BR112020008002A2

BR112020008002A2 - alvos gênicos para fixação de nitrogênio para aprimorar traços de plantas

Info

Publication number: BR112020008002A2
Application number: BR112020008002-0A
Authority: BR
Inventors: Alvin Tamsir; Sarah BLOCH; Neal Shah
Original assignee: Pivot Bio, Inc.
Priority date: 2017-10-25
Filing date: 2018-10-25
Publication date: 2020-11-03
Also published as: WO2019084342A1; US20200331820A1; CN117757706A; KR20200087166A; JP2023100703A; AU2018354338B2; EP3700879A4; CN111527057A; MX2020004344A; AU2024200115A1; AU2018354338A1; CA3080172A1; PH12020550489A1; RU2020116780A; EP3700879A1; JP2021500907A

Abstract

Métodos e sistemas são fornecidos para a geração e utilização de uma bactéria geneticamente modificada que compreendem uma modificação no glnD, em que a dita modificação é selecionada a partir do grupo que consiste em: deleção do gene inteiro, deleção do gene substancialmente inteiro, deleção de um domínio de ACT, deleção de mais de 50% de um domínio de ACT, desativação de um domínio de ACT e desativação de um domínio de UTase.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “ALVOS

GÊNICOS PARA DIRECIONAMENTO DE FIXAÇÃO DE NITROGÊNIO PARA APRIMORAR TRAÇOS DE PLANTAS”. REFERÊNCIA CRUZADA

[0001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente Pro- visório No. US 62/577.149, depositado em 25 de outubro de 2017, que é inteiramente incorporado neste documento a título de referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] As plantas estão enlaçadas ao microbioma por meio de um metaboloma compartilhado. Uma relação multidimensional entre um traço de cultura particular e o metaboloma subjacente é caracterizada por um cenário com vários máximos locais. A otimização de um máximo local inferior para outro que representa um melhor traço, alterando-se a influência do microbioma no metaboloma, pode ser desejável por uma variedade de razões, tais como para a otimização de cultura. São re- queridas abordagens econômica, ambiental e socialmente sustentáveis para a agricultura e a produção de alimentos para atender às necessi- dades de uma crescente população global. Até 2050, a Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura projeta que a produção total de alimentos precisa aumentar em 70% para atender às necessi- dades da população em crescimento, um desafio que é exacerbado por vários fatores, incluindo a diminuição de recursos hídricos, o aumento da competição por terras aráveis, o aumento dos preços de energia, aumento dos custos de insumos e a provável necessidade de as cultu- ras se adaptarem às pressões de um clima global mais seco, mais quente e mais extremo.

[0003] Uma área de interesse está na melhoria da fixação de nitro- gênio. O gás nitrogênio (N2) é um componente importante da atmosfera da Terra. Além disso, o nitrogênio elementar (N) é um componente im- portante de muitos compostos químicos que constituem os organismos vivos. No entanto, muitos organismos não podem usar o N2 diretamente para sintetizar os produtos químicos utilizados em processos fisiológi- cos, tais como crescimento e reprodução. Para utilizar o N2, o N2 deve ser combinado com hidrogênio. A combinação de hidrogênio com N2 é conhecida como fixação de nitrogênio. A fixação de nitrogênio, realizada de forma química ou biológica, requer um investimento de grandes quantidades de energia. Nos sistemas biológicos, uma enzima conhe- cida como nitrogenase catalisa a reação que resulta na fixação de nitro- gênio. Um objetivo importante da pesquisa de fixação de nitrogênio é a extensão desse fenótipo para plantas não leguminosas, particularmente para gramíneas agronômicas importantes, tais como trigo, arroz e maís. Apesar do enorme progresso no entendimento do desenvolvimento da simbiose de fixação de nitrogênio entre rizóbia e leguminosas, ainda não está claro o caminho para usar esse conhecimento para induzir nódulos de fixação de nitrogênio em culturas não leguminosas. Enquanto isso, o desafio de fornecer fontes suplementares suficientes de nitrogênio, tais como fertilizantes, continuará a aumentar com a crescente necessidade de maior produção de alimentos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0004] A presente divulgação fornece uma bactéria geneticamente modificada que compreende uma modificação em glnD, em que a dita modificação é selecionada do grupo que consiste em: deleção do gene inteiro, deleção do gene substancialmente inteiro, deleção de um domí- nio ACT, deleção de mais de 50% de um domínio ACT, desativação de um domínio ACT e desativação de um domínio de UTase. Em algumas modalidades, a bactéria geneticamente modificada compreende uma modificação em glnA que resulta em expressão ou atividade alterada de glnA. Em algumas modalidades, a modificação resulta em expressão diminuída de glnA. Em algumas modalidades, a modificação compre- ende a substituição do promotor nativo de glnA por um promotor com atividade inferior. Em algumas modalidades, a modificação compreende a substituição do promotor nativo de glnA por um promotor selecionado do grupo que consiste em: um promotor de glnB, um promotor de glnD e um promotor de glnE. Em algumas modalidades, a bactéria genetica- mente modificada compreende uma modificação em glnA que resulta em expressão ou atividade diminuída de glnA.

[0005] A presente divulgação fornece uma bactéria geneticamente modificada que compreende expressão alterada de rpoN. Em algumas modalidades, a bactéria geneticamente modificada aumentou a expres- são de rpoN. Em algumas modalidades, a bactéria geneticamente mo- dificada aumentou a expressão de rpoN. Em algumas modalidade, a bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que a dita bactéria geneticamente modificada é uma bactéria diazotrófica geneticamente modificada. Em algumas mo- dalidades, a expressão de rpoN é aumentada deletando o promotor na- tivo de rpoN e substituindo-o por um promotor constitutivo forte. Em al- gumas modalidades, a bactéria geneticamente modificada é intergené- rica. Em algumas modalidades, a bactéria geneticamente modificada é capaz de fixar nitrogênio atmosférico na presença de nitrogênio exó- geno. Em algumas modalidades, a bactéria geneticamente modificada compreende uma modificação em uma rede genética de fixação de ni- trogênio. Em algumas modalidades, a bactéria geneticamente modifi- cada compreende uma modificação em NifA. Em algumas modalidades, a bactéria geneticamente modificada compreende uma modificação que resulta em expressão aumentada de NifA. Em algumas modalidades, a bactéria geneticamente modificada compreende uma modificação em NifL. Em algumas modalidades, a bactéria geneticamente modificada compreende uma modificação que resulta em expressão diminuída de NifL. Em algumas modalidades, a bactéria geneticamente modificada compreende uma modificação em NifH. Em algumas modalidades, a bactéria geneticamente modificada compreende uma modificação que resulta em expressão aumentada de NifH. Em algumas modalidades, a dita bactéria geneticamente modificada compreende uma modificação que resulta em expressão aumentada de aglomerado de genes de Nif. Em algumas modalidades, a bactéria geneticamente modificada com- preende uma modificação em uma rede genética de assimilação de ni- trogênio. Em algumas modalidades, a bactéria geneticamente modifi- cada compreende uma modificação em GlnE. Em algumas modalida- des, a bactéria geneticamente modificada compreende uma modifica- ção que resulta em atividade diminuída de GlnE. Em algumas modali- dades, a bactéria geneticamente modificada compreende uma modifi- cação que resulta em atividade reduzida de amtB.

[0006] A presente divulgação fornece um método para aumentar a quantidade de nitrogênio derivado da atmosfera em uma planta, que compreende colocar a dita planta em contato com uma pluralidade da dita bactéria geneticamente modificada descrita neste documento. Em algumas modalidades, a bactéria geneticamente modificada é aplicada a uma semente da dita planta. Em algumas modalidades, a bactéria ge- neticamente modificada é aplicada a uma muda da dita planta. Em al- gumas modalidades, a bactéria geneticamente modificada é aplicada à dita planta em uma formulação líquida. Em algumas modalidades, a bactéria geneticamente modificada é aplicada à dita planta após o plan- tio, mas antes da colheita da dita planta. Em algumas modalidades, a bactéria geneticamente modificada é aplicada à dita planta como adu- bação de cobertura. Em algumas modalidades, a bactéria genetica- mente modificada é aplicada à dita planta entre um mês e oito meses após a germinação. Em algumas modalidades, a bactéria genetica- mente modificada é aplicada à dita planta entre dois meses e oito meses após a germinação. Em algumas modalidades, a bactéria genetica- mente modificada é aplicada à dita planta entre um mês e três meses após a germinação. Em algumas modalidades, a bactéria genetica- mente modificada é aplicada à dita planta entre três meses e seis meses após a germinação. Em algumas modalidades, a planta é uma planta de cereal. Em algumas modalidades, a planta é uma planta de milho. Em algumas modalidades, a planta é uma planta de arroz. Em algumas modalidades, a planta é uma planta de trigo. Em algumas modalidades, a planta é uma planta de soja.

[0007] A presente divulgação fornece uma composição que com- preende uma semente e um revestimento de semente; em que o reves- timento de semente compreende uma pluralidade das ditas bactérias geneticamente modificadas, conforme descrito neste documento. Em al- gumas modalidades, a semente é uma semente de cereal. Em algumas modalidades, a semente é selecionada do grupo que consiste em: uma semente de milho, uma semente de trigo, uma semente de arroz, uma semente de soja, uma semente de centeio e uma semente de sorgo. A presente divulgação fornece uma composição que compreende uma planta e uma pluralidade da dita bactéria geneticamente modificada des- crita neste documento. Em algumas modalidades, a planta é uma muda. Em algumas modalidades, a semente é uma semente de cereal. Em algumas modalidades, a semente é selecionada do grupo que consiste em milho, arroz, trigo, soja, centeio e sorgo.

INCORPORAÇÃO A TÍTULO DE REFERÊNCIA

[0008] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente menci- onados neste relatório descritivo são incorporados neste documento a título de referência da mesma forma como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse indicado específica e individual- mente para ser incorporado a título de referência.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0009] As características inovadoras da invenção são apresentadas com particularidade nas reivindicações anexas. Uma melhor compreen- são das características e vantagens da presente invenção será obtida por referência à seguinte descrição detalhada que apresenta modalida- des ilustrativas, nas quais os princípios da invenção são utilizados, e aos desenhos anexos:

[0010] As Figuras 1A e 1B retratam o enriquecimento e o isola- mento de bactérias de fixação de nitrogênio. (A) A placa de ágar com Nfb foi usada para isolar colônias únicas de bactérias de fixação de ni- trogênio. (B) Ágar com Nfb semissólido vazado em tubo de Balch. A seta aponta para a película de bactérias de fixação de nitrogênio enriqueci- das.

[0011] A Figura 2 retrata uma triagem por PCR de nifH representa- tiva. Bandas positivas foram observadas a cerca de 350 pb para duas colônias nesta triagem. As bandas inferiores representam dímeros de iniciadores.

[0012] A Figura 3 retrata um exemplo de uma triagem por PCR de colônias a partir de mutagênese selecionada por CRISPR-Cas. As co- lônias CI006 foram triadas com iniciadores específicos para o lócus nifL. O produto de PCR do tipo selvagem é esperado em cerca de 2,2kb, enquanto o mutante é esperado em cerca de 1,1kb. Sete das dez colô- nias triadas mostram, claramente, a deleção desejada.

[0013] As Figuras 4A a 4D retratam fenótipos in vitro de várias ce- pas. As atividades do Ensaio de Redução de Acetileno (ARA) de mutan- tes da cepa CI010 (Figura 4A) e mutantes da cepa CI006 (Figura 4B) aumentaram em meios de fixação de nitrogênio suplementados com 0 a 10 mM de glutamina. As atividades de ARA de cepas adicionais são mostradas na Figura 4C, e o perfil de excreção de amônio ao longo do tempo de duas cepas é mostrado na Figura 4D.

[0014] A Figura 5 retrata perfil de expressão de cultura de 9 genes diferentes nas cepas CI006 envolvidas em fixação de nitrogênio diaza- otrófico. Os números representam a contagem de cada transcrição. São indicadas várias condições (0, 1, 10 mM de glutamina e 0%, 10%, 20% de ar atmosférico em N2).

[0015] A Figura 6 retrata a colonização por CI006 de raízes de mi- lho. As mudas de milho foram inoculadas com CI006 que abriga um plasmídeo de expressão de RFP. Após duas semanas de crescimento e manutenção de plasmídeo através da rega com o antibiótico apropri- ado, as raízes foram colhidas e imageadas através de microscopia de fluorescência. Observa-se colonização do espaço intercelular da raiz.

[0016] A Figura 7 retrata o nitrogênio derivado do nível de micróbio em cepa WT (CI050) e otimizada (CM002).

[0017] A Figura 8 mostra uma configuração experimental para um ensaio de massa de frutificação de Micro-Tom.

[0018] A Figura 9 mostra uma triagem de 10 cepas para aumento de massa de frutos de plantas Micro-Tom. São apresentados resultados para seis réplicas. Para a coluna 3, p = 0,07. Para a coluna 7, p = 0,05.

[0019] As Figuras 10A a 10C retratam resultados adicionais para atividades de ARA de micróbios candidatos e mutantes candidatos de contrapartida cultivados em meios de fixação de nitrogênio suplementa- dos com 0 a 10 mM de glutamina.

[0020] A Figura 11 retrata um mutante duplo que exibe maior ex- creção de amônia do que o mutante único do qual foi derivado.

[0021] A Figura 12 retrata o NDFA obtido a partir do experimento de absorção de gás 15N (extrapolado usando dias expostos) para medir o NDFA em plantas de milho em condição fertilizada.

[0022] A Figura 13 retrata o valor de NDFA obtido a partir do expe- rimento de absorção de gás 15N (extrapolado usando dias expostos) para medir o NDFA em plantas Setaria em condição fertilizada.

[0023] A Figura 14A retrata a taxa de incorporação de gás 15N. As plantas inoculadas com a cepa evoluída apresentaram aumento na in- corporação de gás 15N em comparação com as plantas não inoculadas.

[0024] A Figura 14B retrata, 4 semanas após o plantio, que até 7% do nitrogênio em plantas inoculadas com uma cepa evoluída é derivado do nitrogênio fixo microbialmente.

[0025] A Figura 14C retrata que a área foliar (e outras medições de biomassa, dados não mostrados) é aumentada em plantas inoculadas com uma cepa evoluída quando comparada a plantas não inoculadas ou inoculadas do tipo selvagem.

[0026] A Figura 15A retrata cepas evoluídas que mostram produ- ção de nifH significativamente maior no tecido de raiz, conforme medido pelo estudo transcriptômico in planta.

[0027] A Figura 15B retrata que a taxa de nitrogênio fixo encontrada em tecido de planta está correlacionada com a taxa na qual essa planta específica é colonizada pela cepa otimizada HoME.

[0028] A Figura 16A retrata um mapa de textura de solo de vários solos de campo testados para colonização. Os solos dos quais alguns micróbios eram originalmente provenientes são indicados com estrelas.

[0029] A Figura 16B retrata a taxa de colonização da Cepa 1 e Cepa 5 que são testadas em quatro tipos diferentes de solo (círculos). Ambas as cepas apresentaram perfil de colonização relativamente ro- busto em diversos tipos de solo.

[0030] A Figura 16C retrata a colonização da Cepa 1, conforme tes- tada em um ensaio de campo ao longo de uma estação de crescimento. A cepa 1 persiste no tecido de milho até a semana 12 após o plantio e começa a mostrar declínio na colonização após esse período.

[0031] A Figura 17 retrata um esquema de reprodução de micró- bios, de acordo com modalidades.

[0032] A Figura 18 retrata uma vista ampliada da medição da com- posição de microbioma, conforme mostrado na Figura 17.

[0033] As Figuras 19A e 19B retratam atividade aumentada de ni- trogenase e excreção de amônio em mutantes da cepa CI006 de K. sac- chari com modificações no gene de síntese de glicogênio glgA.

[0034] As Figuras 20A e 20B retratam atividade aumentada de ni- trogenase e excreção de amônio em mutantes da cepa CI137 de K. va- riicola com modificações no gene de síntese de glicogênio glgA sobre cepas progenitoras com genótipos idênticos, mas sem a modificação de glgA.

[0035] A Figura 21 ilustra um esquema do gene glnE, que mostra regiões correspondentes aos domínios funcionais da proteína GlnE.

[0036] A Figura 22 retrata excreção aumentada de amônio em meios livres de nitrogênio mínimos em mutantes da cepa CI137 de K. variicola com modificações no gene glnD.

[0037] A Figura 23 retrata excreção aumentada de amônio em mu- tantes da cepa CI006 de K. sacchari com modificações no gene glnD.

[0038] A Figura 24A retrata excreção aumentada de amônio em meios livres de nitrogênio mínimos em mutantes da cepa CI137 de K. variicola com modificações no gene glnK.

[0039] A Figura 24B retrata excreção aumentada de amônio em mutantes da cepa CI137 de K. variicola com modificações no gene glnA criadas inserindo um promotor de um gene expresso constitutivamente em um nível baixo (glnE, glnD ou glnB) a montante e mutando códon de início ATG para GTG sobre uma cepa com uma mutação glnE_KO2 em meio mínimo suplementado com 5mM de glutamina.

[0040] A Figura 25 retrata excreção aumentada de amônio em mu- tantes da cepa CI137 de K. variicola com modificações no gene glnA criadas inserindo um promotor de um gene expresso constitutivamente em um nível baixo (glnE, glnD ou glnB) a montante e mutando o códon de início ATG para GTG sobre uma cepa com uma mutação glnE_KO2 e ΔnifL::Prm1.2 em meio mínimo suplementado com 5mM de glutamina.

[0041] A Figura 26 retrata excreção aumentada de amônio em mu- tantes da cepa CI006 de K. sacchari com modificações no gene glnA criadas inserindo um promotor de um gene expresso constitutivamente em um nível baixo (glnE, glnD ou glnB) a montante e mutando o códon de início ATG para GTG sobre uma cepa com uma mutação glnE_KO2 e ΔnifL::Prm1.2 em meio mínimo livre de nitrogênio.

[0042] A Figura 27 retrata excreção aumentada de amônio em mu- tantes da cepa CI137 de K. variicola com modificações em um óperon que codifica GOGAT (glnBD) criadas inserindo o promotor glnD a mon- tante do óperon sobre a cepa progenitora 137-2084.

[0043] A Figura 28 retrata, em mutantes da cepa CI137 de K. varii- cola com modificações em um óperon que codifica GOGAT (glnBD) cri- adas inserindo o promotor glnD a montante do óperon, atividade aumen- tada de nitrogenase, conforme medido pelo ARA sobre a cepa progeni- tora 137-2084.

[0044] A Figura 29 retrata excreção aumentada de amônio em mu- tantes da cepa CI006 de K. sacchari com modificações na expressão da enzima glutaminase glsA2 criadas inserindo um promotor forte a mon- tante do gene glsA2 em comparação com o controle progenitor.

[0045] A Figura 30 retrata excreção aumentada de amônio em mu- tantes da cepa CI137 de K. variicola com modificações na expressão da enzima glutaminase glsA2 criadas inserindo um promotor forte a mon- tante do gene glsA2 em comparação com o controle progenitor.

[0046] A Figura 31 retrata excreção aumentada de amônio em mu- tantes da cepa CI137 de K. variicola com modificações no gene asnB em comparação com a cepa de controle progenitor.

[0047] A Figura 32 retrata atividade aumentada de nitrogenase em mutantes da cepa CI137 de K. variicola com modificações de rpoN em comparação com o controle progenitor.

[0048] A Figura 33 retrata excreção aumentada de nitrogênio em mutantes da cepa CI137 de K. variicola com modificações de rpoN em comparação com o controle progenitor.

[0049] A Figura 34 retrata atividade aumentada de nitrogenase em mutantes da cepa CI006 de K. sacchari com expressão alterada do gene otsB em comparação com o controle progenitor.

[0050] A Figura 35 retrata excreção aumentada de nitrogênio em mutantes da cepa CI006 de K. sacchari com expressão alterada do gene otsB em comparação com o controle progenitor.

[0051] As Figuras 36A e 36B retratam a excreção inalterada de ni- trogênio e a colonização aumentada em mutantes da cepa CI137 de K. variicola com modificações em phoB em comparação com o controle progenitor.

[0052] A Figura 37 retrata a colonização aumentada em mutantes da cepa CI006 de K. sacchari com modificações em yjbE em compara- ção com o controle progenitor.

[0053] As Figuras 38A e 38B retratam atividade aumentada de ni- trogenase e excreção de nitrogênio em mutantes da cepa CI006 de K. sacchari com modificações na expressão do gene de transporte de sul- fato otsB criadas inserindo um promotor diretamente a montante do gene em comparação com a cepa progenitora.

[0054] As Figuras 39A e 39B retratam atividade aumentada de ni- trogenase em mutantes da cepa CI006 de K. sacchari com modificações na expressão do gene de transporte de sulfato cysZ criadas inserindo um promotor diretamente a montante do gene em comparação com a cepa progenitora.

[0055] As Figuras 40A e 40B retratam excreção aumentada de amônio em mutantes da cepa CI137 de K. variicola com modificações em dctA1 e dctA2. As Figuras 41A e 41B ilustram a razão de transcrição de nifH para transcrição de nifA em diversas cepas com diferentes promotores e se- quências de RBS inseridas a montante de nifA.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0056] Os termos "polinucleotídeo", "nucleotídeo", "sequência nu- cleotídica", "ácido nucleico" e "oligonucleotídeo" são usados de forma intercambiável. Os mesmos se referem a uma forma polimérica de nu- cleotídeos de qualquer comprimento, desoxirribonucleotídeos ou ribo- nucleotídeos, ou análogos dos mesmos. Os polinucleotídeos podem ter qualquer estrutura tridimensional e podem desempenhar qualquer fun- ção, conhecida ou desconhecida. A seguir, são apresentados exemplos não limitativos de polinucleotídeos: regiões codificadoras ou não codifi- cadoras de um gene ou fragmento de gene, loci (lócus) definidos a partir da análise de enlace, éxons, íntrons, RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência (tRNA), RNA ribossômico (rRNA), RNA interferente curto (siRNA), RNA em formato de grampo curto (shRNA), micro-RNA (miRNA), ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucle- otídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer se- quência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico e iniciadores. Um polinucleotídeo pode compreender um ou mais nucle- otídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeos. Se presentes, as modificações na estrutura nucleotídica podem ser transmitidas antes ou após a montagem do polímero. A se- quência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídicos. Um polinucleotídeo pode ser adicionalmente modificado após polimerização, tal como por conjugação com um componente de marcação.

