BR112021010947A2 - Composições de polímero com estabilidade aprimorada para produtos microbianos de fixação de nitrogênio - Google Patents

Abstract

composições de polímero com estabilidade aprimorada para produtos microbianos de fixação de nitrogênio. a presente divulgação se refere à integração de polímeros exógenos aos micróbios para conferir um aumento de estabilidade e de viabilidade para uma vida útil estendida dos micróbios desejados (por exemplo, bactérias), em comparação àqueles micróbios que carecem de polímeros exógenos. os micróbios incluem micróbios transgênicos, micróbios não transgênicos e micróbios remodelados não intergenéricos. a utilização dos produtos microbianos ensinados permitirá uma expansão significativa da vida útil típica das composições microbianas. os micróbios que compreendem polímeros exógenos descritos neste documento são capazes de ser combinados com outras composições agricolamente benéficas. além disso, a divulgação proporciona a adição de biofilmes microbianos exógenos às composições supracitadas.

Description

“COMPOSIÇÕES DE POLÍMERO COM ESTABILIDADE APRIMORADA PARA PRODUTOS MICROBIANOS DE FIXAÇÃO DE NITROGÊNIO” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade de Pedido Provisório US nº62/776.782, depositado em 7 de dezembro de 2018, que está incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.

DECLARAÇÃO SOBRE A LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] Os conteúdos do arquivo de texto enviado eletronicamente aqui estão incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade: Uma cópia de formato legível por computador do nome de arquivo de Listagem de Sequências: PIVO_009_01WO_SeqList_ST25.txt9, data registrada: 30 de novembro 2019; tamanho de arquivo: ≈ 632 quilobytes.

FUNDAMENTOS DA DIVULGAÇÃO

[003] Em 2050, a Organização das Nações Unidas para a Alimentação e a Agricultura projeta que a produção total de alimentos deve aumentar em 70% para atender às necessidades de uma população crescente, um desafio que é exacerbado por vários fatores, incluindo: diminuição dos recursos de água doce, aumento da competição por terras aráveis, aumento dos preços da energia, aumento dos custos dos insumos e a provável necessidade de adaptação das culturas às pressões de um clima global mais seco, quente e extremo.

[004] As práticas agrícolas atuais não estão bem equipadas para atender a essa demanda crescente de produção de alimentos, ao mesmo tempo em que equilibram os impactos ambientais resultantes do aumento da intensidade agrícola.

[005] Um dos principais insumos agrícolas necessários para satisfazer a demanda global de alimentos é o fertilizante de nitrogênio. No entanto, o padrão industrial atual utilizado para produzir fertilizante de nitrogênio, é um método de fixação de nitrogênio artificial chamado de processo Haber-Bosch, que converte o nitrogênio atmosférico (N2) em amônia (NH3) por uma reação com hidrogênio (H2) usando um catalisador de metal sob altas temperaturas e pressões. Esse processo consome muitos recursos e é prejudicial ao meio ambiente.

[006] Ao contrário do processo sintético de Haber-Bosch, certos sistemas biológicos evoluíram para fixar o nitrogênio atmosférico. Esses sistemas utilizam uma enzima chamada nitrogenase, que catalisa a reação entre N2 e H2 e resulta na fixação de nitrogênio. Por exemplo, os rizóbios são bactérias diazotróficas que fixam nitrogênio após se estabelecerem no interior dos nódulos radiculares de leguminosas. Um objetivo importante da pesquisa de fixação de nitrogênio é a extensão desse fenótipo para plantas não leguminosas, particularmente para gramíneas agronômicas importantes como trigo, arroz e milho. No entanto, apesar do progresso significativo feito na compreensão do desenvolvimento da simbiose de fixação de nitrogênio entre rizóbios e leguminosas, o caminho para usar esse conhecimento para induzir nódulos fixadores de nitrogênio em culturas não leguminosas ainda não está claro.

[007] Consequentemente, a grande maioria da agricultura moderna em linha utiliza fertilizante de nitrogênio que é produzido por meio do processo Haber- Bosch de uso intensivo de recursos e prejudicial ao meio ambiente. Por exemplo, o USDA indica que o agricultor de milho dos EUA tipicamente aplica entre 130 e 200 libras de nitrogênio por acre (146 a 224 kg/ha). Esse nitrogênio não é apenas produzido em um processo sintético de uso intensivo de recursos, mas é aplicado por maquinário pesado cruzando/impactando o solo do campo, queimando petróleo e exigindo horas de trabalho humano.

[008] Além disso, o fertilizante de nitrogênio produzido pelo processo industrial Haber-Bosch não é bem utilizado pela cultura alvo. A chuva, o escoamento, o calor, a volatilização e o microbioma do solo degradam o fertilizante químico aplicado. Isso equivale não apenas a dinheiro desperdiçado, mas também aumenta a poluição em vez da produção real. Para esta finalidade, as Nações Unidas calculam que quase 80% do fertilizante é perdido antes que uma cultura possa utilizá-lo. Consequentemente, a produção e a entrega de fertilizantes agrícolas modernos não só são prejudiciais ao meio ambiente, como também são extremamente ineficientes.

[009] Embora micróbios aprimorados com capacidade de fixação de nitrogênio atmosférico sejam desejáveis, métodos de preservação dos micróbios ou de aumento da estabilidade natural dos micróbios são ainda mais desejáveis.

[010] A fim de atender às crescentes necessidades de abastecimento de alimentos do mundo - ao mesmo tempo em que equilibra a utilização de recursos e fornece impactos mínimos sobre os sistemas ambientais - uma abordagem melhor para a fixação de nitrogênio e entrega às plantas é urgentemente necessária.

SUMÁRIO DA DIVULGAÇÃO

[011] A divulgação fornece composições e métodos para criar as ditas composições, que têm capacidade para preservar os micróbios fixadores de nitrogênio. As composições microbianas ensinadas no presente documento são estáveis. Ou seja, a viabilidade microbiana nas ditas composições é aprimorada.

[012] Assim, nas modalidades, é ensinada uma composição microbiana, compreendendo: uma ou mais bactérias isoladas; e uma composição de polímero compreendendo um ou mais polímeros, em que um ou mais polímeros são exógenos a uma ou mais bactérias isoladas. A composição microbiana pode compreender ainda: um ou mais biofilmes exógenos a uma ou mais bactérias isoladas. Em modalidades, o um ou mais biofilmes compreendem espécies dentro de um gênero selecionado dos seguintes gêneros: Pseudomonas, Kosakonia, Bacillus, Azospirillum, Candida, Saccharomycese Agrobacterium. Em modalidades, o um ou mais biofilmes compreendem Kosakonia sacchari. Em modalidades, a uma ou mais bactérias isoladas são do gênero Klebsiella e o um ou mais biofilmes compreendem um micróbio do gênero Kosakonia. Em modalidades, a uma ou mais bactérias isoladas são Klebsiella variicola e o um ou mais biofilmes compreendem Kosakonia sacchari. Em modalidades, a uma ou mais bactérias isoladas são Klebsiella variicola da cepa 137-1036 e o um ou mais biofilmes compreendemKosakonia sacchari. Em modalidades, o um ou mais biofilmes compreendem dois biofilmes produzidos por dois micróbios produtores de biofilme diferentes. Em modalidades, a uma ou mais bactérias isoladas são selecionadas a partir dos seguintes gêneros: Achromobacter, Agrobacterium, Anabaena, Azorhizobium, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Bradyrhizobium, Candida, Clostridium, Enterobacter, Klebsiella, Kluyvera, Kosakonia, Mesorhizobium, Microbacterium, Pseudomonas, Rahnella, Rhizobium, Saccharomyces, Sinorhizobiume combinações dos mesmos. Em modalidades, a uma ou mais bactérias isoladas são selecionadas a partir de: Achromobacter marplatensis, Achromobacter spiritinus, Azospirillum lipoferum, Enterobacter sp., Klebsiella variicola, Kluyvera intermedia, Kosakonia pseudosacchari, Kosakonia sacchari,

Microbacterium murale, Rahnella aquatilise combinações dos mesmos. Em modalidades, a uma ou mais bactérias isoladas são do gênero Klebsiella. Em modalidades, a uma ou mais bactérias isoladas são uma Klebsiella variicola. Em modalidades, a uma ou mais bactérias isoladas são da cepa 137-1036 de Klebsiella variicola.

[013] Em modalidades, o um ou mais polímeros são selecionados a partir de: polivinilpirrolidona (PVP), polivinilpirrolidona-acetato de vinila (PVP-VA), carboximetilcelulose (CMC), hidroxipropilmetilcelulose, alginato e combinações dos mesmos. Em modalidades, o um ou mais polímeros são polivinilpirrolidona-acetato de vinila (PVP-VA). Em modalidades, o um ou mais polímeros são um polímero submetido à eletrofiação. Em modalidades, o um ou mais polímeros compreendem um copolímero. Em modalidades, a uma ou mais bactérias isoladas têm capacidade de fixação de nitrogênio.

[014] Em modalidades, a viabilidade de uma ou mais bactérias isoladas exibe um aumento, em comparação com uma composição de controle que compreende uma ou mais bactérias isoladas desprovidas do um ou mais polímeros. Em modalidades, a viabilidade da uma ou mais bactérias isoladas exibe um aumento quando armazenadas durante pelo menos 30 dias, em comparação com uma composição de controle que compreende uma ou mais bactérias isoladas desprovidas do um ou mais polímeros. Em modalidades, a viabilidade da uma ou mais bactérias isoladas exibe um aumento quando armazenadas em cultura líquida. Em aspectos, o termo "estabilidade" é usado, o que, no contexto da divulgação, muitas vezes se refere à "viabilidade" dos micróbios encontrados na composição.

[015] Em aspectos, a composição é um sólido, líquido ou semissólido. Em aspectos, a composição é um revestimento de semente presente em uma semente de planta ou outro material de propagação de planta. Em aspectos, a composição é um revestimento de semente presente em uma semente de milho que tem um inseticida, herbicida, fungicida ou nematicida presente na dita semente. Em aspectos, a composição está em uma formulação de sulco.

[016] Em aspectos, uma ou mais bactérias isoladas são endofíticas, epifíticas ou rizosféricas. Em aspectos, uma ou mais bactérias isoladas são bactérias de tipo selvagem. Em aspectos, uma ou mais bactérias isoladas são bactérias transgênicas.

Em aspectos, uma ou mais bactérias isoladas são bactérias remodeladas não intergenéricas.

Em aspectos, uma ou mais bactérias isoladas são bactérias remodeladas não intergenéricas selecionadas da Tabela 1, ou progênies ou derivados das mesmas.

Em aspectos, uma ou mais bactérias isoladas são capazes de fixar nitrogênio atmosférico.

Em aspectos, uma ou mais bactérias isoladas são bactérias remodeladas não intergenéricas capazes de fixar nitrogênio atmosférico na presença de nitrogênio exógeno.

Em aspectos, uma ou mais bactérias isoladas são bactérias remodeladas não intergenéricas que compreendem: pelo menos uma variação genética introduzida em pelo menos um gene, ou polinucleotídeo não codificador, da rede regulatória genética de assimilação ou de fixação de nitrogênio.

Em aspectos, a uma ou mais bactérias isoladas compreendem uma sequência de controle introduzida ligada operavelmente a pelo menos um gene da rede regulatória genética de assimilação ou de fixação de nitrogênio.

Em aspectos, a uma ou mais bactérias isoladas compreendem um promotor heterólogo ligado operavelmente a pelo menos um gene da rede regulatória genética de assimilação ou de fixação de nitrogênio Em aspectos, cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende pelo menos uma variação genética introduzida em um membro selecionado do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, polinucleotídeo que codifica glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, drat, amtB, polinucleotídeo que codifica glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB, nifQ, um gene associado à biossíntese de uma enzima nitrogenase ou combinações dos mesmos.

Em aspectos, cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende pelo menos uma variação genética introduzida em pelo menos um gene, ou nucleotídeo não codificador, da rede regulatória genética de assimilação ou de fixação de nitrogênio que resulta em um ou mais de aumento de expressão ou atividade de NifA ou glutaminase; diminuição de expressão ou atividade de NifL, NtrB, glutamina sintetase, GlnB, GlnK, DraT, AmtB; diminuição de atividade de remoção de adenilila de GlnE; ou diminuição de atividade de remoção de uridilila de GlnD.

Em aspectos, cada uma das uma ou mais bactérias isoladas compreende um gene nifL mutado que compreende um promotor heterólogo no dito gene nifL.

Em aspectos, cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada que carece de um domínio de remoção de adenilila (AR). Em aspectos, cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende um gene amtB mutado que resulta na carência de expressão do dito gene amtB.

Em aspectos, cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende pelo menos um de: um gene nifL mutado que compreende um promotor heterólogo no dito gene nifL; um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada que carece de um domínio de remoção de adenilila (AR); um gene amtB mutado que resulta na carência de expressão do dito gene amtB; e combinações dos mesmos.

Em aspectos, cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende um gene nifL mutado que compreende um promotor heterólogo no dito gene nifL e um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada que carece de um domínio de remoção de adenilila (AR). Em aspectos, cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende um gene nifL mutado que compreende um promotor heterólogo no dito gene nifL, um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada que carece de um domínio de remoção de adenilila (AR) e um gene amtB mutado que resulta na carência de expressão do dito gene amtB.

Em aspectos, cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende pelo menos uma variação genética introduzida em genes envolvida em uma via selecionada do grupo que consiste em: produção de exopolissacarídeo, produção de endo-poligalaturonase, produção de trealose e conversão de glutamina.

Em aspectos, cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende pelo menos uma variação genética introduzida em genes selecionada do grupo que consiste em: bcsii, bcsiii, yjbE, fhaB, pehA, otsB, treZ, glsA2, e combinações dos mesmos.

Em aspectos, a uma ou mais bactérias isoladas compreendem bactérias selecionadas de: uma bactéria depositada como NCMA 201701002, uma bactéria depositada como NCMA 201708004, uma bactéria depositada como NCMA 201708003, uma bactéria depositada como NCMA 201708002, uma bactéria depositada como NCMA 201712001, uma bactéria depositada como NCMA 201712002 e combinações das mesmas.

Em aspectos, a uma ou mais bactérias isoladas compreendem bactérias que compreendem uma sequência de ácidos nucleicos que compartilha pelo menos cerca de 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de ácidos nucleicos selecionada das SEQ ID NOs: 177-260, 296-303 e 458-469. Em aspectos, a uma ou mais bactérias isoladas compreendem bactérias que compreendem uma sequência de ácidos nucleicos selecionada das SEQ ID NOs: 177-260, 296-303 e 458-469.

[017] Em alguns aspectos, as composições da divulgação são sinérgicas, em que os elementos da composição levam à viabilidade microbiana que é mais do que a viabilidade aditiva que seria vista de cada componente individual da composição por si só.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[018] A Figura 1A representa uma visão geral do processo de remodelagem microbiana guiada, de acordo com as modalidades.

[019] A Figura 1B representa uma vista expandida da medição da composição do microbioma como mostrado na Figura 1A.

[020] A Figura 1C representa uma abordagem problemática de "bioprospecção tradicional", que tem várias desvantagens em comparação com a plataforma ensinada de remodelagem microbiana guiada (GMR).

[021] A Figura 1D representa uma abordagem problemática de "campo inicial", que tem várias desvantagens em comparação com a plataforma ensinada de remodelagem microbiana guiada (GMR).

[022] A Figura 1E representa o período de tempo no ciclo de crescimento do milho, em que o nitrogênio é mais necessário para a planta.

[023] A Figura 1F representa uma visão geral de um processo de desenvolvimento de campo para um micróbio remodelado.

[024] A Figura 1G representa uma visão geral de uma modalidade de plataforma de remodelagem microbiana guiada.

[025] A Figura 1H representa uma visão geral de uma plataforma de remodelagem microbiana guiada por computador.

[026] A Figura 1I representa o uso de dados de campo combinados com modelagem em aspectos da plataforma de remodelagem microbiana guiada.

[027] A Figura 1J representa 5 propriedades que podem ser possuídas por micróbios remodelados da presente divulgação.

[028] A Figura 1K representa um esquema de uma abordagem de remodelagem para um micróbio, PBC6.1.

[029] A Figura 1L representa a expressão de nifA desacoplada da regulação de nitrogênio endógeno em micróbios remodelados.

[030] A Figura 1M representa assimilação e excreção melhoradas de nitrogênio fixado por micróbios remodelados.

[031] A Figura 1N representa o aprimoramento do rendimento de milho atribuível a micróbios remodelados.

[032] A Figura 1O ilustra a ineficiência de sistemas de distribuição de nitrogênio atuais, que resultam em campos subfertilizados, campos superfertilizados e escoamento de nitrogênio prejudicial ao meio ambiente.

[033] A Figura 2A representa a estabilidade da formulação de 137-1036 após 1 semana de armazenamento a 25 °C.

[034] A Figura 2B representa a estabilidade da formulação de 137-1036 após 1 semana de armazenamento a 37 °C.

[035] A Figura 3A representa a estabilidade da formulação de 137-1036 após 2 semanas de armazenamento a 25 °C.

[036] A Figura 3B representa a estabilidade da formulação de 137-1036 após 2 semanas de armazenamento a 37 °C.

[037] A Figura 4A representa a estabilidade da formulação de 137-1034 após 1 semana de armazenamento a 25 °C.

[038] A Figura 4B representa a estabilidade da formulação de 137-1034 após 1 semana de armazenamento a 37 °C.

[039] A Figura 5A representa a estabilidade da formulação de 137-1034 após 2 semanas de armazenamento a 25 °C.

[040] A Figura 5B representa a estabilidade da formulação de 137-1034 após 2 semanas de armazenamento a 37 °C.

[041] A Figura 6A representa a estabilidade da formulação de 137-1036 que compreende biofilme e PVP-VA em armazenamento a 37 °C por 30 dias. A comparação da perda de viabilidade demonstra que, em qualquer concentração de biofilme, a adição de PVP-VA a 5% melhorou a perda de viabilidade em lata (menor perda logarítmica).

[042] A Figura 6B representa a estabilidade da formulação de 137-1036 que compreende biofilme e PVP-VA em armazenamento a 25 °C por 30 dias. A comparação de perda de viabilidade demonstra que em biofilme a 20% e 5%, a adição de PVP-VA a 5% melhorou a perda de viabilidade em lata (menor perda logarítmica), biofilme a 10% não foi conclusivo.

[043] A Figura 6C representa a estabilidade da formulação de 137-1034 que compreende biofilme e PVP-VA em armazenamento a 37 °C por 30 dias. A comparação da perda de viabilidade demonstra que, em qualquer concentração de biofilme, a adição de PVP-VA a 5% melhorou a perda de viabilidade em lata (menor perda logarítmica). Não houve benefício detectado a 25 °C

[044] A Figura 7A representa os resultados de um estudo de estabilidade da formulação de PVP-VA a 4 °C, que demonstrou uma resposta de estabilidade variável em diferentes germoplasmas de milho comerciais. Conforme ilustrado, algumas sementes de milho mantiveram a UFC/semente alvo por mais de 7 semanas, enquanto outras perdem a viabilidade mais rapidamente. A perda de viabilidade foi maior nas formulações sem PVP-VA e o impacto do PVP-VA foi dependente do tipo de semente.

[045] A Figura 7B representa os resultados de um estudo de estabilidade da formulação de PVP-VA a 10 °C, que demonstrou uma resposta de estabilidade variável em diferentes germoplasmas de milho comerciais. Conforme ilustrado, diferentes sementes híbridas apresentaram diferentes respostas de estabilidade a PVP-VA. Enquanto o PVP-VA teve um impacto positivo em todas as sementes, os impactos do PVP-VA sobre a estabilidade das sementes foram mais pronunciados para as sementes com impacto mais negativo sobre o micróbio. Sementes Channel > semente Heine > semente Golden Harvest

[046] A Figura 7C representa os resultados de um estudo de estabilidade da formulação de PVP-VA a 25 °C, que demonstrou que todas as células perderam a viabilidade em 1 semana, independentemente do germoplasma de milho comercial ou do tratamento com PVP-VA.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA DIVULGAÇÃO

[047] Embora várias modalidades da presente invenção tenham sido mostradas e descritas no presente documento, será óbvio para aqueles versados na técnica que tais modalidades são fornecidas apenas a título de exemplo.

Inúmeras variações, alterações, e substituições poderão ocorrer para aqueles versados na técnica sem que se afaste da divulgação. Deve ser entendido que várias alternativas às modalidades da divulgação descritas no presente documento podem ser empregadas.

[048] O aumento da utilização de fertilizantes traz consigo preocupações ambientais e também provavelmente não é possível para muitas regiões economicamente estressadas do mundo. Além disso, muitos operadores do setor no cenário microbiano estão focados na criação de micróbios intergenéricos. No entanto, há uma grande carga regulatória colocada sobre os micróbios geneticamente modificados que são caracterizados/classificados como intergenéricos. Esses micróbios intergenéricos enfrentam não só uma carga regulatória mais alta, o que torna difícil a adoção e implementação generalizadas, como também enfrentam um grande escrutínio da percepção pública.

[049] Atualmente, não há micróbios geneticamente modificados no mercado que sejam não intergenéricos e que sejam capazes de aumentar a fixação de nitrogênio em culturas não leguminosas. A escassez de tal micróbio é um elemento que falta para ajudar a conduzir um sistema agrícola do século XXI verdadeiramente ecológico e mais sustentável.

[050] A presente divulgação resolve os problemas supracitados e fornece um micróbio não-intergenérico que foi geneticamente modificado para fixar prontamente nitrogênio nas culturas. Esses micróbios não são caracterizados/classificados como micróbios intergenéricos e, portanto, não enfrentarão as pesadas cargas regulatórias de tais. Além disso, os micróbios não intergenéricos ensinados servirão para ajudar os agricultores do século XXI a se tornarem menos dependentes do uso de quantidades cada vez maiores de fertilizante de nitrogênio exógeno.

DEFINIÇÕES

[051] O uso dos termos “um/uma”, “uns/umas”, “o/a” e “os/as” e referentes similares no contexto de descrever a divulgação (especialmente no contexto das reivindicações a seguir) deve ser interpretado para abranger tanto o singular quanto o plural, exceto onde indicado em contrário no presente documento ou em caso de contradição clara pelo contexto. Os termos "compreendendo", "tendo" "incluindo" e

"contendo" devem ser interpretados como termos não limitados (ou seja, que significa "incluindo, porém sem limitação") exceto onde especificado em contrário. A menção de faixas de valores no presente documento se destina meramente a servir como um método abreviado de referência individual a cada valor separado que está dentro da faixa, exceto onde indicado em contrário no presente documento, e cada valor separado é incorporado no relatório descritivo como se fosse individualmente citado no presente documento. Por exemplo, se a faixa 10- 15 for divulgada, então 11, 12, 13 e 14 são também divulgados. Todos os métodos descritos no presente documento podem ser realizados em qualquer ordem adequada, exceto onde indicado em contrário no presente documento ou de outro modo claramente contradito pelo contexto. O uso de qualquer um e todos os exemplos, ou linguagem exemplificativa (por exemplo, "como") fornecido no presente documento se destina apenas a iluminar melhor a divulgação e não representa uma limitação no escopo da divulgação de outro modo reivindicada. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da divulgação.

[052] Os termos "polinucleotídeo", "nucleotídeo", “sequência de nucleotídeos” e "oligonucleotídeo" são usados de forma intercambiável. Os mesmos se referem a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, desoxirribonucleicos ou ribonucleotídeos ou análogos dos mesmos. Os polinucleotídeos podem ter qualquer estrutura tridimensional e podem executar qualquer função, conhecida ou desconhecida. A seguir, são exemplos não limitantes de polinucleotídeos: regiões codificantes ou não codificantes de um gene ou fragmento de gene, loci (locus), definidos a partir da análise de ligação, éxons, íntrons, RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência (tRNA), RNA ribossômico (rRNA), RNA de interferência curto (siRNA), RNA em formato de grampo curto (shRNA), micro-RNA (miRNA), ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico e iniciadores. Um polinucleotídeo pode compreender um ou mais nucleotídeos modificados, como nucleotídeos metilados e os análogos de nucleotídeos. Se presentes, modificações na estrutura de nucleotídeos podem ser conferidas, antes ou após a montagem do polímero. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídeos. Um polinucleotídeo pode ser ainda modificado após a polimerização, como por conjugação com uma componente de identificação.

[053] "Hibridização" se refere a uma reação na qual um ou mais polinucleotídeos reagem para formar um complexo que é estabilizado por ligação de hidrogênio entre as bases dos resíduos de nucleotídeos. A ligação de hidrogênio pode ocorrer por pareamento de bases de Watson Crick, ligação de Hoogstein ou de qualquer outra maneira específica de sequência de acordo com a complementaridade de base. O complexo pode compreender duas fitas formando uma estrutura duplex, três ou mais fitas formando um complexo de múltiplas fitas, uma única fita auto-hibridizante ou qualquer combinação dessas. Uma reação de hibridização pode constituir uma etapa de um processo mais extenso, como a iniciação de PCR ou a clivagem enzimática de um polinucleotídeo por uma endonuclease. Uma segunda sequência que é complementar a uma primeira sequência é chamada de "complemento" da primeira sequência. O termo "hibridizável", conforme aplicado a um polinucleotídeo, se refere à capacidade do polinucleotídeo de formar um complexo que é estabilizado por ligação de hidrogênio entre as bases dos resíduos de nucleotídeo em uma reação de hibridização.

[054] Como usado no presente documento, "biofilme" ou "biofilme maduro" se refere a células microbianas associadas e/ou acumuladas e/ou agregadas, seus produtos (por exemplo, substâncias exopoliméricas) e partículas inorgânicas aderentes a uma superfície viva ou inerte.

[055] Como usado no presente documento, "polímero" ou "substância polimérica" se refere a um composto químico ou mistura de compostos formados por polimerização/copolimerização e compreendendo unidades estruturais de repetição. O termo "polímero" é entendido como abrangendo um polímero que compreende unidades de repetição do mesmo monômero e um polímero que compreende unidades de repetição de dois ou mais tipos diferentes de monômeros (copolímero).

[056] Como usado no presente documento, um polímero “substancialmente isento de solvente” contém menos que cerca de 1000 partes por milhão de solvente.

[057] Conforme usado no presente documento, ‘perda logarítmica” é o log {UFC inicial/ml} - registro {UFC/ml após armazenamento}.

[058] "Complementaridade” se refere à capacidade de um ácido nucleico formar ligação (ou ligações) de hidrogênio com outra sequência de ácido nucleico por Watson-Crick tradicional ou outros tipos não tradicionais. Um porcentagem de complementaridade indica a percentagem de resíduos contíguos de uma molécula de ácido nucleico que pode formar ligações de hidrogênio (por exemplo, pareamento de bases de Watson-Crick) com uma segunda sequência de ácidos nucleicos (por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9,10 de 10 sendo 50%, 60%, 70%, 80%, 90% e 100% complementar, respectivamente). "Perfeitamente complementar" significa que todos os resíduos contíguos de uma sequência de ácidos nucleicos formarão uma ligação de hidrogênio com o mesmo número de resíduos contíguos em uma segunda sequência de ácidos nucleicos. "Substancialmente complementar", como usado no presente documento, se refere a um grau de complementaridade que é pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% sobre uma região de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais nucleotídeos, ou se refere a dois ácidos nucleicos que hibridizam sob condições estringentes. A identidade de sequência, como com o propósito de avaliar a porcentagem de complementaridade, pode ser medida por qualquer algoritmo de alinhamento adequado, incluindo, porém sem limitação, o algoritmo Needleman-Wunsch (consultar, por exemplo, o alinhador EMBOSS Needle disponível em www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html, opcionalmente com configurações padrão), o algoritmo BLAST (consultar, por exemplo, a ferramenta de alinhamento BLAST disponível em blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, opcionalmente com configurações padrão), ou o algoritmo Smith-Waterman (consultar, por exemplo, o alinhador EMBOSS Water disponível em www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html, opcionalmente com configurações padrão). O alinhamento ideal pode ser avaliado usando quaisquer parâmetros adequados de um algoritmo escolhido, incluindo parâmetros padrão.

[059] Em geral, "condições estringentes" para hibridização se referem a condições sob as quais um ácido nucleico com complementaridade a uma sequência alvo hibridiza predominantemente com uma sequência alvo e substancialmente não hibridiza com sequências não alvo. As condições estringentes geralmente dependem da sequência e variam dependendo de vários fatores. Em geral, quanto mais longa a sequência, mais alta é a temperatura à qual a sequência hibridiza especificamente com sua sequência alvo. Exemplos não limitantes de condições estringentes são descritos em detalhes em Tijssen (1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I, Segundo Capítulo “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay”, Elsevier, N.Y.

[060] Como usado no presente documento, "expressão" se refere ao processo pelo qual um polinucleotídeo é transcrito a partir de um modelo de DNA (como em e mRNA ou outro transcrito de RNA) e/ou o processo pelo qual um mRNA transcrito é subsequentemente traduzido em peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. Os transcritos e os polipeptídeos codificados são coletivamente chamados de “produto de gene”. Se o polinucleotídeo for derivado de DNA genômico, a expressão pode incluir o splicing do mRNA em uma célula eucariótica.

[061] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo", e "proteína" são usados de forma intercambiável no presente documento para se referir aos polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. Os polímeros podem ser lineares ou ramificados, podem compreender aminoácidos modificados, e podem ser interrompidos por não aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de aminoácido que foi modificado; por exemplo, pela formação da ligação de dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação, como conjugação com um componente de identificação. Como usado no presente documento, o termo "aminoácido" inclui aminoácidos naturais e/ou não naturais ou sintéticos, incluindo glicina e isômeros ópticos D ou L e os análogos dos aminoácidos e peptidomiméticos.

[062] Como usado no presente documento, o termo "cerca de" é usado como um sinônimo com o termo "aproximadamente." Ilustrativamente, o uso do termo "cerca de" em relação a uma quantidade indica que valores ligeiramente fora dos valores citados, por exemplo, mais ou menos 0,1% a 10%.

[063] O termo "cultura biologicamente pura" ou "cultura substancialmente pura" se refere a uma cultura de uma espécie bacteriana descrita no presente documento não contendo nenhuma outra espécie bacteriana em quantidades suficientes para interferir na replicação da cultura ou ser detectada por técnicas bacteriológicas normais.

[064] “Produtividade da planta” se refere, em geral, a qualquer aspecto de crescimento ou desenvolvimento de uma planta que seja a razão pela qual a planta é cultivada. Para culturas de alimentos, como grãos ou vegetais, “produtividade vegetal” pode se referir ao rendimento de grãos ou frutos colhidos de uma cultura específica. Como usado no presente documento, a produtividade da planta melhorada se refere amplamente a melhorias no rendimento de grãos, frutos, flores ou outras partes da planta colhidas com vários propósitos, melhorias no crescimento das partes da planta, incluindo talos, folhas e raízes, promoção do crescimento da planta, manutenção de alto teor de clorofila nas folhas, aumento do número de frutos ou sementes, aumento do peso da unidade de frutos ou sementes, redução da emissão de NO2 devido ao uso reduzido de fertilizantes de nitrogênio e melhorias similares no crescimento e desenvolvimento das plantas.

[065] Micróbios dentro e ao redor das culturas de alimentos podem influenciar os traços dessas culturas. Os traços de plantas que podem ser influenciadas por micróbios incluem: rendimento (por exemplo, produção de grãos, geração de biomassa, desenvolvimento de frutos, floração); nutrição (por exemplo, nitrogênio, fósforo, potássio, ferro, aquisição de micronutrientes); gerenciamento de estresse abiótico (por exemplo, tolerância à seca, tolerância ao sal, tolerância ao calor); e gerenciamento de estresse biótico (por exemplo, pragas, ervas daninhas, insetos, fungos e bactérias). As estratégias para alterar os traços da cultura incluem: aumentar as concentrações de metabólitos principais; alteração da dinâmica temporal da influência do micróbio nos principais metabólitos; ligar a produção/degradação de metabólitos microbianos a novos estímulos ambientais; reduzir metabólitos negativos; e melhorar o equilíbrio de metabólitos ou proteínas subjacentes.

[066] Conforme usado no presente documento, uma "sequência de controle" se refere a um operador, promotor, silenciador ou terminador.

[067] Conforme usado no presente documento, "in planta" pode se referir a na planta, sobre a planta ou intimamente associado à planta, dependendo do contexto de uso (por exemplo, associações endofíticas, epifíticas ou rizosféricas). A planta pode compreender partes da planta, tecido, folhas, raízes, pelos da raiz, rizomas, talos, sementes, óvulos, pólen, flores, frutos, etc.

[068] Em algumas modalidades, as sequências de controle nativas ou endógenas de genes da presente divulgação são substituídas por uma ou mais sequências de controle intragenéricas.

[069] Conforme usado no presente documento, "introduzido" se refere à introdução por meio de biotecnologia moderna, e não uma introdução de ocorrência natural.

[070] Em algumas modalidades, as bactérias da presente divulgação foram modificadas de modo que não sejam bactérias de ocorrência natural.

[071] Em algumas modalidades, as bactérias da presente divulgação estão presentes na planta em uma quantidade de pelo menos 10 3 ufc, 104 ufc, 105 ufc, 106 ufc, 107 ufc, 108 ufc, 109 ufc, 1010 ufc, 1011 ufc ou 1012 ufc por grama de peso fresco ou seco da planta. Em algumas modalidades, as bactérias da presente divulgação estão presentes na planta em uma quantidade de pelo menos cerca de 103 ufc, cerca de 104 ufc, cerca de 105 ufc, cerca de 106 ufc, cerca de 107 ufc, cerca de 108 ufc, cerca de 109 ufc, cerca de 1010 ufc, cerca de 1011 ufc ou cerca de 1012 ufc por grama de peso fresco ou seco da planta. Em algumas modalidades, as bactérias da presente divulgação estão presentes na planta em uma quantidade de pelo menos 103 a 109, 103 a 107, 103 a 105, 105 a 109, 105 a 107, 106 a 1010, 106 a 107 ufc por grama de peso fresco ou seco da planta.

[072] Fertilizantes e nitrogênio exógeno da presente divulgação podem compreender as seguintes moléculas contendo nitrogênio: amônio, nitrato, nitrito, amônia, glutamina, etc. As fontes de nitrogênio da presente divulgação podem incluir amônia anidra, sulfato de amônia, ureia, fosfato de diamônio, forma de ureia, fosfato de monoamônio, nitrato de amônio, soluções de nitrogênio, nitrato de cálcio, nitrato de potássio, nitrato de sódio, etc.

[073] Conforme usado no presente documento, "nitrogênio exógeno" se refere a nitrogênio não atmosférico prontamente disponível no solo, campo ou meio de crescimento que está presente sob condições não limitantes de nitrogênio,

incluindo amônia, amônio, nitrato, nitrito, ureia, ácido úrico, ácidos de amônio, etc.

[074] Como usado no presente documento, "condições não limitantes de nitrogênio" se refere ao nitrogênio não atmosférico disponível no solo, campo, meio em concentrações maiores que cerca de 4 mM de nitrogênio, conforme divulgado por Kant et al. (2010. J. Exp. Biol. 62(4):1499-1509), que está incorporado ao presente documento a título de referência.

[075] Conforme usado no presente documento, um "microrganismo intergenérico" é um microrganismo que é formado pela combinação deliberada de material genético originalmente isolado de organismos de gêneros taxonômicos diferentes. Um "mutante intergenérico" pode ser usado de forma intercambiável com "microrganismo intergenérico". Um exemplo de "microrganismo intergenérico" inclui um microrganismo contendo um elemento genético móvel que foi identificado pela primeira vez em um microrganismo em um gênero diferente do microrganismo receptor. Explicações adicionais podem ser encontradas, inter alia, em 40 CFR §

725.3.

[076] Em aspectos, os micróbios ensinados no presente documento são "não intergenéricos", o que significa que os micróbios não são intergenéricos.

[077] Conforme usado no presente documento, um "microrganismo intragenérico" é um microrganismo que é formado pela combinação deliberada de material genético originalmente isolado de organismos dos mesmos gêneros taxonômicos. Um "mutante intragenérico" pode ser usado de forma intercambiável com "microrganismo intragenérico".

[078] Conforme usado no presente documento, "material genético introduzido" significa material genético que é adicionado e permanece como um componente do genoma do receptor.

[079] Conforme usado no presente documento, no contexto de microrganismos não intergenéricos, o termo "remodelado" é usado como sinônimo do termo "geneticamente modificado". Consequentemente, um "microrganismo remodelado não intergenérico" tem um significado sinônimo para "microrganismo geneticamente modificado não intergenérico" e será utilizado de forma intercambiável. Além disso, a divulgação pode se referir a uma "cepa geneticamente modificada" ou "derivado geneticamente modificado" ou "micróbio não intergenérico geneticamente modificado", esses termos são usados como sinônimos de "cepa remodelada" ou "derivado remodelado" ou "micróbio não intergenérico remodelado".

[080] Em algumas modalidades, a rede regulatória genética de assimilação e de fixação de nitrogênio compreende polinucleotídeos que codificam genes e sequências não codificantes que direcionam, modulam e/ou regulam a fixação e/ou assimilação de nitrogênio microbiano e pode compreender sequências polinucleotídicas do aglomerado nif (por exemplo, nifA, nifB, nifC, ......nifZ), polinucleotídeos que codificam a proteína C reguladora de nitrogênio, polinucleotídeos que codificam a proteína B reguladora de nitrogênio, sequências polinucleotídicas do aglomerado gln (por exemplo glnA e glnD), draT, e transportadores/permeases de amônia. Em alguns casos, o aglomerado Nif pode compreender NifB, NifH, NifD, NifK, NifE, NifN, NifX, hesa e NifV. Em alguns casos, o aglomerado Nif pode compreender um subconjunto de NifB, NifH, NifD, NifK, NifE, NifN, NifX, hesa e NifV.

[081] Em algumas modalidades, o fertilizante da presente divulgação compreende pelo menos 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de nitrogênio em peso.

[082] Em algumas modalidades, o fertilizante da presente divulgação compreende pelo menos cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 17%, cerca de 18%, cerca de 19%, cerca de 20%, cerca de 21%, cerca de 22%, cerca de 23%, cerca de 24%, cerca de 25%, cerca de 26%, cerca de 27%, cerca de 28%, cerca de 29%, cerca de 30%, cerca de 31%, cerca de 32%, cerca de 33%, cerca de 34%, cerca de 35%, cerca de 36%, cerca de 37%, cerca de 38%, cerca de 39%, cerca de 40%, cerca de 41%,

cerca de 42%, cerca de 43%, cerca de 44%, cerca de 45%, cerca de 46%, cerca de 47%, cerca de 48%, cerca de 49%, cerca de 50%, cerca de 51%, cerca de 52%, cerca de 53%, cerca de 54%, cerca de 55%, cerca de 56%, cerca de 57%, cerca de 58%, cerca de 59%, cerca de 60%, cerca de 61%, cerca de 62%, cerca de 63%, cerca de 64%, cerca de 65%, cerca de 66%, cerca de 67%, cerca de 68%, cerca de 69%, cerca de 70%, cerca de 71%, cerca de 72%, cerca de 73%, cerca de 74%, cerca de 75%, cerca de 76%, cerca de 77%, cerca de 78%, cerca de 79%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, ou cerca de 99% de nitrogênio em peso.

[083] Em algumas modalidades, o fertilizante da presente divulgação compreende cerca de 5% a 50%, cerca de 5% a 75%, cerca de 10% a 50%, cerca de 10% a 75%, cerca de 15% a 50%, cerca de 15% a 75%, cerca de 20% a 50%, cerca de 20% a 75%, cerca de 25% a 50%, cerca de 25% a 75%, cerca de 30% a 50%, cerca de 30% a 75%, cerca de 35% a 50%, cerca de 35% a 75%, cerca de 40% a 50%, cerca de 40% a 75%, cerca de 45% a 50%, cerca de 45% a 75%, ou cerca de 50% a 75% de nitrogênio em peso.

[084] Em algumas modalidades, o aumento da fixação de nitrogênio e/ou a produção de 1% ou mais do nitrogênio na planta são medidos em relação às plantas de controle, que não foram expostas às bactérias da presente divulgação. Todos os aumentos ou diminuições nas bactérias são medidos em relação às bactérias de controle. Todos os aumentos ou diminuições nas plantas são medidos em relação às plantas de controle.

[085] Conforme usado no presente documento, um "promotor constitutivo" é um promotor, que é ativo na maioria das condições e/ou durante a maioria dos estágios de desenvolvimento. Existem várias vantagens no uso de promotores constitutivos em vetores de expressão usados em biotecnologia, como: alto nível de produção de proteínas usadas para selecionar células ou organismos transgênicos; alto nível de expressão de proteínas repórter ou marcadores classificáveis, permitindo fácil detecção e quantificação; alto nível de produção de um fator de transcrição que faz parte de um sistema de transcrição regulatório;

produção de compostos que exigem atividade onipresente no organismo; e produção de compostos que são necessários durante todos os estágios de desenvolvimento. Promotores constitutivos exemplificativos não limitantes incluem, promotor CaMV 35S, promotores de opina, promotor de ubiquitina, promotor de álcool desidrogenase, etc.

[086] Conforme usado no presente documento, um "promotor não constitutivo" é um promotor que é ativo sob certas condições, em certos tipos de células e/ou durante certos estágios de desenvolvimento. Por exemplo, promotores induzíveis específicos para tecido, preferidos para tecido, preferido para tipo celular e promotores sob controle de desenvolvimento são promotores não constitutivos. Exemplos de promotores sob controle de desenvolvimento incluem promotores que preferencialmente iniciam a transcrição em certos tecidos.

[087] Conforme usado no presente documento, o promotor "induzível" ou "reprimível" é um promotor que está sob controle de fatores químicos ou ambientais. Exemplos de condições ambientais que podem afetar a transcrição por promotores induzíveis incluem condições anaeróbicas, certos produtos químicos, a presença de luz, condições ácidas ou básicas, etc.

[088] Como usado no presente documento, um promotor "específico para tecido" é um promotor que inicia a transcrição apenas em certos tecidos. Ao contrário da expressão constitutiva de genes, a expressão específica para tecido é o resultado de vários níveis de interação de regulação gênica. Como tal, na técnica às vezes é preferível usar promotores de espécies homólogas ou intimamente relacionadas para alcançar a expressão eficiente e confiável de transgenes em tecidos específicos. Essa é uma das principais razões para a grande quantidade de promotores específicos para tecido isolados de tecidos específicos encontrados na literatura científica e de patentes.

[089] Conforme usado no presente documento, o termo "operavelmente ligado" se refere à associação de sequências de ácidos nucleicos em um único fragmento de ácido nucleico de modo que a função de um seja regulada pelo outro. Por exemplo, um promotor está operavelmente ligado a uma sequência de codificação quando écapaz de regular a expressão dessa sequência de codificação (isto é, a sequência de codificação que está sob o controle transcricional do promotor). As sequências de codificação podem ser operavelmente ligadas a sequências regulatórias em uma orientação senso ou antissenso. Em outro exemplo, as regiões de RNA complementares da divulgação podem ser operavelmente ligadas, direta ou indiretamente, 5′ em relação ao mRNA alvo, ou 3′ em relação ao mRNA alvo, ou dentro do mRNA alvo, ou uma primeira região complementar é 5′ e seu complemento é 3’ em relação ao mRNA alvo.

[090] Em aspectos “aplicar à planta uma pluralidade de bactérias não- intergenéricas” inclui quaisquer meios pelos quais a planta (incluindo partes de plantas, como uma semente, raiz, talo, tecido, etc.) é colocada em contato (ou seja, exposta) com a dita bactéria em qualquer estágio do ciclo de vida da planta. Consequentemente, "aplicar à planta uma pluralidade de bactérias não intergenéricas" inclui qualquer um dos seguintes meios de expor a planta (incluindo partes da planta, como uma semente, raiz, talo, tecido, etc.) às ditas bactérias: pulverizar sobre a planta, gotejar sobre a planta, aplicar como um revestimento das sementes, aplicar a um campo que então será plantado com sementes, aplicar a um campo já plantado com sementes, aplicar a um campo com plantas adultas, etc.

[091] Como usado no presente documento, "MRTN" é um acrônimo para máximo retorno ao nitrogênio e é utilizado como um tratamento experimental nos Exemplos. MRTN foi desenvolvido pela Iowa State University e as informações podem ser encontradas em: //cnrc.agron.iastate.edu/ O MRTN é a taxa de nitrogênio em que o retorno líquido econômico para a aplicação de nitrogênio é maximizado. A abordagem para calcular o MRTN é uma abordagem regional para o desenvolvimento de diretrizes para a taxa de nitrogênio do milho em estados individuais. Os dados do teste de taxa de nitrogênio foram avaliados para Illinois, Iowa, Michigan, Minnesota, Ohio e Wisconsin, em que um número adequado de testes de pesquisa estava disponível para plantações de milho após plantações de soja e milho após milho. Os testes foram conduzidos com mola, cobertura ou pré- plantio dividido/nitrogênio aplicado à cobertura e os locais não foram irrigados, exceto para aqueles que foram indicados para areias irrigadas em Wisconsin. MRTN foi desenvolvido pela Iowa State University devido a diferenças evidentes nos métodos para determinar as taxas de nitrogênio sugeridas necessárias para a produção de milho, percepções errôneas relativas às diretrizes de taxa de nitrogênio e preocupações sobre as taxas de aplicação. Calculando-se o MRTN, os profissionais podem determinar os seguintes: (1) a taxa de nitrogênio em que o retorno econômico líquido para a aplicação de nitrogênio é maximizado, (2) a taxa de nitrogênio econômica ideal, que é o ponto em que o último incremento de nitrogênio retorna um grande aumento de rendimento o suficiente para pagar pelo nitrogênio adicional, (3) o valor do aumento de grãos de milho atribuído à aplicação de nitrogênio e o rendimento máximo, que é o rendimento em que a aplicação de mais nitrogênio não resulta em um aumento no rendimento do milho. Dessa forma, os cálculos de MRTN fornecem aos profissionais os meios para maximizar as culturas de milho em diferentes regiões enquanto maximizam os ganhos financeiros das aplicações de nitrogênio.

[092] O termo mmol é uma abreviatura para milimol, que é um milésimo (10−3) de um mol, abreviado no presente documento como mol.

[093] Conforme usado no presente documento, os termos "microrganismo" ou "micróbio" devem ser considerados de forma ampla. Esses termos, usados de forma intercambiável, incluem, porém sem limitação, os dois domínios procarióticos, Bacteria e Archaea. O termo pode também abranger fungos eucarióticos e protistas.

[094] O termo "consórcios microbianos" ou "consórcio microbiano" se refere a um subconjunto de uma comunidade microbiana de espécies microbianas individuais, ou cepas de uma espécie, que podem ser descritas como realizando uma função comum, ou podem ser descritas como participantes, ou levando a, ou se correlacionando com, um parâmetro reconhecível, como um traço fenotípico de interesse.

[095] O termo "comunidade microbiana" significa um grupo de micróbios que compreende duas ou mais espécies ou cepas. Ao contrário dos consórcios microbianos, uma comunidade microbiana não precisa estar realizando uma função comum, ou não precisa estar participando, ou levando a, ou se correlacionando com, um parâmetro reconhecível, como um traço fenotípico de interesse.

[096] Como usado no presente documento, "isolar", "isolado", "micróbio isolado" e termos similares pretendem significar que o um ou mais microrganismos foram separados de pelo menos um dos materiais aos quais está associado em um ambiente específico (por exemplo, solo, água, tecido vegetal, etc.). Dessa forma, um “micróbio isolado” não existe em seu ambiente de ocorrência natural; em vez disso, é através das várias técnicas descritas no presente documento que o micróbio foi removido de seu ambiente natural e colocado em um estado de existência de ocorrência não natural. Dessa forma, a cepa isolada ou micróbio isolado pode existir como, por exemplo, uma cultura biologicamente pura, ou como esporos (ou outras formas da cepa). Em aspectos, o micróbio isolado pode estar em associação a um carreador aceitável, que pode ser um carreador agricolamente aceitável.

[097] Em certos aspectos da divulgação, os micróbios isolados existem como "culturas isoladas e biologicamente puras". Será entendido por um versado na técnica, que uma cultura isolada e biologicamente pura de um micróbio específico, denota que a dita cultura é substancialmente isenta de outros organismos vivos e contém apenas o micróbio individual em questão. A cultura pode conter concentrações variáveis do dito micróbio. A presente divulgação observa que micróbios isolados e biologicamente puros frequentemente "diferem necessariamente de materiais menos puros ou impuros". Consultar, por exemplo, In re Bergstrom, 427 F.2d 1394, (CCPA 1970) (que discute prostaglandinas purificadas), consultar também, In re Bergy, 596 F.2d 952 (CCPA 1979) (que discute micróbios purificados), consultar também, Parke- Davis& Co. v. HK Mulford & Co. , 189 F. 95 (SDNY 1911) (Learned Hand que discute adrenalina purificada), publicado em parte, revisado em parte, 196 F. 496 (2d Cir. 1912), cada um dos quais está incorporado ao presente documento a título de referência. Além disso, em alguns aspectos, a divulgação fornece certas medidas quantitativas da concentração, ou limitações de pureza, que devem ser encontradas dentro de uma cultura microbiana isolada e biologicamente pura. A presença desses valores de pureza, em certas modalidades, é um atributo adicional que distingue os micróbios presentemente divulgados daqueles micróbios existentes em um estado natural. Consultar, por exemplo, Merck& Co. v. Olin Mathieson Chemical Corp., 253 F.2d 156 (4ºCir. 1958) (que discute as limitações de pureza da vitamina B12 produzida por micróbios), incorporado ao presente documento a título de referência.

[098] Conforme usado no presente documento, "isolados individuais"

devem ser entendidos como significando uma composição, ou cultura, compreendendo uma predominância de um único gênero, espécie ou cepa de microrganismo, após a separação de um ou mais outros microrganismos.

[099] Os micróbios da presente divulgação podem incluir esporos e/ou células vegetativas. Em algumas modalidades, os micróbios da presente divulgação incluem micróbios em um estado viável, mas não cultivável (VBNC). Como usado no presente documento, "esporo" ou "esporos" se referem a estruturas produzidas por bactérias e fungos que são adaptados para sobrevivência e dispersão. Os esporos são geralmente caracterizados como estruturas dormentes; no entanto, os esporos têm capacidade de diferenciação através do processo de germinação. A germinação é a diferenciação de esporos em células vegetativas que têm capacidade de atividade metabólica, crescimento e reprodução. A germinação de um único esporo resulta em uma única célula vegetativa fúngica ou bacteriana. Os esporos fúngicos são unidades de reprodução assexuada e, em alguns casos, são estruturas necessárias nos ciclos de vida dos fungos. Os esporos bacterianos são estruturas para condições de sobrevivência que podem normalmente não ser conducentes à sobrevivência ou ao crescimento das células vegetativas.

[100] Conforme usado no presente documento, "composição microbiana" se refere a uma composição que compreende um ou mais micróbios da presente divulgação. Em algumas modalidades, uma composição microbiana é administrada às plantas (incluindo várias partes da planta) e/ou em campos agrícolas.

[101] Conforme usado no presente documento, "carreador", "carreador aceitável" ou "carreador agricolamente aceitável" se refere a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual o micróbio pode ser administrado, o que não afeta negativamente o micróbio.

REGULAÇÃO DA FIXAÇÃO DE NITROGÊNIO

[102] Em alguns casos, a via de fixação de nitrogênio pode atuar como um alvo para engenharia genética e otimização. Um traço que pode ser alvejado para regulação pelos métodos descritos no presente documento é a fixação de nitrogênio. O fertilizante de nitrogênio é a maior despesa operacional em uma fazenda e o maior impulsionador de maiores rendimentos em culturas como milho e trigo. São descritos no presente documento produtos microbianos que podem fornecer formas renováveis de nitrogênio em culturas não leguminosas. Embora alguns endófitos tenham a genética necessária para fixar nitrogênio em cultura pura, o desafio técnico fundamental é que os endófitos de tipo selvagem de cereais e gramíneas param de fixar nitrogênio em campos fertilizados. A aplicação de fertilizantes químicos e os níveis de nitrogênio residual em solos de campo sinalizam ao micróbio para desativar a via bioquímica para a fixação de nitrogênio.

[103] Mudanças nos níveis de transcrição e pós-tradução de componentes da rede regulatória de fixação de nitrogênio podem ser benéficas para o desenvolvimento de um micróbio com capacidade de fixar e transferir nitrogênio para o milho na presença de fertilizante. Com essa finalidade, é descrita no presente documento a tecnologia Host-Microbe Evolution (HoME) para desenvolver redes regulatórias com precisão e obter fenótipos inovadores. Também são descritas no presente documento bibliotecas exclusivas e proprietárias de endófitos fixadores de nitrogênio isolados de milho, pareadas com dados ômicos extensos em torno da interação de micróbios e planta hospedeira sob diferentes condições ambientais, como estresse e excesso de nitrogênio. Em algumas modalidades, essa tecnologia permite a evolução precisa da rede regulatória genética de endófitos para produzir micróbios que fixam nitrogênio ativamente, mesmo na presença de fertilizante no campo. Também são descritas no presente documento avaliações do potencial técnico de micróbios em evolução que colonizam os tecidos da raiz do milho e produzem nitrogênio para plantas fertilizadas e avaliações da compatibilidade de endófitos com práticas de formulação padrão e solos diversos para determinar a viabilidade de integrar os micróbios em estratégias modernas de gerenciamento de nitrogênio.

[104] Para utilizar o nitrogênio elementar (N) para a síntese química, as formas de vida combinam o gás nitrogênio (N2) disponível na atmosfera com o hidrogênio em um processo conhecido como fixação de nitrogênio. Devido à natureza intensiva de energia de fixação biológica de nitrogênio, os diazotróficos (bactérias e arqueias que fixam o gás nitrogênio atmosférico) desenvolveram uma regulação sofisticada e rigorosa do aglomerado de genes nif em resposta ao oxigênio ambiental e ao nitrogênio disponível. Os genesnif codificam enzimas envolvidas na fixação de nitrogênio (como o complexo nitrogenase) e proteínas que regulam a fixação de nitrogênio. Shamseldin (2013. Global J. Biotechnol. Biochem. 8(4):84-94) divulga descrições detalhadas de genes nif e seus produtos, e está incorporado ao presente documento a título de referência. São descritos no presente documento métodos de produção de uma planta com um traço melhorado que compreende isolar bactérias de uma primeira planta, introduzir uma variação genética em um gene das bactérias isoladas para aumentar a fixação de nitrogênio, expor uma segunda planta às bactérias variantes, isolar bactérias da segunda planta que tem um traço melhorado em relação à primeira planta e repetir as etapas com bactérias isoladas da segunda planta.

[105] Em Proteobacteria, a regulação da fixação de nitrogênio se concentra na proteína NifA de ligação ao intensificador dependente de σ 54, o regulador transcricional positivo do aglomerado nif. Os níveis intracelulares de NifA ativo são controlados por dois fatores principais: transcrição do operon nifLA e inibição da atividade de NifA pela interação proteína-proteína com NifL. Ambos os processos são responsivos aos níveis intracelulares de glutamina via cascata de sinalização da proteína PII. Essa cascata é mediada por GlnD, que detecta diretamente a glutamina e catalisa a uridililação ou desuridililação de duas proteínas regulatórias PII - GlnB e GlnK - em resposta à ausência ou presença, respectivamente, de glutamina ligada. Em condições de excesso de nitrogênio, o GlnB não modificado sinaliza a desativação do promotor nifLA. No entanto, sob condições de limitação de nitrogênio, o GlnB é modificado pós-tradução, o que inibe sua atividade e leva à transcrição do operon nifLA. Dessa forma, a transcrição de nifLA é rigidamente controlada em resposta ao nitrogênio ambiental por meio da cascata de sinalização da proteína PII. No nível pós-tradução da regulação de NifA, GlnK inibe a interação NifL/NifA em uma questão dependente do nível geral de GlnK livre dentro da célula.

[106] O NifA é transcrito a partir do operon nifLA, cujo promotor é ativado pelo NtrC fosforilado, outro regulador dependente de σ 54. O estado de fosforilação de NtrC é mediado pela histidina quinase NtrB, que interage com o GlnB desuridililado, mas não com o GlnB uridililado. Sob condições de excesso de nitrogênio, um alto nível intracelular de glutamina leva à desuridililação de GlnB, que então interage com NtrB para desativar sua atividade de fosforilação e ativar sua atividade de fosfatase, resultando na desfosforilação de NtrC e na desativação do promotor nifLA. No entanto, sob condições de limitação de nitrogênio, um baixo nível de glutamina intracelular resulta na uridililação de GlnB, que inibe sua interação com NtrB e permite a fosforilação de NtrC e a transcrição do operon nifLA. Desta forma, a expressão de nifLA é rigidamente controlada em resposta ao nitrogênio ambiental via a cascata de sinalização da proteína PII. nifA, ntrB, ntrC e glnB, são todos genes que podem ser mutados nos métodos descritos no presente documento. Esses processos podem também ser responsivos a níveis intracelulares ou extracelulares de amônia, ureia ou nitratos.

[107] A atividade de NifA também é regulada pós-traducionalmente em resposta ao nitrogênio ambiental, mais tipicamente por meio da inibição da atividade de NifA mediada por NifL. Em geral, a interação de NifL e NifA é influenciada pela cascata de sinalização da proteína PII via GlnK, embora a natureza das interações entre GlnK e NifL/NifA varie significativamente entre os diazotróficos. Na Klebsiella pneumoniae, ambas as formas de GlnK inibem a interação de NifL/NifA, e a interação entre GlnK e NifL/NifA édeterminada pelo nível geral de GlnK livre dentro da célula. Sob condições de excesso de nitrogênio, o GlnK desuridililado interage com o transportador de amônio AmtB, que serve tanto para bloquear a absorção de amônio pelo AmtB quanto para sequestrar o GlnK para a membrana, permitindo a inibição de NifA por NifL. Por outro lado, em Azotobacter vinelandii, a interação com GlnK desuridililado é necessária para a interação de NifL/NifA e inibição de NifA, enquanto a uridililação de GlnK inibe sua interação com NifL. Em diazotróficos sem o gene nifL, há evidências de que a atividade de NifA é inibida diretamente pela interação com as formas desuridililadas de GlnK e GlnB sob condições de excesso de nitrogênio. Em algumas bactérias, o aglomerado de Nif pode ser regulado por glnRe, além disso, em alguns casos, isso pode compreender uma regulação negativa. Independentemente do mecanismo, a inibição pós-traducional de NifA é um importante regulador do aglomerado de nif na maioria dos diazotróficos conhecidos. Além disso, nifL, amtB, glnK e glnR são genes que podem ser mutados nos métodos descritos no presente documento.

[108] Além de regular a transcrição do aglomerado de genes nif, muitos diazotróficos desenvolveram um mecanismo para a modificação pós-traducional direta e inibição da própria enzima nitrogenase, conhecido como desligamento da nitrogenase. Isso é mediado por ribosilação de ADP da proteína Fe (NifH) sob condições de excesso de nitrogênio, o que interrompe sua interação com o complexo proteico MoFe (NifDK) e suprime a atividade da nitrogenase. DraT catalisa a ribosilação de ADPda proteína Fe e desligamento da nitrogenase, enquanto DraG catalisa a remoção de ADP-ribose e reativação da nitrogenase. Conforme com a transcrição de nifLA e a inibição de NifA, o desligamento da nitrogenase também é regulado via a cascata de sinalização da proteína PII. Sob condições de excesso de nitrogênio, o GlnB desuridililado interage e ativa DraT, enquanto o GlnK desuridililado interage tanto com DraG quanto com AmtB para formar um complexo, sequestrando DraG para a membrana. Sob condições limitantes de nitrogênio, as formas uridililadas de GlnB e GlnK não interagem com DraT e DraG, respectivamente, levando à inativação de DraT e à difusão de DraG para a proteína Fe, em que remove a ADP-ribose e ativa a nitrogenase. Os métodos descritos no presente documento contemplam também a introdução de variação genética nos genes nifH, nifD, nifK e draT.

[109] Embora alguns endófitos tenham a capacidade de fixar nitrogênio in vitro, muitas vezes a genética é silenciada no campo por altos níveis de fertilizantes químicos exógenos. Pode-se desacoplar a detecção de nitrogênio exógeno da expressão da enzima nitrogenase para facilitar a fixação de nitrogênio baseada em campo. O aprimoramento da integralidade da atividade da nitrogenase ao longo do tempo serve ainda para aumentar a produção de nitrogênio para utilização pela cultura. Alvos específicos para variação genética para facilitar a fixação de nitrogênio baseada em campo usando os métodos descritos no presente documento incluem um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em nifA, nifL, ntrB, ntrC, gln A, glnB, glnK, draT, amtB, gln D, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB e nifQ.

[110] Um alvo adicional para variação genética para facilitar a fixação de nitrogênio baseada em campo usando os métodos descritos no presente documento é a proteína NifA. A proteína NifA é tipicamente o ativador para a expressão de genes de fixação de nitrogênio. O aumento da produção de NifA (constitutivamente ou durante a condição de alto teor de amônia) contorna a via nativa de detecção de amônia. Além disso, a redução da produção de proteínas NifL, um conhecido inibidor de NifA, também leva a um aumento do nível de NifA livremente ativo. Além disso, o aumento do nível de transcrição do operon nifAL (constitutivamente ou durante a condição de alto teor de amônia) também leva a um nível geral mais alto de proteínas NifA. O nível elevado de expressão de nifAL é alcançado alterando-se o próprio promotor ou reduzindo-se a expressão de NtrB (parte da cascata de sinalização de ntrB e ntrC que originalmente resultaria no desligamento do operon nifAL durante a condição de alto teor de nitrogênio). O alto nível de NifA obtido por esses ou quaisquer outros métodos descritos no presente documento aumenta a atividade de fixação de nitrogênio dos endófitos.

[111] Outro alvo para variação genética para facilitar a fixação de nitrogênio baseada em campo usando os métodos descritos no presente documento é a cascata de sinalização PII de GlnD/GlnB/GlnK. O nível de glutamina intracelular é detectado através da cascata de sinalização PII de GlnD/GlnB/GlnK. As mutações de sítio ativo em GlnD que suprimem a atividade de remoção de uridilila de GlnD interrompem a cascata de detecção de nitrogênio. Além disso, a redução da concentração de GlnB causa um curto-circuito na cascata de detecção de glutamina. Essas mutações “enganam” as células para que percebam um estado limitado de nitrogênio, aumentando assim o nível de atividade de fixação de nitrogênio. Esses processos podem também ser responsivos a níveis intracelulares ou extracelulares de amônia, ureia ou nitratos.

[112] A proteína amtB é também um alvo para variação genética de modo a facilitar a fixação de nitrogênio baseada em campo usando os métodos descritos no presente documento. A absorção de amônia do ambiente pode ser reduzida diminuindo-se o nível de expressão da proteína amtB. Sem amônia intracelular, o endófito não tem capacidade para detectar o alto nível de amônia, impedindo a regulação decrescente dos genes de fixação de nitrogênio. Qualquer amônia que consegue entrar no compartimento intracelular é convertida em glutamina. O nível de glutamina intracelular é o principal denominador de detecção de nitrogênio. A redução do nível de glutamina intracelular impede que as células detectem altos níveis de amônio no ambiente. Esse efeito pode ser alcançado aumentando-se o nível de expressão da glutaminase, uma enzima que converte a glutamina em glutamato. Além disso, a glutamina intracelular pode também ser reduzida pela diminuição da glutamina sintase (uma enzima que converte a amônia em glutamina). Em diazotróficos, a amônia fixada é rapidamente assimilada em glutamina e glutamato para ser usada em processos celulares. As interrupções na assimilação da amônia podem permitir o desvio do nitrogênio fixado para ser exportado da célula como amônia. A amônia fixada é predominantemente assimilada em glutamina pela glutamina sintetase (GS), codificada por glnA, e subsequentemente em glutamina pela glutamina oxoglutarato aminotransferase (GOGAT). Em alguns exemplos, glnS codifica uma glutamina sintetase. GS é regulado pós-traducionalmente por GS adenilil transferase (GlnE), uma enzima bifuncional codificada por glnE que catalisa tanto a adenililação quanto a desadenililação de GS por meio da atividade de sua adenilil-transferase (AT) e domínios de remoção de adenilila (AR), respectivamente. Sob condições limitantes de nitrogênio, glnA é expresso, e o domínio AR de GlnE desadinilila GS, permitindo que seja ativo. Sob condições de excesso de nitrogênio, a expressão de glnA é desligada e o domínio AT de GlnE é ativado alostericamente pela glutamina, causando a adenililação e desativação de GS.

[113] Além disso, o gene draT pode também ser um alvo para variação genética para facilitar a fixação de nitrogênio baseada em campo usando os métodos descritos no presente documento. Uma vez que as enzimas fixadoras de nitrogênio são produzidas pela célula, o desligamento da nitrogenase representa outro nível no qual a célula desregula a atividade de fixação sob condições de alto teor de nitrogênio. Esse desligamento pode ser removido diminuindo-se o nível de expressão de DraT.

[114] Métodos para conferir novos fenótipos microbianos podem ser realizados nos níveis transcricional, traducional e pós-traducional. O nível transcricional inclui alterações no promotor (como alteração da afinidade do fator sigma ou sítios de ligação para fatores de transcrição, incluindo deleção de todo ou uma porção do promotor) ou alteração dos terminadores e atenuadores da transcrição. O nível de tradução inclui alterações nos sítios de ligação ao ribossomo e a alteração dos sinais de degradação do mRNA. O nível pós-traducional inclui a mutação do sítio ativo de uma enzima e a alteração das interações proteína-

proteína. Essas mudanças podem ser alcançadas de várias maneiras. A redução do nível de expressão (ou supressão completa) pode ser alcançada trocando-se o sítio de ligação ao ribossomo nativo (RBS) ou promotor por outro com menor resistência/eficiência. Os sítios de início ATG podem ser trocados para um códon de início GTG, TTG ou CTG, o que resulta na redução da atividade traducional da região de codificação. A supressão completa da expressão pode ser por knockout (deleção) da região codificadora de um gene. O deslocamento do quadro de leitura aberto (ORF) provavelmente resultará em um códon de parada prematuro ao longo do ORF, criando assim um produto truncado não funcional. A inserção de códons de parada no quadro também criará de modo similar um produto truncado não funcional. A adição de uma etiqueta de degradação no N ou C terminal pode também ser feita para reduzir a concentração eficaz de um gene específico.

[115] Por outro lado, o nível de expressão dos genes descritos no presente documento pode ser alcançado usando um promotor mais forte. Para garantir a alta atividade do promotor durante a condição de alto nível de nitrogênio (ou qualquer outra condição), um perfil de transcrição de todo o genoma em uma condição de alto nível de nitrogênio pode ser obtido e promotores ativos com um nível de transcrição desejado podem ser escolhidos desse conjunto de dados para substituir o promotor fraco. Os códons de início fracos podem ser trocados por um códon de início ATG para melhor eficiência de iniciação da tradução. Os sítios de ligação ao ribossomo (RBS) fracos podem também ser trocados por um RBS diferente com maior eficiência de iniciação da tradução. Além disso, a mutagênese sítio-específica pode também ser realizada para alterar a atividade de uma enzima.

[116] O aumento do nível de fixação de nitrogênio que ocorre em uma planta pode levar a uma redução na quantidade de fertilizante químico necessário para a produção de cultura e reduzir as emissões de gases de efeito estufa (por exemplo, óxido nitroso). Regulação de Potencial de Colonização

[117] Em algumas modalidades, as vias e genes envolvidos na colonização podem atuar como um alvo para engenharia genética e otimização.

[118] Em alguns casos, os exopolissacarídeos podem estar envolvidos na colonização bacteriana de plantas. Em alguns casos, os micróbios colonizadores de plantas podem produzir um biofilme. Em alguns casos, os micróbios colonizadores de plantas secretam moléculas que podem auxiliar na adesão à planta ou na evasão de uma resposta imunológica da planta. Em alguns casos, os micróbios colonizadores de plantas podem excretar moléculas de sinalização que alteram a resposta das plantas aos micróbios. Em alguns casos, os micróbios colonizadores de plantas podem secretar moléculas que alteram o microambiente local. Em alguns casos, um micróbio colonizador de planta pode alterar a expressão de genes para se adaptar a uma planta da qual o dito micróbio está próximo. Em alguns casos, um micróbio colonizador de planta pode detectar a presença de uma planta no ambiente local e pode alterar a expressão de genes em resposta.

[119] Em algumas modalidades, para melhorar a colonização, um gene envolvido em uma via selecionada do grupo que consiste em: produção de exopolissacarídeo, produção de endo-poligalaturonase, produção de trealose e conversão de glutamina pode ser alvejado para engenharia genética e otimização.

[120] Em algumas modalidades, uma enzima ou via envolvida na produção de exopolissacarídeos pode ser geneticamente modificada para melhorar a colonização. Genes exemplificativos que codificam uma enzima produtora de exopolissacarídeo que podem ser alvejados para melhorar a colonização incluem, porém sem limitação, bcsii, bcsiiie yjbE.

[121] Em algumas modalidades, uma enzima ou via envolvida na produção de uma hemaglutinina filamentosa pode ser geneticamente modificada para melhorar a colonização. Por exemplo, um gene fhaB que codifica uma hemaglutinina filamentosa pode ser alvejado para melhorar a colonização.

[122] Em algumas modalidades, uma enzima ou via envolvida na produção de uma endo-poligalaturonase pode ser geneticamente modificada para melhorar a colonização. Por exemplo, um gene pehA que codifica um precursor de endo- poligalaturonase pode ser alvejado para melhorar a colonização.

[123] Em algumas modalidades, uma enzima ou via envolvida na produção de trealose pode ser geneticamente modificada para melhorar a colonização. Genes exemplificativos que codificam uma enzima produtora de trealose que podem ser alvejados para melhorar a colonização incluem, porém sem limitação, otsB e treZ.

[124] Em algumas modalidades, uma enzima ou via envolvida na conversão de glutamina pode ser geneticamente modificada para melhorar a colonização. Por exemplo, o gene glsA2 codifica uma glutaminase que converte a glutamina em amônio e glutamato. A regulação positiva de glsA2 melhora a aptidão, aumentando o grupo de glutamato da célula, aumentando assim o N disponível para as células. Consequentemente, em algumas modalidades, o gene glsA2 pode ser alvejado para melhorar a colonização.

[125] Em algumas modalidades, os genes de colonização selecionados do grupo que consiste em: bcsii, bcsiii, yjbE, fhaB, pehA, otsB, treZ, glsA2e combinações dos mesmos, podem ser geneticamente modificados para melhorar a colonização.

[126] Os genes de colonização que podem ser alvejados para melhorar o potencial de colonização são também descritos em uma publicação PCT, nº WO/2019/032926, que está incorporada a título de referência no presente documento em sua totalidade.

GERAÇÃO DE POPULAÇÕES BACTERIANAS ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS

[127] Os micróbios úteis em métodos e composições divulgados no presente documento podem ser obtidos extraindo-se micróbios de superfícies ou tecidos de plantas nativas. Os micróbios podem ser obtidos triturando-se sementes para isolar micróbios. Os micróbios podem ser obtidos plantando-se sementes em diversas amostras de solo e recuperando-se micróbios dos tecidos. Além disso, os micróbios podem ser obtidos inoculando-se plantas com micróbios exógenos e determinando-se quais micróbios aparecem nos tecidos das plantas. Exemplos não limitativos de tecidos vegetais podem incluir uma semente, muda, folha, estaca, planta, bulbo ou tubérculo.

[128] Um método de obtenção de micróbios pode ser através do isolamento de bactérias do solo. As bactérias podem ser coletadas de vários tipos de solo. Em alguns exemplos, o solo pode ser caracterizado por traços como alta ou baixa fertilidade, níveis de umidade, níveis de minerais e várias práticas de cultivo. Por exemplo, o solo pode estar envolvido em uma rotação de culturas em que diferentes culturas são plantadas no mesmo solo em épocas de plantio sucessivas. O crescimento sequencial de diferentes culturas no mesmo solo pode evitar a depleção desproporcional de certos minerais. As bactérias podem ser isoladas das plantas que crescem nos solos selecionados. As mudas podem ser colhidas em 2- 6 semanas de crescimento. Por exemplo, pelo menos 400 isolados podem ser coletados em uma rodada de colheita. Os tipos de solo e planta revelam o fenótipo da planta, bem como as condições, que permitem o enriquecimento a jusante de certos fenótipos.

[129] Os micróbios podem ser isolados de tecidos vegetais para avaliar os traços microbianos. Os parâmetros para o processamento de amostras de tecido podem ser variados para isolar diferentes tipos de micróbios associativos, como bactérias rizosféricas, epifíticas ou endofíticas. Os isolados podem ser cultivados em meio isento de nitrogênio para enriquecimento de bactérias que realizam a fixação de nitrogênio. Alternativamente, os micróbios podem ser obtidos em bancos de cepas globais.

[130] As análises em planta são realizadas para avaliar os traços microbianos. Em algumas modalidades, o tecido da planta pode ser processado para triagem por processamento de alto rendimento para DNA e RNA. Além disso, medições não invasivas podem ser usadas para avaliar as características da planta, como a colonização. As medições de micróbios selvagens podem ser obtidas planta a planta. As medições de micróbios selvagens podem também ser obtidas no campo usando métodos de rendimento médio. As medições podem ser feitas sucessivamente ao longo do tempo. O sistema de planta modelo pode ser usado incluindo, porém sem limitação, Setaria.

[131] Os micróbios em um sistema de planta podem ser analisados por meio de perfis transcricionais de um micróbio em um sistema de planta. Exemplos de triagem por meio de perfis transcricionais são o uso de métodos de reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), códigos de barras moleculares para detecção de transcritos, Sequenciamento de Próxima Geração e marcação de micróbios com marcadores fluorescentes. Os fatores de impacto podem ser medidos para avaliar a colonização na estufa, incluindo, mas não se limitando a, microbioma, fatores abióticos, condições do solo, oxigênio, umidade, temperatura, condições de inóculo e localização da raiz. A fixação de nitrogênio pode ser avaliada em bactérias medindo-se gás/fertilizante 15N (diluição) com IRMS ou NanoSIMS, como descrito no presente documento, NanoSIMS é espectrometria de massa de íons secundários de alta resolução. A técnica NanoSIMS é uma forma de investigar a atividade química de amostras biológicas. A catálise da redução das reações de oxidação que impulsionam o metabolismo de microrganismos pode ser investigada a nível celular, subcelular, molecular e elementar. O NanoSIMS pode fornecer alta resolução espacial de mais de 0,1 µm. O NanoSIMS pode detectar o uso de traçadores de isótopos, como 13C, 15N e 18O. Portanto, o NanoSIMS pode ser usado para a atividade química do nitrogênio na célula.

[132] Estufas automatizadas podem ser usadas para análises de plantas. As métricas da planta em resposta à exposição microbiana incluem, porém sem limitação, biomassa, análise de cloroplasto, câmera CCD, medições de tomografia volumétrica.

[133] Uma forma de enriquecer uma população de micróbios é de acordo com o genótipo. Por exemplo, um ensaio de reação em cadeia da polimerase (PCR) com um iniciador alvejado ou iniciador específico. Os iniciadores projetados para o gene nifH podem ser usados para identificar os diazotróficos, pois os diazotróficos expressam o gene nifH no processo de fixação de nitrogênio. Uma população microbiana pode também ser enriquecida por meio de abordagens independentes de cultura de uma única célula e abordagens de isolamento guiadas por quimiotaxia. Alternativamente, o isolamento alvejado de micróbios pode ser realizado através da cultura dos micróbios em meios de seleção. Abordagens premeditadas para enriquecer populações microbianas para traços desejados podem ser guiadas por dados de bioinformática e são descritas no presente documento.

ENRIQUECIMENTO PARA MICRÓBIOS COM CAPACIDADES DE FIXAÇÃO DE NITROGÊNIO USANDO BIOINFORMÁTICA

[134] Ferramentas de bioinformática podem ser usadas para identificar e isolar rizobactérias promotoras de crescimento de plantas (PGPRs), que são selecionadas com base em sua capacidade de realizar a fixação de nitrogênio. Micróbios com alta capacidade de fixação de nitrogênio podem promover traços favoráveis nas plantas. Os modos de análise bioinformática para a identificação de

PGPRs incluem, porém sem limitação, genômica, metagenômica, isolamento alvejado, sequenciamento de genes, sequenciamento de transcriptoma e modelagem.

[135] A análise genômica pode ser usada para identificar PGPRs e confirmar a presença de mutações com métodos de Sequenciamento de Próxima Geração conforme descrito no presente documento e controle de versão de micróbio.

[136] A metagenômica pode ser usada para identificar e isolar PGPR usando um algoritmo de predição para colonização. Os metadados podem também ser usados para identificar a presença de uma cepa geneticamente modificada em amostras ambientais e de estufa.

[137] O sequenciamento transcriptômico pode ser usado para prever genótipos que levam a fenótipos PGPR. Além disso, os dados transcriptômicos são usados para identificar promotores para alterar a expressão do gene. Os dados transcriptômicos podem ser analisados em conjunto com a Sequência do Genoma Completo (WGS) para gerar modelos de metabolismo e redes regulatórias de genes.

DOMESTICAÇÃO DE MICRÓBIOS

[138] Micróbios isolados da natureza podem sofrer um processo de domesticação em que os micróbios são convertidos em uma forma que é geneticamente rastreável e identificável. Uma maneira de domesticar um micróbio é modificar o mesmo geneticamente com resistência a antibióticos. O processo de modificação genética da resistência aos antibióticos pode começar determinando- se a sensibilidade aos antibióticos na cepa microbiana de tipo selvagem. Se a bactéria for sensível ao antibiótico, então o antibiótico pode ser um bom candidato para a modificação genética de resistência a antibióticos. Subsequentemente, um gene resistente a antibióticos ou um vetor suicida contra-selecionável pode ser incorporado no genoma de um micróbio usando métodos de recombineering. Um vetor suicida contra-selecionável pode consistir em uma deleção do gene de interesse, um marcador selecionável e o marcador contra-selecionável sacB. A contra-seleção pode ser usada para trocar sequências de DNA microbiano nativo com genes resistentes a antibióticos. Um método de rendimento médio pode ser usado para avaliar vários micróbios simultaneamente, permitindo a domesticação paralela. Os métodos alternativos de domesticação incluem o uso de nucleases teleguiadas (homing nucleases) para impedir que as sequências do vetor suicida excluam (loop out) ou obtenham sequências do vetor intermediárias.

[139] Os vetores de DNA podem ser introduzidos em bactérias por meio de vários métodos, incluindo eletroporação e transformações químicas. Uma biblioteca padrão de vetores pode ser usada para transformações. Um exemplo de um método de edição de genes é CRISPR precedido por testes de Cas9 para garantir a atividade de Cas9 nos micróbios.

MODIFICAÇÃO GENÉTICA NÃO TRANSGÊNICA DE MICRÓBIOS

[140] Uma população microbiana com traços favoráveis pode ser obtida por meio da evolução dirigida. A evolução direta é uma abordagem em que o processo de seleção natural é imitado para desenvolver proteínas ou ácidos nucleicos em direção a um objetivo definido pelo usuário. Um exemplo de evolução direta é quando mutações aleatórias são introduzidas em uma população microbiana, os micróbios com os traços mais favoráveis são selecionados e o crescimento dos micróbios selecionados é continuado. Os traços mais favoráveis em rizobactérias promotoras de crescimento (PGPRs) podem estar na fixação de nitrogênio. O método de evolução dirigida pode ser iterativo e adaptativo com base no processo de seleção após cada iteração.

[141] Rizobactérias promotoras de crescimento de plantas (PGPRs) com alta capacidade de fixação de nitrogênio podem ser geradas. A evolução de PGPRs pode ser realizada por meio da introdução da variação genética. A variação genética pode ser introduzida por meio de mutagênese por reação em cadeia da polimerase, mutagênese dirigida por oligonucleotídeos, mutagênese de saturação, mutagênese por embaralhamento de fragmentos, recombinação homóloga, sistemas CRISPR/Cas9, mutagênese química e combinações dos mesmos. Essas abordagens podem introduzir mutações aleatórias na população microbiana. Por exemplo, os mutantes podem ser gerados usando DNA ou RNA sintético por meio de mutagênese dirigida por oligonucleotídeo. Os mutantes podem ser gerados usando ferramentas contidas em plasmídeos, que são posteriormente curados. Genes de interesse podem ser identificados usando bibliotecas de outras espécies com traços aprimorados, incluindo, porém sem limitação, propriedades de PGPR aprimoradas, colonização de cereais aprimorada, sensibilidade aumentada ao oxigênio, fixação de nitrogênio aumentada e excreção de amônia aumentada. Os genes intragenéricos podem ser projetados com base nessas bibliotecas usando software como o software de design Geneious ou Platypus. As mutações podem ser projetadas com o auxílio de aprendizado de máquina. As mutações podem ser projetadas com o auxílio de um modelo metabólico. O design automatizado da mutação pode ser feito usando a la Platypus e guiará os RNAs para mutagênese dirigida por Cas.

[142] Os genes intragenéricos podem ser transferidos para o micróbio hospedeiro. Além disso, os sistemas repórter podem também ser transferidos para o micróbio. Os sistemas repórter caracterizam os promotores, determinam o sucesso da transformação, examinam mutantes e atuam como ferramentas de triagem negativa.

[143] Os micróbios portadores da mutação podem ser cultivados por meio de passagens em série. Uma colônia microbiana contém uma única variante do micróbio. As colônias microbianas são examinadas com o auxílio de um coletor de colônias automatizado e manipulador de líquidos. Mutantes com duplicação de genes e aumento do número de cópias expressam um genótipo superior do traço desejado.

SELEÇÃO DE MICRÓBIOS PROMOTORES DE CRESCIMENTO DE PLANTAS COM BASE NA FIXAÇÃO DE NITROGÊNIO

[144] As colônias microbianas podem ser examinadas usando vários ensaios para avaliar a fixação de nitrogênio. Uma maneira de medir a fixação de nitrogênio é por meio de um único ensaio fermentativo, que mede a excreção de nitrogênio. Um método alternativo é o ensaio de redução de acetileno (ARA) com amostragem em linha ao longo do tempo. O ARA pode ser realizado em placas de alto rendimento de matrizes de microtubos. O ARA pode ser realizado com plantas vivas e tecidos vegetais. A formulação do meio e a concentração de oxigênio do meio podem ser variadas em ensaios ARA. Outro método de triagem de variantes microbianas é o uso de biossensores. O uso de NanoSIMS e microespectroscopia Raman pode ser usado para investigar a atividade dos micróbios. Em alguns casos,

as bactérias podem também ser cultivadas e expandidas usando métodos de fermentação em biorreatores. Os biorreatores são projetados para melhorar a robustez do crescimento de bactérias e diminuir a sensibilidade das bactérias ao oxigênio. Microfermentadores baseados em placa de TP médio a alto são usados para avaliar a sensibilidade ao oxigênio, necessidades nutricionais, fixação de nitrogênio e excreção de nitrogênio. As bactérias podem também ser co-cultivadas com micróbios competitivos ou benéficos para elucidar as vias crípticas. A citometria de fluxo pode ser usada para examinar bactérias que produzem altos níveis de nitrogênio usando indicadores químicos, colorimétricos ou fluorescentes. As bactérias podem ser cultivadas na presença ou ausência de uma fonte de nitrogênio. Por exemplo, as bactérias podem ser cultivadas com glutamina, amônia, ureia ou nitratos. REMODELAGEM MICROBIANA GUIADA - UMA VISÃO GERAL

[145] A remodelagem microbiana guiada é um método para identificar e melhorar sistematicamente a função das espécies no microbioma da cultura. Em alguns aspectos, e de acordo com uma metodologia específica de agrupamento/categorização, o método compreende três etapas: 1) seleção de espécies candidatas mapeando-se interações planta-micróbio e prevendo-se redes regulatórias ligadas a um fenótipo específico, 2) aprimoramento pragmático e previsível de fenótipos microbianos por meio de cruzamento intraespécie de redes regulatórias e aglomerados de genes dentro de genoma de micróbio e 3) triagem e seleção de novos genótipos microbianos que produzem fenótipos de cultura desejados.

[146] Para avaliar sistematicamente o aprimoramento das cepas, é criado um modelo que liga a dinâmica de colonização da comunidade microbiana à atividade genética por espécies-chave. O modelo é usado para prever alvos genéticos para remodelagem genética não intergenérica (ou seja, a modificação genética da arquitetura genética do micróbio de uma forma não transgênica). Consultar, a Figura 1 para uma representação gráfica de uma modalidade do processo.

[147] Conforme ilustrado na Figura 1, o aprimoramento racional do microbioma da cultura pode ser usado para aumentar a biodiversidade do solo,

ajustar o impacto das espécies-chave e/ou alterar o tempo e a expressão de importantes vias metabólicas.

[148] Para esta finalidade, os inventores desenvolveram uma plataforma para identificar e aprimorar a função das cepas no microbioma da cultura. Em alguns aspectos, os inventores chamam esse processo de melhoramento genético microbiano.

[149] O processo de "Remodelagem Microbiana Guiada” mencionado acima será mais elaborado nos Exemplos, por exemplo, no Exemplo 1, intitulado: “Guided Microbial Remodeling – A Platform for the Rational Improvement of Microbial Species for Agriculture”.

PASSAGEM SERIAL

[150] A produção de bactérias para melhorar os traços das plantas (por exemplo, fixação de nitrogênio) pode ser alcançada por meio de passagens serial. A produção dessas bactérias pode ser feita por meio da seleção de plantas, que têm um traço melhorado específico que é influenciado pela flora microbiana, além da identificação de bactérias e/ou composições que têm capacidade para conferir um ou mais traços melhorados a uma ou mais plantas. Um método de produção de uma bactéria para melhorar um traço da planta inclui as etapas de: (a) isolar as bactérias do tecido ou solo de uma primeira planta; (b) introduzir uma variação genética em uma ou mais das bactérias para produzir uma ou mais bactérias variantes; (c) expor uma pluralidade de plantas às bactérias variantes; (d) isolar bactérias de tecido ou solo de uma da pluralidade de plantas, em que a planta da qual a bactéria é isolada tem um traço melhorado em relação a outras plantas na pluralidade de plantas; e (e) repetir as etapas (b) a (d) com bactérias isoladas da planta com um traço melhorado (etapa (d)). As etapas (b) a (d) podem ser repetidas qualquer número de vezes (por exemplo, uma, duas, três vezes, quatro vezes, cinco vezes, dez vezes ou mais) até que o traço melhorado em uma planta atinja o nível desejado. Além disso, a pluralidade de plantas pode ser mais de duas plantas, como 10 a 20 plantas, ou 20 ou mais, 50 ou mais, 100 ou mais, 300 ou mais, 500 ou mais, ou 1000 ou mais plantas.

[151] Além de obter uma planta com um traço melhorado, é obtida uma população bacteriana que compreende bactérias compreendendo uma ou mais variações genéticas introduzidas em um ou mais genes (por exemplo, genes que regulam a fixação de nitrogênio). Repetindo-se as etapas descritas acima, uma população de bactérias pode ser obtida que inclui os membros mais adequados da população que se correlacionam com um traço da planta de interesse. As bactérias nessa população podem ser identificadas e suas propriedades benéficas determinadas, como por análise genética e/ou fenotípica. A análise genética pode ocorrer de bactérias isoladas na etapa (a). As informações fenotípicas e/ou genotípicas podem ser obtidas usando técnicas, incluindo: triagem de alto rendimento de componentes químicos de origem vegetal, técnicas de sequenciamento, incluindo sequenciamento de alto rendimento de material genético, técnicas de exibição diferencial (incluindo DDRT-PCR e DD-PCR), técnicas de microarranjo de ácido nucleico, sequenciamento de RNA (Whole Transcriptome Shotgun Sequencing) e qRT-PCR (PCR quantitativa em tempo real). As informações obtidas podem ser usadas para obter informações de perfil da comunidade sobre a identidade e a atividade das bactérias presentes, como análise filogenética ou triagem baseada em microarranjo de ácidos nucleicos que codificam componentes de operons de rRNA ou outros loci taxonomicamente informativos. Exemplos de loci taxonomicamente informativos incluem gene rRNA16S, gene rRNA 23S, gene rRNA 5S, gene rRNA 5.8S, gene rRNA 12S, gene rRNA 18S, gene rRNA 28S, gene gyrB, gene rpoB, gene fusA, gene recA, gene coxl, gene nifD. Exemplos de processos de perfil taxonômico para determinar táxons presentes em uma população são descritos no documento nºUS20140155283. A identificação bacteriana pode compreender a caracterização da atividade de um ou mais genes ou uma ou mais vias de sinalização, como genes associados à via de fixação de nitrogênio. As interações sinérgicas (em que dois componentes, em virtude de sua combinação, aumentam um efeito desejado em mais de uma quantidade aditiva) entre espécies bacterianas diferentes podem também estar presentes nas populações bacterianas. VARIAÇÃO GENÉTICA - LOCAIS E FONTES DE ALTERAÇÃO

GENÔMICA

[152] A variação genética pode ser um gene selecionado do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glnD, glnE, nifJ,

nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB e nifQ.

A variação genética pode ser uma variação em um gene que codifica uma proteína com funcionalidade selecionada a partir do grupo que consiste em: glutamina sintetase, glutaminase, glutamina sintetase adenililtransferase, ativador transcricional, ativador anti-transcricional, piruvato flavodoxina oxidorredutase, flavodoxina ou NAD+-dinitrogênio-redutase aDP-D-ribosiltransferase.

A variação genética pode ser uma mutação que resulta em um ou mais dos seguintes: aumento da expressão ou atividade de NifA ou glutaminase; diminuição de expressão ou atividade de NifL, NtrB, glutamina sintetase, GlnB, GlnK, DraT, AmtB; diminuição da atividade de remoção de adenilila de GlnE; ou diminuição da atividade de remoção de uridilila de GlnD.

A introdução de uma variação genética pode compreender a inserção e/ou deleção de um ou mais nucleotídeos em um sítio alvo, como 1, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 ou mais nucleotídeos.

A variação genética introduzida em uma ou mais bactérias dos métodos divulgados no presente documento pode ser uma mutação knockout (por exemplo, deleção de um promotor, inserção ou deleção para produzir um códon de parada prematuro, deleção de um gene inteiro), ou pode ser eliminação ou supressão da atividade de um domínio de proteína (por exemplo, mutação pontual que afeta um sítio ativo, ou deleção de uma porção de um gene que codifica a porção relevante do produto de proteína), ou pode alterar ou suprimir uma sequência reguladora de um gene alvo.

Uma ou mais sequências reguladoras podem também ser inseridas, incluindo sequências reguladoras heterólogas e sequências reguladoras encontradas dentro de um genoma de uma espécie ou gênero bacteriano correspondente à bactéria na qual a variação genética é introduzida.

Além disso, as sequências reguladoras podem ser selecionadas com base no nível de expressão de um gene em uma cultura bacteriana ou em um tecido de planta.

A variação genética pode ser uma variação genética pré-determinada que é introduzida especificamente em um sítio alvo.

A variação genética pode ser uma mutação aleatória no sítio alvo.

A variação genética pode ser uma inserção ou deleção de um ou mais nucleotídeos.

Em alguns casos, uma pluralidade de diferentes variações genéticas (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 10 ou mais) é introduzida em uma ou mais das bactérias isoladas antes de expor as bactérias a plantas para avaliar o aprimoramento de traços.

