HU205389B

HU205389B - Process for producing 1-alanine

Info

Publication number: HU205389B
Application number: HU894784A
Authority: HU
Inventors: Asmik Gevorkovna Azizjan; Artur Albertovich Ambarcumjan; Shavarsh Mikaelovich Kocharjan; Marica Ananikovna Ananikjan
Original assignee: Nitia Npo Armbiotekhnologia
Priority date: 1988-04-26
Filing date: 1989-04-25
Publication date: 1992-04-28
Also published as: JPH03500486A; CN1038669A; EP0369029A4; EP0369029A1; SU1719433A1; YU85489A; WO1989010408A1; US5124257A; HUT53940A; HU894784D0; FI896231A0

Description

A találmány tárgya új eljárás L-alanin mikrobiológiai úton, fermentációval történő előállítására. A találmány tehát a mikrobiológiai iparral, közelebbről aminosavak előállításával kapcsolatos.

Ismertek az L-alanin előállítására olyan eljárások, amelyek során aszparaginsavat alakítanak L-alaninná β-dekarboxiláz-enzimet tartalmazó mikroorganizmusok segítségével (lásd. a 3 899 128 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást).

Ezeket az eljárásokat több lépésben valósítják meg: ez azért szükséges, mert az eljárás első lépésében az L-aszparaginsavat, például ammőnium-fumarátból aszparaginázenzim segítségével állítják elő, majd az eljárás második lépésében az így kapott L-aszparaginsavat L-aszparaginát^-dekarboxiláz-enzim segítségével alakítják L-alaninná [J. Chibata és munkatársai: „Alanine”, Progress in Industrial Microbiology 24, 224-232 (1986), Tokió].

Ismert továbbá az L-alanin előállítása racém keverékből olyan módon, hogy a D,L-alanint acetilezik, az amino-aciláz-enzim segítségével az acetil-L-alanint szelektíven hidrolizálják, s így jutnak L-alaninhoz, majd a következő lépésben az L-alanint elválasztják az acetil-D-alanintól (lásd a 3 386 888 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást). Ez az eljárás is több lépésből áll, mivel közbenső termékként D,Lalanint és acetil-DL-alanint nyernek, és az amino-aciláz-enzimet alkalmazzák. Mindez az eljárás kivitelezését bonyolítja és drágítja.

A jelen találmány célja új eljárás kidolgozása L-alanín előállítására mikroorganizmusok új típusú mutánsainak az alkalmazásával, amely lehetővé teszi a késztermék kinyerését nagyipari szempontból elfogadható hozammal, tenyésztőközegben végbemenő, egyszerűsített eljárással.

E feladatot úgy oldjuk meg, hogy az L-alanin előállítását Brevibacterium flavum és Corynebacterium glutamicum fajú mikroorganizmusok tenyésztésével végezzük asszimilálható szén- és nitrogénforrást, szervetlen sókat és szerves vegyületeket tartalmazó táptalajon, amelyek a mikroorganizmusok szaporodását serkentik. A tenyésztést az L-alaninnak a tenyésztőközegben történő feldúsulásáig, majd a végtermék ezt követő leválasztásáig végezzük, s ennek során a találmány szerint mikroorganizmusokként a Brevibacterium és Corynebacterium mikroorganizmusok olyan mutánsait alkalmazzuk, amelyek szaporodásuk során D-alanint igényelnek.

A jelen találmány révén lehetővé válik optikailag tiszta L-alanin előállítása tenyésztőközegben úgy, hogy a technika jelenlegi állása szerint szükséges, az L-alaninnak a racém keverékből történő elválasztásával kapcsolatos lépések kizárhatók, s ennek során a tenyésztőközegben a végtennék 28 g/liter (az alábbiakban g/1) hozammal kapható.

A találmány szerinti eljárás során célszerű a Brevibacterium flavum fajhoz tartozó mikroorganizmusainak az alkalmazása, amelyek az Ossz-szövetségi Genetikai és Ipari Mikroorganizmusok Elválasztását Fejlesztő Tudományos Kutató Intézetben [orosz neve:

Vsesozuny nauchno-issledovatelsky institut genetiki i selektsii promayshlennykh mikroorganismov (rövidítve: VNH Genetika), Szovjetunió, 113545, Moszkva, Dorozhny proezd, 1] vannak letétbe helyezve: Brevibacterium flavum AA1 törzs regisztrációs száma B-3061, 1984. április 5.; valamint Brevibacterium flavum AA2, regisztrációs száma B-3062,1984. április 5.

A találmány értelmében a végterméknek a tenyésztőközegben való szaporítása céljából célszerű olyan Brevibacterium flavum fajhoz tartozó mikroorganizmusokat alkalmazni, amelyek D„L-a-amino-vajsavval szemben rezisztensek.

A jelen találmány értelmében célszerű továbbá a Brevibacterium flavum fajhoz tartozó mikroorganizmusok olyan mutánsainak az alkalmazása, amelyek a fentebb említett helyen (VNH Genetika) az alábbi regisztrációs számokkal nyertek elhelyezést

Brevibacterium flavum AA6 törzs, regisztrációs száma B-3991, 1987. április I.;

Brevibacterium flavum AA5 törzs, regisztrációs száma B-3992,1987. április 1.

A jelen találmány értelmében célszerű a Corynebacterium glutamicum fajhoz tartozó mikroorganizmusok olyan mutánsainak az alkalmazása, amelyek a fentebb említett helyen (VNH Genetika) az alábbi regisztrációs számokkal nyertek elhelyezést:

Corynebacterium glutamicum AA41, regisztrációs száma B-3321,1985. március 25.;

Corynebacterium glutamicum AA11, regisztrációs száma B-3323,1985. március 25.

