CN1038669A - L-丙氨酸的制备方法 - Google Patents

L-丙氨酸的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1038669A
CN1038669A CN89103501A CN89103501A CN1038669A CN 1038669 A CN1038669 A CN 1038669A CN 89103501 A CN89103501 A CN 89103501A CN 89103501 A CN89103501 A CN 89103501A CN 1038669 A CN1038669 A CN 1038669A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ala
brevibacterium flavum
bacterial strain
microorganism
registration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN89103501A
Other languages
English (en)
Inventor
埃斯米克·格沃考夫那·阿日简
阿特·阿尔伯托维奇·阿姆巴察绵
沙瓦施·米基洛维奇·考查林
玛里查·埃那里考夫那·埃那里金
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nauchno-Issledovatelsky Tekhnologichesky Institut Aminokislot Nauchno-Proizvodst
Original Assignee
Nauchno-Issledovatelsky Tekhnologichesky Institut Aminokislot Nauchno-Proizvodst
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nauchno-Issledovatelsky Tekhnologichesky Institut Aminokislot Nauchno-Proizvodst filed Critical Nauchno-Issledovatelsky Tekhnologichesky Institut Aminokislot Nauchno-Proizvodst
Publication of CN1038669A publication Critical patent/CN1038669A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/84—Brevibacterium
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/843—Corynebacterium

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

L-丙氨酸的制取方法，包括在含有可消化的碳、氮源，无机盐和微生物生长刺激素的培养基上培养为生长需要D-丙氨酸的短杆菌或棒状杆菌属的微生物突变体，直到在培养液中积累L-丙氨酸，接着分离目的产物。