A pluralidade de variações genéticas pode ser qualquer um dos tipos acima, tipos iguais ou diferentes e em qualquer combinação. Em alguns casos, uma pluralidade de variações genéticas diferentes é introduzida em série, introduzindo uma primeira variação genética após uma primeira etapa de isolamento, uma segunda variação genética após uma segunda etapa de isolamento e assim por diante, de modo a acumular uma pluralidade de variações genéticas em bactérias conferindo traços progressivamente aprimorados nas plantas associadas. VARIAÇÃO GENÉTICA - MÉTODOS DE INTRODUÇÃO DE ALTERAÇÃO

GENÔMICA

[153] Em geral, o termo "variação genética" se refere a qualquer alteração introduzida em uma sequência polinucleotídica em relação a um polinucleotídeo de referência, como um genoma de referência ou porção do mesmo, ou gene de referência ou porção do mesmo. Uma variação genética pode ser chamada de uma "mutação" e uma sequência ou organismo que compreende uma variação genética pode ser chamada de uma "variante genética" ou "mutante". As variações genéticas podem ter uma série de efeitos, como o aumento ou diminuição de alguma atividade biológica, incluindo expressão gênica, metabolismo e sinalização celular. As variações genéticas podem ser introduzidas especificamente em um sítio alvo ou introduzidas aleatoriamente. Uma variedade de ferramentas e métodos moleculares estão disponíveis para a introdução da variação genética. Por exemplo, a variação genética pode ser introduzida por meio de mutagênese de reação em cadeia de polimerase, mutagênese dirigida por oligonucleotídeo, mutagênese de saturação, mutagênese de embaralhamento de fragmento, recombinação homóloga, recombineering, recombinação lambda red, sistemas CRISPR/Cas9, mutagênese química e combinações das mesmas. Métodos químicos de introdução de variação genética incluem a exposição de DNA a um mutagênico químico, por exemplo, metanossulfonato de etila (EMS), metanossulfonato de metila (MMS), N-nitrosoureia (EN U), N-metil-N-nitro-N′- nitrosoguanidina, 4-nitroquinolina N-óxido, dietilsulfato, benzopireno, ciclofosfamida, bleomicina, trietilmelamina, monômero de acrilamida, mostarda de nitrogênio, vincristina, diepoxialcanos (por exemplo, diepoxibutano), ICR-170, formaldeído, cloridrato de procarbazina, óxido de etileno, dimetilnitrosamina, 7,12 dimetilbenz(a)antraceno, clorambucila, hexametilfosforamida, bissulfano e similares. Os agentes indutores de mutação de radiação incluem radiação ultravioleta, irradiação γ, raios-X e bombardeio rápido de nêutrons. A variação genética pode também ser introduzida em um ácido nucleico usando, por exemplo, trimetilpsoraleno com luz ultravioleta. A inserção aleatória ou alvejada de um elemento de DNA móvel, por exemplo, um elemento transponível, é outro método adequado para gerar variação genética. As variações genéticas podem ser introduzidas em um ácido nucleico durante a amplificação em um sistema in vitro isento de células, por exemplo, usando uma técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), como a PCR propensa a erros. As variações genéticas podem ser introduzidas em um ácido nucleico in vitro usando técnicas de embaralhamento de DNA (por exemplo, embaralhamento de éxons, troca de domínio e similares). Variações genéticas podem também ser introduzidas em um ácido nucleico como resultado de uma deficiência em uma enzima de reparo de DNA em uma célula, por exemplo, a presença em uma célula de um gene mutante que codifica uma enzima de reparo de DNA mutante deve gerar uma alta frequência de mutações (ou seja, cerca de 1 mutação/100 genes-1 mutação/10 000 genes) no genoma da célula. Exemplos de genes que codificam enzimas de reparo de DNA incluem, porém sem limitação, Mut H, Mut S, Mut L e Mut U, e os homólogos dos mesmos em outras espécies (por exemplo, MSH 1 6, PMS 1 2, MLH 1, GTBP, ERCC -1 e similares). Descrições de exemplo de vários métodos para a introdução de variações genéticas são fornecidas em, por exemplo, Stemple (2004) Nature 5:1-7; Chiang et al. (1993) PCR Methods Appl 2 (3): 210-217; Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 91:10747-10751; e Pat. US nº6.033.861 e nº6.773.900.

[154] As variações genéticas introduzidas em micróbios podem ser classificadas como transgênicas, cisgênicas, intragenômicas, intragenéricas, intergenéricas, sintéticas, evoluídas, rearranjadas ou SNPs.

[155] A variação genética pode ser introduzida em várias vias metabólicas dentro dos micróbios para obter melhorias nos traços descritos acima. As vias representativas incluem as vias de absorção de enxofre, biossíntese de glicogênio, a via de regulação da glutamina, a via de absorção de molibdênio, a via de fixação de nitrogênio, assimilação de amônia, excreção ou secreção de amônia, absorção de nitrogênio, biossíntese de glutamina, anammox (oxidação anaeróbia da amônia), solubilização de fosfato, transporte de ácido orgânico, produção de ácido orgânico, produção de aglutininas, genes sequestrantes de radicais de oxigênio reativos, biossíntese de Ácido Indol Acético, biossíntese de trealose, enzimas ou vias de degradação da parede celular de plantas, genes de fixação de raízes, secreção de exopolissacarídeo, via de glutamato sintase, vias de absorção de ferro, via de sideróforo, via de quitinase, ACC deaminase, biossíntese de glutationa, genes de sinalização de fósforo, via quorum quenching, vias de citocromo, via de hemoglobina, via semelhante à hemoglobina bacteriana, pequeno RNA rsmZ, biossíntese de rizobitoxina, proteína de adesão a lapA, via quorum sensing AHL, biossíntese de fenazina, biossíntese de lipopetídeo cíclico e produção de antibiótico.

[156] CRISPR/Cas9 (Repetições palindrômicas curtas regularmente espaçadas aglomeradas) /sistemas associados a CRISPR (Cas) podem ser usados para introduzir as mutações desejadas. CRISPR/Cas9 fornecem bactérias e arqueias com imunidade adaptativa contra vírus e plasmídeos usando RNAs de CRISPR (crRNAs) para guiar o silenciamento de ácidos nucleicos invasores. A proteína Cas9 (ou equivalente funcional e/ou variante da mesma, isto é, proteína semelhante a Cas9) contém naturalmente atividade de endonuclease de DNA que depende da associação da proteína a duas moléculas de RNA sintéticas ou de ocorrência natural chamadas de crRNA e tracrRNA (também chamadas de RNAs guia). Em alguns casos, as duas moléculas são ligadas covalentemente para formar uma única molécula (também chamada de RNA guia único ("sgRNA"). Assim, a proteína Cas9 ou semelhante a Cas9 se associa a um RNA de alvejamento de DNA (tal termo abrange tanto a configuração de RNA guia de duas moléculas quanto a configuração de RNA guia de molécula única), que ativa a proteína Cas9 ou semelhante a Cas9 e guia a proteína para uma sequência de ácido nucleico alvo. Se a proteína Cas9 ou semelhante a Cas9 retiver sua função enzimática natural, a mesma irá clivar o DNA alvo para criar uma quebra de fita dupla, o que pode levar à alteração do genoma (ou seja, edição: deleção, inserção (quando um polinucleotídeo doador está presente), substituição, etc.), alterando assim a expressão do gene. Algumas variantes de Cas9 (tais variantes são abrangidas pelo termo Cas9-like) foram alteradas de modo que tivessem uma atividade de clivagem de DNA diminuída (em alguns casos, as mesmas clivam uma única fita em vez de ambas as fitas do DNA alvo, enquanto em outros casos, as mesmas foram severamente reduzidas a nenhuma atividade de clivagem de DNA). Descrições exemplificativas adicionais exemplares de sistemas CRISPR para a introdução de variação genética podem ser encontradas, por exemplo, no documento nº US8795965.

[157] Como uma técnica de amplificação cíclica, a mutagênese por reação em cadeia da polimerase (PCR) usa iniciadores mutagênicos para introduzir as mutações desejadas. A PCR é realizada por ciclos de desnaturação, anelamento e extensão. Após a amplificação por PCR, a seleção do DNA mutado e a remoção do DNA do plasmídeo parental podem ser realizadas por: 1) substituição de dCTP por dCTP hidroximetilado durante a PCR, seguido de digestão com enzimas de restrição para remover apenas o DNA parental não hidroximetilado; 2) mutagênese simultânea de um gene de resistência a antibióticos e do gene estudado, alterando o plasmídeo para uma resistência a antibióticos diferente, sendo que a nova resistência a antibióticos facilita a seleção da mutação desejada posteriormente; 3) após a introdução de uma mutação desejada, digestão do DNA modelo metilado parental pela enzima de restrição Dpnl que cliva apenas DNA metilado, pelo qual as cadeias não metiladas mutagenizadas são recuperadas; ou 4) circularização dos produtos de PCR mutados em uma reação de ligação adicional para aumentar a eficiência de transformação do DNA mutado. Uma descrição adicional de métodos exemplificativos pode ser encontrada, por exemplo, nos documentos nº US7132265, nº US6713285, nº US6673610, nº US6391548, nº US5789166, nº US5780270, nºUS5354670, nºUS5071743 e nºUS20100267147.

[158] A mutagênese dirigida por oligonucleotídeo, também chamada de mutagênese sítio-dirigida, tipicamente utiliza um iniciador de DNA sintético. Esse iniciador sintético contém a mutação desejada e é complementar ao DNA modelo em torno do sítio de mutação, de modo que possa hibridizar com o DNA no gene de interesse. A mutação pode ser uma única mudança de base (uma mutação pontual), múltiplas mudanças de base, deleção ou inserção, ou uma combinação dessas. O iniciador de fita simples é, então, estendido usando uma DNA polimerase, que copia o restante do gene. O gene copiado dessa forma contém o sítio mutado e pode, então, ser introduzido em uma célula hospedeira como um vetor e clonado. Por fim, os mutantes podem ser selecionados por sequenciamento de DNA para verificar se os mesmos contêm a mutação desejada.

[159] Variações genéticas podem ser introduzidas usando PCR propensa a erros. Nessa técnica, o gene de interesse é amplificado usando uma DNA polimerase sob condições que são deficientes na fidelidade de replicação da sequência. O resultado é que os produtos de amplificação contêm pelo menos um erro na sequência. Quando um gene é amplificado e o produto (ou produtos) resultante da reação contém uma ou mais alterações na sequência quando comparados com a molécula modelo, os produtos resultantes são mutagenizados em comparação com o modelo. Outro meio de introduzir mutações aleatórias é expor as células a um mutagênico químico, como nitrosoguanidina ou metanossulfonato de etila (Nestmann, Mutat Res junho de 1975; 28(3):323-30), e o vetor contendo o gene é, então, isolado do hospedeiro.

[160] A mutagênese de saturação é outra forma de mutagênese aleatória, na qual se tenta gerar todas ou quase todas as mutações possíveis em um sítio específico, ou região estreita de um gene. Em um sentido geral, a mutagênese de saturação écompreendida de mutagenização de um conjunto completo de cassetes mutagênicos (em que cada cassete tem, por exemplo, 1-500 bases de comprimento) na sequência polinucleotídica definida a ser mutagenizada (em que a sequência a ser mutagenizada tem, por exemplo, de 15 a 100 000 bases de comprimento). Portanto, um grupo de mutações (por exemplo, na faixa de 1 a 100 mutações) é introduzido em cada cassete a ser mutagenizado. Um agrupamento de mutações a ser introduzido em um cassete pode ser diferente ou o mesmo de um segundo agrupamento de mutações a ser introduzido em um segundo cassete durante a aplicação de uma rodada de mutagênese de saturação. Tais agrupamentos são exemplificados por deleções, adições, agrupamentos de códons específicos e agrupamentos de cassetes de nucleotídeos específicos.

[161] A mutagênese por embaralhamento de fragmentos, também chamada de embaralhamento de DNA, é uma forma de propagar mutações benéficas rapidamente. Em um exemplo de um processo de embaralhamento,

DNAse é usado para fragmentar um conjunto de genes parentais em pedaços de, por exemplo, cerca de 50-100 pb de comprimento. Isso é, então, seguido de uma reação em cadeia da polimerase (PCR) sem iniciadores - fragmentos de DNA com sequência homóloga suficiente sobreposta se anelam entre si e são, então, estendidos pela DNA polimerase. Várias rodadas dessa extensão de PCR podem ocorrer, depois que algumas das moléculas de DNA atingirem o tamanho dos genes parentais. Esses genes podem, então, ser amplificados com outro PCR, desta vez com a adição de iniciadores que são projetados para complementar as extremidades das fitas. Os iniciadores podem ter sequências adicionais adicionadas às suas extremidades 5', como sequências para sítios de reconhecimento de enzimas de restrição necessários para ligação a um vetor de clonagem. Outros exemplos de técnicas de embaralhamento são fornecidos no documento nºUS20050266541.

[162] A mutagênese por recombinação homóloga envolve a recombinação entre um fragmento de DNA exógeno e a sequência polinucleotídica alvejada. Após ocorrer uma quebra de fita dupla, seções de DNA em torno das extremidades 5’ da quebra são cortadas em um processo denominado ressecção. Na etapa de invasão da fita que se segue, uma extremidade 3’ saliente da molécula de DNA quebrada, então, "invade" uma molécula de DNA similar ou idêntica que não está quebrada. O método pode ser usado para deletar um gene, remover éxons, adicionar um gene e introduzir mutações pontuais. A mutagênese por recombinação homóloga pode ser permanente ou condicional. Tipicamente, um modelo de recombinação também é fornecido. Um modelo de recombinação pode ser um componente de outro vetor, contido em um vetor separado ou fornecido como um polinucleotídeo separado. Em algumas modalidades, um modelo de recombinação é projetado para servir como um modelo em recombinação homóloga, como dentro ou perto de uma sequência alvo cortada ou clivada por uma nuclease sítio-específica. Um polinucleotídeo modelo pode ser de qualquer comprimento adequado, como cerca ou mais do que cerca de 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1000 ou mais nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo modelo é complementar a uma porção de um polinucleotídeo que compreende a sequência alvo. Quando alinhado de maneira ideal, um polinucleotídeo modelo pode se sobrepor a um ou mais nucleotídeos de sequências alvo (por exemplo, cerca de ou mais do que cerca de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais nucleotídeos). Em algumas modalidades, quando uma sequência modelo e um polinucleotídeo compreendendo uma sequência alvo estão alinhados de forma ideal, o nucleotídeo mais próximo do polinucleotídeo modelo está dentro de cerca de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 5000, 10000 ou mais nucleotídeos da sequência alvo. Exemplos não limitativos de nucleases sítio-dirigidas úteis em métodos de recombinação homóloga incluem nucleases de dedo de zinco, nucleases CRISPR, nucleases TALE e meganuclease. Para uma descrição mais detalhada do uso de tais nucleases, consultar, por exemplo, os documentos nº US8795965 e nºUS20140301990.

[163] Mutagênicos que criam principalmente mutações pontuais e deleções curtas, inserções, transversões e/ou transições, incluindo mutagênicos químicos ou radiação, podem ser usadas para criar variações genéticas. Os mutagênicos incluem, porém sem limitação, metanossulfonato de etila, metilmetanossulfonato, N-etil-N-nitrosureia, trietilmelamina, N-metil-N-nitrosoureia, procarbazina, clorambucila, ciclofosfamida, sulfato de dietila, monômero de acrilamida, melfalano, mostarda de nitrogênio, vincristina, dimetilnitrosamina, N-metil-N'-nitro- Nitrosoguanidina, nitrosoguanidina, 2-aminopurina, 7,12 dimetil-benz(a)antraceno, óxido de etileno, hexametilfosforamida, bissulfano, diepoxialcanos (diepoxioctano, diepoxibutano, diepoxibutano, e similares), dicloridrato de 2-metoxi-6-cloro-9[3-(etil- 2-cloro- etil)aminopropilamino]acridina e formaldeído.

[164] A introdução da variação genética pode ser um processo incompleto, de modo que algumas bactérias em uma população tratada de bactérias carreguem uma mutação desejada, enquanto outras não. Em alguns casos, é desejável aplicar uma pressão de seleção de modo a enriquecer para bactérias portadoras de uma variação genética desejada. Tradicionalmente, a seleção de variantes genéticas bem-sucedidas envolveu a seleção a favor ou contra alguma funcionalidade conferida ou suprimida pela variação genética, como no caso da inserção do gene de resistência a antibióticos ou supressão de uma atividade metabólica capaz de converter um composto não letal em um metabólito letal. Também épossível aplicar uma pressão de seleção com base na própria sequência polinucleotídica, de modo que apenas uma variação genética desejada precise ser introduzida (por exemplo, sem também exigir um marcador selecionável). Nesse caso, a pressão de seleção pode compreender clivar genomas que carecem da variação genética introduzida em um sítio alvo, de modo que a seleção seja efetivamente dirigida contra a sequência de referência na qual se busca introduzir a variação genética. Tipicamente, a clivagem ocorre dentro de 100 nucleotídeos do sítio alvo (por exemplo, dentro de 75, 50, 25, 10 ou menos nucleotídeos do sítio alvo, incluindo clivagem no ou dentro do sítio alvo). A clivagem pode ser dirigida por uma nuclease sítio-específica selecionada do grupo que consiste em uma nuclease de dedo de zinco, uma nuclease CRISPR, uma nuclease TALE (TALEN) ou uma meganuclease. Tal processo é similar a processos para intensificar a recombinação homóloga em um sítio alvo, exceto que nenhum modelo para recombinação homóloga é fornecido. Como resultado, as bactérias que carecem da variação genética desejada têm maior probabilidade de sofrer clivagem que, se não for reparada, resulta na morte celular. As bactérias que sobrevivem à seleção podem, então, ser isoladas para uso na exposição a plantas para avaliar a atribuição de um traço melhorado.

[165] Uma nuclease CRISPR pode ser usada como a nuclease sítio- específica para dirigir a clivagem para um sítio alvo. Uma seleção melhorada de micróbios mutados pode ser obtida usando Cas9 para exterminar células não mutadas. As plantas são, então, inoculadas com os micróbios mutados para reconfirmar a simbiose e criar pressão evolutiva para selecionar simbiontes eficientes. Os micróbios podem, então, ser re-isolados dos tecidos das plantas. Os sistemas de nuclease CRISPR empregados para seleção contra não variantes podem empregar elementos similares aos descritos acima em relação à introdução de variação genética, exceto que nenhum modelo para recombinação homóloga é fornecido. A clivagem dirigida ao sítio alvo aumenta, portanto, a morte das células afetadas.

[166] Outras opções para induzir especificamente a clivagem em um sítio alvo estão disponíveis, como nucleases de dedo de zinco, sistemas de nuclease TALE (TALEN) e meganuclease. As nucleases de dedo de zinco (ZFNs) são endonucleases de DNA artificiais geradas pela fusão de um domínio de ligação de

DNA de dedo de zinco a um domínio de clivagem de DNA. As ZFNs podem ser geneticamente modificadas para alvejar as sequências de DNA desejadas e isso permite que as nucleases de dedo de zinco clivem as sequências alvo exclusivas. Quando introduzidas em uma célula, as ZFNs podem ser usadas para editar o DNA alvo na célula (por exemplo, o genoma da célula) induzindo quebras de fita dupla. As nucleases efetoras semelhantes ao ativador de transcrição (TALENs) são endonucleases de DNA artificiais geradas pela fusão de um domínio de ligação de DNA efetor TAL (semelhante ao ativador de transcrição) a um domínio de clivagem de DNA. As TALENS podem ser rapidamente geneticamente modificadas para se ligar a praticamente qualquer sequência de DNA desejada e, quando introduzidas em uma célula, as TALENs podem ser usadas para editar o DNA alvo na célula (por exemplo, o genoma da célula) induzindo quebras de fita dupla. Meganucleases (endonuclease de homing) são endodeoxirribonucleases caracterizadas por um grande sítio de reconhecimento (sequências de DNA de fita dupla de 12 a 40 pares de bases. As meganucleases podem ser usadas para substituir, eliminar ou modificar sequências de uma forma altamente alvejada. Com a modificação de sua sequência de reconhecimento por meio da modificação genética de proteínas, a sequência alvo pode ser alterada. As meganucleases podem ser usadas para modificar todos os tipos de genoma, sejam bacterianos, vegetais ou animais e são comumente agrupadas em quatro famílias: a família LAGLIDADG (SEQ ID NO: 1), a família GIY-YIG, a família His-Cyst box e a família HNH. As endonucleases de homing exemplificativas incluem I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I- PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII e I-TevIII. VARIAÇÃO GENÉTICA - MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO

[167] Os micróbios da presente divulgação podem ser identificados por uma ou mais modificações ou alterações genéticas, que foram introduzidas no dito micróbio. Um método pelo qual a dita modificação ou alteração genética pode ser identificada é por meio da referência a uma SEQ ID NO que contém uma porção da sequência genômica do micróbio que é suficiente para identificar a modificação ou alteração genética.

[168] Além disso, no caso de micróbios que não tiveram uma modificação ou alteração genética (por exemplo, um tipo selvagem, WT) introduzida em seus genomas, a divulgação pode utilizar sequências de ácidos nucleicos 16S para identificar os ditos micróbios. Uma sequência de ácidos nucleicos 16S é um exemplo de um "marcador molecular" ou "marcador genético", que se refere a um indicador que é usado em métodos para visualizar diferenças nas características de sequências de ácidos nucleicos. Exemplos de outros indicadores são marcadores de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), marcadores de polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado (AFLP), polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), mutações de inserção, marcadores de microssatélites (SSRs), regiões amplificadas caracterizadas por sequência (SCARs), marcadores de sequência polimórfica amplificada clivada (CAPS) ou marcadores de isozima ou combinações dos marcadores descritos no presente documento que definem uma localização genética e cromossômica específica. Os marcadores incluem ainda sequências polinucleotídicas que codificam rRNA 16S ou 18S e sequências espaçadoras transcritas internas (ITS), que são sequências encontradas entre genes de rRNA de subunidade pequena e subunidade grande que provaram ser especialmente úteis na elucidação de relações ou distinções quando comparadas entre si. Além disso, a divulgação utiliza sequências exclusivas encontradas em genes de interesse (por exemplo, nif H, D, K, L, A, glnE, amtB, etc.) para identificar os micróbios divulgados no presente documento.

[169] A estrutura primária da subunidade 16S de rRNA principal compreende uma combinação específica de regiões conservadas, variáveis e hipervariáveis que evoluem em taxas diferentes e permitem a resolução de linhagens muito antigas, como domínios, e linhagens mais modernas, como gêneros. A estrutura secundária da subunidade 16S inclui aproximadamente 50 hélices que resultam no pareamento de bases de cerca de 67% dos resíduos. Esses recursos estruturais secundários altamente conservados são de grande importância funcional e podem ser usados para garantir homologia posicional em múltiplos alinhamentos de sequência e análise filogenética. Nas últimas décadas, o gene de rRNA 16S se tornou o marcador taxonômico mais sequenciado e é a base para a classificação sistemática atual de bactérias e arqueias (Yarza et al.

2014. Nature Rev. Micro. 12:635-45).

[170] Dessa forma, em certos aspectos, a divulgação fornece uma sequência que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com qualquer sequência nas Tabelas 23, 24, 25 e 26.

[171] Dessa forma, em certos aspectos, a divulgação fornece um micróbio que compreende uma sequência, que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com as SEQ ID NOs: 62-303. Essas sequências e suas descrições associadas podem ser encontradas nas Tabelas 25 e 26.

[172] Em alguns aspectos, a divulgação fornece um micróbio que compreende uma sequência de ácidos nucleicos 16S, que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com as SEQ ID NOs: 85, 96, 111, 121, 122, 123, 124, 136, 149, 157, 167, 261, 262, 269, 277-283. Essas sequências e suas descrições associadas podem ser encontradas na Tabela 26.

[173] Em alguns aspectos, a divulgação fornece um micróbio que compreende uma sequência de ácidos nucleicos, que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com as SEQ ID NOs: 86-95, 97-110, 112-120, 125-135, 137-148, 150-156, 158-166, 168-176, 263-268, 270-274, 275, 276, 284-295. Essas sequências e suas descrições associadas podem ser encontradas na Tabela 26.

[174] Em alguns aspectos, a divulgação fornece um micróbio que compreende uma sequência de ácidos nucleicos, que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com as SEQ ID NOs: 177- 260, 296-303. Essas sequências e suas descrições associadas podem ser encontradas na Tabela 26.

[175] Em alguns aspectos, a divulgação fornece um micróbio que compreende, ou iniciador que compreende, ou sonda que compreende, ou sequência de junção não nativa que compreende uma sequência de ácido nucleico, que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com as SEQ ID NOs: 304-424. Essas sequências são descritas na Tabela 27.

[176] Em alguns aspectos, a divulgação fornece um micróbio que compreende uma sequência de junção não nativa que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com as SEQ ID NOs: 372-

405. Essas sequências são descritas na Tabela 27.

[177] Em alguns aspectos, a divulgação fornece um micróbio que compreende uma sequência de aminoácidos, que compartilha pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com as SEQ ID NOs: 77, 78, 81, 82 ou 83. Essas sequências e suas descrições associadas podem ser encontradas na Tabela 25. VARIAÇÃO GENÉTICA - MÉTODOS DE DETECÇÃO: INICIADORES,

SONDAS E ENSAIOS

[178] A presente divulgação ensina iniciadores, sondas e ensaios que são úteis para detectar os micróbios ensinados no presente documento. Em alguns aspectos, a divulgação fornece métodos de detecção das cepas parentais WT. Em outros aspectos, a divulgação fornece métodos de detecção de micróbios geneticamente modificados não intergenéricos derivados das cepas WT. Em aspectos, a presente divulgação fornece métodos de identificação de alterações genéticas não intergenéricas em um micróbio.

[179] Em aspectos, os métodos de modificação genética genômica da presente divulgação levam à criação de sequências de "junção" de nucleotídeos não naturais nos micróbios não intergenéricos derivados. Essas junções de nucleotídeos de ocorrência não natural podem ser usadas como um tipo de diagnóstico que é indicativo da presença de uma alteração genética específica em um micróbio ensinado no presente documento.

[180] As presentes técnicas são capazes de detectar essas junções de nucleotídeos de ocorrência não natural por meio da utilização de métodos de PCR quantitativos especializados, incluindo iniciadores e sondas projetados exclusivamente. Em alguns aspectos, as sondas da divulgação se ligam às sequências de junção de nucleotídeos de ocorrência não natural. Em alguns aspectos, a PCR tradicional é utilizada. Em outros aspectos, a PCR em tempo real é utilizada. Em alguns aspectos, a PCR quantitativa (qPCR) é utilizada.

[181] Assim, a divulgação pode abranger a utilização de dois métodos comuns para a detecção de produtos de PCR em tempo real: (1) corantes fluorescentes não específicos que se intercalam com qualquer DNA de fita dupla e (2) sondas de DNA específicas de sequência que consistem em oligonucleotídeos que são marcados com um repórter fluorescente que permite a detecção apenas após a hibridização da sonda com sua sequência complementar. Em alguns aspectos, apenas a junção de nucleotídeos de ocorrência não natural será amplificada por meio dos iniciadores ensinados e, consequentemente, pode ser detectada por meio de um corante não específico ou por meio da utilização de uma sonda de hibridização específica. Em outros aspectos, os iniciadores da divulgação são escolhidos de modo que os iniciadores flanqueiem ambos os lados de uma sequência de junção, de modo que se ocorrer uma reação de amplificação, então a dita sequência de junção estará presente.

[182] Aspectos da divulgação envolvem moléculas de sequência de junção de nucleotídeos de ocorrência não natural per se, juntamente com outras moléculas de nucleotídeo que são capazes de se ligar às ditas sequências de junção de nucleotídeos de ocorrência não natural sob condições de hibridização leves a estringentes. Em alguns aspectos, as moléculas de nucleotídeos que são capazes de se ligar às ditas sequências de junção de nucleotídeos de ocorrência não natural sob condições de hibridização leves a estringentes são denominadas "sondas de nucleotídeos".

[183] Em aspectos, o DNA genômico pode ser extraído de amostras e usado para quantificar a presença de micróbios da divulgação usando qPCR. Os iniciadores utilizados na reação qPCR podem ser iniciadores projetados por Primer Blast (//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) para amplificar regiões exclusivas do genoma de tipo selvagem ou regiões exclusivas das cepas mutantes não intergenéricas geneticamente modificadas. A reação qPCR pode ser realizada usando o kit SYBR GreenER qPCR SuperMix Universal (Thermo Fisher P/N 11762100), usando apenas iniciadores de amplificação direta e reversa; alternativamente, o kit Kapa Probe Force (Kapa Biosystems P/N KK4301) pode ser usado com iniciadores de amplificação e uma sonda TaqMan contendo um marcador de corante FAM na extremidade 5', um extintor ZEN interno e um ligante de sulco menor e extintor fluorescente na extremidade 3' (Integrated DNA Technologies).

[184] Certos iniciadores, sondas e sequências de junção não nativas estão listados na Tabela 27. A eficiência da reação qPCR pode ser medida usando uma curva padrão gerada a partir de uma quantidade conhecida de gDNA do genoma alvo. Os dados podem ser normalizados para cópias do genoma por g de peso fresco usando o peso do tecido e o volume de extração.

[185] A reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) é um método de quantificar, em tempo real, a amplificação de uma ou mais sequências de ácidos nucleicos. A quantificação em tempo real do ensaio de PCR permite a determinação da quantidade de ácidos nucleicos que são gerados pelas etapas de amplificação de PCR, comparando-se os ácidos nucleicos de amplificação de interesse e uma sequência de ácido nucleico de controle adequada, que pode atuar como um padrão de calibração.

[186] As sondas TaqMan são frequentemente utilizadas em ensaios qPCR que exigem uma especificidade aumentada para quantificar sequências de ácidos nucleicos alvo. As sondas TaqMan compreendem uma sonda oligonucleotídica com um fluoróforo ligado à extremidade 5’ e um extintor ligado à extremidade 3' da sonda. Quando as sondas TaqMan permanecem como estão com as extremidades 5’ e 3' da sonda em contato próximo uma com a outra, o extintor impede a transmissão do sinal fluorescente do fluoróforo. As sondas TaqMan são projetadas para se anelar dentro de uma região de ácido nucleico amplificada por um conjunto específico de iniciadores. À medida que a Taq polimerase estende o iniciador e sintetiza a fita nascente, a atividade de exonuclease 5’ a 3' da Taq polimerase degrada a sonda que se anelou com o modelo. Essa degradação da sonda libera o fluoróforo, quebrando assim a proximidade do extintor e permitindo a fluorescência do fluoróforo. A fluorescência detectada no ensaio qPCR é diretamente proporcional ao fluoróforo liberado e à quantidade de modelo de DNA presente na reação.

[187] Os recursos de qPCR permitem que o profissional elimine a etapa de pós-amplificação trabalhosa da preparação de eletroforese em gel, que geralmente é necessária para a observação dos produtos amplificados de ensaios de PCR tradicionais. Os benefícios do qPCR sobre a PCR convencional são consideráveis e incluem maior velocidade, facilidade de uso, reprodutibilidade e capacidade quantitativa.

MELHORA DE TRAÇOS

[188] Os métodos da presente divulgação podem ser empregados para introduzir ou melhorar um ou mais de uma variedade de traços desejáveis. Exemplos de traços que podem ser introduzidos ou melhorados incluem: biomassa da raiz, comprimento da raiz, altura, comprimento do broto, número de folhas, eficiência do uso de água, biomassa geral, rendimento, tamanho do fruto, tamanho do grão, taxa de fotossíntese, tolerância à seca, tolerância ao calor, tolerância ao sal, resistência ao estresse de nematódeos, resistência a um patógeno fúngico, resistência a um patógeno bacteriano, resistência a um patógeno viral, nível de um metabólito e expressão de proteoma. Os traços desejáveis, incluindo altura, biomassa geral, raiz e/ou biomassa da parte aérea, germinação de sementes, sobrevivência de mudas, eficiência fotossintética, taxa de transpiração, número ou massa de semente/fruto, grãos da planta ou rendimento de frutos, teor de clorofila da folha, taxa fotossintética, comprimento da raiz ou qualquer combinação dos mesmos, podem ser usados para medir o crescimento e comparados com a taxa de crescimento de plantas agrícolas de referência (por exemplo, plantas sem os traços melhorados) cultivadas sob condições idênticas.

[189] Um traço preferido a ser introduzido ou melhorado é a fixação de nitrogênio, como descrito no presente documento. Em alguns casos, uma planta resultante dos métodos descritos no presente documento exibe uma diferença no traço que é pelo menos cerca de 5% maior, por exemplo, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos 100%, pelo menos cerca de 200%, pelo menos cerca de 300%, pelo menos cerca de 400% ou maior que uma planta agrícola de referência cultivada sob as mesmas condições no solo. Em exemplos adicionais, uma planta resultante dos métodos descritos no presente documento exibe uma diferença no traço que é pelo menos cerca de 5% maior, por exemplo, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos 100%, pelo menos cerca de 200%, pelo menos cerca de 300%, pelo menos cerca de 400% ou maior que uma planta agrícola de referência cultivada sob condições similares no solo.

[190] O traço que será melhorado pode ser avaliado sob condições, incluindo a aplicação de um ou mais estressores bióticos ou abióticos. Exemplos de estressores incluem estresse abiótico (como estresse por calor, estresse salino, estresse por seca, estresse por frio e estresse por baixo teor de nutrientes) e estresse biótico (como estresse de nematódeos, estresse por insetos herbívoros, estresse por patógenos fúngicos, estresse por patógenos bacterianos e estresse por patógenos virais).

[191] O traço melhorado por métodos e composições da presente divulgação pode ser a fixação de nitrogênio, inclusive em uma planta que não era anteriormente capaz de fixação de nitrogênio. Em alguns casos, as bactérias isoladas de acordo com um método descrito no presente documento produzem 1% ou mais (por exemplo 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, ou mais) do nitrogênio de uma planta, o que pode representar um aumento na capacidade de fixação de nitrogênio de pelo menos 2 vezes (por exemplo, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 dobrado, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 1000 vezes ou mais) em comparação com bactérias isoladas da primeira planta antes de introduzir qualquer variação genética. Em alguns casos, as bactérias produzem 5% ou mais do nitrogênio de uma planta. O nível desejado de fixação de nitrogênio pode ser alcançado após repetir as etapas de introduzir variação genética, expor a uma pluralidade de plantas e isolar bactérias de plantas com um traço melhorado uma ou mais vezes (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 25 ou mais vezes). Em alguns casos, níveis aumentados de fixação de nitrogênio são obtidos na presença de fertilizante suplementado com glutamina, amônia ou outra fonte química de nitrogênio. Métodos para avaliar o grau de fixação de nitrogênio são conhecidos, cujos exemplos são descritos no presente documento.

[192] O melhoramento genético de micróbios é um método para identificar e melhorar sistematicamente a função das espécies no microbioma da cultura. O método compreende três etapas: 1) seleção de espécies candidatas mapeando-se interações planta-micróbio e prevendo-se redes regulatórias ligadas a um fenótipo específico, 2) aprimoramento pragmático e previsível de fenótipos microbianos por meio de cruzamento intraespécie de redes regulatórias e aglomerados de genes e 3) triagem e seleção de novos genótipos microbianos que produzem fenótipos de cultura desejados. Para avaliar sistematicamente o aprimoramento das cepas, é criado um modelo que liga a dinâmica de colonização da comunidade microbiana à atividade genética por espécies-chave. O modelo é usado para prever alvos genéticos para melhoramento genético e melhora da frequência de seleção de melhoras em traços codificados por microbioma de relevância agronômica.

MEDIÇÃO DE NITROGÊNIO ENTREGUE EM UM CONTEXTO DE CAMPO AGRICOLAMENTE RELEVANTE

[193] No campo, a quantidade de nitrogênio entregue pode ser determinada pela função de colonização multiplicada pela atividade.

[194] A equação acima exige (1) a colonização média por unidade de tecido de planta, e (2) a atividade como a quantidade de nitrogênio fixado, ou a quantidade de amônia excretada por cada célula microbiana. Para conversão em libras de nitrogênio por acre, a fisiologia do crescimento do milho é monitorada ao longo do tempo, por exemplo, o tamanho da planta e o sistema radicular associado ao longo dos estágios de maturação.

[195] As libras de nitrogênio entregue a uma cultura por acre-estação pode ser calculada pela seguinte equação:

[196] O Tecido da Planta (t) é o peso fresco do tecido da planta do milho durante o tempo de crescimento (t). Os valores para fazer o cálculo razoavelmente são descritos em detalhes na publicação intitulada Roots, Growth and Nutrient Uptake (Mengel. Dept. of Agronomy Pub.# AGRY-95-08 (Rev. May-95. p. 1-8.).

[197] A Colonização (t) é a quantidade de micróbios de interesse encontrados no tecido da planta, por grama de peso fresco do tecido da planta, em qualquer momento específico, t, durante a estação de crescimento. No caso de apenas um único ponto de tempo disponível, o único ponto de tempo é normalizado como a taxa de colonização de pico ao longo da estação, e a taxa de colonização dos pontos de tempo restantes são ajustados consequentemente.

[198] A atividade (t) é a taxa cujo N é fixado pelos micróbios de interesse por unidade de tempo, em qualquer momento específico, t, durante a estação de crescimento. Em modalidades divulgadas no presente documento, essa taxa de atividade é aproximada pelo ensaio de redução de acetileno in vitro (ARA) em meio ARA na presença de glutamina 5 mM ou ensaio de excreção de amônio em meio ARA na presença de íons amônio 5 mM.

[199] A quantidade de nitrogênio entregue é, então, calculada integrando- se numericamente a função acima. Nos casos em que os valores das variáveis descritas acima são medidos discretamente em pontos de tempo definidos, os valores entre esses pontos de tempo são aproximados realizando-se interpolação linear.

FIXAÇÃO DE NITROGÊNIO

[200] São descritos no presente documento métodos para aumentar a fixação de nitrogênio em uma planta, compreendendo expor a planta a bactérias que compreendem uma ou mais variações genéticas introduzidas em um ou mais genes que regulam a fixação de nitrogênio, em que as bactérias produzem 1% ou mais de nitrogênio na planta (por exemplo 2%, 5%, 10%, ou mais), que pode representar uma capacidade de fixação de nitrogênio de pelo menos 2 vezes em comparação com a planta na ausência das bactérias. As bactérias podem produzir o nitrogênio na presença de fertilizantes suplementados com glutamina, ureia, nitratos ou amônia. As variações genéticas podem ser qualquer variação genética descrita no presente documento, incluindo os exemplos fornecidos acima, em qualquer número e qualquer combinação. A variação genética pode ser introduzida em um gene selecionado do grupo que consiste em nifA, nifL, ntrB, ntrC, glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB, e nifQ. A variação genética pode ser uma mutação que resulta em um ou mais dos seguintes: aumento da expressão ou atividade de nifA ou glutaminase; diminuição de expressão ou atividade de nifL, NtrB, glutamina sintetase, glnB, glnK, draT, amtB; diminuição da atividade de remoção de adenilila de GlnE; ou diminuição da atividade de remoção de uridilila de GlnD. A variação genética introduzida em uma ou mais bactérias dos métodos divulgados no presente documento pode ser uma mutação de knockout ou pode suprimir uma sequência reguladora de um gene alvo, ou pode compreender a inserção de uma sequência reguladora heteróloga, por exemplo, a inserção de uma sequência reguladora encontrada dentro do genoma da mesma espécie ou gênero bacteriano. A sequência reguladora pode ser escolhida com base no nível de expressão de um gene em uma cultura bacteriana ou em tecido vegetal. A variação genética pode ser produzida por mutagênese química. As plantas cultivadas na etapa (c) podem ser expostas a estressores bióticos ou abióticos.

[201] A quantidade de fixação de nitrogênio que ocorre nas plantas descritas no presente documento pode ser medida de várias maneiras, por exemplo, por um ensaio de redução de acetileno (AR). Um ensaio de redução de acetileno pode ser realizado in vitro ou in vivo. A evidência de que uma bactéria específica está fornecendo nitrogênio fixado a uma planta pode incluir: 1) o N total da planta aumenta significativamente após a inoculação, de preferência, com um aumento concomitante na concentração de N na planta; 2) os sintomas de deficiência de nitrogênio são aliviados sob condições limitantes de N após a inoculação (que deve incluir um aumento na matéria seca); 3) afixação de N 2 é documentada através do uso de uma abordagem de 15N (que pode ser experimentos de diluição de isótopos, ensaios de redução de 15N ou ensaios de 2 abundância natural de 15 N); 4) N fixado é incorporado em uma proteína vegetal ou metabólito; e 5) todos esses efeitos não são observados em plantas não inoculadas ou em plantas inoculadas com um mutante da cepa de inóculo.

[202] A cascata reguladora de fixação de nitrogênio de tipo selvagem pode ser representada como um circuito lógico digital em que as entradas de O 2 e NH4+ passam por uma porta NOR, cuja saída entra em uma porta AND além de ATP. Em algumas modalidades, os métodos divulgados no presente documento interrompem a influência de NH4+ nesse circuito, em vários pontos da cascata regulatória, de modo que os micróbios possam produzir nitrogênio mesmo em campos fertilizados. No entanto, os métodos divulgados no presente documento também visam alterar o impacto de ATP ou O2 no conjunto de circuitos, ou substituir o conjunto de circuitos por outras cascatas regulatórias na célula, ou alterar circuitos genéticos em vez da fixação de nitrogênio. Os aglomerados de genes podem ser novamente geneticamente modificados para gerar produtos funcionais sob o controle de um sistema regulatório heterólogo. Com a eliminação de elementos regulatórios nativos fora e dentro de sequências de codificação de aglomerados de genes e substituí- los por sistemas regulatórios alternativos, os produtos funcionais de operons genéticos complexos e outros aglomerados de genes podem ser controlados e/ou movidos para células heterólogas, incluindo células de espécies diferentes em vez das espécies das quais os genes nativos foram derivados. Uma vez geneticamente modificados novamente, os aglomerados de genes sintéticos podem ser controlados por circuitos genéticos ou outros sistemas regulatórios induzíveis, controlando assim a expressão dos produtos conforme desejado. Os cassetes de expressão podem ser projetados para atuar como portas lógicas, geradores de pulso, osciladores, interruptores ou dispositivos de memória. O cassete de expressão de controle pode ser ligado a um promotor de modo que o cassete de expressão funcione como um sensor ambiental, como um sensor de oxigênio, temperatura, toque, estresse osmótico, estresse de membrana ou redox.

[203] Como exemplo, os genes nifL, nifA, nifT e nifX podem ser eliminados do aglomerado de genes nif. Os genes sintéticos podem ser projetados por códon randomizando o DNA que codifica cada sequência de aminoácidos. A seleção do códon é realizada, especificando que o uso do códon seja o mais divergente possível do uso do códon no gene nativo. As sequências propostas são varridas quanto a quaisquer características indesejadas, como sítios de reconhecimento de enzimas de restrição, sítios de reconhecimento de transpóson, sequências repetitivas, promotores sigma 54 e sigma 70, sítios de ligação ao ribossomo crípticos e terminadores independentes de rho. Os sítios de ligação ao ribossomo sintético são escolhidos para corresponder à força de cada sítio de ligação ao ribossomo nativo correspondente, como por meio da construção de um plasmídeo repórter fluorescente em que os 150 pb que circundam o códon de início de um gene (de -60 a +90) são fundidos a um gene fluorescente. Essa quimera pode ser expressa sob o controle do promotor Ptac e a fluorescência medida por meio de citometria de fluxo. Para gerar sítios de ligação ao ribossomo sintéticos, é gerada uma biblioteca de plasmídeos repórter que usa 150 pb (-60 a +90) de um cassete de expressão sintético. Brevemente, um cassete de expressão sintético pode consistir em um espaçador de DNA aleatório, uma sequência degenerada que codifica uma biblioteca RBS e a sequência de codificação para cada gene sintético. Múltiplos clones são varridos para identificar o sítio de ligação ao ribossomo sintético que melhor corresponda ao sítio de ligação ao ribossomo nativo. Operons sintéticos que consistem nos mesmos genes que os operons nativos são, dessa forma, construídos e testados quanto à complementação funcional. Uma descrição adicional exemplificativa de operons sintéticos é fornecida no documento nº US20140329326.

ESPÉCIES BACTERIANAS

[204] Os micróbios úteis nos métodos e composições divulgados no presente documento podem ser obtidos de qualquer fonte. Em alguns casos, os micróbios podem ser bactérias, arqueias, protozoários ou fungos. Os micróbios dessa divulgação podem ser micróbios fixadores de nitrogênio, por exemplo, uma bactéria fixadora de nitrogênio, arqueia fixadora de nitrogênio, fungos fixadores de nitrogênio, levedura fixadora de nitrogênio ou protozoários fixadores de nitrogênio. Os micróbios úteis nos métodos e composições divulgados no presente documento podem ser micróbios formadores de esporos, por exemplo, bactérias formadoras de esporos. Em alguns casos, as bactérias úteis nos métodos e composições divulgados no presente documento podem ser bactérias Gram positivas ou bactérias Gram negativas. Em alguns casos, as bactérias podem ser bactérias formadoras de endósporos do filo Firmicute. Em alguns casos, as bactérias podem ser um diazotrófico. Em alguns casos, as bactérias podem não ser um diazotrófico.

[205] Os métodos e composições dessa divulgação podem ser usados com uma arqueia, como, por exemplo, Methanothermobacter thermoautotrophicus.

[206] Em alguns casos, as bactérias que podem ser úteis incluem, porém sem limitação, Agrobacterium radiobacter, Bacillus acidocaldarius, Bacillus acidoterrestris, Bacillus agri, Bacillus aizawai, Bacillus albolactis, Bacillus alcalophilus, Bacillus alvei, Bacillus aminoglucosidicus, Bacillus aminovorans, Bacillus amylolyticus (também conhecido como Paenibacillus amylolyticus) Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus aneurinolyticus, Bacillus atrophaeus, Bacillus azotoformans, Bacillus badius, Bacillus cereus (sinônimos: Bacillus endorhythmos, Bacillus medusa), Bacillus chitinosporus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus endoparasiticus Bacillus fastidiosus, Bacillus firmus, Bacillus kurstaki, Bacillus lacticola, Bacillus lactimorbus, Bacillus lactis, Bacillus laterosporus (também conhecido como Brevibacillus laterosporus), Bacillus lautus, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus maroccanus megaterium, Bacillus metiens, Bacillus mycoides, Bacillus natto, Bacillus nematocida, Bacillus nigrificans, Bacillus nigrum, Bacillus pantothenticus, Bacillus popillae, Bacillus psychrosaccharolyticus, Bacillus pumilus, Bacillus siamensis, Bacillus smithii, Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus uniflagellatus, Bradyrhizobium japonicum, Brevibacillus brevis Brevibacillus laterosporus (anteriormente Bacillus laterosporus), Chromobacterium subtsugae, Delftia acidovorans, Lactobacillus acidophilus, Lysobacter antibioticus, Lysobacter enzymogenes, Paenibacillus alvei, Paenibacillus polymyxa, Paenibacillus popilliae (anteriormente Bacillus popilliae), Pantoea agglomerans, Pasteuria penetrans (anteriormente Bacillus penetrans), Pasteuria usgae, Pectobacterium carotovorum (anteriormente Erwinia carotovora), Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas cepacia (anteriormente conhecido como Burkholderia cepacia), Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas proradix, Pseudomonas putida, Pseudomonas syringae, Serratia entomophila, Serratia marcescens, Streptomyces colombiensis, Streptomyces galbus, Streptomyces goshikiensis, Streptomyces griseoviridis, Streptomyces lavendulae, Streptomyces prasinus, Streptomyces saraceticus, Streptomyces venezuelae, Xanthomonas campestris, Xenorhabdus luminescens, Xenorhabdus nematophila, Rhodococcus globerulus AQ719 (Nº de Acesso NRRL B-21663), Bacillus sp. AQ175 (Nºde Acesso ATCC 55608), Bacillus sp. AQ 177 (Nºde Acesso ATCC 55609), Bacillus sp. AQ178 (Nºde Acesso ATCC 53522) e cepa Streptomyces sp. Nºde Acesso NRRL B-30145. Em alguns casos, a bactéria pode ser Azotobacter chroococcum, Methanosarcina barkeri, Klesiella pneumoniae, Azotobacter vinelandii, Azospirillum brasilense, Rhodobacter spharoides, Rhodobacter capsulatus, Rhodobcter palustris, Rhodosporillum rubrum, Rhizobium leguminosarum ou Rhizobium etli.

[207] Em alguns casos, a bactéria pode ser uma espécie de Clostridium, por exemplo Clostridium pasteurianum, Clostridium beijerinckii, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium acetobutylicum.

[208] Em alguns casos, as bactérias usadas com os métodos e composições da presente divulgação podem ser cianobactérias. Exemplos de gêneros de cianobactérias incluem Anabaena (por exemplo, Anagaena sp. PCC7120), Nostoc (por exemplo Nostoc punctiforme) ou Synechocystis (por exemplo Synechocystis sp. PCC6803).

[209] Em alguns casos, as bactérias usadas com os métodos e composições da presente divulgação podem pertencer ao filo Chlorobi, por exemplo, Chlorobium tepidum.

[210] Em alguns casos, os micróbios usados com os métodos e composições da presente divulgação podem compreender um gene homólogo a um gene NifH conhecido. Sequências de genes NifH conhecidos podem ser encontradas, por exemplo, no banco de dados de NifH de Zehr lab, (://wwwzehr.pmc.ucsc.edu/nifH_Database_Public/, 4 de abril de 2014), ou no banco de dados NifH de Buckley lab (://www.css.cornell.edu/faculty/buckley/nifh.htm, e Gaby, John Christian e Daniel H. Buckley. "A comprehensive aligned nifH gene database: a multipurpose tool for studies of nitrogen-fixing bacteria". Banco de dados 2014 (2014): bau001.). Em alguns casos, os micróbios usados com os métodos e composições da presente divulgação podem compreender uma sequência que codifica um polipeptídeo com pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 98%, 99% ou mais de 99% de identidade de sequência com uma sequência do banco de dados de NifH de Zehr lab, (://wwwzehr.pmc.ucsc.edu/nifH_Database_Public/, 4 de abril de 2014). Em alguns casos, os micróbios usados com os métodos e composições da presente divulgação podem compreender uma sequência que codifica um polipeptídeo com pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 98%, 99% ou mais de 99% de identidade de sequência com uma sequência do banco de dados de NifH de Buckley lab, (Gaby, John Christian e Daniel H. Buckley. "A comprehensive aligned nifH gene database: a multipurpose tool for studies of nitrogen-fixing bacteria". Banco de dados 2014 (2014): bau001.).

[211] Os micróbios úteis nos métodos e composições divulgados no presente documento podem ser obtidos ao extrair micróbios de superfícies ou tecidos de plantas nativas; triturar sementes para isolar micróbios; plantar sementes em diversas amostras de solo e recuperar micróbios dos tecidos; ou inocular plantas com micróbios exógenos e determinar quais micróbios aparecem nos tecidos das plantas. Exemplos não limitadores de tecidos vegetais incluem uma semente, muda, folha, estaca, planta, bulbo, tubérculo, raiz e rizomas. Em alguns casos, as bactérias são isoladas de uma semente. Os parâmetros para o processamento de amostras podem ser variados para isolar diferentes tipos de micróbios associativos, como rizosféricos, epifíticos ou endofíticos. As bactérias podem também ser provenientes de um repositório, como coleções de cepas ambientais, em vez de inicialmente isolamento de uma primeira planta. Os micróbios podem ser genotipados e fenotipados, via sequenciamento dos genomas de micróbios isolados; perfilamento da composição das comunidades in planta; caracterização da funcionalidade transcriptômica de comunidades ou micróbios isolados; ou triagem de características microbianas usando meios seletivos ou fenotípicos (por exemplo, fenótipos de fixação de nitrogênio ou de solubilização de fosfato). As cepas ou populações candidatas selecionadas podem ser obtidas por meio de dados de sequência; dados fenotípicos; dados da planta (por exemplo, genoma, fenótipo e/ou dados de rendimento); dados do solo (por exemplo, pH, teor de N/P/K e/ou comunidades bióticas do solo a granel); ou qualquer combinação desses.

[212] As bactérias e métodos de produção de bactérias descritos no presente documento podem ser aplicados a bactérias capazes de se autopropagar eficientemente sobre a superfície da folha, superfície da raiz ou dentro dos tecidos da planta sem induzir uma reação de defesa danosa da planta ou bactérias que são resistentes às respostas de defesa da planta. As bactérias descritas no presente documento podem ser isoladas por cultura de um extrato de tecido de planta ou lavagem da superfície da folha em um meio sem nitrogênio adicionado. No entanto, as bactérias podem não ser cultiváveis, isto é, não se sabe que é cultivável ou difícil de cultivar usando métodos padrão conhecidos na técnica. As bactérias descritas no presente documento podem ser um endófito ou um epífito ou uma bactéria que habita a rizosfera da planta (bactérias rizosféricas). As bactérias obtidas após repetir as etapas de introduzir variação genética, expor a uma pluralidade de plantas e isolar bactérias de plantas com um traço melhorado uma ou mais vezes (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 25, ou mais vezes) podem ser endofíticas, epifíticas ou rizosféricas. Endófitos são organismos que entram no interior das plantas sem causar sintomas de doenças ou causar a formação de estruturas simbióticas e são de interesse agronômico, pois podem aumentar o crescimento das plantas e melhorar a nutrição das plantas (por exemplo, através da fixação de nitrogênio). As bactérias podem ser um endófito transmitido pela semente. Endófitos transmitidos por sementes incluem bactérias associadas ou derivadas da semente de uma grama ou planta, como um endófito bacteriano transmitido por sementes encontrado em sementes maduras, secas, não danificadas (por exemplo, sem rachaduras, infecção fúngica visível ou germinadas prematuramente). O endófito bacteriano transmitido pela semente pode ser associado ou derivado da superfície da semente; alternativamente, ou além disso, pode ser associado ou derivado do compartimento interno da semente (por exemplo, de uma semente esterilizada à superfície). Em alguns casos, um endófito bacteriano transmitido pela semente é capaz de se replicar no tecido da planta, por exemplo, no interior da semente. Além disso, em alguns casos, o endófito bacteriano transmitido pela semente é capaz de sobreviver à dessecação.

[213] As bactérias isoladas de acordo com os métodos da divulgação, ou usadas em métodos ou composições da divulgação, podem compreender uma pluralidade de táxons bacterianos diferentes em combinação. A título de exemplo, as bactérias podem incluir Proteobacteria (como Pseudomonas, Enterobacter, Stenotrophomonas, Burkholderia, Rhizobium, Herbaspirillum, Pantoea, Serratia, Rahnella, Azospirillum, Azorhizobium, Azotobacter, Duganella, Delftia, Bradyrhizobiun, Sinorhizobium e Halomonas), Firmicutes (como Bacillus, Paenibacillus, Lactobacillus, Mycoplasma, e Acetabacterium) e Actinobacteria (como Streptomyces, Rhodacoccus, Microbacterium e Curtobacterium). As bactérias usadas nos métodos e composições dessa divulgação podem incluir consórcios bacterianos fixadores de nitrogênio de duas ou mais espécies. Em alguns casos, uma ou mais espécies bacterianas do consórcio bacteriano podem ser capazes de fixar nitrogênio. Em alguns casos, uma ou mais espécies do consórcio bacteriano podem facilitar ou aumentar a capacidade de fixação de nitrogênio de outras bactérias. As bactérias que fixam o nitrogênio e as bactérias que aumentam a capacidade de outras bactérias fixarem o nitrogênio podem ser iguais ou diferentes. Em alguns exemplos, uma cepa bacteriana pode ser capaz de fixar nitrogênio quando em combinação com uma cepa bacteriana diferente, ou em um certo consórcio bacteriano, mas pode ser incapaz de fixar nitrogênio em uma monocultura. Exemplos de gêneros bacterianos que podem ser encontrados em consórcios de bactérias fixadoras de nitrogênio incluem, porém sem limitação, Herbaspirillum, Azospirillum, Enterobacter e Bacillus.

[214] As bactérias que podem ser produzidas pelos métodos divulgados no presente documento incluem Azotobacter sp., Bradyrhizobium sp., Klebsiella sp., e Sinorhizobium sp. Em alguns casos, as bactérias podem ser selecionadas a partir do grupo que consiste em: Azotobacter vinelandii, Azospirillum brasilense, Bradyrhizobium japonicum, Klebsiella pneumoniae e Sinorhizobium meliloti. Em alguns casos, as bactérias podem ser do gênero Enterobacter ou Rahnella. Em alguns casos, as bactérias podem ser do gênero Frankia ou Clostridium. Exemplos de bactérias do gênero Clostridium incluem, porém sem limitação, Clostridium acetobutilicum, Clostridium pasteurianum, Clostridium beijerinckii, Clostridium perfringens e Clostridium tetani. Em alguns casos, as bactérias podem ser do gênero Paenibacillus, por exemplo Paenibacillus azotofixans, Paenibacillus borealis, Paenibacillus durus, Paenibacillus macerans, Paenibacillus polymyxa, Paenibacillus alvei, Paenibacillus amylolyticus, Paenibacillus campinasensis, Paenibacillus chibensis, Paenibacillus glucanolyticus, Paenibacillus illinoisensis, Paenibacillus larvae subsp. Larvas, Paenibacillus larvae subsp. Pulvifaciens, Paenibacillus lautus, Paenibacillus macerans, Paenibacillus macquariensis, Paenibacillus macquariensis, Paenibacillus pabuli, Paenibacillus peoriae, ou Paenibacillus polymyxa.

[215] Em alguns exemplos, as bactérias isoladas de acordo com os métodos da divulgação podem ser um membro de um ou mais dos seguintes táxons: Achromobacter, Acidithiobacillus, Acidovorax, Acidovoraz, Acinetobacter, Actinoplanes, Adlercreutzia, Aerococcus, Aeromonas, Afipia, Agromyces, Ancylobacter, Arthrobacter, Atopostipes, Azospirillum, Bacillus, Bdellovibrio, Beijerinckia, Bosea, Bradyrhizobium, Brevibacillus, Brevundimonas, Burkholderia, Candidatus Haloredivivus, Caulobacter, Cellulomonas, Cellvibrio, Chryseobacterium, Citrobacter, Clostridium, Coraliomargarita, Corynebacterium, Cupriavidus, Curtobacterium, Curvibacter, Deinococcus, Delftia, Desemzia, Devosia, Dokdonella, Dyella, Enhydrobacter, Enterobacter, Enterococcus, Erwinia, Escherichia, Escherichia/Shigella, Exiguobacterium, Ferroglobus, Filimonas, Finegoldia, Flavisolibacter, Flavobacterium, Frigoribacterium, Gluconacetobacter, Hafnia, Halobaculum, Halomonas, Halosimplex, Herbaspirillum, Hymenobacter, Klebsiella, Kocuria, Kosakonia, Lactobacillus, Leclercia, Lentzea, Luteibacter, Luteimonas, Massilia, Mesorhizobium, Methylobacterium, Microbacterium, Micrococcus, Microvirga, Mycobacterium, Neisseria, Nocardia, Oceanibaculum, Ochrobactrum, Okibacterium, Oligotropha, Oryzihumus, Oxalophagus, Paenibacillus, Panteoa, Pantoea, Pelomonas, Perlucidibaca, Plantibacter , Polynucleobacter, Propionibacterium, Propioniciclava, Pseudoclavibacter, Pseudomonas, Pseudonocardia, Pseudoxanthomonas, Psychrobacter, Rahnella, Ralstonia, Rheinheimera, Rhizobium, Rhodococcus, Rhodopseudomonas, Roseateles, Ruminococcus, Sebaldella, Sediminibacillus, Sediminibacterium,

Serratia, Shigella, Shinella, Sinorhizobium, Sinosporangium, Sphingobacterium, Sphingomonas, Sphingopyxis, Sphingosinicella, Staphylococcus, 25 Stenotrophomonas, Strenotrophomonas, Streptococcus, Streptomyces, Stygiolobus, Sulfurisphaera, Tatumella, Tepidimonas, Thermomonas, Thiobacillus, Variovorax, WPS-2 genera incertae sedis, Xanthomonase Zimmermannella.

[216] Em alguns casos, uma espécie bacteriana selecionada de pelo menos um dos seguintes gêneros é utilizada: Enterobacter, Klebsiella, Kosakonia e Rahnella. Em alguns casos, é usada uma combinação de espécies bacterianas dos seguintes gêneros: Enterobacter, Klebsiella, Kosakonia e Rahnella. Em alguns casos, as espécies utilizadas podem ser uma ou mais das seguintes: Enterobacter sacchari, Klebsiella variicola, Kosakonia sacchari e Rahnella aquatilis.

[217] Em alguns casos, um micróbio Gram positivo pode ter um sistema de nitrogenase molibdênio-ferro que compreende: nifH, nifD, nifK, nifB, nifE, nifN, nifX, hesA, nifV, nifW, nifU, nifS, nifI1 e nifI2. Em alguns casos, um micróbio Gram positivo pode ter um sistema de nitrogenase de vanádio que compreende: vnfDG, vnfK, vnfE, vnfN, vupC, vupB, vupA, vnfV, vnfR1, vnfH, vnfR2, vnfA (regulador transcricional). Em alguns casos, um micróbio Gram positivo pode ter um sistema de nitrogenase apenas de ferro que compreende: anfK, anfG, anfD, anfH, anfA (regulador transcricional). Em alguns casos, um micróbio Gram positivo pode ter um sistema de nitrogenase que compreende glnBe glnK (proteínas de sinalização de nitrogênio). Alguns exemplos de enzimas envolvidas no metabolismo do nitrogênio em micróbios Gram positivos incluem glnA (glutamina sintetase), gdh (glutamato desidrogenase), bdh (3-hidroxibutirato desidrogenase), glutaminase, gltAB/gltB/gltS (glutamato sintase), asnA/asnB (aspartato- amônia ligase/asparagina sintetase), e ansA/ansZ (asparaginase). Alguns exemplos de proteínas envolvidas no transporte de nitrogênio em micróbios Gram positivos incluem amtB (transportador de amônio), glnK (regulador do transporte de amônio), glnPHQ/glnQHMP (transportadores de glutamina/glutamato dependentes de ATP), glnT/alsT/yrbD/yflA (transportadores de simporte de prótons semelhantes à glutamina), e gltP/gltT/yhcl/nqt (transportadores de simporte de prótons semelhantes ao glutamato).

[218] Exemplos de micróbios Gram positivos que podem ser de particular interesse incluem Paenibacillus polymixa, Paenibacillus riograndensis, Paenibacillus sp., Frankia sp., Heliobacterium sp., Heliobacterium chlorum, Heliobacillus sp., Heliophilum sp., Heliorestis sp., Clostridium acetobutylicum, Clostridium sp., Mycobacterium flaum, Mycobacterium sp., Arthrobacter sp., Agromyces sp., Corynebacterium autitrophicum, Corynebacterium sp., Micromonspora sp., Propionibacteria sp., Streptomyces sp. e Microbacterium sp..

[219] Alguns exemplos de alterações genéticas que podem ser feitas em micróbios Gram positivos incluem: deleção de glnR para remover a regulação negativa de BNF na presença de nitrogênio ambiental, inserir promotores diferentes diretamente a montante do aglomerado nif para eliminar a regulação por GlnR em resposta ao nitrogênio ambiental, mutar glnA para reduzir a taxa de assimilação de amônio pela via GS-GOGAT, deletar amtB para reduzir a absorção de amônio do meio, mutar glnA para que esteja constitutivamente no estado inibido por feedback (FBI-GS), para reduzir a assimilação de amônio pela via GS-GOGAT.

[220] Em alguns casos, o glnR é o principal regulador do metabolismo e da fixação do N em espécies de Paenibacillus. Em alguns casos, o genoma de uma espécie de Paenibacillus pode não conter um gene para produzir glnR. Em alguns casos, o genoma de uma espécie de Paenibacillus pode não conter um gene para produzir glnE ou glnD. Em alguns casos, o genoma de uma espécie de Paenibacillus pode conter um gene para produzir glnB ou glnK. Por exemplo, Paenibacillus sp. WLY78 não contém um gene para glnB, ou seus homólogos encontrados no archaeon Methanococcus maripaludis, nifI1 e nifI2. Em alguns casos, os genomas de espécies de Paenibacillus podem ser variáveis. Por exemplo, Paenibacillus polymixa E681 carece de glnK e gdh, tem vários transportadores de compostos de nitrogênio, porém apenas amtB parece ser controlado por GlnR. Em outro exemplo, Paenibacillus sp. JDR2 tem glnK, gdh e a maioria dos outros genes centrais do metabolismo do nitrogênio, tem muito menos transportadores de compostos de nitrogênio, porém tem glnPHQ controlado por GlnR. Paenibacillus riograndensis SBR5 contém um operon glnRA padrão, um gene fdx, um operon nif principal, um operon nif secundário e um operon anf (que codifica nitrogenase apenas de ferro). Sítios glnR/tnrA putativos foram encontrados a montante de cada um desses operons. GlnR pode regular todos os operons acima,

exceto o operon anf. GlnR pode se ligar a cada uma dessas sequências reguladoras como um dímero.

[221] As cepas fixadoras de N de Paenibacillus podem se enquadrar em dois subgrupos: Subgrupo I, que contém apenas um aglomerado mínimo de genes nif e subgrupo II, que contém um aglomerado mínimo, mais um gene não caracterizado entre nifX e hesA e muitas vezes outros aglomerados duplicando alguns genes nif, como nifH, nifHDK, nifBEN ou aglomerados que codificam vanádio nitrogenase (vnf) ou genes da nitrogenase apenas de ferro (anf).

[222] Em alguns casos, o genoma de uma espécie de Paenibacillus pode não conter um gene para produzir glnB ou glnK. Em alguns casos, o genoma de uma espécie de Paenibacillus pode conter um aglomerado nif mínimo com 9 genes transcritos de um promotor sigma-70. Em alguns casos, um aglomerado nif de Paenibacillus pode ser regulado negativamente por nitrogênio ou oxigênio. Em alguns casos, o genoma de uma espécie de Paenibacillus pode não conter um gene para produzir sigma-54. Por exemplo, Paenibacillus sp. WLY78 não contém um gene para sigma-54. Em alguns casos, um aglomerado nif pode ser regulado por glnR e/ou TnrA. Em alguns casos, a atividade de um aglomerado nif pode ser alterada alterando-se a atividade de glnR e/ou TnrA.

[223] Em Bacilli, a glutamina sintetase (GS) é inibida por feedback por altas concentrações de glutamina intracelular, causando uma mudança na confirmação (chamada de FBI-GS). Os aglomerados Nif contêm sítios de ligação distintos para os reguladores GlnR e TnrA em várias espécies de Bacilli. O GlnR se liga e reprime a expressão gênica na presença de excesso de glutamina intracelular e AMP. Uma função de GlnR pode ser prevenir o influxo e a produção intracelular de glutamina e amônio sob condições de alta disponibilidade de nitrogênio. TnrA pode ligar e/ou ativar (ou reprimir) a expressão do gene na presença de glutamina intracelular limitante e/ou na presença do FBI-GS. Em alguns casos, a atividade de um aglomerado de Bacilli nif pode ser alterada alterando-se a atividade de GlnR.

[224] A glutamina sintetase inibida por feedback (FBI-GS) pode ligar GlnR e estabilizar a ligação de GlnR a sequências de reconhecimento. Várias espécies bacterianas têm um sítio de ligação a GlnR/TnrA a montante do aglomerado nif. A alteração da ligação de FBI-GS e GlnR pode alterar a atividade da via nif.

FONTES DE MICRÓBIOS

[225] As bactérias (ou qualquer micróbio de acordo com a divulgação) podem ser obtidas a partir de qualquer ambiente terrestre geral, incluindo seus solos, plantas, fungos, animais (incluindo invertebrados) e outra biota, incluindo os sedimentos, água e biota de lagos e rios; do ambiente marinho, sua biota e sedimentos (por exemplo, água do mar, lamas marinhas, plantas marinhas, invertebrados marinhos (por exemplo, esponjas), vertebrados marinhos (por exemplo, peixes)); a geosfera terrestre e marinha (rególito e rocha, por exemplo, rochas subterrâneas esmagadas, areia e argila); a criosfera e sua água de degelo; a atmosfera (por exemplo, poeiras aéreas filtradas, nuvens e gotas de chuva); ambientes urbanos, industriais e outros feitos pelo homem (por exemplo, matéria orgânica e mineral acumulada no concreto, calhas de beira de estrada, superfícies de telhado e superfícies de estrada).

[226] As plantas das quais as bactérias (ou qualquer micróbio de acordo com a divulgação) são obtidas podem ser uma planta com um ou mais traços desejáveis, por exemplo, uma planta que cresce naturalmente em um ambiente específico ou sob certas condições de interesse. A título de exemplo, uma certa planta pode crescer naturalmente em solo arenoso ou areia de alta salinidade, ou sob temperaturas extremas, ou com pouca água, ou pode ser resistente a certas pragas ou doenças presentes no meio ambiente, e pode ser desejável para uma cultura comercial a ser cultivada em tais condições, particularmente se as mesmas forem, por exemplo, as únicas condições disponíveis em uma localização geográfica específica. A título de exemplo adicional, as bactérias podem ser coletadas de culturas comerciais cultivadas em tais ambientes, ou mais especificamente de plantas de culturas individuais que melhor exibem um traço de interesse entre uma cultura cultivada em qualquer ambiente específico: por exemplo, as plantas de crescimento mais rápido entre um cultura cultivada em solos limitantes salinos, ou as plantas menos danificadas em culturas expostas a danos severos por insetos ou epidemia de doenças, ou plantas com quantidades desejadas de certos metabólitos e outros compostos, incluindo teor de fibra, teor de óleo e similares, ou plantas que exibem cores, sabor ou cheiro desejáveis. As bactérias podem ser coletadas de uma planta de interesse ou de qualquer material que ocorra no ambiente de interesse, incluindo fungos e outros animais e biota vegetal, solo, água, sedimentos e outros elementos do ambiente, conforme referido anteriormente.

[227] As bactérias (ou qualquer micróbio de acordo com a divulgação) podem ser isoladas do tecido da planta. Esse isolamento pode ocorrer a partir de qualquer tecido adequado na planta, incluindo, por exemplo, raiz, talo e folhas e tecidos reprodutivos da planta. A título de exemplo, os métodos convencionais para isolamento de plantas incluem tipicamente a excisão estéril do material vegetal de interesse (por exemplo, raízes ou comprimentos de talo, folhas), esterilização de superfície com uma solução adequada (por exemplo, hipoclorito de sódio a 2%), após o qual o material vegetal é colocado em meio nutriente para o crescimento microbiano. Alternativamente, o material vegetal esterilizado na superfície pode ser triturado em um líquido estéril (geralmente água) e a suspensão líquida, incluindo pequenos pedaços do material vegetal triturado, espalhado sobre a superfície de um meio de ágar sólido adequado, ou meio, que pode ou pode não ser seletivo (por exemplo, conter apenas ácido fítico como uma fonte de fósforo). Essa abordagem é especialmente útil para bactérias que formam colônias isoladas e podem ser separadas individualmente para placas separadas de meio nutriente e, ainda, purificadas para uma única espécie por métodos bem conhecidos. Alternativamente, a raiz da planta ou amostras de folhagem podem não ser esterilizadas na superfície, porém apenas lavadas suavemente, incluindo microrganismos epifíticos de superfície no processo de isolamento, ou os micróbios epifíticos podem ser isolados separadamente, imprimindo e retirando pedaços de raízes de plantas, talo ou folhas na superfície de um meio de ágar e, então, isolando as colônias individuais como acima. Essa abordagem é especialmente útil para bactérias, por exemplo. Alternativamente, as raízes podem ser processadas sem remover por lavagem pequenas quantidades de solo aderidas às raízes, incluindo micróbios que colonizam a rizosfera da planta. De outro modo, o solo que adere às raízes pode ser removido, diluído e espalhado em ágar de meio seletivo e não seletivo adequado para isolar colônias individuais de bactérias rizosféricas.

TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICRORGANISMOS PARA EFEITOS DE PROCEDIMENTO DE PATENTE

[228] Os depósitos microbianos da presente divulgação foram feitos de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para Efeitos do Procedimento em Matéria de Patentes (Tratado de Budapeste).

[229] Os requerentes declaram que, de acordo com 37 C.F.R. § 1808(a)(2) "todas as restrições impostas pelo depositante sobre a disponibilidade ao público do material depositado serão irrevogavelmente removidas após a concessão da patente”. Essa declaração está sujeita ao parágrafo (b) dessa seção (ou seja 37 C.F.R. § 1808(b)).

[230] O Enterobacter sacchari foi agora reclassificado como Kosakonia sacchari, o nome do organismo pode ser usado de forma intercambiável ao longo do manuscrito.

[231] Quaisquer micróbios da presente divulgação são derivados de duas cepas de tipo selvagem. A cepa CI006 é uma espécie bacteriana anteriormente classificada no gênero Enterobacter (consultar a reclassificação mencionada acima em Kosakonia). A cepa CI019 é uma espécie bacteriana classificada no gênero Rahnella. As informações de depósito para CI006 Kosakonia tipo selvagem (WT) e CI019 Rahnella WT são encontradas na Tabela 1abaixo.

[232] Alguns microrganismos descritos nesse pedido foram depositados em 6 de janeiro de 2017 ou 11 de agosto de 2017 com o Bigelow National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA), localizado em 60 Bigelow Drive, East Boothbay, Maine 04544, EUA. Conforme supracitado, todos os depósitos foram feitos de acordo com os termos do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para Efeitos do Procedimento em Matéria de Patentes. Os números de acesso do Bigelow National Center for Marine Algae and Microbiota e as datas de depósito para os depósitos do Tratado de Budapeste supracitados são fornecidos na Tabela 1.

[233] As culturas biologicamente puras de Kosakonia sacchari (WT), Rahnella aquatilis (WT) e uma cepa variante/remodelada de Kosakonia sacchari foram depositadas em 6 de janeiro de 2017 com o Bigelow National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA), localizado em 60 Bigelow Drive, East

Boothbay, Maine 04544, EUA, e atribuídas com os números de Designação de Depósito de Patente NCMA 201701001, 201701003, e 201701002, respectivamente. As informações de depósito aplicáveis são encontradas abaixo na Tabela 1.

[234] As culturas biologicamente puras de cepas variantes/remodeladas de Kosakonia sacchari foram depositadas em sexta-feira, 11 de agosto de 2017 com o Bigelow National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA), localizado em 60 Bigelow Drive, East Boothbay, Maine 04544, EUA, e atribuídas com os números de Designação de Depósito de Patente NCMA 201708004, 201708003, e 201708002, respectivamente. As informações de depósito aplicáveis são encontradas abaixo na Tabela 1.

[235] Uma cultura biologicamente pura de Klebsiella variicola (WT) foi depositada em 11 de agosto de 2017 com o Bigelow National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA), localizado em 60 Bigelow Drive, East Boothbay, Maine 04544, EUA, e atribuída com o número de depósito de Designação de Depósito de Patente NCMA 201708001. As culturas biologicamente puras de duas cepas variantes/remodeladas de Klebsiella variicola foram depositadas em quarta- feira, 20 de dezembro de 2017 com o Bigelow National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA), localizado em 60 Bigelow Drive, East Boothbay, Maine 04544, EUA, e atribuídas com os números de Designação de Depósito de Patente NCMA 201712001 e 201712002, respectivamente. As informações de depósito aplicáveis são encontradas abaixo na Tabela 1. TABELA 1: MICRORGANISMOS DEPOSITADOS SOB O TRATADO DE

BUDAPESTE Designação de Cepa Pivot Depositári (algumas Número Data de Taxonomia o cepas têm de Acesso Depósito múltiplas designações ) CI006, Kosakonia sacchari 6 de janeiro de NCMA PBC6.1, 201701001 (WT) 2017 6

Designação de Cepa Pivot Depositári (algumas Número Data de Taxonomia o cepas têm de Acesso Depósito múltiplas designações ) CI019, Rahnella aquatilis 6 de janeiro de NCMA 201701003 19 (WT) 2017 CM029, 6- 6 de janeiro de NCMA Kosakonia sacchari 201701002 412 2017 6-403 11 de agosto de NCMA Kosakonia sacchari 201708004 CM037 2017 6-404, 11 de agosto de NCMA CM38, Kosakonia sacchari 201708003 2017 PBC6.38 CM094, 11 de agosto de NCMA 6-881, Kosakonia sacchari 201708002 2017 PBC6.94 CI137, 137, Klebsiella variicola 11 de agosto de NCMA 201708001 PB137 (WT) 2017 20 de dezembro NCMA 137-1034 Klebsiella variicola 201712001 de 2017 20 de dezembro NCMA 137-1036 Klebsiella variicola 201712002 de 2017

MICRORGANISMOS ISOLADOS E BIOLOGICAMENTE PUROS

[236] A presente divulgação, em certas modalidades, fornece microrganismos isolados e biologicamente puros que têm aplicações, inter alia, na agricultura. Os microrganismos divulgados podem ser utilizados em seus estados isolados e biologicamente puros, bem como formulados em composições (consultar a seção abaixo para descrições de composições exemplificativas). Além disso, a divulgação fornece composições microbianas contendo pelo menos dois membros dos microrganismos isolados e biologicamente puros divulgados, bem como métodos de utilização das ditas composições microbianas. Além disso, a divulgação fornece métodos de modulação da fixação de nitrogênio em plantas via utilização dos micróbios isolados e biologicamente puros divulgados.

[237] Em alguns aspectos, os microrganismos isolados e biologicamente puros da divulgação são aqueles da Tabela 1. Em outros aspectos, os microrganismos isolados e biologicamente puros da divulgação são derivados de um microrganismo da Tabela 1. Por exemplo, uma cepa, filho, mutante ou derivado de um microrganismo da Tabela 1 são fornecidos no presente documento. A divulgação contempla todas as combinações possíveis de micróbios mencionados na Tabela 1, as ditas combinações às vezes formam consórcios microbianos. Os micróbios da Tabela 1, individualmente ou em qualquer combinação, podem ser combinados com qualquer planta, molécula ativa (sintética, orgânica, etc.), adjuvante, carreador, suplemento ou biológico, mencionado na divulgação.

[238] Em alguns aspectos, a divulgação fornece composições microbianas compreendendo espécies agrupadas nas Tabelas 2-8. Em alguns aspectos, essas composições compreendendo várias espécies microbianas são denominadas um consórcio ou consórcios microbianos.

[239] Em relação às Tabelas 2-8, as letras de A I representam uma seleção não limitante de microrganismos da presente divulgação, definida como:

[240] A = Micróbio com número de acesso 201701001 identificado na Tabela 1;

[241] B = Micróbio com número de acesso 201701003 identificado na Tabela 1;

[242] C = Micróbio com número de acesso 201701002 identificado na Tabela 1;

[243] D = Micróbio com número de acesso 201708004 identificado na Tabela 1;

[244] E = Micróbio com número de acesso 201708003 identificado na Tabela 1;

[245] F = Micróbio com número de acesso 201708002 identificado na Tabela 1;

[246] G = Micróbio com número de acesso 201708001 identificado na Tabela 1;

[247] H = Micróbio com número de acesso 201712001 identificado na Tabela 1; e

[248] I = Micróbio com número de acesso 201712002 identificado na Tabela

1. TABELA 2: COMPOSIÇÕES DE OITO E NOVE CEPAS A, B, C, D, E, A, B, C, D, A, B, C, D, A, B, C, D, E, A, B, C, D, A, B, C, E, F, G, H E, F, G, I E, F, H, I G, H, I F, G, H, I F, G, H, I A, B, D, E, F, A, C, D, E, B, C, D, E, A, B, C, D, E, G, H, I F, G, H, I F, G, H, I F, G, H, I TABELA 3: COMPOSIÇÕES DE SETE CEPAS A,B,C,D,E,F, A, B, C, D, A, B, C, D, A, B, C, D, E, A, B, C, D, E, A, B, C, D, G E, F, H E, F, I G, H G, I E, H, I A, B, C, D, F, A, B, C, D, F, A, B, C, D, A, B, C, D, A, B, C, E, F, A, B, C, E, G, H G, I F, H, I G, H, I G, H F, G, I A, B, C, E, F, A, B, C, E, A, B, C, F, A, B, D, E, F, A, B, D, E, F, A, B, D, E, H, I G, H, I G, H, I G, H G, I F, H, I A, B, D, E, G, A, B, D, F, A, B, E, F, A, C, D, E, F, A, C, D, E, F, A, C, D, E, H, I G, H, I G, H, I G, H G, I F, H, I A, C, D, E, A, C, D, F, A, C, E, F, A, D, E, F, G, B, C, D, E, F, B, C, D, E, G, H, I G, H, I G, H, I H, I G, H F, G, I B, C, D, E, F, B, C, D, E, B, C, D, F, B, C, E, F, G, B, D, E, F, G, C, D, E, F, H, I G, H, I G, H, I H, I H, I G, H, I TABELA 4: COMPOSIÇÕES DE SEIS CEPAS A, B, C, D, A, B, C, D, A, B, C, D, A, B, C, D, A, B, C, D, A, B, C, D, A, B, C, D, E, F E, G E, H E, I F, G F, H F, I A, B, C, D, A, B, C, D, A, B, C, D, A, B, C, E, A, B, C, E, A, B, C, E, A, B, C, E, G, H G, I H, I F, G F, H F, I G, H A, B, C, E, A, B, C, E, A, B, C, F, A, B, C, F, A, B, C, F, A, B, C, G, A, B, D, E, G, I H, I G, H G, I H, I H, I F, G A, B, D, E, A, B, D, E, A, B, D, E, A, B, D, E, A, B, D, E, A, B, D, F, A, B, D, F, F, H F, I G, H G, I H, I G, H G, I D, E, F, G, C, E, F, G, A, B, D, F, A, B, D, G, A, B, E, F, A, B, E, F, A, B, E, F, H, I H, I H, I H, I G, H G, I H, I A, B, E, G, A, B, F, G, A, C, D, E, A, C, D, E, A, C, D, E, A, C, D, E, A, C, D, E, H, I H, I F, G F, H F, I G, H G, I A, C, D, E, A, C, D, F, A, C, D, F, A, C, D, F, A, C, D, G, A, C, E, F, A, C, E, F, H, I G, H G, I H, I H, I G, H G, I A, C, E, F, A, C, E, G, A, C, F, G, A, D, E, F, A, D, E, F, A, D, E, F, A, D, E, G,

H, I H, I H, I G, H G, I H, I H, I A, D, F, G, A, E, F, G, B, C, D, E, B, C, D, E, B, C, D, E, B, C, D, E, B, C, D, E, H, I H, I F, G F, H F, I G, H G, I B, C, D, E, B, C, D, F, B, C, D, F, B, C, D, F, B, C, D, G, B, C, E, F, B, C, E, F, H, I G, H G, I H, I H, I G, H G, I B, C, E, F, B, C, E, G, B, C, F, G, B, D, E, F, B, D, E, F, B, D, E, F, B, D, E, G, H, I H, I H, I G, H G, I H, I H, I B, D, F, G, B, E, F, G, C, D, E, F, C, D, E, F, C, D, E, F, C, D, E, G, C, D, F, G, H, I H, I G, H G, I H, I H, I H, I

TABELA 5: COMPOSIÇÕES DE CINCO CEPAS

A, B, C, A, B, C, A, B, C, A, B, C, A, B, C, A, B, C, A, B, C, A, B, C, D, E D, F D, G D, H D, I E, F E, G E, H A, B, C, A, B, C, A, B, C, A, B, C, A, B, C, A, B, C, A, B, D, A, B, D, F, H F, G F, I G, H G, I H, I E, F E, G A, B, D, A, B, D, A, B, D, A, B, D, A, B, D, A, B, D, A, B, D, A, B, E, E, I F, G F, H F, I G, H G, I H, I F, G A, B, E, A, B, E, A, B, E, A, B, E, A, B, F, A, B, F, A, B, F, A, B, G, F, I G, H G, I H, I G, H G, I H, I H, I A, C, D, A, C, D, A, C, D, A, C, D, A, C, D, A, C, D, A, C, D, A, C, D, E, G E, H E, I F, G F, H F, I G, H G, I A, C, E, A, C, E, A, C, E, A, C, E, A, C, E, A, C, E, A, C, F, A, C, F, F, G F, H F, I G, H G, I H, I G, H G, I A, C, G, A, D, E, A, D, E, A, D, E, A, D, E, A, D, E, A, D, E, A, D, F, H, I F, G F, H F, I G, H G, I H, I G, H A, D, F, A, D, G, A, E, F, A, E, F, A, E, F, A, E, G, A, F, G, B, C, D, H, I H, I G, H G, I H, I H, I H, I E, F B, C, D, B, C, D, B, C, D, B, C, D, B, C, D, B, C, D, B, C, D, B, C, D, E, H E, I F, G F, H F, I G, H G, I H, I B, C, E, B, C, E, B, C, E, B, C, E, B, C, E, B, C, F, B, C, F, B, C, F, F, H F, I G, H G, I H, I G, H G, I H, I B, D, E, B, D, E, B, D, E, B, D, E, B, D, E, B, D, E, B, D, F, B, D, F, F, G F, H F, I G, H G, I H, I G, H G, I B, D, G, B, E, F, B, E, F, B, E, F, B, E, G, B, F, G, C, D, E, C, D, E, H, I G, H G, I H, I H, I H, I F, G F, H C, D, E, C, D, E, C, D, E, C, D, F, C, D, F, C, D, F, C, D, G, C, E, F, G, H G, I H, I G, H G, I H, I H, I G, H C, E, F, C, E, G, C, F, G, D, E, F, D, E, F, D, E, F, D, E, G, D, F, G, H, I H, I H, I G, H G, I H, I H, I H, I

A, B, C, A, B, D, A, B, E, A, C, D, A, C, D, A, C, F, A, D, F, B, C, D, E, I E, H F, H E, F H, I H, I G, I E, G B, C, E, B, C, G, B, D, F, C, D, E, C, E, F, E, F, G, F, G H, I H, I F, I G, I H, I TABELA 6: COMPOSIÇÕES DE QUATRO CEPAS A, B, C, A, B, C, A, B, C, A, B, C, A, B, C, A, B, C, A, B, D, A, B, D, D, G, H,

D E F G H I E F I A, B, D, A, B, D, A, B, D, A, B, E, A, B, E, A, B, E, A, B, E, A, B, F, E, F, G, G H I F G H I G H A, B, F, A, D, F, A, D, F, A, D, G, A, D, G, A, D, H, A, E, F, A, E, F, E, F, G, H H I H I I G H I A, B, F, A, B, G, A, B, G, A, B, H, A, C, D, A, C, D, A, C, D, A, C, D, E, F, H, I H I I E F G H I A, C, D, A, C, E, A, C, E, A, C, E, A, C, E, A, C, F, A, C, F, A, C, F, E, G, H, I F G H I G H I I A, C, G, A, C, G, A, C, H, A, D, E, A, D, E, A, D, E, A, D, E, A, D, F, F, G, H, H I I F G H I G I A, E, F, A, E, G, A, E, G, A, E, H, A, F, G, A, F, G, A, F, H, A, G, H, D, E, F, I H I I H I I I H B, C, D, B, C, D, B, C, D, B, C, D, B, C, D, B, C, E, B, C, E, B, C, E, D, E, F, E F G H I F G H I B, C, E, B, C, F, B, C, F, B, C, F, B, C, G, B, C, G, B, C, H, B, D, E, D, E, G, I G H I H I I F H B, D, E, B, D, E, B, D, E, B, D, F, B, D, F, B, D, F, B, D, G, B, D, G, D, E, G, G H I G H I H I I B, D, H, B, E, F, B, E, F, B, E, F, B, E, G, B, E, G, B, E, H, B, F, G, D, E, H, I G H I H I I H I B, F, G, B, F, H, B, G, H, C, D, E, C, D, E, C, D, E, C, D, E, C, D, F, D, F, G, I I I F G H I G H C, D, F, C, D, F, C, D, G, C, D, G, C, D, H, C, E, F, C, E, F, C, E, F, D, F, G, H I H I I G H I I C, E, G, C, E, G, C, E, H, C, F, G, C, F, G, C, F, H, C, G, H, D, E, F, D, F, H,

H I I H I I I G I TABELA 7: COMPOSIÇÕES DE TRÊS CEPAS A, B, A, B, A, B, A, B, A, C, E, F, A,B,C A,B,D A, B, I A,C,E G, H, I

E F G H D H A, C, A, C, A, C, A, C, I A, D, A, D, A, D, A, D, A, D, I F, H, I E, F, F G H E F G H G A, E, A, E, A, E, A, F, A, F, A, G, A, E, I A, F, I A, G, I F, G, I D, H, I F G H G H H B, C, B, C, B, C, B, C, B, C, B, D, B, D, F, G, A, H, I B, C, I D, G, I D E F G H E F H B, D, B, D, B, E, B, E, B, F, B, F, B, D, I B,E,G B, E, I E, H, I E, F, I G H F H G H B, G, C, D, C, D, C, D, C, D, D, G, B, F, I B, G, I B, H, I C, D, I E, G, I H E F G H H C, E, C, E, C, E, C, F, C, F, C, G, C, G, E, G, C, E, I CFI D, F, I F G H G H H I H D, E, D, E, D, F, D, F, C, H, I D,E,G D, E, I

F H G H TABELA 8: COMPOSIÇÕES DE DUAS CEPAS A, C, A,B A,C A,D A, E A, F A, H A,I B,C B, D B,E B, F B, G B, H B,I

G D C, D, D, F, C, E C, F C,H C,I D,E D,F D,I E, F E,G E,H E,I F,H G G H G F,I G,H G,I H,I

[249] Em algumas modalidades, as composições microbianas podem ser selecionadas a partir de qualquer grupo membro das Tabelas 2-8.

[250] Em algumas modalidades, qualquer micróbio da presente divulgação pode ser modificado ou otimizado para excretar amônio constitutiva ou não constitutivamente. Em algumas modalidades, a modificação de qualquer micróbio da presente divulgação é uma modificação transgênica. Em algumas modalidades, os micróbios já são um organismo transgênico e as cepas são modificadas de modo que não contenham mais um elemento transgênico. Em algumas modalidades, a modificação de qualquer micróbio da presente divulgação é uma modificação não transgênica. Em algumas modalidades, quaisquer dois ou mais PGPR são combinados em um consórcio microbiano. Em algumas modalidades, quaisquer dois ou mais micróbios da presente divulgação, ou aqueles derivados dos mesmos, são combinados em um consórcio microbiano. Em algumas modalidades, os consórcios microbianos são aplicados a qualquer uma ou mais plantas da presente divulgação e/ou ao solo circundante ou meio de crescimento. Em algumas modalidades, qualquer PGPR é aplicado a qualquer uma ou mais das plantas da presente divulgação e/ou ao solo circundante ou meio de crescimento.

[251] Em algumas modalidades, os micróbios da presente divulgação são modificados ou otimizados para intensificar ou aumentar a capacidade de colonizar plantas. Em algumas modalidades, a capacidade acentuada ou aumentada de colonizar plantas é uma capacidade intensificada ou aumentada de colonizar a superfície das raízes.

COMPOSIÇÕES AGRÍCOLAS

[252] As composições compreendendo bactérias ou populações bacterianas produzidas de acordo com os métodos descritos no presente documento e/ou tendo as características descritas no presente documento, podem estar sob a forma de um líquido, uma espuma ou um produto seco. As composições compreendendo bactérias ou populações bacterianas produzidas de acordo com os métodos descritos no presente documento e/ou tendo as características, conforme descrito no presente documento, podem também ser usadas para aprimorar os traços de plantas. Em alguns exemplos, uma composição compreendendo populações bacterianas pode estar sob a forma de um pó seco, uma pasta fluida de pó e água ou um tratamento de semente fluxível. As composições compreendendo populações bacterianas podem ser revestidas na superfície de uma semente e podem estar sob a forma líquida.

[253] A composição pode ser fabricada em biorreatores, como reatores de tanque agitado contínuo, reatores em batelada e na fazenda. Em alguns exemplos, as composições podem ser armazenadas em um recipiente, como um jarro ou em mini granel. Em alguns exemplos, as composições podem ser armazenadas dentro de um objeto selecionado do grupo que consiste em uma garrafa, campânula, ampola, pacote, vaso, saco, caixa, contentor, envelope, caixa de papelão, recipiente, silo, contêiner para transporte, carroceria de caminhão e/ou invólucro.

[254] As composições podem também ser usadas para melhorar os traços das plantas. Em alguns exemplos, uma ou mais composições podem ser revestidas sobre uma semente. Em alguns exemplos, uma ou mais composições podem ser revestidas sobre uma muda. Em alguns exemplos, uma ou mais composições podem ser revestidas sobre uma superfície de uma semente. Em alguns exemplos, uma ou mais composições podem ser revestidas sobre uma camada acima de uma superfície de uma semente. Em alguns exemplos, uma composição que é revestida sobre uma semente pode estar sob a forma líquida, na forma de produto seco, na forma de espuma, na forma de uma pasta fluida de pó e água ou em um tratamento de semente fluxível. Em alguns exemplos, uma ou mais composições podem ser aplicadas a uma semente e/ou muda por pulverização, imersão, revestimento, encapsulamento e/ou salpicamento de pó da semente e/ou muda com uma ou mais composições. Em alguns exemplos, várias bactérias ou populações bacterianas podem ser revestidas em uma semente e/ou uma muda da planta. Em alguns exemplos, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez ou mais de dez bactérias de uma combinação bacteriana podem ser selecionadas de um dos seguintes gêneros: Acidovorax, Agrobacterium, Bacillus, Burkholderia, Chryseobacterium, Curtobacterium, Enterobacter, Escherichia, Methylobacterium, Paenibacillus, Pantoea, Pseudomonas, Ralstonia, Saccharibacillus, Sphingomonas e Stenotrophomonas.

[255] Em alguns exemplos, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez ou mais de dez bactérias e populações bacterianas de uma combinação endofítica são selecionados a partir de uma das seguintes famílias: Bacillaceae, Burkholderiaceae, Comamonadaceae, Enterobacteriaceae, Flavobacteriaceae, Methylobacteriaceae, Microbacteriaceae, Paenibacillileae, Pseudomonnaceae, Rhizobiaceae, Sphingomonadaceae, Xanthomonadaceae, Cladosporiaceae, Gnomoniaceae, Incertae sedis, Lasiosphaeriaceae, Netriaceae e Pleosporaceae.

