ酸のオキシダーゼ８ミリ単位、０．１〜０．５＋＋＋ＭのＤ−アラニンの含有物を有する試験溶液０．２Ｉｎｆｌ、　３３ｍＭのピロリン酸緩衝液（ｐＨ８，３）を含む最終体積０．４ｄの反応混合物におけるアミノ酸のＤ−オキシダーゼの酵素により決定する。その反応は、Ｄ−アラニンの９３〜９５％がピルビン酸に転換されるような平衡を達成するために、３７°Ｃで行なわれる。このようにして形成されたピルビン酸を、４４０ｎｍの波長で分光光度計により決定する。次に、Ｄ、Ｌ− アラニン及びＤ−アラニンの合計含有量の測定値に基づいて、培養液体中におけるアラニンのＤ−及びＬ−形成の％を計算する。

得られたデータは、上記表に示される。ＡＴＣＣ１４０６７及びＡＴＣＣ１３０３２株に比較して、ＡＡＩ、ＡＡ２．ＡＡ５．ＡＡ６．ＡＡＩＩ及びＡＡ４１株は、Ｄ−アラニンを産生ずることができないことが前記表から推定される。

続く発酵のための生産体株の接種物質を、いづれか従来の方法、たとえば栄養培地の表面上又は同化可能な炭素源、窒素、有機塩及び微生物の増殖を確保する有機物質を含む液体栄養培地中において増殖することにより調製することができる。

有機物質は、それらが特定の生産体株の増殖のために不可欠である場合、ビタミン（ビオチン、チアミノ）及び他の化合物、たとえばアミノ酸に相当する。

本発明の方法に使用される微生物の突然変異体を培養するための栄養発酵培地として、同化できる炭素源、窒素源、無機塩、微生物の増殖を刺激する有機物質及びＬ−アラニンの蓄積物を含む栄養培地を使用することができる。

同化できる炭素源として、サッカロース、グルコース、フルクトース、マルトース、マンドース、スターチ、スターチ加水分解物及び糖蜜；多価アルコール、たとえばグリセロール及びソルビトール；有機酸、たとえば蟻酸、酢酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、プロピオン酸；アルコール、たとえばメタノール及びエタノールを使用することができる。これらの炭素源は、別々に又は種々の重量割合でお互いの可能性ある組合せで使用され得る。炭素源の全量が発酵の開始で導入され、又は発酵過程の間、分割して導入され得る。

同化できる窒素源として、アンモニウムの有機及び無機塩、たとえば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、乳酸アンモニウム；アンモニア、尿素；種々の天然に存在する窒素含有化合物、たとえばペプトン、酵母加水分解物、肉汁抽出物、植物タンパク質の加水分解物を使用することができる。

無機塩として、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸マグネシウム、塩化ナトリウム、鉄、マンガン及び亜鉛の塩類、炭酸カルシウムを使用することができる。

上記微生物の増殖のために必要とされる有機物質として、チアミン、ビオチン又はその置換体、及びアミノ酸を、それらが微生物の増殖のために不可欠である場合、使用することができる。それらの有機物質が栄養培地の他の成分の組成物中に十分な量で存在する場合、それらの純粋な形で有機物質を添加する必要はない。

Ｌ−アラニンの蓄積は、２０〜３７°Ｃの範囲内の温度及び６８５〜９．０の範囲内のｐＨ値で上記特定された微生物を培養した後、生じる。

Ｌ−アラニンの出現は、発酵の開始の後、６〜１０時間で観察される。しかしながら、培養液体中におけるし一アラニンの蓄積の最大レベルは、炭素源及びエネルギー（３２時間及びそれ以上の後、炭素源の使用される濃度及びエネルギーに依存する）の十分な消費の結果として達成される。

培養液体中のし一アラニンの含有量を、濾紙クロマトグラフィー及びニンヒドリンによる染色の方法により、又はアミノ酸分析器により決定する。

蓄積されたし一アラニンは、いづれかの従来の方法、たとえば遠心分離又は濾過による微生物及び他の不溶性粒子の除去、イオン交換樹脂上へのし一アラニンの吸着、続く溶出、。

Ｌ−アラニンの濃縮及び結晶化により培養液体から回収され得る。

例１プレビバクテリウムフラビウムＡＡ２株の接種物質を、３０’Ｃで２２時間、１５ｇ／Ａの寒天−寒天及び１００雁／ｌのＤ−アラニンを含む肉汁−ペプトンスラントブイヨンの表面上での試験管中で微生物を増殖し、そして続いて、殺菌された生理食塩水により前記微生物を洗浄することによって調製する（得られた懸濁液中の微生物の濃度は１０９個の細胞／　ｍＱである）。