Description

本发明涉及微生物工业，更具体地说涉及氨基酸的制备方法，更确切地说是关于用发酶法制取L-丙氨酸的方法。
本申请的发明可用于医学，化学、食品和烟草工业。
已知制备L-丙氨酸的方法是通过具有β-脱羧酶活性的微生物固定化细胞的作用从天门冬氨酸转化而制备的（US，A，3898128）。
这种已知方法是多步骤的，这与必需分步制取有关，例如在方法的第一步通过天门冬氨酸酶的作用将富马酸铵转化成L-天门冬氨酸，方法的第二步-将所得的L-天门冬氨酸通过L-天门冬氨酸-β-脱羧酶的作用而转化成L-丙氨酸。（Progress        in        Industrial        Microbiology，V.24，1986，Tokyo，I，Chibate，T.Tosa，T.Kakimoto“Alamine”，P.224-232）。
从外消旋混合物中分离L-丙氨酸的已知方法，包括将D，L-丙氨酸进行乙酰化，然后借助于酰化氨基酸水解酶选择性地水解乙酰基-L-丙氨酸而获得L-丙氨酸。此后由乙酰基-D-丙氨酸中分离L-丙氨酸（US，A，3386888）。
上述方法是多步骤的，必需要制取中间产物D，L-丙氨酸、乙酰基-D，L-丙氨酸、酰化氨基酸水解酶，这样就使工艺复杂化并提高了工艺成本。
本发明的任务是使用微生物的新的突变体而建立一种制备L-丙氨酸的方法，该方法可以简化制备目的产物的工艺，并在培养液中达到工业上可接受的目的产物的产率。
此任务是这样解决的：在通过在含有可消化的碳、氮源，无机盐和刺激微生物生长的有机化合物的培养基中培养短杆菌和棒状菌属微生物，在培养液中集聚L-丙氨酸，分离目的产物的L-丙氨酸的制备方法中，按照本发明，作为微生物使用为生长需要D-丙氨酸的短杆菌和棒状杆菌属的微生物突变体。
由于本发明，不需过去由外消旋混合物中分离L-丙氨酸所必要的步骤，就可以在培养液中制取旋光纯的L-丙氨酸，同时在培养液中目的产物的含量达到28克/升。
根据本发明，最好使用黄色短杆菌种（Brevibacterium        flavum）微生物突变体，它们寄存在全苏遗传和选育工业微生物科学研究所，URSS，113545，莫斯科，Dorozhny街1号（Vsesojuzny        nauchno-issledovatelsky        institut        genetiki        i        selektsii        promyshlennykhmicroorganismov（VNII        Genetiki）URSS，113545，Moscow，Dorozhny        proezd，1）：AA1黄色短杆菌菌株，在1984年4月5日登记，其登记号为B-3061;
AA2黄色短杆菌菌株，于1984年4月5日登记，其登记号为B-3062。
根据本发明，为了随后在培养液中增加目的产物的含量（达44克/升），最好使用对D，L-α-氨基丁酸稳定的短杆菌属微生物突变体。
根据本发明，宜于使用黄色短杆菌种微生物突变体，它们寄存在全苏遗传和选育工业微生物科学研究所，URSS，113545，莫斯科，Dorozhny街1号：
AA5黄色短杆菌菌株，于1987年4月1日登记，登记号为B-3991;
AA6黄色短杆菌菌株，于1987年4月1日登记，其登记号为B-3992。
此外，根据本发明，宜于使用戊二霉素棒状杆菌种（Corynebacterium        glutamicum）的微生物突变体，它们寄存在全苏遗传和选育工业微生物科学研究所（VNII        Genetiki）URSS，113545，莫斯科，Dorozhny街1号：
AA41戊二霉素棒状杆菌菌株，于1985年3月25日登记，其登记号是B-3321;
AA11戊二霉素棒状杆菌菌株，于1985年3月25日登记，其登记号是B-3323。
本发明的进一步的目的和优点，从以下对L-丙氨酸制取方法的详述中和实施该方法的具体实例中可以变得更加清楚。
本发明所推荐的L-丙氨酸制备方法基于利用在培养基中培养的生产L-丙氨酸的微生物。
推荐使用为生长需要D-丙氨酸的短杆菌和棒状杆菌属的微生物的突变体。这些微生物的具体实例是：生产L-丙氨酸的AA1黄色短杆菌菌株，它寄存在全苏遗传和选育工业微生物科学研究所（VNII        Genetiki）URSS，113545，莫斯科，Dorozhny街1号，在1984年4月5日登记，其登记号为B-3061;
生产L-丙氨酸的AA2黄色短杆菌菌株，它寄存在全苏遗传和选育工业微生物科学研究所（VNII        Genetiki）URSS，113545，莫斯科，Dorozhny街1号，在1984年4月5日登记，其登记号为B-3062;
生产L-丙氨酸的AA41戊二霉素棒状杆菌菌株，它寄存在全苏遗传和选育工业微生物科学研究所（VNII        Genetiki）URSS，113545，莫斯科，Dorozhny街1号，在1985年3月25日登记，其登记号为B-3321;
生产L-丙氨酸的AA11戊二霉素棒状杆菌菌株，它寄存在全苏遗传和选育工业微生物科学研究所（VNII        Genetiki）URSS，113545，莫斯科，Dorozhny街1号，在1985年3月25日登记，其登记号为B-3323。