[0057] "Hibridização" refere-se a uma reação na qual um ou mais polinucleotídeos reagem para formar um complexo que é estabilizado por meio de ligação de hidrogênio entre as bases dos resíduos de nu- cleotídeos. A ligação de hidrogênio pode ocorrer por emparelhamento de bases de Watson Crick, aglutinação de Hoogstein ou de qualquer outra maneira específica de sequência de acordo com a complementa- ridade de bases. O complexo pode compreender duas cadeias que for- mam uma estrutura dupla, três ou mais cadeias que formam um com- plexo de múltiplas cadeias, uma única cadeia auto-hibridante ou qual- quer combinação destes. Uma reação de hibridização pode constituir uma etapa de um processo mais extenso, como a iniciação da PCR ou a clivagem enzimática de um polinucleotídeo por uma endonuclease. Uma segunda sequência que é complementar a uma primeira sequên- cia é denominada o "complemento" da primeira sequência. O termo “hi- bridizável", conforme aplicado a um polinucleotídeo, refere-se à capaci- dade de o polinucleotídeo formar um complexo que é estabilizado por meio de ligação de hidrogênio entre as bases dos resíduos de nucleotí- deos em uma reação de hibridização.

[0058] "Complementaridade" refere-se à capacidade de um ácido nucleico formar ligação (ou ligações) de hidrogênio com outra sequência de ácidos nucleicos pelo Watson-Crick tradicional ou por outros tipos não tradicionais. Uma complementaridade percentual indica a porcenta- gem de resíduos em uma molécula de ácido nucleico que pode formar ligações de hidrogênio (por exemplo, emparelhamento de bases Wat- son-Crick) com uma segunda sequência de ácido nucleico (por exem- plo, 5, 6, 7, 8, 9, 10 em 10 sendo 50%, 60%, 70%, 80%, 90% e 100% complementares, respectivamente). "Perfeitamente complementar" sig- nifica que todos os resíduos contíguos de uma sequência de ácido nu- cleico se ligarão ao hidrogênio com o mesmo número de resíduos con- tíguos em uma segunda sequência de ácido nucleico. "Substancial- mente complementar", conforme usado neste documento, refere-se a um grau de complementaridade que é pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, ou 100% em uma região de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30,

35, 40, 45, 50 ou mais nucleotídeos, ou refere-se a dois ácidos nucleicos que hibridizam sob condições rigorosas. A identidade de sequência, como para fins de avaliação da complementaridade percentual, pode ser medida por qualquer algoritmo de alinhamento adequado, incluindo, porém sem limitação, o algoritmo Needleman-Wunsch (consultar, por exemplo, o alinhador EMBOSS Needle disponível em www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html, opcional- mente com configurações padrão), o algoritmo BLAST (consultar, por exemplo, a ferramenta de alinhamento BLAST disponível em blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, opcionalmente com configurações pa- drão) ou o algoritmo Smith-Waterman (consultar, por exemplo, o alinha- dor EMBOSS Water disponível em www.ebi.ac.uk/Tools/psa/em- boss_water/nucleotide.html, opcionalmente com configurações padrão). O alinhamento ideal pode ser avaliado com uso de quaisquer parâme- tros adequados de um algoritmo escolhido, incluindo parâmetros pa- drão.

[0059] Em geral, "condições rigorosas" para hibridização se referem a condições sob as quais um ácido nucleico com complementaridade com uma sequência-alvo hibridiza, predominantemente, com uma se- quência-alvo e substancialmente não hibridiza com sequências não alvo. As condições rigorosas são geralmente dependentes de sequên- cia e variam de acordo com vários fatores. Em geral, quanto mais longa a sequência, maior a temperatura na qual a sequência hibridiza especi- ficamente com sua sequência-alvo. Exemplos não limitativos de condi- ções rigorosas são descritos em detalhes em Tijssen (1993), TLabora- tory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I, Segundo Capítulo “Overview of princi- ples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay”, Else- vier, NY.

[0060] Em geral, "identidade de sequência" refere-se a uma corres- pondência exata de nucleotídeo para nucleotídeo ou de aminoácido para aminoácido de duas sequências polinucleotídicas ou polipeptídi- cas, respectivamente.

Tipicamente, as técnicas para determinar a iden- tidade de sequência incluem determinar a sequência nucleotídica de um polinucleotídeo e/ou determinar a sequência de aminoácidos codificada por esse meio e comparar essas sequências com uma segunda sequên- cia de nucleotídeo ou aminoácido.

Duas ou mais sequências (polinucle- otídeo ou aminoácido) podem ser comparadas determinando sua "iden- tidade percentual". A identidade percentual de duas sequências, sejam sequências de ácidos nucleicos ou aminoácidos, pode ser calculada como o número de correspondências exatas entre duas sequências ali- nhadas dividido pelo comprimento das sequências mais curtas e multi- plicado por 100. Em alguns casos, a identidade percentual de uma se- quência de teste e uma sequência de referência, sejam sequências de ácidos nucleicos ou aminoácidos, pode ser calculada como o número de correspondências exatas entre duas sequências alinhadas dividido pelo comprimento da sequência de referência e multiplicado por 100. A identidade percentual também pode ser determinada, por exemplo, comparando informações de sequência com uso do programa de com- putador avançado BLAST, incluindo a versão 2.2.9, disponível junto aos Institutos Nacionais de Saúde.

O programa BLAST se baseia no método de alinhamento de Karlin e Altschul, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 87: 2.264 a 2.268 (1990) e conforme discutido em Altschul et al., J.

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Biol. 215: 403 a 410 (1990); Karlin e Altschul, Proc.

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Acad.

Sci.

USA 90: 5.873 a 5.877 (1993); e Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3.389 a 3.402 (1997). Resumidamente, o programa BLAST define identidade como o número de símbolos idênticos alinhados (geralmente nucleotídeos ou aminoácidos), dividido pelo número total de símbolos na menor das duas sequências. O programa pode ser usado para determinar a identi- dade percentual em todo o comprimento das proteínas sendo compara- das. Parâmetros padrão são fornecidos para otimizar pesquisas com sequências curtas de consultas, por exemplo, com o programa blastp. O programa também permite o uso de um filtro SEG para mascarar seg- mentos das sequências de consulta, conforme determinado pelo pro- grama SEG de Wootton e Federhen, Computers and Chemistry 17: 149 a 163 (1993). As faixas dos graus desejados de identidade de sequência são de aproximadamente 80% a 100% e os valores inteiros entre as mesmas. Tipicamente, as identidades percentuais entre uma sequência divulgada e uma sequência reivindicada são de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%.

[0061] Conforme usado neste documento, "expressão" refere-se ao processo pelo qual um polinucleotídeo é transcrito de um modelo de DNA (tal como para e mRNA ou outro transcrito de RNA) e/ou o pro- cesso pelo qual um mRNA transcrito é subsequentemente traduzido em peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. Transcritos e polipeptídeos codi- ficados podem ser denominados, coletivamente, "produto genético". Se o polinucleotídeo for derivado de DNA genômico, a expressão pode in- cluir o splicing do mRNA em uma célula eucariótica.

[0062] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados neste documento de forma intercambiável para se referir a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados e pode ser in- terrompido por não aminoácidos. Os termos também abrangem um po- límero de aminoácido que foi modificado; por exemplo, formação de li- gação de dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação, tal como conjugação com um componente de marcação. Conforme usado neste documento, o termo "aminoácido"

inclui aminoácidos naturais e/ou não naturais ou sintéticos, incluindo gli- cina e os isômeros ópticos D ou L, e análogos de aminoácidos e pepti- domiméticos.

[0063] Conforme usado neste documento, o termo “cerca de" é usado como sinônimo do termo "aproximadamente". Ilustrativamente, o uso do termo “cerca de”, em relação a uma quantidade, indica que os valores estão ligeiramente fora dos valores citados, por exemplo, mais ou menos 0,1% a 10%.

[0064] O termo "cultura biologicamente pura" ou "cultura substanci- almente pura" refere-se a uma cultura de uma espécie bacteriana des- crita neste documento que não contém outras espécies bacterianas em quantidades suficientes para interferir na replicação da cultura ou ser detectadas por técnicas bacteriológicas normais.

[0065] "Produtividade de planta" refere-se, geralmente, a qualquer aspecto do crescimento ou desenvolvimento de uma planta que é uma razão pela qual a planta é cultivada. Para culturas alimentares, tais como grãos ou vegetais, "produtividade de planta" pode se referir ao rendimento de grãos ou frutas colhidos de uma determinada cultura. Conforme usado neste documento, a produtividade aprimorada de planta refere-se, amplamente, a aprimoramentos no rendimento de grãos, frutas, flores ou outras partes de plantas colhidas para vários fins, aprimoramentos no crescimento de partes de plantas, incluindo caules, folhas e raízes, promoção do crescimento de planta, manutenção de alto teor de clorofila nas folhas, aumento do número de frutos ou sementes, aumento do peso por unidade de frutos ou sementes, redução da emis- são de NO2 devido ao uso reduzido de fertilizantes nitrogenados e apri- moramentos semelhantes no crescimento e desenvolvimento de plan- tas.

[0066] Micróbios em culturas alimentares ou em torno das mesmas podem influenciar nos traços dessas culturas. Os traços de plantas que podem ser influenciados por micróbios incluem: rendimento (por exem- plo, produção de grãos, geração de biomassa, desenvolvimento de fru- tos, conjunto de flores); nutrição (por exemplo, nitrogênio, fósforo, po- tássio, ferro, aquisição de micronutrientes); gerenciamento de estresse abiótico (por exemplo, tolerância à seca, tolerância ao sal, tolerância ao calor); e gerenciamento de estresse biótico (por exemplo, pragas, ervas daninhas, insetos, fungos e bactérias). As estratégias para alterar os traços de culturas incluem: aumento das principais concentrações de metabólitos; alteração da dinâmica temporal da influência de micróbios nos principais metabólitos; enlace de produção/degradação de metabó- litos microbianos a novas pistas ambientais; redução de metabolitos ne- gativos; e aprimoramento do equilíbrio de metabólitos ou proteínas sub- jacentes.

[0067] Conforme usado neste documento, uma "sequência de con- trole" refere-se a um operador, promotor, silenciador ou terminador.

[0068] Em algumas modalidades, as sequências de controle nativas ou endógenas de genes da presente divulgação são substituídas por uma ou mais sequências de controle intragenéricas.

[0069] Conforme usado neste documento, "introduzido" refere-se à introdução por meio da biotecnologia moderna, e não uma introdução que ocorre naturalmente.

[0070] Em algumas modalidades, as bactérias da presente divulga- ção foram modificadas para que não sejam bactérias que ocorrem na- turalmente.

[0071] Em algumas modalidades, as bactérias da presente divulga- ção estão presentes na planta em uma quantidade de pelo menos 10 3 cfu, 104 cfu, 105 cfu, 106 cfu, 107 cfu, 108 cfu, 109 cfu, 1010 cfu, 1011 cfu ou 1012 cfu por grama de peso fresco ou seco da planta. Em algumas modalidades, as bactérias da presente divulgação estão presentes na planta em uma quantidade de pelo menos cerca de 103 cfu, cerca de

104 cfu, cerca de 105 cfu, cerca de 106 cfu, cerca de 107 cfu, cerca de 108 cfu, cerca de 109 cfu, cerca de 1010 cfu, cerca de 1011 cfu ou cerca de 1012 cfu por grama de peso fresco ou seco da planta. Em algumas modalidades, as bactérias da presente divulgação estão presentes na planta em uma quantidade de pelo menos 103 a 109, 103 a 107, 103 a 105, 105 a 109, 105 a 107, 106 a 1010, 106 a 107 cfu por grama de peso fresco ou seco da planta.

[0072] Fertilizantes e nitrogênio exógeno da presente divulgação podem compreender as seguintes moléculas contendo nitrogênio: amô- nio, nitrato, nitrito, amônia, glutamina, etc. As fontes de nitrogênio da presente divulgação podem incluir amônia anidra, sulfato de amônia, ureia, fosfato de diamônio, ureia-formaldeído, fosfato de monoamônio, nitrato de amônio, soluções de nitrogênio, nitrato de cálcio, nitrato de potássio, nitrato de sódio, etc.

[0073] Conforme usado neste documento, "nitrogênio exógeno" re- fere-se ao nitrogênio não atmosférico prontamente disponível no solo, campo ou meio de crescimento que está presente em condições não limitantes de nitrogênio, incluindo amônia, amônio, nitrato, nitrito, ureia, ácido úrico, ácidos de amônio, etc.

[0074] Conforme usado neste documento, "condições não limitan- tes de nitrogênio" refere-se ao nitrogênio não atmosférico disponível no solo, campo, meio em concentrações superiores a cerca de 4 mM de nitrogênio, conforme divulgado por Kant et al. (2010. J. Exp. Biol. 62 (4):

1.499 a 1.509), que é incorporado neste documento a título de referên- cia.

[0075] Conforme usado neste documento, "material genético intro- duzido" significa material genético que é adicionado ao genoma do re- ceptor e permanece como um componente do mesmo.

[0076] Em algumas modalidades, a rede de regulação genética de fixação e assimilação de nitrogênio compreende polinucleotídeos que codificam genes e sequências não codificadoras que direcionam, mo- dulam e/ou regulam a fixação e/ou assimilação microbiana de nitrogênio e pode compreender sequências de polinucleotídeos do aglomerado de nif (por exemplo, nifA, nifB, nifC,…….nifZ), polinucleotídeos que codifi- cam proteína reguladora de nitrogênio C, polinucleotídeos que codifi- cam proteína reguladora de nitrogênio B, sequências de polinucleotí- deos do aglomerado de gln (por exemplo, glnA and glnD), draT e trans- portadores/permeases de amônia. Em alguns casos, o aglomerado de Nif pode compreender NifB, NifH, NifD, NifK, NifE, NifN, NifX, hesa e NifV. Em alguns casos, o aglomerado de Nif pode compreender um sub- conjunto de NifB, NifH, NifD, NifK, NifE, NifN, NifX, hesa e NifV.

[0077] Em algumas modalidades, o fertilizante da presente divulga- ção compreende pelo menos 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de nitrogênio em peso.

[0078] Em algumas modalidades, o fertilizante da presente divulga- ção compreende pelo menos cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 17%, cerca de 18%, cerca de 19%, cerca de 20%, cerca de 21%, cerca de 22%, cerca de 23%, cerca de 24%, cerca de 25%, cerca de 26%, cerca de 27%, cerca de 28%, cerca de 29%, cerca de 30%, cerca de 31%, cerca de 32%, cerca de 33%, cerca de 34%, cerca de 35%, cerca de 36%, cerca de 37%, cerca de 38%, cerca de 39%, cerca de 40%,

cerca de 41%, cerca de 42%, cerca de 43%, cerca de 44%, cerca de 45%, cerca de 46%, cerca de 47%, cerca de 48%, cerca de 49%, cerca de 50%, cerca de 51%, cerca de 52%, cerca de 53%, cerca de 54%, cerca de 55%, cerca de 56%, cerca de 57%, cerca de 58%, cerca de 59%, cerca de 60%, cerca de 61%, cerca de 62%, cerca de 63%, cerca de 64%, cerca de 65%, cerca de 66%, cerca de 67%, cerca de 68%, cerca de 69%, cerca de 70%, cerca de 71%, cerca de 72%, cerca de 73%, cerca de 74%, cerca de 75%, cerca de 76%, cerca de 77%, cerca de 78%, cerca de 79%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99% de nitrogênio em peso.

[0079] Em algumas modalidades, o fertilizante da presente divulga- ção compreende cerca de 5% a 50%, cerca de 5% a 75%, cerca de 10% a 50%, cerca de 10% a 75%, cerca de 15% a 50%, cerca de 15% a 75%, cerca de 20% a 50%, cerca de 20% a 75%, cerca de 25% a 50%, cerca de 25% a 75%, cerca de 30% a 50%, cerca de 30% a 75%, cerca de 35% a 50%, cerca de 35% a 75%, cerca de 40% a 50%, cerca de 40% a 75%, cerca de 45% a 50%, cerca de 45% a 75% ou cerca de 50% a 75% de nitrogênio em peso.

[0080] Em algumas modalidades, o aumento da fixação de nitrogê- nio e/ou a produção de 1% ou mais do nitrogênio na planta são medidos em relação às plantas de controle, que não foram expostas às bactérias da presente divulgação. Todos os aumentos ou diminuições de bacté- rias são medidos em relação às bactérias de controle. Todos os aumen- tos ou diminuições nas plantas são medidos em relação às plantas de controle.

[0081] Conforme usado neste documento, um "promotor constitu- tivo" é um promotor ativo na maioria das condições e/ou na maioria dos estágios de desenvolvimento. Existem várias vantagens em usar pro- motores constitutivos em vetores de expressão usados em biotecnolo- gia, tais como: alto nível de produção de proteínas usadas para seleci- onar células ou organismos transgênicos; alto nível de expressão de proteínas repórteres ou marcadores classificáveis, permitindo fácil de- tecção e quantificação; alto nível de produção de um fator de transcrição que faz parte de um sistema regulador de transcrição; produção de com- postos que requerem atividade onipresente no organismo; e produção de compostos necessários em todos os estágios de desenvolvimento. Promotores constitutivos não limitativos exemplares incluem, promotor 35S de CaMV, promotores de opina, promotor de ubiquitina, promotor de álcool desidrogenase, etc.

[0082] Conforme usado neste documento, um "promotor não cons- titutivo" é um promotor que é ativo sob certas condições, em certos tipos de células e/ou durante certos estágios de desenvolvimento. Por exem- plo, promotores específicos de tecido, preferenciais de tecido, específi- cos de tipo de célula, preferenciais de tipo de célula, induzíveis e pro- motores sob controle de desenvolvimento são promotores não constitu- tivos. Exemplos de promotores sob controle de desenvolvimento in- cluem promotores que iniciam, preferencialmente, a transcrição em cer- tos tecidos.

[0083] Conforme usado neste documento, promotor "induzível" ou "reprimível" é um promotor que está sob controle de fatores químicos ou ambientais. Exemplos de condições ambientais que podem afetar a transcrição por promotores induzíveis incluem condições anaeróbicas, certos produtos químicos, a presença de luz, condições ácidas ou bási- cas, etc.

[0084] Conforme usado neste documento, um promotor "específico de tecido" é um promotor que inicia a transcrição apenas em certos te-

cidos. Ao contrário da expressão constitutiva de genes, a expressão es- pecífica de tecido é o resultado de vários níveis de interação de regula- ção de genes. Como tal, na técnica, por vezes, é preferível utilizar pro- motores de espécies homólogas ou intimamente relacionadas para al- cançar expressão eficiente e fiável de transgenes em tecidos particula- res. Esta é uma das principais razões para a grande quantidade de pro- motores específicos de tecido isolados de tecidos específicos encontra- das na literatura científica e patentária.

[0085] Conforme usado neste documento, o termo "operacional- mente enlaçado" refere-se à associação de sequências de ácidos nu- cleicos em um único fragmento de ácido nucleico, de modo que a função de uma é regulada pela outra. Por exemplo, um promotor está operaci- onalmente enlaçado a uma sequência de codificação quando é capaz de regular a expressão dessa sequência de codificação (isto é, que a sequência de codificação está sob o controle transcricional do promo- tor). As sequências de codificação podem ser operacionalmente enla- çadas a sequências reguladoras em uma orientação de sentido ou de antissentido. Em outro exemplo, as regiões de RNA complementares da divulgação podem ser operacionalmente enlaçadas, direta ou indireta- mente, 5’ ao mRNA alvo, ou 3’ ao mRNA alvo, ou dentro do mRNA alvo, ou uma primeira região complementar é 5’ e seu complemento é 3’ ao mRNA alvo.

REGULAÇÃO DA FIXAÇÃO DE NITROGÊNIO

[0086] Um traço que pode ser direcionado para a regulação pelos métodos descritos neste documento é a fixação de nitrogênio. O fertili- zante nitrogenado é a maior despesa operacional em uma fazenda e o maior acionador de maiores rendimentos em culturas em linha, como milho e trigo. Estão descritos neste documento produtos microbianos que podem fornecer formas renováveis de nitrogênio em culturas não leguminosas. Embora alguns endófitos possuam a genética necessária para fixar nitrogênio em cultura pura, o desafio técnico fundamental é que os endófitos do tipo selvagem de cereais e gramíneas parem de fixar nitrogênio em campos fertilizados. A aplicação de fertilizantes quí- micos e níveis residuais de nitrogênio em solos de campo sinaliza ao micróbio para que desative a via bioquímica para fixação de nitrogênio.

[0087] Alterações nos níveis transcricionais e pós-traducionais da rede reguladora de fixação de nitrogênio são requeridas para desenvol- ver um micróbio capaz de fixar e transferir nitrogênio para milho na pre- sença de fertilizante. Para esse fim, é descrita neste documento a tec- nologia Host-Microbe Evolution (HoME) para evoluir com precisão redes reguladoras e obter fenótipos inovadores. Também são descritas neste documento bibliotecas exclusivas e proprietárias de endófitos fixadores de nitrogênio isolados do milho, emparelhados com extensos dados ômicos em torno da interação de micróbios e plantas hospedeiras sob diferentes condições ambientais, como estresse e excesso de nitrogê- nio. Essa tecnologia permite a evolução precisa da rede reguladora ge- nética de endófitos para produzir micróbios que fixam ativamente o ni- trogênio, até mesmo na presença de fertilizantes no campo. Também são descritas neste documento avaliações do potencial técnico de de- senvolvimento de micróbios que colonizam tecidos radiculares de milho e produzem nitrogênio para plantas fertilizadas e avaliações da compa- tibilidade de endófitos com práticas de formulação padrão e diversos solos para determinar a viabilidade de integrar os micróbios nas estra- tégias modernas de gerenciamento de nitrogênio.

[0088] Para utilizar nitrogênio elementar (N) na síntese química, as formas de vida combinam gás nitrogênio (N2) disponível na atmosfera com hidrogênio em um processo conhecido como fixação de nitrogênio. Devido à natureza de energia intensa de fixação biológica de nitrogênio, os diazotróficos (bactérias e arqueias que fixam o gás nitrogênio atmos-

férico) desenvolveram uma regulação sofisticada e rigorosa do aglome- rado de genes nif em resposta ao oxigênio ambiental e ao nitrogênio disponível. Os genes Nif codificam enzimas envolvidas na fixação de nitrogênio (tais como o complexo nitrogenase) e proteínas que regulam a fixação de nitrogênio. Shamseldin (2013. Global J. Biotechnol. Bio- chem. 8 (4): 84 a 94) descreve descrições detalhadas de genes nif e seus produtos e é incorporado neste documento a título de referência. São descritos neste documento métodos de produção de uma planta com um traço aprimorado que compreende o isolamento de bactérias de uma primeira planta, a introdução de uma variação genética em um gene nif das bactérias isoladas, a exposição de uma segunda planta às bactérias variantes e o isolamento de bactérias da segunda planta com um traço aprimorado em relação à primeira planta e a repetição das etapas com bactérias isoladas da segunda planta.

