JPH01112993A - ５−ヒドロキシ−ｌ−トリプトファンの製造法及び微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は生理活性アミンの１つであるセロトニンの前駆
物質として、或いは必須アミノ酸の１つであるＬ−トリ
プトファンの類縁物質として医薬品や化学工業原料等と
して有用な化合物である５−ヒドロキシ−Ｌ、−）リゾ
トファン（以下５１（ＴＰと略称する。）の製造法及び
該方法に於いて効果的に用い得る微生物に関する。

（従来技術と問題点） 微生物を用い′ｆＩ：、５　）ＩＴＰの製造法としては
、従来、例えばインドール誘導体をぶ料とする方法（特
開昭５９−４５９００、同５７−８３２８８、同５７−
８７９１等）やアントラニル酸誘導体を原料とする方法
（特開昭６０−３４１９５等）が知られており、これら
の方法にて使用すべき微生物として、アクロモバクタ−
属、コリネバクテリア属、サツカロミセス属、セラチア
属、エアロモナス属、バチルス属、エシェリヒア属、プ
レバクテリア属等が提案されている。しかし、これら従
来公知の方法はいずれも５　）ＩＴＰの収率が必ずしも
充分なものとは言い難く、更には、培養物中にＬ−トリ
プトファンが生成蓄積する場合も多い。培養物中にＬ−
）リデトファンが生成蓄積した場合、目的とする５　Ｈ
ＴＰとの分離が難しく、５　ＨＴＰＯ分離精梨工程に於
ける損失が大きくなり経済的な不利は逃れない。

（発明の課題及び解決手段） 本発明者らは培養物中の５　ＨＴＰの蓄積濃度が高く且
り一トリグトファン等の好ましくない副生物の生成を出
来る限り抑えｉ　５　ＨＴＰの工業上有利な製造法を開
発すべく種々検討を重ねた結果本発明を完成するに至っ
几。

即ち、本発明によれば５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトフ
ァン生産能を有し、且生育必要量以上のＬ−トリプトフ
ァンまたはその前駆体の合成酵素系を持たないバチルス
属に属する微生物を５−ヒドロキシインドールもしくは
５−ヒドロキシアントラニル酸ま几はそれらの塩を含み
、友だし、Ｌ−トリプトファンｔ７ｔはその前駆体を含
まない栄養培地で培養し、培養物より５−ヒドロキシ−
し−トリプトファンを採取することを特徴とする５−ヒ
ドロキシ−Ｌ−トリプトファンの姿造法及び該方法の実
施にあ友す効果的に使用し得る微生物として、バチルス
ＳＤ−５８ま之はバチルスＳＤ−５９が提供される。

従来かかる製造法としてアントラニル陵要求性株を用い
る方法（特開昭６ｌ−５２２７７）が提唱され最良の方
法とされていたが菌の生育のｋめトリプトファン又はそ
の前駆体例えばアントラニル酸を必要として培地中に適
当Ｉ、適宜供給する操作が必要であっ友が本発明ではか
かる操作は必要でないなどのメリットがある。本発明に
従ったアントラニル酸合成酵素活性を減少せしめ念５−
ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン生産能を有する・ぐチ
ルス属に属する微生物は以下のようにして取得した。

すなわち、発明者らは、バチルス属に属する菌を、例え
ば常法に従ってＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ングアニジン（ＮＴＧ　）処理あるいは紫外線照射処理
などで人工突然変異を誘発せしめ、微生物固有のＬ−ト
リプトファンによるフィードバック阻害機構を解除した
菌を選抜する目的で、変異処理菌を生育最低阻止濃度以
上にトリプトファンアナログ体である５−フルオロトリ
プトファンを含んだ寒天平板培地（スビデイゼン培地）
に撒き、生育した数百のコロニーについてそれぞれ５−
ビ゛ロキシーＬ−トリグトファン生産能の高い５−フル
オロトリプトファン耐性菌株（即ち、Ｌ−トリゾトファ
／によるフィードバック抑制が解除し７’Ｃ）１に得た
。例えばこのようにして生産性の高い菌として、バチル
ス・ズプチルスからはＳＤ−５６（原株は東京大学応用
微生物研究所より入手し几■ＡＭ１０２６）、バチルス
・アミロリクエファシェンスからはＳＤ−５７（原株は
東京大学応用微生物研究所より入手したＩＡＭ−１５２
１である）が得られる。