A találmány további célja és jellemző vonásai kitűnnek az L-alanin előállítási eljárásának alábbi, részletes leírásából, valamint az eljárás végrehajtására adott konkrét példákból.

A találmány szerinti eljárás legelőnyösebb kiviteli módja

A jelen találmány szerinti, L-alanin előállítására szolgáló eljárás L-alanint termelő mikroorganizmusok alkalmazásán alapul, amelyeket táptalajon tenyésztünk.

Az eljárás során Brevibacterium flavum és Corynebacterium glutamicum fajú mikroorganizmusok olyan mutánsait alkalmazzuk, amelyek szaporodásuk során D-alanint igényelnek. Ilyen mikroorganizmusok konkrét példájaként említjük a Brevibacterium flavum AA1 törzset, amely L-alanint termel, s amelyet 1984. április 5-én B-3061 regisztrációs számmal a fentebb említett VNH Genetikai Intézetben letétbe helyeztünk; valamint az alábbi törzseket:

a Brevibacterium falvum AA2, L-alanint termelő törzset, amelyet 1984. április 5-én B-3062 regisztrációs számmal a fentebb említett VNH Genetikai Intézetben helyeztünk letétbe;

a Corynebacterium glutamicum A A41, L-alanint termelő törzset, amelyet 1985. március 25-én B-3321 regisztrációs számmal a fentebb említett VNH Genetikai Intézetben helyeztünk letétbe;

a Corynebacterium glutamicum AA11, L-alanínt termelő törzset, amelyet 1985. március 25-én B-3323

HU 205 389 Β regisztrációs számmal a fentebb említett VNII Genetikai Intézetben helyeztünk letétbe.

A találmány szerint javasoljuk továbbá a Brevibacterium flavum fajú mikroorganizmusok olyan mutánsainak az alkalmazását, amelyek D-alanint használnak fel, és D,L-a-amino-vajsavval szemben ellenállók (rezisztensek). Ilyen mikroorganizmusokra konkrét példaként említjük a Brevibacterium flavum AA5 vagy Brevibacterium falvum AA6, L-alanint termelő törzset, amelyeket a fentebb említett VNII Genetikai Intézetben 1987. április 1-jén B-3991, illetve B-3992 regisztrációs számmal helyeztünk letétbe.

A D-alaninos auxotrófiát mutató mutációkat tetszőleges, ismert eljárással indukálhatjuk, például úgy, hogy a mikroorganizmusokat N-metil-N’-nitro-N-nitrozo-guanidinnel, illetve ibolyántúli besugárzással kezeljük. A D,L-a-amino-vajsavval szemben rezisztens mutációk lehetnek spontán jellegűek, vagy indukálhatók a mikroorganizmusok tetszőleges, ismert eljárás útján végzett kezelésével. A mikroorganizmusok genomjában (genetikai állományában) a DjL-a-aminovajsavval szembeni rezisztenciát és a D-alaninos auxotrófiát tetszőleges sorrendben indukálhatjuk.

D-alanint felhasználó mutánsok szelekciójára szolgáló anyatörzsekként bármilyen, a természetben előforduló mikroorganizmust vagy mikroorganizmus-mutánst alkalmazhatunk, amely az alanint racém keverék alakjában termeli. A fentebb említett, új Brevibacterium flavum AA1, Brevibacterium flavum AA2, Brevibacterium flavum AA6 és Brevibacterium flavum AA5 törzseket genetikai elválasztási technikával kapjuk a Brevibacterium flavum ATCC 14067 törzsből, amelyet a fentebb említett VNII Genetikai Intézetben 1969. január 16-án B-42 regisztrációs számmal helyeztek letétbe. A fentebb említett új Corynebacterium glutamicum AA41 és Corynebacterium glutamicum AA11 törzseket a széles körben ismert Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 törzsből nyertük genetikai elválasztó módszerrel; ez utóbbi törzs a fentebb említett VNH Genetikai Intézetben 1969. január 16-án B-41 regisztrációs számmal nyert elhelyezést.

A jelen találmány szerinti eljárásban alkalmazott mikroorganizmusok, illetve olyan, javasolt típusú mutánsok szelektálására, amelyek D-alanint igényelnek, és adott esetben D,L-a-amino-vajsavval szemben rezisztensek, alkalmazható bármilyen törzs, amely a Brevibacterium vagy Corynebacterium fajhoz tartozik.

Az AA1, AA2, AA41 és ΑΑ11 törzsek - D-alaninos auxotrófiájukon és L-alanint termelő képességükön kívül - a Brevibacterium flavum ATCC 14067, illetve Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 anyatörzsektől jellemzőik szempontjából nem különböznek.

A találmány szerinti eljárás végrehajtására javasolt, L-alanint termelő Brevibacterium flavum AA1 és Brevibacterium falvum AA2 törzsek alaktani-tenyészeti és fiziológiai-biokémiai ismertetőjelei az alábbiak.

A sejtek oválisak, enyhén megnyúltak, mozdulatlanok, spórákat nem képeznek, Gram-pozitívak. A baktériumtelepek hús-pepton-agaron tenyésztve 48 órás inkubálás után kerek alakúak, felületük sima, ritkán durvább jellegű, sárgás színeződésű; e telepek átmérője eléri a 2 mm-t.

Fakultatív anaerob jellegűek. A zselatint nem folyósítják el, a glükózt és a szacharózt elerjesztik. Az ammónium-nitrogént asszimilálják. Tenyésztésük optimális hőmérséklete 30-32 ’C, legkedvezőbb pH-értéke 7,2-7,8. Minimáltáptalajokon szaporodásukhoz biotint és tiamint is igényelnek.