[0089] Nas Proteobactérias, a regulação da fixação de nitrogênio gira em torno da proteína NifA de aglutinação ao reforçador dependente de σ54, o regulador transcricional positivo do aglomerado de nif. Os ní- veis intracelulares de NifA ativo são controlados por dois fatores princi- pais: transcrição do óperon nifLA e inibição da atividade de NifA por meio de interação proteína-proteína com NifL. Ambos os processos são responsívos aos níveis de glutamina intraceular por meio da cascata de sinalização de proteína PII. Essa cascata é mediada por GlnD, que de- tecta diretamente a glutamina e catalisa a uridililação ou desuridililação de duas proteínas reguladoras de PII a GlnB e GlnK a em resposta à ausência ou presença, respectivamente, de glutamina aglutinada. Sob condições de excesso de nitrogênio, GlnB não modificado sinaliza a de- sativação do promotor nifLA. No entanto, sob condições de limitação de nitrogênio, o GlnB é modificado após a tradução, o que inibe a atividade do mesmo e leva à transcrição do óperon nifLA. Desta forma, a transcri-

ção de nifLA é fortemente controlada em resposta ao nitrogênio ambi- ental através da cascata de sinalização de proteína PII. No nível pós- traducional da regulação de NifA, o GlnK inibe a interação NifL/NifA em um modo dependente do nível geral de GlnK livre na célula.

[0090] NifA é transcrito a partir do óperon nifLA, cujo promotor é ati- vado por NtrC fosforilado, outro regulador dependente de σ54. O estado de fosforilação de NtrC é mediado pela histidina quinase NtrB, que inte- rage com GlnB desuridililado, mas não GlnB uridililado. Sob condições de excesso de nitrogênio, um alto nível intracelular de glutamina leva à desuridililação de GlnB, que interage, então, com o NtrB para desativar sua atividade de fosforilação e ativar sua atividade de fosfatase, que resulta na desfosforilação do NtrC e na desativação do promotor nifLA. No entanto, sob condições de limitação de nitrogênio, um baixo nível de glutamina intracelular resulta em uridililação de GlnB, que inibe sua in- teração com o NtrB e permite a fosforilação do NtrC e a transcrição do óperon nifLA. Deste modo, a expressão de nifLA é rigidamente contro- lada em resposta ao nitrogênio ambiental por meio da cascata de sina- lização de proteína PII. nifA, ntrB, ntrC e glnB, são todos genes que podem ser mutados nos métodos descritos neste documento. Esses processos também podem ser responsivos aos níveis intracelulares de amônia, ureia ou nitratos.

[0091] A atividade de NifA também é regulada de modo pós-tradu- cional em resposta ao nitrogênio ambiental, mais tipicamente através da inibição mediada por NifL da atividade de NifA. Em geral, a interação de NifL e NifA é influenciada pela cascata de sinalização de proteína PII por meio de GlnK, embora a natureza das interações entre GlnK e NifL/NifA varie significativamente entre os diazotróficos. Em Klebsiella pneumoniae, ambas as formas de GlnK inibem a interação NifL/NifA, e a interação entre GlnK e NifL/NifA é determinada pelo nível geral de GlnK livre dentro da célula. Sob condições de excesso de nitrogênio, o

GlnK desuridililado interage com o transportador de amônio AmtB, que serve tanto para bloquear a absorção de amônio pelo AmtB quanto para sequestrar o GlnK para a membrana, permitindo a inibição do NifA pelo NifL. Por outro lado, em Azotobacter vinelandii, a interação com GlnK desuridililado é requerida para a interação NifL/NifA e inibição de NifA, enquanto a uridililação de GlnK inibe sua interação com NifL. Em diazo- tróficos sem o gene nifL, há evidências de que a atividade de NifA é inibida diretamente pela interação com as formas desuridililadas de GlnK e GlnB sob condições de excesso de nitrogênio. Em algumas bac- térias, o aglomerado de Nif pode ser regulado por glnR e, em alguns casos, isso pode compreender regulação negativa. Independentemente do mecanismo, a inibição pós-traducional do NifA é um importante re- gulador do aglomerado de nif na maioria dos diazotróficos conhecidos. Além disso, nifL, amtB, glnK e glnR são genes que podem ser mutados nos métodos descritos neste documento.

[0092] Além de regular a transcrição do aglomerado de genes nif, muitos diazotróficos desenvolveram um mecanismo para a modificação pós-traducional direta e a inibição da enzima nitrogenase em si, conhe- cido como desligamento de nitrogenase. Isso é mediado pela ADP-ribo- silação da proteína Fe (NifH) sob condições de excesso de nitrogênio, o que interrompe sua interação com o complexo proteico MoFe (NifDK) e abole a atividade da nitrogenase. DraT catalisa a ADP-ribosilação da proteína Fe e o desligamento da nitrogenase, enquanto DraG catalisa a remoção da ADP-ribose e a reativação da nitrogenase. Assim como na transcrição de nifLA e inibição de NifA, o desligamento da nitrogenase também é regulado por meio da cascata de sinalização da proteína PII. Sob condições de excesso de nitrogênio, o GlnB desuridililado interage e ativa o DraT, enquanto o GlnK desuridililado interage com DraG e AmtB para formar um complexo, sequestrando DraG para a membrana. Sob condições de limitação de nitrogênio, as formas uridililadas de GlnB e GlnK não interagem com DraT e DraG, respectivamente, levando à inativação de DraT e à difusão de DraG para a proteína Fe, em que remove a ADP-ribose e ativa a nitrogenase. Os métodos descritos neste documento também contemplam a introdução de variação genética nos genes nifH, nifD, nifK e draT.

[0093] Embora alguns endófitos tenham a capacidade de fixar nitro- gênio in vitro, muitas vezes, a genética é silenciada no campo por níveis elevados de fertilizantes químicos exógenos. Pode-se dissociar a detec- ção de nitrogênio exógeno da expressão da enzima nitrogenase para facilitar a fixação de nitrogênio baseada em campo. O aprimoramento da totalidade da atividade de nitrogenase ao longo do tempo serve, ainda, para aumentar a produção de nitrogênio para utilização pela cul- tura. Os alvos específicos para variação genética para facilitar a fixação de nitrogênio baseada em campo com uso dos métodos descritos neste documento incluem um ou mais genes selecionados do grupo que con- siste em nifA, nifL, ntrB, ntrC, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB e nifQ.

[0094] Um alvo adicional para a variação genética para facilitar a fixação de nitrogênio baseada em campo com uso dos métodos descri- tos neste documento é a proteína NifA. A proteína NifA é tipicamente o ativador para expressão de genes de fixação de nitrogênio. O aumento da produção de NifA (constitutivamente ou durante uma condição de alta amônia) contorna a via nativa de detecção de amônia. Além disso, a redução da produção de proteínas NifL, um inibidor conhecido da NifA, também leva a um nível aumentado de NifA livremente ativa. Além disso, o aumento do nível de transcrição do óperon nifAL (constitutiva- mente ou durante uma condição de alta amônia) também leva a um nível geral mais alto de proteínas NifA. O nível elevado de expressão de nifAL é alcançado alterando o próprio promotor ou reduzindo a expressão de

NtrB (parte da cascata de sinalização de ntrB e ntrC que originalmente resultaria no desligamento do óperon nifAL durante a condição de alto nitrogênio). O alto nível de NifA alcançado por estes ou quaisquer outros métodos descritos neste documento aumenta a atividade de fixação de nitrogênio dos endófitos.

[0095] Outro alvo para que a variação genética facilite a fixação de nitrogênio baseada em campo com uso dos métodos descritos neste documento é a cascata de sinalização de GlnD/GlnB/GlnK PII. O nível intracelular de glutamina é detectado através da cascata de sinalização de GlnD/GlnB/GlnK PII. As mutações em sítio ativo em GlnD que abo- lem a atividade de remoção de uridilila do GlnD interrompem a cascata de detecção de nitrogênio. Além disso, a redução da concentração de GlnB provoca um curto-circuito na cascata de detecção de glutamina. Essas mutações "induzem" as células a perceber um estado limitado de nitrogênio, aumentando, assim, a atividade em nível de fixação de nitro- gênio. Esses processos também podem ser responsivos a níveis intra- celulares ou extracelulares de amônia, ureia ou nitratos.

[0096] A proteína amtB também é um alvo para que variação gené- tica facilite a fixação de nitrogênio baseada em campo com uso dos mé- todos descritos neste documento. A absorção de amônia do ambiente pode ser reduzida diminuindo o nível de expressão da proteína amtB. Sem amônia intracelular, o endófito não é capaz de detectar o alto nível de amônia, impedindo a regulação decrescente dos genes de fixação de nitrogênio. Qualquer amônia que consiga entrar no compartimento intracelular é convertida em glutamina. O nível intracelular de glutamina é a principal moeda da detecção de nitrogênio. Diminuir o nível intrace- lular de glutamina impede que as células detectem altos níveis de amô- nio no ambiente. Este efeito pode ser alcançado aumentando o nível de expressão da glutaminase, uma enzima que converte glutamina em glu- tamato. Além disso, a glutamina intracelular também pode ser reduzida pela diminuição da glutamina sintase (uma enzima que converte amônia em glutamina). Nos diazotróficos, a amônia fixa é rapidamente assimi- lada em glutamina e glutamato para ser usada em processos celulares. As interrupções na assimilação de amônia podem permitir que o desvio de nitrogênio fixo seja exportado da célula como amônia. A amônia fixa é predominantemente assimilada em glutamina pela glutamina sintetase (GS), codificada pela glnA e, posteriormente, em glutamina pela gluta- mina oxoglutarato aminotransferase (GOGAT). Em alguns exemplos, glnS codifica uma glutamina sintetase. A GS é regulada após a tradução pela GS adenilil transferase (GlnE), uma enzima bifuncional codificada pela glnE que catalisa a adenililação e a desadenililação de GS pela atividade de seus domínios de adenilil transferase (AT) e de remoção de adenilil (AR), respectivamente. Sob condições de limitação de nitro- gênio, o glnA é expresso e o domínio de AR de GlnE desadenilila GS, permitindo que seja ativo. Sob condições de excesso de nitrogênio, a expressão de glnA é desativada e o domínio de AT de GlnE é ativado alostericamente pela glutamina, causando adenililação e desativação de GS.

[0097] Além disso, o gene draT também pode ser um alvo para que variação genética facilite a fixação de nitrogênio baseada em campo, utilizando os métodos descritos neste documento. Uma vez que as en- zimas fixadoras de nitrogênio são produzidas pela célula, o desliga- mento da nitrogenase representa outro nível no qual a célula regula de forma decrescente a atividade de fixação em condições de alto nitrogê- nio. Esse desligamento pode ser removido diminuindo o nível de expres- são de DraT.

[0098] Métodos para transmitir novos fenótipos microbianos podem ser desempenhados nos níveis transcricional, traducional e pós-traduci- onal. O nível de transcrição inclui alterações no promotor (tais como al- teração da afinidade do fator sigma ou sítios de aglutinação para fatores de transcrição, incluindo deleção de todo ou parte do promotor) ou alte- ração de terminadores e atenuadores de transcrição. O nível de tradu- ção inclui alterações nos sítios de aglutinação ao ribossomo e alteração dos sinais de degradação do mRNA. O nível pós-tradução inclui a mu- tação do sítio ativo de uma enzima e a alteração das interações prote- ína-proteína. Essas mudanças podem ser alcançadas de várias manei- ras. A redução do nível de expressão (ou abolição completa) pode ser alcançada trocando o sítio de aglutinação ao ribossomo nativo (RBS) ou o promotor por outro com menor resistência/eficiência. Os sítios de iní- cio de ATG podem ser trocados por um códon de início GTG, TTG ou CTG, que resulta na redução da atividade de tradução da região de co- dificação. A abolição completa da expressão pode ser feita por knockout (deleção) da região de codificação de um gene. A mudança de estrutura do quadro de leitura aberto (ORF) provavelmente resultará em um có- don de parada prematuro ao longo do ORF, criando, assim, um produto truncado não funcional. A inserção de códons de parada no quadro tam- bém criará, de maneira semelhante, um produto truncado não funcional. A adição de uma etiqueta de degradação no terminal N ou C também pode ser feita para reduzir a concentração efetiva de um gene especí- fico.

[0099] Inversamente, o nível de expressão dos genes descritos neste documento pode ser alcançado com uso de um promotor mais forte. Para garantir alta atividade de promotor durante uma condição de alto nível de nitrogênio (ou qualquer outra condição), um perfil de trans- crição de todo o genoma em uma condição de alto nível de nitrogênio pode ser obtido e promotores ativos com um nível de transcrição dese- jado podem ser escolhidos a partir desse conjunto de dados para subs- tituir o promotor fraco. Os códons de início fracos podem ser trocados por um códon de início ATG para melhorar a eficiência de iniciação de tradução. Sítios de aglutinação ribossômica fracos (RBS) também po- dem ser trocados por um RBS diferente, com maior eficiência de inicia- ção de tradução. Além disso, a mutagênese sítio-específica também pode ser desempenhada para alterar a atividade de uma enzima.

[00100] O aumento do nível de fixação de nitrogênio que ocorre em uma planta pode levar a uma redução na quantidade de fertilizante quí- mico necessária para a produção de culturas e reduzir as emissões de gases de efeito estufa (por exemplo, óxido nitroso).

AUMENTO DA ATIVIDADE DE FIXAÇÃO DE NITROGÊNIO

[00101] As nitrogenases são enzimas responsáveis por catalisar a fixação de nitrogênio. Existem três tipos de nitrogenase encontrados em várias bactérias fixadoras de nitrogênio: nitrogenase de molibdênio (Mo), nitrogenase de vanádio (V) e nitrogenase apenas de ferro (Fe). As nitrogenases são sistemas de dois componentes constituídos pelo Com- ponente I (também conhecido como dinitrogenase) e pelo Componente II (também conhecido como dinitrogenase redutase). O componente I é uma proteína MoFe na nitrogenase de molibdênio, uma proteína VFe na nitrogenase de vanádio e uma proteína Fe na nitrogenase apenas de ferro. O componente II é uma proteína Fe que contém um aglomerado de ferro-enxofre (Fe-S).

[00102] Em alguns casos, a variação do suprimento de cofatores pode resultar em um aumento da fixação de nitrogênio. Por exemplo, o aumento de absorção de enxofre pode fornecer uma associação maior de cofatores para as enzimas nitrogenase, aumentando, assim, o nú- mero de complexos funcionais de nitrogenase. Em alguns casos, a ab- sorção de enxofre pode ser aumentada pela regulação crescente de ge- nes de transporte de sulfato. Alguns exemplos de genes de transporte de sulfato podem ser, mas sem limitação, cysPTWA, sbp, sbp, cysZK.

[00103] Em alguns casos, a variação do suprimento de cofatores pode resultar em um aumento na fixação de nitrogênio. Por exemplo, o aumento da absorção de molibdênio (Mo) pode aumentar o número de complexos funcionais de nitrogenase. Em alguns casos, a absorção de Mo pode ser aumentada através da regulação crescente de genes de transporte de Mo. Alguns exemplos de genes de transporte de Mo po- dem ser, mas sem limitação, modEBA, modEB e modA.

[00104] Em alguns casos, o suprimento de cofator pode ser afetado pela absorção de ferro. A absorção de ferro pode ser influenciada pelo sistema de transporte de tonB. Em alguns casos, a influência na absor- ção de ferro pode ser alcançada através da regulação crescente de ge- nes do sistema de transporte de tonB. Alguns exemplos de genes do sistema de transporte de tonB podem ser, mas sem limitação, tonB e exbAB. Em alguns casos, a absorção de ferro pode ser influenciada por sideróforos, que aumentam a absorção de ferro em micróbios e plantas. Em alguns casos, a influência na absorção de ferro pode ser alcançada através da regulação crescente dos genes de biossíntese de siderófo- ros. Alguns exemplos de genes de biossíntese de sideróforos podem ser, mas sem limitação, yhfA, yusV, sbnA, fiu, yfiZ e fur.

[00105] A variação do fluxo metabólico para ATP pode resultar em um aumento da fixação de nitrogênio. Por exemplo, o fluxo metabólico para ATP pode ser aumentado alvejando a biossíntese de glicogênio. A biossíntese de glicogênio pode ser influenciada pelo desvio do carbono para a glicólise, o ciclo TCA e/ou fosforilação oxidativa, em vez da sín- tese de glicogênio. Em alguns casos, a biossíntese de glicogênio pode ser influenciada pela deleção ou regulação decrescente do gene rele- vante para a glicogênio sintase. Um exemplo de um gene da glicogênio sintase pode ser, mas sem limitação, glgA.

[00106] A variação do número de enzimas nitrogenase por célula pode resultar em um aumento na fixação de nitrogênio. Por exemplo, o número de enzimas nitrogenase por célula pode ser afetado pela des- repressão de nif. A desrepressão de nif pode ser alcançada sinalizando constitutivamente a inanição de nitrogênio. Em alguns casos, a desre- pressão de nif pode ser alcançada pela deleção do domínio de UR de genes relevantes. Um exemplo de um gene que pode ser alvejado para desreprimir genes nif pode ser, mas sem limitação, glnD. Em alguns ca- sos, a transcrição do aglomerado (ou dos aglomerados) de nif pode ser aumentada inserindo promotores fortes a montante de um óperon nifHDK ou nifDK.

[00107] Outra maneira de aumentar a fixação de nitrogênio pode ser aumentar o número de enzimas nitrogenase por célula, aumentando a transcrição de aglomerado de nif. A transcrição de aglomerado de Nif pode ser aumentada aumentando a transcrição de nifA. Em alguns ca- sos, a transcrição de aglomerado de nif pode ser influenciada pelo au- mento do número de cópias de um gene nifA no genoma.

[00108] A transcrição de aglomerado de Nif também pode ser au- mentada aumentando a tradução de NifA. Em alguns casos, a tradução de NifA pode ser aumentada aumentando a força do sítio de aglutinação de ribossomo no gene nifA.

[00109] A alteração da sensibilidade ao oxigênio da nitrogenase pode resultar em um aumento da fixação de nitrogênio. A sensibilidade ao oxigênio pode ser influenciada pela redução da detecção de oxigê- nio. Em alguns casos, a redução da detecção de oxigênio pode ser por meio de interrupção de genes detectores de oxigênio. Alguns exemplos de genes detectores de oxigênio podem ser, mas sem limitação, nifT/fixU, fixJ e fixL.

[00110] Em alguns casos, a sensibilidade ao oxigênio pode ser influ- enciada pela manutenção de níveis baixos de oxigênio citosólico, pro- movendo a respiração mediada pelo citocromo bd. Em alguns casos, a sensibilidade ao oxigênio pode ser influenciada por meio de regulação crescente de genes que codificam citocromo bd oxidase e/ou knockout de sistemas alternativos de citocromo. Alguns exemplos de genes que codificam genes de citocromo bd podem ser, mas sem limitação, cydABX, cydAB e cydX. Em alguns casos, a nitrogenase pode ser pro- tegida da oxidação alterando o equilíbrio redox na célula. O equilíbrio redox pode ser alterado através do sequestro de ROS. Uma estratégia para cumprir o sequestro de ROs seria a regulação crescente de genes relevantes. Alguns exemplos de genes sequestrantes de ROs podem ser, mas sem limitação, grxABCD, trxA, trxC e tpx.

[00111] Em alguns casos, a sensibilidade ao oxigênio pode ser influ- enciada pelo sequestro de oxigênio livre. Em alguns casos, o sequestro do oxigênio livre pode ser alcançado através da regulação crescente dos genes de hemoglobina bacteriana. Um exemplo de um gene de he- moglobina pode ser, mas sem limitação, glbN. Em alguns casos, o se- questro de oxigênio livre pode ser alcançado através da regulação cres- cente de genes fixNOPQ que codificam uma oxidase heme-cobre do tipo cbb3 de alta afinidade.

[00112] A modificação de IHFa pode resultar em um aumento da ex- pressão da nitrogenase. Em alguns casos, a expressão da nitrogenase pode ser aumentada facilitando a interação entre nifA e σ54 na sequên- cia a montante de ativação a montante de certos genes. Em particular, a regulação crescente de IHF pode aumentar a transcrição de nitroge- nase. Em alguns casos, a regulação crescente de IHF em combinação com nifA e σ54 pode aumentar a transcrição de óperon de nitrogenase. Em alguns casos, as cepas que podem ser utilizadas neste processo de aumento da expressão de nitrogênio podem incluir, mas sem limitação, cepas Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari e/ou Klebsiella variicola. Em alguns casos, a regulação crescente de um óperon de nitrogenase pode ser mais eficaz quando acumulada com mutação em um gene que codifica σ54.

[00113] A modificação de um gene que codifica σ54 pode resultar em um aumento da expressão da nitrogenase. Em alguns casos, a regula- ção crescente de um gene para σ54 pode aumentar a transcrição da nitrogenase. Um exemplo de um gene que codifica σ54 inclui, mas sem limitação, rpoN. Em alguns casos, as cepas que podem ser utilizadas neste processo de aumento da expressão de nitrogênio podem incluir, mas sem limitação, cepas Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari e/ou Klebsiella variicola. Em alguns casos, a regulação crescente de σ54 em combinação com nifA e IHF pode aumentar a transcrição de um óperon de nitrogenase. Em alguns casos, a transcrição do óperon de nitroge- nase pode ser aprimorada ainda mais, dispondo a regulação crescente de σ54 com uma mutação IHF.

[00114] Em alguns casos, a deleção de uma proteína, tal como DraT em uma cepa, tal como uma cepa de kosakonia, pode aumentar a ativi- dade da nitrogenase. Em alguns casos, a DraT pode modificar pós-tra- ducionalmente uma enzima nitrogenase para inibir a atividade da mesma. Em alguns casos, as cepas que podem ser utilizadas nesse processo de aumento da atividade da nitrogenase podem incluir, mas sem limitação, cepas de kosakonia.

[00115] Em alguns casos, a modificação de um gene asnB pode au- mentar a excreção de amônio. Em particular, o truncamento e a regula- ção crescente de um gene asnB podem converter a glutamina nova- mente em amônio. As enzimas AsnB contêm dois domínios; um pode desaminar a glutamina para liberar amônio e o outro usa o amônio para gerar asparagina. Truncar o AsnB para deletar o domínio da asparagina sintase e/ou regular de forma crescente o domínio da glutamina desa- minase pode ajudar a converter a glutamina celular de volta em amônio, aumentando, assim, a excreção de amônio. Em alguns casos, as cepas que podem ser utilizadas neste processo de aumento da excreção de amônio podem incluir, mas sem limitação, cepas de Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari e Klebsiella variicola.