次に、この５−フルオロトリプトファン耐性及び５−ヒ
ドロキシ−し−トリプトファン生産能を有する変異菌株
を親株とし再び上と同様にして人工突然変異誘発処理し
て、処理後、ＮＴＧ処理した場合は菌体を遠心分離（ｌ
ｏｏ００ＧＸ５分）し、次にトリス緩衝液（ｐＨ７，０
）に懸濁し再度遠心分離して、ＮＴＧ　ｔ−除去し、最
終的に菌をアントラニル酸２０〜５０　ｐｐｍ　′ｆ、
含むスピデイゼン培地のような枯草菌用最小培地にて３
０〜４０℃で数時間培養する。

次に対数増殖前〜中期に、アントラニル酸要求性菌を濃
縮すべく、ペニシリン２００〜１０００−Ｌニット／―
ヲ添加して３０〜４０℃で３０〜９０分振盪し、上と同
様に集菌洗浄し、アントラニル酸２０〜ｓ　ｏ　ｐｐｍ
含有枯草菌用最小培地では生育するが、アントラニル酸
無添加枯草菌用最小培地では生育しないアントラニル酸
要求性菌株をスクリーニングする。

次に、上のようにして得られるアントラニル酸要求性株
を前記したような方法で人工突然変異誘発処理した後、
集菌（ＮＴＧ処理の場合は菌体を洗浄しＮＴＧを除去）
し、栄養培地で３０〜４０℃３時間培養した後、遠心分
離により集菌しトリス緩衝液に菌濃度１×ｌＯ８個／　
ｍｌになるように懸濁し、アントラニル酸を含まない枯
草用最小寒天培地に塗布し、３０〜４０℃で１〜３日間
静置培養する。

生育したコロニーに関して、各々３０℃〜４０℃でスぎ
デイゼン培地で液体培養し同時に親株のＳＤ−５６、Ｓ
Ｄ−５７も培養し、集菌後、アントラニル酸合成酵素活
性（伊藤らの方法に従った。

ｇｅｎｅｔｉｃｓ、５２．１３０３〜１３１６（１９６
５））’！ｚ比較した所親株（ＳＤ−５６またはＳＤ−
５７）に比較しアントラニル酸合成酵素活性が顕著に低
下し几菌株が選択出来た。このようにしてＳＤ−５６か
らはＳＤ−５８（微工研菌寄第９６０１号）、ＳＤ−５
７からはＳＤ−５９（微工研菌寄第９６０２号）が取得
できた。

これら菌の菌学的性質は菌株ＳＤ−５８の場合原株、ｐ
４チルス・ズプチルスＩＭＡ　１０２６株（東京大学応
用微生物研究所より入手）と比較し、またＳＤ−５９の
場合原株バチルス・アミロリクイファシェンスＩＡＭ１
５２）と比較すると、トリブトファンによるフィードバ
ック抑制解除、５−ヒドロキシ−Ｌ−）リゾトファン生
産能およびトリクトファン合成系酵素活性の点で相違す
る以外は原株と実質的に同じである。

以上、バチルス属に属する菌としてノ９チルス・ズブチ
ルスとバチルス・アミロリクイファシェンスを用い念が
、各種前駆体から５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン
をつくる能力があるものならどの菌でも使用できること
は言うまでもない。

本発明に従って、５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン
を製造するには、バチルスＳＤ−５８またはＳＤ−５９
ｔ−５−ヒドロキシアンスラニル酸又は５−ヒドロキシ
インドール又はその塩を添加した培地中で培養すること
により実施する。栄養培地中の５−ヒドロキシアンスラ
ニル酸又は５−ヒドロキシインドール又はその塩の濃度
には特に限定はないが、目的５−ヒドロキシ−Ｌ−トリ
プトファンの収量、培養条件及ば経済的観点から一般に
は０．１〜３０００１ｎ９／ｌ、好ましくは１０〜１０
００１ｎ９Ａの濃度を保持し乍ら培養する。

本発明方法において使用することのできる培地としては
、前記微生物が培養により増殖し得るものであれば任意
のものでよく、例えば炭素源としてはブドウ糖、糖密、
蔗糖、デン粉、デン粉糖化液、セルロース分解物などの
糖類、酢酸、エタノール等が用いられる。窒素源として
はアンモニア、硫安、塩安、硝安、燐安などのアンモニ
ウム塩や尿素、硝酸塩等が適宜用いられる。無機塩とじ
ては燐酸、カリウム、マグネシウム、マンガン等の塩類
、例えば燐酸アンモニウム、燐酸カリ、燐酸ソーダ、硫
酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、苛性カリ
等の通常の工業用薬品で良く、他に微１元素としてカル
シウム、亜鉛、硼素、銅、コバルト、モリブデン等の塩
類を加えても良い。