A Brevibacterium flavum AA1 és Brevibacterium flavum AA2 törzset az alábbiak szerint állítjuk elő.

Az ATCC 14067 törzset hús-pepton-levesben 30 ’C hőmérsékleten levegőztetéssel 10⁹ sejt/ml titer eléréséig tenyésztjük, majd a sejtekből a hús-pepton-táplevest centrifugálással kimossuk, és a sejteket 5,5 pH-értékű citrátpufferoldatban ismét szuszpendáljuk. E szuszpenzióhoz 300 gg/ml végkoncentráció eléréséig N-metilN’-nitro-N-nitrozo-guanidint adunk, és az elegyet levegőztetés közben 20 percig 30 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután a sejtekből a mutagén hatóanyagot hűtött hús-pepton-táplevessel kimossuk, hús-pepton-táplevessel 10 ml térfogatra töltve kémcsövekbe visszük át, levegőztetés közben 18 órán át 30 1 ’C hőmérsékleten inkubáljuk, majd 2 tömeg% agar-agart tartalmazó hús-pepton-tápleves felületére oltjuk.

A telepeket - amelyek a tenyésztőközegben 48 óra alatt 30 ’C hőmérsékleten végzett inkubáció során kialakultak - szaporodóképességük vizsgálata céljból az alábbi összetételű, kétféle táptalajra visszük.

Az 1. táptalaj összetétele:

Komponensek	mg/ml
Glükóz	20,0
Nátrium-szulfát	2,0
Dikálium-hidrogén-foszfát	1,0
Ammónium-klorid	3,0
Ammónium-nitrát	1,0
Magnézium-szulfát-heptahidrát	0,1
Mangán(II)-szulfát-heptahídrát	blO-⁴
Mangán(II)-szulfát-pentahidrát	MO^-4
Vas(H)-szulfát-heptahidrát	5-10·⁵
Biotin	5·10-³
Tiamin-klorid	MO-⁴
Agar-agar	20,0
PH	7,4

A 2. táptalaj összetétele az 1. táptalajtól abban különbözik, hogy 100 gg/ml D-alanint is tartalmaz. A Brevibacterium falvum AA1 és Brevibacterium flavum AA2 mutánsokat azokból a telepekből választjuk ki, amelyek az 1. táptalajon 30 ’C hőmérsékleten 48 órás inkubálással szaporodásra nem képesek, azonban a 2. táptalajon szaporodni képesek.

A találmány szerinti eljárás végrehajtására javasolt, L-alanint termelő Corynebacterium glutamicum AA41 Corynebacterium glutamicum AA11 törzsek alaktanitenyészeti és fiziológiai-biokémiai ismertetőjelei az alábbiak.

HU 205 389 Β

Alaktani ismertetőjelek:

A sejtek oválisak, enyhén megnyúltak, hosszméretük 1,7-2,5 pm, spóramentesek, mozdulatlanok, Grampozitívak.

Tenyészeti ismertetőjelek:

Hús-pepton-agaron, 30 °C hőmérsékleten tenyésztve, a sejtek a második napon 2 mm átmérőjű, kerek, sima, sárgás színű telepeket képeznek.

Hús-pepton-agaros keneten a szaporodás a tenyésztés második napján mérséklet, a kialakuló telep élei simák, felülete fénylő, sárgás krémszínű.

Egyszúrásos oltás után szaporodás hús-pepton-agaron mérsékelt, főként a táptalaj felületén megy végbe.

Ha a tenyésztést Glover-féle minimáltáptalajon glükózzal végezzük, akkor a szaporodáshoz biotin, tiamin és D-alanin szükséges. A tenyésztést 30 °C hőmérsékleten végezve, a második napon 1 mm átmérőjű telepek alakulnak ki, amelyek világos krémszínűik. A kenet szaporodása a második napon mérsékelt, sűrű, színe világos krémszínű.

A sejtek burgonyán is szaporxthatók, ez esetben sárgás árnyalatú pigmentet képeznek. A zselatint nem folyósítják el.

Szénforrással szemben a következőképpen viselkednek: a glükózt, szacharózt, mannózt, fruktőzt és maltőzt elerjesztik; a galaktózt, ramnózt, szorbózt, szorbitot gyengébben eqesztik; az ammónium- és nátriumacetátot gyengébben változtatják el; az etanolt gyengébben erjesztik, a laktózt nem erjesztik.

Nitrogénforrással szemben a következőképpen viselkednek: az ammónium-szulfátot és ammónium-kloridot, valamint a karbamidot asszimilálják.

Szaporodásuk optimális hőmérséklete 30-32 °C, optimális pH-értéke 7,2-7,8.

A Brevibacterium flavum AA5 törzset az alábbiak szerint tenyésztjük.

A Brevibacterium flavum ATCC 14067 törzset hús-pepton-táplevesben 30 °C hőmérsékleten levegőztetéssel 10’ sejt/ml titerig tenyésztjük, utána a sejtekből a hús-pepton-táplevest centrifugálással eltávolítjuk, és a sejteket 5,5 pH-értékű citrátpufferoldatban ismét szuszpendáljuk. Az így kapott szuszpenzióhoz 300 gg/ml végkoncentráció elérésig N-metil-N’nitro-N-nitrozo-guanidint adunk, és az elegyet levegőztetés közben 20 percig 30 °C-on inkubáljuk. Ezután a sejtekből a mutagén hatóanyagot hűtött húspepton-táplevessel kimossuk, és ugyanezzel a táplevessel 10 ml térfogatra töltve kémcsövekbe visszük át, 18 órán át 30 °C-on inkubáljuk, majd az alábbi összetételű 1. táptalaj felületére oltjuk:

