CN116814512B

CN116814512B - 微生物组合物及其促生用途

Info

Publication number: CN116814512B
Application number: CN202311111736.1A
Authority: CN
Inventors: 王绪敏; 曲江勇; 王丽君; 刘秀梅; 邢志凯; 王爽; 张伟华; 鲁晓菲
Original assignee: Yantai University
Current assignee: Yantai University
Priority date: 2023-08-31
Filing date: 2023-08-31
Publication date: 2023-11-24
Anticipated expiration: 2043-08-31
Also published as: CN116814512A

Abstract

本发明提供了一种微生物组合物，属于微生物菌肥领域，所述的微生物组合物中包括活菌比例为2‑5：2‑5：1‑4的中间根瘤菌、荧光假单胞菌和巨大芽孢杆菌。通过上述微生物组合物制备的微生物菌肥能够促进作物的有效生长，减少其他类型肥料的用量，实现成本的最大程度控制。用于葡萄培养时，能够提高果实品质和产量，具有较好的农业应用前景。

Description

微生物组合物及其促生用途

技术领域

本发明属于微生物菌肥领域，具体涉及微生物组合物及其促生用途。

背景技术

随着化肥的大量使用，其利用率不断降低。仅靠大量增施化肥来提高作物产量是有限的，并且还伴有污染环境等一系列问题。微生物肥料在解决该问题上有一定优势，根据我国作物的种类和土壤条件，将微生物肥料与化肥配合施用，既能保证增产，又能减少化肥使用量，降低成本，同时还可以改善土壤及作物品质，减少污染。

微生物肥料又称生物肥料或菌肥，微生物资源丰富，种类和功能繁多，可以开发成不同功能、不同用途的肥料。微生物肥料主要有3类产品，分别是农用微生物菌剂、生物有机肥、复合微生物肥料。与传统的化肥和农药相比，微生物肥料能有效地改良土壤肥力，增加化肥和能源的利用率。施用微生物肥料能够减少化肥用量，改善化肥带来的土壤板结、环境污染等问题。另外与化学肥料相比，微生物肥料生产所消耗的能源少，生产成本降低，有利于生态环境保护。微生物菌株可以经过人工选育并不断纯化、复壮以提高其活力，未来发展空间较大。

申请号为CN202110855076.2的中国专利公开了一种蔬菜专用的微生物复合肥，所述微生物复合肥由按照重量份计的以下组分制备得到：载体60-100份，复合液体菌剂15-25份；所述复合液体菌剂包括有枯草芽孢杆菌VGP004菌株发酵液、巨大芽孢杆菌VGP625菌株发酵液、圆褐固氮菌VGP021菌株发酵液和短短芽孢杆菌VGP123菌株发酵液中的任意一种或几种。该发明具有如下优点：施用根际微生物复合接种剂，既可以增加蔬菜产量，同时可提高其质量。另外，使用该产品也可以溶解土壤中的难溶性磷素、固定空气中的氮素，给植物提供充足的养分，同时还可以促进植物对其他营养元素的吸收，调节和促进植物生长，还可以帮助植物抵御病原真菌的侵染，提高产量。但其主要应用于蔬菜，应用范围受限。

申请号为CN202010257789.4的中国专利公开了一种复合微生物菌剂及其在防治多种植物病害中的应用。所述复合微生物菌剂不仅对细菌、真菌和卵菌等引起的青枯病、根腐病、软腐病、黑胫病、赤霉病、根黑腐病等多种主要土传病害均有显著的抑制作用，茄科作物番茄、十字花科作物快菜和葫芦科作物黄瓜的生物量均显著提高，而且对植物病毒病害番茄黄化曲叶病毒也具有显著抑制作用。该发明有效解决了以往微生物菌剂仅针对单一病原菌的缺陷和化学农药防治带来的环境污染和食品质量问题。但其仅体现了对幼苗的促生效果，对于果实的影响并不明确。

葡萄属于喜肥果树，要想产量高、品质好，施肥非常重要，肥料选择和施肥时间等方面格外关键。基肥和追肥中选择微生物菌肥是较为可行的方式，不断扩展微生物菌肥类型，对促进葡萄种植具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种微生物菌肥及其制备方法，解决作物根际土壤细菌群落结构不良带来的作物产量下降问题以及化肥使用过度造成的土壤板结和肥力下降问题。本发明的另一目的是为作物种植提供养分，提高作物产量。