[256] Em alguns exemplos, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez ou mais de dez bactérias e populações bacterianas de uma combinação endofítica são selecionados a partir de uma das seguintes famílias: Bacillaceae, Burkholderiaceae, Comamonadaceae, Enterobacteriaceae, Flavobacteriaceae, Methylobacteriaceae, Microbacteriaceae, Paenibacillileae,

Pseudomonnaceae, Rhizobiaceae, Sphingomonadaceae, Xanthomonadaceae, Cladosporiaceae, Gnomoniaceae, Incertae sedis, Lasiosphaeriaceae, Netriaceae, Pleosporaceae.

[257] Exemplos de composições podem incluir revestimentos de sementes para culturas agrícolas comercialmente importantes, por exemplo, sorgo, canola, tomate, morango, cevada, arroz, milho e trigo. Exemplos de composições podem também incluir revestimentos de sementes para milho, soja, canola, sorgo, batata, arroz, vegetais, cereais e sementes oleaginosas. As sementes fornecidas no presente documento podem ser organismos geneticamente modificados (OGM), não-OGM, orgânicos ou convencionais. Em alguns exemplos, as composições podem ser pulverizadas nas partes aéreas da planta ou aplicadas às raízes por inserção em sulcos em que as sementes da planta são plantadas, rega do solo ou imersão das raízes em uma suspensão da composição. Em alguns exemplos, as composições podem ser desidratadas de maneira adequada que mantém a viabilidade/estabilidade da célula e a capacidade de inocular e colonizar artificialmente plantas hospedeiras. As espécies bacterianas podem estar presentes em composições a uma concentração entre 10 8 a 1010 UFC/ml. Em alguns exemplos, as composições podem ser suplementadas com íons de metal traço, como íons de molibdênio, íons de ferro, íons de manganês ou combinações desses íons. A concentração de íons em exemplos de composições como descrito no presente documento pode ser entre cerca de 0,1 mM e cerca de 50 mM. Alguns exemplos de composições podem também ser formulados com um carreador, como beta-glucano, carboxilmetilcelulose (CMC), substância polimérica extracelular bacteriana (EPS), açúcar, leite animal ou outros carreadores adequados. Em alguns exemplos, turfa ou materiais de plantação podem ser usados como um carreador, ou biopolímeros em que uma composição está aprisionada no biopolímero podem ser usados como um carreador. As composições que compreendem as populações bacterianas descritas no presente documento podem melhorar os traços das plantas, como promover o crescimento da planta, manter o teor de clorofila alto nas folhas, aumentar o número de frutas ou sementes e aumentar o peso da unidade de fruta ou semente.

[258] As composições que compreendem as populações bacterianas descritas no presente documento podem ser revestidas sobre a superfície de uma semente. Como tal, as composições que compreendem uma semente revestida com uma ou mais bactérias descritas no presente documento são também contempladas. O revestimento da semente pode ser formado pela mistura da população bacteriana com um carreador granular poroso quimicamente inerte. Alternativamente, as composições podem ser inseridas diretamente nos sulcos nos quais a semente é plantada ou pulverizada sobre as folhas da planta ou aplicada imergindo as raízes em uma suspensão da composição. Uma quantidade eficaz da composição pode ser usada para ocupar a região do subsolo adjacente às raízes da planta com crescimento bacteriano viável ou ocupar as folhas da planta com crescimento bacteriano viável. Em geral, uma quantidade eficaz é uma quantidade suficiente para resultar em plantas com traços melhorados (por exemplo, um nível desejado de fixação de nitrogênio).

[259] As composições bacterianas descritas no presente documento podem ser formuladas usando um carreador agricolamente aceitável. A formulação útil para essas modalidades pode incluir pelo menos um membro selecionado do grupo que consiste em um agente de pegajosidade, um estabilizante microbiano, um fungicida, um agente antibacteriano, um conservante, um estabilizante, um tensoativo, um agente anticomplexo, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador de crescimento de planta, um fertilizante, um rodenticida, um dessecante, um bactericida, um nutriente ou qualquer combinação dos mesmos. Em alguns exemplos, as composições podem ser estáveis em armazenamento. Por exemplo, qualquer uma das composições descritas no presente documento pode incluir um carreador agricolamente aceitável (por exemplo, um ou mais de um fertilizante, como um fertilizante não natural, um agente de adesão, como um agente de adesão não natural, e um pesticida como um pesticida de ocorrência não natural). Um agente de adesão de ocorrência não natural pode ser, por exemplo, um polímero, copolímero ou cera sintética. Por exemplo, qualquer uma das sementes revestidas, mudas ou plantas descritas no presente documento pode conter tal carreador agricolamente aceitável no revestimento da semente. Em qualquer uma das composições ou métodos descritos no presente documento, um carreador agricolamente aceitável pode ser ou pode incluir um composto de ocorrência não natural (por exemplo, um fertilizante de ocorrência não natural, um agente de adesão de ocorrência não natural, como um polímero, copolímero ou cera sintética ou um pesticida de ocorrência não natural). Exemplos não limitantes de carreadores agricolamente aceitáveis são descritos abaixo. Exemplos adicionais de carreadores agricolamente aceitáveis são conhecidos na técnica.

[260] Em alguns casos, as bactérias são misturadas com um carreador agricolamente aceitável. O carreador pode ser um carreador sólido ou líquido e em várias formas, incluindo microesferas, pós, emulsões e similares. O carreador pode ser qualquer um ou mais de uma série de carreadores que conferem uma variedade de propriedades, como maior estabilidade, molhabilidade ou dispersabilidade. Agentes umectantes, como tensoativos naturais ou sintéticos, que podem ser tensoativos não iônicos ou iônicos, ou uma combinação dos mesmos, podem ser incluídos na composição. As emulsões de água em óleo podem também ser usadas para formular uma composição que inclui as bactérias isoladas (consultar, por exemplo, a Patente US nº7.485.451). As formulações adequadas que podem ser preparadas incluem pós molháveis, grânulos, géis, tiras de ágar ou péletes, espessantes e similares, partículas microencapsuladas e similares, líquidos, como fluidos aquosos, suspensões aquosas, emulsões de água em óleo, etc. A formulação pode incluir grãos ou produtos leguminosos, por exemplo, grãos moídos ou feijões, caldo ou farinha derivada de grãos ou feijões, amido, açúcar ou óleo.

[261] Em algumas modalidades, o carreador agrícola pode ser solo ou um meio de crescimento de planta. Outros carreadores agrícolas que podem ser usados incluem água, fertilizantes, óleos à base de plantas, umectantes ou combinações dos mesmos. Alternativamente, o carreador agrícola pode ser um sólido, como terra diatomácea, greda, sílica, alginato, argila, bentonita, vermiculita, caixas de sementes, outros produtos vegetais e animais ou combinações, incluindo grânulos, péletes ou suspensões. As misturas de qualquer um dos ingredientes anteriormente mencionados são também contempladas como carreadores, como, porém sem limitação, pesta (farinha e argila de caulim), ágar ou péletes à base de farinha em greda, areia ou argila, etc. As formulações podem incluir fontes de alimentos para as bactérias, como cevada, arroz ou outros materiais biológicos, como sementes, partes de plantas, bagaço de cana-de-açúcar, cascas ou talos de processamento de grãos, material vegetal moído ou madeira de resíduos de construção, serragem ou pequenas fibras de reciclagem de papel, tecido ou madeira.

[262] Por exemplo, um fertilizante pode ser usado para ajudar a promover o crescimento ou fornecer nutrientes a uma semente, muda ou planta. Exemplos não limitantes de fertilizantes incluem nitrogênio, fósforo, potássio, cálcio, enxofre, magnésio, boro, cloreto, manganês, ferro, zinco, cobre, molibdênio e selênio (ou um sal dos mesmos). Exemplos adicionais de fertilizantes incluem um ou mais aminoácidos, sais, carboidratos, vitaminas, glicose, NaCl, extrato de levedura, NH4H2PO4, (NH4)2SO4, glicerol, valina, L-leucina, ácido láctico, ácido propiônico, ácido succínico, ácido málico, ácido cítrico, tartarato de KH, xilose, lixose e lecitina. Em uma modalidade, a formulação pode incluir um agente de pegajosidade ou aderente (chamado de um agente adesivo) para ajudar a ligar outros agentes ativos a uma substância (por exemplo, uma superfície de uma semente). Tais agentes são úteis para combinar bactérias com carreadores que podem conter outros compostos (por exemplo, agentes de controle que não são biológicos), para produzir uma composição de revestimento. Tais composições ajudam a criar revestimentos em torno da planta ou semente para manter o contato entre o micróbio e outros agentes com a planta ou parte da planta. Em uma modalidade, os adesivos são selecionados a partir do grupo que consiste em: alginato, gomas, amidos, lecitinas, formononetina, álcool polivinílico, formononetinato alcalino, hesperetina, acetato de polivinila, cefalinas, Goma Arábica, Goma Xantana, Óleo Mineral, Polietileno Glicol (PEG) , Polivinilpirrolidona (PVP), Arabino-galactano, Metilcelulose, PEG 400, Quitosano, Poliacrilamida, Poliacrilato, Poliacrilonitrila, Glicerol, Trietilenoglicol, Acetato de Vinila, Goma Gelana, Poliestireno, Polivinila, Carboximetilcelulose, Goma Ghatti e Goximetileno copolímeros em bloco de polioxietileno-polioxibutileno.

[263] Em algumas modalidades, os adesivos podem ser, por exemplo, uma cera, como cera de carnaúba, cera de abelha, cera chinesa, cera de goma-laca, cera de espermacete, cera de candelila, cera de mamona, cera de ouricúrio e cera de farelo de arroz, um polissacarídeo (por exemplo, amido, dextrinas, maltodextrinas, alginato e quitosanas), uma gordura, óleo, uma proteína (por exemplo, gelatina e zeínas), gomas aráveis e goma laca. Os agentes adesivos podem ser compostos de ocorrência não natural, por exemplo, polímeros, copolímeros e ceras. Por exemplo, exemplos não limitantes de polímeros que podem ser usados como um agente adesivo incluem: acetatos de polivinila; copolímeros de acetato de polivinila; copolímeros de etileno acetato de vinila (EVA); álcoois polivinílicos; copolímeros de álcool polivinílico; celuloses (por exemplo, etilceluloses, metilceluloses, hidroximetilceluloses, hidroxipropilceluloses e carboximetilceluloses), polivinilpirrolidonas; cloreto de vinila, copolímeros de cloreto de vinilideno, lignossulfonatos de cálcio; copolímeros acrílicos, acrilatos de polivinila; óxido de polietileno; polímeros e copolímeros de acrilamida; acrilato de poli-hidroxietila, monômeros de metilacrilamida e policloropreno.

[264] Em alguns exemplos, um ou mais dos agentes de adesão, agentes antifúngicos, agentes de regulação do crescimento e pesticidas (por exemplo, inseticida) são compostos de ocorrência não natural (por exemplo, em qualquer combinação). Exemplos adicionais de carreadores agricolamente aceitáveis incluem dispersantes (por exemplo, polivinilpirrolidona/acetato de vinila PVPIVA S- 630), tensoativos, aglutinantes e agentes de preenchimento.

[265] A formulação pode conter também um tensoativo. Exemplos não limitantes de tensoativos incluem misturas de tensoativos de nitrogênio, como Prefer 28 (Cenex), Surf-N (US), Inhance (Brandt), P-28 (Wilfarm) e Patrol (Helena); óleos de sementes esterificados incluem Sun-It II (AmCy), MSO (UAP), Scoil (Agsco), Hasten (Wilfarm) e Mes-100 (Drexel); e tensoativos de organo-silicone incluem Silwet L77 (UAP), Silikin (Terra), Dyne-Amic (Helena), Kinetic (Helena), Sylgard 309 (Wilbur-Ellis) e Century (Precision). Em uma modalidade, o tensoativo está presente em uma concentração entre 0,01% v/v a 10% v/v. Em outra modalidade, o tensoativo está presente em uma concentração entre 0,1% v/v a 1% v/v.

[266] Em certos casos, a formulação inclui um estabilizante microbiano. Tal agente pode incluir um dessecante, que pode incluir qualquer composto ou mistura de compostos que podem ser classificados como um dessecante, independentemente de o composto ou compostos serem usados em tais concentrações que de fato tenham um efeito dessecante sobre um inoculante líquido. Esses dessecantes são idealmente compatíveis com a população bacteriana usada e devem promover a capacidade da população microbiana de sobreviver à aplicação sobre as sementes e sobreviver à dessecação. Exemplos de dessecantes adequados incluem um ou mais dentre trealose, sacarose, glicerol e Metilenoglicol. Outros dessecantes adequados incluem, porém sem limitação, açúcares não redutores e álcoois de açúcar (por exemplo, manitol ou sorbitol). A quantidade de dessecante introduzida na formulação pode variar de cerca de 5% a cerca de 50% em peso/volume, por exemplo, entre cerca de 10% a cerca de 40%, entre cerca de 15% a cerca de 35%, ou entre cerca de 20% a cerca de 30%. Em alguns casos, é vantajoso que a formulação contenha agentes como um fungicida, um agente antibacteriano, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador de crescimento de planta, um rodenticida, bactericida ou um nutriente. Em alguns exemplos, os agentes podem incluir protetores que fornecem proteção contra patógenos transmitidos pela superfície da semente. Em alguns exemplos, os protetores podem fornecer algum nível de controle de patógenos transmitidos pelo solo. Em alguns exemplos, os protetores podem ser eficazes predominantemente sobre a superfície da semente.

[267] Em alguns exemplos, um fungicida pode incluir um composto ou agente, seja químico ou biológico, que pode inibir o crescimento de um fungo ou exterminar um fungo. Em alguns exemplos, um fungicida pode incluir compostos que podem ser fungistáticos ou fungicidas. Em alguns exemplos, o fungicida pode ser um protetor ou agentes que são eficazes predominantemente sobre a superfície da semente, fornecendo proteção contra patógenos transmitidos pela superfície da semente e fornecendo algum nível de controle de patógenos transmitidos pelo solo. Exemplos não limitantes de fungicidas protetores incluem captano, maneb, tirame ou fludioxonil.

[268] Em alguns exemplos, o fungicida pode ser um fungicida sistêmico, que pode ser absorvido pela muda emergente e inibir ou exterminar o fungo dentro dos tecidos da planta hospedeira. Os fungicidas sistêmicos usados para o tratamento de sementes incluem, porém sem limitação aos seguintes: azoxistrobina, carboxina, mefenoxam, metalaxil, tiabendazol, trifloxistrobina e vários fungicidas de triazol, incluindo difenoconazol, ipconazol, tebuconazol e triticonazol. Mefenoxam e metalaxil são usados principalmente para alvejar os fungos de bolor de água Pythium e Phytophthora. Alguns fungicidas são preferidos a outros, dependendo da espécie de planta, seja por diferenças sutis na sensibilidade das espécies de fungos patogênicos ou por causa das diferenças na distribuição ou sensibilidade dos fungicidas das plantas. Em alguns exemplos, o fungicida pode ser um agente de controle biológico, como uma bactéria ou fungo. Esses organismos podem ser parasíticos aos fungos patogênicos, ou secretar toxinas ou outras substâncias que podem exterminar ou impedir o crescimento de fungos. Qualquer tipo de fungicida, particularmente aqueles que são comumente usados em plantas, pode ser usado como um agente de controle na composição de uma semente.

[269] Em alguns exemplos, a composição de revestimento de sementes compreende um agente de controle que tem propriedades antibacterianas. Em uma modalidade, o agente de controle com propriedades antibacterianas é selecionado a partir dos compostos descritos no presente documento em outro lugar. Em outra modalidade, o composto é estreptomicina, oxitetraciclina, ácido oxolínico ou gentamicina. Outros exemplos de compostos antibacterianos que podem ser usados como parte de uma composição de revestimento de sementes incluem aqueles à base de diclorofeno e álcool benzílico hemi formal (Proxel® da ICI ou Acticide® RS da Thor Chemie e Kathon® MK 25 da Rohm & Haas) e derivados de isotiazolinona, como alquilisotiazolinonas e benzisotiazolinonas (Acticide® MBS da Thor Chemie).

[270] Em alguns exemplos, o regulador de crescimento é selecionado a partir do grupo que consiste em: ácido abscísico, amidoclor, ancimidol, 6- benzilaminopurina, brassinolida, butralina, clormequat (cloreto de clormequat), cloreto de colina, ciclanilida, daminozida, dikegulac, dimetipina, 2,6- dimetilpuridina, etefon, flumetralina, flurprimidol, flutiacet, forclorfenuron, ácido giberélico, inabenfida, ácido indol-3-acético, hidrazida maleico, mefluidida, mepiquat (cloreto de mepiquat), ácido naftalenoacético, ácido N-6-benziladenina, paclobutrazol, fosforotritioato de proexadiona, ácido 2,3,5-tri-iodobenzoico, trinexapac-etila e uniconazol. Exemplos não limitantes adicionais de reguladores de crescimento incluem brassinosteroides, citocininas (por exemplo, cinetina e zeatina), auxinas

(por exemplo, ácido indolilacético e aspartato de indolilacetila), flavonoides e isoflavanoides (por exemplo, formononetina e diosmetina), fitoaixinas (por exemplo, gliceolina) ), e oligossacarídeos indutores de fitoalexina (por exemplo, pectina, quitina, quitosano, ácido poligalacurônico e ácido oligogalacturônico) e gibelerinas. Esses agentes são idealmente compatíveis com a semente ou muda agrícola sobre a qual a formulação é aplicada (por exemplo, não deve ser prejudicial ao crescimento ou à saúde da planta). Além disso, o agente é idealmente aquele que não causa problemas de segurança para uso humano, animal ou industrial (por exemplo, sem problemas de segurança ou o composto é suficientemente lábil para que o produto vegetal derivado da planta contenha quantidades insignificantes do composto).

[271] Alguns exemplos de agentes de biocontrole antagonistas de nematódeos incluem ARF18; 30 Arthrobotrys spp.; Chaetomium spp.; Cylindrocarpon spp.; Exophilia spp.; Fusarium spp.; Gliocladium spp.; Hirsutella spp.; Lecanicillium spp.; Monacrosporium spp.; Myrothecium spp.; Neocosmospora spp.; Paecilomyces spp.; Pochonia spp.; Stagonospora spp.; vesicular- arbuscular mycorrhizal fungi, Burkholderia spp.; Pasteuria spp., Brevibacillus spp.; Pseudomonas spp.; e Rhizobacteria. Os agentes de biocontrole antagonistas de nematódeos particularmente preferidos incluem ARF18, Arthrobotrys oligospora, Arthrobotrys dactyloides, Chaetomium globosum, Cylindrocarpon heteronema, Exophilia jeanselmei, Exophilia pisciphila, Fusarium aspergilus, Fusarium solani, Gliocladium catenulatum, Gliocladium roseum, Gliocladium vixens, Hirsutella rhossiliensis, Hirsutella minnesotensis, Lecanicillium lecanii, Monacrosporium drechsleri, Monacrosporium gephyropagum, Myrotehcium verrucaria, Neocosmospora vasinfecta, Paecilomyces lilacinus, Pochonia chlamydosporia, Stagonospora heteroderae, Stagonospora phaseoli, fungos micorrízicos vesicular- arbusculares, Burkholderia cepacia, Pasteuria penetrans, Pasteuria thornei, Pasteuria nishizawae, Pasteuria ramosa, Pastrueia usage, cepa G4 de Brevibacillus laterosporus, Pseudomonas fluorescens e Rhizobacteria.

[272] Alguns exemplos de nutrientes podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em um fertilizante de nitrogênio incluindo, porém sem limitação, Ureia, Nitrato de amônio, Sulfato de amônio, Soluções de nitrogênio sem pressão,

Amônia Aqua, Amônia anidra, Tiossulfato de amônio, Ureia revestida com enxofre, Ureia -formaldeídos, IBDU, Ureia revestida com polímero, Nitrato de cálcio, Ureaform e Ureia de metileno, fertilizantes de fósforo, como Fosfato diamônio, Fosfato de monoamônio, Polifosfato de amônio, Superfosfato concentrado e Superfosfato triplo e fertilizantes de potássio, como Cloreto de potássio, Sulfato de potássio, Sulfato de potássio-magnésio, Nitrato de potássio. Essas composições podem existir como sais livres ou íons dentro da composição do revestimento da semente. Alternativamente, nutrientes/fertilizantes podem ser complexados ou quelados para fornecer liberação sustentada ao longo do tempo.

[273] Alguns exemplos de rodenticidas podem incluir aqueles selecionados a partir do grupo de substâncias que consiste em 2-isovalerilindan-1,3-diona, 4- (quinoxalin-2-ilamino) benzenossulfonamida, alfa-cloroidrina, fosfeto de alumínio, antu, óxido arsenioso, carbonato de bário, bistiosemi, brodifacoum, bromadiolona, brometalina, cianeto de cálcio, cloralose, clorofacinona, colecalciferol, coumaclor, coumafuril, coumatetralil, crimidina, difenacoum, difetialona, difacinona, ergocalciferol, flocoumafen, fluoroacetamida, flupropadina, cloridrato de flupropadina, cianeto de hidrogênio, iodometano, lindano, fosfeto de magnésio, brometo de metila, norbormida, fosacetim, fosfina, fósforo, pindona, arsenito de potássio, pirinuron, escilirosídeo, arsenito de sódio, cianeto de sódio, fluoroacetato de sódio, estricnina, sulfato de tálio, varfarina e fosfeto de zinco.

[274] Sob a forma líquida, por exemplo, soluções ou suspensões, as populações bacterianas podem ser misturadas ou suspensas em água ou em soluções aquosas. Os diluentes ou carreadores líquidos adequados incluem água, soluções aquosas, destilados de petróleo ou outros carreadores líquidos.

[275] As composições sólidas podem ser preparadas dispersando as populações bacterianas em e sobre um carreador sólido adequadamente dividido, como turfa, trigo, farelo, vermiculita, argila, talco, bentonita, terra diatomácea, terra de Fuller, solo pasteurizado e similares. Quando tais formulações são utilizadas como pós molháveis, podem ser utilizados agentes dispersantes biologicamente compatíveis, como dispersantes e emulsionantes não iônicos, aniônicos, anfotéricos ou catiônicos.

[276] Os carreadores sólidos usados na formulação incluem, por exemplo,

carreadores minerais, como argila de caulim, pirofilita, bentonita, montmorilonita, terra diatomácea, solo branco ácido, vermiculita e perlita, e sais inorgânicos, como sulfato de amônio, fosfato de amônio, nitrato de amônio, ureia, cloreto de amônio e carbonato de cálcio. Além disso, podem ser usados pós finos orgânicos, como farinha de trigo, farelo de trigo e farelo de arroz. Os carreadores líquidos incluem óleos vegetais como óleo de soja e óleo de semente de algodão, glicerol, etileno glicol, polietileno glicol, propileno glicol, polipropileno-glicol, etc.

PRAGAS

[277] As composições agrícolas da divulgação, que podem compreender qualquer micróbio ensinado no presente documento, às vezes são combinadas com um ou mais pesticidas.

[278] Os pesticidas que são combinados com os micróbios da divulgação podem alvejar qualquer uma das pragas mencionadas abaixo.

[279] “Praga" inclui, porém sem limitação, insetos, fungos, bactérias, nematódeos, ácaros, carrapatos e similares. Pragas de insetos incluem insetos selecionados dentre as ordens as ordens Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente Lepidoptera e Coleoptera.

[280] Os versados na técnica reconhecerão que nem todos os compostos são igualmente eficazes contra todas as pragas. Os compostos que podem ser combinados com micróbios da divulgação podem exibir atividade contra pragas de insetos, que podem incluir agronômicos economicamente importantes, floresta, estufa, plantas ornamentais de viveiro, alimentos e fibras, saúde pública e animal, estrutura doméstica e comercial, pragas de produtos domésticos e armazenados.

[281] Como supracitado, as composições agrícolas da divulgação (que podem compreender qualquer micróbio ensinado no presente documento) estão em modalidades combinadas com um ou mais pesticidas. Esses pesticidas podem ser ativos contra qualquer uma das seguintes pragas:

[282] Larvas da ordem Lepidoptera incluem, porém sem limitação, lagartas- militares, larvas de traça, lagartas falsa-medideiras e heliotinas na família Noctuidae Spodoptera frugiperda J E Smith (lagarta-militar do outono); S. exigua Hubner

(lagarta-militar da beterraba); S. litura Fabricius (larva de traça do tabaco, lagarta- rosca); Mamestra configurata Walker (lagarta-militar bertha); M. brassicae Linnaeus (traça do repolho); Agrotis ipsilon Hufnagel (larva de traça preta); A. orthogonia Morrison (larrva de traça ocidental); A. subterranea Fabricius (larva de traça granulada); Alabama argillacea Hubner (verme da folha do-algodoeiro); Trichoplusia ni Hubner (lagarta falsa-medideira do repolho); Pseudoplusia includens Walker (lagarta falsa-medideira); Anticarsia gemmatalis Hubner (lagarta-da-soja); Hypena scabra Fabricius (verme-de-trevo verde); Heliothis virescens Fabricius (lagarta do tabaco); Pseudaletia unipuncta Haworth (lagarta-militar); Athetis mindara Barnes e Mcdunnough (larva de traça de pele áspera); Euxoa messoria Harris (larva de traça de lado escuro); Earias insulana Boisduval (lagarta espinhosa); E. vittella Fabricius (lagarta manchada); Helicoverpa armigera Hubner (lagarta americana); H. zea Boddie (lagarta de espiga de milho ou lagarta de algodão); Melanchra picta Harris (lagartas zebra); Egira (Xylomyges) curialis Grote (larva de traça de citros); brocas, traça-das-paredes, lagartas cone e esqueletizadores da família Pyralidae Ostrinia nubilalis Hubner (broca de milho europeia); Amyelois transitella Walker (lagarta de laranja naval); Anagasta kuehniella Zeller (traça do trigo mediterrâneo); Cadra cautella Walker (traça da amêndoa); Chilo suppressalis Walker (broca de talo de arroz); C. partellus, (broca de sorgo); Corcyra cephalonica Stainton (traça de arroz); Crambus caliginosellus Clemens (lagarta de rede de raiz de milho); C. teterrellus Zincken (verme do capim- do-campo); Cnaphalocrocis medinalis Guenée (traça tortricídea de arroz); Desmia funeralis Hubner (dobrador de folha de uva); Diaphania hyalinata Linnaeus (verme de melão); D. nitidalis Stoll (verme do picles); Diatraea grandiosella Dyar (broca de milho do sudoeste), D. saccharalis Fabricius (broca de cana-de-açúcar); Eoreuma loftini Dyar (broca de arroz mexicano); Ephestia elutella Hübner (traça do tabaco (cacau); Galleria mellonella Linnaeus (traça grande da cera); Herpetogramma licarsisalis Walker (lagarta de céspede); Homoeosoma electellum Hulst (traça de girassol); Elasmopalpus lignosellus Zeller (broca-do-colo); Achroia grisella Fabricius (traça da cera); Loxostege sticticalis Linnaeus (lagarta da beterraba); Orthaga thyrisalis Walker (mariposa teia da árvore do chá); Maruca testulalis Geyer (broca de feijão); Plodia interpunctella Hubner (traça-indiana-da-farinha); Scirpophaga incertulas Walker (broca do tronco amarelo); Udea rubigalis Guenee (traça do aipo); e lagartas enroladeiras, lagartas de broto, lagartas de semente e lagartas de fruta na família Tortricidae Acleris gloverana Walsingham (lagarta de broto de cabeça preta do oeste); A. Fernald (lagarta de broto de cabeça preta do leste); Archips argyrospila Walker (lagarta enroladeira de árvore frutífera); A. rosana Linnaeus (lagarta enroladeira europeia); e outras espécies Archips , Adoxophyes orana Fischer von Rosslerstamm (traça tortricídea dos frutos de verão); Cochylis hospes Walsingham (traça bandeada de girassol); Cydia latiferreana Walsingham (traça da avelaneira); C. pomonella Linnaeus (traça das crucíferas); Platynota flavedana Clemens (lagarta enroladeira de folha variegado); P. stultana Walsingham (lagarta enroladeira de folha de onívoro); Lobesia botrana Denis & Schiffermüller (traça da videira europeia); Spilonota ocellana Denis & Schiffermüller (traça vermelha dos gomos); Endopiza viteana Clemens (traça de bagas de uva); Eupoecilia ambiguella Hubner (traça das viediras); Bonagota salubricola Meyrick (lagarta enroladeira da maçã); Grapholita molesta Busck (traça oriental); Suleima helianthana Riley (traça de broto de girassol); Argyrotaenia spp .; Choristoneura spp. .

[283] Outras pragas agronômicas selecionadas na ordem Lepidoptera incluem, porém sem limitação, Alsophila pometaria Harris (lagarta do outono); Anarsia lineatella Zeller (broca do galho do pêssego); Anisota senatoria JE Smith (lagarta do carvalho listrado laranja); Antheraea pernyi Guerin-Meneville (Traça do Carvalho Chinês); Bombyx mori Linnaeus (Bicho da seda); Bucculatrix thurberiella Busck (perfurador de folhas de algodão); Colias eurytheme Boisduval (lagarta da alfafa); Datana integerrima Grote & Robinson (lagarta da nogueira); Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov (traça da seda siberiana), Ennomos subsignaria Hubner (lagarta do olmo); Erannis tiliaria Harris (lagarta de tília); Euproctis chrysorrhoea Linnaeus (mariposa do rabo marrom); Harrisina americana Guerin-Meneville (esqueletizador de folha de uva); Hemileuca oliviae Cockrell (lagarta); Hyphantria cunea Drury (lagarta do outono); Keiferia lycopersicella Walsingham (traça do tomate); Lambdina fiscellaria Hulst (lagarta-enroladora de cicuta oriental); L. fiscellaria lugubrosa Hulst (lagarta-enroladora de cicuta ocidental); Leucoma salicis Linnaeus (mariposa do cetim); Lymantria dispar Linnaeus (mariposa cigana); Manduca quinquemaculata Haworth (mariposa de cinco manchas, lagarta do tomate); M. sexta Haworth (lagarta do tomate, lagarta do tabaco); Operophtera brumata Linnaeus (mariposa do inverno); Paleacrita vernata Peck (lagarta da primavera); Papilio cresphontes Cramer (rabo de andorinha gigante); Phryganidia californica Packard (lagarta do carvalho da Califórnia); Phyllocnistis citrella Stainton (traça dos citros); Phyllonorycter blancardella Fabricius (minador-da-folha tentiforme manchada); Pieris brassicae Linnaeus (grande borboleta branca); P. rapae Linnaeus (pequena borboleta branca); P. napi Linnaeus (borboleta verde com veias brancas); Platyptilia carduidactyla Riley (traça da pluma de alcachofra); Plutella xylostella Linnaeus (traça-das-crucíferas); Pectinophora gossypiella Saunders (lagarta rosada); Pontia protodice Boisduval e Leconte (lagarta do sul); Sabulodes aegrotata Guenee (looper onmívoro); Schizura concinna JE Smith (lagarta corcunda vermelha); Sitotroga cerealella Olivier (traça do grão Angoumois); Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller (lagarta processionária do pinheiro); Tineola bisselliella Hummel (traça-das-roupas); Tuta absoluta Meyrick (traça do tomateiro); Yponomeuta padella Linnaeus (mariposa arminho); Heliothis subflexa Guenee; Malacosoma spp. e Orgyia spp .; Ostrinia nubilalis (broca europeia do milho); larva do milho; Agrotis ipsilon (lagarta negra).

[284] Larvas e adultos da ordem Coleoptera, incluindo gorgulhos das famílias Anthribidae, Bruchidae e Curculionidae (incluindo, porém sem limitação: Anthonomus grandis Boheman (gorgulho do algodoeiro); Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel (gorgulho da água do arroz); Sitophilus granarius Linnaeus; S. oryzae Linnaeus (gorgulho do arroz); Hypera punctata Fabricius (gorgulho da folha do trevo); Cylindrocopturus adspersus LeConte (gorgulho do talo do girassol); Smicronyx fulvus LeConte (gorgulho vermelho da semente de girassol); S. sordidus LeConte (gorgulho cinzento da semente de girassol); Sphenophorus Chittenden (percevejo do milho)); besouros da pulga, besouros do pepino, vermes da raiz, besouros das folhas, besouros da batata e minadores da família Chrysomelidae (incluindo, porém sem limitação: Leptinotarsa decemlineata Say (besouro da batata do Colorado); Diabrotica virgifera LeConte (lagarta da raiz do milho ocidental); D. barberi Smith; e Lawrence (lagarta da raiz do milho do norte); D. undecimpunctata howardi Barber (lagarta da raiz do milho do sul); Chaetocnema pulicaria Melsheimer (besouro-pulga do milho); Phyllotreta Cruciferae Goeze (besouro-pulga de crucíferas); Phyllotreta striolata (besouro-pulga listrado); Colaspis brunnea Fabricius (uva colaspis); Oulema melanopus Linnaeus (besouro das folhas dos cereais); Zygogramma exclamationis Fabricius (besouro do girassol)); besouros da família Coccinellidae (incluindo, porém sem limitação: Epilachna varivestis Mulsant (besouro mexicano do feijão)); forras e outros besouros da família Scarabaeidae (incluindo, porém sem limitação: Popillia japonica Newman (besouro japonês); Cyclocephala borealis Arrow (forra mascarada do norte , larva branca); C. immaculata Olivier (forra mascarada do sul, larva branca); Rhizotrogus majalis Razoumowsky (forra europeia); Phyllophaga crinita Burmeister (larva branca); Ligyrus gibbosus De Geer (besouro da cenoura)); besouros de carpete da família Dermestidae; vermes-arame da família Elateridae, Eleodes spp., Melanotus spp .; Conoderus spp .; Limonius spp .; Agriotes spp .; Ctenicera spp .; Aeolus spp .; besouros da família Scolytidae e besouros da família Tenebrionidae; Cerotoma trifurcate (besouro da folha do feijão); e larva-arame.

[285] Adultos e imaturos da ordem Diptera, incluindo minadores da folha Agromyza parvicornis Loew (traça da mancha do milho); mosquitos (incluindo, porém sem limitação: Contarinia sorghicola Coquillett (mosquito de sorgo); Mayetiola destructor Say (mosca de Hessian); Sitodiplosis mosellana Gehin (mosquito de trigo); Neolasioptera murtfeldtiana Felt, (mosquito de semente de girassol)); moscas da fruta (Tephritidae), Oscinella frit Linnaeus (moscas da fruta); larvas (incluindo, porém sem limitação: Delia platura Meigen (mosca-do-milho); D. coarctata Fallen (mosca do bulbo do trigo) e outras Delia spp., Meromyza americana Fitch (mosca do talo do trigo); Musca domestica Linnaeus (moscas domésticas); Fannia canicularis Linnaeus, F. femoralis Stein (moscas domésticas menores); Stomoxys calcitrans Linnaeus (moscas estáveis)); moscas faciais, moscas-dos-chifres, moscas varejeiras, Chrysomya spp .; Phormia spp. e outras pragas de mosca muscoide, mutucas, Tabanus spp .; moscas do berne Gastrophilus spp .; Oestrus spp .; larvas de gado Hypoderma spp .; moscas de veado Chrysops spp .; Melophagus ovinus Linnaeus (keds) e outros Brachycera, mosquitos Aedes spp .; Anopheles spp .; Culex spp .; moscas pretas Prosimulium spp .; Simulium spp .; mosquitos picadores, mosquitos-palha, ciárídeos e outros Nematocera.

[286] Adultos e ninfas das ordens Hemiptera e Homoptera, como, porém sem limitação, adelgídeos da família Adelgidae, insetos de planta da família Miridae, cicadas da família Cicadidae, cigarrinhas, Empoasca spp.; da Cicadellidae, cigarrinhas de plantas das famílias Cixiidae, Flatidae, Fulgoroidea, Issidae e Delphacidae, cigarrinhas de árvore da família Membracidae, psilídeos da família Psyllidae, moscas-brancas da família Aleyrodidae, afídeos da família Aphididae, filoxera da família Phylloxeridae, cochonilhas-farinhentas da família Pseudococcidae, escalas das famílias Asterolecanidae, Coccidae, Dactylopiidae, Diaspididae, Eriococcidae Ortheziidae, Phoenicococcidae e Margarodidae, percevejo-de-renda da família Tingidae, percevejos da família Pentatomidae, percevejos-de-cincha, Blissus spp.; e outros percevejos-das-sementes da família Lygaeidae, cigarrinhas da família Cercopidae, percevejos da abóbora da família Coreidae e percevejos vermelhos e manchadores de algodão da família Pyrrhocoridae.

[287] Membros agronomicamente importantes da ordem Homoptera incluem, porém sem limitação: Acyrthisiphon pisum Harris (afídeo de ervilha); Aphis craccivora Koch (afídeo do feijão-frade); A. fabae Scopoli (afídeo do feijão preto); A. gossypii Glover (afídeo do algodão, afídeo do melão); A. maidiradicis Forbes (afídeo da raiz de milho); A. pomi De Geer (afídeo da maçã); A. spiraecola Patch (afídeo de Spiraea); Aulacorthum solani Kaltenbach (afídeo de Dedalis); Chaetosiphon fragaefolii Cockerell (afídeo do morango); Diuraphis noxia Kurdjumov/Mordvilko (afídeo do trigo russo); Dysaphis plantaginea Paaserini (afídeo cinzento da macieira); Eriosoma lanigerum Hausmann (afídeo lanígero das macieiras); Brevicoryne brassicae Linnaeus (afídeo do repolho); Hyalopterus pruni Geoffroy (afídeo farinhento da ameixa); Lipaphis erysimi Kaltenbach (afídeo do nabo); Metopolophium dirrhodum Walker (afídeo do cereal); Macrosiphum euphorbiae Thomas (afídeo da batata); Myzus persicae Sulzer (afídeo do pessegueiro, afídeo verde do pessegueiro); Nasonovia ribisnigri Mosley (afídeo da alface); Pemphigus spp. (afídeos da raiz e afídeos de galha); Rhopalosiphum maidis Fitch (afídeo da folha do milho); R. padi Linnaeus (afídeo-da-cerejeira-brava); Schizaphis graminum Rondani (pulgão dos cereais); Sipha flava Forbes (afídeo amarelo da cana-de-açúcar); Sitobion avenae Fabricius (afídeo inglês dos grãos);

Therioaphis maculata Buckton (afídeo manchado da alfafa); Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe (afídeo preto dos citrinos) e T. citricida Kirkaldy (afídeo marrom dos citrinos); Melanaphis sacchari (afídeo da cana-de-açúcar); Adelges spp. (adelgídeos); Phylloxera devastatrix Pergande (filoxera de nogueira-pecã); Bemisia tabaci Gennadius (mosca-branca do tabaco, mosca-branca da batata doce); B. argentifolii Bellows & Perring (mosca-branca da folha de prata); Dialeurodes citri Ashmead (mosca-branca dos citrinos); Trialeurodes abutiloneus (mosca-branca de asa listrada) e T. vaporariorum Westwood (mosca-branca de estufa); Empoasca fabae Harris (cigarrinha da batata); Laodelphax striatellus Fallen (cigarrinha menor marrom); Macrolestes quadrilineatus Forbes (cigarrinha de áster); Nephotettix cinticeps Uhler (cigarrinha verde); ); N. nigropictus Stal (cigarrinha do arroz); Nilaparvata lugens Stal (cigarrinha marrom); Peregrinus maidis Ashmead (cigarrinha do milho); Sogatella furcifera Horvath (cigarrinha de costas brancas); Sogatodes orizicola Muir (delfacídeo do arroz); Typhlocyba pomaria McAtee (cigarrinha branca da macieira); Erythroneoura spp. (cigarrinhas da uva); Magicicada septendecim Linnaeus (cigarra periódica); Icerya purchasi Maskell (pulgão branco); Quadraspidiotus perniciosus Comstock (pulgão de São José); Planococcus citri Risso (cochonilha dos citrinos); Pseudococcus spp. (outro complexo de cochonilha); Cacopsylla pyricola Foerster (psilídeo da pera); Trioza diospyri Ashmead ( psilídeo) do caqui).

[288] As espécies da ordem Hemiptera incluem, porém sem limitação: Acrosternum hilare Say (percevejo verde); Anasa tristis De Geer (praga da abóbora); Blissus leucopterus leucopterus Say (praga das gramíneas); Corythuca gossypii Fabricius (praga da renda de algodão); Cyrtopeltis modesta Distant (praga do tomate); Dysdercus suturellus Herrich-Schäffer (manchador de algodão); Euschistus servus Say (percevejo marrom); E. variolarius Palisot de Beauvois (percevejo manchado); Graptostethus spp. (complexo de pragas-das-sementes); Leptoglossus corculus Say (praga-das-sementes de pinheiro de péem folha); Lygus lineolaris Palisot de Beauvois (praga manchada da planta); L. Hesperus Knight (praga ocidental manchado da planta); L. pratensis Linnaeus (praga comum de prado); L. rugulipennis Poppius (praga europeia manchada da planta); Lygocoris pabulinus Linnaeus (capsídeo verde comum); Nezara viridula Linnaeus (percevejo verde do sul); Oebalus pugnax Fabricius (percevejo do arroz); Oncopeltus fasciatus Dallas (praga grande da asclépia); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulga do algodão).

[289] Hemiptera como, Calocoris norvegicus Gmelin (praga do morango); Orthops campestris Linnaeus; Plesiocoris rugicollis Fallen (capsídeo da maçã); Cyrtopeltis modestus Distant (praga do tomate); Cyrtopeltis notatus Distant (mosca sugadora); Spanagonicus albofasciatus Reuter (pulga com marca branca); Diaphnocoris chlorionis Say (praga de espinheiro-da-virgínia); Labopidicola allii Knight (praga da cebola); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulga do algodão); Adelphocoris rapidus Say (percevejo de planta rápida); Poecilocapsus lineatus Fabricius (praga de planta de quatro linhas); Nysius ericae Schilling (praga das gramíneas falsa); Nysius raphanus (praga das gramíneas falsa); Nezara viridula Linnaeus (percevejo verde do sudeste); Eurygaster spp.; Coreidae spp.; Pyrrhocoridae spp.; Tinidae spp.; Blostomatidae spp.; Reduviidae spp. e Cimicidae spp..

[290] Adultos e larvas da ordem Acari (ácaros), como Aceria tosichella Keifer (ácaro do trigo); Petrobia latens Muller (ácaro marrom do trigo); ácaros- aranha e ácaros vermelhos da família Tetranychidae, Panonychus ulmi Koch (ácaro vermelho europeu); Tetranychus urticae Koch (ácaro-aranha de duas manchas); (T. Mcdanieli McGregor (ácaro McDaniel); T. cinnabarinus Boisduval (ácaro-aranha carmim); T. turkestani Ugarov & Nikolski (ácaro-aranha do morango); ácaros planos da família Tenuipalpidae, Brevipalpus lewisi McGregor (ácaro plano dos citrinos); ácaros da ferrugem e do broto da família Eriophyidae e outros ácaros de alimentação foliar e ácaros importantes na saúde humana e animal, isto é, os ácaros de poeira da família Epidermoptidae, ácaros do folículo da família Demodicidae, ácaros dos grãos da família Glycyphagidae, carrapatos da ordem Ixodidae. Ixodes scapularis Say (carrapato de cervo); I. holocyclus Neumann (carrapato da paralisia australiana); Dermacentor variabilis Say (carrapato de cachorro americano); Amblyomma americanum Linnaeus (carrapato estrela solitária) e ácaros da sarna e coceira nas famílias Psoroptidae, Pyemotidae e Sarcoptidae.

[291] Pragas de insetos da ordem Thysanura, como Lepisma saccharina

Linnaeus (peixinho-de-prata); Thermobia domestica Packard (tesourinha).

[292] Outras pragas de artrópodes incluem: aranhas da ordem Araneae, como Loxosceles reclusa Gertsch e Mulaik (aranha-violinista) e Latrodectus mactans Fabricius (aranha viúva negra) e centopeias da ordem Scutigeromorpha, como Scutigera coleoptrata Linnaeus (centopeia caseira).

[293] A superfamília de percevejos e outros insetos relacionados, incluindo, porém sem limitação, espécies pertencentes à família Pentatomidae (Nezara viridula, Halyomorpha halys, Piezodorus guildini, Euschistus servus, Acrosternum hilare, Euschistus heros, Euschistus tristigmus, Acrosternum hilichelops, Dulichelops, Ducosternum hilichelopsc e Bagrada hilaris (Bagrada Bug)), a família Plataspidae (Megacopta cribraria-Bean plataspid) e a família Cydnidae (percevejoScaptocoris castaneaRoot) e espécies de Lepidoptera incluindo, porém sem limitação: mariposa de dorso de diamante, por exemplo, Helicoverpa zea Boddie; lagarta falsa-medideira, por exemplo, Pseudoplusia includens Walker e lagarta-da-soja, por exemplo, Anticarsia gemmatalis Hubner.

[294] Nematódeos incluem nematódeos parasitários como nematódeos das galhas radiculares, formadores de cistos, e formadores de lesões, incluindo Heterodera spp., Meloidogyne spp. e Globodera spp.; particularmente membros dos nematódeos do cisto, incluindo, porém sem limitação, Heterodera glycines (nematódeo formador de cistos da soja); Heterodera schachtii (nematódeos do cisto da beterraba); Heterodera avenae (nematódeo formador de cistos de cereais); e Globodera rostochiensis e Globodera pailida (nematódeos do cisto da batata). Os nematódeos das lesões incluem Pratylenchus spp.

COMPOSIÇÕES PESTICIDAS QUE COMPREENDEM UM PESTICIDA E UM MICRÓBIO DA DIVULGAÇÃO

[295] Conforme supracitado, as composições agrícolas da divulgação, que podem compreender qualquer micróbio ensinado no presente documento, às vezes são combinadas com um ou mais pesticidas. Os pesticidas podem incluir herbicidas, inseticidas, fungicidas, nematicidas, etc.

[296] Em algumas modalidades, os pesticidas/combinações microbianas podem ser aplicados sob a forma de composições e podem ser aplicados à área de cultura ou planta a ser tratada, simultaneamente ou em sucessão, com outros compostos. Esses compostos podem ser fertilizantes, exterminadores de gramíneas, crioprotetores, tensoativos, detergentes, sabonetes pesticidas, óleos inativos, polímeros e/ou formulações de carreador de liberação prolongada ou biodegradáveis que permitem a dosagem a longo prazo de uma área alvo após uma única aplicação da formulação. Os mesmos também podem ser herbicidas seletivos, inseticidas químicos, virucidas, microbiocidas, amebicidas, pesticidas, fungicidas, bactericidas, nematocidas, moluscicidas ou misturas de diversas dessas preparações, se desejado, juntamente com carreadores agricolamente aceitáveis adicionais, tensoativos ou adjuvantes de promoção de aplicação empregados de modo costumeiro na técnica da formulação. Os carreadores (ou seja, carreadores agricolamente aceitáveis) e adjuvantes adequados podem ser sólidos ou líquidos e correspondem às substâncias empregadas de modo comum na tecnologia da formulação, por exemplo, substâncias minerais naturais ou regeneradas, solventes, dispersantes, agentes umectantes, agentes de pegajosidade, acentuadores de pegajosidade, aglutinantes ou fertilizantes. De modo similar, as formulações podem ser preparadas em “iscas” comestíveis ou fabricadas em “armadilhas” para pragas de modo a permitir alimentação ou ingestão por uma praga-alvo da formulação pesticida.

[297] Composições químicas exemplificativas, que podem ser combinadas com os micróbios da divulgação, incluem:

[298] Herbicidas de Frutos/Vegetais: Atrazina, Bromacil, Diuron, Glifosato, Linuron, Metribuzin, Simazina, Trifluralin, Fluazifop, Glufosinato, Halo sulfuron Gowan, Paraquat, Propizamida, Sethoxydim, Butafenacil, Halosulfuron, Indaziflam; Inseticidas de Frutos/Veqetais: Aldicarbe, Bacillus thuringiensis, Carbaril, Carbofurano, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Diazinon, Malation, Abamectina, Ciflutrina/betaciflutrina, Esfenvalerato, Lambda-cialotrina, Acequinocil, Bifenazato, Metoxifenozida, Novaluron, Cromafenozida, Tiacloprida, Dinotefurano, Fluacripirim, Tolfenpirade, Clotianidina, Espirodiclofeno, Gama-cialotrina, Espiromesifena, Espinosade, Rinaxypir, Ciazypir, Espinoteram, Triflumuron, Espirotetramato, Imidacloprida, Flubendiamida, Tiodicarbe, Metaflumizona, Sulfoxaflor, Ciflumetofeno, Cianopirrafeno, Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxame, Espinotoram, Tiodicarbe, Flonicamida, Metiocarbe, Benzoato de

Emamectina, Indoxacarbe, Fortiazato, Fenamifos, Cadusafós, Piriproxifen, Óxido de fenbutatina, Hextiazox, Metomil, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2, 2- difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona; Fungicidas de Frutos e Vegetais: Carbendazim, Clorotalonil, EBDCs, Enxofre, Tiofanato metílico, Azoxistrobin, Cimoxanil, Fluazinam, Fosetil, Iprodiona, Cresoxim metílico, Metalaxil/mefenoxam, Trifloxistrobina, Etaboxam, Iprovalicarb, Trifloxistrobin, Fenexamid, Fumarato de oxpoconazol, Ciazofamida, Fenamidona, Zoxamida, Picoxistrobina, Piraclostrobina, Ciflufenamida, Boscalid;

[299] Herbicidas de Cereais: Isoproturona, bromoxinil, loxinil, Phenoxies, Clorsulfuron, Clodinafope, Diclofope, Diflufenican, Fenoxaprop, Florasulam, Fluoroxipir, Metsulfuron, Triasulfuron, Flucarbazona, lodosulfuron, Propoxicarbazona, Picolinafen, Mesossulfuron, Beflubutamida, Pinoxaden, Amidosulfuron, Tifensulfuron metílico, Tribenuron, Flupirsulfuron, Sulfossulfuron, Pirasulfotol, Piroxsulam, Flufenacet, Tralcoxidim, Piroxasulfon; Fungicidas de Cereais:Carbendazim, Clorotalonil, Azoxistrobin, Ciproconazol, Ciprodinil, Fenpropimorfe, Epoxiconazol, Cresoxim metílico, Quinoxifen, Tebuconazol, Trifloxistrobina, Simeconazol, Picoxistrobina, Piraclostrobina, Dimoxistrobinol, Proxistrobinol; Inseticidas de Cereais :Dimetoato, Lambda-cialotrina, Deltametrina, alfa-Cipermetrina, β-ciflutrina, Bifentrina, Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinetofurano, Clorpirifós, Metamidofós, Oxidemeton metílico, Pirimicarbe, Metiocarbe;

[300] Herbicidas de Milho: Atrazina, Alacloro, Bromoxinil, Acetocloro, Dicamba, Clopiralide, S-Dimetenamida, Glufosinato, Glifosato, Isoxaflutol, S- Metolacloro, Mesotriona, Nicosulfuron, Primisulfuron, Rimsulfuron, Sulcotriona, Foransulfuron, Topramezona, Tembotriona, Saflufenacil, Tiencarbazona, Flufenacet, Piroxasulfon; Inseticidas de Milho Maís:Carbofuran, Clorpirifós, Bifentrina, Fipronil, Imidacloprida, Lambda-Cialotrina, Teflutrina, Terbufós, Tiametoxame, Clotianidina, Espiromesifeno, Flubendiamida, Triflumuron, Rinaxipir, Deltametrina, Tiodicarbe, β-Ciflutrina, Cipermetrina, Bifentrina, Lufenuron, Triflumoron, Teflutrina, Tebupirinfós, Etiprol, Ciazipir, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinetofurano, Avermectina, Metiocarbe, Espirodiclofeno, Espirotetramate; Fungicidas de Milho Maís:Fenitropan, Tirame, Protioconazol, Tebuconazol,

Trifloxistrobina;

[301] Herbicidas de Arroz: Butacloro, Propanil, Azimsulfuron, Bensulfuron, Cialofop, Daimuron, Fentrazamida, Imazossulfuron, Mefenacete, Oxaziclomefona, Pirazossulfuron, Piributicarbe, Quinclorac, Tiobencarbe, Indanofano, Flufenacete, Fentrazamida, Halossulfuron, Oxaziclomefona, Benzobiciclon, Piriftalida, Penoxsulam, Bispiribac, Oxadiargil, Etoxissulfuron, Pretilacloro, Mesotriona, Tefuriltriona, Oxadiazona, Fenoxaprop, Pirimissulfano; Inseticidas de Arroz: Diazinon, Fenitrotion, Fenobucarbe, Monocrotofós, Benfuracarbe, Buprofezina, Dinotefurano, Fipronila, Imidacloprida, Isoprocarbe, Tiacloprida, Cromafenozida, Tiacloprida, Dinotefurano, Clotianidina, Etiprol, Flubendiamida, Rinaxipir, Deltametrina, Acetamiprida, Tiametoxame, Ciazipir, Espinosade, Espinotoram, Benzoato de Emamectina, Cipermetrina, Clorpirifós, Cartap, Metamidofós, Etofenprox, Triazofós, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)- ona, Carbofurano, Benfuracarbe; Fungicidas de Arroz:Tiofanato metílico, Azoxistrobina, Carpropamida, Edifenfós, Ferimzona, Iprobenfós, Isoprotiolano, Pencicuron, Probenazol, Piroquilon, Triciclazol, Trifloxistrobina, Diclocimet, Fenoxanil, Simeconazol, Tiadinil;

[302] Herbicidas de Algodão: Diuron, Fluometuron, MSMA, Oxifluorfeno, Prometrina, Trifluralina, Carfentrazona, Cletodim, Fluazifop butílico, Glifosato, Norflurazon, Pendimetalina, Piritiobac de sódio, Trifloxisulfuron, Tepraloxidim, Glufosinato, Flumioxazina, Tidiazuron; Inseticidas de Algodão: Acefato, Aldicarbe, Clorpirifós, Cipermetrina, Deltametrina, Malation, Monocrotofós, Abamectina, Acetamiprida, Benzoato de Emamectina, Imidacloprida, Indoxacarbe, Lambda- Cialotrina, Espinosade, Tiodicarbe, Gama-Cialotrina, Espiromesifeno, Piridalila, Flonicamida, Flubendiamida, Triflumuron, Rinaxipir, Beta-Ciflutrina, Espirotetramate, Clotianidina, Tiametoxame, Tiacloprida, Dinetofurano, Flubendiamida, Ciazipir, Espinosade, Espinotoram, gama Cialotrina, 4-[[(6- Clorpiridin-3-il) metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Tiodicarbe, Avermectina, Flonicamida, Piridalila, Espiromesifeno, Sulfoxaflor, Profenofós, Triazofós, Endossulfano; Fungicidas de Algodão: Etridiazol, Metalaxil, Quintozeno;

[303] Herbicidas de Soja: Alacloro, Bentazona, Trifluralina, Clorimuron

Etílico, Cloransulam Metílico, Fenoxaprop, Fomesafen, Fluazifop, Glifosato, Imazamox, Imazaquin, Imazetapir, (S-) Metolacloro, Metribuzina, Pendimetalina, Tepraloxidim; Inseticidas de Soja: Lambda-cialotrina, Metomil, Paration, Tiocarbe, imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxame, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinetofuran, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazypir, Espinosade, Espinotoram, Benzoato de Emamectina, Fipronila, Etiprol, Deltametrina, β-Ciflutrina, gama e lambda Cialotrina, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil] (2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Espirotetramate, Espinodiclofeno, Triflumuron, Flonicamida, Tiodicarbe, beta-Ciflutrina; Fungicidas de Soja: Azoxistrobina, Ciproconazol, Epoxiconazol, Flutriafol, Piraclostrobina, Tebuconazol, Trifloxistrobina, Protioconazol, Tetraconazol;

[304] Herbicidas de Beterraba Sacarina: Cloridazon, Desmedifame, Etofumesato, Femedifame, Trialato, Clopiralida, Fluazifop, Lenacil, Metamitron, Quinmerac, Cicloxidime, Triflusulfuron, Tepraloxidime, Quizalofop; Inseticidas de Beterraba Sacarina: Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxame, Tiacloprida, Acetamiprida, Dinetofurano, Deltametrina, β-Ciflutrina, gmma/lambda Cialotrina, 4- [[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluor-etil)amino]furan-2(5H)-ona, Teflutrina, Rinaxipir, Ciaxipir, Fipronila, Carbofurano;

[305] Herbicidas de Canola: Clopiralida, Diclofop, Fluazifop, Glufosinato, Glifosato, Metazacloro, Trifluralina, Etametsulfurona, Quinmerac, Quizalofop, Cletodime, Tepraloxidime; Fungicidas de Canola: Azoxistrobina, Carbendazime, Fludioxonila, Iprodiona, Procloraz, Vinclozolina; Inseticidas de Canola: Organofosfatos de Carbofurano, Piretroides, Tiacloprida, Deltametrina, Imidacloprida, Clotianidina, Tiametoxame, Acetamiprida, Dinetofurano, β-Ciflutrina, gama e lambda Cialotrina, tau-Fluvialeriato, Etiprol, Espinosade, Espinotoram, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazypir, 4-[[(6-Clorpiridin-3-il)metil] (2,2- difluoretil)amino] furan-2(5H)-ona.

COMPOSIÇÕES INSETICIDAS QUE COMPREENDEM UM INSETICIDA E UM MICRÓBIO DA DIVULGAÇÃO

[306] Conforme supracitado, as composições agrícolas da divulgação, que podem compreender qualquer micróbio ensinado no presente documento, às vezes são combinadas com um ou mais inseticidas.

[307] Em algumas modalidades, as composições inseticidas podem estar incluídas nas composições apresentadas no presente documento, e podem ser aplicadas a uma planta (ou plantas) ou uma parte (ou partes) da mesma simultaneamente ou em sucessão, com outros compostos.

Os inseticidas incluem carbonato de amônio, silicato de potássio aquoso, ácido bórico, sulfato de cobre, enxofre elementar, enxofre, enxofre de cal, ésteres de octanoato de sacarose, 4- [[(6-Clorpiridin-3-il)metil](2, 2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, abamectina, notenona, fenazaquina, fenopiroximato, piridabeno, pirimedifeno, tebufenpirade, tolfenpirade, acefato, benzoato de emamectina, lepimectina, milbemectina, hidropreno, quinopreno, metopreno, fenoxicarbe,piriproxifeno, brometo de metrila e outros haletos de alquila, fluoreto de fulfurila, cloropicrina, bórax, octaborato dissódico, borato de sódio, metaborato de sódio, emético de tártaro, dazomete, metame, pimetrozina, pirifluquinazona, flofentezina, diflovidazina, hexitiazox, bifenazato, tiametoxam, imidacloprida, fenpiroximato, azadiractina, permetrina, esfenvalerato, acetamiprida, bifentrina, indoxacarbe, azadiractina, piretrina, imidacloprida, beta-ciflutrina, sulfotep, tebupirinfós, temefós, terbufós, tetraclorvinfós, tiometon, triazofós, alanicarbe, aldicarbe, bendiocarbe, benfluracarbe, butocarboxim, butoxicarboxim, carbarila, carbofurano, carbosulfano, etiofencarbe, fenobucarbe, formetanato, furatiocarbe, isoprocarbe, metiocarbe, metimila, metolcarbe, oxamila, primicarbe, propoxur, tiodicarbe, tofanox, triazamato, trimetacarbe, XMC, xililcarbe, acefato, azametifós, azinfós-etílico, azinfós-metílico, cadusafós, cloretoxifox, triclorfon, vamidotion, clordano, endosulfan, etiprol, fipronil, acrinatrina, aletrina, bifentrina, bioaletrina, bioaleterina X-ciclopentenila, bioresmetrina, ciclorotrina, ciflutrina, cialotrina, cipermetrina, cifenotrina [(1R)-trans-isômeros], deltametrina, empentrina [(EZ)- (1R)- isômeros], esfenvalerato, etofenprox, fenpropatrina, fenvalerato, flucitrinato, flumetrina, halfenprox, cadatrina, fenotiina [(1R)-trans-isômero] praletrina, piretrinas (piretrum), resmetrina, silafluofen, teflutrina, tetrametrina, tetrametrina [(1R)-isômeros], tralometrina, transflutrina, alfa-cipermetrina, beta-ciflutrina, beta-cipermetrina, d-cis- trans aletrina, d-trans aletrina, gama-cialotrina, lamda-cialotrina, tau-fluvalinato, teta-cipermetrina, zeta-cipermetrina, metoxiclor, nicotina, sulfoxaflor, acetamiprida, clotianidina, dinotefuran, imidacloprida, nitenpiram, tiacloprida, tiametoxan, tebuprinfós, beta-ciflutrina, clotianidina, flonicamida, hidrametilnon, amitraz,

flubendiamida, blorantraniliprol, lambda cialotrina, espinosade, gama cialotrina, Beauveria bassiana, extrato de capsicum oleoresin, óleo de alho, carbaril, clorpirifós, sulfoxaflor, lambda cialotrina, Clorfenvinfós, Clormefós, Clorpirifós, Clorpirifós-metílico, Coumafós, Cianofós, Demeton-S-metílico, Diazinon, Diclorvos/ DDVP, Dicrotofós, Dimetoato, Dimetilvinfós, Disulfoton, EPN, Etion, Etoprofós, Fanfur, Fenamifós, Fenitrotion, Fention, Fostiazato, Heptenofós, Imiciafós, Isofenfós, Saliciato de O-(metoxiaminotio-fosforil) isopropílico, Isoxation, Malation, Mecarbam, Metamidofós, Metidation, Mevinfós, Monocrotofós, Naled, Ometoato, Oxidemeton-metílico, Paration, Paration-metílico, fentoato, Forato, Fosalona, Fosmet, Fosfamidon, Foxim, Pirimifós-metílico, Profenofós, Propetanfós, Protiofós, Piraclofós, Piridafention, Quinalfosfluacripirim, tebufenozida, clorantraniliprol, Bacillus thuringiensis subs.

Kurstaki, terbufós, óleo mineral, Fenpropatrina, metaldeído, deltametrina, diazinon, dimetoato, diflubenzuron, piriproxifeno, óleo de alecrim, óleo de hortelã-pimenta, geraniol, azadiractina, butóxido de piperonila, ciantraniliprol, alfa cipermetrina, teflutrina, pimetrozina, malation, Bacillus thuringiensis subsp. israelensis, dicofol, bromopropilato, benzoximato, azadiractina, flonicamida, óleo de soja, cepa PRAA4-1 de Chromobacterium subtsugae , cipermetrina zeta, fosmete, metoxifenozida, óleo parafínico, espirotetramate, metomil, cepa F52 de Metarhizium anisopliae , etoprop, tetradifon, propargita, óxido de fenbutatina, azociclotina, ciexatina, diafentiuron, Bacillus sphaericus, etoxazol, flupiradifurona, azadiractina, Beauveria bassiana, ciflumetofeno, azadiractina, quinometionato, acefato, cepa 97 de Isaria fumosorosea Apopka, tetraboroidrato de sódio decaidratado, benzoato de emamectina, criolita, espinetoram, extrato de Chenopodium ambrosioides , novaluron, dinotefuran, carbarila, acequinocila, flupiradifurona, fosfato de ferro, caulim, buprofezina, ciromazina, cromafenozida, halofenozida, metoxifenozida, tebufenozida, bistrifluron, clorfluazuron, diflubenzuron, flucicloxuron, flufenoxuron, hexaflumuron, lufenuron, nocaluron, noviflumuron, teflubenzuron, triflumuron, bensultap, cloridrato de cartape, tiociclam, tiossultap-sódico, DNOC, clorfenapir, sulfuramida, forato, tolfenpirad, sulfoxaflor, óleo de nim, cepa SA-10 de Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, ciromazina, Burkholderia spp., morta por calor, ciantraniliprol, cienopirafen, ciflumetofen, cianeto de sódio, cianeto de potássio, cianeto de cálcio, fosfeto de alumínio, fosfeto de cálcio, fosfina, fosfeto de zinco, espriodiclofeno, espiromesifeno, espirotetramate, metaflumizona, flubendiamida, piflubumida, oxamil, Bacillus thuringiensis subsp. aizawai, etoxazol e esfenvalerato TABELA 9. INSETICIDAS EXEMPLIFICATIVOS ASSOCIADOS A VÁRIOS MODOS DE AÇÃO, QUE PODEM SER COMBINADOS COM MICRÓBIOS DA

DIVULGAÇÃO Função (ou Classe de Inseticidas funções) Modo de Ação composto exemplificativos fisiológica afetada Alanicarbe, Aldicarbe, Bendiocarbe, Benfuracarbe, Butocarboxim, Butoxicarboxim, Carbaril, Carbofurano, Carbossulfano, Etiofencarbe, inibidores da Fenobucarbe, Nervo e acetilcolinesterase carbamatos Formetanato, músculo (AChE) Furatiocarbe, Isoprocarbe, Metiocarbe, Metomil, Metolcarbe, Oxamil, Pirimicarbe, Propoxur, Tiodicarbe, Tiofanox, Triazamato, Trimetacarbe, XMC, Xilicarbe Acefato, Azametifós, Azinfós etílico, Azinfós metílico, Cadusafós, Cloretoxifós, Clorfenvinfós, Clormefós, Clorpirifós, Clorpirifós metílico, Coumafós, inibidores da Cianofós, Demeton-S Nervo e acetilcolinesterase organofosfatos metílico, Diazinon, músculo (AChE) Diclorvos/ DDVP, Dicrotofós, Dimetoato, Dimetilvinfós, Disulfoton, EPN, Etion, Etoprofós, Fanfur, Fenamifós, Fenitrotion, Fention, Fostiazato, Heptenofós,

Função (ou Classe de Inseticidas funções) Modo de Ação composto exemplificativos fisiológica afetada Imiciafós, Isofenfós, Salicilato de O- (metoxiaminotio-fosforil) isopropílico, Isoxation, Malation, Mecarbam, Metamidofós, Metildation, Mevinfós, Monocrotofós, Naled, Ometoato, Oxidemeton metílico, Paration, Paration metílico, Fentoato, Forato, Fosalona, Fosmet, Fosfamidon, Foxim, Pirimifós metílico, Profenofós, Propetanfós, Protiofós, Piraclofós, Piridafention, Quinalfos, Sulfotep, Tebupirimifós, Temefós, Terbufós, Tetraclorvinfós, Tiometon, Triazofós, Triclorfon, Vamidotion Bloqueadores de canal de cloreto organoclorados Nervo e Clordano, Endosulfan dependente de de ciclodieno músculo

GABA Bloqueadores de canal de cloreto fenilpirazóis Nervo e Etiprol, Fipronil dependente de (Fipróis) músculo

GABA Acrinatrina, Aletrina, Bifentrina, Bioaletrina, Bioaletrina S- ciclopentenila, Bioresmetrina, moduladores do piretroides, Cicloprotrina, Ciflutrina, Nervo e canal de sódio piretrinas Cialotrina, Cipermetrina, músculo Cifenotrina [(1R)-trans- isômeros], Deltametrina, Empentrina [(EZ)- (1R) - isômeros], Esfenvalerato, Etofenprox,

Função (ou Classe de Inseticidas funções) Modo de Ação composto exemplificativos fisiológica afetada Fenpropatrina, Fenvalerato, Flucitrinato, Flumetrina, Halfenprox, Cadatrina, Fenotrina [(1R)-trans-isômero], Praletrina, Piretrinas (piretro), Resmetrina, Silafluofeno, Teflutrina, Tetrametrina, Tetrametrina [(1R)- isômeros], Tralometrina, Transflutrina, alfa- Cipermetrina, beta- Ciflutrina, beta- Cipermetrina, d-cis-trans Aletrina, d-trans Aletrina, gama-Cialotrina, lambda- Cialotrina, tau- Fluvalinato, teta- Cipermetrina, zeta- Cipermetrina moduladores de Nervo e DDT, metoxicloro DDT, metoxicloro canal de sódio músculo Acetamiprida, moduladores Clotianidina, competitivos do Dinotefurano, Nervo e receptor nicotínico neonicotinoides Imidacloprida, músculo de acetilcolina Nitenpirame, Tiacloprida, (nAChR) Tiametoxame moduladores competitivos do Nervo e receptor nicotínico nicotina nicotina músculo de acetilcolina (nAChR) moduladores competitivos do Nervo e receptor nicotínico sulfoximinas sulfoxaflor músculo de acetilcolina (nAChR) moduladores Nervo e butenolídeos Flupiradifurona competitivos do músculo

Função (ou Classe de Inseticidas funções) Modo de Ação composto exemplificativos fisiológica afetada receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR) moduladores alostéricos de Nervo e receptor nicotínico espinosinas Espinetoram, Espinosade músculo de acetilcolina (nAChR) Moduladores Abamectina, Benzoato alostéricos de canal avermectinas, de emamectina, Nervo e de cloreto milbemicinas Lepimectina, músculo bloqueado por Milbemectina glutamato (GluCl) mimetizadores do análogos do Hidropreno, Cinopreno, Crescimento hormônio juvenil hormônio juvenil Metopreno mimetizadores do Fenoxicarbe Fenoxicarbe Crescimento hormônio juvenil mimetizadores do Piriproxifeno Piriproxifeno Crescimento hormônio juvenil inibidores não Desconhecido Brometo de metila e específicos (multi- haletos de alquila ou não outros haletos de alquila sítio) variados específico inibidores não Desconhecido específicos (multi- Cloropicrina Cloropicrina ou não sítio) variados específico inibidores não Desconhecido Criolita, fluoreto de específicos (multi- fluoretos ou não sulfurila sítio) variados específico Bórax, ácido bórico, inibidores não Desconhecido Octaborato dissódico, específicos (multi- boratos ou não Borato de sódio, sítio) variados específico Metaborato de sódio inibidores não Desconhecido específicos (multi- tártaro emético tártaro emético ou não sítio) variados específico inibidores não geradores de Desconhecido específicos (multi- isotiocianato de Dazomete, Metame ou não sítio) variados metila específico

Função (ou Classe de Inseticidas funções) Modo de Ação composto exemplificativos fisiológica afetada Derivados de moduladores de Pimetrozina, Nervo e piridina órgãos cordotonais Pirifluquinazon músculo azometina inibidores de Clofentezina, Clofentezina, crescimento de Diflovidazina, Crescimento Diflovidazina, Hexitiazox ácaros Hexitiazox inibidores de crescimento de Etoxazol Etoxazol Crescimento ácaros Bacillus disruptores thuringiensis e as Bt var. aizawai, Bt var. microbianos de proteínas israelensis, Bt var.

Intestino membranas inseticidas que os kurstaki, Bt var. médio intestinais de mesmo tenebrionensis insetos produzem disruptores microbianos de Bacillus Intestino membranas Bacillus sphaericus sphaericus médio intestinais de insetos inibidores da ATP Diafentiuron Diafentiuron Respiração sintase mitocondrial inibidores de ATP acaricidas de Azociclotina, Ciexatina, Respiração sintase mitocondrial organotina Óxido de fenbutatina inibidores de ATP Propargita Propargita Respiração sintase mitocondrial inibidores de ATP Tetradifon Tetradifon Respiração sintase mitocondrial desacopladores de fosforilação Clorfenapir, oxidativa via Clorfenapir, DNOC, DNOC, Respiração ruptura do Sulfuramida Sulfuramida gradiente de prótons Bloqueadores do canal do receptor Bensultap, Cloridrato de análogos de Nervo e nicotínico da Cartap, Tiociclam, nereistoxina músculo acetilcolina Tiossulfato de sódio (nAChR)

Função (ou Classe de Inseticidas funções) Modo de Ação composto exemplificativos fisiológica afetada Bistrifluron, Clorfluazuron, Diflubenzuron, Flucicloxuron, inibidores da Flufenoxuron, biossíntese de benzoilureias Crescimento Hexaflumuron, quitina, tipo 0 Lufenuron, Novaluron, Noviflumuron, Teflubenzuron, Triflumuron inibidores de biossíntese de Buprofezina Buprofezina Crescimento quitina, tipo 1 disruptor de muda, Ciromazina Ciromazina Crescimento Dípteros Cromafenozida, agonistas do Halofenozida, receptor de diacil-hidrazinas Crescimento Metoxifenozida, ecdisona Tebufenozida agonistas do Nervo e receptor de Amitraz Amitraz músculo octopamina inibidores do transporte de elétrons do Hidrametilnona Hidrametilnona Respiração complexo III mitocondrial inibidores do transporte de elétrons do Acequinocila Acequinocila Respiração complexo III mitocondrial inibidores do transporte de elétrons do Fluacripirim Fluacripirim Respiração complexo III mitocondrial inibidores do transporte de Bifenazato Bifenazato Respiração elétrons do

Função (ou Classe de Inseticidas funções) Modo de Ação composto exemplificativos fisiológica afetada complexo III mitocondrial inibidores do Fenazaquina, transporte de Fenpiroximato, Meti acaricidas e elétrons do Piridabem, Pirimidifeno, Respiração inseticidas complexo I Tebufenpirade, mitocondrial Tolfenpirade inibidores do transporte de elétrons do Rotenona Rotenona Respiração complexo I mitocondrial bloqueadores do canal de sódio Nervo e oxadiazinas Indoxacarbe dependentes de músculo voltagem bloqueadores do canal de sódio Nervo e semicarbazonas Metaflumizona dependentes de músculo voltagem derivados de Espirodiclofeno, Inibidores da acetil- ácido tetrônico e Espiromesifeno, Crescimento CoA carboxilase tetrâmico Espirotetramate inibidores do transporte de Fosfeto de alumínio, elétrons do fosfetos Fosfeto de cálcio, Respiração complexo IV Fosfina, Fosfeto de zinco mitocondrial inibidores do transporte de Cianeto de cálcio, elétrons do cianetos Cianeto de potássio, Respiração complexo IV Cianeto de sódio mitocondrial inibidores do transporte de derivados de Cienopirafeno, elétrons do Respiração beta-cetonitrila Ciflumetofeno complexo II mitocondrial inibidores do carboxanilidas Piflubumida Respiração

Função (ou Classe de Inseticidas funções) Modo de Ação composto exemplificativos fisiológica afetada transporte de elétrons do complexo II mitocondrial moduladores do Clorantraniliprol, Nervo e receptor de diamidas Ciantraniliprol, músculo rianodina Flubendiamida Moduladores de órgãos cordotonais Nervo e Flonicamida Flonicamida - sítio alvo músculo indefinido compostos de modo de ação Azadiractina Azadiractina Desconhecido desconhecido ou incerto compostos de modo de ação Benzoximato Benzoximato Desconhecido desconhecido ou incerto compostos de modo de ação Bromopropilato Bromopropilato Desconhecido desconhecido ou incerto compostos de modo de ação Quinometionato Quinometionato Desconhecido desconhecido ou incerto compostos de modo de ação Dicofol Dicofol Desconhecido desconhecido ou incerto compostos de modo de ação enxofre de cal enxofre de cal Desconhecido desconhecido ou incerto compostos de modo de ação Piridalila Piridalila Desconhecido desconhecido ou incerto

Função (ou Classe de Inseticidas funções) Modo de Ação composto exemplificativos fisiológica afetada compostos de modo de ação Enxofre Enxofre Desconhecido desconhecido ou incerto TABELA 10. LISTA EXEMPLIFICATIVA DE PESTICIDAS, QUE PODEM

SER COMBINADOS COM MICRÓBIOS DA DIVULGAÇÃO Categoria Compostos

INSETICIDAS Arseniato de cálcio acetoarsenito de cobre, inseticidas arseniato de cobre, arsenicais arseniato de chumbo, arsenito de potássio, arsenito de sódio alicina anabasina azadiractina carvacrol d-limoneno matrina nicotina nornicotina oximatrina piretrinas cinerinas inseticidas cinerina I botânicos cinerina II jasmolina I jasmolina II piretrina I piretrina II quassia rodojaponina-III rotenona ryania sabadilla sanguinarina triptolida inseticidas de bendiocarbe carbamato carbarila

Categoria Compostos benfuracarbe inseticidas de carbofurano metilcarbamato carbosulfano de decarbofurano benzofuranila furatiocarbe dimetano dimetilano inseticidas de hiquincarbe dimetilcarbama isolano to pirimicarbe piramate pirolano alanicarbe aldicarbe aldoxicarbe butocarboxim butoxicarboxim inseticidas de metomila carbamato de nitrilacarbe oxima oxamila tazimcarbe tiocarboxima tiodicarbe tiofanox alixicarbe aminocarbe bufencarbe butacarbe carbanolato cloetocarbe

CPMC dicresil dimetacarb dioxacarbe inseticidas de EMPC metilcarbamato etiofencarbe de fenila fenethacarbe fenobucarbe isoprocarbe metiocarbe metolcarbe mexacarbato promacila promecarbe propoxur trimetacarbe

XMC

Categoria Compostos xililcarbe broflanilida clorantraniliprol ciantraniliprol inseticidas de ciclaniliprol diamida cialodiamida flubendiamida tetraniliprol dinex inseticidas de dinoprop dinitrofenol dinosam

DNOC hexafluorossilicato de bário criolita inseticidas de flursulamida flúor fluoreto de sódio hexafluorossilicato de sódio sulfluramida Amitraz clordimeforme inseticidas de formetanato formamidina formparanato medimeforme semiamitraz acrilonitrila dissulfeto de carbono tetracloreto de carbono sulfeto de carbonila clorofórmio cloropicrina cianogênio para-diclorobenzeno 1,2-dicloropropano ditioéter formiato de etila inseticidas dibrometo de etileno fumigantes dicloreto de etileno óxido de etileno cianeto de hidrogênio brometo de metila iodeto de metila metilclorofórmio cloreto de metileno naftaleno fosfina tetratiocarbonato de sódio fluoreto de sulfurila

Categoria Compostos tetracloroetano bórax ácido bórico polissulfeto de cálcio oleato de cobre inseticidas terra diatomácea inorgânicos cloreto mercuroso tiocianato de potássio gel de sílica tiocianato de sódio reguladores de crescimento de insetos inibidores da buprofezina síntese de ciromazina quitina bistrifluron clorbenzuron clorfluazuron diclorbenzuron diflubenzuron inibidores da flucicloxuron síntese de flufenoxuron quitina hexaflumuron benzoilfenilurei lufenuron a novaluron noviflumuron penfluron teflubenzuron triflumuron dayoutong epofenonano fenoxicarbe mimetizadores hidropreno do hormônio quinopreno juvenil metopreno piriproxifeno tripreno hormônio juvenil I hormônios hormônio juvenis juvenil II hormônio juvenil III cromafenozida furano tebufenozida agonistas do halofenozida hormônio da metoxifenozida muda tebufenozida yishijing

Categoria Compostos hormônios da α-ecdisona ecdise ecdisterona inibidores da diofenolano ecdise precoceno I precocenos precoceno II precoceno III reguladores de crescimento de diciclanil insetos não classificados inseticidas de lactona macrocíclica abamectina doramectina inseticidas de emamectina avermectina eprinomectina ivermectina selamectina lepimectina inseticidas de milbemectina milbemicina milbemicina oxima moxidectina inseticidas de Espinetoram espinosina espinosade inseticidas neonicotinoide s clotianidina inseticidas dinotefurano neonicotinoide imidacloprida s de imidaclotiz nitroguanidina tiametoxame inseticidas neonicotinoide nitenpirame s de nitiazina nitrometileno inseticidas acetamiprida neonicotinoide imidacloprida s de nitenpiram piridilmetilamin paichongding a tiacloprida bensultape inseticidas de cartape análogos de politialan nereistoxina tiociclam

Categoria Compostos tiossultape bromo-DDT canfecloro

DDT pp′-DDT inseticidas DDD etílico organoclorado HCH s gama-HCH lindano metoxicloro pentaclorofenol

TDE aldrina bromociclen clorbiciclen clordano clordecona dieldrina dilor endosulfan inseticidas de alfa-endosulfan ciclodieno endrina

HEOD heptacloro

HHDN isobenzan isodrin kelevan mirex inseticidas organofosforad os bromfenvinfós calvinfós chlorfenvinfós crotoxifós dichlorvos dicrotofós inseticidas dimetilvinfós organofosforad fospirato os heptenofós metocrotofós mevinfós monocrotofós naled naftalofós fosfmidon

Categoria Compostos propafós

TEPP tetraclorvinfós inseticidas de dioxabenzofós organotiofosfat fosmetilano o fentoato acetion acetofós amiton cadusafós cloretoxifós clormefós demefion demefion-O demefion-S demeton demeton-O demeton-S demeton-metílico demeton-O-metílico inseticidas de demeton-S-metílico organotiofosfat demeton-S-metilsulfon o alifático disulfoton etion etoprofós

IPSP isotioato malation metacrifós metilacetofós oxidemeton-metílico oxideprofós oxidisulfoton forato sulfotep terbufós tiometon amidition ciantoato dimetoato inseticidas de etoato metílico organotiofosfat formotion o de amida mecarbam alifático ometoato protoato sofamida vamidotion

Categoria Compostos inseticidas de Clorphoxim organotiofosfat foxim o oxima foxim metílico azametifós colofonato coumafós coumitoato dioxation inseticidas de endotion organotiofosfat menazon o morfoton heterocíclicos fosalona piraclofós pirazotion piridafention quinotion inseticidas de organotiofosfat diticrofós o de ticrofós benzotiopirano inseticidas de organotiofosfat azinfós etílico o de azinfós metílico benzotriazina inseticidas de dialifos organotiofosfat fosmete o isoindol inseticidas de isoxation organotiofosfat zolaprofós o isoxazol inseticidas de organotiofosfat clorprazofós o de pirazofós pirazolopirimidi na inseticidas de clorpirifós organotiofosfat clorpirifós metílico o de piridina butatiofós diazinon etrinfós inseticidas de lirinfós organotiofosfat pirimioxifós o de pirimidina pirimifós etílico pirimifós metílico primidofós pirimitado

Categoria Compostos tebupirinfós inseticidas de organotiofosfat quinalfós o de quinalfós metílico quinoxalina atidation inseticidas de litidation organotiofosfat metidation o de tiadiazol protidation inseticidas de isazofós organotiofosfat triazofós o de triazol azotoato bromofós bromofós-etílico carbofenotion clortiofós cianofós citioato dicapton diclofention etafós fanfur fenclorfós fenitrotion fensulfotion inseticidas de fention organotiofosfat fention-etílico o de fenila heterofós jodfenfós mesulfenfós paration paration-metílico fencapton fosniclor profenofós protofós sulprofós temefós triclormetafós-3 trifenofós xiaocongliulina inseticidas de butonato fosfonato triclorfon inseticidas de mecarfon fosfonotioato inseticidas de fonofós

Categoria Compostos etilfosfonotioat tricloronate o de fenila inseticidas de cianofenfós fenilfosfonotio EPN ato de fenila leptofós crufomato fenamifós fostietan Fosforamidato mefosfolan s fosfolan fosfolan-metílico pirimetafós acefato cloramina fósforo isocarbofós inseticidas de isofenfós fosforamidotio isofenfós-metílico ato metamidofós fosglicina propetanfós dimefox inseticidas de mazidox fosforodiamida mipafox schradan inseticidas de indoxacarbe oxadiazina inseticidas de metoxadiazona oxadiazolona dialifos inseticidas fosmete ftalimidas tetrametrina inseticidas maltodextrina físicos ácido bórico inseticidas terra diatomácea dessecantes gel de sílica clorantraniliprol ciantraniliprol ciclaniliprol inseticidas de dimetilan pirazol Isolan tebufenpirade tetraniliprol tolfenpirade acetoprol inseticidas de etiprol fenilpirazol fipronil

Categoria Compostos flufiprol piraclofós pirafluprol piriprol pirolan vaniliprol Inseticidas piretroides acrinatrina aletrina bioaletrina esdepaletrina bartrina bifentrina capa-bifentrina bioetanometrina brofenvalerato broflutrinato brometrina butetrina clorempentrina cicletrina cicloprotrina ciflutrina beta-ciflutrina cialotrina Inseticidas gama-cialotrina éster lambda-cialotrina piretroides cipermetrina alfa-cipermetrina beta-cipermetrina teta-cipermetrina zeta-cipermetrina cifenotrina deltametrina dimeflutrina dimetrina empentrina d-fanshiluquebingjuzhi cloropraletrina fenflutrina fenpiritrina fenpropatrina fenvalerato esfenvalerato flucitrinaato fluvalinato

Categoria Compostos tau-fluvalinato furametrina furetrina heptaflutrina imiprotrina japotrinas cadetrina metotrina metoflutrina épsilon-metoflutrina monfluorotrina épsilon-monfluorotrina pentmetrina permetrina biopermetrina transpermetrina fenotrina praletrina proflutrina propartrina piresmetrina renoflutrina meperflutrina resmetrina bioresmetrina cismetrina teflutrina capa-teflutrina teraletrina tetrametrina tetrametilflutrina tralocitrina tralometrina transflutrina valerato etofemprox flufenprox Inseticidas éter halfenprox piretroides protrifenbuto silafluofeno Inseticidas sulfoxima oxima tiofluoximato piretroides inseticidas de flufenerim pirimidinamina pirimidifeno inseticidas de clorfenapir pirrol

Categoria Compostos inseticidas de amônio sanguinarino quaternário inseticidas de sulfoxaflor sulfoximina inseticidas de espirotetramata ácido tetrâmico inseticidas de espiromesifeno ácido tetrônico clotianidina inseticidas imidaclotiz tiazol tiametoxam tiapronil inseticidas tazimcarbe tiazolidina tiacloprida inseticidas diafentiuron tioureia inseticidas de flucofuron ureia sulcofuron inseticidas dicloromezotiaz zwitteriônicos triflumezopirim afidopiropeno afoxolaner alosamidina closantel cobre naftenato de crotamiton

EXD fenazaflor fenoxacrim flometoquin flonicamida fluexafon inseticidas não flupiradifurona classificados fluralaner fluxametamida hidrametilnon isoprotiolano jiahuangchongzong malonoben metaflumizona nifluridida plifenato piridabeno piridalila pirifluquinazon rafoxanida

Categoria Compostos turingiensina triarateno triazamato

ACARICIDAS acaricidas carvacrol botânicos sanguinarina azobenzeno benzoximato benzoato de benzila bromopropilato clorbenzida clorfenetol clorfenson clorfensulfeto clorobenzilato cloropropilato ciflumetofeno acaricidas de

DDT difenil em dicofol ponte difenil sulfona dofenapina fenson fentrifanila fluorbensida genit hexaclorofeno fenproxida proclonol tetradifon tetrasul benomil carbanolato carbaril acaricidas de carbofurano carbamato metiocarbe metolcarbe promacil propoxur aldicarbe acaricidas butocarboxim oxima oxamil carbamato tiocarboxima tiofanox acaricidas de bifenazato carbazato acaricidas de binapacril dinitrofenol dinex

Categoria Compostos dinobuton dinocape dinocape-4 dinocape-6 dinocton dinopenton dinosulfon dinoterbon

DNOC amitraz clordimeform cloromebuform acaricidas formetanato formamidina formparanato medimeform semiamitraz acaricidas lactona tetranactina macrocíclica abamectina doramectina acaricidas de eprinomectina avermectina ivermectina selamectina milbemectina acaricidas milbemicina oxima milbemicina moxidectina clofentezina ciromazina diflovidazin reguladores de dofenapina crescimento de fluazuron ácaros flubenzimina flucicloxuron flufenoxuron hexitiazox bromociclen canficloro acaricidas

DDT organoclorado dienocloro s endosulfan lindano acaricidas organofosforad os acaricidas clorfenvinfós organofosforad crotoxifós

Categoria Compostos os diclorvos heptenofós mevinfós monocrotofós nalede

TEPP tetraclorvinfós amidition amiton azinfós-etílico azinfós-metílico azotoato benoxafós bromofós bromofós-etílico carbofenotion clorpirifós clortiofós coumafós ciantoato demeton demeton-O demeton-S demeton-metílico demeton-O-metílico demeton-S-metílico acaricidas demeton-S-metilsulfon organotiofosfat dialifós o diazinon dimetoato dioxation disulfoton endotion etion etoato-metílico formotion malation mecarbam metacrifós ometoato oxideprofós oxidisulfoton paration fencapton forato fosalona fosmet

Categoria Compostos fostina foxim pirimifós-metílico protidation protoato pirimitato quinalfós quintiofós sofamida sulfotep tiometon triazofós trifenofós vamidotion acaricidas de triclorfon fosfonato acaricidas isocarbofós fosforamidotio metamidofós ato propetanfós dimefox acaricidas mipafox fosforodiamida schradan azociclotina acaricidas ciexatina organoestânico óxido de fenbutatina s fostina acaricidas diclofluanida fenilsulfamida acaricidas dialifós ftalimida fosmete cienopirafeno acaricidas fenpiroximato pirazol piflubumida tebufenpirade acetoprol acaricidas fipronil fenilpirazol vaniliprol acaricidas piretroides acrinatrina bifentrina broflutrinato acaricidas cialotrina éster cipermetrina piretroides alfa-cipermetrina fenpropatrina fenvalerato

Categoria Compostos flucitrinato flumetrina fluvalinato tau-fluvalinato permetrina acaricidas éter halfenprox piretroides acaricidas de pirimidifeno pirimidinamina acaricidas clorfenapir pirrol acaricidas de amônio sanguinarina quaternário acaricidas quinometinato quinoxalina tioquinox acaricidas de estrobilurina bifujunzhi acaricidas fluacripirim metoxiacrilato flufenoxistrobina estrobilurina piriminostrobina acaricidas aramita éster sulfito propargita acaricidas espirodiclofeno ácido tetrônico acaricidas clofentezina tetrazina diflovidazina acaricidas flubenzimina tiazolidina hexitiazox acaricidas fenotiocarbe tiocarbamato acaricidas clorometiuron tioureia diafenthiuron acequinocila afoxolaner amidoflumet óxido arsenioso clenpirina closantel acaricidas não crotamiton classificados cicloprato cimiazol dissulfiram etoxazol fenazaflor fenazaquina

Categoria Compostos fluenetil fluralaner mesulfen

MNAF nifluridida nicomicinas piridabeno sulfiram sulfluramida enxofre turingiensina triarateno

QUIMIOESTERILIZ

ANTES Afolatobisazirbusulfandiflubenzurondimatifhemelhempametep ametiotepaafolato bisazir busulfan diflubenzuron dimatif hemel hempa metepa metiotepa afolato metílico morzida penfluron tepa tioempa tiotepa tretamina uredepa

REPELENTE DE

INSETOS acrep butopironoxil cânfora d-cânfora carbóxido ftalato de dibutila dietiltoluamida carbato de dimetila ftalato de dimetila succinato de dibutila etoexadiol hexamida icaridina

Categoria Compostos metoquin-butílico metilneodecanamida 2-(octiltio)etanol oxamato quwenzhi quyingding rebemida zengxiaoan

NEMATICIDA nematicidas de abamectina avermectina nematicidas carvacrol botânicos benomil nematicidas carbofurano carbamato carbosulfano cloetocarbe alanicarbe nematicidas aldicarbe oxima aldoxicarbe carbamato oxamil tirpato dissulfeto de carbono cianogênio 1,2-dicloropropano nematicidas 1,3-dicloropropeno fumigantes ditioéter metil brometo de metila iodeto de metila tetratiocarbonato de sódio nematicidas organofosforad os diamidafós nematicidas de fenamifós organofosfato fostietano fosfamidon cadusafós clorpirifós diclofention dimetoato nematicidas de etoprofós organotiofosfat fensulfotion o fostiazato heterofós isamidofós Isazofós

Categoria Compostos forato fosfocarbe terbufós tionazina triazofós nematicidas imiciafós fosfonotioato mecarfon acetoprol benclotiaz cloropicrina dazomet

DBCP nematicidas DCIP não fluazaindolizina classificados fluensulfona furfural metam isotiocianato de metila tioxazafen xilenóis

[308] Os inseticidas incluem também sinergistas ou ativadores que não são considerados tóxicos ou inseticidas, porém são materiais usados com inseticidas para sinergizar ou intensificar a atividade dos inseticidas. Sinergistas ou ativadores incluem butóxido de piperonila.

PESTICIDAS BIORRACIONAIS

[309] Os inseticidas podem ser bioracionais ou também podem ser conhecidos como biopesticidas ou pesticidas biológicos. Biorracional se refere a qualquer substância de origem natural (ou substâncias artificiais semelhantes às de origem natural) que tem um efeito prejudicial ou letal em praga (ou pragas) alvo específica, por exemplo, insetos, ervas daninhas, doenças de plantas (incluindo nematódeos) e praga vertebradas, possuem um modo de ação exclusivo, não são tóxicas para o homem, plantas e animais domésticos e têm pouco ou nenhum efeito adverso na vida selvagem e no meio ambiente.