個々の２５０成の発酵フラスコ中に、次の組成物（ｇ／ｆ！、）の殺菌された発酵培地１０ｄで無菌状態で注ぐ：糖蜜−２００．０（糖として計算される場合、１００）、酵母塊状物の加水分解物１２０．０　、ＣａＣ０ｚ−３０，０（ｐ）１７．５）。プレビバクテリウムフラビウムＡＡ２株の接種物質０．５μ！をフラスコ中に充填し、そして３０°Ｃで７２時間、振盪しなから（１７０ｒｐｏ＋）インキュベートする。

発酵の完結後に得られる培養液体中におけるし一アラニンの含有率は、５．１ｇ／ｆである。Ｌ−アラニン５．１ｇを含む、プレビバクテリウムフラビウムＡＡ２株の得られた培養液体２５０ｄを遠心分離しく５０００ｒｐｍで２０分間）、細菌及び他の不溶性粒状物を除く。このようにして得られた上清液を、ＮＨ４＋形でイオン交換樹脂を含むカラムに、樹脂の体積当たり溶液０．６〜０．７体積／時の速度で上部から下部の方に通す。カラムを水により洗浄し、そして吸着されたＬ−アラニンを、３．５％のアンモニア水溶液により溶離する。その得られた溶出液を真空下で濃縮し、そしてＬ−アラニンを１４〜１６℃で４時間、結晶化する。結晶を、フィルター紙を通して濾過することにより溶液から分離し、そして真空乾燥せしめる。Ｌ−アラニンの収量は、母液中におけるその含有率を考慮しなければ、３．３ｇであり、従って、培養液体中におけるその含を物からめ合計の収率は６５％である。濾紙クロマトグラフィーデータによる生成物の純度は７７．４％である。

例２プレビバクテリウムフラビウムＡＡＩ株の接種物質を、例１に記載されている条件下で調製する。

個々の２５０ｄの発酵フラスコ中に、次の組成物Ｃｇ／ｌ）の殺菌された発酵培地１０ｉを滅菌状態で注ぐ：糖密−２００．０（糖について計算する場合、１００）、酵母塊状物の加水分解物−１２０，０、ＣａＣＯ３−３０，０（ｐＨ７，５）。

また、前記例１に特定された条件に類似する条件下で調製されたプレビバクテリウムフラビウムＡＡＩ株の接種物質０．５ｉをフラスコ中に充填する。そのフラスコを、３０℃で７２時間、振盪しながら（７０ｒ、ｐ、ｏ＋、）インキュベートする。発酵の完結後に調製された培養液体中のし一アラニンの含有率は、６９ｇ／ｉである。

例３個々の２５０　ｄの発酵フラスコ中に、次の組成物（ｇ／Ｅ）の殺菌された発酵培地１０ｄを滅菌状態で注ぐ：糖密−２００．０（糖について計算する場合、１００）、酵母塊状物の加水分解物−１２０，０、ＣａＣＯ５−３０，０（ｐＨ７，５）。

また、前記例１に特定された条件に類似する条件下で調製されたコリネバクテリウムダルタミニカムＡＡＩＩ株の接種物質０、５　ｄをフラスコ中に充填する。

そのフラスコを、３０’Ｃで７２時間、振盪しながら（７０ｒ、ｐ、ｍ、）インキュベートする。発酵の完結後に調製された培養液体中のし一アラニンの含有率は、３．８ｇ／／！である。

例４個々の２５Ｍの発酵フラスコ中に、次の組成物（ｇ　／　１　）の殺菌された発酵培地１０ｍ１！を滅菌状態で注ぐ：糖密−２００．０（糖について計算する場合、１００）、酵母塊状物の加水分解物−１２０，０、ＣａＣＯ３−３０，０（ｐＨ７，５）。

また、前記例１に特定された条件に類似する条件下で調製されたコリネバクテリウムダルタミニカムＡＡ４１株の接種物質０．５成をフラスコ中に充填する。そのフラスコを、３０°Ｃで７２時間、振盪しながら（７０ｒ、ｐ、Ｉ＋＋、）インキュベートする。発酵の完結後に調製された培養液体中のし一アラニンの含有率は、６．４ｇ／Ｉｌである。