本发明中，“活菌总数”和“总活菌数”具有相同的含义。

本发明中，“菌数”一般指活菌数。

一方面，本发明提供了一种微生物组合物。

所述的微生物组合物中包括活菌比例为2-5：2-5：1-4的中间根瘤菌、荧光假单胞菌、巨大芽孢杆菌。

优选地，所述的微生物组合物中包括活菌比例为2：2：1的中间根瘤菌、荧光假单胞菌、巨大芽孢杆菌。

另一方面，本发明提供了前述的微生物组合物在制备微生物菌肥中的应用。

所述的微生物菌肥可以是液态菌肥，也可以是固态菌肥。

当所述的微生物菌肥为液态菌肥时，所述的微生物菌肥中总活菌数不低于2.5×10⁸CFU/mL。

当所述的微生物菌肥为固态菌肥时，所述的微生物菌肥中总活菌数不低于2.5×10⁸CFU/g。

优选地，所述的微生物菌肥为液态菌肥，总活菌数范围为3×10⁸-10×10⁸CFU/mL。

进一步优选地，所述的液态菌肥中包括中间根瘤菌1.5×10⁸-3.5×10⁸CFU/mL，荧光假单胞菌1.5×10⁸-3.5×10⁸CFU/mL，巨大芽孢杆菌0.5×10⁸-2.5×10⁸CFU/mL。

所述液态菌肥的制备方法中可以包括将三种菌分别培养，然后按照菌数比例混合。

优选地，所述的微生物菌肥为固态菌肥，总活菌数范围为2.5×10⁸-7×10⁸CFU/g。

所述的固态菌肥为液态菌肥与基料混合制备，所述的基料与液态菌肥的混合体积比为1.5-2：1。

优选地，所述的固态菌肥中包括：中间根瘤菌1.5×10⁸-3.5×10⁸CFU/mL，荧光假单胞菌1.5×10⁸-3.5×10⁸CFU/mL，巨大芽孢杆菌0.5×10⁸-2.5×10⁸CFU/mL。

所述的微生物菌肥可以是葡萄用微生物菌肥。

所述的微生物菌肥中还可包括肥料领域其他可接受的载体或赋形剂。

所述的微生物菌肥也可以是复合肥，即所述的微生物菌肥中还可以包括其他类型的肥料，包括但不限于氮肥、磷肥、钾肥、有机肥等。

本发明同时提供了包括前述的微生物组合物的微生物菌肥。

本发明的有益效果：

本发明提供的微生物组合物在各菌种特定比例下，能够促进作物的有效生长，并表现出菌种之间的协同增效作用，为实现成本的最大程度控制提供了基础。用于葡萄培养时，能够至少减少10%其他类型肥料的用量，并提高葡萄果实品质和产量，具有较好的农业应用前景。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中：

中间根瘤菌来源：四川省食品发酵工业研究设计院，学名Mesorhizobium sp.。

荧光假单胞菌来源：中国农业科学院生物技术研究所的荧光假单胞菌L-6-2，学名Pseudomonas fluorescens。

巨大芽孢杆菌来源：中国科学院微生物研究所，原始编号BN6。

实施例1液态菌肥的制备

液态菌肥的制备方法参照如下步骤：

（1）培养：在无菌条件下，将中间根瘤菌、荧光假单胞菌、巨大芽孢杆菌分别接种于LB培养基，在28-37℃条件下恒温培养24-36h；

（2）混合：将培养后的菌悬液按一定体积3-7：3-7：1-5混合均匀，使菌悬液中的总活菌数为3×10⁸-10×10⁸CFU/mL，其中：中间根瘤菌1.5×10⁸-3.5×10⁸CFU/mL，荧光假单胞菌1.5×10⁸-3.5×10⁸CFU/mL，巨大芽孢杆菌0.5×10⁸-2.5×10⁸CFU/mL。并保证液态菌肥中，氮、磷、钾的质量含量均≥4％。

本实施例中共制备了以下几种活菌含量（CFU/mL）的液态菌肥：

实施例2固态菌肥的制备

固态菌肥的制备方法参照如下步骤：

（1）粉碎基料：将经过粗加工的农作物秸秆和麸皮等基料粉碎成200-300mm粗粉，作为赋形剂；

（2）拌料：按照基料与实施例1方法制得的液态菌肥为1.5-2：1（V:V）进行混合，用基料吸附液态菌肥，加入相应体积的水，同时使体系温度达到30-40℃。

（3）粉碎过筛：将基料和液态菌肥搅拌均匀后进一步粉碎过筛，筛孔孔径100-200目；

（4）造粒：粉碎过筛后的物料通过造粒机进行造粒，制成1-2mm的固态菌肥颗粒。

所述固态菌肥中，氮、磷、钾的质量含量均≥6％，活菌总数为2.5×10⁸-7×10⁸CFU/g，其中，中间根瘤菌1.0-2.5×10⁸CFU/g，荧光假单胞菌1.0-2.5×10⁸CFU/g，巨大芽孢杆菌0.5-2.0×10⁸CFU/g。