[310] Os inseticidas biorracionais (ou biopesticidas ou pesticidas biológicos) podem ser agrupados como: (1) bioquímicos (hormônios, enzimas, feromônios e agentes naturais, como insetos e reguladores de crescimento de plantas), (2) microbianos (vírus, bactérias, fungos, protozoários e nematódeos), ou (3)

Protetores incorporados em plantas (PIPs) - principalmente plantas transgênicas, por exemplo, milho Bt.

[311] Os biopesticidas, ou pesticidas biológicos, podem incluir amplamente agentes fabricados a partir de microrganismos vivos ou um produto natural e vendidos para o controle de pragas de plantas. Os biopesticidas podem ser: microrganismos, produtos bioquímicos e semioquímicos. Os biopesticidas podem também incluir peptídeos, proteínas e ácidos nucleicos, como DNA de fita dupla, DNA de fita simples, RNA de fita dupla, RNA de fita simples e DNA ou RNA em formato de grampo.

[312] Bactérias, fungos, oomicetos, vírus e protozoários são usados para o controle biológico de pragas de insetos. O biopesticida microbiano mais amplamente utilizado é a bactéria patogênica de inseto Bacillus thuringiensis (Bt), que produz um cristal de proteína (a δ-endotoxina de Bt) durante a formação de esporos bacterianos que é capaz de causar lise de células intestinais quando consumida por insetos suscetíveis. Os biopesticidas de Bt microbianos consistem em esporos bacterianos e cristais de δ-endotoxina produzidos em massa em tanques de fermentação e formulados como um produto pulverizável. O Bt não causa danos aos vertebrados e é seguro para as pessoas, organismos benéficos e meio ambiente. Assim, as pulverizações de Bt são uma tática crescente para o manejo de pragas em frutas e vegetais, em que seu alto nível de seletividade e segurança são considerados desejáveis e em que a resistência a inseticidas químicos sintéticos é um problema. As pulverizações de Bt também têm sido usadas em culturas de commodities, como milho, soja e algodão, porém com o advento da modificação genética das plantas, os agricultores estão cada vez mais cultivando variedades transgênicas de Bt.

[313] Outros inseticidas microbianos incluem produtos à base de baculovírus entomopatogênicos. Baculovírus que são patogênicos para artrópodes pertencem à família dos vírus e possuem grandes genomas de DNA circulares, covalentemente fechados e de fita dupla que são embalados em nucleocapsídeos. Mais de 700 baculovírus foram identificados a partir de insetos das ordens Lepidoptera, Hymenoptera e Diptera. Os baculovírus são geralmente altamente específicos para seus insetos hospedeiros e, portanto, são seguros para o meio ambiente, seres humanos, outras plantas e organismos benéficos. Mais de 50 produtos de baculovírus foram usados para controlar diferentes pragas de insetos em todo o mundo. Nos EUA e na Europa, o granulovírus de Cydia pomonella (CpGV) é usado como um biopesticida inundativo contra a traça-das-crucíferas em maçãs. O Estado de Washington, como o maior produtor de maçã dos EUA, usa CpGV em 13% da cultura de maçã. No Brasil, o nucleopoliedrovírus da lagarta da soja Anticarsia gemmatalis foi utilizado em até 4 milhões de ha (aproximadamente 35%) da cultura de soja em meados da década de 1990. Vírus como o Gemstar® (Certis USA) estão disponíveis para controlar as larvas das espécies Heliothis e Helicoverpa.

[314] Pelo menos 170 produtos biopesticidas diferentes à base de fungos entomopatogênicos foram desenvolvidos para uso contra pelo menos cinco ordens de insetos e acarinos em culturas de estufa, frutas e vegetais do campo, bem como culturas de commodities. A maioria dos produtos é baseada nos ascomicetos Beauveria bassiana ou Metarhizium anisopliae. M. anisopliae foi também desenvolvido para o controle de pragas de gafanhotos na África e Austrália e é recomendado pela Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura (FAO) para o manejo de gafanhotos.

[315] Vários pesticidas microbianos registrados nos Estados Unidos estão listados na Tabela 16 de Kabaluk et al. 2010 (Kabaluk, JT et al. (Ed.). 2010. The Use and Regulation of Microbial Pesticides in Representative Jurisdictions Worldwide. IOBC Global. 99pp.) e pesticidas microbianos registrados em países selecionados estão listados no Anexo 4 de Hoeschle-Zeledon et al. 2013 (Hoeschle- Zeledon, I., P. Neuenschwander e L. Kumar. (2013). Regulatory Challenges for biological control. SP-IPM Secretariat, International Institute of Tropical Agriculture (IITA), Ibadan, Nigéria. 43 pp.), cada um dos quais está incorporado ao presente documento em sua totalidade.

[316] As plantas produzem uma grande variedade de metabólitos secundários que impedem os herbívoros de se alimentarem das mesmas. Alguns desses podem ser usados como biopesticidas. Os mesmos incluem, por exemplo, piretrinas, que são compostos inseticidas de ação rápida produzidos por Chrysanthemum cinerariaefolium. Os mesmos têm baixa toxicidade para mamíferos, porém se degradam rapidamente após a aplicação. Essa curta persistência levou ao desenvolvimento de piretrinas sintéticas (piretroides). O composto botânico mais amplamente usado é o óleo de nim, um inseticida químico extraído das sementes de Azadirachta indica. Dois pesticidas altamente ativos estão disponíveis com base em metabólitos secundários sintetizados por actinomicetos do solo, porém os mesmos foram avaliados pelas autoridades regulatórias como se fossem pesticidas químicos sintéticos. Espinosade é uma mistura de dois compostos macrolídeos de Saccharopolyspora spinosa. O mesmo tem uma toxicidade muito baixa para mamíferos e os resíduos se degradam rapidamente no campo. Os agricultores e produtores usaram o mesmo amplamente após sua introdução em 1997, porém algumas pragas importantes como tripes das flores ocidentais já desenvolveram resistência. A abamectina é um composto de lactona macrocíclica produzida por Streptomyces avermitilis. O mesmo é ativo contra uma variedade de espécies de pragas, porém também desenvolveu resistência à mesma, por exemplo, em ácaros tetraniquídeos.

[317] Foi constatado que os peptídeos e proteínas de vários organismos possuem propriedades pesticidas. Talvez mais proeminentes sejam os peptídeos do veneno da aranha (King, GF e Hardy, MC (2013) Spider-venom peptides: structure, pharmacology, and potential for control of insect pests. Annu. Rev. Entomol. 58: 475-496). Um arranjo exclusivo de ligações dissulfeto em peptídeos de veneno de aranha os torna extremamente resistentes a proteases. Como resultado, esses peptídeos são altamente estáveis no intestino do inseto e na hemolinfa e muitos dos mesmos são oralmente ativos. Os peptídeos alvejam uma ampla gama de receptores e canais iônicos no sistema nervoso dos insetos. Outros exemplos de peptídeos inseticidas incluem: veneno de anêmona do mar que age nos canais de Na + dependentes de voltagem (Bosmans, F. e Tytgat, J. (2007) Sea anemone venom as a source of inseticidal peptides acting on voltage-gated Na+ channels. Toxicon. 49 (4): 550–560); o peptídeo PA1b (Albumina de Ervilha 1, subunidade b) de sementes de leguminosas com atividade letal em várias pragas de insetos, como mosquitos, alguns afídeos e gorgulhos de cereais (Eyraud, V. et al. (2013) Expression and Biological Activity of the Cystine Knot Bioinseticida PA1b (Albumina 1 de Ervilha, Subunidade b). PLoS ONE 8 (12): e81619); e um peptídeo interno de 10 kDa gerado por hidrólise enzimática de urease de Canavalia ensiformis (feijão-de-porco) em insetos suscetíveis (Martinelli, AHS, et al. (2014) Structure–function studies on jaburetox, a recombinant inseticidal peptide derived from jack bean (Canavalia ensiformis) urease. Biochimica et Biophysica Acta 1840: 935–944). Exemplos de inseticidas peptídicos comercialmente disponíveis incluem Spear™ - T para o tratamento de tripes em vegetais e plantas ornamentais em estufas, Spear™ - P para controlar o Besouro da Batata do Colorado e Spear™ - C para proteger as culturas contra pragas de lepidópteros (Vestaron Corporation, Kalamazoo, MI). Uma proteína inseticida inovadora de Bacillus bombysepticus, chamada toxina de cristal parasporal (PC), mostra atividade patogênica oral e letalidade para bichos-da-seda e cepas de Helicoverpa armigera resistentes a Cry1Ac (Lin, P. et al. (2015) PC, uma toxina inseticida oral inovadora de Bacillus bombysepticus envolvida na letalidade do hospedeiro via APN e BtR-175. Sci. Rep. 5: 11101).

[318] Um semioquímico é um sinal químico produzido por um organismo que causa uma mudança comportamental em um indivíduo da mesma espécie ou de uma espécie diferente. Os semioquímicos mais amplamente usados para proteção de culturas são feromônios sexuais de insetos, alguns dos quais agora podem ser sintetizados e são usados para monitoramento ou controle de pragas por captura em massa, sistemas lure-and-kill e interrupção do acasalamento. Em todo o mundo, a interrupção do acasalamento é usada em mais de 660 000 ha e tem sido particularmente útil em culturas de pomares.

[319] Conforme usado no presente documento, "traço inseticida transgênico" se refere a um traço exibido por uma planta que foi geneticamente modificada para expressar um ácido nucleico ou polipeptídeo que é prejudicial a uma ou mais pragas. Em uma modalidade, as plantas da presente divulgação são resistentes à fixação e/ou infestação de qualquer uma ou mais das pragas da presente divulgação. Em uma modalidade, o traço compreende a expressão de proteínas inseticidas vegetativas (VIPs) de Bacillus thuringiensis, lectinas e inibidores de proteinase de plantas, terpenoides, colesterol oxidases de Streptomyces spp., quitinases de insetos e enzimas quitinolíticas fúngicas, proteínas inseticidas bacterianas e genes de resistência a reconhecimento precoce.

Em outra modalidade, o traço compreende a expressão de uma proteína de Bacillus thuringiensis que é tóxica para uma praga. Em uma modalidade, a proteína de Bt é uma proteína Cry (proteína de cristal). As culturas de Bt incluem milho de Bt, algodão de Bt e soja de Bt. As toxinas de Bt podem ser da família Cry (consultar, por exemplo, Crickmore et al., 1998, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 807-812), que são particularmente eficazes contra Lepidoptera, Coleoptera e Diptera.

[320] As toxinas Cry e Cyt de Bt pertencem a uma classe de toxinas bacterianas conhecidas como toxinas formadoras de poros (PFT) que são secretadas como proteínas solúveis em água que sofrem mudanças conformacionais para inserir ou translocar através das membranas celulares de seu hospedeiro. Há dois grupos principais de PFT: (i) as toxinas α-helicoidais, em que as regiões α-hélice formam o poro transmembranar, e (ii) as toxinas β-barril, que se inserem na membrana formando um β-barril composto por grampos de folha β de cada monômero. Consultar, Parker MW, Feil SC, “Pore-forming protein toxins: from structure to function”, Prog. Biophys. Mol. Biol. Maio de 2005; 88(1):91-142. A primeira classe de PFT inclui toxinas como as colicinas, exotoxina A, toxina da difteria e também as toxinas de três domínios Cry. Por outro lado, aerolisina, α- hemolisina, antígeno protetor do antraz, toxinas dependentes do colesterol como a perfringolisina O e as toxinas Cyt pertencem às toxinas β-barril. Id. Em geral, as bactérias produtoras de PFT secretam suas toxinas e essas toxinas interagem com receptores específicos localizados na superfície da célula hospedeira. Na maioria dos casos, as PFT são ativadas por proteases do hospedeiro após a ligação ao receptor, induzindo a formação de uma estrutura oligomérica que é competente para inserção. Por fim, a inserção da membrana é ativada, na maioria dos casos, por uma diminuição do pH que induz um estado de glóbulo fundido da proteína. Id.

[321] O desenvolvimento de culturas transgênicas que produzem proteínas Cry de Bt tem permitido a substituição de inseticidas químicos por alternativas ecológicas. Em plantas transgênicas, a toxina Cry é produzida continuamente, protegendo a toxina contra degradação e tornando-a acessível aos insetos mastigadores e brocadores. A produção da proteína Cry em plantas foi melhorada pela modificação genética de genes cry com um viés no uso de códon em plantas, pela remoção de sequências de sinal de splicing putativas e deleção da região carbóxi-terminal da pró-toxina. Consultar, Schuler TH, et al., “Insect-resistant transgenic plants”, Trends Biotechnol. 1998;16:168–175. O uso de culturas resistentes a insetos diminuiu consideravelmente o uso de pesticidas químicos nas áreas em que essas culturas transgênicas são plantadas. Consultar, Qaim M, Zilberman D, “Yield effects of genetically modified crops in developing countries”, Science. 2003 Feb 7; 299(5608):900-2.

[322] As proteínas Cry conhecidas incluem: δ-endotoxinas incluindo, porém sem limitação: Cry1, Cry2, Cry3, Cry4, Cry5, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry10, Cry11, Cry12, Cry13, Cry14, Cry15, Cry16, Cry17, Cry18, Cry19, Cry20, Cry21, Cry22, Cry23, Cry24, Cry25, Cry26, Cry27, Cry 28, Cry 29, Cry 30, Cry31, Cry32, Cry33, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry38, Cry39, Cry40, Cry41, Cry42, Cry43, Cry44, Cry45, Cry 46, Cry47, Cry49, Cry 51, Cry52, Cry 53, Cry 54, Cry55, Cry56, Cry57, Cry58, Cry59. Classes de genes de δ-endotoxina Cry60, Cry61, Cry62, Cry63, Cry64, Cry65, Cry66, Cry67, Cry68, Cry69, Cry70 e Cry71 e os genes citolíticos e cyt2 de B. thuringiensis.

[323] Os membros dessas classes de proteínas inseticidas de B. thuringiensis incluem, porém sem limitação: CrylAa1 (Número de Acesso AAA22353); Cry1Aa2 (Número de Acesso AAA22552); Cry1Aa3 (Número de Acesso BAA00257); Cry1Aa4 (Número de Acesso CAA31886); Cry1Aa5 (Número de Acesso BAA04468); Cry1Aa6 (Número de Acesso AAA86265); Cry1Aa7 (Número de Acesso AAD46139); Cry1Aa8 (Número de Acesso 126149); Cry1Aa9 (Número de Acesso BAA77213); CrylAa10 (Número de Acesso AAD55382); CrylAa11 (Número de Acesso CAA70856); Cry1Aa12 (Número de Acesso AAP80146); Cry1Aa13 (Número de Acesso AAM44305); Cry1Aa14 (Número de Acesso AAP40639); Cry1Aa15 (Número de Acesso AAY66993); Cry1Aa16 (Número de Acesso HQ439776); Cry1Aa17 (Número de Acesso HQ439788); Cry1Aa18 (Número de Acesso HQ439790); Cry1Aa19 (Número de Acesso HQ685121); Cry1Aa20 (Número de Acesso JF340156); Cry1Aa21 (Número de Acesso JN651496); Cry1Aa22 (Número de Acesso KC158223); Cry1Abl (Número de Acesso AAA22330); Cry1Ab2 (Número de Acesso AAA22613); Cry1Ab3 (Número de Acesso AAA22561); Cry1Ab4 (Número de Acesso BAA00071); Cry1Ab5 (Número de Acesso CAA28405); Cry1Ab6 (Número de Acesso

AAA22420); Cry1Ab7 (Número de Acesso CAA31620); Cry1Ab8 (Número de Acesso AAA22551); Cry1Ab9 (Número de Acesso CAA38701); Cry1Ab10 (Número de Acesso A29125); Cry1Ab11 (Número de Acesso I12419); Cry1Ab12 (Número de Acesso AAC64003); Cry1Ab13 (Número de Acesso AAN76494); Cry1Ab14 (Número de Acesso AAG16877); Cry1Ab15 (Número de Acesso AA013302); Cry1Ab16 (Número de AcessoAAK55546); Cry1Ab17 (Número de Acesso AAT46415); Cry1Ab18 (Número de Acesso AAQ88259); Cry1Ab19 (Número de Acesso AAW31761); Cry1Ab20 (Número de Acesso ABB72460); Cry1Ab21 (Número de Acesso ABS18384); Cry1Ab22 (Número de Acesso ABW87320); Cry1Ab23 (Número de Acesso HQ439777); Cry1Ab24 (Número de Acesso HQ439778); Cry1Ab25 (Número de Acesso HQ685122); Cry1Ab26 (Número de Acesso HQ847729); Cry1Ab27 (Número de Acesso JN135249); Cry1Ab28 (Número de Acesso JN135250); Cry1Ab29 (Número de Acesso JN135251); Cry1Ab30 (Número de Acesso JN135252); Cry1Ab31 (Número de Acesso JN135253); Cry1Ab32 (Número de Acesso JN135254); Cry1Ab33 (Número de Acesso AAS93798); Cry1Ab34 (Número de Acesso KC156668); Cry1Ab-like (Número de Acesso AAK14336); Cry1Ab-like (Número de Acesso AAK14337); Cry1Ab-like (Número de Acesso AAK14338); Cry1Ab-like (Número de Acesso ABG88858); Cry1Ac1 (Número de Acesso AAA22331); Cry1Ac2 (Número de Acesso AAA22338); Cry1Ac3 (Número de Acesso CAA38098); Cry1Ac4 (Número de Acesso AAA73077); Cry1Ac5 (Número de Acesso AAA22339); Cry1Ac6 (Número de AcessoAAA86266); Cry1Ac7 (Número de Acesso AAB46989); Cry1Ac8 (Número de Acesso AAC44841); Cry1Ac9 (Número de Acesso AAB49768); CrylAc10 (Número de Acesso CAA05505); CrylAc11 (Número de Acesso CAA10270); Cry1Ac12 (Número de Acesso I12418); Cry1Ac13 (Número de Acesso AAD38701); Cry1Ac14 (Número de Acesso AAQ06607); Cry1Ac15 (Número de Acesso AAN07788); Cry1Ac16 (Número de Acesso AAU87037); CrylAc17 (Número de Acesso AAX18704); Cry1Ac18 (Número de Acesso AAY88347); Cry1Ac19 (Número de Acesso ABD37053); Cry1Ac20 (Número de Acesso ABB89046); Cry1Ac21 (Número de Acesso AAY66992); Cry1Ac22 (Número de Acesso ABZ01836); Cry1Ac23 (Número de Acesso CAQ30431); Cry1Ac24 (Número de Acesso ABL01535); Cry1Ac25 (Número de Acesso FJ513324); Cry1Ac26 (Número de Acesso FJ617446); Cry1Ac27 (Número de Acesso FJ617447); Cry1Ac28 (Número de Acesso ACM90319); Cry1Ac29 (Número de Acesso DQ438941); Cry1Ac30 (Número de Acesso GQ227507); Cry1Ac31 (Número de Acesso GU446674); Cry1Ac32 (Número de Acesso HM061081 ); Cry1Ac33 (Número de Acesso GQ866913); Cry1Ac34 (Número de Acesso HQ230364); Cry1Ac35 (Número de Acesso JF340157); Cry1Ac36 (Número de Acesso JN387137); Cry1Ac37 (Número de Acesso JQ317685); CrylAd1 (Número de Acesso AAA22340); Cry1Ad2 (Número de Acesso CAA01880); CrylAe1 (Número de Acesso AAA22410); CrylAf1 (Número de Acesso AAB82749); CrylAg1 (Número de Acesso AAD46137); CrylAh1 (Número de Acesso AAQ14326); Cry1Ah2 (Número de Acesso ABB76664); Cry1Ah3 (Número de Acesso HQ439779); CrylAi1 (Número de Acesso AA039719); Cry1Ai2 (Número de Acesso HQ439780); Cry1A-like (Número de Acesso AAK14339); Cry1Bal (Número de Acesso CAA29898); Cry1Ba2 (Número de Acesso CAA65003); Cry1Ba3 (Número de Acesso AAK63251); Cry1Ba4 (Número de Acesso AAK51084); Cry1Ba5 (Número de Acesso AB020894); Cry1Ba6 (Número de Acesso ABL60921); Cry1Ba7 (Número de Acesso HQ439781); CrylBb1 (Número de Acesso AAA22344); Cry1Bb2 (Número de Acesso HQ439782); Cry1Bcl (Número de Acesso CAA86568); Cry1Bdl (Número de Acesso AAD10292); Cry1Bd2 (Número de Acesso AAM93496); CrylBe1 (Número de Acesso AAC32850); Cry1Be2 (Número de Acesso AAQ52387); Cry1Be3 (Número de Acesso ACV96720); Cry1Be4 (Número de Acesso HM070026); CrylBf1 (Número de Acesso CAC50778); Cry1Bf2 (Número de Acesso AAQ52380); Cry1Bgl (Número de Acesso AA039720); Cry1Bhl (Número de Acesso HQ589331); Cry1Bil (Número de Acesso KC156700); Cry1Cal (Número de Acesso CAA30396); Cry1Ca2 (Número de Acesso CAA31951); Cry1Ca3 (Número de Acesso AAA22343); Cry1Ca4 (Número de Acesso CAA01886); Cry1Ca5 (Número de Acesso CAA65457); Cry1Ca6 [1] (Número de Acesso AAF37224); Cry1Ca7 (Número de Acesso AAG50438); Cry1Ca8 (Número de Acesso AAM00264); Cry1Ca9 (Número de Acesso AAL79362); CrylCa10 (Número de Acesso AAN16462); Cry1Ca11(Número de Acesso AAX53094); Cry1Ca12 (Número de Acesso HM070027); Cry1Ca13 (Número de Acesso HQ412621); Cry1Ca14 (Número de AcessoJN651493); CrylCb1 (Número de Acesso M97880);

Cry1Cb2 (Número de Acesso AAG35409); Cry1Cb3 (Número de Acesso ACD50894); semelhante a Cry1Cb (Número de Acesso AAX63901); Cry1Dal (Número de Acesso CAA38099); Cry1Da2 (Número de Acesso I76415); Cry1Da3 (Número de Acesso HQ439784); Cry1 Dbl (Número de Acesso CAA80234); Cry1 Db2 (Número de Acesso AAK48937); Cry1 Dcl (Número de Acesso ABK35074); Cry1Eal (Número de Acesso CAA37933); Cry1Ea2 (Número de Acesso CAA39609); Cry1Ea3 (Número de Acesso AAA22345); Cry1Ea4 (Número de Acesso AAD04732); Cry1Ea5 (Número de Acesso A15535); Cry1Ea6 (Número de Acesso AAL50330); Cry1Ea7 (Número de Acesso AAW72936); Cry1Ea8 (Número de Acesso ABX11258); Cry1Ea9 (Número de Acesso HQ439785); CrylEa10 (Número de Acesso ADR00398); CrylEa11 (Número de Acesso JQ652456); Cry1Ebl (Número de Acesso AAA22346); Cry1Fal (Número de Acesso AAA22348); Cry1Fa2 (Número de Acesso AAA22347); Cry1Fa3 (Número de Acesso HM070028); Cry1Fa4 (Número de AcessoHM439638); Cryl Fbl (Número de Acesso CAA80235); Cry1Fb2 (Número de Acesso BAA25298); Cry1Fb3 (Número de Acesso AAF21767); Cry1Fb4 (Número de Acesso AAC10641); Cry1Fb5 (Número de Acesso AA013295); Cry1Fb6 (Número de Acesso ACD50892); Cry1Fb7 (Número de Acesso ACD50893); CrylGal (Número de Acesso CAA80233); Cry1Ga2 (Número de Acesso CAA70506); CrylGbl (Número de Acesso AAD10291); Cry1Gb2 (Número de Acesso AA013756); CrylGcl (Número de Acesso AAQ52381); CrylHa1 (Número de Acesso CAA80236); CrylHbl (Número de Acesso AAA79694); Cry1Hb2 (Número de Acesso HQ439786); CrylH-like (Número de Acesso AAF01213); CrylIal (Número de Acesso CAA44633); Cry1Ia2 (Número de Acesso AAA22354); Cry1Ia3 (Número de Acesso AAC36999); Cry1Ia4 (Número de Acesso AAB00958); Cry1Ia5 (Número de Acesso CAA70124); Cry1Ia6 (Número de Acesso AAC26910); Cry1Ia7 (Número de Acesso AAM73516); Cry1Ia8 (Número de Acesso AAK66742); Cry1Ia9 (Número de Acesso AAQ08616); Cry1Ia10 (Número de Acesso AAP86782); CrylIa11 (Número de Acesso CAC85964); Cry1Ia12 (Número de Acesso AAV53390); Cry1Ia13 (Número de Acesso ABF83202); Cry1Ia14 (Número de Acesso ACG63871); Cry1Ia15 (Número de AcessoFJ617445); Cry1Ia16 (Número de Acesso FJ617448); CrylIal7 (Número de Acesso GU989199); CrylIal8 (Número de Acesso ADK23801 ); CrylIal9 (Número de

Acesso HQ439787); Cry1Ia20 (Número de Acesso JQ228426); Cry1Ia21 (Número de Acesso JQ228424); Cry1Ia22 (Número de AcessoJQ228427); Cry1Ia23 (Número de Acesso JQ228428); Cry1Ia24 (Número de Acesso JQ228429); Cry1Ia25 (Número de Acesso JQ228430); Cry1Ia26 (Número de Acesso JQ228431); Cry1Ia27 (Número de Acesso JQ228432); Cry1Ia28 (Número de Acesso JQ228433); Cry1Ia29 (Número de AcessoJQ228434); Cry1Ia30 (Número de Acesso JQ317686); Cry1Ia31 (Número de Acesso JX944038); Cry1Ia32 (Número de Acesso JX944039); Cry1Ia33 (Número de Acesso JX944040); CrylIb1 (Número de Acesso AAA82114); Cry1Ib2 (Número de Acesso ABW88019); Cry1Ib3 (Número de Acesso ACD75515); Cry1Ib4 (Número de Acesso HM051227); Cry1Ib5 (Número de Acesso HM070028); Cry1Ib6 (Número de Acesso ADK38579); Cry1Ib7 (Número de Acesso JN571740); Cry1Ib8 (Número de Acesso JN675714); Cry1Ib9 (Número de Acesso JN675715); Cry1Ib10 (Número de Acesso JN675716); CrylIbll (Número de Acesso JQ228423); CrylIcl (Número de Acesso AAC62933); Cry1Ic2 (Número de Acesso AAE71691); CrylIdl (Número de Acesso AAD44366); Cry1Id2 (Número de Acesso JQ228422); CrylIel (Número de Acesso AAG43526); Cry1Ie2 (Número de Acesso HM439636); Cry1Ie3 (Número de Acesso KC156647); Cry1Ie4 (Número de Acesso KC156681); Cryllfl (Número de Acesso AAQ52382); CrylIgl (Número de Acesso KC156701); CrylI-like (Número de Acesso AAC31094); CrylI- like (Número de Acesso ABG88859); CrylJal (Número de Acesso AAA22341); Cry1Ja2 (Número de Acesso HM070030); Cry1Ja3 (Número de Acesso JQ228425); CrylJbl (Número de Acesso AAA98959); CrylJcl (Número de Acesso AAC31092); Cry1Jc2 (Número de Acesso AAQ52372); CrylJdl (Número de Acesso CAC50779); CrylKal (Número de Acesso AAB00376); Cry1Ka2 (Número de Acesso HQ439783); CrylLal (Número de Acesso AAS60191); Cry1La2 (Número de Acesso HM070031); CrylMal (Número de Acesso FJ884067); Cry1Ma2 (Número de Acesso KC156659); CrylNal (Número de Acesso KC156648); CrylNbl (Número de Acesso KC156678); Cryl-like (Número de Acesso AAC31091); Cry2Aal (Número de Acesso AAA22335); Cry2Aa2 (Número de Acesso AAA83516); Cry2Aa3 (Número de Acesso D86064); Cry2Aa4 (Número de Acesso AAC04867); Cry2Aa5 (Número de Acesso CAA10671); Cry2Aa6 (Número de Acesso CAA10672); Cry2Aa7 (Número de Acesso CAA10670); Cry2Aa8 (Número de Acesso AA013734); Cry2Aa9 (Número de Acesso AA013750); Cry2Aal O (Número de Acesso AAQ04263); Cry2Aal 1 (Número de Acesso AAQ52384); Cry2Aa12 (Número de Acesso AB183671); Cry2Aa13 (Número de Acesso ABL01536); Cry2Aa14 (Número de Acesso ACF04939); Cry2Aa15 (Número de Acesso JN426947); Cry2Abl (Número de Acesso AAA22342); Cry2Ab2 (Número de Acesso CAA39075); Cry2Ab3 (Número de Acesso AAG36762); Cry2Ab4 (Número de Acesso AA013296); Cry2Ab5 (Número de Acesso AAQ04609); Cry2Ab6 (Número de Acesso AAP59457); Cry2Ab7 (Número de Acesso AAZ66347); Cry2Ab8 (Número de Acesso ABC95996); Cry2Ab9 (Número de Acesso ABC74968); Cry2Ab10 (Número de Acesso EF157306); Cry2Abll (Número de Acesso CAM84575); Cry2Ab12 (Número de Acesso ABM21764); Cry2Ab13 (Número de Acesso ACG76120); Cry2Ab14 (Número de Acesso ACG76121); Cry2Ab15 (Número de Acesso HM037126); Cry2Ab16 (Número de Acesso GQ866914); Cry2Abl 7 (Número de Acesso HQ439789); Cry2Ab18 (Número de Acesso JN135255); Cry2Ab19 (Número de Acesso JN135256); Cry2Ab20 (Número de Acesso JN135257); Cry2Ab21 (Número de Acesso JN135258); Cry2Ab22 (Número de Acesso JN135259); Cry2Ab23 (Número de Acesso JN135260); Cry2Ab24 (Número de Acesso JN135261); Cry2Ab25 (Número de Acesso JN415485); Cry2Ab26 (Número de Acesso JN426946); Cry2Ab27 (Número de Acesso JN415764); Cry2Ab28 (Número de Acesso JN651494); Cry2Acl (Número de Acesso CAA40536); Cry2Ac2 (Número de Acesso AAG35410); Cry2Ac3 (Número de Acesso AAQ52385); Cry2Ac4 (Número de Acesso ABC95997); Cry2Ac5 (Número de Acesso ABC74969); Cry2Ac6 (Número de Acesso ABC74793); Cry2Ac7 (Número de Acesso CAL18690); Cry2Ac8 (Número de Acesso CAM09325); Cry2Ac9 (Número de Acesso CAM09326); Cry2Ac10 (Número de Acesso ABN15104); Cry2Acll (Número de Acesso CAM83895); Cry2Ac12 (Número de Acesso CAM83896); Cry2Adl (Número de Acesso AAF09583); Cry2Ad2 (Número de Acesso ABC86927); Cry2Ad3 (Número de Acesso CAK29504); Cry2Ad4 (Número de Acesso CAM32331 ); Cry2Ad5 (Número de Acesso CA078739); Cry2Ael (Número de Acesso AAQ52362); Cry2Afl (Número de Acesso AB030519); Cry2Af2 (Número de Acesso GQ866915); Cry2Agl (Número de Acesso ACH91610); Cry2Ahl (Número de Acesso EU939453); Cry2Ah2 (Número de Acesso ACL80665); Cry2Ah3 (Número de

Acesso GU073380); Cry2Ah4 (Número de Acesso KC156702); Cry2Ail (Número de Acesso FJ788388); Cry2Aj (Número de Acesso); Cry2Akl (Número de Acesso KC156660); Cry2Bal (Número de Acesso KC156658); Cry3Aal (Número de Acesso AAA22336); Cry3Aa2 (Número de Acesso AAA22541); Cry3Aa3 (Número de Acesso CAA68482); Cry3Aa4 (Número de Acesso AAA22542); Cry3Aa5 (Número de Acesso AAA50255); Cry3Aa6 (Número de Acesso AAC43266); Cry3Aa7 (Número de Acesso CAB41411); Cry3Aa8 (Número de Acesso AAS79487); Cry3Aa9 (Número de Acesso AAW05659); Cry3Aa10 (Número de AcessoAAU29411); Cry3Aall (Número de Acesso AAW82872); Cry3Aa12 (Número de Acesso ABY49136); Cry3Bal (Número de Acesso CAA34983); Cry3Ba2 (Número de Acesso CAA00645); Cry3Ba3 (Número de Acesso JQ397327); Cry3Bbl (Número de Acesso AAA22334); Cry3Bb2 (Número de Acesso AAA74198); Cry3Bb3 (Número de Acesso I15475); Cry3Cal (Número de Acesso CAA42469); Cry4Aal (Número de Acesso CAA68485); Cry4Aa2 (Número de Acesso BAAOOl 79); Cry4Aa3 (Número de AcessoCAD30148); Cry4Aa4 (Número de Acesso AFB18317); Cry4A-like (Número de Acesso AAY96321); Cry4Bal (Número de Acesso CAA30312); Cry4Ba2 (Número de Acesso CAA30114); Cry4Ba3 (Número de Acesso AAA22337); Cry4Ba4 (Número de Acesso BAAOOl 78); Cry4Ba5 (Número de Acesso CAD30095); Cry4Ba-like (Número de Acesso ABC47686); Cry4Cal (Número de Acesso EU646202); Cry4Cbl (Número de Acesso FJ403208); Cry4Cb2 (Número de Acesso FJ597622); Cry4Ccl (Número de Acesso FJ403207); Cry5Aal (Número de Acesso AAA67694); Cry5Abl (Número de Acesso AAA67693); Cry5Acl (Número de Acesso I34543); Cry5Adl (Número de Acesso ABQ82087); Cry5Bal (Número de Acesso AAA68598); Cry5Ba2 (Número de Acesso ABW88931); Cry5Ba3 (Número de Acesso AFJ04417); Cry5Cal (Número de Acesso HM461869); Cry5Ca2 (Número de Acesso ZP _04123426); Cry5Dal (Número de Acesso HM461870); Cry5Da2 (Número de Acesso ZP _04123980); Cry5Eal (Número de Acesso HM485580); Cry5Ea2 (Número de Acesso ZP _04124038); Cry6Aal (Número de Acesso AAA22357); Cry6Aa2 (Número de Acesso AAM46849); Cry6Aa3 (Número de Acesso ABH03377); Cry6Bal (Número de Acesso AAA22358); Cry7 Aal (Número de Acesso AAA22351); Cry7Abl (Número de Acesso AAA21120); Cry7Ab2 (Número de Acesso AAA21121); Cry7Ab3

(Número de Acesso ABX24522); Cry7 Ab4 (Número de Acesso EU380678); Cry7 Ab5 (Número de Acesso ABX79555); Cry7 Ab6 (Número de Acesso ACI44005); Cry7 Ab7 (Número de Acesso ADB89216); Cry7 Ab8 (Número de Acesso GU145299); Cry7Ab9 (Número de Acesso ADD92572); Cry7Bal (Número de Acesso ABB70817); Cry7Bbl (Número de Acesso KC156653); Cry7Cal (Número de Acesso ABR67863); Cry7Cbl (Número de Acesso KC156698); Cry7Dal (Número de Acesso ACQ99547); Cry7Da2 (Número de Acesso HM572236); Cry7Da3 (Número de Acesso KC156679); Cry7Eal (Número de AcessoHM035086); Cry7Ea2 (Número de Acesso HM132124); Cry7Ea3 (Número de Acesso EEM19403); Cry7Fal (Número de Acesso HM035088); Cry7Fa2 (Número de Acesso EEM19090); Cry7Fbl (Número de Acesso HM572235); Cry7Fb2 (Número de Acesso KC156682); Cry7Gal (Número de Acesso HM572237); Cry7Ga2 (Número de Acesso KC156669); Cry7Gbl (Número de Acesso KC156650); Cry7Gcl (Número de Acesso KC156654); Cry7Gdl (Número de Acesso KC156697); Cry7Hal (Número de Acesso KC156651); Cry7Ial (Número de Acesso KC156665); Cry7Jal (Número de Acesso KC156671); Cry7Kal (Número de Acesso KC156680); Cry7Kbl (Número de Acesso BAM99306); Cry7Lal (Número de Acesso BAM99307); Cry8Aal (Número de Acesso AAA21117); Cry8Abl (Número de Acesso EU044830); Cry8Acl (Número de Acesso KC156662); Cry8Adl (Número de Acesso KC156684); Cry8Bal (Número de Acesso AAA21118); Cry8Bbl (Número de Acesso CAD57542); Cry8Bcl (Número de Acesso CAD57543); Cry8Cal (Número de Acesso AAA21119); Cry8Ca2 (Número de Acesso AAR98783); Cry8Ca3 (Número de Acesso EU625349); Cry8Ca4 (Número de Acesso ADB54826); Cry8Dal (Número de Acesso BAC07226); Cry8Da2 (Número de Acesso BD133574); Cry8Da3 (Número de Acesso BD133575); Cry8Dbl (Número de Acesso BAF93483); Cry8Eal (Número de Acesso AAQ73470); Cry8Ea2 (Número de Acesso EU047597); Cry8Ea3 (Número de Acesso KC855216); Cry8Fal (Número de Acesso AAT48690); Cry8Fa2 (Número de Acesso HQl 74208); Cry8Fa3 (Número de Acesso AFH78109); Cry8Gal (Número de Acesso AAT46073); Cry8Ga2 (Número de Acesso ABC42043); Cry8Ga3 (Número de Acesso FJ198072); Cry8Hal (Número de Acesso AAW81032); Cry8Ial (Número de Acesso EU381044); Cry8Ia2 (Número de Acesso GU073381); Cry8Ia3 (Número de Acesso HM044664); Cry8Ia4 (Número de Acesso KC156674); Cry8Ibl (Número de

Acesso GU325772); Cry8Ib2 (Número de Acesso KC156677); Cry8Jal (Número de Acesso EU625348); Cry8Kal (Número de Acesso FJ422558); Cry8Ka2 (Número de Acesso ACN87262); Cry8Kbl (Número de Acesso HM123758); Cry8Kb2 (Número de Acesso KC156675); Cry8Lal (Número de Acesso GU325771); Cry8Mal (Número de Acesso HM044665); Cry8Ma2 (Número de Acesso EEM86551); Cry8Ma3 (Número de Acesso HM210574); Cry8Nal (Número de Acesso HM640939); Cry8Pal (Número de Acesso HQ388415); Cry8Qal (Número de Acesso HQ441166); Cry8Qa2 (Número de Acesso KC152468); Cry8Ral (Número de Acesso AFP87548); Cry8Sal (Número de Acesso JQ740599); Cry8Tal (Número de Acesso KC156673); Cry8-like (Número de Acesso FJ770571); Cry8-like (Número de Acesso ABS53003); Cry9Aal (Número de Acesso CAA41122); Cry9Aa2 (Número de Acesso CAA41425); Cry9Aa3 (Número de Acesso GQ249293); Cry9Aa4 (Número de Acesso GQ249294); Cry9Aa5 (Número de Acesso JXl 74110); Cry9Aa like (Número de Acesso AAQ52376); Cry9Bal (Número de Acesso CAA52927); Cry9Ba2 (Número de Acesso GU299522); Cry9Bbl (Número de Acesso AAV28716); Cry9Cal (Número de Acesso CAA85764); Cry9Ca2 (Número de Acesso AAQ52375); Cry9Dal (Número de Acesso BAAl 9948); Cry9Da2 (Número de Acesso AAB97923); Cry9Da3 (Número de Acesso GQ249293); Cry9Da4 (Número de Acesso GQ249297); Cry9Dbl (Número de Acesso AAX78439); Cry9Dcl (Número de Acesso KCl 56683); Cry9Eal (Número de Acesso BAA34908); Cry9Ea2 (Número de Acesso AA012908); Cry9Ea3 (Número de Acesso ABM21765); Cry9Ea4 (Número de Acesso ACE88267); Cry9Ea5 (Número de Acesso ACF04743); Cry9Ea6 (Número de AcessoACG63872); Cry9Ea7 (Número de Acesso FJ380927); Cry9Ea8 (Número de Acesso GQ249292); Cry9Ea9 (Número de Acesso JN651495); Cry9Ebl (Número de Acesso CAC50780); Cry9Eb2 (Número de Acesso GQ249298); Cry9Eb3 (Número de Acesso KC156646); Cry9Ecl (Número de Acesso AAC63366); Cry9Edl (Número de Acesso AAX78440); Cry9Eel (Número de Acesso GQ249296); Cry9Ee2 (Número de Acesso KC156664); Cry9Fal (Número de Acesso KC156692); Cry9Gal (Número de Acesso KC156699); Cry9-like (Número de Acesso AAC63366); CrylOAal (Número de AcessoAAA22614); Cry10Aa2 (Número de Acesso E00614); Cry10Aa3 (Número de Acesso CAD30098); Cry10Aa4 (Número de Acesso AFB18318); CrylOA-like

(Número de Acesso DQ167578); Cryl lAal (Número de Acesso AAA22352); Cryl 1Aa2 (Número de Acesso AAA22611); Cry11Aa3 (Número de Acesso CAD30081); Cry11Aa4 (Número de Acesso AFB18319); CryllAa-like (Número de Acesso DQ166531); CryllBal (Número de Acesso CAA60504); CryllBbl (Número de Acesso AAC97162); Cry11Bb2 (Número de Acesso HM068615); Cry12Aal (Número de Acesso AAA22355); Cry13Aal (Número de Acesso AAA22356); Cry14Aal (Número de Acesso AAA21516); Cry14Abl (Número de Acesso KC156652); Cry15Aal (Número de Acesso AAA22333); Cryl6Aal (Número de Acesso CAA63860); Cry17Aal (Número de Acesso CAA67841); Cry18Aal (Número de Acesso CAA67506); Cryl8Bal (Número de Acesso AAF89667); Cry18Cal (Número de Acesso AAF89668); Cry19Aal (Número de Acesso CAA68875); Cry19Bal (Número de Acesso BAA32397); Cry19Cal (Número de Acesso AFM37572); Cry20Aal (Número de Acesso AAB93476); Cry20Bal (Número de Acesso ACS93601); Cry20Ba2 (Número de Acesso KC156694); Cry20-like (Número de Acesso GQ144333); Cry21Aal (Número de Acesso I32932); Cry21Aa2 (Número de Acesso I66477); Cry21Bal (Número de Acesso BAC06484); Cry21Cal (Número de Acesso JF521577); Cry21Ca2 (Número de Acesso KC156687); Cry21Dal (Número de Acesso JF521578); Cry22Aal (Número de Acesso I34547); Cry22Aa2 (Número de Acesso CAD43579); Cry22Aa3 (Número de Acesso ACD93211); Cry22Abl (Número de Acesso AAK50456); Cry22Ab2 (Número de Acesso CAD43577); Cry22Bal (Número de Acesso CAD43578); Cry22Bbl (Número de Acesso KC156672); Cry23Aal (Número de Acesso AAF76375); Cry24Aal (Número de Acesso AAC61891); Cry24Bal (Número de Acesso BAD32657); Cry24Cal (Número de Acesso CAJ43600); Cry25Aal (Número de Acesso AAC61892); Cry26Aal (Número de Acesso AAD25075); Cry27Aal (Número de Acesso BAA82796); Cry28Aal (Número de Acesso AAD24189); Cry28Aa2 (Número de Acesso AAG00235); Cry29Aal (Número de Acesso CAC80985); Cry30Aal (Número de Acesso CAC80986); Cry30Bal (Número de Acesso BAD00052); Cry30Cal (Número de Acesso BAD67157); Cry30Ca2 (Número de Acesso ACU24781); Cry30Dal (Número de Acesso EF095955); Cry30Dbl (Número de Acesso BAE80088); Cry30Eal (Número de Acesso ACC95445); Cry30Ea2 (Número de Acesso FJ499389); Cry30Fal (Número de Acesso ACI22625); Cry30Gal (Número de

Acesso ACG60020); Cry30Ga2 (Número de AcessoHQ638217); Cry31Aal (Número de Acesso BABll 757); Cry31Aa2 (Número de Acesso AAL87458); Cry31Aa3 (Número de Acesso BAE79808); Cry31Aa4 (Número de Acesso BAF32571); Cry31Aa5 (Número de Acesso BAF32572); Cry31Aa6 (Número de Acesso BA144026); Cry31Abl (Número de AcessoBAE79809); Cry31Ab2 (Número de Acesso BAF32570); Cry31Acl (Número de Acesso BAF34368); Cry31Ac2 (Número de Acesso AB731600); Cry31Adl (Número de Acesso BA144022); Cry32Aal (Número de Acesso AAG36711); Cry32Aa2 (Número de Acesso GU063849); Cry32Abl (Número de AcessoGU063850); Cry32Bal (Número de Acesso BAB78601); Cry32Cal (Número de Acesso BAB78602); Cry32Cbl (Número de Acesso KC156708); Cry32Dal (Número de Acesso BAB78603); Cry32Eal (Número de Acesso GU324274); Cry32Ea2 (Número de Acesso KC156686); Cry32Ebl (Número de Acesso KC156663); Cry32Fal (Número de Acesso KC156656); Cry32Gal (Número de Acesso KC156657); Cry32Hal (Número de Acesso KC156661); Cry32Hbl (Número de Acesso KC156666); Cry32Ial (Número de Acesso KCl 56667); Cry32Jal (Número de Acesso KCl 56685); Cry32Kal (Número de Acesso KCl 56688); Cry32Lal (Número de Acesso KC156689); Cry32Mal (Número de Acesso KC156690); Cry32Mbl (Número de Acesso KC156704); Cry32Nal (Número de Acesso KC156691); Cry32Oal (Número de Acesso KC156703); Cry32Pal (Número de Acesso KC156705); Cry32Qal (Número de AcessoKC156706); Cry32Ral (Número de Acesso KC156707); Cry32Sal (Número de Acesso KC156709); Cry32Tal (Número de Acesso KC156710); Cry32Ual (Número de Acesso KC156655); Cry33Aal (Número de AcessoAAL26871); Cry34Aal (Número de Acesso AAG50341); Cry34Aa2 (Número de AcessoAAK64560); Cry34Aa3 (Número de Acesso AAT29032); Cry34Aa4 (Número de Acesso AAT29030); Cry34Abl (Número de Acesso AAG41671); Cry34Acl (Número de Acesso AAG50118); Cry34Ac2 (Número de Acesso AAK64562); Cry34Ac3 (Número de Acesso AAT29029); Cry34Bal (Número de Acesso AAK64565); Cry34Ba2 (Número de Acesso AAT29033); Cry34Ba3 (Número de Acesso AAT29031); Cry35Aal (Número de Acesso AAG50342); Cry35Aa2 (Número de Acesso AAK64561); Cry35Aa3 (Número de Acesso AAT29028); Cry35Aa4 (Número de Acesso AAT29025); Cry35Abl (Número de Acesso AAG41672);

Cry35Ab2 (Número de Acesso AAK64563); Cry35Ab3 (Número de Acesso AY536891); Cry35Acl (Número de Acesso AAG50117); Cry35Bal (Número de Acesso AAK64566); Cry35Ba2 (Número de Acesso AAT29027); Cry35Ba3 (Número de Acesso AAT29026); Cry36Aal (Número de Acesso AAK64558); Cry37 Aal (Número de Acesso AAF76376); Cry38Aal (Número de Acesso AAK64559); Cry39Aal (Número de Acesso BAB72016); Cry40Aal (Número de Acesso BAB72018); Cry40Bal (Número de Acesso BAC77648); Cry40Cal (Número de Acesso EU381045); Cry40Dal (Número de Acesso ACF15199); Cry41Aal (Número de Acesso BAD35157); Cry41Abl (Número de Acesso BAD35163); Cry41Bal (Número de Acesso HM461871); Cry41Ba2 (Número de Acesso ZP _04099652); Cry42Aal (Número de Acesso BAD35166); Cry43Aal (Número de Acesso BAD15301); Cry43Aa2 (Número de Acesso BAD95474); Cry43Bal (Número de Acesso BAD15303); Cry43Cal (Número de Acesso KC156676); Cry43Cbl (Número de Acesso KC156695); Cry43Ccl (Número de Acesso KC156696); Cry43-like (Número de Acesso BAD15305); Cry44Aa (Número de Acesso BAD08532); Cry45Aa (Número de Acesso BAD22577); Cry46Aa (Número de Acesso BAC79010); Cry46Aa2 (Número de Acesso BAG68906); Cry46Ab (Número de Acesso BAD35170); Cry47 Aa (Número de Acesso AAY24695); Cry48Aa (Número de Acesso CAJ18351); Cry48Aa2 (Número de Acesso CAJ86545); Cry48Aa3 (Número de Acesso CAJ86546); Cry48Ab (Número de Acesso CAJ86548); Cry48Ab2 (Número de Acesso CAJ86549); Cry49Aa (Número de Acesso CAH56541); Cry49Aa2 (Número de Acesso CAJ86541); Cry49Aa3 (Número de Acesso CAJ86543); Cry49Aa4 (Número de Acesso CAJ86544); Cry49Abl (Número de Acesso CAJ86542); Cry50Aal (Número de Acesso BAE86999); Cry50Bal (Número de Acesso GU446675); Cry50Ba2 (Número de Acesso GU446676); Cry51Aal (Número de Acesso AB114444); Cry51Aa2 (Número de Acesso GU570697); Cry52Aal (Número de Acesso EF613489); Cry52Bal (Número de Acesso FJ361760); Cry53Aal (Número de Acesso EF633476); Cry53Abl (Número de Acesso FJ361759); Cry54Aal (Número de Acesso ACA52194); Cry54Aa2 (Número de Acesso GQ140349); Cry54Bal (Número de Acesso GU446677); Cry55Aal (Número de Acesso ABW88932); Cry54Abl (Número de Acesso JQ916908); Cry55Aa2 (Número de Acesso AAE33526); Cry56Aal (Número de

Acesso ACU57499); Cry56Aa2 (Número de Acesso GQ483512); Cry56Aa3 (Número de Acesso JX025567); Cry57Aal (Número de Acesso ANC87261); Cry58Aal (Número de Acesso ANC87260); Cry59Bal (Número de Acesso JN790647); Cry59Aal (Número de Acesso ACR43758); Cry60Aal (Número de Acesso ACU24782); Cry60Aa2 (Número de Acesso EA057254); Cry60Aa3 (Número de Acesso EEM99278); Cry60Bal (Número de Acesso GU810818); Cry60Ba2 (Número de Acesso EA057253); Cry60Ba3 (Número de Acesso EEM99279); Cry61Aal (Número de Acesso HM035087); Cry61Aa2 (Número de Acesso HM132125); Cry61Aa3 (Número de Acesso EEM19308); Cry62Aal (Número de Acesso HM054509); Cry63Aal (Número de Acesso BA144028); Cry64Aal (Número de Acesso BAJ05397); Cry65Aal (Número de Acesso HM461868); Cry65Aa2 (Número de Acesso ZP_04123838); Cry66Aal (Número de Acesso HM485581); Cry66Aa2 (Número de Acesso ZP _04099945); Cry67Aal (Número de Acesso #HM485582); Cry67Aa2 (Número de Acesso ZP_04148882); Cry68Aal (Número de Acesso HQ113114); Cry69Aal (Número de Acesso HQ401006); Cry69Aa2 (Número de Acesso JQ821388); Cry69Abl (Número de Acesso JN209957); Cry70Aal (Número de Acesso JN646781); Cry70Bal (Número de Acesso AD051070); Cry70Bbl (Número de Acesso EEL67276); Cry71Aal (Número de Acesso JX025568); Cry72Aal (Número de Acesso JX025569); Cyt1Aa (Número de Acesso no GenBank X03182); Cyt1Ab (Número de Acesso no GenBank X98793); Cyt1B (Número de Acesso no GenBank U37196); Cyt2A (Número de Acesso no GenBank Accession Number Z14147); e Cyt2B (Número de Acesso no GenBank U52043).

[324] Exemplos de δ-endotoxinas incluem também, porém sem limitação, proteínas Cry1A das Patentes US nº 5.880.275, nº 7.858.849 8.530.411, nº

8.575.433 e nº8.686.233; uma toxina DIG-3 ou DIG-11 (deleção N-terminal de α- hélice 1 e/ou variantes α-hélice 2 de proteínas cry, como Cry1A, Cry3A) das Patentes US nº8.304.604, nº8.304.605 e nº8.476.226; Cry1B do pedido de patente US nºde série 10/525,318; Cry1C de Pat. US nº6.033.874; Cry1F da Pat. US nº

5.188.960 e nº6.218.188; quimeras Cry1A/F da Pat. US nº7.070.982; nº6.962.705 e nº 6.713.063); uma proteína Cry2, como a proteína Cry2Ab da Pat. US nº

7.064.249); uma proteína Cry3A incluindo, porém sem limitação, uma proteína inseticida híbrida geneticamente modificada (eHIP) criada pela fusão de combinações exclusivas de regiões variáveis e blocos conservados de pelo menos duas proteínas Cry diferentes (Número de Publicação de Pedido de Patente US 2010/0017914); uma proteína Cry4; uma proteína Cry5; uma proteína Cry6; proteínas Cry8 das Patentes US nº 7.329.736, nº 7.449.552, nº 7.803.943, nº

7.476.781, nº7.105.332, nº7.378.499 e nº7.462.760; uma proteína Cry9, como membros das famílias Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E e Cry9F, incluindo, porém sem limitação, proteína Cry9D da Pat. US nº8.802.933 e a proteína Cry9B da Pat. US nº8.802.934; uma proteína Cry15 de Naimov, et al., (2008), "Applied and Environmental Microbiology", 74:7145-7151; uma Cry22, uma proteína Cry34Abl das Patentes US nº6.127.180, nº6.624.145 e nº6.340.593; uma proteína CryET33 e cryET34 das Patentes US nº6.248.535, nº6.326.351, nº6.399.330, nº

6.949.626, nº7.385.107 e nº7.504.229; um CryET33 e homólogos CryET34 do Número de Publicação de Patente dos EUA 2006/0191034, 2012/0278954, e Publicação PCT Número WO 2012/139004; uma proteína Cry35Abl da Pat. Nos.

6.083.499, 6.548.291 e 6.340.593; uma proteína Cry46, uma proteína Cry 51, uma toxina binária Cry; um TIC901 ou toxina relacionada; TIC807 de Publicação do Pedido de Patente US Número 2008/0295207; ET29, ET37, TIC809, TIC810, TIC812, TIC127, TIC128 de PCT US 2006/033867; toxinas TIC853 da Pat. US nº

8.513.494, AXMI-027, AXMI-036 e AXMI-038 da Pat. US nº8.236.757; AXMI-031, AXMI-039, AXMI-040, AXMI-049 da US Pat. No. 7.923.602; AXMI-018, AXMI-020 e AXMI-021 de WO 2006/083891; AXMI-010 de WO 2005/038032; AXMI-003 de documento nºWO 2005/021585; AXMI-008 de Publicação do Pedido de Patente US Número 2004/0250311; AXMI-006 de Publicação do Pedido de Patente US Número 2004/0216186; AXMI-007 de Publicação do Pedido de Patente US Número 2004/0210965; AXMI-009 de Publicação do Pedido de Patente US Número 2004/0210964; AXMI-014 de Publicação do Pedido de Patente US Número 2004/0197917; AXMI-004 de Publicação do Pedido de Patente US Número 2004/0197916; AXMI-028 e AXMI-029 de WO 2006/119457; AXMI-007, AXMI-008, AXMI-0080rf2, AXMI-009, AXMI-014 e AXMI-004 de WO 2004/074462; AXMI-150 de Pat. US nº 8.084.416; AXMI-205 de Publicação do Pedido de Patente US Número 2011/0023184; AXMI-011, AXMI-012, AXMI-013, AXMI-015, AXMI-019,

AXMI-044, AXMI-037, AXMI-043, AXMI-033, AXMI-034, AXMI-022, AXMI-023, AXMI- 041, AXMI-063 e AXMI-064 de Publicação do Pedido de Patente US Número 2011/0263488; AXMI-Rl e proteínas relacionadas da Publicação do Pedido de Patente US Número 2010/0197592; AXMI221Z, AXMI222z, AXMI223z, AXMI224z e AXMI225z de documento nºWO 2011/103248; AXMI218, AXMI219, AXMI220, AXMI226, AXMI227, AXMI228, AXMI229, AXMI230 e AXMI231 de documento nº WO 2011/103247 e Pat.

US nº8.759.619; AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005, AXMI- 163 e AXMI-184 da Pat.

US nº8.334.431; AXMI-001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI- 035 e AXMI-045 de Publicação do Pedido de Patente US Número 2010/0298211; AXMI-066 e AXMI-076 de Publicação do Pedido de Patente US Número 2009/0144852; AXMI128, AXMI130, AXMI131, AXMI133, AXMI140, AXMI141, AXMI142, AXMI143, AXMI144, AXMI146, AXMI148, AXMI149, AXMI152, AXMI153, AXMI154, AXMI155, AXMI156, AXMI157, AXMI158, AXMI162, AXMI165, AXMI166, AXMI167, AXMI168, AXMI169, AXMI170, AXMI171, AXMI172, AXMI173, AXMI174, AXMI175, AXMI176, AXMI177, AXMI178, AXMI179, AXMI180, AXMI181, AXMI182, AXMI185, AXMI186, AXMI187, AXMI188, AXMI189 de US.

No. 8.318.900; AXMI079, AXMI080, AXMI081, AXMI082, AXMI091, AXMI092, AXMI096, AXMI097, AXMI098, AXMI099, AXMI100, AXMI101, AXMI102, AXMI103, AXMI104, AXMI107, AXMI108, AXMI109, AXMI110, AXMI111, AXMI112, AXMI114, AXMI116, AXMI117, AXMI118, AXMI119, AXMI120, AXMI121, AXMI122, AXMI123, AXMI124, AXMI1257, AXMI1268, AXMI127, AXMI129, AXMI164, AXMI151, AXMI161, AXMI183, AXMI132, AXMI138, AXMI137 de Publicação do Pedido de Patente US Número 2010/0005543, AXMI270 de Publicação do Pedido de Patente US nº US20140223598, AXMI279 da Publicação do Pedido de Patente nº US20140223599, proteínas cry como Cry1A e Cry3A que têm sítios proteolíticos modificados da Pat.

US nº8.319.019; uma proteína de toxina Cry1Ac, Cry2Aa e Cry1Ca da cepa VBTS 2528 de Bacillus thuringiensis da Publicação de Pedido de Patente US Número 2011/0064710. Outras proteínas Cry são bem conhecidas pelo versado na técnica.

Consultar, N.

Crickmore, et al., Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins”, Microbiology and Molecular Biology Reviews,” (1998) Vol 62: 807-813; consultar também, N.

Crickmore, et al., “Bacillus thuringiensis toxin nomenclature” (2016), at

://www.btnomenclature.info/.

[325] O uso de proteínas Cry como traços de plantas transgênicas é bem conhecido por um versado na técnica e plantas transgênicas Cry incluindo, porém sem limitação, plantas que expressam CrylAc, Cry1Ac+Cry2Ab, CrylAb, CrylA.105, CrylF, Cry1Fa2, CrylF+CrylAc, Cry2Ab, Cry3A, mCry3A, Cry3Bbl, Cry34Abl, Cry35Abl, Vip3A, mCry3A, Cry9c e CBI-Bt receberam aprovação regulamentar. Consultar, Sanahuja et al., “Bacillus thuringiensis: a century of research, development and commercial applications”, (2011) Plant Biotech Journal, abril 9(3):283-300 e a CERA (2010) GM Crop Database Center for Environmental Risk Assessment (CERA), ILSI Research Foundation, Washington DC em cera- gmc.org/index.php?action=gm_crop_database, que pode ser acessado na web usando o prefixo "www"). Mais de uma proteína pesticida bem conhecida por um versado na técnica pode também ser expressa em plantas, como Vip3Ab & CrylFa (US2012/0317682); CrylBE & CrylF (US2012/0311746); CrylCA & CrylAB (US2012 / 0311745); CrylF & CryCa (US2012/0317681); CrylDA & CrylBE (US2012/0331590); CrylDA & CrylFa (US2012 / 0331589); CrylAB & CrylBE (US2012/0324606); CrylFa & Cry2Aa e Cryll & CrylE (US2012/0324605); Cry34Ab/35Ab e Cry6Aa (US20130167269); Cry34Ab / VCry35Ab & Cry3Aa (US20130167268); CrylAb & CrylF (US20140182018); e Cry3A e CrylAb ou Vip3Aa (US20130116170). As proteínas pesticidas incluem também lipases inseticidas, incluindo acil-hidrolases lipídicas da Pat. US nº7.491.869, e colesterol oxidases, como de Streptomyces (Purcell et al. (1993) Biochem Biophys Res Commun 15:1406-1413).

[326] As proteínas pesticidas incluem também toxinas VIP (proteínas inseticidas vegetativas). Bactérias entomopatogênicas produzem proteínas inseticidas que se acumulam em corpos de inclusão ou cristais parasporais (como as proteínas Cry e Cyt supracitadas), bem como proteínas inseticidas que são secretadas no meio de cultura. Entre as últimas estão as proteínas Vip, que se dividem em quatro famílias de acordo com sua identidade de aminoácidos. As proteínas Vip1 e Vip2 atuam como toxinas binárias e são tóxicas para alguns membros dos Coleópteros e Hemípteros. Acredita-se que o componente Vip1 se ligue a receptores na membrana do intestino médio do inseto, e o componente Vip2 entra na célula, em que exibe sua atividade ADP-ribosiltransferase contra a actina, impedindo a formação de microfilamentos. Vip3 não tem nenhuma similaridade de sequência com Vip1 ou Vip2 e é tóxico para uma grande variedade de membros dos Lepidópteros. Foi demonstrado que seu modo de ação se assemelha ao das proteínas Cry em termos de ativação proteolítica, ligação à membrana epitelial do intestino médio e formação de poros, embora as proteínas Vip3A não compartilhem sítios de ligação com as proteínas Cry. A última propriedade os torna bons candidatos para serem combinados com proteínas Cry em plantas transgênicas (culturas tratadas comBacillus thuringiensis[culturas de Bt]) para prevenir ou retardar a resistência a insetos e para ampliar o espectro inseticida. Existem variedades comercialmente cultivadas de algodão de Bt e milho de Bt que expressam a proteína Vip3Aa em combinação com proteínas Cry. Para a família Vip4 relatada mais recentemente, nenhum inseto alvo foi encontrado ainda. Consultar, Chakroun et al., "Bacterial Vegetative Insecticidal Proteins (Vip) from Entomopathogenic Bacteria", Microbiol Mol Biol Rev. 2016 Mar 2;80(2):329-50. VIPs podem ser encontrados nas Pat. US nº5.877.012, nº6.107.279, nº6.137.033, nº7.244.820, nº7.615.686 e nº8.237.020 e similares. Outras proteínas VIP são bem conhecidas por aqueles versados na técnica (consultar, lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html, que pode ser acessado na web usando o prefixo "www").

[327] As proteínas pesticidas incluem também proteínas do complexo de toxinas (TC), que podem ser obtidas de organismos como Xenorhabdus, Photorhabdus e Paenibacillus (consultar, Patentes US nº 7.491.698 e nº

8.084.418). Algumas proteínas TC têm atividade inseticida “autônoma” e outras proteínas TC aumentam a atividade das toxinas independentes produzidas pelo mesmo organismo. A toxicidade de uma proteína TC "independente" (de Photorhabdus, Xenorhabdus ou Paenibacillus, por exemplo) pode ser aumentada por um ou mais "potenciadores" de proteína TC derivados de um organismo de origem de um gênero diferente. Existem três tipos principais de proteínas TC. Conforme referido no presente documento, as proteínas de Classe A ("Proteína A") são toxinas independentes. As proteínas da classe B (“Proteína B”) e as proteínas da classe C (“Proteína C”) aumentam a toxicidade das proteínas da classe A.

Exemplos de proteínas de classe A são TcbA, TcdA, XptAl e XptA2. Exemplos de proteínas de classe B são TcaC, TcdB, XptBlXb e XptCl Wi. Exemplos de proteínas de classe C são TccC, XptClXb e XptBl Wi. As proteínas pesticidas também incluem proteínas de veneno de aranha, cobra e escorpião. Exemplos de peptídeos de veneno de aranha incluem, porém sem limitação, peptídeos de licotoxina-1 e mutantes dos mesmos (Patente US nº8.334.366).

[328] Alguns PIPs registrados atualmente estão listados na Tabela 11. Plantas transgênicas foram também projetadas para expressar dsRNA dirigido contra genes de insetos (Baum, JA et al. (2007) Control of coleopteran insect pests through RNA interference. Nature Biotechnology 25: 1322-1326; Mao, Y.B. et al. (2007) Silencing a cotton bollworm P450 monooxygenase gene by plant-mediated RNAi impairs larval tolerance of gossypol. Nature Biotechnology 25: 1307-1313). A interferência de RNA pode ser ativada na praga pela alimentação da praga na planta transgênica. A alimentação de pragas, portanto, causa lesão ou morte à praga. TABELA 11 LISTA DE PROTETORES EXEMPLIFICATIVOS INCORPORADOS EM PLANTAS, QUE PODEM SER COMBINADOS COM

MICRÓBIOS DA DIVULGAÇÃO Números de Protetores Incorporados em Empresa e Nomes Registro de Plantas (PIPs) Comerciais Pesticidas Batata Batata Naturemark Batata Cry3A Código PC 006432 524-474 New Leaf Monsanto Batata Cry3A & PLRV Monsanto 524-498 Códigos PC 006432, 006469 New Leaf Plus Milho Mycogen Seeds/Dow Evento de Milho Cry1Ab 176 Código 68467-1 Agro PC 006458 66736-1 Syngenta Seeds Agrisure CB (com Evento de Milho Cry1Ab Bt11 EPA Yieldgard) 67979-1 Código PC 006444 Identificador Atributo Milho Doce 65268-1 Exclusivo OECD SYN-BTØ11-1, Protegido por Insetos Syngenta Seeds

Números de Protetores Incorporados em Empresa e Nomes Registro de Plantas (PIPs) Comerciais Pesticidas Evento de milho Cry1Ab MON 801 Monsanto 524-492 Evento de milho Cry1Ab MON 810 Código PC 006430 Identificador Monsanto 524-489 Exclusivo OECD MON-ØØ81Ø-6 Dekalb Genetics c/o Milho Cry1Ac Código PC 006463 Monsanto 69575-2 BT-XTRA Mycogen Seeds/Dow Evento de milho Cry1F TC1507 Agro 68467-2 Código PC 006481 Identificador Pioneer Hi- 29964-3 Exclusivo OECD DAS-Ø15Ø7-1 Bred/Dupont Evento de milho moCry1F DAS- Ø6275-8 Código PC 006491 Mycogen Seeds/Dow 68467-4 Identificador Exclusivo OECD DAS- Agro Ø6275-8 Aventis Milho Cry9C 264-669 StarLink Evento de milho Cry3Bb1 MON863 Código PC 006484 Monsanto 524-528 Identificador Exclusivo OCDE MON- YielGard RW ØØ863-5 Evento de milho Cry3Bb1 MON Monsanto 88017 Código PC 006498 YieldGrad VT 524-551 Identificador Exclusivo OCDE MON- Rootworm 88Ø17-3 Evento de milho Cry34Ab1/Cry35Ab1 Mycogen Seeds/Dow DAS-591227-7 Agro 68467-5 Código PC 006490 Pioneer Hi- 29964-4 Identificador Exclusivo OCDE DAS- Bred/Dupont 59122-7 Herculex Rootworm Evento de milho Cry34Ab1/Cry35Ab1 Pioneer Hi- e Evento de milho Cry1F 4114 29964-17 Bred/Dupont Códigos PC 006555, 006556 Evento de milho mCry3A MIR 604 Syngenta Seeds Código PC 006509 Identificador 67979-5 Agrisure RW Exclusivo OECD SYN-IR604-8 Evento de milho Cry1A.105 e Monsanto 524-575

Números de Protetores Incorporados em Empresa e Nomes Registro de Plantas (PIPs) Comerciais Pesticidas Cry2Ab2 MON 89034 Códigos PC Genuity VT Double 006515 e 006514 Pro Evento de Milho Vip3Aa20 MIR 162 Syngenta Seeds Código PC 006599 Identificador 67979-14 Agrisure Viptera Exclusivo OECD SYN-IR162-4 Milho eCry3.1Ab no Evento 5307 Código PC 016483 Identificador Syngenta 67979-22 Exclusivo OECD SYN-Æ 53Æ 7-1 Eventos Empilhados e Mistura de Sementes de Milho MON863 x MON810 com Cry3Bb1 + Monsanto YieldGard 524-545 Cry1Ab Plus Mycogen Seeds/Dow DAS-59122-7 x TC1507 com Agro Pioneer Hi- 68467-6 Cry34Ab1/Cry35Ab1 + Cry1F Bred/Dupont 29964-5 Herculex Xtra Monsanto MON 88017 x MON 810 com Cry1AB YieldGard VT Triplo 524-552 + Cry3Bb YieldGard VT Plus Syngenta MIR 604 x Bt11 com mCry3A + Agrisure CB/RW 67979-8 Cry1Ab Agrisure 3000GT Monsanto Seg 89034 x Seg 88017 com Genuity VT Triple 524-576 Cry1A.105 + Cry2Ab2 + Cry3Bb1

PRO Bt11 x MIR 162 com Cry1Ab + Syngenta Seeds 67979-12 Vip3Aa 20 Agrisure 2100 Bt11 x MIR 162 x MIR 604 com Syngenta Seeds 67979-13 Cry1Ab + Vip3Aa20 + mCry3A Agrisure 3100 MON 89034 x TC1507 x MON 88017 Monsanto Company x DAS-59122-7 com Cry1A.105 + Mycogen Seeds/Dow 524-581 Cry2Ab2 + Cry1F + Cry3Bb1 + Agro 68467-7 Cry34Ab1/Cry35Ab1 Genuity SmartStax Mistura de sementes MON 89034 x Monsanto Company 524-595 TC1507 x MON 88017 x DAS-59122- Mycogen Seeds/Dow 68467-16 7 Agro

Números de Protetores Incorporados em Empresa e Nomes Registro de Plantas (PIPs) Comerciais Pesticidas Genuity SmartStax RIB completo SmartStax Refuge Advanced; Refuge Advanced Powered by SmartStax Pioneer Hi- Mistura de sementes de Herculex Bred/Dupont 29964-6 Xtra + Herculex I Proteção ideal contra insetos AcreMax1 Pioneer Hi- Mistura de sementes de Herculex RW Bred/Dupont 29964-10 + Milho não Bt Optimum AcreMax

RW Pioneer Hi- (Cry1F x Cry34/35 x Cry1Ab) - Bred/Dupont 29964-11 mistura de sementes Optimum AcreMax Xtra Pioneer Hi- (Cry1F x Cry1Ab) - mistura de Bred/Dupont 29964-12 sementes Optimum AcreMax Insect Protection Pioneer Hi- (Cry1F x mCry3A) Bred/Dupont 29964-13 Trisect ideal Pioneer Hi- (Cry1F x Cry34/35 x Cry1Ab x Bred/Dupont 29964-14 mCry3A) Optimum Intrasect Xtreme 59122 x MON 810 x MIR 604 Pioneer Hi- 29964-15 (Cry34/35 x Cry1Ab x mCry3A) Bred/Dupont Pioneer Hi- Optimum AcreMax Xtreme (Cry1F x Bred/Dupont Cry34/35 x Cry1Ab x mCry3A) - Optimum AcreMax 29964-16 mistura de sementes Xtreme (mistura de sementes) MON 810 x MIR 604 (Cry1Ab x Pioneer Hi- 29964-18 mCry3A) Bred/Dupont

Números de Protetores Incorporados em Empresa e Nomes Registro de Plantas (PIPs) Comerciais Pesticidas Pioneer Hi- 1507 x MON810 x MIR 162 (Cry1F x Bred/Dupont 29964-19 Cry1Ab x Vip 3Aa20) Optimum Intrasect Leptra Pioneer Hi- 1507 x MIR 162 (Cry1F x Vip30Aa20) 29964-20 Bred/Dupont 4114 x MON 810 x MIR 604 Pioneer Hi- (Cry34/35 x Cry1F x Cry1Ab x 29964-21 Bred/Dupont mCry3A) - mistura de sementes 4114 x MON 810 x MIR 604 Pioneer Hi- (Cry34/35 x Cry1F x Cry1Ab x 29964-22 Bred/Dupont mCry3A) Pioneer Hi- 1507 x MON810 x MIR 604 (Cry1F x Bred/Dupont Cry1Ab x mCry3A) - mistura de 29964-23 Optimum AcreMax sementes Trisect Pioneer Hi- 1507 x MON810 x MIR 604 (Cry1F x Bred/Dupont 29964-24 Cry1Ab x mCry3A) Optimum Intrasect Trisect 4114 x MON 810 (Cry34/35 x Cry1F x Pioneer Hi- 29964-25 Cry1Ab) Bred/Dupont Pioneer Hi- 1507 x MON810 x MIR 162 (Cry1F x Bred/Dupont Cry1Ab x Vip 3Aa20) - mistura de 29964-26 Optimum AcreMax sementes Leptra 524-583, 524-584, Intermediários SmartStax (8 524-586, 524 -587, Monsanto produtos) 524-588, 524-589, 524 -590 MON 89034 x 1507 (Cry1A.105 x Monsanto 524-585 Cry2Ab2 x Cry1F) Genuity PowerCore Monsanto MON 89034 (Cry1A.105 x Cry2Ab2) - Genuity VT Double 524-597 mistura de sementes PRO RIB completo MON 89034 x 88017 RIB completo Monsanto 524-606 (Cry1A.105 x Cry2Ab2 x Cry3Bb1) - Genuity VT Triple

Números de Protetores Incorporados em Empresa e Nomes Registro de Plantas (PIPs) Comerciais Pesticidas mistura de sementes PRO RIB completo MON 89034 x 1507 (Cry1A.105 x Monsanto Cry2Ab2 x Cry1F) - mistura de Genuity PowerCore 524-612 sementes RIB completo Syngenta Seeds Bt11 x MIR162 x 1507 (Cry1Ab x Agrisure Viptera 3220 67979-15 Vip3Aa20 x Cry1F) Refuge Renew Bt11 x 59122-7 x MIR 604 x 1507 Syngenta Seeds (Cry1Ab x Cry34/35 x mCry3A x 67979-17 Agrisure 3122 Cry1F) Syngenta Seeds Bt11 x MIR162 x TC1507 (Cry1Ab x Agisure Viptera 3220 Vip3Aa20 x Cry1F) - mistura de 67979-19 (Refúgio EZ) (Refúgio sementes avançado) Bt11 x DAS 59122-7 x MIR604 x Syngenta Seeds TC1507 (Cry1Ab x Cry34/35 x Agisure Viptera 3122 67979-20 mCry3A x Cry1F) - mistura de (E-Z Refuge) (Refuge sementes Advanced) Bt11 x MIR 162 x MIR 604 x TC1507 Syngenta Seeds x 5307 (Cry1Ab x Vip3Aa20 x Agrisure Duracade 67979-23 mCry3A x Cry1F x eCry3.1Ab) (Refuge Renew) 5222 Bt11 x MIR 604 x TC1507 x 5307 Syngenta Seeds (Cry1Ab x mCry3A x Cry1F x Agrisure Duracade 67979-24 eCry3.1Ab) (Refuge Renew) 5122 Bt11 x MIR 604 x TC1507 x 5307 Syngenta Seeds (Cry1Ab x mCry3A x Cry1F x Agisure Duracade 67979-25 eCry3.1Ab) - mistura de sementes 5122 EZ Refuge Bt11 x MIR 162 x MIR 604 x TC1507 Syngenta Seeds x 5307 (Cry1Ab x Vip3Aa20 x Agisure Duracade 67979-26 mCry3A x Cry1F x eCry3.1Ab) - 5222 E-Z Refuge mistura de sementes Bt11 x MIR 162 x MIR 604 x TC1507 Syngenta Seeds x 5307 (Cry1Ab x Vip3Aa20 x Agrisure Duracade 67979-27 mCry3A x Cry1F x eCry3.1Ab) (Refuge Renew) 5022 MIR604 x DAS-59122-7 x TC1507 Syngenta Seeds 67979-29 (mCry3A x Cry34/35 x Cry1F)

Números de Protetores Incorporados em Empresa e Nomes Registro de Plantas (PIPs) Comerciais Pesticidas 68467-8, 68467-9, 68467-10, 68467- Mycogen Seeds/Dow SmartStax Intermediates (8 produtos) 11, 68467-13, Agro 68467-14, 68467- 15 Mycogen Seeds/Dow MON 89034 x 1507 (Cry1A.105 x Agro 68467-12 Cry2Ab2 x Cry1F) PowerCore; PowerCore Enlist Mycogen Seeds/Dow Agro MON 89034 x 1507 (Cry1A.105 x PowerCore Refuge Cry2Ab2 x Cry1F) - mistura de 68467-21 Advanced; Refuge sementes Advanced Powered by PowerCore Pioneer Hi- 1507 x MON 810 Bred/Dupont 29964-7 Optimum Intrasect Pioneer Hi- 59122 x 1507 x MON 810 29964-8 Bred/Dupont Pioneer Hi- 59122 x MON 810 29964-9 Bred/Dupont Algodão Monsanto Algodão Cry1Ac 524-478 BollGard Cry1Ac e Cry2Ab2 no Evento 15985 Monsanto 524-522 Algodão Códigos PC 006445, 006487 BollGard II Evento de algodão Bt MON531 com Cry1Ac (apenas para uso em viveiros Monsanto 524-555 de reprodução) Evento de algodão Bt MON15947 com Cry2Ab2 (apenas para uso em Monsanto 524-556 viveiros de reprodução) COT102 x MON 15985 (Vip3Aa19 x Monsanto 524-613 Cry1Ac x Cry2Ab2) Bollgard III Algodão Cry1F e Cry1Ac (Eventos Mycogen Seeds/Dow 68467-3

Números de Protetores Incorporados em Empresa e Nomes Registro de Plantas (PIPs) Comerciais Pesticidas DAS-21023-5 x DAS-24236-5) Agro Códigos PC de Algodão 006512, Widestrike 006513 Mycogen Seeds/Dow Evento 3006-210-23 (Cry1Ac) 68467-17 Agro Mycogen Seeds/Dow Evento 281-24-236 (Cry1F) 68467-18 Agro Mycogen Seeds/Dow WideStrike x COT102 (Cry1F x Agro 68467-19 Cry1Ac x Vip3Aa19) WideStrike 3 Algodão Vip3Aa19 e FLCry1Ab (Eventos Cot102xCot67B) Códigos Syngenta Seeds PC 016484, 016486 Identificador (Formalmente 67979-9 exclusivo OECD SYN-IR102-7 X VipCot) SYN-IR67B-1 COT102 (Vip3Aa19) Syngenta Seeds 67979-18 COT67B (FLCry1Ab) Syngenta Seeds 67979-21 T304-40 (Cry1Ab) Bayer CropScience 264-1094 GHB119 (Cry2Ae) Bayer CropScience 264-1095 T304-40 x GHB119 (Cry1Ab x Cry2Ae) Bayer CropScience 264-1096 Identificador Exclusivo OCDE: BCS- TwinLink GHØØ4-7 x BCS-GHØØ5-8 Soja Cry1Ac no Evento 87701 Código PC Monsanto de Soja 006532 Identificador 524-594 Inacta Exclusivo OECD Cry1A.105 e Cry2Ab2 no Evento 87751 Códigos PC de Soja 006614, Monsanto 524-619 006615 Identificador Exclusivo OECD MON-87751-7 Cry1Ac x Cry1F no Evento DAS 81419 Códigos PC de Soja 006527, Mycogen Seeds/Dow 68467-20 006528 Identificador Exclusivo OECD Agro DAS 81419 (Cry1Ac x Cry1F)

[329] Em algumas modalidades, qualquer um ou mais dos pesticidas apresentados no presente documento podem ser utilizados com qualquer um ou mais dos micróbios da divulgação e podem ser aplicados a plantas ou partes das mesmas, incluindo sementes.

HERBICIDAS

[330] Conforme supracitado, as composições agrícolas da divulgação, que podem compreender qualquer micróbio ensinado no presente documento, às vezes são combinadas com um ou mais herbicidas.

[331] Composições compreendendo bactérias ou populações bacterianas produzidas de acordo com os métodos descritos no presente documento e/ou tendo as características descritas no presente documento podem incluir ainda um ou mais herbicidas. Em algumas modalidades, as composições herbicidas são aplicadas às plantas e/ou partes da planta. Em algumas modalidades, as composições herbicidas podem estar incluídas nas composições apresentadas no presente documento, e podem ser aplicadas a uma planta (ou plantas) ou uma parte (ou partes) da mesma simultaneamente ou em sucessão, com outros compostos.

[332] Herbicidas incluem 2,4-D, 2,4-DB, acetoclor, acifluorfen, alaclor, ametrin, atrazina, aminopiralida, benefin, bensulfuron, bensulida, bentazon, biciclopirona, bromacil, bromoxinil, butilato, carfentrazona, clorimuron, clorsulfuron, cletodim, clomazona, clopiralida, cloransulam, cicloato, DCPA, desmedifam, dicamba, diclobenil, diclofop, diclosulam, diflufenzopir, dimetenamida, diquat, diuron, DSMA, endothall, EPTC, etalfluralin, etofumesato, fenoxaprop, fluazifop-P, flucarbzona, flufenacet, flumetsulam, flumiclorac, flumioxazin, fluometuron, fluroxipir, fomesafen, foramsulfuron, glufosinato, glifosato, halosulfuron, hexazinona, imazametabenz, imazamox, imazapic, imazaquin, imazetapir, isoxaflutol, lactofen, linuron, MCPA, MCPB, mesotriona, metolaclor-s, metribuzin, indaziflam, metsulfuron, molinato, MSMA, napropamida, naptalam, nicosulfuron, norflurazon, orizalin, oxadiazon, oxifluorfen, paraquat, ácido pelargônico, pendimetalina, fenmedifam, picloram, primisulfuron, prodiamina, prometrina, pronamida, propanil, prosulfuron, pirazon, piritioac, quinclorac, quizalofop, rimsulfuron, S-metolaclor, setoxidim, siduron, simazina, sulfentrazona, sulfometuron, sulfosulfuron, tebutiuron, tembotriona, terbacil, tiazopir, tifensulfuron,

tiobencarb, topramezona, tralcoxidim, trialato, triasulfuron, tribenuron, triclopir, trifluralina e triflusulfuron.

[333] Em algumas modalidades, qualquer um ou mais dos herbicidas apresentados no presente documento podem ser utilizados com qualquer uma ou mais das plantas ou partes das mesmas apresentadas no presente documento.

[334] Os produtos herbicidas podem incluir CORVUS, BALANCE FLEXX, CAPRENO, DIFLEXX, LIBERTY, LAUDIS, AUTUMN SUPER e DIFLEXX DUO.

[335] Em algumas modalidades, qualquer um ou mais dos herbicidas apresentados na Tabela 12 abaixo podem ser utilizados com qualquer um ou mais dos micróbios ensinados no presente documento e podem ser aplicados a qualquer uma ou mais plantas ou partes das mesmas apresentadas no presente documento. TABELA 12. LISTA DE HERBICIDAS EXEMPLIFICATIVOS, QUE PODEM

SER COMBINADOS COM MICRÓBIOS DA DIVULGAÇÃO Número do Local de grupo de Família Química Herbicida Ação herbicidas Sethoxydim (Poast, Inibidores Poast Plus) 1 Cicloexanodionas ACCase Clethodim (Select, Select Max, Arrow) Fluazifop (Fusilade DX, componente em Fusion) Fenoxaprop (Puma, Ariloxifenoxipropionatos componente em Fusion) Quizalofop (Assure II, Targa) Fenilpirazolinas Pinoxaden (Axial XL) Inibidores de Imazetapir (Pursuit) 2 Imidazolinonas ALS Imazamox (Raptor) Clorimuron (Classic) Halosulfuron (Permit, Sandea) Iodosulfuron Sulfonilureias (componente em Autumn Super) Mesosulfuron (Osprey)

Número do Local de grupo de Família Química Herbicida Ação herbicidas Nicosulfuron (Accent Q) Primisulfuron (Beacon) Prosulfuron (Peak) Rimsulfuron (Matriz,resolução) Thifensulfuron (Harmony) Tribenuron (Express) Triflusulfuron (UpBeet) Flumetsulam(Fiton) Cloransulam- metílico(FirstRate) Piroxsulam(PowerFle Triazolopirimidina x HL) Florasulam (componente em Quelex) Propoxicarbazona (Olympus) Sulfonilaminocarboniltriazoli Tiencarbazona nonas metílica (componente em Capreno) Trifluralina (muitos Inibidores de nomes) microtúbulos Etalfluralina 3 Dinitroanilina (inibidores de (Sonalan) raiz) Pendimetalina (Prowl/Prowl H2O) Benzamida Pronamida(freio) Halauxifen (Elevore, Auxinas 4 Arilpicolinato componente em sintéticas Quelex) 2,4-D (Enlist One, outro) Ácidos fenoxiacéticos 2,4-DB (Butyrac 200, Butoxone 200)

MCPA Ácido Benzoico Dicamba (Banvel,

Número do Local de grupo de Família Química Herbicida Ação herbicidas Clareza, DiFlexx, Engenia, XtendiMax; componente em Status) Clopiralide (Stinger) Piridina Fluroxypyr (Starane Ultra) Atrazina Inibidores do 5 Triazinas Simazina (Princep, fotossistema II Sim-Trol) Metribuzin Triazinona (Metribuzin, outros) Hexazinona (Velpar) Desmedipham (Betenex) Fenilcarbamatos Phenmedipham (componente em Betamix) Uracilas Terbacil (Sinbar) Bentazon (Basagran, 6 Benzotiadiazóis outros) Bromoxinil (Buctril, nitrila Moxy, outros) 7 Fenilureias Linuron (Lorox, Linex) Inibidor da síntese de 8 Tiocarbamatos EPTC (Eptam) lipídios Inibidor 9 Organofósforo como âncora Glifosato

EPSPS Inibidor de Glufosinato (Liberty, glutamina 10 Organofósforo como âncora Rely) sintetase Inibidor da biossíntese de Clomazone diterpeno 13 Isoxazolidinona (Comando) (branqueame nto) Inibidores de 14 Difeniléter Acifluorfen (Ultra

Número do Local de grupo de Família Química Herbicida Ação herbicidas protoporfirino Blazer) gênio oxidase Fomesafen (Flexstar, (PPO) Reflex) Lactofen (Cobra, Phoenix) Flumiclorac (Recurso) N-fenilftalimida Flumioxazin (Valor, Valor EZ, Rowel) Sulfentrazona (Autoridade, Espartano) Triazolinona Carfentrazona (Aim) Flutiaceto-metil (Cadete) Piraflufen-etílco Pirazóis (Vida) Saflufenacila Pirimidinadiona (Sharpen) Acetocloro (Harness, Surpass NXT, Breakfree NXT, Warrant) Dimetenamida-P Inibidores de (Outlook) ácidos graxos Metolacloro 15 Acetamidas de cadeia (Paralelo) longa Piroxassulfona (Zidua, Zidua SC) s-metolacloro (Dual Magnum, Dual II Magnum, Cinch) Flufenacet (definir) Site específico 16 Benzofuranos Etofumesato(Nortron) desconhecido Inibidor de diflufenzopir transporte de 19 Semicarbazona (componente em auxina Status) Inibidores de 22 Bipiridiliums Paraquat

Número do Local de grupo de Família Química Herbicida Ação herbicidas fotossistema I (Gramoxona, Parazona) Diquat (Reglona) Isoxaflutol (Balance Flexx) Pirasulfotol (componente em Isoxazol Huskie) 4-inibidores Pirazol Topramezona de HPPD 27 Pirazolona (Armezon/Impact) (alvejamento) Tricetonas Biciclopirona (componente em Acuron) Mesotriona (Calisto) Tembotriona (Laudis)

FUNGICIDAS

[336] Conforme supracitado, as composições agrícolas da divulgação, que podem compreender qualquer micróbio ensinado no presente documento, às vezes são combinadas com um ou mais fungicidas.

[337] Composições compreendendo bactérias ou populações bacterianas produzidas de acordo com os métodos descritos no presente documento e/ou tendo as características descritas no presente documento podem incluir ainda um ou mais fungicidas. Em algumas modalidades, as composições fungicidas podem estar incluídas nas composições apresentadas no presente documento, e podem ser aplicadas a uma planta (ou plantas) ou uma parte (ou partes) da mesma simultaneamente ou em sucessão, com outros compostos. Os fungicidas incluem azoxistrobina, captano, carboxina, etaboxam, fludioxonil, mefenoxam, fludioxonil, tiabendazol, tiabendaz, ipconazol, mancozeb, ciazofamida, zoxamida, metalaxil, PCNB, metaconazol, piraclostrobina, cepa QST 713 de Bacillus subtilis , sedaxano, tiametoxam, fludioxonil, tirame, tolclofós metílico, trifloxistrobina, cepa MBI 600 de Bacillus subtilis , piraclostrobina, fluoxastrobina, cepa QST 2808 de Bacillus pumilus , clorotalonil, cobre, flutriafol, fluxapiroxade, mancozeb, glaxonil, pentiopirade, triazol, propiconaozolm protioconazol, tebuconazol, fluoxastrobina, piraclostrobina,

picoxistrobina, qols, tetraconazol, trifloxistrobina, ciproconazol, flutriafol, SDHI, EBDCs, sedaxano, MAXIM QUATTRO (gludioxonil, mefenoxam, azoxistrobina e tiabendaz), RAXIL (tebuconazol, protioconazol, metalaxil e alquil aminas de sebo etoxiladas) e benzovindiflupir.

[338] Em algumas modalidades, qualquer um ou mais dos fungicidas apresentados no presente documento podem ser utilizados com qualquer uma ou mais das plantas ou partes das mesmas apresentadas no presente documento.

NEMATICIDAS

[339] Conforme supracitado, as composições agrícolas da divulgação, que podem compreender qualquer micróbio ensinado no presente documento, às vezes são combinadas com um ou mais nematicidas.

[340] Composições compreendendo bactérias ou populações bacterianas produzidas de acordo com os métodos descritos no presente documento e/ou tendo as características descritas no presente documento podem incluir ainda um ou mais nematicidas. Em algumas modalidades, as composições nematicidas podem estar incluídas nas composições apresentadas no presente documento, e podem ser aplicadas a uma planta (ou plantas) ou uma parte (ou partes) da mesma simultaneamente ou em sucessão, com outros compostos. Os nematicidas podem ser selecionados a partir de DD, 1,3-dicloropropeno, dibrometo de etileno, 1,2- dibromo-3-cloropropano, brometo de metila, cloropicrina, metame de sódio, dazomete, metilisotiocianato, tetratiocarbonato de sódio, aldicarbe, aldoxicarbe, carbofurano, oxamil, etoprop, fenamifós, cadusafos, fostiazato, terbufós, fensulfotion, forato, DiTera, clandosan, sincocina, iodeto de metila, brometo de propargila, 2,5-di-hidroximetil-3,4-di-hidroxipirrolidina (DMDP), qualquer uma ou mais das avermectinas, azida de sódio, furfural, Bacillus firmus, abamectrina, tiametoxame, fludioxonil, clotiandina, ácido salicílico e éster S-metílico do ácido benzo-(1,2,3)-tiadiazol-7-carbotioico.

[341] Em algumas modalidades, qualquer um ou mais dos nematicidas apresentados no presente documento podem ser utilizados com qualquer uma ou mais das plantas ou partes das mesmas apresentadas no presente documento.

[342] Em algumas modalidades, qualquer um ou mais dos nematicidas, fungicidas, herbicidas, inseticidas e/ou pesticidas apresentados no presente documento podem ser utilizados com qualquer uma ou mais das plantas ou partes das mesmas apresentadas no presente documento. FERTILIZANTES, ESTABILIZANTES DE NITROGÊNIO E INIBIDORES DE

UREASE

[343] Conforme supracitado, as composições agrícolas da divulgação, que podem compreender qualquer micróbio ensinado no presente documento, às vezes são combinadas com um ou mais de um: fertilizante, estabilizante de nitrogênio ou inibidor de urease.

[344] Em algumas modalidades, os fertilizantes são usados em combinação com os métodos e bactérias da presente divulgação. Os fertilizantes incluem composições de amônia anidra, ureia, nitrato de amônio e ureia-nitrato de amônio (UAN), entre muitos outros. Em algumas modalidades, fertilização pop-up e/ou fertilização starter éusada em combinação com os métodos e bactérias da presente divulgação.

[345] Em algumas modalidades, os estabilizantes de nitrogênio são usados em combinação com os métodos e bactérias da presente divulgação. Os estabilizantes de nitrogênio incluem nitrapirina, 2-cloro-6-(triclorometil)piridina, N- SERVE 24, INSTINCT, dicianodiamida (DCD).

[346] Em algumas modalidades, os inibidores de urease são usados em combinação com os métodos e bactérias da presente divulgação. Os inibidores da urease incluem N-(n-butil)-triamida tiofosfórica (NBPT), AGROTAIN, AGROTAIN PLUS e AGROTAIN PLUS SC. Além disso, a divulgação contempla a utilização de AGROTAIN ADVANCED 1.0, AGROTAIN DRI-MAXX e AGROTAIN ULTRA.