例５発酵の方法を、Ｌ−アラニンを産生する株としてプレビバクテリウムフラビウムＡＡＩ株を用いて、前記例１に記載される条件に類似する条件下で行なうが、但し、次の組成物（ｇ／りの栄養発酵培地を使用する：サッカロース−１００，０、（ＮＨ４）　２ｓｏ４−５５．０、ＫｔｌｚＰＯ４−３，０、Ｍｇ５Ｑ　４・７ＨｚＯ−１，０、Ｄ−アラニン−０，１、Ｆｅ５Ｏ＝４ＨｚＯ−０，０１、＋１ｎｓ０４・５ＨｚＯ−０，０１、ビオチン−０，０００２、臭化チアミン−０，００００５、ＣａＣＯ５−５０，０（ｐＨ＝　７．５　）。

７２時間のインキュベーションの後、培養液体中のし一アラニンの含有率は１７．６ｇ／ｆに等しい。

例６発酵の方法を、Ｌ−アラニンを産生ずる株としてプレビバクテリウムフラビウムＡＡ２株を用いて、前記例１に記載される条件に類似する条件下で行なうが、但し、次の組成物（ｇ／りの栄養発酵培地を使用する：サッカロースー１００．０、（ＮＨ４）！５０４−５５．０ＳＫＨｚＰＯａ−３，０、ＭｇＳＯ４・７８！Ｏ−１，０、Ｄ−アラニン−０，１、ＦｅＳＯ４・７１（ｇｏ−０，０１，１１ｎｓＯｎ−５ＨｚＯ−０，０１、ビオチン−０，０００２、臭化チアミン−ｏ、ｏｏｏｏｓ、ＣａＣＯ３−５０，０（ｐＨ＝　７．５　）。

７２時間のインキュベーションの後、培養液体中のし一アラニンの含有率は２０．４ｇ／Ｉ！、に等しい。

例７発酵の方法を、Ｌ−アラニンを産生ずる株としてコリネバクテリウムダルタミニカムＡＡＩＩ株を用いて、前記例１に記載される条件に類似する条件下で行なうが、但し、次の組成物（ｇ／／りの栄養発酵培地を使用する：サッカロースー１００．０、（ＮＨ４）　ｚｓｏ、−５５，０、ＫＨｚＰＯｎ−３，０，Ｍｇ５Ｏａ・７Ｈ２０−１，０，Ｄ−アラニン−０，１、Ｆｅ５０４４ＨｚＯ−０，０１、ＭｎＳＯ４・５ＨｚＯ−０，０１、ビオチン−０，０００２、臭化チアミン− ｏ、ｏｏｏｏｓ、ＣａＣＯ３−５０，０（ｐＨ＝　７．５　）。

７２時間のインキュベーションの後、培養液体中のし一アラニンの含有率は２．６ｇ／ｌ！に等しい。

例８発酵の方法を、Ｌ−アラニンを産生ずる株としてコリネバクテリウムグルタミニカムＡＡ４１株を用いて、前記例１に記載される条件に類似する条件下で行なうが、但し、次の組成物（ｇ　／　ｌ　）の栄養発酵培地を使用する：サッカロース−１００，０、（ＮＯ，）　ｚｓｏ４−５５．０、ＫＨ，ＰＯ，−３，０、ＦＩｇＳＯａ・７Ｈ２０−１，０、Ｄ−７ラニンー０．１　、　Ｐｅ５０４・７ＨｚＯ−０，０１、ＭｎＳＯ４・５ＨｚＯ−０，０１、ビオチン−０，０００２、臭化チアミン−０，００００５、ＣａＣＯｘ−５０，０（ｐＨ＝　７．５　）。

７２時間のインキュベーションの後、培養液体中のし一アラニンの含有率は５．１ｇ／ｆに等しい。

例９発酵の方法を、例５の条件に類似する条件下で行なう。但し、Ｌ−アラニン産生株として、ブラビバクテリウムフラビウムＡＡＳ株をフラスコ中に導入する。発酵培地は、次の組成物（ｇ／ｆ）を有する：サッカロースー１２０゜０　、（Ｎ）１４）２５０４−５５．０、ＫＨ，ＰＯ４−３，０、Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ！０− １．０　、Ｄ−アラニン−０，１、Ｆｅ５Ｏｎ４ＨｚＯ−０，０１、Ｍｎ５Ｏａ・５ＨｚＯ−０，０１、ビオチン−０，０００２、臭化チアミン−０，００００５、ＣａＣＯ５−５０，０（ｐＨ＝　７．５　）　−フラスコを、３０°Ｃで７２時間、振盪しながらインキュベートする。発酵の完結後に得られる培養液体中のし一アラニンの含有率は、３２．９　ｇ　／　Ｉ！−に等しい。