根据本发明也建议使用需要D-丙氨酸并对D，L-氨基丁酸稳定的短杆菌属微生物突变体。这种微生物的实例可以是生产L-丙氨酸的AA5黄色短杆菌菌株或AA6黄色短杆菌菌株，它们寄存在全苏遗传和选育工业微生物科学研究所（VNII，Genetiki）URSS，113545，莫斯科，Dorozhny街1号，在1987年4月1日登记，其登记号分别为B-3991、B-3932。
对D-丙氨酸的营养缺陷性突变可以用任何已知方法（例如，用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍处理或紫外线照射）由处理微生物而诱导产生。对D，L-α-氨基丁酸的稳定性突变可以自生或可以用已知的任何方法由处理微生物而诱导产生。在微生物基因中对D，L-α-氨基丁酸的稳定性突变和对D-丙氨酸的营养缺陷性突变两者共存可在任何反应顺序中实现。
作为用于选育需要D-丙氨酸的突变体的亲本菌株可以使用任何生产外消旋丙氨酸的天然微生物或微生物的突变体。上述新菌株-AA1黄色短杆菌、AA2黄色短杆菌、AA6黄色短杆菌和AA5黄色短杆菌菌株通过遗传一选育方法由ATCC14067黄色短杆菌菌株获取，该菌株寄存在全苏遗传和选育工业微生物科学研究所（VNII        Genetiki）URSS，113545，莫斯科，Dorozhny街1号，并于1969年1月16日登记，其登记号是B-42。上述新的AA41戊二霉素棒状杆菌菌株和AA11戊二霉素棒状杆菌菌株是通过遗传-选育方法由众所周知的ATCC        13032戊二霉素棒状杆菌菌株获取的。
然而，为选育本发明中所述的微生物的亲本菌株或需要D-丙氨酸的并可对D，L-α-氨基丁酸稳定的本发明的突变体型，可以使用属于短杆菌或棒状杆菌属的任何微生物菌株。
AA1、AA2、AA41、AA11菌株按其本身的特性（除对D-丙氨酸的营养缺陷性和生产L-丙氨酸能力外）与其各自的亲本菌株ATCC14067黄色短杆菌和ATCC13032戊二霉素棒状杆菌没有区别。
本发明的生产L-丙氨酸的菌株-AA1黄色短杆菌菌株和AA2黄色短杆菌菌株具有以下的形态-培养特征和生理生化特征。
细胞是卵形的，稍扁长，不活动的，非孢子形成的，革兰氏阳性的。在肉胨琼脂上培养48小时后的菌落是园形的，具有光滑的，很少粗糙的表面，呈黄色，其直径达2毫米。
兼性厌氧细菌。不稀释明胶。发酵葡萄糖、蔗糖。吸收氨氮。在30～32℃和pH7.2～7.8条件下适宜生长。为在最少的介质中生长需要生物素和硫胺素。
AA1黄色短杆菌菌株和AA2黄色短杆菌菌株的制取按下述方法实现：
在30℃，充气条件下，在肉胨培养基中培养ATCC14067菌株，直到其滴定度达109细胞/毫升。细胞用离心法洗去肉胨汁并再悬浮在柠檬酸盐的缓冲液（pH5.5）中。在所得悬浮液中加入N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍使其最终浓度达300微克/毫升，在30℃，充气条件下培养20分钟。然后将细胞用冷却的肉胨液洗去诱变剂，转入有10毫升肉胨培养基的试管中，在30℃，充气条件下培养18小时，然后接种在含有2%（重量）琼脂的肉胨培养基表面上。在30℃，通过48小时培养，在培养基上成长的菌落用印迹法检测其在二种下述成分的培养基中的生长能力：培养基1（毫克/毫升）：葡萄糖-20.0，Na2SO4-2，K2HPO4-10，NH4Cl-3.0，NH4NO3-1.0，MgSO4·7H2O-0.1，MnSO4·5H2O-1×10-4，FeSO4·7H2O-1×10-4，生物素5×10-5，氯化硫胺-1×10-4，琼脂-20.0，pH7.4。培养基2的组成不同于培养基1是在于它含有100微克/毫升的L-丙氨酸。AA1黄色短杆菌和AA2黄色短杆菌突变体选自这样的菌落，该菌落在30℃，经过48小时培养不能在培养基1上生长而能在培养基2上生长。
本发明的生产L-丙氨酸的AA41戊二霉素棒状杆菌菌株和AA11戊二霉素棒状菌菌株具有以下的形态-培养特性和生理生化特征：
细胞是卵形的、短的，它不形成孢子，呈革兰氏阳性。在肉胨琼脂上经48小时培养后菌落是园形的，有光译的，呈淡黄色，其边缘是光滑的，直径达2-3毫米。
兼性厌氧细菌，它不凝结牛奶，不稀释明胶，发酵葡萄糖、蔗糖，吸收氨氮和尿素。适于在30-32℃和pH～7.2～7.8时生长。
为了在最少培养基中生长，需要硫胺素。
AA5和AA6菌株按其本身的特征（除了对D，-L-α-氨基丁酸的稳定性、对D-丙氨酸的营养缺陷性和生产L-丙氨酸能力以外）与其亲本菌株ATCC14067黄色短杆菌菌株没有不同。
本发明的生产L-丙氨酸的AA5黄色短杆菌菌株和AA6黄色短杆菌菌株具有以下培养-形态学特征。
形态学特征。
细菌是卵形的，稍扁长，长1.7～2.5微米，它是没有孢子的、不活动的、革兰氏阳性细菌。
培养特征。
于30℃，在肉胨琼脂上，在生长第2昼夜形成2毫米直径的园形、光滑、微黄色菌落。
在肉胨琼脂上划线。在第二昼夜生长是中等的，边缘是光滑的，表面是有光译的，致密的，呈微黄奶油色。
注入肉胨琼脂中生长。在培养基表面基本上是中等。
有葡萄糖的格洛弗（Γловер）无机培养基。为了生长必需生物素、硫胺素和D-丙氨酸。于30℃，在生长的第2昼夜形成直径为1毫米的菌落，呈亮奶油色。在第2昼夜的划线生长是中等的，致密的，呈亮淡奶油色。
在马铃薯上生长并形成黄色色素。
不稀释明胶。