Komponensek	mg/ml
Glükóz	20,0
Nátrium-szulfát	2,0
Dikálium-hidrogén-foszfát	1,0
Ammónium-klorid	3,0
Ammónium-nitrát	1,0

Komponensek	mg/ml
Magnézium-szulfát-heptahidrát	0,1
Mangán(II)-szulfát-pentahidrát	1·1(Η
Vas(H)-szuIfát-heptahidrát	bld⁴
Biotin	540-⁵
Tiamin-klorid	WO⁴
Agar-agar	20,0
D,L-a-amino-vajsav	30,0
pH	7,4

Az 1. táptalajon tenyésztett kolóniákat 4-5 napos, 30 °C hőmérsékleten végzett inkubálás után tisztítjuk, és alanintermelő képességüket megvizsgáljuk. A fokozott mennyiségű D,L-alanint termelő, kiválasztott mutánsok egyikét N-metil-N’-nitro-N-nitrozo-guanidinnel kezelve ismét mutagenezisnek vetjük alá, és elkülönítjük azokat a mutánsokat, amelyek szaporodásukhoz Dalanint igényelnek. Az ilyen módon elkülönített mutánsok egyike a Brevibacterium flavum AA5 törzs, amely L-alanint termel.

A Brevibacterium flavum AA6 törzset az alábbi módon állítjuk elő.

A Brevibacterium flavum ATCC 14067 törzset mutagenezisnek vetjük alá (N-metil-N’-nitro-N-nitrozoguanidinnel), és kiválasztunk egy D-alanint igénylő mutánst. A kitenyésztett mutánst - amely szaporodásához D-alanint igényel - ismét N-metil-N’-nitro-N-nitrozo-guanidinnel kezeljük, majd kiválasztjuk azokat a mutánsokat, amelyek D,L-a-amino-vajsavval szemben rezisztensek- ugyanolyan módon, mint a Brevibacterium flavum AA5 tenyésztésekor - azonban az 1. táptalajhoz 0,1 mg/ml koncentrációban D-alanint is adunk. Az ilyen módon kiválasztott mutánsok egyike - amelyek az L-alanint fokozott mennyiségben termelik - a Brevibacterium flavum AA6.

A Corynebacterium glutamicum AA11 és Coynebacterium glutamicum AA41 törzseket a Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 törzsből nyerjük ugyanolyan szelekciós eljárással, mint amelyet fentebb a Brevibacterium flavum AA1 és AA2 törzsek Brevibacterium flavum ATCC 14067 törzsből történő előállítására leírtunk.

Az alábbi táblázatban összefoglaljuk a találmány szerinti eljáráshoz javasolt törzsek megkülönböztető ismertetőjeleit a megfelelő brevibacterium flavum ATCC 14067 és Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 anyatörzsekkel összehasonlítva.

A táblázatban felsorolt törzsek szaporodásához szükséges D-alanin szükséglet megállapítása céljából az adott törzs szuszpenzióját csík alakjában az 1. és 2. összetételű táptalaj felületére visszük (a táptalajok összetételét lásd fentebb), és 40 órán át 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A táblázatban a szaporodást a szaporodás elmaradását jellel tüntettük fel.

Ellentétben az ATCC 14067 és ATCC 13032 anyatörzsekkel, az AA1, AA2, AA5, AA6, AA11 és AA41 törzsek az 1. összetételű táptalajon nem szaporodnak.

HU 205 389 Β

Törzs	Szaporodóképesség a táptalajon	A D- és L-alanint feldúsító képesség a táptalajon %-ban
D-alanin nélkül	%-ban 100 pg/ml D-alanin jelentlétében	100 pg/ml D-alanin és 30 pg/ml D,L-a-amino-vajsav jelenlétében
D-alanin	L-alanin
Brevibacterium falvum ATCC 14067	+	+		45	55
Brevibacterium flavumAAl		+		0	100
Brevibacterium falvum AA2		+		0	100
Brevibacterium falvum AA5		+	+	0	100
Brevibacterium flavum AA6		+	+	0	100
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032	+	+		48	52
Corynebacterium glutamicum AA11		+		0	100
Corynebacterium glutamicum AA41	-	+	-	0	100

Az AA5 és AA6 törzsek - ellentétben a táblázatban felsorolt többi törzsekkel - képesek a szaporodásra olyan táptalajon, amelynek összetétele a 2. táptalajjal, azonos azzal az eltéréssel, hogy 30 mg/mg koncentrációban D,L-a-amino-vajsavat is tartalmaz.

Abból a célból, hogy a törzsek D- és L-alanint szintetizáló képességét megállapíthassuk, e törzsek szuszpenzióját kémcsőben az alábbi összetételű, sterilizált táptalaj 5 ml térfogatú mennyiségére oltjuk:

Komponensek	g/i
Glükóz	50%
Ammónium-szulfát	30,0
Kálium-dihidrogén-foszfát	3,0
Magnézium-szulfát-heptahidrát	1,0
D-alanin	0,1
Vas(II)-szulfát-heptahidrát	0,01
Mangán(II)-szulfát-pentahidrát	0,01
Biotin	0,0002
Tiamin-bromid	0,00005
Kalcium-karbonát	30,0

A számítás annak alapján történik, hogy a mikroor- 55 ganizmusok koncentrációja 10⁷ sejt/ml. A kémcsöveket enyhe rázatás közben 40 órán át 30 ’C-on inkubáljuk.