例１０発酵の方法を、例５の条件に類似する条件下で行なう。但し、Ｌ−アラニン産生株として、ブラビバクテリウムフラビウムＡＡＳ株をフラスコ中に導入する。発酵培地は、次の組成物Ｃｇ／ｉ！、）を有する：サッカロース−１２０，０、（ＮＨ４）ｚＳＯ＊−５５，０、ＫＨ２ＰＯ４−３，０、ＭｇＳＯ４・７ＨｚＯ− １，０ＳＤ−アラニン−０，１、Ｐｅ５Ｏｎ４ＨｚＯ−０，０１、Ｍｎ５０４− ５８ｚＯ−０，０１、ビオチン−０，０００２、臭化チアミン−０，００００５、ＣａＣ０＋−５０，０（ｐＨ＝　７．５　）。

フラスコを、３０°Ｃで７２時間、振盪しながらインキュベートする。発酵の完結後に得られる培養液体中のし一アラニンの含有率は、３１．４ｇ／ｌに等しい。

例１１発酵の方法を、例５の条件に類似する条件下で行なう。但し、Ｌ−アラニン産生株として、ブラビバクテリウムフラビウムＡＡＩ株をフラスコ中に導入する。発酵培地は、次の組成物（ｇ／Ｉりを有する：サソ力ロースー１２０．０　、（ＮＨ，）ｚＳＯ，−５５，０、ＫＨｚＰＯｎ−３，０、Ｍｇ５Ｏ，・７ＨｚＯ−１，０、Ｄ−アラニン−０，１、Ｐｅ５Ｏａ・７８ｚＯ−０，０１、Ｍｎ５Ｏ，− ５）１２０−０．０１、ビオチン−０，０００２、臭化チアミン−０，００００５、ＣａＣＯ３−５０，０（ｐＨ＝　７．５　）。

フラスコを、３０°Ｃで７２時間、振盪しながらインキュベートする。発酵の完結後に得られる培養液体中のし一アラニンの含有率は、２０．６　ｇ　／　４２に等しい。

例１２発酵の方法を、例５に特定された条件に類似する条件下で行なう。

しかしながら、肉汁−ペプトンブイヨン（微生物の濃度は１０９個の細胞／ｉである）の１日の寒天スラントから洗い落されることにより得られた懸濁液を含んで成る個々のフラスコ中に、プレビバクテリウムフラビウムＡＡ５株の接種物質０、５　ｄを導入する。発酵培地は、次の組成Ｔｈ（ｇ／ｆ）を有する：サッカロース−１５０，０、（Ｎ）１４）！ＳＱ、−５５，０、ＫＨｚＰＯａ−３，０、ＭｇＳＯ４４ＨｚＯ−１，０、Ｄ−アラニン−０，１、Ｆｅ５Ｏａ４ＨｚＯ− ０，０１、ＭｎＳＯ４・５ＨｚＯ−０−０１、ビオチン−０，０００２、臭化チアミン−０，００００５、ＣａＣＯｘ−５０，０（ｐＨ＝　７．５　）。

フラスコを、３０°Ｃで９６時間、振盪しながらインキュベートする。発酵の完結後に得られた培養液体中にかけるし一アラニンの含有率は、４３．８　ｇ　／　Ａに等しい。

プレビバクテリウムフラビウムＡＡＳ株の培養液体２５０ｄからのし一アラニンの精製（Ｌ−アラニンの合計量はｌ１ｇである）を、例１に示される条件に類似する条件下で行なう。母液体中におけるその含有量を考慮しない場合、Ｌ−アラニンの収量は７．３ｇであり、従って、培養液体中におけるその含有物からのそめ合計収率は６７％である。濾紙クロマトグラフィーデータによる、その生成物の純度は、９１．３％である。