本实施例中共制备了以下几种活菌含量（CFU/mL）的固态菌肥：

实验例生物菌肥在葡萄上的应用效果研究

本实验例中，采用实施例2中的固态菌肥2-1作为生物有机肥，采用实施例1中的液态菌肥1-1作为微生物菌肥。

1、供试材料

以三年生的马瑟兰（酿酒葡萄）和阳光玫瑰（鲜食葡萄）为供试作物，种植密度为1500株·m^-2。土壤理化性状土壤pH 6.37，有机质含量为23.65 g·kg^-1，全氮含量为1.63g·kg-1，有效磷含量为88.97 mg·kg^-1，速效钾含量为305 mg·kg^-1，解钾氮65.71 mg·kg^-1。

供试肥料：

生物有机肥样本（执行标准NY884—2012），有效活菌数≥2000万·g^-1，有机质≥40%；

微生物菌肥（执行标准GB20287—2006），有效活菌数≥2亿·mL^-1；

51%复合肥（含氮、磷、钾有效养分均17%）：史丹利，瓜果专用氮磷钾三元复合肥，货号：SN30612796788；

45%复合肥（含氮、磷、钾有效养分均15%）：史丹利，瓜果专用氮磷钾三元复合肥，货号：SN30612796788；

硫酸钾肥：罗布泊全水溶硫酸钾肥，商品编号：10038698733581；

商品有机肥：史丹利，葡萄肥料专用肥，货号：sdl0葡萄复合肥。

露天栽培，株行距为0.6m×6m，每株留4穗。

2、方法

试验设2个处理，每处理面积3335 m²，每个处理设置两组平行。

T1为对照处理，秋季葡萄采收后进行施用基肥，施用普通商品有机肥9 t·hm^-2，51%复合肥225 kg·hm^-2，追肥分别在3月份追施45%复合肥300 kg·hm^-2，5月份追施51%复合肥300 kg·hm^-2，7月追施硫酸钾肥450 kg·hm^-2；

T2为化肥减量10%+生物有机肥处理，秋季葡萄采收后进行施用基肥，施用生物有机肥6 t·hm^-2，51%复合肥202.5 kg·hm^-2，追肥分别在3月份追施45%复合肥270 kg·hm^-2、微生物菌肥15 L·hm^-2，5月追施51%复合肥270 kg·hm^-2、微生物菌肥15 L·hm^-2，7月追施硫酸钾肥405 kg·hm^-2、微生物菌肥15 L·hm^-2。

除施肥外，T1、T2其他管理措施相同。

3、样品的采集与测定

（1）果实品质检测

2022年8月3日，采集新鲜成熟果实，每处理随机采集3 kg进行品质检测。

1）以NaOH滴定法测定总酸(以酒石酸计)含量：

①处理与制备：将样品研碎过筛，混合均匀，加入少量无二氧化碳的蒸馏水，将样品溶解到250mL容量瓶中，在78-80℃水浴上加热0.5小时，冷却，定容，用干燥滤纸过滤，收集滤液备用。

②样品滴定：精确吸取制备的滤液50mL，加入酚酞指示剂2-3滴，用0.1mol/L标准碱液滴定至微红色30秒不褪色，记录用量，同时做空白试验；以下式运算样品含酸量；

总酸度（%）=[C*(V1-V2)*K*V3*100%]/M*V4

式中：

C-标准氢氧化钠溶液的浓度mol/L；

V1-滴定所消耗标准碱液的体积mL；

V2-空白所消耗标准碱液的体积mL；

V3-样品稀释液总体积mL；

V4-滴定时吸取的样液的体积mL；

M-样品质量或体积（g或mL）。

K--换算为适当酸的系数，即1mol氢氧化钠相当于主要酸的克数。

总酸度测定结果通常以样品含量最多的那种酸表示，酒石酸表示，其K=0.074。

2）以蒽酮比色法测定可溶性糖含量：

①葡萄糖标准曲线的制作。

②样品中可溶性糖的提取：

将3kg样品，剪碎，置于研钵中加入少量蒸馏水，研磨成匀浆，然后转入20mL刻度试管中，用10mL蒸馏水分次洗涤研钵，洗液一并转入刻度试管中。置沸水浴中加盖煮沸10分钟，冷却后过滤，滤液收集于100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度线，摇匀备用。