[00116] Em alguns casos, a modificação de um gene asnB pode au- mentar a excreção de amônio. Em particular, a deleção de um gene asnB pode reduzir os sumidouros de amônio em uma célula. O asnB é capaz de usar amônio citosólico em vez de glutamina como um doador de N. Em alguns casos, deletar, truncar ou regular de forma crescente de asnB pode aumentar a quantidade de amônio excretada de uma cé- lula. Em alguns casos, as cepas que podem ser utilizadas neste pro- cesso de aumento da excreção de amónio podem incluir, mas sem limi- tação, cepas de Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari e Klebsiella va- riicola.

[00117] Em alguns casos, a modificação de glnD pode ser benéfica na modificação da regulação de assimilação de nitrogênio. Em particu- lar, as modificações de glnD podem ser usadas para otimizar a regula- ção das vias de assimilação de nitrogênio através da via de sinalização da proteína PII. A enzima codificada por glnD modifica as proteínas PII GlnK e GlnB. A enzima GlnD uridilila e desuridilila, de forma reversível, as proteínas PII em condições de limitação e excesso de nitrogênio, res- pectivamente. As proteínas PII conferem cascatas de sinalização às vias metabólicas do nitrogênio. Exemplos de genes do metabolismo do nitrogênio influenciados pela sinalização da proteína PII incluem, mas sem limitação, glnA que codifica glutamina sintetase, ntrB/glnL que co- difica histidina quinase sensorial/fosfatase ntrB, ntrC regulador transcri- cional de aglutinação a DNA glnG/ntrC e o óperon nifLA. Em alguns ca- sos, o glnD pode ser deletado para diminuir a transcrição dos genes de assimilação de nitrogênio e a quantidade de nitrogênio assimilado den- tro de uma célula. Em alguns casos, o glnD pode ser modificado dele- tando a região ACT12, deletando a região UR e/ou desativando a região UR através da mutação de resíduos específicos de aminoácidos (por exemplo, resíduos 90, 91 e/ou 104). Em alguns casos, as cepas que podem ser utilizadas neste processo de diminuição da assimilação de nitrogênio podem incluir, mas sem limitação, cepas de Rahnella aquati- lis, Kosakonia saccharie Klebsiella variicola.

[00118] Em alguns casos, a modificação da glnD pode ser benéfica no aumento da atividade de nitrogenase, excreção de amônio e/ou cres- cimento de plantas. Em particular, a remoção de uma região de detec- ção de nitrogênio pode aumentar a atividade da nitrogenase e/ou o cres- cimento da planta. Em alguns casos, um domínio ACT do glnD pode ser deletado. Em alguns casos, o domínio ACT está envolvido na detecção do status de nitrogênio por meio de regulação alostérica por glutamina. A remoção de um domínio ACT pode diminuir a atividade da uridilil- transferase, sinalizando, desse modo, o excesso de nitrogênio e regu- lando de forma decrescente os genes de assimilação de nitrogênio, le- vando a um aumento na excreção de amônio. Em alguns casos, as ce- pas que podem ser utilizadas neste processo de aumento da atividade de nitrogenase, excreção de amónio e/ou o crescimento das plantas po- dem incluir, mas sem limitação, cepas de Kosakonia sacchari e Klebsi- ella variicola.

[00119] Em alguns casos, a modificação da glnD pode ser benéfica no aumento da atividade de nitrogenase, excreção de amônio e/ou cres- cimento de plantas. Em particular, a remoção ou desativação de uma região de uridilil-transferase (UT) dentro de um domínio da glnD pode aumentar a atividade de nitrogenase, a excreção de amônio e/ou o cres- cimento de planta. A remoção ou desativação de um domínio UT pode diminuir a atividade da uridilil-transferase, sinalizando, desse modo, o excesso de nitrogênio e regulando, de forma decrescente, os genes de assimilação de nitrogênio, levando a um aumento na excreção de amô- nio. Em alguns casos, cepas que podem ser utilizadas nesse processo de aumento da atividade de nitrogenase, excreção de amônio e/ou o crescimento de plantas podem incluir, mas sem limitação, cepas de Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari e Klebsiella variicola.

[00120] Em alguns casos, a modificação de GlnB pode ser benéfica no aumento da excreção de compostos nitrogenados. Em alguns casos, o domínio uridilila transferase (UTase) de GlnD modifica o GlnB na tiro- sina-51. Em alguns casos, modificando o domínio UTase de GlnD, a produção de GlnB-UMP pode ser diminuída. Em alguns casos, remo- vendo o domínio UTase de GlnD, a produção de GlnB-UMP pode ser diminuída. Em alguns casos, alterando o domínio UTase de GlnD, a pro- dução de GlnB-UMP pode ser impedida. Em alguns casos, removendo o domínio UTase de GlnD, a produção de GlnB-UMP pode ser impedida. Em alguns casos, o GlnB pode ser modificado pela deleção de tirosina-

51. Em alguns casos, o GlnB pode ser modificado modificando o GlnB na tirosina-51. Em alguns casos, as cepas que podem ser utilizadas neste processo de aumento da excreção de amónio podem incluir, mas sem limitação, cepas de Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari e Kleb- siella variicola.

[00121] Em alguns casos, a modificação de GlnK pode ser benéfica no aumento da excreção de amônio. Em alguns casos, GlnK pode se comportar dentro de uma cepa como um análogo de GlnB, com base em uma similaridade de estrutura entre GlnK e GlnB. Em alguns casos, a modificação de GlnK pode aumentar a excreção de amônio remo- vendo os efeitos inibitórios que podem ser baseados em GlnK. Em al- guns casos, alterando GlnK, os efeitos inibitórios na excreção de amônio podem ser diminuídos. Em alguns casos, removendo GlnK, os efeitos inibitórios na excreção de amônio podem ser diminuídos. Em alguns ca- sos, alterando GlnK, os efeitos inibitórios na excreção de amônio com base em GlnK podem ser evitados. Em alguns casos, removendo o gene glnK, os efeitos inibitórios na excreção de amônio com base no GlnK podem ser evitados. Em alguns casos, as cepas que podem ser utilizadas neste processo de aumento da excreção de amónio podem incluir, mas sem limitação, cepas de Rahnella aquatilis, Kosakonia sac- chari e Klebsiella variicola.

[00122] Em alguns casos, a modificação de glnK pode ser benéfica no aumento da excreção de amônio. Em alguns casos, o domínio UTase de GlnD modifica glnK na tirosina-51. Em alguns casos, modificando o domínio UTase de GlnD, a produção de glnK-UMP pode ser diminuída. Em alguns casos, removendo o domínio UTase de GlnD, a produção de glnK-UMP pode ser diminuída. Em alguns casos, alterando o domínio UTase de GlnD, a produção de glnK-UMP pode ser impedida. Em al- guns casos, removendo o domínio UTase de GlnD, a produção de glnK- UMP pode ser impedida. Em alguns casos, o GlnK pode ser modificado pela deleção de tirosina-51. Em alguns casos, o GlnK pode ser modifi- cado modificando o GlnK na tirosina-51. Em alguns casos, as cepas que podem ser utilizadas neste processo de aumento da excreção de amô- nio podem incluir, mas sem limitação, cepas de Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari e Klebsiella variicola.

[00123] Em alguns casos, a modificação do glnL que codifica a pro- teína NtrB pode ser benéfica no aumento da excreção de amônio. Em particular, a modificação de NtrB pode ser benéfica no controle da trans- crição de glnA independente do status de nitrogênio. Em alguns casos, a modificação do ntrB pode ser alcançada deletando resíduos específi- cos para titular a atividade. Em alguns casos, as cepas que podem ser utilizadas neste processo de aumento da excreção de amônio podem incluir, mas sem limitação, cepas de Rahnella aquatilis, Kosakonia sac- chari e Klebsiella variicola.

[00124] Em alguns casos, a modificação de glnA pode ser benéfica no aumento da excreção de amônio. Em alguns casos, a modificação de NtrC pode ser benéfica na modificação do nível de proteína GlnA na célula. Em particular, a modificação de NtrC pode ser benéfica impe- dindo a fosforilização de NtrC. O NtrC fosforilado pode levar à ativação transcricional do glnA. Como tal, a modificação de ntrC de modo a im- pedir a fosforilização de ntrC pode ser benéfica na diminuição da trans- crição de glnA. Em alguns casos, a modificação do NtrC pode ser alcan- çada substituindo o asparato 54. Em alguns casos, as cepas que podem ser utilizadas neste processo de aumento da excreção de amônio po- dem incluir, mas sem limitação, cepas de Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari e Klebsiella variicola.

[00125] Em alguns casos, a modificação da Glutaminase B pode ser benéfica no aumento da excreção de amônio. Em particular, em alguns casos, a conversão de glutamina de volta em glutamato e amônia pela Glutaminase B pode ser regulada de forma crescente, de modo a au- mentar a excreção de amônio. Em alguns casos, as cepas que podem ser utilizadas neste processo de aumento da excreção de nitrogênio po- dem incluir, mas sem limitação, cepas de Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari e Klebsiella variicola.

[00126] Em alguns casos, a modificação de nifA pode ser benéfica no aumento da expressão de nitrogenase. Em alguns casos, pode ser benéfico modificar nifA para aumentar o número de cópias do gene nifA em uma célula. O número de cópias do gene nifA pode ser aumentado através da inserção de várias cópias de um gene nifA em frente a pro- motores que expressam constitutivamente. Em alguns casos, fixar uma cópia do gene nifA a um ou mais óperons de manutenção pode aumen- tar um número geral de genes nifA em uma célula. Em alguns casos, as cepas que podem ser utilizadas neste processo de aumento da expres- são da nitrogenase podem incluir, mas sem limitação, cepas de Rahnella aquatilis e Klebsiella variicola.

[00127] Em alguns casos, a modificação de um óperon da nitroge- nase pode ser benéfica no aumento da expressão de nitrogenase. Em alguns casos, pode ser benéfico regular de forma crescente óperons de nitrogenase de modo a aumentar a transcrição de nitrogenase. Em al- guns casos, promotores de dentro da bactéria que estão ativos quando a bactéria está colonizando a rizosfera podem ser inseridos em frente aos óperons da nitrogenase para regular, de forma crescente, óperons de nitrogenase. Em alguns casos, o nifL pode ser deletado nos óperons de nitrogenase para regular, de forma crescente, óperons de nitroge- nase. Em alguns casos, o nifA pode ser deletado nos óperons de nitro- genase para regular, de forma crescente, óperons de nitrogenase. Em alguns casos, nifA e nifL podem ser deletados dentro dos óperons de nitrogenase para regular, de forma crescente, óperons de nitrogenase. Em alguns casos, múltiplos promotores podem ser colocados direta- mente em frente aos genes nifHDK, a fim de contornar o controle de transcrição de nifA. Em alguns casos, as cepas que podem ser utiliza- das neste processo de aumento da expressão da nitrogenase podem incluir, mas sem limitação, cepas de Rahnella aquatilis e Klebsiella va- riicola.

[00128] Em alguns casos, a modificação de glnE pode ser benéfica no aumento da excreção de amônio. Em alguns casos, um motivo con- servado de aspartato-aminoácido-aspartato (DXD) no domínio AR de glnE pode ser alterado. Em alguns casos, a alteração de um resíduo de DXD conservado no domínio AR de glnE pode ser usada para remover a atividade de desadenililação de glnE. Em alguns casos, um resíduo D pode ser substituído em um motivo de DXD na região de AR de glnE. Em alguns casos, a substituição de um resíduo D em um motivo de DXD na região de AR de glnE pode deixar o sítio de aglutinação de GlnB intacto, de modo a permitir a regulação da atividade de adenilação en- quanto diminui ou impede a atividade de AR. Em alguns casos, as cepas que podem ser utilizadas neste processo de aumento da excreção de amônio podem incluir, mas sem limitação, cepas de Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari e Klebsiella variicola.

[00129] Em alguns casos, a modificação de glnA pode ser benéfica no aumento da excreção de AMM. Em alguns casos, o glnA pode ser regulado de forma decrescente pela inserção dos promotores de glnB, glnD e/ou glnE a montante do gene glnA. Em alguns casos, a modifica- ção de glnA pode dissociar a expressão de glnA de uma cascata de sinalização de status N e diminuir a expressão para um nível basal, de modo que mais nitrogênio fixo permaneça não assimilado. Em alguns casos, as cepas que podem ser utilizadas neste processo de aumento da excreção de amônio podem incluir, mas sem limitação, cepas de Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari e Klebsiella variicola.

[00130] Em alguns casos, a modificação de GOGAT pode ser bené- fica no aumento da excreção de amônio. Em alguns casos, o GOGAT pode ser regulado de forma decrescente pela inserção, a montante dos genes GOGAT, de um promotor que controla glnB, glnD e/ou glnE. A regulação decrescente de GOGAT pode, por sua vez, levar à redução da expressão de glutamina oxiglutarato aminotransferase. Em alguns casos, a modificação de GOGAT pode dissociar a expressão de GO- GAT de uma cascata de sinalização de status N e diminuir a expressão para um nível basal, de modo que mais nitrogênio fixo permaneça não assimilado. Em alguns casos, as cepas que podem ser utilizadas neste processo de aumento da excreção de amônio podem incluir, mas sem limitação, cepas de Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari e Klebsiella variicola.

[00131] Em alguns casos, a modificação de GDH pode ser benéfica no aumento da excreção de amônio. Em alguns casos, o GDH pode ser regulado de forma decrescente pela inserção, a montante do gene GDH, de um promotor que controla glnB, glnD e/ou glnE. A regulação decres- cente de GDH pode, por sua vez, levar à diminuição da expressão de glutamato desidrogenase específica de NAD. Em alguns casos, a modi- ficação de GDH pode dissociar a expressão de GDH de uma cascata de sinalização de status N e diminuir a expressão para um nível basal, de modo que mais nitrogênio fixo permaneça não assimilado. Em alguns casos, as cepas que podem ser utilizadas neste processo de aumento da excreção de amônio podem incluir, mas sem limitação, cepas de Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari e Klebsiella variicola. AUMENTO DA FIXAÇÃO DE NITROGÊNIO ATRAVÉS DA ASSIMILA-

ÇÃO

[00132] A quantidade de nitrogênio fornecida a uma planta associ- ada a micróbios pode ser aumentada diminuindo a assimilação de nitro- gênio no micróbio. Aqui, a assimilação pode ser influenciada pela taxa de excreção de amônia. Ao alvejar a assimilação de amônia, a disponi- bilidade de nitrogênio pode ser aumentada. Em alguns casos, a influên- cia da assimilação de amônia pode ocorrer diminuindo a taxa de reab- sorção de amônia após a excreção. Para diminuir a taxa de reabsorção de amônia após a excreção, qualquer gene relevante pode ser subme- tido a knockout. Um exemplo de genes de reabsorção de amônia pode ser, mas sem limitação, amtB.

[00133] Em alguns casos, a assimilação pode ser influenciada pela taxa de absorção de planta. Ao alvejar os genes e vias de assimilação de nitrogênio de planta, a disponibilidade de nitrogênio pode ser aumen- tada. Em alguns casos, a assimilação de amônia por uma planta pode ser alterada através de inoculação com micróbios promotores de cres- cimento de plantas fixadoras de N. Uma triagem pode ser efetuada para identificar micróbios que induzem a assimilação de amônia em plantas. AUMENTO DA FIXAÇÃO DE NITROGÊNIO ATRAVÉS DA COLONIZA-

ÇÃO

[00134] O aumento da capacidade de colonização dos micróbios pode aumentar a quantidade de nitrogênio fixo fornecida a uma planta. A colonização pode ser influenciada pela alteração da capacidade de carga (a abundância de micróbios na superfície da raiz) e/ou aptidão dos micróbios. Em alguns casos, a influência da capacidade de carga e a aptidão dos micróbios pode ser alcançada através da alteração do transporte de ácidos orgânicos. O transporte de ácido orgânico pode ser melhorado através da regulação crescente de genes relevantes. Um exemplo de um gene de transporte de ácido orgânico pode ser, mas sem limitação, dctA.

[00135] Por exemplo, a capacidade de colonização pode ser afetada pela expressão de aglutininas. O aumento da expressão de aglutininas pode ajudar os micróbios a aderir às raízes de plantas. Exemplos de genes de aglutinina podem incluir, mas sem limitação, fhaB e fhaC.

[00136] A capacidade de colonização pode ser afetada por um au- mento na entrada endofítica. Por exemplo, a entrada endofítica pode ser afetada por enzimas de degradação de parede celular (CDWE) de planta. O aumento da expressão e/ou secreção de CDWE pode aumen- tar a colonização e a entrada endofítica dos micróbios. Alguns exemplos de CDWEs são, mas sem limitação, poligalacturonases e celulases. Um exemplo de um gene de poligalacturonases é pehA. Em alguns casos, a exportação de poligalacturonases e celulases pode ser aumentada fornecendo um sinal de exportação com as enzimas.

[00137] A variação da capacidade de carga pode resultar em uma quantidade aumentada de nitrogênio sendo fornecida a uma planta as- sociada. A capacidade de carga pode ser afetada pela formação de bi- ofilme. Em alguns casos, a capacidade de carga pode ser afetada por rsmZ pequeno de RNA. O rsmZ pequeno de RNA é um regulador nega- tivo da formação de biofilme. Em alguns casos, a formação de biofilme pode ser promovida pela deleção ou regulação decrescente de rsmZ, que leva ao aumento da tradução de rsmA (um regulador positivo do metabolismo secundário) e à formação de biofilme.

[00138] Em alguns casos, a formação de biofilme pode ser influenci- ada pelo aumento da capacidade de as cepas aderirem à superfície de raiz. Em alguns casos, a formação de biofilme pode ser promovida atra- vés da regulação crescente de grandes proteínas de adesão. Um exem- plo de uma grande proteína de adesão pode ser, mas sem limitação, lapA.

[00139] Em alguns casos, a capacidade de carga pode ser afetada pela detecção de quórum. Em alguns casos, a detecção de quórum pode ser aprimorada aumentando o número de cópias de genes de bi- ossíntese de AHL.

[00140] Em alguns casos, a colonização da rizosfera pode ser influ- enciada pela massa radicular. Por exemplo, a massa radicular pode ser afetada pela biossíntese microbiana de IAA. A biossíntese aumentada de IAA pelo micróbio pode estimular a formação de biomassa radicular. Em alguns casos, a influência da biossíntese de IAA pode ser alcançada através da regulação crescente (em uma variedade de níveis) de genes de biossíntese de IAA. Um exemplo de um gene de biossíntese de IAA pode ser, mas sem limitação, ipdC.

[00141] Em alguns casos, a sinalização de etileno pode induzir resis- tência sistêmica na planta e afetar a capacidade de colonização do mi- cróbio. O etileno é uma molécula de sinalização de planta que provoca uma ampla faixa de respostas com base em tecido de planta e nível de etileno. O modelo predominante para a resposta ao etileno em raízes é que as plantas que são expostas ao estresse respondem rapidamente produzindo um pequeno pico de etileno que inicia uma resposta prote- tora pela planta, por exemplo, a transcrição de genes que codificam pro- teínas defensivas. Se o estresse persistir ou for intenso, ocorre um se- gundo pico muito maior de etileno, geralmente após vários dias. Esse segundo pico de etileno induz processos, tais como senescência, clo- rose e abscisão que podem levar a uma inibição significativa do cresci- mento e sobrevivência de plantas. Em alguns casos, bactérias promo-

toras de crescimento de plantas podem estimular o crescimento radicu- lar produzindo a auxina IAA, que estimula uma pequena resposta de etileno nas raízes. Ao mesmo tempo, as bactérias podem impedir o se- gundo grande pico de etileno produzindo uma enzima (ACC desami- nase) que retarda a produção de etileno na planta, mantendo assim um nível de etileno propício ao estímulo do crescimento radicular. A indução de resistência sistêmica na planta pode ser influenciada por IAAs bac- terianos. Em alguns casos, o estímulo à biossíntese de IAA pode ser alcançado através da regulação crescente (em uma variedade de ní- veis) de genes de biossíntese de IAA. Um exemplo de um gene de bi- ossíntese pode ser, mas sem limitação, ipdC.

[00142] Em alguns casos, a colonização pode ser afetada pela ACC Desaminase. A ACC Desaminase pode diminuir a produção de etileno na raiz, desviando o ACC para um produto secundário. Em alguns ca- sos, a influência da ACC desaminase pode ser alcançada através da regulação crescente de genes de ACC desaminase. Alguns exemplos de genes de ACC desaminase podem ser, mas sem limitação, dcyD.

[00143] Em alguns casos, a colonização pode ser influenciada pela capacidade de carga e/ou aptidão de micróbio. Por exemplo, a capaci- dade de carga e/ou a aptidão de micróbios podem ser afetadas pela superprodução de trealose. A superprodução de trealose pode aumen- tar a tolerância à seca. Em alguns casos, a influência de superprodução de trealose pode ser alcançada por meio da regulação crescente (em uma variedade de níveis) de genes de biossíntese de trealose. Alguns exemplos de genes de biossíntese de trealose podem ser, mas sem li- mitação, otsA, otsB, treZ e treY. Em alguns casos, a regulação cres- cente de otsB também pode aumentar a atividade de fixação de nitro- gênio.

[00144] Em alguns casos, a capacidade de carga pode ser afetada pela fixação de raiz. A fixação de raiz pode ser influenciada pela secre- ção de exopolissacarídeos. Em alguns casos, a influência da secreção de exopolissacarídeos pode ser alcançada através da regulação cres- cente de proteínas de produção de exopolissacarídeos. Alguns exem- plos de proteínas de produção de exopolissacarídeos podem ser, mas sem limitação, yjbE e pssM. Em alguns casos, a influência da secreção de exopolissacarídeos pode ser alcançada através da regulação cres- cente de biossíntese de celulose. Alguns exemplos de genes de bios- síntese de celulose podem ser, mas sem limitação, genes acs e aglo- merados de genes bcs.

[00145] Em alguns casos, a capacidade de carga e/ou a aptidão de micróbio podem ser afetadas pela inibição fúngica. A inibição fúngica pode ser influenciada pelas quitinases, que podem quebrar as paredes celulares de fungos e levar ao biocontrole de fungos da rizosfera. Em alguns casos, a influência da inibição de fungos pode ser alcançada através da regulação crescente de genes de quitinase. Alguns exemplos de genes de quitinase podem ser, mas sem limitação, quitinase classe 1 e chiA.