与碳源的关系：发酵葡萄糖、蔗糖、甘露糖、果糖、麦芽糖、较弱的半乳糖、鼠李糖、山梨糖、山梨醇、乙酸铵盐或钠盐、乙醇，但不发酵乳糖。
与氮源的关系：吸收硫酸铵和氯化铵、尿素。
适于在30～32℃和pH7.2～7.8生长。
AA5黄色短杆菌菌株是按以下方法制备的。
将ATCC14067黄色短杆菌菌株在30℃、充气条件下在肉胨液中培养，直到滴定度达109细胞/毫升。用离心法洗去细胞上的肉胨液并再悬浮于柠檬酸盐缓冲液（pH5.5）中。在所得的悬浮液中加入N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍，直到其最终浓度为300微克/毫升，并在30℃，充气条件下培养20分钟。然后用冷却的肉胨液洗去细胞上的诱变剂，转入含有10毫升肉胨液的试管，在30℃培养18小时，然后接种在1号培养基表面上，1号培养基的组成（毫克/毫升）：葡萄糖-20，Na2SO4-2，K2HPO4-1，NH4Cl-3，NH4NO3-1，MgSO4·7H2O-0.1，MnSO4·5H2O-1×10-4，FeSO4·7H2O-1×10-4，生物素-5×10-5，氯化硫胺-1×10-4，琼脂-20，D，L-α-氨基丁酸-30，pH7.4。在30℃培养4～5昼夜，将在1号培养基上所成长的菌落进行纯化并检测其生长丙氨酸的能力。将这样选取的生成高产量D，L-丙氨酸的突变体之一重新用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍诱变，并选取为生长需要D-丙氨酸的突变体。生产L-丙氨酸的AA5黄色短杆菌菌株是这样选取的突变体之一。
AA6黄色短杆菌菌株是按以下方法制取的：
ATCC14067黄色短杆菌菌株用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍诱变并选取需要D-丙氨酸的突变体。将所得的为生长需要D-丙氨酸的突变体再用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍诱变并选取对D，L-α-氨基丁酸稳定的突变体，用类似于上述制取AA5黄色短杆菌菌株的方法，不过，在1号培养基成分中要加入浓度为0.1毫克/毫升的D-丙氨酸。这样选取的生产高产量L-丙氨酸突变体之一标明为AA6黄色短杆菌菌株。
AA11戊二霉素棒状杆菌菌株和AA41戊二霉素棒状杆菌菌株是通过选育方法由ATCC13032戊二霉素棒状杆菌菌株获得的，该选育方法类似于上述由ATCC14067黄色短杆菌菌株获取AA1黄色短杆菌菌株和AA2黄色短杆菌菌株。
本发明的菌株与相应的亲本菌株ATCC14067黄色短杆菌菌株和ATCC13032戊二霉素棒状杆菌菌株的区别特征列于下表。
Figure 89103501X_IMG1
为测定表中所列的菌株生长时对D-丙氨酸的需要性，将这些菌株的悬浮体用环置在1号和2号培养基（这些培养基的成分已在上面说明）的表面上，并在30℃时培养40小时。出现生长以符号“+”表示，而没有生长则以符号“-”表示。
AA1，AA2，AA5，AA6，AA11，AA41菌株与其亲本菌株ATCC14067和ATCC13032的不同点在于在1号培养基中不生长。
AA5和AA6菌株不同于表中所列的其它菌株，它能够在类似于2号培养基组成的培养基中生长，但与之不同的是在其组成中还含有30毫克/毫升D，L-α-氨基丁酸。
为了测定菌株对合成丙氨酸的D和L-立体异构体的能力，将这些菌株悬浮体置入试管中，该试管含有5毫升下述组成的无菌培养基（克/升）：葡萄糖-50.0，（NH4）2SO4-30.0，KH2PO4-30，MgSO4·7H2O-1.0，D-丙氨酸-0.1，FeSO4·7H2O-0.01，MnSO4·5H2O-0.01，生物素-0.0002，溴化硫胺-0.00005，CaCO3-30.0，要这样考虑，使微生物浓度达到107细胞/毫升。试管在30℃，摇晃的条件下培养40小时。在所得培养液中用纸色谱法，茚三酮显色或借助于氨基酸分析器测定D，L-丙氨酸含量（D型和L型丙氨酸的总含量）。D-丙氨酸含量是借助于D-氧化酶氨基酸在最终体积为0.4毫升的反应混合物中发酵来测定的，该混合物含有：由猪肾制得的8毫单位氧化酶D-氨基酸，0.2毫升含有D-丙氨酸0.1～5.0mM的试验溶液，33mM焦磷酸缓冲液，pH8.3。反应在37℃进行，直到达到平衡为止，在这时，93-95%D-丙氨酸转化成丙酮酸盐。所生成的丙酮酸盐用分光光度法在波长440nm时测定。然后基于所测定的D，L-型丙氨酸总含量和D-丙氨酸含量计算在培养液中D-L-型丙氨酸的百分比。
所得数据列于上表。
从表中看出，AA1，AA2，AA5，AA6，AA11，AA41菌株不同于ATCC14067和ATCC13032菌株是在于不能生产D-丙氨酸。
用于以后的发酵的生产菌株的接种材料可以用任何已知方法制备，例如，在培养基的表面上培养或在含有可消化的碳、氮源，无机盐和保证微生物生长的有机物质的液体培养基中培养。
对有机物质有维生素（生物素、硫胺素），以及其他化合物，其中包括氨基酸，如果它们对具体生产的菌株的成长是必要的。
为培养本发明所使用的微生物突变体，作为培养发酵介质可以使用任何培养基，这些培养基含有可消化的碳、氮源，无机盐，有机物质，它们刺激微生物的生长并积累L-丙氨酸。
