CN112980745B - 变栖克雷伯氏菌sy1及其应用 - Google Patents

变栖克雷伯氏菌sy1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种变栖克雷伯氏菌SY1及其应用，所述的应用为：将变栖克雷伯氏菌SY1接种至含苯基二甲酸类化合物的BSM培养基中，在pH 4.0‑9.0、20‑40℃、100‑200rpm条件下进行降解反应，反应完全后，实现苯基二甲酸类化合物的降解；本发明采用单一菌株可对TPA进行有效降解，同时还可降解邻苯二甲酸或对苯二甲酸双羟乙酯等重要的苯二甲酸类化合物，可用于精对苯二甲酸生产废水，化纤废水等的净化处理。

Description

变栖克雷伯氏菌SY1及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一株具有对苯二甲酸(TPA)或邻苯二甲酸(PA)降解能力的菌株——变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)SY1，及其在微生物降解对苯二甲酸(TPA)和邻苯二甲酸(PA)中的应用。
(二)背景技术
对苯二甲酸(terephthalic，TPA)是生产聚对苯二甲酸乙二醇酯(Polyethleneterephthalate，PET)的主要原料，也是PET降解过程中的重要和主要的降解产物。此外，TPA也用于生产涂料、胶粘剂、增塑剂和染料等行业，是一种重要的工业原料。据报道，全球TPA的产量达到了125万吨/年。每吨TPA的生产，会产生3～4m3的废水，其中含有1500mg/L的TPA。TPA具有一定的毒性，对水中的微生物有强抑制作用，对动物会导致膀胱结石和膀胱癌以及损伤睾丸功能。如何有效地去废水中的TPA，一直是令人关注的问题。目前处理TPA废水的主要方法有：活性炭吸附法、二氧化氯或臭氧氧化法以及生物处理法。TPA降解菌广泛存在于土壤、河流、堆肥以及污水处理厂的活性污泥中。目前报导的TPA降解菌有Nocardiasp.strain DSM 43251、Bacillus sp、Dietzia sp.strain GS-1、Pseudomonas sp.strainC4S、Comamonas testosteroni T-2、Comamonas testosteroni YZW-D以及Delftiatsuruhatensis sp.T7。发明人以TPA为模式化合物，从杭州市上塘河河底污泥中分离出1株TPA降解菌Klebsiella variicola SY1，并研究了其对TPA的降解特性。此外，还发现该菌株同时具有邻苯二甲酸(PA)的降解能力。目前尚无Klebsiella属降解TPA的报道。
(三)发明内容
本发明目的是提供一株具有对苯二甲酸(TPA)或邻苯二甲酸(PA)降解能力的菌株——变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)SY1，及其在微生物降解对苯二甲酸(TPA)或邻苯二甲酸(PA)中的应用。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株新菌株-变栖克雷伯氏菌SY1(Klebsiella variicola SY1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020198，保藏日期2020年6月10日，地址中国武汉，武汉大学，邮编430072。
本发明还提供一种所述变栖克雷伯氏菌SY1在降解苯基二甲酸类化合物中的应用，所述苯基二甲酸类化合物为邻苯二甲酸(PA)、对苯二甲酸双羟乙酯(BHET)或对苯二甲酸(TPA)。
进一步，所述的应用为：将变栖克雷伯氏菌SY1接种至含苯基二甲酸类化合物的BSM培养基中，在pH 4.0-9.0、20-40℃、100-200rpm条件下进行降解反应，反应完全后，实现苯基二甲酸类化合物的降解；所述BSM培养基组成：K2HPO4·3H2O1.0g/L，NaCl 1.0g/L，(NH4)2SO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，CaCl2 0.0755g/L，FeCl3·6H2O 0.0143g/L，溶剂为水，pH7.5。
进一步，所述苯基二甲酸类化合物在BSM培养基中加入终浓度为250mg/L-3000mg/L，优选1000mg/L。
进一步，所述降解条件优选为：pH6.0、30℃、180rpm。
进一步，所述苯基二甲酸类化合物以250mg/mL的二甲基亚砜(DMSO)溶液形式加入。
进一步，所述变栖克雷伯氏菌SY1接种前，先进行斜面和种子扩大培养，再将种子液以体积浓度1-5％(优选2％)的接种量种至含苯基二甲酸类化合物的BSM培养基；所述斜面培养：将菌株SY1接种至LB固体培养基中，30℃培养24h，获得斜面菌体；所述种子培养：挑取斜面菌体接种至LB液体培养基中，30℃、180rpm培养24h，获得种子液。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：目前处理TPA废水的主要方法有：活性炭吸附法、二氧化氯或臭氧氧化法以及活性污泥处理法，本发明采用单一菌株可对TPA进行有效降解，同时还可降解邻苯二甲酸(PA)或对苯二甲酸双羟乙酯(BHET)等重要的苯二甲酸类化合物，可用于精对苯二甲酸生产废水，化纤废水等的净化处理。