[00146] Em alguns casos, a absorção eficiente de ferro pode ajudar os micróbios a sobreviver na rizosfera, onde precisam competir com ou- tros micróbios do solo e com a planta para absorção de ferro. Em alguns casos, a quelação de alta afinidade (sideróforos) e os sistemas de trans- porte podem ajudar na competência da rizosfera: 1) garantindo que os micróbios obtenham ferro suficiente e 2) reduzindo a associação de ferro para as espécies concorrentes. O aumento da capacidade do mi- cróbio para realizar isso pode aumentar sua aptidão competitiva na ri- zosfera. Em alguns casos, a influência na absorção de ferro pode ser por meio da regulação crescente de genes de sideróforos. Alguns exem- plos de genes de sideróforos podem ser, mas sem limitação, yhfA, yusV, sbnA, fiu, yfiZ e fur. Em alguns casos, a absorção de ferro pode ser influenciada pelo sistema de transporte de tonB. Em alguns casos, a influência na absorção de ferro pode ser por meio da regulação cres- cente de genes do sistema de transporte de tonB. Alguns exemplos de genes do sistema de transporte tonB podem ser, mas sem limitação, tonB e exbAB.

[00147] Em alguns casos, a capacidade de carga e/ou a aptidão de micróbio podem ser afetadas pelo equilíbrio redox e/ou sequestro de ROS. O equilíbrio redox e/ou sequestro de ROS podem ser influencia- dos pela biossíntese da glutationa bacteriana (GSH). Em alguns casos, a influência da biossíntese da glutationa bacteriana (GSH) pode ser através da regulação crescente de genes da biossíntese da glutationa bacteriana. Alguns exemplos de genes de biossíntese de glutationa bac- teriana podem ser, mas sem limitação, gshA, gshAB e gshB.

[00148] Em alguns casos, o equilíbrio Redox pode ser influenciado pelo sequestro de ROS. Em alguns casos, a influência do sequestro de ROS pode ser através da regulação crescente de catalases. Alguns exemplos de genes de catalases podem ser, mas sem limitação, katEG e Mn catalase.

[00149] Em alguns casos, a formação de biofilme pode ser influenci- ada pela sinalização de fósforo. Em alguns casos, a influência de sina- lização de fósforo pode ser por meio de alteração da expressão de ge- nes de sinalização de fósforo. Alguns exemplos de genes de sinalização de fósforo podem ser, mas sem limitação, phoR e phoB.

[00150] Em alguns casos, a capacidade de carga pode ser afetada pela fixação de raiz. A fixação de raiz pode ser influenciada pela bios- síntese de surfactina. Em alguns casos, a influência da biossíntese de surfactina pode ser alcançada através da regulação crescente de bios- síntese de surfactina para aprimorar a formação de biofilme. Um exem- plo de genes de biossíntese de surfactina pode ser, mas sem limitação, srfAA.

[00151] Em alguns casos, a colonização e/ou a aptidão de micróbios podem ser influenciadas pela capacidade de carga, competição com ou- tros micróbios e/ou proteção de culturas contra outros micróbios. Em alguns casos, a competição com outros micróbios e/ou a proteção de culturas contra outros micróbios pode ser influenciada pela detecção de quórum e/ou pelo arrefecimento brusco de quórum. O arrefecimento brusco de quórum pode influenciar a colonização, inibindo a detecção de quórum de possíveis bactérias patogênicas/concorrentes. Em alguns casos, a influência do arrefecimento brusco de quórum pode ser alcan- çada através da inserção e/ou regulação crescente de genes que codi- ficam as enzimas de arrefecimento brusco de quórum. Alguns exemplos de genes de arrefecimento brusco de quórum podem ser, mas sem limi- tação, ahlD, Y2-aiiA, aiiA, ytnP e attM. Em alguns casos, a modificação de enzimas envolvidas no arrefecimento brusco de quórum, tais como Y2-aiiA e/ou ytnP, pode ser benéfica para a colonização. Em alguns ca- sos, a regulação crescente de Y2-aiiA e/ou ytnP pode resultar em hidró- lise de lactona acil-homoserina extracelular (AHL). aiiA é uma lactonase N-acil homoserina que é uma enzima que decompõe a lactona homose- rina. A quebra de AHL pode interromper ou retardar a capacidade de sinalização de quórum de bactérias gram negativas concorrentes. Em alguns casos, as cepas que podem ser utilizadas neste processo de au- mento da colonização podem incluir, mas sem limitação, cepas de Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari e Klebsiella variicola.

[00152] Em alguns casos, a capacidade de carga e/ou a aptidão dos micróbios podem ser afetadas pela biossíntese de rizobitoxina. A bios- síntese de rizobitoxina pode diminuir a produção de etileno na raiz, ini- bindo a ACC sintase. Em alguns casos, a influência da biossíntese de rizobitoxina pode ser alcançada através da regulação crescente de ge- nes de biossíntese de rizobitoxina.

[00153] Em alguns casos, a capacidade de carga pode ser afetada pela fixação de raiz. A fixação de raiz pode ser influenciada pela secre- ção de exopolissacarídeos. Em alguns casos, a influência da secreção de exopolissacarídeos pode ser alcançada gerando mutantes hipermu- coides, deletando mucA.

[00154] Em alguns casos, a fixação de raiz pode ser influenciada pela biossíntese da fenazina. Em alguns casos, a influência da biossíntese de fenazina pode ser alcançada através da regulação crescente de ge- nes de biossíntese de fenazina para aprimorar a formação de biofilme.

[00155] Em alguns casos, a fixação de raiz pode ser influenciada pela biossíntese de lipopeptídeo cíclico (CLP). Em alguns casos, a influência da biossíntese de lipopeptídeos cíclicos (CLP) pode ser alcançada atra- vés da regulação crescente da biossíntese de CLP para aprimorar a for- mação de biofilme.

[00156] Em alguns casos, a capacidade de carga e/ou a concorrên- cia podem ser afetadas pela síntese de antibióticos. A síntese de anti- bióticos pode aumentar a produção de antibióticos para exterminar os micróbios concorrentes. Em alguns casos, o aumento da produção de antibióticos pode ser alcançado pela mineração de genomas para vias de biossíntese de antibióticos e para a regulação crescente.

[00157] Em alguns casos, a colonização pode ser afetada pela tole- rância à dessecação. Em alguns casos, a modificação do rpoE pode ser benéfica para a colonização. Em alguns casos, a regulação crescente da rpoE pode resultar no aumento da expressão de genes e vias de tolerância ao estresse. Em alguns casos, a rpoE pode ser regulada de forma crescente com uso de um promotor exclusivo comutável. Em al- guns casos, a rpoE pode ser regulada de forma crescente com uso de um promotor de arabinose. rpoE é um fator sigma semelhante ao phyR. Quando expressa, a rpoE pode causar regulação crescente de vários genes de tolerância ao estresse. Visto que as enzimas de tolerância ao estresse podem não ser úteis durante um ciclo de colonização, um pro- motor comutável pode ser usado. Em alguns casos, o promotor pode estar ativo durante o crescimento de biomassa e/ou durante o revesti- mento de sementes. Em alguns casos, um promotor comutável pode ser usado onde o açúcar ou o produto químico pode ser adicionado durante a fase logarítmica de crescimento de biomassa, mas também pode ter o promotor não ligado durante uma ou mais outras aplicações do micró- bio. Em alguns casos, o rpoE pode ser regulado de forma crescente, ao mesmo tempo que regula rseA de forma decrescente. Em alguns casos, as cepas que podem ser utilizadas neste processo de aumento da colo- nização podem incluir, mas sem limitação, cepas de Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari e Klebsiella variicola.

[00158] Em alguns casos, a colonização pode ser afetada pela tole- rância à dessecação. Em alguns casos, a modificação de rseA pode ser benéfica para a colonização. Em alguns casos, o rseA pode ser regu- lado de forma decrescente com uso de um promotor exclusivo comutá- vel. Em alguns casos, o rseA pode ser regulado de forma decrescente com uso de um promotor de arabinose. rseA é um fator antissigma co- expresso com rpoE. Em alguns casos, as enzimas permanecem ligadas umas às outras, o que pode diminuir ou desativar a capacidade de rpoE de atuar como um fator de transcrição. No entanto, durante condições de estresse, o resA pode ser clivado e o rpoE pode estar livre para re- gular de forma crescente/decrescente os genes de tolerância ao es- tresse. Ao romper a cotranscrição com rpoE, os níveis de rpoE e resA podem ser titulados independentemente, o que pode ser benéfico na otimização da colonização de cepas geneticamente modificadas. Em al- guns casos, as cepas que podem ser utilizadas neste processo de au- mento da colonização podem incluir, mas sem limitação, cepas de Rahnella aquatilis, Kosakonia sacchari e Klebsiella variicola.

GERAÇÃO DE POPULAÇÕES BACTERIANAS ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS

[00159] Os micróbios úteis nos métodos e composições divulgados neste documento podem ser obtidos através da extração de micróbios de superfícies ou tecidos de plantas nativas. Os micróbios podem ser obtidos moendo sementes para isolar micróbios. Os micróbios podem ser obtidos plantando sementes em diversas amostras de solo e recu- perando micróbios de tecidos. Além disso, os micróbios podem ser ob- tidos inoculando plantas com micróbios exógenos e determinando quais micróbios aparecem nos tecidos vegetais. Exemplos não limitativos de tecidos vegetais podem incluir uma semente, muda, folha, ramo, planta, bulbo ou tubérculo.

[00160] Um método de obtenção de micróbios pode ser através do isolamento de bactérias dos solos. As bactérias podem ser coletadas de vários tipos de solo. Em algum exemplo, o solo pode ser caracterizado por traços, tais como alta ou baixa fertilidade, níveis de umidade, níveis de minerais e várias práticas de cultura. Por exemplo, o solo pode estar envolvido em uma rotação de culturas, em que diferentes culturas são plantadas no mesmo solo em estações sucessivas de plantio. O cresci- mento sequencial de diferentes culturas no mesmo solo pode impedir o esgotamento desproporcional de certos minerais. As bactérias podem ser isoladas das plantas que crescem nos solos selecionados. As plan- tas de mudas podem ser colhidas após 2 a 6 semanas de crescimento. Por exemplo, pelo menos 400 isolados podem ser coletados em uma etapa de colheita. Os tipos de solo e planta revelam o fenótipo da planta, bem como as condições, que permitem o enriquecimento a jusante de certos fenótipos.

[00161] Micróbios podem ser isolados de tecidos vegetais para ava- liar os traços microbianos. Os parâmetros para o processamento de amostras de tecido podem variar para isolar diferentes tipos de micró- bios associativos, tais como bactérias rizoféricas, epífitas ou endófitos.

Os isolados podem ser cultivados em meio livre de nitrogênio para enri- quecer as bactérias que desempenham a fixação de nitrogênio. Alterna- tivamente, micróbios podem ser obtidos em bancos globais de cepa.

[00162] A análise in planta é desempenhada para avaliar traços mi- crobianos. Em algumas modalidades, o tecido de planta pode ser pro- cessado para triagem por processamento de alto desempenho para DNA e RNA. Além disso, medições não invasivas podem ser usadas para avaliar as características de plantas, tais como a colonização. As medições em micróbios selvagens podem ser obtidas em uma base planta por planta. Medições em micróbios selvagens também podem ser obtidas no campo com uso de métodos de desempenho médio. As me- dições podem ser feitas sucessivamente ao longo do tempo. O sistema de planta modelo pode ser usado incluindo, porém sem limitação, Seta- ria.

[00163] Micróbios em um sistema de planta podem ser triados por meio de perfil de transcrição de um micróbio em um sistema de planta. Exemplos de triagem através de perfil transcricional são uso de métodos de reação quantitativa em cadeia da polimerase (qPCR), códigos de barras moleculares para detecção de transcrições, sequenciamento de próxima geração e etiquetagem de micróbios com marcadores fluores- centes. Os fatores de impacto podem ser medidos para avaliar a colo- nização em estufa, incluindo, porém sem limitação, microbioma, fatores abióticos, condições de solo, oxigênio, umidade, temperatura, condi- ções de inóculo e localização de raízes. A fixação de nitrogênio pode ser avaliada em bactérias através da medição de gás 15N/fertilizante (diluição) com IRMS ou NanoSIMS, conforme descrito neste docu- mento, NanoSIMS é uma espectrometria de massa de íons secundários de alta resolução. A técnica de NanoSIMS é uma maneira de investigar a atividade química de amostras biológicas. A catálise de redução das reações de oxidação que acionam o metabolismo de microrganismos pode ser investigada nos níveis celular, subcelular, molecular e elemen- tar. A NanoSIMS pode fornecer alta resolução espacial superior a 0,1 µm. A NanoSIMS pode detectar o uso de rastreadores de isótopos, tais 13 15 18 como C, Ne O. Portanto, a NanoSIMS pode ser usada para a ati- vidade química de nitrogênio na célula.

[00164] Estufas automatizadas podem ser usadas para análise de plantas. As métricas de planta em resposta à exposição microbiana in- cluem, mas sem limitação, biomassa, análise de cloroplasto, câmera CCD, medições de tomografia volumétrica.

[00165] Uma maneira de enriquecer uma população de micróbios é de acordo com o genótipo. Por exemplo, um ensaio de reação em ca- deia da polimerase (PCR) com um iniciador alvejado ou iniciador espe- cífico. Os iniciadores projetados para o gene nifH podem ser usados para identificar diazotróficos, visto que os diazotróficos expressam o gene nifH no processo de fixação de nitrogênio. Uma população micro- biana também pode ser enriquecida através de abordagens indepen- dentes de cultura de célula única e abordagens de isolamento guiadas por quimiotaxia. Alternativamente, o isolamento alvejado de micróbios pode ser desempenhado cultivando os micróbios em meios de seleção. Abordagens premeditadas para enriquecer populações microbianas para traços desejados podem ser guiadas por dados de bioinformática e são descritas neste documento. ENRIQUECIMENTO PARA MICRÓBIOS COM CAPACIDADE DE FI-

XAÇÃO DE NITROGÊNIO COM USO DE BIOINFORMÁTICA

[00166] Ferramentas bioinformáticas podem ser usadas para identi- ficar e isolar rizobactérias promotoras de crescimento de plantas (PGPRs), que são selecionadas com base em sua capacidade de de- sempenhar a fixação de nitrogênio. Micróbios com alta capacidade de fixação de nitrogênio podem promover traços favoráveis em plantas. Os modos de análise bioinformática para a identificação de PGPRs in- cluem, mas sem limitação, genômica, metagenômica, isolamento alve- jado, sequenciamento de genes, sequenciamento de transcriptoma e modelagem.

[00167] A análise genômica pode ser usada para identificar PGPRs e confirmar a presença de mutações com métodos de Sequenciamento de Próxima Geração, conforme descrito neste documento e controle de versão de micróbios.

[00168] A metagenômica pode ser usada para identificar e isolar o PGPR com uso de um algoritmo de previsão para colonização. Os me- tadados também podem ser usados para identificar a presença de uma cepa geneticamente modificada em amostras ambientais e de estufa.

[00169] O sequenciamento transcriptômico pode ser usado para pre- ver genótipos que levam a fenótipos PGPR. Além disso, dados transcri- ptômicos são usados para identificar promotores para alterar a expres- são gênica. Os dados transcriptômicos podem ser analisados em con- junto com a Sequência de Genoma Completo (WGS) para gerar mode- los de metabolismo e redes reguladoras de genes.

DOMESTICAÇÃO DE MICRÓBIOS

[00170] Os micróbios isolados da natureza podem passar por um processo de domesticação em que os micróbios são convertidos em uma forma que é geneticamente rastreável e identificável. Uma maneira de domesticar um micróbio é modificá-lo geneticamente com resistência a antibióticos. O processo de modificar geneticamente a resistência a antibióticos pode começar determinando a sensibilidade aos antibióticos na cepa microbiana do tipo selvagem. Se as bactérias forem sensíveis ao antibiótico, então, o antibiótico pode ser um bom candidato à modifi- cação genética de resistência a antibióticos. Posteriormente, um gene resistente a antibióticos ou um vetor de suicídio contrasselecionável pode ser incorporado ao genoma de um micróbio com uso de métodos de recombinação. Um vetor de suicídio contrasselecionável pode con- sistir em uma deleção do gene de interesse, um marcador selecionável e o marcador contrasselecionável sacB. A contrasseleção pode ser usada para intercambiar sequências de DNA microbiano nativo com ge- nes resistentes a antibióticos. Um método de desempenho médio pode ser usado para avaliar múltiplos micróbios simultaneamente, permitindo a domesticação paralela. Métodos alternativos de domesticação in- cluem o uso de nucleases de autodirecionamento para impedir que as sequências de vetores de suicídio se repitam ou obtenham sequências de vetores intervenientes.

[00171] Os vetores de DNA podem ser introduzidos nas bactérias através de diversos métodos, incluindo eletroporação e transformações químicas. Uma biblioteca padrão de vetores pode ser usada para trans- formações. Um exemplo de um método de edição de genes é o CRISPR precedido pelo teste Cas9 para garantir a atividade de Cas9 nos micró- bios.

MODIFICAÇÃO GENÉTICA NÃO TRANSGÊNICA DE MICRÓBIOS

[00172] Uma população microbiana com traços favoráveis pode ser obtida por meio de evolução direta. A evolução direta é uma abordagem em que o processo de seleção natural é simulado para desenvolver pro- teínas ou ácidos nucleicos em direção a uma meta definida pelo usuário. Um exemplo de evolução direta é quando mutações aleatórias são in- troduzidas em uma população microbiana, os micróbios com os traços mais favoráveis são selecionados e o crescimento dos micróbios sele- cionados é continuado. Os traços mais favoráveis nas rizobactérias pro- motoras de crescimento (PGPRs) podem estar na fixação de nitrogênio. O método de evolução direta pode ser iterativo e adaptável com base no processo de seleção após cada iteração.

[00173] Podem ser geradas rizobactérias promotoras de cresci-

mento de plantas (PGPRs) com alta capacidade de fixação de nitrogê- nio. A evolução de PGPRs pode ser efetuada através da introdução de variação genética. A variação genética pode ser introduzida por meio de mutagênese por reação em cadeia da polimerase, mutagênese oligonu- cleotídeo-dirigida, mutagênese por saturação, mutagênese por embara- lhamento de fragmentos, recombinação homóloga, sistemas CRISPR/Cas9, mutagênese química e combinações dos mesmos. Es- tas abordagens podem introduzir mutações aleatórias na população mi- crobiana. Por exemplo, os mutantes podem ser gerados com uso de DNA ou RNA sintético por meio de mutagênese oligonucleotídeo-diri- gida. Os mutantes podem ser gerados com uso de ferramentas contidas em plasmídeos, que são posteriormente curados. Os genes de interesse podem ser identificados com uso de bibliotecas de outras espécies com traços aprimorados, incluindo, porém sem limitação, propriedades de PGPR aprimoradas, colonização aprimorada de cereais, sensibilidade aumentada ao oxigênio, fixação aumentada de nitrogênio e excreção aumentada de amônia. Os genes intragenéricos podem ser projetados com base nessas bibliotecas com uso de software, tal como o software de projeto Geneious ou Platypus. Mutações podem ser projetadas com o auxílio de aprendizado de máquina. Mutações podem ser projetadas com o auxílio de um modelo metabólico. O projeto automatizado da mu- tação pode ser feito com uso de um Platypus la e guiará RNAs para mutagênese Cas-dirigida.

[00174] Os genes intragenéricos podem ser transferidos para o mi- cróbio hospedeiro. Além disso, os sistemas repórter também podem ser transferidos para o micróbio. Os sistemas repórter caracterizam os pro- motores, determinam o sucesso da transformação, triam os mutantes e agem como ferramentas de triagem negativas.

[00175] Os micróbios portadores da mutação podem ser cultivados por meio de passagem em série. Uma colônia microbiana contém uma única variante do micróbio. As colônias microbianas são triadas com o auxílio de um coletor automático de colônias e manipulador de líquidos. Mutantes com duplicação de genes e número de cópias aumentado ex- pressam um genótipo mais alto do traço desejado.

SELEÇÃO DE MICRÓBIOS PROMOTORES DE CRESCIMENTO DE PLANTAS COM BASE NA FIXAÇÃO DE NITROGÊNIO

[00176] As colônias microbianas podem ser triadas com uso de vá- rios ensaios para avaliar a fixação de nitrogênio. Uma maneira de medir a fixação de nitrogênio é através de um único ensaio fermentativo, que mede a excreção de nitrogênio. Um método alternativo é o ensaio de redução de acetileno (ARA) com amostragem em linha ao longo do tempo. O ARA pode ser realizado em placas de alto desempenho de matrizes de microtubos. O ARA pode ser desempenhado com plantas vivas e tecidos vegetais. A formulação do meio e a concentração de oxigênio do meio podem variar nos ensaios de ARA. Outro método de triagem de variantes microbianas é com uso de biossensores. O uso da microespectroscopia Raman E NanoSIMS pode ser usado para investi- gar a atividade dos micróbios. Em alguns casos, as bactérias também podem ser cultivadas e expandidas com uso de métodos de fermenta- ção em biorreatores. Os biorreatores são projetados para melhorar a robustez do crescimento de bactérias e diminuir a sensibilidade das bac- térias ao oxigênio. Os microfermentadores baseados em placas de mé- dio a alto TP são usados para avaliar a sensibilidade ao oxigênio, as necessidades nutricionais, a fixação e a excreção de nitrogênio. As bac- térias também podem ser cocultivadas com micróbios competitivos ou benéficos para elucidar as vias crípticas. A citometria de fluxo pode ser usada para triar bactérias que produzem altos níveis de nitrogênio com uso de indicadores químicos, colorimétricos ou fluorescentes. As bacté- rias podem ser cultivadas na presença ou ausência de uma fonte de nitrogênio. Por exemplo, as bactérias podem ser cultivadas com gluta- mina, amônia, ureia ou nitratos.

REPRODUÇÃO DE MICRÓBIOS

[00177] A reprodução de micróbios é um método para identificar e aprimorar, sistematicamente, a função de espécies no microbioma de cultura. O método compreende três etapas: 1) seleção de espécies can- didatas através do mapeamento de interações planta-micróbio e previ- são de redes reguladoras enlaçadas a um fenótipo específico, 2) apri- moramento pragmático e previsível de fenótipos microbianos através de cruzamento intraespécies de redes reguladoras e aglomerados de ge- nes, e 3) triagem e seleção de novos genótipos microbianos que produ- zem os fenótipos desejados de culturas. Para avaliar sistematicamente o aprimoramento de cepas, é criado um modelo que enlaça a dinâmica de colonização da comunidade microbiana à atividade genética por es- pécies-chave. O modelo é usado para prever a reprodução de alvos ge- néticos e aprimorar a frequência de seleção de aprimoramentos em tra- ços codificados por microbioma de relevância agronômica.