例１３発酵の方法を、例５に特定された条件に類似する条件下で行なう。

しかしながら、肉汁−ペプトンブイヨン（微生物の濃度は１０９個の細胞／ｉである）の１日の寒天スラントから洗い落されることにより得られた懸濁液を含んで成る個々のフラスコ中に、プレビバクテリウムフラビウムＡＡＳ株の接種物質０．５−を導入する。発酵培地は、次の組成物（ｇ／ｆ）を有する：サッカロース−１５０，０、（ＮＨ１４）！５０４−５５．０、ＫＨ２ＰＯ４−３，０、ＭｇＳＯ４４ＨｚＯ−１，０、Ｄ−アラニン−０，１、ＦｅＳＯ４４ＨｚＯ−０，０１、Ｍｎ５Ｏ＊・５）１ｚＯ−０，０１、ビオチン−０，０００２、臭化チアミン−０，００００５、ＣａＣＯ３−５０，０（ｐＨ＝　７．５　）。

フラスコを、３０°Ｃで９６時間、振盪しながらインキュベートする。発酵の完結後に得られる培養液体中にかけるし一アラニンの含有率は、４２．３　ｇ　／　ｆに等しい。

例１４発酵の方法を、例５に特定された条件に類似する条件下で行なう。　。

しかしながら、肉汁−ペプトンブイヨン（微生物の濃度は１０９個の細胞／ｄである）の１日の寒天スラントから洗い落されることにより得られた懸濁液を含んで成る個々のフラスコ中に、プレビバクテリウムフラビウムＡＡＩ株の接種物質０．５ｄを導入する。発酵培地は、次の組成物（ｇ／４１りを有する：サンカロースー１５０．０　、（ＮＨ４）２ＳＯ，−５５，０，ＫＨ２ＰＯ，−３，０、Ｍｇ５Ｏｎ・７）１ｚｏ−１，０、Ｄ−アラニン−０，１、ＦｅＳＯ４４ＨｚＯ −０，０１、ＭｎＳＯ４・５８ｚＯ−０，０１、ビオチン−０，０００２、臭化チアミン−０，００００５、ＣａＣ０ａ−５０，０（ｐＨ＝　７．５　）。

フラスコを、３０°Ｃで９６時間、振盪しながらインキュベートする。発酵の完結後に得られる培養液体中にかけるし一アラニンの含有率は、２８．１ｇ／ｌに等しい。

産業上の適用性本発明は、医学、化学、食品及びタバコ産業において有用である。

手続補正書（方式）平成２年ノＺ月ｑ日

Claims

【特許請求の範囲】

１．同化できる炭素源、窒素源、無機塩類及び微生物の増殖の刺激剤を含む栄養培地上で、その培養液体にＬ−アラニンが蓄積するまで、ブレビバクテリウム及びコリネバクテリウム属の微生物を培養し、続いて所望する生成物を単離することを含んで成るＬ−アラニンを調製方法であって、微生物として、それらの増殖のためにＤ−アラニンを必要とするブレビバクテリウム又はコリネバクテリウム属の微生物の突然変異体を使用することを特徴とする方法。
２．【配列があります】に寄託された下記ブレビバクテリウムフラビウム種の微生物の突然変異体：１９８４年４月５日、Ｂ−３０６１として登録されたブレビバクテリウムフラビウムＡＡ１株；１９８４年４月５日、Ｂ−３０６２として登録されたブレビバクテリウムフラビウムＡＡ２株を使用することを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
３．Ｄ，Ｌ−α−アミノ酪酸に対して耐性のブレビバクテリウム属の微生物の突然変異体を使用することを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
４．【配列があります】に寄託された下記ブレビバクテリウムフラビウム種の微生物の突然変異体：１９８７年４月１日、Ｂ−３９９１として登録されたブレビバクテリウムフラビウムＡＡ５株；１９８７年４月１日、Ｂ−３９９２として登録されたブレビバクテリウムフラビウムＡＡ６株を使用することを特徴とする請求の範囲第１又は３記載の方法。
５．【配列があります】に寄託された下記コリネバクテリウムグルタミニカム種の微生物の突然変異体：１９８５年３月２５日、Ｂ−３３２１として登録されたコリネバクテリウムグルタミニカムＡＡ４１株；１９８５年３月２５日、Ｂ−３３２３として登録されたコリネバクテリウムグルタミニカムＡＡ１１株を使用することを特徴とする請求の範囲第１記載の方法。
６．Ｌ−アラニンの下記産生株：ブレビバクテリウムフラビウムＡＡ１；ブレビバクテリウムフラビウムＡＡ２；ブレビバクテリウムフラビウムＡＡ５；ブレビバクテリウムフラビウムＡＡ６；コリネバクテリウムグルタミニカムＡＡ４１；コリネバクテリウムグルタミニカムＡＡ１１の特徴を有し、そしてそれらのいづれかと同一の微生物の生物学的に純粋な培養物。