作为可消化的碳源，可以使用以下碳源如蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、甘露糖、淀粉、水解淀粉和糖蜜;多元醇，如丙三醇和山梨醇;有机酸，如蚁酸、乙酸、乳酸、富马酸、马来酸、丙酸;还有醇如甲醇和乙醇。上述碳源可以单独使用，也可彼此以不同重量比相结合而使用。滤源物质的总量在发酵开始时加入，或者分成若干份在发酵过程中加入。
作为可消化氮源可以使用有机物，也可以使用无机铵盐，如硫酸铵、氯化铵、碳酸铵、乙酸铵、硝酸铵、磷酸铵、乳酸铵和氨;尿素;各种天然的含氮化合物，如胨、酵母水解物、肉的提取液和植物蛋白的水解物。
作为无机盐可以使用磷酸钾、磷酸钠、硫酸镁、氯化钠、铁、锰和锌盐、碳酸钙。
作为上述微生物生长所必需的有机物质可以使用硫胺素、生物素或其代用物，如果因微生物生长需要的话也可以用氨基酸。在培养基的其它成分的组成中，在有足量有机物质存在的条件下，就没有必要加入纯态的有机物质。
积聚L-丙氨酸是在充气条件下，在20～37℃温度和pH6.5～9.0培养时产生的。
发酵开始后经过6～10小时，观察到呈现L-丙氨酸。可是在培养液中达到最大程度的积聚L-丙氨酸是完全消耗碳源和能量的结果（经过32小时或更长时间，这决定于所使用的碳源浓度和能量）。
在培养液中L-丙氨酸的含量用纸色谱法和茚三酮显色方法或用氨基酸分析器进行测定。
积聚的L-丙氨酸可以使用任何已知方法由培养液中分离出来，例如，使用离心法或过滤除去微生物和其它不溶微粒，在离子交换柱上吸附L-丙氨酸，接着洗脱、浓缩并结晶L-丙氨酸。
实施例1
AA2黄色短杆菌菌株的接种物是通过将微生物在试管中的斜面肉胨液表面上培养而制备的，该肉胨液含有15克/升琼脂和100毫升/升D-丙氨酸，在30℃培养22小时，接着用无菌生理溶液洗去微生物（在所得悬浮液中微生物浓度为109细胞/毫升）。
在250毫升体积的发酵瓶中无菌操作，按10毫升注入灭过菌的发酵介质;其成分如下（克/升）：糖蜜-200.0（按蔗糖计算-100），酵母生物量水解物-120.0，CaCO3-30.0，pH7.5。
在发酵瓶中，按0.5微升加入AA2黄色短杆菌菌株的接种物，并在30℃，摇晃条件下（70转/分）培养72小时。在完成发酵后所得的培养液中L-丙氨酸的含量为5.1克/升。将250毫升所得的含有5.1克L-丙氨酸的AA2黄色短杆菌菌株的培养液进行离心分离（5000转/分，20分钟）以除去细菌和其它不溶解的微粒。所得上清液以从上到下的流动方向流经装有NH+4型离子交换树脂的柱子，其流速为每小时按树脂体积计为0.6～0.7体积的溶液。柱子用水洗涤并用3.5%的氨水溶液洗脱吸附的L-丙氨酸。将所得洗脱液真空浓缩并在14～16℃下将L-丙氨酸结晶四小时。通过滤纸由溶液中过滤分离晶体并真空干燥。不计算其在母液中的含量，L-丙氨酸的产量为3.3克，为培养液中含量的总量的65%。
根据纸色谱数据，产品的纯度为77.4%。
实施例2
AA1黄色短杆菌菌株的接种物是在例1所述的类似条件下制备的。
在250毫升体积的发酵瓶中无菌操作，按10毫升注入无菌发酵介质，其组成如下（克/升）：糖蜜-200.0（按蔗糖计算-100）;酵母生物量水解物-120。0;CaCO3-30.0，pH7.5。
在发酵瓶中按0.5毫升加入AA1黄色短杆菌株的接种物，该菌株是在例1所述的类似条件下制得的。发酵瓶在30℃，摇晃条件（70转/分）下培养72小时。完成发酵后，所得培养液中L-丙氨酸的含量为6.9克/升。
实施例3
在250毫升体积的发酵瓶中无菌操作，按10毫升注入灭过菌的以下组成的发酵介质（克/升）：糖蜜-200。0（按蔗糖计算-100）;酵母生物量水解物-120.0;CaCO3-30.0，pH7.5。
在发酵瓶中按0.5毫升加入AA11戊二霉素棒状杆菌菌株接种物，该菌株是在例1所述的类似条件下制取的。发酵瓶在30℃，摇晃条件（70转/分）下培养72小时，完成发酵后所得的培养液中的L-丙氨酸含量为3.8克/升。
实施例4
在250毫升体积的发酵瓶中无菌操作，按10毫升加入灭过菌的以下组成的发酵介质（克/升）：糖蜜-200.0（按蔗糖计算-100），酵母生物量水解物-120.0，CaCO3-30.0，pH7.5。
在发酵瓶中按0.5毫升加入AA41戊二霉素棒状杆菌菌株接种物，该菌株是在例1所述的类似条件下制取的。发酵瓶在30℃，摇晃条件（70转/分）下培养72小时。完成发酵后所得培养液中的L-丙氨酸含量为6.4克/升。
实施例5
发酵操作是在例1所述的类似条件下进行的，作为生产L-丙氨酸的菌株使用AA1黄色短杆菌菌株，但使用以下组成的培养发酵介质（克/升）：蔗糖-100.0，（NH4）2SO4-55.0，KH2PO4-3.0，MgSO4·7H2O-1.0，D-丙氨酸-0.1，FeSO4·7H2O-0.01，MnSO4·5H2O-0.01，生物素-0.0002，溴化硫胺-0.00005，CaCO3-50.0，pH7.5。
培养72小时后，在培养液中的L-丙氨酸含量为17.6克/升。
实施例6
发酵操作是在例1所述的类似条件下进行的，可是作为生产L-丙氨酸的菌株使用AA2黄色短杆菌菌株并使用以下组成的发酵介质（克/升）：蔗糖-100.0，（NH4）2SO4-55.0，KH2PO4-3.0，MgSO4·7H2O-1.0，D-丙氨酸-0.1，FeSO4·7H2O-0.01，MnSO4·5H2O-0.01，生物素-0.0002，溴化硫胺-0.00005，CaCO3-50.0，pH7.5。