[00178] A produção de bactérias para aprimorar os traços de plantas (por exemplo, fixação de nitrogênio) pode ser alcançada através de pas- sagem em série. A produção desta bactéria pode ser feita selecionando plantas, que possuem um traço particular aprimorado que é influenciado pela flora microbiana, além de identificar bactérias e/ou composições que são capazes de transmitir um ou mais traços aprimorados a uma ou mais plantas. Um método de produção de uma bactéria para aprimorar um traço de planta inclui as etapas de: (a) isolar bactérias de tecido ou solo de uma primeira planta; (b) introduzir uma variação genética em uma ou mais bactérias para produzir uma ou mais bactérias variantes; (c) expor uma pluralidade de plantas às bactérias variantes; (d) isolar bactérias de tecido ou solo de uma dentre a pluralidade de plantas, em que a planta a partir da qual a bactéria é isolada tem um traço aprimo- rado em relação a outras plantas na pluralidade de plantas; e (e) repetir as etapas (b) a (d) com bactérias isoladas da planta com um traço apri- morado (etapa (d)). As etapas (b) a (d) podem ser repetidas inúmeras vezes (por exemplo, uma vez, duas vezes, três vezes, quatro vezes, cinco vezes, dez vezes ou mais) até que o traço aprimorado em uma planta atinja o nível desejado. Além disso, a pluralidade de plantas pode ser mais de duas plantas, tal como 10 a 20 plantas, ou 20 ou mais, 50 ou mais, 100 ou mais, 300 ou mais, 500 ou mais, ou 1.000 ou mais plantas.

[00179] Além de obter uma planta com um traço aprimorado, é obtida uma população bacteriana que compreende bactérias que compreen- dem uma ou mais variações genéticas introduzidas em um ou mais ge- nes (por exemplo, genes que regulam a fixação de nitrogênio). Repe- tindo as etapas descritas acima, é possível obter uma população de bactérias que inclui os membros mais apropriados da população que se correlacionam com um traço de planta de interesse. As bactérias nessa população podem ser identificadas e suas propriedades benéficas de- terminadas, tais como por análise genética e/ou fenotípica. A análise genética pode ocorrer de bactérias isoladas na etapa (a). Informações fenotípicas e/ou genotípicas podem ser obtidas com uso de técnicas que incluem: triagem de alto desempenho de componentes químicos de ori- gem vegetal, técnicas de sequenciamento incluindo sequenciamento de alto desempenho de material genético, técnicas de exibição diferencial (incluindo DDRT-PCR e DD-PCR), técnicas de microarranjo de ácido nucleico, sequenciamento de RNA (Sequenciamento Shotgun de Trans- critoma Completo) e qRT-PCR (PCR quantitativa em tempo real). As informações obtidas podem ser usadas para obter informações de perfis da comunidade sobre a identidade e a atividade das bactérias presen- tes, tais como análise filogenética ou triagem baseada em microarranjos de ácidos nucleicos que codificam componentes de óperons de rRNA ou outros loci taxonomicamente informativos. Exemplos de loci taxono- micamente informativos incluem o gene 16S rRNA, o gene 23S rRNA, o gene 5S rRNA, o gene 5.8S rRNA, o gene 12S rRNA, o gene 18S rRNA, o gene 28S rRNA, o gene gyrB, o gene rpoB, o gene fusA, o gene recA, o gene coxl, o gene nifD. Exemplos de processos de perfil taxonômico para determinar táxons presentes em uma população são descritos no documento US20140155283. A identificação bacteriana pode compre- ender caracterizar a atividade de um ou mais genes ou uma ou mais vias de sinalização, tais como genes associados à via de fixação de ni- trogênio. Interações sinergéticas (em que dois componentes, em virtude de sua combinação, aumentam o efeito desejado em mais do que uma quantidade aditiva) entre diferentes espécies bacterianas também po- dem estar presentes nas populações bacterianas.

[00180] A variação genética pode ser um gene selecionado a partir do grupo que consiste em: nifA, nifL, ntrB, ntrC, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB e nifQ. A variação genética pode ser uma va- riação em um gene que codifica uma proteína com funcionalidade sele- cionada do grupo que consiste em: glutamina sintetase, glutaminase, glutamina sintetase adenililtransferase, ativador transcricional, ativador antitranscricional, piruvato flavodoxina oxidorredutase, flavodoxina ou NAD+-dinitrogênio-redutase aDP-D-ribosiltransferase. A variação gené- tica pode ser uma mutação que resulta em um ou mais dentre: expres- são ou atividade aumentada de NifA ou glutaminase; expressão ou ati- vidade diminuída de NifL, NtrB, glutamina sintetase, GlnB, GlnK, DraT, AmtB; atividade diminuída de remoção de adenilila de GlnE; ou ativi- dade diminuída de remoção de uridilila de GlnD. A introdução de uma variação genética pode compreender a inserção e/ou deleção de um ou mais nucleotídeos em um sítio alvo, tais como 1, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50,

100, 250, 500 ou mais nucleotídeos.

A variação genética introduzida em uma ou mais bactérias dos métodos divulgados neste documento pode ser uma mutação de knockout (por exemplo, deleção de um promotor, inserção ou deleção para produzir um códon de parada prematuro, de- leção de um gene inteiro) ou pode ser eliminação ou abolição da ativi- dade de um domínio proteico (por exemplo, mutação pontual que afeta um sítio ativo ou deleção de uma porção de um gene que codifica a porção relevante do produto proteico) ou pode alterar ou abolir uma se- quência reguladora de um gene alvo.

Uma ou mais sequências regula- doras também podem ser inseridas, incluindo sequências reguladoras heterólogas e sequências reguladoras encontradas dentro de um ge- noma de uma espécie ou gênero bacteriano correspondente às bacté- rias nas quais a variação genética é introduzida.

Além disso, as sequên- cias reguladoras podem ser selecionadas com base no nível de expres- são de um gene em uma cultura bacteriana ou dentro de um tecido ve- getal.

A variação genética pode ser uma variação genética predetermi- nada que é introduzida, especificamente, em um sítio-alvo.

A variação genética pode ser uma mutação aleatória dentro do sítio-alvo.

A varia- ção genética pode ser uma inserção ou deleção de um ou mais nucleo- tídeos.

Em alguns casos, uma pluralidade de variações genéticas dife- rentes (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 10 ou mais) é introduzida em uma ou mais bactérias isoladas antes de expor as bactérias às plantas para ava- liar o aprimoramento de traços.

A pluralidade de variações genéticas pode ser qualquer uma dos tipos acima, tipos iguais ou diferentes, e em qualquer combinação.

Em alguns casos, uma pluralidade de variações genéticas diferentes é introduzida em série, introduzindo uma primeira variação genética após uma primeira etapa de isolamento, uma se- gunda variação genética após uma segunda etapa de isolamento e as- sim por diante, de modo a acumular uma pluralidade de variações ge-

néticas nas bactérias que transmitem traços progressivamente aprimo- rados nas plantas associadas.

[00181] Em geral, o termo "variação genética" refere-se a qualquer alteração introduzida em uma sequência polinucleotídica em relação a um polinucleotídeo de referência, tal como um genoma de referência ou uma porção do mesmo, ou um gene de referência ou porção do mesmo. Uma variação genética pode ser denominada uma "mutação" e uma se- quência ou organismo que compreende uma variação genética pode ser denominada "variante genética" ou "mutante". As variações genéticas podem ter vários efeitos, tais como o aumento ou diminuição de alguma atividade biológica, incluindo expressão gênica, metabolismo e sinaliza- ção celular. Variações genéticas podem ser introduzidas, especifica- mente, em um sítio-alvo ou introduzidas aleatoriamente. Uma variedade de ferramentas e métodos moleculares está disponível para a introdu- ção de variação genética. Por exemplo, a variação genética pode ser introduzida por meio de mutagênese por reação em cadeia da polime- rase, mutagênese oligonucleotídeo-dirigida, mutagênese por saturação, mutagênese por embaralhamento de fragmentos, recombinação homó- loga, recombinação, recombinação mediada por lambda red, sistemas CRISPR/Cas9, mutagênese química e combinações dos mesmos. Os métodos químicos de introdução de variação genética incluem a expo- sição do DNA a um mutagênico químico, por exemplo, metanossulfo- nato de etila (EMS), metanossulfonato de metila (MMS), N-nitrosoureia (EN U), N-metil-N-nitro-N′-nitrosoguanidina, N-óxido de 4-nitroquinolina, sulfato de dietil, benzopireno, ciclofosfamida, bleomicina, trietilmela- mina, monômero de acrilamida, mostarda de nitrogênio, vincristina, die- poxialcanos (por exemplo, diepoxibutano), ICR-170, formaldeído, clori- drato de procarbazina, óxido de etileno, dimetilnititol, 7,12 dimetil- benz(a)antraceno, clorambucil, hexametilfosforamida, bissulfano e simi- lares. Os agentes indutores de mutação por radiação incluem radiação ultravioleta, irradiação γ, raios X e bombardeio rápido de nêutrons. A variação genética também pode ser introduzida em um ácido nucleico com uso de, por exemplo, trimetilpsoraleno com luz ultravioleta. A inser- ção aleatória ou alvejada de um elemento de DNA móvel, por exemplo, um elemento transponível, é outro método adequado para gerar varia- ção genética. Variações genéticas podem ser introduzidas em um ácido nucleico durante a amplificação em um sistema in vitro livre de células, por exemplo, com uso de uma técnica de reação em cadeia de polime- rase (PCR), tal como a PCR propensa a erros. Variações genéticas po- dem ser introduzidas em um ácido nucleico in vitro com uso de técnicas de embaralhamento de DNA (por exemplo, embaralhamento de éxon, troca de domínio e similares). Variações genéticas também podem ser introduzidas em um ácido nucleico como resultado de uma deficiência em uma enzima de reparo de DNA em uma célula, por exemplo, espera- se que a presença em uma célula de um gene mutante que codifica uma enzima de reparo de DNA mutante gere uma alta frequência de muta- ções (isto é, cerca de 1 mutação/100 genes-1 mutação/10.000 genes) no genoma da célula. Exemplos de genes que codificam enzimas de reparo de DNA incluem, mas sem limitação, Mut H, Mut S, Mut L e Mut U e os homólogos dos mesmos em outras espécies (por exemplo, MSH 1 6, PMS 1 2, MLH 1, GTBP, ERCC -1 e similares). Descrições de exem- plos de vários métodos para a introdução de variações genéticas são fornecidas em, por exemplo, Stemple (2004) Nature 5: 1 a 7; Chiang et al. (1993) PCR Methods Appl 2 (3): 210 a 217; Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10.747 a 10.751; e Patentes US6.033.861 e US6.773.900.

[00182] As variações genéticas introduzidas em micróbios podem ser classificadas como transgênicas, cisgênicas, intragenômicas, intragêni- cas, intergenéricas, sintéticas, evoluídas, reorganizadas ou SNPs.

[00183] A variação genética pode ser introduzida em várias vias me- tabólicas dentro de micróbios para provocar aprimoramentos nos traços descritos acima. As vias representativas incluem vias de absorção de enxofre, biossíntese de glicogênio, via de regulação de glutamina, via de absorção de molibdênio, via de fixação de nitrogênio, assimilação de amônia, excreção ou secreção de amônia, absorção de nNitrogênio, bi- ossíntese de glutamina, annamox, solubilização de fosfato, transporte de ácido orgânico, produção de ácido orgânico, produção de aglutininas, genes de sequestro de radicais reativos de oxigênio, biossíntese de ácido acético indol, biossíntese de trealose, enzimas ou vias de degra- dação de parede celular de planta, genes de fixação de raízes, secreção de exopolissacarídeos, via da glutamato sintase, vias de absorção de ferro, via siderófora, via quitinase, ACC desaminase, biossíntese de glu- tationa, genes de sinalização de fósforo, via de arrefecimento brusco de quórum, vias de citocromo, via de hemoglobina, via semelhante a he- moglobina bacteriana, rsmZ pequeno de RNA, biossíntese de rizobito- xina, proteína de adesão lapA, via de detecção de quórum de AHL, bi- ossíntese de fenazina, biossíntese de lipopéptido cíclico e produção de antibiótico.

[00184] Os sistemas CRISPR/Cas9 (repetições palindrômicas curtas regularmente espaçadas aglomeradas)/associados a CRISPR (Cas) po- dem ser usados para introduzir as mutações desejadas. Os sistemas CRISPR/Cas9 fornecem, às bactérias e arqueias, imunidade adaptativa contra vírus e plasmídeos com uso de RNAs CRISPR (crRNAs) para guiar o silenciamento de ácidos nucleicos invasores. A proteína Cas9 (ou equivalente funcional e/ou variante da mesma, isto é, proteína do tipo Cas9) contém naturalmente atividade de endonuclease de DNA que depende da associação da proteína com duas moléculas de RNA sinté- ticas ou de ocorrência natural denominadas crRNA e tracrRNA (também denominadas RNAs guia). Em alguns casos, as duas moléculas são en- laçadas de modo covalente para formar uma única molécula (também denominada um RNA guia único ("sgRNA"). Assim, a proteína Cas9 ou do tipo Cas9 associa-se a um RNA que alveja DNA (cujo termo abrange tanto a configuração de RNA guia de duas moléculas quanto a configu- ração de RNA guia de molécula única), que ativa a proteína Cas9 ou do tipo Cas9 e guia o proteína para uma sequência-alvo de ácidos nuclei- cos. Se a proteína Cas9 ou do tipo Cas9 retiver sua função enzimática natural, a mesma clivará o DNA alvo para criar uma quebra de cadeia dupla, que pode levar à alteração do genoma (isto é, edição: deleção, inserção (quando um polinucleotídeo doador estiver presente), substi- tuição, etc.), alterando, assim, a expressão gênica. Algumas variantes de Cas9 (cujas variantes são englobadas pelo termo do tipo Cas9) fo- ram alteradas de modo que tenham uma atividade de clivagem do DNA reduzida (em alguns casos, as mesmas clivam uma única cadeia em vez de ambas as cadeias do DNA alvo, enquanto em outros casos, as mesmas reduziram severamente a nenhuma atividade de clivagem de DNA). Descrições exemplificativas adicionais de sistemas CRISPR para introdução de variação genética podem ser encontradas, por exemplo, no documento US8795965.

[00185] Como uma técnica de amplificação cíclica, a mutagênese da reação em cadeia da polimerase (PCR) utiliza iniciadores mutagênicos para introduzir as mutações desejadas. A PCR é desempenhada por ciclos de desnaturação, hibridização e extensão. Após a amplificação por PCR, a seleção de DNA mutado e a remoção de DNA do plasmídeo progenitor podem ser cumpridas por: 1) substituição do dCTP por dCTP hidroximetilado durante a PCR, seguido de digestão com enzimas de restrição para remover apenas o DNA progenitor não hidroximetilado; 2) mutagênese simultânea de um gene de resistência a antibióticos e do gene estudado alterando o plasmídeo para uma resistência a antibióti- cos diferente, a nova resistência a antibióticos facilitando a seleção da mutação desejada posteriormente; 3) após a introdução de uma muta- ção desejada, a digestão do DNA modelo metilado progenitor pela en- zima de restrição Dpnl, que cliva apenas o DNA metilado, pelo qual as cadeias não metiladas mutagenizadas são recuperadas; ou 4) circulari- zação dos produtos de PCR mutados em uma reação de ligação adici- onal para aumentar a eficiência de transformação do DNA mutado. Uma descrição adicional de métodos exemplificativos pode ser encontrada, por exemplo, nos documentos US7132265, US6713285, US6673610, US6391548, US5789166, US5780270, US5354670, US5071743 e US20100267147.

[00186] A mutagênese oligonucleotídeo-dirigida, também denomi- nada mutagênese sítio-dirigida, utiliza tipicamente um iniciador de DNA sintético. Este iniciador sintético contém a mutação desejada e é com- plementar ao DNA modelo ao redor do sítio de mutação, para que possa hibridar com o DNA no gene de interesse. A mutação pode ser uma única alteração de base (uma mutação pontual), várias alterações de base, deleção ou inserção ou uma combinação dessas. O iniciador de cadeia única é estendido, então, com uso de uma DNA polimerase, que copia o restante do gene. O gene assim copiado contém o sítio mutado e pode, então, ser introduzido em uma célula hospedeira como um vetor e clonado. Por fim, os mutantes podem ser selecionados por sequenci- amento de DNA para verificar se contêm a mutação desejada.

[00187] Variações genéticas podem ser introduzidas com uso de PCR propensa a erros. Nesta técnica, o gene de interesse é amplificado com uso de um DNA polimerase em condições deficientes na fidelidade da replicação de sequência. O resultado é que os produtos de amplifi- cação contêm pelo menos um erro na sequência. Quando um gene é amplificado e o produto resultante da reação contém (ou os produtos resultantes da reação contêm) uma ou mais alterações em sequência quando comparado à molécula modelo, os produtos resultantes são mu- tagenizados em comparação com o modelo. Outro meio de introduzir mutações aleatórias é expor as células a um mutagênico químico, tal como nitrosoguanidina ou metanossulfonato de etila (Nestmann, Mutat Res 1975 junho; 28 (3): 323 a 330), e o vetor que contém o gene é, então, isolado do hospedeiro.

[00188] A mutagênese de saturação é outra forma de mutagênese aleatória, na qual se tenta gerar todas ou quase todas as mutações pos- síveis em um sítio específico ou região estreita de um gene. Em um sentido geral, a mutagênese de saturação é composta pela mutageni- zação de um conjunto completo de cassetes mutagênicos (em que cada cassete tem, por exemplo, 1 a 500 bases de comprimento) na sequência de polinucleotídeos definida a ser mutagenizada (em que a sequência a ser mutagenizada tem, por exemplo, de 15 a 100.000 bases de compri- mento). Portanto, um grupo de mutações (por exemplo, que varia de 1 a 100 mutações) é introduzido em cada cassete para ser mutagenizado. Um agrupamento de mutações a ser introduzido em um cassete pode ser diferente ou igual de um segundo agrupamento de mutações a ser introduzido em um segundo cassete durante a aplicação de um ciclo de mutagênese de saturação. Tais agrupamentos são exemplificados por deleções, adições, agrupamentos de códons particulares e agrupamen- tos de cassetes de nucleotídeos específicos.

[00189] A mutagênese de embaralhamento de fragmentos, também denominadaembaralhamento de DNA, é uma maneira de propagar ra- pidamente mutações benéficas. Em um exemplo de um processo de embaralhamento, a DNAse é usada para fragmentar um conjunto de genes progenitores em pedaços de, por exemplo, cerca de 50 a 100 pb de comprimento. Isto é, então, seguido por uma reação em cadeia da polimerase (PCR) sem iniciadores -- fragmentos de DNA com sequência homóloga suficiente sobreposta se hibridizarão um ao outro e são, en- tão, estendidos pela DNA polimerase. Diversos ciclos dessa extensão de PCR podem ocorrer após algumas das moléculas de DNA atingirem o tamanho dos genes progenitores. Esses genes podem ser, então, am- plificados com outra PCR, desta vez com a adição de inicadores proje- tados para complementar as extremidades das cadeias. Os iniciadores podem ter sequências adicionais adicionadas às suas extremidades 5’, tais como sequências para sítios de reconhecimento de enzimas de res- trição necessárias para a ligação a um vetor de clonagem. Exemplos adicionais de técnicas de embaralhamento são fornecidos no docu- mento US20050266541.

[00190] A mutagênese de recombinação homóloga envolve a recom- binação entre um fragmento de DNA exógeno e a sequência polinucle- otídica alvejada. Após ocorrer uma ruptura de cadeia dupla, as seções de DNA em torno das extremidades 5’ da ruptura são cortadas em um processo denominado ressecção. Na etapa de invasão de cadeia que se segue, uma extremidade 3’ pendente da molécula de DNA rompida "invade" uma molécula de DNA semelhante ou idêntica que não está rompida. O método pode ser usado para deletar um gene, remover éxons, adicionar um gene e introduzir mutações pontuais. A mutagê- nese de recombinação homóloga pode ser permanente ou condicional. Normalmente, também é fornecido um modelo de recombinação. Um modelo de recombinação pode ser um componente de outro vetor, con- tido em um vetor separado ou fornecido como um polinucleotídeo sepa- rado. Em algumas modalidades, um modelo de recombinação é proje- tado para servir como um modelo na recombinação homóloga, tal como dentro ou perto de uma sequência-alvo cortada ou clivada por uma nu- clease de sítio específico. Um polinucleotídeo modelo pode ter qualquer comprimento adequado, tal como cerca de 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100,

150, 200, 500, 1.000 ou mais nucleotídeos de comprimento. Em algu- mas modalidades, o polinucleotídeo modelo é complementar a uma por- ção de um polinucleotídeo que compreende a sequência-alvo. Quando idealmente alinhado, um polinucleotídeo modelo pode se sobrepor a um ou mais nucleotídeos de uma sequência-alvo (por exemplo, cerca de ou mais que cerca de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais nucleotídeos). Em algumas modalidades, quando uma se- quência e um polinucleotídeo modelo compreendendo uma sequência- alvo estão idealmente alinhados, o nucleotídeo mais próximo do polinu- cleotídeo modelo está dentro de cerca de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 1.000, 5.000, 10.000 ou mais nucleotídeos da sequência-alvo. Exemplos não limitativos de nucleases de sítio direcio- nado úteis em métodos de recombinação homóloga incluem nucleases de dedos de zinco, nucleases CRISPR, nucleases TALE e meganu- clease. Para uma descrição adicional do uso de tais nucleases, con- sulte, por exemplo, os documentos US8795965 e US20140301990.

[00191] Mutagênicos que criam principalmente mutações pontuais e deleções, inserções, transversões e/ou transições curtas, incluindo mu- tagênicos químicos ou radiação, podem ser usados para criar variações genéticas. Os mutagênicos incluem, mas sem limitação, metanossulfo- nato de etila, sulfonato de metilmetano, N-etil-N-nitrosureia, trietilmela- mina, N-metil-N-nitrosoureia, procarbazina, clorambucil, ciclofosfamida, sulfato de dietila, monômero de acrilamida, melfalano, mostarda nitro- genada, vincristina, dimetilnitrosamina, N-metil-N’-nitro-Nitrosoguani- dina, nitrosoguanidina, 2-aminopurina, 7,12 dimetil-benz(a)antraceno, óxido de etileno, hexametilfosforamida, bissulfano, diepoxialcanos (die- poxoctanano, diepoxibutano e similares), dicloridrato de 2-metóxi-6- cloro-9[3-(etil-2-cloro-etil)aminopropilamino]acridina e formaldeído.