(四)附图说明
图1、菌株SY1降解TPA的液相图。
图2、菌株SY1的系统发育进化树。
图3、TPA标准曲线。
图4、温度对菌株SY1生长的影响。
图5、温度对菌株SY1降解TPA的影响。
图6、pH对菌株SY1生长的影响。
图7、pH对菌株SY1降解TPA的影响。
图8、底物浓度对菌株SY1生长的影响。
图9、底物浓度对菌株SY1降解TPA的影响。
图10、BA、PCA和TPA标准品的液相图。
图11、菌株SY1降解TPA的中间产物液相图，A为菌株SY1降解TPA 0h和48h液相图；B为48h放大图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
1、实验材料与方法
1.1培养基：
LB液体培养基(g/L)：酵母膏(5.0)，蛋白胨(10.0)，NaCl(10.0)，溶剂为水，调至pH7.0，115℃灭菌30min；
LB固体培养基是在LB液体培养基中添加20g/L琼脂。
BSM培养基(即基础无机盐培养基，g/L)：K2HPO4·3H2O(1.0)，NaCl(1.0)，(NH4)2SO4(0.5)，MgSO4·7H2O(0.4)，CaCl2(0.0755)，FeCl3·6H2O(0.0143)，溶剂为水，调至pH 7.5，115℃灭菌30min；
BSM固体培养基在BSM培养基中添加20g/L琼脂。
TPA液体培养基：在BSM培养基中加入对苯二甲酸(TPA)(溶解于DMSO，母液浓度为250mg/mL)，使溶液中TPA终浓度为250mg/L。
TPA固体培养基：在TPA液体培养基中添加20g/L琼脂。
1.2TPA降解菌的筛选
菌株的富集培养：取杭州市上塘河河底污泥水样100μL，滴入50ml LB液体培养基中，30℃，180rpm过夜培养，获得富集培养液。
将富集培养液用无菌水进行10-3～10-6倍梯度稀释，然后将梯度稀释液涂布于TPA固体培养基，30℃倒置培养。根据菌落形态、大小进行初步筛选，将长势较好的菌株接入TPA液体培养基中，30℃活化；将经过活化的菌株在TPA固体培养基平板上划线，进行进一步纯化；将纯化后的菌株接种至TPA液体培养基复筛比较，在培养0h和48h时，取样用HPLC法测定TPA降解能力，筛选得到菌株SY1。
1.3HPLC测定TPA
TPA标准溶液的配制及标准曲线的制作：准确称取一定量的TPA标准样品，使用DMSO溶解，配制成浓度为125mg/mL的标准溶液，再以70％(v/v)甲醇-水混合溶剂稀释标准溶液，分别配制成终浓度为250mg/L，200mg/L，150mg/L，100mg/L，50mg/L的标准溶液。进样量10μL，用HPLC分别测定各浓度TPA的峰面积，以TPA浓度为横坐标，相应的TPA峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
色谱分析条件：使用Agilent 1260HPLC检测，进样量为10μL，流动相为甲醇：水＝70％：30％(体积浓度)，等度洗脱，流速为0.5mL/min，色谱柱为Diamonsil 5μmC18，250×4.6mm，柱温为30℃，使用二极管阵列(DAD)检测器，检测波长为254nm。
1.4菌株SY1的16S rRNA基因测序
基因组DNA的提取：使用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取菌株SY1基因组DNA。16S rDNA扩增：以提取出的总DNA为模板，使用细菌通用引物，使用高保真聚合酶2×Phanta Master Mix扩增菌株的16S rDNA序列。将PCR片段回收纯化后送往杭州擎科梓熙生物技术有限公司进行测序，核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
引物序列入下：
F:5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’(E.coli 27F)
R:5’-TPAC CTT GTT ACG ACT T-3’(E.coli 1492R)
SEQ ID NO.1
cagtcgagcggtagcacagagagcttgctctcgggtgacgagcggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagtgggggaccttcgggcctcatgccatcagatgtgcccagatgggattagctggtaggtggggtaacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggttgtaaagcactttcagcggggaggaaggcgatgaggttaataacctcatcgattgacgttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgtcaagtcggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcattcgaaactggcaggctagagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgatgtcgatttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaaatcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggtcttgacatccacagaactttccagagatggattggtgccttcgggaactgtgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcggttaggccgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgaccagggctacacacgtgctacaatggcatatacaaagagaagcgacctcgcgagagcaagcggacctcataaagtatgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtagatcagaatgctacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggaggg。
1.5菌株SY1的生理生化特征鉴定
将分离得到的纯化菌株SY1在TPA平板上划线培养，挑取单菌落进行革兰氏染色。使用肠杆菌科细菌生化鉴定条对菌株SY1进行生化鉴定：挑取营养琼脂平板上的单菌落至2ml无菌生理盐水中，重悬成均一细胞悬液。分别接种到以下培养基(每孔加入100μL菌悬液)：半固体琼脂，鸟氨酸脱羧酶肉汤，赖氨酸脱羧酶肉汤，氨基酸脱羧酶对照，西蒙氏枸橼酸盐，硫化氢，尿素酶，蛋白胨水(色氨酸肉汤)，MR，VP，苯丙氨酸，甘露醇，肌醇，山梨醇，蜜二糖，核糖醇，棉子糖。其中半固体琼脂采用穿刺接种。赖氨酸、鸟氨酸和氨基酸对照加入200μL无菌石蜡封口。接种完毕后盖上盖子，置于37℃恒温培养箱中培养。培养24h后按照说明书滴加指示剂并记录实验结果，其中甲基红(MR)试验需在培养48h后判定。
1.6温度对菌株SY1降解TPA的影响
斜面培养：将菌株SY1接种至LB固体培养基中，30℃培养24h，获得斜面菌体；
种子培养：挑取斜面菌体接种至LB液体培养基中，30℃、180rpm培养24h，获得种子液；
TPA的降解：向BSM培养基中添加250mg/mL的TPA母液(溶剂为DMSO)使TPA终浓度为250mg/L，调pH至7.0，将种子液以体积浓度2％的接种量接种，分别于25℃、30℃及37℃，180rpm培养。
每组设置3个平行，每12h取样测定OD600，根据测得的OD600值绘制不同温度下菌株SY1的生长曲线，比较不同温度对菌株SY1生长的影响。同时每12h取样，HPLC检测培养液中TPA的残留量，根据菌株SY1的生长速率和降解TPA的速率来确定菌株SY1降解TPA的最适温度。
降解率＝(降解前TPA含量-降解后TPA含量)/降解前TPA含量×100％
1.7pH对菌株SY1降解TPA的影响
向BSM培养基中添加250mg/mL的TPA母液(溶剂为DMSO)使TPA终浓度为250mg/L，分别调pH至4-9(4、5、6、7、8、9)，将种子液(同步骤1.6方法制备)以体积浓度2％的接种量接种，分别于30℃、180rpm培养。
每组设置3个平行，取培养0h和30h的培养液，同步骤1.6方法测定OD600及TPA残留量。比较不同pH条件下菌株SY1生长情况。同样根据菌株SY1的生长速率和降解TPA的速率确定菌株SY1的最适PH。
1.8底物浓度对菌株SY1降解TPA的影响
向BSM培养基中添加250mg/mL的TPA母液(溶剂为DMSO)使TPA终浓度为250mg/L、500mg/L、1000mg/L、2000mg/L、3000mg/L，分别调pH至7.0，将种子液(同步骤1.6方法制备)以体积浓度2％的接种量接种，分别于30℃、180rpm培养。
每组设置3个平行，每12h取样测定OD600，根据测得的OD600值绘制不同底物浓度下菌株SY1的生长曲线，比较不同底物浓度对菌株SY1生长的影响。同时每12h取样，同步骤1.6HPLC方法检测培养液中TPA的残留量。菌株SY1生长量和TPA降解量测定方法同上。比较不同初始TPA浓度对菌株SY1生长及降解TPA的影响。
1.9菌株SY1降解TPA的中间产物分析
向BSM培养基中添加250mg/mL的TPA母液(溶剂为DMSO)使TPA终浓度为250mg/L，pH为6.0，种子液(同步骤1.6方法制备)体积接种量为2％，30℃，180rpm培养30h后，使用HPLC对菌株SY1降解TPA的中间产物进行检测分析。HPCL条件：使用Agilent 1260HPLC检测，进样量为10μL，流动相为甲醇：3％冰乙酸＝70％：30％，等度洗脱，流速为0.5mL/min，色谱柱为Diamonsil 5μm C18，250×4.6mm，柱温为30℃，使用二极管阵列(DAD)检测器，检测波长为254nm。
1.10菌株SY1的底物特异性
配制BSM固体培养基，分别加入终浓度均为250mg/L的底物溶液，底物为TPA、PA(邻苯二甲酸)、BHET(对苯二甲酸双羟乙酯)、DMT(对苯二甲酸二甲酯)、DTP(对苯二甲酸二乙酯)、DOTP(对苯二甲酸二辛酯)、DMP(邻苯二甲酸二甲酯)、DEP(邻苯二甲酸二乙酯)、DBP(邻苯二甲酸二丁酯)、DEHP(邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯)，其中DMP、DEP、DBP、DEHP分别用甲醇溶解配制成100mg/L的母液，TPA、BHET、DMT、DTP、DOTP分别用DMSO溶解配制成100mg/L的母液；以甲醇、DMSO作为对照底物；将菌株SY1用LB培养基30℃培养至对数生长期，用无菌水重悬3次后，涂布于各底物平板，移至30℃恒温培养基倒置培养；次日观察其生长情况。
2结果与分析
2.1TPA降解菌株的筛选与初步鉴定
通过筛选获得了一株TPA降解菌，记为菌株SY1，其菌落形态为白色，圆形，表面光滑，边缘整齐；HPLC检测其TPA降解能力发现，经过48h降解，TPA基本降解完全(图1)，表明其具有良好的TPA降解能力。
提取菌株SY1的基因组DNA，PCR扩增其16S rRNA基因并测序，其序列(SEQ IDNO.1)在NCBI上的登录号为：MN822704。利用RDP数据库进行同源比对，获得与菌株SY1相似度最高的20株菌株的16S rDNA序列；通过MEGA7.0软件，使用Neighbor-joinging法构建系统发育树(图2)；结果显示菌株SY1与Klebsiella variicola F2R9T同源性最高，为99.93％。革兰氏染色镜检结果显示：SY1菌体形态为短杆状，革兰氏阴性；生理生化鉴定结果如表1所示，结合以上鉴定结果，参照《Bergeys Manual of Systematic Bacteriology》(第二版)，将菌株SY1命名为变栖克雷伯氏菌SY1(Klebsiella variicola SY1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020198，保藏日期2020年6月10日，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072。
表1菌株SY1生理生化鉴定结果
Figure BDA0003049366720000071
2.2TPA标准曲线
分别配制浓度为50、100、150、200和250mg/L的TPA溶液，用HPLC分别测定各浓度TPA的峰面积；以TPA浓度为横坐标，相应的TPA峰面积为纵坐标，绘制TPA标准曲线(图3)。峰面积与TPA浓度的换算公式如下：y＝57.87x-52.28，该曲线相关系数R2＝0.9945，线性关系良好。
2.3温度对菌株SY1生长和降解的影响
在TPA初始浓度为250mg/L，体积接种量为2％的条件下，用不同培养温度(25℃、30℃、37℃)，180rpm培养，测试温度对菌株SY1生长和降解的影响。结果如图4和图5所示：在25℃条件下，OD600最高，生长速率最快；在25℃、30℃、37℃条件下降解36h时的TPA残留浓度分别为15mg/L、8.5mg/L、7.5mg/L，TPA的降解率分别为94％、96.6％和97％，且在48h后都能降解完全。综合考虑，将30℃作为后续实验温度。
2.4pH对菌株SY1生长和降解的影响
在TPA初始浓度为250mg/L，体积接种量为2％，30℃，180rpm条件下，将培养基初始pH分别调节至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，测试pH对菌株SY1生长和降解的影响，结果如图6和图7所示：菌株SY1在pH小于等于5.0的条件下无法生长，在pH 6.0的条件下，OD600值最高。在pH 6.0-9.0的条件下，降解30h时的TPA残留浓度分别为9mg/L、18mg/L、21.25mg/L、20.25mg/L，TPA降解率分别为96.4％、92.8％、91.5％和92.9％。其中pH 6.0的条件下生长和降解最优，说明菌株SY1的最适pH为6.0。
2.5底物浓度对菌株SY1生长和降解的影响
在pH为7.0，体积接种量为2％，30℃，180rpm条件下，测试了不同初始TPA浓度(250mg/L、500mg/L、1000mg/L、2000mg/L和3000mg/L)对菌株SY1生长和降解的影响，结果如图8和图9所示：初始TPA浓度为250mg/L和500mg/L在培养36h后基本降解完全；初始TPA浓度为1000mg/L，在培养48h后残余量为85.53mg/L，在60h后基本降解完全；初始TPA浓度为2000mg/L和3000mg/L，在培养60h后，残余量分别为1382.67mg/L和2372.30mg/L。菌株SY1的最高TPA降解速率为19.06mg/L·h。说明菌株SY1对TPA的耐受能力较高，可以在高浓度TPA条件下生长(精对苯二甲酸生产废水中TPA的浓度约为800-1500mg/L，该菌株耐受浓度远高于该浓度)。
2.6菌株SY1降解TPA中间产物分析
为了确定菌株SY1对TPA的降解途径，将HPLC检测条件优化为：流动相为甲醇：3％冰乙酸＝70％：30％，等度洗脱，流速为0.5mL/min，色谱柱为Diamonsil 5μmC18，250×4.6mm，柱温为30℃，使用二极管阵列(DAD)检测器，检测波长为254nm。
优化HPLC条件后，原儿茶酸(PCA)标准品的出峰时间为5.0min，苯甲酸(BA)标准品的出峰时间为7.8min，TPA标准品的出峰时间为5.9min(图10)。
在菌株SY1降解TPA的中间过程没有发现产物累积，在降解48h后，检测到了与PCA标准品出峰时间相一致的中间产物(图11)，推测其可能为PCA，但未发现与BA标准品出峰时间相一致的产物峰。因此，菌株SY1更有可能先将TPA转化为中间产物PCA，再进行进一步降解。
2.7菌株SY1的底物特异性
按照方法1.10，考察了菌株SY1对多种底物的利用能力，结果如表1所示：菌株SY1可在TPA、PA、BHET为唯一碳源的平板上生长，但不能以其余的对苯二甲酸酯和邻苯二甲酸酯为碳源的平板上生长，说明该菌株除了可以降解TPA外，还可以降解邻苯二甲酸(PA)和BHET，但对于大多数对苯二甲酸酯类和邻苯二甲酯类没有明显的降解效果。
表1 Klebsiella variicola SY1的底物特异性
Figure BDA0003049366720000091
注：“+”表示菌在固体平板上的生长情况，“+”越多表示生长越好，“-”表示菌无法生长
结论
(1)本发明以TPA为唯一碳源，从环境中筛选到一株有较强TPA降解能力的菌株SY1。该菌株形态为短杆状，革兰氏阴性，结合生理生化实验和16S rRNA基因序列分析结果，将其命名为Klebsiella variicola SY1。目前尚无Klebsiella属降解TPA的报道。
(2)研究了Klebsiella variicola SY1对TPA的降解特性，结果表明，该菌株降解TPA的最适温度为30℃，最适pH为6.0；且对TPA的耐受浓度较高，可以在3000mg/L的TPA浓度下生长，TPA降解速率为19.06mg/L·h；Klebsiella variicola SY1除了可以降解TPA外，还可以降解邻苯二甲酸(PA)和BHET，但对于大多数对苯二甲酸酯类和邻苯二甲酯类没有明显的降解效果；
(3)研究了Klebsiella variicola SY1降解TPA及PA的中间产物，结果表明菌株SY1降解TPA和PA的中间产物均为PCA。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 变栖克雷伯氏菌SY1及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1399
<212> DNA
<213> 变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)
<400> 1
cagtcgagcg gtagcacaga gagcttgctc tcgggtgacg agcggcggac gggtgagtaa 60
tgtctgggaa actgcctgat ggagggggat aactactgga aacggtagct aataccgcat 120
aacgtcgcaa gaccaaagtg ggggaccttc gggcctcatg ccatcagatg tgcccagatg 180
ggattagctg gtaggtgggg taacggctca cctaggcgac gatccctagc tggtctgaga 240
ggatgaccag ccacactgga actgagacac ggtccagact cctacgggag gcagcagtgg 300
ggaatattgc acaatgggcg caagcctgat gcagccatgc cgcgtgtgtg aagaaggcct 360
tcgggttgta aagcactttc agcggggagg aaggcgatga ggttaataac ctcatcgatt 420
gacgttaccc gcagaagaag caccggctaa ctccgtgcca gcagccgcgg taatacggag 480
ggtgcaagcg ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgcac gcaggcggtc tgtcaagtcg 540
gatgtgaaat ccccgggctc aacctgggaa ctgcattcga aactggcagg ctagagtctt 600
gtagaggggg gtagaattcc aggtgtagcg gtgaaatgcg tagagatctg gaggaatacc 660
ggtggcgaag gcggccccct ggacaaagac tgacgctcag gtgcgaaagc gtggggagca 720
aacaggatta gataccctgg tagtccacgc tgtaaacgat gtcgatttgg aggttgtgcc 780
cttgaggcgt ggcttccgga gctaacgcgt taaatcgacc gcctggggag tacggccgca 840
aggttaaaac tcaaatgaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 900
tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctggtc ttgacatcca cagaactttc cagagatgga 960
ttggtgcctt cgggaactgt gagacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct cgtgttgtga 1020
aatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttatcc tttgttgcca gcggttaggc 1080
cgggaactca aaggagactg ccagtgataa actggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc 1140
atcatggccc ttacgaccag ggctacacac gtgctacaat ggcatataca aagagaagcg 1200
acctcgcgag agcaagcgga cctcataaag tatgtcgtag tccggattgg agtctgcaac 1260
tcgactccat gaagtcggaa tcgctagtaa tcgtagatca gaatgctacg gtgaatacgt 1320
tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt gggttgcaaa agaagtaggt 1380
agcttaacct tcgggaggg 1399

Claims (7)

1.变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)SY1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020198，保藏日期2020年6月10日，地址中国武汉武汉大学，邮编430072。
2.一种权利要求1所述变栖克雷伯氏菌SY1在降解苯基二甲酸类化合物中的应用，其特征在于所述苯基二甲酸类化合物为邻苯二甲酸、对苯二甲酸双羟乙酯或对苯二甲酸。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：将变栖克雷伯氏菌SY1接种至含苯基二甲酸类化合物的BSM培养基中，在pH 4.0-9.0、20-40℃、100-200rpm条件下进行降解反应，反应完全后，实现苯基二甲酸类化合物的降解；所述BSM培养基组成：K2HPO4·3H2O1.0g/L，NaCl 1.0g/L，(NH4)2SO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，CaCl20.0755g/L，FeCl3·6H2O 0.0143g/L，溶剂为水，pH7.5。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述苯基二甲酸类化合物在BSM培养基中加入终浓度为250mg/L-3000mg/L。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述降解条件为：pH6.0、30℃、180rpm。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述苯基二甲酸类化合物以250mg/mL的二甲基亚砜溶液形式加入。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述变栖克雷伯氏菌SY1接种前，先进行斜面和种子扩大培养，再将种子液以体积浓度1-5％的接种量种至含苯基二甲酸类化合物的BSM培养基；所述斜面培养：将菌株SY1接种至LB固体培养基中，30℃培养24h，获得斜面菌体；所述种子培养：挑取斜面菌体接种至LB液体培养基中，30℃、180rpm培养24h，获得种子液。
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CN107384975B (zh) * 2017-08-10 2019-09-24 张家港美景荣化学工业有限公司 生物安全变栖克雷伯氏菌及其在1,3-丙二醇生产中的应用
BR112020026771A2 (pt) * 2018-06-27 2021-03-30 Pivot Bio, Inc. Composições agrícolas que compreendem micróbios de fixação de nitrogênio remodelados
AU2019394973A1 (en) * 2018-12-07 2021-06-03 Pivot Bio, Inc. Polymer compositions with improved stability for nitrogen fixing microbial products
CN112522167B (zh) * 2020-12-28 2022-03-22 华南农业大学 一株高效降解丁草胺的变栖克雷伯氏菌wx-01及其应用

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