[347] Além disso, podem ser utilizadas formas estabilizadas de fertilizante. Por exemplo, uma forma estabilizada de fertilizante é SUPER U, contendo nitrogênio a 46% em um grânulo estabilizado à base de ureia, SUPERU contém inibidores de urease e nitrificação para proteger contra desnitrificação, lixiviação e volatilização. Fertilizantes foliares estabilizados e alvejados, como NITAMIN, podem também ser usados no presente documento.

[348] Os fertilizantes pop-up são comumente usados em plantações de milho. A fertilização pop-up consiste na aplicação de alguns quilos de nutrientes com a semente no momento do plantio. A fertilização pop-up é usada para aumentar o vigor da muda.

[349] O fertilizante de liberação lenta ou controlada que pode ser usado no presente documento envolve: Um fertilizante contendo um nutriente de planta em uma forma que retarda sua disponibilidade para absorção e uso pela planta após a aplicação, ou que estende sua disponibilidade para a planta significativamente mais do que uma referência ‘fertilizante de nutriente rapidamente disponível', como nitrato de amônio ou ureia, fosfato de amônio ou cloreto de potássio. Esse atraso de disponibilidade inicial ou tempo estendido de disponibilidade contínua pode ocorrer por uma variedade de mecanismos. Esses incluem solubilidade em água controlada do material por revestimentos semipermeáveis, oclusão, materiais proteicos ou outras formas químicas, por hidrólise lenta de compostos de baixo peso molecular solúveis em água ou por outros meios desconhecidos.

[350] O fertilizante de nitrogênio estabilizado que pode ser usado no presente documento envolve: Um fertilizante ao qual um estabilizante de nitrogênio foi adicionado. Um estabilizante de nitrogênio é uma substância adicionada a um fertilizante que estende o tempo em que o componente de nitrogênio do fertilizante permanece no solo sob a forma de N-ureia ou N-amoniacal.

[351] O inibidor de nitrificação que pode ser usado no presente documento envolve: Uma substância que inibe a oxidação biológica de N-amoniacal em N- nitrato. Alguns exemplos incluem: (1) 2-cloro-6-(triclorometil-piridina), nome comum Nitrapirina, fabricado por Dow Chemical; (2) 4-amino-1,2,4-6-triazol-HCl, nome comum ATC, fabricado por Ishihada Industries; (3) 2,4-diamino-6-tricloro- metiltriazina, nome comum CI-1580, fabricado por American Cyanamid; (4) Dicianodiamida, nome comum DCD, fabricado por Showa Denko; (5) Tioureia, nome comum TU, fabricado por Nitto Ryuso; (6) 1-mercapto-1,2,4-triazol, nome comum MT, fabricado por Nippon; (7) 2-amino-4-cloro-6-metil-piramidina, nome comum AM, fabricado por Mitsui Toatsu; (8) fosfato de 3,4-dimetilpirazol (DMPP), da BASF; (9) 1-amida-2-tioureia (ASU), da Nitto Chemical Ind .; (10) Tiossulfato de amônio (ATS); (11) 1H-1,2,4-triazol (HPLC); (12) óxido de 5-etileno-3-tricloro- metil1,2,4-tiodiazol (Terrazol), de Olin Mathieson; (13) 3-metilpirazol (3-MP); (14) 1- carbamoil-3-metil-pirazol (CMP); (15) Nim; e (16) DMPP.

[352] O inibidor de urease que pode ser usado no presente documento envolve: Uma substância que inibe a ação hidrolítica da ureia pela enzima urease. Milhares de produtos químicos foram avaliados como inibidores da urease do solo (Kiss e Simihaian, 2002). No entanto, apenas alguns dos muitos compostos testados atendem aos requisitos necessários de serem não tóxicos, eficazes em baixa concentração, estáveis e compatíveis com a ureia (sólidos e soluções), degradáveis no solo e econômicos. Os mesmos podem ser classificados de acordo com suas estruturas e sua interação assumida com a enzima urease (Watson, 2000, 2005). Quatro classes principais de inibidores de urease foram propostas: (a) reagentes que interagem com os grupos sulfidrila (reagentes sulfidrila), (b) hidroxamatos, (c) produtos químicos para proteção de culturas agrícolas e (d) análogos estruturais de ureia e compostos relacionados. N-(n-butil) triamida tiofosfórica (NBPT), fenilfosforodiamidato (PPD/ PPDA) e hidroquinona são provavelmente os inibidores de urease mais profundamente estudados (Kiss e Simihaian, 2002). Pesquisas e testes práticos foram também realizados com triamida do ácido N-(2-nitrofenil) fosfórico (2-NPT) e tiossulfato de amônio (ATS). Os compostos organo-fósforo são análogos estruturais da ureia e são alguns dos inibidores mais eficazes da atividade da urease, bloqueando o sítio ativo da enzima (Watson, 2005). TRATAMENTOS DE SEMENTES INSETICIDAS (ISTS) PARA MILHO

[353] Os tratamentos de sementes de milho normalmente alvejam três espectros de pragas: nematódeos, doenças fúngicas de mudas e insetos.

[354] Os tratamentos de sementes com inseticidas são geralmente o principal componente de um pacote de tratamento de sementes. A maioria das sementes de milho disponíveis hoje vem com um pacote básico que inclui um fungicida e um inseticida. Em alguns aspectos, as opções de inseticidas para tratamentos de sementes incluem PONCHO (clotianidina), Cruiser/Cruiser EXTREME (tiametoxame) e GAUCHO (Imidacloprida). Todos os três produtos são produtos químicos neonicotinoides. CRUISER e PONCHO na taxa de 250 (,25 mg de AI/semente) são algumas das opções de base mais comuns disponíveis para o milho. Em alguns aspectos, as opções de inseticida para tratamentos incluem CRUISER 250 tiametoxame, CRUISER 250 (tiametoxame) mais LUMIVIA (clorantraniliprol), CRUISER 500 (tiametoxame) e PONCHO VOTIVO 1250

(Clotianidina & Bacillus firmus I-1582).

[355] O pacote de tratamento de sementes com inseticida básico da Pioneer consiste em CRUISER 250 com PONCHO/VOTIVO 1250 também disponível. VOTIVO é um agente biológico que protege contra os nematódeos.

[356] Os produtos da Monsanto, incluindo milho, soja e algodão, estão sob o tratamento da ACCELERON. A semente de milho Dekalb vem padrão com PONCHO 250. Os produtores têm também a opção de atualizar PONCHO/VOTIVO, com PONCHO aplicado à taxa de 500.

[357] Agrisure, Golden Harvest e Garst têm um pacote básico com um fungicida e CRUISER 250. Milho completo deAVICTA também está disponível; isso inclui CRUISER 500, fungicida e proteção contra nematódeo. CRUISER EXTREME é outra opção disponível como pacote de tratamento de sementes; as quantidades de CRUISER são iguais às do tratamento de sementes com CRUISER convencional, ou seja, 250, 500 ou 1250.

[358] Outra opção é comprar o tratamento inseticida mínimo disponível e ter um revendedor para tratar a semente a jusante.

[359] ISTs comercialmente disponíveis para milho estão listados na Tabela 13 abaixo e podem ser combinados com um ou mais dos micróbios ensinados no presente documento. TABELA 13 LISTA DE TRATAMENTOS DE SEMENTES EXEMPLIFICATIVOS, INCLUINDO ISTS, QUE PODEM SER COMBINADOS

COM MICRÓBIOS DA DIVULGAÇÃO Tipo de Ingrediente (ou Nome Comercial do Cultura Tratamento ingredientes) Ativo Produto DYNASTY Milho, Soja F azoxistrobina PROTÉGÉ FL Milho F Bacillus pumilus YIELD SHIELD Milho, Soja HISTICK N/T Soja F Bacillus subtilis VAULT HP Milho, Soja CAPTANO 400 Milho, Soja F Captano CAPTANO 400-C Milho, Soja F Fludioxonil MAXIM 4FS Milho, Soja Peróxido de OXIDATE Soja

F hidrogênio STOROX Soja

Tipo de Ingrediente (ou Nome Comercial do Cultura Tratamento ingredientes) Ativo Produto ACCELERON DC-509 Milho F ipconazol RANCONA 3.8 FS Milho, Soja VORTEX Milho BONIDE MANCOZEB C/ ConcentradoDE ZINCO DITHANE 75DF

RAINSHIELD DITHANE DF RAINSHIELD Milho DITHANE F45 RAINSHIELD Milho DITHANE M45 Milho F mancozeb MANCOZEB FLUXÍVEL Milho LESCO 4 Milho PENNCOZEB 4FL Milho FLUXÍVEL Milho PENNCOZEB 75DF FLUXÍVEL SECO Milho PENNCOZEB 80WP Milho F mefenoxam AVENTAL XL Milho, Soja ACCELERON DC-309 Milho ACCELERON DX-309 Milho, Soja ADQUIRIR Milho, Soja

AGRI STAR METALAXYL 265 ST Milho, Soja ALLEGIANCE DRY Milho, Soja F) metalaxil ALLEGIANCE FL Milho, Soja BELMONT 2.7 FS Milho, Soja METALAXIL DYNA-SHIELD Milho, Soja SEBRING 2.65 ST Milho, Soja SEBRING 318 FS Milho, Soja SEBRING 480 FS Milho, Soja VIREO MEC Soja ACCELERON DX-109 Soja F piraclostrobina ESTAMINA Milho Streptomyces F MYCOSTOP Milho, Soja griseoviridis Streptomyces F ACTINOGROW ST Milho, Soja lydicus AMTIDE TEBU 3.6F Milho SATIVA 309 FS Milho F Tebuconazol SATIVA 318 FS Milho TEBUSHA 3.6FL Milho TEBUZOL 3.6F Milho

Tipo de Ingrediente (ou Nome Comercial do Cultura Tratamento ingredientes) Ativo Produto F tiabendazol MERTECT 340-F Soja 42-S THIRAM Milho, Soja F Tiram FLOWSAN Milho, Soja SIGNET 480 FS Milho, Soja Trichoderma F T-22 HC Milho, Soja harzianum Rifai ACCELERON DX-709 Milho F trifloxistrobina TRILEX FLUXÍVEL Milho, soja LORSBAN 50W em pacotes I clorpirifós Milho solúveis em água ACCELERON IC-609 Milho I clotianidina NIPSIT INSIDE Milho, Soja PONCHO 600 Milho ACCELERON IX-409 Milho AGRI STAR MACHO 600 ST Milho, Soja AGRISOLUTIONS NITRO Milho, Soja

SHIELD ATTENDANT 600 Milho, Soja AXCESS Milho, Soja COURAZE 2F Soja I imidacloprida IMIDACLOPRIDA 5 DYNA- SHIELD Milho, Soja GAUCHO 480 FLUXÍVEL Milho, Soja GAUCHO 600 FLUXÍVEL Milho, Soja GAUCHO SB FLUXÍVEL Milho, Soja NUPRID 4.6F PRO Soja SENATOR 600 FS Milho, Soja I tiametoxame CRUISER 5FS Milho, Soja N abamectina AVICTA 500 FS Milho, Soja N Bacillus firmus VOTIVO FS Soja SOLO X-CYTO Soja P citocinina X-CYTE Soja ACCELERON HX-209 Milho, Soja proteína harpina alfa P N-HIBIT GOLD CST Milho, Soja beta N-HIBIT HX-209 Milho, Soja P ácido indol butírico KICKSTAND PGR Milho, Soja tiametoxame, MILHO AVICTA DUO I, N Milho abamectina AVICTA DUO 250 I, F clotianidina, Bacillus PONCHO VOTIVO Milho, Soja

Tipo de Ingrediente (ou Nome Comercial do Cultura Tratamento ingredientes) Ativo Produto firmus F, F carboxina, captana ACENTUADOR Soja permetrina, KERNEL GUARD I, F Milho, Soja carboxina SUPREME F, F carboxina, tirame VITAFLO 280 Milho, Soja MAXIM XL Milho, Soja WARDEN RTA Soja mefenoxam, AVENTAL MAXX RFC F, F fludioxonil AVENTAL MAXX RTA +

MOLY

AVENTAL MAXX RTA imidacloprida, AGRISOLUTIONS I, F Milho metalaxil CONCUR

RANCONA SUMMIT F, F metalaxil, ipconazol Soja

RANCONA XXTRA PROTECTOR-L- F, F tirame, metalaxil Soja

ALLEGIANCE trifloxistrobina, TRILEX AL F, F Soja metalaxil TRILEX 2000 citocinina, ácido

ESTIMULAR O AUMENTO P, P, P giberélico, ácido Milho, Soja

DE RENDIMENTO indol butírico mefenoxam, F, F, I fludioxonil, CRUISERMAXX PLUS Soja tiametoxame captana, carboxina, BEAN GUARD / F, F, F Soja metalaxil ALLEGIANCE captano, carboxina, F, F, I ACENTUAR AW Soja imidacloprida carboxina, metalaxil, F, F, I LATITUDE Milho, Soja imidacloprida metalaxil, F, F, F piraclostrobina, ESTAMINA F3 HL Milho triticonazol azoxistrobina, fludioxonil, F, F, F, I CRUISER EXTREME Milho mefenoxam, tiametoxame

Tipo de Ingrediente (ou Nome Comercial do Cultura Tratamento ingredientes) Ativo Produto azoxistrobina, fludioxonil, F, F, F, F, F MAXIM QUATTRO Milho mefenoxam, tiabendazol I Clorantraniliprol LUMIVIA Milho F = Fungicida; I = Inseticida; N = Nematicida; P = Regulador de Crescimento Vegetal

APLICAÇÃO DE POPULAÇÕES BACTERIANAS EM CULTURAS

[360] A composição das bactérias ou população bacteriana descrita no presente documento pode ser aplicada em sulco, em talco ou como tratamento de sementes. A composição pode ser aplicada a uma embalagem de sementes a granel, mini granel, em um saco ou em talco.

[361] A plantadeira pode plantar a semente tratada e cultivar a cultura de acordo com os métodos convencionais, linhas pareadas ou métodos que não exigem aragem. As sementes podem ser distribuídas usando uma tremonha de controle ou uma tremonha individual. As sementes também podem ser distribuídas usando ar pressurizado ou manualmente. A colocação de sementes pode ser realizada usando tecnologias de taxa variável. Além disso, a aplicação das bactérias ou população bacteriana descrita no presente documento pode ser aplicada usando tecnologias de taxa variável. Em alguns exemplos, as bactérias podem ser aplicadas a sementes de milho, soja, canola, sorgo, batata, arroz, vegetais, cereais, pseudocereais e sementes oleaginosas. Exemplos de cereais podem incluir cevada, fonio, aveia, gramínea palmer, centeio, painço, sorgo, espelta, tefe, triticale e trigo. Exemplos de pseudocereais podem incluir noz-de-pão, trigo sarraceno, taboa, chia, linho, amaranto de grãos, hanza, quinoa e gergelim. Em alguns exemplos, as sementes podem ser organismos geneticamente modificados (OGM), não-OGM, orgânicos ou convencionais.

[362] Aditivos como microfertilizante, PGR, herbicida, inseticida e fungicida podem ser usados adicionalmente para tratar as culturas. Exemplos de aditivos incluem protetores de cultura, como inseticidas, nematicidas, fungicidas, agentes de intensificação, como corantes, polímeros, peletização, priming e desinfetantes e outros agentes, como inoculante, PGR, amaciante e micronutrientes. Os PGRs podem ser hormônios vegetais naturais ou sintéticos que afetam o crescimento da raiz, a floração ou o alongamento do talo. PGRs podem incluir auxinas, giberelinas, citocininas, etileno e ácido abscísico (ABA).

[363] A composição pode ser aplicada em sulco em combinação com fertilizante líquido. Em alguns exemplos, o fertilizante líquido pode ser mantido em tanques. Os fertilizantes NPK contêm macronutrientes de sódio, fósforo e potássio.

[364] A composição pode melhorar os traços de plantas, como promover o crescimento da planta, manter o teor de clorofila alto nas folhas, aumentar o número de frutas ou sementes e aumentar o peso da unidade de fruta ou semente. Os métodos da presente divulgação podem ser empregados para introduzir ou melhorar um ou mais de uma variedade de traços desejáveis. Exemplos de traços que podem ser introduzidos ou melhorados incluem: biomassa da raiz, comprimento da raiz, altura, comprimento do broto, número de folhas, eficiência do uso de água, biomassa geral, rendimento, tamanho do fruto, tamanho do grão, taxa de fotossíntese, tolerância à seca, tolerância ao calor, tolerância ao sal, tolerância a estresse por baixo teor de nitrogênio, eficiência de uso de nitrogênio, resistência ao estresse de nematódeos, resistência a um patógeno fúngico, resistência a um patógeno bacteriano, resistência a um patógeno viral, nível de um metabólito, modulação no nível de um metabólito, expressão de proteoma. Os traços desejáveis, incluindo altura, biomassa geral, raiz e/ou biomassa da parte aérea, germinação de sementes, sobrevivência de mudas, eficiência fotossintética, taxa de transpiração, número ou massa de semente/fruto, grãos da planta ou rendimento de frutos, teor de clorofila da folha, taxa fotossintética, comprimento da raiz ou qualquer combinação dos mesmos, podem ser usados para medir o crescimento e comparados com a taxa de crescimento de plantas agrícolas de referência (por exemplo, plantas sem os traços introduzidos e/ou melhorados) cultivadas sob condições idênticas. Em alguns exemplos, os traços desejáveis, incluindo altura, biomassa geral, raiz e/ou biomassa da parte aérea, germinação de sementes, sobrevivência de mudas, eficiência fotossintética, taxa de transpiração, número ou massa de semente/fruto, grãos da planta ou rendimento de frutos, teor de clorofila da folha, taxa fotossintética, comprimento da raiz ou qualquer combinação dos mesmos, podem ser usados para medir o crescimento e comparados com a taxa de crescimento de plantas agrícolas de referência (por exemplo, plantas sem os traços introduzidos e/ou melhorados) cultivadas sob condições similares.

[365] Um traço agronômico de uma planta hospedeira pode incluir, porém sem limitação, os seguintes: teor de óleo alterado, teor de proteína alterado, composição de carboidrato de semente alterada, composição de óleo de semente alterada e composição de proteína de semente alterada, tolerância química, tolerância ao frio, senescência retardada, resistência a doenças, tolerância à seca, peso de espiga, melhora do crescimento, melhora da saúde, tolerância ao calor, tolerância a herbicidas, resistência a herbívoros, fixação de nitrogênio aprimorada, utilização de nitrogênio aprimorada, arquitetura de raiz aprimorada, eficiência de uso de água aprimorada, biomassa aumentada, comprimento de raiz aumentado, peso da semente aumentado, comprimento de broto aumentado, rendimento aumentado, rendimento aumentado sob condições de limitação de água, massa do caroço, teor de umidade do caroço, tolerância ao metal, número de espigas, número de caroços por espiga, número de vagens, melhora da nutrição, resistência a patógenos, resistência a pragas, melhora da capacidade fotossintética, tolerância à salinidade, manutenção da coloração, melhora do vigor, peso seco aumentado de sementes maduras, peso fresco aumentado de sementes maduras, número aumentado de sementes maduras por planta, teor de clorofila aumentado, número aumentado de vagens por planta, comprimento aumentado de vagens por planta, número reduzido de folhas murchas por planta, número reduzido de folhas severamente murchas por planta e número aumentado de folhas não murchas por planta, uma modulação detectável no nível de um metabólito, uma modulação detectável no nível de um transcrito e uma modulação detectável no proteoma, em comparação com uma planta isolinha cultivada de uma semente sem a dita formulação de tratamento de semente.

[366] Em alguns casos, as plantas são inoculadas com bactérias ou populações bacterianas isoladas da mesma espécie de planta que o elemento vegetal da planta inoculada. Por exemplo, uma bactéria ou população bacteriana que é normalmente encontrada em uma variedade de Zea mays (milho) está associada a um elemento vegetal de uma planta de outra variedade de Zea mays que em seu estado natural carece das ditas bactérias e populações bacterianas.

Em uma modalidade, as bactérias e as populações bacterianas são derivadas de uma planta de uma espécie de planta relacionada como o elemento vegetal da planta inoculada. Por exemplo, uma bactéria e populações bacterianas que são normalmente encontradas em Zea diploperennis Iltis et al., (Teosinto diploperenial) são aplicadas a um Zea mays (milho), ou vice-versa. Em alguns casos, as plantas são inoculadas com bactérias e populações bacterianas que são heterólogas ao elemento vegetal da planta inoculada. Em uma modalidade, as bactérias e as populações bacterianas são derivadas de uma planta de outra espécie. Por exemplo, uma bactéria e populações bacterianas normalmente encontradas em dicotiledôneas são aplicadas a uma planta monocotiledônea (por exemplo, inoculando milho com uma bactéria e populações bacterianas derivadas da soja) ou vice-versa. Em outros casos, as bactérias e as populações de bactérias a serem inoculadas em uma planta são derivadas de uma espécie relacionada da planta que está sendo inoculada. Em uma modalidade, as bactérias e as populações bacterianas são derivadas de um táxon relacionado, por exemplo, de uma espécie relacionada. A planta de outra espécie pode ser uma planta agrícola. Em outra modalidade, as bactérias e as populações bacterianas fazem parte de uma composição projetada inoculada em qualquer elemento da planta hospedeira.

[367] Em alguns exemplos, as bactérias ou população bacteriana são exógenas, em que as bactérias e a população bacteriana são isoladas de uma planta diferente da planta inoculada. Por exemplo, em uma modalidade, as bactérias ou população bacteriana podem ser isoladas de uma planta diferente da mesma espécie que a planta inoculada. Em alguns casos, as bactérias ou população bacteriana podem ser isoladas de uma espécie relacionada à planta inoculada.

[368] Em alguns exemplos, as bactérias e as populações bacterianas descritas no presente documento são capazes de se mover de um tipo de tecido para outro. Por exemplo, a detecção e o isolamento da presente divulgação de bactérias e populações bacterianas dentro dos tecidos maduros das plantas após o revestimento no exterior de uma semente demonstra sua capacidade de se mover do exterior da semente para os tecidos vegetativos de uma planta em maturação. Portanto, em uma modalidade, a população de bactérias e populações bacterianas são capazes de se mover do exterior da semente para os tecidos vegetativos de uma planta. Em uma modalidade, as bactérias e as populações bacterianas que são revestidas sobre a semente de uma planta são capazes, após a germinação da semente em um estado vegetativo, de se localizar em um tecido diferente da planta. Por exemplo, bactérias e populações bacterianas podem ser capazes de se localizar em qualquer um dos tecidos da planta, incluindo: a raiz, raiz adventícia, raiz 5 seminal, pelo de raiz, talo, folha, flor, botão, pendão, meristema, pólen, pistilo, ovários, estame, fruta, estolho, rizoma, nódulo, tubérculo, tricoma, células de guarda, hidátodo, pétala, sépala, gluma, ráquis, câmbio vascular, floema e xilema. Em uma modalidade, as bactérias e as populações bacterianas são capazes de se localizar na raiz e/ou no pelo da raiz da planta. Em outra modalidade, as bactérias e as populações bacterianas são capazes de se localizar nos tecidos fotossintéticos, por exemplo, folhas e brotos da planta. Em outros casos, as bactérias e as populações bacterianas estão localizadas nos tecidos vasculares da planta, por exemplo, no xilema e no floema. Em ainda outra modalidade, as bactérias e as populações bacterianas são capazes de se localizar nos tecidos reprodutivos (flor, pólen, pistilo, ovários, estame, fruto) da planta. Em outra modalidade, as bactérias e as populações bacterianas são capazes de se localizar na raiz, brotos, folhas e tecidos reprodutivos da planta. Em ainda outra modalidade, as bactérias e as populações bacterianas colonizam um fruto ou tecido de semente da planta. Em ainda outra modalidade, as bactérias e as populações bacterianas são capazes de colonizar a planta de modo que ela esteja presente na superfície da planta (ou seja, sua presença está detectavelmente presente no exterior da planta ou na episfera da planta). Em ainda outras modalidades, as bactérias e as populações bacterianas são capazes de se localizar em substancialmente todos, ou todos, os tecidos da planta. Em certas modalidades, as bactérias e as populações bacterianas não estão localizadas na raiz de uma planta. Em outros casos, as bactérias e as populações bacterianas não estão localizadas nos tecidos fotossintéticos da planta.

[369] A eficácia das composições pode também ser avaliada medindo-se a maturidade relativa da cultura ou a unidade de aquecimento da cultura (CHU). Por exemplo, a população bacteriana pode ser aplicada ao milho e o crescimento do milho pode ser avaliado de acordo com a maturidade relativa do grão de milho ou o momento em que o grão de milho está no peso máximo. A unidade de aquecimento de cultura (CHU) pode também ser usada para prever a maturação da cultura de milho. A CHU determina a quantidade de acúmulo de calor medindo- se as temperaturas máximas diárias no crescimento da cultura.

[370] Nos exemplos, as bactérias podem ser localizar em qualquer um dos tecidos da planta, incluindo: a raiz, raiz adventícia, raiz seminal, pelo de raiz, talo, folha, flor, botão, pendão, meristema, pólen, pistilo, ovários, estame, fruta, estolho, rizoma, nódulo, tubérculo, tricoma, células de guarda, hidátodo, pétala, sépala, gluma, ráquis, câmbio vascular, floema e xilema. Em outra modalidade, as bactérias ou a população bacteriana são capazes de se localizar nos tecidos fotossintéticos, por exemplo, folhas e brotos da planta. Em outros casos, as bactérias e as populações bacterianas estão localizadas nos tecidos vasculares da planta, por exemplo, no xilema e no floema. Em outra modalidade, as bactérias ou a população bacteriana são capazes de se localizar em tecidos reprodutivos (flor, pólen, pistilo, ovários, estame ou fruto) da planta. Em outra modalidade, as bactérias e as populações bacterianas são capazes de se localizar na raiz, brotos, folhas e tecidos reprodutivos da planta. Em outra modalidade, as bactérias ou a população bacteriana colonizam um fruto ou tecido de semente da planta. Em ainda outra modalidade, as bactérias ou a população bacteriana são capazes de colonizar a planta de modo que a mesma esteja presente na superfície da planta. Em outra modalidade, as bactérias ou a população bacteriana são capazes de se localizar em substancialmente todos, ou todos, os tecidos da planta. Em certas modalidades, as bactérias ou a população bacteriana não estão localizadas na raiz de uma planta. Em outros casos, as bactérias e as populações bacterianas não estão localizadas nos tecidos fotossintéticos da planta.

[371] A eficácia das composições bacterianas aplicadas às culturas pode ser avaliada medindo-se várias características do crescimento da cultura, incluindo, porém sem limitação, taxa de plantio, vigor da semeadura, resistência da raiz, tolerância à seca, altura da planta, taxa de secagem e peso de teste.

ESPÉCIES DE PLANTAS

[372] Os métodos e bactérias descritos no presente documento são adequados para qualquer uma de uma variedade de plantas, como plantas dos gêneros Hordeum, Oryza, Zea e Triticeae. Outros exemplos não limitantes de plantas adequadas incluem musgos, líquenes e algas. Em alguns casos, as plantas têm valor econômico, social e/ou ambiental, como culturas de alimentos, culturas de fibras, culturas oleaginosas, plantas na silvicultura ou indústrias de papel e celulose, matéria-prima para a produção de biocombustíveis e/ou plantas ornamentais. Em alguns exemplos, as plantas podem ser usadas para produzir produtos economicamente valiosos, como um grão, uma farinha, um amido, um xarope, uma refeição, um óleo, um filme, uma embalagem, um produto nutracêutico, uma polpa, uma ração animal, uma forragem para peixes, um material a granel para produtos químicos industriais, um produto de cereal, um produto alimentício humano processado, um açúcar, um álcool, e/ou uma proteína. Exemplos não limitantes de plantas de cultura incluem milho, arroz, trigo, cevada, sorgo, painço, aveia, triticale de centeio, trigo sarraceno, milho doce, cana-de- açúcar, cebola, tomate, morango e aspargo. Em algumas modalidades, os métodos e bactérias descritos no presente documento são adequados para qualquer uma de uma variedade de plantas transgênicas, plantas não transgênicas e plantas híbridas das mesmas.

[373] Em alguns exemplos, as plantas que podem ser obtidas ou melhoradas usando os métodos e composição divulgados no presente documento podem incluir plantas que são importantes ou interessantes para agricultura, horticultura, biomassa para a produção de moléculas de biocombustível e outros produtos químicos e/ou silvicultura. Alguns exemplos dessas plantas podem incluir abacaxi, banana, coco, lírio, favas e gramíneas; e plantas dicotiledôneas, como, por exemplo, ervilhas, alfafa, tomate verde, melão, grão de bico, chicória, trevo, couve, lentilha, soja, tabaco, batata, batata doce, rabanete, repolho, colza, macieira, uva, algodão, girassol, agrião, canola, frutas cítricas (incluindo laranja, tangerina, quincã, limão, lima, toranja, tangerina, tangelo, cidra e pomelo), pimenta, feijão, alface, Panicum virgatum (switch), Sorghum bicolor (sorgo, sudão), Miscanthus giganteus (miscanthus), Saccharum sp. (cana-energia), Populus balsamifera (choupo), Zea mays (milho), Glycine max (soja), Brassica napus (canola), Triticum aestivum (trigo), Gossypium hirsutum (algodão), Oryza sativa (arroz), Helianthus annuus

(girassol), Medicago sativa (alfafa), Beta vulgaris (beterraba sacarina), Pennisetum glaucum (painço-pérola), Panicum spp. Sorghum spp., Miscanthus spp., Saccharum spp., Erianthus spp., Populus spp., Secale cereale (centeio), Salix spp. (salgueiro), Eucalyptus spp. (eucalipto), Triticosecale spp. (triticum- 25 trigo X centeio), Bamboo, Carthamus tinctorius (cártamo), Jatropha curcas (Jatropha), Ricinus communis (rícino), Elaeis guineensis (óleo de palma), Phoenix dactylifera (tamareira), Archontophoenix cunninghamiana (palma-rei), Syagrus romanzoffiana (jerivá), Linum usitatissimum (linho), Brassica juncea, Manihot esculenta (mandioca), Lycopersicon esculentum (tomate), Lactuca saliva (alface), Musa paradisiaca (banana), Solanum tuberosum (batata), Brassica oleracea (brócolis, couve-flor, couve-de-bruxelas), Camellia sinensis (chá), Fragaria ananassa (morango), Theobroma cacao (cacau), Coffea arabica (café), Vitis vinifera (uva), Ananas comosus (abacaxi), Capsicum annum (pimenta picante & doce), Allium cepa (cebola), Cucumis melo (melão), Cucumis sativus (pepino), Cucurbita maxima (abóbora), Cucurbita moschata (abóbora), Spinacea oleracea (espinafre), Citrullus lanatus (melancia), Abelmoschus esculentus (quiabo), Solanum melongena (beringela), Papaver somniferum (papoila dormideira), Papaver orientale, Taxus baccata, Taxus brevifolia, Artemisia annua, Cannabis saliva, Camptotheca acuminate, Catharanthus roseus, Vinca rosea, Cinchona officinalis, Coichicum autumnale, Veratrum californica, Digitalis lanata, Digitalis purpurea, Dioscorea 5 spp., Andrographis paniculata, Atropa belladonna, Datura stomonium, Berberis spp., Cephalotaxus spp., Ephedra sinica, Ephedra spp., Erythroxylum coca, Galanthus wornorii, Scopolia spp., Lycopodium serratum (Huperzia serrata), Lycopodium spp., Rauwolfia serpentina, Rauwolfia spp., Sanguinaria canadensis, Hyoscyamus spp., Calendula officinalis, Chrysanthemum parthenium, Coleus forskohlii, Tanacetum parthenium, Parthenium argentatum (guaiúle), Hevea spp. (borracha), Mentha spicata (hortelã), Mentha piperita (hortelã), Bixa orellana, Alstroemeria spp., Rosa spp. (rosa), Dianthus caryophyllus (carnation), Petunia spp. (petúnia), Poinsettia pulcherrima (poinsétia), Nicotiana tabacum (tabaco), Lupinus albus (tremoço), Uniola paniculata (aveia), Hordeum vulgare (cevada) e Lolium spp. (centeio).

[374] Em alguns exemplos, uma planta monocotiledônea pode ser usada.

Plantas monocotiledôneas pertencem às ordens das Alismatales, Arales, Arecales, Bromeliales, Commelinales, Cyclanthales, Cyperales, Eriocaulales, Hydrocharitales, Juncales, Lilliales, Najadales, Orchidales, Pandanales, Poales, Restionales, Triuridales, Typhales e Zingiberales. Plantas que pertencem à classe das Gymnospermae são Cycadales, Ginkgoales, Gnetales e Pinales. Em alguns exemplos, a planta monocotiledônea pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em milho maís, arroz, trigo, cevada e cana-de-açúcar.

[375] Em alguns exemplos, uma planta dicotiledônea pode ser usada, inclusive aquelas que pertencem às ordens das Aristochiales, Asterales, Batales, Campanulales, Capparales, Caryophyllales, Casuarinales, Celastrales, Cornales, Diapensales, Dilleniales, Dipsacales, Ebenales, Ericales, Eucomiales, Euphorbiales, Fabales, Fagales, Gentianales, Geraniales, Haloragales, Hamamelidales, Middles, Juglandales, Lamiales, Laurales, Lecythidales, Leitneriales, Magniolales, Malvales, Myricales, Myrtales, Nymphaeales, Papeverales, Piperales, Plantaginales, Plumb aginales, Podostemales, Polemoniales, Polygalales, Polygonales, Primulales, Proteales, Rafflesiales, Ranunculales, Rhamnales, Rosales, Rubiales, Salicales, Santales, Sapindales, Sarraceniaceae, Scrophulariales, Theales, Trochodendrales, Umbellales, Urticales e Violates. Em alguns exemplos, a planta dicotiledônea pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em algodão, soja, pimenta e tomate.

[376] Em alguns casos, a planta a ser melhorada não é prontamente passível às condições experimentais. Por exemplo, uma planta de cultivo pode levar muito tempo para crescer o suficiente para avaliar de forma prática um traço melhorado em série ao longo de múltiplas iterações. Consequentemente, uma primeira planta da qual as bactérias são inicialmente isoladas, e/ou a pluralidade de plantas às quais bactérias geneticamente manipuladas são aplicadas pode ser uma planta modelo, como uma planta mais passível de avaliação sob as condições desejadas. Exemplos não limitantes de plantas modelo incluem Setaria, Brachypodium e Arabidopsis. A capacidade de bactérias isoladas de acordo com um método da divulgação que usa uma planta modelo pode, então, ser aplicada a uma planta de outro tipo (por exemplo, uma planta de cultivo) para confirmar a atribuição do traço melhorado.

[377] Os traços que podem ser melhorados pelos métodos divulgados no presente documento incluem qualquer característica observável da planta, incluindo, por exemplo, taxa de crescimento, altura, peso, cor, sabor, cheiro, mudanças na produção de um ou mais compostos pela planta (incluindo, por exemplo, metabólitos, proteínas, fármacos, carboidratos, óleos e quaisquer outros compostos). A seleção de plantas com base nas informações genotípicas também é considerada (por exemplo, incluindo o padrão de expressão do gene da planta em resposta às bactérias, ou a identificação da presença de marcadores genéticos, como aqueles associados à fixação aumentada de nitrogênio). As plantas podem também ser selecionadas com base na ausência, supressão ou inibição de uma certa característica ou traço (como uma característica ou traço indesejável) em oposição à presença de uma certa característica ou traço (como uma característica ou traço desejável).

MILHO NÃO GENETICAMENTE MODIFICADO

[378] Os métodos e bactérias descritos no presente documento são adequados para qualquer uma de uma variedade de plantas de milho não geneticamente modificadas ou parte das mesmas. E em alguns aspectos, o milho é orgânico. Além disso, os métodos e bactérias descritos no presente documento são adequados para qualquer um dos seguintes híbridos, variedades, linhagens não geneticamente modificadas, etc. Em algumas modalidades, as variedades de milho geralmente se enquadram em seis categorias: milho doce, milho do tipo flint, pipoca, milho dentado, milho selvagem e farinha de milho. Milho Doce

[379] As variedades do tipo su Amarelo incluem Earlivee, Early Sunglow, Sundance, Early Golden Bantam, Iochief, Merit, Jubilee e Golden Cross Bantam. As variedades do tipo su Branco incluem True Platinum, Country Gentleman, Silver Queen e Stowell's Evergreen. As variedades do tipo Bicolor su incluem Sugar & Gold, Quickie, Double Standard, Butter & Sugar, Sugar Dots, Honey & Creme. As variedades do tipo Multicolor su incluem Hookers, Triple Play, Painted Hill, Black Mexican/Aztec.

[380] As variedades do tipo se Amarelo incluem Buttergold, Precocious, Spring Treat, Sugar Buns, Colorow, Kandy King, Bodacious R/M, Tuxedo,

Incredible, Merlin, Miracle e Kandy Korn EH. White se varieties include Spring Snow, Sugar Pearl, Whiteout, Cloud Nine, Alpine, Silver King e Argent. As variedades do tipo Bicolor se incluem Sugar Baby, Fleet, Bon Jour, Trinity, Bi- Licious, Temptation, Luscious, Ambrosia, Accord, Brocade, Lancelot, Precious Gem, Peaches e Cream Mid EH e Delectable R/M. As variedades Multicolor se incluem Ruby Queen.

[381] As variedades do tipo sh2 Amarelo incluem Extra Early Super Sweet, Takeoff, Early Xtra Sweet, Raveline, Summer Sweet Yellow, Krispy King, Garrison, Illini Gold, Challenger, Passion, Excel, Jubilee SuperSweet, Illini Xtra Sweet e Crisp 'N Sweet. As variedades do tipo sh2 Branco incluem Summer Sweet White, Tahoe, Aspen, Treasure, How Sweet It Is e Camelot. As variedades do tipo Bicolor sh2 incluem Summer Sweet Bicolor, Radiance, Honey 'N Pearl, Aloha, Dazzle, Hudson e Phenomenal.

[382] As variedades do tipo sy Amarelo incluem Applause, Inferno, Honeytreat e Honey Select. As variedades do tipo sy Branco incluem Silver Duchess, Cinderella, Mattapoisett, Avalon e Captivate. As variedades do tipo Bicolor sy incluem Pay Dirt, Revelation, Renaissance, Charisma, Synergy, Montauk, Kristine, Serendipity/Providence e Cameo.

[383] As variedades do tipo superdoce aumentado incluem Xtra-Tender 1ddA, Xtra-Tender 11dd, Mirai 131Y, Mirai 130Y, Vision e Mirai 002. As variedades do tipo superdoce aumentado Branco incluem Xtra-Tender 3dda, Xtra-Tender 31dd, Mirai 421W, XTH 3673 e Devotion. As variedades do tipo superdoce aumentado Bicolor incluem Xtra-Tender 2dda, Xtra-Tender 21dd, Kickoff XR, Mirai 308BC, Anthem XR, Mirai 336BC, Fantastic XR, Triumph, Mirai 301BC, Stellar, American Dream, Mirai 350BC e Obsession.

MILHO FLINT

[384] As variedades de milho flint incluem Bronze-Orange, Candy Red Flint, Floriani Red Flint, Glass Gem, Indian Ornamental (Rainbow), Mandan Red Flour, Painted Mountain, Petmecky, Cherokee White Flour,

PIPOCA

[385] As variedades de pipoca incluem Monarch Butterfly, Yellow Butterfly, Midnight Blue, Ruby Red, Mixed Baby Rice, Queen Mauve, Mushroom Flake,

Japanese Hull-less, Strawberry, Blue Shaman, Miniature Colored, Miniature Pink, Pennsylvania Dutch Butter Flavor e Red Strawberry.

MILHO DENTADO

[386] As variedades de milho dentado incluem Bloody Butcher, Blue Clarage, Ohio Blue Clarage, Cherokee White Eagle, Hickory Cane, Hickory King, Jellicorse Twin, Kentucky Rainbow, Daymon Morgan's Knt. Butcher, Leaming, Leaming's Yellow, McCormack's Blue Giant, Neal Paymaster, Pungo Creek Butcher, Reid's Yellow Dent, Rotten Clarage e Tennessee Red Cob.

[387] Em algumas modalidades, as variedades de milho incluem P1618W, P1306W, P1345, P1151, P1197, P0574, P0589 e P0157. W = milho branco.

[388] Em algumas modalidades, os métodos e bactérias descritos no presente documento são adequados para qualquer híbrido das variedades de milho maís apresentadas no presente documento.

MILHO MAÍS GENETICAMENTE MODIFICADO

[389] Os métodos e bactérias descritos no presente documento são adequados para qualquer uma de um híbrido, variedade, linhagem, etc. de plantas de milho maís geneticamente modificadas ou parte das mesmas.

[390] Além disso, os métodos e bactérias descritos no presente documento são adequados para qualquer um dos seguintes eventos de milho maís geneticamente modificados, que foram aprovados em um ou mais países: 32138 (32138 SPT Maintainer), 3272 (ENOGEN), 3272 x Bt11, 3272 x bt11 x GA21, 3272 x Bt11 x MIR604, 3272 x Bt11 x MIR604 x GA21, 3272 x Bt11 x MIR604 x TC1507 x 5307 x GA21, 3272 x GA21, 3272 x MIR604, 3272 x MIR604 x GA21, 4114, 5307 (AGRISURE Duracade), 5307 x GA21, 5307 x MIR604 x Bt11 x TC1507 x GA21 (AGRISURE Duracade 5122), 5307 x MIR604 x Bt11 x TC1507 x GA21 x MIR162 (AGRISURE Duracade 5222), 59122 (HERCULEX RW), 59122 x DAS40278, 59122 x GA21, 59122 x MIR604, 59122 x MIR604 x GA21, 59122 x MIR604 x TC1507, 59122 x MIR604 x TC1507 x GA21, 59122 x MON810, 59122 x MON810 x MIR604, 59122 x MON810 x NK603, 59122 x MON810 x NK603 x MIR604, 59122 x MON88017, 59122 x MON88017 x DAS40278, 59122 x NK603 (Herculex RW ROUNDUP READY 2), 59122 x NK603 x MIR604, 59122 x TC1507 x GA21, 676, 678, 680, 3751 IR, 98140, 98140 x 59122, 98140 x TC1507, 98140 x TC1507 x

59122, Bt10 (Bt10), Bt11 [X4334CBR, X4734CBR] (AGRISURE CB/LL), Bt11 x 5307, Bt11 x 5307 x GA21, Bt11 x 59122 x MIR604, Br11 x 59122 x MIR604 x GA21, Bt11 x 59122 x MIR604 x TC1507, M53, M56, DAS-59122-7, Bt11 x 59122 x MIR604 x TC1507 x GA21, Bt11 x 59122 x TC1507, TC1507 x DAS-59122-7, Bt11 x 59122 x TC1507 x GA21, Bt11 x GA21 (AGRISURE GT/CB/LL), Bt11 x MIR162 (AGRISURE Viptera 2100), BT11 x MIR162 x 5307, Bt11 x MIR162 x 5307 x GA21, Bt11 x MIR162 x GA21 (AGRISURE Viptera 3110), Bt11 x MIR162 x MIR604 (AGRISURE Viptera 3100), Bt11 x MIR162 x MIR604 x 5307, Bt11 x MIR162 x MIR604 x 5307 x GA21, Bt11 x MIR162 x MIR604 x GA21 (AGRISURE Viptera 3111 / AGRISURE Viptera 4), Bt11, MIR162 x MIR604 x MON89034 x 5307 x GA21, Bt11 x MIR162 x MIR604 x TC1507, Bt11 x MIR162 x MIR604 x TC1507 x 5307, Bt11 x MIR162 x MIR604 x TC1507 x GA21, Bt11 x MIR162 x MON89034, Bt11 x MIR162 x MON89034 x GA21, Bt11 x MIR162 x TC1507, Bt11 x MIR162 x TC1507 x 5307, Bt11 x MIR162 x TC1507 x 5307 x GA21, Bt11 x MR162 x TC1507 x GA21 (AGRISURE Viptera 3220), BT11 x MIR604 (Agrisure BC/LL/RW), Bt11 x MIR604 x 5307, Bt11 x MIR604 x 5307 x GA21, Bt11 x MIR604 x GA21, Bt11 x MIR604 x TC1507, Bt11 x MIR604 x TC1507 x 5307, Bt11 x MIR604 x TC1507 x GA21, Bt11 x MON89Ø34 x GA21, Bt11 x TC1507, Bt11 x TC1507 x 5307, Bt11 x TC1507 x GA21, Bt176 [176] (NaturGard KnockOut / Maximizer), BVLA430101, CBH-351 (STARLINK Maize), DAS40278 (ENLIST Maize), DAS40278 x NK603, DBT418 (Bt Xtra Maize), DLL25 [B16], GA21 (ROUNDUP READY Maize / AGRISURE GT), GA21 x MON810 (ROUNDUP READY Yieldgard Maize), GA21 x T25, HCEM485, LY038 (MAVERA Maize), LY038 x MON810 (MAVERA Yieldgard Maize), MIR162 (AGRISURE Viptera), MIR162 x 5307, MIR162 x 5307 x GA21, MIR162 x GA21, MIR162 x MIR604, MIR162 x MIR604 x 5307, MIR162 x MIR604 x 5307 x GA21, MIR162 x MIR604 x GA21, MIR162 x MIR604 x TC1507 x 5307, MIR162 x MIR604 x TC1507 x 5307 x GA21, MIR162 x MIR604 x TC1507 x GA21, MIR162 x MON89Ø34, MIR162 x NK603, MIR162 x TC1507, MIR162 x TC1507 x 5307, MIR162 x TC1507 x 5307 x GA21, MIR162 x TC1507 x GA21, MIR604 (AGRISURE RW), MIR604 x 5307, MIR604 x 5307 x GA21, MIR604 x GA21 (AGRISURE GT/RW), MIR604 x NK603, MIR604 x TC1507, MIR604 x TC1507 x 5307, MIR604 x TC1507 x 5307 xGA21, MIR604 x TC1507 x GA21, MON801 [MON80100],

MON802, MON809, MON810 (YIELDGARD, MAIZEGARD), MON810 x MIR162, MON810 x MIR162 x NK603, MON810 x MIR604, MON810 x MON88017 (YIELDGARD VT Triple), MON810 x NK603 x MIR604, MON832 (ROUNDUP READY Maize), MON863 (YIELDGARD Rootworm RW, MAXGARD), MON863 x MON810 (YIELDGARD Plus), MON863 x MON810 x NK603 (YIELDGARD Plus com RR), MON863 x NK603 (YIELDGARD RW + RR), MON87403, MON87411, MON87419, MON87427 (ROUNDUP READY Maize), MON87427 x 59122, MON87427 x MON88017, MON87427 x MON88017 x 59122, MON87427 x MON89034, MON87427 x MON89034 x 59122, MON87427 x MON89034 x MIR162 x MON87411, MON87427 x MON89034 x MON88017, MON87427 x MON89034 x MON88017 x 59122, MON87427 x MON89034 x NK603, MON87427 x MON89034 x TC1507, MON87427 x MON89034 x TC1507 x 59122, MON87427 x MON89034 x TC1507 x MON87411 x 59122, MON87427 x MON89034 x TC1507 x MON87411 x 59122 x DAS40278, MON87427 x MON89034 x TC1507 x MON88017 , MON87427 x MON89Ø34 x MIR162 x NK603, MON87427 x MON89Ø34 x TC15Ø7 x MON88Ø17 x 59122, MON87427 x TC1507, MON87427 x TC1507 x 59122, MON87427 x TC1507 x MON88017, MON87427 x TC1507 x MON88017 x 59122, MON87460 (GENUITY DROUGHTGARD), MON87460 x MON88017, MON87460 x MON89034 x MON88017, MON87460 x MON89034 x NK603, MON87460 x NK603, MON88017, MON88017 x DAS40278, MON89034, MON89034 x 59122, MON89034 x 59122 x DAS40278, MON89034 x 59122 x MON88017, MON89034 x 59122 x MON88017 x DAS40278, MON89034 x DAS40278, MON89034 x MON87460, MON89034 x MON88017 (GENUITY VT Triple Pro), MON89034 x MON88017 x DAS40278, MON89034 x NK603 (GENUITY VT Double Pro), MON89034 x NK603 x DAS40278, MON89034 x TC1507, MON89034 x TC1507 x 59122, MON89034 x TC1507 x 59122 x DAS40278, MON89034 x TC1507 x DAS40278, MON89034 x TC1507 x MON88017, MON89034 x TC1507 x MON88017 x 59122 (GENUITY SMARTSTAX), MON89034 x TC1507 x MON88017 x 59122 x DAS40278, MON89034 x TC1507 x MON88017 x DAS40278, MON89034 x TC1507 x NK603 (POWER CORE), MON89034 x TC1507 x NK603 x DAS40278, MON89034 x TC1507 x NK603 x MIR162, MON89034 x TC1507 x NK603 x MIR162 x DAS40278, MON89Ø34 x GA21, MS3 (INVIGOR Maize), MS6

(INVIGOR Maize), MZHG0JG, MZIR098, NK603 (ROUNDUP READY 2 Maize), NK603 x MON810 x 4114 x MIR604, NK603 x MON810 (YIELDGARD CB + RR), NK603 x T25 (ROUNDUP READY LIBERTY LINK Maize), T14 (LIBERTY LINK Maize), T25 (LIBERTY LINK Maize), T25 x MON810 (LIBERTY LINK YIELDGARD Maize), TC1507 (HERCULEX I, HERCULEX CB), TC1507 × 59122 × MON810 × MIR604 x NK603 (OPTIMUM INTRASECT XTREME), TC1507 × MON810 × MIR604 × NK603, TC1507 x 5307, TC1507 x 5307 x GA21, TC1507 x 59122 (HERCULEX XTRA), TC1507 x 59122 x DAS40278, TC1507 x 59122 x MON810, TC1507 x 59122 x MON810 x MIR604, TC1507 x 59122 x MON810 x NK603 (OPTIMUM INTRASECT XTRA), TC1507 x 59122 x MON88017, TC1507 x 59122 x MON88017 x DAS40278, TC1507 x 59122 x NK603 (HERCULEX XTRA RR), TC1507 x 59122 x NK603 x MIR604, TC1507 x DAS40278, TC1507 x GA21, TC1507 x MIR162 x NK603, TC1507 x MIR604 x NK603 (OPTIMUM TRISECT), TC1507 x MON810, TC1507 x MON810 x MIR162, TC1507 x MON810 x MIR162 x NK603, TC1507 x MON810 x MIR604, TC1507 x MON810 x NK603 (OPTIMUM INTRASECT), TC1507 x MON810 x NK603 x MIR604, TC1507 x MON88017, TC1507 x MON88017 x DAS40278, TC1507 x NK603 (HERCULEX I RR), TC1507 x NK603 x DAS40278, TC6275e VCO-01981-5.

PLANTAS GENETICAMENTE MODIFICADAS ADICIONAIS

[391] Os métodos e bactérias descritos no presente documento são adequados para qualquer uma de uma variedade de plantas geneticamente modificadas ou parte das mesmas.

[392] Além disso, os métodos e bactérias descritos no presente documento são adequados para qualquer um dos seguintes eventos de planta geneticamente modificados, que foram aprovados em um ou mais países. TABELA 14 - CARACTERÍSTICAS DO ARROZ, QUE PODEM SER

COMBINADAS COM MICRÓBIOS DA DIVULGAÇÃO ArrozOryza sativa Evento Empresa Descrição Tolerância ao herbicida imidazolinona, CL121, imazetapir, induzida por mutagênese química CL141, BASF Inc. da enzima acetolactato sintase (ALS) usando CFX51 metanossulfonato de etila (EMS).

ArrozOryza sativa Evento Empresa Descrição Tolerância a herbicidas de imidazolinona IMINTA-1, induzida por mutagênese química da enzima BASF Inc. IMINTA-4 acetolactato sintase (ALS) usando azida sódica. Arroz tolerante a herbicida glufosinato de amônio produzido pela inserção de um gene LLRICE06, Aventis codificador de fosfinotricina acetiltransferase LLRICE62 CropScience (PAT) modificado da bactéria de solo Streptomyces hygroscopicus). Bayer Arroz tolerante a herbicida glufosinato de CropScience amônio produzido pela inserção de um gene LLRICE601 (Aventis codificador de fosfinotricina acetiltransferase CropScience (PAT) modificado da bactéria de solo (AgrEvo)) Streptomyces hygroscopicus). Tolerância ao herbicida imidazolinona, imazetapir, induzida por mutagênese química PWC16 BASF Inc. da enzima acetolactato sintase (ALS) usando metanossulfonato de etila (EMS).

TABELA 15 – TRAÇOS DE ALFAFA, QUE PODEM SER COMBINADOS

COM MICRÓBIOS DA DIVULGAÇÃO Medicago sativa Alfalfa Evento Empresa Descrição Alfafa tolerante a herbicida glifosato (luzerna) Monsanto produzida pela inserção de um gene que codifica a J101, Company e Forage enzima 5-enolipiruvilchiquimato-3-fosfato sintase J163 Genetics (EPSPS) da cepa CP4 de Agrobacterium International tumefaciens.

TABELA 16 – TRAÇOS DE TRIGO, QUE PODEM SER COMBINADOS

COM MICRÓBIOS DA DIVULGAÇÃO Triticum aestivum Trigo Evento Empresa Descrição Seleção para uma versão mutagenizada da enzima acetoidroxiácido sintase (AHAS), também AP205CL BASF Inc. conhecida como acetolactato sintase (ALS) ou acetolactato piruvato-liase.

Triticum aestivum Trigo Evento Empresa Descrição Seleção para uma versão mutagenizada da enzima acetoidroxiácido sintase (AHAS), também AP602CL BASF Inc. conhecida como acetolactato sintase (ALS) ou acetolactato piruvato-liase. Seleção para uma versão mutagenizada da enzima BW255-2, acetoidroxiácido sintase (AHAS), também BASF Inc. BW238-3 conhecida como acetolactato sintase (ALS) ou acetolactato piruvato-liase. Tolerância a herbicidas de imidazolinona induzida por mutagênese química do gene da BW7 BASF Inc. acetoidroxiácido sintase (AHAS) usando azida de sódio. Variedade de trigo tolerante ao glifosato produzida pela inserção de um gene que codifica 5- Monsanto MON71800 enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) da Company bactéria do solo Agrobacterium tumefaciens, cepa CP4. Seleção para uma versão mutagenizada da enzima Proteção de acetoidroxiácido sintase (AHAS), também SWP965001 Cultura de conhecida como acetolactato sintase (ALS) ou Cianamida acetolactato piruvato-liase. Seleção para uma versão mutagenizada da enzima acetoidroxiácido sintase (AHAS), também Teal 11A BASF Inc. conhecida como acetolactato sintase (ALS) ou acetolactato piruvato-liase.

TABELA 17 – TRAÇOS DE GIRASSOL, QUE PODEM SER COMBINADOS

COM MICRÓBIOS DA DIVULGAÇÃO Helianthus annuus Girassol Evento Empresa Descrição BASF Tolerância a herbicidas de imidazolinona por seleção de um X81359 Inc. mutante de ocorrência natural.

TABELA 18 – TRAÇOS DE SOJA, QUE PODEM SER COMBINADOS COM

MICRÓBIOS DA DIVULGAÇÃO

Glycine max L.

Soybean Evento Empresa Descrição Bayer Soja tolerante a herbicida glufosinato de amônio A2704-12, CropScience produzida pela inserção de um gene codificador A2704-21, (Aventis de fosfinotricina acetiltransferase (PAT) A5547-35 CropScience modificada da bactéria de solo Streptomyces (AgrEvo)) viridochromogenes.

Bayer Soja tolerante a herbicida glufosinato de amônio CropScience produzida pela inserção de um gene codificador A5547-127 (Aventis de fosfinotricina acetiltransferase (PAT) CropScience modificada da bactéria de solo Streptomyces (AgrEvo)) viridochromogenes.

O gene csr1-2 introduzido de Arabidopsis thaliana codifica uma proteína acetoidroxiácido sintase que confere tolerância a herbicidas de BPS-CV127- BASF Inc. imidazolinona devido a uma mutação pontual que 9 resulta em uma única substituição de aminoácido em que o resíduo de serina na posição 653 é substituído por asparagina (S653N). Soja com alto teor de ácido oleico produzida pela inserção de cópias adicionais de uma porção do Pioneer Hi-Bred DP-305423 gene que codifica ômega 6 desaturase, gm-fad2- International Inc. 1, resultando no silenciamento do gene da ômega-6 desaturase endógena (FAD2-1). Evento de soja com dois genes de tolerância a herbicida: glifosato N-acetitransferase, que Pioneer Hi-Bred DP356043 desintoxica o glifosato, e um gene da acetolactato International Inc. sintase (ALS) modificado, que é tolerante a herbicidas inibidores de ALS.

Soja com alto teor de ácido oleico produzida pela DuPont Canada inserção de uma segunda cópia do gene que G94-1, G94- Agricultural codifica a desaturase de ácido graxo (Gm Fad2- 19, G168 Products 1) da soja, que resultou no “silenciamento” do gene hospedeiro endógeno.

Variedade de soja tolerante ao glifosato produzida pela inserção de um gene que codifica Monsanto GTS 40-3-2 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase Company (EPSPS) da bactéria do solo Agrobacterium tumefaciens.

Bayer Soja tolerante a herbicida glufosinato de amônio CropScience produzida pela inserção de um gene codificador GU262 (Aventis de fosfinotricina acetiltransferase (PAT) CropScience modificada da bactéria de solo Streptomyces (AgrEvo)) viridochromogenes.

Glycine max L. Soybean Evento Empresa Descrição Resistência às pragas de lepidópteros da soja, Monsanto incluindo a lagarta-da-soja (Anticarsia MON87701 Company gemmatalis) e a lagarta falsa-medideira (Pseudoplusia includens). Tolerância ao herbicida glifosato por meio da expressão do gene que codifica EPSPS da cepa CP4 de A. tumefaciens e resistência a pragas de MON87701 x Monsanto lepidópteros de soja, incluindo lagarta-da-soja MON89788 Company (Anticarsia gemmatalis) e lagarta falsa-medideira (Pseudoplusia includens) por meio da expressão do gene que codifica Cry1A de B. thuringiensis. Soja tolerante ao glifosato produzida pela inserção de uma 5-enolpiruvilchiquimato-3- Monsanto MON89788 fosfato sintase (EPSPS) modificada que codifica Company o gene aroA (epsps) da CP4 de Agrobacterium tumefaciens. Soja com baixo teor de ácido linolênico produzida por meio de cruzamento tradicional para Agriculture & incorporar o traço inovador de um mutante do OT96-15 Agri-Food gene fan1 de ocorrência natural que foi Canada selecionado quanto ao baixo teor de ácido linolênico. Bayer Soja tolerante a herbicida glufosinato de amônio CropScience produzida pela inserção de um gene codificador W62, W98 (Aventis de fosfinotricina acetiltransferase (PAT) CropScience modificada da bactéria de solo Streptomyces (AgrEvo)) hygroscopicus.

TABELA 19 – TRAÇOS DE MILHO, QUE PODEM SER COMBINADOS

COM MICRÓBIOS DA DIVULGAÇÃO Zea mays L. Maize Evento Empresa Descrição Milho resistente a insetos produzido pela inserção do gene Cry1Ab de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. 176 Syngenta Seeds, Inc. A modificação genética oferece resistência ao ataque da broca europeia do milho (BCE). 3751 IR Pioneer Hi-Bred Seleção de variantes somaclonais por 676, 678, 680 International Inc. cultura de embriões em meio contendo

Zea mays L.

Maize Evento Empresa Descrição Pioneer Hi-Bred imidazolinona.

Milho maís estéril e International Inc. tolerante a herbicida glufosinato de amônio produzido pela inserção de genes que codificam DNA adenina metilase e fosfinotricina acetiltransferase (PAT) de Escherichia coli e Streptomyces viridochromogenes, respectivamente.

Milho maís tolerante a herbicida glufosinato de amônio produzido pela Dekalb Genetics B16 (DLL25) inserção do gene que codifica Corporation fosfinotricina acetiltransferase (PAT) de Streptomyces hygroscopicus.

Milho maís resistente a insetos e tolerante a herbicidas produzido pela BT11 inserção do gene Cry1Ab de Bacillus (X4334CBR, Syngenta Seeds, Inc. thuringiensis subsp. kurstaki, e o gene X4734CBR) que codifica fosfinotricina N- acetiltransferase (PAT) de S. viridochromogenes.

Milho maís empilhado resistente a insetos e tolerante a herbicidas produzido por cruzamento BT11 x GA21 Syngenta Seeds, Inc. convencional de linhagens parentais BT11 (identificador exclusivo OCDE: SYN-BTO11-1) e GA21 (identificador exclusivo OCDE: MON-OOO21-9). Resistência a pragas de coleópteros, particularmente pragas da lagarta da raiz do milho (Diabrotica spp.) e várias pragas de lepidópteros de milho, BT11 x incluindo a broca do milho europeia MIR162 x (ECB, Ostrinia nubilalis), lagarta da Syngenta Seeds, Inc.

MIR604 x espiga do milho (CEW, Helicoverpa GA21 zea), lagarta do cartucho (FAW, Spodoptera frugiperda), e lagarta negra (BCW, Agrotis ipsilon); tolerância a herbicidas contendo glifosato e glufosinato de amônio.

Milho maís empilhado resistente a BT11 x insetos e tolerante a herbicidas Syngenta Seeds, Inc.

MIR162 produzido por cruzamento convencional de linhagens parentais

Zea mays L.

Maize Evento Empresa Descrição BT11 (identificador exclusivo OCDE: SYN-BTO11-1) e MIR162 (identificador exclusivo OECD: SYN-1R162-4). A resistência à broca europeia do milho e a tolerância ao herbicida glufosinato de amônio (Liberty) são derivadas de BT11, que contém o gene Cry1Ab de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, e o gene que codifica a fosfinotricina N- acetiltransferase (PAT) de S. viridochromogenes.

A resistência a outras pragas de lepidópteros, incluindo H. zea, S. frugiperda, A. ipsilone S. albicosta, é derivada de MIR162, que contém o gene vip3Aa da cepa AB88 de Bacillus thuringiensis.

A proteína delta-endotoxina Cry1Ab de Bacillus thuringiensis e o material genético necessário para sua produção (por meio de elementos do vetor pZO1502) no milho Evento Bt11 (Identificador Exclusivo OECD: SYNBTO11-1) x proteína inseticida Vip3Aa20 de Bacillus thuringiensis e o BT11 x material genético necessário para sua MIR162 x Syngenta Seeds, Inc. produção (por meio de elementos do MIR604 vetor pNOV1300) no milho maís Evento MIR162 (Identificador Exclusivo OECD: SYN-IR162-4) x proteína Cry3A modificada e o material genético necessário para sua produção (por meio de elementos do vetor pZM26) no milho Evento MIR604 (Identificador Exclusivo OCDE: SYN - 1R604-5). Milho maís resistente a insetos e tolerante a herbicida glufosinato de amônio desenvolvido pela inserção de genes que codificam a proteína Cry9C CBH-351 Aventis CropScience de Bacillus thuringiensis subsp tolworthi e fosfinotricina acetiltransferase (PAT) de Streptomyces hygroscopicus.

Zea mays L.

Maize Evento Empresa Descrição Variedade de milho maís resistente a insetos lepidópteros e tolerante a herbicida glufosinato de amônio DAS-06275-8 DOW AgroSciences LLC produzida pela inserção do gene Cry1F de Bacillus thuringiensis var aizawai e da fosfinotricina acetiltransferase (PAT) de Streptomyces hygroscopicus.

Milho maís empilhado resistente a insetos e tolerante a herbicidas produzido por cruzamento convencional de linhagens parentais BT11 (identificador exclusivo OCDE: SYN-BTO11-1) e MIR604 (identificador exclusivo OECD: SYN-1R6O5-5). A resistência à broca europeia do milho e BT11 x a tolerância ao herbicida glufosinato de Syngenta Seeds, Inc.

MIR604 amônio (Liberty) são derivadas de BT11, que contém o gene Cry1Ab de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, e o gene que codifica a fosfinotricina N- acetiltransferase (PAT) de S. viridochromogenes.

A resistência ao verme da raiz do milho é derivada de MIR604, que contém o gene mCry3A de Bacillus thuringiensis.

Milho maís empilhado resistente a insetos e tolerante a herbicidas produzido por cruzamento convencional de linhagens parentais BT11 (identificador exclusivo OCDE: SYN-BTO11-1), MIR604 (identificador exclusivo OECD: SYN-1R6O5-5) e GA21 (identificador exclusivo OECD: BT11 x MON-OOO21-9). A resistência à broca MIR604 x Syngenta Seeds, Inc. europeia do milho e a tolerância ao GA21 herbicida glufosinato de amônio (Liberty) são derivadas de BT11, que contém o gene Cry1Ab de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, e o gene que codifica a fosfinotricina N- acetiltransferase (PAT) de S. viridochromogenes.

A resistência à lagarta da raiz do milho é derivada de MIR604 que contém o gene mCry3A de

Zea mays L.

Maize Evento Empresa Descrição Bacillus thuringiensis.

A tolerância ao herbicida glifosato é derivada de GA21, que contém um gene EPSPS modificado de milho.

Milho resistente à larva da raiz do milho produzido pela inserção dos genes Cry34Ab1 e Cry35Ab1 da cepa DOW AgroSciences LLC PS149B1 de Bacillus thuringiensis.

O DAS-59122-7 e Pioneer Hi-Bred gene que codifica PAT de International Inc.

Streptomyces viridochromogenes foi introduzido como um marcador selecionável.

Milho empilhado resistente a insetos e tolerante a herbicida produzido por cruzamento convencional de linhagens parentais DAS-59122-7 (identificador único OECD: DAS-59122-7) e TC1507 (identificador único OECD: DAS- 01507-1) com NK603 (identificador DAS-59122-7 DOW AgroSciences LLC único OECD : MON-00603-6). A x TC1507 x e Pioneer Hi-Bred resistência à larva da raiz do milho é NK603 International Inc. derivada de DAS-59122-7, que contém os genes Cry34Abl e Cry35Abl da cepa P5149B1 de Bacillus thuringiensis.

A resistência e tolerância dos lepidópteros ao herbicida glufosinato de amônio é derivada do TC1507. A tolerância ao herbicida glifosato é derivada do NK603. Milho maís resistente a insetos e tolerante a herbicida glufosinato de amônio desenvolvido pela inserção de Dekalb Genetics genes que codificam a proteína DBT418 Corporation Cry1AC de Bacillus thuringiensis subsp kurstaki e fosfinotricina acetiltransferase (PAT) de Streptomyces hygroscopicus.

Milho maís empilhado resistente a insetos e tolerante a herbicidas MIR604 x produzido por cruzamento Syngenta Seeds, Inc.

GA21 convencional de linhagens parentais MIR604 (identificador exclusivo OCDE: SYN-1R605-5) e GA21 (identificador

Zea mays L.

Maize Evento Empresa Descrição exclusivo OECD: MON-00021-9). A resistência à lagarta da raiz do milho é derivada de MIR604 que contém o gene mCry3A de Bacillus thuringiensis.

A tolerância ao herbicida glifosato é derivada de GA21. Milho maís resistente a insetos produzido pela inserção do gene Cry1Ab de Bacillus thuringiensis MON80100 Monsanto Company subsp. kurstaki.

A modificação genética produz resistência ao ataque pela broca europeia do milho (ECB). Milho resistente a insetos e tolerante a herbicida glifosato produzido pela inserção dos genes que codificam a proteína Cry1Ab de Bacillus MON802 Monsanto Company thuringiensis e a 5- enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) da cepa CP4 de A. tumefaciens.

Resistência à broca europeia do milho (Ostrinia nubilalis) pela introdução de um gene sintético Cry1Ab.

Resistência Pioneer Hi-Bred MON809 ao glifosato por meio da introdução da International Inc. versão bacteriana de uma enzima vegetal, 5-enolinivil chiquimato-3- fosfato sintase (EPSPS). Milho maís resistente a insetos produzido pela inserção de uma forma truncada do gene Cry1Ab de HD-1 de MON810 Monsanto Company Bacillus thuringiensis subsp.

Kurstaki.

A modificação genética produz resistência ao ataque pela broca europeia do milho (ECB). Milho empilhado resistente a insetos e com maior teor de lisina derivado de cruzamentos convencionais das MON810 x Monsanto Company linhagens parentais MON810 LY038 (identificador OECD: MON-OO81O-6) e LY038 (identificador OECD: REN- OOO38-3). MON810 x Monsanto Company Milho empilhado resistente a insetos e

Zea mays L.

Maize Evento Empresa Descrição MON88017 tolerante ao glifosato derivado de cruzamento convencional das linhagens parentais MON810 (identificador OECD: MON-OO81O-6) e MON88017 (identificador OECD: MON-88017-3). A resistência à broca europeia do milho (ECB) é derivada de uma forma truncada do gene Cry1Ab de HD-1 de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki presente em MON810. A resistência da lagarta da raiz do milho é derivada do gene Cry3Bbl da cepa EG4691 de Bacillus thuringiensis da subespécie kumamotoensis presente em MON88017. A tolerância ao glifosato é derivada de um gene que codifica a 5-enolpiruvilchiquimato-3- fosfato sintase (EPSPS) da cepa CP4 de Agrobacterium tumefaciens presente em MON88017. Introdução, por bombardeamento de partículas, de glifosato oxidase (GOX) e uma 5-enolpiruvil chiquimato-3- MON832 Monsanto Company fosfato sintase (EPSPS) modificada, uma enzima envolvida na via bioquímica do chiquimato para a produção de aminoácidos aromáticos.

Milho maís resistente à lagarta da raiz do milho produzido pela inserção do MON863 Monsanto Company gene Cry3Bbl de Bacillus thuringiensis subsp. kumamotoensis.

Híbrido de milho empilhado resistente a insetos derivado de cruzamento MON863 x convencional das linhagens parentais Monsanto Company MON810 MON863 (identificador OECD: MON- 00863-5) e MON810 (identificador OECD: MON-00810-6) Híbrido de milho empilhado resistente MON863 x a insetos e tolerante a herbicida MON810 x derivado do cruzamento convencional Monsanto Company Monsanto do híbrido empilhado MON-00863-5 x NK603 MON-00810-6 e NK603 (identificador OECD: MON-00603-6).

Zea mays L.

Maize Evento Empresa Descrição Híbrido de milho empilhado resistente a insetos e tolerante a herbicida derivado de cruzamento convencional MON863 x Monsanto Company das linhagens parentais MON863 NK603 (identificador OECD: MON-OO863-5) e NK603 (identificador OECD: MON- OO6O3-6). MON 87460 foi desenvolvido para fornecer perda de rendimento reduzida sob condições de limitação de água em comparação com o milho maís MON87460 Monsanto Company convencional.

A eficácia no MON 87460 é derivada da expressão da proteína B de choque frio de Bacillus subtilis (CspB). Milho maís resistente à lagarta da raiz do milho produzido pela inserção do gene Cry3Bbl da cepa EG4691 de Bacillus thuringiensis de subespécie kumamotoensis.

Tolerância ao MON88017 Monsanto Company glifosato derivada da inserção de um gene que codifica a 5- enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) da cepa CP4 de Agrobacterium tumefaciens.

Evento de milho que expressa duas proteínas inseticidas diferentes de MON89034 Monsanto Company Bacillus thuringiensis, proporcionando resistência a várias pragas de lepidópteros.

Milho empilhado resistente a insetos e tolerante ao glifosato derivado de cruzamento convencional das linhagens parentais MON89034 (identificador OECD:. MON-89O34-3) e MON88017 (identificador OECD: MON89034 x Monsanto Company MON-88O17-3). A resistência a insetos MON88017 lepidópteros é derivada de dois genes Cry presentes em MON89043. A resistência à lagarta da raiz do milho é derivada de um único gene Cry e a tolerância ao glifosato é derivada do gene que codifica a 5-

Zea mays L.

Maize Evento Empresa Descrição enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) de Agrobacterium tumefaciens presente em MON88017. Milho empilhado resistente a insetos e tolerante a herbicida produzido por cruzamento convencional de linhagens parentais MON89034 (identificador OECD: MON-89034-3) com NK603 MON89034 x Monsanto Company (identificador exclusivo OECD: MON- NK603 00603-6). A resistência a insetos lepidópteros é derivada de dois genes Cry presentes em MON89043. A tolerância ao herbicida glifosato é derivada de NK603. Híbrido de milho empilhado resistente a insetos e tolerante a herbicida derivado de cruzamento convencional NK603 x Monsanto Company das linhagens parentais NK603 MON810 (identificador OECD:. MON-00603-6) e MON810 (identificador OECD: MON- 00810-6). Milho maís empilhado resistente a insetos e tolerante a herbicida produzido por cruzamento MON89034 x Monsanto Company e convencional de linhagens parentais: TC1507 x Mycogen Seeds c/o Dow MON89034, TC1507, MON88017 e MON88017 x AgroSciences LLC DAS-59 122. Resistência às pragas de DAS-59122-7 insetos acima do solo e abaixo do solo e tolerância a herbicidas contendo glifosato e glufosinato de amônio.

Esterilidade masculina causada pela expressão do gene barnase Bayer CropScience ribonuclease de Bacillus M53 (Aventis amyloliquefaciens; a resistência ao CropScience(AgrEvo )) PPT foi via PPT-acetiltransferase (PAT). Esterilidade masculina causada pela expressão do gene barnase Bayer CropScience ribonuclease de Bacillus M56 (Aventis amyloliquefaciens; a resistência ao CropScience(AgrEvo ) PPT foi via PPT-acetiltransferase (PAT).

Zea mays L.

Maize Evento Empresa Descrição Introdução, por bombardeamento de partículas, de uma 5-enolpiruvil chiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) NK603 Monsanto Company modificada, uma enzima envolvida na via bioquímica do chiquimato para a produção de aminoácidos aromáticos.

Híbrido de milho maís empilhado tolerante a herbicida glufosinato de amônio e glifosato derivado de cruzamento convencional das NK603 x T25 Empresa Monsanto linhagens parentais NK603 (identificador OECD: MON-00603-6) e T25 (identificador OECD: ACS-ZM003- 2). Híbrido de milho empilhado resistente a insetos e tolerante a herbicida Bayer CropScience derivado de cruzamento convencional T25 x MON810 (Aventis das linhagens parentais T25 CropScience(AgrEvo)) (identificador OCDE: ACS-ZMOO3-2) e MON810 (identificador OECD: MON- OO81O-6). Milho maís resistente a insetos e tolerante a herbicida glufosinato de Mycogen (c/o Dow amônio produzido pela inserção do TC1507 AgroSciences); Pioneer gene Cry1F de Bacillus thuringiensis (c/o DuPont) var. aizawai e do gene que codifica a fosfinotricina N-acetiltransferase de Streptomyces viridochromogenes.

Híbrido de milho empilhado resistente a insetos e tolerante a herbicida derivado de cruzamento convencional TC1507 x DOW AgroSciences LLC das linhagens parentais 1507 NK603 (identificador OECD:. DAS-O15O7-1) e NK603 (identificador OECD: MON- OO6O3-6). Milho maís empilhado resistente a insetos e tolerante a herbicidas produzido por cruzamento DOW AgroSciences LLC TC1507 x convencional de linhagens parentais e Pioneer Hi-Bred DAS-59122-7 TC1507 (identificador exclusivo OCDE: International Inc.

DAS-O15O7-1) com DAS-59122-7 (identificador exclusivo OECD: DAS- 59122-7). A resistência a insetos

Zea mays L. Maize Evento Empresa Descrição lepidópteros é derivada de TC1507 devido à presença do gene Cry1F de Bacillus thuringiensis var. aizawai. A resistência à lagarta da raiz do milho é derivada de DAS-59122-7 que contém o gene Cry34Ab1 e Cry35Ab1 da cepa P5149B1 de Bacillus thuringiensis. A tolerância ao herbicida glufosinato de amônio é derivada de TC1507 do gene que codifica a fosfinotricina N- acetiltransferase de Streptomyces viridochromogenes.

Evento Empresa Descrição Família Híbrida P0157 Dupont Pioneer P0157 P0157AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P0157 P0157AMXT Dupont Pioneer AMXT LL RR2 P0157 P0157R Dupont Pioneer RR2 P0157 P0339AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P0339 P0339AMXT Dupont Pioneer AMXT LL RR2 P0339 P0306AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P0306 P0589 Dupont Pioneer P0589 P0589AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P0589 P0589AMXT Dupont Pioneer AMXT LL RR2 P0589 P0589R Dupont Pioneer RR2 P0589 P0574 Dupont Pioneer P0574 P0574AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P0574 P0574AMXT Dupont Pioneer AMXT LL RR2 P0574 P0533EXR Dupont Pioneer HXX LL RR2 P0533 P0506AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P0566 P0760AMXT Dupont Pioneer AMXT LL RR2 P0760 P0707AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P0707 P0707AMXT Dupont Pioneer AMXT LL RR2 P0707 P0825AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P0825

Zea mays L. Maize Evento Empresa Descrição P0825AMXT Dupont Pioneer AMXT LL RR2 P0825 P0969AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P0969 P0969AMXT Dupont Pioneer AMXT LL RR2 P0969 P0937AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P0937 P0919AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P0919 P0905EXR Dupont Pioneer HXX LL RR2 P0905 P1197 Dupont Pioneer P1197 P1197AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P1197 P1197AMXT Dupont Pioneer AMXT LL RR2 P1197 P1197R Dupont Pioneer RR2 P1197 P1151 Dupont Pioneer P1151 P1151AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P1151 P1151R Dupont Pioneer RR2 P1151 P1138AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P1138 P1366AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P1366 P1366AMXT Dupont Pioneer AMXT LL RR2 P1366 P1365AMX Dupont Pioneer AMX LL RR2 P1365 P1353AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P1353 P1345 Dupont Pioneer P1345 P1311AMXT Dupont Pioneer AMXT LL RR2 P1311 P1498EHR Dupont Pioneer HX1 LL RR2 P1498 P1498R Dupont Pioneer RR2 P1498 P1443AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P1443 P1555CHR Dupont Pioneer RW HX1 LL RR2 P1555 P1751AMT Dupont Pioneer AMT LL RR2 P1751 P2089AM Dupont Pioneer AM LL RR2 P2089 QROME Dupont Pioneer Q LL RR2

[393] A seguir estão as definições para a abreviação que ocorre na Tabela

19. AM - OPTIMUM ACREMAX Insect Protection system com YGCB, HX1, LL, RR2. AMT - OPTIMUM ACREMAX TRISECT Insect Protection System com

RW,YGCB,HX1,LL,RR2. AMXT - (OPTIMUM ACREMAX XTreme). HXX - HERCULEX XTRA contém os genes Herculex I e Herculex RW. HX1 - Contém o gene HERCULEX I Insect Protection que fornece proteção contra a broca europeia do milho, broca do milho do sudoeste, lagarta-rosca, lagarta-do-cartucho, lagarta do feijão ocidental, broca menor do colmo de milho, broca do colmo de milho do sul e broca da cana-de-açúcar; e suprime a lagarta da espiga de milho. LL - Contém o gene LIBERTYLINK para resistência ao herbicida LIBERTY. RR2 - Contém o traço ROUNDUP READY Corn 2 que fornece segurança à cultura para aplicações over- the-top de herbicidas glifosato rotulados quando aplicados de acordo com as instruções do rótulo. YGCB - contém o gene da broca do milho YIELDGARD oferece um alto nível de resistência à broca europeia do milho, broca do milho do sudoeste e broca do colmo de milho do sul; resistência moderada à lagarta da espiga do milho e à broca do colmo; e resistência acima da média à lagarta do cartucho. RW - contém o traço de resistência à lagarta-da-raiz AGRISURE. Q - fornece proteção ou supressão contra broca europeia do milho suscetível, broca do milho do sudoeste, lagarta-rosca preta, lagarta-do-cartucho, broca do colmo do milho menor, broca do colmo do milho do sul, broca do colmo, broca da cana-de-açúcar e lagarta da espiga de milho; e também fornece proteção contra lesões larvais causadas por lagarta da raiz do milho ocidental suscetíveis, lagarta da raiz do milho do norte e lagarta da raiz do milho mexicano; contém (1) genes HERCULEX XTRA Insect Protection que produzem as proteínas Cry1F e Cry34ab1 e Cry35ab1, (2) o traço AGRISURE RW que inclui um gene que produz a proteína mCry3A e (3) o gene da broca do milho YIELDGARD que produz a proteína Cry1Ab.

CONCENTRAÇÕES E TAXAS DE APLICAÇÃO DE COMPOSIÇÕES AGRÍCOLAS

[394] Como supracitado, as composições agrícolas da presente divulgação, que compreendem um micróbio ensinado, podem ser aplicadas a plantas de inúmeras maneiras. Em dois aspectos específicos, a divulgação contempla um tratamento em sulco ou um tratamento de sementes

[395] Para modalidades de tratamento de sementes, os micróbios da divulgação podem estar presentes na semente em uma variedade de concentrações. Por exemplo, os micróbios podem ser encontrados em um tratamento de sementes a uma concentração de ufc, por semente de: 1 × 101, 1 × 102, 1 × 103, 1 × 104, 1 × 105, 1 × 106, 1 × 107, 1 × 108, 1 × 109, 1 × 1010ou mais. Em aspectos específicos, as composições de tratamento de sementes compreendem cerca de 1 × 104 a cerca de 1 × 108 ufc por semente. Em outros aspectos específicos, as composições de tratamento de sementes compreendem cerca de 1 × 105 a cerca de 1 × 107 ufc por semente. Em outros aspectos, as composições de tratamento de sementes compreendem cerca de 1 × 10 6 ufc por semente.

[396] Nos Estados Unidos, cerca de 10% da área plantada com milho é plantada a uma densidade de sementes acima de 36 000 sementes por acre; 1/3 da área plantada com milho é plantada a uma densidade de sementes entre cerca de 33 000 a 36 000 sementes por acre; 1/3 da área plantada com milho é plantada a uma densidade de sementes entre cerca de 30 000 a 33 000 sementes por acre, e o restante da área é variável. Consultar, “Corn Seeding Rate Considerations”, escrita por Steve Butzen, disponível em: www.pioneer.com/home/site/us/agronomy/library/corn-seeding-rate- considerations/

[397] A Tabela 20 abaixo utiliza várias concentrações de ufc por semente em uma modalidade de tratamento de sementes contemplada (fileiras) e várias densidades de plantio de área cultivada com semente (1a coluna: 15K-41K) para calcular a quantidade total de ufc por acre, que poderia ser utilizada em vários cenários agrícolas (ou seja, concentração de tratamento de sementes por semente × densidade de sementes plantadas por acre). Dessa forma, se alguém fosse utilizar um tratamento de sementes com 1 × 10 6 ufc por semente e plantar 30 000 sementes por acre, então, o teor total de ufc por poderia ser 3 × 1010 (ou seja, 30K * 1 × 106). TABELA 20: CÁLCULO DE UFC TOTAL POR ACRE PARA

MODALIDADES DE TRATAMENTO DE SEMENTES

População de Milho 1,00E+ 1,00E+ 1,00E+ 1,00E+ 1,00E+ 1,00E+ 1,00E+ 1,00E+ (ou seja, 02 03 04 05 06 07 08 09 sementes por acre) 1,50E+ 1,50E+ 1,50E+ 1,50E+ 1,50E+ 1,50E+ 1,50E+ 1,50E+ 15000 06 07 08 09 10 11 12 13 1,60E+ 1,60E+ 1,60E+ 1,60E+ 1,60E+ 1,60E+ 1,60E+ 1,60E+ 16000 06 07 08 09 10 11 12 13 1,70E+ 1,70E+ 1,70E+ 1,70E+ 1,70E+ 1,70E+ 1,70E+ 1,70E+ 17 000 06 07 08 09 10 11 12 13 1,80E+ 1,80E+ 1,80E+ 1,80E+ 1,80E+ 1,80E+ 1,80E+ 1,80E+ 18000 06 07 08 09 10 11 12 13 1,90E+ 1,90E+ 1,90E+ 1,90E+ 1,90E+ 1,90E+ 1,90E+ 1,90E+ 19000 06 07 08 09 10 11 12 13 2,00E+ 2,00E+ 2,00E+ 2,00E+ 2,00E+ 2,00E+ 2,00E+ 2,00E+ 20000 06 07 08 09 10 11 12 13 2,10E+ 2,10E+ 2,10E+ 2,10E+ 2,10E+ 2,10E+ 2,10E+ 2,10E+ 21000 06 07 08 09 10 11 12 13 2,20E+ 2,20E+ 2,20E+ 2,20E+ 2,20E+ 2,20E+ 2,20E+ 2,20E+ 22000 06 07 08 09 10 11 12 13 2,30E+ 2,30E+ 2,30E+ 2,30E+ 2,30E+ 2,30E+ 2,30E+ 2,30E+ 23000 06 07 08 09 10 11 12 13 2,40E+ 2,40E+ 2,40E+ 2,40E+ 2,40E+ 2,40E+ 2,40E+ 2,40E+ 24,000 06 07 08 09 10 11 12 13 2,50E+ 2,50E+ 2,50E+ 2,50E+ 2,50E+ 2,50E+ 2,50E+ 2,50E+ 25,000 06 07 08 09 10 11 12 13 2,60E+ 2,60E+ 2,60E+ 2,60E+ 2,60E+ 2,60E+ 2,60E+ 2,60E+ 26,000 06 07 08 09 10 11 12 13 2,70E+ 2,70E+ 2,70E+ 2,70E+ 2,70E+ 2,70E+ 2,70E+ 2,70E+ 27000 06 07 08 09 10 11 12 13 2,80E+ 2,80E+ 2,80E+ 2,80E+ 2,80E+ 2,80E+ 2,80E+ 2,80E+ 28000 06 07 08 09 10 11 12 13 2,90E+ 2,90E+ 2,90E+ 2,90E+ 2,90E+ 2,90E+ 2,90E+ 2,90E+ 29000 06 07 08 09 10 11 12 13 3,00E+ 3,00E+ 3,00E+ 3,00E+ 3,00E+ 3,00E+ 3,00E+ 3,00E+ 30000 06 07 08 09 10 11 12 13 3,10E+ 3,10E+ 3,10E+ 3,10E+ 3,10E+ 3,10E+ 3,10E+ 3,10E+ 31000 06 07 08 09 10 11 12 13 32000 3,20E+ 3,20E+ 3,20E+ 3,20E+ 3,20E+ 3,20E+ 3,20E+ 3,20E+

População de Milho 1,00E+ 1,00E+ 1,00E+ 1,00E+ 1,00E+ 1,00E+ 1,00E+ 1,00E+ (ou seja, 02 03 04 05 06 07 08 09 sementes por acre) 06 07 08 09 10 11 12 13 3,30E+ 3,30E+ 3,30E+ 3,30E+ 3,30E+ 3,30E+ 3,30E+ 3,30E+ 33000 06 07 08 09 10 11 12 13 3,40E+ 3,40E+ 3,40E+ 3,40E+ 3,40E+ 3,40E+ 3,40E+ 3,40E+ 34000 06 07 08 09 10 11 12 13 3,50E+ 3,50E+ 3,50E+ 3,50E+ 3,50E+ 3,50E+ 3,50E+ 3,50E+ 35000 06 07 08 09 10 11 12 13 3,60E+ 3,60E+ 3,60E+ 3,60E+ 3,60E+ 3,60E+ 3,60E+ 3,60E+ 36000 06 07 08 09 10 11 12 13 3,70E+ 3,70E+ 3,70E+ 3,70E+ 3,70E+ 3,70E+ 3,70E+ 3,70E+ 37000 06 07 08 09 10 11 12 13 3,80E+ 3,80E+ 3,80E+ 3,80E+ 3,80E+ 3,80E+ 3,80E+ 3,80E+ 38000 06 07 08 09 10 11 12 13 3,90E+ 3,90E+ 3,90E+ 3,90E+ 3,90E+ 3,90E+ 3,90E+ 3,90E+ 39000 06 07 08 09 10 11 12 13 4,00E+ 4,00E+ 4,00E+ 4,00E+ 4,00E+ 4,00E+ 4,00E+ 4,00E+ 40000 06 07 08 09 10 11 12 13 4,10E+ 4,10E+ 4,10E+ 4,10E+ 4,10E+ 4,10E+ 4,10E+ 4,10E+ 41000 06 07 08 09 10 11 12 13

[398] Para modalidades em sulco, os micróbios da divulgação podem ser aplicados a uma concentração de ufc por acre de: 1 × 106, 3,20 × 1010, 1,60 × 1011, 3,20 × 1011, 8,0 × 1011, 1,6 × 1012, 3,20 × 1012 ou mais. Portanto, em aspectos, as composições líquidas em sulco podem ser aplicadas a uma concentração de entre cerca de 1 × 106 a cerca de 3 × 1012 ufc por acre.

[399] Em alguns aspectos, as composições em sulco estão contidas em uma formulação líquida. Nas modalidades de líquido em sulco, os micróbios podem estar presentes a uma concentração de ufc por mililitro de: 1 × 101, 1 × 102, 1 × 103, 1 × 104, 1 × 105, 1 × 106, 1 × 107, 1 × 108, 1 × 109, 1 × 1010, 1 × 1011, 1 × 1012, 1 × 1013 ou mais. Em certos aspectos, as composições líquidas em sulco compreendem micróbios a uma concentração de cerca de 1 × 10 6 a cerca de 1 × 1011 ufc por mililitro. Em outros aspectos, as composições líquidas em sulco compreendem micróbios a uma concentração de cerca de 1 × 10 7 a cerca de 1 × 1010 ufc por mililitro. Em outros aspectos, as composições líquidas em sulco compreendem micróbios a uma concentração de cerca de 1 × 108 a cerca de 1 × 109 ufc por mililitro. Em outros aspectos, as composições líquidas em sulco compreendem micróbios a uma concentração de até cerca de 1 × 1013 ufc por mililitro.

PERFIL TRANSCRIPTÔMICO DE MICRÓBIOS CANDIDATOS

[400] O trabalho anterior dos inventores envolveu o perfil transcriptômico da cepa CI010 para identificar promotores que são ativos na presença de nitrogênio ambiental. A cepa CI010 foi cultivada em um meio definido, isento de nitrogênio suplementado com glutamina 10 mM. O RNA total foi extraído dessas culturas (kit QIAGEN RNeasy) e submetido ao sequenciamento de RNAseq via Illumina HiSeq (SeqMatic, Fremont CA). As leituras de sequenciamento foram mapeadas para os dados do genoma CI010 usando Geneious, e genes altamente expressos sob controle de promotores transcricionais proximais foram identificados.

[401] As Tabelas 21-23 listam genes e seu nível de expressão relativa conforme medido por meio de sequenciamento RNASeq de RNA total. As sequências dos promotores proximais foram registradas para uso na mutagênese de vias de nif, vias relacionadas à utilização de nitrogênio ou outros genes com um nível de expressão desejado. TABELA 21 Nome Mínimo Máximo Comprimento Direção CDS de lipoproteína mureína 2.929.898 2930134 237 direto CDS de proteína de membrana 5.217.517 5.217.843 327 direto proteína de ligação a

3.479.979 3.480.626 648 direto zinco/cádmio CDS CDS de proteína transportadora

4.563.344 4563580 237 reverso de acila CDS de ompX 4.251.002 4.251.514 513 direto CDS de Proteína de ligação a

375.156 375428 273 direto DNA HU-beta CDS de sspA 629.998 630636 639 reverso CDS de tatE 3.199.435 3.199.638 204 reverso CDS de repressor LexA 1.850.457 1.851.065 609 direto CDS de hisS <3999979 4.001.223 >1245 direto

TABELA 22

RNASeq RNASeq RNASe RNASeq Confiança _ _ Razão de q_WT - _WT - Absoluta nifL - nifL - Expressão Contag Contage Nome de Contage Contage Diferencia em de m de Expressão m de m de l Leitura Transcriç Diferencial Leitura Transcriç Bruta ão Bruta Bruta ão Bruta CDS de lipoproteína 1000 -1,8 12950,5 10078,9 5151,5 4106,8 mureína CDS de proteína de 1000 -1,3 9522,5 5371,3 5400 3120 membrana CDS de proteína de ligação a 3,3 1,1 6461 1839,1 5318 1550,6 zinco/cádmi o CDS de proteína 25,6 1,6 1230,5 957,6 1473,5 1174,7 transportad ora de acila ompX CDS 1,7 1,1 2042 734,2 1687,5 621,5 CDS de Proteína de ligação a 6,9 -1,3 1305 881,7 725 501,8 DNA HU- beta CDS de 0,2 1 654 188,8 504,5 149,2 sspA CDS de 1,4 1,3 131 118,4 125 115,8 tatE CDS de repressor 0,1 -1,1 248 75,1 164 50,9 LexA CDS de 0 -1,1 467 69,2 325 49,3 hisS

TABELA 23

Prm (Na direção Sequência Sequência Nome direta, região - Expressa Vizinha 250 a +10) SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: CDS de lipoproteína SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 23 mureína CDS de proteína de SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 24 membrana CDS de proteína de SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 25 ligação a zinco/cádmio CDS de proteína SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 26 transportadora de acila CDS de ompX SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 27 CDS de Proteína de SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 28 ligação a DNA HU-beta CDS de sspA SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 29 CDS de tatE SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 30 CDS de repressor LexA SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 31 CDS de hisS SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 32

TABELA 24 - TABELA DE CEPAS Mutaçã Descrição do DNA Mutação Nome Linhagem Genótipo o do mutagênico do gene 2 gene 1 Cepa isolada do gênero CI006 Enterobacter Nenhum WT (agora Kosakonia) Cepa isolada CI008 do gênero Nenhum WT Burkholderia Cepa isolada CI010 do gênero Nenhum WT Klebsiella Cepa isolada CI019 do gênero Nenhum WT Rahnella

Mutaçã Descrição do DNA Mutação Nome Linhagem Genótipo o do mutagênico do gene 2 gene 1 Cepa isolada CI028 do gênero Nenhum WT Enterobacter Cepa isolada CI050 do gênero Nenhum WT Klebsiella Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de resistência à CM00 Mutante de canamicina (KanR) SEQ ID ΔnifL::KanR 2 CI050 que codifica o gene NO: 33 aph1 da aminoglicosídeo O- fosfotransferase inserido.

Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de resistência à CM01 Mutante de espectinomicina ΔnifL::Spec SEQ ID 1 CI019 (SpecR) que codifica R NO: 34 o gene de estreptomicina 3 '' - O-adenililtransferase aadA inserido.

Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de resistência à CM01 Mutante de canamicina (KanR) SEQ ID ΔnifL::KanR 3 CI006 que codifica o gene NO: 35 aph1 da aminoglicosídeo O- fosfotransferase inserido.

Ruptura do gene amtB com um CM00 Mutante de cassete de expressão ΔamtB::Kan SEQ ID 4 CI010 de resistência à R NO: 36 canamicina (KanR) que codifica o gene

Mutaçã Descrição do DNA Mutação Nome Linhagem Genótipo o do mutagênico do gene 2 gene 1 aph1 da aminoglicosídeo O- fosfotransferase inserido.

Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de resistência à CM00 Mutante de canamicina (KanR) SEQ ID ΔnifL::KanR 5 CI010 que codifica o gene NO: 37 aph1 da aminoglicosídeo O- fosfotransferase inserido.

Ruptura do gene nifL com um fragmento da CM01 Mutante de SEQ ID região a montante do ΔnifL::Prm5 5 CI006 NO: 38 gene ompX inserido (Prm5). Ruptura do gene nifL com um fragmento da região a montante de CM02 Mutante de SEQ ID um gene não anotado ΔnifL::Prm2 1 CI006 NO: 39 e os primeiros 73 pb desse gene inserido (Prm2). Ruptura do gene nifL com um fragmento da região a montante do CM02 Mutante de SEQ ID gene acpP e os ΔnifL::Prm4 3 CI006 NO: 40 primeiros 121pb do gene acpP inserido (Prm4). Ruptura do gene nifL com um fragmento da região a montante do CM01 Mutante de SEQ ID gene Ipp e os ΔnifL::Prm1 4 CI006 NO: 41 primeiros 29pb do gene Ipp inserido (Prm1). CM01 Mutante de Ruptura do gene nifL SEQ ID ΔnifL::Prm9 6 CI006 com um fragmento da NO: 42

Mutaçã Descrição do DNA Mutação Nome Linhagem Genótipo o do mutagênico do gene 2 gene 1 região a montante do gene lexA 3 e os primeiros 21pb do gene IexA3 inserido (Prm9). Ruptura do gene nifL com um fragmento da região a montante do CM02 Mutante de SEQ ID gene mntP 1 e os ΔnifL::Prm3 2 CI006 NO: 43 primeiros 53pb do gene mntP 1 inserido (Prm3). Ruptura do gene nifL com um fragmento da CM02 Mutante de SEQ ID região a montante do ΔnifL::Prm7 4 CI006 NO: 44 gene sspA inserido (Prm7). Ruptura do gene nifL com um fragmento da região a montante do CM02 Mutante de ΔnifL::Prm1 SEQ ID gene hisS e os 5 CI006 0 NO: 45 primeiros 52pb do gene hisS inserido (Prm10). Ruptura do gene gInB com um cassete de expressão de resistência à CM00 Mutante de canamicina (KanR) ΔglnB::Kan SEQ ID 6 CI010 que codifica o gene R NO: 46 aph1 da aminoglicosídeo O- fosfotransferase inserido.

Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de CM01 Mutante de resistência à SEQ ID ΔnifL::KanR 7 CI028 canamicina (KanR) NO: 47 que codifica o gene aph1 da aminoglicosídeo O-

Mutaçã Descrição do DNA Mutação Nome Linhagem Genótipo o do mutagênico do gene 2 gene 1 fosfotransferase inserido.

Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de resistência à CM01 Mutante de espectinomicina ΔnifL::Spec SEQ ID 1 CI019 (SpecR) que codifica R NO: 48 o gene de estreptomicina 3 '' - O-adenililtransferase aadA inserido.

Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de resistência à CM01 Mutante de canamicina (KanR) SEQ ID ΔnifL::KanR 3 CI006 que codifica o gene NO: 49 aph1 da aminoglicosídeo O- fosfotransferase inserido.

Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de resistência à CM00 Mutante de canamicina (KanR) SEQ ID ΔnifL::KanR 5 CI010 que codifica o gene NO: 50 aph1 da aminoglicosídeo O- fosfotransferase inserido.

Ruptura do gene nifL com um fragmento da região a montante do CM01 Mutante de SEQ ID gene Ipp e os ΔnifL::Prm1 4 CI006 NO: 51 primeiros 29pb do gene Ipp inserido (Prm1). Ruptura do gene nifL CM01 Mutante de SEQ ID com um fragmento da ΔnifL::Prm5 5 CI006 NO: 52 região a montante do

Mutaçã Descrição do DNA Mutação Nome Linhagem Genótipo o do mutagênico do gene 2 gene 1 gene ompX inserido (Prm5). Ruptura do gene nifL com um fragmento da região a montante do CM02 Mutante de SEQ ID gene acpP e os ΔnifL::Prm4 3 CI006 NO: 53 primeiros 121pb do gene acpP inserido (Prm4). Ruptura do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene ompX inserido (Prm5) e deleção do 1287pb após o códon ΔnifL::Prm5 CM02 Mutante de de início do gene SEQ ID SEQ ID ΔglnE- 9 CI006 glnE contendo o NO: 54 NO: 61 AR_KO1 domínio de remoção de adenilila de glutamato-amônia- ligase adenililtransferase (ΔglnE-AR_KO1). Ruptura do gene nifL com um fragmento da região a montante do CM01 Mutante de SEQ ID gene Ipp e os ΔnifL::Prm1 4 CI006 NO: 55 primeiros 29pb do gene Ipp inserido (Prm1). Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de resistência à CM01 Mutante de espectinomicina ΔnifL::Spec SEQ ID 1 CI019 (SpecR) que codifica R NO: 56 o gene de estreptomicina 3 '' - O-adenililtransferase aadA inserido.

CM01 Mutante de Ruptura do gene nifL ΔnifL::Spec SEQ ID 1 CI019 com um cassete de R NO: 57

Mutaçã Descrição do DNA Mutação Nome Linhagem Genótipo o do mutagênico do gene 2 gene 1 expressão de resistência à espectinomicina (SpecR) que codifica o gene de estreptomicina 3 '' - O-adenililtransferase aadA inserido. Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de resistência à CM01 Mutante de canamicina (KanR) SEQ ID ΔnifL::KanR 3 CI006 que codifica o gene NO: 58 aph1 da aminoglicosídeo O- fosfotransferase inserido. Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de resistência à CM01 Mutante de espectinomicina ΔnifL::Spec SEQ ID 1 CI019 (SpecR) que codifica R NO: 59 o gene de estreptomicina 3 '' - O-adenililtransferase aadA inserido. Ruptura do gene nifL com um cassete de expressão de resistência à CM01 Mutante de espectinomicina ΔnifL::Spec SEQ ID 1 CI019 (SpecR) que codifica R NO: 60 o gene de estreptomicina 3 '' - O-adenililtransferase aadA inserido.

POLÍMEROS

[402] Em alguns aspectos, os polímeros da presente divulgação são contemplados para aumentar a estabilidade e/ou viabilidade de bactérias armazenadas durante um período de tempo a temperaturas diferentes. A presente divulgação contempla uma grande variedade de polímeros, incluindo: polímeros sintéticos, polímeros de ocorrência natural, copolímeros, polímeros de fase seca, polímeros de fase úmida, polímeros semi-secos, polímeros de gel, polímeros microporosos, polímeros de emulsão, polímeros formadores de filme, alosferas (nanomateriais poliméricos), polímeros eletrofiados, polímeros reticulados e combinações dos mesmos.

[403] Em alguns aspectos, o polímero é um polímero de ocorrência natural. Em alguns aspectos, o polímero é produzido por uma planta ou parte da planta. Em alguns aspectos, o polímero é derivado de uma planta, parte da planta ou substância da mesma. Em alguns aspectos, o polímero é produzido por um animal ou parte de um animal. Em alguns aspectos, o polímero é derivado de um animal, parte de animal ou substância do mesmo. Em alguns aspectos, o polímero é produzido por um micróbio, como uma alga, protista, bactéria ou fungo. Em alguns aspectos, o polímero é derivado de um micróbio ou de uma substância do mesmo. Em alguns aspectos, o polímero éum exopolímero. Em alguns aspectos, o polímero é um endopolímero.

[404] Em alguns aspectos, o polímero contém apenas unidades de repetição de um tipo de monômero. Em alguns aspectos, o polímero contém unidades de repetição de mais de um tipo de monômero (copolímero). Em alguns aspectos, a estrutura do polímero é um polímero linear - um polímero linear. Em alguns aspectos, a estrutura do polímero é um polímero ramificado - um polímero ramificado. Em alguns aspectos, a estrutura do polímero é um polímero de rede. Em alguns aspectos, o polímero é um polímero de rede interpenetrante.

[405] Em alguns aspectos, o polímero é submetido à eletrofiação para gerar fibras poliméricas finas em escala submícron e nanomícron a partir de soluções de polímero usando alta voltagem elétrica.

[406] Em alguns aspectos, o polímero é selecionado a partir de: polivinilpirrolidona, copolímero de polivinilpirrolidona-acetato de vinila (PVP-VA), 2- pirrolidinona, 1-etenilexadecila-, homopolímero, carragenina, alginato de sódio, hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), polietilenoglicol, goma arábica, maltodextrina,

alginato de sódio, alginato, goma xantana, carboximetilcelulose (CMC), carboximetilcelulose de sódio (Na-CMC), amido BR-07, amido BR-08, amido e derivados de amido, pululano, quitosano, glicosaminoglicanos (GAGs), sulfato de queratina GAG, ácido hialurônico GAG, sulfato de heparina GAG, sulfato de condroitina GAG, fibrina polimerizada, polimetilcrilato, ácido poliacrílico, ácido polimetacrílico, estireno-butadieno, acrílico, estireno-acrílico, acetato de vinila, polímero à base de tocoferil polietilenoglicol (TPG) e ácido poli(lático-co-glicólico) (PLGA), etc.

[407] Em alguns aspectos, o polímero é uma proteína. Em alguns aspectos, a proteína pode ser selecionada a partir de proteína de soja, proteína de ervilha, proteína de soro de leite, proteína de cânhamo e componentes de proteína de leite (como leite desnatado). Em alguns aspectos, a proteína de soja, proteína de ervilha, proteína de soro de leite e proteína de cânhamo são isolados de proteínas totais da planta ou da parte específica da planta descrita no nome.

[408] Em alguns aspectos, os derivados de amido são selecionados a partir de amido tratado com ácido (INS 1401), dextrina (INS 1400), amido modificado alcalino (INS 1402), amido branqueado (INS 1403), amido oxidado (INS 1404), amido tratado com enzima (INS 1405), fosfato de monoamido (INS 1410), fosfato de di-amido (INS 1412), amido acetilado (INS 1420), amido hidroxipropilado (INS 1440), amido hidroxietilado com óxido de etileno, octenilsuccinato de sódio e amido (INS 1450), octenil succinato de alumínio e amido (INS 1452), amido catiônico, amido carobximetilado com ácido monocloroacético. Os derivados de amido podem ser combinados com as seguintes modificações: fosfato de fosfato de di-amido (INS 1413), fosfato de di-amido acetilado (INS 1414), adipato de di-amido acetilado (INS 1422), fosfato de di-amido de hidroxipropila (INS 1422), amido oxidado acetilado (INS 1451).

[409] Em alguns aspectos, o polímero é capaz de formar um hidrogel, que é uma rede de cadeias de polímero insolúvel em água e superabsorvente (por exemplo, o hidrogel pode conter mais de 99% de água. Os hidrogéis também possuem um alto grau de flexibilidade similar ao tecido natural, devido ao seu teor de água significativo.

[410] As bactérias podem ser preservadas em polímeros. Consultar Rojas-

Tapias et al. 2015 Preservação de células vegetativas de Azotobacter chroococcum em polímeros secos. Universitas Scientiarum. 20(2):201-207; Amalraj et al. 2013 Efeito de aditivos poliméricos, adjuvantes, tensoativos sobre a sobrevivência, estabilidade e capacidade de promoção do crescimento vegetal de bioinoculantes líquidos. J Plant Physiol Pathol. 1(2):1-5; Nagy et al. 2014. Forma de dosagem sólida nanofibrosa de bactérias vivas preparada por eletrofiação. eXPRESS Polymer Letters. 8(5):352-361.

COMPOSIÇÕES DE POLÍMERO

[411] Em alguns aspectos, a composição de polímero é uma combinação de um ou polímero com qualquer um ou mais micróbios da presente divulgação. Em alguns aspectos, a composição de polímero compreende qualquer uma ou mais bactérias da presente divulgação. Em alguns aspectos, a composição de polímero compreende qualquer um ou mais micróbios fixadores de nitrogênio da presente divulgação. Em alguns aspectos, a composição de polímero não compreende quaisquer micróbios. Em alguns aspectos, a composição do polímero é estéril.

[412] Em alguns aspectos, a composição do polímero é uma combinação de dois ou mais polímeros. Em alguns aspectos, a composição de polímero compreende uma única espécie microbiana, formando uma cultura pura. Em alguns aspectos, a composição de polímero compreende um consórcio de bactérias. Em alguns aspectos, a composição de polímero compreende uma ou mais espécies microbianas. Em alguns aspectos, a composição de polímero compreende pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9 ou pelo menos 10 espécies microbianas.

[413] Em alguns aspectos, a composição de polímero é um líquido. Em alguns aspectos, a composição de polímero é um sólido. Em alguns aspectos, a composição de polímero compreende elementos sólidos e líquidos. Em alguns aspectos, a composição de polímero é um semissólido. Em alguns aspectos, a composição de polímero é um gel. Em alguns aspectos, a composição do polímero é seca. Em alguns aspectos, a composição de polímero está sob a forma de uma areia ou material granular. Em alguns aspectos, a composição de polímero é um pó. Em alguns aspectos, a composição de polímero compreende qualquer um ou mais elementos divulgados no presente documento.

[414] Em alguns aspectos, a composição de polímero pode compreender um ou mais biofilmes microbianos. Em alguns aspectos, o biofilme é heterólogo ao um ou mais micróbios da composição de polímero. Em alguns aspectos, a composição de polímero pode compreender um ou mais biofilmes microbianos em combinação com outros polímeros. Em aspectos, a combinação de um polímero e biofilme exibe um efeito sinérgico.

[415] Em algumas modalidades, a combinação de pelo menos dois polímeros da presente divulgação exibe um efeito sinérgico, sobre um ou mais traços descritos no presente documento, na presença de um ou mais polímeros que entram em contato entre si. O efeito sinérgico obtido pelos métodos ensinados pode ser quantificado, por exemplo, de acordo com a fórmula de Colby (ou seja, (E) = X+Y – (X*Y/100)). Consultar Colby, R.S., “Calculating Synergistic and Antagonistic Responses of Herbicide Combinations”, 1967. Weeds. Vol. 15, pp. 20-22, incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade. Dessa forma, "sinérgico" se destina a refletir um resultado/parâmetro/efeito que foi aumentado em mais do que uma quantidade aditiva.

[416] Em alguns aspectos, as bactérias da presente divulgação são secas/dessecadas de modo que uma pluralidade de células permaneça viável. Em algumas modalidades, as células bacterianas secas/dessecadas são introduzidas na composição de polímero. Em alguns aspectos, as bactérias são introduzidas no polímero conforme o polímero está sendo formado. Em alguns aspectos, as bactérias são introduzidas no polímero conforme o polímero está sendo reticulado. Em algumas modalidades, as bactérias são pulverizadas ou revestidas com o polímero. Em alguns aspectos, as bactérias são misturadas ao polímero. Em algumas modalidades, as bactérias estão sob a forma de uma biomassa líquida. Em alguns aspectos, as bactérias estão sob a forma de uma pasta concentrada. Em alguns aspectos, as bactérias estão sob a forma de um gel.

[417] Em alguns aspectos, a composição de polímero é um sólido. Em alguns aspectos, a composição do polímero é moída para criar areia/granules. Em alguns aspectos, a composição de polímero é moída para criar partículas do tamanho de cerca de 10 mícrons, cerca de 20 mícrons, cerca de 30 mícrons, cerca de 40 mícrons, cerca de 50 mícrons, cerca de 60 mícrons, cerca de 70 mícrons,

cerca de 80 mícrons, cerca de 90 mícrons, cerca de 100 mícrons, cerca de 150 mícrons, cerca de 200 mícrons, cerca de 250 mícrons, cerca de 300 mícrons, cerca de 350 mícrons, cerca de 400 mícrons, cerca de 450 mícrons, cerca de 500 mícrons, cerca de 550 mícrons, cerca de 600 mícrons, cerca de 650 mícrons, cerca de 700 mícrons, cerca de 750 mícrons, cerca de 800 mícrons, cerca de 850 mícrons, cerca de 900 mícrons, cerca de 950 mícrons ou cerca de 1000 mícrons.

[418] Em alguns aspectos, a composição de polímero é combinada com uma cera, gordura, óleo, ácido graxo, álcool graxo, ou outros compostos químicos com propriedades físicas-químicas similares e congelada por pulverização em microesferas de cerca de 10 mícrons, cerca de 20 mícrons, cerca de 30 mícrons, cerca de 40 mícrons, cerca de 50 mícrons, cerca de 60 mícrons, cerca de 70 mícrons, cerca de 80 mícrons, cerca de 90 mícrons, cerca de 100 mícrons, cerca de 150 mícrons, cerca de 200 mícrons, cerca de 250 mícrons, cerca de 300 mícrons, cerca de 350 mícrons, cerca de 400 mícrons, cerca de 450 mícrons, cerca de 500 mícrons, cerca de 550 mícrons, cerca de 600 mícrons, cerca de 650 mícrons, cerca de 700 mícrons, cerca de 750 mícrons, cerca de 800 mícrons, cerca de 850 mícrons, cerca de 900 mícrons, cerca de 950 mícrons ou cerca de 1000 mícrons.

[419] Em alguns aspectos, as composições de polímero da divulgação encapsulam os micróbios. Em algumas modalidades, os micróbios são encapsulados por um ou mais compostos diferentes das composições de polímero da presente divulgação. Em alguns aspectos, os micróbios são encapsulados e, então, adicionados/expostos às composições de polímero. Em alguns aspectos, os micróbios são adicionados/expostos às composições de polímero e, então, encapsulados com material adicional.

[420] A composição (ou composições) de encapsulamento da presente divulgação protegem os micróbios contra estressores externos, como temperatura, radiação, etc. Em alguns aspectos, os estressores externos incluem estressores físicos e térmicos. Em alguns aspectos, os estressores externos incluem produtos químicos presentes nas composições. As composições de encapsulação criam, ainda, um ambiente que pode ser benéfico aos micróbios, como minimizando o estresse oxidativo de um ambiente aeróbico em micróbios anaeróbicos. Consultar

Kalsta et al. (US 5.104.662A), Ford (US 5.733.568A) e Mosbach e Nilsson (US

4.647.536A) quanto a composições de encapsulação de micróbios e métodos de encapsulação de micróbios.

[421] Em alguns aspectos, as composições da presente divulgação exibem uma tolerância térmica, que é usada de forma intercambiável com tolerância ao calor e resistência ao calor. Em alguns aspectos, as composições da presente divulgação exibem uma tolerância térmica em um ambiente não refrigerado. Em alguns aspectos, as composições da presente divulgação exibem uma tolerância térmica à temperatura ambiente. Em alguns aspectos, as composições da presente divulgação exibem uma tolerância térmica a temperaturas de cerca de 4 ºC, cerca de 6 ºC, cerca de 10 ºC, cerca de 12 ºC, cerca de 14 ºC, cerca de 16 ºC, cerca de 18 ºC, cerca de 20 ºC, cerca de 22 ºC, cerca de 24 ºC, cerca de 26 ºC, cerca de 28 ºC, cerca de 30 ºC, cerca de 32 ºC, cerca de 34 ºC, cerca de 36 ºC, cerca de 38 ºC, cerca de 40 ºC ou cerca de 42 ºC. Em alguns aspectos, as composições da presente divulgação exibem uma tolerância térmica a temperaturas de pelo menos 4 ºC, pelo menos 6 ºC, pelo menos 10 ºC, pelo menos 12 ºC, pelo menos 14 ºC, pelo menos 16 ºC, pelo menos 18 ºC, pelo menos 20 ºC, a pelo menos 22 ºC, pelo menos 24 ºC, pelo menos 26 ºC, pelo menos 28 ºC, pelo menos 30 ºC, pelo menos 32 ºC, pelo menos 34 ºC, pelo menos 36 ºC, pelo menos 38 ºC, pelo menos 40 ºC, pelo menos 42 ºC, pelo menos 44 ºC, pelo menos 46 ºC , pelo menos 48 ºC, pelo menos 50 ºC, pelo menos 52 ºC, pelo menos 54 ºC, pelo menos 56 ºC, pelo menos 58 ºC, ou pelo menos 60 ºC.

[422] Em alguns aspectos, as composições tolerantes ao calor da presente divulgação são tolerantes às altas temperaturas associadas ao armazenamento em ambientes de alto calor, etc. Em alguns aspectos, as composições tolerantes ao calor da presente divulgação são resistentes à eliminação do calor e à desnaturação dos componentes de parede celular e o ambiente intracelular.

[423] Em alguns aspectos, o encapsulamento é um encapsulamento do tipo reservatório. Em alguns aspectos, o encapsulamento é um encapsulamento do tipo matriz. Em alguns aspectos, o encapsulamento éum encapsulamento do tipo matriz revestida. Burgain et al. (2011. J. Food Eng. 104:467-483) divulga inúmeras modalidades e técnicas de encapsulamento, todas as quais estão incorporadas a título de referência.

[424] Em alguns aspectos, as composições da presente divulgação são encapsuladas em um ou mais dos seguintes: goma gelana, goma xantana, K- Carragenina, acetato ftalato de celulose, quitosana, amido, derivados de amido, gordura do leite, proteína de soro de leite, alginato, alginato de Ca, alginato de Mg, raftilose, raftilina, pectina, sacarídeo, glicose, maltodextrina, goma arábica, guar, farinha de semente, alginato, dextrinas, dextranos, celulose, gelatina, gelatina, albumina, caseína, glúten, goma acácia, tragacanto, cera, parafina, ácido esteárico, silicatos, monodiglicerídeos e diglicerídeos. Em algumas modalidades, as composições da presente divulgação são encapsuladas por um ou mais de um polímero, carboidrato, açúcar, plástico, vidro, polissacarídeo, lipídeo, cera, óleo, ácido graxo ou glicerídeo.

[425] Em alguns aspectos, o encapsulamento das composições da presente divulgação é realizado por uma extrusão, emulsificação, revestimento, aglomeração, liofilização, vitrificação, secagem de espuma, preservação por vaporização, secagem a vácuo, eletrofiação ou secagem por pulverização.

[426] Em alguns aspectos, a composição de encapsulamento compreende microcápsulas com uma multiplicidade de núcleos líquidos encapsulados em um material de cápsula sólida. Para fins da divulgação, uma "multiplicidade" de núcleos é definida como dois ou mais. Em alguns aspectos, a composição de encapsulamento compreende uma multiplicidade de núcleos sólidos. Em alguns aspectos, a composição de encapsulamento compreende uma multiplicidade de dois ou mais tipos de núcleos sólidos. Em alguns aspectos, os tipos de núcleos sólidos diferem pelo tempo de liberação. Em alguns aspectos, a composição de encapsulamento compreende uma multiplicidade de dois ou mais tipos de núcleos sólidos, em que pelo menos um tipo de núcleo sólido fornece liberação rápida do conteúdo após a administração e pelo menos um tipo de núcleo sólido fornece liberação lenta do conteúdo após a administração; produzindo assim uma composição que administra uma inoculação sustentada de micróbios por um período de tempo.

[427] Em alguns aspectos, vários materiais auxiliares são contemplados para uso individualmente ou em combinação com outros materiais de acordo com a presente divulgação. Em alguns aspectos, os materiais auxiliares podem ser selecionados a partir de: antioxidantes, estabilizadores de luz, corantes e lacas, óleos essenciais, agentes antiformação de torta, cargas, estabilizantes de pH, dispersantes, antiespumantes, agentes umectantes, agentes de acoplamento, açúcares (monossacarídeos, dissacarídeos trissacarídeos e polissacarídeos) e similares podem ser incorporados no material fusível em quantidades que não diminuem sua utilidade para a presente divulgação.

[428] Em alguns aspectos, o polímero é introduzido em meios líquidos compreendendo qualquer uma ou mais bactérias da presente divulgação. Em alguns aspectos, o polímero é introduzido em meios líquidos compreendendo qualquer uma ou mais bactérias da presente divulgação a uma % em peso de pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% ou 90%

[429] Em alguns aspectos, o polímero é introduzido em meio líquido compreendendo qualquer uma ou mais bactérias em um volume de 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9: ou 10:1.

[430] Em alguns aspectos, a composição de polímero pode compreender uma emulsão. Em alguns aspectos, a composição de polímero pode ser uma emulsão. Em alguns aspectos, a composição de polímero pode compreender uma nanoemulsão. Em alguns aspectos, a composição de polímero pode ser uma nanoemulsão.

[431] Emulsões se referem a uma mistura de dois ou mais líquidos que são, em circunstâncias padrão, normalmente imiscíveis (não misturáveis ou incapazes de serem misturados). Um exemplo de emulsão poderia ser um vinagrete.

[432] As nanoemulsões diferem das emulsões pelo fato de que os tamanhos das gotículas são iguais ou menores que 250 nm. As nanoemulsões não se formam espontaneamente; um cisalhamento externo deve ser aplicado para romper as gotículas maiores formando outras menores. As nanoemulsões e emulsões em nanoescala são usadas como sinônimos para o mesmo termo na presente divulgação.

[433] Em algumas modalidades, emulsões e nanoemulsões são criadas na presença de um agente emulsificante. Em algumas modalidades, os agentes emulsificantes podem ser selecionados, porém sem limitação, a partir dos seguintes; acompanhado do número de registro CAS correspondente: Estearato de amônio, 1002-89-7; Palmitato de ascorbila, 137-66-6; Estearato de butila, 123-95- 5; Estearato de cálcio, 1592-23-0; Mono-oleato de diglicerila, 49553-76-6; Monoestearato de diglicerila, 12694-22-3; Ácido dodecanoico, monoéster com 1,2,3-propanotriol, 27215-38-9; Mono-oleato de glicerol, 111-03-5; Dicaprilato de glicerila, 36354-80-0; Dimiristato de glicerila, 53563-63-6; Dioleato de glicerila, 25637-84-7; Diestearato de glicerila, 1323-83-7; Monomiristato de glicerila, 27214- 38-6; Mono-octanoato de glicerila, 26402-26-6; Mono-oleato de glicerila, 25496-72- 4; Monoestearato de glicerila, 31566-31-1; Estearato de glicerila, 11099-07-3; Miristato de isopropila, 110-27-0; Lecitinas, 8002-43-5; 1-Monolaurina, 142-18-7; 1- Monomiristina, 589-68-4; Monopalmitina, 26657-96-5; Ácido octanoico, sal de potássio, 764-71-6; Ácido octanoico, sal de sódio, 1984-06-1; Ácido oleico, 112-80- 1; Ácido palmítico, 57-10-3; Oleato de poliglicerila, 9007-48-1; Estearato de poliglicerila, 9009-32-9; Monolaurato de polioxietileno sorbitano (Tween 20), 9005- 64-5; Miristato de potássio, 13429-27-1; Oleato de potássio, 143-18-0; Estearato de potássio, 593-29-3; Oleato de sódio, 143-19-1; Estearato de sódio, 822-16-2; Lecitinas de soja, 8030-76-0; Succinato de tocoferil polietilenoglicol (TPGS), 9002- 96-4; Vitamina E, 1406-18-4; 557-05-1 e Estearato de zinco, 557-05-1.

[434] Em algumas modalidades, as nanoemulsões compreendem gotículas que são menores do que ou cerca de 250 nm, 245 nm, 240 nm, 235, nm 230 nm, 225 nm, 220 nm, 215 nm, 210 nm, 205, nm 200 nm, 195 nm , 190 nm, 185 nm, 180 nm, 175 nm, 170 nm, 165 nm, 160 nm, 155 nm, 150 nm, 145 nm, 140 nm, 135 nm, 130 nm, 125 nm, 120 nm, 115 nm, 110 nm, 105 nm, 100 nm, 95 nm, 90 nm, 85 nm, 80 nm, 75 nm, 70 nm, 65 nm, 60 nm, 55 nm, 50 nm, 45 nm, 40 nm, 35 nm, 30 nm, 25 nm, 20 nm, 15 nm, 10 nm, 5 nm, 4 nm, 3 nm, 2 nm ou 1 nm; em que o modificador a ou cerca de se aplica a cada um dos tamanhos especificados acima.

[435] Em algumas modalidades, as nanoemulsões compreendem gotículas que estão na faixa de tamanho entre cerca de 1 nm a 5 nm, 1 nm a 10 nm, 1 nm a 50 nm, 1 nm a 100 nm, 1 nm a 150 nm, 1 nm a 200 nm , 1 nm a 250 nm, 5 nm a 10 nm, 5 nm a 50 nm, 5 nm a 100 nm, 5 nm a 150 nm, 5 nm a 200 nm, 2 nm a 250 nm, 10 nm a 50 nm, 10 nm a 100 nm, 10 nm a 150 nm, 10 a 200 nm, 10 nm a 250 nm,

25 nm a 50 nm, 25 nm a 100 nm, 25 nm a 150 nm, 25 nm a 200 nm, 25 nm a 250 nm, 50 nm a 100 nm, 50 nm a 150 nm, 50 nm a 200 nm, 50 nm a 250 nm, 100 nm a 150 nm, 100 nm a 200 nm, 100 nm a 250 nm, 150 nm a 200 nm, 150 nm a 250 nm e 200 nm a 250 nm; em que o modificador cerca de se aplica a cada uma das faixas acima.

[436] O teor de umidade é uma medida da quantidade total de água em uma composição, geralmente expressa como uma porcentagem do peso total. O teor de umidade éuma medida útil para determinar o peso seco de uma composição e pode ser usado para confirmar se o processo de dessecação/secagem de uma composição está completo. O teor de umidade é calculado dividindo o (peso úmido da composição menos o peso após a dessecação/secagem) pelo peso úmido da composição e multiplicando por 100.

[437] O teor de umidade define a quantidade de água em uma composição, porém a atividade da água está mais relacionada a como a água na composição irá reagir com os microrganismos. Quanto maior a atividade da água, mais rápido os microrganismos são capazes de crescer. A atividade da água é calculada encontrando a razão entre a pressão de vapor em uma composição e a pressão de vapor de água pura. Mais especificamente, a atividade de água é a pressão de vapor parcial da água em uma composição dividida pela pressão de vapor parcial do estado padrão de água pura. Água pura tem uma atividade de água de 1. Uma determinação da atividade de água de uma composição não é a quantidade de água em uma composição, mas sim uma medida da disponibilidade da água para o crescimento microbiano. Os microrganismos têm uma atividade de água mínima e ideal para o crescimento.

[438] Em um aspecto, as composições de polímero da presente divulgação são dessecadas. Uma composição microbiana é dessecada se o teor de umidade da composição estiver entre 0% e 20%.

[439] Em um aspecto, as composições de polímero da presente divulgação têm um teor de umidade de cerca de 0,5%, cerca de 0,6%, cerca de 0,7%, cerca de 0,8%, cerca de 0,9%, cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 17%, cerca de 18%, cerca de 19%, cerca de 20%, cerca de 21%, cerca de 22%, cerca de 23%, cerca de 24%, cerca de 25%, cerca de 26%, cerca de 27%, cerca de 28%, cerca de 29%, cerca de 30%, cerca de 31%, cerca de 32%, cerca de 33%, cerca de 34%, cerca de 35%, cerca de 36%, cerca de 37%, cerca de 38%, cerca de 39%, cerca de 40%, cerca de 41%, cerca de 42%, cerca de 43%, cerca de 44%, cerca de 45%, cerca de 46%, cerca de 47%, cerca de 48%, cerca de 49%, cerca de 50%, cerca de 51%, cerca de 52%, cerca de 53%, cerca de 54%, cerca de 55%, cerca de 56%, cerca de 57%, cerca de 58%, cerca de 59%, cerca de 60%, cerca de 61%, cerca de 62%, cerca de 63%, cerca de 64%, cerca de 65%, cerca de 66%, cerca de 67%, cerca de 68%, cerca de 69%, cerca de 70%, cerca de 71%, cerca de 72%, cerca de 73%, cerca de 74%, cerca de 75%, cerca de 76%, cerca de 77%, cerca de 78%, cerca de 79%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou cerca de 100%.

[440] Em um aspecto, as composições de polímero da presente divulgação têm um teor de umidade menor que 0,5%, menor que 0,6%, menor que 0,7%, menor que 0,8%, menor que 0,9%, menor que 1%, menor que 2%, menor que 3%, menor que 4%, menor que 5%, menor que 6%, menor que 7%, menor que 8%, menor que 9%, menor que 10%, menor que 11%, menor que 12%, menor que 13%, menor que 14%, menor que 15%, menor que 16%, menor que 17%, menor que 18%, menor que 19%, menor que 20%, menor que 21%, menor que 22%, menor que 23%, menor que 24%, menor que 25%, menor que 26%, menor que 27%, menor que 28%, menor que 29%, menor que 30%, menor que 31%, menor que 32%, menor que 33%, menor que 34%, menor que 35%, menor que 36%, menor que 37%, menor que 38%, menor que 39%, menor que 40%, menor que 41%, menor que 42%, menor que 43%, menor que 44%, menor que 45%, menor que 46%, menor que 47%, menor que 48%, menor que 49%, menor que 50%, menor que 51%, menor que 52%, menor que 53%, menor que 54%, menor que 55%, menor que 56%, menor que 57%, menor que 58%, menor que 59%, menor que 60%, menor que 61%, menor que 62%, menor que 63%, menor que 64%, menor que 65%,

menor que 66%, menor que 67%, menor que 68%, menor que 69%, menor que 70%, menor que 71%, menor que 72%, menor que 73%, menor que 74%, menor que 75%, menor que 76%, menor que 77%, menor que 78%, menor que 79%, menor que 80%, menor que 81%, menor que 82%, menor que 83%, menor que 84%, menor que 85%, menor que 86%, menor que 87%, menor que 88%, menor que 89%, menor que 90%, menor que 91%, menor que 92%, menor que 93%, menor que 94%, menor que 95%, menor que 96%, menor que 97%, menor que 98%, menor que 99% ou menor que 100%.

[441] Em um aspecto, as composições de polímero da presente divulgação têm um teor de umidade menor que cerca de 0,5%, menor que cerca de 0,6%, menor que cerca de 0,7%, menor que cerca de 0,8%, menor que cerca de 0,9%, menor que cerca de 1%, menor que cerca de 2%, menor que cerca de 3%, menor que cerca de 4%, menor que cerca de 5%, menor que cerca de 6%, menor que cerca de 7%, menor que cerca de 8%, menor que cerca de 9%, menor que cerca de 10%, menor que cerca de 11%, menor que cerca de 12%, menor que cerca de 13%, menor que cerca de 14%, menor que cerca de 15%, menor que cerca de 16%, menor que cerca de 17%, menor que cerca de 18%, menor que cerca de 19%, menor que cerca de 20%, menor que cerca de 21%, menor que cerca de 22%, menor que cerca de 23%, menor que cerca de 24%, menor que cerca de 25%, menor que cerca de 26%, menor que cerca de 27%, menor que cerca de 28%, menor que cerca de 29%, menor que cerca de 30%, menor que cerca de 31%, menor que cerca de 32%, menor que cerca de 33%, menor que cerca de 34%, menor que cerca de 35%, menor que cerca de 36%, menor que cerca de 37%, menor que cerca de 38%, menor que cerca de 39%, menor que cerca de 40%, menor que cerca de 41%, menor que cerca de 42%, menor que cerca de 43%, menor que cerca de 44%, menor que cerca de 45%, menor que cerca de 46%, menor que cerca de 47%, menor que cerca de 48%, menor que cerca de 49%, menor que cerca de 50%, menor que cerca de 51%, menor que cerca de 52%, menor que cerca de 53%, menor que cerca de 54%, menor que cerca de 55%, menor que cerca de 56%, menor que cerca de 57%, menor que cerca de 58%, menor que cerca de 59%, menor que cerca de 60%, menor que cerca de 61%, menor que cerca de 62%, menor que cerca de 63%, menor que cerca de 64%,

menor que cerca de 65%, menor que cerca de 66%, menor que cerca de 67%, menor que cerca de 68%, menor que cerca de 69%, menor que cerca de 70%, menor que cerca de 71%, menor que cerca de 72%, menor que cerca de 73%, menor que cerca de 74%, menor que cerca de 75%, menor que cerca de 76%, menor que cerca de 77%, menor que cerca de 78%, menor que cerca de 79%, menor que cerca de 80%, menor que cerca de 81%, menor que cerca de 82%, menor que cerca de 83%, menor que cerca de 84%, menor que cerca de 85%, menor que cerca de 86%, menor que cerca de 87%, menor que cerca de 88%, menor que cerca de 89%, menor que cerca de 90%, menor que cerca de 91%, menor que cerca de 92%, menor que cerca de 93%, menor que cerca de 94%, menor que cerca de 95%, menor que cerca de 96%, menor que cerca de 97%, menor que cerca de 98%, menor que cerca de 99% ou menor que cerca de 100%.

[442] Em um aspecto, as composições de polímero da presente divulgação têm um teor de umidade de 1% a 100%, 1% a 95%, 1% a 90%, 1% a 85%, 1% a 80%, 1% a 75%, 1% a 70%, 1% a 65%, 1% a 60%, 1% a 55%, 1% a 50%, 1% a 45%, 1% a 40%, 1% a 35%, 1% a 30%, 1% a 25%, 1% a 20%, 1% a 15%, 1% a 10%, 1% a 5%, 5% a 100%, 5% a 95%, 5% a 90%, 5% a 85%, 5% a 80%, 5% a 75%, 5% a 70%, 5% a 65%, 5% a 60%, 5% a 55%, 5% a 50%, 5% a 45%, 5% a 40%, 5% a 35%, 5% a 30%, 5% a 25%, 5% a 20%, 5% a 15%, 5% a 10%, 10% a 100%, 10% a 95%, 10% a 90%, 10% a 85%, 10% a 80%, 10% a 75%, 10% a 70%, 10% a 65%, 10% a 60%, 10% a 55%, 10% a 50%, 10% a 45%, 10% a 40%, 10% a 35%, 10% a 30%, 10% a 25%, 10% a 20%, 10% a 15%, 15% a 100%, 15% a 95%, 15% a 90%, 15% a 85%, 15% a 80%, 15% a 75%, 15% a 70%, 15% a 65%, 15% a 60%, 15% a 55%, 15% a 50%, 15% a 45%, 15% a 40%, 15% a 35%, 15% a 30%, 15% a 25%, 15% a 20%, 20% a 100%, 20% a 95%, 20% a 90%, 20% a 85%, 20% a 80%, 20% a 75%, 20% a 70%, 20% a 65%, 20% a 60%, 20% a 55%, 20% a 50%, 20% a 45%, 20% a 40%, 20% a 35%, 20% a 30%, 20% a 25%, 25% a 100%, 25% a 95%, 25% a 90%, 25% a 85%, 25% a 80%, 25% a 75%, 25% a 70%, 25% a 65%, 25% a 60%, 25% a 55%, 25% a 50%, 25% a 45%, 25% a 40%, 25% a 35%, 25% a 30%, 30% a 100%, 30% a 95%, 30% a 90%, 30% a 85%, 30% a 80%, 30% a 75%, 30% a 70%, 30% a 65%, 30% a 60%, 30% a 55%, 30% a 50%, 30% a 45%, 30% a 40%, 30% a 35%, 35% a 100%, 35% a 95%, 35% a 90%, 35% a 85%, 35% a 80%,

35% a 75%, 35% a 70%, 35% a 65%, 35% a 60%, 35% a 55%, 35% a 50%, 35% a 45%, 35% a 40%, 40% a 100%, 40% a 95%, 40% a 90%, 40% a 85%, 40% a 80%, 40% a 75%, 40% a 70%, 40% a 65%, 40% a 60%, 40% a 55%, 40% a 50%, 40% a 45%, 45% a 100%, 45% a 95%, 45% a 90%, 45% a 85%, 45% a 80%, 45% a 75%, 45% a 70%, 45% a 65%, 45% a 60%, 45% a 55%, 45% a 50%, 50% a 100%, 50% a 95%, 50% a 90%, 50% a 85%, 50% a 80%, 50% a 75%, 50% a 70%, 50% a 65%, 50% a 60%, 50% a 55%, 55% a 100%, 55% a 95%, 55% a 90%, 55% a 85%, 55% a 80%, 55% a 75%, 55% a 70%, 55% a 65%, 55% a 60%, 60% a 100%, 60% a 95%, 60% a 90%, 60% a 85%, 60% a 80%, 60% a 75%, 60% a 70%, 60% a 65%, 65% a 100%, 65% a 95%, 65% a 90%, 65% a 85%, 65% a 80%, 65% a 75%, 65% a 70%, 70% a 100%, 70% a 95%, 70% a 90%, 70% a 85%, 70% a 80%, 70% a 75%, 75% a 100%, 75% a 95%, 75% a 90%, 75% a 85%, 75% a 80%, 80% a 100%, 80% a 95%, 80% a 90%, 80% a 85%, 85% a 100%, 85% a 95%, 85% a 90%, 90% a 100%, 90% a 95% ou 95% a 100%.

[443] Em um aspecto, as composições de polímero da presente divulgação são secas. Em alguns aspectos, as composições de polímero da presente divulgação são líquidas. Em um aspecto, as composições de polímero da presente divulgação têm uma atividade de água de cerca de 0,1, cerca de 0,15, cerca de 0,2, cerca de 0,25, cerca de 0,30, cerca de 0,35, cerca de 0,4, cerca de 0,5, cerca de 0,55, cerca de 0,60, cerca de 0,65, cerca de 0,70, cerca de 0,75, cerca de 0,8, cerca de 0,85, cerca de 0,90 ou cerca de 0,95.

[444] Em um aspecto, as composições de polímero da presente divulgação têm uma atividade de água menor que cerca de 0,1, menor que cerca de 0,15, menor que cerca de 0,2, menor que cerca de 0,25, menor que cerca de 0,30, menor que cerca de 0,35, menor que cerca de 0,4, menor que cerca de 0,5, menor que cerca de 0,55, menor que cerca de 0,60, menor que cerca de 0,65, menor que cerca de 0,70, menor que cerca de 0,75, menor que cerca de 0,8, menor que cerca de 0,85, menor que cerca de 0,90 ou menor que cerca de 0,95.

[445] Em um aspecto, as composições de polímero da presente divulgação têm uma atividade de água menor que 0,1, menor que 0,15, menor que 0,2, menor que 0,25, menor que 0,30, menor que 0,35, menor que 0,4, menor que 0,5, menor que 0,55, menor que 0,60, menor que 0,65, menor que 0,70, menor que 0,75, menor que 0,8, menor que 0,85, menor que 0,90 ou menor que 0,95.

[446] Em um aspecto, as composições de polímero da presente divulgação têm uma atividade de água de 0,1 a 0,95, 0,1 a 0,90, 0,1 a 0,85, 0,1 a 0,8, 0,1 a 0,75, 0,1 a 0,70, 0,1 a 0,65, 0,1 a 0,55, 0,1 a 0,50, 0,1 a 0,45, 0,1 a 0,40, 0,1 a 0,35, 0,1 a 0,3, 0,1 a 0,25, 0,1 a 0,2, 0,1 a 0,15, 0,15 a 0,95, 0,15 a 0,90, 0,15 a 0,85, 0,15 a 0,8, 0,15 a 0,75, 0,15 a 0,70, 0,15 a 0,65, 0,15 a 0,55, 0,15 a 0,50, 0,15 a 0,45, 0,15 a 0,40, 0,15 a 0,35, 0,15 a 0,3, 0,15 a 0,25, 0,15 a 0,2, 0,2 a 0,95, 0,2 a 0,90, 0,2 a 0,85, 0,2 a 0,8, 0,2 a 0,75, 0,2 a 0,70, 0,2 a 0,65, 0,2 a 0,55, 0,2 a 0,50, 0,2 a 0,45, 0,2 a 0,40, 0,2 a 0,35, 0,2 a 0,3, 0,2 a 0,25, 0,25 a 0,95, 0,25 a 0,90, 0,25 a 0,85, 0,25 a 0,8, 0,25 a 0,75, 0,25 a 0,70, 0,25 a 0,65, 0,25 a 0,55, 0,25 a 0,50, 0,25 a 0,45, 0,25 a 0,40, 0,25 a 0,35, 0,25 a 0,3, 0,3 a 0,95, 0,3 a 0,90, 0,3 a 0,85, 0,3 a 0,8, 0,3 a 0,75, 0,3 a 0,70, 0,3 a 0,65, 0,3 a 0,55, 0,3 a 0,50, 0,3 a 0,45, 0,3 a 0,40, 0,3 a 0,35, 0,35 a 0,95, 0,35 a 0,90, 0,35 a 0,85, 0,35 a 0,8, 0,35 a 0,75, 0,35 a 0,70, 0,35 a 0,65, 0,35 a 0,55, 0,35 a 0,50, 0,35 a 0,45, 0,35 a 0,40, 0,4 a 0,95, 0,4 a 0,90, 0,4 a 0,85, 0,4 a 0,8, 0,4 a 0,75, 0,4 a 0,70, 0,4 a 0,65, 0,4 a 0,55, 0,4 a 0,50, 0,4 a 0,45, 0,45 a 0,95, 0,45 a 0,90, 0,45 a 0,85, 0,45 a 0,8, 0,45 a 0,75, 0,45 a 0,70, 0,45 a 0,65, 0,45 a 0,55, 0,45 a 0,50, 0,5 a 0,95, 0,5 a 0,90, 0,5 a 0,85, 0,5 a 0,8, 0,5 a 0,75, 0,5 a 0,70, 0,5 a 0,65, 0,5 a 0,55, 0,55 a 0,95, 0,55 a 0,90, 0,55 a 0,85, 0,55 a 0,8, 0,55 a 0,75, 0,55 a 0,70, 0,55 a 0,65, 0,6 a 0,95, 0,6 a 0,90, 0,6 a 0,85, 0,6 a 0,8, 0,6 a 0,75, 0,6 a 0,70, 0,65 a 0,95, 0,65 a 0,90, 0,65 a 0,85, 0,65 a 0,8, 0,65 a 0,75, 0,7 a 0,95, 0,7 a 0,90, 0,7 a 0,85, 0,7 a 0,8, 0,75 a 0,95, 0,75 a 0,90, 0,75 a 0,85, 0,8 a 0,95, 0,8 a 0,90, 0,8 a 0,85, 0,85 a 0,95, 0,85 a 0,90 ou 0,9 a 0,95. (I) REVESTIMENTOS DE SEMENTE

[447] Conforme descrito no presente documento, "revestimento de sementes" e "tratamento de sementes" são usados de forma intercambiável. Conforme descrito no presente documento, "semente" inclui sementes de plantas, rebentos, estacas, bulbos, tubérculos e qualquer material de propagação vegetal. Em alguns aspectos, a composição de polímero é aplicada à semente da planta. Em alguns aspectos, a composição de polímero é aplicada às sementes e/ou outros materiais de propagação vegetal de milho, soja, canola, sorgo, batata, arroz, vegetais, cereais, cana-de-açúcar, pseudocereais, algodão e sementes oleaginosas. Exemplos de cereais podem incluir cevada, fonio, aveia, gramínea palmer, centeio, painço, sorgo, espelta, tefe, triticale e trigo. Em alguns aspectos, os outros materiais de propagação vegetal incluem rebentos e estacas, bulbos, tubérculos e qualquer material de propagação vegetal. Exemplos de pseudocereais podem incluir noz-de-pão, trigo sarraceno, taboa, chia, linho, amaranto em grãos, hanza, quinoa e gergelim. Em alguns exemplos, as sementes podem ser organismos geneticamente modificados (OGM), não-OGM, orgânicos, o produto de novas técnicas de melhoramento genético ou convencionais.

[448] Em alguns aspectos, a composição de polímero é aplicada à semente da planta revestindo a semente com um líquido, pasta fluida ou pó compreendendo a composição de polímero. Em alguns aspectos, o revestimento de semente é um revestimento de semente seco. Em alguns aspectos, o revestimento de semente é um revestimento de semente líquido.

ADMINISTRAÇÃO DA COMPOSIÇÃO DE POLÍMERO

[449] Em alguns aspectos, a composição de polímero descrita no presente documento pode ser aplicada em sulco, em talco ou como um tratamento de semente. Em alguns aspectos, a composição de polímero é aplicada à semente antes de chegar à fazenda ou depois de chegar à fazenda. Em alguns aspectos, a composição de polímero é aplicada à semente em tratadores contínuos ou em batelada. Em alguns aspectos, a composição de polímero é aplicada à semente em tratadores de trado. Em alguns aspectos, a composição de polímero é aplicada na plantadeira. Em alguns aspectos, o polímero é aplicado à semente usando o processo de peletização, incrustação e revestimento de filme. Em alguns aspectos, a plantadeira recebe a composição de polímero como uma substância seca que é usada como um inoculante para cultivar a uma ou mais bactérias na composição de polímero no local. As bactérias resultantes são, então, usadas como um tratamento de sementes ou tratamento em sulcos. Em alguns aspectos, a composição de polímero é primeiro aplicada à semente e, então, aplicada em sulco juntamente com a semente que já compreende a composição de polímero. Em alguns aspectos, a primeira composição de polímero aplicada àsemente édiferente da última composição de polímero aplicada em sulco juntamente com a semente que compreende a primeira composição de polímero. Em alguns aspectos, a composição de polímero é aplicada à semente com um lubrificante de semente. Em alguns aspectos, a composição de polímero é aplicada à semente dentro da caixa da plantadeira em combinação com lubrificantes, como talco, grafite ou cera de polietileno. Em alguns aspectos, a composição de polímero é aplicada à semente em combinação com lubrificantes, como talco, grafite ou cera de polietileno.

[450] Em alguns aspectos, a plantadeira pode plantar a semente tratada e cultivar a cultura de acordo com os métodos convencionais, linhas pareadas ou métodos que não exigem aragem. Em alguns aspectos, as sementes podem ser distribuídas usando uma tremonha de controle ou uma tremonha individual. As sementes podem também ser distribuídas usando ar pressurizado, em plantadeiras a vácuo, mecanicamente ou manualmente. Em alguns aspectos, a colocação de sementes pode ser realizada usando tecnologias de taxa variável. Além disso, a aplicação das bactérias ou população bacteriana descrita no presente documento pode ser aplicada usando tecnologias de taxa variável. Em alguns aspectos, a composição de polímero pode ser aplicada a sementes de plantas da presente divulgação.

[451] Aditivos como microfertilizante, PGR, herbicida, inseticida e fungicida podem ser usados adicionalmente para tratar as culturas. Exemplos de aditivos incluem protetores de cultura, como inseticidas, nematicidas, fungicidas, agentes de intensificação, como corantes, polímeros, peletização, priming e desinfetantes e outros agentes, como inoculante, PGR, amaciante e micronutrientes. Os PGRs podem ser hormônios vegetais naturais ou sintéticos que afetam o crescimento da raiz, a floração ou o alongamento do talo. PGRs podem incluir auxinas, giberelinas, citocininas, etileno e ácido abscísico (ABA).

[452] Em alguns aspectos, qualquer um ou mais aditivos ou tratamentos químicos da presente divulgação podem ser aplicados às partes da planta/semente em combinação com o micróbio (ou micróbios) e polímero (ou polímeros) por mistura em tanque, coaplicação, aplicação sequencial ou tratamento excessivo de partes da planta/semente anteriormente tratadas com um ou mais aditivos ou tratamentos químicos da presente divulgação. Em alguns aspectos, pode ser necessário limitar a aplicação a apenas certos métodos de tratamento para desempenho ideal e sobrevivência dos micróbios. Conforme usado no presente documento, "mistura em tanque" significa o produto químico (ou produtos químicos)/aditivo (ou aditivos)/polímero (ou polímeros)/micróbio (ou micróbios) são misturados em uma pasta fluida e, então, aplicados à semente. Conforme usado no presente documento, "coaplicação" significa que a semente está em um tratador contínuo ou em batelada, e o produto químico (ou produtos químicos)/aditivo (ou aditivos)/polímero (ou polímeros)/micróbio (ou micróbios) são aplicados ao mesmo tempo. Conforme usado no presente documento, "aplicação sequencial" ou "aplicada sequencialmente" significa que a semente está em um tratador contínuo ou em batelada, e um ou mais dentre o produto químico (ou produtos químicos)/aditivo (ou aditivos)/polímero (ou polímeros)/micróbio (ou micróbios) são aplicados sequencialmente à semente, com um pequeno atraso entre cada aplicação, com o micróbio (ou micróbios)/polímero (ou polímeros) adicionado por último. Como usado no presente documento, "tratamento excessivo" significa que a semente é tratada com produto químico (ou produtos químicos)/aditivo (ou aditivos), deixada secar e curar totalmente e, então, o micróbio (ou micróbios) são adicionados.

[453] A composição pode ser aplicada em sulco em combinação com fertilizante líquido. Em alguns aspectos, uma composição formulada para aplicação em sulco é aquela que é compatível com o fertilizante líquido. Em alguns exemplos, o fertilizante líquido pode ser mantido em tanques. Os fertilizantes NPK contêm macronutrientes de nitrogênio, fósforo e potássio.

[454] Em alguns aspectos, o polímero ou composição de polímero é combinado/misturado com uma ou mais bactérias ou uma composição microbiana imediatamente antes da administração. Em alguns aspectos, o polímero ou composição de polímero é combinado/misturado com uma ou mais bactérias ou uma composição microbiana menos de 30 minutos, menos de 1 hora, menos de 2 horas, menos de 3 horas, menos de 4 horas, menos de 5 horas, menos de 6 horas, menos de 7 horas, menos de 8 horas, menos de 9 horas, menos de 10 horas, menos de 11 horas, menos de 12 horas, menos de 13 horas, menos de 14 horas, menos de 15 horas, menos de 16 horas, menos de 17 horas, menos de 18 horas, menos de 19 horas, menos de 20 horas, menos de 21 horas, menos de 22 horas, menos de 23 horas, menos de 24 horas, menos de 25 horas, menos de 26 horas,

menos de 27 horas, menos de 28 horas, menos de 29 horas, menos de 30 horas, menos de 35, menos de 40 horas, menos de 45 horas, menos de 50 horas, menos de 55 horas, menos de 60 horas, menos de 65 horas, menos de 70 horas, menos de 75 horas, menos de 80 horas, menos de 85 horas, menos de 90 horas, menos de 95 horas, menos de 100 horas, menos de 110 horas, menos de 120 horas, menos de 130 horas s, menos de 140 horas, menos de 150 horas, menos de 160 horas, menos de 170 horas, menos de 180 horas, menos de 190 horas ou menos de 200 horas antes da administração.

[455] Em alguns aspectos, o polímero ou composição de polímero é combinado/misturado com uma ou mais bactérias ou uma composição microbiana cerca de 30 minutos, cerca de 1 hora, cerca de 2 horas, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, cerca de 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 11 horas, cerca de 12 horas, cerca de 13 horas, cerca de 14 horas, cerca de 15 horas, cerca de 16 horas, cerca de 17 horas, cerca de 18 horas, cerca de 19 horas, cerca de 20 horas, cerca de 21 horas, cerca de 22 horas , cerca de 23 horas, cerca de 24 horas, cerca de 25 horas, cerca de 26 horas, cerca de 27 horas, cerca de 28 horas, cerca de 29 horas, cerca de 35 horas, cerca de 40 horas, cerca de 45 horas, cerca de 50 horas, cerca de 55 horas, cerca de 60 horas, cerca de 65 horas, cerca de 70 horas, cerca de 75 horas, cerca de 80 horas, cerca de 85 horas, cerca de 90 horas, cerca de 95 horas, cerca de 100 horas, cerca de 110 horas, cerca de 120 horas, cerca de 130 horas, cerca de 140 horas , cerca de 150 horas, cerca de 160 horas, cerca de 170 horas, cerca de 180 horas, cerca de 190 horas, cerca de 200 horas ou cerca de 0 hora antes da administração.

[456] Em alguns aspectos, o polímero ou composição de polímero é combinado/misturado com uma ou mais bactérias ou uma composição microbiana cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12, cerca de 13, cerca de 14 , cerca de 15, cerca de 16, cerca de 17, cerca de 18, cerca de 19, cerca de 20, cerca de 21, cerca de 22, cerca de 23, cerca de 24, cerca de 25, cerca de 26, cerca de 27, cerca de 28, cerca de 29, cerca de 30, cerca de 35, cerca de 40, cerca de 45, cerca de 50, cerca de 55, cerca de 60, cerca de 65, cerca de 70, cerca de

75, cerca de 80, cerca de 85, cerca de 90, cerca de 95, cerca de 100, cerca de 110, cerca de 120, cerca de 130, cerca de 140, cerca de 150, cerca de 160, cerca de 170, cerca de 180, cerca de 190, cerca de 200, cerca de 210, cerca de 220, cerca de 230, cerca de 240, cerca de 250, cerca de 260, cerca de 270, cerca de 280, cerca de 290, cerca de 300 , cerca de 310, cerca de 320, cerca de 330, cerca de 340, cerca de 350, cerca de 360 ou cerca de 370 dias antes da administração.

[457] Em alguns aspectos, o polímero ou composição de polímero é combinado/misturado com uma ou mais bactérias ou uma composição microbiana menos de 1, menos de 2, menos de 3, menos de 4, menos de 5, menos de 6, menos de 7, menos de 8, menos de 9, menos de 10, inferior menos de 11, menos de 12, menos de 13, menos de 14, menos de 15, menos de 16, menos de 17, menos de 18, menos de 19, menos de 20, menos de 21, menos de 22, menos de 23 , menos de 24, menos de 25, menos de 26, menos de 27, menos de 28, menos de 29, menos de 30, menos de 35, menos de 40, menos de 45, menos de 50, menos de 55, menos do que 60, menos do que 65, menos do que 70, menos do que 75, menos do que 80, menos do que 85, menos do que 90, menos do que 95, menos do que 100, menos do que 110, menos do que 120, menos do que 130, menos do que 140 , menos de 150, menos de 160, menos de 170, menos de 180, menos de 190, menos de 200, menos de 210, menos de 220, menos de 230, menos de 240, menos de 250, menos de 260, menos que 270, menos que 280, menos que 290, menos que 300, menos que 310, menos que 320, menos que 330, menos de 340, menos de 350, menos de 360 ou menos de 370 dias antes da administração.

[458] Em alguns aspectos, o polímero ou composição de polímero é combinado/misturado com uma ou mais bactérias ou uma composição microbiana cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12, cerca de 13, cerca de 14, cerca de 15, cerca de 16, cerca de 17, cerca de 18, cerca de 19, cerca de 20, cerca de 21, cerca de 22, cerca de 23, cerca de 24, cerca de 25, cerca de 26, cerca de 27, cerca de 28, cerca de 29, cerca de 30, cerca de 31, cerca de 32, cerca de 33, cerca de 34, cerca de 35, cerca de 36, cerca de 37, cerca de 38, cerca de 39, cerca de 40, cerca de 41, cerca de 42, cerca de 43, cerca de 44, cerca de 45, cerca de 46, cerca de 47, cerca de 48, cerca de 49, cerca de 50, cerca de 51, cerca de 52, cerca de 53, cerca de 54, cerca de 55, cerca de 56, cerca de 57, cerca de 58, cerca de 59 ou cerca de 60 meses antes da administração.

[459] Em alguns aspectos, o polímero ou composição de polímero é combinado/misturado com uma ou mais bactérias ou uma composição microbiana menos de 1, menos de 2, menos de 3, menos de 4, menos de 5, menos de 6, menos de 7, menos de 8, menos de 9, menos de 10, inferior menos de 11, menos de 12, menos de 13, menos de 14, menos de 15, menos de 16, menos de 17, menos de 18, menos de 19, menos de 20, menos de 21, menos de 22, menos de 23 , menos de 24, menos de 25, menos de 26, menos de 27, menos de 28, menos de 29, menos de 30, menos de 31, menos de 32, menos de 33, menos de 34, menos de 35, menos do que 36, menos do que 37, menos do que 38, menos do que 39, menos do que 40, menos do que 41, menos do que 42, menos do que 43, menos do que 44, menos do que 45, menos do que 46, menos do que 47, menos do que 48 , menos de 49, menos de 50, menos de 51, menos de 52, menos de 53, menos de 54, menos de 55, menos de 56, menos de 57, menos de 58, menos de 59 ou menos de 60 meses antes da administração.

[460] Em alguns aspectos, o polímero ou composição de polímero é administrado como uma mistura ou solução separada da uma ou mais bactérias ou composição microbiana. Em alguns aspectos, o polímero ou composição de polímero é administrado como uma mistura ou solução separada da uma ou mais bactérias ou composição microbiana, porém simultaneamente com a uma ou mais bactérias ou composição microbiana. Em alguns aspectos, o polímero ou composição de polímero é administrado como uma mistura ou solução separada da uma ou mais bactérias ou composição microbiana, porém imediatamente antes da uma ou mais bactérias ou composição microbiana. Em alguns aspectos, o polímero ou composição de polímero é administrado como uma mistura ou solução separada da uma ou mais bactérias ou composição microbiana, porém imediatamente após a uma ou mais bactérias ou composição microbiana.

[461] Em alguns aspectos, o polímero ou composição de polímero é combinado/misturado com uma ou mais bactérias ou composição microbiana imediatamente após a colheita das bactérias. Em alguns aspectos, o polímero ou composição de polímero é combinado/misturado com uma ou mais bactérias ou composição microbiana imediatamente após a uma ou mais bactérias ou composição microbiana ter sido dessecada. Em alguns aspectos, o polímero ou composição de polímero é combinado/misturado com uma ou mais bactérias ou composição microbiana, e a composição de polímero microbiana resultante é, então, dessecada.

[462] Em alguns aspectos, um primeiro polímero ou composição de polímero é combinado/misturado com uma ou mais bactérias ou composição microbiana formando uma composição de polímero microbiana. Em alguns aspectos, um segundo polímero ou composição de polímero é combinado/misturado com a composição do polímero microbiana. Em alguns aspectos, um terceiro polímero ou composição de polímero é combinado/misturado com a composição de polímero microbiana compreendendo o primeiro e o segundo polímeros ou composição de polímero.

[463] Em alguns aspectos, uma composição de polímero microbiana compreendendo um primeiro polímero ou composição de polímero é administrada simultaneamente com um segundo polímero ou composição de polímero. Em outros aspectos, o primeiro polímero ou composição de polímero é diferente do segundo polímero ou composição de polímero. Em outros aspectos, o primeiro polímero ou composição de polímero é igual ao segundo polímero ou composição de polímero. Em alguns aspectos, o segundo polímero ou composição de polímero é administrado imediatamente antes da administração da composição de polímero microbiana. Em alguns aspectos, o segundo polímero ou composição de polímero é administrado imediatamente após a administração da composição de polímero microbiana.

[464] Em alguns aspectos, a mistura do polímero ou composição de polímero com uma ou mais bactérias ou composição microbiana é seguida de um período de tempo para permitir que o polímero ou composição de polímero cure ou seque antes de aplicar um polímero ou composição de polímero subsequente. Em alguns aspectos, a mistura do polímero ou composição de polímero com uma ou mais bactérias ou composição microbiana é seguida de um período de tempo para permitir que o polímero ou composição de polímero cure ou seque antes da administração da composição de polímero microbiana.

ESTABILIDADE/VIABILIDADE CONFERIDA POR POLÍMERO

[465] Os termos "viabilidade", "viabilidade microbiana" ou "viabilidade celular" geralmente se referem à porcentagem de células que são capazes de crescer em meio de crescimento sólido ou líquido. Os termos "estabilidade", "estabilidade microbiana" ou "estabilidade celular" geralmente se referem à porcentagem de células que são capazes de crescer em meio de crescimento sólido ou líquido ao longo de um período de tempo, às vezes chamado de viabilidade ao longo do tempo. A viabilidade de uma célula muda ao longo do tempo e é conhecida como a estabilidade da célula. A manutenção da viabilidade de um micróbio se refere à redução de sua perda ao longo do tempo, que é chamada de "estabilidade".

[466] Em alguns aspectos, a viabilidade se refere a pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% do número total de células que permanecem viáveis em uma amostra, em comparação com uma amostra de referência/controle correspondente.

[467] Em alguns aspectos, a estabilidade se refere a pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% do número total de células que permanecem viáveis em uma amostra durante um período de tempo, em comparação com uma amostra de referência/controle correspondente.

[468] Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo polímero exibe uma estabilidade celular aumentada durante um período de tempo mais longo em comparação com uma composição microbiana de controle que carece do polímero.

[469] Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo polímero exibe uma estabilidade celular aumentada em comparação com uma composição microbiana de controle que carece do polímero. Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo polímero exibe um aumento na estabilidade de pelo menos 5%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 700%, 800% ou 900% em comparação com uma amostra de referência/controle correspondente durante o mesmo período de tempo.

[470] Em alguns aspectos, o período de tempo é pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 ou 250 dias após a fabricação da composição microbiana compreendendo polímero ou da amostra de referência/controle correspondente.

[471] Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo polímero exibe uma estabilidade de pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% ou 95% em um refrigerador ((1,66-4,44 ºC (35-40 °F)) durante um período de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60 dias, em comparação com uma amostra de referência/controle correspondente durante o mesmo período de tempo.

[472] Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo polímero exibe uma estabilidade de pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% ou 95% em um refrigerador ((1,66-4,44 ºC (35-40 °F)) durante um período de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60 semanas,

em comparação com uma amostra de referência/controle correspondente durante o mesmo período de tempo.

[473] Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo polímero exibe uma estabilidade de pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% ou 95% à temperatura ambiente ((20-22,22 ºC (68-72°F)) durante um período de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60 dias, em comparação com uma amostra de referência/controle correspondente durante o mesmo período de tempo.

[474] Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo polímero exibe uma estabilidade de pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% ou 95% à temperatura ambiente ((20-22,22 ºC (68-72°F)) durante um período de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60 semanas, em comparação com uma amostra de referência/controle correspondente durante o mesmo período de tempo.

[475] Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo polímero exibe uma estabilidade de pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% ou 95% em um refrigerador ((21,11-37,77 ºC) (70-100°F)) durante um período de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60 dias, em comparação com uma amostra de referência/controle correspondente durante o mesmo período de tempo.

[476] Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo polímero exibe uma estabilidade de pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% ou 95% a ((21-11-37,77 ºC (70-100°F)) durante um período de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60 semanas, em comparação com uma amostra de referência/controle correspondente durante o mesmo período de tempo.

[477] Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo polímero exibe uma estabilidade de pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% ou 95% a uma temperatura abaixo de -28,88 ºC (-20°F) durante um período de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60 dias, em comparação com uma amostra de referência/controle correspondente durante o mesmo período de tempo.

[478] Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo polímero exibe uma estabilidade de pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% ou 95% a uma temperatura ambiente abaixo de -28,88 ºC (-20°F) durante um período de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60 semanas, em comparação com uma amostra de referência/controle correspondente durante o mesmo período de tempo.

[479] Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo polímero exibe uma estabilidade aumentada quando submetida a condições de dessecação, em comparação com uma amostra de referência/controle correspondente. Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo polímero exibe uma estabilidade aumentada quando submetida à secagem por congelamento, em comparação com uma amostra de referência/controle correspondente. Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo polímero exibe uma estabilidade aumentada quando submetida à secagem por atomização, em comparação com uma amostra de referência/controle correspondente. Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo polímero exibe uma estabilidade aumentada quando submetida à liofilização, em comparação com uma amostra de referência/controle correspondente. Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo polímero exibe uma estabilidade aumentada quando submetida a congelamento por atomização, em comparação com uma amostra de referência/controle correspondente.

BIOFILMES

[480] Em certas modalidades, as composições de polímero supracitadas podem ser combinadas com um biofilme. Alternativamente, a divulgação fornece também composições apenas de biofilme sem um polímero.

[481] A maioria dos microrganismos vive e cresce em formas agregadas, como biofilmes, flocos (biofilmes planctônicos) e sedimentos. Consultar Costerton et al. 1995. Annu. Rev. Microbiol. 49:711-745; Wimpenny. 2000. Em Community Structure and Co-operation in Biofilms (ed. Allison, Gilbert, Lappin-Scott e Wilson). Pp. 1-24, Cambridge University Press, Cambridge, Reino Unido. Biofilmes são acúmulos de cátions multivalentes, partículas inorgânicas e material biogênico, bem como compostos coloidais e dissolvidos. Essas formas de crescimento são frequentemente chamadas coletivamente de biofilmes. Biofilmes são distribuídos de forma ubíqua em ambientes aquáticos, em tecidos de plantas e animais e em superfícies de filtros, cascos de navios, dispositivos médicos, etc. Biofilmes tipicamente se desenvolvem em limites de fase e podem frequentemente ser encontrados aderentes a uma superfície sólida em interfaces sólido-água. Biofilmes podem também ser encontrados em interfaces sólido-ar.

[482] A formação de biofilme geralmente começa quando microrganismos de flutuação livre, como bactérias, entram em contato com uma superfície adequada e começam a secretar uma substância polimérica extracelular (EPS). Uma EPS é uma rede de açúcares, proteínas e ácidos nucleicos que permite que os microrganismos em um biofilme adiram uns aos outros. O contato e a fixação à superfície adequada são seguidos de um período de crescimento. Camadas adicionais de microrganismo e EPS se acumulam nas primeiras camadas. Os canais de nutrientes se cruzam em biofilmes, permitindo a troca de nutrientes e produtos residuais.

[483] A formação de biofilme é frequentemente determinada por uma ou mais condições ambientais que se apresentam se o biofilme for apenas algumas camadas de células ou significativamente mais. Por exemplo, microrganismos que produzem grandes quantidades de EPS podem crescer em biofilmes bastante espessos, mesmo que não tenham acesso a muitos nutrientes. Os microrganismos que dependem de oxigênio podem ser limitados por quão denso o biofilme pode se tornar. As células dentro do biofilme podem deixar o biofilme e se estabelecer sobre uma nova superfície. Um aglomerado de células pode se separar ou células individuais são liberadas do biofilme em um processo conhecido como dispersão de semeadura.

[484] As comunidades de micróbios costumam ser mais resistentes a estressores, como falta de água, pH alto ou baixo ou a presença de substâncias tóxicas, como antibióticos, antimicrobianos ou metais pesados. Acredita-se que a resistência dos biofilmes surja da EPS, atuando como uma barreira protetora que impede a desidratação ou atua como um escudo contra a luz UV. Substâncias nocivas, como antimicrobianos, alvejantes ou metais pesados, são ligadas ou neutralizadas quando entram em contato com a EPS. Essas substâncias podem ser diluídas em concentrações subletais antes de atingirem várias camadas de células dentro do biofilme. É possível que certos antibióticos/antimicrobianos penetrem na EPS e prossigam através das camadas do biofilme.

[485] Os microrganismos encontrados dentro dos biofilmes existem em estreita associação em altas densidades celulares e estão embutidos em uma matriz de EPS. A produção de EPS é uma propriedade microbiana geral expressa na maioria dos ambientes. A capacidade de formar EPS é amplamente distribuída entre organismos procarióticos, porém também pode ocorrer em microrganismos eucarióticos, como algas, leveduras, bolores e fungos. Consultar Ghosle. 2001. Biofouling. 17:117-127; e US20060096918A1. As EPS não são estruturas essenciais de bactérias, porém sob condições naturais, a produção de EPS é uma característica importante de sobrevivência, visto que a maioria das bactérias ambientais ocorre em agregados, como flocos e biofilmes, cuja integridade estrutural e funcional é baseada essencialmente na presença de uma matriz de EPS.

[486] As EPS são consideradas componentes essenciais que determinam a morfologia, arquitetura, coerência, propriedades físico-químicas e atividade bioquímica de agregados microbianos. A EPS forma uma matriz de biofilme tridimensional, semelhante a um gel, altamente hidratada e carregada localmente, em que os microrganismos estão essencialmente imobilizados. Em geral, a proporção de EPS em biofilmes pode variar entre cerca de 50% e cerca de 90% da matéria orgânica total. Consultar Nielsen et al. 1997. Wat. Sci. Tech. 36:11-19. As EPS estão envolvidas na formação de flocos de lodo ativado (biofloculação) e no desenvolvimento de biofilmes fixos. A EPS pode incluir substâncias como, por exemplo, polissacarídeos (por exemplo, monossacarídeos, ácidos urônicos e amino açúcares ligados por ligações glicosídicas), polipeptídeos, ácidos nucleicos, lipídeos/fosfolipídeos (por exemplo, ácidos graxos, fosfato de glicerol, etanolamina, serina e colina) e substâncias húmicas (por exemplo, compostos fenólicos, açúcares simples e aminoácidos). As composições de EPS podem ser avaliadas após a remoção das macromoléculas das células microbianas. Métodos físicos e químicos, incluindo centrifugação, filtração, aquecimento, mistura, sonicação e tratamento com hidróxido de sódio ou agentes complexantes e resinas de troca iônica podem ser usados para extrair EPS de agregados microbianos. Consultar Jahn e Nielsen. 1995. Wat. Sci. Tech. 31:157- 164; e Nielsen e Jahn. 1999. Microbial Extracellular Polymeric plants (ed. Wingender, neu e Flemming), páginas 49-72, Springer, Berlin. O uso de resina de troca catiônica combinada com agitação, por exemplo, pode ser usado para isolar EPS de um biofilme sem causar lise celular significativa. Tais métodos são baseados na remoção de íons de cálcio, desestabilizando a estrutura de EPS e facilitando a separação da EPS das células.

MICRORGANISMOS PRODUTORES DE BIOFILME

[487] Em alguns aspectos, micróbios produtores de biofilme podem ser selecionados de micróbios obtidos do solo (por exemplo, rizosfera), ar, água (por exemplo, ambiente marinho, água doce, lodo de água residual), sedimento, óleo, plantas (por exemplo, raízes, folhas, talos), animais (por exemplo, mamíferos, répteis, pássaros e similares), produtos agrícolas e ambientes extremos (por exemplo, drenagem ácida de minas ou sistemas hidrotérmicos). Em um aspecto adicional, micróbios obtidos de ambientes marinhos ou de água doce, como um oceano, rio ou lago. Em outra modalidade, os micróbios podem ser da superfície da massa de água ou de qualquer profundidade da massa de água (por exemplo, uma amostra do fundo do mar).

[488] Em aspectos da divulgação em que os micróbios são isolados de um material de origem (por exemplo, o material no qual os mesmos residem naturalmente), qualquer uma ou uma combinação de várias técnicas padrão que serão prontamente conhecidas por pessoas versadas na técnica pode ser usada. No entanto, a título de exemplo, esses em geral empregam processos pelos quais uma cultura sólida ou líquida de um único microrganismo pode ser obtida em uma forma substancialmente pura, geralmente por separação física sobre a superfície de um meio de crescimento microbiano sólido ou por isolamento dilutivo volumétrico em um meio de crescimento microbiano líquido. Esses processos podem incluir isolamento de material seco, suspensão líquida, pastas fluidas ou homogenatos em que o material é espalhado em uma camada fina sobre um meio de crescimento de gel sólido adequado ou diluições em série do material produzido em um meio estéril e inoculado em meio de cultura líquido ou sólido.

[489] Os biofilmes podem ser formados a partir de vários tipos de microrganismos. Por exemplo, um biofilme pode conter bactérias das subclasses α, β ou γ de Proteobacteria; bactérias gram-positivas com alto teor de GC e/ou bactérias do grupo Cytophaga-Flavobacterium. Várias espécies de fungos e leveduras também são conhecidas por produzirem biofilmes.

[490] Além das bactérias, os biofilmes podem conter ou ser produzidos por organismos protozoários e metazoários, como invertebrados (por exemplo, nematódeos), flagelados e ciliados (por exemplo, rotíferos).

[491] Em alguns aspectos, micróbios produtores de biofilme incluem bactérias, fungos e leveduras. Em alguns aspectos, o micróbio produtor de biofilme é uma bactéria. Em alguns aspectos, o micróbio produtor de biofilme é um fungo. Em alguns aspectos, o micróbio produtor de biofilme é uma levedura. Em alguns aspectos, o micróbio produtor de biofilme é um flagelado. Em alguns aspectos, o micróbio produtor de biofilme é um ciliado. Em alguns aspectos, o micróbio produtor de biofilme é uma alga.

[492] Em alguns aspectos, o micróbio produtor de biofilme é uma bactéria Gram-negativa. Em alguns aspectos, o micróbio produtor de biofilme é uma bactéria Gram-positiva.

[493] Em alguns aspectos, o micróbio produtor de biofilme é um patógeno. Em alguns aspectos, o micróbio produtor de biofilme é um patógeno obrigatório.

Em alguns aspectos, o micróbio produtor de biofilme é um patógeno oportunista. Em alguns aspectos, o micróbio produtor de biofilme é um patógeno vegetal. Em alguns aspectos, o micróbio produtor de biofilme é um patógeno humano. Em alguns aspectos, o micróbio produtor de biofilme é um patógeno animal. Em alguns aspectos, o micróbio produtor de biofilme é um micróbio do solo. Em alguns aspectos, o micróbio produtor de biofilme é um micróbio colonizador de planta. Em alguns aspectos, o micróbio produtor de biofilme é um micróbio colonizador de raiz. Em alguns aspectos, o micróbio produtor de biofilme é um micróbio colonizador de rizosfera.

[494] Em alguns aspectos, o micróbio produtor de biofilme é selecionado de qualquer uma ou mais das seguintes espécies: Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Rhizobium leguminosarum, Agrobacterium tumefaciens, Paenibacillus polymyxa, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Azospirillum braslinense, Acetobacter xylinum, Kosakonia sacchari, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus cohnii, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Lysteria innocua, Micrococcus luteus, Rhodococcus fascians, Microbacterium oxydans, Williamsia muralis, Escherichia coli, Serratia marcescens, Comamonas acidovorans, Burkholderia cepacia, Citrobacter freundii, Legionella pneumophila, Legionella waltersii, Legionella brunensis, Salmonella enterica, Shewanella putrefaciens, Rhodotorula mucilaginosa e Candida albicans.

[495] Em alguns aspectos, o micróbio produtor de biofilme é uma espécie de qualquer um ou mais dos seguintes gêneros: Pseudomonas, Rhizobium, Agrobacterium, Paenibacillus, Bacillus, Azospirillum, Erwinia, Xanthomonas, Pantoea, Acetobacter, Kosakonia, Staphylococcus, Mycobacterium, Micrococcus, Rhodococcus, Cellulosimicrobium, Microbacterium, Williamsia, Escherichia, Klebsiella, Streptococcus, Enterococcus, Leptospira, Clostridium, Listeria, Legionella, Salmonella, Campylobacter, Citrobacter, Shewanella, Burkholderia, Serratia, Comamonas, Cryptococcus, Candida, Saccharomyces, Penicillium, Cladosporium e Rhodotorula. Em alguns aspectos, o micróbio produtor de biofilme é uma espécie de Pseudomonas. Em alguns aspectos, o micróbio produtor de biofilme é uma espécie de Kosakonia.

PRODUÇÃO DE BIOFILME

[496] Em alguns aspectos, o meio de crescimento é inoculado com micróbios planctônicos. Em alguns aspectos, o meio de crescimento é inoculado com micróbios sésseis já em um biofilme. Em alguns aspectos, o meio de crescimento é inoculado com micróbios em crescimento em fase logarítmica. Em alguns aspectos, o meio de crescimento é inoculado com micróbios em crescimento em fase de latência. Em alguns aspectos, o meio de crescimento é inoculado com micróbios em fase estacionária.

[497] Em alguns aspectos, o micróbio produtor de biofilme produz um biofilme quando cresce na fase logarítmica. Em alguns aspectos, o micróbio produtor de biofilme produz um biofilme quando cresce na fase logarítmica.

[498] Em alguns aspectos, os biofilmes são cultivados em um frasco durante a agitação. Em alguns aspectos, os biofilmes são cultivados em um frasco sem agitação. Em alguns aspectos, os biofilmes são cultivados em uma superfície sólida (carreador). Em alguns aspectos, os biofilmes são cultivados em um biorreator. Em alguns aspectos, os biofilmes são cultivados em um quimiostato. Em alguns aspectos, os biofilmes são cultivados em um sistema de fluxo contínuo.

[499] Em alguns aspectos, os biofilmes são cultivados por co-inoculação de pelo menos uma cepa em um meio de crescimento. Em alguns aspectos, os biofilmes são cultivados por co-inoculação de pelo menos duas cepas em um meio de crescimento. Em alguns aspectos, os biofilmes são cultivados por co-inoculação de pelo menos três cepas em um meio de crescimento. Em alguns aspectos, os biofilmes são cultivados por co-inoculação de pelo menos quatro cepas em um meio de crescimento. Em alguns aspectos, os biofilmes são cultivados por co-inoculação de pelo menos cinco cepas em um meio de crescimento.

[500] Em alguns aspectos, os biofilmes são produzidos em biorreatores conforme descrito no documento nºEP2186890A1, nºWO2017203440A1, Patente US nº5.116.506, nºUS20090258404A1 e nºUS20090152195A1.

[501] Em alguns aspectos, os biofilmes são cultivados in situ com uma ou mais das bactérias da presente divulgação. Em alguns aspectos, o meio de crescimento é capaz de suportar o crescimento logarítmico de um ou mais micróbios produtores de biofilme e um ou mais micróbios não produtores de biofilme. O cocultivo do um ou mais micróbios produtores de biofilme e do um ou mais micróbios não produtores de biofilme resulta em crescimento logarítmico adequado dos dois ou mais micróbios, de modo que os micróbios não produtores de biofilme sejam encerrados no biofilme produzido pelos micróbios produtores de biofilme. (I) ISOLAMENTO / COLETA DE BIOFILME

[502] Em alguns aspectos, os biofilmes são agitados no meio de crescimento para liberar o biofilme da superfície em que estão aderidos. Em alguns aspectos, a agitação inclui raspagem, sonicação, forças de cisalhamento, mistura, etc.

[503] Em alguns aspectos, os biofilmes são isolados dos meios de crescimento ou câmaras de crescimento e derramados sobre um filtro que permitirá que o sobrenadante e micróbios unicelulares planctônicos passem, enquanto retém a composição do biofilme. Em alguns aspectos, os biofilmes são isolados do meio usado, derramando todo o conteúdo da câmara de reação / frasco de crescimento em um filtro compreendendo poros de 5 micrômetros de diâmetro. Em alguns aspectos, os biofilmes são isolados do meio usado, derramando todo o conteúdo da câmara de reação / frasco de crescimento em um filtro compreendendo poros de 10 micrômetros de diâmetro. Em alguns aspectos, os biofilmes são isolados do meio usado, derramando todo o conteúdo da câmara de reação / frasco de crescimento em um filtro compreendendo poros de 15 micrômetros de diâmetro. Em alguns aspectos, os biofilmes são isolados do meio usado, derramando todo o conteúdo da câmara de reação / frasco de crescimento em um filtro compreendendo poros de 20 micrômetros de diâmetro.

[504] Em alguns aspectos, a filtração ocorre com o auxílio de um aspirador a vácuo.

[505] Em alguns aspectos, o material de biofilme restante no filtro é lavado pelo menos uma vez com um tampão ou meio adequado. Em alguns aspectos, o material de biofilme restante no filtro é lavado pelo menos duas vezes com um tampão ou meio adequado. Em alguns aspectos, o material de biofilme restante no filtro élavado pelo menos três vezes com um tampão ou meio adequado. Em alguns aspectos, o material de biofilme restante no filtro é lavado pelo menos quatro vezes com um tampão ou meio adequado. Em alguns aspectos, o material de biofilme restante no filtro é lavado pelo menos cinco vezes com um tampão ou meio adequado.

[506] Em alguns aspectos, os biofilmes são sonicados para permitir que o biofilme se quebre em seções ligeiramente menores e para impedir que o biofilme recuperado e purificado permaneça em uma única massa.

[507] Em alguns aspectos, os biofilmes são ressuspensos em um tampão ou meio e concentrados em um volume menor por meio do uso de centrifugação ou ultracentrifugação.

[508] Em alguns aspectos, os biofilmes são ressuspensos em um volume a 1X, 1,5X, 2X, 2,5X. 3X, 3,5X, 4X, 4,5X, 5X, 5,5X, 6X, 6,5X, 7X, 7,5X, 8X, 8,5X, 9X, 9,5X ou 10X. (II) TRATAMENTO DE BIOFILME

[509] Em alguns aspectos, os biofilmes são esterilizados para exterminar os micróbios restantes que produziram os biofilmes. Em alguns aspectos, a esterilização é o extermínio por calor. Em alguns aspectos, o extermínio por calor é a autoclavagem do biofilme. Em alguns aspectos, a esterilização é a exposição dos biofilmes a raios UV. Em alguns aspectos, a esterilização é a exposição dos biofilmes a raios X. Em alguns aspectos, a esterilização é a exposição dos biofilmes a raios gama.

[510] Em alguns aspectos, a esterilização do biofilme não modula qualquer uma ou mais propriedades ou traços conferidos pelo biofilme.

COMPOSIÇÕES DE BIOFILME

[511] Em alguns aspectos, a composição de biofilme é uma combinação de biofilme com qualquer um ou mais micróbios da presente divulgação. Em alguns aspectos, os biofilmes são misturados com qualquer uma ou mais bactérias da presente divulgação. Em alguns aspectos, os biofilmes são misturados com qualquer um ou mais micróbios fixadores de nitrogênio atmosféricos da presente divulgação.

[512] Em alguns aspectos, a composição do biofilme é uma combinação de dois ou mais biofilmes produzidos por diferentes microrganismos. Em alguns aspectos, os biofilmes da presente divulgação podem ser compostos ou produzidos por uma única espécie microbiana, formando uma cultura pura. Em alguns aspectos, os biofilmes podem ser compostos ou produzidos por um consórcio de bactérias. Em alguns aspectos, os biofilmes podem ser produzidos por uma ou mais espécies microbianas. Em alguns aspectos, os biofilmes podem ser produzidos por pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9 ou pelo menos 10 espécies microbianas.

[513] Em alguns aspectos, o biofilme é exógeno à uma ou mais bactérias às quais é adicionado. Em alguns aspectos, o biofilme é nativo à uma ou mais bactérias às quais é adicionado.

[514] Em alguns aspectos, a composição de biofilme é um líquido. Em alguns aspectos, a composição de biofilme é um sólido. Em alguns aspectos, a composição de biofilme compreende tanto elementos sólidos como líquidos. Em alguns aspectos, a composição de biofilme é um semissólido. Em alguns aspectos, a composição de biofilme é seca. Em alguns aspectos, a composição de biofilme é uma areia. Em alguns aspectos, a composição de biofilme é um pó. Em alguns aspectos, a composição de biofilme é um gel.

[515] Em alguns aspectos, a composição de biofilme compreende qualquer um ou mais elementos divulgados no presente documento.

[516] Em algumas modalidades, a combinação de pelo menos dois biofilmes da presente divulgação exibe um efeito sinérgico, sobre um ou mais traços descritos no presente documento, na presença de um ou mais biofilmes que entram em contato entre si. O efeito sinérgico obtido pelos métodos ensinados pode ser quantificado, por exemplo, de acordo com a fórmula de Colby (ou seja, (E) = X+Y – (X*Y/100)). Consultar Colby, R.S., “Calculating Synergistic and Antagonistic Responses of Herbicide Combinations”, 1967. Weeds. 6:237-245(1990), incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade. Dessa forma, "sinérgico" se destina a refletir um resultado/parâmetro/efeito que foi aumentado em mais do que uma quantidade aditiva.

[517] Em alguns aspectos, os biofilmes são introduzidos em meios líquidos compreendendo qualquer uma ou mais bactérias da presente divulgação. Em alguns aspectos, os biofilmes são introduzidos em meios líquidos compreendendo qualquer uma ou mais bactérias da presente divulgação a uma % em volume de pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% ou 90%

[518] Em alguns aspectos, os biofilmes são introduzidos em meios líquidos compreendendo qualquer uma ou mais bactérias em um volume de 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9: ou 10:1.

[519] O teor de umidade é uma medida da quantidade total de água em uma composição, geralmente expressa como uma porcentagem do peso total. O teor de umidade éuma medida útil para determinar o peso seco de uma composição e pode ser usado para confirmar se o processo de dessecação/secagem de uma composição está completo. O teor de umidade é calculado dividindo o (peso úmido da composição menos o peso após a dessecação/secagem) pelo peso úmido da composição e multiplicando por 100.

[520] O teor de umidade define a quantidade de água em uma composição, porém a atividade da água explica como a água na composição irá reagir com os microrganismos. Quanto maior a atividade da água, mais rápido os microrganismos são capazes de crescer. A atividade da água é calculada encontrando a razão entre a pressão de vapor em uma composição e a pressão de vapor de água pura. Mais especificamente, a atividade de água é a pressão de vapor parcial da água em uma composição dividida pela pressão de vapor parcial do estado padrão de água pura. Água destilada pura tem uma atividade de água de 1. A determinação da atividade de água de uma composição não é a quantidade de água em uma composição, mas sim a quantidade de quantidade de água em excesso que está disponível para uso pelos microrganismos. Os microrganismos têm uma atividade de água mínima e ideal para o crescimento.

[521] Em um aspecto, as composições de biofilme da presente divulgação são dessecadas. Uma composição microbiana é dessecada se o teor de umidade da composição estiver entre 0% e 20%.

[522] Em um aspecto, as composições de biofilme da presente divulgação têm um teor de umidade de cerca de 0,5%, cerca de 0,6%, cerca de 0,7%, cerca de 0,8%, cerca de 0,9%, cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%,

cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 17%, cerca de 18%, cerca de 19%, cerca de 20%, cerca de 21%, cerca de 22%, cerca de 23%, cerca de 24%, cerca de 25%, cerca de 26%, cerca de 27%, cerca de 28%, cerca de 29%, cerca de 30%, cerca de 31%, cerca de 32%, cerca de 33%, cerca de 34%, cerca de 35%, cerca de 36%, cerca de 37%, cerca de 38%, cerca de 39%, cerca de 40%, cerca de 41%, cerca de 42%, cerca de 43%, cerca de 44%, cerca de 45%, cerca de 46%, cerca de 47%, cerca de 48%, cerca de 49%, cerca de 50%, cerca de 51%, cerca de 52%, cerca de 53%, cerca de 54%, cerca de 55%, cerca de 56%, cerca de 57%, cerca de 58%, cerca de 59%, cerca de 60%, cerca de 61%, cerca de 62%, cerca de 63%, cerca de 64%, cerca de 65%, cerca de 66%, cerca de 67%, cerca de 68%, cerca de 69%, cerca de 70%, cerca de 71%, cerca de 72%, cerca de 73%, cerca de 74%, cerca de 75%, cerca de 76%, cerca de 77%, cerca de 78%, cerca de 79%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou cerca de 100%.