Az így előállított tenyésztőközegben papírkromatográfiás eljárással, ninhidrinfestéssel vagy aminosav-analizáló műszerrel meghatározzuk a D,L-alanin mennyisé- 60 gét (az alanin D- és L-alakjának összmennyiségét). A D-alanintartalmat D-aminosav-oxidáz-enzim segítségével határozzuk meg 0,4 ml végtérfogatú reakcióelegyben, amelynek komponensei a következők: 8 milliegység sertésveséből származó D-aminosav-oxidáz,

0,2 ml vizsgálandó oldat, amely 0,1-5,0 mmól D-alanint tartalmaz és 33 mmól pirofoszfát-pufferoldat, amelynek pH-értéke 8,3. A reakciót 37 ’C hőmérsékleten az egyensúly eléréséig végezzük, amidőn a D-alanin 93-95%-a piruváttá alakul át. Az így keletkezett piruvátot 440 nm hullámhosszon spektrofotometriásán mérjük. Ezután a D,L-alanin összes mennyiségének mért értékéből és a D-alanin mennyiségének mért értékéből kiszámítjuk a tenyésztőközegben (tenyésztőfolyadékban) jelen levő D- és L-alanin százalékos ará45 nyát.

Az így kapott adatokat a fenti táblázatban tüntettük fel. A táblázatból világosan látható, hogy - az ATCC 14067 és ATCC 13032 törzsekkel ellentétben - az AA1, AA2, AA5, AA6, AA11 és AA41 törzsek D-ala50 nin termelésére nem képesek.

A termelőtörzsek inokulumát (oltványát) a soron következő fermentálás céljára bármely ismert eljárással előkészíthetjük: például a táptalaj felületén történő tenyésztéssel vagy folyékony táptalajban való tenyésztéssel, amelyek asszimilálható szén- és nitrogénforrásokat, valamint olyan szervetlen sókat és szerves vegyületeket tartalmaznak, amelyek a mikroorganizmusok szaporodását elősegítik.

E szerves anyagokhoz tartoznak a vitaminok (biotin, tiamin), valamint más vegyületek, például aminosavak,

HU 205389 Β amennyiben egy konkrétan adott termelőtörzs szaporodásához szükségesek.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazott mikroorganizmus-mutánsok tenyésztéséhez fermentációs táptalajként bármely táptalaj használható, amely asszimilálható szén- és nitrogénforrásokat, valamint szerveden sókat és szerves vegyületeket tartalmaz, amelyek a mikroorganizmusok szaporodását és az L-alanin feldúsulását elősegítik.

E célra alkalmas, asszimilálható szénfoirás például: a szacharóz, glükóz, fruktóz, maltóz, mannóz, keményítő, keményítő-hidrolizátumés a melasz; többértékű alkoholok, így a glicerin és a szorbit; szerves savak, így a hangyasav, ecetsav, tejsav, fumársav, maleinsav, propionsav; valamint alkoholok, például a metanol és az etanol. E szénfomások alkalmazhatók önmagukban vagy különböző tömegarányú keverékeik alakjában. A szénforrást beadagolhatjuk a fermentáció kezdetén, vagy több részletben a fermentáció előrehaladása során.

Asszimilálható nitrogénfoiráskéntmind szerves, mind szerveden anyagokat alkalmazhatunk, ilyenek például: a szerveden ammóniumsók, így az ammónium-szulfáf ammónium-klorid, ammónium-karbonát, ammóniumnitrát, ammónium-foszfát; szerves ammóniumsók - például az ammónium-acetát vagy az ammőnium-Iaktát -; karbamid; különböző természetes, nitrogéntartalmú vegyületek — például pepton, élesztő-hidrolizátum, húskiYonat, valamint növényi fehérjék hidrolizátumai.

Szerveden sóként, például kálium-foszfát, nátriumfoszfát, magnézium-szulfát, nátrium-klorid, vas-, mangán- és cinksók, valamint kalcium-karbonát alkalmazható.

A mikroorganizmusok szaporodásához igényelt szerves anyag lehet, például tíamin vagy biotin, vagy ezek helyettesítői, valamint aminosavak, amennyiben ezek mikroorganizmusok növekvéséhez szükségesek. Ha egy táptalaj összetételében egyébként is kielégítő mennyiségben szerepelnek szerves anyagok, akkor nem feltétienül szükséges az említett szerves anyagok tiszta alakban történő hozzáadása.

Ha a tenyésztést anaerob körülmények között 20— 3Ί °C hőmérséklet-tartományban és 6,5-9,0 pH-tartományban végezzük, akkor végbemegy az L-alanin felszaporodása (dúsulása).

Az L-alanin keletkezése a fermentáció kezdetétől számítva 6-10 órán belül megfigyelhető: a tenyésztőközegben az L-alanin maximális mértékű felhalmozódása a szénforrás és energia teljes elfogyasztása után következik be (32 órán belül vagy ezen túl, az alkalmazott szénforrás koncentrációjától és az energiától függőén).

A tenyésztőfolyadékban (tenyésztőközegben) az Lalanin mennyiségét papírkromatográfiával, ninhidrines festéssel vagy aminosav-meghatározó műszerrel állapítjuk meg.

A tenyésztőközegből a felhalmozottL-alanint bármely ismert eljárással kinyerhetjük: így például olyan módon, hogy a mikroorganizmusokat és egyéb oldhatatlan részeket centrifugálással vagy szűréssel eltávolítjuk, az L-alanint ioncserélő gyantán adszorbeáljuk, majd eluáljuk, az eluátumot betőményítjük, és az L-alanint kristályosítjuk.

A találmány szerinti eljárást az alábbi - nem korlátozó jellegű - kiviteli példákban részletesen ismertetjük.