培养72小时后，在培养液中的L-丙氨酸含量为20.4克/升。
实施例7
发酵操作是在例1所述的类似条件下进行的，可是作为生产L-丙氨酸的菌株使用AA11戊二霉素棒状杆菌菌株并使用以下组成的发酵介质（克/升）：蔗糖-100.0，（NH4）2SO4-55.0，KH2PO4-3.0，MgSO4·7H2O-1.0，D-丙氨酸-0.1，FeSO4·7H2O-0.01，MnSO4·5H2O-0.01，生物素-0.0002，溴化硫胺-0.00005，CaCO3-50.0，pH7.5。
培养72小时后，在培养液中的L-丙氨酸含量为2.6克/升。
实施例8
发酵操作是在例1所述的类似条件下进行的，可是作为生产L-丙氨酸的菌株使用AA41戊二霉素棒状杆菌菌株，并使用以下组成的发酵介质（克/升）：蔗糖-100.0，（NH4）2SO4-55.0，KH2PO4-3.0，MgSO4·7H2O-1.0，D-丙氨酸-0.1，FeSO4·7H2O-0.01，MnSO4·5H2O-0.01，生物素-0.00002，溴化硫胺-0.00005，CaCO3-50.0，PH7.5。
培养72小时后，在培养液中的L-丙氨酸含量为5.1克/升。
实施例9
发酵操作是在例5所述的类似条件下进行的，在发酶瓶中加入作为生产L-丙氨酸菌株的AA5黄色短杆菌菌株。发酵介质具有以下组成（克/升）：蔗糖-120.0，（NH4）2SO4-55。0，KH2PO4-3.0，MgSO4·7H2O-1.0，D-丙氨酸-0.1，FeSO4·7H2O-0.01，MnSO4·5H2O-0.01，生物素-0.0002，溴化硫胺-0.00005，CaCO3-50.0，pH7.5。
发酵瓶在30℃，摇晃条件下培养72小时。发酵完成后所得培养液中的L-丙氨酸含量为32.9克/升。
实施例10
发酵操作是在例5所述的类似条件下进行的，在发酵瓶中加入作为生产L-丙氨酸菌株的AA6黄色短杆菌菌株。
发酵介质具有以下组成（克/升）;蔗糖-120.0;（NH4）2SO4-55.0;KH2PO4-3.0;MgSO4·7H2O-1.0;D-丙氨酸-0.1;FeSO4·7H2O-0.01;MnSO4·5H2O-0.01;生物素-0.0002;溴化硫胺-0.00005;CaCO3-50.0;pH7.5。发酵瓶在30℃，摇晃条件下培养72小时。发酵完成后，所得培养液中的L-丙氨酸含量为31.4克/升。
实施例11
发酵操作是在例5所述的类似条件下进行的，在发酵瓶中加入作为生产L-丙氨酸菌株的AA6黄色短杆菌菌株。
发酵介质具有以下组成（克/升）：蔗糖-120.0，（NH4）2SO4-55.0，KH2PO4-3.0，MgSO4·7H2O-1.0，D-丙氨酸-0.1，FeSO4·7H2O-0.01，MnSO4·5H2O-0.01，生物素-0.0002，溴化硫胺-0.00005，CaCO3-50.0，pH7.5。
发酵瓶在30℃，摇晃条件下培养72小时。在发酵完成后所得培养液中的L-丙氨酸含量为20.6克/升。
实施例12
发酵操作是在例5所述类似条件下进行的。可是在发酵瓶中按0.5毫升加入AA5黄色短杆菌菌株的接种物，该接种物是悬浮液，它是从一昼夜琼脂化的肉胨液斜面上冲洗而得的（微生物浓度为109细胞/毫升）。发酵介质具有以下组成（克/升）：蔗糖-150。0;（NH4）2SO4-55.0;KH2PO4-3.0;MgSO4·7H2O-1.0;D-丙氨酸-0.1;FeSO4·7H2O-0.01;MnSO4·5H2O-0.01;生物素-0.0002;溴化硫胺-0.00005;CaCO3-50.0，PH7.5。
发酵瓶在30℃，摇晃条件下培养96小时。发酵完成后，所得培养液中的L-丙氨酸含量为43.8克/升。
由250毫升AA5黄色短杆菌菌株培养液中纯化L-丙氨酸（L-丙氨酸总含量为11克）是在例1所述的类似条件下进行的。L-丙氨酸的产量在不计算其在母液中的含量时为7.3克，是在培养液中的含量的总量的67%。产品的纯度按纸色谱法为91.3%。
实施例13
发酵操作是在例5所述类似的条件下进行的。
但是在发酵瓶中按0.5毫升加入AA6黄色短杆菌菌株的接种物，该接种物是悬浮液，它是从一昼夜琼脂化肉胨液斜面上冲洗而得的（微生物浓度为109细胞/毫升）。发酵介质具有以下组成（克/升）：蔗糖-150.0;（NH4）2SO4-55.0;KH2PO4-3.0;MgSO4·7H2O-1.0;D-丙氨酸-0.1;FeSO4·7H2O-0.01;MnSO4·5H2O-0.01;生物素-0.0002;溴化硫胺-0.00005;CaCO3-50.0，pH7.5。
发酵瓶在30℃，摇晃条件下培养36小时。发酵完成后所得培养液中的L-丙氨酸含量为42.3克/升。
实施例14
发酵操作是在例5所述类似的条件下进行的。
但是在发酵瓶中按0.5毫升加入AA1黄色短杆菌菌株的接种物，该接种物是悬浮液，它是从一昼夜琼脂化的肉胨液斜面上冲洗而得的（微生物浓度为109细胞/毫升）。发酵介质具有以下组成（克/升）：蔗糖-150.0;（NH4）2SO4-55.0;KH2PO4-3.0;MgSO4·7H2O-1.0;D-丙氨酸-0.1;FeSO4·7H2O-0.01;MnSO4·5H2O-0.01;生物碱-0.0002;溴化硫胺-0.00005;CaCO3-50.0;pH7.5。
发酵瓶在30℃，摇晃条件下培养96小时。发酵完全后所得培养液中的L-丙氨酸含量为28.1克/升。