[523] Em um aspecto, as composições de biofilme da presente divulgação têm um teor de umidade menor que 0,5%, menor que 0,6%, menor que 0,7%, menor que 0,8%, menor que 0,9%, menor que 1%, menor que 2%, menor que 3%, menor que 4%, menor que 5%, menor que 6%, menor que 7%, menor que 8%, menor que 9%, menor que 10%, menor que 11%, menor que 12%, menor que 13%, menor que 14%, menor que 15%, menor que 16%, menor que 17%, menor que 18%, menor que 19%, menor que 20%, menor que 21%, menor que 22%, menor que 23%, menor que 24%, menor que 25%, menor que 26%, menor que 27%, menor que 28%, menor que 29%, menor que 30%, menor que 31%, menor que 32%, menor que 33%, menor que 34%, menor que 35%, menor que 36%, menor que 37%, menor que 38%, menor que 39%, menor que 40%, menor que 41%, menor que 42%, menor que 43%, menor que 44%, menor que 45%, menor que 46%, menor que 47%, menor que 48%, menor que 49%, menor que 50%, menor que 51%, menor que 52%, menor que 53%, menor que 54%, menor que 55%, menor que 56%, menor que 57%, menor que 58%, menor que 59%, menor que 60%, menor que 61%, menor que 62%, menor que 63%, menor que 64%, menor que 65%, menor que 66%, menor que 67%, menor que 68%, menor que 69%, menor que 70%, menor que 71%, menor que 72%, menor que 73%, menor que 74%, menor que 75%, menor que 76%, menor que 77%, menor que 78%, menor que 79%, menor que 80%, menor que 81%, menor que 82%, menor que 83%, menor que 84%, menor que 85%, menor que 86%, menor que 87%, menor que 88%, menor que 89%, menor que 90%, menor que 91%, menor que 92%, menor que 93%, menor que 94%, menor que 95%, menor que 96%, menor que 97%, menor que 98%, menor que 99% ou menor que 100%.

[524] Em um aspecto, as composições de biofilme da presente divulgação têm um teor de umidade menor que cerca de 0,5%, menor que cerca de 0,6%, menor que cerca de 0,7%, menor que cerca de 0,8%, menor que cerca de 0,9%, menor que cerca de 1%, menor que cerca de 2%, menor que cerca de 3%, menor que cerca de 4%, menor que cerca de 5%, menor que cerca de 6%, menor que cerca de 7%, menor que cerca de 8%, menor que cerca de 9%, menor que cerca de 10%, menor que cerca de 11%, menor que cerca de 12%, menor que cerca de 13%, menor que cerca de 14%, menor que cerca de 15%, menor que cerca de 16%, menor que cerca de 17%, menor que cerca de 18%, menor que cerca de 19%, menor que cerca de 20%, menor que cerca de 21%, menor que cerca de 22%, menor que cerca de 23%, menor que cerca de 24%, menor que cerca de 25%, menor que cerca de 26%, menor que cerca de 27%, menor que cerca de 28%, menor que cerca de 29%, menor que cerca de 30%, menor que cerca de 31%, menor que cerca de 32%, menor que cerca de 33%, menor que cerca de 34%, menor que cerca de 35%, menor que cerca de 36%, menor que cerca de 37%, menor que cerca de 38%, menor que cerca de 39%, menor que cerca de 40%, menor que cerca de 41%, menor que cerca de 42%, menor que cerca de 43%, menor que cerca de 44%, menor que cerca de 45%, menor que cerca de 46%, menor que cerca de 47%, menor que cerca de 48%, menor que cerca de 49%, menor que cerca de 50%, menor que cerca de 51%, menor que cerca de 52%, menor que cerca de 53%, menor que cerca de 54%, menor que cerca de 55%, menor que cerca de 56%, menor que cerca de 57%, menor que cerca de 58%, menor que cerca de 59%, menor que cerca de 60%, menor que cerca de 61%,

menor que cerca de 62%, menor que cerca de 63%, menor que cerca de 64%, menor que cerca de 65%, menor que cerca de 66%, menor que cerca de 67%, menor que cerca de 68%, menor que cerca de 69%, menor que cerca de 70%, menor que cerca de 71%, menor que cerca de 72%, menor que cerca de 73%, menor que cerca de 74%, menor que cerca de 75%, menor que cerca de 76%, menor que cerca de 77%, menor que cerca de 78%, menor que cerca de 79%, menor que cerca de 80%, menor que cerca de 81%, menor que cerca de 82%, menor que cerca de 83%, menor que cerca de 84%, menor que cerca de 85%, menor que cerca de 86%, menor que cerca de 87%, menor que cerca de 88%, menor que cerca de 89%, menor que cerca de 90%, menor que cerca de 91%, menor que cerca de 92%, menor que cerca de 93%, menor que cerca de 94%, menor que cerca de 95%, menor que cerca de 96%, menor que cerca de 97%, menor que cerca de 98%, menor que cerca de 99% ou menor que cerca de 100%.

[525] Em um aspecto, as composições de biofilme da presente divulgação têm um teor de umidade de 1% a 100%, 1% a 95%, 1% a 90%, 1% a 85%, 1% a 80%, 1% a 75%, 1% a 70%, 1% a 65%, 1% a 60%, 1% a 55%, 1% a 50%, 1% a 45%, 1% a 40%, 1% a 35%, 1% a 30%, 1% a 25%, 1% a 20%, 1% a 15%, 1% a 10%, 1% a 5%, 5% a 100%, 5% a 95%, 5% a 90%, 5% a 85%, 5% a 80%, 5% a 75%, 5% a 70%, 5% a 65%, 5% a 60%, 5% a 55%, 5% a 50%, 5% a 45%, 5% a 40%, 5% a 35%, 5% a 30%, 5% a 25%, 5% a 20%, 5% a 15%, 5% a 10%, 10% a 100%, 10% a 95%, 10% a 90%, 10% a 85%, 10% a 80%, 10% a 75%, 10% a 70%, 10% a 65%, 10% a 60%, 10% a 55%, 10% a 50%, 10% a 45%, 10% a 40%, 10% a 35%, 10% a 30%, 10% a 25%, 10% a 20%, 10% a 15%, 15% a 100%, 15% a 95%, 15% a 90%, 15% a 85%, 15% a 80%, 15% a 75%, 15% a 70%, 15% a 65%, 15% a 60%, 15% a 55%, 15% a 50%, 15% a 45%, 15% a 40%, 15% a 35%, 15% a 30%, 15% a 25%, 15% a 20%, 20% a 100%, 20% a 95%, 20% a 90%, 20% a 85%, 20% a 80%, 20% a 75%, 20% a 70%, 20% a 65%, 20% a 60%, 20% a 55%, 20% a 50%, 20% a 45%, 20% a 40%, 20% a 35%, 20% a 30%, 20% a 25%, 25% a 100%, 25% a 95%, 25% a 90%, 25% a 85%, 25% a 80%, 25% a 75%, 25% a 70%, 25% a 65%, 25% a 60%, 25% a 55%, 25% a 50%, 25% a 45%, 25% a 40%, 25% a 35%, 25% a 30%, 30% a 100%, 30% a 95%, 30% a 90%, 30% a 85%, 30% a 80%, 30% a 75%, 30% a 70%, 30% a 65%, 30% a 60%, 30% a 55%, 30% a 50%, 30% a 45%, 30% a

40%, 30% a 35%, 35% a 100%, 35% a 95%, 35% a 90%, 35% a 85%, 35% a 80%, 35% a 75%, 35% a 70%, 35% a 65%, 35% a 60%, 35% a 55%, 35% a 50%, 35% a 45%, 35% a 40%, 40% a 100%, 40% a 95%, 40% a 90%, 40% a 85%, 40% a 80%, 40% a 75%, 40% a 70%, 40% a 65%, 40% a 60%, 40% a 55%, 40% a 50%, 40% a 45%, 45% a 100%, 45% a 95%, 45% a 90%, 45% a 85%, 45% a 80%, 45% a 75%, 45% a 70%, 45% a 65%, 45% a 60%, 45% a 55%, 45% a 50%, 50% a 100%, 50% a 95%, 50% a 90%, 50% a 85%, 50% a 80%, 50% a 75%, 50% a 70%, 50% a 65%, 50% a 60%, 50% a 55%, 55% a 100%, 55% a 95%, 55% a 90%, 55% a 85%, 55% a 80%, 55% a 75%, 55% a 70%, 55% a 65%, 55% a 60%, 60% a 100%, 60% a 95%, 60% a 90%, 60% a 85%, 60% a 80%, 60% a 75%, 60% a 70%, 60% a 65%, 65% a 100%, 65% a 95%, 65% a 90%, 65% a 85%, 65% a 80%, 65% a 75%, 65% a 70%, 70% a 100%, 70% a 95%, 70% a 90%, 70% a 85%, 70% a 80%, 70% a 75%, 75% a 100%, 75% a 95%, 75% a 90%, 75% a 85%, 75% a 80%, 80% a 100%, 80% a 95%, 80% a 90%, 80% a 85%, 85% a 100%, 85% a 95%, 85% a 90%, 90% a 100%, 90% a 95% ou 95% a 100%.

[526] Em um aspecto, as composições de biofilme da presente divulgação têm uma atividade de água de cerca de 0,1, cerca de 0,15, cerca de 0,2, cerca de 0,25, cerca de 0,30, cerca de 0,35, cerca de 0,4, cerca de 0,5, cerca de 0,55, cerca de 0,60, cerca de 0,65, cerca de 0,70, cerca de 0,75, cerca de 0,8, cerca de 0,85, cerca de 0,90 ou cerca de 0,95.

[527] Em um aspecto, as composições de biofilme da presente divulgação têm uma atividade de água menor que cerca de 0,1, menor que cerca de 0,15, menor que cerca de 0,2, menor que cerca de 0,25, menor que cerca de 0,30, menor que cerca de 0,35, menor que cerca de 0,4, menor que cerca de 0,5, menor que cerca de 0,55, menor que cerca de 0,60, menor que cerca de 0,65, menor que cerca de 0,70, menor que cerca de 0,75, menor que cerca de 0,8, menor que cerca de 0,85, menor que cerca de 0,90 ou menor que cerca de 0,95.

[528] Em um aspecto, as composições de biofilme da presente divulgação têm uma atividade de água menor que 0,1, menor que 0,15, menor que 0,2, menor que 0,25, menor que 0,30, menor que 0,35, menor que 0,4, menor que 0,5, menor que 0,55, menor que 0,60, menor que 0,65, menor que 0,70, menor que 0,75, menor que 0,8, menor que 0,85, menor que 0,90 ou menor que 0,95.

[529] Em um aspecto, as composições de biofilme da presente divulgação têm uma atividade de água de 0,1 a 0,95, 0,1 a 0,90, 0,1 a 0,85, 0,1 a 0,8, 0,1 a 0,75, 0,1 a 0,70, 0,1 a 0,65, 0,1 a 0,55, 0,1 a 0,50, 0,1 a 0,45, 0,1 a 0,40, 0,1 a 0,35, 0,1 a 0,3, 0,1 a 0,25, 0,1 a 0,2, 0,1 a 0,15, 0,15 a 0,95, 0,15 a 0,90, 0,15 a 0,85, 0,15 a 0,8, 0,15 a 0,75, 0,15 a 0,70, 0,15 a 0,65, 0,15 a 0,55, 0,15 a 0,50, 0,15 a 0,45, 0,15 a 0,40, 0,15 a 0,35, 0,15 a 0,3, 0,15 a 0,25, 0,15 a 0,2, 0,2 a 0,95, 0,2 a 0,90, 0,2 a 0,85, 0,2 a 0,8, 0,2 a 0,75, 0,2 a 0,70, 0,2 a 0,65, 0,2 a 0,55, 0,2 a 0,50, 0,2 a 0,45, 0,2 a 0,40, 0,2 a 0,35, 0,2 a 0,3, 0,2 a 0,25, 0,25 a 0,95, 0,25 a 0,90, 0,25 a 0,85, 0,25 a 0,8, 0,25 a 0,75, 0,25 a 0,70, 0,25 a 0,65, 0,25 a 0,55, 0,25 a 0,50, 0,25 a 0,45, 0,25 a 0,40, 0,25 a 0,35, 0,25 a 0,3, 0,3 a 0,95, 0,3 a 0,90, 0,3 a 0,85, 0,3 a 0,8, 0,3 a 0,75, 0,3 a 0,70, 0,3 a 0,65, 0,3 a 0,55, 0,3 a 0,50, 0,3 a 0,45, 0,3 a 0,40, 0,3 a 0,35, 0,35 a 0,95, 0,35 a 0,90, 0,35 a 0,85, 0,35 a 0,8, 0,35 a 0,75, 0,35 a 0,70, 0,35 a 0,65, 0,35 a 0,55, 0,35 a 0,50, 0,35 a 0,45, 0,35 a 0,40, 0,4 a 0,95, 0,4 a 0,90, 0,4 a 0,85, 0,4 a 0,8, 0,4 a 0,75, 0,4 a 0,70, 0,4 a 0,65, 0,4 a 0,55, 0,4 a 0,50, 0,4 a 0,45, 0,45 a 0,95, 0,45 a 0,90, 0,45 a 0,85, 0,45 a 0,8, 0,45 a 0,75, 0,45 a 0,70, 0,45 a 0,65, 0,45 a 0,55, 0,45 a 0,50, 0,5 a 0,95, 0,5 a 0,90, 0,5 a 0,85, 0,5 a 0,8, 0,5 a 0,75, 0,5 a 0,70, 0,5 a 0,65, 0,5 a 0,55, 0,55 a 0,95, 0,55 a 0,90, 0,55 a 0,85, 0,55 a 0,8, 0,55 a 0,75, 0,55 a 0,70, 0,55 a 0,65, 0,6 a 0,95, 0,6 a 0,90, 0,6 a 0,85, 0,6 a 0,8, 0,6 a 0,75, 0,6 a 0,70, 0,65 a 0,95, 0,65 a 0,90, 0,65 a 0,85, 0,65 a 0,8, 0,65 a 0,75, 0,7 a 0,95, 0,7 a 0,90, 0,7 a 0,85, 0,7 a 0,8, 0,75 a 0,95, 0,75 a 0,90, 0,75 a 0,85, 0,8 a 0,95, 0,8 a 0,90, 0,8 a 0,85, 0,85 a 0,95, 0,85 a 0,90 ou 0,9 a 0,95. (I) REVESTIMENTOS DE SEMENTE

[530] Em alguns aspectos, a composição de biofilme é aplicada à semente da planta. Em alguns aspectos, a composição do biofilme é aplicada a sementes de milho, soja, canola, sorgo, batata, arroz, vegetais, cereais, pseudocereais e sementes oleaginosas. Exemplos de cereais podem incluir cevada, fonio, aveia, gramínea palmer, centeio, painço, sorgo, espelta, tefe, triticale e trigo. Exemplos de pseudocereais podem incluir noz-de-pão, trigo sarraceno, taboa, chia, linho, amaranto de grãos, hanza, quinoa e gergelim. Em alguns exemplos, as sementes podem ser organismos geneticamente modificados (OGM), não-OGM, orgânicos ou convencionais.

[531] Em alguns aspectos, a composição de biofilme é aplicada à semente da planta revestindo a semente com um líquido, pasta fluida ou pó compreendendo a composição de biofilme. Em alguns aspectos, o revestimento de semente é um revestimento de semente seco. Em alguns aspectos, o revestimento de semente é um revestimento de semente úmido. Em alguns aspectos, o revestimento da semente é aplicado úmido e é deixado secar sobre a semente.

ADMINISTRAÇÃO DA COMPOSIÇÃO DE BIOFILME

[532] A composição de biofilme descrita no presente documento pode ser aplicada em sulco, em talco ou como um tratamento de semente. A composição de biofilme pode ser aplicada a uma embalagem de sementes a granel, mini granel, em um saco ou em talco.

[533] A plantadeira pode plantar a semente tratada e cultivar a cultura de acordo com os métodos convencionais, linhas pareadas ou métodos que não exigem aragem. As sementes podem ser distribuídas usando uma tremonha de controle ou uma tremonha individual. As sementes também podem ser distribuídas usando ar pressurizado ou manualmente. A colocação de sementes pode ser realizada usando tecnologias de taxa variável. Além disso, a aplicação das bactérias ou população bacteriana descrita no presente documento pode ser aplicada usando tecnologias de taxa variável. Em alguns exemplos, as bactérias podem ser aplicadas a sementes de plantas da presente divulgação.

[534] Aditivos como microfertilizante, PGR, herbicida, inseticida e fungicida podem ser usados adicionalmente para tratar as culturas. Exemplos de aditivos incluem protetores de cultura, como inseticidas, nematicidas, fungicidas, agentes de intensificação, como corantes, polímeros, peletização, priming e desinfetantes e outros agentes, como inoculante, PGR, amaciante e micronutrientes. Os PGRs podem ser hormônios vegetais naturais ou sintéticos que afetam o crescimento da raiz, a floração ou o alongamento do talo. PGRs podem incluir auxinas, giberelinas, citocininas, etileno e ácido abscísico (ABA).

[535] A composição pode ser aplicada em sulco em combinação com fertilizante líquido. Em alguns exemplos, o fertilizante líquido pode ser mantido em tanques. Os fertilizantes NPK contêm macronutrientes de sódio, fósforo e potássio.

VIABILIDADE CONFERIDA POR BIOFILME

[536] Em alguns aspectos, "viabilidade", "viabilidade microbiana" ou "viabilidade celular" se referem à porcentagem de células que são capazes de crescer em meio de crescimento sólido ou líquido. Em alguns aspectos, a viabilidade se refere a pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% do número total de células que permanecem viáveis em uma amostra, em comparação com uma composição de referência/controle correspondente.

[537] Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo biofilme exibe uma viabilidade celular aumentada durante um período de tempo mais longo em comparação com uma composição microbiana de controle que carece do biofilme.

[538] Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo biofilme exibe uma viabilidade celular aumentada em comparação com uma composição microbiana de controle que carece do biofilme. Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo biofilme exibe um aumento na viabilidade de pelo menos 5%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 700%, 800% ou 900% em comparação com uma composição de referência/controle correspondente durante o mesmo período de tempo.

[539] Em alguns aspectos, o período de tempo é pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 ou 250 dias após a fabricação da composição microbiana compreendendo biofilme ou da composição de referência/controle correspondente.

[540] Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo biofilme exibe uma viabilidade de pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% ou 95% em um refrigerador ((1,66-4,44 ºC (35-40 °F)) durante um período de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60 dias, em comparação com uma composição de referência/controle correspondente durante o mesmo período de tempo.

[541] Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo biofilme exibe uma viabilidade de pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% ou 95% em um refrigerador ((1,66-4,44 ºC (35-40 °F)) durante um período de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60 semanas, em comparação com uma composição de referência/controle correspondente durante o mesmo período de tempo.

[542] Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo biofilme exibe uma viabilidade de pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% ou 95% à temperatura ambiente ((20-22,22 ºC (68-72 °F)) durante um período de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60 dias, em comparação com uma composição de referência/controle correspondente durante o mesmo período de tempo.

[543] Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo biofilme exibe uma viabilidade de pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% ou 95% à temperatura ambiente ((20-22,22 ºC (68-72°F)) durante um período de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60 semanas, em comparação com uma composição de referência/controle correspondente durante o mesmo período de tempo.

[544] Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo biofilme exibe uma viabilidade de pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% ou 95% em um refrigerador ((21,11-37,77 ºC) (70-100°F)) durante um período de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60 dias, em comparação com uma composição de referência/controle correspondente durante o mesmo período de tempo.

[545] Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo biofilme exibe uma viabilidade de pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% ou 95% a ((21-11-37,77 ºC (70-100°F)) durante um período de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60 semanas, em comparação com uma composição de referência/controle correspondente durante o mesmo período de tempo.

[546] Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo biofilme exibe uma viabilidade de pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% ou 95% a uma temperatura abaixo de -28,88 ºC (-20°F) durante um período de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60 dias, em comparação com uma composição de referência/controle correspondente durante o mesmo período de tempo.

[547] Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo biofilme exibe uma viabilidade de pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% ou 95% a uma temperatura ambiente abaixo de -28,88 ºC (-20°F) durante um período de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60 semanas, em comparação com uma composição de referência/controle correspondente durante o mesmo período de tempo.

[548] Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo biofilme exibe uma estabilidade aumentada no jarro, uma estabilidade aumentada na semente, uma estabilidade aumentada no sulco e/ou uma estabilidade aumentada no talco em comparação com uma composição microbiana de controle que carece do biofilme. Em alguns aspectos, um aumento na estabilidade é medido em termos de viabilidade.

[549] Em alguns aspectos, a composição microbiana que compreende biofilme exibe um aumento na estabilidade, por exemplo, estabilidade no jarro, na estabilidade da semente, na estabilidade em sulco ou na estabilidade em talco (por exemplo, como refletido pelo aumento da viabilidade celular) a temperaturas mais altas como, 30 °C, 37 °C, 45 °C ou 60 °C, em comparação com uma composição microbiana de controle que carece do biofilme.

[550] Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo biofilme exibe um aumento na estabilidade, como um aumento na estabilidade no jarro, na estabilidade de semente, na estabilidade em sulco ou na estabilidade de talco (por exemplo, como refletido por viabilidade celular aumentada) em pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% a temperaturas mais elevadas, como 30 °C, 37 °C, 45 °C ou 60 °C, por um período de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, ou 60 semanas, em comparação com uma composição de referência/controle correspondente que carece do biofilme armazenado sob as mesmas condições.

[551] Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo biofilme exibe um aumento na estabilidade, por exemplo, para um aumento na estabilidade no jarro, na estabilidade de semente, na estabilidade em sulco ou na estabilidade de talco (por exemplo, como refletido pela viabilidade celular aumentada) em pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% a temperaturas mais elevadas como 30 °C, 37 °C, 45 °C ou 60 °C, durante um período de pelo menos 1, 2, 3, 4,

5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60 dias, em comparação com uma composição de referência/controle correspondente que carece do biofilme armazenado sob as mesmas condições.

[552] Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo biofilme exibe uma viabilidade aumentada quando submetida a condições de dessecação, em comparação com uma composição de referência/controle correspondente. Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo biofilme exibe uma viabilidade aumentada quando submetida à secagem por congelamento, em comparação com uma composição de referência/controle correspondente. Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo biofilme exibe uma viabilidade aumentada quando submetida à secagem por atomização, em comparação com uma composição de referência/controle correspondente. Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo biofilme exibe uma viabilidade aumentada quando submetida à liofilização, em comparação com uma composição de referência/controle correspondente. Em alguns aspectos, a composição microbiana compreendendo biofilme exibe uma viabilidade aumentada quando submetida a congelamento por pulverização, em comparação com uma composição de referência/controle correspondente.

EXEMPLOS

[553] Os seguintes exemplos são fornecidos com o propósito de ilustrar várias modalidades da divulgação e não se destinam a limitar a invenção de forma alguma. As alterações na mesma e outros usos que são abrangidos dentro do espírito da divulgação, como definido pelo escopo das reivindicações ocorrerão para os versados na técnica. EXEMPLO 1: REMODELAGEM MICROBIANA GUIADA - UMA

PLATAFORMA PARA O APRIMORAMENTO RACIONAL DE ESPÉCIES MICROBIANAS PARA AGRICULTURA

[554] Um exemplo de visão geral de uma modalidade da plataforma de Remodelagem Microbiana Guiada (GMR) pode ser resumida no esquema da Figura 1A.

[555] A Figura 1A ilustra que a composição do microbioma pode primeiro ser caracterizada e uma espécie de interesse é identificada (por exemplo, para encontrar um micróbio com as características de colonização adequadas).

[556] O metabolismo das espécies de interesse pode ser mapeado e associado à genética. Por exemplo, a via de fixação de nitrogênio do micróbio pode ser caracterizada. A via que está sendo caracterizada pode ser examinada sob uma gama de condições ambientais. Por exemplo, a capacidade de o micróbio fixar o nitrogênio atmosférico na presença de vários níveis de nitrogênio exógeno em seu ambiente pode ser examinada. O metabolismo de nitrogênio pode envolver a entrada de amônia (NH4+) da rizosfera para o citosol das bactérias via o transportador de AmtB. Amônia e L-glutamato (L-Glu) são catalisados pela glutamina sintetase e ATP em glutamina. A glutamina pode levar à formação de biomassa bacteriana e também pode inibir a expressão do operon nif, ou seja, pode ser uma força competitiva quando se deseja que o micróbio fixe nitrogênio atmosférico e excrete amônia. A via de fixação de nitrogênio é caracterizada em mais detalhes nas seções anteriores do relatório descritivo.

[557] Posteriormente, uma alteração genômica não intergenérica alvejada pode ser introduzida no genoma do micróbio, usando métodos incluindo, porém sem limitação: conjugação e recombinação, mutagênese química, evolução adaptativa e edição de genes. A alteração genômica não intergenérica alvejada pode incluir uma inserção, interrupção, deleção, alteração, perturbação, modificação, etc. do genoma.

[558] Os micróbios remodelados derivados, que compreendem o fenótipo desejado resultante do genótipo subjacente remodelado são, então, usados para inocular culturas.

[559] A presente divulgação fornece, em certas modalidades, micróbios remodelados não intergenéricos que são capazes de fixar nitrogênio atmosférico e fornecer tal nitrogênio a uma planta. Em aspectos, esses micróbios remodelados não intergenéricos são capazes de fixar o nitrogênio atmosférico, mesmo na presença de nitrogênio exógeno.

[560] A Figura 1B mostra uma visão expandida da medição da etapa do microbioma. Em algumas modalidades, a presente divulgação encontra espécies microbianas que têm características de colonização desejadas e, então, utiliza essas espécies no processo de remodelagem subsequente.

[561] A plataforma de Remodelagem Microbiana Guiada (GMR) supracitada será descrita agora com mais especificidade.

[562] Em alguns aspectos, a plataforma de GMR compreende as seguintes etapas: A. Isolamento - Obter micróbios do solo, rizosfera, superfície, etc. de uma planta de cultura de interesse; B. Caracterização - Envolve a caracterização dos micróbios isolados para genótipo/fenótipos de interesse (por exemplo, sequência do genoma, capacidade de colonização, atividade de fixação de nitrogênio, capacidade de solubilização de capacidade de P, excreção de um metabólito de interesse, excreção de um composto promotor de plantas, etc.); C. Domesticação - Desenvolvimento de um protocolo molecular para modificação genética não intergenérica do micróbio; D. Campanha e Otimização de Modificação Genética Não Intergenérica - Geração de cepas microbianas não intergenéricas derivadas com modificações genéticas em vias essenciais (por exemplo, genes associados àcolonização, genes de fixação/assimilação de nitrogênio, genes de solubilização de P); E. Análise - Avaliação de cepas não intergenéricas derivadas para fenótipos de interesse in vitro (por exemplo, ensaios ARA) e in planta (por exemplo, ensaios de colonização); F. Iterar Campanha de Modificação Genética/Análise - Iteração das etapas D e E para aprimoramento adicional da cepa microbiana.

[563] Cada uma das etapas do processo da plataforma GMR será elaborada a seguir. A. ISOLAMENTO DE MICRÓBIOS

[564] 1. Obter uma amostra de solo

[565] Os micróbios serão isolados do solo e/ou raízes de uma planta. Em um exemplo, as plantas serão cultivadas em um laboratório ou uma estufa em pequenos vasos. Amostras de solo serão obtidas em várias áreas agrícolas. Por exemplo, solos com diversas características de textura podem ser coletados,

incluindo greda (por exemplo, greda turfosa, greda areosa), solo argiloso (por exemplo, argila pesada, argila siltosa), solo arenoso, solo siltoso, solo turfoso, solo calcário e similares.

[566] 2. Cultivar plantas-iscas

[567] Sementes de uma planta-isca (uma planta de interesse) (por exemplo, milho, trigo, arroz, sorgo, painço, soja, vegetais, frutas, etc.) serão plantadas em cada tipo de solo. Em um exemplo, diferentes variedades de uma planta-isca serão plantadas em vários tipos de solo. Por exemplo, se a planta de interesse for milho, sementes de diferentes variedades de milho, como milho do campo, milho doce, milho tradicional, etc., serão plantadas em vários tipos de solo descritos acima.

[568] 3. Colher amostras do solo e/ou de raiz e placa em meio adequado

[569] As plantas serão colhidas destocando-as após algumas semanas (por exemplo, 2-4 semanas) de crescimento. Uma alternativa para o cultivo de plantas em um laboratório/estufa, o solo e/ou raízes da planta de interesse podem ser coletados diretamente dos campos com diferentes tipos de solo.

[570] Para isolar micróbios e epífitos da rizosfera, as plantas serão removidas suavemente, saturando o solo com água destilada ou afofando suavemente o solo com as mãos para evitar danos às raízes. Se partículas de solo maiores estiverem presentes, essas partículas serão removidas submergindo as raízes em uma poça de água destilada e/ou agitando suavemente as raízes. A raiz será cortada e uma pasta fluida de solo grudada na raiz será preparada colocando a raiz em uma placa ou tubo com uma pequena quantidade de água destilada e agitando suavemente a placa/tubo em um agitador ou centrifugando o tubo em baixa velocidade. Essa pasta fluida será processada conforme descrito abaixo.

[571] Para isolar endófitos, o excesso de solo nas superfícies das raízes será removido com água deionizada. Após a remoção do solo, as plantas serão esterilizadas na superfície e enxaguadas vigorosamente em água esterilizada. Uma seção limpa de 1 cm da raiz será excisada da planta e colocada em uma solução salina tamponada com fosfato contendo microesferas de aço de 3 mm. Uma pasta fluida será gerada por agitação vigorosa da solução com um Qiagen TissueLyser II.

[572] O solo e/ou uma pasta fluida de raiz pode ser processada de várias maneiras, dependendo do traço benéfico à planta desejado dos micróbios a serem isolados. Por exemplo, o solo e a pasta fluida de raiz podem ser diluídos e inoculados em vários tipos de meio de triagem para isolar micróbios rizosféricos, endofíticos, epifíticos e outros micróbios associados a plantas. Por exemplo, se o traço benéfico à planta desejado for a fixação de nitrogênio, então a pasta fluida de solo/raiz será semeada em um meio isento de nitrogênio (por exemplo, meio de ágar Nfb) para isolar os micróbios fixadores de nitrogênio. De modo similar, para isolar bactérias solubilizantes de fosfato (PSB), podem ser usados meios contendo fosfato de cálcio como a única fonte de fósforo. PSB pode solubilizar fosfato de cálcio e assimilar e liberar fósforo em quantidades maiores. Essa reação se manifesta como um halo ou uma zona clara na placa e pode ser usada como uma etapa inicial para isolar PSB.

[573] 4. Separar as colônias, purificar as culturas e verificar a presença de genes de interesse

[574] As populações de micróbios obtidas na etapa A3 são estriadas para obter colônias únicas (culturas puras). Uma parte da cultura pura é ressuspensa em um meio adequado (por exemplo, uma mistura de R2A e glicerol) e submetida à análise de PCR para verificar a presença de um ou mais genes de interesse. Por exemplo, para identificar bactérias fixadoras de nitrogênio (diazotrofos), culturas purificadas de micróbios isolados podem ser submetidas a uma análise de PCR para detectar a presença de genes nif que codificam enzimas envolvidas na fixação de nitrogênio atmosférico em uma forma de nitrogênio disponível para organismos vivos.

[575] 5. Armazenar uma cultura purificada

[576] Culturas purificadas de cepas isoladas serão armazenadas, por exemplo, a -80 °C, para referência e análise futura. B. CARACTERIZAÇÃO DE MICRÓBIOS ISOLADOS

[577] 1. Caracterização Filogenética e Sequenciamento do Genoma Completo

[578] Micróbios isolados serão analisados para caracterização filogenética (atribuição de gênero e espécie) e todo o genoma dos micróbios será sequenciado.

[579] Para a caracterização filogenética, o rDNA 16S do micróbio isolado será sequenciado utilizando iniciadores degenerados de rDNA 16S para gerar identidade filogenética. As leituras da sequência de rDNA 16S serão mapeadas em um banco de dados para inicialmente atribuir o gênero, espécie e nome da cepa a micróbios isolados. O sequenciamento do genoma completo é usado como a etapa final para atribuir gênero/espécie filogenética aos micróbios.

[580] Todo o genoma dos micróbios isolados será sequenciado para identificar as principais vias. Para o sequenciamento do genoma completo, o DNA genômico será isolado usando um kit de isolamento de DNA genômico (por exemplo, QIAmp DNA mini kit da QIAGEN) e uma biblioteca de DNA total será preparada usando os métodos conhecidos na técnica. Todo o genoma será sequenciado usando métodos de sequenciamento de alto rendimento (também chamado de Sequenciamento de Próxima Geração) conhecidos na técnica. Por exemplo, Illumina, Inc., Roche e Pacific Biosciences fornecem ferramentas de sequenciamento do genoma completo que podem ser usadas para preparar bibliotecas de DNA total e realizar o sequenciamento do genoma completo.

[581] Toda a sequência do genoma para cada cepa isolada será montada; genes de interesse serão identificados; anotados; e registrados como alvos potenciais para remodelagem. Todas as sequências do genoma serão armazenadas em um banco de dados.

[582] 2. Testar o micróbio quanto à colonização de uma planta hospedeira em uma estufa

[583] Micróbios isolados serão caracterizados para a colonização de plantas hospedeiras em uma estufa. Para isso, sementes da planta hospedeira desejada (por exemplo, milho, trigo, arroz, sorgo, soja) serão inoculadas com culturas de micróbios isolados individualmente ou em combinação e plantadas no solo. Alternativamente, culturas de micróbios isolados, individualmente ou em combinação, podem ser aplicadas às raízes da planta hospedeira inoculando o solo diretamente sobre as raízes. O potencial de colonização dos micróbios será testado, por exemplo, usando um método de PCR quantitativa (qPCR) descrito em maiores detalhes a seguir.

[584] 3. Testar o micróbio quanto à colonização da planta hospedeira em ensaios de campo em pequena escala e isolar o RNA de amostras de raízes colonizadas (Testes CAT)

[585] Os micróbios isolados serão avaliados quanto à colonização da planta hospedeira desejada em testes de campo em pequena escala. Adicionalmente, o RNA será isolado de amostras de raízes colonizadas para obter dados do transcriptoma da cepa em um ambiente de campo. Esses experimentos de campo em pequena escala são referidos no presente documento como testes CAT (Colonização e Transcrição), uma vez que esses testes fornecem dados de Colonização e Transcrição para a cepa em um ambiente de campo.

[586] Para esses experimentos, sementes da planta hospedeira (por exemplo, milho, trigo, arroz, sorgo, soja) serão inoculadas usando culturas de micróbios isolados individualmente ou em combinação e plantadas no solo. Alternativamente, culturas de micróbios isolados, individualmente ou em combinação, podem ser aplicadas às raízes da planta hospedeira inoculando o solo diretamente sobre as raízes. Os testes CAT podem ser realizados em uma variedade de solos e/ou sob várias temperaturas e/ou condições de umidade para avaliar o potencial de colonização e obter o perfil do transcriptoma do micróbio em vários tipos de solo e condições ambientais.

[587] A colonização das raízes da planta hospedeira pelo micróbio (ou micróbios) inoculado será avaliada, por exemplo, usando um método qPCR conforme descrito abaixo.

[588] Em um protocolo, o potencial de colonização de micróbios isolados foi avaliado da seguinte forma. Um dia após o plantio das sementes de milho, 1 ml de cultura microbiana crescida na noite anterior (meio SOB) foi encharcado bem no local em que a semente estava localizada. 1 ml dessa cultura crescida na noite anterior foi aproximadamente equivalente a cerca de 10^9 ufc, variando dentro de 3 vezes uma da outra, dependendo da cepa que está sendo usada. Cada muda foi fertilizada 3x por semana com 50 ml de solução modificada de Hoagland suplementada com 2, 5mM ou 0,25 mM de nitrato de amônio. Quatro semanas após o plantio, amostras de raízes foram coletadas para extração de DNA. Os detritos do solo foram lavados usando pulverização de água pressurizada. Essas amostras de tecido foram homogeneizadas usando QIAGEN Tissuelyzer e o DNA foi extraído usando QIAmp DNA Mini Kit (QIAGEN) de acordo com o protocolo recomendado. O ensaio de qPCR foi realizado usando Stratagene Mx3005P RT-PCR nesses extratos de DNA usando iniciadores que foram projetados (usando o Primer BLAST do NCBI) para serem específicos para um loci em cada genoma do micróbio.

[589] A presença de cópias do genoma do micróbio foi quantificada, o que refletiu o potencial de colonização do micróbio. A identidade da espécie microbiana foi confirmada pelo sequenciamento dos produtos de amplificação por PCR.

[590] Além disso, o RNA será isolado da raiz colonizada e/ou amostras de solo e sequenciado.

[591] Ao contrário do perfil de DNA, um perfil de RNA varia dependendo das condições ambientais. Portanto, o sequenciamento de RNA isolado de raízes colonizadas e/ou do solo refletirá a atividade transcricional dos genes in planta na rizosfera.

[592] O RNA pode ser isolado da raiz colonizada e/ou amostras de solo em pontos de tempo diferentes para analisar as mudanças no perfil de RNA do micróbio colonizado nesses pontos de tempo.

[593] Por exemplo, o RNA pode ser isolado da raiz colonizada e/ou amostras de solo logo após a fertilização do campo e algumas semanas após a fertilização do campo e sequenciadas para gerar o perfil transcricional correspondente.

[594] De modo similar, o sequenciamento de RNA pode ser realizado sob condições de alto teor de fosfato e baixo teor de fosfato para entender quais genes são transcricionalmente ativos ou reprimidos sob essas condições.

[595] Métodos para sequenciamento transcriptômico/RNA são conhecidos na técnica. Brevemente, o RNA total será isolado da cultura purificada do micróbio isolado; o cDNA será preparado usando transcriptase reversa; e o cDNA será sequenciado usando ferramentas de sequenciamento de alto rendimento descritas acima.

[596] As leituras de sequenciamento da análise do transcriptoma podem ser mapeadas para a sequência genômica e os promotores transcricionais para os genes de interesse podem ser identificados.

[597] 4. Analisar a atividade benéfica às plantas de micróbios isolados

[598] A atividade benéfica às plantas de micróbios isolados será avaliada.

[599] Por exemplo, micróbios fixadores de nitrogênio serão avaliados quanto à atividade de fixação de nitrogênio usando um ensaio de redução de acetileno (ARA) ou micróbios solubilizantes de fosfato serão avaliados quanto à solubilização de fosfato. Qualquer parâmetro de interesse pode ser utilizado e um ensaio adequado desenvolvido para tal. Por exemplo, os ensaios podem incluir curvas de crescimento para métrica de colonização e ensaios para a produção de fitormônios como ácido indol acético (IAA) ou giberelinas. Um ensaio para qualquer atividade benéfica às plantas que seja de interesse pode ser desenvolvido.

[600] Esta etapa confirmará o fenótipo de interesse e eliminará quaisquer falsos positivos.

[601] 5. Seleção de potenciais candidatos de micróbios isolados

[602] Os dados gerados nas etapas acima serão usados para selecionar micróbios para desenvolvimento posterior. Por exemplo, micróbios que mostram uma combinação desejada de potencial de colonização, atividade benéfica às plantas e/ou perfis de DNA e RNA relevantes serão selecionados para domesticação e remodelagem. C. DOMESTICAÇÃO DE MICRÓBIOS SELECIONADOS

[603] Os micróbios selecionados serão domesticados; em que, os micróbios serão convertidos em uma forma que é geneticamente tratável e identificável.

[604] 1. Testar a sensibilidade a antibióticos

[605] Uma maneira de domesticar os micróbios é modificar os mesmos geneticamente com resistência a antibióticos. Para isso, a cepa microbiana do tipo selvagem será testada quanto à sensibilidade a vários antibióticos. Se a cepa for sensível ao antibiótico, então o antibiótico pode ser um bom candidato para uso em ferramentas/vetores genéticos para remodelar a cepa.

[606] 2. Projetar e construir um vetor

[607] Os vetores que são condicionais para sua replicação (por exemplo, um plasmídeo suicida) serão construídos para domesticar os micróbios selecionados (micróbios hospedeiros). Por exemplo, um plasmídeo suicida contendo um marcador de resistência a antibióticos adequado, um marcador contra-selecionável, uma origem de replicação para manutenção em um micróbio doador (por exemplo, E. coli), um gene que codifica uma proteína fluorescente (GFP, RFP, YFP, CFP, e similares) para examinar a inserção através de fluorescência, será construída uma origem de transferência para conjugação no micróbio hospedeiro e uma sequência polinucleotídica que compreende braços de homologia ao genoma do hospedeiro com uma variação genética desejada. O vetor pode compreender um sítio SceI e outros elementos adicionais.

[608] Marcadores de resistência a antibióticos exemplificativos incluem marcador de resistência à ampicilina, marcador de resistência à canamicina, marcador de resistência à tetraciclina, marcador de resistência ao cloranfenicol, marcador de resistência à eritromicina, marcador de resistência à estreptomicina, marcador de resistência à espectinomicina, etc. Marcadores contra-selecionáveis exemplificativos incluem sacB, rpsL, tetAR, pheS, thyA, lacY, gata-1, ccdB, etc.

[609] 3. Geração de micróbios doadores

[610] Em um protocolo, um plasmídeo suicida contendo um marcador de resistência a antibióticos adequado, um marcador contra-selecionável, a origem de replicação λpir para manutenção em E. coli ST18 contendo o gene do iniciador de replicação pir, um gene que codifica a proteína verde fluorescente (GFP) para examinar a inserção através de fluorescência, uma origem de transferência para conjugação no micróbio hospedeiro e uma sequência polinucleotídica compreendendo braços de homologia ao genoma do hospedeiro com uma variação genética desejada (por exemplo, um promotor de dentro do próprio genoma do micróbio para inserção em um local heterólogo) será transformado em E. coli ST18 (um auxotrófico para ácido aminolevulínico, ALA) para gerar micróbios doadores.

[611] 4. Misturar micróbios doadores com micróbios hospedeiros

[612] Micróbios doadores serão misturados com micróbios hospedeiros (micróbios candidatos selecionados da etapa B5) para permitir a integração conjugativa do plasmídeo no genoma do hospedeiro. A mistura de micróbios doadores e hospedeiros será inoculada em um meio contendo o antibiótico e não contendo ALA. O plasmídeo suicida é capaz de se replicar em micróbios doadores (E. coli ST18), porém não no hospedeiro. Portanto, quando a mistura contendo micróbios doadores e hospedeiros é inoculada em um meio contendo o antibiótico e não contendo ALA, apenas as células hospedeiras que integraram o plasmídeo em seu genoma serão capazes de crescer e formar colônias no meio. Os micróbios doadores não crescerão devido à ausência de ALA.

[613] 5. Confirmar a integração do vetor

[614] Uma integração adequada do plasmídeo suicida contendo o marcador de proteína fluorescente, o marcador de resistência a antibióticos, o marcador contra-selecionável, etc. no locus destinado do micróbio hospedeiro será confirmada por fluorescência de colônias na placa e usando PCR de colônia.

[615] 6. Semear colônia de integração confirmada

[616] Uma segunda rodada de recombinação homóloga nos micróbios hospedeiros excluirá (removerá) a cadeia principal do plasmídeo deixando a variação genética desejada (por exemplo, um promotor de dentro do próprio genoma do micróbio para inserção em um local heterólogo) integrado no genoma do hospedeiro de uma certa porcentagem de micróbios hospedeiros, revertendo uma certa porcentagem de volta ao tipo selvagem.

[617] As colônias de micróbios hospedeiros que excluíram a cadeia principal do plasmídeo (e, portanto, excluíram o marcador contra-selecionável) podem ser selecionadas cultivando as mesmas em um meio adequado.

[618] Por exemplo, se sacB for usado como um marcador contra- selecionável, a perda desse marcador devido à perda da estrutura do plasmídeo será testada pelo crescimento das colônias em um meio contendo sacarose (sacB confere sensibilidade à sacarose). As colônias que crescem nesse meio teriam perdido o marcador sacB e a cadeia principal do plasmídeo e poderiam conter a variação genética desejada ou ser revertidas no tipo selvagem. Além disso, essas colônias não irão apresentar fluorescência na placa devido à perda do marcador de proteína fluorescente.

[619] Em alguns isolados, o sacB ou outros marcadores contra- selecionáveis não conferem sensibilidade total à sacarose ou outros mecanismos de contra-seleção, o que exige a triagem de um grande número de colônias para isolar uma exclusão bem-sucedida. Nesses casos, a exclusão pode ser auxiliada pelo uso de um "plasmídeo auxiliar" que se replica independentemente na célula hospedeira e expressa uma endonuclease de restrição, por exemplo, SceI, que reconhece um sítio na cadeia principal do plasmídeo suicida integrado. A cepa com o plasmídeo suicida integrado é transformada com o plasmídeo auxiliar contendo um marcador de resistência a antibióticos, uma origem de replicação compatível com a cepa hospedeira e um gene que codifica uma endonuclease de restrição controlada por um promotor constitutivo ou induzível. A quebra de fita dupla induzida na estrutura do plasmídeo integrado pela endonuclease de restrição promove a recombinação homóloga para excluir o plasmídeo suicida. Isso aumenta o número de colônias excluídas na placa de contra-seleção e diminui o número de colônias que precisam ser examinadas para encontrar uma colônia contendo a mutação desejada. O plasmídeo auxiliar é, então, removido da cepa por cultura e subcultivo em série na ausência de seleção de antibiótico para o plasmídeo. As culturas subcultivadas são semeadas para colônias únicas, as colônias são selecionadas e rastreadas quanto à sensibilidade ao antibiótico usado para a seleção do plasmídeo auxiliar, bem como a ausência do plasmídeo confirmada por PCR de colônia. Por fim, o genoma é sequenciado e a ausência de DNA de plasmídeo auxiliar é confirmada conforme descrito em D6.

[620] 7. Confirmar a integração da variação genética através de PCR de colônia

[621] As colônias que se desenvolveram melhor no meio contendo sacarose (ou outro meio adequado, dependendo da marcação contra-selecionável usada) serão selecionadas e a presença da variação genética no locus destinado será confirmada por triagem das colônias usando PCR de colônia.

[622] Embora esse exemplo descreva um protocolo para domesticar o micróbio e introduzir variação genética no micróbio, um versado na técnica entenderia que a variação genética pode ser introduzida nos micróbios selecionados usando uma variedade de outras técnicas conhecidas na técnica, como : mutagênese por reação em cadeia da polimerase, mutagênese oligonucleotídeo-dirigida, mutagênese de saturação, mutagênese por embaralhamento de fragmentos, recombinação homóloga, sistemas ZFN, TALENS, CRISPR (Cas9, Cpf1, etc.), mutagênese química e combinações das mesmas.

[623] 8. Iterar as etapas C2-C7

[624] Se qualquer uma das etapas C2-C7 não conseguir fornecer o resultado pretendido, as etapas serão repetidas para projetar um vetor alternativo que possa compreender elementos diferentes para facilitar a incorporação das variações genéticas desejadas e marcadores no micróbio hospedeiro.

[625] 9. Desenvolver um procedimento operacional padrão (SOP)

[626] Uma vez que as etapas C2-C7 podem ser reproduzidas de forma consistente para uma determinada cepa, as etapas serão usadas para desenvolver um procedimento operacional padrão (SOP) para essa cepa e vetor. Esse SOP pode ser usado para melhorar outros traços benéficos às plantas do micróbio. D. CAMPANHA DE MODIFICAÇÃO GENÉTICA NÃO INTERGENÉRICA E

OTIMIZAÇÃO

[627] 1. Identificar alvos genéticos para otimização

[628] Os micróbios selecionados serão geneticamente modificados/remodelados para melhorar o desempenho da atividade benéfica às plantas. Para isso, serão identificados alvos genéticos para melhorar a atividade benéfica às plantas.

[629] Os alvos genéticos podem ser identificados de várias maneiras. Por exemplo, os genes de interesse podem ser identificados anotando ao mesmo tempo os genes de todo o sequenciamento do genoma de micróbios isolados. Os mesmos podem ser identificados através de uma pesquisa bibliográfica. Por exemplo, os genes envolvidos na fixação de nitrogênio são conhecidos na literatura. Esses genes conhecidos podem ser usados como alvos para a introdução de variações genéticas. Os alvos genéticos podem também ser identificados com base nos dados de sequenciamento de RNA obtidos na etapa B3 (ensaios de campo em pequena escala para colonização) ou realizando o sequenciamento de RNA descrito na etapa abaixo.

[630] 2. Selecionar promotores para trocas de promotores

[631] Uma variação genética desejada para melhorar a atividade benéfica à planta pode compreender a troca de promotor, em que o promotor nativo para um gene alvo é substituído por um promotor mais forte ou mais fraco (quando comparado ao promotor nativo) de dentro do genoma do micróbio, ou promotor regulado de forma diferente (por exemplo, um independente de N). Se a expressão de um gene alvo aumentar a atividade benéfica à planta (por exemplo, nifA, cuja expressão aumenta a fixação de nitrogênio em micróbios), o promotor desejado para troca de promotor é um promotor mais forte (em comparação com o promotor nativo do gene alvo) que poderia aumentar ainda mais o nível de expressão do gene alvo em comparação com o promotor nativo. Se a expressão de um gene alvo diminuir a atividade benéfica à planta (por exemplo, nifL que regula negativamente a fixação de nitrogênio), o promotor desejado para troca de promotor é um promotor fraco (em comparação com o promotor nativo do gene alvo) que poderia diminuir substancialmente o nível de expressão do gene alvo em comparação com o promotor nativo. Os promotores podem ser inseridos em genes para realizar o "knock-out" da expressão de um gene, enquanto ao mesmo tempo regula positivamente a expressão de um gene a jusante.

[632] Os promotores para troca de promotor podem ser selecionados com base nos dados de sequenciamento de RNA. Por exemplo, os dados de sequenciamento de RNA podem ser usados para identificar promotores fortes e fracos, ou promotores constitutivamente ativos vs. promotores induzíveis.

[633] Por exemplo, para identificar promotores fortes e fracos, ou promotores constitutivamente ativos vs. induzíveis, na via de fixação de nitrogênio, os micróbios selecionados serão cultivados in vitro sob condições depletadas de nitrogênio e repletas de nitrogênio; o RNA do micróbio será isolado dessas culturas; e sequenciado.

[634] Em um protocolo, o perfil de RNA do micróbio sob condições depletadas e repletas de nitrogênio será comparado e os promotores ativos com um nível de transcrição desejado serão identificados. Esses promotores podem ser selecionados para trocar um promotor fraco.

[635] Os promotores podem também ser selecionados usando os dados de sequenciamento de RNA obtidos na etapa B3 que reflete o perfil de RNA do micróbio in planta na rizosfera da planta hospedeira.

[636] O sequenciamento de RNA em várias condições permite a seleção de promotores que: a) são ativos na rizosfera durante o ciclo de crescimento da planta hospedeira em condições de campo fertilizadas, e b) também são ativos em condições in vitro relevantes para que possam ser rapidamente examinados.

[637] Em um protocolo exemplificativo, dados de sequenciamento de RNA in planta de ensaios de colonização (por exemplo, etapa B3) são usados para medir os níveis de expressão de genes em micróbios isolados. Em uma modalidade, o nível de expressão do gene é calculado como leituras por quilobase por milhão de leituras mapeadas (RPKM). O nível de expressão de vários genes é comparado ao nível de expressão de um gene alvo e pelo menos os 10, 20, 30, 40, 50, 60 ou 70 principais promotores, associados aos vários genes, que mostram o nível mais alto ou mais baixo de expressão em comparação com o gene alvo são selecionados como possíveis candidatos para troca de promotor. Assim, pode-se observar os níveis de expressão de vários genes em relação a um gene alvo e, então, selecionar os genes que demonstram expressão aumentada em relação a um gene alvo (ou padrão) e, então, encontrar os promotores associados aos ditos genes.

[638] Por exemplo, se o gene alvo for a regulação positiva de nifA, os primeiros 10, 20, 30, 40, 50 ou 60 promotores para genes que mostram o nível mais alto de expressão em comparação com nifA são selecionados como possíveis candidatos para troca de promotor.

[639] Esses candidatos podem ser ainda pré-selecionados com base em dados de sequenciamento de RNA in vitro. Por exemplo, para nifA como o gene alvo, possíveis candidatos a promotor selecionados com base nos dados de sequenciamento de RNA in planta são ainda selecionados escolhendo-se os promotores com os níveis de expressão de genes similares ou aumentados em comparação com nifA sob condições depletadas de nitrogênio vs. repletas de nitrogênio in vitro.

[640] O conjunto de promotores selecionados nessa etapa é usado para trocar o promotor nativo do gene alvo (por exemplo, nifA). As cepas remodeladas com promotores trocados são testadas em ensaios in vitro; as cepas com atividade mais baixa do que o esperado são eliminadas; e as cepas com atividade esperada ou mais alta do que o esperado são testadas em campo. O ciclo de seleção do promotor pode ser repetido em cepas remodeladas para melhorar ainda mais sua atividade benéfica às plantas.

[641] É descrito aqui um experimento de troca de promotor exemplificativo que foi realizado com base em dados de sequenciamento de RNA in planta e in vitro da cepa CI137 de Klebsiella variicola para melhorar o traço de fixação de nitrogênio. CI137 foi analisado em ensaios de ARA nas concentrações de glutamina 0 mM e 5 mM e o RNA foi extraído dessas amostras de ARA. O RNA foi sequenciado via NextSeq e um subconjunto de leituras de uma amostra foi mapeado para o genoma CI137 (dados de sequenciamento de RNAin vitro). O RNA foi extraído das raízes de plantas de milho no estágio V5 no ensaio de colonização e atividade (por exemplo, etapa B3) para CI137. Amostras de 6 plantas foram agrupadas; o RNA da amostra agrupada foi sequenciado usando NextSeq, e as leituras foram mapeadas para o genoma CI137 (dados de sequenciamento de RNAin planta). De um total de 2x108 leituras, 7x104 leituras mapeadas para CI137. Os dados de sequenciamento de RNAin planta foram usados para classificar genes na ordem dos níveis de expressão in planta e os níveis de expressão foram comparados com o nível de expressão de nifA nativo. Os primeiros 40 promotores que mostraram o nível de expressão mais alto (com base na expressão do gene) em comparação com o nível de expressão de nifA nativo foram selecionados. Esses 40 promotores foram ainda pré-selecionados com base nos dados de sequenciamento de RNA in vitro, em que os promotores com níveis de expressão in vitro aumentados ou similares em comparação com nifA foram selecionados. A lista final de promotores incluiu 17 promotores e 2 versões da maioria dos promotores foram usadas para gerar mutantes de troca de promotor; assim, um total de 30 promotores foi testado. A geração de um conjunto de mutantes CI137 em que nifL foi deletado parcial ou completamente e os 30 promotores inseridos (ΔnifL::Prm) foram testados. 28 de 30 mutantes foram gerados com sucesso. Os mutantes ΔnifL::Prm foram analisados em ensaios de ARA nas concentrações de glutamina 0mM e 5mM e o RNA foi extraído dessas amostras de ARA. Vários mutantes mostraram atividade ARA mais baixa do que o esperado ou diminuída em comparação com a cepa WT CI137. Alguns mutantes mostraram atividade de ARA mais alta do que o esperado.

[642] Uma pessoa versada na técnica entenderá a partir do exemplo acima que, embora os dados de sequenciamento de RNA in planta e/ou in vitro possam ser usados para selecionar promotores para troca de promotor, a etapa de seleção de promotor é altamente imprevisível e envolve muitos desafios.

[643] Por exemplo, o sequenciamento de RNA in planta revela principalmente os genes que são altamente expressos; no entanto, é difícil detectar diferenças sutis na expressão do gene e/ou genes com baixos níveis de expressão. Por exemplo, em alguns experimentos de sequenciamento de RNA in planta, apenas cerca de 40 de cerca de 5000 genes de um genoma microbiano foram detectados. Assim, a técnica de sequenciamento de RNA in planta é útil para identificar genes expressos abundantemente e seus promotores correspondentes; no entanto, a técnica tem dificuldade para identificar genes de baixa expressão e promotores correspondentes e pequenas diferenças entre a expressão gênica.

[644] Além disso, o perfil de RNA in planta reflete o estado dos genes no momento em que os micróbios foram isolados; no entanto, uma ligeira mudança nas condições de campo pode alterar substancialmente o perfil de RNA de micróbios rizosféricos/epifíticos/endofíticos. Portanto, é difícil prever com antecedência se os promotores selecionados com base em dados de sequenciamento de RNA de um ensaio de campo forneceriam níveis de expressão desejáveis do gene alvo quando cepas remodeladas são testadas in vitro e em campo.

[645] Além disso, a avaliação in planta consome tempo e recursos; portanto, experimentos in planta não podem ser conduzidos com frequência e/ou repetidos de maneira rápida ou fácil. Por outro lado, embora o sequenciamento de RNA in vitro possa ser conduzido de maneira relativamente rápida e fácil, as condições in vitro não mimetizam as condições de campo e os promotores que podem apresentar alta atividade in vitro podem não apresentar atividade comparável in planta.

[646] Além disso, os promotores muitas vezes não se comportam como previsto em um novo contexto. Portanto, os dados de sequenciamento de RNA in planta e in vitro podem, na melhor das hipóteses, servir como um ponto de partida na etapa de seleção do promotor; no entanto, chegar a qualquer promotor específico que poderia fornecer níveis de expressão desejáveis do gene alvo no campo é, em alguns casos, imprevisível.

[647] Outra limitação na etapa de seleção do promotor é o número de promotores disponíveis. Devido ao fato de que um dos objetivos da presente invenção é fornecer micróbios não transgênicos; promotores para troca de promotor precisam ser selecionados de dentro do genoma ou gênero do micróbio. Assim, ao contrário de uma abordagem transgênica, o presente processo não pode simplesmente entrar na literatura e encontrar/usar um promotor transgênico bem caracterizado de um organismo hospedeiro diferente.

[648] Outra restrição é que o promotor deve ser ativo in planta durante uma fase de crescimento desejada. Por exemplo, o maior requisito de nitrogênio nas plantas é geralmente no final da estação de crescimento, por exemplo, fases vegetativas tardias e reprodutivas iniciais. Por exemplo, no milho, a absorção de nitrogênio é mais alta durante os estágios V6 (6 folhas) a R1 (estágio reprodutivo 1). Portanto, para aumentar a disponibilidade de nitrogênio durante os estágios V6 a R1 do milho, os micróbios remodelados devem apresentar maior atividade de fixação de nitrogênio durante esses estágios do ciclo de vida do milho. Consequentemente, os promotores que são ativos in planta durante os estágios vegetativos tardios e reprodutivos iniciais do milho precisam ser selecionados. Essa restrição não apenas reduz o número de promotores que podem ser testados na troca de promotor, como também torna a etapa de seleção de promotor imprevisível. Como discutido acima, a imprevisibilidade surge, em parte, pois embora os dados de sequenciamento de RNA de ensaios de campo em pequena escala (por exemplo, etapa B3) possam ser usados para identificar promotores que são ativos in planta durante um estágio de crescimento desejado, os dados de RNA são baseados nas condições de campo (por exemplo, tipo de solo, nível de água no solo, nível de nitrogênio disponível, etc.) no momento da coleta da amostra. Como um versado na técnica entenderia, as condições de campo podem mudar ao longo do período de tempo dentro do mesmo campo e também mudar substancialmente em vários campos. Assim, os promotores selecionados sob uma condição de campo podem não se comportar como esperado em outras condições de campo. Da mesma forma, os promotores selecionados podem não se comportar como esperado após a troca. Portanto, é difícil antecipar se os promotores selecionados seriam ativos in planta durante uma fase de crescimento desejada de uma planta de interesse.

[649] 3. Projetar variações genéticas não intergenéricas

[650] Com base nas etapas D1 (identificação de alvos gênicos) e D2

(identificação de promotores para troca de promotores), variações genéticas não intergenéricas serão projetadas.

[651] O termo "não intergenérico" indica que a variação genética a ser introduzida no hospedeiro não contém uma sequência de ácidos nucleicos de fora do gênero hospedeiro (ou seja, nenhum DNA transgênico). Embora vetores e/ou outras ferramentas genéticas sejam usadas para introduzir a variação genética no micróbio hospedeiro, os métodos da presente divulgação incluem etapas para excluir (remover) as sequências de vetor de cadeia principal ou outras ferramentas genéticas introduzidas no micróbio hospedeiro, deixando apenas a variação genética desejada no genoma do hospedeiro. Assim, o micróbio resultante é não transgênico.

[652] Variações genéticas não intergenéricas exemplificativas incluem uma mutação no gene de interesse que pode melhorar a função da proteína codificada pelo gene; um promotor constitucionalmente ativo que pode substituir o promotor endógeno do gene de interesse para aumentar a expressão do gene; uma mutação que inativará o gene de interesse; a inserção de um promotor de dentro do genoma do hospedeiro em uma localização heteróloga, por exemplo, a inserção do promotor em um gene que resulta na inativação do dito gene e na regulação positiva de um gene a jusante; e similares. As mutações podem ser mutações pontuais, inserções e/ou deleções (deleção total ou parcial do gene). Por exemplo, em um protocolo, para melhorar a atividade de fixação de nitrogênio do micróbio hospedeiro, uma variação genética desejada pode compreender uma mutação de inativação do gene nifL (regulador negativo da via de fixação de nitrogênio) e/ou compreender a substituição do promotor endógeno do gene nifH (proteína nitrogenase de ferro que catalisa uma reação essencial para fixar o nitrogênio atmosférico) por um promotor constitucionalmente ativo que irá conduzir a expressão do gene nifH constitutivamente.

[653] 4. Gerar cepas derivadas não intergenéricas

[654] Após projetar as variações genéticas não intergenéricas, as etapas C2-C7 serão realizadas para gerar cepas derivadas não intergenéricas (ou seja, micróbios remodelados).

[655] 5. Armazenar uma cultura purificada do micróbio remodelado

[656] Uma cultura purificada do micróbio remodelado será preservada em um banco, de modo que o gDNA possa ser extraído para o sequenciamento do genoma completo descrito a seguir.

[657] 6. Confirmar a presença da variação genética desejada

[658] O DNA genômico do micróbio remodelado será extraído e o sequenciamento do genoma completo será realizado no DNA genômico usando os métodos descritos anteriormente. As leituras resultantes serão mapeadas para as leituras anteriormente armazenadas em LIMS para confirmar: a) presença da variação genética desejada, e b) ausência completa de mapeamento de leituras para sequências de vetores (por exemplo, cadeia principal de plasmídeo ou sequência de plasmídeo auxiliar) que foram usados para gerar o micróbio remodelado.

[659] Essa etapa permite a detecção sensível de DNA de gênero não hospedeiro (DNA transgênico) que pode permanecer na cepa após a exclusão do método de cadeia principal do vetor (por exemplo, plasmídeo suicida) e pode fornecer um controle para a inserção fora do alvo acidental da variação genética, etc. E. ANÁLISE DE MICRÓBIOS REMODELADOS

[660] 1. Análise da atividade benéfica às plantas

[661] A atividade benéfica às plantas e a cinética de crescimento dos micróbios remodelados serão avaliadas in vitro.

[662] Por exemplo, cepas remodeladas para melhorar a função de fixação de nitrogênio serão avaliadas quanto à atividade de fixação de nitrogênio e adequação através de ensaios de redução de acetileno, ensaios de excreção de amônio, etc.

[663] As cepas remodeladas para solubilização de fosfato aprimorada serão avaliadas quanto à atividade de solubilização de fosfato.

[664] Essa etapa permite a triagem rápida, de médio a alto rendimento de cepas remodeladas para os fenótipos de interesse.

[665] 2. Análise da colonização e transcrição dos genes alterados

[666] As cepas remodeladas serão avaliadas quanto à colonização da planta hospedeira na estufa ou no campo usando as etapas descritas em B3. Além disso, o RNA será isolado das amostras de raiz colonizada e/ou solo e sequenciado para analisar a atividade transcricional de genes alvo. Os genes alvo compreendem os genes que contêm a variação genética introduzida e também podem compreender outros genes que exercem uma função no traço benéfico às plantas do micróbio.

[667] Por exemplo, um grupo de genes, os genes nif, controla a atividade de fixação de nitrogênio de micróbios. Com o uso do protocolo descrito acima, uma variação genética pode ser introduzida em um dos genes nif (por exemplo, uma inserção de promotor), enquanto os outros genes no aglomerado nif estão em sua forma endógena (ou seja, sua sequência de genes e/ou a região do promotor não é alterada). Os dados de sequenciamento de RNA serão analisados quanto à atividade transcricional do gene nif contendo a variação genética e podem também ser analisados quanto a outros genes nif que não são alterados diretamente, pela alteração genética inserida, porém ainda assim podem ser influenciados pela alteração genética introduzida.

[668] Essa etapa permite a determinação da adequação das cepas de melhor desempenho in vitro na rizosfera e permite a medição da atividade transcricional de genes alterados in planta. F. Iterar Campanha/Análise de Modificação Genética

[669] Os dados de análise in vitro e in planta (etapas E1 e E2) serão usados para empilhar mutações benéficas de forma iterativa.

[670] Além disso, as etapas A-E descritas acima podem ser repetidas para ajustar os traços benéficos às plantas dos micróbios. Por exemplo, as plantas serão inoculadas usando cepas microbianas remodeladas na primeira rodada; colhidas após algumas semanas de crescimento; e os micróbios do solo e/ou das raízes das plantas serão isolados. A atividade funcional (traço benéfico às plantas e potencial de colonização) e o perfil de DNA e RNA de micróbios isolados serão caracterizados, para selecionar micróbios com atividade benéfica às plantas e potencial de colonização aprimorados. Os micróbios selecionados serão remodelados para aprimorar ainda mais a atividade benéfica às plantas. Os micróbios remodelados serão avaliados quanto àatividade funcional (traço benéfico à planta e potencial de colonização) e perfil de RNA in vitro e in planta e as cepas de melhor desempenho serão selecionadas. Se desejado, as etapas A-E podem ser repetidas para melhorar ainda mais a atividade benéfica às plantas dos micróbios remodelados da segunda rodada. O processo pode ser repetido por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais rodadas.

[671] As etapas exemplificativas descritas acima estão resumidas na Tabela A abaixo. TABELA A - UMA VISÃO GERAL DE UMA MODALIDADE DA

PLATAFORMA DE REMODELAGEM MICROBIANA GUIADA Etapas Contribuição Formas Alternativas A Isolamento Fornecer micróbios do 1 Obter uma amostra de solo solo WT que serão isolados Permitir a seleção de Cultivar "plantas-iscas" de Trigo, sorgo, arroz, 2 micróbios benéficos às milho em amostra de solo painço, soja, etc. plantas pela rizosfera Selecionar por exclusão Outros meios isentos Colher, limpar e extrair a os micróbios do solo de nitrogênio, outros amostra de raiz e placa em quanto aqueles que a) meios seletivos ou de 3 meio isento de nitrogênio colonizam a raiz e b) triagem (por exemplo, (especificamente NfB) fixam nitrogênio para solubilização de atmosférico fosfato) Iniciadores Selecionar por exclusão degenerados para Separar colônias, purificar os micróbios quanto outros genes de culturas e examinar a aqueles que contêm o 4 interesse, por presença de nifH usando gene nifH (eliminar os exemplo, ipdC iniciadores degenerados falsos positivos do (biossíntese de exame de meio) fitormônios) Armazenar uma cultura 5 purificada da cepa B Caracterização Sequenciar e montar o genoma da cepa usando a Caracterizar o genoma 1 plataforma Illumina e/ou para as principais vias PacBio Testar o micróbio quanto à Trigo, sorgo, arroz, Selecionar por exclusão colonização de raízes de painço, soja, etc., 2 micróbios que colonizam milho na estufa (método outros métodos para bem a planta baseado em qPCR) testar a colonização

Etapas Contribuição Formas Alternativas (por exemplo, plaqueamento) Conhecidos Testar o micróbio quanto à Testes de campo internamente como colonização de raízes de maiores, outras testes "CAT", os milho em testes de campo culturas, outros mesmos fornecem 3 em pequena escala (método métodos para testar a dados de Colonização e baseado em qPCR) e isolar colonização (por Transcrição para a cepa o RNA de amostras de exemplo, em um ambiente de raízes colonizadas plaqueamento) campo Testar o micróbio quanto à atividade de fixação de Confirmar o fenótipo de 4 nitrogênio em um ensaio de fixação de N da cepa redução de acetileno (ARA) Usar os dados acima para selecionar o micróbio Permitir a seleção de 5 candidato para candidatos com maior domesticação e otimização potencial posteriores C Domesticação Determinar quais marcadores de seleção Testar os micróbios quanto à de antibióticos podem 1 sensibilidade a vários ser usados para antibióticos transformar ferramentas genéticas Projetar e construir um plasmídeo suicida contendo um marcador de resistência a antibióticos adequado, O plasmídeo pode marcador contra- Essas são as "partes" conter um sítio SceI ou selecionável sacB, origem necessárias para manter outro marcador contra- de replicação para o plasmídeo e realizar a selecionável, 2 manutenção em E. coli, GFP conjugação, inserção e repórteres para examinar a inserção "exclusão" do genoma fluorescentes por fluorescência, origem de do hospedeiro alternativos, elementos transferência para adicionais conjugação no hospedeiro, braços de homologia ao genoma do hospedeiro e a mutação desejada.

Transformar o plasmídeo Preparação para Poderia usar uma cepa 3 suicida em ST18 de E. coli conjugação no de doador diferente de

Etapas Contribuição Formas Alternativas (um auxotrófico para ácido hospedeiro; manutenção E. coli ou outro aminolevulínico, ALA) para de plasmídeo micróbio; marcador gerar células doadoras auxotrófico diferente O plasmídeo suicida é capaz de se replicar em E. coli, porém não no hospedeiro. Portanto, o plaqueamento da Misturar as células do mistura em tais placas doador com as células significa que apenas as Poderia usar uma cepa hospedeiras receptoras para células hospedeiras que de doador diferente de conjugação, e plaqueamento 4 receberam o plasmídeo E. coli ou outro no meio selecionando o e experimentaram a micróbio; marcador marcador de resistência a integração do plasmídeo auxotrófico diferente antibióticos e NÃO contendo no cromossomo serão

ALA capazes de crescer e formar colônias. A ST18 de E coli é incapaz de crescer devido à ausência de ALA. Confirmar a integração Confirmar a integração do adequada da cadeia plasmídeo através de principal do plasmídeo fluorescência de GFP e 5 suicida contendo GFP, o integração no locus cassete de resistência a destinado através de PCR antibióticos, o marcador de colônia sacB, etc. O marcador sacB confere sensibilidade à sacarose; as colônias Semear colônia de que sofreram uma Marcador contra- integração confirmada em segunda rodada de selecionável diferente, 6 uma placa contendo recombinação homóloga exclusão mediada por sacarose e examinar quanto e "excluíram" o SceI, etc. a colônias não fluorescentes plasmídeo crescerão melhor e não fluorescem na placa. Após o segundo evento de recombinação Examinar colônias excluídas homóloga, apenas 50% 7 quanto à mutação destinada das colônias excluídas usando PCR de colônia devem conter a mutação, os outros 50% serão WT

Etapas Contribuição Formas Alternativas Se qualquer uma das etapas Permitir a solução de 2 a 7 falhar, voltar para a problemas iterativos de 8 etapa 2 e redesenhar com plasmídeo suicida para partes alternativas do desenvolver um plasmídeo protocolo de trabalho Uma vez que as etapas 2 a 7 podem ser realizadas de forma confiável, desenvolver 9 um SOP para essa cepa/plasmídeo que será usado para Otimização Campanha de Modificação D Genética Não Intergenérica e Otimização Identificar alvos genéticos para otimizar uma via, por 1 exemplo, genes nif através de pesquisa bibliográfica Após a seleção de promotores que a) são Selecionar promotores para ativos na rizosfera Culturas alternativas; trocas de promotor usando durante o ciclo de condições alternativas dados de RNAseq coletados crescimento de milho em de dados RNAseq in vitro em condições condições de campo 2 (estufa, campo, in vitro, depletadas de N e repletas fertilizadas b) são o que for relevante de N, e in planta da rizosfera também ativos em para o fenótipo do milho (Coletados na condições repletas de N alvejado) etapa B3) in vitro para que possam ser rapidamente examinados.

Projetar mutações não intergenéricas em genes Nenhum DNA de fora do essenciais: deleções (gene Alterar sequências cromossomo hospedeiro total ou parcial), trocas de reguladoras (por 3 é adicionado, portanto, o promotor ou alterações de exemplo, RBS), RNAs micróbio resultante énão par de bases simples; não codificadores, etc. transgênico armazenar esses projetos em LIMS Isso foi realizado em um Usar o protocolo rendimento mais alto do estabelecido, executar as que a etapa de 4 etapas C2-7 para gerar domesticação - até 20 ou cepas derivadas não mais cepas de uma vez intergenéricas (mutantes) por pessoa.

Etapas Contribuição Formas Alternativas Armazenar uma cultura purificada da cepa, extrair 5 gDNA e conduzir WGS via Illumina A remoção do plasmídeo suicida é Mapear as leituras Permitir a detecção bastante confiável; no resultantes para os projetos muito sensível de DNA entanto, o uso de armazenados em LIMS para não intergenérico que outros plasmídeos confirmar a) presença da pode permanecer na estáveis em métodos mutação desejada e b) cepa após o método do alternativos requer 6 ausência completa de plasmídeo suicida; essa etapa adicional mapeamento de leituras confirmar a ausência de para garantir com total para qualquer plasmídeo DNA transgênico, confiança que nenhum suicida ou outras sequências controlar a inserção fora DNA transgênico que de plasmídeo usadas para do alvo acidental do foi anteriormente gerar as cepas plasmídeo suicida, etc. transformado permaneça na cepa. E Análise Analisar as cepas quanto à Qualquer outro ensaio atividade de fixação de Permitir a triagem rápida, in vitro, por exemplo, nitrogênio in vitro e de médio a alto solubilização de 1 adequação através de ARA, rendimento de mutantes fosfato, qPCR para ensaios de excreção de para os fenótipos de transcrição de genes amônio e curvas de interesse. específicos, etc. crescimento Medir a aptidão das Analisar as cepas quanto à cepas de melhor colonização (qPCR) e desempenho in vitro na transcrição de genes alvo e 2 rizosfera; medir a trocados por promotor transcrição de genes (Nanostring) na planta trocados por promotor in (estufa ou campo) planta Iterar Campanha/Análise

F de Modificação Genética Usar dados de análise in vitro e in planta para 1 empilhar mutações benéficas de forma iterativa.

[672] Abordagens Tradicionais para Criar Produtos Biológicos para a Agricultura Sofrem de Desvantagens Inerentes à sua Metodologia

[673] Ao contrário da bioprospecção pura de micróbios do tipo selvagem (WT) ou abordagens transgênicas, GMR permite a otimização genética não intergenérica das principais redes reguladoras dentro do micróbio, o que melhora os fenótipos benéficos às plantas em relação aos micróbios WT, porém não tem os riscos associados a abordagens transgênicas (por exemplo, função genética imprevisível, questões públicas e regulatórias). Consultar, a Figura 1C para uma representação de uma abordagem problemática de "bioprospecção tradicional", que tem várias desvantagens em comparação com a plataforma GMR ensinada.

[674] Outros métodos para o desenvolvimento de micróbios para a agricultura são concentrados no desenvolvimento extensivo de laboratório, que muitas vezes falha no teste de escala de campo, ou estufa extensiva ou de “primeiro em campo” sem uma compreensão dos mecanismos/interações planta-micróbio subjacentes. Consultar, a Figura 1D para uma representação de uma abordagem problemática de "primeiro campo”, que tem várias desvantagens em comparação com a plataforma GMR ensinada.

[675] A Plataforma GMR Resolve esses Problemas de Várias Maneiras

[676] Um ponto forte da plataforma GMR é a identificação de promotores ativos, que são ativos em momentos essenciais fisiologicamente importantes para uma cultura alvo, e que também são ativos sob condições ambientais específicas e relevantes para a agricultura.

[677] Como foi explicado, no contexto da fixação de nitrogênio, a plataforma GMR écapaz de identificar sequências promotoras microbianas, que são ativas sob condições ambientais de nitrogênio exógeno elevado, o que permite ao micróbio remodelado fixar nitrogênio atmosférico e entregar o mesmo a uma planta de cultura alvo, sob condições de cultura de linha agrícola modernas, e no momento em que uma planta mais precisa de nitrogênio fixado. Consultar, a Figura 1E para uma representação do período de tempo no ciclo de crescimento do milho, em que o nitrogênio é mais necessário para a planta. A plataforma GMR ensinada é capaz de criar micróbios remodelados que fornecem nitrogênio a uma planta de milho no período de tempo em que o nitrogênio é necessário e também entregam esse nitrogênio mesmo na presença de nitrogênio exógeno no ambiente do solo.

[678] Esses promotores podem ser identificados por sequenciamento de

RNA da rizosfera e mapeamento de leitura para a sequência do genoma do micróbio, e as principais vias podem ser "reprogramadas" para serem ativadas ou desativadas durante os estágios principais do ciclo de crescimento da planta. Além disso, através de sequenciamento do genoma completo de micróbios otimizados e mapeamento para sequências anteriormente transformadas, o método tem a capacidade de garantir que nenhuma sequência transgênica seja acidentalmente liberada no campo através da inserção fora do alvo de DNA plasmidial, retenção de baixo nível de plasmídeos não detectados através de PCR ou resistência a antibióticos, etc.

[679] A plataforma GMR combina essas abordagens avaliando micróbios de forma iterativa no laboratório e no ambiente da planta, levando a micróbios que são robustos em condições de estufa e de campo, e não apenas em condições de laboratório.

[680] Vários aspectos e modalidades da plataforma GMR ensinada podem ser encontrados nas Figuras 1F-1I. A plataforma GMR culmina na derivação/criação/produção de micróbios remodelados que possuem uma propriedade benéfica às plantas, por exemplo, fixação de nitrogênio.

[681] Os métodos tradicionais de bioprospecção não são capazes de produzir micróbios com as propriedades acima mencionadas.

[682] Propriedades de um Micróbio Remodelado para Fixação de Nitrogênio

[683] No contexto da remodelagem de micróbios para fixação de nitrogênio, existem várias propriedades que o micróbio remodelado pode possuir. Por exemplo, a Figura 1J representa 5 propriedades que podem ser possuídas por micróbios remodelados da presente divulgação.

[684] Os presentes inventores utilizaram a plataforma GMR para produzir bactérias não intergenéricas remodeladas (ou seja, Kosakonia sacchari) capazes de fixar o nitrogênio atmosférico e entregar o dito nitrogênio a uma planta de milho, mesmo sob condições em que o nitrogênio exógeno está presente no ambiente. Consultar, a Figura 1K-M, que ilustra que o processo de remodelagem com sucesso: (1) desacoplou a expressão de nifA da regulação de nitrogênio endógeno; e (2) melhorou a assimilação e excreção de nitrogênio fixado.

[685] Esses micróbios remodelados resultam, por fim, na melhora do rendimento de milho, quando aplicados às culturas de milho. Consultar, a Figura 1N

[686] A Plataforma GMR Fornece uma Abordagem para a Fixação e Entrega de Nitrogênio que Resolve Preocupações Ambientais Urgentes

[687] Como explicado anteriormente, o fertilizante de nitrogênio produzido pelo processo industrial Haber-Bosch não é bem utilizado pela cultura alvo. A chuva, o escoamento, o calor, a volatilização e o microbioma do solo degradam o fertilizante químico aplicado. Isso equivale não apenas a dinheiro desperdiçado, mas também aumenta a poluição em vez da produção real. Para esta finalidade, as Nações Unidas calculam que quase 80% do fertilizante é perdido antes que uma cultura possa utilizá-lo. Consequentemente, a produção e a entrega de fertilizantes agrícolas modernos não só são prejudiciais ao meio ambiente, como também são extremamente ineficientes. Consultar, Figura 10, ilustra a ineficiência de sistemas de entrega de nitrogênio atuais, que resultam em campos subfertilizados, campos superfertilizados e escoamento de nitrogênio prejudicial ao meio ambiente.

[688] A plataforma GMR atual e os micróbios remodelados resultantes fornecem uma abordagem melhor para a fixação e entrega de nitrogênio às plantas. Como será observado nos Exemplos abaixo, os micróbios remodelados não intergenéricos da divulgação são capazes de colonizar as raízes de uma planta de milho e alimentar as ditas plantas de milho com nitrogênio atmosférico fixo, mesmo na presença de nitrogênio exógeno. Esse sistema de fixação e entrega de nitrogênio - habilitado pela plataforma GMR ensinada - ajudará a transformar a agricultura moderna em um sistema mais ambientalmente sustentável. EXEMPLO 2: ESTABILIDADE MICROBIANA CONFERIDA POR POLÍMERO - CONFERINDO A CAPACIDADE PROTETORA DE POLÍMEROS

COM O MICRÓBIO DESEJADO

[689] A polivinilpirrolidona-acetato de vinila (PVP-VA), um polímero, foi usada como agente protetor durante o armazenamento líquido ou seco das bactérias, Klebsiella variicola.

ARMAZENAMENTO LÍQUIDO DE MICRÓBIOS

[690] Uma solução que compreende PVP-VA a 20% e uma cultura isolada de Klebsiella variicola foi preparada, bem como várias soluções de controle. As soluções que compreendem as bactérias foram divididas em alíquotas em múltiplos frascos, vedados e armazenados à temperatura ambiente. Após 200 dias e 250 dias (Tabela B) e após 118 dias e 200 dias (Tabela C), as amostras divididas em alíquotas foram avaliadas quanto às unidades formadoras de colônias.

[691] No dia 118, a cultura de controle de Klebsiella variicola que carece do polímero PVP-VA exibiu uma perda logarítmica de ~10,10. No mesmo dia, a cultura de Klebsiella variicola contendo PVP-VA exibiu uma perda logarítmica de 2,7. No dia 200, a cultura de controle de Klebsiella variicola que carece do polímero PVP- VA exibiu uma perda logarítmica de ~10,10. No mesmo dia, a cultura de Klebsiella variicola contendo PVP-VA exibiu uma perda logarítmica de 2,70. A cultura de Klebsiella variicola contendo PVP-VA exibiu uma estabilidade aumentada nos dias 118 e 200 em comparação com o controle que carece do polímero PVP-VA. Consultar, a Tabela C. Em ambos os dias 200 e 250, as culturas de Klebsiella variicola contendo PVP-VA exibiram perdas logarítmicas menores do que os tratamentos com Trealose e Triptona. Consultar, a Tabela B.

[692] Tabela B: Perda de viabilidade do caldo armazenado (estabilidade durante o armazenamento) a 4 ºC.

Armazenamento Armazenamento a Longo Prazo a Curto Prazo Caldo a 4 °C Perda logarítmica Perda logarítmica Perda logarítmica em 21 dias em 200 dias em 250 dias A03 - Leite 0,06 0,61 0,68 Desnatado a 20% A06 - Trealose a 0,22 7,04 7,28 20% A10 - Sacarose a 0,09 1,5 2,26 20% A18 - Triptona a 0,04 6,16 6,8 20% A20 - PVP-VA a 0 2,5 2,81 20% Sem Emenda 0 1,4 2,03

[693] Tabela C: Perda de viabilidade do caldo armazenado à temperatura ambiente.

Armazenamento a Armazenamento a Longo Prazo Curto Prazo Caldo RT Perda logarítmica Perda logarítmica Perda logarítmica em 21 dias em 118 dias em 200 dias A03 - Leite 0,18 10,12 10,12 Desnatado a 20% A06 - Trealose a 3,16 10,06 10,06 20% A10 - Sacarose a 2,04 10,10 10,10 20% A18 - Triptona a 2,06 10,07 10,07 20% A20 - PVP-VA a 1,17 2,7 2,70 20% Sem Emenda 1,09 2,3 2,4 ARMAZENAMENTO SÓLIDO (NA SEMENTE) DE MICRÓBIOS

[694] Uma solução que compreende PVP-VA a 20% e uma cultura isolada de Klebsiella variicola foi preparada, bem como várias soluções de controle. As soluções que compreendem as bactérias foram revestidas em sementes de milho e deixadas secar e armazenadas à temperatura ambiente (temperatura em fluxo durante o período de armazenamento para experimentos à temperatura ambiente; porém foi de aproximadamente 20-25 °C). Os revestimentos das sementes foram avaliados quanto às unidades formadoras de colônias no dia 21 (4 ºC) e no dia 118 (temperatura ambiente).

[695] No dia 21 (4 ºC), o revestimento das sementes de controle de Klebsiella variicola que carece de PVP-VA exibiu uma perda logarítmica de 0,8. No mesmo dia (4 ºC), o revestimento das sementes de Klebsiella variicola contendo PVP-VA experimental exibiu uma perda logarítmica de 0,73. No dia 118 (temperatura ambiente), o revestimento das sementes de controle de Klebsiella variicola que carece de PVP-VA exibiu uma perda logarítmica de 3,3. No mesmo dia, o revestimento das sementes contendo PVP-VA experimental exibiu uma perda logarítmica de 1,96. Os dados sugerem que PVP-VA protege/prolonga a estabilidade das bactérias armazenadas em líquido em comparação com o controle que carece de PVP-VA. Consultar, a Tabela D e a Tabela E.

[696] Tabela D: Armazenamento a curto prazo e a longo prazo na estabilidade da semente (perda de viabilidade) a 4 ºC.

Armazenamento a Armazenamento a Curto Prazo Longo Prazo Perda de Sementes a Perda armazena 4 °C logarít Perda mento Perda total UFC Perda de mica total em (118 dias em 118 aplicada aplicação em 21 21 dias de dias dias armazena mento) A03 - Leite 1,70E+0 Desnatado a 1,39 0,60 1,99 1,16 2,55 7 20% A06 - 1,50E+0 Trealose a 0,94 0,87 1,81 0,77 1,71 7 20% A10 - 1,64E+0 Sacarose a 1,22 0,33 1,55 0,48 1,70 7 20% A18 - 1,53E+0 Triptona a 0,98 0,60 1,58 1,41 2,39 7 20% A20 - PVP- 1,10E+0 0,53 0,73 1,26 1,17 1,70 VA a 20% 7 Sem 1,6E+07 1,12 0,8 1,9 2,59 3,66 Emenda

[697] Tabela E: Armazenamento a curto prazo e a longo prazo na estabilidade da semente à temperatura ambiente Armazenamento a Armazenamento a curto prazo longo prazo Sementes Perda Perda RT Perda Perda UFC Perda de logarítmi logarítmic total em total em aplicada aplicação ca em 21 a em 118 21 dias 118 dias dias dias A03 - Leite 1,70E+0 Desnatado 1,39 1,34 2,74 3,41 4,81 7 a 20%

Armazenamento a Armazenamento a curto prazo longo prazo Sementes Perda Perda RT Perda Perda UFC Perda de logarítmi logarítmic total em total em aplicada aplicação ca em 21 a em 118 21 dias 118 dias dias dias A06 - 1,50E+0 Trealose a 0,94 1,37 2,31 3,32 4,26 7 20% A10 - 1,64E+0 Sacarose a 1,22 1,06 2,28 2,83 4,05 7 20% A18 - 1,53E+0 Triptona a 0,98 1,47 2,45 3,66 4,64 7 20% A20 - PVP- 1,10E+0 0,53 1,96 2,49 3,67 4,20 VA a 20% 7 Sem 1,6E+07 1,12 3,3 4,4 6,09 7,17 Emenda

[698] As composições experimentais indicadas na coluna da esquerda em cada uma das Tabelas B, C, D e E também foram avaliadas em níveis de corretivos a 5%, porém esse valor foi considerado insuficiente para demonstrar um benefício. EXEMPLO 3: ESTABILIDADE MICROBIANA CONFERIDA POR POLÍMERO - CONFERINDO A CAPACIDADE PROTETORA DE POLÍMEROS

POR MISTURA DE POLÍMEROS COM O INOCULANTE DE MICRÓBIO DESEJADO

[699] Uma composição de PVP-VA esterilizada é adicionada ao meio (20% em volume final) suficiente para sustentar o crescimento de uma cultura inoculada de Klebsiella variicola. Um experimento de controle que carece de PVP-VA é conduzido em paralelo. A cultura de Klebsiella variicola que compreende o PVP-VA é cultivada até a confluência. A cultura de Klebsiella variicola contendo PVP-VA e uma cultura de controle de Klebsiella variicola são divididas em alíquotas em múltiplos frascos vedados, armazenados a (1) 4 ºC ou (2) temperatura ambiente e avaliados quanto a unidades formadoras de colônia no dia 0, dia 21 e dia 190.

ARMAZENAMENTO LÍQUIDO DE MICRÓBIOS

[700] A cultura de Klebsiella variicola contendo PVP-VA e uma cultura de controle de Klebsiella variicola são divididas em alíquotas em múltiplos frascos vedados, armazenados a 4 ºC ou temperatura ambiente e avaliados quanto a unidades formadoras de colônia no dia 0, dia 21 e dia 190.

[701] A cultura de Klebsiella variicola contendo PVP-VA exibiu maior estabilidade no dia 21 e no dia 190 em comparação com o controle correspondente que carece do PVP-VA tanto a 4 ºC como à temperatura ambiente. ARMAZENAMENTO SÓLIDO (NA SEMENTE) DE MICRÓBIOS

[702] A cultura de Klebsiella variicola contendo PVP-VA e uma cultura de controle de Klebsiella variicola são revestidas sobre sementes de milho e deixadas para secar e são armazenadas a 4ºC ou temperatura ambiente. Os revestimentos das sementes são avaliados quanto às unidades formadoras de colônias no dia 0, no dia 21 e no dia 190.

[703] A semente revestida com Klebsiella variicolacontendo PVP-VA exibiu maior estabilidade no dia 21 e no dia 190 em comparação com o controle correspondente que carece do PVP-VA tanto a 4 ºC como à temperatura ambiente. EXEMPLO 4: TRANSFERÊNCIA DE BIOFILME ADOTIVO - CONFERINDO

A CAPACIDADE PROTETORA DE BIOFILMES DE UMA ESPÉCIE PARA OUTRA, MISTURANDO BIOFILME COM O MICRÓBIO DESEJADO

[704] O presente exemplo demonstra a utilização de um biofilme microbiano para formular um micróbio fixador de nitrogênio.

[705] Algumas cepas de bactérias fixadoras de nitrogênio não criam biofilmes, e alterar as condições de fermentação para forçar a cepa a criar um biofilme pode ter um impacto negativo sobre a robustez e o título da cepa.

[706] Um biofilme foi usado como um agente protetor durante o armazenamento líquido ou armazenamento seco das bactérias, Klebsiella variicola. A bactéria Kosakonia sacchari é um formador de biofilme e também exibe certo grau de fixação de nitrogênio. K. sacchari foi cultivado em um meio de crescimento enquanto agitava para produzir um biofilme, que foi isolado por filtração para coletar a composição de biofilme microbiano resultante e submetido a uma ou mais lavagens para remover efluentes e células de K. sacchari frouxamente ligadas. O biofilme foi, então, submetido a um choque térmico suficiente para exterminar qualquer K. sacchari remanescente.

ARMAZENAMENTO LÍQUIDO DE MICRÓBIOS

[707] A composição do biofilme submetida a choque térmico foi, então, adicionada a uma cultura isolada de Klebsiella variicola em uma razão 1:1. A cultura de Klebsiella variicola contendo biofilme e uma cultura de controle de Klebsiella variicola foram divididas em alíquotas em múltiplos frascos vedados, armazenados à temperatura ambiente e avaliados quanto a unidades formadoras de colônia no dia 0, dia 21 e dia 190.

[708] No dia 21, a cultura de controle de Klebsiella variicola que carece do biofilme de K. sacchari exibiu uma perda logarítmica de 1,09. No mesmo dia, a cultura de Klebsiella variicola contendo biofilme exibiu uma perda logarítmica de 1,08. A cultura de Klebsiella variicola contendo biofilme exibiu uma viabilidade aumentada no dia 21 em comparação com o controle que carece do biofilme. ARMAZENAMENTO SÓLIDO (NA SEMENTE) DE MICRÓBIOS

[709] A composição do biofilme submetida a choque térmico foi, então, adicionada a uma cultura isolada de Klebsiella variicola a 10% em volume. A cultura de Klebsiella variicola contendo biofilme e uma cultura de controle de Klebsiella variicola foram revestidas sobre sementes de milho e deixadas secar e armazenadas a uma temperatura variável) temperatura em fluxo durante o período de armazenamento). Os revestimentos das sementes foram avaliados quanto às unidades formadoras de colônias no dia 0, no dia 2 e no dia 21.