1. példa

Brevibacíerium flavum AA2 törzsből inokulumanyagot (oltványanyagot) állítunk elő úgy, hogy a mikroorganizmusokat kémcsövekben ferdén rétegezett hús-peptontápleves - amely 15 g/1 agar-agart és 100 ml/1 D-alanint tartalmaz - felületén 22 órán át 30 °C hőmérsékleten tenyésztjük, majd a mikroorganizmusokat steril, fiziológiás-oldattal lemossuk (az így kapott szuszpenzióban a mikroorganizmusok koncentrációja 10⁹ sejt/ml).

250 ml térfogatú fermentáló lombikokba egyenként 10 ml sterilizált fermentáló táptalajt adagolunk, amelynek összetétele (g/I-ben): 200,0 melasz (cukortartalma 100), 120,0 élesztő-biomassza-hidrolizátum, 30,0 kalcium-karbonát; pH-értéke 7,5.

A lombikokba egyenként 0,5 μΐ Bievibacterium flavum AA2 törzsből származó inokulumot teszünk, és enyhe rázatás közben (70 lengés percenként) 72 órán át 30 °C hőmérsékleten inkubálunk. A fermentáció befejezése után a tenyésztőközeg L-alanintartalma 5,1 g/1.

A baktériumok és más oldhatatlan részek eltávolítása céljából 250 ml így kapott Brevibacterium flavum AA2 tenyésztőközeget - amely 5,1 g/1 L-alanint tartalmaz - percenként 5000 fordulatszámmal 20 percig centrifugálunk. A felülűszót NHí fázisú ioncserélő gyantán felülről lefelé áramoltatjuk, 1 térfogat gyantára számítva óránként 0,6-0,7 térfogatnyi oldatot vezetünk át. Ezután az oszlopot vízzel mossuk, majd az adszorbeált L-alanint 3,5%-os vizes ammóniaoldattal eluáljuk. Az így kapott eluátumot vákuumban betöményítjük, és az L-alanint 14-16 °C hőmérsékleten 4 óra leforgása alatt kristályosítjuk. A kristályokat az oldattól papírszűrőn átszűrve elkülönítjük, és vákuumban megszárítjuk.

így az L-alanint az anyalúgban jelen levő L-alanin figyelembevétele nélkül 3,3 g hozammal kapjuk. Ez a tenyésztőközeg L-alanintartalmára vonatkoztatva 65% összhozamot jelent.

A papírkromatográfiás vizsgálat szerint e termék 77,4%-os tisztaságú.

2. példa

A Brevibacterium flavum AA2 törzs inokulumanyagát az 1. példában megadott eljáráshoz hasonlóan állítjuk elő.

250 ml térfogatú fermentáló lombikokba egyenként 10 ml sterilizált fermentáló táptalajt helyezünk, amelynek összetétele (g/l-ben): 200,0 melasz (cukortartalma 100); 120,0 g élesztő-biomassza-hidrolizátum és 30,0 kalcium-karbonát; pH-értéke 7,5.

A lombikokba egyenként 0,5 ml Brevibacterium flavum AA1 törzsből származó inokulumot teszünk, amelyet az 1. példában leírt körülmények között tenyésztünk. A lombikok tartalmát enyhe rázatás közben (70 lengés percenként) 72 órán át 30 °C-on inkubáljuk.

A tenyésztőközeg L-alanintartalma a fermentáció befejeződése után 6,9 g/1.

HU 205 389 Β

3. példa

250 ml térfogatú fermentáló lombikokba aszeptikus körülmények között 10 ml sterilizált fermentáló táptalajt helyezünk, amelynek összetétele (g/l-ben): 200,0 melasz (cukortartalma 100), 120,0 élesztő-biomassza-hidrolizátumés 30,0 kalcium-karbonát; pH-értéke 73.

A lombikokba egyenként 0,5 ml Corynebacterium glutamicum AA11 törzsből származó inokulumot teszünk, amelyet az 1. példában leírt körülmények között tenyésztünk. A lombikokat enyhe rázatás közben (percenként 70 lengés) 72 órán át 30 °C-on inkubáljuk.

A tenyésztőközeg L-alanintartalma a fermentáció befejeződése után 3,8 g/1.

4. példa

250 ml térfogatú fermentáló lombikokba aszeptikus körülmények között 10 ml sterilizált fermentáló táptalajt helyezünk, amelynek összetétele (g/l-ben); 200,0 melasz (cukortartalma 100), 120,0 élesztő-biomassza-hidrolizátumés 30,0 kalcium-karbonát; pH-értéke 73·

5. példa

A fermentációs folyamatot az 1. példában leírt körülmények között hajtjuk végre, L-alanint termelő törzsként Brevibacterium flavum AA1 törzset alkalmazunk, a fermentáló táptalaj összetétele azonban az alábbi:

Komponensek	g/i
Szacharóz	100,0
Ammónium-szulfát	55,0
Kálium-dihidrogén-foszfát	3,0
Magnézium-szulfát-heptahidrát	1,0
D-alanin	0,1
Vas(H)-szulfát-heptahidrát	0,01
Mangán(II)-szulfát-pentahidrát	0,01
Biotln	0,0002
Tiamin-bromid	0,00005
Kalcium-karbonát	50,0
PH	7,5
72 órás inkubálás után a tenyésztőközeg L-alanintar-
talma 17,6 g/1.
ő. példa
A fermentációs folyamatot az 1. példában leírt kö-
rülmények között hajtjuk végre,	L-alanint termelő
törzsként Brevibacterium flavum AA2 törzset alkalma-
zunk, a fermentáló táptalaj összetétele az alábbi;
Komponensek	g/i
Szacharóz	100,0
Ammónium-szulfát	55,0
Kálium-dihidrogén-foszfát	3,0
Magnézium-szulfát-heptahidrát	1,0
D-alanin	0,1