また微Ｉ有機栄養素としてビタミン、アミノ酸、核酸関
連物質等は菌の生育上は特別に必要とするものではない
が、これらを添加し几り、コーンスチープリカー、肉エ
キス、酵母エキス、ペプトン等の有機物を加えても良い
。５−ヒドロキシアンスラニル酸又は５−ヒドロキシイ
ンドールハソのまま又はメタノール、エタノール、酢酸
等の有機溶媒の溶液の形で使用してもよいが、ナ）　Ｉ
Ｊウム、カリウム、アンモニウムなどのアルカリ塩や硫
酸、塩酸、酢酸等の酸塩の水溶液として使用するのが好
ましい。

本発明方法における培養は好気的条件下に、例えば通気
攪拌や往復振盪方法によって培養することができる。培
養条件は、特に限定はないが、−船釣に言えば、温度３
０〜４０℃、ｐＨ６，８〜８．０及び１０〜７２時間程
度の条件で実施する。

培養液又は培養物からの目的の５−ヒドロキシ−Ｌ　−
）　ＩＪ　ｆ　）ファンの採取方法は慣用方法に従って
行うことができる。例えば、遠心分離により菌体・部を
除い友培養液上清からイオン交換樹脂処理法、活性炭処
理法等の操作を適宜組み合せて５−ヒドロキシ−Ｌ−ト
リプトファンを単離晶析することができる。

実施例 以下に本発明の詳細な説明するが、本発明の範囲をこれ
らの実施例に限定するものでないことはいうまでもない
。

例１（５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファンの製造例） グルコース１０チ、硫安０．２％、　Ｎａ２ｓ０４０．
１％、ＫＨ２ＰＯ４０，５％、ＭｇＳＯ４・４〜６Ｈ２
００，０５％、Ｆｅ＋＋ｌｐｐｍ、Ｍｎ＋＋ｌｐｐｍの
組成の液体培地２１ｊｃ５１ジャーファーメンタ−に入
れ、１１５℃で２０分間加熱滅菌した。

この培養槽に、予じめブイヨン培地中で３０℃で１２時
間振盪培養したバチルスＳＤ−５８又はＳＤ−５９を５
％接種し、３５℃で通気攪拌培養を行っ几。

培養は、１０％の５−ヒドロキシアンスラニル酸アンモ
ニウム塩溶液を培養液中の５−ヒドロキシアンスラニル
酸濃度が５０〜１００　ｐｐｍになるように連続的に添
加し、培養液のｐＨ＠　７．０に保ちながら１５時間実
施し友。

得られた培養液中からＳＤ−５８では９．７　ｌＩ、　
ＳＤ−５９では１３゜８９の５−ヒドロキシ−Ｌ−トリ
プトファンが回収できた。なお、両画とも培地中のＬ−
トリプトファンの濃度は０゜０２１／を以下であった。

なお、上記培養実験と並行して前記し７ｔ　ＳＤ−５８
又はＳＤ−５９の親株である非アンスラニル酸要求性菌
株を上と同様にして１５時間培養したところ、培養液中
の５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファンとしてＳＤ−５
６では°９．１．９　、ＳＤ−５７では１２．８．９回
収でき、Ｌ−トリプトファンの蓄積濃度は０．１．９〜
０．５１１／ｌであり几。

例２（５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファンの製造例） ＳＤ−５８、ＳＤ−５９を例１で用いた培地で５１ジャ
ーファーメンタ−にて２０時間培養し、この培養物２ノ
を同じ培地２００１を含む５００１シャーファーメンタ
−に接種し、溶存酸素ｆ　０．５　ｐｐｍ以上に保ち乍
ら３５℃で１５時間通気攪拌培養を行なり九。培養中、
培養液中の５−ヒドロキシアンスラニル酸の濃度が５０
〜１００　ｐｐｍになるようＫ、２０％０５−ヒドロキ
シアンスラニル酸アンモニウム塩溶液を連続的に添加し
、培養液の−は７、０に保持した。培養完了後培養液か
ら５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファンとしてＳＤ−５
８では０．９６ｋＩＰでＳＤ−５９では１．３５ゆ回収
できた。尚、Ｌ−トリプトファンの蓄積濃度は０．０１
と０．０１５１であった。

特許出願人　　昭和電工株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン生産能を有し
   、且生育必要量以上のＬ−トリプトファンまたはその前
   駆体の合成酵素系を持たないバチルス属に属する微生物
   を５−ヒドロキシインドールもしくは５−ヒドロキシア
   ントラニル酸またはそれらの塩を含み、ただし、Ｌ−ト
   リプトファンまたはその前駆体を含まない栄養培地で培
   養し、培養物より５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン
   を採取することを特徴とする５−ヒドロキシ−Ｌ−トリ
   プトファンの製造法。 ２）バチルスＳＤ−５８またはバチルスＳＤ−５９