③含糖量测定：用移液管吸收1mL提取液于20mL具塞刻度试管中，加1mL水和0.5mL蒽酮试剂。再缓慢加入5mL弄硫酸，盖上试管塞后，轻轻摇匀，再置沸水浴中10分钟（比色空白用2mL蒸馏水与0.5蒽酮试剂混合，并一同于沸水浴保温10分钟）。冷却至室温后，在波长620mm下比色，记录光密度值。查标准曲线得知对应的葡萄糖含量（μg）。

④计算结果：

样品含糖量(g/100g鲜重)=查表所得糖含量(μg)*稀释倍数*100/样品重(g)*10⁶。

3）用PAL-1型折射仪进行样液可溶性固形物含量检测：

①样液制备：样品剪碎、混匀，称取250g，准确至0.1g，放入高速组织捣碎机捣碎，用两层擦镜纸或纱布挤出匀浆液测定。

②测定：调节恒温水浴循环水温度在20±0.5℃，使水流通过折射仪的恒温器。循环水也可在15~25℃范围内调节，温度恒定不超过±0.5℃。

用蒸馏水校准折射仪读数，在20℃时将可溶性固形物调整至0%；温度不在20℃时，按照“折射仪测定可溶性固形物温度校正”表进行校正。

将棱镜表面擦干净后，滴加2~3滴待测液于棱镜中央，立即闭合上下两块棱镜，对准光源，转动消色调节旋钮，使视野分成明暗两部分，再转动棱镜旋钮，使明暗分界线适在物镜的十字交叉点上。读取刻度尺上所示百分数，并记录测定时的温度。

③结果计算：未经稀释的试样，温度校正后的读数即为试样的可溶性固形物含量。稀释过的试样，可溶性固形物的含量按下试计算：

可溶性固形物（%）=P*（m1/m0）

式中：P--测定液可溶性固形物含量，%（m/m）；

m0--稀释前试样质量，g；

m1--稀释后试样质量，g。

④结果显示：同一试样取两个平行测定，以其算术平均值作为测定结果，保留一位小数。

⑤允许差：两个平行的测定结果最大允许绝对差，未经稀释的试样为0.5%，稀释过的试样为0.5%乘以稀释倍数（即稀释后试样克数与稀释前试样克数的比值）。

4）采用Folin-Ciocalteu法测定总多酚含量：

①称取葡萄样品匀浆3g，用80mL水洗入100mL容量瓶中，100℃沸水浴30分钟，取出冷却，定容，过滤，滤液备用。葡萄酒直接吸取2mL于100mL容量瓶中用水定容，备用。

②标准曲线制作：用分度吸管从0、10、20、30、40和50μg/mL的系列一水合没食子酸标准溶液中吸取110mL，分别加水5mL、FC显色剂1mL，715%碳酸钠溶液3mL，显色，此时分别相当于0、110、210、310、410和510μg/mL的一水合没食子酸。放置2小时后，在765nm波长下测定系列标准溶液的吸光度，绘制标准曲线，并求得方程式：

y=0.1167x+0.0129（R2=0.9993）。

③样品测定：吸取110mL样品溶液，分别加入水510mL、FC显色剂1mL和715%碳酸钠溶液3mL，显色。放置2小时后，在760nm波长下测定样品的吸光度，再根据标准曲线计算出样品中总酚的浓度。

5）采用pH示差法测定总花色苷含量：

①样品制备：3kg葡萄样品，用高速组织捣碎机于5000rpm/min转速下粉碎1min；粉碎后的蓝莓果浆转移至烧杯中，加入60mL 60%的乙醇溶液，于50℃提取45min。提取液于2000g转速下离心10min，保留上清液，沉渣中加入50mL 60%的乙醇溶液洗涤，按上述步骤重新提取2次，合并上清液。最后用60%的乙醇溶液定容至200mL，备用。

②检测方法：吸取样品制备液1mL，分别用pH1.0 [0.2mol/L KCl:0.2mol/LHCl=25:67，V/V]和pH4.5[0.2mol/L NaAc·3H₂O:0.2mol/L HAc=1:1，V/V]的缓冲液稀释至10mL，混匀。以1mL溶剂加9mL相应缓冲液作空白，分别在510nm和700nm处测定吸光值。