Komponensek	g/i
Vas(II)-szulfát-heptahidrát Mangán(H)-szulfát-pentahidrát Biotin Tiamin-bromid Kalcium-karbonát pH	0,01 0,01 0,002 0,00005 50,0 ' 7,5
72 órás inkubálás után a tenyésztőközeg L-alanintartalma 20,4 g/1. '
7. példa A fermentációs folyamatot az 1. példában leírt körülmények között hajtjuk végre, L-alanint termelő törzsként Corynebacterium glutamicum AA11 törzset alkalmazunk, és a fermentáló táptalaj összetétele az alábbi;
Komponensek	g/i
Szacharóz Ammónium-szulfát Kálium-dihidrogén-foszfát Magnézium-szulfát-heptahidrát D-alanin Vas(II)-szulfát-heptahidrát Mangán (ü)-szulfát-pentahidrát Biotln Tiamin-bromid 0,00005 Kalcium-karbonát 50,0 pH 7,5	• 100,0 55,0 - 3,0 - 1,0 . 0,1 0,01 0,01 0,0002

órás inkubálás után a tenyésztőközeg L-alanintartalma 2,6 g/1.

8. példa . A fermentációs folyamatot az 1. példában leírt körülmények között hajtjuk végre, L-alanint termelő törzsként Corynebacterium glutamicum AA41 törzset alkalmazunk, és a fermentáló táptalaj összetétele az alábbi;

Komponensek	. g/i
Szacharóz	100,0
Ammónium-szulfát	55,0
Kálium-dihidrogén-foszfát	3,0
Magnézium-szulfát-heptahidrát	1,0
D-alanin	0,1
Vas(II)-szulfát-heptahidrát	0,01
Mangán (ü)-szulfát-pentahidrát	0,01
Biotin	0,0002
Tiamin-bromid	0,00005
Kalcium-karbonát	50,0
pH	73

órás inkubálás után a tenyésztőközeg L-alanintartalma 5,1 g/1.

HU 205 389 Β

9. példa

A fermentációs folyamatot az 5. példában leírt körülmények között hajtjuk végre, a lombikba L-alanint termelő törzsként Brevibacterium flavum AA5 törzset helyezünk. Az alábbi összetételű fermentáló táptalajt alkalmazzuk:

Komponensek	g/i
Szacharóz	100,0
Ammőnium-szulfát	55,0
Kálium-dihidrogén-foszfát	3,0
Magnézium-szulfát-heptahidrát	L0
D-alanin	0,1
Vas(IT)-szulfát-heptahidrát	0,01
Mangán(ü)-szulfát-pentahidrát	0,01
Biotin	0,0002
Tiamin-bromid	0,00005
Kalcium-karbonát	50,0
PH	7,5

A lombikok tartalmát enyhe rázás közben 72 órán át 30 °C-on ínkubáljuk. A tenyésztókózeg L-alanintartalma a fermentáció befejezése után 32,9 g/1.

10. példa

A fermentációs folyamatot az 5. példában leírt körülmények között hajtjuk végre. A lombikba L-alanint termelő törzsként Brevibacterium flavum AA6 törzset helyezünk. Az alábbi összetételű fermentáló táptalajt alkalmazzuk:

Komponensek g/1

Szacharóz	100,0
Ammónium-szulfát	55,0
Kálium-dihidrogén-foszfát	3,0
Magnézium-szulfát-heptahidrát	1,0
D-alanin	0,1
Vas(H)-szulfát-heptahidrát	0,01
Mangán(II)-szulfát-pentahidrát	0,01
Biotin	0,0002
Tiamin-bromid	0,00005

A lombikok tartalmát enyhe rázás közben 72 órán át 30 °C-on ínkubáljuk. A tenyésztőközeg L-alanintartalma a fermentáció befejezése után 31,4 g/1.

ll.példa

A fermentációs folyamatot az 5. példában leírt körülmények között hajtjuk végre. A lombikba L-alanint termelő törzsként Brevibacterium flavum AA1 törzset helyezünk. Az- alábbi összetételű fermentáló táptalajt alkalmazzuk:

Komponensek	g/i
Szacharóz	100,0
Ammónium-szulfát	55,0
Kálium-dihidrogén-foszfát	3,0
Magnézium-szulfát-heptahidrát	1,0
D-alanin	0,1
Vas(ü)-szulfát-heptahidrát	0,01
Mangán(H)-szulfát-pentahidrát	0,01
Biotin	0,0002
Tiamin-bromid	0,00005
Kalcium-karbonát	50,0
PH	7,5

A lombikok tartalmát enyhe rázás közben 72 órán át 30 °C-on ínkubáljuk. A tenyésztőközeg L-alanintartalma a fermentáció befejezése után 20,6 g/1.

12. példa

A fermentációs folyamatot az 5. példában leírt körülmények között hajtjuk végre; a lombikokba azonban egyenként 0,5 ml Brevibacterium flavum AA5 törzsből származó olyan inokulumot helyezünk szuszpenzió alakjában, amelyet ferde agaros hús-pepton-táplevesen végzett egy napos tenyésztés utáni öblítéssel állítottunk elő (mikroorganizmus-koncentrációja 10⁹ sejt/ml). Az alábbi összetételű fermentáló táptalajt alkalmazzuk:

Komponensek	g/i
Szacharóz	100,0
Ammónium-szulfát	.55,0
Kálium-dihidrogén-foszfát	3,0
Magnézium-szulfát-heptahidrát	1,0
D-alanin	0,1
Vas(II)-szulfát-heptahidrát	0,01
Mangán(II)-szulfát-pentahidrát	0,01
Biotin	0,0002
Tiamin-bromid	0,00005
Kalcium-karbonát	50,0
PH	7,5

A lombikok tartalmát enyhe rázás közben 96 órán át 30 °C-on ínkubáljuk. A tenyésztőközeg L-alanintartalma a fermentáció befejezése után 32,9 g/1.