Claims (6)

1、通过在含有碳、氮源，无机盐和微生物生长刺激素的培养基上培养短杆菌和棒状杆菌属的微生物，直到在培养液中积累L-丙氨酸，接着分离目的产物制取L-丙氨酸的方法，其特征在于作为微生物使用为生长需要D-丙氨酸的短杆菌和棒状杆菌属的微生物突变体。
2、按照权利要求1的方法，其特征在于使用寄存在全苏遗传和选育工业微生物科学研究所（VNII        Genetika）URSS，113545，莫斯科，Dorozhny街1号的黄色短杆菌种微生物突变体：
AA1黄色短杆菌菌株，1984年4月5日登记，其登记号为B-3061;
AA2黄色短杆菌菌株，1984年4月5日登记，其登记号为B-3062。
3、按照权利要求1的方法，其特征在于使用对D，L，α-氨基丁酸稳定的短杆菌属微生物突变体。
4、按照权利要求1，3的方法，其特征在于使用寄存在全苏遗传和选育工业微生物科学研究所（VNII        Genetika）URSS，113545，莫斯科，Dorozhny街1号的黄色短杆菌种的微生物的突变体：
AA5黄色短杆菌菌株，1987年4月1日登记，其登记号为B-3991;
AA6黄色短杆菌菌株，1987年4月1日登记，其登记号为B-3992。
5、按照权利要求1的方法，其特征在于使用寄存在全苏遗传和选育工业微生物科学研究所（VNII        Genetika）URSS，113545，莫斯科，Dorozhny街1号的戊二霉素棒状杆菌种的微生物的突变体：
AA41戊二霉素棒状杆菌菌株，1985年3月25日登记，其登记号为B-3321;
AA11戊二霉素棒状杆菌菌株，1985年3月25日登记，其登记号为B-3323。
6、生物学纯的微生物培养物，具有以下任何一种生产L-丙氨酸菌株的特征和标志：
AA1黄色短杆菌;
AA2黄色短杆菌;
AA5黄色短杆菌;
AA6黄色短杆菌;
AA41戊二霉素棒状杆菌;
AA11戊二霉素棒状杆菌。
CN89103501A 1988-04-26 1989-04-19 L-丙氨酸的制备方法 Pending CN1038669A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU4408234 1988-04-26
SU884408234A SU1719433A1 (ru) 1988-04-26 1988-04-26 Способ получени L-аланина