[710] No dia 2, o revestimento das sementes de controle de Klebsiella variicola que carece do biofilme de K. sacchari exibiu uma perda logarítmica de 2,2. No mesmo dia, o revestimento das sementes de Klebsiella variicola contendo biofilme experimental exibiu uma perda logarítmica de 1,4. No dia 21, o revestimento das sementes de controle de Klebsiella variicola que carece do biofilme de K. sacchari exibiu uma perda logarítmica de 3,3. No mesmo dia, o revestimento das sementes de Klebsiella variicola contendo biofilme experimental exibiu uma perda logarítmica de 2,7. Nos dias 2 e 21, o revestimento das sementes de Klebsiella variicola contendo biofilme exibiu uma viabilidade aumentada em comparação com o controle que carece do biofilme. EXEMPLO 5: TRANSFERÊNCIA DE BIOFILME ADOTIVO - CONFERINDO

A CAPACIDADE PROTETORA DE BIOFILMES DE UMA ESPÉCIE PARA OUTRA, MISTURANDO BIOFILME COM O INOCULANTE DE MICRÓBIO DESEJADO

[711] Um biofilme é usado como um agente protetor durante o armazenamento líquido ou armazenamento seco das bactérias, Klebsiella variicola. A bactéria Kosakonia sacchari é um formador de biofilme e também exibe certo grau de fixação de nitrogênio. K. sacchari é cultivado em um meio de crescimento enquanto agitava para produzir um biofilme, que é, então, isolado por filtração para coletar a composição de biofilme microbiano resultante e submetido a uma ou mais lavagens para remover efluentes e células de K. sacchari frouxamente ligadas. O biofilme é, então, submetido a um choque térmico suficiente para exterminar qualquer K. sacchari remanescente.

[712] A composição de biofilme submetida a choque térmico é adicionada ao meio (10% em volume) suficiente para sustentar o crescimento de uma cultura inoculada de Klebsiella variicola. A cultura de Klebsiella variicola que compreende a composição de biofilme é cultivada até a confluência. A cultura de Klebsiella variicola contendo biofilme e uma cultura de controle de Klebsiella variicola são divididas em alíquotas em múltiplos frascos vedados, armazenados à temperatura ambiente e avaliados quanto a unidades formadoras de colônia no dia 0, dia 21 e dia 190.

ARMAZENAMENTO LÍQUIDO DE MICRÓBIOS

[713] A cultura de Klebsiella variicola contendo biofilme e uma cultura de controle de Klebsiella variicola são divididas em alíquotas em múltiplos frascos vedados, armazenados à temperatura ambiente e avaliados quanto a unidades formadoras de colônia no dia 0, dia 21 e dia 190.

[714] A cultura de Klebsiella variicola contendo biofilme exibe maior viabilidade no dia 21 e no dia 190 em comparação com os controles que carecem do biofilme. ARMAZENAMENTO SÓLIDO (NA SEMENTE) DE MICRÓBIOS

[715] A cultura de Klebsiella variicola contendo biofilme e uma cultura de controle de Klebsiella variicola são revestidas sobre sementes de milho e deixadas secar e são armazenadas a uma temperatura variável) temperatura em fluxo durante o período de armazenamento). Os revestimentos das sementes são avaliados quanto às unidades formadoras de colônias no dia 0, no dia 2, no dia 21 e no dia 190.

[716] A cultura de Klebsiella variicola contendo biofilme exibe maior viabilidade no dia 2, no dia 21 e no dia 190 em comparação com os controles que carecem do biofilme. EXEMPLO 6: PROTEÇÃO DE BIOFILME - CONFERINDO A

CAPACIDADE PROTETORA DE BIOFILMES DE UMA ESPÉCIE PARA OUTRA POR COINOCULAÇÃO DE UM PRODUTOR DE BIOFILME E UM NÃO PRODUTOR

[717] Um biofilme é usado como um agente protetor durante o armazenamento líquido ou armazenamento seco das bactérias, Klebsiella variicola. A bactéria Kosakonia sacchari é um formador de biofilme e também exibe certo grau de fixação de nitrogênio. K. sacchari e Klebsiella variicola são coinoculadas em um meio de crescimento capaz de suportar o crescimento de ambas as bactérias. A cultura resultante é aquela que compreende K. sacchari e Klebsiella variicola em contato com o biofilme produzido por K. sacchari. A composição microbiana é purificada para remover o meio gasto.

ARMAZENAMENTO LÍQUIDO DE MICRÓBIOS

[718] A cocultura de K. sacchari e Klebsiella variicola contendo biofilme e uma cultura de controle de Klebsiella variicola são divididas em alíquotas em múltiplos frascos vedados, armazenados à temperatura ambiente e avaliados quanto a unidades formadoras de colônia de Klebsiella variicola no dia 0, no dia 21 e no dia 190.

[719] A cocultura de K. sacchari e Klebsiella variicola contendo biofilme exibe maior viabilidade para Klebsiella variicola no dia 21 e no dia 190 em comparação com os controles que carecem do biofilme. ARMAZENAMENTO SÓLIDO (NA SEMENTE) DE MICRÓBIOS

[720] A cocultura de K. sacchari e Klebsiella variicola contendo biofilme e uma cultura de controle de Klebsiella variicola são revestidas sobre sementes de milho e deixadas secar e são armazenadas a uma temperatura variável) temperatura em fluxo durante o período de armazenamento). Os revestimentos das sementes são avaliados quanto às unidades formadoras de colônias de Klebsiella variicola no dia 0, no dia 2, no dia 21 e no dia 190.

[721] A cocultura de K. sacchari e Klebsiella variicola contendo biofilme exibe maior viabilidade para Klebsiella variicola no dia 2, no dia 21 e no dia 190 em comparação com os controles que carecem do biofilme. EXEMPLO 7: ESTABILIDADE EM JARRO DE COMPOSIÇÕES

COMPREENDENDO UMA OU MAIS BACTÉRIAS ISOLADAS E UM BIOFILME PRODUZIDO POR UM OU MAIS MICRÓBIOS

[722] O biofilme foi produzido pelo crescimento de K. sacchari sob a condição de formação de biofilme, conforme descrito acima. O biofilme foi, então, submetido a um choque térmico para remover todas as células viáveis de K. sacchari. O biofilme foi usado em três concentrações diferentes para formular o caldo de fermentação para duas cepas remodeladas de Klebsiella variicola.: 137- 1036 e 137-1034.

[723] As amostras formuladas foram armazenadas a 25 °C e 37 °C e a viabilidade foi medida em T=0, T=1 semana e T=2 semanas.

[724] As cepas remodeladas responderam ao biofilme de maneira diferente a 25 °C e à alta temperatura (37 °C). A 37 °C, ambas as cepas mostraram melhora significativa da estabilidade em 1 semana e 2 semanas quando o biofilme estava na formulação em comparação com a formulação de controle (Figuras 2B, 3B, 4B e 5B).

[725] A 25 °C, 137-1036 mostrou estabilidade melhorada em 2 semanas de armazenamento para a formulação contendo biofilme (Figura 3A), enquanto em 1 semana, a estabilidade era similar para a formulação contendo biofilme e a formulação de controle (Figura 2A)

[726] A 25 °C, 137-1034 mostrou variações na estabilidade (Figuras 4A e 5A), enquanto que mostrou estabilidade consistentemente melhorada a 37 °C (Figuras 4B e 5B).

[727] Tomados em conjunto, os dados demonstram que a adição de biofilme reduziu a perda de viabilidade durante 2 semanas de armazenamento de ambas as cepas à alta temperatura em comparação com o controle (cepas não formuladas). Além disso, a melhora na viabilidade foi diretamente proporcional à concentração do biofilme, ou seja, em maiores concentrações de biofilme, houve uma menor perda na viabilidade (as formulações eram mais estáveis em maiores concentrações de biofilme). EXEMPLO 8: FORMULAÇÕES DE COMBINAÇÃO DE POLÍMERO E

BIOFILME PARA MELHORAR A ESTABILIDADE DO PRODUTO MICROBIANO

[728] O caldo de fermentação de dois micróbios, 137-1036 e 137-1034, foi criado. No final da fermentação, o caldo de fermentação para cada micróbio foi formulado com 3 níveis de biofilme, com e sem adição de PVP-VA a 5%. Os biofilmes foram derivados conforme descrito anteriormente, utilizando Kosakonia sacchari.

[729] As amostras formuladas (PVP-VA + biofilme) foram armazenadas a 25 °C e 37 °C e a viabilidade do material de formulação foi medida por até 1 mês.

[730] Os resultados podem ser encontrados nas Figuras 6A, 6B e 6C.

[731] Os resultados demonstram que a adição de PVP-VA a 5% melhorou a perda de viabilidade na lata (no jarro) (menor perda logarítmica), em comparação com uma composição apenas de biofilme. EXEMPLO 9: IMPACTO DE PVP-VA NA MELHORA DA ESTABILIDADE

DA SEMENTE EM VÁRIAS SEMENTES DE MILHO COMERCIAIS

[732] Quatro variedades de sementes de milho disponíveis comercialmente, pré-tratadas com produtos químicos, foram selecionadas para o estudo de formulação de PVP-VA. Os quatro germoplasmas de milho e pré- tratamentos químicos podem ser encontrados abaixo na Tabela F. Cada uma dessas quatro variedades de sementes comerciais com um pré-tratamento químico tinha um tratamento com PVP-VA correspondente em comparação com o não tratamento com PVP-VA. Assim, todas as sementes foram tratadas com formulação com e sem PVP-VA a 20%.

[733] A estabilidade das sementes foi monitorada ao longo do tempo a 4 °C, 10 °C e 25 °C.

[734] Os resultados a 4 °C, 10 °C e 25 °C podem ser encontrados nas Figuras 7A, 7B e 7C, respectivamente. O PVP-VA teve um impacto positivo em todo o germoplasma comercial de milho nas temperaturas de armazenamento de 4 °C e 10 °C; no entanto, o grau específico de impacto na estabilidade da semente era variável e dependia do germoplasma de milho subjacente. No entanto, para a temperatura de armazenamento de 25 °C, dentro de 1 semana todas as células perderam a maior parte de sua viabilidade e não houve uma diferença de tratamento com PVP-VA prontamente evidente.

[735] A partir dos dados, pode-se supor que quanto mais “nocivas” as sementes são para as células microbianas (ou seja, impacto negativo nas células microbianas), mais impacto positivo o PVP-VA tem sobre a estabilidade.

[736] Tabela F: Características físicas e químicas de tratamento de sementes Taman Componen ho da tes de Semen Seme % de EC Variedad Nome Tratamento te ntes/K pH Umida Média e de (seme g de (μS) Sementes ntes/lb .) Protioconaz ol, Metalaxil, Fluoxastrobi na, Chan 1045234 Clotianidina nl- a 94% (0,5 6,3 1,788 3,942 9,97 334 PonV 1050405 mg/sement 5 ot a 5% e), Votivo (Bacillus firmus), tioxazafeno (um nematicida) Abamectina , tiametoxam (0,5 GoldH mg/núcleo), arv- G11F16- fludioxonil, 5,7 249,2 2160 4,762 11,91 AbaT 3111A.0 mefenoxam 1 5 mx , azoxistrobin a, tiabendazol, sedaxano

Taman Componen ho da tes de Semen Seme % de EC Variedad Nome Tratamento te ntes/K pH Umida Média e de (seme g de (μS) Sementes ntes/lb .) Metalaxil, Protioconaz ol, 712STX Fluoxastrobi RIB a na, Hein- 95% Clotianidina 5,5 PonV 1,896 4180 8,45 384,5 NJ527B 0,5 4 ot GLZ a mg/núcleo, 5% Votivo (Bacillus firmus I- 1582) Tiametoxa m (0,2 mg/núcleo), fludioxonil, Vik- mefenoxam 1,051,44 375,2 TmxS , 1890 4167 5,7 8,19 9 5 abr azoxistrobin a, tiabendazol, Sabrex, Excelorato

[737] A Tabela 25 e a Tabela 26 descrevem micróbios, sua arquitetura genética subjacente e suas SEQ ID NOs correspondentes. Esses micróbios foram derivados utilizando a plataforma GMR descrita no Exemplo 1. É contemplado que esses micróbios podem estar contidos em uma formulação de composição de polímero como descrito no presente documento. TABELA 25: MICRÓBIOS NÃO INTERGENÉRICOS WT E

REMODELADOS Nome de Cepa Genótipo SEQ ID NO CI006 16S rDNA - contig 5 62

Nome de Cepa Genótipo SEQ ID NO CI006 16S rDNA - contig 8 63 CI019 16S rDNA 64 CI006 nifH 65 CI006 nifD 66 CI006 nifK 67 CI006 nifL 68 CI006 nifA 69 CI019 nifH 70 CI019 nifD 71 CI019 nifK 72 CI019 nifL 73 CI019 nifA 74 Prm5 com regiões flanqueadoras CI006 75 de 500pb operon nifLA - região intergênica a CI006 76 montante mais CDSs nifL e nifA CI006 nifL (Aminoácido) 77 CI006 nifA (aminoácido) 78 CI006 glnE 79 CI006 glnE_KO1 80 CI006 glnE (aminoácido) 81 CI006 glnE_KO1 (Aminoácido) 82 CI006 Domínio GlnE ATase (Aminoácido) 83 CM029 Prm5 inserido na região nifL 84 TABELA 26: MICRÓBIOS NÃO INTERGENÉRICOS WT E

REMODELADOS Junção Inovador ID de SEQ ID a Cepa Genótipo Descrição Cepa NO Associad a, Se Aplicável CI63; 63 SEQ ID 16S N/A N/A

Junção Inovador ID de SEQ ID a Cepa Genótipo Descrição Cepa NO Associad a, Se Aplicável CI063 NO 85 CI63; SEQ ID 63 nifH N/A N/A CI063 NO 86 1 de 2 genes exclusivos CI63; SEQ ID 63 nifD1 anotados como nifD no N/A CI063 NO 87 genoma 63 2 de 2 genes exclusivos CI63; SEQ ID 63 nifD2 anotados como nifD no N/A CI063 NO 88 genoma 63 1 de 2 genes exclusivos CI63; SEQ ID 63 nifK1 anotados como nifK no N/A CI063 NO 89 genoma 63 2 de 2 genes exclusivos CI63; SEQ ID 63 nifK2 anotados como nifK no N/A CI063 NO 90 genoma 63 CI63; SEQ ID 63 nifL N/A N/A CI063 NO 91 CI63; SEQ ID 63 nifA N/A N/A CI063 NO 92 CI63; SEQ ID 63 glnE N/A N/A CI063 NO 93 CI63; SEQ ID 63 amtB N/A N/A CI063 NO 94 500pb imediatamente a CI63; SEQ ID 63 PinfC montante do códon de início N/A CI063 NO 95 ATG do gene infC

SEQ ID CI137 137 16S N/A N/A NO 96 1 de 2 genes exclusivos

SEQ ID CI137 137 nifH1 anotados como nifH no N/A NO 97 genoma 137 2 de 2 genes exclusivos

SEQ ID CI137 137 nifH2 anotados como nifH no N/A NO 98 genoma 137 CI137 137 SEQ ID nifD1 1 de 2 genes exclusivos N/A

Junção Inovador ID de SEQ ID a Cepa Genótipo Descrição Cepa NO Associad a, Se Aplicável NO 99 anotados como nifD no genoma 137 2 de 2 genes exclusivos

SEQ ID CI137 137 nifD2 anotados como nifD no N/A NO 100 genoma 137 1 de 2 genes exclusivos

SEQ ID CI137 137 nifK1 anotados como nifK no N/A NO 101 genoma 137 2 de 2 genes exclusivos

SEQ ID CI137 137 nifK2 anotados como nifK no N/A NO 102 genoma 137

SEQ ID CI137 137 nifL N/A N/A NO 103

SEQ ID CI137 137 nifA N/A N/A NO 104

SEQ ID CI137 137 glnE N/A N/A NO 105 500pb imediatamente a

SEQ ID CI137 137 PinfC montante do códon de início N/A NO 106 TTG do infC

SEQ ID CI137 137 amtB N/A N/A NO 107 promotor interno localizado SEQ ID no gene nlpI; 299pb CI137 137 Prm8.2 N/A NO 108 começando em 81 pb após o A do ATG do gene nlpI 300pb a montante do gene SEQ ID secE começando em 57pb a CI137 137 Prm6.2 N/A NO 109 montante do A do ATG de secE 400 pb imediatamente a

SEQ ID CI137 137 Prm1.2 montante do ATG do gene N/A NO 110 cspE

SEQ ID nenhum 728 16S N/A N/A NO 111

Junção Inovador ID de SEQ ID a Cepa Genótipo Descrição Cepa NO Associad a, Se Aplicável

SEQ ID nenhum 728 nifH N/A N/A NO 112 1 de 2 genes exclusivos

SEQ ID nenhum 728 nifD1 anotados como nifD no N/A NO 113 genoma 728 2 de 2 genes exclusivos

SEQ ID nenhum 728 nifD2 anotados como nifD no N/A NO 114 genoma 728 1 de 2 genes exclusivos

SEQ ID nenhum 728 nifK1 anotados como nifK no N/A NO 115 genoma 728 2 de 2 genes exclusivos

SEQ ID nenhum 728 nifK2 anotados como nifK no N/A NO 116 genoma 728

SEQ ID nenhum 728 nifL N/A N/A NO 117

SEQ ID nenhum 728 nifA N/A N/A NO 118

SEQ ID nenhum 728 glnE N/A N/A NO 119

SEQ ID nenhum 728 amtB N/A N/A NO 120

SEQ ID nenhum 850 16S N/A N/A NO 121

SEQ ID nenhum 852 16S N/A N/A NO 122

SEQ ID nenhum 853 16S N/A N/A NO 123

SEQ ID nenhum 910 16S N/A N/A NO 124

SEQ ID nenhum 910 nifH N/A N/A NO 125 cofator CDS de

SEQ ID nenhum 910 ferro- N/A N/A NO 126 molibdênio

Junção Inovador ID de SEQ ID a Cepa Genótipo Descrição Cepa NO Associad a, Se Aplicável dinitrogenase

SEQ ID nenhum 910 nifD1 N/A N/A NO 127

SEQ ID nenhum 910 nifD2 N/A N/A NO 128

SEQ ID nenhum 910 nifK1 N/A N/A NO 129

SEQ ID nenhum 910 nifK2 N/A N/A NO 130

SEQ ID nenhum 910 nifL N/A N/A NO 131

SEQ ID nenhum 910 nifA N/A N/A NO 132

SEQ ID nenhum 910 glnE N/A N/A NO 133

SEQ ID nenhum 910 amtB N/A N/A NO 134 498pb imediatamente a

SEQ ID nenhum 910 PinfC montante do ATG do gene N/A NO 135 infC

SEQ ID nenhum 1021 16S N/A N/A NO 136

SEQ ID nenhum 1021 nifH N/A N/A NO 137 1 de 2 genes exclusivos

SEQ ID nenhum 1021 nifD1 anotados como nifD no N/A NO 138 genoma 910 2 de 2 genes exclusivos

SEQ ID nenhum 1021 nifD2 anotados como nifD no N/A NO 139 genoma 910 1 de 2 genes exclusivos

SEQ ID nenhum 1021 nifK1 anotados como nifK no N/A NO 140 genoma 910 nenhum 1021 SEQ ID nifK2 2 de 2 genes exclusivos N/A

Junção Inovador ID de SEQ ID a Cepa Genótipo Descrição Cepa NO Associad a, Se Aplicável NO 141 anotados como nifK no genoma 910

SEQ ID nenhum 1021 nifL N/A N/A NO 142

SEQ ID nenhum 1021 nifA N/A N/A NO 143

SEQ ID nenhum 1021 glnE N/A N/A NO 144

SEQ ID nenhum 1021 amtB N/A N/A NO 145 500 bp imediatamente a

SEQ ID nenhum 1021 PinfC montante do códon de início N/A NO 146 ATG do gene infC 348pb inclui 319pb imediatamente a montante

SEQ ID nenhum 1021 Prm1 do códon de início ATG do N/A NO 147 gene lpp e os primeiros 29pb do gene lpp 339pb a montante do gene SEQ ID sspA, terminando em 46pb nenhum 1021 Prm7 N/A NO 148 a montante do ATG do gene sspA

SEQ ID nenhum 1113 16S N/A N/A NO 149

SEQ ID nenhum 1113 nifH N/A N/A NO 150 1 de 2 genes exclusivos

SEQ ID nenhum 1113 nifD1 anotados como nifD no N/A NO 151 genoma 1113 2 de 2 genes exclusivos

SEQ ID nenhum 1113 nifD2 anotados como nifD no N/A NO 152 genoma 1113

SEQ ID nenhum 1113 nifK N/A N/A NO 153 nenhum 1113 SEQ ID nifL N/A N/A

Junção Inovador ID de SEQ ID a Cepa Genótipo Descrição Cepa NO Associad a, Se Aplicável NO 154 devido a uma lacuna na montagem da sequência, só SEQ ID gene parcial nenhum 1113 é possível identificar um N/A NO 155 nifA gene parcial do genoma 1113

SEQ ID nenhum 1113 glnE N/A N/A NO 156

SEQ ID nenhum 1116 16S N/A NO 157

SEQ ID nenhum 1116 nifH N/A NO 158 1 de 2 genes exclusivos

SEQ ID nenhum 1116 nifD1 anotados como nifD no N/A NO 159 genoma 1116 2 de 2 genes exclusivos

SEQ ID nenhum 1116 nifD2 anotados como nifD no N/A NO 160 genoma 1116 1 de 2 genes exclusivos

SEQ ID nenhum 1116 nifK1 anotados como nifK no N/A NO 161 genoma 1116 2 de 2 genes exclusivos

SEQ ID nenhum 1116 nifK2 anotados como nifK no N/A NO 162 genoma 1116

SEQ ID nenhum 1116 nifL N/A N/A NO 163

SEQ ID nenhum 1116 nifA N/A N/A NO 164

SEQ ID nenhum 1116 glnE N/A N/A NO 165

SEQ ID nenhum 1116 amtB N/A N/A NO 166

SEQ ID nenhum 1293 16S N/A N/A NO 167 nenhum 1293 SEQ ID nifH N/A N/A

Junção Inovador ID de SEQ ID a Cepa Genótipo Descrição Cepa NO Associad a, Se Aplicável NO 168 1 de 2 genes exclusivos

SEQ ID nenhum 1293 nifD1 anotados como nifD no N/A NO 169 genoma 1293 2 de 2 genes exclusivos

SEQ ID nenhum 1293 nifD2 anotados como nifD no N/A NO 170 genoma 1293 1 de 2 genes exclusivos

SEQ ID nenhum 1293 nifK anotados como nifK no N/A NO 171 genoma 1293 2 de 2 genes exclusivos

SEQ ID nenhum 1293 nifK1 anotados como nifK no N/A NO 172 genoma 1293

SEQ ID nenhum 1293 nifA N/A N/A NO 173

SEQ ID nenhum 1293 glnE N/A N/A NO 174 1 de 2 genes exclusivos

SEQ ID nenhum 1293 amtB1 anotados como amtB no N/A NO 175 genoma 1293 2 de 2 genes exclusivos

SEQ ID nenhum 1293 amtB2 anotados como amtB no N/A NO 176 genoma 1293 começando em 24pb após o A do códon de início ATG, 1021- SEQ ID 1375pb de nifL foram nenhum ΔnifL::PinfC ds1131 1612 NO 177 deletados e substituídos pela sequência promotora 1021 PinfC começando em 24pb após o A do códon de início ATG, 1375pb de nifL foram ΔnifL::PinfC 1021- SEQ ID deletados e substituídos nenhum com flanco de ds1131 1612 NO 178 pela sequência promotora 500pb 1021 PinfC; 500pb flanqueando o gene nifL a montante e a jusante estão

Junção Inovador ID de SEQ ID a Cepa Genótipo Descrição Cepa NO Associad a, Se Aplicável incluídos gene glnE com 1673pb imediatamente a jusante do códon de início ATG 1021- SEQ ID nenhum glnEΔAR-2 deletado, resultando em ds1133 1612 NO 179 uma proteína glnE truncada que carece do domínio de remoção de adenilila (AR) gene glnE com 1673pb imediatamente a jusante do códon de início ATG deletado, resultando em glnEΔAR-2 1021- SEQ ID uma proteína glnE truncada nenhum com flanco de ds1133 1612 NO 180 que carece do domínio de 500pb remoção de adenilila (AR); 500pb flanqueando o gene glnE a montante e a jusante estão incluídos começando em 24pb após o A do códon de início ATG, 1021- SEQ ID 1375pb de nifL foram nenhum ΔnifL::Prm1 ds1145 1615 NO 181 deletados e substituídos pela sequência promotora 1021 Prm1 começando em 24pb após o A do códon de início ATG, 1375pb de nifL foram ΔnifL::Prm1 deletados e substituídos 1021- SEQ ID nenhum com flanco de pela sequência promotora ds1145 1615 NO 182 500pb 1021 rm1; 500pb flanqueando o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos gene glnE com 1673 pb imediatamente a jusante do 1021- SEQ ID códon de início ATG nenhum glnEΔAR-2 ds1133 1615 NO 183 deletado, resultando em uma proteína glnE truncada que carece do domínio de

Junção Inovador ID de SEQ ID a Cepa Genótipo Descrição Cepa NO Associad a, Se Aplicável remoção de adenilila (AR) gene glnE com 1673bp imediatamente a jusante do códon de início ATG deletado, resultando em glnEΔAR-2 1021- SEQ ID uma proteína glnE truncada nenhum com flanco de ds1133 1615 NO 184 que carece do domínio de 500pb remoção de adenilila (AR); 500pb flanqueando o gene glnE a montante e a jusante estão incluídos começando em 24pb após o A do códon de início ATG, 1021- SEQ ID 1375pb de nifL foram nenhum ΔnifL::Prm1 ds1145 1619 NO 185 deletados e substituídos pela sequência promotora 1021 Prm1 começando em 24pb após o A do códon de início ATG, 1375pb de nifL foram ΔnifL::Prm1 deletados e substituídos 1021- SEQ ID nenhum com flanco de pela sequência promotora ds1145 1619 NO 186 500pb 1021 rm1; 500pb flanqueando o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos gene glnE com 1673 pb imediatamente a jusante do códon de início ATG 1021- SEQ ID nenhum glnEΔAR-2 deletado, resultando em ds1133 1623 NO 187 uma proteína glnE truncada que carece do domínio de remoção de adenilila (AR) gene glnE com 1673pb imediatamente a jusante do glnEΔAR-2 1021- SEQ ID códon de início ATG nenhum com flanco de ds1133 1623 NO 188 deletado, resultando em 500pb uma proteína glnE truncada que carece do domínio de

Junção Inovador ID de SEQ ID a Cepa Genótipo Descrição Cepa NO Associad a, Se Aplicável remoção de adenilila (AR); 500pb flanqueando o gene glnE a montante e a jusante estão incluídos começando em 24pb após o A do códon de início ATG, 1021- SEQ ID 1375pb de nifL foram nenhum ΔnifL::Prm7 ds1148 1623 NO 189 deletados e substituídos pela sequência promotora 1021 Prm7 começando em 24pb após o A do códon de início ATG, 1375pb de nifL foram ΔnifL::Prm7 deletados e substituídos 1021- SEQ ID nenhum com flanco de pela sequência promotora ds1148 1623 NO 190 500pb 1021 rm7; 500pb flanqueando o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos gene glnE com 1290pb imediatamente a jusante do códon de início ATG 137- SEQ ID nenhum glnEΔAR-2 deletado, resultando em ds809 1034 NO 191 uma proteína glnE truncada que carece do domínio de remoção de adenilila (AR) gene glnE com 1290pb imediatamente a jusante do códon de início ATG deletado, resultando em glnEΔAR-2 137- SEQ ID uma proteína glnE truncada nenhum com flanco de ds809 1034 NO 192 que carece do domínio de 500pb remoção de adenilila (AR); 500pb flanqueando o gene glnE a montante e a jusante estão incluídos começando em 24pb após o 137- SEQ ID nenhum ΔnifL::PinfC A do códon de início ATG, ds799 1036 NO 193 1372pb de nifL foram

Junção Inovador ID de SEQ ID a Cepa Genótipo Descrição Cepa NO Associad a, Se Aplicável deletados e substituídos pela sequência promotora 137 PinfC começando em 24pb após o A do códon de início ATG, 1372pb de nifL foram ΔnifL::PinfC deletados e substituídos 137- SEQ ID nenhum com flanco de pela sequência promotora ds799 1036 NO 194 500pb 137 PinfC; 500pb flanqueando o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos gene glnE com 1290pb imediatamente a jusante do códon de início ATG deletado E 36pb deletado deleção de 137- SEQ ID começando em 1472pb a nenhum glnEΔAR-2 nenhum 1314 NO 195 jusante do códon de início, 36pb resultando em uma proteína glnE truncada sem o domínio de remoção de adenilila (AR) gene glnE com 1290pb imediatamente a jusante do códon de início ATG deletado E 36pb deletado começando em 1472pb a deleção de jusante do códon de início, 137- SEQ ID nenhum glnEΔAR-2 resultando em uma proteína nenhum 1314 NO 196 36bp glnE truncada sem o domínio de remoção de adenilila (AR); 500pb flanqueando o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos começando em 24pb após o 137- SEQ ID A do códon de início ATG, nenhum ΔnifL::Prm8.2 ds857 1314 NO 197 1372pb de nifL foram deletados e substituídos

Junção Inovador ID de SEQ ID a Cepa Genótipo Descrição Cepa NO Associad a, Se Aplicável pela sequência promotora 137 Prm8.2 começando em 24pb após o A do códon de início ATG, 1372pb de nifL foram ΔnifL::Prm8.2 deletados e substituídos 137- SEQ ID nenhum com flanco de pela sequência promotora ds857 1314 NO 198 500pb 137 Prm8.2; 500pb flanqueando o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos gene glnE com 1290pb imediatamente a jusante do códon de início ATG deletado E 36pb deletado deleção de 137- SEQ ID começando em 1472pb a nenhum glnEΔAR-2 nenhum 1329 NO 199 jusante do códon de início, 36pb resultando em uma proteína glnE truncada sem o domínio de remoção de adenilila (AR) gene glnE com 1290pb imediatamente a jusante do códon de início ATG deletado E 36pb deletado começando em 1472pb a deleção de jusante do códon de início, 137- SEQ ID nenhum glnEΔAR-2 resultando em uma proteína nenhum 1329 NO 200 36pb glnE truncada sem o domínio de remoção de adenilila (AR); 500pb flanqueando o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos começando em 24pb após o A do códon de início ATG, 137- SEQ ID nenhum ΔnifL::Prm6.2 1372pb de nifL foram ds853 1329 NO 201 deletados e substituídos pela sequência promotora

Junção Inovador ID de SEQ ID a Cepa Genótipo Descrição Cepa NO Associad a, Se Aplicável 137 Prm6.2 começando em 24pb após o A do códon de início ATG, 1372pb de nifL foram ΔnifL::Prm6.2 deletados e substituídos 137- SEQ ID nenhum com flanco de pela sequência promotora ds853 1329 NO 202 500pb 137 Prm6.2; 500pb flanqueando o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos começando em 24pb após o A do códon de início ATG, 137- SEQ ID 1372pb de nifL foram nenhum ΔnifL::Prm1.2 ds843 1382 NO 203 deletados e substituídos pela sequência promotora 137 Prm1.2 começando em 24bp após o A do códon de início ATG, 1372bp de nifL foram ΔnifL::Prm1.2 deletados e substituídos 137- SEQ ID nenhum com flanco de pela sequência promotora ds843 1382 NO 204 500pb 137 Prm1.2; 500pb flanqueando o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos gene glnE com 1290pb imediatamente a jusante do códon de início ATG deletado E 36pb deletado deleção de 137- SEQ ID começando em 1472pb a nenhum glnEΔAR-2 nenhum 1382 NO 205 jusante do códon de início, 36pb resultando em uma proteína glnE truncada sem o domínio de remoção de adenilila (AR) gene glnE com 1290pb deleção de 137- SEQ ID imediatamente a jusante do nenhum glnEΔAR-2 nenhum 1382 NO 206 códon de início ATG 36pb deletado E 36pb deletado

Junção Inovador ID de SEQ ID a Cepa Genótipo Descrição Cepa NO Associad a, Se Aplicável começando em 1472pb a jusante do códon de início, resultando em uma proteína glnE truncada sem o domínio de remoção de adenilila (AR); 500pb flanqueando o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos começando em 24pb após o A do códon de início ATG, 137- SEQ ID 1372pb de nifL foram nenhum ΔnifL::PinfC ds799 1586 NO 207 deletados e substituídos pela sequência promotora 137 PinfC começando em 24pb após o A do códon de início ATG, 1372pb de nifL foram ΔnifL::PinfC deletados e substituídos 137- SEQ ID nenhum com flanco de pela sequência promotora ds799 1586 NO 208 500pb 137 PinfC; 500pb flanqueando o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos gene glnE com 1290pb imediatamente a jusante do códon de início ATG 137- SEQ ID nenhum glnEΔAR-2 deletado, resultando em ds809 1586 NO 209 uma proteína glnE truncada que carece do domínio de remoção de adenilila (AR) gene glnE com 1290pb imediatamente a jusante do códon de início ATG glnEΔAR-2 137- SEQ ID deletado, resultando em nenhum com flanco de ds809 1586 NO 210 uma proteína glnE truncada 500pb que carece do domínio de remoção de adenilila (AR); 500pb flanqueando o gene

Junção Inovador ID de SEQ ID a Cepa Genótipo Descrição Cepa NO Associad a, Se Aplicável glnE a montante e a jusante estão incluídos gene glnE com 1650pb imediatamente a jusante do códon de início ATG 19- SEQ ID nenhum glnEΔAR-2 deletado, resultando em ds34 594 NO 211 uma proteína glnE truncada que carece do domínio de remoção de adenilila (AR) gene glnE com 1650pb imediatamente a jusante do códon de início ATG deletado, resultando em glnEΔAR-2 19- SEQ ID uma proteína glnE truncada nenhum com flanco de ds34 594 NO 212 que carece do domínio de 500pb remoção de adenilila (AR); 500pb flanqueando o gene glnE a montante e a jusante estão incluídos começando em 221pb após o A do códon de início ATG, 19- SEQ ID 845pb de nifL foram nenhum ΔnifL::Prm6.1 ds180 594 NO 213 deletados e substituídos pela sequência promotora CI019 Prm6.1 começando em 221pb após o A do códon de início ATG, 845pb de nifL foram ΔnifL::Prm6.1 deletados e substituídos 19- SEQ ID nenhum com flanco de pela sequência promotora ds180 594 NO 214 500pb CI019 Prm6.1; 500pb flanqueando o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos começando em 221pb após o A do códon de início ATG, 19- SEQ ID nenhum ΔnifL::Prm6.1 845pb de nifL foram ds180 714 NO 215 deletados e substituídos pela sequência promotora

Junção Inovador ID de SEQ ID a Cepa Genótipo Descrição Cepa NO Associad a, Se Aplicável CI019 Prm6.1 começando em 221pb após o A do códon de início ATG, 845pb de nifL foram ΔnifL::Prm6.1 deletados e substituídos 19- SEQ ID nenhum com flanco de pela sequência promotora ds180 714 NO 216 500pb CI019 Prm6.1; 500pb flanqueando o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos começando em 221pb após o A do códon de início ATG, 19- SEQ ID 845pb de nifL foram nenhum ΔnifL::Prm7.1 ds181 715 NO 217 deletados e substituídos pela sequência promotora CI019 Prm7.1 começando em 221pb após o A do códon de início ATG, 845pb de nifL foram ΔnifL::Prm7.1 deletados e substituídos 19- SEQ ID nenhum com flanco de pela sequência promotora ds181 715 NO 218 500pb CI019 Prm76.1; 500pb flanqueando o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos começando em 221pb após o A do códon de início ATG, 19- SEQ ID 845pb de nifL foram 19-713 ΔnifL::Prm1.2 ds172 750 NO 219 deletados e substituídos pela sequência promotora CI019 Prm1.2 começando em 221bp após o A do códon de início ATG, 845bp de nifL foram ΔnifL::Prm1.2 19- SEQ ID deletados e substituídos 19-713 com flanco de ds172 750 NO 220 pela sequência promotora 500pb CI019 Prm1.2; 500pb flanqueando o gene nifL a montante e a jusante estão

Junção Inovador ID de SEQ ID a Cepa Genótipo Descrição Cepa NO Associad a, Se Aplicável incluídos começando em 221pb após o A do códon de início ATG, 19- SEQ ID 845pb de nifL foram 17-724 ΔnifL::Prm1.2 ds172 804 NO 221 deletados e substituídos pela sequência promotora CI019 Prm1.2 começando em 221bp após o A do códon de início ATG, 845bp de nifL foram ΔnifL::Prm1.2 deletados e substituídos 19- SEQ ID 17-724 com flanco de pela sequência promotora ds172 804 NO 222 500pb CI019 Prm1.2; 500pb flanqueando o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos gene glnE com 1650pb imediatamente a jusante do códon de início ATG 19- SEQ ID 17-724 glnEΔAR-2 deletado, resultando em ds34 804 NO 223 uma proteína glnE truncada que carece do domínio de remoção de adenilila (AR) gene glnE com 1650pb imediatamente a jusante do códon de início ATG deletado, resultando em glnEΔAR-2 19- SEQ ID uma proteína glnE truncada 17-724 com flanco de ds34 804 NO 224 que carece do domínio de 500pb remoção de adenilila (AR); 500pb flanqueando o gene glnE a montante e a jusante estão incluídos começando em 221pb após o A do códon de início ATG, 19- SEQ ID 845pb de nifL foram 19-590 ΔnifL::Prm3.1 ds175 806 NO 225 deletados e substituídos pela sequência promotora CI019 Prm3.1

Junção Inovador ID de SEQ ID a Cepa Genótipo Descrição Cepa NO Associad a, Se Aplicável começando em 221pb após o A do códon de início ATG, 845pb de nifL foram ΔnifL::Prm3.1 deletados e substituídos 19- SEQ ID 19-590 com flanco de pela sequência promotora ds175 806 NO 226 500pb CI019 Prm3.1; 500pb flanqueando o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos gene glnE com 1650pb imediatamente a jusante do códon de início ATG 19- SEQ ID 19-590 glnEΔAR-2 deletado, resultando em ds34 806 NO 227 uma proteína glnE truncada que carece do domínio de remoção de adenilila (AR) gene glnE com 1650pb imediatamente a jusante do códon de início ATG deletado, resultando em glnEΔAR-2 19- SEQ ID uma proteína glnE truncada 19-590 com flanco de ds34 806 NO 228 que carece do domínio de 500pb remoção de adenilila (AR); 500bp flanqueando o gene glnE a montante e a jusante estão incluídos começando em 24pb após o A do códon de início ATG, 63- SEQ ID 1375pb de nifL foram nenhum ΔnifL::PinfC ds908 1146 NO 229 deletados e substituídos pela sequência promotora 63 PinfC começando em 24pb após o A do códon de início ATG, ΔnifL::PinfC 1375pb de nifL foram 63- SEQ ID nenhum com flanco de deletados e substituídos ds908 1146 NO 230 500pb pela sequência promotora 63 PinfC; 500pb flanqueando o gene nifL a

Junção Inovador ID de SEQ ID a Cepa Genótipo Descrição Cepa NO Associad a, Se Aplicável montante e a jusante estão incluídos começando em 31pb após o A do códon de início ATG, CM015; SEQ ID 1375pb de nifL foram PBC6.1 6-397 ΔnifL::Prm5 ds24 NO 231 deletados e substituídos 5 pela sequência promotora CI006 Prm5 começando em 31pb após o A do códon de início ATG, 1375pb de nifL foram CM015; ΔnifL::Prm5 deletados e substituídos

SEQ ID PBC6.1 6-397 com flanco de pela sequência promotora ds24 NO 232 5 500pb CI006 Prm5; 500pb flanqueando o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos começando em 31pb após o A do códon de início ATG, SEQ ID 1375pb de nifL foram CM014 6-400 ΔnifL::Prm1 ds20 NO 233 deletados e substituídos pela sequência promotora CI006 Prm1 começando em 31pb após o A do códon de início ATG, 1375pb de nifL foram ΔnifL::Prm1 deletados e substituídos

SEQ ID CM014 6-400 com flanco de pela sequência promotora ds20 NO 234 500pb CI006 Prm1; 500pb flanqueando o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos começando em 31pb após o A do códon de início ATG, CM037; SEQ ID 1375pb de nifL foram PBC6.3 6-403 ΔnifL::Prm1 ds20 NO 235 deletados e substituídos 7 pela sequência promotora CI006 Prm1 CM037; 6-403 SEQ ID ΔnifL::Prm1 começando em 31pb após o ds20

Junção Inovador ID de SEQ ID a Cepa Genótipo Descrição Cepa NO Associad a, Se Aplicável PBC6.3 NO 236 com flanco de A do códon de início ATG, 8 500pb 1375pb de nifL foram deletados e substituídos pela sequência promotora CI006 Prm1; 500pb flanqueando o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos gene glnE com 1644pb imediatamente a jusante do CM037; códon de início ATG

SEQ ID PBC6.3 6-403 glnEΔAR-2 deletado, resultando em ds31 NO 237 9 uma proteína glnE truncada que carece do domínio de remoção de adenilila (AR) gene glnE com 1644pb imediatamente a jusante do códon de início ATG deletado, resultando em CM037; glnEΔAR-2 SEQ ID uma proteína glnE truncada PBC6.4 6-403 com flanco de ds31 NO 238 que carece do domínio de 0 500pb remoção de adenilila (AR); 500pb flanqueando o gene glnE a montante e a jusante estão incluídos gene glnE com 1287pb imediatamente a jusante do CM038; códon de início ATG

SEQ ID PBC6.3 6-404 glnEΔAR-1 deletado, resultando em ds30 NO 239 8 uma proteína glnE truncada que carece do domínio de remoção de adenilila (AR) começando em 31pb após o A do códon de início ATG, CM038; SEQ ID 1375pb de nifL foram PBC6.3 6-404 ΔnifL::Prm1 ds20 NO 240 deletados e substituídos 8 pela sequência promotora CI006 Prm1 CM038; 6-404 SEQ ID ΔnifL::Prm1 começando em 31pb após o ds20

Junção Inovador ID de SEQ ID a Cepa Genótipo Descrição Cepa NO Associad a, Se Aplicável PBC6.3 NO 241 com flanco de A do códon de início ATG, 8 500pb 1375pb de nifL foram deletados e substituídos pela sequência promotora CI006 Prm1; 500pb flanqueando o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos gene glnE com 1287pb imediatamente a jusante do códon de início ATG deletado, resultando em CM038; glnEΔAR-1 SEQ ID uma proteína glnE truncada PBC6.3 6-404 com flanco de ds30 NO 242 que carece do domínio de 8 500pb remoção de adenilila (AR); 500pb flanqueando o gene glnE a montante e a jusante estão incluídos gene glnE com 1287pb imediatamente a jusante do CM029; códon de início ATG

SEQ ID PBC6.2 6-412 glnEΔAR-1 deletado, resultando em ds30 NO 243 9 uma proteína glnE truncada que carece do domínio de remoção de adenilila (AR) gene glnE com 1287pb imediatamente a jusante do códon de início ATG deletado, resultando em CM029; glnEΔAR-1 SEQ ID uma proteína glnE truncada PBC6.2 6-412 com flanco de ds30 NO 244 que carece do domínio de 9 500pb remoção de adenilila (AR); 500pb flanqueando o gene glnE a montante e a jusante estão incluídos começando em 31pb após o CM029; SEQ ID A do códon de início ATG, PBC6.2 6-412 ΔnifL::Prm5 ds24 NO 245 1375pb de nifL foram 9 deletados e substituídos

Junção Inovador ID de SEQ ID a Cepa Genótipo Descrição Cepa NO Associad a, Se Aplicável pela sequência promotora CI006 Prm5 começando em 31pb após o A do códon de início ATG, 1375pb de nifL foram CM029; ΔnifL::Prm5 deletados e substituídos

SEQ ID PBC6.2 6-412 com flanco de pela sequência promotora ds24 NO 246 9 500pb CI006 Prm5; 500pb flanqueando o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos começando em 31pb após o A do códon de início ATG, CM093; SEQ ID 1375pb de nifL foram PBC6.9 6-848 ΔnifL::Prm1 ds20 NO 247 deletados e substituídos 3 pela sequência promotora CI006 Prm1 começando em 31pb após o A do códon de início ATG, 1375pb de nifL foram CM093; ΔnifL::Prm1 deletados e substituídos

SEQ ID PBC6.9 6-848 com flanco de pela sequência promotora ds20 NO 248 3 500pb CI006 Prm1; 500pb flanqueando o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos gene glnE com 1644pb imediatamente a jusante do CM093; códon de início ATG

SEQ ID PBC6.9 6-848 glnEΔAR-2 deletado, resultando em ds31 NO 249 3 uma proteína glnE truncada que carece do domínio de remoção de adenilila (AR) gene glnE com 1644pb imediatamente a jusante do CM093; glnEΔAR-2 SEQ ID códon de início ATG PBC6.9 6-848 com flanco de ds31 NO 250 deletado, resultando em 3 500pb uma proteína glnE truncada que carece do domínio de

Junção Inovador ID de SEQ ID a Cepa Genótipo Descrição Cepa NO Associad a, Se Aplicável remoção de adenilila (AR); 500pb flanqueando o gene glnE a montante e a jusante estão incluídos Os primeiros 1088pb do gene amtB e 4pb a CM093; montante do códon de início

SEQ ID PBC6.9 6-848 ΔamtB deletado; 199pb do gene ds126 NO 251 3 restante carece de um códon de início; nenhuma proteína amtB é traduzida Os primeiros 1088pb do gene amtB e 4pb a CM093; ΔamtB com montante do códon de início

SEQ ID PBC6.9 6-848 flanco de deletado; 199pb do gene ds126 NO 252 3 500pb restante carece de um códon de início; nenhuma proteína amtB é traduzida gene glnE com 1287pb imediatamente a jusante do CM094; códon de início ATG

SEQ ID PBC6.9 6-881 glnEΔAR-1 deletado, resultando em ds30 NO 253 4 uma proteína glnE truncada que carece do domínio de remoção de adenilila (AR) gene glnE com 1287pb imediatamente a jusante do códon de início ATG deletado, resultando em CM094; glnEΔAR-1 SEQ ID uma proteína glnE truncada PBC6.9 6-881 com flanco de ds30 NO 254 que carece do domínio de 4 500pb remoção de adenilila (AR); 500pb flanqueando o gene glnE a montante e a jusante estão incluídos começando em 31pb após o CM094; SEQ ID A do códon de início ATG, PBC6.9 6-881 ΔnifL::Prm1 ds20 NO 255 1375pb de nifL foram 4 deletados e substituídos

Junção Inovador ID de SEQ ID a Cepa Genótipo Descrição Cepa NO Associad a, Se Aplicável pela sequência promotora CI006 Prm1 começando em 31pb após o A do códon de início ATG, 1375pb de nifL foram CM094; ΔnifL::Prm1 deletados e substituídos

SEQ ID PBC6.9 6-881 com flanco de pela sequência promotora ds20 NO 256 4 500pb CI006 Prm1; 500pb flanqueando o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos Os primeiros 1088pb do gene amtB e 4pb a CM094; montante do códon de início

SEQ ID PBC6.9 6-881 ΔamtB deletado; 199pb do gene ds126 NO 257 4 restante carece de um códon de início; nenhuma proteína amtB é traduzida Os primeiros 1088pb do gene amtB e 4pb a CM094; ΔamtB com montante do códon de início

SEQ ID PBC6.9 6-881 flanco de deletado; 199pb do gene ds126 NO 258 4 500pb restante carece de um códon de início; nenhuma proteína amtB é traduzida começando em 20pb após o A do códon de início ATG, 910- SEQ ID 1379pb de nifL foram nenhum ΔnifL::PinfC ds960 1246 NO 259 deletados e substituídos pela sequência promotora 910 PinfC começando em 20pb após o A do códon de início ATG, 1379pb de nifL foram ΔnifL::PinfC 910- SEQ ID deletados e substituídos nenhum com flanco de ds960 1246 NO 260 pela sequência promotora 500pb 910 PinfC; 500pb flanqueando o gene nifL a montante e a jusante estão

Junção Inovador ID de SEQ ID a Cepa Genótipo Descrição Cepa NO Associad a, Se Aplicável incluídos PBC6.1 CI00 SEQ ID 1 de 3 genes exclusivos de 16S-1 N/A , 6, CI6 6 NO 261 16S rDNA no genoma CI006 PBC6.1 CI00 SEQ ID 2 de 3 genes exclusivos de 16S-2 N/A , 6, CI6 6 NO 262 16S rDNA no genoma CI006 PBC6.1 CI00 SEQ ID nifH N/A N/A , 6, CI6 6 NO 263 2 de 2 genes exclusivos PBC6.1 CI00 SEQ ID nifD2 anotados como nifD no N/A , 6, CI6 6 NO 264 genoma CI006 2 de 2 genes exclusivos PBC6.1 CI00 SEQ ID nifK2 anotados como nifK no N/A , 6, CI6 6 NO 265 genoma CI006 PBC6.1 CI00 SEQ ID nifL N/A N/A , 6, CI6 6 NO 266 PBC6.1 CI00 SEQ ID nifA N/A N/A , 6, CI6 6 NO 267 PBC6.1 CI00 SEQ ID glnE N/A N/A , 6, CI6 6 NO 268 PBC6.1 CI00 SEQ ID 3 de 3 genes exclusivos de 16S-3 N/A , 6, CI6 6 NO 269 16S rDNA no genoma CI006 1 de 2 genes exclusivos PBC6.1 CI00 SEQ ID nifD1 anotados como nifD no N/A , 6, CI6 6 NO 270 genoma CI006 1 de 2 genes exclusivos PBC6.1 CI00 SEQ ID nifK1 anotados como nifK no N/A , 6, CI6 6 NO 271 genoma CI006 PBC6.1 CI00 SEQ ID amtB N/A N/A , 6, CI6 6 NO 272 348pb inclui 319pb imediatamente a montante PBC6.1 CI00 SEQ ID Prm1 do códon de início ATG do N/A , 6, CI6 6 NO 273 gene lpp e os primeiros 29pb do gene lpp PBC6.1 CI00 SEQ ID Prm5 313pb começando em N/A

Junção Inovador ID de SEQ ID a Cepa Genótipo Descrição Cepa NO Associad a, Se Aplicável , 6, CI6 6 NO 274 432pb a montante do códon de início ATG do gene ompX e terminando 119pb a montante do códon de início ATG do gene ompX 19, CI01 SEQ ID nifL N/A N/A CI19 9 NO 275 19, CI01 SEQ ID nifA N/A N/A CI19 9 NO 276 19, CI01 SEQ ID 1 de 7 genes exclusivos de 16S-1 N/A CI19 9 NO 277 16S rDNA no genoma CI019 19, CI01 SEQ ID 2 de 7 genes exclusivos de 16S-2 N/A CI19 9 NO 278 16S rDNA no genoma CI019 19, CI01 SEQ ID 3 de 7 genes exclusivos de 16S-3 N/A CI19 9 NO 279 16S rDNA no genoma CI019 19, CI01 SEQ ID 4 de 7 genes exclusivos de 16S-4 N/A CI19 9 NO 280 16S rDNA no genoma CI019 19, CI01 SEQ ID 5 de 7 genes exclusivos de 16S-5 N/A CI19 9 NO 281 16S rDNA no genoma CI019 19, CI01 SEQ ID 6 de 7 genes exclusivos de 16S-6 N/A CI19 9 NO 282 16S rDNA no genoma CI019 19, CI01 SEQ ID 7 de 7 genes exclusivos de 16S-7 N/A CI19 9 NO 283 16S rDNA no genoma CI019 1 de 2 genes exclusivos 19, CI01 SEQ ID nifH1 anotados como nifH no N/A CI19 9 NO 284 genoma CI019 2 de 2 genes exclusivos 19, CI01 SEQ ID nifH2 anotados como nifH no N/A CI19 9 NO 285 genoma CI019 1 de 2 genes exclusivos 19, CI01 SEQ ID nifD1 anotados como nifD no N/A CI19 9 NO 286 genoma CI019 2 de 2 genes exclusivos 19, CI01 SEQ ID nifD2 anotados como nifD no N/A CI19 9 NO 287 genoma CI019

Junção Inovador ID de SEQ ID a Cepa Genótipo Descrição Cepa NO Associad a, Se Aplicável 1 de 2 genes exclusivos 19, CI01 SEQ ID nifK1 anotados como nifK no N/A CI19 9 NO 288 genoma CI019 2 de 2 genes exclusivos 19, CI01 SEQ ID nifK2 anotados como nifK no N/A CI19 9 NO 289 genoma CI019 19, CI01 SEQ ID glnE N/A N/A CI19 9 NO 290 449pb imediatamente a 19, CI01 SEQ ID Prm4 montante do ATG do gene N/A CI19 9 NO 291 dscC 2 500pb imediatamente a 19, CI01 SEQ ID Prm1.2 montante do códon de início N/A CI19 9 NO 292 TTG do gene infC 170pb imediatamente a 19, CI01 SEQ ID Prm3.1 montante do códon de N/A CI19 9 NO 293 iniciação ATG do gene rplN 142pb imediatamente a montante do ATG de uma proteína hipotética 19, CI02 SEQ ID Prm6.1 altamente expressa N/A CI20 0 NO 294 (anotada como PROKKA_00662 na montagem CI019 82) 293pb imediatamente a 19, CI02 SEQ ID Prm7.1 montante do ATG do gene N/A CI21 1 NO 295 lpp gene glnE com 1650pb imediatamente a jusante do 19-375, códon de início ATG CM6 SEQ ID 19-417, glnEΔAR-2 deletado, resultando em ds34 7 NO 296 CM067 uma proteína glnE truncada que carece do domínio de remoção de adenilila (AR) 19-375, glnEΔAR-2 gene glnE com 1650pb CM6 SEQ ID 19-417, com flanco de imediatamente a jusante do ds34 7 NO 297 CM067 500pb códon de início ATG

Junção Inovador ID de SEQ ID a Cepa Genótipo Descrição Cepa NO Associad a, Se Aplicável deletado, resultando em uma proteína glnE truncada que carece do domínio de remoção de adenilila (AR); 500pb flanqueando o gene glnE a montante e a jusante estão incluídos começando em 221pb após o A do códon de início ATG, 19-375, 845pb de nifL foram CM6 SEQ ID 19-417, ΔnifL::null-v1 deletados e substituídos nenhum 7 NO 298 CM067 pela sequência de 31pb "GGAGTCTGAACTCATCC TGCGATGGGGGCTG" começando em 221pb após o A do códon de início ATG, 845pb de nifL foram deletados e substituídos 19-375, ΔnifL::null-v1 CM6 SEQ ID pela sequência de 31pb 19-417, com flanco de nenhum 7 NO 299 "GGAGTCTGAACTCATCC CM067 500pb TGCGATGGGGGCTG"; 500pb flanqueando o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos começando em 221pb após o A do códon de início ATG, 19-377, CM6 SEQ ID 845pb de nifL foram ΔnifL::null-v2 nenhum CM069 9 NO 300 deletados e substituídos pela sequência de 5bp “TTAAA” começando em 221pb após o A do códon de início ATG, 845pb de nifL foram ΔnifL::null-v2 19-377, CM6 SEQ ID deletados e substituídos com flanco de nenhum CM069 9 NO 301 pela sequência de 5pb 500pb "TTAA"; 500pb flanqueando o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos 19-389, CM8 SEQ ID ΔnifL::Prm4 começando em 221pb após ds70

Junção Inovador ID de SEQ ID a Cepa Genótipo Descrição Cepa NO Associad a, Se Aplicável 19-418, 1 NO 302 o A do códon de início ATG, CM081 845pb de nifL foram deletados e substituídos pela sequência CI19 Prm4 começando em 221pb após o A do códon de início ATG, 845pb de nifL foram 19-389, ΔnifL::Prm4 CM8 SEQ ID deletados e substituídos 19-418, com flanco de ds70 1 NO 303 pela sequência CI19 Prm4; CM081 500pb 500pb flanqueando o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos começando em 24pb após o A do códon de início ATG, 137- SEQ ID 1372pb de nifL foram nenhum ΔnifL-Prm1.2 ds843 3890 NO 458 deletados e substituídos pela sequência promotora 137 Prm1.2 começando em 24pb após o A do códon de início ATG, 1372pb de nifL foram ΔnifL-Prm1.2 deletados e substituídos 137- SEQ ID nenhum com flanco de pela sequência promotora ds843 3890 NO 459 500pb 137 Prm1.2; 500pb flanqueando o gene nifL a montante e a jusante estão incluídos gene glnE com 1290pb imediatamente a jusante do códon de início ATG 137- SEQ ID nenhum glnE_KO2 deletado, resultando em ds809 3890 NO 460 uma proteína glnE truncada que carece do domínio de remoção de adenilila (AR) gene glnE com 1290pb glnE_KO2 com imediatamente a jusante do 137- SEQ ID nenhum flanco de códon de início ATG ds809 3890 NO 461 500pb deletado, resultando em uma proteína glnE truncada

Junção Inovador ID de SEQ ID a Cepa Genótipo Descrição Cepa NO Associad a, Se Aplicável que carece do domínio de remoção de adenilila (AR); 500pb flanqueando o gene glnE a montante e a jusante estão incluídos A desativação do sítio de fosforilação do regulador transcricional de ligação ao DNA NrtC por meio da troca 137- SEQ ID do 54º aminoácido de nenhum NtrC_D54A ds2974 3890 NO 462 aspartato para alanina (D para A), alterando o códon GAT para GCT.

Desativa a capacidade do NtrC de ser fosforilado.

A desativação do sítio de fosforilação do regulador transcricional de ligação ao DNA NrtC por meio da troca do 54º aminoácido de NtrC_D54A aspartato para alanina (D 137- SEQ ID com para A), alterando o códon nenhum ds2974 3890 NO 463 sequências de GAT para GCT.

Desativa a flanqueamento capacidade do NtrC de ser fosforilado.

As sequências NtrC de 693 pb a montante e a jusante de 549 pb flanqueando a mutação NtrCD54A estão incluídas.

Deleção do gene nifL de 20pb após o ATG (início) para 87pb antes do TGA (parada) do gene.

Um 137- SEQ ID fragmento de 500 pb da nenhum ΔnifL::PinfC ds799 3896 NO 464 região a montante do gene infC foi inserido (PinfC) a montante de nifA substituindo a porção deletada.

Junção Inovador ID de SEQ ID a Cepa Genótipo Descrição Cepa NO Associad a, Se Aplicável Deleção do gene nifL de 20pb após o ATG (início) para 87pb antes do TGA (parada) do gene.

Um fragmento de 500pb da ΔnifL::PinfC região a montante do gene 137- SEQ ID com nenhum infC foi inserido (PinfC) a ds799 3896 NO 465 sequências de montante de nifA flanqueamento substituindo a porção deletada; 332pb a montante e 324pb a jusante flanqueando o gene nifL estão incluídos.

A desativação do domínio uridililtransferase (UT) da enzima de remoção de uridililtransferase/uridilila 137- SEQ ID glnD_UTase_ nenhum bifuncional, glnD, por ds2538 3896 NO 466 Deactivation mutação dos resíduos de aminoácidos 90 e 91 de GG para DV, bem como o resíduo 104 de D para A.

A desativação do domínio uridililtransferase (UT) da enzima de remoção de uridililtransferase/uridilila glnD_UTase_ bifuncional, glnD, por Deactivation 137- SEQ ID mutação dos resíduos de nenhum com ds2538 3896 NO 467 aminoácidos 90 e 91 de GG sequências de para DV, bem como o flanqueamento resíduo 104 de D para A; 450bp flanqueando os sítios mutados a montante e a jusante estão incluídos.

Inserção de uma cópia do gene nifA em uma região NC- 137- SEQ ID não codificadora de 137. nenhum nifA_copy::Pr ds2969 3896 NO 468 Essa cópia está sendo m1.2 conduzida por um promotor de 400pb (Prm1.2) derivado

Junção Inovador ID de SEQ ID a Cepa Genótipo Descrição Cepa NO Associad a, Se Aplicável de uma região a montante do gene cspE.

Inserção de uma cópia do gene nifA em uma região não codificadora de 137. NC- Essa cópia está sendo nifA_copy::Pr conduzida por um promotor 137- SEQ ID nenhum m1.2 com de 400pb (Prm1.2) derivado ds2969 3896 NO 469 sequências de de uma região a montante flanqueamento do gene cspE. 2000bp flanqueando a inserção de sítio a montante e a jusante estão incluídos.

345 / 367 TABELA 27: DETECÇÃO MICROBIANA

SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO (Sequência de junção de Nome (compreendend (compreenden junção CI de fluxo para Descrição Iniciado Iniciado Sonda de o 100pb a do 100pb a compreendendo base cima/para da junção r F SEQ r R SEQ SEQ Junção montante da jusante da 100pb a montante e baixo junção) junção) 100pb a jusante da junção) gene nifL 1021 ds1131 pra cima 304 338 372 interrompid N/A N/A N/A o / PinfC PinfC / gene nifL 1021 ds1131 para baixo 305 339 373 N/A N/A N/A interrompid o 5 'UTR e ATG / gene 1021 ds1133 N/A 306 340 374 N/A N/A N/A glnE truncado gene nifL 1021 ds1145 pra cima 307 341 375 interrompid N/A N/A N/A o / Prm1 Prm1 / gene nifL 1021 ds1145 para baixo 308 342 376 N/A N/A N/A interrompid o 1021 ds1148 pra cima 309 343 377 gene nifL N/A N/A N/A

346 / 367

SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO (Sequência de junção de Nome (compreendend (compreenden junção CI de fluxo para Descrição Iniciado Iniciado Sonda de o 100pb a do 100pb a compreendendo base cima/para da junção r F SEQ r R SEQ SEQ Junção montante da jusante da 100pb a montante e baixo junção) junção) 100pb a jusante da junção) interrompid o / Prm7 Prm4 / gene nifL 1021 ds1148 para baixo 310 344 378 N/A N/A N/A interrompid o 5 'UTR até ATG-4bp do gene CI006 ds126 N/A 311 345 379 amtB / N/A N/A N/A gene amtB interrompid o Prm1.2 /

SEQ ID gene nifL SEQ ID CI019 ds172 para baixo 312 346 380 NO: 406 N/A interrompid NO: 407

C o gene nifL CI019 ds172 pra cima 313 347 381 interrompid N/A N/A N/A o / Prm1.2

347 / 367

SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO (Sequência de junção de Nome (compreendend (compreenden junção CI de fluxo para Descrição Iniciado Iniciado Sonda de o 100pb a do 100pb a compreendendo base cima/para da junção r F SEQ r R SEQ SEQ Junção montante da jusante da 100pb a montante e baixo junção) junção) 100pb a jusante da junção) Prm3.1 /

SEQ gene nifL SEQ ID SEQ ID CI019 ds175 para baixo 314 348 382 ID NO: interrompid NO: 408 NO: 409 410 o gene nifL CI019 ds175 pra cima 315 349 383 interrompid N/A N/A N/A o / Prm3.1 Prm1 /

SEQ gene nifL SEQ ID SEQ ID CI006 ds20 para baixo 316 350 384 ID NO: interrompid NO: 411 NO: 412 413 o gene nifL CI006 ds20 pra cima 317 351 385 interrompid N/A N/A N/A o / Prm1 gene nifL SEQ

SEQ ID SEQ ID CI006 ds24 pra cima 318 352 386 interrompid ID NO: NO: 414 NO: 415 o / Prm5 416 Prm5 / CI006 ds24 para baixo 319 353 387 gene nifL N/A N/A N/A interrompid

348 / 367

SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO (Sequência de junção de Nome (compreendend (compreenden junção CI de fluxo para Descrição Iniciado Iniciado Sonda de o 100pb a do 100pb a compreendendo base cima/para da junção r F SEQ r R SEQ SEQ Junção montante da jusante da 100pb a montante e baixo junção) junção) 100pb a jusante da junção) o 5 'UTR e ATG / gene CI006 ds30 N/A 320 354 388 N/A N/A N/A glnE truncado 5 'UTR e ATG / gene CI006 ds31 N/A 321 355 389 N/A N/A N/A glnE truncado 5 'UTR e ATG / gene CI019 ds34 N/A 322 356 390 N/A N/A N/A glnE truncado gene nifL CI019 ds70 pra cima 323 357 391 interrompid N/A N/A N/A o / Prm4 Prm4 / gene nifL CI019 ds70 para baixo 324 358 392 N/A N/A N/A interrompid o

349 / 367

SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO (Sequência de junção de Nome (compreendend (compreenden junção CI de fluxo para Descrição Iniciado Iniciado Sonda de o 100pb a do 100pb a compreendendo base cima/para da junção r F SEQ r R SEQ SEQ Junção montante da jusante da 100pb a montante e baixo junção) junção) 100pb a jusante da junção) PinfC /

SEQ gene nifL SEQ ID SEQ ID 137 ds799 para baixo 325 359 393 ID NO: interrompid NO: 417 NO: 418 419 o gene nifL 137 ds799 pra cima 326 360 394 interrompid N/A N/A N/A o / PinfC 5 'UTR e

SEQ ATG / gene SEQ ID SEQ ID 137 ds809 N/A 327 361 395 ID NO: glnE NO: 420 NO: 421 422 truncado gene nifL 137 ds843 pra cima 328 362 396 interrompid N/A N/A N/A o / Prm1.2 Prm1.2 / gene nifL 137 ds843 para baixo 329 363 397 N/A N/A N/A interrompid o gene nifL 137 ds853 pra cima 330 364 398 N/A N/A N/A interrompid

350 / 367

SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO (Sequência de junção de Nome (compreendend (compreenden junção CI de fluxo para Descrição Iniciado Iniciado Sonda de o 100pb a do 100pb a compreendendo base cima/para da junção r F SEQ r R SEQ SEQ Junção montante da jusante da 100pb a montante e baixo junção) junção) 100pb a jusante da junção) o / Prm6.2 Prm6.2 / gene nifL 137 ds853 para baixo 331 365 399 N/A N/A N/A interrompid o gene nifL 137 ds857 pra cima 332 366 400 interrompid N/A N/A N/A o / Prm8.2 Prm8.2 / gene nifL 137 ds857 para baixo 333 367 401 N/A N/A N/A interrompid o PinfC / gene nifL SEQ ID SEQ ID 63 ds908 para baixo 334 368 402 N/A interrompid NO: 423 NO: 424 o gene nifL 63 ds908 pra cima 335 369 403 interrompid N/A N/A N/A o / PinfC 910 ds960 pra cima 336 370 404 gene nifL N/A N/A N/A

351 / 367

SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO (Sequência de junção de Nome (compreendend (compreenden junção CI de fluxo para Descrição Iniciado Iniciado Sonda de o 100pb a do 100pb a compreendendo base cima/para da junção r F SEQ r R SEQ SEQ Junção montante da jusante da 100pb a montante e baixo junção) junção) 100pb a jusante da junção) interrompid o / PinfC PinfC / gene nifL 910 ds960 para baixo 337 371 405 N/A N/A N/A interrompid o região 5’ a montante 137 ds843 pra cima 425 436 447 N/A N/A N/A de nifL/Prm1.2 137 ds843 para baixo 426 437 448 Prm1.2/nifA N/A N/A N/A Deleção de 1647pb de glnE N- 137 ds809 pra cima 427 438 449 terminal N/A N/A N/A após o códon de início. Região 5’ 137 ds2974 pra cima 428 439 450 N/A N/A N/A de NtrC a

352 / 367

SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO (Sequência de junção de Nome (compreendend (compreenden junção CI de fluxo para Descrição Iniciado Iniciado Sonda de o 100pb a do 100pb a compreendendo base cima/para da junção r F SEQ r R SEQ SEQ Junção montante da jusante da 100pb a montante e baixo junção) junção) 100pb a jusante da junção) montante de D54A (GAT -> GCT) Sequência NtrC a jusante da 137 ds2974 para baixo 429 440 451 mutação N/A N/A N/A D54A (GAT-- >GCT) região 5’ a montante 137 799 pra cima 430 441 452 N/A N/A N/A de nifL/PinfC 137 799 para baixo 431 442 453 PinfC/nifA N/A N/A N/A Região 5’ a montante 137 ds2538 pra cima 432 443 454 da mutação N/A N/A N/A de desativaçã

353 / 367

SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO (Sequência de junção de Nome (compreendend (compreenden junção CI de fluxo para Descrição Iniciado Iniciado Sonda de o 100pb a do 100pb a compreendendo base cima/para da junção r F SEQ r R SEQ SEQ Junção montante da jusante da 100pb a montante e baixo junção) junção) 100pb a jusante da junção) o de glnD- Utase. Região 3’ a jusante da mutação de 137 ds2538 para baixo 433 444 455 N/A N/A N/A desativaçã o de glnD- Utase. 5’ a montante de uma cópia extra de gene Prm1.2_nif 137 ds2969 pra cima 434 445 456 A inserido N/A N/A N/A em um sítio não codificador do genoma de Klebsiella

354 / 367

SEQ ID NO SEQ ID NO SEQ ID NO (Sequência de junção de Nome (compreendend (compreenden junção CI de fluxo para Descrição Iniciado Iniciado Sonda de o 100pb a do 100pb a compreendendo base cima/para da junção r F SEQ r R SEQ SEQ Junção montante da jusante da 100pb a montante e baixo junção) junção) 100pb a jusante da junção) entre duas sequências de codificação hipotéticas.

3’ a jusante de uma cópia extra de gene Prm1.2_nifA inserido em um sítio não 137 ds2969 para baixo 435 446 457 codificador N/A N/A N/A do genoma de Klebsiella entre duas sequências de codificação hipotéticas.

MODALIDADES NUMERADAS DA DIVULGAÇÃO I

[738] Não obstante as reivindicações anexas, a divulgação apresenta as seguintes modalidades numeradas:

1. Uma composição microbiana, compreendendo: uma ou mais bactérias isoladas; e uma composição de polímero compreendendo um ou mais polímeros, em que o um ou mais polímeros são exógenos à uma ou mais bactérias isoladas; e, opcionalmente, um ou mais biofilmes exógenos à uma ou mais bactérias isoladas.

2. A composição microbiana da modalidade 1, em que o um ou mais biofilmes exógenos à uma ou mais bactérias isoladas estão presentes.

3. A composição microbiana da modalidade 1 ou 2, em que o um ou mais biofilmes compreendem biofilmes de uma espécie dentro de um gênero selecionado a partir dos seguintes gêneros: Pseudomonas, Kosakonia, Bacillus, Azospirillum, Candida, Saccharomycese Agrobacterium.

4. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o um ou mais biofilmes compreendem biofilmes de Kosakonia sacchari.

5. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ou mais bactérias isoladas são do gênero Klebsiella e um ou mais biofilmes compreendem biofilme de um micróbio do gênero Kosakonia.

6. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas são Klebsiella variicola e o um ou mais biofilmes compreendem biofilme de Kosakonia sacchari.

7. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas são da cepa 137-1036 de Klebsiella variicola e o um ou mais biofilmes compreendem biofilme de Kosakonia sacchari.

8. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o um ou mais biofilmes compreendem dois biofilmes produzidos por dois micróbios que produzem um biofilme diferente.

9. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas são selecionadas dos seguintes gêneros: Achromobacter, Agrobacterium, Anabaena, Azorhizobium, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Bradyrhizobium, Candida, Clostridium, Enterobacter, Klebsiella, Kluyvera, Kosakonia, Mesorhizobium, Microbacterium, Pseudomonas, Rahnella, Rhizobium, Saccharomyces, Sinorhizobium, e combinações dos mesmos.

10. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas são selecionadas de: Achromobacter marplatensis, Achromobacter spiritinus, Azospirillum lipoferum, Enterobacter sp., Klebsiella variicola, Kluyvera intermedia, Kosakonia pseudosacchari, Kosakonia sacchari, Microbacterium murale, Rahnella aquatilise combinações dos mesmos.

11. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ou mais bactérias isoladas são do gênero Klebsiella.

12. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas são uma Klebsiella variicola.

13. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas são de uma cepa 137-1036 de Klebsiella variicola.

14. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o um ou mais polímeros são selecionados de: polivinilpirrolidona (PVP), aceto de polivinilpirrolidona-vinila (PVP-VA), carboximetil celulose (CMC), hidroxipropil metilcelulose, alginato e combinações dos mesmos.

15. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o um ou mais polímeros são aceto de polivinilpirrolidona-vinila (PVP-VA).

16. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o um ou mais polímeros são um polímero de eletrofiação.

17. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o um ou mais polímeros compreendem um copolímero.

18. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ou mais bactérias isoladas são capazes de fixar nitrogênio.

19. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a viabilidade da uma ou mais bactérias isoladas exibe um aumento, em comparação a uma composição de controle que compreende uma ou mais bactérias isoladas que carecem do um ou mais polímeros.

20. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a viabilidade da uma ou mais bactérias isoladas exibe um aumento, quando armazenadas por pelo menos 30 dias, em comparação a uma composição de controle que compreende uma ou mais bactérias isoladas que carecem do um ou mais polímeros.

21. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a viabilidade da uma ou mais bactérias isoladas exibe um aumento quando armazenadas em cultura líquida.

22. A composição farmacêutica liofilizada de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição é um sólido.

23. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição é um líquido.

24. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição é semissólida.

25. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição microbiana é um revestimento de semente presente em uma semente de planta ou outro material de propagação de planta.

26. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição microbiana é um revestimento de semente presente em uma semente de milho que tem um inseticida, herbicida, fungicida ou nematicida presente na dita semente.

27. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição microbiana está em uma formulação de sulco.

28. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas são endofíticas, epifíticas ou rizosféricas.

29. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas são bactérias de tipo selvagem.

30. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas são bactérias transgênicas.

31. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas são bactérias remodeladas não intergenéricas.

32. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas são bactérias remodeladas não intergenéricas selecionadas da Tabela 1, ou progênies ou derivados das mesmas.

33. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas são capazes de fixar nitrogênio atmosférico.

34. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas são bactérias remodeladas não intergenéricas capazes de fixar nitrogênio atmosférico na presença de nitrogênio exógeno.

35. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas são bactérias remodeladas não intergenéricas que compreendem: pelo menos uma variação genética introduzida em pelo menos um gene ou nucleotídeo não codificador, da rede regulatória genética de assimilação ou de fixação de nitrogênio.

36. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende uma sequência de controle introduzida ligada operavelmente a pelo menos um gene da rede regulatória genética de assimilação ou de fixação de nitrogênio.

37. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende um promotor heterólogo ligado operavelmente a pelo menos um gene da rede regulatória genética de assimilação ou de fixação de nitrogênio.

38. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende pelo menos uma variação genética introduzida em um membro selecionado do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, polinucleotídeo que codifica glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, drat, amtB, polinucleotídeo que codifica glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB, nifQ, um gene associado à biossíntese de uma enzima nitrogenase ou combinações dos mesmos.

39. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende pelo menos uma variação genética introduzida em pelo menos um gene, ou nucleotídeo não codificador, da rede regulatória genética de assimilação ou de fixação de nitrogênio que resulta em um ou mais de aumento de expressão ou atividade de NifA ou glutaminase; diminuição de expressão ou atividade de NifL, NtrB, glutamina sintetase, GlnB, GlnK, DraT, AmtB; diminuição de atividade de remoção de adenilila de GlnE; ou diminuição de atividade de remoção de uridilila de GlnD.

40. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende um gene nifL mutado que compreende um promotor heterólogo no dito gene nifL.

41. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada que carece de um domínio de remoção de adenilila (AR).

42. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende um gene amtB mutado que resulta na carência de expressão do dito gene amtB.

43. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende pelo menos um de: um gene nifL mutado que compreende um promotor heterólogo no dito gene nifL; um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada que carece de um domínio de remoção de adenilila (AR); um gene amtB mutado que resulta na carência de expressão do dito gene amtB; e combinações dos mesmos.

44. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende um gene nifL mutado que compreende um promotor heterólogo no dito gene nifL e um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada que carece de um domínio de remoção de adenilila (AR).

45. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende um gene nifL mutado que compreende um promotor heterólogo no dito gene nifL, um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada que carece de um domínio de remoção de adenilila (AR) e um gene amtB mutado que resulta na carência de expressão do dito gene amtB.

46. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende pelo menos uma variação genética introduzida em genes envolvida em uma via selecionada do grupo que consiste em: produção de exopolissacarídeo, produção de endo-poligalaturonase, produção de trealose e conversão de glutamina.

47. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende pelo menos uma variação genética introduzida em genes selecionada do grupo que consiste em: bcsii, bcsiii, yjbE, fhaB, pehA, otsB, treZ, glsA2, e combinações dos mesmos.

48. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas compreendem bactérias selecionadas de: uma bactéria depositada como NCMA 201701002, uma bactéria depositada como NCMA 201708004, uma bactéria depositada como NCMA 201708003, uma bactéria depositada como NCMA 201708002, uma bactéria depositada como NCMA 201712001, uma bactéria depositada como NCMA 201712002 e combinações das mesmas.

49. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas compreendem bactérias que compreendem uma sequência de ácidos nucleicos que compartilha pelo menos cerca de 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de ácidos nucleicos selecionada das SEQ ID NOs: 177-260, 296-303 e 458-469.

50. A composição microbiana de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas compreendem bactérias que compreendem uma sequência de ácidos nucleicos selecionada das SEQ ID NOs: 177-260, 296-303 e 458-469.

MODALIDADES NUMERADAS DA DIVULGAÇÃO II

[739] Não obstante as reivindicações anexas, a divulgação apresenta as seguintes modalidades numeradas:

1. Um método para aumentar a viabilidade de uma composição bacteriana, sendo que o método compreende, combinar: uma ou mais bactérias isoladas; e uma composição de polímero compreendendo um ou mais polímeros, em que um ou mais polímeros são exógenos a uma ou mais bactérias isoladas, em que o aumento na viabilidade é relativo a uma composição de controle que compreende uma ou mais bactérias isoladas que carecem do um ou mais polímeros; e opcionalmente compreende, combinar com as bactérias isoladas e composição de polímeros, um ou mais biofilmes exógenos à uma ou mais bactérias isoladas.

2. O método da modalidade 1, em que o um ou mais biofilmes exógenos à uma ou mais bactérias isoladas são combinados com as bactérias isoladas e a composição de polímero.

3. O método da modalidade 1 ou 2, em que o um ou mais biofilmes compreendem biofilmes de uma espécie em um gênero selecionado dos seguintes gêneros: Pseudomonas, Kosakonia, Bacillus, Azospirillum, Candida, Saccharomycese Agrobacterium.

4. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o um ou mais biofilmes compreendem biofilmes de Kosakonia sacchari.

5. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ou mais bactérias isoladas são do gênero Klebsiella e o um ou mais biofilmes compreendem biofilme do gênero Kosakonia.

6. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas são Klebsiella variicola e o um ou mais biofilmes compreendem biofilme de Kosakonia sacchari.

7. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas são da cepa 137-1036 de Klebsiella variicola e o um ou mais biofilmes compreendem biofilme de Kosakonia sacchari.

8. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o um ou mais biofilmes compreendem dois biofilmes produzidos por dois micróbios que produzem um biofilme diferente.

9. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas são selecionadas dos seguintes gêneros: Achromobacter, Agrobacterium, Anabaena, Azorhizobium, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Bradyrhizobium, Candida, Clostridium, Enterobacter, Klebsiella, Kluyvera, Kosakonia, Mesorhizobium, Microbacterium, Pseudomonas, Rahnella, Rhizobium, Saccharomyces, Sinorhizobium, e combinações dos mesmos.

10. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas são selecionadas de: Achromobacter marplatensis, Achromobacter spiritinus, Azospirillum lipoferum, Enterobacter sp., Klebsiella variicola, Kluyvera intermedia, Kosakonia pseudosacchari, Kosakonia sacchari, Microbacterium murale, Rahnella aquatilise combinações dos mesmos.

11. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ou mais bactérias isoladas são do gênero Klebsiella.

12. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas são uma Klebsiella variicola.

13. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas são de uma cepa 137-1036 de Klebsiella variicola.

14. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o um ou mais polímeros são selecionados de: polivinilpirrolidona (PVP), aceto de polivinilpirrolidona-vinila (PVP-VA), carboximetil celulose (CMC), hidroxipropil metilcelulose, alginato e combinações dos mesmos.

15. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o um ou mais polímeros são aceto de polivinilpirrolidona-vinila (PVP-VA).

16. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o um ou mais polímeros são um um polímero de eletrofiação.

17. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o um ou mais polímeros compreendem um copolímero.

18. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que uma ou mais bactérias isoladas são capazes de fixar nitrogênio.

19. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a viabilidade da uma ou mais bactérias isoladas exibe um aumento, em comparação a uma composição de controle que compreende uma ou mais bactérias isoladas que carecem do um ou mais polímeros.

20. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a viabilidade da uma ou mais bactérias isoladas exibe um aumento, quando armazenadas por pelo menos 30 dias, em comparação a uma composição de controle que compreende uma ou mais bactérias isoladas que carecem do um ou mais polímeros.

21. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a viabilidade da uma ou mais bactérias isoladas exibe um aumento quando armazenadas em cultura líquida.

22. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição é um sólido.

23. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição é um líquido.

24. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição é semissólida.

25. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição microbiana é um revestimento de semente presente em uma semente de planta ou outro material de propagação de planta.

26. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição microbiana é um revestimento de semente presente em uma semente de milho que tem um inseticida, herbicida, fungicida ou nematicida presente na dita semente.

27. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição microbiana está em uma formulação de sulco.

28. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas são endofíticas, epifíticas ou rizoesféricas.

29. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas são bactérias de tipo selvagem.

30. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas são bactérias transgênicas.

31. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas são bactérias remodeladas não intergenéricas.

32. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas são bactérias remodeladas não intergenéricas selecionadas da Tabela 1, ou progênies ou derivados das mesmas.

33. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas são capazes de fixar nitrogênio atmosférico.

34. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas são bactérias remodeladas não intergenéricas capazes de fixar nitrogênio atmosférico na presença de nitrogênio exógeno.

35. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas são bactérias remodeladas não intergenéricas que compreendem: pelo menos uma variação genética introduzida em pelo menos um gene ou nucleotídeo não codificador, da rede regulatória genética de assimilação ou de fixação de nitrogênio.

36. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende uma sequência de controle introduzida ligada operavelmente a pelo menos um gene da rede regulatória genética de assimilação ou de fixação de nitrogênio.

37. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende um promotor heterólogo ligado operavelmente a pelo menos um gene da rede regulatória genética de assimilação ou de fixação de nitrogênio.

38. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende pelo menos uma variação genética introduzida em um membro selecionado do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, polinucleotídeo que codifica glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, drat, amtB, polinucleotídeo que codifica glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB, nifQ, um gene associado à biossíntese de uma enzima nitrogenase ou combinações dos mesmos.

39. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende pelo menos uma variação genética introduzida em pelo menos um gene, ou nucleotídeo não codificador, da rede regulatória genética de assimilação ou de fixação de nitrogênio que resulta em um ou mais de aumento de expressão ou atividade de NifA ou glutaminase; diminuição de expressão ou atividade de NifL, NtrB, glutamina sintetase, GlnB, GlnK, DraT, AmtB; diminuição de atividade de remoção de adenilila de GlnE; ou diminuição de atividade de remoção de uridilila de GlnD.

40. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende um gene nifL mutado que compreende um promotor heterólogo no dito gene nifL.

41. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada que carece de um domínio de remoção de adenilila (AR).

42. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende um gene amtB mutado que resulta na carência de expressão do dito gene amtB.

43. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende pelo menos um de: um gene nifL mutado que compreende um promotor heterólogo no dito gene nifL; um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada que carece de um domínio de remoção de adenilila (AR); um gene amtB mutado que resulta na carência de expressão do dito gene amtB; e combinações dos mesmos.

44. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende um gene nifL mutado que compreende um promotor heterólogo no dito gene nifL e um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada que carece de um domínio de remoção de adenilila (AR).

45. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende um gene nifL mutado que compreende um promotor heterólogo no dito gene nifL, um gene glnE mutado que resulta em uma proteína GlnE truncada que carece de um domínio de remoção de adenilila (AR) e um gene amtB mutado que resulta na carência de expressão do dito gene amtB.

46. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende pelo menos uma variação genética introduzida em genes envolvida em uma via selecionada do grupo que consiste em: produção de exopolissacarídeo, produção de endo-poligalaturonase, produção de trealose e conversão de glutamina.

47. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende pelo menos uma variação genética introduzida em genes selecionada do grupo que consiste em: bcsii, bcsiii, yjbE, fhaB, pehA, otsB, treZ, glsA2, e combinações dos mesmos.

48. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas compreendem bactérias selecionadas de: uma bactéria depositada como NCMA 201701002, uma bactéria depositada como NCMA 201708004, uma bactéria depositada como NCMA 201708003, uma bactéria depositada como NCMA 201708002, uma bactéria depositada como NCMA 201712001, uma bactéria depositada como NCMA 201712002 e combinações das mesmas.

49. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas compreendem bactérias que compreendem uma sequência de ácidos nucleicos que compartilha pelo menos cerca de 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de ácidos nucleicos selecionada das SEQ ID NOs: 177-260, 296-303 e 458-469.

50. O método de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais bactérias isoladas compreendem bactérias que compreendem uma sequência de ácidos nucleicos selecionada das SEQ ID NOs: 177-260, 296-303 e 458-469.

[740] A divulgação contempla todas e quaisquer permutações e combinações dos elementos acima mencionados contidos nas modalidades numeradas.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

[741] Todas as referências, artigos, publicações, patentes, publicações de patente e pedidos de patente citados no presente documento estão incorporados a título de referência em sua totalidade para todas as finalidades. No entanto, a menção a qualquer referência, artigo, publicação, patente, publicação de patente e pedido de patente citada no presente documento não é e não deve ser considerada como uma confirmação ou qualquer forma de sugestão que constitua parte válida do estado da técnica ou forme parte do conhecimento geral comum em qualquer país do mundo. Além disso, a Patente US nº9.975.817, expedida em 22 de maio de 2018, e intitulada: Methods and Compositions for Improving Plant Traits, está incorporada no presente documento a título de referência. Adicionalmente, o documento nº PCT/US2018/013671, depositado em 12 de janeiro de 2018, publicado como WO 2018/132774 A1 em 19 de julho de 2018, e intitulado: Methods and Compositions for Improving Plant Traits, está incorporado ao presente documento a título de referência. Adicionalmente, o documento nº PCT/US2019/059450, depositado em 1ºde novembro de 2019, e intitulado: Biofilm Composions with Improved Stability for Nitrogen Fixing Microbial Products, está incorporado ao presente documento a título de referência.

Claims (33)

REIVINDICAÇÕES

1. Composição microbiana caracterizada pelo fato de que compreende: a. uma ou mais bactérias isoladas; e b. uma composição de polímero que compreende um ou mais polímeros, em que o um ou mais polímeros são exógenos em relação a uma ou mais bactérias isoladas.

2. Composição microbiana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda: c. um ou mais biofilmes ou composições de biofilme isoladas produzidas por um ou mais micróbios, em que o um ou mais biofilmes ou composições de biofilme isoladas são não nativas em relação a uma ou mais bactérias isoladas.

3. Composição microbiana, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o um ou mais micróbios são selecionados das espécies dos seguintes gêneros: Pseudomonas, Kosakonia, Bacillus, Azospirillum, Candida, Saccharomyces e Agrobacterium.

4. Composição microbiana, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o um ou mais micróbios compreendem Kosakonia sacchari.

5. Composição microbiana, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a uma ou mais bactérias isoladas são do gênero Klebsiella e o um ou mais micróbios compreendem um micróbio do gênero Kosakonia.

6. Composição microbiana, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a uma ou mais bactérias isoladas são da cepa 137-1036 de Klebsiella variicola e o um ou mais micróbios compreendem Kosakonia sacchari.

7. Composição microbiana, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o um ou mais biofilmes ou composições de biofilme isoladas compreendem dois biofilmes produzidos por dois micróbios que produzem um biofilme diferente.

8. Composição microbiana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a uma ou mais bactérias isoladas são selecionadas dos seguintes gêneros: Achromobacter, Agrobacterium, Anabaena, Azorhizobium, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Bradyrhizobium, Clostridium, Enterobacter, Klebsiella, Kluyvera, Kosakonia, Mesorhizobium, Microbacterium, Pseudomonas, Rahnella,

Rhizobium, Sinorhizobium e combinações dos mesmos.

9. Composição microbiana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a uma ou mais bactérias isoladas são do gênero Klebsiella.

10. Composição microbiana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a uma ou mais bactérias isoladas são uma Klebsiella variicola.

11. Composição microbiana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a uma ou mais bactérias isoladas são de uma cepa 137-1036 de Klebsiella variicola.

12. Composição microbiana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o um ou mais polímeros são selecionados de: polivinilpirrolidona (PVP), aceto de polivinilpirrolidona-vinila (PVP-VA), carboximetil celulose (CMC), hidroxipropil metilcelulose, alginato e combinações dos mesmos.

13. Composição microbiana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o um ou mais polímeros são aceto de polivinilpirrolidona-vinila (PVP-VA).

14. Composição microbiana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o um ou mais polímeros são um polímero de eletrofiação.

15. Composição microbiana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o um ou mais polímeros compreendem um copolímero.

16. Composição microbiana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a uma ou mais bactérias isoladas são capazes de fixar nitrogênio.

17. Composição microbiana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a estabilidade da uma ou mais bactérias isoladas exibe um aumento, em comparação a uma composição de controle que compreende uma ou mais bactérias isoladas que carecem do um ou mais polímeros.

18. Composição microbiana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a estabilidade da uma ou mais bactérias isoladas exibe um aumento, quando armazenadas por pelo menos 30 dias, em comparação a uma composição de controle que compreende uma ou mais bactérias isoladas que carecem do um ou mais polímeros.

19. Composição microbiana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a estabilidade da uma ou mais bactérias isoladas exibe um aumento quando armazenadas em cultura líquida.

20. Composição microbiana, de acordo com a reivindicação 1, sendo que a composição é caracterizada pelo fato de que é um sólido, um líquido ou um semissólido.

21. Composição microbiana, de acordo com a reivindicação 1, sendo que a composição microbiana é caracterizada pelo fato de que é um revestimento de semente presente em uma semente de planta ou outro material de propagação de planta.

22. Composição microbiana, de acordo com a reivindicação 1, sendo que a composição microbiana é caracterizada pelo fato de que é um revestimento de semente presente em uma semente de milho que tem um inseticida, herbicida, fungicida ou nematicida presente na dita semente.

23. Composição microbiana, de acordo com a reivindicação 1, sendo que a composição microbiana é caracterizada pelo fato de que está em uma formulação de sulco.

24. Composição microbiana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a uma ou mais bactérias isoladas são endofíticas, epifíticas ou rizoesféricas.

25. Composição microbiana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a uma ou mais bactérias isoladas são bactérias de tipo selvagem, bactérias transgênicas ou bactérias remodeladas não intergenéricas.

26. Composição microbiana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a uma ou mais bactérias isoladas são bactérias remodeladas não intergenéricas selecionadas do grupo que consiste em uma bactéria depositada como NCMA 201701002, uma bactéria depositada como NCMA 201708004, uma bactéria depositada como NCMA 201708003, uma bactéria depositada como NCMA 201708002, uma bactéria depositada como NCMA 201712001, uma bactéria depositada como NCMA 201712002, uma bactéria depositada como NCMA 201708001, progênies ou derivados das mesmas, e combinações das mesmas.

27. Composição microbiana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a uma ou mais bactérias isoladas são bactérias remodeladas não intergenéricas capazes de fixar nitrogênio atmosférico na presença de nitrogênio exógeno.

28. Composição microbiana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a uma ou mais bactérias isoladas são bactérias remodeladas não intergenéricas que compreendem: pelo menos uma variação genética introduzida em pelo menos um gene ou nucleotídeo não codificador, da rede regulatória genética de assimilação ou de fixação de nitrogênio.

29. Composição microbiana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende uma sequência de controle introduzida ligada operavelmente a pelo menos um gene da rede regulatória genética de assimilação ou de fixação de nitrogênio.

30. Composição microbiana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que cada uma da uma ou mais bactérias isoladas compreende pelo menos uma variação genética introduzida em um membro selecionado do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, polinucleotídeo que codifica glutamina sintetase, glnA, glnB, glnK, drat, amtB, polinucleotídeo que codifica glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB, nifQ, um gene associado à biossíntese de uma enzima nitrogenase, bcsii, bcsiii, yjbE, fhaB, pehA, otsB, treZ, glsA2 ou combinações dos mesmos.

31. Composição microbiana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a uma ou mais bactérias isoladas compreendem bactérias que compreendem uma sequência de ácidos nucleicos que compartilha pelo menos cerca de 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de ácidos nucleicos selecionada das SEQ ID NOs: 177-260, 296-303 e

458-469.

32. Método para aumentar a estabilidade de uma composição bacteriana, sendo que o método é caracterizado pelo fato de que compreende combinar: a. uma ou mais bactérias isoladas; e b. uma composição de polímero que compreende um ou mais polímeros, em que o um ou mais polímeros são exógenos a uma ou mais bactérias isoladas e em que o aumento na estabilidade é relativo a uma composição de controle que compreende uma ou mais bactérias isoladas que carecem do um ou mais polímeros.

33. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que compreende ainda combinar, com a) e b): c) um ou mais biofilmes ou composições de biofilme isoladas produzidas por um ou mais micróbios, em que o um ou mais biofilmes ou composições de biofilme isoladas são não nativas em relação a uma ou mais bactérias isoladas.