结果按下式计算：

A=[(A₅₁₀-A₇₀₀)_pH1.0-(A₅₁₀-A₇₀₀)_pH4.5]；

ACY(mg/g)=（A*V*n*449）/（29600*m)；

V--提取液总体积（mL)；

n--稀释倍数；

449--矢车菊素-3-葡萄糖苷的相对分子质量；

29600--矢车菊素-3-葡萄糖苷的消光系数；

m--试样的质量（g）；

注：平行测定结果用算术平均值表示，保留两位有效数字。

③允许差：同一分析者对同一试样同时测定两次（或重复测定）所得结果相对偏差不大于10%。

（2）土壤养分检测

果实全部采摘后，采集试验区域土壤进行检测。取土样时清除采样点土壤表面杂物，在0-20 cm耕层进行多点混合采样。土壤中的有机质、全氮、有效磷、速效钾指标按照NY/T 1121.7中的方法进行检测。

（3）果实产量统计

进行分批采摘计产，全部采摘后对总产量进行统计。

4、结果与分析

（1）对果实品质的影响

（2）对土壤理化性质的影响

T2的各项土壤性状指标均高于对照组T1，但未达显著性水平。T2的有效磷、速效钾均有所提高，可能与施用生物有机肥后土壤微生物活性较高，微生物通过生命活动产生较多酶或酸类物质，可促进土壤中难溶养分的分解和转化，促进磷、钾等养分释放有关。不同处理组土壤理化性质指标比较见下表：

（3）对葡萄产量的影响

对葡萄总产量进行统计，T1的葡萄平均产量为19.4 t·hm^－2，T2的平均产量为21.6 t·hm^－2，T1产量提高11.3%。试验结果表明，在施底肥时，用生物有机肥代替普通商品有机肥，在化肥减量10%的条件下，葡萄产量并没有下降，反而有明显提高。

生物有机肥兼具有机肥和生物肥的特点，在香梨、香蕉、草莓等多种水果上应用均有抗病、提质增产、改良土壤的报道，生物有机肥的研发和使用正成为一种趋势，推广应用前景广阔。本试验在化肥减量10%的基础上，对生物有机肥在葡萄作物上的施用效果进行研究，结果表明，生物有机肥可明显增加葡萄产量，同时可改善土壤理化性状，提升土壤肥力；生物有机肥中的功能菌有助于将土壤中作物难以利用的氮磷钾形态转变为可直接利用的形态，促进植物生长。

对比例

参照实施例1-2设置对比例，具体如下：

参照实验例的方法，检测以上对比例种植葡萄的效果，结果如下：

（1）果实品质

（2）土壤理化性质

（3）葡萄产量

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims

1.一种微生物组合物在制备微生物菌肥中的应用，其特征在于，所述的微生物组合物由活菌比例为2-5：2-5：1-4的中间根瘤菌、荧光假单胞菌、巨大芽孢杆菌组成，所述的微生物菌肥中总活菌数不低于2.5×10⁸CFU/mL或2.5×10⁸CFU/g，所述的微生物菌肥为葡萄用微生物菌肥。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的微生物组合物由活菌比例为2：2：1的中间根瘤菌、荧光假单胞菌、巨大芽孢杆菌组成。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的微生物菌肥为液态菌肥，总活菌数为3×10⁸-10×10⁸CFU/mL。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的微生物菌肥为固态菌肥，总活菌数为2.5×10⁸-7×10⁸CFU/g。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的液态菌肥中包括：中间根瘤菌1.5×10⁸-3.5×10⁸CFU/mL，荧光假单胞菌1.5×10⁸-3.5×10⁸CFU/mL，巨大芽孢杆菌0.5×10⁸-2.5×10⁸CFU/mL。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的液态菌肥的制备方法中包括将三种菌分别培养，然后按照菌数比例混合。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的固态菌肥为液态菌肥与基料混合制备，所述的基料与液态菌肥的混合体积比为1.5-2：1，所述的固态菌肥中包括：中间根瘤菌1.0-2.5×10⁸CFU/g，荧光假单胞菌1.0-2.5×10⁸CFU/g，巨大芽孢杆菌0.5-2.0×10⁸CFU/g。

8.一种葡萄用微生物菌肥，其特征在于，包括由活菌比例为2-5：2-5：1-4的中间根瘤菌、荧光假单胞菌、巨大芽孢杆菌组成的微生物组合物。