250 ml Brevibacterium flavum AA5 törzset tartalmazó tenyésztókózeg L-alanintartalmának tisztítását (ahol az összes L-alaníntartalom 11 g) az 1. példában leírt eljáráshoz hasonló körülmények között végezzük. Az L-alanin hozama az anyalúgban levő mennyiség figyelembevétele nélkül 7,3 g, azaz a tenyésztőközeg L-alanintartalmára vonatkoztatva 67% összhozam.

E termék tisztasága a papírkromatográfiás vizsgálat adatai szerint 91,3%.

HU 205 389 Β

13. példa

A fermentációs folyamatot az 5. példában leírt körülmények között hajtjuk végre, a lombikokba azonban egyenként 0,5 ml Brevibacterium flavum AA6 törzsből származó olyan inokulumot helyezünk 0,5 ml szuszpenzió alakjában, amelyet ferde agaros hús-pepton-táplevesen végzett egy napos tenyésztés utáni öblítéssel állítottunk elő (mikroorganizmus-koncentrációja 10⁹sejt/ml). Az alábbi összetételű fermentáló táptalajt alkalmazzuk:

Komponensek	g/i
Szacharóz	100,0
Ammónium-szulfát	55,0
Kálium-dihidrogén-foszfát	3,0
Magnézium-szulfát-heptahidrát	1,0
D-alanin	0,1
Vas(II)-szulfát-heptahidrát	0,01
Mangán(II)-szulfát-pentahidrát	0,01
Biotin	0,0002
Tiamin-bromid	0,00005
Kalcium-karbonát	50,0
PH	7,5

A lombikok tartalmát enyhe rázás közben 96 órán át 30 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. A fermentáció befejezése után a tenyésztőközeg L-alanintartalma 42,3 g/1.

14. példa

A fermentációs folyamatot az 5. példában leírt körülmények között hajtjuk végre; a lombikokba azonban 0,5 ml Brevibacterium flavum AA1 törzsből származó olyan inokulumot helyezünk, amelyet ferde agaros hús-pepton-táplevesen végzett egy napos tenyésztés utáni öblítéssel állítottunk elő (mikroorganizmus-koncentrációja 10⁹ sejt/ml). Az alábbi összetételű fermentáló táptalajt alkalmazzuk:

A lombikok tartalmát enyhe rázás közben 96 órán át 30 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. A fermentáció befejezése után a tenyésztőközeg L-alanintartalma 28,1 g/1.

A találmány az orvostudomány, valamint a vegyipar, élelmiszer- és dohányipar területén alkalmazható.

Claims

1. Eljárás L-alanin előállítására Brevibacterium flavum és Corynebacterium glutamicum fajhoz tartozó mikroorganizmusok tenyésztésével, asszimilálható szén- és nitrogénforrást, szervetlen sókat és a mikroorganizmusok szaporodását elősegítő anyagokat tartalmazó táptalajon, az L-alanin tenyésztőközegben történő feldúsulásáig, a végtermék ezt követő leválasztásával, azzal jellemezve, hogy mikrooiganizmusokként a Brevibacterium flavum, illetve Corynebacterium glutamicum fajhoz tartozó mikroorganizmusok olyan mutánsait alkalmazzuk, amelyek szaporodásukhoz D-alanint igényelnek.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Brevibacterium flavum fajhoz tartozó mikroorganizmusok alábbi D-alanin auxotróf mutánsait alkalmazzuk, amelyeket a Vsesouzny nauchno-issledovatelsky institut genetiki i selektsii promyshlennykh mikroorganismov (rövidítve: VNII Genetika) helyen az alábbiak szerint helyeztünk letétbe:

Brevibacterium flavum AA1 törzs, regisztrációs száma B-3061, az elhelyezés időpontja 1984. április 5.;

Brevibacterium flavum AA2 törzs, regisztrációs száma B-3062, az elhelyezés időpontja 1984. április 5.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Brevibacterium flavum fajhoz tartozó mikroorganizmusok olyan mutánsait alkalmazzuk, amelyek szaporodásukhoz D-alanint igényelnek, és D,L-a-amino-vajsavval szemben rezisztensek.

4. Az 1. vagy 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Brevibacterium flavum fajhoz tartozó mikroorganizmusok alábbi mutánsait alkalmazzuk, amelyeket a Vsesouzny nauchrio-issledovatelsky institut genetiki i selektsii promyshlennykh mikroorganismov (rövidítve: VNII Genetika) helyen az alábbiak szerint helyeztünk letétbe:

Brevibacterium flavum AA5 törzs, regisztrációs száma B-3991, az elhelyezés időpontja 1987. április 1.;

Brevibacterium flavum AA6 törzs, regisztrációs száma B-3992, az elhelyezés időpontja 1987. április 1.

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Corynebacterium glutamicum fajhoz tartozó mikroorganizmusok alábbi D-alanin-auxotróf mutánsait alkalmazzuk, amelyeket a Vsesouzny nauchno-issledovatelsky institut genetiki i selektsii promyshlennykh mikroorganismov (rövidítve: VNII Genetika) helyen az alábbiak szerint helyztünk letétbe:

Corynebacterium glutamicum AA41 törzs, regisztrációs száma B-3321, az elhelyezés időpontja 1985. március 25.;

Corynebacterium glutamicum AA11 törzs, regisztrációs száma B-3323, az elhelyezés időpontja 1985. március 25.