[00192] A introdução de variação genética pode ser um processo in- completo, de modo que algumas bactérias em uma população tratada de bactérias carreguem uma mutação desejada, enquanto outras não. Em alguns casos, é desejável aplicar uma pressão de seleção para en- riquecer as bactérias que carregam uma variação genética desejada. Tradicionalmente, a seleção de variantes genéticas bem-sucedidas en- volvia seleção a favor ou contra alguma funcionalidade transmitida ou abolida pela variação genética, tal como no caso de inserção do gene de resistência a antibióticos ou abolição de uma atividade metabólica capaz de converter um composto não letal em um metabólito letal. Tam- bém é possível aplicar uma pressão de seleção com base em uma se- quência polinucleotídica por si só, de modo que apenas seja necessária a introdução de uma variação genética desejada (por exemplo, sem ne- cessitar também de um marcador selecionável). Nesse caso, a pressão de seleção pode compreender genomas de clivagem sem a variação genética introduzida em um sítio-alvo, de modo que a seleção seja efe- tivamente direcionada contra a sequência de referência na qual a varia- ção genética deve ser introduzida. Tipicamente, a clivagem ocorre den- tro de 100 nucleotídeos do sítio-alvo (por exemplo, dentro de 75, 50, 25, 10 ou menos nucleotídeos do sítio-alvo, incluindo a clivagem no sítio- alvo ou dentro do mesmo). A clivagem pode ser direcionada por uma nuclease de sítio específico selecionada do grupo que consiste em uma nuclease de Dedo de Zinco, uma nuclease CRISPR, uma nuclease TALE (TALEN) ou uma meganuclease. Tal processo é semelhante aos processos para melhorar a recombinação homóloga em um sítio-alvo, exceto que nenhum modelo para recombinação homóloga é fornecido. Como resultado, as bactérias sem a variação genética desejada são mais propensas a sofrer clivagens que, deixadas sem reparo, resultam em morte celular. As bactérias que sobrevivem à seleção podem, então, ser isoladas para uso em exposição a plantas para avaliar a atribuição de um traço aprimorado.

[00193] Uma nuclease CRISPR pode ser usada como nuclease de sítio específico para direcionar a clivagem para um sítio-alvo. Uma se- leção aprimorada de micróbios mutados pode ser obtida com uso de Cas9 para exterminar células não mutadas. As plantas são, então, ino- culadas com os micróbios mutados para confirmar novamente a simbi- ose e criar pressão evolutiva para selecionar simbiontes eficientes. Os micróbios podem ser, então, reisolados de tecidos vegetais. Os siste- mas de nuclease CRISPR usados para seleção contra não variantes podem usar elementos semelhantes àqueles descritos acima com rela- ção à introdução de variação genética, exceto que nenhum modelo para recombinação homóloga é fornecido. A clivagem direcionada ao sítio- alvo acentua, desse modo, a morte de células afetadas.

[00194] Estão disponíveis outras opções para induzir, especifica- mente, a clivagem em um sítio-alvo, tais como nucleases de dedo de zinco, sistemas de nuclease TALE (TALEN) e meganuclease. As nu- cleases de dedo de zinco (ZFNs) são endonucleases artificiais de DNA geradas pela fusão de um domínio de aglutinação de DNA de dedo de zinco a um domínio de clivagem de DNA. As ZFNs podem ser projeta- das para alvejar as sequências de DNA desejadas e isso permite que as nucleases de dedos de zinco clivem sequências-alvo exclusivas. Quando introduzidas em uma célula, as ZFNs podem ser usadas para editar o DNA-alvo na célula (por exemplo, o genoma da célula), indu- zindo rupturas de cadeia dupla. As nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição (TALENs) são endonucleases artificiais de DNA geradas pela fusão de um domínio de aglutinação ao DNA efetor do tipo TAL (ativador da transcrição) a um domínio de clivagem de DNA. As TA- LENS podem ser rapidamente projetadas para ligar praticamente qual- quer sequência de DNA desejada e, quando introduzidas em uma cé- lula, as TALENs podem ser usadas para editar o DNA-alvo na célula (por exemplo, no genoma da célula), induzindo rupturas de cadeia du-

pla. Meganucleases (endonuclease de autodirecionamento) são endo- deoxirribonucleases caracterizadas por um grande sítio de reconheci- mento (sequências de DNA de cadeia dupla de 12 a 40 pares de bases. As meganucleases podem ser usadas para substituir, eliminar ou modi- ficar sequências de maneira altamente alvejada. Modificando sua se- quência de reconhecimento através da modificação genética de proteí- nas, a sequência alvejada pode ser alterada. As meganucleases podem ser usadas para modificar todos os tipos de genoma, seja bacteriano, vegetal ou animal, e são geralmente agrupadas em quatro famílias: a família LAGLIDADG, a família GIY-YIG, a família de caixas de cistos His e a família HNH. Exemplos de endonucleases de autodirecionamento incluem I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I- TevI, I-TevII e I-TevIII.

[00195] Os métodos da presente divulgação podem ser usados para introduzir ou melhorar uma ou mais dentre uma variedade de traços de- sejáveis. Exemplos de traços que podem ser introduzidos ou aprimora- dos incluem: biomassa radicular, comprimento de raiz, altura, compri- mento de rebento, número de folhas, eficiência do uso da água, bio- massa geral, rendimento, tamanho de fruto, tamanho de grão, taxa de fotossíntese, tolerância à seca, tolerância ao calor, tolerância ao sal, re- sistência ao estresse de nematoides, resistência a um patógeno fúngico, resistência a um patógeno bacteriano, resistência a um patógeno viral, nível de um metabólito e expressão de proteoma. Os traços desejáveis, incluindo altura, biomassa geral, biomassa de raiz e/ou rebento, germi- nação de sementes, sobrevivência de mudas, eficiência fotossintética, taxa de transpiração, número ou massa de sementes/frutos, rendimento de grãos ou frutos de plantas, teor de clorofila foliar, taxa fotossintética, comprimento de raiz ou qualquer combinação dos mesmos, podem ser usados para medir o crescimento e comparados com a taxa de cresci- mento de plantas agrícolas de referência (por exemplo, plantas sem os traços aprimorados) cultivadas em condições idênticas.

[00196] Um traço preferencial a ser introduzido ou aprimorado é a fixação de nitrogênio, conforme descrito neste documento. Em alguns casos, uma planta resultante dos métodos descritos neste documento exibe uma diferença no traço que é pelo menos cerca de 5% superior, por exemplo pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos 100%, pelo menos cerca de 200%, pelo menos cerca de 300%, pelo menos cerca de 400% ou superior a uma planta agrícola de referência cultivada nas mesmas condições no solo. Em exemplos adicionais, uma planta resultante dos métodos descritos neste documento exibe uma diferença no traço que é pelo menos cerca de 5% superior, por exemplo pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos 100%, pelo menos cerca de 200%, pelo menos cerca de 300%, pelo menos cerca de 400% ou superior a uma planta agrícola de referência cultivada em condições semelhantes no solo.

[00197] O traço a ser melhorado pode ser avaliado sob condições que incluem a aplicação de um ou mais estressores bióticos ou abióti- cos. Exemplos de estressores incluem estresses abióticos (tais como estresse por calor, estresse por sal, estresse por seca, estresse por frio e estresse por escassez de nutrientes) e estresses bióticos (tais como estresse por nematoide, estresse por herbivoria de insetos, estresse por patógeno fúngico, estresse por patógeno bacteriano e patógeno viral).

[00198] O traço aprimorado por métodos e composições da presente divulgação pode ser a fixação de nitrogênio, inclusive em uma planta que não era capaz, anteriormente, de fixação de nitrogênio. Em alguns casos, as bactérias isoladas de acordo com um método descrito neste documento produzem 1% ou mais (por exemplo, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20% ou mais) de nitrogênio de uma planta, o que pode representar um aumento na capacidade de fixação de nitro- gênio de pelo menos 2 vezes (por exemplo, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 1.000 vezes ou mais) em comparação com as bactérias isoladas da primeira planta antes de introduzir qualquer variação genética. Em alguns casos, as bactérias produzem 5% ou mais do nitrogênio de uma planta. O nível desejado de fixação de nitrogênio pode ser alcançado após repetir uma ou mais vezes as etapas de introdução de variação genética, exposição a uma pluralidade de plantas e isolamento de bac- térias de plantas com um traço aprimorado (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 25 ou mais vezes). Em alguns casos, níveis elevados de fixação de nitrogênio são alcançados na presença de fertilizantes suplementa- dos com glutamina, amônia ou outra fonte química de nitrogênio. São conhecidos métodos para avaliar o grau de fixação de nitrogênio, exem- plos dos quais são descritos neste documento.

[00199] A reprodução de micróbios é um método para identificar e aprimorar, sistematicamente, a função de espécies no microbioma de cultura. O método compreende três etapas: 1) seleção de espécies can- didatas através do mapeamento de interações planta-micróbio e previ- são de redes reguladoras enlaçadas a um fenótipo específico, 2) apri- moramento pragmático e previsível de fenótipos microbianos através de cruzamento intraespécies de redes reguladoras e aglomerados de ge-

nes, e 3) triagem e seleção de novos genótipos microbianos que produ- zem os fenótipos desejados de culturas. Para avaliar sistematicamente o aprimoramento de cepas, é criado um modelo que enlaça a dinâmica de colonização da comunidade microbiana à atividade genética por es- pécies-chave. O modelo é usado para prever a reprodução de alvos ge- néticos e aprimorar a frequência de seleção de aprimoramentos em tra- ços codificados por microbioma de relevância agronômica.

FIXAÇÃO DE NITROGÊNIO

[00200] São descritos neste documento métodos para aumentar a fi- xação de nitrogênio em uma planta, que compreendem expor a planta a bactérias que compreendem uma ou mais variações genéticas intro- duzidas em um ou mais genes que regulam a fixação de nitrogênio, em que as bactérias produzem 1% ou mais de nitrogênio na planta (por exemplo, 2%, 5%, 10% ou mais), o que pode representar uma capaci- dade de fixação de nitrogênio de pelo menos 2 vezes em comparação com a planta na ausência das bactérias. As bactérias podem produzir nitrogênio na presença de fertilizante suplementado com glutamina, ureia, nitratos ou amônia. Variações genéticas podem ser qualquer va- riação genética descrita neste documento, incluindo exemplos forneci- dos acima, em qualquer número e qualquer combinação. A variação ge- nética pode ser introduzida em um gene selecionado do grupo que con- siste em nifA, nifL, ntrB, ntrC, glutamine synthetase, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glutaminase, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB e nifQ. A variação genética pode ser uma mutação que resulta em um ou mais dentre: expressão ou atividade aumentada de nifA ou glutaminase; expressão ou atividade diminuída de nifL, ntrB, glutamina sintetase, glnB, glnK, draT, amtB; ati- vidade diminuída de remoção de adenilila de GlnE; ou atividade diminu- ída de remoção de uridilila de GlnD. A variação genética introduzida em uma ou mais bactérias dos métodos divulgados neste documento pode ser uma mutação knockout ou pode abolir uma sequência reguladora de um gene-alvo ou pode compreender a inserção de uma sequência reguladora heteróloga, por exemplo, inserção de um sequência regula- dora encontrada no genoma da mesma espécie ou gênero bacteriano. A sequência reguladora pode ser escolhida com base no nível de ex- pressão de um gene em uma cultura bacteriana ou no tecido de planta. A variação genética pode ser produzida por mutagênese química. As plantas cultivadas na etapa (c) podem ser expostas a estressores bióti- cos ou abióticos.

[00201] A quantidade de fixação de nitrogênio que ocorre nas plantas descritas neste documento pode ser medida de diversas maneiras, por exemplo, por um ensaio de redução de acetileno (AR). Um ensaio de redução de acetileno pode ser desempenhado in vitro ou in vivo. A evi- dência de que uma bactéria específica está fornecendo nitrogênio fixo a uma planta pode incluir: 1) o total de N de plantas aumenta significati- vamente após a inoculação, de preferência com um aumento concomi- tante da concentração de N na planta; 2) os sintomas de deficiência de nitrogênio são aliviados sob condições com limitação de N após a ino- culação (o que deve incluir um aumento na matéria seca); 3) a fixação 15 de N2 é documentada através do uso de uma abordagem de N (que podem ser experimentos de diluição de isótopos, ensaios de redução de 15N2 ou ensaios de abundância natural de 15N); 4) o N fixo é incorpo- rado em uma proteína ou metabolito vegetal; e 5) todos esses efeitos não são observados em plantas não inoculadas ou em plantas inocula- das com um mutante da cepa de inóculo.

[00202] A cascata reguladora de fixação de nitrogênio do tipo selva- gem pode ser representada como um circuito lógico digital em que as entradas O2 e NH4+ passam através de uma porta NOR, cuja saída entra em uma porta AND além de ATP. Em algumas modalidades, os méto- dos divulgados neste documento interrompem a influência do NH 4+ neste circuito, em múltiplos pontos da cascata reguladora, de modo que os micróbios possam produzir nitrogênio até mesmo em campos fertili- zados. No entanto, os métodos descritos neste documento também pre- veem alterar o impacto de ATP ou O2 no circuito, ou substituir o circuito por outras cascatas reguladoras na célula, ou alterar circuitos genéticos além da fixação de nitrogênio. Aglomerados de genes podem ser gene- ticamente remodificados para gerar produtos funcionais sob o controle de um sistema regulador heterólogo. Eliminando elementos reguladores nativos fora e dentro das sequências de codificação de aglomerados de genes e substituindo-os por sistemas reguladores alternativos, os pro- dutos funcionais de óperons genéticos complexos e outros aglomerados de genes podem ser controlados e/ou movidos para células heterólogas, incluindo células de espécies diferentes das espécies a partir das quais os genes nativos foram derivados. Uma vez geneticamente remodifica- dos, os aglomerados de genes sintéticos podem ser controlados por cir- cuitos genéticos ou outros sistemas reguladores induzíveis, contro- lando, assim, a expressão de produtos conforme desejado. Os cassetes de expressão podem ser projetados para atuar como portas lógicas, ge- radores de pulsos, osciladores, comutadores ou dispositivos de memó- ria. O cassete de expressão de controle pode ser enlaçado a um pro- motor, de modo que o cassete de expressão funcione como um sensor ambiental, tal como um sensor de oxigênio, de temperatura, de toque, de estresse osmótico, de estresse de membrana ou redox.

[00203] Como exemplo, os genes nifL, nifA, nifT e nifX podem ser eliminados do aglomerado de genes nif. Os genes sintéticos podem ser projetados por randomização de códon do DNA que codifica cada se- quência de aminoácidos. A seleção de códons é desempenhada, espe- cificando que o uso de códons seja o mais divergente possível do uso de códons no gene nativo. As sequências propostas são examinadas quanto a quaisquer recursos indesejados, tais como sítios de reconhe- cimento de enzimas de restrição, sítios de reconhecimento de transpo- sons, sequências repetitivas, promotores sigma 54 e sigma 70, sítios de aglutinação de ribossomo críptico e terminadores independentes rho. Os sítios de aglutinação de ribossomo sintético são escolhidos para cor- responder à força de cada sítio de aglutinação de ribossomo nativo cor- respondente, tal como pela construção de um plasmídeo repórter fluo- rescente no qual os 150 pb em torno do códon de início de um gene (de -60 a +90) são fundidos a um gene fluorescente. Esta quimera pode ser expressa sob controle do promotor Ptac e a fluorescência medida por meio de citometria de fluxo. Para gerar sítios de aglutinação de ribos- somo sintético, é gerada uma biblioteca de plasmídeos repórter com uso de 150 pb (-60 a +90) de um cassete de expressão sintético. Resumi- damente, um cassete de expressão sintético pode consistir em um es- paçador de DNA aleatório, uma sequência degenerada que codifica uma biblioteca RBS e a sequência de codificação para cada gene sin- tético. Múltiplos clones são triados para identificar o sítio de aglutinação de ribossomo sintético que melhor corresponde ao sítio de aglutinação de ribossomo nativo. Óperons sintéticos que consistem nos mesmos genes que os óperons nativos são assim construídos e testados para complementação funcional. Uma descrição exemplificativa adicional de óperons sintéticos é fornecida no documento US20140329326.

ESPÉCIES BACTERIANAS

[00204] Micróbios úteis nos métodos e composições divulgados neste documento podem ser obtidos de qualquer fonte. Em alguns ca- sos, os micróbios podem ser bactérias, arqueias, protozoários ou fun- gos. Os micróbios desta divulgação podem ser micróbios fixadores de nitrogênio, por exemplo, bactérias fixadoras de nitrogênio, arqueias fi- xadoras de nitrogênio, fungos fixadores de nitrogênio, leveduras fixado- ras de nitrogênio ou protozoários fixadores de nitrogênio. Micróbios úteis nos métodos e composições divulgados neste documento podem ser micróbios formadores de esporos, por exemplo bactérias formadoras de esporos. Em alguns casos, as bactérias úteis nos métodos e composi- ções divulgados neste documento podem ser bactérias Gram-positivas ou bactérias Gram-negativas. Em alguns casos, a bactéria pode ser uma bactéria formadora de endósporos do filo Firmicute. Em alguns ca- sos, a bactéria pode ser uma diazatrófica. Em alguns casos, a bactéria pode não ser uma diazotrófica.

[00205] Os métodos e composições desta divulgação podem ser uti- lizados com uma arqueia, tal como, por exemplo, Methanothermobacter thermoautotrophicus.

[00206] Em alguns casos, bactérias que podem ser úteis incluem, mas sem limitação, cepas de Agrobacterium radiobacter, Bacillus acido- caldarius, Bacillus acidoterrestris, Bacillus agri, Bacillus aizawai, Baci- llus albolactis, Bacillus alcalophilus, Bacillus alvei, Bacillus aminogluco- sidicus, Bacillus aminovorans, Bacillus amylolyticus (também conhecida como Paenibacillus amylolyticus) Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus aneurinolyticus, Bacillus atrophaeus, Bacillus azotoformans, Bacillus ba- dius, Bacillus cereus (sinônimos: Bacillus endorhythmos, Bacillus me- dusa), Bacillus chitinosporus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Ba- cillus endoparasiticus Bacillus fastidiosus, Bacillus firmus, Bacillus kurs- taki, Bacillus lacticola, Bacillus lactimorbus, Bacillus lactis, Bacillus late- rosporus (também conhecida como Brevibacillus laterosporus), Bacillus lautus, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Baci- llus maroccanus, Bacillus megaterium, Bacillus metiens, Bacillus mycoi- des, Bacillus natto, Bacillus nematocida, Bacillus nigrificans, Bacillus ni- grum, Bacillus pantothenticus, Bacillus popillae, Bacillus psychrosac- charolyticus, Bacillus pumilus, Bacillus siamensis, Bacillus smithii, Baci- llus sphaericus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus unifla- gellatus, Bradyrhizobium japonicum, Brevibacillus brevis Brevibacillus laterosporus (anteriormente Bacillus laterosporus), Chromobacterium subtsugae, Delftia acidovorans, Lactobacillus acidophilus, Lysobacter antibioticus, Lysobacter enzymogenes, Paenibacillus alvei, Paenibaci- llus polymyxa, Paenibacillus popilliae (anteriormente Bacillus popilliae), Pantoea agglomerans, Pasteuria penetrans (anteriormente Bacillus pe- netrans), Pasteuria usgae, Pectobacterium carotovorum (anteriormente Erwinia carotovora), Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas aureofa- ciens, Pseudomonas cepacia (anteriormente conhecida como Burkhol- deria cepacia), Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas proradix, Pseudomonas putida, Pseudomonas syringae, Serratia entomophila, Serratia marcescens, Streptomyces colombiensis, Streptomyces galbus, Streptomyces goshikiensis, Streptomyces griseo- viridis, Streptomyces lavendulae, Streptomyces prasinus, Streptomyces saraceticus, Streptomyces venezuelae, Xanthomonas campestris, Xe- norhabdus luminescens, Xenorhabdus nematophila, Rhodococcus glo- berulus AQ719 (No. de acesso NRRL B-21663), Bacillus sp. AQ175 (No. de acesso ATCC 55608), Bacillus sp. AQ 177 (No. de acesso ATCC 55609), Bacillus sp. AQ178 (No. de acesso ATCC 53522) e Strep- tomyces sp. No. de acesso NRRL No. B-30145. Em alguns casos, a bactéria pode ser Azotobacter chroococcum, Methanosarcina barkeri, Klesiella pneumoniae, Azotobacter vinelandii, Rhodobacter spharoides, Rhodobacter capsulatus, Rhodobcter palustris, Rhodosporillum rubrum, Rhizobium leguminosarum ou Rhizobium etli.

[00207] Em alguns casos, a bactéria pode ser uma espécie de Clos- tridium, por exemplo Clostridium pasteurianum, Clostridium beijerinckii, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium acetobutylicum.

[00208] Em alguns casos, as bactérias usadas com os métodos e composições da presente divulgação podem ser cianobactérias. Exem- plos de gêneros de cianobactérias incluem Anabaena (por exemplo, Anagaena sp. PCC7120), Nostoc (por exemplo, Nostoc punctiforme), ou

Synechocystis (por exemplo, Synechocystis sp. PCC6803).

[00209] Em alguns casos, as bactérias usadas com os métodos e composições da presente divulgação podem pertencer ao filo Chlorobi, por exemplo Chlorobium tepidum.

[00210] Em alguns casos, os micróbios utilizados com os métodos e as composições da presente divulgação podem compreender um gene homólogo a um gene NifH conhecido. Sequências de genes NifH conhe- cidos podem ser encontradas, por exemplo, no banco de dados de NifH do laboratório Zehr, (https://wwwzehr.pmc.ucsc.edu/nifH_Data- base_Public/, 4 de abril de 2014), ou no banco de dados de NifH do laboratório Buckley (http://www.css.cornell.edu/faculty/buckley/nifh.htm, and Gaby, John Christian e Daniel H. Buckley. "A comprehensive alig- ned nifH gene database: a multipurpose tool for studies of nitrogen-fixing bacteria." Database 2014 (2014): bau001.). Em alguns casos, micróbios usados com os métodos e composições da presente divulgação podem compreender uma sequência que codifica um polipeptídeo com pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 98%, 99% ou mais de 99% de identidade de sequência com uma sequência do banco de dados de NifH do laboratório Zehr, (https://wwwzehr.pmc.ucsc.edu/nifH_Database_Public/, 4 de abril de 2014). Em alguns casos, micróbios usados com os métodos e composi- ções da presente divulgação podem compreender uma sequência que codifica um polipeptídeo com pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 98%, 99% ou mais de 99% de identidade de sequência com uma sequência do banco de dados NifH do laboratório Buckley (Gaby, John Christian e Daniel H. Buckley. "A comprehensive aligned nifH gene database: a multipurpose tool for studies of nitrogen-fixing bacteria." Database 2014 (2014): bau001.).