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1038669A true CN1038669A (zh) 1990-01-10

Family

ID=21367916

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN89103501A Pending CN1038669A (zh) 1988-04-26 1989-04-19 L-丙氨酸的制备方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US5124257A (zh)
EP (1) EP0369029A4 (zh)
JP (1) JPH03500486A (zh)
CN (1) CN1038669A (zh)
FI (1) FI896231A0 (zh)
HU (1) HU205389B (zh)
SU (1) SU1719433A1 (zh)
WO (1) WO1989010408A1 (zh)
YU (1) YU85489A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1884565B (zh) * 2006-05-29 2011-05-04 安徽华恒生物工程有限公司 D-丙氨酸微生物制造方法
CN108484423A (zh) * 2018-07-05 2018-09-04 秦皇岛华恒生物工程有限公司 一种从l-丙氨酸发酵液中分离纯化l-丙氨酸的方法

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5478733A (en) * 1993-07-16 1995-12-26 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing L-alanine by fermentation with arthrobacter
WO2010038613A1 (ja) * 2008-09-30 2010-04-08 東レ株式会社 化学品の製造方法および連続培養装置
WO2012077742A1 (ja) 2010-12-09 2012-06-14 東レ株式会社 連続発酵による化学品の製造方法
JPWO2012090863A1 (ja) 2010-12-27 2014-06-05 東レ株式会社 中空糸膜モジュールおよび化学品の製造方法
EP2837687B1 (en) 2012-03-30 2017-02-22 Toray Industries, Inc. Method for producing chemical by means of continuous fermentation and continuous fermentation device
KR101947959B1 (ko) 2018-05-28 2019-02-13 씨제이제일제당 (주) 변이형 호모세린 디하이드로게나제 및 이를 이용한 호모세린 또는 호모세린 유래 l-아미노산의 생산 방법
KR101996769B1 (ko) 2018-12-21 2019-10-01 씨제이제일제당 (주) 변이형 호모세린 디하이드로게나제 및 이를 이용한 호모세린 또는 호모세린 유래 l-아미노산의 생산 방법

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2511867A (en) * 1949-12-19 1950-06-20 Method fob separating enantiomers
JPS531831B2 (zh) * 1972-11-20 1978-01-23
CA1178909A (en) * 1980-09-17 1984-12-04 Murray C. Fusee Process for production of l-alanine using immobilized microorganisms
DE3723932A1 (de) * 1987-07-20 1989-02-02 Henkel Kgaa Klebeverfahren fuer wasserdampfdurchlaessige substrate
JPH074265B2 (ja) * 1987-10-07 1995-01-25 東レ株式会社 発酵法によるｄ−アラニンの製造法
US5508939A (en) * 1993-06-10 1996-04-16 At&T Corp. Method of partitioning a circuit

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1884565B (zh) * 2006-05-29 2011-05-04 安徽华恒生物工程有限公司 D-丙氨酸微生物制造方法
CN108484423A (zh) * 2018-07-05 2018-09-04 秦皇岛华恒生物工程有限公司 一种从l-丙氨酸发酵液中分离纯化l-丙氨酸的方法
CN108484423B (zh) * 2018-07-05 2021-02-09 秦皇岛华恒生物工程有限公司 一种从l-丙氨酸发酵液中分离纯化l-丙氨酸的方法

Also Published As

Publication number Publication date
HUT53940A (en) 1990-12-28
EP0369029A4 (en) 1991-09-25
HU205389B (en) 1992-04-28
FI896231A0 (fi) 1989-12-22
HU894784D0 (en) 1990-07-28
EP0369029A1 (de) 1990-05-23
YU85489A (en) 1990-08-31
SU1719433A1 (ru) 1992-03-15
JPH03500486A (ja) 1991-02-07
US5124257A (en) 1992-06-23
WO1989010408A1 (en) 1989-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1165193A (zh) 发酵产生l-谷氨酸的方法
CN1049689C (zh) 通过发酵制备ｌ－谷氨酸的方法
JPS61202694A (ja) 発酵法によるｌ−グルタミンの製造法
CN1038669A (zh) L-丙氨酸的制备方法
CN1710066A (zh) 一株可高产谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌
FR2661191A1 (fr) Procede de production de l-lysine par fermantation et mutant pour la mise en óoeuvre du procede.
CN1500863A (zh) 染色体上fadR基因被敲除的微生物以及通过该突变体发酵生产L-苏氨酸的方法
CN1113965C (zh) 生产棒酸及/或其盐类的方法
CN1844357A (zh) 谷氨酸棒杆菌突变株及在发酵法生产l－色氨酸中的应用
JP3717970B2 (ja) 発酵法によるｌ−イソロイシンの製造法
CN1273606C (zh) 有效霉烯胺和有效霉胺的微生物制备方法
JP3131311B2 (ja) 発酵法によるｌ−イソロイシンの製造法
CN1279176C (zh) L－蛋氨酸的生产工艺、氨基酰化酶菌株及氨基酰化酶
CN1106018A (zh) 生产维生素b12的方法
CN1129957A (zh) 用复合固相酶制品生产d-氨基酸的方法
CN1027084C (zh) 生产l-山梨糖的方法
JP2670838B2 (ja) Ｌ―α―アミノ酸類の製造方法
JPH119296A (ja) 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法
JP3074781B2 (ja) 発酵法によるｌ−リジンの製造法
JPS63258588A (ja) 発酵法によるｌ−バリンの製造法
CN87108329A (zh) 制备l-缬氨酸的方法
CN1197957C (zh) 一种棒杆菌属菌种以及发酵生产l－赖氨酸的方法
RU2084520C1 (ru) Штамм бактерий brevibacterium flavum - продуцент l-глутамина (варианты)
CN1367827A (zh) 突变细菌株的l－赖氨酸生产
CN1108377C (zh) 由深红酵母菌培养产生l－苯丙氨酸解氨酶的培养方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C01 Deemed withdrawal of patent application (patent law 1993)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication