JP2023100703A - 植物の形質の改良を目的とした窒素固定のための遺伝子標的 - Google Patents

植物の形質の改良を目的とした窒素固定のための遺伝子標的 Download PDF

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Abstract

【課題】ｇｌｎＤの修飾を含む遺伝子操作された細菌を提供し、さらに該細菌を利用するための方法およびシステムを提供する。【解決手段】遺伝子操作された細菌は、ｇｌｎＤの修飾を含み、前記修飾が、遺伝子全体の欠失、実質的に遺伝子全体の欠失、ＡＣＴドメインの欠失、ＡＣＴドメインの５０％を超える欠失、ＡＣＴドメインの非活性化、およびＵＴａｓｅドメインの非活性化からなる群から選択される。【選択図】図２１

Description

相互参照
本出願は、２０１７年１０月２５日に提出された米国仮特許出願第６２／５７７，１４９号の優先権を主張し、これは参照により全体が本明細書に組み込まれる。
発明の背景
植物は、共有メタボロームを介してマイクロバイオームにリンクされている。特定の作物の形質とその基礎となるメタボロームとの間の多次元関係は、多数の極大値を伴うランドスケープを特徴とする。メタボロームに対するマイクロバイオームの影響を変えることによって、下極大値からより良い形質を表す別の極大値に最適化することは、作物の最適化などの様々な理由から望ましい場合がある。増加する世界人口のニーズを満たすために、農業および食糧生産への経済的、環境的、および社会的に持続可能なアプローチが必要である。２０５０年までに、国連食糧農業機関は、増加する人口のニーズを満たすために総食糧生産量を７０％増加させる必要があると予測している。この課題は、淡水資源の減少、農耕地の競争の激化、エネルギー価格の上昇、増加する投入コスト、および作物がより乾燥した、より暑い、より極端な地球気候のストレスに適応する必要可能性を含む、多くの要因によって悪化している。
目的の１つの領域は、窒素固定の向上である。窒素ガス（Ｎ２）は、地球の大気の主成分である。さらに、元素窒素（Ｎ）は、生物を構成する多くの化学化合物の重要な成分である。しかしながら、多くの生物は、Ｎ２を直接使用して、成長および生殖などの生理学的プロセスで使用される化学物質を合成することができない。Ｎ２を利用するために、Ｎ２は、水素と組み合わされなければならない。水素とＮ２との組み合わせは、窒素固定と呼ばれる。化学的に達成されたか、または生物学的に達成されたかにかかわらず、窒素固定は、大量のエネルギーの投資を必要とする。生物系では、ニトロゲナーゼとして知られている酵素が、窒素固定をもたらす反応を触媒する。窒素固定研究の重要な目標は、この表現型を非マメ科植物、特に小麦、稲、トウモロコシなどの重要な農業用草に拡大することである。根粒菌とマメ科植物との間の窒素固定共生の発達を理解する上での大きな進歩にもかかわらず、非マメ科作物に窒素固定結節を誘導するためにその知識を使用する道筋はまだ明確ではない。その一方で、肥料などの十分な補足的窒素源を提供するという課題は、食糧生産の増加の必要性とともに高まり続けるであろう。
本開示は、ｇｌｎＤの修飾を含む遺伝子操作された細菌であって、当該修飾が、遺伝子全体の欠失、実質的に遺伝子全体の欠失、ＡＣＴドメインの欠失、ＡＣＴドメインの５０％を超える欠失、ＡＣＴドメインの非活性化、およびＵＴａｓｅドメインの非活性化からなる群から選択される、遺伝子操作された細菌を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｇｌｎＡの発現または活性の変化をもたらすｇｌｎＡの修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、ｇｌｎＡの発現の低下をもたらす。いくつかの実施形態では、修飾は、未変性のｇｌｎＡプロモーターを、より活性の低いプロモーターで置き換えることを含む。いくつかの実施形態では、修飾は、未変性のｇｌｎＡプロモーターを、ｇｌｎＢプロモーター、ｇｌｎＤプロモーター、およびｇｌｎＥプロモーターからなる群から選択されるプロモーターで置き換えることを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｇｌｎＡの発現または活性の低下をもたらすｇｌｎＡの修飾を含む。
本開示は、ｒｐｏＮの発現の変化を含む、遺伝子操作された細菌を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｒｐｏＮの発現が増加している。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｒｐｏＮの発現が増加している。いくつかの実施形態では、請求項１～９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌であって、当該遺伝子操作された細菌は、遺伝子操作されたジアゾ栄養細菌である。いくつかの実施形態では、ｒｐｏＮ発現は、未変性のｒｐｏＮプロモーターを削除し、強力な構成的プロモーターで置き換えることによって増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、属間である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、外因性窒素の存在下で空中窒素を固定することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、窒素固定遺伝子ネットワークの修飾を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＮｉｆＡの修飾を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＮｉｆＡの発現の増加をもたらす修飾を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＮｉｆＬの修飾を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＮｉｆＬの発現の低下をもたらす修飾を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＮｉｆＨの修飾を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＮｉｆＨの発現の増加をもたらす修飾を含む。いくつかの実施形態では、当該遺伝子操作された細菌は、Ｎｉｆクラスター遺伝子の発現の増加をもたらす修飾を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された細菌は、窒素同化遺伝子ネットワークの修飾を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＧｌｎＥの修飾を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＧｌｎＥの活性の低下をもたらす修飾を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ａｍｔＢの活性の低下をもたらす修飾を含む。
本開示は、当該植物を、本明細書に記載の複数の当該遺伝子操作された細菌と接触させることを含む、植物中の大気由来窒素の量を増加させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、当該植物の種子に適用される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、当該植物の苗に適用される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、液体製剤で当該植物に適用される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、植え付け後、ただし当該植物の収穫前に当該植物に適用される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、側面施肥として当該植物に適用される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、発芽後１ヶ月～８ヶ月の間に当該植物に適用される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、発芽後２ヶ月～８ヶ月の間に当該植物に適用される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、発芽後１ヶ月～３ヶ月の間に当該植物に適用される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、発芽後３ヶ月～６ヶ月の間に当該植物に適用される。いくつかの実施形態では、植物は、穀物植物である。いくつかの実施形態では、植物は、トウモロコシ植物である。いくつかの実施形態では、植物は、稲植物である。いくつかの実施形態では、植物は、小麦植物である。いくつかの実施形態では、植物は、大豆植物である。
本開示は、種子および種子コーティングを含む組成物を提供、ここで、種子コーティングは、本明細書に記載の複数の当該遺伝子操作された細菌を含む。いくつかの実施形態では、種子は、穀物種子である。いくつかの実施形態では、種子は、トウモロコシ種子、小麦種子、稲種子、大豆種子、ライ麦種子、およびモロコシ種子からなる群から選択される。本開示は、植物および本明細書に記載の複数の当該遺伝子操作された細菌を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、植物は、苗である。いくつかの実施形態では、種子は、穀物種子である。いくつかの実施形態では、種子は、トウモロコシ、稲、小麦、大豆、ライ麦、およびモロコシからなる群から選択される。
[本発明1001]
ｇｌｎＤの修飾を含む遺伝子操作された細菌であって、前記修飾が、遺伝子全体の欠失、実質的に遺伝子全体の欠失、ＡＣＴドメインの欠失、ＡＣＴドメインの50％を超える欠失、ＡＣＴドメインの非活性化、およびＵＴａｓｅドメインの非活性化からなる群から選択される、遺伝子操作された細菌。
[本発明1002]
ｇｌｎＡの発現または活性の変化をもたらすｇｌｎＡの修飾を含む、遺伝子操作された細菌。
[本発明1003]
前記修飾が、ｇｌｎＡの発現の低下をもたらす、本発明1002の遺伝子操作された細菌。
[本発明1004]
前記修飾が、未変性のｇｌｎＡプロモーターを、より活性の低いプロモーターで置き換えることを含む、本発明1002の遺伝子操作された細菌。
[本発明1005]
前記修飾が、前記未変性のｇｌｎＡプロモーターを、ｇｌｎＢプロモーター、ｇｌｎＤプロモーター、およびｇｌｎＥプロモーターからなる群から選択されるプロモーターで置き換えることを含む、本発明1002の遺伝子操作された細菌。
[本発明1006]
ｇｌｎＡの発現または活性の低下をもたらすｇｌｎＡの修飾を含む、遺伝子操作された細菌。
[本発明1007]
ｒｐｏＮの発現の変化を含む、遺伝子操作された細菌。
[本発明1008]
増加したｒｐｏＮの発現を有している、本発明1007の遺伝子操作された細菌。
[本発明1009]
増加したｒｐｏＮの発現を有している、本発明1008の遺伝子操作された細菌。
[本発明1010]
遺伝子操作されたジアゾ栄養細菌である、本発明1001～1009のいずれかの遺伝子操作された細菌。
[本発明1011]
未変性のｒｐｏＮプロモーターを削除し、強力な構成的プロモーターで置き換えることによって、ｒｐｏＮ発現が増加する、本発明1001～1009のいずれかの遺伝子操作された細菌。
[本発明1012]
属間である、本発明1001～1009のいずれかの遺伝子操作された細菌。
[本発明1013]
外因性窒素の存在下で空中窒素を固定することができる、本発明1001～1009のいずれかの遺伝子操作された細菌。
[本発明1014]
窒素固定遺伝子ネットワークの修飾を含む、本発明1001～1009のいずれかの遺伝子操作された細菌。
[本発明1015]
ＮｉｆＡの修飾を含む、本発明1001～1009のいずれかの遺伝子操作された細菌。
[本発明1016]
ＮｉｆＡの発現の増加をもたらす修飾を含む、本発明1001～1009のいずれかの遺伝子操作された細菌。
[本発明1017]
ＮｉｆＬの修飾を含む、本発明1001～1009のいずれかの遺伝子操作された細菌。
[本発明1018]
ＮｉｆＬの発現の低下をもたらす修飾を含む、本発明1001～1009のいずれかの遺伝子操作された細菌。
[本発明1019]
ＮｉｆＨの修飾を含む、本発明1001～1009のいずれかの遺伝子操作された細菌。
[本発明1020]
ＮｉｆＨの発現の増加をもたらす修飾を含む、本発明1001～1009のいずれかの遺伝子操作された細菌。
[本発明1021]
Ｎｉｆクラスター遺伝子の発現の増加をもたらす修飾を含む、本発明1001～1009のいずれかの遺伝子操作された細菌。
[本発明1022]
窒素同化遺伝子ネットワークの修飾を含む、本発明1001～1009のいずれかの遺伝子操作された細菌。
[本発明1023]
ＧｌｎＥの修飾を含む、本発明1001～1009のいずれかの遺伝子操作された細菌。
[本発明1024]
ＧｌｎＥの活性の低下をもたらす修飾を含む、本発明1001～1009のいずれかの遺伝子操作された細菌。
[本発明1025]
ａｍｔＢの活性の低下をもたらす修飾を含む、本発明1001～1009のいずれかの遺伝子操作された細菌。
[本発明1026]
植物中の大気由来窒素の量を増加させる方法であって、前記植物を、本発明1001～1025のいずれかの複数の前記遺伝子操作された細菌と接触させることを含む、方法。
[本発明1027]
前記遺伝子操作された細菌が、前記植物の種子に適用される、本発明1026の方法。
[本発明1028]
前記遺伝子操作された細菌が、前記植物の苗に適用される、本発明1026の方法。
[本発明1029]
前記遺伝子操作された細菌が、液体製剤で前記植物に適用される、本発明1026の方法。
[本発明1030]
前記遺伝子操作された細菌が、植え付け後、ただし前記植物の収穫前に前記植物に適用される、本発明1026の方法。
[本発明1031]
前記遺伝子操作された細菌が、側面施肥として前記植物に適用される、本発明1026の方法。
[本発明1032]
前記遺伝子操作された細菌が、発芽後1ヶ月～8ヶ月の間に前記植物に適用される、本発明1026の方法。
[本発明1033]
前記遺伝子操作された細菌が、発芽後2ヶ月～8ヶ月の間に前記植物に適用される、本発明1026の方法。
[本発明1034]
前記遺伝子操作された細菌が、発芽後1ヶ月～3ヶ月の間に前記植物に適用される、本発明1026の方法。
[本発明1035]
前記遺伝子操作された細菌が、発芽後3ヶ月～6ヶ月の間に前記植物に適用される、本発明1026の方法。
[本発明1036]
前記植物が、穀物植物である、本発明1026の方法。
[本発明1037]
前記植物が、トウモロコシ植物である、本発明1026の方法。
[本発明1038]
前記植物が、稲植物である、本発明1026の方法。
[本発明1039]
前記植物が、小麦植物である、本発明1026の方法。
[本発明1040]
前記植物が、大豆植物である、本発明1026の方法。
[本発明1041]
種子および種子コーティングを含む組成物であって、前記種子コーティングが、本発明1001～1025のいずれかの複数の前記遺伝子操作された細菌を含む、組成物。
[本発明1042]
前記種子が、穀物種子である、本発明1041の組成物。
[本発明1043]
前記種子が、トウモロコシ種子、小麦種子、稲種子、大豆種子、ライ麦種子、およびモロコシ種子からなる群から選択される、本発明1041の組成物。
[本発明1044]
植物および本発明1001～1025のいずれかの複数の前記遺伝子操作された細菌を含む、組成物。
[本発明1045]
前記植物が、苗である、本発明1044の組成物。
[本発明1046]
前記種子が、穀物種子である、本発明1044の組成物。
[本発明1047]
前記種子が、トウモロコシ、稲、小麦、大豆、ライ麦、およびモロコシからなる群から選択される、本発明1044の組成物。
参照による組み込み
本明細書で言及されるすべての出版物、特許、および特許出願は、個々の出版物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明および添付の図面を参照することによって得られるであろう。
図１Ａおよび１Ｂは、窒素固定細菌の濃縮および分離を示す。（Ａ）Ｎｆｂ寒天プレートを使用して、窒素固定細菌の単一コロニーを分離した。（Ｂ）半固体Ｎｆｂ寒天をＢａｌｃｈチューブに入れた。矢印は、濃縮された窒素固定細菌のペリクルを指す。 代表的なｎｉｆＨ ＰＣＲスクリーニングを示す。このスクリーニングでは、２つのコロニーについて約３５０ｂｐで陽性のバンドが観察された。下のバンドは、プライマーダイマーを表す。 ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓで選択した突然変異誘発からのコロニーのＰＣＲスクリーニングの例を示す。ＣＩ００６コロニーを、ｎｉｆＬ遺伝子座に特異的なプライマーでスクリーニングした。野生型ＰＣＲ産生物は、約２．２ｋｂで予想されるが、突然変異体は、約１．１ｋｂで予想される。スクリーニングした１０個のコロニーのうち７個は、望ましい欠失を明確に示す。 様々な菌株のインビトロ表現型を示す。０～１０ｍＭグルタミンで補足した窒素固定培地で増殖させた株ＣＩ０１０の突然変異体（図４Ａ）および株ＣＩ００６の突然変異体（図４Ｂ）のアセチレン還元アッセイ（ＡＲＡ）活性。追加の株のＡＲＡ活性を図４Ｃに示し、２つの株の経時的なアンモニウム排泄プロファイルを図４Ｄに示す。 説明は図４Ａに記載の通り。 説明は図４Ａに記載の通り。 説明は図４Ａに記載の通り。 ジアゾ栄養性窒素固定に関与する株ＣＩ００６の９個の異なる遺伝子の培養発現プロファイルを示す。数字は、各転写産物の数を表す。様々な条件（０、１、１０ｍＭのグルタミンおよびＮ２中０％、１０％、２０％の大気）が表示される。 トウモロコシの根のＣＩ００６コロニー形成を示す。トウモロコシの苗に、ＲＦＰ発現プラスミドを内包するＣＩ００６を接種した。適切な抗生物質を散水して２週間増殖させ、プラスミドを維持した後、根を採取し、蛍光顕微鏡で画像化した。根の細胞間空間のコロニー形成が観察される。 ＷＴ（ＣＩ０５０）および最適化（ＣＭ００２）株の微生物レベルに由来する窒素を示す。 Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ着果質量分析の実験装置を示す。 Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ植物の果実質量を増加させるための１０株のスクリーニングを示す。６つの複製の結果を表示する。列３の場合、ｐ＝０．０７。列７の場合、ｐ＝０．０５。 図１０Ａ～１０Ｃは、０～１０ｍＭのグルタミンで補足した窒素固定培地で増殖させた候補微生物および対応する候補突然変異体のＡＲＡ活性の追加の結果を示す。 図１０Ａ～１０Ｃは、０～１０ｍＭのグルタミンで補足した窒素固定培地で増殖させた候補微生物および対応する候補突然変異体のＡＲＡ活性の追加の結果を示す。 図１０Ａ～１０Ｃは、０～１０ｍＭのグルタミンで補足した窒素固定培地で増殖させた候補微生物および対応する候補突然変異体のＡＲＡ活性の追加の結果を示す。 元の単一突然変異体よりも高いアンモニア排泄量を呈する二重突然変異体を示す。 施肥条件でトウモロコシ植物のＮＤＦＡを測定するための１５Ｎガス取り込み実験（曝露日数を使用して外挿）から得られたＮＤＦＡを示す。 施肥条件でセタニア（Ｓｅｔａｒｉａ）植物のＮＤＦＡを測定するための１５Ｎガス取り込み実験（曝露日数を用いて外挿）から得られたＮＤＦＡ値を示す。 １５Ｎガスの取り込み率を示す。進化した株を接種した植物は、接種していない植物と比較して、１５Ｎガスの取り込みの増加を示した。 植え付けから４週間後、進化した株を接種した植物の窒素の最大７％が、微生物的に固定された窒素に由来することを示す。 非接種または野生型接種植物と比較したときに、進化した株を接種した植物では葉面積（および他のバイオマス測定、データは示さず）が増加していることを示す。 図１５Ａは、植物体トランスクリプトーム研究で測定されるように、根組織において著しく高いｎｉｆＨ産生を示す進化した株を示す。図１５Ｂは、植物組織に見られる固定窒素の割合が、その特定の植物がＨｏＭＥ最適化株によってコロニー形成される割合と相関していることを示す。 図１６Ａは、コロニー形成について試験された様々な畑地土壌の土質マップを示す。いくつかの微生物がもともと由来した土壌は、星として示される。図１６Ｂは、４つの異なる土壌タイプ（円）で試験した株１および株５のコロニー形成率を示す。どちらの株も、多様な土壌タイプで比較的強いコロニー形成プロファイルを示した。 図１６Ｃは、生育期間にわたる畑地実験で試験された株１のコロニー形成を示す。株１は、植え付け後１２週間までトウモロコシ組織中で持続し、その後コロニー形成の低下を示し始める。 実施形態による、微生物育種の概略図を示す。 図１７に示されるマイクロバイオーム組成の測定の拡大図を示す。 図１９Ａおよび１９Ｂは、グリコーゲン合成遺伝子ｇｌｇＡの修飾を有するＫ．ｓａｃｃｈａｒｉ株ＣＩ００６の突然変異体において、ニトロゲナーゼ活性およびアンモニウム排泄の増加を示す。 図２０Ａおよび２０Ｂは、グリコーゲン合成遺伝子ｇｌｇＡの修飾を有するＫ．ｖａｒｉｉｃｏｌａ株ＣＩ１３７の突然変異体において、同一の遺伝子型を有するがｇｌｇＡ修飾を欠く親株からの、ニトロゲナーゼ活性およびアンモニウム排泄の増加を示す。 ｇｌｎＥ遺伝子の概略図を示し、ＧｌｎＥタンパク質の機能ドメインに対応する領域を示す。 ｇｌｎＤ遺伝子の修飾を有するＫ．ｖａｒｉｉｃｏｌａ株ＣＩ１３７の突然変異体における、無窒素最小培地でのアンモニウム排泄の増加を示す。 ｇｌｎＤ遺伝子の修飾を有するＫ．ｓａｃｃｈａｒｉ株ＣＩ００６の突然変異体におけるアンモニウム排泄の増加を示す。 ｇｌｎＫ遺伝子の修飾を有するＫ．ｖａｒｉｉｃｏｌａ株ＣＩ１３７の突然変異体における、無窒素最小培地でのアンモニウム排泄の増加を示す。 低レベルで構成的に発現された遺伝子（ｇｌｎＥ、ｇｌｎＤ、またはｇｌｎＢ）からのプロモーターを上流に挿入し、５ｍＭのグルタミンで補足した最小培地中でｇｌｎＥ＿ＫＯ２突然変異を有する株上でＡＴＧ開始コドンをＧＴＧに突然変異させることによって作成されたｇｌｎＡ遺伝子の修飾を有するＫ．ｖａｒｉｉｃｏｌａ株ＣＩ１３７の変異体におけるアンモニウム排泄の増加を示す。 低レベルで構成的に発現された遺伝子（ｇｌｎＥ、ｇｌｎＤ、またはｇｌｎＢ）からのプロモーターを上流に挿入し、５ｍＭグルタミンで補足した最小培地中でｇｌｎＥ＿ＫＯ２およびΔｎｉｆＬ：：Ｐｒｍ１．２突然変異を有する株上でＡＴＧ開始コドンをＧＴＧに突然変異させることによって作成されたｇｌｎＡ遺伝子の修飾を有するＫ．ｖａｒｉｉｃｏｌａ株ＣＩ１３７の突然変異体におけるアンモニウム排泄の増加を示す。 低レベルで構成的に発現された遺伝子（ｇｌｎＥ、ｇｌｎＤ、またはｇｌｎＢ）からのプロモーターを上流に挿入し、無窒素最小培地中でｇｌｎＥ＿ＫＯ２およびΔｎｉｆＬ：：Ｐｒｍ１．２突然変異を有する株上でＡＴＧ開始コドンをＧＴＧに突然変異させることによって作成されたｇｌｎＡ遺伝子の修飾を有するＫ．ｓａｃｃｈａｒｉ株ＣＩ００６の突然変異体におけるアンモニウム排泄の増加を示す。 親株１３７－２０８４上のオペロンの上流にｇｌｎＤプロモーターを挿入することによって作成されたＧＯＧＡＴ（ｇｌｎＢＤ）をコードするオペロンの修飾を有するＫ．ｖａｒｉｉｃｏｌａ株ＣＩ１３７の突然変異体におけるアンモニウム排泄の増加を示す。 ｇｌｎＤプロモーターをオペロンの上流に挿入することによって作成されたＧＯＧＡＴ（ｇｌｎＢＤ）をコードするオペロンの修飾を有するＫ．ｖａｒｉｉｃｏｌａ株ＣＩ１３７の突然変異体における、ＡＲＡによって測定されるニトロゲナーゼ活性の、親株１３７－２０８４からの増加を示す。 親対照と比較して、強力なプロモーターをｇｌｓＡ２遺伝子の上流に挿入することによって作成されたグルタミナーゼ酵素ｇｌｓＡ２発現の修飾を有するＫ．ｓａｃｃｈａｒｉ株ＣＩ００６の突然変異体におけるアンモニウム排泄の増加を示す。 親対照と比較して、強力なプロモーターをｇｌｓＡ２遺伝子の上流に挿入することによって作成されたグルタミナーゼ酵素ｇｌｓＡ２発現の修飾を有するＫ．ｖａｒｉｉｃｏｌａ株ＣＩ１３７の突然変異体におけるアンモニウム排泄の増加を示す。 親対照株と比較して、ａｓｎＢ遺伝子の修飾を有するＫ．ｖａｒｉｉｃｏｌａ株ＣＩ１３７の突然変異体におけるアンモニウム排泄の増加を示す。 親対照と比較して、ｒｐｏＮ修飾を有するＫ．ｖａｒｉｉｃｏｌａ株ＣＩ１３７の突然変異体におけるニトロゲナーゼ活性の増加を示す。 親対照と比較して、ｒｐｏＮ修飾を有するＫ．ｖａｒｉｉｃｏｌａ株ＣＩ１３７の突然変異体における窒素排泄の増加を示す。 親対照と比較して、ｏｔｓＢ遺伝子の発現が変化したＫ．ｓａｃｃｈａｒｉ株ＣＩ００６の突然変異体におけるニトロゲナーゼ活性の増加を示す。 親対照と比較して、ｏｔｓＢ遺伝子の発現が変化したＫ．ｓａｃｃｈａｒｉ株ＣＩ００６の突然変異体における窒素排泄の増加を示す。 図３６Ａおよび３６Ｂは、親対照と比較して、ｐｈｏＢの修飾を有するＫ．ｖａｒｉｉｃｏｌａ株ＣＩ１３７の突然変異体における変化のない窒素排泄およびコロニー形成の増加を示す。 親対照と比較して、ｙｊｂＥの修飾を有するＫ．ｓａｃｃｈａｒｉ株ＣＩ００６の突然変異体におけるコロニー形成の増加を示す。 図３８Ａおよび３８Ｂは、親株と比較して、プロモーターを遺伝子の上流に直接挿入することによって作成された硫酸輸送遺伝子ｏｔｓＢの発現の修飾を有するＫ．ｓａｃｃｈａｒｉ株ＣＩ００６の突然変異体におけるニトロゲナーゼ活性および窒素排泄の増加を示す。 図３９Ａおよび３９Ｂは、親株と比較して、プロモーターを遺伝子の上流に直接挿入することによって作成された硫酸輸送遺伝子ｃｙｓＺの発現の修飾を有するＫ．ｓａｃｃｈａｒｉ株ＣＩ００６の突然変異体におけるニトロゲナーゼ活性の増加を示す。 図４０Ａおよび４０Ｂは、ｄｃｔＡ１およびｄｃｔＡ２の修飾を有するＫ．ｖａｒｉｉｃｏｌａ株ＣＩ１３７の突然変異体におけるアンモニウム排泄の増加を示す。 異なるプロモーターおよびＲＢＳ配列がｎｉｆＡの上流に挿入されたいくつかの株におけるｎｉｆＨ転写産物とｎｉｆＡ転写産物との比率を示す。 異なるプロモーターおよびＲＢＳ配列がｎｉｆＡの上流に挿入されたいくつかの株におけるｎｉｆＨ転写産物とｎｉｆＡ転写産物との比率を示す。
発明の詳細な説明
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用される。それらは、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらの類似体である、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、既知または未知の任意の機能を果たし得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメントのコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義された遺伝子座（複数可）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの組み立ての前または後に与えられてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されている可能性がある。ポリヌクレオチドは、例えば標識成分とのコンジュゲーションによって、重合後にさらに修飾することができる。
「ハイブリダイゼーション」は、１つ以上のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化されている複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対対合、フーグスタイン結合によって、または塩基相補性に従って任意の他の配列特異的な方法で起こり得る。複合体は、二重鎖構造を形成する２本の鎖、多重鎖複合体を形成する３本以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲの開始、またはエンドヌクレアーゼによるポリヌクレオチドの酵素的切断などのより広範なプロセスにおけるステップを構成し得る。第１の配列に相補的である第２の配列は、第１の配列の「補体」と呼ばれる。ポリヌクレオチドに適用される「ハイブリダイズ可能」という用語は、ポリヌクレオチドが、ハイブリダイゼーション反応におけるヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化される複合体を形成する能力を指す。
「相補性」は、伝統的なワトソン・クリックまたは他の非伝統的なタイプのいずれかによって、核酸が別の核酸配列と水素結合（複数可）を形成する能力を指す。相補性パーセントは、第２の核酸配列（例えば、１０のうち５、６、７、８、９、１０がそれぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％相補的である）と水素結合（例えば、ワトソン・クリック塩基対合）を形成することができる核酸分子の残基のパーセンテージを示す。「完全に相補的」とは、核酸配列の隣接するすべての残基が、第２の核酸配列における同じ数の隣接する残基と水素結合することを意味する。本明細書で使用される「実質的に相補的」とは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、もしくはそれ以上のヌクレオチドの領域全体で少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相補性の程度を指すか、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。配列同一性は、例えば相補性のパーセントを評価する目的で、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（例えば、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌで入手可能なＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅアライナーを参照、任意にデフォルト設定で）、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（例えば、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉで入手可能なＢＬＡＳＴアラインメントツールを参照、任意にデフォルト設定で）、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（例えば、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｗａｔｅｒ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌで入手可能なＥＭＢＯＳＳ Ｗａｔｅｒアライナーを参照、任意にデフォルト設定で）を含むが、これらに限定されない任意の好適なアラインメントアルゴリズムによって測定することができる。最適なアラインメントは、デフォルトのパラメーターを含む、選択したアルゴリズムの任意の好適なパラメーターを使用して評価することができる。
一般に、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して相補性を有する核酸が主に標的配列とハイブリダイズし、非標的配列には実質的にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、一般に配列に依存し、いくつかの要因によって異なる。一般に、配列が長いほど、配列がその標的配列に特異的にハイブリダイズする温度が高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ″Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ″，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙに詳細に記載されている。
一般に、「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列それぞれの正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応を指す。典型的には、配列同一性を決定するための技法は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定すること、および／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定すること、ならびにこれらの配列を第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することを含む。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらの「同一性パーセント」を決定することによって比較され得る。核酸配列であろうとアミノ酸配列であろうと、２つの配列の同一性パーセントは、２つの整列した配列間の正確な一致数を短い配列の長さで割って１００を掛けたものとして計算することができる。場合によっては、テスト配列および参照配列の同一性パーセントは、核酸配列であろうとアミノ酸配列であろうと、２つの整列した配列間の正確な一致数を参照配列の長さで割って１００を掛けたものとして計算することができる。同一性パーセントはまた、例えば、国立衛生研究所から入手可能なバージョン２．２．９を含む、高度なＢＬＡＳＴコンピュータープログラムを使用して配列情報を比較することによって決定することができる。ＢＬＡＳＴプログラムは、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８（１９９０）のアラインメント方法に基づいており、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）、Ｋａｒｌｉｎ Ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７（１９９３）、およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９９７）において考察されるとおりである。簡単に言えば、ＢＬＡＳＴプログラムは、同一性を、整列した同一のシンボル（一般にヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を、２つの配列の短い方のシンボルの総数で割ったものとして定義する。このプログラムを使用して、比較するタンパク質の全長にわたって同一性パーセントを決定することができる。デフォルトパラメーターは、短いクエリシーケンス、例えば、ｂｌａｓｔｐプログラムを用いて検索を最適化するために提供される。このプログラムはまた、Ｗｏｏｔｔｏｎ ａｎｄ Ｆｅｄｅｒｈｅｎ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：１４９－１６３（１９９３）のＳＥＧプログラムによって決定されるクエリシーケンスのマスクオフセグメントに対するＳＥＧフィルターの使用を可能にする。望ましい程度の配列同一性の範囲は、およそ８０％～１００％およびそれらの間の整数値である。典型的には、開示された配列と主張された配列との間の同一性パーセントは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％である。
本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがＤＮＡテンプレートから（ｍＲＮＡもしくは他のＲＮＡ転写産物などに）転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡがその後ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写産物およびコードされたポリペプチドは、まとめて「遺伝子産物」と呼ばれる場合がある。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、線状または分枝状であり得、修飾アミノ酸を含み得、非アミノ酸によって中断され得る。この用語はまた、修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシンおよびＤまたはＬ光学異性体の両方を含む天然および／もしくは非天然または合成アミノ酸、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣体を含む。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、「およそ」という用語と同義的に使用される。例示的に、量に関して「約」という用語の使用は、引用された値のわずかに外側の値、例えば、プラスまたはマイナス０．１％～１０％であることを示す。
「生物学的に純粋な培養物」または「実質的に純粋な培養物」という用語は、培養物の複製を妨げる、または通常の細菌学的技法によって検出されるのに十分な量の他の細菌種を含有しない、本明細書に記載の細菌種の培養物を指す。
「植物生産性」とは、一般に、植物が成長する理由である植物の成長または発達の任意の局面を指す。穀物または野菜などの食用作物の場合、「植物生産性」とは、特定の作物から収穫された穀物または果実の収量を指し得る。本明細書で使用される場合、植物生産性の向上とは、様々な目的で収穫された穀物、果実、花、または他の植物部分の収量の向上、茎、葉、および根を含む植物部分の成長の向上、植物成長の促進、葉の高いクロロフィル含有量の維持、果実または種子の数の増加、果実または種子の単位重量の増加、窒素肥料の使用量の減少によるＮＯ２排出の削減、ならびに植物の成長および発達の同様の向上を指す。
食用作物内およびその周辺の微生物は、それらの作物の形質に影響を与え得る。微生物の影響を受ける可能性のある植物の形質としては、収量（例えば、穀物産生、バイオマス生成、果実発育、着花）、栄養（例えば、窒素、リン、カリウム、鉄、微量栄養素の獲得）、非生物的ストレス管理（例えば、干ばつ耐性、耐塩性、耐熱性）、および生物的ストレス管理（例えば、害虫、雑草、昆虫、菌類、および細菌）が挙げられる。作物の形質を変化させるための戦略としては、主要な代謝産物濃度を増加させること、主要な代謝産物に対する微生物の影響の時間的ダイナミクスを変化させること、微生物代謝産物の産生／分解を新しい環境の手がかりにリンクさせること、負の代謝産物を減少させること、および代謝産物または基礎となるタンパク質のバランスを改良することが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「制御配列」は、オペレーター、プロモーター、サイレンサー、またはターミネーターを指す。
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子の未変性または内因性制御配列は、１つ以上の遺伝子内制御配列で置き換えられる。
本明細書で使用される場合、「導入された」とは、自然発生的な導入ではなく、現代のバイオテクノロジーによる導入を指す。
いくつかの実施形態では、本開示の細菌は、自然発生の細菌ではないように修飾されている。
いくつかの実施形態では、本開示の細菌は、植物の新鮮重量または乾燥重量１グラムあたり少なくとも１０３ｃｆｕ、１０４ｃｆｕ、１０５ｃｆｕ、１０６ｃｆｕ、１０７ｃｆｕ、１０８ｃｆｕ、１０９ｃｆｕ、１０１０ｃｆｕ、１０１１ｃｆｕ、または１０１２ｃｆｕの量で植物中に存在する。いくつかの実施形態では、本開示の細菌は、植物の新鮮重量または乾燥重量１グラムあたり少なくとも約１０３ｃｆｕ、約１０４ｃｆｕ、約１０５ｃｆｕ、約１０６ｃｆｕ、約１０７ｃｆｕ、約１０８ｃｆｕ、約１０９ｃｆｕ、約１０１０ｃｆｕ、約１０１１ｃｆｕ、または約１０１２ｃｆｕの量で植物中に存在する。いくつかの実施形態では、本発明の細菌は、植物の新鮮重量または乾燥重量１グラムあたり少なくとも１０３～１０９、１０３～１０７、１０３～１０５、１０５～１０９、１０５～１０７、１０６～１０１０、１０６～１０７ｃｆｕの量で植物中に存在する。
本開示の肥料および外因性窒素は、以下の窒素含有分子：アンモニウム、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニア、グルタミン等を含み得る。本開示の窒素源は、無水アンモニア、硫酸アンモニア、尿素、リン酸二アンモニウム、尿素形態、リン酸一アンモニウム、硝酸アンモニウム、窒素溶液、硝酸カルシウム、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム等を含み得る。
本明細書で使用される場合、「外因性窒素」とは、アンモニア、アンモニウム、硝酸塩、亜硝酸塩、尿素、尿酸、アンモニウム酸等を含む、非窒素制限条件下で存在する土壌、畑地、または成長培地で容易に利用できる非空中窒素を指す。
本明細書で使用される場合、「非窒素制限条件」は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｎｔ ｅｔ ａｌ．（２０１０．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．６２（４）：１４９９－１５０９）によって開示されるように、約４ｍＭ窒素を超える濃度で土壌、畑地、培地で利用できる非空中窒素を指す。
本明細書で使用される場合、「導入された遺伝物質」は、レシピエントのゲノムに追加され、その構成要素として残る遺伝物質を意味する。
いくつかの実施形態では、窒素固定および同化遺伝子調節ネットワークは、微生物の窒素固定および／または同化を指示、調整、および／または調節する遺伝子および非コード配列をコードするポリヌクレオチドを含み、ｎｉｆクラスター（例えば、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＣ、……ｎｉｆＺ）のポリヌクレオチド配列、窒素調節タンパク質Ｃをコードするポリヌクレオチド、窒素調節タンパク質Ｂをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎクラスター（例えば、ｇｌｎＡおよびｇｌｎＤ）のポリヌクレオチド配列、ｄｒａＴ、およびアンモニアトランスポーター／透過酵素を含み得る。場合によっては、Ｎｉｆクラスターは、ＮｉｆＢ、ＮｉｆＨ、ＮｉｆＤ、ＮｉｆＫ、ＮｉｆＥ、ＮｉｆＮ、ＮｉｆＸ、ｈｅｓａ、およびＮｉｆＶを含み得る。場合によっては、Ｎｉｆクラスターは、ＮｉｆＢ、ＮｉｆＨ、ＮｉｆＤ、ＮｉｆＫ、ＮｉｆＥ、ＮｉｆＮ、ＮｉｆＸ、ｈｅｓａ、およびＮｉｆＶのサブセットを含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示の肥料は、少なくとも５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、１１重量％、１２重量％、１３重量％、１４重量％、１５重量％、１６重量％、１７重量％、１８重量％、１９重量％、２０重量％、２１重量％、２２重量％、２３重量％、２４重量％、２５重量％、２６重量％、２７重量％、２８重量％、２９重量％、３０重量％、３１重量％、３２重量％、３３重量％、３４重量％、３５重量％、３６重量％、３７重量％、３８重量％、３９重量％、４０重量％、４１重量％、４２重量％、４３重量％、４４重量％、４５重量％、４６重量％、４７重量％、４８重量％、４９重量％、５０重量％、５１重量％、５２重量％、５３重量％、５４重量％、５５重量％、５６重量％、５７重量％、５８重量％、５９重量％、６０重量％、６１重量％、６２重量％、６３重量％、６４重量％、６５重量％、６６重量％、６７重量％、６８重量％、６９重量％、７０重量％、７１重量％、７２重量％、７３重量％、７４重量％、７５重量％、７６重量％、７７重量％、７８重量％、７９重量％、８０重量％、８１重量％、８２重量％、８３重量％、８４重量％、８５重量％、８６重量％、８７重量％、８８重量％、８９重量％、９０重量％、９１重量％、９２重量％、９３重量％、９４重量％、９５重量％、９６重量％、９７重量％、９８重量％、９９重量％の窒素を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の肥料は、少なくとも約５重量％、約６重量％、約７重量％、約８重量％、約９重量％、約１０重量％、約１１重量％、約１２重量％、約１３重量％、約１４重量％、約１５重量％、約１６重量％、約１７重量％、約１８重量％、約１９重量％、約２０重量％、約２１重量％、約２２重量％、約２３重量％、約２４重量％、約２５重量％、約２６重量％、約２７重量％、約２８重量％、約２９重量％、約３０重量％、約３１重量％、約３２重量％、約３３重量％、約３４重量％、約３５重量％、約３６重量％、約３７重量％、約３８重量％、約３９重量％、約４０重量％、約４１重量％、約４２重量％、約４３重量％、約４４重量％、約４５重量％、約４６重量％、約４７重量％、約４８重量％、約４９重量％、約５０重量％、約５１重量％、約５２重量％、約５３重量％、約５４重量％、約５５重量％、約５６重量％、約５７重量％、約５８重量％、約５９重量％、約６０重量％、約６１重量％、約６２重量％、約６３重量％、約６４重量％、約６５重量％、約６６重量％、約６７重量％、約６８重量％、約６９重量％、約７０重量％、約７１重量％、約７２重量％、約７３重量％、約７４重量％、約７５重量％、約７６重量％、約７７重量％、約７８重量％、約７９重量％、約８０重量％、約８１重量％、約８２重量％、約８３重量％、約８４重量％、約８５重量％、約８６重量％、約８７重量％、約８８重量％、約８９重量％、約９０重量％、約９１重量％、約９２重量％、約９３重量％、約９４重量％、約９５重量％、約９６重量％、約９７重量％、約９８重量％、または約９９％の窒素を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の肥料は、約５重量％～５０重量％、約５重量％～７５重量％、約１０重量％～５０重量％、約１０重量％～７５重量％、約１５重量％～５０重量％、約１５重量％～７５重量％、約２０重量％～５０重量％、約２０重量％～７５重量％、約２５重量％～５０重量％、約２５重量％～７５重量％、約３０重量％～５０重量％、約３０重量％～７５重量％、約３５重量％～５０重量％、約３５重量％～７５重量％、約４０重量％～５０重量％、約４０重量％～７５重量％、約４５重量％～５０重量％、約４５重量％～７５重量％、または約５０重量％～７５重量％の窒素を含む。
いくつかの実施形態では、植物における窒素固定の増加および／または１％以上の窒素の産生は、本開示の細菌に曝露されていない対照植物と比較して測定される。細菌におけるすべての増加または減少は、対照細菌と比較して測定される。植物におけるすべての増加または減少は、対照植物と比較して測定される。
本明細書で使用される場合、「構成的プロモーター」は、ほとんどの条件下でおよび／またはほとんどの発達段階中に活性であるプロモーターである。バイオテクノロジーで使用される発現ベクターで構成的プロモーターを使用することには、トランスジェニック細胞または生物を選択するために使用されるタンパク質の高レベルの産生、レポータータンパク質またはスコアリング可能なマーカーの高レベルの発現、容易な検出および定量化を可能にする、調節転写系の一部である転写因子の高レベルの産生、生物においてユビキタス活性を必要とする化合物の産生、すべての発達段階中に必要とされる化合物の産生などのいくつかの利点がある。非限定的な例示の構成的プロモーターとしては、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、オピンプロモーター、ユビキチンプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター等が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「非構成的プロモーター」は、ある特定の条件下、ある特定のタイプの細胞において、および／またはある特定の発達段階中に活性であるプロモーターである。例えば、組織特異的、組織優先、細胞型特異的、細胞型優先、誘導性プロモーター、および発達制御下のプロモーターは、非構成的プロモーターである。発達制御下にあるプロモーターの例としては、ある特定の組織において優先的に転写を開始するプロモーターが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「誘導性」または「抑制性」プロモーターは、化学的または環境的要因の制御下にあるプロモーターである。誘導性プロモーターによる転写に影響を与える可能性のある環境条件の例としては、嫌気性条件、ある特定の化学物質、光の存在、酸性または塩基性条件等が挙げられる。
本明細書中で使用される場合、「組織特異的」プロモーターは、ある特定の組織においてのみ転写を開始するプロモーターである。遺伝子の構成的発現とは異なり、組織特異的発現は、いくつかの相互作用する遺伝子調節レベルの結果である。したがって、当技術分野では、特定の組織における導入遺伝子の効率的かつ信頼性の高い発現を達成するために、相同種または近縁種からのプロモーターを使用することが好ましい場合がある。これは、科学文献および特許文献の両方に見られる特定の組織から分離された大量の組織特異的プロモーターの主な理由の１つである。
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、一方の機能が他方によって調節されるような、単一の核酸フラグメント上の核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、そのコード配列の発現を調節することができる場合（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある場合）、コード配列と作動可能に連結されている。コード配列は、センスまたはアンチセンス配向で調節配列に作動可能に連結することができる。別の例では、本開示の相補的ＲＮＡ領域は、直接的または間接的に、標的ｍＲＮＡに対して５′もしくは標的ｍＲＮＡに対して３′、または標的ｍＲＮＡ内に作動可能に連結され得るか、あるいは第１の相補領域は５′であり、その補体は標的ｍＲＮＡに対して３′である。
窒素固定の調節
本明細書に記載の方法による調節の標的となり得る１つの形質は、窒素固定である。窒素肥料は、農場での最大の運営経費であり、トウモロコシおよび小麦などの連作作物のより高い収量の最大の推進力である。非マメ科作物に再生可能な形態の窒素を供給することができる微生物産物が、本明細書に記載されている。一部のエンドファイトは、純粋培養で窒素を固定するために必要な遺伝学を有するが、基本的な技術的課題は、穀物および草の野生型エンドファイトが、施肥した畑地で窒素の固定を停止することである。化学肥料の適用および畑地土壌中の残留窒素レベルは、微生物に窒素固定のための生化学的経路を遮断するように合図する。
窒素固定調節ネットワークの転写レベルおよび翻訳後レベルの変更は、肥料の存在下で窒素を固定し、トウモロコシに移すことができる微生物を開発するために必要である。そのために、本明細書では、調節ネットワークを正確に進化させ、新しい表現型を引き出す宿主－微生物進化（ＨｏＭＥ）技術について説明する。また本明細書では、トウモロコシから分離された窒素固定エンドファイトの独自の独占的ライブラリーを、窒素ストレスおよび過剰などの異なる環境条件下での微生物と宿主植物の相互作用を取り巻く広範なオーミクスデータと組み合わせて説明する。この技術は、エンドファイトの遺伝子調節ネットワークの正確な進化を可能にし、畑地に肥料が存在する場合でも窒素を積極的に固定する微生物を産生する。また本明細書では、トウモロコシの根組織にコロニーを形成し、施肥した植物に窒素を産生する微生物を進化させる技術的可能性の評価、および微生物を現代の窒素管理戦略に統合する実現可能性を決定するための標準的な配合慣行および多様な土壌とのエンドファイトの適合性の評価についても説明する。
元素窒素（Ｎ）を化学合成に利用するために、生命体は、大気中で利用可能な窒素ガス（Ｎ２）と水素とを、窒素固定として知られるプロセスで組み合わせる。生物学的窒素固定のエネルギー集約的な性質のため、ジアゾ栄養生物（空中窒素ガスを固定する細菌および古細菌）は、環境酸素および利用可能な窒素に応答して、ｎｉｆ遺伝子クラスターの洗練された厳密な調節を進化させてきた。Ｎｉｆ遺伝子は、窒素固定に関与する酵素（ニトロゲナーゼ複合体など）および窒素固定を調節するタンパク質をコードする。Ｓｈａｍｓｅｌｄｉｎ（２０１３．ＧｌｏｂａｌＪ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８（４）：８４－９４）は、ｎｉｆ遺伝子およびそれらの産生物の詳細な説明を開示しており、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書では、第１の植物から細菌を分離すること、分離された細菌のｎｉｆ遺伝子に遺伝的変異を導入すること、第２の植物を変異体細菌に曝露すること、第１の植物と比較して形質が改良された第２の植物から細菌を分離すること、および第２の植物から分離された細菌でこれらのステップを繰り返すことを含む、形質が改良された植物を産生する方法が説明される。
プロテオバクテリアでは、窒素固定の調節は、ｎｉｆクラスターの正の転写調節因子であるσ５４依存性エンハンサー結合タンパク質ＮｉｆＡに集中する。活発なＮｉｆＡの細胞内レベルは、２つの主要な要因：ｎｉｆＬＡオペロンの転写およびＮｉｆＬとのタンパク質間相互作用によるＮｉｆＡ活性の阻害によって制御される。これらのプロセスはどちらも、ＰＩＩタンパク質シグナル伝達カスケードを介して細胞内グルタミンレベルに応答する。このカスケードは、グルタミンを直接感知し、結合したグルタミンの有無に応じて、２つのＰＩＩ調節タンパク質（ＧｌｎＢおよびＧｌｎＫ）それぞれのウリジリル化または脱ウリジリル化を触媒するＧｌｎＤによって媒介される。窒素過剰の条件下では、未修飾のＧｌｎＢは、ｎｉｆＬＡプロモーターの非活性化を合図する。ただし、窒素制限の条件下では、ＧｌｎＢは、翻訳後に修飾され、これがその活性を阻害し、ｎｉｆＬＡオペロンの転写につながる。このようにして、ｎｉｆＬＡ転写は、ＰＩＩタンパク質シグナル伝達カスケードを介して、環境窒素に応答して厳密に制御される。ＮｉｆＡ調節の翻訳後レベルでは、細胞内の遊離ＧｌｎＫの全体的なレベルに依存する問題において、ＧｌｎＫは、ＮｉｆＬ／ＮｉｆＡ相互作用を阻害する。
ＮｉｆＡは、そのプロモーターがリン酸化ＮｔｒＣによって活性化される、別のσ５４依存性調節因子であるｎｉｆＬＡオペロンから転写される。ＮｔｒＣのリン酸化状態は、脱ウリジリル化ＧｌｎＢと相互作用するが、ウリジリル化ＧｌｎＢとは相互作用しないヒスチジンキナーゼＮｔｒＢによって媒介される。窒素過剰の条件下では、グルタミンの細胞内レベルが高いとＧｌｎＢの脱ウリジリル化につながり、次いでＧｌｎＢは、ＮｔｒＢと相互作用してそのリン酸化活性を非活性化させ、そのホスファターゼ活性を活性化し、ＮｔｒＣの脱リン酸化およびｎｉｆＬＡプロモーターの非活性化をもたらす。ただし、窒素制限の条件下では、低レベルの細胞内グルタミンは、ＧｌｎＢのウリジリル化をもたらし、ＮｔｒＢとの相互作用を阻害し、ＮｔｒＣのリン酸化およびｎｉｆＬＡオペロンの転写を可能にする。このようにして、ｎｉｆＬＡ発現は、ＰＩＩタンパク質シグナル伝達カスケードを介して、環境窒素に応答して厳密に制御される。ｎｉｆＡ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、およびｇｌｎＢはすべて、本明細書に記載の方法で突然変異させることができる遺伝子である。これらのプロセスはまた、アンモニア、尿素、または硝酸塩の細胞内レベルに応答し得る。
ＮｉｆＡの活性はまた、最も典型的にはＮｉｆＬを介したＮｉｆＡ活性の阻害を通じて、環境窒素に応答して翻訳後に調節される。一般に、ＮｉｆＬとＮｉｆＡとの相互作用は、ＧｌｎＫを介したＰＩＩタンパク質シグナル伝達カスケードの影響を受けるが、ＧｌｎＫとＮｉｆＬ／ＮｉｆＡとの間の相互作用の性質は、ジアゾ栄養生物間で著しく異なる。クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）では、ＧｌｎＫの両方の形態が、ＮｉｆＬ／ＮｉｆＡ相互作用を阻害し、ＧｌｎＫとＮｉｆＬ／ＮｉｆＡとの間の相互作用は、細胞内の遊離ＧｌｎＫの全体的なレベルによって決定される。窒素過剰条件下で、脱ウリジリル化ＧｌｎＫは、ＡｍｔＢによるアンモニウムの取り込みをブロックし、ＧｌｎＫを膜に隔離するのに役立つアンモニウムトランスポーターＡｍｔＢと相互作用し、ＮｉｆＬによるＮｉｆＡの阻害を可能にする。一方、アゾトバクター・ビネランジイ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）では、ＮｉｆＬ／ＮｉｆＡ相互作用およびＮｉｆＡ阻害には脱ウリジリル化ＧｌｎＫとの相互作用が必要であるが、ＧｌｎＫのウリジリル化は、ＮｉｆＬとの相互作用を阻害する。ｎｉｆＬ遺伝子を欠くジアゾ栄養生物では、ＮｉｆＡ活性が窒素過剰条件下でＧｌｎＫおよびＧｌｎＢの両方の脱ウリジリル化型との相互作用によって直接阻害されるという証拠がある。一部の細菌では、Ｎｉｆクラスターは、ｇｌｎＲによって調節され得、さらに場合によっては、これは負の調節を含み得る。機序に関係なく、ＮｉｆＡの翻訳後阻害は、最も知られているジアゾ栄養生物のｎｉｆクラスターの重要な調節因子である。さらに、ｎｉｆＬ、ａｍｔＢ、ｇｌｎＫ、およびｇｌｎＲは、本明細書に記載の方法で突然変異させることができる遺伝子である。
ｎｉｆ遺伝子クラスターの転写を調節することに加えて、多くのジアゾ栄養生物は、直接の翻訳後修飾、およびニトロゲナーゼ遮断として知られるニトロゲナーゼ酵素自体の阻害のための機序を進化させてきた。これは、ＭｏＦｅタンパク質複合体（ＮｉｆＤＫ）との相互作用を破壊し、ニトロゲナーゼ活性を廃止する窒素過剰条件下でのＦｅタンパク質（ＮｉｆＨ）のＡＤＰリボシル化によって媒介される。ＤｒａＴは、Ｆｅタンパク質のＡＤＰリボシル化およびニトロゲナーゼの遮断を触媒し、ＤｒａＧは、ＡＤＰリボースの除去およびニトロゲナーゼの再活性化を触媒する。ｎｉｆＬＡ転写およびＮｉｆＡ阻害と同様に、ニトロゲナーゼ遮断もまた、ＰＩＩタンパク質シグナル伝達カスケードを介して調節される。窒素過剰条件下では、脱ウリジリル化ＧｌｎＢは、ＤｒａＴと相互作用して活性化するが、脱ウリジリル化ＧｌｎＫは、ＤｒａＧおよびＡｍｔＢの両方と相互作用して複合体を形成し、ＤｒａＧを膜に隔離する。窒素制限条件下では、ＧｌｎＢおよびＧｌｎＫのウリジリル化型は、それぞれＤｒａＴおよびＤｒａＧと相互作用せず、ＤｒａＴの不活性化およびＤｒａＧのＦｅタンパク質への拡散につながり、ＡＤＰリボースを除去してニトロゲナーゼを活性化する。本明細書に記載の方法はまた、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、およびｄｒａＴ遺伝子に遺伝的変異を導入することを企図する。
一部のエンドファイトは、インビトロで窒素を固定する能力を有するが、多くの場合、遺伝学は、高レベルの外因性化学肥料によって畑地ではサイレンシングされる。外因性窒素の感知をニトロゲナーゼ酵素の発現から切り離して、畑地ベースの窒素固定を促進することができる。時間をかけてニトロゲナーゼ活性の統合を向上させることは、作物による利用のための窒素の産生をさらに増強するのに役立つ。本明細書に記載の方法を使用して畑地ベースの窒素固定を容易にする遺伝的変異の特定のターゲットとしては、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢ、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱからなる群から選択される１つ以上の遺伝子が挙げられる。
本明細書に記載の方法を使用して畑地ベースの窒素固定を促進するための遺伝的変異の追加の標的は、ＮｉｆＡタンパク質である。ＮｉｆＡタンパク質は、典型的に、窒素固定遺伝子の発現のためのアクチベーターである。ＮｉｆＡの産生を（構成的にまたは高アンモニア条件下のいずれかで）増加させることで、未変性のアンモニア感知経路を回避する。さらに、ＮｉｆＡの既知の阻害剤であるＮｉｆＬタンパク質の産生を低減することは、自由に活動するＮｉｆＡのレベルの増加にもつながる。さらに、ｎｉｆＡＬオペロンの転写レベルを（構成的にまたは高アンモニア条件下のいずれかで）増加させることは、より高いＮｉｆＡタンパク質の全体レベルにもつながる。ｎｉｆＡＬの発現レベルの上昇は、プロモーター自体を変化させることによって、またはＮｔｒＢ（本来は高窒素条件下でｎｉｆＡＬオペロンの遮断をもたらすｎｔｒＢおよびｎｔｒＣシグナル伝達カスケードの一部）の発現を低減することによって達成される。本明細書に記載のこれらまたは任意の他の方法によって達成される高レベルのＮｉｆＡは、エンドファイトの窒素固定活性を増加させる。
本明細書に記載の方法を使用して畑地ベースの窒素固定を促進するための遺伝的変異の別の標的は、ＧｌｎＤ／ＧｌｎＢ／ＧｌｎＫ ＰＩＩシグナル伝達カスケードである。細胞内グルタミンレベルは、ＧｌｎＤ／ＧｌｎＢ／ＧｌｎＫ ＰＩＩシグナル伝達カスケードを通じて感知される。ＧｌｎＤのウリジリル除去活性を無効にするＧｌｎＤの活性部位突然変異は、窒素感知カスケードを破壊する。さらに、ＧｌｎＢ濃度の低減は、グルタミン感知カスケードを短絡させる。これらの突然変異は、細胞を「だまして」窒素制限状態を知覚させ、それによって窒素固定レベルの活性を増加させる。これらのプロセスはまた、アンモニア、尿素、または硝酸塩の細胞内または細胞外レベルに応答し得る。
ａｍｔＢタンパク質もまた、本明細書に記載の方法を使用して畑地ベースの窒素固定を促進するための遺伝的変異の標的である。ａｍｔＢタンパク質の発現レベルを低下させることによって、環境からのアンモニアの取り込みを低減することができる。細胞内アンモニアがないと、エンドファイトは、高レベルのアンモニアを感知することができず、窒素固定遺伝子の下方調節を防げる。細胞内区画に入ったいかなるアンモニアも、グルタミンに変換される。細胞内グルタミンレベルは、窒素感知の主要通貨である。細胞内グルタミンレベルを低下させると、細胞は環境内の高いアンモニウム濃度を感知できなくなる。この効果は、グルタミンをグルタミン酸に変換する酵素であるグルタミナーゼの発現レベルを増加させることによって達成され得る。さらに、グルタミンシンターゼ（アンモニアをグルタミンに変換する酵素）を減少させることによって、細胞内のグルタミンを低減することもできる。ジアゾ栄養生物では、固定アンモニアは、細胞プロセスに使用されるグルタミンおよびグルタミン酸にすばやく同化される。アンモニア同化に対する破壊は、アンモニアとして細胞から排出されるように固定窒素の転換を可能にし得る。固定されたアンモニアは、主にグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）によってグルタミンに同化され、ｇｌｎＡによってコードされ、その後、グルタミンオキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＯＧＡＴ）によってグルタミンに同化される。いくつかの例では、ｇｌｎＳは、グルタミンシンテターゼをコードする。ＧＳは、それぞれそのアデニリルトランスフェラーゼ（ＡＴ）およびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインの活性を介してＧＳのアデニリル化および脱アデニリル化の両方を触媒するｇｌｎＥによってコードされる二機能性酵素である、ＧＳアデニリルトランスフェラーゼ（ＧｌｎＥ）によって翻訳後に調節される。窒素制限条件下では、ｇｌｎＡが発現され、ＧｌｎＥのＡＲドメインは、ＧＳを脱アディニリル化し、ＧＳを活性にする。窒素過剰の条件下では、ｇｌｎＡ発現はオフになり、ＧｌｎＥのＡＴドメインは、グルタミンによってアロステリックに活性化され、ＧＳのアデニリル化および非活性化を引き起こす。
さらに、ｄｒａＴ遺伝子はまた、本明細書に記載の方法を使用して畑地ベースの窒素固定を容易にするための遺伝的変異の標的であり得る。窒素固定酵素が細胞によって産生されると、ニトロゲナーゼの遮断は、細胞が高窒素条件で固定活性を下方調節する別のレベルを表す。この遮断は、ＤｒａＴの発現レベルを低下させることによって取り除くことができる。
新しい微生物の表現型を付与するための方法は、転写、翻訳、および翻訳後のレベルで行うことができる。転写レベルには、プロモーターでの変化（シグマ因子の親和性またはプロモーターのすべてもしくは一部の削除を含む、転写因子の結合部位の変更など）あるいは転写ターミネーターおよびアテニュエーターの変更が含まれる。翻訳レベルには、リボソーム結合部位の変更およびｍＲＮＡ分解シグナルの変更が含まれる。翻訳後レベルには、酵素の活性部位の突然変異およびタンパク質間相互作用の変更が含まれる。これらの変更は、様々な方法で達成され得る。発現レベルの低減（または完全な廃止）は、未変性のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）またはプロモーターを、強度／効率の低い別のものと交換することによって達成され得る。ＡＴＧ開始部位は、ＧＴＧ、ＴＴＧ、またはＣＴＧ開始コドンに交換することができ、これがコード領域の翻訳活性の低減をもたらす。遺伝子のコード領域をノックアウト（削除）することによって、発現の完全な廃止を行うことができる。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をフレームシフトすると、ＯＲＦに沿って未成熟終止コドンが発生し、それによって機能しない切り詰められた産生物が作成される。フレーム内終止コドンの挿入も同様に、機能しない切り詰められた産生物を作成する。特定の遺伝子の有効濃度を低減するために、ＮまたはＣ末端での分解タグの付加を行うこともできる。
逆に、本明細書に記載の遺伝子の発現レベルは、より強力なプロモーターを使用することによって達成することができる。高窒素レベル条件（または任意の他の条件）で高いプロモーター活性を確保するには、高窒素レベル条件でのゲノム全体の転写プロファイルを取得し、そのデータセットから望ましい転写レベルの活発なプロモーターを選択して、弱いプロモーターと置き換えることができる。より良い翻訳開始効率のために、弱い開始コドンをＡＴＧ開始コドンと交換することができる。弱いリボソーム結合部位（ＲＢＳ）は、翻訳開始効率が高い異なるＲＢＳと交換することもできる。さらに、部位特異的突然変異誘発を行って、酵素の活性を変化させることもできる。
植物で発生する窒素固定のレベルを増加させると、作物の産生に必要な化学肥料の量の低減につながり、温室効果ガスの排出量（例えば、亜酸化窒素）を低減し得る。
窒素固定の活性を高める
ニトロゲナーゼは、窒素固定を触媒する酵素である。様々な窒素固定細菌に見られる３種類のニトロゲナーゼ：モリブデン（Ｍｏ）ニトロゲナーゼ、バナジウム（Ｖ）ニトロゲナーゼ、および鉄のみ（Ｆｅ）ニトロゲナーゼが存在する。ニトロゲナーゼは、成分Ｉ（ジニトロゲナーゼとしても知られる）および成分ＩＩ（ジニトロゲナーゼレダクターゼとしても知られる）で構成される二成分系である。成分Ｉは、モリブデンニトロゲナーゼ中のＭｏＦｅタンパク質、バナジウムニトロゲナーゼ中のＶＦｅタンパク質、鉄のみのニトロゲナーゼ中のＦｅタンパク質である。成分ＩＩは、鉄－硫黄（Ｆｅ－Ｓ）クラスターを含有するＦｅタンパク質である。
場合によっては、補因子の供給を変化させると、窒素固定の増加をもたらすことができる。例えば、硫黄の取り込みを増加させると、ニトロゲナーゼ酵素のための補因子のより大きなプールを提供し、したがって機能性ニトロゲナーゼ複合体の数を増加させることができる。場合によっては、硫黄の取り込みは、硫酸塩輸送遺伝子を上方調節することによって増加させることができる。硫酸塩輸送遺伝子のいくつかの例は、ｃｙｓＰＴＷＡ、ｓｂｐ、ｓｂｐ、ｃｙｓＺＫであり得るが、これらに限定されない。
場合によっては、補因子の供給を変化させることが、窒素固定の増加をもたらし得る。例えば、モリブデン（Ｍｏ）の取り込みを増加させると、機能性ニトロゲナーゼ複合体の数を増加させることができる。場合によっては、Ｍｏの取り込みは、Ｍｏ輸送遺伝子を上方調節することによって増加させることができる。Ｍｏ輸送遺伝子のいくつかの例は、ｍｏｄＥＢＡ、ｍｏｄＥＢ、およびｍｏｄＡであり得るが、これらに限定されない。
場合によっては、補因子の供給は、鉄の取り込みの影響を受ける可能性がある。鉄の取り込みは、ｔｏｎＢ輸送系の影響を受ける可能性がある。場合によっては、鉄の取り込みに影響を与えることは、ｔｏｎＢ輸送系遺伝子を上方調節することによって達成され得る。ｔｏｎＢ輸送系遺伝子のいくつかの例は、ｔｏｎＢおよびｅｘｂＡＢであり得るが、これらに限定されない。場合によっては、鉄の取り込みは、微生物および植物における鉄の取り込みを増加させるシデロフォアの影響を受ける可能性がある。場合によっては、鉄の取り込みに影響を与えることは、シデロフォア生合成遺伝子を上方調節することによって達成され得る。シデロフォア生合成遺伝子のいくつかの例は、ｙｈｆＡ、ｙｕｓＶ、ｓｂｎＡ、ｆｉｕ、ｙｆｉＺ、およびｆｕｒであり得るが、これらに限定されない。
ＡＴＰへの代謝フラックスを変化させることは、窒素固定の増加をもたらし得る。例えば、ＡＴＰへの代謝フラックスは、グリコーゲン生合成を標的とすることによって増加させることができる。グリコーゲン生合成は、グリコーゲン合成ではなく、炭素を解糖系に分流すること、ＴＣＡサイクル、および／または酸化的リン酸化の影響を受ける可能性がある。場合によっては、グリコーゲン生合成は、グリコーゲンシンターゼの関連遺伝子を削除または下方調節することによって影響を受ける可能性がある。グリコーゲンシンターゼ遺伝子の例は、ｇｌｇＡであり得るが、これに限定されない。
細胞あたりのニトロゲナーゼ酵素の数を変化させることは、窒素固定の増加をもたらし得る。例えば、細胞あたりのニトロゲナーゼ酵素の数は、ｎｉｆ抑制解除によって影響され得る。Ｎｉｆ抑制解除は、窒素飢餓を構成的にシグナル伝達することによって達成され得る。場合によっては、ｎｉｆ抑制解除は、関連遺伝子のＵＲドメインを削除することによって達成され得る。ｎｉｆ遺伝子を抑制解除するために標的とすることができる遺伝子の例は、ｇｌｎＤであり得るが、これに限定されない。場合によっては、ｎｉｆクラスター（複数可）の転写は、ｎｉｆＨＤＫまたはｎｉｆＤＫオペロンの上流に強力なプロモーターを挿入することによって増加させることができる。
窒素固定を増加させる別の方法は、ｎｉｆクラスターの転写を増加させることによって、細胞あたりのニトロゲナーゼ酵素の数を増加させることであり得る。Ｎｉｆクラスターの転写は、ｎｉｆＡ転写を増加させることによって増加させることができる。場合によっては、ｎｉｆクラスターの転写は、ゲノム内のｎｉｆＡ遺伝子のコピー数を増加させることによって影響を受ける可能性がある。
Ｎｉｆクラスターの転写は、ＮｉｆＡ翻訳を増加させることによって増加させることもできる。場合によっては、ＮｉｆＡ翻訳は、ｎｉｆＡ遺伝子のリボソーム結合部位の強度を高めることによって増加させることができる。
ニトロゲナーゼの酸素感受性を変化させることは、窒素固定の増加をもたらし得る。酸素感受性は、酸素感知を低減することによって影響を受ける可能性がある。場合によっては、酸素感知を低減することは、酸素感知遺伝子を破壊することによって行われてもよい。酸素感知遺伝子のいくつかの例は、ｎｉｆＴ／ｆｉｘＵ、ｆｉｘＪ、およびｆｉｘＬであり得るが、これらに限定されない。
場合によっては、酸素感受性は、チトクロムｂｄを介した呼吸を促進することによりサイトゾル酸素レベルを低く保つことによって影響を受ける可能性がある。場合によっては、酸素感受性は、チトクロムｂｄオキシダーゼをコードする遺伝子を上方調節する、および／または代替チトクロム系をノックアウトすることによって影響を受ける可能性がある。チトクロムｂｄ遺伝子をコードする遺伝子のいくつかの例は、ｃｙｄＡＢＸ、ｃｙｄＡＢ、およびｃｙｄＸであり得るが、これらに限定されない。場合によっては、ニトロゲナーゼは、細胞内の酸化還元バランスを変化させることによって酸化から保護され得る。酸化還元バランスは、ＲＯＳスカベンジングによって変化させることができる。ＲＯＳスカベンジングを達成するための１つの戦略は、関連遺伝子を上方調節することである。ＲＯＳスカベンジング遺伝子のいくつかの例は、ｇｒｘＡＢＣＤ、ｔｒｘＡ、ｔｒｘＣ、およびｔｐｘであり得るが、これらに限定されない。
場合によっては、酸素感受性は、遊離酸素をスカベンジングすることによって影響を受ける可能性がある。場合によっては、遊離酸素をスカベンジングすることは、細菌ヘモグロビン遺伝子を上方調節することによって達成され得る。ヘモグロビン遺伝子の例は、ｇｌｂＮであり得るが、これに限定されない。場合によっては、遊離酸素をスカベンジングすることは、高親和性ヘム銅ｃｂｂ３型オキシダーゼをコードするｆｉｘＮＯＰＱ遺伝子を上方調節することによって達成され得る。
ＩＨＦａを修飾することは、ニトロゲナーゼの発現の増加をもたらし得る。場合によっては、ニトロゲナーゼ発現は、ある特定の遺伝子の上流の上流活性化配列でのｎｉｆＡとσ５４との間の相互作用を促進することによって増加させることができる。特に、ＩＨＦの上方調節は、ニトロゲナーゼ転写を増加させることができる。場合によっては、ｎｉｆＡおよびσ５４と組み合わせたＩＨＦの上方調節は、ニトロゲナーゼオペロンの転写を増加させることができる。場合によっては、窒素発現を増加させるこのプロセスにおいて利用され得る株は、ラーニア・アクアティリス（Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ）、コサコニア・サッカリ（Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ）、および／またはクレブシエラ・バリコラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ）株を含み得るが、これらに限定されない。場合によっては、ニトロゲナーゼオペロンの上方調節は、σ５４をコードする遺伝子の突然変異と重なると、より効果的であり得る。
σ５４をコードする遺伝子を修飾することは、ニトロゲナーゼの発現の増加をもたらし得る。場合によっては、σ５４の遺伝子の上方調節は、ニトロゲナーゼ転写を増加させることができる。σ５４をコードする遺伝子の例には、ｒｐｏＮが含まれるが、これに限定されない。場合によっては、窒素発現を増加させるこのプロセスにおいて利用され得る株は、Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ、および／またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ株を含み得るが、これらに限定されない。場合によっては、σ５４をｎｉｆＡおよびＩＨＦと組み合わせて上方調節すると、ニトロゲナーゼオペロンの転写が増加する可能性がある。場合によっては、ニトロゲナーゼオペロンの転写は、σ５４の上方調節をＩＨＦ突然変異を重ねることによってさらに改良することができる。
場合によっては、ｋｏｓａｋｏｎｉａ株などの株でＤｒａＴなどのタンパク質を削除することで、ニトロゲナーゼ活性を増加させることができる。場合によっては、ＤｒａＴは、ニトロゲナーゼ酵素を翻訳後に修飾して、その活性を阻害することができる。場合によっては、ニトロゲナーゼ活性を増加させるこのプロセスにおいて利用され得る株は、ｋｏｓａｋｏｎｉａ株を含み得るが、これに限定されない。
場合によっては、ａｓｎＢ遺伝子の修飾は、アンモニウム排泄を増加させることができる。特に、ａｓｎＢ遺伝子の切り詰めおよび上方調節は、グルタミンをアンモニウムに再変換することができる。ＡｓｎＢ酵素は、２つのドメインを含有し、１つは、グルタミンを脱アミノ化してアンモニウムを放出し、もう１つは、アンモニウムを使用してアスパラギンを生成する。アスパラギンシンターゼドメインを削除してＡｓｎＢを切り詰めること、および／またはグルタミンデアミナーゼドメインを上方調節すると、細胞グルタミンをアンモニウムに再変換するのを助けることができ、それによってアンモニウムの排泄を増加させる。場合によっては、アンモニウム排泄を増加させるこのプロセスで利用され得る株は、Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ株を含み得るが、これらに限定されない。
場合によっては、ａｓｎＢ遺伝子の修飾は、アンモニウム排泄を増加させることができる。特に、ａｓｎＢ遺伝子の削除は、細胞内のアンモニウムシンクを低減することができる。ａｓｎＢは、グルタミンの代わりにサイトゾルアンモニウムをＮドナーとして使用することができる。場合によっては、ａｓｎＢを削除、切り詰め、または上方調節すると、細胞から排泄されるアンモニウムの量を増加させる可能性がある。場合によっては、アンモニウム排泄を増加させるこのプロセスで利用され得る株は、Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ株を含み得るが、これらに限定されない。
場合によっては、ｇｌｎＤの修飾は、窒素同化の調節を修飾する上で有益であり得る。特に、ｇｌｎＤの修飾を使用して、ＰＩＩタンパク質シグナル伝達経路を介した窒素同化経路の調節を最適化することができる。ｇｌｎＤによってコードされた酵素は、ＰＩＩタンパク質ＧｌｎＫおよびＧｌｎＢを修飾する。ＧｌｎＤ酵素は、それぞれ窒素制限および過剰の条件でＰＩＩタンパク質を可逆的にウリジリル化および脱ウリジリル化する。ＰＩＩタンパク質は、シグナル伝達カスケードを窒素代謝経路に付与する。ＰＩＩタンパク質シグナル伝達の影響を受ける窒素代謝遺伝子の例としては、グルタミンシンテターゼをコードするｇｌｎＡ、感覚ヒスチジンキナーゼ／ホスファターゼｎｔｒＢをコードするｎｔｒＢ／ｇｌｎＬ、ｇｌｎＧ／ｎｔｒＣ ＤＮＡ結合転写調節因子ｎｔｒＣ、およびｎｉｆＬＡオペロンが挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、窒素同化遺伝子の転写および細胞内で同化される窒素の量を減らすために、ｇｌｎＤが削除されてもよい。場合によっては、ＡＣＴ１２領域を削除する、ＵＲ領域を削除する、および／または特定のアミノ酸残基（例えば、残基９０、９１、および／または１０４）を突然変異させることによりＵＲ領域を非活性化することによって、ｇｌｎＤを修飾することができる。場合によっては、窒素同化を減少させるこのプロセスで利用され得る株は、Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ株を含み得るが、これらに限定されない。
場合によっては、ｇｌｎＤの修飾は、ニトロゲナーゼ活性、アンモニウム排泄、および／または植物の成長を高める上で有益であり得る。特に、窒素感知領域の除去は、ニトロゲナーゼ活性および／または植物の成長を高めることができる。場合によっては、ｇｌｎＤのＡＣＴドメインが削除され得る。場合によっては、ＡＣＴドメインは、グルタミンによるアロステリック調節を介して窒素状態の感知に関与している。ＡＣＴドメインを除去することは、ウリジリルトランスフェラーゼの活性を低下させる可能性があり、それによって窒素過剰をシグナル伝達し、窒素同化遺伝子を下方調節し、アンモニウム排泄の増加につながる。場合によっては、ニトロゲナーゼ活性、アンモニウム排泄、および／または植物の成長を高めるこのプロセスで利用され得る株は、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ株を含み得るが、これらに限定されない。
場合によっては、ｇｌｎＤの修飾は、ニトロゲナーゼ活性、アンモニウム排泄、および／または植物の成長を高める上で有益であり得る。特に、ｇｌｎＤのドメイン内のウリジリルトランスフェラーゼ（ＵＴ）領域の除去または非活性化は、ニトロゲナーゼ活性、アンモニウム排泄、および／または植物の成長を増加させることができる。ＵＴドメインを除去または非活性化することは、ウリジリルトランスフェラーゼ活性を低下させる可能性があり、それによって窒素過剰をシグナル伝達し、窒素同化遺伝子を下方調節し、アンモニウム排泄の増加につながる。場合によっては、ニトロゲナーゼ活性、アンモニウム排泄、および／または植物の成長を高めるこのプロセスで利用され得る株には、Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ株が含まれるが、これらに限定されない。
場合によっては、ＧｌｎＢの修飾は、窒素化合物の排泄を増加させる上で有益であり得る。場合によっては、ＧｌｎＤのウリジリルトランスフェラーゼ（ＵＴａｓｅ）ドメインは、チロシン－５１においてＧｌｎＢを修飾する。場合によっては、ＧｌｎＤのＵＴａｓｅドメインを修飾することによって、ＧｌｎＢ－ＵＭＰ産生を減少させることができる。場合によっては、ＧｌｎＤのＵＴａｓｅドメインを除去することによって、ＧｌｎＢ－ＵＭＰ産生を減少させることができる。場合によっては、ＧｌｎＤのＵＴａｓｅドメインを変更することによって、ＧｌｎＢ－ＵＭＰ産生を防ぐことができる。場合によっては、ＧｌｎＤのＵＴａｓｅドメインを除去することによって、ＧｌｎＢ－ＵＭＰ産生を防ぐことができる。場合によっては、ＧｌｎＢは、チロシン－５１を削除することによって修飾され得る。場合によっては、ＧｌｎＢは、チロシン－５１においてＧｌｎＢを修飾することによって修飾され得る。場合によっては、アンモニウム排泄を増加させるこのプロセスで利用され得る株は、Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ株を含み得るが、これらに限定されない。
場合によっては、ＧｌｎＫの修飾は、アンモニウム排泄を増加させる上で有益であり得る。場合によっては、ＧｌｎＫは、ＧｌｎＫとＧｌｎＢとの間の構造の類似性に基づいてＧｌｎＢ類似体として株内で動作することができる。場合によっては、ＧｌｎＫを修飾することは、ＧｌｎＫに基づく可能性のある阻害効果を除去することによって、アンモニウム排泄を増加させることができる。場合によっては、ＧｌｎＫを変更することによって、アンモニウム排泄に対する阻害効果を減少させることができる。場合によっては、ＧｌｎＫを除去することによって、アンモニウム排泄に対する阻害効果を減少させることができる。場合によっては、ＧｌｎＫを変更することによって、ＧｌｎＫに基づくアンモニウム排泄に対する阻害効果を防ぐことができる。場合によっては、ｇｌｎＫ遺伝子を除去することによって、ＧｌｎＫに基づくアンモニウム排泄の阻害効果を防ぐことができる。場合によっては、アンモニウム排泄を増加させるこのプロセスで利用され得る株は、Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ株を含み得るが、これらに限定されない。
場合によっては、ｇｌｎＫの修飾は、アンモニウム排泄を増加させる上で有益であり得る。場合によっては、ＧｌｎＤのＵＴａｓｅドメインは、チロシン－５１においてｇｌｎＫを修飾する。場合によっては、ＧｌｎＤのＵＴａｓｅドメインを修飾することによって、ｇｌｎＫ－ＵＭＰ産生を減少させることができる。場合によっては、ＧｌｎＤのＵＴａｓｅドメインを除去することによって、ｇｌｎＫ－ＵＭＰ産生を減少させることができる。場合によっては、ＧｌｎＤのＵＴａｓｅドメインを変更することによって、ｇｌｎＫ－ＵＭＰ産生を防ぐことができる。場合によっては、ＧｌｎＤのＵＴａｓｅドメインを除去することによって、ｇｌｎＫ－ＵＭＰ産生を防ぐことができる。場合によっては、ＧｌｎＫは、チロシン－５１を削除することによって修飾され得る。場合によっては、ＧｌｎＫは、チロシン－５１においてＧｌｎＫを修飾することによって修飾され得る。場合によっては、アンモニウム排泄を増加させるこのプロセスで利用され得る株は、Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ株を含み得るが、これらに限定されない。
場合によっては、ＮｔｒＢタンパク質をコードするｇｌｎＬの修飾は、アンモニウム排泄を増加させる上で有益であり得る。特に、ＮｔｒＢの修飾は、窒素の状態とは無関係にｇｌｎＡの転写を制御する上で有益であり得る。場合によっては、ｎｔｒＢの修飾は、特定の常駐を削除して活性を滴定することによって達成され得る。場合によっては、アンモニウム排泄を増加させるこのプロセスで利用され得る株は、Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ株を含み得るが、これらに限定されない。
場合によっては、ｇｌｎＡの修飾は、アンモニウム排泄を増加させる上で有益であり得る。場合によっては、ＮｔｒＣの修飾は、細胞内のＧｌｎＡタンパク質のレベルを修飾する上で有益であり得る。特に、ＮｔｒＣの修飾は、ＮｔｒＣのリン酸化を防ぐことによって有益であり得る。リン酸化ＮｔｒＣは、ｇｌｎＡの転写活性化につながる可能性がある。このように、ｎｔｒＣのリン酸化を防ぐためのｎｔｒＣの修飾は、ｇｌｎＡの転写を減少させる上で有益であり得る。場合によっては、ＮｔｒＣの修飾は、アスパラギン酸５４を置換することによって達成され得る。場合によっては、アンモニウム排泄を増加させるこのプロセスで利用され得る株は、Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ株を含み得るが、これらに限定されない。
場合によっては、グルタミナーゼＢの修飾は、アンモニウム排泄を増加させる上で有益であり得る。特に、場合によっては、グルタミナーゼＢによるグルタミンのグルタミン酸およびアンモニアへの再変換は、アンモニウム排泄を増加させるように上方調節され得る。場合によっては、窒素排泄を増加させるこのプロセスで利用され得る株は、Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ株を含み得るが、これらに限定されない。
場合によっては、ｎｉｆＡの修飾は、ニトロゲナーゼ発現を増加させる上で有益であり得る。場合によっては、細胞内のｎｉｆＡ遺伝子のコピー数を増加させるようにｎｉｆＡを修飾することが有益であり得る。ｎｉｆＡ遺伝子のコピー数は、構成的に発現するプロモーターの前にｎｉｆＡ遺伝子の複数のコピーを挿入することによって増加させることができる。場合によっては、ｎｉｆＡ遺伝子のコピーを１つ以上のハウスキーピングオペロンに付着させることは、細胞内のｎｉｆＡ遺伝子の総数を増加させることができる。場合によっては、ニトロゲナーゼ発現を増加させるこのプロセスで利用され得る株は、Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ株を含み得るが、これらに限定されない。
場合によっては、ニトロゲナーゼオペロンの修飾は、ニトロゲナーゼ発現を増加させる上で有益であり得る。場合によっては、ニトロゲナーゼの転写を増加させるようにニトロゲナーゼオペロンを上方調節することが有益であり得る。場合によっては、細菌が根圏にコロニーを形成しているときに活性である細菌内のプロモーターを、ニトロゲナーゼオペロンの前に挿入して、ニトロゲナーゼオペロンを上方調節することができる。場合によっては、ニトロゲナーゼオペロン内でｎｉｆＬを削除して、ニトロゲナーゼオペロンを上方調節することができる。場合によっては、ニトロゲナーゼオペロン内でｎｉｆＡを削除して、ニトロゲナーゼオペロンを上方調節することができる。場合によっては、ニトロゲナーゼオペロン内でｎｉｆＡおよびｎｉｆＬを削除して、ニトロゲナーゼオペロンを上方調節することができる。場合によっては、ｎｉｆＡ転写制御を回避するように、複数のプロモーターをｎｉｆＨＤＫ遺伝子の前に直接配置することができる。場合によっては、ニトロゲナーゼ発現を増加させるこのプロセスで利用され得る株は、Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ株を含み得るが、これらに限定されない。
場合によっては、ｇｌｎＥの修飾は、アンモニウム排泄を増加させる上で有益であり得る。場合によっては、ｇｌｎＥのＡＲドメイン上の保存されたアスパラギン酸－アミノ酸－アスパラギン酸（ＤＸＤ）モチーフが変更され得る。場合によっては、ｇｌｎＥのＡＲドメイン上の保存されたＤＸＤ残基を変更することを使用して、ｇｌｎＥから脱アデニリル化活性を取り除くことができる。場合によっては、Ｄ残基が、ｇｌｎＥのＡＲ領域のＤＸＤモチーフ上で置換され得る。場合によっては、ｇｌｎＥのＡＲ領域内のＤＸＤモチーフ上のＤ残基の置換は、ＡＲ活性を低下または防止しながら、アデニル化活性の調節を可能にするように、ＧｌｎＢ結合部位が無傷のままにすることができる。場合によっては、アンモニウム排泄を増加させるこのプロセスで利用され得る株は、Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ株を含み得るが、これらに限定されない。
場合によっては、ｇｌｎＡの修飾は、ＡＭＭ排泄を増加させる上で有益であり得る。場合によっては、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＤ、および／またはｇｌｎＥのプロモーターをｇｌｎＡ遺伝子の上流に挿入することによって、ｇｌｎＡを下方調節することができる。場合によっては、ｇｌｎＡの修飾は、ｇｌｎＡの発現をＮステータスシグナル伝達カスケードから切り離し、発現を基礎レベルに減少させることができるため、より多くの固定窒素が吸収されないままになる。場合によっては、アンモニウム排泄を増加させるこのプロセスで利用され得る株は、Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ株を含み得るが、これらに限定されない。
場合によっては、ＧＯＧＡＴの修飾は、アンモニウム排泄を増加させる上で有益であり得る。場合によっては、ＧＯＧＡＴは、ＧＯＧＡＴ遺伝子の上流にｇｌｎＢ、ｇｌｎＤ、および／またはｇｌｎＥを制御するプロモーターを挿入することによって下方調節され得る。ＧＯＧＡＴの下方調節は、次いで、グルタミンオキシグルタル酸アミノトランスフェラーゼの発現の低下につながり得る。場合によっては、ＧＯＧＡＴの修飾は、ＧＯＧＡＴの発現をＮステータスシグナル伝達カスケードから切り離し、発現を基礎レベルに減少させることができるため、より多くの固定窒素が吸収されないままになる。場合によっては、アンモニウム排泄を増加させるこのプロセスで利用され得る株は、Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ株を含み得るが、これらに限定されない。
場合によっては、ＧＤＨの修飾は、アンモニウム排泄を増加させる上で有益であり得る。場合によっては、ＧＤＨは、ＧＤＨ遺伝子の上流にｇｌｎＢ、ｇｌｎＤ、および／またはｇｌｎＥを制御するプロモーターを挿入することによって下方調節され得る。ＧＤＨの下方調節は、次いで、ＮＡＤ特異的グルタミン酸デヒドロゲナーゼの発現の低下につながり得る。場合によっては、ＧＤＨの修飾は、ＧＤＨの発現をＮステータスシグナル伝達カスケードから切り離し、発現を基礎レベルに減少させることができるため、より多くの固定窒素が吸収されないままになる。場合によっては、アンモニウム排泄を増加させるこのプロセスで利用され得る株は、Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ株を含み得るが、これらに限定されない。
同化によって窒素固定を増加させる
微生物関連植物に提供される窒素の量は、微生物における窒素同化を減少させることによって増加させることができる。ここで、同化は、アンモニアの排泄速度の影響を受ける可能性がある。アンモニアの同化を標的とすることにより、窒素の利用可能性が増加する可能性がある。場合によっては、アンモニア同化に影響を与えるのは、排泄後のアンモニア再取り込みの速度を減少させることによる可能性がある。排泄後のアンモニアの再取り込み速度を減少させるために、任意の関連遺伝子をノックアウトすることができる。アンモニア再取り込み遺伝子の例は、ａｍｔＢであり得るが、これに限定されない。
場合によっては、同化は、植物の取り込み速度の影響を受ける可能性がある。植物の窒素同化遺伝子および経路を標的とすることにより、窒素の利用可能性を高めることができる。場合によっては、植物によるアンモニア同化は、Ｎ固定植物成長促進微生物の接種によって変化させることができる。スクリーニングを実施して、植物においてアンモニア同化を誘導する微生物を同定することができる。
コロニー形成によって窒素固定を増加させる
微生物のコロニー形成能力を高めることで、植物に提供される固定窒素の量を増加させることができる。コロニー形成は、収容力（根表面の微生物の豊富さ）および／または微生物の適応度を変化させることによって影響を受ける可能性がある。場合によっては、収容力および微生物の適応度に影響を与えることは、有機酸輸送を変化させることによって達成され得る。有機酸輸送は、関連遺伝子を上方調節することによって向上させることができる。有機酸輸送遺伝子の例は、ｄｃｔＡであり得るが、これに限定されない。
例えば、コロニー形成能力は、凝集素の発現によって影響され得る。凝集素の発現の増加は、微生物が植物の根に付着するのを助け得る。凝集素遺伝子の例には、ｆｈａＢおよびｆｈａＣが含まれ得るが、これらに限定されない。
コロニー形成能力は、エンドファイトの侵入の増加によって影響され得る。例えば、エンドファイトの侵入は、植物細胞壁分解酵素（ＣＤＷＥ）によって影響され得る。ＣＤＷＥ発現および／または分泌を増加させることで、微生物のコロニー形成およびエンドファイトの侵入を増加させることができる。ＣＤＷＥのいくつかの例は、ポリガラクツロナーゼおよびセルラーゼであるが、これらに限定されない。ポリガラクツロナーゼ遺伝子の例は、ｐｅｈＡである。場合によっては、ポリガラクツロナーゼおよびセルラーゼの輸出は、輸出シグナルに酵素を提供することによって増加させることができる。
収容力を変化させることは、関連する植物に提供される窒素の量の増加をもたらし得る。収容力は、バイオフィルム形成によって影響され得る。場合によっては、収容力は、小さなＲＮＡ ｒｓｍＺによって影響され得る。小さなＲＮＡ ｒｓｍＺは、バイオフィルム形成の負の調節因子である。場合によっては、バイオフィルム形成は、ｒｓｍＺを削除または下方調節することによって促進され得、ｒｓｍＡ（二次代謝の正の調節因子）の翻訳およびバイオフィルム形成の増加につながる。
場合によっては、バイオフィルム形成は、菌株が根の表面に付着する能力を強化することによって影響を受ける可能性がある。場合によっては、バイオフィルム形成は、大きな接着タンパク質を上方調節することによって促進され得る。大きな接着タンパク質の例は、ｌａｐＡであり得るが、これに限定されない。
場合によっては、収容力は、クオラムセンシングによって影響され得る。場合によっては、クオラムセンシングは、ＡＨＬ生合成遺伝子のコピー数を増加させることによって強化され得る。
場合によっては、根圏のコロニー形成は、根の質量の影響を受ける可能性がある。例えば、根の質量は、微生物のＩＡＡ生合成によって影響され得る。微生物によるＩＡＡ生合成の増加は、根のバイオマス形成を刺激し得る。場合によっては、ＩＡＡ生合成に影響を及ぼすことは、ＩＡＡ生合成遺伝子の上方調節（レベルの範囲で）を通じて達成され得る。ＩＡＡ生合成遺伝子の例は、ｉｐｄＣであり得るが、これに限定されない。
場合によっては、エチレンシグナル伝達は、植物において全身抵抗性を誘導し、微生物のコロニー形成能力に影響し得る。エチレンは、植物組織およびエチレンレベルに基づいて幅広い応答を引き出す植物シグナル伝達分子である。根のエチレン応答の一般的なモデルは、ストレスにさらされている植物が、植物による保護応答、例えば、防御タンパク質をコードする遺伝子の転写を開始するエチレンの小さなピークを生成することによって迅速に応答することである。ストレスが持続するかまたは激しい場合、エチレンの第２のはるかに大きなピークは、多くの場合数日後に発生する。この第２のエチレンピークは、植物の成長および生存の著しい阻害につながり得る老化、白化、および脱離などのプロセスを誘導する。場合によっては、植物成長促進細菌は、オーキシンＩＡＡを産生することによって根の成長を刺激し、根の小さなエチレン反応を刺激する。同時に、細菌は、植物におけるエチレン産生を遅らせる酵素（ＡＣＣデアミナーゼ）を産生することによって、第２の大きなエチレンピークを防止し、したがって根の成長を刺激を促すエチレンレベルを維持する。植物の全身抵抗性の誘導は、細菌ＩＡＡの影響を受ける可能性がある。場合によっては、ＩＡＡ生合成を刺激することは、ＩＡＡ生合成遺伝子の上方調節（レベルの範囲で）を通じて達成され得る。生合成遺伝子の例は、ｉｐｄＣであり得るが、これに限定されない。
場合によっては、コロニー形成が、ＡＣＣデアミナーゼによって影響され得る。ＡＣＣデアミナーゼは、ＡＣＣを副産物に分流させることによって、根でのエチレン産生を減少させ得る。場合によっては、ＡＣＣデアミナーゼに影響を与えることは、ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子の上方調節を通じて達成され得る。ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子のいくつかの例は、ｄｃｙＤであり得るが、これに限定されない。
場合によっては、コロニー形成は、収容力および／または微生物の適応度の影響を受ける可能性がある。例えば、収容力および／または微生物の適応度は、トレハロースの過剰産生によって影響され得る。トレハロースの過剰産生は、干ばつ耐性を高め得る。場合によっては、トレハロースの過剰産生に影響を及ぼすことは、トレハロース生合成遺伝子の上方調節（レベルの範囲で）を通じて達成され得る。トレハロース生合成遺伝子のいくつかの例は、ｏｔｓＡ、ｏｔｓＢ、ｔｒｅＺ、およびｔｒｅＹであり得るが、これらに限定されない。場合によっては、ｏｔｓＢの上方調節もまた、窒素固定活性を増加させることができる。
場合によっては、収容力は、根の付着によって影響され得る。根の付着は、エキソポリサッカライドの分泌の影響を受ける可能性がある。場合によっては、エキソポリサッカライドの分泌に影響を与えることは、エキソポリサッカライド産生タンパク質の上方調節を通じて達成され得る。エキソポリサッカライド産生タンパク質のいくつかの例は、ｙｊｂＥおよびｐｓｓＭであり得るが、これらに限定されない。場合によっては、エキソポリサッカライド分泌に影響を与えることは、セルロース生合成の上方調節を通じて達成され得る。セルロース生合成遺伝子のいくつかの例は、ａｃｓ遺伝子およびｂｃｓ遺伝子クラスターであり得るが、これらに限定されない。
場合によっては、収容力および／または微生物の適応度が、真菌阻害によって影響され得る。真菌阻害は、真菌細胞壁を破壊し得るキチナーゼによって影響を受ける可能性があり、根圏真菌の生物的防除につながり得る。場合によっては、真菌阻害に影響を与えることは、キチナーゼ遺伝子の上方調節を通じて達成され得る。キチナーゼ遺伝子のいくつかの例は、キチナーゼクラス１およびｃｈｉＡであり得るが、これらに限定されない。
場合によっては、効率的な鉄の取り込みは、微生物が鉄の取り込みに関して他の土壌微生物および植物と競合する必要がある場合、微生物が根圏で生き残るのに役立ち得る。場合によっては、高親和性キレート化（シデロフォア）および輸送系が、１）微生物が十分な鉄を確実に取得し、２）競合種の鉄プールを低減することによって、根圏の能力を高めることができる。これを行う微生物の能力を高めることで、根圏での競争適応度を高めることができる。場合によっては、鉄の取り込みに影響を与えることは、シデロフォア遺伝子を上方調節することによるものであり得る。シデロフォア遺伝子のいくつかの例は、ｙｈｆＡ、ｙｕｓＶ、ｓｂｎＡ、ｆｉｕ、ｙｆｉＺ、およびｆｕｒであり得るが、これらに限定されない。場合によっては、鉄の取り込みは、ｔｏｎＢ輸送系の影響を受ける可能性がある。場合によっては、鉄の取り込みに影響を与えることは、ｔｏｎＢ輸送系遺伝子を上方調節することによるものであり得る。ｔｏｎＢ輸送系遺伝子のいくつかの例は、ｔｏｎＢおよびｅｘｂＡＢであり得るが、これらに限定されない。
場合によっては、収容力および／または微生物の適応度は、酸化還元バランスおよび／またはＲＯＳスカベンジングによって影響され得る。酸化還元バランスおよび／またはＲＯＳスカベンジングは、細菌グルタチオン（ＧＳＨ）生合成の影響を受ける可能性がある。場合によっては、細菌グルタチオン（ＧＳＨ）生合成に影響を与えることは、細菌グルタチオン生合成遺伝子の上方調節を介するものであり得る。細菌グルタチオン生合成遺伝子のいくつかの例は、ｇｓｈＡ、ｇｓｈＡＢ、およびｇｓｈＢであり得るが、これらに限定されない。
場合によっては、酸化還元バランスは、ＲＯＳスカベンジングの影響を受ける可能性がある。場合によっては、ＲＯＳスカベンジングに影響を与えることは、カタラーゼの上方調節を介するものであり得る。カタラーゼ遺伝子のいくつかの例は、ｋａｔＥＧおよびＭｎカタラーゼであり得るが、これらに限定されない。
場合によっては、バイオフィルム形成は、リンのシグナル伝達の影響を受ける可能性がある。場合によっては、リンのシグナル伝達に影響を与えることは、リンのシグナル伝達遺伝子の発現を変化させることによるものであり得る。リンシグナル伝達遺伝子のいくつかの例は、ｐｈｏＲおよびｐｈｏＢであり得るが、これらに限定されない。
場合によっては、収容力は、根の付着によって影響され得る。根の付着は、サーファクチン生合成の影響を受ける可能性がある。場合によっては、サーファクチン生合成に影響を与えることは、バイオフィルム形成を向上させるためにサーファクチン生合成を上方調節することによって達成され得る。サーファクチン生合成遺伝子の例は、ｓｒｆＡＡであり得るが、これに限定されない。
場合によっては、コロニー形成および／または微生物の適応度は、収容力、他の微生物との競争、および／または他の微生物からの作物保護の影響を受ける可能性がある。場合によっては、他の微生物との競争および／または他の微生物からの作物保護は、クオラムセンシングおよび／またはクオラムクエンチングの影響を受ける可能性がある。クオラムクエンチングは、潜在的な病原性／競合細菌のクオラムセンシングを阻害することによって、コロニー形成に影響を与えることができる。場合によっては、クオラムクエンチングに影響を与えることは、クオラムクエンチング酵素をコードする遺伝子を挿入および／または上方調節することによって達成され得る。クオラムクエンチング遺伝子のいくつかの例は、ａｈｌＤ、Ｙ２－ａｉｉＡ、ａｉｉＡ、ｙｔｎＰ、およびａｔｔＭであり得るが、これらに限定されない。場合によっては、Ｙ２－ａｉｉＡおよび／またはｙｔｎＰなどのクオラムクエンチングに関与する酵素の修飾が、コロニー形成に有益であり得る。場合によっては、Ｙ２－ａｉｉＡおよび／またはｙｔｎＰの上方調節は、細胞外アシル－ホモセリンラクトン（ＡＨＬ）の加水分解をもたらし得る。ａｉｉＡは、ホモセリンラクトンを分解する酵素であるＮ－アシルホモセリンラクトナーゼである。ＡＨＬを分解することで、競合するグラム陰性菌のクオラムシグナル伝達能力を停止または減速させることができる。場合によっては、コロニー形成を増加させるこのプロセスで利用され得る株は、Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ株を含み得るが、これらに限定されない。
場合によっては、収容力および／または微生物の適応度は、リゾビトキシン生合成によって影響され得る。リゾビトキシン生合成は、ＡＣＣシンターゼを阻害することによって、根でのエチレン産生を減少させることができる。場合によっては、リゾビトキシン生合成に影響を与えることは、リゾビトキシン生合成遺伝子を上方調節することによって達成され得る。
場合によっては、収容力は、根の付着によって影響され得る。根の付着は、エキソポリサッカライドの分泌の影響を受ける可能性がある。場合によっては、エキソポリサッカライドの分泌に影響を与えることは、ｍｕｃＡを削除することによってハイパームコイド突然変異体を生成することによって達成され得る。
場合によっては、根の付着は、フェナジン生合成の影響を受ける可能性がある。場合によっては、フェナジン生合成に影響を及ぼすことは、フェナジン生合成遺伝子を上方調節してバイオフィルム形成を向上させることによって達成され得る。
場合によっては、根の付着は、環状リポペプチド（ＣＬＰ）生合成の影響を受ける可能性がある。場合によっては、環状リポペプチド（ＣＬＰ）生合成に影響を与えることは、ＣＬＰ生合成を上方調節してバイオフィルム形成を向上させることによって達成され得る。場合によっては、収容力および／または競争は、抗生物質の合成によって影響され得る。抗生物質の合成は、抗生物質の産生を増加させて、競合する微生物を殺すことができる。場合によっては、抗生物質の産生を増加させることは、抗生物質生合成経路および上方調節のためにゲノムをマイニングすることによって達成され得る。
場合によっては、コロニー形成は、乾燥耐性によって影響され得る。場合によっては、ｒｐｏＥの修飾は、コロニー形成に有益であり得る。場合によっては、ｒｐｏＥの上方調節は、ストレス耐性遺伝子および経路の発現の増加をもたらし得る。場合によっては、ｒｐｏＥは、独自の切り替え可能なプロモーターを使用して上方調節され得る。場合によっては、ｒｐｏＥは、アラビノースプロモーターを使用して上方調節され得る。ｒｐｏＥは、ｐｈｙＲと同様のシグマ因子である。発現すると、ｒｐｏＥは、複数のストレス耐性遺伝子の上方調節を引き起こし得る。ストレス耐性酵素は、コロニー形成サイクル中には有用ではない可能性があるため、切り替え可能なプロモーターを使用することができる。場合によっては、プロモーターは、バイオマス増殖中および／または種子コーティング中に活性であり得る。場合によっては、バイオマス増殖の対数期中に糖または化学物質がスパイクされ得る場合、切り替え可能なプロモーターを使用することができるが、微生物の１つ以上の他の適用中にプロモーターがオンにならない場合もある。場合によっては、ｒｓｅＡを下方調節しながら、ｒｐｏＥを上方調節することもできる。場合によっては、コロニー形成を増加させるこのプロセスで利用され得る株は、Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ株を含み得るが、これらに限定されない。
場合によっては、コロニー形成は、乾燥耐性によって影響され得る。場合によっては、ｒｓｅＡの修飾は、コロニー形成に有益であり得る。場合によっては、ｒｓｅＡは、独自の切り替え可能なプロモーターを使用して下方調節され得る。場合によっては、ｒｓｅＡは、アラビノースプロモーターを使用して下方調節することができる。ｒｓｅＡは、ｒｐｏＥと共発現する抗シグマ因子である。場合によっては、酵素は、互いに結合したままであり、これによりｒｐｏＥが転写因子として作用する能力を低下させるまたは無効にする可能性がある。ただし、ストレス状態の間、ｒｅｓＡは切断され得、ｒｐｏＥは、ストレス耐性遺伝子を自由に上方／下方調節することができる。ｒｐｏＥとの共転写を破壊することによって、ｒｐｏＥおよびｒｅｓＡのレベルを個別に滴定することができ、これは操作された株のコロニー形成を最適化する上で有益であり得る。場合によっては、コロニー形成を増加させるこのプロセスで利用され得る株は、Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａ株を含み得るが、これらに限定されない。
細菌集団の生成
細菌の分離
本明細書に開示される方法および組成物において有用な微生物は、未変性植物の表面または組織から微生物を抽出することによって得ることができる。微生物は、種を粉砕して微生物を分離することによって得ることができる。微生物は、様々な土壌試料に種を植え、組織から微生物を回収することによって得ることができる。さらに、微生物は、植物に外因性微生物を接種し、どの微生物が植物組織に現れるかを決定することによって得ることができる。植物組織の非限定的な例には、種子、苗、葉、切穂、植物、球根、または塊茎が含まれ得る。
微生物を得る方法は、土壌から細菌を分離することによるものであり得る。細菌は、様々な種類の土壌から収集され得る。いくつかの例では、土壌は、肥沃度の高低、水分レベル、ミネラルレベル、および様々な作付けなどの形質によって特徴付けられ得る。例えば、土壌は、異なる作物が連続する植え付け期に同じ土壌に植えられる場合、輪作に関与している可能性がある。同じ土壌で異なる作物を順次栽培すると、ある特定のミネラルの不均衡な枯渇を防ぐことができる。選択した土壌で育つ植物から細菌を分離することができる。実生植物は、成長の２～６週で収穫することができる。例えば、１回の収穫で少なくとも４００の分離株を収集することができる。土壌および植物のタイプは、植物の表現型と、ある特定の表現型の下流の濃縮を可能にする条件とを明らかにする。
微生物を植物組織から分離して、微生物の形質を評価することができる。組織試料を処理するためのパラメーターを変化させて、根粒菌、着生植物、またはエンドファイトなどの異なるタイプの関連微生物を分離することができる。分離株を無窒素培地で培養して、窒素固定を行う細菌を濃縮することができる。あるいは、世界的な株バンクから微生物を入手することもできる。
植物体において分析を行い、微生物の形質を評価する。いくつかの実施形態では、植物組織は、ＤＮＡおよびＲＮＡのハイスループット処理によるスクリーニングのために処理することができる。さらに、非侵襲的測定を使用して、コロニー形成などの植物の特性を評価することができる。野生微生物の測定値は、植物ごとに得ることができる。野生微生物の測定値は、ミディアムスループット法を使用して畑地で得ることもできる。時間の経過とともに連続して測定を行うことができる。Ｓｅｔａｒｉａを含むがこれに限定されないモデル植物系を使用することができる。
植物系の微生物は、植物系の微生物の転写プロファイリングを介してスクリーニングすることができる。転写プロファイリングによるスクリーニングの例は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、転写産物検出のための分子バーコード、次世代シーケンシング、および蛍光マーカーによる微生物タグ付けの方法を使用することである。マイクロバイオーム、非生物要因、土壌条件、酸素、水分、温度、接種条件、および根の局在化を含むが、これらに限定されない影響因子を測定して、温室でのコロニー形成を評価することができる。本明細書に記載されるように、ＩＲＭＳまたはＮａｎｏＳＩＭＳを用いて１５Ｎガス／肥料（希釈）を測定することによって、細菌内の窒素固定を評価することができる。ＮａｎｏＳＩＭＳは、高分解能二次イオン質量分析である。ＮａｎｏＳＩＭＳ技法は、生体試料から化学活性を調査する方法である。微生物の代謝を促進する酸化反応の還元の触媒作用は、細胞、細胞内、分子、および元素レベルで調査することができる。ＮａｎｏＳＩＭＳは、０．１μｍを超える高い空間分解能を提供することができる。ＮａｎｏＳＩＭＳは、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏなどの同位体トレーサーの使用を検出することができる。したがって、ＮａｎｏＳＩＭＳを、細胞内の窒素の化学活性に使用することができる。
自動温室を植物体分析に使用することができる。微生物への曝露に応じた植物指標には、バイオマス、葉緑体分析、ＣＣＤカメラ、容積測定断層撮影が含まれるが、これらに限定されない。
微生物集団を濃縮する１つの方法は、遺伝子型によるものである。例えば、標的化プライマーまたは特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイ。ジアゾ栄養生物は、窒素固定の過程でｎｉｆＨ遺伝子を発現するため、ｎｉｆＨ遺伝子用に設計されたプライマーを使用してジアゾ栄養生物を同定することができる。微生物集団はまた、単一細胞培養に依存しないアプローチおよび走化性誘導分離アプローチを介して濃縮することもできる。あるいは、微生物の標的分離は、選択培地で微生物を培養することによって行うことができる。望ましい形質のために微生物集団を濃縮する計画的なアプローチは、バイオインフォマティクスデータによって導き出すことができ、本明細書で説明する。
バイオインフォマティクスを使用した窒素固定能力による微生物の濃縮
バイオインフォマティクスツールを使用して、植物成長促進根圏細菌（ＰＧＰＲ）を同定し、分離することができ、これらは、窒素固定を行う能力に基づいて選択される。高い窒素固定能力を持つ微生物は、植物の好ましい形質を促進することができる。ＰＧＰＲの同定のための分析のバイオインフォマティクスモードには、ゲノミクス、メタゲノミクス、標的分離、遺伝子シーケンシング、トランスクリプトームシーケンシング、およびモデリングが含まれるが、これらに限定されない。
ゲノミクス分析を使用して、ＰＧＰＲを同定し、本明細書に記載の次世代シーケンシングの方法および微生物のバージョン管理で突然変異の存在を確認することができる。
メタゲノミクスを使用して、コロニー形成の予測アルゴリズムを用いてＰＧＰＲを同定し、分離することができる。メタデータを使用して、環境および温室試料における操作された株の存在を同定することもできる。
トランスクリプトームシーケンシングを使用して、ＰＧＰＲ表現型につながる遺伝子型を予測することができる。さらに、トランスクリプトームデータを使用して、遺伝子発現を変化させるためのプロモーターを同定する。トランスクリプトームデータを、全ゲノムシーケンス（ＷＧＳ）と組み合わせて分析して、代謝および遺伝子調節ネットワークのモデルを生成することができる。
微生物の馴化
自然から分離された微生物は、微生物が遺伝的に追跡可能で同定可能な形態に変換される馴化プロセスを受け得る。微生物を馴化する１つの方法は、抗生物質耐性で微生物を操作することである。抗生物質耐性を操作するプロセスは、野生型微生物株の抗生物質感受性を決定することから始めることができる。細菌が抗生物質に感受性である場合、抗生物質は、抗生物質耐性操作の良い候補となり得る。その後、抗生物質耐性遺伝子または対抗選択可能な自殺ベクターを、組み換え法を使用して微生物のゲノムに組み込むことができる。対抗選択可能な自殺ベクターは、目的の遺伝子、選択可能なマーカー、および対抗選択可能なマーカーｓａｃＢの欠失から構成され得る。対抗選択を使用して、抗生物質耐性遺伝子と未変性の微生物ＤＮＡ配列を交換することができる。ミディアムスループット法を使用して、複数の微生物を同時に評価して、並行馴化を可能にすることができる。馴化の代替方法には、自殺ベクター配列がループアウトすること、または介在ベクター配列を得ることを防ぐためのホーミングヌクレアーゼの使用が含まれる。
ＤＮＡベクターは、エレクトロポレーションおよび化学的形質転換を含むいくつかの方法によって細菌に導入することができる。ベクターの標準ライブラリーを変換に使用することができる。遺伝子編集の方法の一例は、ＣＲＩＳＰＲであり、微生物中のＣａｓ９の活性を確認するＣａｓ９試験が先行する。
微生物の非トランスジェニック操作
指向性進化を介して、好ましい形質を持つ微生物集団を得ることができる。指向性進化は、自然選択のプロセスを模倣して、ユーザー定義の目標に向けてタンパク質または核酸を進化させるアプローチである。指向性進化の例は、ランダムな突然変異が微生物集団に導入され、最も好ましい形質を持つ微生物が選択され、選択された微生物の増殖が継続する場合である。成長促進根圏細菌（ＰＧＰＲ）の最も好ましい形質は、窒素固定にあり得る。指向性進化の方法は、各反復後の選択プロセスに基づいて、反復的かつ適応的であり得る。
窒素固定能力の高い植物成長促進根圏細菌（ＰＧＰＲ）を生成することができる。ＰＧＰＲの進化は、遺伝的変異の導入を介して実行することができる。遺伝的変異は、ポリメラーゼ連鎖反応突然変異誘発、オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発、飽和突然変異誘発、フラグメントシャフリング突然変異誘発、相同組み換え、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系、化学突然変異誘発、およびそれらの組み合わせを介して導入することができる。これらのアプローチは、微生物集団にランダムな突然変異を導入することができる。例えば、突然変異体は、オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発を介して、合成ＤＮＡまたはＲＮＡを使用して生成することができる。突然変異体は、後に硬化されるプラスミドに含まれているツールを使用して生成することができる。目的の遺伝子は、ＰＧＰＲ特性の向上、穀物のコロニー形成の向上、酸素感受性の増加、窒素固定の増加、アンモニア排泄の増加を含むが、これらに限定されない形質が改良された他の種からのライブラリーを使用して同定することができる。ＧｅｎｅｉｏｕｓまたはＰｌａｔｙｐｕｓデザインソフトウェアなどのソフトウェアを使用して、これらのライブラリーに基づいて属内遺伝子を設計することができる。突然変異は、機械学習を利用して設計することができる。突然変異は、代謝モデルを利用して設計することができる。突然変異の自動設計は、Ｐｌａｔｙｐｕｓを使用して行うことができ、Ｃａｓ指向性突然変異誘発のためにＲＮＡを誘導する。
属内遺伝子を、宿主微生物に移入することができる。さらに、レポーター系を微生物に移入することもできる。レポーター系は、プロモーターを特徴付け、形質転換の成功を決定し、突然変異体をスクリーニングし、ネガティブスクリーニングツールとして機能する。
突然変異を有する微生物は、連続継代を介して培養することができる。微生物コロニーは、微生物の単一変異体を含む。自動コロニーピッカーおよびリキッドハンドラーを用いて、微生物コロニーをスクリーニングする。遺伝子の重複および増加したコピー数を持つ突然変異体は、望ましい形質のより高い遺伝子型を発現する。
窒素固定に基づく植物成長促進微生物の選択
微生物コロニーは、窒素固定を評価するための様々なアッセイを使用してスクリーニングすることができる。窒素固定を測定する１つの方法は、窒素排泄を測定する単一の発酵アッセイによるものである。代替方法は、経時的なインラインサンプリングによるアセチレン還元アッセイ（ＡＲＡ）である。ＡＲＡは、マイクロチューブアレイのハイスループットプレートで行うことができる。ＡＲＡは、生きている植物および植物組織で行うことができる。培地配合および培地酸素濃度は、ＡＲＡアッセイにおいて変えることができる。微生物変異体をスクリーニングする別の方法は、バイオセンサーを使用することによるものである。ＮａｎｏＳＩＭＳおよびラマン顕微分光法の使用によって、微生物の活性を調査することができる。場合によっては、バイオリアクターでの発酵方法を使用して、細菌を培養し、拡大することもできる。バイオリアクターは、細菌の成長の堅牢性を向上させ、酸素に対する細菌の感受性を低下させるように設計されている。中～高ＴＰプレートベースのマイクロ発酵槽を使用して、酸素感受性、栄養ニーズ、窒素固定、および窒素排泄を評価する。細菌はまた、潜在的な経路を解明するために、競合的または有益な微生物と共培養することができる。フローサイトメトリーを使用して、化学的、比色分析、または蛍光指示薬を使用して、高レベルの窒素を産生する細菌をスクリーニングすることができる。細菌は、窒素源の存在下または不在下で培養することができる。例えば、細菌は、グルタミン、アンモニア、尿素、または硝酸塩とともに培養され得る。
微生物の繁殖
微生物の繁殖は、作物のマイクロバイオーム内の種の役割を体系的に同定して改良する方法である。この方法は、３つのステップ：１）植物－微生物相互作用をマッピングし、特定の表現型にリンクされた調節ネットワークを予測することによる候補種の選択、２）調節ネットワークおよび遺伝子クラスターの種内交雑による微生物表現型の実用的かつ予測可能な改良、ならびに３）望ましい作物の表現型を産生する新しい微生物の遺伝子型のスクリーニングおよび選択を含む。株の改良を体系的に評価するために、微生物群集のコロニー形成動態を主要な種による遺伝的活性にリンクするモデルが作成される。このモデルを使用して、遺伝的標的の繁殖を予測し、農業的関連性のマイクロバイオームでコードされた形質の改良を選択する頻度を向上させる。
植物形質（例えば、窒素固定）を改良するための細菌の産生は、継代培養によって達成することができる。この細菌の産生は、１つ以上の植物に１つ以上の改良された形質を与えることができる細菌および／または組成物を同定することに加えて、微生物叢によって影響を受ける特定の改良された形質を有する植物を選択することによって行うことができる。植物形質を改良するために細菌を産生する１つの方法は、以下のステップを含む。（ａ）第１の植物の組織または土壌から細菌を分離すること、（ｂ）１つ以上の細菌に遺伝的変異を導入して、１つ以上の変異体細菌を産生すること、（ｃ）複数の植物を変異体細菌に曝露すること、（ｄ）複数の植物のうちの１つの組織または土壌から細菌を分離すること（ここで、細菌が分離される植物は、複数の植物の他の植物と比較して改良された形質を有する）、（ｅ）形質が改良された植物から分離された細菌を用いてステップ（ｂ）～（ｄ）を繰り返す（ステップ（ｄ））。ステップ（ｂ）～（ｄ）は、植物の改良された形質が望ましいレベルに達するまで、任意の回数（例えば、１回、２回、３回、４回、５回、１０回、またはそれ以上）繰り返すことができる。さらに、複数の植物は、２つよりも多い植物、例えば、１０～２０個の植物、または２０個以上、５０個以上、１００個以上、３００個以上、５００個以上、または１０００個以上の植物であり得る。
形質が改良された植物を得ることに加えて、１つ以上の遺伝子（例えば、窒素固定を調節する遺伝子）に導入された１つ以上の遺伝的変異を含む細菌を含む細菌集団が得られる。上記のステップを繰り返すことによって、目的の植物の形質と相関する集団の最も適切なメンバーを含む、細菌の集団を得ることができる。この集団の細菌を同定し、それらの有益な特性を、遺伝子および／または表現型分析などによって決定することができる。ステップ（ａ）で分離された細菌の遺伝子分析を行うことができる。表現型および／または遺伝子型の情報は、植物起源の化学成分のハイスループットスクリーニング、遺伝物質のハイスループットシーケンシングを含むシーケンシング技法、ディファレンシャルディスプレイ技法（ＤＤＲＴ－ＰＣＲおよびＤＤ－ＰＣＲを含む）、核酸マイクロアレイ技法、ＲＮＡシーケンシング（全トランスクリプトームショットガンシーケンシング）、およびｑＲＴ－ＰＣＲ（定量的リアルタイムＰＣＲ）を含む技法を使用して得ることができる。得られた情報を使用して、ｒＲＮＡオペロンまたは他の分類学的に有益な遺伝子座の構成要素をコードする核酸の系統発生分析またはマイクロアレイベースのスクリーニングなど、存在する細菌の識別および活性に関する群集プロファイリング情報を得ることができる。分類学的に有益な遺伝子座の例としては、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、１２Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、２８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｒｐｏＢ遺伝子、ｆｕｓＡ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、ｃｏｘｌ遺伝子、ｎｉｆＤ遺伝子が挙げられる。集団に存在する分類群を決定するための分類学的プロファイリングのプロセス例は、ＵＳ２０１４／０１５５２８３に記載されている。細菌同定は、窒素固定経路に関連する遺伝子などの、１つ以上の遺伝子または１つ以上のシグナル伝達経路の活性を特徴付けることを含み得る。異なる細菌種間の相乗的相互作用（２つの成分が、それらの組み合わせによって、望ましい効果を添加量よりも多く増加させる場合）も、細菌集団に存在する可能性がある。
遺伝的変異は、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢ、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱからなる群から選択される遺伝子であり得る。遺伝的変異は、グルタミンシンテターゼ、グルタミナーゼ、グルタミンシンテターゼアデニリルトランスフェラーゼ、転写アクチベーター、抗転写アクチベーター、ピルビン酸フラボドキシン酸化還元酵素、フラボドキシン、またはＮＡＤ＋－ジナイトロゲン－レダクターゼａＤＰ－Ｄ－リボシルトランスフェラーゼからなる群から選択される機能性を有するタンパク質をコードする遺伝子における変異であり得る。遺伝的変異は、ＮｉｆＡまたはグルタミナーゼの発現または活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミンシンテターゼ、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現または活性の低下；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の低下；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の低下のうちの１つ以上をもたらす突然変異であり得る。遺伝的変異の導入は、１、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、またはそれ以上のヌクレオチドなど、標的部位での１つ以上のヌクレオチドの挿入および／または削除を含み得る。本明細書に開示される方法のうちの１つ以上の細菌に導入される遺伝的変異は、ノックアウト突然変異（例えば、プロモーターの削除、未成熟終止コドンを産生するための挿入または削除、遺伝子全体の削除）であり得るか、またはそれがタンパク質ドメインの活性の排除もしくは廃止（例えば、活性部位に影響を与える点突然変異、もしくはタンパク質産物の関連部分をコードする遺伝子の一部の削除）であり得るか、またはそれは標的遺伝子の調節配列を変えるもしくは廃止する可能性がある。遺伝的変異が導入される細菌に対応する細菌種または属のゲノム内に見られる異種調節配列および調節配列を含む、１つ以上の調節配列を挿入することもできる。さらに、調節配列は、細菌培養物中または植物組織内の遺伝子の発現レベルに基づいて選択され得る。遺伝的変異は、標的部位に特異的に導入される所定の遺伝的変異であり得る。遺伝的変異は、標的部位内のランダムな突然変異であり得る。遺伝的変異は、１つ以上のヌクレオチドの挿入または欠失であり得る。場合によっては、複数の異なる遺伝的変異（例えば、２、３、４、５、１０、またはそれ以上）が、形質改良を評価するために植物に細菌を曝露する前に、分離された細菌のうちの１つ以上に導入される。複数の遺伝的変異は、上記のタイプのうちのいずれか、同じまたは異なるタイプ、および任意の組み合わせであり得る。場合によっては、複数の異なる遺伝的変異が連続して導入され、第１の分離ステップの後に第１の遺伝的変異を導入し、第２の分離ステップの後に第２の遺伝的変異を導入するなどして、進行的に改良された形質を関連する植物に付与する細菌に複数の遺伝的変異を蓄積する。
一般に、「遺伝的変異」という用語は、参照ゲノムもしくはその一部、または参照遺伝子もしくはその一部などの参照ポリヌクレオチドと比較してポリヌクレオチド配列に導入される任意の変化を指す。遺伝的変異は、「突然変異」と呼ばれる場合があり、遺伝子変異を含む配列または生物は、「遺伝的変異体」または「突然変異体」と呼ばれる場合がある。遺伝的変異は、遺伝子発現、代謝、および細胞シグナル伝達を含む、いくつかの生物学的活性の増加または減少など、いくつもの効果を有し得る。遺伝的変異は、標的部位に特異的に導入され得るか、またはランダムに導入され得る。遺伝的変異を導入するために、様々な分子ツールおよび方法が利用可能である。例えば、遺伝的変異は、ポリメラーゼ連鎖反応突然変異誘発、オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発、飽和突然変異誘発、フラグメントシャフリング突然変異誘発、相同組み換え、組み換え、ラムダレッド媒介組み換え、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系、化学突然変異誘発、およびそれらの組み合わせを介して導入され得る。遺伝的変異を導入する化学的方法には、化学的突然変異原、例えば、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、メタンスルホン酸メチル（ＭＭＳ）、Ｎ－ニトロソウレア（ＥＮ Ｕ）、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロ－Ｎ′－ニトロソグアニジン、４－ニトロキノリンＮ－オキシド、硫酸ジエチル、ベンゾピレン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、トリエチルメラミン、アクリルアミドモノマー、ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ジエポキシアルカン（例えば、ジエポキシブタン）、ＩＣＲ－１７０、ホルムアルデヒド、塩酸プロカルバジン、酸化エチレン、ジメチルニトロソアミン、７，１２ジメチルベンズ（ａ）アントラセン、クロラムブシル、ヘキサメチルホスホルアミド、ビススルファン等へのＤＮＡの曝露が含まれる。放射線突然変異誘発剤には、紫外線、γ線、Ｘ線、および高速中性子衝撃が含まれる。遺伝的変異はまた、例えば、紫外線を伴うトリメチルソラレンを使用して核酸に導入され得る。可動性ＤＮＡ要素、例えば、転位性要素のランダム挿入または標的化挿入は、遺伝的変異を生成するための別の好適な方法である。遺伝的変異は、無細胞インビトロ系での増幅中に、例えば、エラーが発生しやすいＰＣＲなどのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を使用して、核酸に導入することができる。遺伝的変異は、ＤＮＡシャッフリング技法（例えば、エクソンシャッフリング、ドメインスワッピング等）を使用して、インビトロで核酸に導入することができる。遺伝的変異はまた、細胞内のＤＮＡ修復酵素の欠損の結果として核酸に導入され得る。例えば、細胞内の突然変異体ＤＮＡ修復酵素をコードする突然変異体遺伝子の存在は、細胞のゲノム中で高頻度の突然変異（すなわち、約１突然変異／１００遺伝子～１突然変異／１０，０００遺伝子）を生成することが予想される。ＤＮＡ修復酵素をコードする遺伝子の例には、Ｍｕｔ Ｈ、Ｍｕｔ Ｓ、Ｍｕｔ Ｌ、およびＭｕｔ Ｕ、ならびに他の種におけるそれらのホモログ（例えば、ＭＳＨ １ ６、ＰＭＳ １ ２、ＭＬＨ １、ＧＴＢＰ、ＥＲＣＣ－１等）が含まれるが、これらに限定されない。遺伝的変異を導入するための様々な方法の例示的な説明は、例えば、Ｓｔｅｍｐｌｅ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ５：１－７、Ｃｈｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ ２（３）：２１０－２１７、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１０７４７－１０７５１、および米国特許第６，０３３，８６１号および同第６，７７３，９００号に提供されている。
微生物に導入された遺伝的変異は、トランスジェニック、シスジェニック、ゲノム内、属内、属間、合成、進化、再配置、またはＳＮＰとして分類され得る。
上記の形質の改良を引き出すために、微生物内の多くの代謝経路に遺伝的変異を導入することができる。代表的な経路には、硫黄取り込み経路、グリコーゲン生合成、グルタミン調節経路、モリブデン取り込み経路、窒素固定経路、アンモニア同化、アンモニアの排泄または分泌、ｎ窒素取り込み、グルタミン生合成、アナモックス、リン酸可溶化、有機酸輸送、有機酸産生、凝集素産生、活性酸素ラジカルスカベンジング遺伝子、インドール酢酸生合成、トレハロース生合成、植物細胞壁分解酵素または経路、根付着遺伝子、エキソポリサッカライド分泌、グルタミン酸シンターゼ経路、鉄取り込み経路、シデロフォア経路、キチナーゼ経路、ＡＣＣデアミナーゼ、グルタチオン生合成、リンシグナル伝達遺伝子、クオラムクエンチング経路、チトクロム経路、ヘモグロビン経路、細菌ヘモグロビン様経路、小ＲＮＡ ｒｓｍＺ、リゾビトキシン生合成、ｌａｐＡ接着タンパク質、ＡＨＬクオラムセンシング経路、フェナジン生合成、環状リポペプチド生合成、および抗生物質産生が含まれる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（クラスター化された定期的に間隔を空けた短いパリンドロームの繰り返し）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系を使用して、望ましい突然変異を導入することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を使用して侵入する核酸のサイレンシングを誘導することによって、細菌および古細菌にウイルスおよびプラスミドに対する適応免疫を提供する。Ｃａｓ９タンパク質（またはその機能的同等物および／もしくは変異体、すなわち、Ｃａｓ９様タンパク質）は、タンパク質と、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれる（ガイドＲＮＡとも呼ばれる）２つの天然に存在するＲＮＡ分子または合成ＲＮＡ分子との会合に依存するＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を自然に含んでいる。場合によっては、２つの分子が共有結合して、単一分子（単一ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）とも呼ばれる）を形成する。したがって、Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（この用語は、２分子ガイドＲＮＡ構成および単一分子ガイドＲＮＡ構成の両方を包含する）と会合し、これがＣａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質を活性化して、タンパク質を標的核酸配列に誘導する。Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質が、その本来の酵素機能を保持している場合、標的ＤＮＡを切断して二本鎖切断を作成し、これがゲノム変化（すなわち、編集：削除、挿入（ドナーポリヌクレオチドが存在する場合）、置換等）につながる可能性があり、それによって遺伝子発現を変化させる。Ｃａｓ９のいくつかの変異体（これらの変異体は、Ｃａｓ９様という用語によって包含される）は、ＤＮＡ切断活性が低下するように変化している（場合によっては、標的ＤＮＡの両方の鎖ではなく一本鎖を切断し、場合によっては、ＤＮＡ切断活性をなくなるまで大幅に低減する）。遺伝的変異を導入するためのＣＲＩＳＰＲ系のさらなる例示的な説明は、例えばＵＳ８７９５９６５に見られ得る。
周期的増幅技法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）突然変異誘発は、突然変異誘発プライマーを使用して、望ましい突然変異を導入する。ＰＣＲは、変性、アニーリング、および伸長のサイクルによって行われる。ＰＣＲによる増幅後、突然変異したＤＮＡの選択および親プラスミドＤＮＡの除去は、１）ＰＣＲ中のヒドロキシメチル化ｄＣＴＰによるｄＣＴＰの置換、続いて非ヒドロキシメチル化親ＤＮＡのみを除去するための制限酵素による消化；２）抗生物質耐性遺伝子および研究された遺伝子の両方の同時突然変異誘発（プラスミドを異なる抗生物質耐性に変更し、新しい抗生物質耐性は、その後の望ましい突然変異の選択を容易にする）；３）望ましい突然変異を導入した後、メチル化ＤＮＡのみを切断する制限酵素ＤｐｎＩによる親メチル化テンプレートＤＮＡの消化（これによって、突然変異した非メチル化鎖が回収される）；または４）突然変異したＤＮＡの形質転換効率を高めるための追加のライゲーション反応での突然変異したＰＣＲ産物の環状化によって達成され得る。例示的な方法のさらなる説明は、例えば、ＵＳ７１３２２６５、ＵＳ６７１３２８５、ＵＳ６６７３６１０、ＵＳ６３９１５４８、ＵＳ５７８９１６６、ＵＳ５７８０２７０、ＵＳ５３５４６７０、ＵＳ５０７１７４３、およびＵＳ２０１０／０２６７１４７に見出すことができる。
部位指向性突然変異誘発とも呼ばれるオリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発は、典型的に、合成ＤＮＡプライマーを利用する。この合成プライマーは、望ましい突然変異を含み、目的の遺伝子においてＤＮＡとハイブリダイズできるように、突然変異部位の周囲のテンプレートＤＮＡに相補的である。突然変異は、単一の塩基変化（点突然変異）、複数の塩基変化、削除、もしくは挿入、またはこれらの組み合わせであり得る。次いで、ＤＮＡポリメラーゼを使用して一本鎖プライマーを伸長し、これが残りの遺伝子をコピーする。このようにしてコピーされた遺伝子は、突然変異部位を含み、次いでベクターとして宿主細胞に導入され、クローン化され得る。最後に、ＤＮＡシーケンシングによって突然変異体を選択して、それらが望ましい突然変異を含んでいることを確認することができる。
遺伝的変異は、エラーが発生しやすいＰＣＲを使用して導入することができる。この技法では、配列の複製の忠実度が不足している条件下で、ＤＮＡポリメラーゼを使用して目的の遺伝子を増幅させる。その結果、増幅産物は、シーケンス内に少なくとも１つのエラーを含有する。遺伝子が増幅され、反応の結果として生じる産生物（複数可）が、テンプレート分子と比較して１つ以上のシーケンスの変化を含む場合、結果として生じる産生物は、テンプレートと比較して突然変異誘発される。ランダム突然変異を導入する別の方法は、ニトロソグアニジンまたはメタンスルホン酸エチルなどの化学的突然変異原に細胞を曝露することであり（Ｎｅｓｔｍａｎｎ，Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ １９７５ Ｊｕｎｅ；２８（３）：３２３－３０）、次いで、遺伝子を含むベクターが宿主から分離される。
飽和突然変異誘発は、ランダム突然変異誘発の別の形態であり、特定の部位、または遺伝子の狭い領域で、起こり得るすべてまたはほぼすべての突然変異を生成しようとする。一般的な意味では、飽和突然変異誘発は、突然変異誘発される定義されたポリヌクレオチド配列（突然変異誘発される配列は、例えば、１５～１００，０００塩基長である）における突然変異誘発カセットの完全なセット（各カセットは、例えば、１～５００塩基長である）を突然変異誘発することを含む。したがって、突然変異の群（例えば、１～１００突然変異の範囲）が、突然変異誘発される各カセットに導入される。１つのカセットに導入される突然変異の群は、１回の飽和突然変異誘発の適用中に第２のカセットに導入される突然変異の第２の群とは異なり得るか、または同じであり得る。そのような分類は、特定のコドンの欠失、付加、分類、および特定のヌクレオチドカセットの分類によって例示される。
ＤＮＡシャフリングとも呼ばれるフラグメントシャフリング突然変異誘発は、有益な突然変異を迅速に伝播させる方法である。シャフリングプロセスの例では、ＤＮＡｓｅを使用して、親遺伝子のセットを、例えば、長さ約５０～１００ｂｐの切片に断片化する。次いで、プライマーなしのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が続き、相同配列が十分に重複しているＤＮＡフラグメントは互いにアニールし、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。ＤＮＡ分子の一部が親遺伝子のサイズに達した後、このＰＣＲ伸長が数回起こる。次いで、今回は鎖の末端を補完するように設計されたプライマーを付加して、これらの遺伝子を別のＰＣＲで増幅させることができる。プライマーは、クローニングベクターへのライゲーションに必要な制限酵素認識部位の配列など、５′末端に付加された追加の配列を有し得る。シャフリング技法のさらなる例は、ＵＳ２００５／０２６６５４１に提供されている。
相同組み換え突然変異誘発は、外因性ＤＮＡフラグメントと標的ポリヌクレオチド配列との間の組み換えを伴う。二本鎖切断が発生した後、切除と呼ばれるプロセスで切断の５′端の周りのＤＮＡの一部が切り取られる。次の鎖侵入ステップでは、切断したＤＮＡ分子のオーバーハング３′末端が、切断されていない類似または同一のＤＮＡ分子に「侵入」する。この方法を使用して、遺伝子を削除し、エクソンを削除し、遺伝子を付加し、点突然変異を導入することができる。相同組み換え突然変異誘発は、永続的または条件付きであり得る。典型的に、組み換えテンプレートも提供される。組み換えテンプレートは、別のベクターの構成要素であり得るか、別のベクターに含まれ得るか、または別個のポリヌクレオチドとして提供され得る。いくつかの実施形態では、組み換えテンプレートは、部位特異的ヌクレアーゼによって切れ目が入れられるか、または切断される標的配列内またはその近くなどの相同組み換えにおいてテンプレートとして機能するように設計される。テンプレートポリヌクレオチドは、任意の好適な長さ、例えば約１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００、１０００、またはそれ以上のヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、テンプレートポリヌクレオチドは、標的配列を含むポリヌクレオチドの一部に相補的である。最適に整列すると、テンプレートポリヌクレオチドは、標的配列の１つ以上のヌクレオチド（例えば、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上のヌクレオチド）と重複し得る。いくつかの実施形態では、テンプレート配列および標的配列を含むポリヌクレオチドが最適に整列される場合、テンプレートポリヌクレオチドの最も近いヌクレオチドは、標的配列から約１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、５０００、１００００、またはそれ以上のヌクレオチド内にある。相同組み換えの方法において有用な部位指向性ヌクレアーゼの非限定的な例には、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、およびメガヌクレアーゼが含まれる。そのようなヌクレアーゼの使用のさらなる説明については、例えば、ＵＳ８７９５９６５およびＵＳ２０１４／０３０１９９０を参照されたい。
化学的突然変異原または放射線を含む、主に点突然変異および短い欠失、挿入、塩基転換、および／または遷移を作成する突然変異原を使用して、遺伝的変異を作成することができる。突然変異原としては、メタンスルホン酸エチル、メタンスルホン酸メチル、Ｎ－エチル－Ｎ－ニトロソウレア、トリエチルメラミン、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソウレア、プロカルバジン、クロラムブシル、シクロホスファミド、硫酸ジエチル、アクリルアミドモノマー、メルファラン、ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ジメチルニトロソアミン、Ｎ－メチル－Ｎ′－ニトロ－ニトロソグアニジン、ニトロソグアニジン、２－アミノプリン、７，１２ジメチル－ベンズ（ａ）アントラセン、エチレンオキシド、ヘキサメチルホスホルアミド、ビススルファン、ジエポキシアルカン（ジエポキシオクタン、ジエポキシブタン等）、２－メトキシ－６－クロロ－９［３－（エチル－２－クロロエチル）アミノプロピルアミノ］アクリジン二塩酸塩、およびホルムアルデヒドが挙げられるが、これらに限定されない。
遺伝的変異の導入は、不完全なプロセスであり得、それにより処理された細菌集団の一部の細菌は望ましい突然変異を保有するが、保有しないものもある。場合によっては、望ましい遺伝的変異を保有する細菌を濃縮するように選択圧を印加することが望ましい。伝統的に、成功した遺伝的変異体の選択には、抗生物質耐性遺伝子を挿入する、または非致死性化合物を致死性代謝産物に変換することができる代謝活性を廃止する場合など、遺伝的変異によって付与または廃止されるいくつかの機能性に対する選択が含まれていた。望ましい遺伝的変異のみを導入する必要があるように（例えば、選択可能なマーカーも必要とせずに）、ポリヌクレオチド配列自体に基づいて選択圧を印加することも可能である。この場合、選択ストレスは、標的部位に導入された遺伝的変異を欠くゲノムを切断することを含み得、それにより選択は、遺伝的変異が導入されることが求められる参照配列に対して効果的に指向される。典型的には、切断は、標的部位の１００ヌクレオチド以内で起こる（例えば、標的部位での切断または標的部位内での切断を含む、標的部位から７５、５０、２５、１０またはそれ以下のヌクレオチド内）。切断は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはメガヌクレアーゼからなる群から選択された部位特異的ヌクレアーゼによって指向され得る。そのようなプロセスは、相同組み換えのテンプレートが提供されないことを除いて、標的部位での相同組み換えを強化するためのプロセスと同様である。結果として、望ましい遺伝的変異を欠く細菌は、切断され、修復されずに放置されると、細胞死をもたらす可能性が高くなる。次いで、改良された形質の付与を評価するため、植物に曝露する際に使用するために細菌生存選択を分離することができる。
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを部位特異的ヌクレアーゼとして使用して、切断を標的部位に指向することができる。Ｃａｓ９を使用して非突然変異細胞を殺すことによって、突然変異微生物の選択を改良することができる。次いで、植物に突然変異微生物を接種して共生を再確認し、効率的な共生生物を選択するための進化ストレスを生み出す。次いで、微生物を植物組織から再分離することができる。非変異体に対する選択に用いられるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ系は、相同組み換えのテンプレートが提供されていないことを除いて、遺伝的変異の導入に関して上記のものと同様の要素を用いることができる。したがって、標的部位に指向された切断は、影響を受けた細胞の死を促進する。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）系、およびメガヌクレアーゼなど、標的部位での切断を特異的に誘導する他のオプションが利用可能である。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって生成される人工ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。ＺＦＮは、望ましいＤＮＡ配列を標的とするように操作することができ、これにより、ジンクフィンガーヌクレアーゼが固有の標的配列を切断できる。細胞に導入されたとき、ＺＦＮは、二本鎖切断を誘導することによって、細胞（例えば、細胞のゲノム）内の標的ＤＮＡを編集することができる。転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＴＡＬ（転写アクチベーター様）エフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって生成される人工ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。ＴＡＬＥＮは、事実上あらゆる望ましいＤＮＡ配列に結合するように迅速に操作することができ、細胞に導入されたとき、ＴＡＬＥＮを使用して、二本鎖切断を誘導することによって細胞（例えば、細胞のゲノム）中の標的ＤＮＡを編集することができる。メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）は、大きな認識部位（１２～４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列）を特徴とするエンドデオキシリボヌクレアーゼである。メガヌクレアーゼを使用して、高度に標的化した方法で配列を置換、排除、または修飾することができる。タンパク質工学を介してそれらの認識配列を修飾することによって、標的配列を変更することができる。メガヌクレアーゼを使用して、細菌、植物、または動物を問わず、すべてのゲノム型を修飾することができ、一般に４つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ－Ｃｙｓｔボックスファミリー、およびＨＮＨファミリーに分類される。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼとしては、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ、およびＩ－ＴｅｖＩＩＩが挙げられる。
本開示の方法は、様々な望ましい形質のうちの１つ以上を導入または改良するために用いられ得る。導入または改良され得る形質の例としては、根のバイオマス、根の長さ、高さ、苗条の長さ、葉の数、水の利用効率、全体のバイオマス、収量、果実のサイズ、粒径、光合成率、干ばつ耐性、耐熱性、塩耐性、線虫ストレスに対する耐性、真菌性病原体に対する耐性、細菌性病原体に対する耐性、ウイルス性病原体に対する耐性、代謝産物のレベル、およびプロテオームの発現が挙げられる。高さ、全体のバイオマス、根および／または苗条のバイオマス、種子の発芽、苗の生存、光合成効率、蒸散率、種子／果実の数または質量、植物の穀粒または果実の収量、葉のクロロフィル含有量、光合成率、根の長さ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、望ましい形質を使用して成長を測定し、同一の条件下で栽培された参照農業植物（例えば、形質が改良されていない植物）の成長速度と比較することができる。
導入または改良される好ましい形質は、本明細書に記載されるように、窒素固定である。場合によっては、本明細書に記載の方法から得られる植物は、同じ条件下、土壌で栽培された参照農業植物よりも少なくとも約５％大きい、例えば少なくとも約５％、少なくとも約８％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、またはそれ以上大きい形質の差を呈する。さらなる例では、本明細書に記載の方法から得られる植物は、同様の条件下、土壌で栽培された参照農業植物よりも少なくとも約５％大きい、例えば少なくとも約５％、少なくとも約８％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、またはそれ以上大きい形質の差を呈する。
改良される形質は、１つ以上の生物的または非生物的ストレッサーの適用を含む条件下で評価され得る。ストレッサーの例としては、非生物的ストレス（熱ストレス、塩ストレス、干ばつストレス、寒冷ストレス、低栄養ストレスなど）および生物的ストレス（線虫ストレス、昆虫植食性ストレス、真菌性病原体ストレス、細菌性病原体ストレス、ウイルス性病原体など）が挙げられる。
本開示の方法および組成物によって改良される形質は、窒素固定であり得、以前は窒素固定ができなかった植物におけるものを含む。場合によっては、本明細書に記載の方法に従って分離された細菌は、１％以上（例えば、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、またはそれ以上）の植物の窒素を産生し、これは任意の遺伝的変異を導入する前に第１の植物から分離された細菌と比較して、少なくとも２倍（例えば、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、またはそれ以上）の窒素固定能力の増加を表し得る。場合によっては、細菌は、植物の窒素の５％以上を産生する。遺伝的変異を導入するステップ、複数の植物に曝露するステップ、および形質が改良された植物から細菌を分離するステップを１回以上（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２５回、またはそれ以上）繰り返した後、望ましいレベルの窒素固定が達成され得る。場合によっては、グルタミン、アンモニア、または他の化学的窒素源で補足した肥料の存在下で、窒素固定レベルの向上が達成される。窒素固定の程度を評価する方法は知られており、その例は本明細書に記載されている。
微生物の繁殖は、作物のマイクロバイオーム内の種の役割を体系的に同定して改良する方法である。この方法は、３つのステップ：１）植物－微生物相互作用をマッピングし、特定の表現型にリンクされた調節ネットワークを予測することによる候補種の選択、２）調節ネットワークおよび遺伝子クラスターの種内交雑による微生物表現型の実用的かつ予測可能な改良、ならびに３）望ましい作物の表現型を産生する新しい微生物の遺伝子型のスクリーニングおよび選択を含む。株の改良を体系的に評価するために、微生物群集のコロニー形成動態を主要な種による遺伝的活性にリンクするモデルが作成される。このモデルを使用して、遺伝的標的の繁殖を予測し、農業的関連性のマイクロバイオームでコードされた形質の改良を選択する頻度を向上させる。
窒素固定
窒素固定を調節する１つ以上の遺伝子に導入された１つ以上の遺伝的変異を含む細菌に植物を曝露することを含む、植物における窒素固定を増加させる方法が本明細書に記載されており、細菌は、植物において１％以上（例えば、２％、５％、１０％、またはそれ以上）の窒素を産生し、これは細菌の不在下の植物と比較して、少なくとも２倍の窒素固定能力を表し得る。細菌は、グルタミン、尿素、硝酸塩、またはアンモニアで補足した肥料の存在下で窒素を産生することができる。遺伝的変異は、上記に提供された例を含む、任意の数および任意の組み合わせの、本明細書に記載の任意の遺伝的変異であり得る。遺伝的変異は、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミンシンテターゼ、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼ、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱからなる群から選択される遺伝子に導入され得る。遺伝的変異は、ｎｉｆＡまたはグルタミナーゼの発現または活性の増加；ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、グルタミンシンテターゼ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢの発現または活性の低下；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の低下；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の低下のうちの１つ以上をもたらす突然変異であり得る。本明細書に開示される方法のうちの１つ以上の細菌に導入される遺伝的変異は、ノックアウト突然変異であり得るか、または標的遺伝子の調節配列を廃止し得るか、または異種調節配列の挿入、例えば、同じ細菌種または属のゲノム内に見られる調節配列の挿入を含み得る。調節配列は、細菌培養物または植物組織内の遺伝子の発現レベルに基づいて選択することができる。遺伝的変異は、化学的突然変異誘発によって産生され得る。ステップ（ｃ）で生育された植物は、生物的または非生物的ストレッサーに曝露され得る。
本明細書に記載の植物で生じる窒素固定の量は、いくつかの方法で、例えばアセチレン還元（ＡＲ）アッセイによって測定することができる。アセチレン還元アッセイは、インビトロまたはインビボで行うことができる。特定の細菌が固定窒素を植物に提供しているという証拠には、次が含まれ得る：１）植物の総Ｎは、接種時に著しく増加し、好ましくは植物におけるＮ濃度も付随して増加する；２）窒素欠乏症状は、接種時のＮ制限条件下で軽減される（乾物の増加を含むはずである）；３）Ｎ２固定は、１５Ｎアプローチ（同位体希釈実験、１５Ｎ２還元アッセイ、または１５Ｎ天然存在度アッセイ）の使用を通じて記録される；４）固定Ｎは、植物タンパク質または代謝産物に組み込まれる；および５）これらの効果のすべてが、非接種植物または接種株の突然変異体を接種した植物では見られない。
野生型窒素固定調節カスケードは、入力Ｏ２およびＮＨ４ ＋が、ＮＯＲゲートを通過するデジタル論理回路として表すことができ、その出力は、ＡＴＰに加えてＡＮＤゲートに入る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、調節カスケードの複数の点で、この回路に対するＮＨ４ ＋の影響を妨害し、それにより微生物は、施肥した畑地でも窒素を産生することができる。しかしながら、本明細書に開示される方法はまた、回路に対するＡＴＰまたはＯ２の影響を変えること、または回路を細胞内の他の調節カスケードで置き換えること、または窒素固定以外の遺伝子回路を変えることを想定する。遺伝子クラスターは、異種調節系の制御下で機能的産生物を生成するように再操作され得る。遺伝子クラスターのコード配列の外および内で未変性の調節要素を排除し、それらを代替の調節系で置き換えることによって、複雑な遺伝子オペロンおよび他の遺伝子クラスターの機能的産物を制御する、および／または未変性遺伝子が由来する種以外の異なる種の細胞を含む異種細胞に移動させることができる。再操作されると、合成遺伝子クラスターは、遺伝子回路または他の誘導性調節系によって制御され得、それにより産生物の発現を必要に応じて制御する。発現カセットは、論理ゲート、パルス発生器、発振器、スイッチ、またはメモリデバイスとして機能するように設計することができる。制御発現カセットを、プロモーターに連結することができ、それにより発現カセットは、酸素、温度、接触、浸透圧ストレス、膜ストレス、または酸化還元センサーなどの環境センサーとして機能する。
例として、ｎｉｆＬ、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＴ、およびｎｉｆＸ遺伝子は、ｎｉｆ遺伝子クラスターから排除され得る。合成遺伝子は、各アミノ酸配列をコードするＤＮＡをコドンランダム化することによって設計することができる。コドン選択は、コドン使用が未変性遺伝子のコドン使用と可能な限り異なることを指定して行われる。提案された配列は、制限酵素認識部位、トランスポゾン認識部位、反復配列、σ５４およびσ７０プロモーター、潜在的なリボソーム結合部位、ｒｈｏ独立ターミネーターなどの任意の不要な特徴について走査される。合成リボソーム結合部位は、例えば、遺伝子の開始コドン（－６０～＋９０）を取り囲む１５０ｂｐが蛍光遺伝子に融合された蛍光レポータープラスミドを構築することによって、対応する各未変性リボソーム結合部位の強度と一致するように選択される。このキメラは、Ｐｔａｃプロモーターの制御下で発現し、蛍光は、フローサイトメトリーを介して測定することができる。合成リボソーム結合部位を生成するために、１５０ｂｐ（－６０～＋９０）の合成発現カセットを使用したレポータープラスミドのライブラリーが生成される。簡単に言えば、合成発現カセットは、ランダムＤＮＡスペーサー、ＲＢＳライブラリーをコードする縮重配列、および各合成遺伝子のコード配列からなり得る。複数のクローンをスクリーニングして、未変性リボソーム結合部位と最もよく一致した合成リボソーム結合部位を特定する。したがって、未変性オペロンと同じ遺伝子からなる合成オペロンが構築され、機能的相補性について試験される。合成オペロンのさらなる例示的な説明は、ＵＳ２０１４／０３２９３２６に提供されている。
細菌種
本明細書に開示される方法および組成物において有用な微生物は、任意の供給源から入手され得る。場合によっては、微生物は、細菌、古細菌、原生動物、または真菌であり得る。本開示の微生物は、窒素固定微生物、例えば、窒素固定細菌、窒素固定古細菌、窒素固定真菌、窒素固定酵母、または窒素固定原虫であり得る。本明細書に開示される方法および組成物において有用な微生物は、芽胞形成微生物、例えば芽胞形成細菌であり得る。場合によっては、本明細書に開示される方法および組成物において有用な細菌は、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌であり得る。場合によっては、細菌は、フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅ ｐｈｙｌｕｍ）の内生胞子形成細菌であり得る。場合によっては、細菌は、ジアザトロフであり得る。場合によっては、細菌は、ジアゾ栄養生物でない可能性がある。
本開示の方法および組成物は、例えば、メタンサーモバクター・サーモオートトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）などの古細菌とともに使用することができる。
場合によっては、有用であり得る細菌としては、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス・アシドカルダリウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、バチルス・アシドテレストリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、バチルス・アグリ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｇｒｉ）、バチルス・アイザワイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｉｚａｗａｉ）、バチルス・アルボラクティス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｂｏｌａｃｔｉｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルベイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｖｅｉ）、バチルス・アミノグルコシディカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｉｎｏｇｌｕｃｏｓｉｄｉｃｕｓ）、バチルス・アミノボランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ）、バチルス・アミロリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）（パエニバシラス・アミロリティカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）としても知られる）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・アネウリノリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）、バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）、バチルス・アゾトフォーマンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）、バチルス・バディウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）（同義語：バチルス・エンドリトモス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｅｎｄｏｒｈｙｔｈｍｏｓ）、バチルス・メドゥサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｄｕｓａ））、バチルス・キチノスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｉｔｉｎｏｓｐｏｒｕｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・エンドパラシチカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｅｎｄｏｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）、バチルス・ファスティディオスス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｓｔｉｄｉｏｓｕｓ）、バチルス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・クルスターキ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｕｒｓｔａｋｉ）、バチルス・ラクチコラ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｃｏｌａ）、バチルス・ラクチモルバス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｍｏｒｂｕｓ）、バチルス・ラクチス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、バチルス・ラテロスポラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）（ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）としても知られる）、バチルス・ロータス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンチモルブス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｉｍｏｒｂｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・マロカヌス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｒｏｃｃａｎｕｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・メチエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｉｅｎｓ）、バチルス・ミコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バチルス・ナットー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔｔｏ）、バチルス・ネマトキダ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎｅｍａｔｏｃｉｄａ）、バチルス・ニグリフィカンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎｉｇｒｉｆｉｃａｎｓ）、バチルス・ニグルム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎｉｇｒｕｍ）、バチルス・パントテンチカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｎｔｏｔｈｅｎｔｉｃｕｓ）、バチルス・ポピリエ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌａｅ）、バチルス・サイクロサッカロリチカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｙｃｈｒｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・シアメンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉａｍｅｎｓｉｓ）、バチルス・スミティ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ）、バチルス・スファエリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バチルス・ウニフラゲラツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｕｎｉｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ）、ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、ブレビバチルス・ブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ブレビバチルス・ラテロスポルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）（以前はバチルス・ラテロスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ））、クロモバクテリウム・スプトスガエ（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｂｔｓｕｇａｅ）、デルフチア・アシドボランス（Ｄｅｌｆｔｉａ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、リソバクテル・アンティビオティクス（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）、リソバクテル・エンジモゲネス（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ）、パエニバチルス・アルベイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｖｅｉ）、パエニバチルス・ポリミクサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）、パエニバチルス・ポピリアエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）（以前はバチルス・ポピリアエ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅ））、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、パスツリア・ペネトランス（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）（以前はバチルス・ペネトランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ））、パスツリア・ウスガエ（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ ｕｓｇａｅ）、ペクトバクテリウム・カロトボラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）（以前はエルウィニア・カロトボラム（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ））、シュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・アウレオファキエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）（以前はバークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）として知られる）、シュードモナス・クロロラピス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・プロラディクス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｒｏｒａｄｉｘ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）、セラチア・エントモフィラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、ストレプトマイセス・コロムビエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｌｏｍｂｉｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・ガルブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇａｌｂｕｓ）、ストレプトマイセス・ゴシキエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｏｓｈｉｋｉｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・グリセオビリディス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｖｉｒｉｄｉｓ）、ストレプトマイセス・ラベンジュレ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）、ストレプトマイセス・プラシヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒａｓｉｎｕｓ）、ストレプトマイセス・サラケティクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓａｒａｃｅｔｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・ベネズエラエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）、ザントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、ゼノラブダス・ルミネスケンス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）、ゼノラブダス・ネマトフィラ（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａ）、ロドコッカス・グロベルルス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｇｌｏｂｅｒｕｌｕｓ）ＡＱ７１９（ＮＲＲＬ受託番号Ｂ－２１６６３）、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＡＱ１７５（ＡＴＣＣ受託番号５５６０８）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＡＱ １７７（ＡＴＣＣ受託番号５５６０９）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＡＱ１７８（ＡＴＣＣ受託番号５３５２２）、およびストレプトマイセス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）株ＮＲＲＬ受託番号Ｂ－３０１４５が挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、細菌は、アゾトバクター・クロオコッカム（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ）、メタノサルシナ・バルケリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ）、クレシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｒｏｉｄｅｓ）、ロドバクター・カプスラータス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ロドバクター・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｂｃｔｅｒ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドスピリラム・ルブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ）、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）、またはリゾビウム・エトリー（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｔｌｉ）であり得る。
場合によっては、細菌は、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）の種、例えばクロストリジウム・パストゥリアヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）であり得る。
場合によっては、本開示の方法および組成物で使用される細菌は、シアノバクテリアであり得る。シアノバクテリア属の例としては、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）（例えば、Ａｎａｇａｅｎａ種ＰＣＣ７１２０）、ネンジュモ属（Ｎｏｓｔｏｃ）（例えば、ノストック・パンクテフォルメ（Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ））、またはシネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）（例えば、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ種ＰＣＣ６８０３）が挙げられる。
場合によっては、本開示の方法および組成物で使用される細菌は、クロロビウム属（Ｃｈｌｏｒｏｂｉ）、例えばクロロビウム・テピダム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ）に属し得る。
場合によっては、本開示の方法および組成物で使用される微生物は、既知のＮｉｆＨ遺伝子に相同な遺伝子を含み得る。既知のＮｉｆＨ遺伝子の配列は、例えば、Ｚｅｈｒ ｌａｂ ＮｉｆＨデータベース、（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗｚｅｈｒ．ｐｍｃ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｎｉｆＨ＿Ｄａｔａｂａｓｅ＿Ｐｕｂｌｉｃ／、２０１４年４月４日）またはＢｕｃｋｌｅｙ ｌａｂ ＮｉｆＨデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｓｓ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ／ｆａｃｕｌｔｙ／ｂｕｃｋｌｅｙ／ｎｉｆｈ．ｈｔｍおよびＧａｂｙ，Ｊｏｈｎ Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，ａｎｄ Ｄａｎｉｅｌ Ｈ．Ｂｕｃｋｌｅｙ．″Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｌｉｇｎｅｄ ｎｉｆＨ ｇｅｎｅ ｄａｔａｂａｓｅ：ａ ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ－ｆｉｘｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ．″Ｄａｔａｂａｓｅ ２０１４（２０１４）：ｂａｕ００１．）に見られ得る。場合によっては、本開示の方法および組成物で使用される微生物は、Ｚｅｈｒ ｌａｂ ＮｉｆＨデータベースからの配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９６％、９８％、９９％、または９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする配列を含み得る（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗｚｅｈｒ．ｐｍｃ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｎｉｆＨ＿Ｄａｔａｂａｓｅ＿Ｐｕｂｌｉｃ／、２０１４年４月４日）。場合によっては、本開示の方法および組成物で使用される微生物は、Ｂｕｃｋｌｅｙ ｌａｂ ＮｉｆＨデータベースからの配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９６％、９８％、９９％、または９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする配列を含み得る（Ｇａｂｙ， Ｊｏｈｎ Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ， ａｎｄ Ｄａｎｉｅｌ Ｈ． Ｂｕｃｋｌｅｙ．″Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｌｉｇｎｅｄ ｎｉｆＨ ｇｅｎｅ ｄａｔａｂａｓｅ：ａ ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ－ｆｉｘｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ．″Ｄａｔａｂａｓｅ ２０１４（２０１４）：ｂａｕ００１．）。
本明細書に開示される方法および組成物において有用な微生物は、未変性植物の表面または組織から微生物を抽出すること、種を粉砕して微生物を分離すること、多様な土壌試料に種子を植え、組織から微生物を回収すること、または植物に外因性微生物を接種し、どの微生物が植物組織に現れるかを決定することによって得ることができる。植物組織の非限定的な例には、種子、苗、葉、切穂、植物、球根、または塊茎が含まれる。場合によっては、細菌は、種子から分離される。試料を処理するためのパラメーターを変化させて、根粒菌、着生植物、またはエンドファイトなどの異なる種類の関連微生物を分離することができる。細菌は、第１の植物から最初に分離する代わりに、環境菌株コレクションなどのリポジトリから調達することもできる。微生物は、分離された微生物のゲノムをシーケンシングすること、植物体の群集の構成をプロファイリングすること、群集または分離された微生物のトランスクリプトーム機能を特徴付けること、または選択培地もしくは表現型培地（例えば、窒素固定もしくはリン酸塩可溶化表現型）を使用して微生物の特徴をスクリーニングすることによって遺伝子型および表現型を決定することができる。選択された候補株または集団は、配列データ、表現型データ、植物データ（例えば、ゲノム、表現型、および／もしくは収量データ）、土壌データ（例えば、ｐＨ、Ｎ／Ｐ／Ｋ含有量、および／もしくはバルク土壌生物群集）、またはこれらの任意の組み合わせを介して入手することができる。
本明細書に記載される細菌および細菌を産生する方法は、損傷を与える植物防御反応を誘導することなく、葉表面、根表面、または植物組織内で効率的に自己増殖することができる細菌、または植物防御応答に耐性の細菌に適用することができる。本明細書に記載の細菌は、植物組織抽出物または葉の表面洗浄物を、窒素を添加していない培地で培養することによって分離することができる。しかしながら、細菌は培養不可能であり得る、すなわち、当該技術分野で既知の標準的な方法を使用して培養可能であることが知られていないか、または培養が困難であり得る。本明細書に記載の細菌は、エンドファイトまたは着生植物または植物根圏に生息する細菌（根圏細菌）であり得る。遺伝的変異を導入するステップ、複数の植物に曝露するステップ、および形質が改良された植物から細菌を分離するステップを１回以上（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２５回、またはそれ以上）繰り返した後に得られる細菌は、内生性、着生性、または根圏性であり得る。エンドファイトは、病気の症状を引き起こしたり、共生構造の形成を誘発したりすることなく植物の内部に侵入する生物であり、植物の成長を促進し、植物の栄養を改良できるため（例えば、窒素固定を通じて）、農業的に興味深い。細菌は、種子伝染性エンドファイトであり得る。種子伝染性エンドファイトには、草または植物の種子に関連または由来する細菌、例えば成熟、乾燥した損傷のない（例えば、割れ、目に見える真菌感染、または未成熟の発芽がない）種子に見られる種子伝染性細菌エンドファイトが含まれる。種子伝染性細菌エンドファイトは、種子の表面に関連または由来し得るか、あるいはさらに、（例えば、表面滅菌された種子の）内部種子区画に関連または由来し得る。場合によっては、種子伝染性細菌エンドファイトは、植物組織内、例えば、種子の内部で複製することができる。また、場合によっては、種子伝染性細菌エンドファイトは、乾燥に耐えることができる。
本開示の方法に従って分離された、または本開示の方法もしくは組成物で使用される細菌は、複数の異なる細菌分類群を組み合わせて含むことができる。例として、細菌としては、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）（例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ヘルバスピリラム（Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、ラーニア（Ｒａｈｎｅｌｌａ）、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、アゾリゾビウム（Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、デュガネラ（Ｄｕｇａｎｅｌｌａ）、デルフチア（Ｄｅｌｆｔｉａ）、ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｎ）、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）およびハロモナス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ））、フィルミクテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、パエニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、およびアセトバクテリウム（Ａｃｅｔａｂａｃｔｅｒｉｕｍ））、ならびにアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）（例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄａｃｏｃｃｕｓ）、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびクルトバクテリウム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ））を挙げることができる。本開示の方法および組成物で使用される細菌は、２つ以上の種の窒素固定細菌共同体を含み得る。場合によっては、細菌共同体の１つ以上の細菌種が、窒素固定可能であり得る。場合によっては、細菌共同体の１つ以上の種が、他の細菌が窒素を固定する能力を促進または強化し得る。窒素を固定する細菌および他の細菌が窒素を固定する能力を強化する細菌は、同じでも異なっていてもよい。いくつかの例では、細菌株は、異なる細菌株と組み合わせた場合、またはある特定の細菌共同体で窒素を固定することができても、単一培養では窒素を固定できない場合がある。窒素固定細菌共同体に見られ得る細菌属の例には、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、およびＢａｃｉｌｌｕｓが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に開示された方法によって産生され得る細菌には、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）ｓｐ．、およびＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．が含まれる。場合によっては、細菌は、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびシノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）からなる群から選択することができる。場合によっては、細菌は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属またはＲａｈｎｅｌｌａ属であり得る。場合によっては、細菌は、フランキア（Ｆｒａｎｋｉａ）属またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属であり得る。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌の例としては、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｉｌｉｃｕｍ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉが挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、細菌は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、例えば、パエニバチルス・アゾトフィクサンス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｚｏｔｏｆｉｘａｎｓ）、パエニバチルス・ボレアリス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｏｒｅａｌｉｓ）、パエニバチルス・デュラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｕｒｕｓ）、パエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｖｅｉ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、パエニバチルス・キャンピナセンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｍｐｉｎａｓｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・チベンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｉｂｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・グルカノリティカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｕｃａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）、パエニバチルス・イリノイセンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｌｌｉｎｏｉｓｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・ラルバエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｒｖａｅ）ｓｕｂｓｐ． Ｌａｒｖａｅ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｒｖａｅ ｓｕｂｓｐ． プルビファシエンス（Ｐｕｌｖｉｆａｃｉｅｎｓ）、パエニバチルス・ラウタス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ、パエニバチルス・マッカリエンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｑｕａｒｉｅｎｓｉｓ）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｑｕａｒｉｅｎｓｉｓ、パエニバチルス・パブリ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｂｕｌｉ）、パエニバチルス・ペオリアエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｏｒｉａｅ）、またはＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａであり得る。
いくつかの例では、本開示の方法に従って分離された細菌は、以下の分類群のうちの１つ以上のメンバーであり得る：アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、アシドチオバチルス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシドボラックス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）、アシドボラズ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｚ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アクチノプラネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）、アドレクルーツィア（Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ）、アエロコッカス（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、アフピア（Ａｆｉｐｉａ）、アグロマイセス（Ａｇｒｏｍｙｃｅｓ）、アンキロバクター（Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、アトポスティペス（Ａｔｏｐｏｓｔｉｐｅｓ）、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、ブデロビブリオ（Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ）、ベイエリンキア（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ）、ボセア（Ｂｏｓｅａ）、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレバンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｈａｌｏｒｅｄｉｖｉｖｕｓ、カウロバクター（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、セルビブリオ（Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ）、クリセオバクテリウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、コラリオマルガリータ（Ｃｏｒａｌｉｏｍａｒｇａｒｉｔａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）、Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、カービバクター（Ｃｕｒｖｉｂａｃｔｅｒ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｄｅｌｆｔｉａ、デセムジア（Ｄｅｓｅｍｚｉａ）、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）、ドクドネラ（Ｄｏｋｄｏｎｅｌｌａ）、ディエラ（Ｄｙｅｌｌａ）、エンヒドロバクター（Ｅｎｈｙｄｒｏｂａｃｔｅｒ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ／シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、エキシグオバクテリウム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フェログロバス（Ｆｅｒｒｏｇｌｏｂｕｓ）、フィリモナス（Ｆｉｌｉｍｏｎａｓ）、フィネゴルディア（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ）、フラビソリバクター（Ｆｌａｖｉｓｏｌｉｂａｃｔｅｒ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フリゴリバクテリウム（Ｆｒｉｇｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グルコナセトバクター（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）、ハロバクラム（Ｈａｌｏｂａｃｕｌｕｍ）、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ、ハロシンプレックス（Ｈａｌｏｓｉｍｐｌｅｘ）、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、ハイメノバクター（Ｈｙｍｅｎｏｂａｃｔｅｒ）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、コクリア（Ｋｏｃｕｒｉａ）、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、レクレシア（Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ）、レントジア（Ｌｅｎｔｚｅａ）、ルテイバクター（Ｌｕｔｅｉｂａｃｔｅｒ）、ルテイモナス（Ｌｕｔｅｉｍｏｎａｓ）、マッシリア（Ｍａｓｓｉｌｉａ）、メソリゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、マイクロビルガ（Ｍｉｃｒｏｖｉｒｇａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、オセアニバクラム（Ｏｃｅａｎｉｂａｃｕｌｕｍ）、オクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）、オキバクテリウム（Ｏｋｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、オリゴトロファ（Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ）、オリジフムス（Ｏｒｙｚｉｈｕｍｕｓ）、オキサロファガス（Ｏｘａｌｏｐｈａｇｕｓ）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、パントエア（Ｐａｎｔｅｏａ）、Ｐａｎｔｏｅａ、ペロモナス（Ｐｅｌｏｍｏｎａｓ）、ペルルシジバカ（Ｐｅｒｌｕｃｉｄｉｂａｃａ）、プラチバクター（Ｐｌａｎｔｉｂａｃｔｅｒ）、ポリヌクレオバクター（Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｂａｃｔｅｒ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロピオニシクラバ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｃｌａｖａ）、シュードクラビバクター（Ｐｓｅｕｄｏｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、シュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）、シュードザントモナス（Ｐｓｅｕｄｏｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、サイクロバクター（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ラインハイメラ（Ｒｈｅｉｎｈｅｉｍｅｒａ）、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロセアテレス（Ｒｏｓｅａｔｅｌｅｓ）、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、セバルデラ（Ｓｅｂａｌｄｅｌｌａ）、セディミニバシラス（Ｓｅｄｉｍｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、セディミニバクテリウム（Ｓｅｄｉｍｉｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、シネラ（Ｓｈｉｎｅｌｌａ）、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、シノスポランギウム（Ｓｉｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ）、スフィンゴバクテリウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、スフィンゴピクシス（Ｓｐｈｉｎｇｏｐｙｘｉｓ）、スフィンゴシニセラ（Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｉｃｅｌｌａ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、２５ Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ、ストレノトロホモナス（Ｓｔｒｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、スチギオロブス（Ｓｔｙｇｉｏｌｏｂｕｓ）、スルフリスパエラ（Ｓｕｌｆｕｒｉｓｐｈａｅｒａ）、テイタメラ（Ｔａｔｕｍｅｌｌａ）、テピディモナス（Ｔｅｐｉｄｉｍｏｎａｓ）、サーモモナス（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎａｓ）、チオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、バリオボラックス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ）、ＷＰＳ－２ 属の所属不明（ｇｅｎｅｒａ ｉｎｃｅｒｔａｅ ｓｅｄｉｓ）、ザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、およびジマーマンネラ（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎｅｌｌａ）。
細菌は、土壌、植物、菌類、動物（無脊椎動物を含む）、ならびに湖および川の堆積物、水、生物相を含む他の生物相を含む、あらゆる一般的な陸地環境から；海洋環境、その生物相、および堆積物（例えば、海水、海洋泥、海洋植物、海洋無脊椎動物（例えば、海綿動物）、海洋脊椎動物（例えば、魚））から；陸地および海洋の地圏（レゴリスおよび岩、例えば砕かれた地下の岩、砂、および粘土）；雪氷圏およびその融水；大気（例えば、ろ過された空気中のほこり、雲、および雨のしずく）；都市、産業、および他の人工環境（例えば、コンクリート、道端の側溝、屋根の表面、および路面に蓄積した有機物および鉱物）から得ることができる。
細菌が得られる植物は、１つ以上の望ましい形質を有する植物、例えば、特定の環境またはある特定の目的の条件下で自然に成長する植物であってよい。例として、ある特定の植物は、砂質土壌もしくは高塩分の砂、または極端な温度下、または水がほとんどない状態で自然に成長し得るか、あるいは環境に存在するある特定の害虫または病気に耐性がある可能性があり、特にそれらが、例えば、特定の地理的場所で利用可能な唯一の条件である場合、そのような条件で栽培される商業作物にとって望ましい場合がある。さらなる例として、細菌は、そのような環境で栽培された商業作物から、またはより具体的には、任意の特定の環境で栽培された作物の中で目的の形質を最もよく示す個々の作物植物から、例えば、生理食塩水が制限された土壌で栽培された作物、または深刻な虫害もしくは病気の流行にさらされた作物の中で最も被害の少ない植物、またはある特定の代謝産物および繊維含有量、油含有量等を含む他の化合物の望ましい量を有する植物、または望ましい色、味、もしくは匂いを示す植物から収集することができる。細菌は、目的の植物、または真菌および他の動物および植物の生物相、土壌、水、堆積物、ならびに以前に言及した環境の他の要素を含む、目的の環境で発生する任意の物質から収集することができる。
細菌は、植物組織から分離することができる。この分離は、例えば根、茎、および葉、ならびに植物生殖組織を含む、植物中の任意の適切な組織から起こり得る。例として、植物からの分離のための従来の方法は、典型的に、目的の植物材料の無菌切除（例えば、根または茎の長さ、葉）、適切な溶液（例えば、２％次亜塩素酸ナトリウム）による表面滅菌を含み、その後、植物材料は、微生物の成長のために栄養培地に置かれる。あるいは、表面が滅菌された植物材料は、好適な固体寒天培地（複数可）の表面全体に広がった粉砕植物材料の小片を含む滅菌液体（通常は水）および液体懸濁液で粉砕することができ、これは選択的であってもなくてもよい（例えば、リン源としてフィチン酸のみを含有する）。このアプローチは、分離されたコロニーを形成し、個別に取り除いて栄養培地のプレートを分離し、周知の方法によって単一種にさらに精製することができる細菌に特に有用である。あるいは、植物の根または葉の試料を表面滅菌せず、単に軽く洗浄することができるため、分離プロセスにおいて表面に生息する着生微生物が含まれるか、または植物の根、幹、もしくは葉の小片を寒天培地の表面に押し付けて引き上げ、次いで上記のように個々のコロニーを分離することによって、着生微生物を別々に分離することができる。このアプローチは、例えば、細菌に特に有用である。あるいは、根に付着した少量の土壌を洗い落とすことなく、根を処理することができるため、植物根圏にコロニーを形成する微生物が含まれる。それ以外では、根に付着した土壌を取り除き、希釈し、好適な選択培地および非選択培地の寒天上に広げて、根圏細菌の個々のコロニーを分離することができる。
Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓおよびエンテロバクターサッカリ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｉ）の生物学的に純粋な培養物は、２０１５年７月１４日にアメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）；国際寄託機関）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）に寄託され、それぞれＡＴＴＣ特許寄託指定番号ＰＴＡ－１２２２９３およびＰＴＡ－１２２２９４が割り当てられた。これらの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約および規則（ブダペスト条約）の規定に基づいて行われた。
組成物
本明細書に記載の方法に従って産生された、および／または本明細書に記載のような特性を有する細菌または細菌集団を含む組成物は、液体、泡、または乾燥製品の形態であり得る。いくつかの例では、細菌集団を含む組成物は、乾燥粉末、粉末および水のスラリー、または流動可能な種子処理剤の形態であり得る。
組成物は、連続撹拌タンク反応器、バッチ反応器などのバイオリアクターで、および農場で製造することができる。いくつかの例では、組成物は、水差しなどの容器またはミニバルクで保管することができる。いくつかの例では、組成物は、ボトル、瓶、アンプル、パッケージ、容器、バッグ、ボックス、ビン、封筒、カートン、コンテナ、サイロ、輸送コンテナ、トラックベッド、および／またはケースからなる群から選択される物体内で保管され得る。
組成物を使用して、植物の形質を改良することもできる。いくつかの例では、１つ以上の組成物を種子にコーティングすることができる。いくつかの例では、１つ以上の組成物を苗にコーティングすることができる。いくつかの例では、１つ以上の組成物を種子の表面にコーティングすることができる。いくつかの例では、１つ以上の組成物を種子の表面の上の層としてコーティングすることができる。いくつかの例では、種子にコーティングされる組成物は、液体の形態、乾燥製品の形態、泡の形態、粉末および水のスラリーの形態、または流動性の種子処理剤であり得る。いくつかの例では、１つ以上の組成物は、１つ以上の組成物で種子および／または苗に噴霧、浸漬、コーティング、カプセル化、および／または散布することによって種子および／または苗に適用することができる。いくつかの例では、複数の細菌または細菌集団を、植物の種子および／または苗にコーティングすることができる。いくつかの例では、細菌の組み合わせの少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、または１０以上の細菌は、以下の属：Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、サッカリバチルス（Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ、およびＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓのうちの１つから選択され得る。
いくつかの例では、エンドファイトの組み合わせの少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、または１０以上の細菌および細菌集団は、以下のファミリー：バシラス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、バークホルデリア科（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ）、コマモナス科（Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、フラボバクテリウム科（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、メチルバクテリア科（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、マイクロバクテリウム科（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、パエニバシラス科（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｉｌｅａｅ）、シュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｎａｃｅａｅ）、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）、スフィンゴモナス科（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、キサントモナス科（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、クラドスポリウム科（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉａｃｅａｅ）、グノモニア科（Ｇｎｏｍｏｎｉａｃｅａｅ）、所属不明（Ｉｎｃｅｒｔａｅ ｓｅｄｉｓ）、ラシオスパエリア科（Ｌａｓｉｏｓｐｈａｅｒｉａｃｅａｅ）、ベニアワツブタケ科（Ｎｅｔｒｉａｃｅａｅ）、およびプレオスポラ科（Ｐｌｅｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）のうちの１つから選択される。
いくつかの例では、エンドファイトの組み合わせの少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも夜、少なくとも１０、または１０以上の細菌および細菌集団は、以下のファミリー：Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ、Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｉｌｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｎａｃｅａｅ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉａｃｅａｅ、Ｇｎｏｍｏｎｉａｃｅａｅ、Ｉｎｃｅｒｔａｅ ｓｅｄｉｓ、Ｌａｓｉｏｓｐｈａｅｒｉａｃｅａｅ、Ｎｅｔｒｉａｃｅａｅ、およびＰｌｅｏｓｐｏｒａｃｅａｅのうちの１つから選択される。
組成物の例には、商業的に重要な農作物、例えば、モロコシ、キャノーラ、トマト、イチゴ、大麦、稲、トウモロコシ、および小麦のための種子コーティングが含まれ得る。組成物の例には、トウモロコシ、大豆、キャノーラ、モロコシ、ジャガイモ、稲、野菜、穀物、および油糧種子のための種子コーティングも含まれ得る。本明細書で提供される種子は、遺伝子組み換え生物（ＧＭＯ）、非ＧＭＯ、有機物、または従来のものであり得る。いくつかの例では、組成物は、植物の空中部分に噴霧するか、または植物種子が植えられている溝に挿入する、土壌に散水する、または組成物の懸濁液に根を浸すことによって根に適用することができる。いくつかの例では、組成物は、細胞生存率および宿主植物に人工的に接種してコロニーを形成する能力を維持する好適な方法で脱水されてもよい。細菌種は、１０８～１０１０ＣＦＵ／ｍＬの濃度で組成物中に存在してもよい。いくつかの例では、組成物は、モリブデンイオン、鉄イオン、マンガンイオン、またはこれらのイオンの組み合わせなどの微量金属イオンで補足されてもよい。本明細書に記載の組成物の例におけるイオンの濃度は、約０．１ｍＭ～約５０ｍＭであってよい。組成物のいくつかの例はまた、β－グルカン、カルボキシルメチルセルロース（ＣＭＣ）、細菌の細胞外ポリマー物質（ＥＰＳ）、糖、動物乳、または他の好適な担体などの担体とともに配合されてもよい。いくつかの例では、泥炭または植栽材料を担体として使用することができ、または組成物が生体高分子に封入されている生体高分子を担体として使用することができる。
本明細書に記載の細菌集団を含む組成物は、種子の表面にコーティングされてもよい。したがって、本明細書に記載の１つ以上の細菌でコーティングされた種子を含む組成物もまた企図される。種のコーティングは、細菌集団を多孔性で化学的に不活性な粒状担体と混合することによって形成することができる。あるいは、組成物は、種子が植えられている溝に直接挿入するか、または植物の葉に噴霧するか、または組成物の懸濁液に根を浸すことによって適用することができる。有効量の組成物を使用して、植物の根に隣接する亜土壌領域に生菌成長を定着させるか、または植物の葉に生菌成長を定着させることができる。一般に、有効量は、改良された形質（例えば、望ましいレベルの窒素固定）を有する植物をもたらすのに十分な量である。
本明細書に記載の細菌組成物は、農業的に許容される担体を使用して配合され得る。これらの実施形態に有用な製剤は、粘着付与剤、微生物安定剤、殺菌剤、抗菌剤、防腐剤、安定剤、界面活性剤、抗錯化剤、除草剤、殺線虫剤、殺虫剤、植物成長調節剤、肥料、殺鼠剤、乾燥剤、殺菌剤、栄養素、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含み得る。いくつかの例では、組成物は、貯蔵安定性であり得る。例えば、本明細書に記載の組成物のうちのいずれも、農業上許容される担体（例えば、非天然に存在する肥料などの肥料、非天然に存在する付着剤などの付着剤、および非天然に存在する農薬などの農薬のうちの１つ以上）を含み得る。非天然に存在する付着剤は、例えば、ポリマー、コポリマー、または合成ワックスであり得る。例えば、本明細書に記載のコーティングされた種子、苗、または植物のうちのいずれも、種子コーティング中にそのような農業的に許容される担体を含有し得る。本明細書に記載の組成物または方法のうちのいずれにおいても、農業的に許容される担体は、非天然に存在する化合物（例えば、非天然に存在する肥料、ポリマー、コポリマー、もしくは合成ワックスなどの非天然に存在する付着剤、または非天然に存在する農薬）であり得るか、あるいはそれを含み得る。農業的に許容される担体の非限定的な例を以下に説明する。農業的に許容される担体のさらなる例は、当該技術分野で知られている。
場合によっては、細菌は、農業上許容される担体と混合される。担体は、固体担体または液体担体であり得、ミクロスフェア、粉末、乳濁液等を含む様々な形態であり得る。担体は、増加した安定性、湿潤性、または分散性などの様々な特性を付与するいくつかの担体のうちの任意の１つ以上であってよい。非イオン性もしくはイオン性界面活性剤であり得る天然もしくは合成界面活性剤などの湿潤剤、またはそれらの組み合わせを組成物に含めることができる。油中水型エマルジョンを使用して、分離された細菌を含む組成物を配合することもできる（例えば、米国特許第７，４８５，４５１号を参照）。調製することができる好適な製剤としては、水和剤、顆粒、ゲル、寒天ストリップまたはペレット、増粘剤等、マイクロカプセル化粒子等、液体、例えば水性流動性物質、水性懸濁液、油中水型エマルジョン等が挙げられる。製剤は、穀物または豆類製品、例えば、粉砕された穀物または豆、穀物または豆に由来するブロスまたは小麦粉、デンプン、砂糖、または油を含み得る。
いくつかの実施形態では、農業用担体は、土壌または植物成長培地であってよい。使用できる他の農業用担体には、水、肥料、植物ベースの油、保湿剤、またはそれらの組み合わせが含まれる。あるいは、農業用担体は、珪藻土、ローム、シリカ、アルギン酸塩、粘土、ベントナイト、バーミキュライト、果皮、他の植物および動物製品、または顆粒、ペレット、または懸濁剤を含む組み合わせなどの固体であってもよい。前述の成分のうちのいずれかの混合物も、ペスタ（小麦粉およびカオリン粘土）、寒天、またはローム、砂、もしくは粘土等の小麦粉ベースのペレットなどの担体として企図されている。製剤は、大麦、稲などの細菌の食物源、または種子、植物の部分、サトウキビのバガス、穀物加工からの殻もしくは茎、建設現場のごみからの粉砕された植物材料もしくは木材、紙のリサイクルからのおがくずもしくは小さな繊維、生地、または木を含み得る。
例えば、肥料を使用して、成長の促進を助けるか、または種子、苗、もしくは植物に栄養素を供給することができる。肥料の非限定的な例としては、窒素、リン、カリウム、カルシウム、硫黄、マグネシウム、ホウ素、塩化物、マンガン、鉄、亜鉛、銅、モリブデン、およびセレン（またはその塩）が挙げられる。肥料の追加の例としては、１つ以上のアミノ酸、塩、炭水化物、ビタミン、グルコース、ＮａＣｌ、酵母エキス、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、グリセロール、バリン、Ｌ－ロイシン、乳酸、プロピオン酸、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、ＫＨ酒石酸、キシロース、リキソース、およびレシチンが挙げられる。一実施形態では、製剤は、他の活性剤を物質（例えば、種子の表面）に結合するのを助ける粘着付与剤または付着剤（接着剤と呼ばれる）を含むことができる。そのような薬剤は、細菌を他の化合物（例えば、生物学的でない防除剤）を含み得る担体と組み合わせて、コーティング組成物を生成するのに有用である。そのような組成物は、植物または種子の周りにコーティングを作成して、微生物および他の薬剤と植物または植物部分との接触を維持するのに役立つ。一実施形態では、接着剤は、アルギン酸塩、ガム、デンプン、レシチン、ホルモノネチン、ポリビニルアルコール、ホルモノネチン酸アルカリ、ヘスペレチン、ポリ酢酸ビニル、セファリン、アラビアゴム、キサンタンガム、鉱物油、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、アラビノガラクタン、メチルセルロース、ＰＥＧ ４００、キトサン、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリアクリロニトリル、グリセロール、トリエチレングリコール、酢酸ビニル、ジェランガム、ポリスチレン、ポリビニル、カルボキシメチルセルロース、ガティガム、およびポリオキシエチレン－ポリオキシブチレンブロックコポリマーからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、接着剤は、例えば、カルナバワックス、蜜蝋、チャイニーズワックス、シェラックワックス、スペルマセチワックス、キャンデリラワックス、キャスターワックス、オウリキュリーワックス、および米ぬかワックスなどのワックス、多糖類（例えば、デンプン、デキストリン、マルトデキストリン、アルギン酸塩、およびキトサン）、脂肪、油、タンパク質（例えば、ゼラチンおよびゼイン）、耕作用ゴム、ならびにシェラックであり得る。接着剤は、非天然に存在する化合物、例えば、ポリマー、コポリマー、およびワックスであり得る。例えば、接着剤として使用できるポリマーの非限定的な例としては、ポリ酢酸ビニル、ポリ酢酸ビニルコポリマー、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）コポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルコールコポリマー、セルロース（例えば、エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、およびカルボキシメチルセルロース）、ポリビニルピロリドン、塩化ビニル、塩化ビニリデンコポリマー、リグノスルホン酸カルシウム、アクリル系コポリマー、ポリビニルアクリレート、ポリエチレンオキシド、アシルアミドポリマーおよびコポリマー、ポリヒドロキシエチルアクリレート、メチルアクリルアミドモノマー、ならびにポリクロロプレンが挙げられる。
いくつかの例では、付着剤、抗真菌剤、成長調節剤、および農薬（例えば、殺虫剤）のうちの１つ以上は、（例えば、任意の組み合わせで）非天然に存在する化合物である。農業的に許容される担体の追加の例としては、分散剤（例えば、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルＰＶＰＩＶＡ Ｓ－６３０）、界面活性剤、結合剤、および充填剤が挙げられる。
製剤はまた、界面活性剤を含み得る。界面活性剤の非限定的な例としては、Ｐｒｅｆｅｒ ２８（Ｃｅｎｅｘ）、Ｓｕｒｆ－Ｎ（ＵＳ）、Ｉｎｈａｎｃｅ（Ｂｒａｎｄｔ）、Ｐ－２８（Ｗｉｌｆａｒｍ）、およびＰａｔｒｏｌ（Ｈｅｌｅｎａ）などの窒素－界面活性剤ブレンドが挙げられる。エステル化種油としては、Ｓｕｎ－Ｉｔ ＩＩ（ＡｍＣｙ）、ＭＳＯ（ＵＡＰ）、Ｓｃｏｉｌ（Ａｇｓｃｏ）、Ｈａｓｔｅｎ（Ｗｉｌｆａｒｍ）、およびＭｅｓ－１００（Ｄｒｅｘｅｌ）が挙げられる。オルガノ－シリコーン界面活性剤としては、Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ７７（ＵＡＰ）、Ｓｉｌｉｋｉｎ（Ｔｅｒｒａ）、Ｄｙｎｅ－Ａｍｉｃ（Ｈｅｌｅｎａ）、Ｋｉｎｅｔｉｃ（Ｈｅｌｅｎａ）、Ｓｙｌｇａｒｄ ３０９（Ｗｉｌｂｕｒ－Ｅｌｌｉｓ）、およびＣｅｎｔｕｒｙ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）が挙げられる。一実施形態では、界面活性剤は、０．０１％ ｖ／ｖ～１０％ ｖ／ｖの間の濃度で存在する。別の実施形態では、界面活性剤は、０．１％ ｖ／ｖ～１％ ｖ／ｖの間の濃度で存在する。
ある特定の場合において、製剤は、微生物安定剤を含む。そのような薬剤は、乾燥剤を含むことができ、これは、化合物（複数可）が実際に液体接種剤に対して乾燥効果を有するような濃度で使用されるかどうかにかかわらず、乾燥剤として分類できる任意の化合物または化合物の混合物を含むことができる。そのような乾燥剤は、使用される細菌集団と理想的に適合し、微生物集団が種子への適用を生き延び、乾燥を生き延びる能力を促進するはずである。好適な乾燥剤の例としては、トレハロース、スクロース、グリセロール、およびメチレングリコールのうちの１つ以上が挙げられる。他の好適な乾燥剤としては、非還元糖および糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）が挙げられるが、これらに限定されない。製剤に導入される乾燥剤の量は、重量／容量で約５％～約５０％、例えば、約１０％～約４０％、約１５％～約３５％、または約２０％～約３０％の範囲であり得る。場合によっては、製剤が、殺菌剤、抗菌剤、除草剤、殺線虫剤、殺虫剤、植物成長調節剤、殺鼠剤、殺菌剤、または栄養素などの薬剤を含むことが有利である。いくつかの例では、薬剤は、種子表面伝染性病原体に対する保護を提供する保護剤を含み得る。いくつかの例では、保護剤は、土壌伝染性病原体のある程度の防除を提供することができる。いくつかの例では、保護剤は、主に種子表面で有効であり得る。
いくつかの例では、殺菌剤は、化学的であろうと生物学的であろうと、真菌の成長を阻害するかまたは真菌を殺すことができる化合物または薬剤を含み得る。いくつかの例では、殺菌剤は、静真菌性または殺真菌性であり得る化合物を含み得る。いくつかの例では、殺菌剤は、保護剤、または主に種子表面で有効である薬剤であり、種子表面伝染性病原体に対する保護を提供し、土壌伝染性病原体のある程度の防除を提供する。保護剤殺菌剤の非限定的な例としては、キャプタン、マネブ、チラム、またはフルジオキソニルが挙げられる。
いくつかの例では、殺菌剤は、浸透性殺菌剤であり得、これは、出現する苗に吸収され、宿主植物組織内の真菌を阻害または殺すことができる。種子処理剤に使用される浸透性殺菌剤としては、アゾキシストロビン、カルボシン、メフェノキサム、メタラキシル、チアベンダゾール、トリフロキシストロビン、ならびにジフェノコナゾール、イプコナゾール、テブコナゾール、およびトリチコナゾールを含む様々なトリアゾール殺菌剤が挙げられるが、これらに限定されない。メフェノキサムおよびメタラキシルは、主に水カビ真菌のフハイカビ（Ｐｙｔｈｉｕｍ）およびエキビョウキン（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）を標的にするために使用される。病原菌種の感受性の微妙な違いのため、または殺菌剤の分布または植物の感受性の違いのため、植物種によっては、いくつかの殺菌剤が他のものよりも優先される。いくつかの例では、殺菌剤は、細菌または真菌などの生物的防除剤であり得る。そのような生物は、病原菌に対して寄生性であるか、または菌類を殺すか、それ以外では菌類の成長を妨げることができる毒素または他の物質を分泌し得る。任意のタイプの殺菌剤、特に植物で一般的に使用される殺菌剤は、種子組成物中の防除剤として使用することができる。
いくつかの例では、種子コーティング組成物は、抗菌特性を有する防除剤を含む。一実施形態では、抗菌特性を有する防除剤は、本明細書の他の場所に記載されている化合物から選択される。別の実施形態では、化合物はストレプトマイシン、オキシテトラサイクリン、オキソリン酸、またはゲンタマイシンである。種子コーティング組成物の一部として使用できる抗菌化合物の他の例としては、ジクロロフェンおよびベンジルアルコールヘミホルマール（ＩＣＩのＰｒｏｘｅｌ（登録商標）またはＴｈｏｒ ＣｈｅｍｉｅのＡｃｔｉｃｉｄｅ（登録商標）ＲＳおよびＲｏｈｍ＆ＨａａｓのＫａｔｈｏｎ（登録商標）ＭＫ ２５）、ならびにアルキルイソチアゾリノンおよびベンズイソチアゾリノン（Ｔｈｏｒ ＣｈｅｍｉｅのＡｃｔｉｃｉｄｅ（登録商標）ＭＢＳ）などのイソチアゾリノン誘導体が挙げられる。
いくつかの例では、成長調節剤は、アブシジン酸、アミドクロル、アンシミドール、６－ベンジルアミノプリン、ブラシノライド、ブトラリン、クロルメクアット（クロルメクアットクロリド）、塩化コリン、シクラニリド、ダミノジド、ジケグラック、ジメチピン、２，６－ジメチルプリジン、エテホン、フルメトラリン、フルルプリミドール、フルチアセット、フォルクロルフェヌロン、ジベレリン酸、イナベンフィド、インドール－３－酢酸、マレイン酸ヒドラジド、メフルイジド、メピコート（メピコートクロライド）、ナフタレン酢酸、Ｎ－６－ベンジルアデニン、パクロブトラゾール、プロヘキサジオンホスホロトリチオエート、２，３，５－トリヨード安息香酸、トリネキサパック－エチル、およびウニコナゾールからなる群から選択される。成長調節剤の追加の非限定的な例としては、ブラシノステロイド、サイトカイニン（例えば、キネチンおよびゼアチン）、オーキシン（例えば、インドリル酢酸およびアスパラギン酸インドリルアセチル）、フラボノイドおよびイソフラバノイド（例えば、ホルモノネチンおよびジオスメチン）、フィトアイキシン（例えば、グリセオリン）、およびフィトアレキシン誘導性オリゴ糖（例えば、ペクチン、キチン、キトサン、ポリガラクロン酸、およびオリゴガラクツロン酸）、およびジベレリンが挙げられる。そのような薬剤は、製剤が適用される農業用種子または苗と理想的に適合する（例えば、それは植物の成長または健康に有害であってはならない）。さらに、この薬剤は、理想的には、人間、動物、または産業での使用に安全上の懸念を引き起こさないものである（例えば、安全性の問題がない、または化合物が十分に不安定であるため、植物に由来する商品植物製品に微量の化合物が含まれている）。
線虫拮抗生物防除剤のいくつかの例としては、ＡＲＦ１８；３０ アルツロボトリス（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ）ｓｐｐ．；ケトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）ｓｐｐ．；シリンドロカルポン（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ）ｓｐｐ．；エキソフィラ（Ｅｘｏｐｈｉｌｉａ）ｓｐｐ．；フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）ｓｐｐ．；グリオクラディウム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ）ｓｐｐ．；ヒルステラ（Ｈｉｒｓｕｔｅｌｌａ）ｓｐｐ．；レカニシリウム（Ｌｅｃａｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）ｓｐｐ．；モナクロスポリウム（Ｍｏｎａｃｒｏｓｐｏｒｉｕｍ）ｓｐｐ．；ミロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ）ｓｐｐ．；ネオコスモスポラ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ）ｓｐｐ．；パエシロミセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）ｓｐｐ．；ポコニア（Ｐｏｃｈｏｎｉａ）ｓｐｐ．；スタゴノスポラ（Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ）ｓｐｐ．；のう状樹枝状菌根菌、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐｐ．；パスツリア（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ）ｓｐｐ．、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．；および根圏細菌（Ｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉａ）が挙げられる。特に好ましい線虫拮抗生物防除剤としては、ＡＲＦ１８、アルツロボトリス・オリゴスポラ（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ ｏｌｉｇｏｓｐｏｒａ）、アルツロボトリス・ダクチロイデス（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ ｄａｃｔｙｌｏｉｄｅｓ）、ケトミウム・グロブサム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｇｌｏｂｏｓｕｍ）、シリンドロカルポン・ヘテロネマ（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ ｈｅｔｅｒｏｎｅｍａ）、エキソフィラ・ジェンセルメイ（Ｅｘｏｐｈｉｌｉａ ｊｅａｎｓｅｌｍｅｉ）、エキソフィラ・ピシフィラ（Ｅｘｏｐｈｉｌｉａ ｐｉｓｃｉｐｈｉｌａ）、フザリウム・アスペルギルス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ）、フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）、グリオクラディウム・カテヌラタム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、グリオクラディウム・ロセウム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、グリオクラディウム・ビキセンス（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｖｉｘｅｎｓ）、ヒルステラ・ロシリエンシス（Ｈｉｒｓｕｔｅｌｌａ ｒｈｏｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ヒルステラ・ミネソテンシス（Ｈｉｒｓｕｔｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔｅｎｓｉｓ）、レカニシリウム・レカニ（Ｌｅｃａｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｅｃａｎｉｉ）、モナクロスポリウム・ドレクスレリ（Ｍｏｎａｃｒｏｓｐｏｒｉｕｍ ｄｒｅｃｈｓｌｅｒｉ）、モナクロスポリウム・ゲフィロパグム（Ｍｏｎａｃｒｏｓｐｏｒｉｕｍ ｇｅｐｈｙｒｏｐａｇｕｍ）、ミロテシウム・ベルカリア（Ｍｙｒｏｔｅｈｃｉｕｍ ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ）、ネオコスモスポラ・バシンフェクタ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ）、パエシロミセス・リラシナス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｌｉｌａｃｉｎｕｓ）、ポコニア・クラミドスポリア（Ｐｏｃｈｏｎｉａ ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｉａ）、スタゴノスポラ・ヘテロデラエ（Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａｅ）、スタゴノスポラ・ファセオリ（Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ ｐｈａｓｅｏｌｉ）、のう状樹枝状菌根菌、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ、パスツリア・ソルネイ（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ ｔｈｏｒｎｅｉ）、パスツリア・ニシザワエ（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ ｎｉｓｈｉｚａｗａｅ）、パスツリア・ラモサ（Ｐａｓｔｅｕｒｉａ ｒａｍｏｓａ）、パスツリア・ウサゲ（Ｐａｓｔｒｕｅｉａ ｕｓａｇｅ）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ株Ｇ４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、およびＲｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉａが挙げられる。
栄養素のいくつかの例は、尿素、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、非加圧窒素溶液、アンモニア水、無水アンモニア、チオ硫酸アンモニウム、硫黄被覆尿素、尿素－ホルムアルデヒド、ＩＢＤＵ、ポリマー被覆尿素、硝酸カルシウム、尿素ホルムおよびメチレン尿素を含むが、これらに限定されない窒素肥料、リン肥料（リン酸二アンモニウム、リン酸一アンモニウム、ポリリン酸アンモニウム、濃リン酸三リン酸塩、および重過りん酸石灰など）、およびカリウム肥料（塩化カリウム、硫酸カリウム、カリウム－硫酸マグネシウム、硝酸カリウムなど）からなる群から選択され得る。そのような組成物は、種子被覆組成物内に遊離塩またはイオンとして存在し得る。あるいは、栄養素／肥料を複合化またはキレート化して、長期にわたる徐放を実現することができる。
殺鼠剤のいくつかの例には、２－イソバレリリンダン－１，３－ジオン、４－（キノキサリン－２－イルアミノ）ベンゼンスルホンアミド、α－クロロヒドリン、リン化アルミニウム、アンツー、ヒ素三酸化物、炭酸バリウム、ビスチオセミ、ブロジファクム、ブロマジオロン、ブロメタリン、シアン化カルシウム、クロラロース、クロロファシノン、コレカルシフェロール、クマクロル、クマフリル、クマテトラリル、クリミジン、ジフェナクム、ジフェチアロン、ジファシノン、エルゴカルシフェロール、フロクマフェン、フルオロアセトアミド、フルプロパジン、フルプロパジン塩酸塩、シアン化水素、ヨードメタン、リンダン、リン化マグネシウム、臭化メチル、ノルボルミド、ホサセチム、ホスフィン、リン、ピンドン、亜ヒ酸カリウム、ピリヌロン、シリロサイド、亜ヒ酸ナトリウム、シアン化ナトリウム、フルオロ酢酸ナトリウム、ストリキニーネ、硫酸タリウム、ワルファリン、およびリン化亜鉛からなる物質群から選択されるものが含まれ得る。
液体形態、例えば、溶液または懸濁液では、細菌集団を水または水溶液に混合または懸濁することができる。好適な液体希釈剤または担体には、水、水溶液、石油留分、または他の液体担体が含まれる。
固体組成物は、泥炭、小麦、ふすま、バーミキュライト、粘土、タルク、ベントナイト、珪藻土、フラー土、低温殺菌土壌等の適切に分割された固体担体の中および上に細菌集団を分散させることによって調製することができる。そのような製剤を水和剤として使用する場合、非イオン性、アニオン性、両性、またはカチオン性の分散剤および乳化剤などの生体適合性のある分散剤を使用することができる。
配合時に使用される固体担体には、例えば、カオリンクレー、パイロフィライト、ベントナイト、モンモリロナイト、珪藻土、酸性白土、バーミキュライト、およびパーライトなどの鉱物担体、ならびに硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素、塩化アンモニウム、および炭酸カルシウムなどの無機塩が含まれる。また、小麦粉、小麦ふすま、米ぬかなどの有機微粉末を使用してもよい。液体担体には、大豆油および綿実油などの植物油、グリセロール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール等が含まれる。
作物への細菌集団の適用
本明細書に記載の細菌または細菌集団の組成物は、溝、タルクで、または種子処理剤として適用することができる。組成物は、バルク、ミニバルク、バッグ、またはタルクで種子包装体に適用することができる。
プランターは、処理された種子を植え、従来の方法、ツインロー、または耕起を必要としない方法に従って作物を育てることができる。種子は、制御ホッパーまたは個別ホッパーを使用して分配され得る。種子は、加圧空気を使用して、または手動で分配され得る。種子の配置は、可変速技術を使用して行うことができる。さらに、本明細書に記載の細菌または細菌集団の適用は、可変速技術を使用して適用され得る。いくつかの例では、細菌は、トウモロコシ、大豆、キャノーラ、モロコシ、ジャガイモ、稲、野菜、穀物、偽穀物、および油糧種子の種子に適用され得る。穀物の例としては、大麦、フォニオ、オート麦、パーマー草、ライ麦、パールミレット、モロコシ、スペルト、テフ、ライ小麦、および小麦を挙げることができる。偽穀物の例としては、ブレッドナッツ、ソバ、ガマ、チア、亜麻、アマランス子実、ハンザ、キノア、およびゴマを挙げることができる。いくつかの例では、種子は、遺伝子組み換え生物（ＧＭＯ）、非ＧＭＯ、有機または従来のものであり得る。
マイクロ肥料、ＰＧＲ、除草剤、殺虫剤、および殺菌剤などの添加剤をさらに使用して作物を処理することができる。添加剤の例としては、殺虫剤、殺線虫剤、殺菌剤などの作物保護剤、着色剤、ポリマー、ペレット化剤、プライミング、消毒剤などの強化剤、および接種剤、ＰＧＲ、軟化剤、微量栄養素などの他の薬剤が挙げられる。ＰＧＲは、根の成長、顕花、または茎の伸長に影響を与える天然または合成の植物ホルモンであり得る。ＰＧＲは、オーキシン、ジベレリン、サイトカイニン、エチレン、およびアブシジン酸（ＡＢＡ）を含み得る。
この組成物は、液体肥料と組み合わせて溝に適用することができる。いくつかの例では、液体肥料は、タンクに保持されてもよい。ＮＰＫ肥料は、ナトリウム、リン、およびカリウムの主要栄養素を含有する。
組成物は、植物の成長を促進し、葉の高いクロロフィル含有量を維持し、果実または種子の数を増やし、果実または種子の単位重量を増やすなど、植物の形質を改良することができる。本開示の方法は、様々な望ましい形質のうちの１つ以上を導入または改良するために用いられ得る。導入または改良され得る形質の例としては、根のバイオマス、根の長さ、高さ、苗条の長さ、葉の数、水の利用効率、全体のバイオマス、収量、果実のサイズ、粒径、光合成率、干ばつ耐性、耐熱性、塩耐性、低窒素ストレスに対する耐性、窒素利用効率、線虫ストレスに対する耐性、真菌性病原体に対する耐性、細菌性病原体に対する耐性、ウイルス性病原体に対する耐性、代謝産物のレベル、代謝産物のレベルの調整、プロテオームの発現が挙げられる。高さ、全体のバイオマス、根および／または苗条のバイオマス、種子の発芽、苗の生存、光合成効率、蒸散率、種子／果実の数または質量、植物の穀粒または果実の収量、葉のクロロフィル含有量、光合成率、根の長さ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、望ましい形質を使用して成長を測定し、同一の条件下で成長した参照農業植物（例えば、形質が導入および／または改良されていない植物）の成長速度と比較することができる。いくつかの例では、高さ、全体のバイオマス、根および／または苗条のバイオマス、種子の発芽、苗の生存、光合成効率、蒸散率、種子／果実の数または質量、植物の穀粒または果実の収量、葉のクロロフィル含有量、光合成率、根の長さ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、望ましい形質を使用して成長を測定し、同様の条件下で成長した参照農業植物（例えば、形質が導入および／または改良されていない植物）の成長速度と比較することができる。
宿主植物に対する農業的形質には、前述の種子処理製剤を含まない種子から成長した同質遺伝子系統植物と比較して、油含有量の変化、タンパク質含有量の変化、種子炭水化物組成の変化、種子油組成の変化、種子タンパク質組成の変化、化学的耐性、耐寒性、遅延老化、耐病性、干ばつ耐性、穂の重量、成長向上、健康強化４、熱耐性、除草剤耐性、草食動物耐性、窒素固定の向上、窒素利用の向上、根の構造の改良、水利用効率の向上、バイオマスの増加、根の長さの増加、種子重量の増加、苗条の長さの増加、収量の増加、水分制限条件下での収量の増加、穀粒の質量、穀粒の含水率、金属耐性、穂数、穂ごとの穀粒数、鞘の数、栄養強化、病原菌耐性、害虫耐性、光合成能力の向上、耐塩性、緑の維持、活力の向上、成熟種子の乾燥重量の増加、成熟種子の新鮮重量の増加、植物あたりの成熟種子の数の増加、クロロフィル含有量の増加、植物あたりの鞘の数の増加、植物あたりの鞘の長さの増加、植物あたりのしおれた葉の数の減少、植物あたりの深刻にしおれた葉の数の減少、および植物あたりのしおれていない葉の数の増加、代謝産物のレベルの検出可能な変調、転写産物のレベルの検出可能な調整、およびプロテオームの検出可能な調整が含まれ得るが、これらに限定されない。
場合によっては、植物は、接種された植物の植物要素と同じ種の植物から分離された細菌または細菌集団を接種される。例えば、ある種のＺｅａ ｍａｙｓ（トウモロコシ）に通常見られる細菌または細菌集団は、その自然の状態では当該細菌および細菌集団を欠く別の種のＺｅａ ｍａｙｓの植物の植物要素と関連している。一実施形態では、細菌および細菌集団は、接種された植物の植物要素としての関連する種の植物に由来する。例えば、ジーア・ディプロペレンニス・イルティス（Ｚｅａ ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉｓ Ｉｌｔｉｓ）等（ディプロペレンニアル・テオシント（ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉａｌ ｔｅｏｓｉｎｔｅ））に通常見られる細菌および細菌集団は、Ｚｅａ ｍａｙｓ（トウモロコシ）に適用される、またはその逆である。場合によっては、植物は、接種された植物の植物要素に対して異種である細菌および細菌集団を接種される。一実施形態では、細菌および細菌集団は、別の種の植物に由来する。例えば、双子葉植物で通常見られる細菌および細菌集団は、単子葉植物に適用される（例えば、大豆由来の細菌および細菌集団をトウモロコシに接種する）、またはその逆である。他の場合では、植物に接種される細菌および細菌集団は、接種されている植物の関連種に由来する。一実施形態では、細菌および細菌集団は、関連する分類群、例えば、関連する種に由来する。別の種の植物は、農業植物であり得る。別の実施形態では、細菌および細菌集団は、任意の宿主植物要素に接種される設計された組成物の一部である。
いくつかの例では、細菌または細菌集団は外因性であり、細菌および細菌集団は、接種された植物とは異なる植物から分離される。例えば、一実施形態では、細菌または細菌集団は、接種された植物と同じ種の異なる植物から分離することができる。場合によっては、細菌または細菌集団は、接種された植物に関連する種から分離することができる。
いくつかの例では、本明細書に記載の細菌および細菌集団は、ある組織タイプから別の組織タイプに移動することができる。例えば、種子の外側にコーティングした後の植物の成熟組織内の細菌および細菌集団の本発明の検出および分離は、種子の外側から成熟している植物の栄養組織に移動するそれらの能力を実証する。したがって、一実施形態では、細菌の集団および細菌集団は、種子の外部から植物の栄養組織に移動することができる。一実施形態では、植物の種子にコーティングされた細菌および細菌集団は、種子が栄養状態に発芽すると、植物の異なる組織に局在化することができる。例えば、細菌および細菌集団は、根、不定根、種子５根、根毛、苗条、葉、花、つぼみ、房、分裂組織、花粉、雌しべ、子房、雄しべ、果実、走根、根茎、根粒、塊茎、毛状突起、孔辺細胞、排水組織、花弁、がく片、苞穎、花軸、維管束形成層、師部、および木部を含む、植物の組織のうちのいずれか１つに局在化することができる。一実施形態では、細菌および細菌集団は、植物の根および／または根毛に局在化することができる。別の実施形態では、細菌および細菌集団は、光合成組織、例えば、植物の葉および苗条に局在化することができる。他の場合では、細菌および細菌集団は、植物の維管束組織、例えば、木部および師部に局在化している。さらに別の実施形態では、細菌および細菌集団は、植物の生殖組織（花、花粉、雌しべ、子房、雄しべ、果実）に局在化することができる。別の実施形態では、細菌および細菌集団は、植物の根、苗条、葉、および生殖組織に局在化することができる。さらに別の実施形態では、細菌および細菌集団は、植物の果実または種子組織にコロニーを形成する。さらに別の実施形態では、細菌および細菌集団は、それが植物の表面に存在するように（すなわち、その存在が植物の外部または植物のエピスフィアに検出可能に存在するように）、植物にコロニーを形成することができる。さらに他の実施形態では、細菌および細菌集団は、植物の実質的にすべて、またはすべての組織に局在化することができる。ある特定の実施形態では、細菌および細菌集団は、植物の根に局在化されない。他の場合では、細菌および細菌集団は、植物の光合成組織に局在化されない。
組成物の有効性は、作物の相対的成熟度または作物暖房ユニット（ＣＨＵ）を測定することによって評価することもできる。例えば、細菌集団をトウモロコシに適用することができ、トウモロコシ粒の相対的成熟度またはトウモロコシ粒が最大重量にある時間に従って、トウモロコシの成長を評価することができる。作物暖房ユニット（ＣＨＵ）を使用して、トウモロコシの成熟度を予測することもできる。ＣＨＵは、作物の成長に関する１日の最高気温を測定することによって蓄熱量を決定する。
例では、細菌は、根、不定根、種子根、根毛、苗条、葉、花、つぼみ、房、分裂組織、花粉、雌しべ、子房、雄しべ、果実、走根、根茎、根粒、塊茎、毛状突起、孔辺細胞、排水組織、花弁、がく片、苞穎、花軸、維管束形成層、師部、および木部を含む、植物の組織のうちのいずれか１つに局在化することができる。別の実施形態では、細菌または細菌集団は、光合成組織、例えば、植物の葉および苗条に局在化することができる。他の場合では、細菌および細菌集団は、植物の維管束組織、例えば、木部および師部に局在化している。さらに別の実施形態では、細菌または細菌集団は、植物の生殖組織（花、花粉、雌しべ、子房、雄しべ、または果実）に局在化することができる。別の実施形態では、細菌および細菌集団は、植物の根、苗条、葉、および生殖組織に局在化することができる。別の実施形態では、細菌または細菌集団は、植物の果実または種子組織にコロニーを形成する。さらに別の実施形態では、細菌または細菌集団は、植物の表面に存在するように植物にコロニーを形成することができる。別の実施形態では、細菌または細菌集団は、植物の実質的にすべて、またはすべての組織に局在化することができる。ある特定の実施形態では、細菌または細菌集団は、植物の根に局在化されない。他の場合では、細菌および細菌集団は、植物の光合成組織に局在化されない。
作物に適用される細菌組成物の有効性は、植栽密度、播種力、根の強さ、干ばつ耐性、植物の高さ、乾燥、および試験重量を含むがこれらに限定されない作物の成長の様々な特徴を測定することによって評価することができる。
植物種
本明細書に記載の方法および細菌は、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ）属、イネ（Ｏｒｙｚａ）属、トウモロコシ（Ｚｅａ）属、およびムギ（Ｔｒｉｔｉｃｅａｅ）属などの様々な植物のうちのいずれにも適している。好適な植物の他の非限定的な例には、コケ、地衣類、および藻類が含まれる。場合によっては、これらの植物は、食用作物、繊維作物、油糧作物、林業またはパルプおよび製紙産業の植物、バイオ燃料産生用の原料、および／または観賞植物などの経済的、社会的、および／または環境的価値を有する。いくつかの例では、植物を使用して、穀物、小麦粉、デンプン、シロップ、ミール、油、フィルム、包装、栄養補助食品、パルプ、動物飼料、魚の飼料、工業用化学品のバルク材料、シリアル製品、人間用加工食品、砂糖、アルコール、および／またはタンパク質などの経済的に価値のある製品を生産することができる。作物植物の非限定的な例には、トウモロコシ、稲、小麦、大麦、モロコシ、キビ、オート麦、ライ麦ライ小麦、そば、スイートコーン、サトウキビ、タマネギ、トマト、イチゴ、およびアスパラガスが含まれる。
いくつかの例では、本明細書に開示される方法および組成物を使用して取得または改良され得る植物は、農業、園芸、バイオ燃料分子および他の化学物質の産生のためのバイオマス、および／または林業にとって重要または興味深い植物を含み得る。これらの植物のいくつかの例としては、パイナップル、バナナ、ココナッツ、ユリ、グラスピー、アルファルファ、トマティロ、メロン、ひよこ豆、チコリ、クローバー、ケール、レンズ豆、大豆、タバコ、ジャガイモ、サツマイモ、大根、キャベツ、セイヨウアブラナ、リンゴの木、ブドウ、綿、ヒマワリ、シロイヌナズナ、キャノーラ、柑橘類（オレンジ、マンダリン、キンカン、レモン、ライム、グレープフルーツ、タンジェリン、タンジェロ、シトロン、およびザボンを含む）、コショウ、豆、レタス、パニクム・ウィルガツム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ）（スイッチ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）（モロコシ、スーダン）、ジャイアントミスカンサス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）（ススキ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）ｓｐ．（エネルギー用サトウキビ）、バルサムポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ）（ポプラ）、Ｚｅａ ｍａｙｓ（トウモロコシ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）（大豆）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）（キャノーラ）、パンコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）（小麦）、ゴシピウム・ヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）（綿）、オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）（米）、ヘリアンサス・アヌス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）（ヒマワリ）、メディカゴ・サティバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖ）ａ（アルファルファ）、ベータ・バルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）（テンサイ）、ペニセツム・グラウクム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ）（パールミレット）、キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ）ｓｐｐ．、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ）ｓｐｐ．、ススキ（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）ｓｐｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．、エリアンサス（Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ）ｓｐｐ．、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ）ｓｐｐ．、セカル・セレアレ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）（ライ麦）、サリックス（Ｓａｌｉｘ）ｓｐｐ．（柳）、ユーカリプタス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）ｓｐｐ．（ユーカリ）、ライコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ）ｓｐｐ．（小麦－２５小麦Ｘライ麦）、バンブー（Ｂａｍｂｏｏ）、カルサムス・チンクトリウス（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）（ベニバナ）、ナンヨウアブラギリ（Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ）（ヤトロファ）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（キャスター）、ギニアアブラヤシ（Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）（オイルヤシ）、ナツメヤシ（Ｐｈｏｅｎｉｘ ｄａｃｔｙｌｉｆｅｒａ）（デーツヤシ）、アルコントフェニックス・カンニンガミアナ（Ａｒｃｈｏｎｔｏｐｈｏｅｎｉｘ ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｉａｎａ）（キングヤシ）、サイアグラス・ロマンゾフィアナ（Ｓｙａｇｒｕｓ ｒｏｍａｎｚｏｆｆｉａｎａ）（クイーンヤシ）、リヌム・ウシタチッシマム（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）（亜麻）、ブラシッカ・ジュンセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）、マニホット・エスクレンタ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）（カッサヤ）、リコペルシコン・エクスレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）（トマト）、ラクツカ・サティバ（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｌｉｖａ）（レタス）、ムサ・パラディシアカ（Ｍｕｓａ ｐａｒａｄｉｓｉａｃａ）（バナナ）、ソラヌム・ツベロスム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）（ジャガイモ）、ブラシカ・オレラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）（ブロッコリー、カリフラワー、芽キャベツ）、チャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）（茶）、フラガリア・アナナッサ（Ｆｒａｇａｒｉａ ａｎａｎａｓｓａ）（イチゴ）、テオブロマ・カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）（ココア）、アラビカコーヒーノキ（Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ）（コーヒー）、ヴィティス・ヴィニフェラ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）（ブドウ）、アナナス・コモサス（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ）（パイナップル）、カプシカム・アンニュウム(Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｍ）（トウガラシおよびピーマン）、アリウム・セパ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）（タマネギ）、キューカミス・メロ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）（メロン）、キューカミス・サティバ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）（キュウリ）、セイヨウカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍａｘｉｍａ）（カボチャ）、ニホンカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍｏｓｃｈａｔａ）（カボチャ）、スピナシア・オレラセア（Ｓｐｉｎａｃｅａ ｏｌｅｒａｃｅａ）（ホウレンソウ）、シトルラス・ラナタス（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ）（スイカ）、アベルモスクス・エスクレンタス（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）（オクラ）、ソラナム・メロンゲナ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）（ナス）、パパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）（ケシ）、オニゲシ（Ｐａｐａｖｅｒ ｏｒｉｅｎｔａｌｅ）、ヨーロッパイチイ（Ｔａｘｕｓ ｂａｃｃａｔａ）、太平洋イチイ（Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）、クソニンジン（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ）、カンナビス・サティバ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｌｉｖａ）、カンレンボク（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ ａｃｕｍｉｎａｔｅ）、ニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ）、ニチニチソウ（Ｖｉｎｃａ ｒｏｓｅａ）、キナノキ（Ｃｉｎｃｈｏｎａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、イヌサフラン（Ｃｏｉｃｈｉｃｕｍ ａｕｔｕｍｎａｌｅ）、カリフォルニアバイケイソウ（Ｖｅｒａｔｒｕｍ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、ジギタリスラナタ（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｌａｎａｔａ）、ジギタリス・パープレア（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｐｕｒｐｕｒｅａ）、ヤマノイモ（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ）ｓｐｐ．、アンドログラフィス・パニキュラータ（Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）、ベラドンナ（Ａｔｒｏｐａ ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ）、シロバナヨウシュチョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ ｓｔｏｍｏｎｉｕｍ）、バーベリー（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ）ｓｐｐ．、イヌガヤ（Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ）ｓｐｐ．、シナマオウ（Ｅｐｈｅｄｒａ ｓｉｎｉｃａ）、マオウ（Ｅｐｈｅｄｒａ）ｓｐｐ．、コカノキ（Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ ｃｏｃａ）、マツユキソウ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｗｏｒｎｏｒｉｉ）、ハシリドコロ（Ｓｃｏｐｏｌｉａ）ｓｐｐ．、Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ ｓｅｒｒａｔｕｍ（トウゲシバ）、ヒカゲノカズラ（Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ）ｓｐｐ．、インドジャボク（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ）、ラウオルフィア（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ）ｓｐｐ．、サンギナリア・カナデンシス（Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヒヨス（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）ｓｐｐ．、キンセンカ（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、ナツシロギク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）、コレウス・フォルスコリ（Ｃｏｌｅｕｓ ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ）、ナツシロギク（Ｔａｎａｃｅｔｕｍ ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）、パルテニウム・アルゲンタトゥム（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）（グアユール）、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ．）ｓｐｐ．（ゴム）、スペアミント（Ｍｅｎｔｈａ ｓｐｉｃａｔａ）（ミント）、ペパーミント（Ｍｅｎｔｈａ ｐｉｐｅｒｉｔａ）（ミント）、ベニノキ（Ｂｉｘａ ｏｒｅｌｌａｎａ）、アルストロメリア（Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａ ｓｐｐ．）、ロサ（Ｒｏｓａ）ｓｐｐ．（バラ）、ジアンタス・カリオフィルス（Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）（カーネーション）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ）ｓｐｐ．（ペチュニア）、ポインセチア・プルケリマ（Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）（ポインセチア）、ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）（タバコ）、ルピナス・アルバス（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ）（ハウチワマメ）、ユニオラ・パニキュラタ（Ｕｎｉｏｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）（オート麦）、ホルデウム・ブルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）（大麦）、およびロリウム（Ｌｏｌｉｕｍ）ｓｐｐ．（ライ麦）が挙げられる。
いくつかの例では、単子葉植物を使用することができる。単子葉植物は、オモダカ（Ａｌｉｓｍａｔａｌｅｓ）、サトイモ（Ａｒａｌｅｓ）、ヤシ（Ａｒｅｃａｌｅｓ）、パイナップル（Ｂｒｏｍｅｌｉａｌｅｓ）、ツユクサ（Ｃｏｍｍｅｌｉｎａｌｅｓ）、パナマソウ（Ｃｙｃｌａｎｔｈａｌｅｓ）、カヤツリグサ（Ｃｙｐｅｒａｌｅｓ）、ホシクサ（Ｅｒｉｏｃａｕｌａｌｅｓ）、トチカガミ（Ｈｙｄｒｏｃｈａｒｉｔａｌｅｓ）、イグサ（Ｊｕｎｃａｌｅｓ）、ユリ（Ｌｉｌｌｉａｌｅｓ）、イバラモ（Ｎａｊａｄａｌｅｓ）、ラン（Ｏｒｃｈｉｄａｌｅｓ）、タコノキ（Ｐａｎｄａｎａｌｅｓ）、イネ（Ｐｏａｌｅｓ）、サンアソウ（Ｒｅｓｔｉｏｎａｌｅｓ）、ホンゴウソウ（Ｔｒｉｕｒｉｄａｌｅｓ）、ガマ（Ｔｙｐｈａｌｅｓ）、およびショウガ（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｌｅｓ）目に属する。裸子植物（Ｇｙｍｎｏｓｐｅｒｍａｅ）のクラスに属する植物は、ソテツ（Ｃｙｃａｄａｌｅｓ）、イチョウ（Ｇｉｎｋｇｏａｌｅｓ）、グネツム（Ｇｎｅｔａｌｅｓ）、およびマツ（Ｐｉｎａｌｅｓ）である。いくつかの例では、単子葉植物は、トウモロコシ、稲、小麦、大麦、およびサトウキビからなる群から選択することができる。
いくつかの例では、ウマノスズクサ（Ａｒｉｓｔｏｃｈｉａｌｅｓ）、キク（Ａｓｔｅｒａｌｅｓ）、バティス（Ｂａｔａｌｅｓ）、キキョウ（Ｃａｍｐａｎｕｌａｌｅｓ）、フウチョウソウ（Ｃａｐｐａｒａｌｅｓ）、ナデシコ（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｌｅｓ）、モクマオウ（Ｃａｓｕａｒｉｎａｌｅｓ）、ニシキギ（Ｃｅｌａｓｔｒａｌｅｓ）、ミズキ（Ｃｏｒｎａｌｅｓ）、イワウメ（Ｄｉａｐｅｎｓａｌｅｓ）、ビワモドキ（Ｄｉｌｌｅｎｉａｌｅｓ）、マツムシソウ（Ｄｉｐｓａｃａｌｅｓ）、カキノキ（Ｅｂｅｎａｌｅｓ）、ツツジ（Ｅｒｉｃａｌｅｓ）、トチュウ（Ｅｕｃｏｍｉａｌｅｓ）、トウダイグサ（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｌｅｓ）、マメ（Ｆａｂａｌｅｓ）、ブナ（Ｆａｇａｌｅｓ）、リンドウ（Ｇｅｎｔｉａｎａｌｅｓ）、フウロソウ（Ｇｅｒａｎｉａｌｅｓ）、アリノトウグサ（Ｈａｌｏｒａｇａｌｅｓ）、マンサク（Ｈａｍａｍｅｌｉｄａｌｅｓ）、ミドレス（Ｍｉｄｄｌｅｓ）、クルミ（Ｊｕｇｌａｎｄａｌｅｓ）、シソ（Ｌａｍｉａｌｅｓ）、クスノキ（Ｌａｕｒａｌｅｓ）、サガリバナ（Ｌｅｃｙｔｈｉｄａｌｅｓ）、レイトネリア（Ｌｅｉｔｎｅｒｉａｌｅｓ）、モクレン（Ｍａｇｎｉｏｌａｌｅｓ）、アオイ（Ｍａｌｖａｌｅｓ）、ヤマモモ（Ｍｙｒｉｃａｌｅｓ）、フトモモ（Ｍｙｒｔａｌｅｓ）、スイレン（Ｎｙｍｐｈａｅａｌｅｓ）、アワ（Ｐａｐｅｖｅｒａｌｅｓ）、コショウ（Ｐｉｐｅｒａｌｅｓ）、オオバコ（Ｐｌａｎｔａｇｉｎａｌｅｓ）、イソマツ（Ｐｌｕｍｂａｇｉｎａｌｅｓ）、カワゴケソウ（Ｐｏｄｏｓｔｅｍａｌｅｓ）、ナス（Ｐｏｌｅｍｏｎｉａｌｅｓ）、ヒメハギ（Ｐｏｌｙｇａｌａｌｅｓ）、タデ（Ｐｏｌｙｇｏｎａｌｅｓ）、サクラソウ（Ｐｒｉｍｕｌａｌｅｓ）、ヤマモガシ（Ｐｒｏｔｅａｌｅｓ）、ラフレシア（Ｒａｆｆｌｅｓｉａｌｅｓ）、キンポウゲ（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｌｅｓ）、クロウメモドキ（Ｒｈａｍｎａｌｅｓ）、バラ（Ｒｏｓａｌｅｓ）、アカネ（Ｒｕｂｉａｌｅｓ）、ヤナギ（Ｓａｌｉｃａｌｅｓ）、ビャクダン（Ｓａｎｔａｌｅｓ）、ムクロジ（Ｓａｐｉｎｄａｌｅｓ）、サラセニア（Ｓａｒｒａｃｅｎｉａｃｅａｅ）、ゴマノハグサ（Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｌｅｓ）、ツバキ（Ｔｈｅａｌｅｓ）、ヤマグルマ（Ｔｒｏｃｈｏｄｅｎｄｒａｌｅｓ）、セリ（Ｕｍｂｅｌｌａｌｅｓ）、イラクサ（Ｕｒｔｉｃａｌｅｓ）、およびスミレ（Ｖｉｏｌａｔｅｓ）目に属するものを含む、双子葉植物を使用することができる。いくつかの例では、双子葉植物は、綿、大豆、コショウ、およびトマトからなる群から選択することができる。
場合によっては、改良される植物は、実験条件に容易に対応することができない。例えば、作物植物が十分に成長するのに時間がかかりすぎて、実際に改良された形質を複数回反復して連続的に評価することができない場合がある。したがって、細菌が最初に分離される第１の植物、および／または遺伝子操作された細菌が適用される複数の植物は、望ましい条件下での評価にさらに従順な植物などのモデル植物であり得る。モデル植物の非限定的な例には、Ｓｅｔａｒｉａ、ミナトカモジグサ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ）、およびシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）が含まれる。次いで、モデル植物を使用して本開示の方法に従って分離された細菌の能力を、別のタイプの植物（例えば、作物植物）に適用して、改良された形質の付与を確認することができる。
本明細書に開示される方法によって改良され得る形質には、例えば、成長速度、高さ、体重、色、味、臭い、植物による１つ以上の化合物の産生の変化を含む（例えば、代謝産物、タンパク質、薬物、炭水化物、油、および任意の他の化合物を含む）、植物の任意の観察可能な特性が含まれる。遺伝子型情報に基づいて植物を選択することも考えられる（例えば、細菌に応答する植物遺伝子発現のパターンを含む、または窒素固定の増加に関連するものなどの遺伝子マーカーの存在を識別する）。植物はまた、ある特定の特徴または形質（望ましい特徴または形質など）の存在とは対照的に、ある特定の特徴または形質（望ましくない特徴または形質など）の不在、抑制、または阻害に基づいて選択されてもよい。
本明細書で提供される実施例は、細菌の分離、細菌および植物の分析、ならびに植物の形質改良の方法を説明している。これらの実施例は、例示のみを目的としており、決して限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例１：植物組織からの微生物の分離
表土は、中央カリフォルニアの様々な農業地域から得た。重粘土、泥炭粘土ローム、シルト粘土、および砂ロームを含む、多様なテクスチャー特性を持つ２０の土壌を収集した。表１に示すように、様々なトウモロコシ、スイートコーン、ヘリテージコーン、およびトマトの種子を各土壌に植えた。
Figure 2023100703000002
（表１）多様な特性を持つ土壌に植えられた作物の種類および品種
植物を、２～４週間の成長後に根から抜き、根表面の余分な土壌を脱イオン水で除去した。土壌を除去した後、植物を漂白剤で表面殺菌し、滅菌水で激しくすすいだ。きれいにした根の１ｃｍの切片を植物から切り取り、３ｍｍのスチールビーズを含むリン酸緩衝生理食塩水に入れた。Ｑｉａｇｅｎ ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩで溶液を激しく振とうすることによって、スラリーを生成した。
根および生理食塩水のスラリーを希釈し、様々な種類の成長培地に接種して、根圏、内生、着生、および他の植物関連微生物を分離した。Ｒ２ＡおよびＮｆｂ寒天培地を使用して、単一コロニーを得て、半固体Ｎｆｂ培地斜面を使用して、窒素固定細菌の集団を得た。図１Ａ～Ｂに示すように、半固体Ｎｆｂ培地斜面で２～４週間インキュベートした後、微生物集団を収集し、画線してＲ２Ａ寒天上に単一コロニーを得た。単一コロニーをＲ２Ａおよびグリセロールの混合物に再懸濁し、ＰＣＲ分析にかけ、後の分析のために－８０℃で凍結した。およそ１，０００の単一コロニーが得られ、「分離された微生物」と指定した。
次いで、分離株をコロニーＰＣＲスクリーニングにかけて、ジアゾ栄養生物を同定するためにｎｉｆＨ遺伝子の存在を検出した。スクリーニングでジアゾ栄養生物の９０％以上を検出することが示されている前述のプライマーセットＵｅｄａ １９Ｆ／３８８Ｒを使用して、各分離株のｎｉｆクラスターの存在を調べた（Ｕｅｄａ ｅｔ ａｌ．１９９５；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：１４１４－１４１７）。図２に示すように、精製された分離株の単一コロニーを選び、ＰＢＳに再懸濁し、コロニーＰＣＲのテンプレートとして使用した。陽性のＰＣＲバンドを示した分離株のコロニーを再度画線し、コロニーＰＣＲおよび再画線プロセスを２回繰り返して、ジアゾ栄養生物の偽陽性の同定を防止した。次いで、精製された分離株を「候補微生物」と指定した。
実施例２：分離された微生物の特徴付け
シーケンシング、分析、および系統学的特徴付け
５１５ｆ－８０６ｒプライマーセットを用いた１６Ｓ ｒＤＮＡのシーケンシングを使用して、分離された微生物および候補微生物の予備的な系統学的同定を行った（例えば、Ｖｅｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．；ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００２ Ｄｅｃ ２３；２：３９．）。表２に示すように、微生物は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｒａｈｎｅｌｌａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、ラオウルテラ（Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ）、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、およびＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓを含む多様な属を含む。
Figure 2023100703000003
（表２）ディープ１６Ｓ ｒＤＮＡシーケンシングによって決定されたトマト植物から分離された微生物の多様性。
その後、３９の候補微生物のゲノムを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑプラットフォームを使用してシーケンシングした。純粋培養物からのゲノムＤＮＡを、ＱＩＡｍｐ ＤＮＡミニキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して抽出し、シーケンシング用の全ＤＮＡライブラリーは、第三販売者（ＳｅｑＭａｔｉｃ，Ｈａｙｗａｒｄ）を通じて準備した。次いで、ゲノムアセンブリをＡ５パイプラインを介して実行した（Ｔｒｉｔｔ ｅｔ ａｌ．２０１２；ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７（９）：ｅ４２３０４）。遺伝子を同定し、注釈を付け、窒素固定の調節および発現に関連するものを突然変異誘発の標的として注目した。
候補微生物のトランスクリプトームプロファイリング
株ＣＩ０１０のトランスクリプトームプロファイリングを行って、環境窒素の存在下で活性であるプロモーターを同定した。株ＣＩ０１０は、１０ｍＭグルタミンで補足した定義された無窒素培地で培養した。全ＲＮＡをこれらの培養物から抽出し（ＱＩＡＧＥＮ ＲＮｅａｓｙキット）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ（ＳｅｑＭａｔｉｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ ＣＡ）を介してＲＮＡｓｅｑシーケンシングにかけた。シーケンシング読み取り値を、Ｇｅｎｅｉｏｕｓを使用してＣＩ０１０ゲノムデータにマッピングし、近位転写プロモーターの制御下にある高度に発現された遺伝子を同定した。表３Ａ～Ｃは、全ＲＮＡのＲＮＡＳｅｑシーケンシングによって測定された遺伝子およびそれらの相対的発現レベルの一覧である。ｎｉｆ経路、窒素利用関連経路、または望ましい発現レベルの他の遺伝子の突然変異誘発で使用するために、近位プロモーターの配列を記録した。
遺伝的扱いやすさの評価
候補微生物を、形質転換性および遺伝的扱いやすさに基づいて特徴付けた。最初に、最適な炭素源の利用率を、関連する培地の小さなパネルでの成長、ならびに無窒素培地および富栄養培地の両方での成長曲線によって決定した。二番目に、各菌株の自然な抗生物質耐性を、突然変異誘発の選択マーカーとして使用される抗生物質のパネルを含む液体培養でのスポット播種および増殖を通じて決定した。三番目に、各菌株を、プラスミドの集団のエレクトロポレーションを介してその形質転換性について試験した。プラスミド集団は、７つの複製起点、すなわち、ｐ１５ａ、ｐＳＣ１０１、ＣｌｏＤＦ、ｃｏｌＡ、ＲＫ２、ｐＢＢＲ１、およびｐＲＯ１６００と、４つの抗生物質耐性マーカー、すなわち、ＣｍＲ、ＫｍＲ、ＳｐｅｃＲ、およびＴｅｔＲとの組み合わせによる拡大を含む。起源および耐性マーカーの適合性とのこの体系的な評価を使用して、候補微生物におけるプラスミドベースの突然変異誘発のためのベクターを同定した。
実施例３：候補微生物の突然変異誘発
ラムダレッド媒介ノックアウト
候補微生物のいくつかの突然変異体を、プラスミドｐＫＤ４６またはカナマイシン耐性マーカーを含む誘導体を使用して生成した（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．２０００；ＰＮＡＳ ９７（１２）：６６４０－６６４５）。ノックアウトカセットを、標的遺伝子に隣接する２５０ｂｐのホモロジーで設計し、オーバーラップ伸長ＰＣＲによって生成した。候補微生物をｐＫＤ４６で形質転換し、アラビノースの存在下で培養してラムダレッド機械的発現を誘導し、エレクトロポレーション用に準備し、ノックアウトカセットで形質転換して候補突然変異株を産生した。表４に示すように、４つの候補微生物および１つの実験室株クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）Ｍ５Ａ１を使用して、窒素固定調節遺伝子ｎｉｆＬ、ｇｌｎＢ、およびａｍｔＢの１３の候補突然変異体を生成した。
Figure 2023100703000004
（表４）ラムダレッド突然変異誘発によって作成された単一ノックアウト突然変異体の一覧
Ｃａｓ９選択によるオリゴ指向性突然変異誘発
オリゴ指向性突然変異誘発を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０ＢのｒｐｏＢ遺伝子へのゲノム変化を標的化し、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いて突然変異体を選択した。突然変異誘発性オリゴ（ｓｓ１２８３：
Figure 2023100703000005
＊は、ホスホロチオエート結合を表す）は、ｒｐｏＢ遺伝子に４ｂｐの突然変異を介してリファンピシン耐性を付与するように設計した。Ｃａｓ９をコードするプラスミドを含有する細胞を、Ｃａｓ９発現のために誘導し、エレクトロポレーション用に準備し、次いで突然変異誘発性オリゴ、およびＷＴ ｒｐｏＢ配列のＣａｓ９切断を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の構成的発現をコードするプラスミドの両方でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションした細胞を非選択培地で一晩回収して、得られた突然変異染色体を十分に分離できるようにした。ｇＲＮＡをコードするプラスミドの選択時にプレーティングした後、スクリーニングされた１０コロニーのうち２コロニーに望ましい突然変異が含まれていることが示され、残りはｇＲＮＡプラスミドのプロトスペーサー突然変異またはＣａｓ９プラスミド喪失によって生成されたエスケープ突然変異体であることが示された。
Ｃａｓ９選択によるラムダレッド突然変異誘発
候補微生物ＣＩ００６およびＣＩ０１０の突然変異体は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓによる選択を伴うラムダレッド突然変異誘発を介して生成された。ノックアウトカセットには、転写プロファイリング（実施例２に記載され、表３に示されている）によって同定された内因性プロモーター、および削除標的に隣接する約２５０ｂｐの相同領域が含まれていた。ＣＩ００６およびＣＩ０１０は、アラビノース誘導性プロモーターの制御下でラムダレッド組み換えシステム（ｅｘｏ、β、ｇａｍ遺伝子）をコードするプラスミドにより形質転換され、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下でＣａｓ９により形質転換された。Ｒｅｄ組み換えおよびＣａｓ９系は、得られた形質転換体において誘導され、株は、エレクトロポレーションのために調製された。ノックアウトカセットおよびプラスミドでコードされた選択ｇＲＮＡは、その後、コンピテント細胞に形質転換された。Ｃａｓ９プラスミドおよびｇＲＮＡプラスミドの両方に選択的な抗生物質をプレーティングした後、スクリーニングされた１０コロニーのうち７コロニーは、図３に示すように、意図したノックアウト突然変異を示した。
実施例４：候補分子のインビトロ表現型決定
外因性窒素がニトロゲナーゼ生合成および様々な突然変異体における活性に及ぼす影響を評価した。アセチレン還元アッセイ（ＡＲＡ）（Ｔｅｍｍｅ ｅｔ．ａｌ．２０１２；１０９（１８）：７０８５－７０９０）を使用して、純粋培養条件でのニトロゲナーゼ活性を測定した。株を気密試験管で培養し、アセチレンからエチレンへの還元を、Ａｇｉｌｅｎｔ ６８９０ガスクロマトグラフで定量化した。０～１０ｍＭのグルタミンで補足した窒素固定培地中で増殖させた候補微生物および対応する候補突然変異体のＡＲＡ活性を図４Ａ～Ｂおよび図１０Ａ～Ｃに示す。
嫌気性培養条件下で、グルタミンおよびアンモニア濃度の範囲を試験して、窒素固定活性への影響を定量化した。野生型細胞では、グルタミン濃度が増加するにつれて、活性は急速に減少した。ただし、一連の初期ノックアウト突然変異では、それ以外では野生型の活性を遮断するグルタミンの濃度下で、窒素固定遺伝子の発現を可能にする突然変異のクラスを検証した。このプロファイルは、図４Ｃに示すように、４種の異なるジアゾ栄養生物において生成された。さらに、同定された遺伝的部分を使用して調節ネットワークを再配線することによって、窒素固定活性レベルが予測通りに調整された。これは、株ＣＭ０２３、ＣＭ０２１、ＣＭ０１５、およびＣＩ００６を示す図４Ｂに見られる。株ＣＭ０２３は、低度に進化した株であり、株ＣＭ０２１は、高度に進化した株であり、株ＣＭ０１５は、中度に進化した株であり、株ＣＩ００６は、野生型（株２）である。培養上清に排泄されたアンモニアは、酵素ベースのアッセイ（ＭＥＧＡＺＹＭＥ）を使用して試験した。このアッセイは、３４０ｎｍの吸光度で消費されるＮＡＤＰＨの量を測定する。アッセイは、１Ｅ９ ＣＦＵ／ｍＬの開始密度で、無窒素嫌気性環境で育成された細菌培養物に対して行った。図４Ｄに示すように、６つの進化した株のパネル全体で、１つの株は、４８時間にわたって最大１００μＭのアンモニアを排泄した。さらに、図１１に示すように、二重突然変異体は、それが由来する単一突然変異体よりも高いアンモニア排泄を示した。これは、生理的必要量を超えるアンモニアを産生する微生物の能力を示している。
純粋培養物の転写プロファイリング
ＣＩ００６の転写活性は、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ Ｅｌｅｍｅｎｔｓプラットフォームを使用して測定した。細胞を無窒素培地で増殖させ、４時間のインキュベーション後に１０Ｅ８細胞を収集した。Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙキットを使用して、全ＲＮＡを抽出した。図５に示すように、精製されたＲＮＡを、プローブハイブリダイゼーションおよびデジタルアナライザー分析のために、Ｃｏｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）に提出した。
実施例５：候補微生物の植物体表現型決定
候補微生物による植物のコロニー形成
候補微生物による望ましい宿主植物のコロニー形成を、短期間の植物成長実験を通じて定量化した。トウモロコシ植物に、プラスミドまたはＴｎ５統合ＲＦＰ発現カセットのいずれかからＲＦＰを発現する株を接種した。植物は、滅菌砂および非滅菌泥炭培地の両方で育成し、発芽後３日目に、新興の植物子葉鞘に直接１ｍＬの細胞培養物を分注することによって接種を行った。プラスミドは、適切な抗生物質を含む溶液とともに植物に散水することによって維持された。３週間後、植物の根を収集し、滅菌水で３回すすぎ、目に見える土壌を取り除き、２つの試料に分けた。１つの根試料を蛍光顕微鏡で分析して、候補微生物の局在化パターンを特定した。図６に示すように、長さ１０ｍｍの最も細い無傷の植物の根で顕微鏡検査を行った。
コロニー形成を評価するための第２の定量的方法が開発された。エンドファイトを接種した植物の根からの全ＤＮＡ調製物に対して、定量的ＰＣＲアッセイを行った。トウモロコシの種子（Ｄｅｋａｌｂ ＤＫＣ－６６－４０）を、２．５インチ×２．５インチ×１０インチのポット内で予めオートクレーブ処理した砂で発芽させた。植え付けの１日後、１ｍＬのエンドファイト一晩培養物（ＳＯＢ培地）を、種子が置かれた場所のすぐ右で濡らした。１ｍＬのこの一晩培養物は、約１０＾９ｃｆｕとほぼ同等であり、使用している株によって互いに３倍以内で異なる。各苗は、２．５ｍＭまたは０．２５ｍＭの硝酸アンモニウムで補足した５０ｍＬの修飾Ｈｏａｇｌａｎｄ溶液で週３回施肥した。植え付けの４週間後、ＤＮＡ抽出のために根試料を収集した。土壌片は、加圧水スプレーを使用して洗い流した。次いで、これらの組織試料をＱＩＡＧＥＮ Ｔｉｓｓｕｅｌｙｚｅｒを使用して均質化し、推奨されるプロトコルに従って、ＱＩＡｍｐ ＤＮＡミニキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してＤＮＡを抽出した。ｑＰＣＲアッセイは、これらのＤＮＡ抽出物に対してＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｍｘ３００５Ｐ ＲＴ－ＰＣＲを使用し、エンドファイトの各ゲノム内の遺伝子座に特異的になるように（ＮＣＢＩのＰｒｉｍｅｒ ＢＬＡＳＴを使用して）設計されたプライマーを使用して行った。エンドファイトのゲノムコピーの存在を定量化した。エンドファイトの同一性をさらに確認するために、ＰＣＲ増幅産物の配列を決定し、正しい配列を有することを確認した。候補微生物からの株ＣＩ００６およびＣＩ００８のコロニー形成プロファイルの概要を表５に提示する。１０＾７ｘ ｃｆｕ／ｇｆｗもの高い根のコロニー形成率が、株ＣＩ００８において示された。
Figure 2023100703000006
（表５）ｑＰＣＲによって測定したトウモロコシのコロニー形成
植物体内ＲＮＡプロファイリング
植物体のｎｉｆ経路成分の生合成は、ｎｉｆ遺伝子の転写を測定することによって推定された。全ＲＮＡは、ＣＩ００６接種植物の根の植物組織から得た（前述の植え付け方法）。ＲＮＡ抽出は、ＲＮＥａｓｙミニキットを使用し、推奨プロトコル（ＱＩＡＧＥＮ）に従って行った。次いで、これらの植物組織からの全ＲＮＡを、株ＣＩ００６のゲノム内のｎｉｆ遺伝子に特異的なプローブを使用して、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ Ｅｌｅｍｅｎｔｓキット（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用してアッセイした。植物体におけるｎｉｆ遺伝子発現のデータを表６にまとめる。ＣＭ０１３株を接種した植物では、ｎｉｆＨ遺伝子の発現が検出されたが、ＣＩ００６を接種した植物ではｎｉｆＨの発現は検出できなかった。株ＣＭ０１３は、ｎｉｆＬ遺伝子がノックアウトされている株ＣＩ００６の派生物である。
１００万キロベースあたりの転写産物（ＴＰＭ）によってランク付けされたＣＭ０１１の高度に発現された遺伝子を、施肥条件下の植物体で測定した。これらの高度に発現された遺伝子のいくつかの発現を制御するプロモーターを、標的化窒素固定および同化遺伝子座への相同組み換えのテンプレートとして使用した。温室栽培したＣＭ０１１接種植物からのＲＮＡ試料を抽出し、Ｒｉｂｏ－Ｚｅｒｏキットを使用してｒＲＮＡを除去し、ＩｌｌｕｍｉｎａのＴｒｕｓｅｑプラットフォームを使用してシーケンシングし、ＣＭ０１１のゲノムに再度マッピングした。ＣＭ０１１からの高度に発現された遺伝子を表７に列挙する。
Figure 2023100703000007
（表６）植物体におけるｎｉｆＨの発現
Figure 2023100703000008
Figure 2023100703000009
（表７）ＣＭ０１１からの高度に発現された遺伝子
１５Ｎアッセイ
固定を実証するための主な方法は、窒素同位体１５Ｎを使用し、これは１４Ｎに対して設定された割合で大気中に見られる。肥料または大気のいずれかを１５Ｎの濃縮レベルで補充することによって、１５Ｎ２ガスで補足した大気から固定された１５Ｎの高濃度で固定を直接観察するか（Ｙｏｓｈｉｄａ １９８０）、または逆に、植物組織中の大気Ｎ２ガスによる濃縮肥料の希釈によって固定を観察することができる（Ｉｎｉｇｕｅｚ ２００４）。希釈法は、植物の成長過程で累積した固定窒素の観察を可能にするが、１５Ｎ２ガス法は、植物が閉じ込められた雰囲気で成長できる短い間隔で発生する固定の測定に制限される（速度測定）。したがって、ガス法は、特異性に優れているが（大気圧を超える植物の１５Ｎ２レベルの上昇は、明らかに固定に起因し得るため）、累積的な活性を示すことはできない。
両方のタイプのアッセイを行って、野生型および無接種のトウモロコシ植物と比較して、改良された株の固定活性を測定したところ、改良された株のいくつかについて植物体で高い固定率が観察された（図１２、図１４Ａ、および図１４Ｂ）。これらのアッセイは、インビトロで観察された株の活性がインビボの結果につながることを示すのに役立つ。さらに、これらのアッセイは、肥料が株活性に及ぼす影響を測定できるため、農業環境での好適な機能を示唆している。ｓｅｔａｒｉａ植物に野生型および改良株を接種した場合にも同様の結果が観察された（図１３）。図１４Ａ～１４Ｃに示される植物体内固定活性は、トランスクリプトームデータによってさらに裏付けられている。進化した株は、野生型の対応物と比較して増加したｎｉｆＨ転写レベルを呈する。さらに、植物体中の微生物由来の窒素レベルは、植物ごとのコロニー形成レベルとも相関している。これらの結果（図１２、図１３、図１４Ａ～１４Ｃ、図１５Ａ、および図１５Ｂ）は、微生物が、ｎｉｆ遺伝子クラスターの調節の改良を通じて、植物組織において大気由来窒素の増加が見られるもっともな理由であるという仮説を裏付けている。固定を直接測定することに加えて、窒素ストレス植物バイオマスアッセイにおいて改良株を植物に接種した場合の影響を測定した。植物バイオマスは、微生物と植物との多くの考えられる相互作用に関連し得るが、窒素が制限されている場合、固定窒素の追加が植物の表現型に影響を与えると予想される。接種した植物は、完全な窒素の不在下で育てられ、未処理の対照と比較して、接種した植物では葉面積、苗条の新鮮重量および乾燥重量、根の新鮮重量および乾燥重量の有意な増加が観察された（図１４Ｃ）。これらの違いは、窒素固定のみに起因するものではないが、改良された株が植物に積極的に窒素を供給しているという結論を裏付けている。上記のようにトウモロコシおよびｓｅｔａｒｉａ植物を成長させ、接種した。１５Ｎを１．２％含む肥料を、散水によって定期的に植物に供給した。微生物による窒素固定は、植物組織の１５ Ｎレベルを測定することによって定量化した。植え付け後４週間で４枚目の葉組織を収集し、乾燥させた。乾燥した葉の試料をビーズ（ＱＩＡＧＥＮ Ｔｉｓｓｕｅｌｙｚｅｒ）を使用して均質化し、ＩＲＭＳ（Ｔｈｅ Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ ＣｅｎｔｅｒのＭＢＬ Ｓｔａｂｌｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｗｏｏｄｓ Ｈｏｌｅ，ＭＡ）に分注した。大気由来の窒素（ＮＤＦＡ）を計算し、ＣＩ０５０およびＣＭ００２による窒素産生を図７に示す。
植物ホルモン産生アッセイ
ドワーフトマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）品種′Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ′は、インビトロアッセイを通じて果実の成熟に対するインドール－３－酢酸の影響を研究するために以前に使用されている（Ｃｏｈｅｎ １９９６；Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｈｏｒｔｉｃ Ｓｃｉ １２１：５２０－５２４）。候補微生物による植物ホルモンの産生および分泌を評価するために、未熟なＭｉｃｒｏ－Ｔｏｍ果実を使用したプレートベースのスクリーニングアッセイが開発された。図８に示すように、１２ウェルの組織培養試験プレートは、ウェルに寒天培地を入れて固化させ、１０μＬの一晩微生物培養物を寒天表面にスポットすることによって調製した。増加する量のジベレリン酸（ＧＡ）を含むが、細菌培養物を含まない寒天を含むウェルを、陽性対照および標準として使用した。成長中のＭｉｃｒｏ－Ｔｏｍ植物から切除された開花後１日の花を、茎を先にして、細菌スポット培養のポイントで寒天に挿入した。これらの花を２～３週間監視した後、果実を収穫して計量した。図９に示すように、いくつかの複製にわたって植物果実の量が増加していることは、接種微生物による植物ホルモンの産生を示している。
実施例６：循環型宿主微生物の進化
トウモロコシ植物にＣＭ０１３を接種し、４週間でほぼＶ５成長期まで成長させた。１５Ｎ分析による微生物源からの窒素蓄積の向上を示すものを根から抜き、加圧水を使用して根を洗浄して、大量の土壌を除去した。０．２５ｇの根の切片を切り取り、ＰＢＳ溶液ですすいで、微細な土壌粒子および非付着性微生物を除去した。ＱＩＡＧＥＮ ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩの３ｍｍスチールビーズを使用して、組織試料を均質化した。ホモジネートを希釈し、ＳＯＢ寒天培地上に置いた。単一コロニーを液体培地に再懸濁し、１６ｓ ｒＤＮＡのＰＣＲ分析および接種株に固有の突然変異を行った。微生物の分離、突然変異誘発、接種、および再分離のプロセスは、微生物の形質、植物の形質、および微生物のコロニー形成能力を向上させるために反復的に繰り返すことができる。
実施例７：地理間の適合性
改良された微生物が接種された植物にコロニー形成する能力は、畑地条件下での植物の成功にとって重要である。説明されている分離方法は、トウモロコシなどの作物植物と密接な関係を有し得る土壌微生物から選択するように設計されているが、多くの株は、一連の植物の遺伝子型、環境、土壌タイプ、または接種条件にわたって効果的にコロニー形成しない場合がある。コロニー形成は、一連の微生物株と宿主植物との間の相互作用を必要とする複雑なプロセスであるため、コロニー形成能力のスクリーニングは、さらなる開発のための優先株を選択するための中心的な方法となっている。コロニー形成を評価するための初期の取り組みでは、菌株の蛍光標識を使用した。これは有効であるが、時間がかかり、株ベースで拡張可能ではなかった。コロニー形成の活性は、単純な改良を受け入れられないため、潜在的な製品候補が自然の生着菌である株から選択されることが不可欠である。
アッセイは、ｑＰＣＲおよびコミュニティ試料中で株特異的になるように設計されたプライマーを使用して、任意の所与の宿主植物における野生型株の堅牢なコロニー形成を試験するために設計された。このアッセイは、トウモロコシ組織試料からの微生物のコロニー形成率を迅速に測定することを意図している。蛍光顕微鏡法およびプレートベースの技法を使用して可能性がある生着菌として評価された株を使用した初期試験では、ｑＰＣＲアプローチが定量的かつ拡張可能であることが示された。
典型的なアッセイは、次のように行われる：植物、主にトウモロコシおよび小麦の品種を、温室の泥炭鉢植えミックスで１株あたり６回複製して栽培する。植え付け後４日または５日で、ＯＤ５９０が０．６～１．０（およそ５Ｅ＋０８ ＣＦＵ／ｍＬ）に希釈された細菌の１ｍＬ潅注の初期定常期培養液を、現れた子葉鞘の上に分注する。植物に水道水だけをまき、試料採取前に４週間育てる。この時点で、植物を根から抜き、根を徹底的に洗浄して泥炭残留物をほとんど取り除く。きれいな根の試料を切り取り、均質化して、植物細胞片および関連する細菌細胞のスラリーを作成する。ｑＰＣＲのテンプレートとして使用する植物および細菌ＤＮＡの混合物を効果的に産生するハイスループットＤＮＡ抽出プロトコルを開発した。細菌細胞スパイクイン実験に基づいて、このＤＮＡ抽出プロセスは、根の新鮮重量と比較して定量的な細菌ＤＮＡ試料を提供する。各株を、プライマーＢＬＡＳＴ（Ｙｅ ２０１２）を使用して設計された株特異的プライマーを使用して評価し、接種されていない植物からのバックグラウンド増幅と比較する。一部のプライマーは、接種されていない植物ではオフターゲット増幅を示すため、コロニー形成は、増幅の存在またはバックグラウンドレベルと比較した正しい産生物の増幅の増加のいずれかによって決定される。
このアッセイを使用して、異なる土壌地理にわたる微生物産物の適合性を測定した。畑地土壌の質および畑地条件は、微生物産物の効果に大きな影響を与え得る。土壌のｐＨ、保水能力、および競合微生物は、接種菌の生存およびコロニー形成能力に影響を与え得る土壌の要因のほんの数例である。コロニー形成アッセイは、カリフォルニアの農地から試料採取された３種類の土壌タイプを植物成長培地として使用して行った（図１６Ａ）。中間の接種密度を使用して、現実的な農業条件を概算した。３週間以内に、株５はすべての植物に１Ｅ＋０６～１Ｅ＋０７ ＣＦＵ／ｇ ＦＷでコロニー形成した。植物成長の７週間後、株１の進化版は、すべての土壌タイプで高いコロニー形成率（１Ｅ＋０６ ＣＦＵ／ｇＦＷ）を呈した（図１６Ｂ）。
さらに、畑地条件の複雑さにおけるコロニー形成を評価するために、２０１５年６月にＳａｎ Ｌｕｉｓ Ｏｂｉｓｐｏで１エーカーの畑地試験を開始して、２種類の畑地トウモロコシにおける７つの野生型株の影響およびコロニー形成を評価した。農業設計および試験の実施は、契約実地研究機関であるＰａｃｉｆｉｃ Ａｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈが行った。接種には、接種方法実験で試験された同じ泥炭栽培種子コーティング技法を用いた。成長期の過程で、植物試料を収集して、根および茎の内部のコロニー形成を評価した。植え付け後４週間および８週間で各処理の３つの複製プロットから、１６週間で収穫直前に各処理の６つすべての複製プロットから試料を収集した。１２週目に、株１および株２を接種した処理の６つすべての複製プロット、ならびに未処理の対照から追加の試料を収集した。洗浄した根の新鮮重量１グラムあたりの細胞数を、ｑＰＣＲおよび株特異的プライマーを用いた他のコロニー形成アッセイと同様に評価した。２つの株、株１および株２は、一貫して広範囲の根のコロニー形成を示し、１２週間でピークに達し、その後急激に減少した（図１６Ｃ）。株２は、株１よりも１桁少ない数で存在するように思われたが、植物間でより一貫した数で見られた。茎内部に効果的にコロニー形成する株は出現しなかった。ｑＰＣＲコロニー形成データを裏付けるために、プレートおよび１６Ｓシーケンシングを使用して根試料から両方の株を正常に再分離し、一致するシーケンスの分離株を同定した。
微生物の繁殖の例は、図１７および図１８の概略図にまとめることができる。図１７は、微生物の繁殖を示しており、そこでは、マイクロバイオームの組成を最初に測定することができ、目的の種が同定される。マイクロバイオームの代謝をマッピングし、遺伝学にリンクさせることができる。その後、コンジュゲーションおよび組み換え、化学的突然変異誘発、適応進化、および遺伝子編集を含むがこれらに限定されない方法を使用して、標的化遺伝的変異を導入することができる。派生微生物は、作物に接種するために使用される。いくつかの例では、最良の表現型を持つ作物が選択される。
図１７に示すように、マイクロバイオームの組成を最初に測定し、目的の種を同定することができる。マイクロバイオームの代謝をマッピングし、遺伝学にリンクさせることができる。窒素の代謝には、ＡｍｔＢトランスポーターを介して、根圏から細菌のサイトゾルへのアンモニア（ＮＨ４ ＋）の流入が含まれ得る。アンモニアおよびＬ－グルタミン酸（Ｌ－Ｇｌｕ）は、グルタミンシンテターゼおよびＡＴＰによってグルタミンに触媒される。グルタミンは、バイオマスの形成（植物の成長）につながる可能性があり、ｎｉｆオペロンの発現を阻害する可能性もある。その後、コンジュゲーションおよび組み換え、化学的突然変異誘発、適応進化、および遺伝子編集を含むがこれらに限定されない方法を使用して、標的化遺伝的変異を導入することができる。派生微生物は、作物に接種するために使用される。最良の表現型を持つ作物が選択される。
本発明を説明する文脈において（特に、以下の特許請求の範囲の文脈において）「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語、ならびに類似の指示対象の使用は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方をカバーするものと解釈されるべきである。「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、特に断りのない限り、制限のない用語（すなわち、「含むがこれに限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書での値の範囲の列挙は、本明細書に別段の指示がない限り、範囲内に含まれる各個別の値を個別に参照する簡略法として機能することのみを意図し、各個別の値は、本明細書で個別に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。例えば、１０～１５の範囲が開示されている場合、１１、１２、１３、および１４も開示されている。本明細書に記載のすべての方法は、本明細書で別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で行うことができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例、または例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をよりよく明らかにすることを意図し、別段の請求がない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中の言語は、請求されていない要素を本発明の実施に不可欠であると示すものと解釈されるべきではない。
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示して説明してきたが、そのような実施形態が例としてのみ提供されていることは当業者には明らかであろう。当業者は、本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、および置換を思いつくであろう。本明細書に記載されている本発明の実施形態の様々な代替形態が、本発明を実施する際に用いられ得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造、ならびにそれらの等価物がそれによってカバーされることが意図されている。
（表３Ａ）
Figure 2023100703000010
（表３Ｂ）
Figure 2023100703000011
実施例８：ｇｌｇＡの削除は窒素排泄を増加させる
グリコーゲンの合成は、解糖系およびＴＣＡサイクルから炭素が分離される。グリコーゲン合成の減少または廃止は、解糖系およびＴＣＡサイクルへの炭素流束の増加をもたらし、細胞内でのＡＴＰの可用性の向上につながり得る。窒素固定は、１つのＮ２分子を還元するために１６ＡＴＰを必要とし、ＡＴＰの可用性によって制限され得るため、これはニトロゲナーゼ活性の増加につながり得る。グリコーゲンシンターゼは、遺伝子ｇｌｇＡによってコードされる。ｇｌｇＡの下方調節または削除は、窒素固定活性の増加につながる可能性がある。
この目的のために、ｇｌｇＡを削除したＫｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ ＣＩ００６およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｉｉｃｏｌａの株を構築した。株６－１６９４、６－１７４４、および１３７－１８９３を、アンモニア排泄（ＡＭＭ）アッセイにかけた。ここで経時的なアンモニア排泄を、窒素固定条件下、無窒素培地で細胞を培養し、細胞をペレット化し、無細胞培養液中の遊離アンモニウムを測定することによって測定した。より高いアンモニウム排泄レベルは、より高い窒素固定および排泄を示した。株６－１６８１および１３７－１８９３を、５ｍＭリン酸アンモニウムで補足した培地で、前述のようにＡＲＡアッセイにかけた。株６－１６９４は、親株６－３４２に対応する。株６－１７４４は、親株６－９２３に対応する。株６－１６８１は、親株６－３４６に対応する。株１３７－１８９３は、親株１３７－１５８６に対応する。
ＡＭＭアッセイのデータを図１９Ａ～２０Ｂに示す。株６－１６９４および６－１７４４は、親株と比較して窒素排泄能力の増加を示す（図１９Ａ）。株６－１６８１は、その親株と比較してＡＲＡ活性の増加を呈した（図１９Ｂ）。株１３７－１８９３は、ＡＲＡによって測定して、アンモニウム排泄の増加（図２０Ａ）およびニトロゲナーゼ活性（図２０Ｂ）の両方を呈した。したがって、細菌のグリコーゲン合成を低減または排除すると、排泄される窒素の量を増やすことができる。本明細書に記載される株の詳細は、表８および９に見ることができる。
実施例９：ｇｌｎＤ突然変異は窒素排泄を増加させる
ＧｌｎＤは、細胞内の窒素感知の中心的な「スイッチ」として機能する、二機能性のウリジリルトランスフェラーゼ／ウリジリル除去酵素である。これは、３つの異なるドメイン：ＰＩＩタンパク質ＧｌｎＢおよびＧｌｎＫをウリジリル化するＵＴａｓｅドメイン；ＰＩＩタンパク質からウリリル基を除去する、ウリジリル除去（ＵＲ）ドメイン（ＨＤドメインとしても知られる）；グルタミン結合に応答して他の２つのドメインの活性を調節する２つのＡＣＴドメインを含む（図２１）。窒素過剰では、グルタミンがＡＣＴドメインに結合し、ＵＲドメインが活性化される。窒素飢餓では、ＡＣＴは結合されておらず、ＵＴａｓｅドメインが活性である。後続のＰＩＩタンパク質シグナル伝達は、ニトロゲナーゼおよび窒素同化遺伝子を含むいくつかの遺伝子クラスターの転写に影響を与える。
窒素の固定および排泄にどのように影響するかを確認するために、様々な切り詰めおよび削除を行った。ＵＴａｓｅ、ＵＲ、およびＡＣＴ１／２（グルタミン感知）ドメインを修飾するいくつかのｇｌｎＤ突然変異は、ＡＲＡおよびアンモニウム排泄アッセイで測定されるように、活性の増加につながる。図２２は、Ｋ．ｖａｒｉｉｃｏｌａ ＣＩ１３７でのアンモニウム排泄の増加につながるいくつかのｇｌｎＤ修飾を示している。図２３は、Ｋ．ｓａｃｃｈａｒｉのアンモニウム排泄の増加につながるいくつかのｇｌｎＤ修飾を示している。
実施例１０：ｇｌｎＫの削除は窒素排泄を増加させる
ＧｌｎＫは、ＰＩＩタンパク質であり、これは翻訳後調節因子であり得、アンモニウム排泄の競合経路である可能性があるグルタミン合成に関与し得る。ＧｌｎＫのレベルが高いほど、排泄されるＮＨ４の量が低減し得る。ｇｌｎＫを除去すると、ＮＨ４排泄の抑制効果が低減または排除され得る。
ＧｌｎＫは、ｎｉｆＬ：：１．２の削除およびｇｌｎＥの削除がすでに含まれている株で削除した。したがって、ｇｌｎＫの削除は、窒素を固定する能力がすでに増加している株に導入された。図２４Ａでは、ｇｌｎＫが削除された株は、１３７－２２２５として示され、親株は、１３７－２０８４として示されている。ＡＭＭ分析をこれらの細胞で行い、それにより１時間あたりのＯＤあたりのＮＨ４＋排泄量（ｍＭ）を測定した。このアッセイでは、より多くのＮＨ４＋排泄がより高い窒素固定活性を示す場合がある。特に、１３７－２２２５株は、ＡＭＭアッセイで測定した場合、親株より１．３２倍高い窒素固定活性を示した。
実施例１１：ｇｌｎＡ遺伝子の下方調節はアンモニウム排泄を増加させる
グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）は、ｇｌｎＡ遺伝子によってコードされている。ＧＳ活性の低減は、窒素同化速度の低下をもたらし得る。窒素固定条件では、これは細胞内のアンモニウムの蓄積およびアンモニウムの排泄につながり得る。
ｇｌｎＡの未変性プロモーターが、低レベルで構成的に発現することが知られているプロモーター（ｇｌｎＢ、ｇｌｎＤ、またはｇｌｎＥ遺伝子のプロモーター）によって置き換えられたいくつかの株が構築された。これは、ｇｌｎＡ転写の減少につながると予想される。場合によっては、ｇｌｎＡ遺伝子のＡＴＧ開始コドンもＧＴＧに突然変異して、ＧＳタンパク質の翻訳開始率を低下させた。図２４Ｂ、図２５、および図２６は、ｇｌｎＡ遺伝子の下方調節がアンモニウム排泄の増加をもたらしたＣＩ１３７およびＣＩ００６のいくつかの突然変異体を説明している。
実施例１２：グルタミン酸シンターゼの下方調節はアンモニウム排泄の増加をもたらす
グルタミン酸は、細胞内の窒素の主なプールとして機能し、ＧＳ－ＧＯＧＡＴ経路は窒素同化の主な経路である。ｇｌｔＢＤオペロンは、ＧＯＧＡＴをコードする。ｇｌｔＢＤオペロンの未変性プロモーターが削除され、強力な構成的プロモーターで置き換えられた株（１３７－２２１５）が構築された。図２７は、１３７－２２１５が親対照と比較して、どのようにアンモニウム排泄の増加を呈するかを示している。図２８は、１３７－２２１５がＡＲＡによって測定して、窒素固定活性の増加を呈したことを示している。
実施例１３：グルタミナーゼ遺伝子ｇｌｓＡ２の上方調節は、アンモニウム排泄の増加をもたらす
グルタミナーゼ酵素は、グルタミンのＣ－Ｎ結合を切断し、アンモニウムおよびグルタミン酸を放出する。細胞内のグルタミナーゼ活性の増加は、グルタミンからのアンモニウム排泄およびアンモニウム排泄の増加につながり得る。ｇｌｓＡ２遺伝子は、グルタミナーゼをコードする。ｇｌｓＡ２遺伝子の未変性プロモーターが削除され、強力なプロモーター配列で置き換えられた株が構築された。図２９および図３０は、親株対照と比較して、これらの株によるアンモニウム排泄の増加を示している。
実施例１４：ａｓｎＢのグルタミナーゼドメインの上方調節はアンモニウム排泄の増加をもたらす
ａｓｎＢ遺伝子は、グルタミナーゼドメインおよびアスパラギンシンターゼドメインの２つのドメインを有するトランスアミナーゼ酵素をコードする。図３１は、アスパラギンシンターゼドメインの削除またはａｓｎＢ遺伝子の上方調節が、アンモニウム排泄の増加にどのようにつながり得るかを示している。
実施例１５：ｒｐｏＮの上方調節は窒素固定を増加させる
ｒｐｏＮ（σ５４）は、特定の開始部位へのＲＮＡポリメラーゼの付着を促進するために使用される開始因子である。ｎｉｆＡおよびｉｈｆＡ／Ｂとともに、ｎｉｆＨを転写する。ｒｐｏＮを上方調節することは、ｎｉｆＨレベルの増加を可能にすることができ、窒素固定の増加をもたらし得る。
ｒｐｏＮが、その未変性プロモーターを削除し、強力な構成的プロモーターで置き換えることによって上方調節されたＫ．ｖａｒｉｉｃｏｌａ ＣＩ１３７の２つの株が構築された。データを図３２および図３３に示す。ｒｐｏＮが修飾された株は、１３７－２２５１および１３７－２２８５として示され、親株は１３７－２０８４として示される。
図３２では、データは、コロニー形成単位ごとに１時間あたりに形成されるエチレン量の１０を底とする対数として示されているため、エチレン形成量が多いほど、窒素固定が多いことを示す。窒素源として提供された５ｍＭリン酸アンモニウムを用いてアッセイを行った。１３７－２２５１株は、親株よりも１．２３倍窒素を固定し（ｐ＝０．０２８）、１３７－２２８５株は、親株よりも１．９５倍窒素を固定した（ｐ＝０．０３１）。
これらの結果は、酵素ｎｉｆＨをコードするＲＮＡの転写に関与するポリメラーゼの量を増やすことによって、窒素固定が強化され得ることを示唆している。
実施例１６：ｏｔｓＢの上方調節は窒素固定活性の増加につながる ｏｔｓＢは、細胞内のトレハロースの生合成に関与しており、ｏｔｓＢの修飾は、株の堅牢性を向上させる可能性がある。ここでは、ｏｔｓＢの修飾を作成および試験して、これらの修飾が細胞内の窒素固定に悪影響を及ぼしたかどうかを判断した。
窒素固定細菌の３つの株を修飾して、ｏｔｓＢ遺伝子の発現を増加させた。ｏｔｓＢ遺伝子の未変性プロモーターを削除し、強力な構成的プロモーターで置き換えた。修飾された株は、６－９２１および６－９２２（親株６－４３５）および６－１６９７（親株６－９２３）である。修飾株６－９２１および６－９２２に対してＡＲＡアッセイを行った（図３４）。データは、コロニー形成単位ごとに１時間あたりに形成されるエチレン量の１０を底とする対数として示されているため、エチレン形成量が多いほど、窒素固定が多いことを示す。窒素源として提供された５ｍＭリン酸アンモニウムを用いてアッセイを行った。ＣＩ００６を陰性対照として使用した。驚くべきことに、修飾された株の窒素固定活性は、親と比較して増加している。
株６－１６９７に対してアンモニウム排泄アッセイを行った。データは、１時間あたりのＮＨ４＋排泄量（ｍＭ／ＯＤ）として表示され、それにより値が高いほど窒素排泄量が多いことを示す。データは、異なる日に行われた実験を表している。データを図３５に示す。窒素排泄活性は、親と比較して増加した。驚くべきことに、修飾株のアンモニウム排泄活性は、親と比較して増加している。
実施例１７：ｐｈｏＢを修飾して根圏のコロニー形成を増加させることができる
いくつかの株のコロニー形成は、バイオフィルム形成に関連している可能性があり、これは、リンシグナル伝達の影響を受ける可能性があり、場合によっては、ｐｈｏＢなどのリンシグナル伝達遺伝子の発現を変化させることによって影響を受ける可能性がある。したがって、ｐｈｏＢの変化は、いくつかの細菌株のコロニー形成に影響を与える可能性がある。
ＡＭＭアッセイによって測定して、窒素排泄量が多い細菌株において、ｐｈｏＢへの修飾（株１３７－１９０１）を作成した。親株は、１３７－１５８６として示した。
修飾が細胞の窒素排泄活性に悪影響を与えるかどうかを決定するために、細胞に対してＡＭＭアッセイを行った。修飾は、細胞の窒素排泄活性を低減しなかった（図３６Ａ）。したがって、ｐｈｏＢは、窒素排泄を低減することなく修飾され得る。
トウモロコシ根コロニー形成アッセイを行って、修飾が、植物根にコロニー形成する株の能力に影響を与えるかどうかを決定した。簡単に言えば、発芽後に植物に約１０９個の細胞を接種し、４週間成長させ、その時点で収穫した。種子根および最初の節を合わせた試料は、植物の冠部の下約１～２インチから採取した。収集後、試料を溶解し、ｑＰＣＲを行って、根組織１グラムあたりに存在する細胞数（ＣＦＵ／ｇｆｗ）を決定した。図３６Ｂに見られるように、株１３７－１９０１は、親株１３７－１５８６と比較してコロニー形成の増加を示した。したがって、ｐｈｏＢの修飾は、根の細胞のコロニー形成を増加させることができ、この場合、突然変異株のコロニー形成は、親株のそれよりも高かった。
実施例１８：ｙｊｂＥ２を修飾して根圏のコロニー形成を増加させることができる
ｙｊｂＥ遺伝子は、エキソポリサッカライドの分泌を促進することができ、ある特定の株の根付着を増加させ得る。
トウモロコシ根コロニー形成アッセイを行って、ｙｊｂＥの修飾が、植物根にコロニー形成する株の能力に影響を与えるかどうかを決定した。簡単に言えば、発芽後に植物に約１０９個の細胞を接種し、４週間成長させ、その時点で収穫した。種子根および最初の節を合わせた試料は、植物の冠部の下約１～２インチから採取した。収集後、試料を溶解し、ｑＰＣＲを行って、根組織１グラムあたりに存在する細胞数（ＣＦＵ／ｇｆｗ）を決定した。図３７に見られるように、株６－１７７９は、親株６－８４８と比較してコロニー形成の増加を示した。
実施例１９：ｏｔｓＢ
ｏｔｓＢは、細胞内のトレハロースの生合成に関与しており、ｏｔｓＢの修飾は、株の堅牢性を向上させる可能性がある。ここでは、ｏｔｓＢの修飾を作成および試験して、これらの修飾が細胞内の窒素固定に悪影響を及ぼしたかどうかを判断した。
窒素固定細菌の株を修飾して、ｏｔｓＢ遺伝子の発現を増加させた。修飾された細胞に対してＡＲＡアッセイを行った。データは、コロニー形成単位ごとに１時間あたりに形成されるエチレン量の１０を底とする対数として示されているため、エチレン形成量が多いほど、窒素固定が多いことを示す。窒素源として提供された０ｍＭ（上パネル）または５ｍＭ（下パネル）リン酸アンモニウムを用いてアッセイを行った。修飾された株は、６－１６９７および６－１６９８（親株６－９２３）である。ＣＩ００６を陰性対照として使用した。データを図３８Ａに示す。修飾された株の窒素固定活性は、親と比較して増加している。したがって、細胞の窒素固定活性に悪影響を与えることなく、ｏｔｓＢの修飾を行うことができる。
修飾された細胞に対してアンモニウム排泄アッセイを行った。データは、１時間あたりのＮＨ４＋排泄量（ｍＭ／ＯＤ）として表示され、それにより値が高いほど窒素排泄量が多いことを示す。データは、異なる日に行われた実験を表している。データを図３８Ｂに示す。窒素排泄活性は、親と比較して増加した。したがって、細胞の窒素固定活性に悪影響を与えることなく、ｏｔｓＢの修飾を行うことができる。
実施例２０：ｃｙｓＺ突然変異は窒素固定を増加させる
ＣｙｓＺは、硫酸塩の取り込みを媒介し、その後、ニトロゲナーゼ活性に必要な補因子を含む細菌細胞での硫黄含有化合物の合成に利用される硫黄を提供する。ｃｙｓＺなどの硫黄輸送遺伝子の発現を増加させると、機能性ニトロゲナーゼ複合体の量を増加させることができる。この目的で、ｃｙｓＺ修飾を用いて２つのＫｏｓａｋｏｎｉａ ｓａｃｃｈａｒｉ株を作成し、これらを６－１６９１および６－９１６として示す。アセチレン還元アッセイ（ＡＲＡ）を行い、データをｃｙｓＺに修飾のない親株と比較した（株６－３４６および６－４３５は、それぞれ６－１６９１および６－９１６の親であった）。株ＣＩ００６を陰性対照として使用し、６－１６９１およびその親を５ｍＭリン酸アンモニウムでアッセイし（図３９Ａ）、６－９１６およびその親を５ｍＭグルタミンでアッセイした（図３９Ｂ）ことを除いて、ＡＲＡアッセイを両方の株で同様に行った。どちらの株も、ＷＴ株および親株よりも増加したニトロゲナーゼ活性を呈する。６－１６９１によって示された増加は約１４倍であったが、株６－９１６は、その親よりも約６倍高い窒素固定活性を有していた。
実施例２１：バイオフィルム形成
バイオフィルム形成は、関連する植物に提供される窒素の量に影響を与える可能性がある。植物の根のバイオフィルム形成の増加は、植物に提供される窒素の量を増加させることができる。
いくつかの遺伝子は、バイオフィルム形成を調節することができる。例えば、ｓｍＺは、バイオフィルム調節の負の調節因子であり得る。ｓｍＺの機能が低減または排除されるようなｓｍＺの突然変異は、細菌のバイオフィルム形成を増加させる可能性がある。突然変異誘発を行って、窒素排泄および固定活性が増加した株のｓｍＺを突然変異させ、細菌のｓｍＺ突然変異体ライブラリーを作成することができる。
一部のタンパク質は、バイオフィルム形成を促進することができる。例えば、ｌａｐＡを含む大きな付着タンパク質は、バイオフィルム形成を促進し得る。ウエスタンブロットによって検出されるように、より多くのｌａｐＡが産生されるように、ｌａｐＡの発現を調節する１つ以上のプロモーターを上方調節することができる。
ｓｍＺ突然変異およびｌａｐＡ上方調節を持つ株を生成して、試験用の株のｓｍＺ／ｌａｐＡライブラリーを生成することができる。ｓｍＺ／ＬａｐＡ株は、バイオフィルム形成を増加させることができ、ｓｍＺ突然変異またはｌａｐＡ突然変異のみを有する株よりも高いバイオフィルム形成能を有し得る。
株を溶原性緩衝液（ＬＢ）で成長させ、苗とともに土壌に接種することができる。苗、土壌、および細菌株は、鉢の中、畑地中、屋内、または屋外に存在し得る。苗は、春、夏、秋、または冬に植えることができる。空気の湿度は、約０％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％であり得る。雨、霧、曇り、または晴れであり得る。温度は、約４℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、または４５℃であり得る。苗は、夜明け、朝、正午、午後、夕暮れ、夕方、または夜に植えることができる。苗は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、または３０日間成長させておくことができる。時間の経過後、植物を掘り起こして、根のバイオフィルムの量を測定することができる。
実施例２２：酸素感受性
ニトロゲナーゼ酵素の酸素感受性は、窒素固定、窒素排泄、またはその両方に影響を与える可能性がある。ニトロゲナーゼ酵素の酸素感受性を低下させると、窒素固定活性が増加し得るか、窒素排泄活性が増加し得るか、またはその両方が起こり得る。酸素が減少した１つ以上のニトロゲナーゼ酵素を含む細菌の株は、その株が増加した窒素固定活性または増加した窒素排泄活性を示すように作成され得る。
遺伝子修飾は、野生型または遺伝的に改良された窒素固定活性、窒素排泄活性、または両方を備えた細菌細胞で行うことができる。遺伝子修飾は、１つ以上のニトロゲナーゼ酵素遺伝子が突然変異誘発プロトコルによってミュートされ、そのような株のライブラリーを作成することができるように、細胞に導入することができる。
ライブラリーの各株を、酸素感受性アッセイにかけることができる。これを行うには、ＡＭＭおよびＡＲＡアッセイを、様々な酸素濃度の条件下で行うことができる。酸素濃度は、１μＭ～６μＭの範囲であり得る。データを分析して、株が減少した窒素排泄または窒素固定活性を酸素濃度の関数として示すかどうかを判断することができる。修飾されたニトロゲナーゼ酵素を持ついくつかの菌株は、酸素濃度が増加するにつれて、窒素排泄または窒素固定活性の減少をほとんどまたはまったく示さない場合がある。
実施例２３：ｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ、ｍｏｄＥを変化させる
モリブデン取り込み経路は、細胞内へのモリブデンの取り込みを可能にする細菌の代謝経路を指し得る。モリブデンは、窒素固定の補因子として機能することができる。細胞のモリブデンの取り込みを増加させることは、窒素固定、窒素排泄、または両方を増加させる可能性がある。
モリブデン輸送経路の主要な酵素には、ｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ、およびｍｏｄＥが含まれる。細菌株におけるこれらの遺伝子のうちのいずれか１つ、２つ、または３つの修飾または上方調節は、細胞内のモリブデンの取り込みを増加させ、細胞内の窒素固定、窒素排泄、または両方を増加させることができる。
遺伝子修飾は、修飾がモリブデン輸送の増加をもたらすように、細菌細胞内のこれらの遺伝子に対して行うことができる。そのような修飾を特定するために、ｍｏｄＡ、ｍｏｄＢ、またはｍｏｄＣをコードする遺伝子の活性部位内およびその周辺で突然変異誘発を行うことができる。突然変異体のライブラリーは、各遺伝子について構築され得る。次いで、モリブデン取り込み活性の増加について、これらのライブラリーをスクリーニングすることができる。これらのライブラリーは、野生型細胞から、または窒素固定の増加、窒素排泄の増加、または両方を示すようにすでに修飾されている細胞から作成することができる。
モリブデン取り込み経路にある１つ以上の遺伝子が上方調節されるように、これらの細胞で遺伝子修飾を行うことができる。変異体のライブラリーはまた、モリブデン取り込み経路における１つ以上の遺伝子のプロモーター活性が増加するように構築することもできる。例えば、ｍｏｄＡＢＣプロモーターは、転写を増加させるために遺伝的に調整することができる。ウエスタンブロッティングを使用して、どの株が１つ以上のモリブデン取り込み遺伝子の発現を増加させたかを判断することができ、これらの株は、目的の変異株である可能性がある。
モリブデン取り込み活性の増加についてスクリーニングするために、目的の各突然変異体または変異体、および各株の突然変異していない親株を、ＬＢ培地の９６ウェルプレートの３つのウェルに接種して成長させることができる。細胞がＯＤ＝０．８に達したら、各突然変異体のウェルのうちの１つを収穫し、それにより細胞をペレット化し、過剰なＬＢを洗い流し、細胞を再懸濁し、溶解して、９６ウェルプレートでの分光分析用に調製する。分光分析を使用してモリブデン含有量を測定し、試料中のベースラインモリブデン含有量を確立することができる。残りの試料は、追加の量が各ウェルの総容量の１０％以下になるように、ＬＢ中のテトラオキシアニオンモリブデン酸塩としてのモリブデンまたはＬＢのみを添加することができる。アッセイにおける各ウェルのモリブデンの最終濃度は、１０ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、または１００ｎＭのいずれかであり得、２つ以上の濃度を試験することができる。アッセイは、１秒、１０秒、３０秒、１分、２分、３分、４分、５分、１０分、２０分、３０分、および６０分のうちの１つ以上で実施することができる。
最初に、各濃度について、時間の関数として各細胞に輸送されたモリブデンの量をプロットして、アッセイの最適な期間を決定することができる。最適な期間は、定常状態に到達していない時間間隔であり得、反応速度は依然として線形である。次いで、最適な期間で、濃度の関数として各細胞に輸送されたモリブデンの量をプロットすることができ、ミカエリス・メンテン分析を行うことができる。Ｋｍ比較によって決定された、突然変異および修飾されていない親株よりもモリブデン輸送の有意な増加（ｐ＜０．０５）を示す目的の突然変異株または変異体を、さらなるアッセイのために選択することができる。
次に、さらなるアッセイのために選択された各株を、本明細書に記載のＡＭＭアッセイおよびＡＲＡアッセイに供して、それぞれ窒素排泄および固定を測定することができる。これらの突然変異または変異体のうちの１つ以上は、これらの細菌株のうちの１つ以上のＡＭＭ、ＡＲＡ、または両方を増加させる可能性がある。
実施例２４：鉄輸送の増加は窒素固定を増加させる
鉄取り込み経路は、細胞内への鉄の取り込みを可能にする細菌の代謝経路を指し得る。鉄は、窒素固定を促進する補因子として機能することができる。細胞の鉄の取り込みを増加させることは、窒素固定、窒素排泄、または両方を増加させる可能性がある。
鉄輸送経路の主要な酵素には、ｅｘｂＡ、ｅｘｂＢ、およびｔｏｎＢが含まれ得る。細菌株におけるこれらの遺伝子のうちのいずれか１つ、２つ、または３つの修飾または上方調節は、細胞内の鉄の取り込みを増加させ、細胞内の窒素固定、窒素排泄、または両方を増加させることができる。
遺伝子修飾は、修飾が鉄輸送の増加をもたらすように、細菌細胞内のこれらの遺伝子に対して行うことができる。そのような修飾を特定するために、ｅｘｂＡ、ｅｘｂＢ、またはｔｏｎＢをコードする遺伝子の活性部位内およびその周辺で突然変異誘発を行うことができる。突然変異体のライブラリーは、各遺伝子について構築され得る。次いで、鉄取り込み活性の増加について、これらのライブラリーをスクリーニングすることができる。これらのライブラリーは、野生型細胞から、または窒素固定の増加、窒素排泄の増加、または両方を示すようにすでに修飾されている細胞から作成することができる。
鉄取り込み経路にある１つ以上の遺伝子が上方調節されるように、これらの細胞で遺伝子修飾を行うことができる。変異体のライブラリーはまた、鉄取り込み経路における１つ以上の遺伝子のプロモーター活性が増加するように構築することもできる。ウエスタンブロッティングを使用して、どの株が１つ以上の鉄取り込み遺伝子の発現を増加させたかを判断することができ、これらの株は、目的の変異株である可能性がある。
鉄取り込み活性の増加についてスクリーニングするために、目的の各突然変異体または変異体、および各株の突然変異していない親株を、ＬＢ培地の９６ウェルプレートの３つのウェルに接種して成長させることができる。細胞がＯＤ＝０．８に達したら、各突然変異体のウェルのうちの１つを収穫し、それにより細胞をペレット化し、過剰なＬＢを洗い流し、細胞を再懸濁し、溶解して、９６ウェルプレートでの分光分析用に調製する。分光分析を使用して鉄含有量を測定し、試料中のベースライン鉄含有量を確立することができる。残りの試料は、追加の量が各ウェルの総容量の１０％以下になるように、ＬＢ中のＦｅＳＯ４としての鉄またはＬＢのみを添加することができる。鉄の溶解度を高めるために、０．１ｍＭの酢酸（最終濃度）を含めてもよい。アッセイにおける各ウェルの鉄の最終濃度は、１０ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、または１００μＭのうちのいずれかであり得、２つ以上の濃度を試験することができる。アッセイは、１秒、１０秒、３０秒、１分、２分、３分、４分、５分、１０分、２０分、３０分、および６０分のうちの１つ以上で実施することができる。
最初に、各濃度について、時間の関数として各細胞に輸送された鉄の量をプロットして、アッセイの最適な期間を決定することができる。最適な期間は、定常状態に到達していない時間間隔であり得、反応速度は依然として線形である。次いで、最適な期間にわたって、濃度の関数として各細胞に輸送された鉄の量をプロットすることができ、ミカエリス・メンテン分析を行うことができる。Ｋｍ比較によって決定された、突然変異および修飾されていない親株よりも鉄輸送の有意な増加（ｐ＜０．０５）を示す目的の突然変異株または変異体を、さらなるアッセイのために選択することができる。
次に、さらなるアッセイのために選択された各株を、本明細書に記載のＡＭＭアッセイおよびＡＲＡアッセイに供して、それぞれ窒素排泄および固定を測定することができる。これらの突然変異または変異体のうちの１つ以上は、これらの細菌株のうちの１つ以上のＡＭＭ、ＡＲＡ、または両方を増加させる可能性がある。
実施例２５：シデロフォア生合成遺伝子の増加は窒素固定を増加させ得る
ｙｈｆシデロフォアまたは鉄キレート化分子は、細菌における鉄の取り込みに影響を与える可能性がある。ｙｈｆシデロフォアの産生を増加させると、細菌における鉄の取り込みを増加させることができる。ｙｈｆＡ、ｙｕｓＶ、ｓｂｎＡ、ｙｆｉＺ、ｆｉｕ、およびｆｕｒを含むシデロフォア遺伝子の修飾は、ｙｈｆシデロフォアの産生を増加させることができ、次いで細胞への鉄の取り込みを増加させ得る。これらの修飾は、窒素固定または排泄の増加につながる可能性がある。
遺伝子修飾は、修飾がシデロフォア産生の増加をもたらすように、細菌細胞内のこれらの遺伝子に対して行うことができる。そのような修飾を同定するために、突然変異誘発を、ｙｈｆＡ、ｙｕｓＶ、ｓｂｎＡ、ｙｆｉＺ、ｆｉｕ、またはｆｕｒをコードする遺伝子の活性部位内およびその周辺で行うことができる。突然変異体のライブラリーは、各遺伝子について構築され得る。次いで、これらのライブラリーを、シデロフォア産生の増加についてスクリーニングすることができる。これらのライブラリーは、野生型細胞から、または窒素固定の増加、窒素排泄の増加、または両方を示すようにすでに修飾されている細胞から作成することができる。シデロフォア産生の増加をスクリーニングするために、各突然変異体をＯＤ＝０．８まで成長させ、次いで、過剰であるが毒性ではない量のシデロフォア前駆体を添加して、３０分または６０分間インキュベートする。割り当てられた期間の後に産生されたシデロフォアの量を正規化することができ、増加したシデロフォア産生を示す菌株は、増加した鉄輸送についてスクリーニングすることができる。
鉄取り込み活性の増加についてスクリーニングするために、目的の各突然変異体または変異体、および各株の突然変異していない親株を、ＬＢ培地の９６ウェルプレートの３つのウェルに接種して成長させることができる。細胞がＯＤ＝０．８に達したら、各突然変異体のウェルのうちの１つを収穫し、それにより細胞をペレット化し、過剰なＬＢを洗い流し、細胞を再懸濁し、溶解して、９６ウェルプレートでの分光分析用に調製する。分光分析を使用して鉄含有量を測定し、試料中のベースライン鉄含有量を確立することができる。残りの試料は、追加の量が各ウェルの総容量の１０％以下になるように、ＬＢ中のＦｅＳＯ４としての鉄またはＬＢのみを添加することができる。鉄の溶解度を高めるために、０．１ｍＭの酢酸（最終濃度）を含めてもよい。アッセイにおける各ウェルの鉄の最終濃度は、１０ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、または１００μＭのうちのいずれかであり得、２つ以上の濃度を試験することができる。アッセイは、１秒、１０秒、３０秒、１分、２分、３分、４分、５分、１０分、２０分、３０分、および６０分のうちの１つ以上で実施することができる。
最初に、各濃度について、時間の関数として各細胞に輸送された鉄の量をプロットして、アッセイの最適な期間を決定することができる。最適な期間は、定常状態に到達していない時間間隔であり得、反応速度は依然として線形である。次いで、最適な期間にわたって、濃度の関数として各細胞に輸送された鉄の量をプロットすることができ、ミカエリス・メンテン分析を行うことができる。Ｋｍ比較によって決定された、突然変異および修飾されていない親株よりも鉄輸送の有意な増加（ｐ＜０．０５）を示す目的の突然変異株または変異体を、さらなるアッセイのために選択することができる。
次に、さらなるアッセイのために選択された各株を、本明細書に記載のＡＭＭアッセイおよびＡＲＡアッセイに供して、それぞれ窒素排泄および固定を測定することができる。これらの突然変異または変異体のうちの１つ以上は、これらの細菌株のうちの１つ以上のＡＭＭ、ＡＲＡ、または両方を増加させる可能性がある。
実施例２６：ｄｃｔＡ１およびｄｃｔＡ２
ｄｃｔＡ１およびｄｃｔＡ２は、内膜を横切るペリプラズムからのフマル酸ジカルボキシレート、Ｌ－およびＤ－リンゴ酸塩、ならびにより少ない程度でコハク酸の好気性輸送に関与している。これらの遺伝子への修飾は、微生物のコロニー形成に影響を与える可能性がある。
ｄｃｔＡ１（株１３７～１８６１）およびｄｃｔＡ２（株１３７～１９０５）への修飾は、ＡＭＭアッセイで測定された高窒素排泄を伴う株で作成された。親株は、１３７－１９０５として示した。
修飾が細胞の窒素排泄活性に悪影響を与えるかどうかを決定するために、細胞に対してＡＭＭアッセイを行った。修飾は、細胞の窒素排泄活性を低減しなかった（図４０Ａ）。したがって、ｄｃｔＡ１およびｄｃｔＡ２は、窒素排泄を低減することなく修飾することができる。
コロニー形成アッセイを、ｑＰＣＲを使用して細胞上で行い、修飾が細胞のコロニー形成特性に影響を与えたかどうかを判断した。簡単に言えば、発芽後に植物に約１０９個の細胞を接種し、４週間成長させ、その時点で収穫した。種子根および最初の節を合わせた試料は、植物の冠部の下約１～２インチから採取した。収集後、試料を溶解し、ｑＰＣＲを行ってＣＦＵ／ｇｆｗを決定した。データを図４０Ｂに示す。どちらの株もコロニー形成の増加を示した。したがって、ｄｃｔＡ１およびｄｃｔＡ２の修飾は、細胞のコロニー形成を増加させることができる。
実施例２７：乾燥耐性を高める
乾燥耐性を向上させることで、種子のコーティング、または植物もしくは畑地への他の乾式適用で使用される株のコロニー形成を増加させることができる。遺伝子操作された微生物は、ｒｐｏＥ遺伝子に作動可能に連結されたアラビノースプロモーターを含むように作成される。遺伝子操作された微生物および操作されていない親対照を、乾燥させる前に、アラビノースで補足した培地で４８時間培養する。乾燥後、操作された株および操作されていない株のそれぞれの一部を、アラビノースを含まない培地で復活させ、２４時間後の培地中の微生物数を測定する。操作された株を含む培地は、操作されていない親株を含む培地よりも多くの微生物を含む。
乾燥した微生物を、トウモロコシ種子に適用し、トウモロコシ種子の発芽に好適な条件下の温室で、アラビノースを欠く土壌に植える。４週間後、苗を収穫し、植物の根にある操作された微生物および操作されていない微生物の両方のコロニー形成単位の数を測定する。操作された微生物に曝露された植物は、操作されていない親株に曝露された植物よりも多くの微生物と関連する。
実施例２８：ｎｉｆＡ ＲＢＳの変更はｎｉｆＨ転写を増加させる
ｎｉｆＡの上流に挿入されたプロモーターＲＢＳ配列は、ｎｉｆＨ：ｎｉｆＡ転写の比率の増加につながり、挿入されたＲＢＳの強度の増加に起因する活性ＮｉｆＡタンパク質の量の増加を示し、ＮｉｆＡの翻訳開始率が高くなる。
株は、ｎｉｆＬ遺伝子を削除し、プロモーターおよび宿主のゲノムの他の場所に見られる遺伝子のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）の両方を含む、ｎｉｆＡの上流に配列を挿入することによって生成された。２つの生物学的複製物を富化培地で一晩生育し、１０ｍＭグルタミンで補足した最小培地で継代培養した。得られた培養物を分割し、固定窒素源または１０ｍＭグルタミンを含まないＡＲＡ培地で嫌気性培養物に接種するために使用した。５時間の嫌気性培養の後、各培養物の試料を採取し、ＲＮＡを抽出し、逆転写を行ってｃＤＮＡを生成し、ｑＰＣＲによって分析してｎｉｆＡおよびｎｉｆＨの転写を測定した。目的の遺伝子の転写産物を、異なる窒素条件で一貫した転写を示すハウスキーピング遺伝子ｈｅｌＤに正規化した。結果として得られた４つの試料の正規化データをプロットして、各株におけるｎｉｆＡ転写とｎｉｆＨ転写との関係を示した。図４１Ａおよび４１Ｂの改造された株は、ｎｉｆＡ転写よりもｎｉｆＨをプロットする線形最適線で増加した勾配を示し、ＮｉｆＡの翻訳開始率の増加により、各ｎｉｆＡ転写産物がこれらの株でより多くのｎｉｆＨ転写産物をもたらすことを示している。
（表８）本明細書に記載の株
Figure 2023100703000012
Figure 2023100703000013
Figure 2023100703000014
Figure 2023100703000015
（表９）本明細書に記載のさらなる株
Figure 2023100703000016
Figure 2023100703000017
Figure 2023100703000018
Figure 2023100703000019
Figure 2023100703000020
Figure 2023100703000021
Figure 2023100703000022
Figure 2023100703000023
Figure 2023100703000024
Figure 2023100703000025
Figure 2023100703000026
Figure 2023100703000027
Figure 2023100703000028
Figure 2023100703000029
Figure 2023100703000030
添付の特許請求の範囲にかかわらず、本明細書に示される開示は、以下の項によっても定義される。
１．乾燥耐性が向上した微生物株。
２．ｒｐｏＥ発現が切り替え可能なプロモーターによって調節される、微生物株。
３．当該切り替え可能なプロモーターが、アラビノースプロモーターである、第２項に記載の微生物株。
４．ｒｓｅＡ遺伝子が下方調節されている、第２項に記載の微生物株。
５．当該切り替え可能なプロモーターが、化学物質で活性化され得るプロモーターである、第２項に記載の微生物株。
６．当該切り替え可能なプロモーターが、糖で活性化され得るプロモーターである、第２項に記載の微生物株。
７．当該切り替え可能なプロモーターが、アラビノースで活性化され得るプロモーターである、第２項に記載の微生物株。
８．微生物の乾燥耐性を高める方法であって、当該微生物を、切り替え可能なプロモーターに作動可能に連結されたｒｐｏＥ遺伝子を含有するように操作することと、バイオマス増殖の対数期中に当該切り替え可能なプロモーターを活性化することと、それにより当該微生物の乾燥耐性を高めることと、を含む、方法。
９．種子コーティング中に微生物の乾燥耐性を高める方法であって、当該微生物を、切り替え可能なプロモーターに作動可能に連結されたｒｐｏＥ遺伝子を含有するように操作することと、乾燥前に当該切り替え可能なプロモーターを活性化することと、それにより当該微生物の乾燥耐性を高めることと、を含む、方法。
１０．当該切り替え可能なプロモーターが、化学物質で活性化され得るプロモーターである、第９項に記載の方法。
１１．当該切り替え可能なプロモーターが、糖で活性化され得るプロモーターである、第９項に記載の方法。
１２．当該切り替え可能なプロモーターが、アラビノースで活性化され得るプロモーターである、第９項に記載の方法。
１３．当該切り替え可能なプロモーターが、バイオマス増殖の対数期中に活性化される、第９項に記載の方法。
１４．当該切り替え可能なプロモーターが、種子コーティング中に活性化される、第９項に記載の方法。
１５．当該微生物がまた、ｒｓｅＡの発現を減少させるように操作される、第９項に記載の方法。
１６．ｃｙｓＰに作動可能に連結された異種調節エレメントを含む、遺伝子操作された細菌。
１７．当該異種調節エレメントが、プロモーターである、第１６項に記載の遺伝子操作された細菌。
１８．当該異種調節エレメントが、当該遺伝子操作された細菌に固有である、第１６項に記載の遺伝子操作された細菌。
１９．ニトロゲナーゼ補因子の成分の細胞への輸送を触媒するタンパク質の発現増加をもたらす遺伝的変異を含む、遺伝子操作された細菌。
２０．ニトロゲナーゼ補因子の成分の細胞への輸送を触媒する当該タンパク質が、硫黄トランスポーター遺伝子である、第１９項に記載の遺伝子操作された細菌。
２１．当該硫黄トランスポーター遺伝子が、ｃｙｓＺである、第２０項に記載の遺伝子操作された細菌。
２２．当該硫黄トランスポーター遺伝子が、ｃｙｓＫである、第２０項に記載の遺伝子操作された細菌。
２３．当該硫黄トランスポーター遺伝子が、ｃｙｓＴである、第２０項に記載の遺伝子操作された細菌。
２４．当該硫黄トランスポーター遺伝子が、ｃｙｓＷである、第２０項に記載の遺伝子操作された細菌。
２５．当該硫黄トランスポーター遺伝子が、ｃｙｓＡである、第２０項に記載の遺伝子操作された細菌。
２６．当該硫黄トランスポーター遺伝子が、ｓｂｐである、第２０項に記載の遺伝子操作された細菌。
２７．当該遺伝的変異が、ｃｙｓＺＫオペロンの発現の増加をもたらす、第１９項に記載の遺伝子操作された細菌。
２８．当該遺伝的変異が、ｃｙｓＰＴＷＡオペロンの発現の増加をもたらす、第１９項に記載の遺伝子操作された細菌。
２９．ニトロゲナーゼ補因子の成分の細胞への輸送を触媒する当該タンパク質が、モリブデントランスポーター遺伝子である、第１９項に記載の遺伝子操作された細菌。
３０．当該モリブデントランスポーター遺伝子が、ｍｏｄＥである、第２９項に記載の遺伝子操作された細菌。
３１．当該モリブデントランスポーター遺伝子が、ｍｏｄＢである、第２９項に記載の遺伝子操作された細菌。
３２．当該モリブデントランスポーター遺伝子が、ｍｏｄＡである、第２９項に記載の遺伝子操作された細菌。
３３．当該遺伝的変異が、ｍｏｄＥＢオペロンの発現の増加をもたらす、第１９項に記載の遺伝子操作された細菌。
３４．当該遺伝的変異が、ｍｏｄＥＢＡオペロンの発現の増加をもたらす、第１９項に記載の遺伝子操作された細菌。
３５．ニトロゲナーゼ補因子の成分の細胞への輸送を触媒する当該タンパク質が、鉄トランスポーター遺伝子である、第１９項に記載の遺伝子操作された細菌。
３６．当該鉄トランスポーター遺伝子が、ｅｘｂＡである、第３５項に記載の遺伝子操作された細菌。
３７．当該鉄トランスポーター遺伝子が、ｅｘｂＢである、第３５項に記載の遺伝子操作された細菌。
３８．当該鉄トランスポーター遺伝子が、ｔｏｎＢである、第３５項に記載の遺伝子操作された細菌。
３９．当該遺伝的変異が、ｅｘｂＡＢオペロンの発現の増加をもたらす、第１９項に記載の遺伝子操作された細菌。
４０．当該遺伝的変異が、プロモーターの挿入を含む、第１９項～第３９項のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
４１．遺伝子操作された細菌であって、当該遺伝子操作された細菌が、シデロフォア生合成遺伝子の発現の変化を含む、遺伝子操作された細菌。
４２．当該シデロフォア生合成遺伝子が、ｉｓｙｈｆＡである、第４１項に記載の遺伝子操作された細菌。
４３．当該シデロフォア生合成遺伝子が、ｙｕｓＶである、第４１項に記載の遺伝子操作された細菌。
４４．当該シデロフォア生合成遺伝子が、ｓｂｎＡである、第４１項に記載の遺伝子操作された細菌。
４５．当該シデロフォア生合成遺伝子が、ｙｆｉＺである、第４１項に記載の遺伝子操作された細菌。
４６．当該シデロフォア生合成遺伝子が、ｆｉｕである、第４１項に記載の遺伝子操作された細菌。
４７．当該シデロフォア生合成遺伝子が、ｆｕｒである、第４１項に記載の遺伝子操作された細菌。
４８．ｇｌｇＡの遺伝的変異を含む遺伝子操作された細菌であって、当該遺伝子操作された細菌が、ｇｌｇＡの当該遺伝的変異のない同じ種の細菌と比較して、窒素固定活性が増加している、遺伝子操作された細菌。
４９．当該遺伝的変異が、ｇｌｇＡの発現の低下をもたらす、第４７項に記載の遺伝子操作された細菌。
５０．ＮｉｆＡの翻訳の増加をもたらす非天然のリボソーム結合部位を含む、遺伝子操作された細菌。
５１．ＮｉｆＡ遺伝子の少なくとも２つのコピーを含む、遺伝子操作された細菌。
５２．当該遺伝子操作された細菌が、ＮｉｆＡ遺伝子の少なくとも３つのコピーを含む、第５１項に記載の遺伝子操作された細菌。
５３．当該遺伝子操作された細菌が、ＮｉｆＡ遺伝子の少なくとも４つのコピーを含む、第５１項に記載の遺伝子操作された細菌。
５４．当該遺伝子操作された細菌が、ＮｉｆＡ遺伝子の少なくとも５つのコピーを含む、第５１項に記載の遺伝子操作された細菌。
５５．当該遺伝子操作された細菌が、ＮｉｆＡ遺伝子の少なくとも６つのコピーを含む、第５１項に記載の遺伝子操作された細菌。
５６．当該遺伝子操作された細菌が、ＮｉｆＡ遺伝子の少なくとも７つのコピーを含む、第５１項に記載の遺伝子操作された細菌。
５７．当該遺伝子操作された細菌が、ＮｉｆＡ遺伝子の１０を超えるコピーを含む、第５１項に記載の遺伝子操作された細菌。
５８．ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、およびｎｉｆＫからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子に作動可能に連結された異種プロモーターを含む遺伝子操作された細菌であって、当該異種プロモーターが、宿主微生物の遺伝物質に由来する、遺伝子操作された細菌。
５９．活性酸素種スカベンジング遺伝子に遺伝的変異体を含む、遺伝子操作された細菌。
６０．当該活性酸素種スカベンジング遺伝子が、ｇｒｘＡである、第５９項に記載の遺伝子操作された細菌。
６１．当該活性酸素種スカベンジング遺伝子が、ｇｒｘＢである、第５９項に記載の遺伝子操作された細菌。
６２．当該活性酸素種スカベンジング遺伝子が、ｇｒｘＣである、第５９項に記載の遺伝子操作された細菌。
６３．当該活性酸素種スカベンジング遺伝子が、ｇｒｘＤである、第５９項に記載の遺伝子操作された細菌。
６４．当該活性酸素種スカベンジング遺伝子が、ｔｒｘＡである、第５９項に記載の遺伝子操作された細菌。
６５．当該活性酸素種スカベンジング遺伝子が、ｔｒｘＣである、第５９項に記載の遺伝子操作された細菌。
６６．当該活性酸素種スカベンジング遺伝子が、ｔｐｘである、第５９項に記載の遺伝子操作された細菌。
６７．ｇｒｘＡＢＣＤオペロンの発現の変化をもたらす遺伝子を含む、遺伝子操作された細菌。
６８．結果として、同じ種の操作されていないジアゾ栄養細菌よりも少なくとも０．０５％酸素の条件下で増加したレベルのニトロゲナーゼ活性をもたらす遺伝的変異体を含む、遺伝子操作された細菌。
６９．当該遺伝的変異体が、同じ種の操作されていないジアゾ栄養細菌よりも少なくとも０．１％酸素の条件下で増加したレベルのニトロゲナーゼ活性をもたらす、第６８項に記載の遺伝子操作された細菌。
７０．当該遺伝的変異体が、同じ種の操作されていないジアゾ栄養細菌よりも少なくとも０．５％酸素の条件下で増加したレベルのニトロゲナーゼ活性をもたらす、第６８項に記載の遺伝子操作された細菌。
７１．当該遺伝的変異体が、同じ種の操作されていないジアゾ栄養細菌よりも少なくとも１％酸素の条件下で増加したレベルのニトロゲナーゼ活性をもたらす、第６８項に記載の遺伝子操作された細菌。
７２．当該遺伝的変異体が、ｃｙｄＡＢＸオペロンの発現の変化をもたらす、第６８項に記載の遺伝子操作された細菌。
７３．当該遺伝的変異体が、ｃｙｄＡＢオペロンの発現の変化をもたらす、第６８項に記載の遺伝子操作された細菌。
７４．当該遺伝的変異体が、ｃｙｄＸ遺伝子の発現の変化をもたらす、第６８項に記載の遺伝子操作された細菌。
７５．当該遺伝的変異体が、ｃｙｄＡ遺伝子の発現の変化をもたらす、第６８項に記載の遺伝子操作された細菌。
７６．当該遺伝的変異体が、ｃｙｄＢ遺伝子の発現の変化をもたらす、第６８項に記載の遺伝子操作された細菌。
７７．当該遺伝的変異体が、ｇｌｂＮ遺伝子の発現の変化をもたらす、第６８項に記載の遺伝子操作された細菌。
７８．当該遺伝的変異体が、ｆｉｘＮＯＰＱオペロンの発現の変化をもたらす、第６８項に記載の遺伝子操作された細菌。
７９．当該遺伝的変異体が、ｆｉｘＮ遺伝子の発現の変化をもたらす、第６８項に記載の遺伝子操作された細菌。
８０．当該遺伝的変異体が、ｆｉｘＯ遺伝子の発現の変化をもたらす、第６８項に記載の遺伝子操作された細菌。
８１．当該遺伝的変異体が、ｆｉｘＰ遺伝子の発現の変化をもたらす、第６８項に記載の遺伝子操作された細菌。
８２．当該遺伝的変異体が、ｆｉｘＱ遺伝子の発現の変化をもたらす、第６８項に記載の遺伝子操作された細菌。
８３．ａｓｎＢの修飾を含む、遺伝子操作された細菌。
８４．ａｓｎＢ、ａｓｎＡ、ｇｌｎＬ、ウリジリルトランスフェラーゼａｍｔＢ、およびＧＤＨからなる群から選択される遺伝子の修飾を含む、遺伝子操作された細菌。
８５．当該遺伝的変異体が、ａｓｎＢ遺伝子の発現の変化をもたらす、第８４項に記載の遺伝子操作された細菌。
８６．当該遺伝的変異体が、ａｓｎＡ遺伝子の発現の変化をもたらす、第８４項に記載の遺伝子操作された細菌。
８７．当該遺伝的変異体が、ｇｌｎＬ遺伝子の発現の変化をもたらす、第８４項に記載の遺伝子操作された細菌。
８８．当該遺伝的変異体が、ウリジリルトランスフェラーゼ遺伝子の発現の変化をもたらす、第８４項に記載の遺伝子操作された細菌。
８９．当該遺伝的変異体が、ＧＤＨ遺伝子の発現の変化をもたらす、第８４項に記載の遺伝子操作された細菌。
９０．ｇｌｎＫの修飾を含む遺伝子操作された細菌であって、当該修飾が、遺伝子全体の欠失、実質的に遺伝子全体の欠失、ＡＣＴドメインの欠失、ＡＣＴドメインの５０％を超える欠失、ＡＣＴドメインの非活性化、およびＵＴａｓｅドメインの非活性化からなる群から選択される、遺伝子操作された細菌。
９１．ｇｌｎＤの修飾を含む遺伝子操作された細菌であって、当該修飾が、遺伝子全体の欠失、実質的に遺伝子全体の欠失、ＡＣＴドメインの欠失、ＡＣＴドメインの５０％を超える欠失、ＡＣＴドメインの非活性化、およびＵＴａｓｅドメインの非活性化からなる群から選択される、遺伝子操作された細菌。
９２．同じ種の操作されていない細菌と比較して、根圏での生存率が向上した遺伝子操作された細菌であって、糖トランスポーターの発現の増加をもたらす遺伝的変異を含む、細菌。
９３．当該糖トランスポーターが、ｄｃｔＡである、第９２項に記載の遺伝子操作された細菌。
９４．糖トランスポーターの発現の増加をもたらす遺伝的変異を含む、遺伝子操作された細菌。
９５．当該糖トランスポーターが、ｄｃｔＡである、第９４項に記載の遺伝子操作された細菌。
９６．同じ種の操作されていない細菌と比較して、根圏での生存率が向上した遺伝子操作された細菌であって、変化したクオラムシグナル伝達をもたらす遺伝的変異を含む、遺伝子操作された細菌。
９７．変化したクオラムシグナル伝達をもたらす当該遺伝的変異が、変化したクオラムクエンチングをもたらす、第９６項に記載の遺伝子操作された細菌。
９８．変化したクオラムシグナル伝達をもたらす当該遺伝的変異が、Ｙ２－ａｉｉＡ発現の変化をもたらす、第９６項に記載の遺伝子操作された細菌。
９９．変化したクオラムシグナル伝達をもたらす当該遺伝的変異が、ｙｔｎＰ発現の変化をもたらす、第９６項に記載の遺伝子操作された細菌。
１００．同じ種の操作されていない細菌と比較して、根圏での生存率が向上した遺伝子操作された細菌であって、根付着の増加をもたらす遺伝的変異を含む、遺伝子操作された細菌。
１０１．根付着の増加をもたらす当該遺伝的変異が、フェナジン生合成の変化をもたらす遺伝的変異を含む、第１００項に記載の遺伝子操作された細菌。
１０２．根付着の増加をもたらす当該遺伝的変異が、環状リポペプチド生合成の変化をもたらす遺伝的変異を含む、第１００項に記載の遺伝子操作された細菌。
１０３．根付着の増加をもたらす当該遺伝的変異が、アグルタニンの発現の変化をもたらす遺伝的変異を含む、第１００項に記載の遺伝子操作された細菌。
１０４．根付着の増加をもたらす当該遺伝的変異が、ｆｈａＢの発現の変化をもたらす遺伝的変異を含む、第１００項に記載の遺伝子操作された細菌。
１０５．根付着の増加をもたらす当該遺伝的変異が、ｆｈａＣの発現の変化をもたらす遺伝的変異を含む、第１００項に記載の遺伝子操作された細菌。
１０６．根付着の増加をもたらす当該遺伝的変異が、ｙｊｂＥの発現の変化をもたらす遺伝的変異を含む、第１００項に記載の遺伝子操作された細菌。
１０７．根付着の増加をもたらす当該遺伝的変異が、ｐｓｓＭの発現の変化をもたらす遺伝的変異を含む、第１００項に記載の遺伝子操作された細菌。
１０８．根付着の増加をもたらす当該遺伝的変異が、ａｃｓ遺伝子の発現の変化をもたらす遺伝的変異を含む、第１００項に記載の遺伝子操作された細菌。
１０９．根付着の増加をもたらす当該遺伝的変異が、ｏｔｓＡの発現の変化をもたらす遺伝的変異を含む、第１００項に記載の遺伝子操作された細菌。
１１０．根付着の増加をもたらす当該遺伝的変異が、ｏｔｓＡを含むオペロンの発現の変化をもたらす遺伝的変異を含む、第１００項に記載の遺伝子操作された細菌。
１１１．根付着の増加をもたらす当該遺伝的変異が、ｔｒｅＹの発現の変化をもたらす遺伝的変異を含む、第１００項に記載の遺伝子操作された細菌。
１１２．根付着の増加をもたらす当該遺伝的変異が、ｔｒｅＹを含むオペロンの発現の変化をもたらす遺伝的変異を含む、第１００項に記載の遺伝子操作された細菌。
１１３．バイオフィルム形成の増加をもたらす遺伝的変異を含む、遺伝子操作された細菌。
１１４．バイオフィルム形成の増加をもたらす当該遺伝的変異が、ｓｍＺの発現の変化をもたらす遺伝的変異を含む、第１１３項に記載の遺伝子操作された細菌。
１１５．バイオフィルム形成の増加をもたらす当該遺伝的変異が、ｌａｐＡの発現の変化をもたらす遺伝的変異を含む、第１１３項に記載の遺伝子操作された細菌。
１１６．バイオフィルム形成の増加をもたらす当該遺伝的変異が、ＡＨＬ生合成遺伝子の発現の変化をもたらす遺伝的変異を含む、第１１３項に記載の遺伝子操作された細菌。
１１７．バイオフィルム形成の増加をもたらす当該遺伝的変異が、ｐｈｏＢの発現の変化をもたらす遺伝的変異を含む、第１１３項に記載の遺伝子操作された細菌。
１１８．バイオフィルム形成の増加をもたらす当該遺伝的変異が、ｐｈｏＲの発現の変化をもたらす遺伝的変異を含む、第１１３項に記載の遺伝子操作された細菌。
１１９．バイオフィルム形成の増加をもたらす当該遺伝的変異が、ＭｕｃＡの発現の変化をもたらす遺伝的変異を含む、第１１３項に記載の遺伝子操作された細菌。
１２０．同じ種の操作されていない細菌と比較して、根圏での生存率が向上した遺伝子操作された細菌であって、細胞壁分解酵素の発現の増加をもたらす遺伝的変異を含む、細菌。
１２１．当該細胞壁分解酵素が、ポリガラクツロナーゼを含む、第１２０項に記載の遺伝子操作された細菌。
１２２．当該細胞壁分解酵素が、セルラーゼを含む、第１２０項に記載の遺伝子操作された細菌。
１２３．当該細胞壁分解酵素が、ｐｅｈＡを含む、第１２０項に記載の遺伝子操作された細菌。
１２４．当該遺伝子操作された細菌が、遺伝子操作されたジアゾ栄養細菌である、第１９～１２３項のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
１２５．当該遺伝子操作された細菌が、非属間である、第１９～１２３項のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
１２６．当該遺伝子操作された細菌が、属間である、第１９～１２３項のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
１２７．当該遺伝子操作された細菌が、外因性窒素の存在下で空中窒素を固定することができる、第１９～１２３項のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
１２８．当該遺伝子操作された細菌が、窒素固定遺伝子ネットワークの修飾を含む、第１９～１２３項のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
１２９．当該遺伝子操作された細菌が、ＮｉｆＡの修飾を含む、第１９～１２３項のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
１３０．当該遺伝子操作された細菌が、ＮｉｆＡの発現の増加をもたらす修飾を含む、第１９～１２３項のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
１３１．当該遺伝子操作された細菌が、ＮｉｆＬの修飾を含む、第１９～１２３項のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
１３２．当該遺伝子操作された細菌が、ＮｉｆＬの発現の低下をもたらす修飾を含む、第１９～１２３項のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
１３３．当該遺伝子操作された細菌が、ＮｉｆＨの修飾を含む、第１９～１２３項のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
１３４．当該遺伝子操作された細菌が、ＮｉｆＨの発現の増加をもたらす修飾を含む、第１９～１２３項のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
１３５．当該遺伝子操作された細菌が、Ｎｉｆクラスター遺伝子の発現の増加をもたらす修飾を含む、第１９～１２３項のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
１３６．当該遺伝子操作された細菌が、窒素同化遺伝子ネットワークの修飾を含む、第１９～１２３項のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
１３７．当該遺伝子操作された細菌が、ＧｌｎＥの修飾を含む、第１９～１２３項のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
１３８．当該遺伝子操作された細菌が、ＧｌｎＥの活性の低下をもたらす修飾を含む、第１９～１２３項のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
１３９．当該遺伝子操作された細菌が、ａｍｔＢの活性の低下をもたらす修飾を含む、第１９～１２３項のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
１４０．植物中の大気由来窒素の量を増加させる方法であって、当該植物を、第１９～１３９項のいずれか一項に記載の複数の当該遺伝子操作された細菌と接触させることを含む、方法。
１４１．当該遺伝子操作された細菌が、当該植物の種子に適用される、第１４０項に記載の方法。
１４２．当該遺伝子操作された細菌が、当該植物の苗に適用される、第１４０項に記載の方法。
１４３．当該遺伝子操作された細菌が、液体製剤で当該植物に適用される、第１４０項に記載の方法。
１４４．当該遺伝子操作された細菌が、植え付け後、ただし当該植物の収穫前に当該植物に適用される、第１４０項に記載の方法。
１４５．当該前記遺伝子操作された細菌が、側面施肥として当該植物に適用される、第１４０項に記載の方法。
１４６．当該遺伝子操作された細菌が、発芽後１ヶ月～８ヶ月の間に当該植物に適用される、第１４０項に記載の方法。
１４７．当該遺伝子操作された細菌が、発芽後２ヶ月～８ヶ月の間に当該植物に適用される、第１４０項に記載の方法。
１４８．当該遺伝子操作された細菌が、発芽後１ヶ月～３ヶ月の間に当該植物に適用される、第１４０項に記載の方法。
１４９．当該遺伝子操作された細菌が、発芽後３ヶ月～６ヶ月の間に当該植物に適用される、第１４０項に記載の方法。
１５０．当該植物が、穀物植物である、第１４０項に記載の方法。
１５１．当該植物が、トウモロコシ植物である、第１４０項に記載の方法。
１５２．当該植物が、稲植物である、第１４０項に記載の方法。
１５３．当該植物が、小麦植物である、第１４０項に記載の方法。
１５４．当該植物が、大豆植物である、第１４０項に記載の方法。
１５５．種子および種子コーティングを含む組成物であって、種子コーティングが、第１９～３９項のいずれか一項に記載の複数の当該遺伝子操作された細菌を含む、組成物。
１５６．当該種子が、穀物種子である、第１５５項に記載の組成物。
１５７．当該種子が、トウモロコシ種子、小麦種子、稲種子、大豆種子、ライ麦種子およびモロコシ種子からなる群から選択される、第１５５項に記載の組成物。
１５８．植物および第１９～３９のいずれか一項に記載の複数の当該遺伝子操作された細菌を含む、組成物
１５９．当該植物が、苗である、第１５８項に記載の組成物。
１６０．当該種子が、穀物種子である、第１５８項に記載の組成物。
１６１．当該種子が、トウモロコシ、稲、小麦、大豆、ライ麦、およびモロコシからなる群から選択される、第１５８項に記載の組成物。
１６２．微生物における窒素固定を増加させる方法であって、硫黄トランスポーターの活性の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１６３．微生物における窒素固定を増加させる方法であって、硫黄輸送遺伝子の発現の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１６４．微生物における窒素固定を増加させる方法であって、モリブデントランスポーターの活性の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１６５．微生物における窒素固定を増加させる方法であって、モリブデン輸送遺伝子の発現の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１６６．微生物における窒素固定を増加させる方法であって、鉄トランスポーターの活性の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１６７．微生物における窒素固定を増加させる方法であって、鉄輸送遺伝子の発現の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１６８．微生物における窒素固定を増加させる方法であって、シデロフォア生合成の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１６９．微生物における窒素固定を増加させる方法であって、シデロフォア生合成を制御する遺伝子の発現の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１７０．微生物における窒素固定を増加させる方法であって、活性酸素種スカベンジャーの活性の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１７１．微生物における窒素固定を増加させる方法であって、活性酸素種スカベンジング遺伝子の発現の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１７２．微生物における窒素固定を増加させる方法であって、クオラムシグナル伝達に関与するタンパク質の活性の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１７３．微生物における窒素固定を増加させる方法であって、クオラムシグナル伝達遺伝子の発現の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１７４．微生物における窒素固定を増加させる方法であって、アグルタニンの活性の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１７５．微生物における窒素固定を増加させる方法であって、アグルタニンの発現の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１７６．微生物における窒素固定を増加させる方法であって、バイオフィルム形成に関与するタンパク質の活性の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１７７．微生物における窒素固定を増加させる方法であって、バイオフィルム形成遺伝子の発現の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１７８．微生物における窒素固定を増加させる方法であって、ＡＨＬ生合成タンパク質の活性の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１７９．微生物における窒素固定を増加させる方法であって、ＡＨＬ生合成遺伝子の発現の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１８０．微生物における窒素固定を増加させる方法であって、細胞壁分解酵素の活性の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１８１．微生物における窒素固定を増加させる方法であって、細胞壁分解酵素の遺伝子の発現の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１８２．微生物における窒素固定を増加させる方法であって、窒素固定遺伝子ネットワークの変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１８３．微生物における窒素固定を増加させる方法であって、窒素同化遺伝子ネットワークの変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１８４．微生物による窒素固定を増加させる方法であって、ｒｐｏＥ、ｒｓｅＡ、ｃｙｓＰ、ｃｙｓＺ、ｃｙｓＫ、ｃｙｓＴ、ｃｙｓＷ、ｃｙｓＡ、ｓｂｐ、ｃｙｓＺＫオペロン、ｃｙｓＰＴＷＡオペロン、ｍｏｄＥ、ｍｏｄＢ、ｍｏｄＡ、ｍｏｄＥＢオペロン、ｍｏｄＥＢＡオペロン、ｅｘｂＡ、ｅｘｂＢ、ｔｏｎＢ、ｅｘｂＡＢオペロン、ｉｓｙｈｆＡ、ｙｕｓＶ、ｓｂｎＡ、ｙｆｉＺ、ｆｉｕ、ｆｕｒ、ｇｌｇＡ、ＮｉｆＡ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｇｒｘＡ、ｇｒｘＢ、ｇｒｘＣ、ｇｒｘＤ、ｔｒｘＡ、ｔｒｘＣ、ｔｐｘ、ｇｒｘＡＢＣＤオペロン、ｃｙｄＡＢＸオペロン、ｃｙｄＡＢオペロン、ｃｙｄＸ、ｃｙｄＡ、ｃｙｄｄＢ、ｇｌｂＮ、ｆｉｘＮＯＰＱ、ｆｉｘＮ、ｆｉｘＯ、ｆｏｘＰ、ｆｉｘＱ、ａｓｎＢ、ａｓｎＡ、ｇｌｎＬ、ウリジリルトランスフェラーゼ、ａｍｔＢ、ｇｌｎＫ、ＧＤＨ、およびｇｌｎＤからなる群における遺伝子に遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１８６．微生物によるアンモニウム排泄を増加させる方法であって、硫黄トランスポーターの活性の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１８７．微生物によるアンモニウム排泄を増加させる方法であって、硫黄輸送遺伝子の発現の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１８８．微生物によるアンモニウム排泄を増加させる方法であって、モリブデントランスポーターの活性の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１８９．微生物によるアンモニウム排泄を増加させる方法であって、モリブデン輸送遺伝子の発現の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１９０．微生物によるアンモニウム排泄を増加させる方法であって、鉄トランスポーターの活性の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１９１．微生物によるアンモニウム排泄を増加させる方法であって、鉄輸送遺伝子の発現の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１９２．微生物によるアンモニウム排泄を増加させる方法であって、シデロフォア生合成の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１９３．微生物によるアンモニウム排泄を増加させる方法であって、シデロフォア生合成を制御する遺伝子の発現の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１９４．微生物によるアンモニウム排泄を増加させる方法であって、活性酸素種スカベンジャーの活性の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１９５．微生物によるアンモニウム排泄を増加させる方法であって、活性酸素種スカベンジング遺伝子の発現の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１９６．微生物によるアンモニウム排泄を増加させる方法であって、クオラムシグナル伝達に関与するタンパク質の活性の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１９７．微生物によるアンモニウム排泄を増加させる方法であって、クオラムシグナル伝達遺伝子の発現の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１９８．微生物によるアンモニウム排泄を増加させる方法であって、アグルタニンの活性の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
１９９．微生物によるアンモニウム排泄を増加させる方法であって、アグルタニンの発現の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
２００．微生物によるアンモニウム排泄を増加させる方法であって、バイオフィルム形成に関与するタンパク質の活性の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
２０１．微生物によるアンモニウム排泄を増加させる方法であって、バイオフィルム形成遺伝子の発現の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
２０２．微生物によるアンモニウム排泄を増加させる方法であって、ＡＨＬ生合成タンパク質の活性の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
２０３．微生物によるアンモニウム排泄を増加させる方法であって、ＡＨＬ生合成遺伝子の発現の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
２０４．微生物によるアンモニウム排泄を増加させる方法であって、細胞壁分解酵素の活性の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
２０５．微生物によるアンモニウム排泄を増加させる方法であって、細胞壁分解酵素の遺伝子の発現の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
２０６．微生物によるアンモニウム排泄を増加させる方法であって、窒素固定遺伝子ネットワークの変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
２０７．微生物によるアンモニウム排泄を増加させる方法であって、窒素同化遺伝子ネットワークの変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
２０８．微生物によるアンモニウム排泄を増加させる方法であって、ｒｐｏＥ、ｒｓｅＡ、ｃｙｓＰ、ｃｙｓＺ、ｃｙｓＫ、ｃｙｓＴ、ｃｙｓＷ、ｃｙｓＡ、ｓｂｐ、ｃｙｓＺＫオペロン、ｃｙｓＰＴＷＡオペロン、ｍｏｄＥ、ｍｏｄＢ、ｍｏｄＡ、ｍｏｄＥＢオペロン、ｍｏｄＥＢＡオペロン、ｅｘｂＡ、ｅｘｂＢ、ｔｏｎＢ、ｅｘｂＡＢオペロン、ｉｓｙｈｆＡ、ｙｕｓＶ、ｓｂｎＡ、ｙｆｉＺ、ｆｉｕ、ｆｕｒ、ｇｌｇＡ、ＮｉｆＡ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｇｒｘＡ、ｇｒｘＢ、ｇｒｘＣ、ｇｒｘＤ、ｔｒｘＡ、ｔｒｘＣ、ｔｐｘ、ｇｒｘＡＢＣＤオペロン、ｃｙｄＡＢＸオペロン、ｃｙｄＡＢオペロン、ｃｙｄＸ、ｃｙｄＡ、ｃｙｄｄＢ、ｇｌｂＮ、ｆｉｘＮＯＰＱ、ｆｉｘＮ、ｆｉｘＯ、ｆｏｘＰ、ｆｉｘＱ、ａｓｎＢ、ａｓｎＡ、ｇｌｎＬ、ウリジリルトランスフェラーゼ、ａｍｔＢ、ｇｌｎＫ、ＧＤＨ、およびｇｌｎＤからなる群における遺伝子に遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
２０９．根圏における微生物の生存を増加させる方法であって、根付着に関与するタンパク質の活性の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
２１０．根圏における微生物の生存を増加させる方法であって、根付着に関与するタンパク質の遺伝子の発現の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
２１１．根圏における微生物の生存を増加させる方法であって、モリブデントランスポーターの活性の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
２１２．根圏における微生物の生存を増加させる方法であって、モリブデン輸送遺伝子の発現の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
２１３．根圏における微生物の生存を増加させる方法であって、鉄トランスポーターの活性の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
２１４．根圏における微生物の生存を増加させる方法であって、鉄輸送遺伝子の発現の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
２１５．根圏における微生物の生存を増加させる方法であって、シデロフォア生合成の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
２１６．根圏における微生物の生存を増加させる方法であって、シデロフォア生合成を制御する遺伝子の発現の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
２１７．根圏における微生物の生存を増加させる方法であって、活性酸素種スカベンジャーの活性の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
２１８．根圏における微生物の生存を増加させる方法であって、活性酸素種スカベンジング遺伝子の発現の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
２１９．根圏における微生物の生存を増加させる方法であって、クオラムシグナル伝達に関与するタンパク質の活性の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
２２０．根圏における微生物の生存を増加させる方法であって、クオラムシグナル伝達遺伝子の発現の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
２２１．根圏における微生物の生存を増加させる方法であって、アグルタニンの活性の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
２２２．根圏における微生物の生存を増加させる方法であって、アグルタニンの発現の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
２２３．根圏における微生物の生存を増加させる方法であって、バイオフィルム形成に関与するタンパク質の活性の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
２２４．根圏における微生物の生存を増加させる方法であって、バイオフィルム形成遺伝子の発現の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
２２５．根圏における微生物の生存を増加させる方法であって、ＡＨＬ生合成タンパク質の活性の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
２２６．根圏における微生物の生存を増加させる方法であって、ＡＨＬ生合成遺伝子の発現の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
２２７．根圏における微生物の生存を増加させる方法であって、細胞壁分解酵素の活性の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
２２８．根圏における微生物の生存を増加させる方法であって、細胞壁分解酵素の遺伝子の発現の変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
２２９．根圏における微生物の生存を増加させる方法であって、窒素固定遺伝子ネットワークの変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
２３０．根圏における微生物の生存を増加させる方法であって、窒素同化遺伝子ネットワークの変化をもたらす遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
２３１．根圏における微生物の生存を増加させる方法であって、ｆｈａＢ、ｆｈａＣ、ｙｊｂＥ、ｐｓｓＭ、ｏｔｓＡ、ｔｒｅＹ、ｓｍＺ、ｌａｐＡ、ｐｈｏＢ、ｐｈｏＲ、ＭｕｃＡ、およびｐｅｈＡからなる群における遺伝子に遺伝子修飾を導入することを含む、方法。
配列情報
SEQUENCE LISTING
<110> PIVOT BIO, INC.
<120> GENE TARGETS FOR NITROGEN FIXATION TARGETING FOR IMPROVING PLANT
TRAITS
<150> US 62/577,149
<151> 2017-10-25
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5

<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
"LAGLIDADG" family peptide motif sequence
<400> 1
Leu Ala Gly Leu Ile Asp Ala Asp Gly
1 5

<210> 2
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 2
gttgatcaga ccgatgttcg gaccttccaa ggtttcgatc ggacatacgc gaccgtagtg 60
ggtcgggtgt acgtctcgaa cttcaaagcc 90

Claims (47)

  1. ｇｌｎＤの修飾を含む遺伝子操作された細菌であって、前記修飾が、遺伝子全体の欠失、実質的に遺伝子全体の欠失、ＡＣＴドメインの欠失、ＡＣＴドメインの５０％を超える欠失、ＡＣＴドメインの非活性化、およびＵＴａｓｅドメインの非活性化からなる群から選択される、遺伝子操作された細菌。
  2. ｇｌｎＡの発現または活性の変化をもたらすｇｌｎＡの修飾を含む、遺伝子操作された細菌。
  3. 前記修飾が、ｇｌｎＡの発現の低下をもたらす、請求項２に記載の遺伝子操作された細菌。
  4. 前記修飾が、未変性のｇｌｎＡプロモーターを、より活性の低いプロモーターで置き換えることを含む、請求項２に記載の遺伝子操作された細菌。
  5. 前記修飾が、前記未変性のｇｌｎＡプロモーターを、ｇｌｎＢプロモーター、ｇｌｎＤプロモーター、およびｇｌｎＥプロモーターからなる群から選択されるプロモーターで置き換えることを含む、請求項２に記載の遺伝子操作された細菌。
  6. ｇｌｎＡの発現または活性の低下をもたらすｇｌｎＡの修飾を含む、遺伝子操作された細菌。
  7. ｒｐｏＮの発現の変化を含む、遺伝子操作された細菌。
  8. 増加したｒｐｏＮの発現を有している、請求項７に記載の遺伝子操作された細菌。
  9. 増加したｒｐｏＮの発現を有している、請求項８に記載の遺伝子操作された細菌。
  10. 遺伝子操作されたジアゾ栄養細菌である、請求項１～９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  11. 未変性のｒｐｏＮプロモーターを削除し、強力な構成的プロモーターで置き換えることによって、ｒｐｏＮ発現が増加する、請求項１～９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  12. 属間である、請求項１～９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  13. 外因性窒素の存在下で空中窒素を固定することができる、請求項１～９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  14. 窒素固定遺伝子ネットワークの修飾を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  15. ＮｉｆＡの修飾を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  16. ＮｉｆＡの発現の増加をもたらす修飾を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  17. ＮｉｆＬの修飾を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  18. ＮｉｆＬの発現の低下をもたらす修飾を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  19. ＮｉｆＨの修飾を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  20. ＮｉｆＨの発現の増加をもたらす修飾を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  21. Ｎｉｆクラスター遺伝子の発現の増加をもたらす修飾を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  22. 窒素同化遺伝子ネットワークの修飾を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  23. ＧｌｎＥの修飾を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  24. ＧｌｎＥの活性の低下をもたらす修飾を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  25. ａｍｔＢの活性の低下をもたらす修飾を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  26. 植物中の大気由来窒素の量を増加させる方法であって、前記植物を、請求項１～２５のいずれか一項に記載の複数の前記遺伝子操作された細菌と接触させることを含む、方法。
  27. 前記遺伝子操作された細菌が、前記植物の種子に適用される、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記遺伝子操作された細菌が、前記植物の苗に適用される、請求項２６に記載の方法。
  29. 前記遺伝子操作された細菌が、液体製剤で前記植物に適用される、請求項２６に記載の方法。
  30. 前記遺伝子操作された細菌が、植え付け後、ただし前記植物の収穫前に前記植物に適用される、請求項２６に記載の方法。
  31. 前記遺伝子操作された細菌が、側面施肥として前記植物に適用される、請求項２６に記載の方法。
  32. 前記遺伝子操作された細菌が、発芽後１ヶ月～８ヶ月の間に前記植物に適用される、請求項２６に記載の方法。
  33. 前記遺伝子操作された細菌が、発芽後２ヶ月～８ヶ月の間に前記植物に適用される、請求項２６に記載の方法。
  34. 前記遺伝子操作された細菌が、発芽後１ヶ月～３ヶ月の間に前記植物に適用される、請求項２６に記載の方法。
  35. 前記遺伝子操作された細菌が、発芽後３ヶ月～６ヶ月の間に前記植物に適用される、請求項２６に記載の方法。
  36. 前記植物が、穀物植物である、請求項２６に記載の方法。
  37. 前記植物が、トウモロコシ植物である、請求項２６に記載の方法。
  38. 前記植物が、稲植物である、請求項２６に記載の方法。
  39. 前記植物が、小麦植物である、請求項２６に記載の方法。
  40. 前記植物が、大豆植物である、請求項２６に記載の方法。
  41. 種子および種子コーティングを含む組成物であって、前記種子コーティングが、請求項１～２５のいずれか一項に記載の複数の前記遺伝子操作された細菌を含む、組成物。
  42. 前記種子が、穀物種子である、請求項４１に記載の組成物。
  43. 前記種子が、トウモロコシ種子、小麦種子、稲種子、大豆種子、ライ麦種子、およびモロコシ種子からなる群から選択される、請求項４１に記載の組成物。
  44. 植物および請求項１～２５のいずれか一項に記載の複数の前記遺伝子操作された細菌を含む、組成物。
  45. 前記植物が、苗である、請求項４４に記載の組成物。
  46. 前記種子が、穀物種子である、請求項４４に記載の組成物。
  47. 前記種子が、トウモロコシ、稲、小麦、大豆、ライ麦、およびモロコシからなる群から選択される、請求項４４に記載の組成物。
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