[00211] Os micróbios úteis nos métodos e composições divulgados neste documento podem ser obtidos extraindo micróbios de superfícies ou tecidos de plantas nativas; moendo sementes para isolar micróbios; plantando sementes em diversas amostras de solo e recuperando mi- cróbios de tecidos; ou inoculando plantas com micróbios exógenos e determinando quais micróbios aparecem nos tecidos vegetais. Exem- plos não limitativos de tecidos vegetais incluem uma semente, muda, folha, ramo, planta, bolbo ou tubérculo. Em alguns casos, as bactérias são isoladas de uma semente. Os parâmetros para o processamento de amostras podem variar para isolar diferentes tipos de micróbios associ- ativos, tais como rizosféricos, epífitas ou endófitos. As bactérias também podem ser provenientes de um repositório, tal como coleções de cepas ambientais, em vez de isolar inicialmente as mesmas a partir de uma primeira planta. Os micróbios podem ser genotipados e fenotipados, por meio de sequenciamento dos genomas de micróbios isolados; perfil da composição das comunidades in planta; caracterização da funcionali- dade transcriptômica de comunidades ou micróbios isolados; ou triagem de características microbianas com uso de meios seletivos ou fenotípi- cos (por exemplo, fenótipos de fixação de nitrogênio ou solubilização de fosfato). Cepas ou populações candidatas selecionadas podem ser ob- tidas por meio de dados de sequência; dados de fenótipo; dados de planta (por exemplo, dados de genoma, fenótipo e/ou rendimento); da- dos de solo (por exemplo, pH, teor de N/P/K e/ou comunidades bióticas de solo granular); ou qualquer combinação destes.

[00212] As bactérias e métodos de produção de bactérias descritos neste documento podem se aplicar a bactérias capazes de se autopro- pagar eficientemente na superfície de folha, superfície de raiz ou no in- terior de tecidos de planta sem induzir uma reação de defesa de planta prejudicial ou bactérias que são resistentes às respostas de defesa de planta. As bactérias descritas neste documento podem ser isoladas cul- tivando um extrato de tecido vegetal ou superfície de folha lavada em um meio sem nenhum nitrogênio adicionado. No entanto, as bactérias podem não ser cultiváveis, isto é, não conhecidas por serem cultiváveis ou difíceis de serem cultivadas com uso de métodos padrão conhecidos na técnica. As bactérias descritas neste documento podem ser um en- dófito ou uma epífita ou uma bactéria que habita a rizosfera de planta (bactérias rizosféricas). As bactérias obtidas após repetir uma ou mais vezes as etapas de introdução de variação genética, exposição a uma pluralidade de plantas e isolamento de bactérias de plantas com um traço aprimorado (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 25, ou mais vezes) podem ser endofíticas, epifíticas ou rizosféricas. Endófitos são organis- mos que entram no interior das plantas sem causar sintomas de doen- ças ou provocar a formação de estruturas simbióticas e são de interesse agronômico, visto que podem acentuar o crescimento de plantas e apri- morar a nutrição de plantas (por exemplo, através de fixação de nitro- gênio). A bactéria pode ser um endófito transmitido por sementes. Os endófitos transmitidos por sementes incluem bactérias associadas ou derivadas da semente de uma grama ou planta, tal como um endófito bacteriano transmitido por semente encontrado em sementes maduras, secas e não danificadas (por exemplo, sem rachaduras, infecção fún- gica visível ou germinadas prematuramente). O endófito bacteriano transmitido por semente pode ser associado ou derivado da superfície da semente; de modo alternativo ou adicional, pode ser associado ou derivado do compartimento interno de sementes (por exemplo, de uma semente de superfície esterilizada). Em alguns casos, um endófito bac- teriano transmitido por semente é capaz de se replicar dentro do tecido de planta, por exemplo, no interior da semente. Além disso, em alguns casos, o endófito bacteriano transmitido por semente é capaz de sobre- viver à dessecação.

[00213] As bactérias isoladas de acordo com métodos da divulgação, ou usadas em métodos ou composições da divulgação, podem compre-

ender uma pluralidade de diferentes táxons bacterianos em combina- ção. A título de exemplo, as bactérias podem incluir Proteobacteria (tal como Pseudomonas, Enterobacter, Stenotrophomonas, Burkholderia, Rhizobium, Herbaspirillum, Pantoea, Serratia, Rahnella, Azospirillum, Azorhizobium, Azotobacter, Duganella, Delftia, Bradyrhizobiun, Sinorhi- zobium and Halomonas), Firmicutes (tal como Bacillus, Paenibacillus, Lactobacillus, Mycoplasma e Acetabacterium) e Actinobacteria (tal como Streptomyces, Rhodacoccus, Microbacterium e Curtobacterium). As bactérias usadas nos métodos e composições desta divulgação po- dem incluir consórcios bacterianos fixadores de nitrogênio de duas ou mais espécies. Em alguns casos, uma ou mais espécies bacterianas dos consórcios bacterianos podem ser capazes de fixar nitrogênio. Em alguns casos, uma ou mais espécies dos consórcios bacterianos podem facilitar ou acentuar a capacidade de outras bactérias fixarem nitrogênio. As bactérias que fixam nitrogênio e as bactérias que acentuam a capa- cidade de outras bactérias fixarem nitrogênio podem ser iguais ou dife- rentes. Em alguns exemplos, uma cepa bacteriana pode ser capaz de fixar nitrogênio quando em combinação com uma cepa bacteriana dife- rente, ou em certos consórcios bacterianos, mas pode ser incapaz de fixar nitrogênio em uma monocultura. Exemplos de gêneros bacterianos que podem ser encontrados em consórcio bacteriano fixador de nitrogê- nio incluem, mas sem limitação, Herbaspirillum, Azospirillum, Entero- bacter e Bacillus.

[00214] As bactérias que podem ser produzidas pelos métodos divul- gados neste documento incluem Azotobacter sp., Bradyrhizobium sp., Klebsiella sp. e Sinorhizobium sp. Em alguns casos, as bactérias podem ser selecionadas do grupo que consiste em: Azotobacter vinelandii, Bradyrhizobium japonicum, Klebsiella pneumoniae e Sinorhizobium meliloti. Em alguns casos, as bactérias podem ser do gênero Entero- bacter ou Rahnella. Em alguns casos, as bactérias podem ser do gênero

Frankia ou Clostridium. Exemplos de bactérias do gênero Clostridium incluem, mas sem limitação, Clostridium acetobutilicum, Clostridium pasteurianum, Clostridium beijerinckii, Clostridium perfringens e Clostridium tetani. Em alguns casos, as bactérias podem ser do gênero Paenibacillus, por exemplo, Paenibacillus azotofixans, Paenibacillus bo- realis, Paenibacillus durus, Paenibacillus macerans, Paenibacillus polymyxa, Paenibacillus alvei, Paenibacillus amylolyticus, Paenibacillus campinasensis, Paenibacillus chibensis, Paenibacillus glucanolyticus, Paenibacillus illinoisensis, Paenibacillus larvae subsp. Larvae, Paeniba- cillus larvae subsp. Pulvifaciens, Paenibacillus lautus, Paenibacillus ma- cerans, Paenibacillus macquariensis, Paenibacillus macquariensis, Pa- enibacillus pabuli, Paenibacillus peoriae ou Paenibacillus polymyxa.

[00215] Em alguns exemplos, as bactérias isoladas de acordo com os métodos da divulgação podem ser membros de um ou mais dos se- guintes táxons: Achromobacter, Acidithiobacillus, Acidovorax, Acidovo- raz, Acinetobacter, Actinoplanes, Adlercreutzia, Aerococcus, Aeromo- nas, Afipia, Agromyces, Ancylobacter, Arthrobacter, Atopostipes, Azos- pirillum, Bacillus, Bdellovibrio, Beijerinckia, Bosea, Bradyrhizobium, Bre- vibacillus, Brevundimonas, Burkholderia, Candidatus Haloredivivus, Caulobacter, Cellulomonas, Cellvibrio, Chryseobacterium, Citrobacter, Clostridium, Coraliomargarita, Corynebacterium, Cupriavidus, Curtobac- terium, Curvibacter, Deinococcus, Delftia, Desemzia, Devosia, Dokdo- nella, Dyella, Enhydrobacter, Enterobacter, Enterococcus, Erwinia, Es- cherichia, Escherichia/Shigella, Exiguobacterium, Ferroglobus, Filimo- nas, Finegoldia, Flavisolibacter, Flavobacterium, Frigoribacterium, Glu- conacetobacter, Hafnia, Halobaculum, Halomonas, Halosimplex, Her- baspirillum, Hymenobacter, Klebsiella, Kocuria, Kosakonia, Lactobaci- llus, Leclercia, Lentzea, Luteibacter, Luteimonas, Massilia, Mesorhizo- bium, Methylobacterium, Microbacterium, Micrococcus, Microvirga, Mycobacterium, Neisseria, Nocardia, Oceanibaculum, Ochrobactrum,

Okibacterium, Oligotropha, Oryzihumus, Oxalophagus, Paenibacillus, Panteoa, Pantoea, Pelomonas, Perlucidibaca, Plantibacter, Polynu- cleobacter, Propionibacterium, Propioniciclava, Pseudoclavibacter, Pseudomonas, Pseudonocardia, Pseudoxanthomonas, Psychrobacter, Ralstonia, Rheinheimera, Rhizobium, Rhodococcus, Rhodopseudomo- nas, Roseateles, Ruminococcus, Sebaldella, Sediminibacillus, Sedimi- nibacterium, Serratia, Shigella, Shinella, Sinorhizobium, Sinosporan- gium, Sphingobacterium, Sphingomonas, Sphingopyxis, Sphingosini- cella, Staphylococcus, 25 Stenotrophomonas, Strenotrophomonas, Streptococcus, Streptomyces, Stygiolobus, Sulfurisphaera, Tatumella, Tepidimonas, Thermomonas, Thiobacillus, Variovorax, WPS-2 genera incertae sedis, Xanthomonas e Zimmermannella.

[00216] As bactérias podem ser obtidas de qualquer ambiente terres- tre geral, incluindo solos, plantas, fungos, animais do mesmo (incluindo invertebrados) e outra biota, incluindo sedimentos, água e biota de lagos e rios; do ambiente marinho, biota e sedimentos do mesmo (por exem- plo, água do mar, lamas marinhas, plantas marinhas, invertebrados ma- rinhos (por exemplo, esponjas), vertebrados marinhos (por exemplo, peixes)); a geosfera terrestre e marinha (regolito e rocha, por exemplo, rochas subterrâneas esmagadas, areia e argila); a criosfera e a água derretida da mesma; a atmosfera (por exemplo, poeira aérea filtrada, nuvens e gotículas de chuva); ambientes urbanos, industriais e outros criados pelo homem (por exemplo, matéria orgânica e mineral acumu- lada no concreto, calhas nas rodovias, superfícies de telhados e super- fícies de estradas).

[00217] As plantas a partir das quais as bactérias são obtidas podem ser uma planta com um ou mais traços desejáveis, por exemplo, uma planta que cresce naturalmente em um ambiente particular ou sob cer- tas condições de interesse. A título de exemplo, uma determinada planta pode crescer naturalmente em solo arenoso ou areia de alta salinidade,

ou sob temperaturas extremas, ou com pouca água, ou pode ser resis- tente a certas pragas ou doenças presentes no ambiente, e pode ser desejável para que uma cultura comercial seja cultivada nessas condi- ções, principalmente se forem, por exemplo, as únicas condições dispo- níveis em uma localização geográfica específica. A título de exemplo adicional, as bactérias podem ser coletadas de culturas comerciais cul- tivadas em tais ambientes ou, mais especificamente, de plantas de cul- tura individuais que melhor exibem um traço de interesse entre uma cul- tura cultivada em qualquer ambiente específico: por exemplo, as plantas de crescimento mais rápido entre uma cultura cultivada em solos com limitação de solução salina, ou as plantas menos danificadas em cultu- ras expostas a danos graves por insetos ou epidemia de doenças, ou plantas com quantidades desejadas de certos metabólitos e outros com- postos, incluindo teor de fibras, teor de óleo e similares ou plantas que exibam cores, sabor ou aroma desejáveis. As bactérias podem ser co- letadas de uma planta de interesse ou de qualquer material que ocorra no ambiente de interesse, incluindo fungos e outra biota animal e vege- tal, solo, água, sedimentos e outros elementos do ambiente, conforme mencionado anteriormente.

[00218] As bactérias podem ser isoladas do tecido de planta. Este isolamento pode ocorrer a partir de qualquer tecido apropriado na planta, incluindo, por exemplo, raízes, caule e folhas e tecidos reprodu- tivos de planta. A título de exemplo, os métodos convencionais de iso- lamento de plantas incluem tipicamente a excisão estéril do material ve- getal de interesse (por exemplo, comprimentos de raízes ou caules, fo- lhas), esterilização da superfície com uma solução apropriada (por exemplo, hipoclorito de sódio a 2%), em seguida, o material vegetal é colocado em meio nutritivo para crescimento microbiano. Alternativa- mente, o material vegetal de superfície esterilizada pode ser triturado em um líquido estéril (geralmente água) e a suspensão líquida, incluindo pequenos pedaços do material vegetal triturado espalhados sobre a su- perfície de um meio de ágar sólido adequado, ou meios, que pode ou não ser seletivo (por exemplo, conter apenas ácido fítico como uma fonte de fósforo). Esta abordagem é especialmente útil para bactérias que formam colônias isoladas e podem ser coletadas individualmente para separar placas de meio nutritivo e purificadas para uma única es- pécie por métodos bem conhecidos. Como alternativa, as amostras de raízes ou folhas de plantas podem não ter superfície esterilizada, mas apenas lavada suavemente, incluindo, desse modo, microrganismos epifíticos que habitam a superfície no processo de isolamento, ou os micróbios epifíticos podem ser isolados separadamente, gravando e re- tirando pedaços de raízes, caule ou folhas de planta da superfície de um meio de ágar e, depois, isolando colônias individuais como acima. Essa abordagem é especialmente útil para bactérias, por exemplo. Al- ternativamente, as raízes podem ser processadas sem remoção por meio de lavagem de pequenas quantidades de solo presas às raízes, incluindo micróbios que colonizam a rizosfera de planta. Caso contrário, o solo aderente às raízes pode ser removido, diluído e espalhado em ágar de meios seletivos e não seletivos adequados para isolar colônias individuais de bactérias rizosféricas.

[00219] As culturas biologicamente puras de Rahnella aquatilis e En- terobacter sacchari foram depositadas em 14 de julho de 2015 com a American Type Culture Collection (ATCC; uma Autoridade Internacional para Depósitos), Manassas, VA, EUA, e foram atribuídos os números de depósito de patente ATTC PTA-122293 e PTA- 122294, respectiva- mente. Esses depósitos foram feitos de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depó- sito de Microrganismos para Efeitos de Procedimento em Matéria de Patentes e os Regulamentos (Tratado de Budapeste).

COMPOSIÇÕES

[00220] As composições que compreendem bactérias ou popula- ções bacterianas produzidas de acordo com métodos descritos neste documento e/ou com características conforme descrito neste docu- mento podem estar na forma de um líquido, uma espuma ou um produto seco. Em alguns exemplos, uma composição que compreende popula- ções bacterianas pode estar na forma de um pó seco, uma pasta fluida de pó e água ou um tratamento de sementes fluidificável.

[00221] A composição pode ser fabricada em biorreatores, tais como reatores de tanque agitado continuamente, reatores em batelada e na fazenda. Em alguns exemplos, as composições podem ser armazena- das em um recipiente, tal como um jarro ou em recipiente do tipo caixa. Em alguns exemplos, as composições podem ser armazenadas dentro de um objeto selecionado do grupo que consiste em uma garrafa, frasco, ampola, pacote, vaso, bolsa, caixa, caixote de lixo, envelope, cartucho, recipiente, silo, contêiner de transporte, boleia e/ou estojo.

[00222] As composições também podem ser usadas para aprimorar os traços de plantas. Em alguns exemplos, uma ou mais composições podem ser revestidas em uma semente. Em alguns exemplos, uma ou mais composições podem ser revestidas em uma muda. Em alguns exemplos, uma ou mais composições podem ser revestidas sobre a su- perfície de uma semente. Em alguns exemplos, uma ou mais composi- ções podem ser revestidas como uma camada acima de uma superfície de uma semente. Em alguns exemplos, uma composição que é reves- tida sobre uma semente pode estar na forma líquida, na forma de pro- duto seco, na forma de espuma, na forma de uma pasta fluida de pó e água ou em um tratamento de sementes fluidificável. Em alguns exem- plos, uma ou mais composições podem ser aplicadas a uma semente e/ou muda por pulverização, imersão, revestimento, encapsulamento e/ou espanação da semente e/ou muda com uma ou mais composições.

Em alguns exemplos, múltiplas bactérias ou populações bacterianas po- dem ser revestidas em uma semente e/ou em uma muda da planta. Em alguns exemplos, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos qua- tro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez ou mais de dez bactérias de uma combinação bacteriana podem ser selecionadas dentre um dos seguin- tes gêneros: Acidovorax, Agrobacterium, Bacillus, Burkholderia, Chry- seobacterium, Curtobacterium, Enterobacter, Escherichia, Methylobac- terium, Paenibacillus, Pantoea, Pseudomonas, Ralstonia, Saccharibaci- llus, Sphingomonas e Stenotrophomonas.

[00223] Em alguns exemplos, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez ou mais de dez bactérias e populações bacterianas de uma combinação endofítica são selecionadas dentre uma das seguintes famílias: Bacillaceae, Burkholderiaceae, Comamonadaceae, Enterobacteriaceae, Flavobacte- riaceae, Methylobacteriaceae, Microbacteriaceae, Paenibacillileae, Pseudomonnaceae, Rhizobiaceae, Sphingomonadaceae, Xanthomona- daceae, Cladosporiaceae, Gnomoniaceae, Incertae sedis, Lasiosphae- riaceae, Netriaceae e Pleosporaceae.

[00224] Em alguns exemplos, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos noite, pelo menos dez ou mais de dez bactérias e populações bacterianas de uma combinação endofítica são selecionadas dentre uma das seguintes famílias: Bacillaceae, Burkholderiaceae, Comamonadaceae, Enterobacteriaceae, Flavobacte- riaceae, Methylobacteriaceae, Microbacteriaceae, Paenibacillileae, Pseudomonnaceae, Rhizobiaceae, Sphingomonadaceae, Xanthomona- daceae, Cladosporiaceae, Gnomoniaceae, Incertae sedis, Lasiosphae- riaceae, Netriaceae, Pleosporaceae.

[00225] Exemplos de composições podem incluir revestimentos de sementes para culturas agrícolas comercialmente importantes, por exemplo, sorgo, canola, tomate, morango, cevada, arroz, maís e trigo. Exemplos de composições também podem incluir revestimentos de se- mentes para milho, soja, canola, sorgo, batata, arroz, vegetais, cereais e oleaginosas. As sementes, conforme fornecidas neste documento, po- dem ser organismos geneticamente modificados (GMO), não GMO, or- gânicos ou convencionais. Em alguns exemplos, as composições po- dem ser pulverizadas nas partes aéreas da planta ou aplicadas às raí- zes inserindo-as em sulcos nos quais as sementes das plantas são plan- tadas, regando o solo ou mergulhando as raízes em uma suspensão da composição. Em alguns exemplos, as composições podem ser desidra- tadas de uma maneira adequada que mantenha a viabilidade celular e a capacidade de inocular e colonizar artificialmente plantas hospedeiras. As espécies bacterianas podem estar presentes em composições a uma concentração entre 108 e 1010 CFU/ml. Em alguns exemplos, as compo- sições podem ser suplementadas com íons de metais-traço, tais como íons de molibdênio, íons de ferro, íons de manganês ou combinações desses íons. A concentração de íons em exemplos de composições, conforme descrito neste documento, pode ser entre cerca de 0,1 mM e cerca de 50 mM. Alguns exemplos de composições também podem ser formulados com um veículo, tal como beta-glucana, carboxilmetil celu- lose (CMC), substância polimérica extracelular bacteriana (EPS), açú- car, leite animal ou outros veículos adequados. Em alguns exemplos, turfa ou materiais de plantio podem ser usados como veículo, ou biopo- límeros em que uma composição é aprisionada no biopolímero podem ser usados como um veículo.

[00226] As composições que compreendem as populações bacteria- nas descritas neste documento podem ser revestidas na superfície de uma semente. Como tal, também são contempladas composições que compreendem uma semente revestida com uma ou mais bactérias des- critas neste documento. O revestimento de sementes pode ser formado misturando a população bacteriana com um veículo granular poroso, quimicamente inerte. Alternativamente, as composições podem ser in- seridas diretamente nos sulcos nos quais a semente é plantada ou pul- verizadas nas folhas da planta ou aplicadas mergulhando as raízes em uma suspensão da composição. Uma quantidade eficaz da composição pode ser usada para preencher a região do subsolo adjacente às raízes da planta com crescimento bacteriano viável ou preencher as folhas da planta com crescimento bacteriano viável. Em geral, uma quantidade eficaz é uma quantidade suficiente para resultar em plantas com traços aprimorados (por exemplo, um nível desejado de fixação de nitrogênio).

[00227] As composições bacterianas descritas neste documento po- dem ser formuladas com uso de um veículo agricolamente aceitável. A formulação útil para essas modalidades pode incluir pelo menos um membro selecionado do grupo que consiste em um acentuador de pe- gajosidade, um estabilizador microbiano, um fungicida, um agente anti- bacteriano, um conservante, um estabilizante, um tensoativo, um agente anticomplexo, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador de crescimento de plantas, um fertilizante, um rodenticida, um desse- cante, um bactericida, um nutriente ou qualquer combinação dos mes- mos. Em alguns exemplos, as composições podem ser estáveis em pra- teleira. Por exemplo, qualquer uma das composições descritas neste documento pode incluir um veículo agricolamente aceitável (por exem- plo, um ou mais dentre um fertilizante, tal como fertilizantes de ocorrên- cia não natural, um agente de adesão, tal como um agente de adesão de ocorrência não natural e um pesticida, tal como um pesticida de ocor- rência não natural). Um agente de adesão de ocorrência não natural pode ser, por exemplo, um polímero, copolímero ou cera sintética. Por exemplo, qualquer uma das mudas, plantas ou sementes revestidas descritas neste documento pode conter um veículo agricolamente acei- tável no revestimento de sementes. Em qualquer uma das composições ou métodos descritos neste documento, um veículo agricolamente acei- tável pode ser ou pode incluir um composto de ocorrência não natural (por exemplo, um fertilizante de ocorrência não natural, um agente de adesão de ocorrência não natural, tal como um polímero, copolímero ou cera sintética ou um pesticida de ocorrência não natural). Exemplos não limitativos de veículos agricolamente aceitáveis são descritos abaixo. Exemplos adicionais de veículos agricolamente aceitáveis são conheci- dos na técnica.

[00228] Em alguns casos, as bactérias são misturadas com um veí- culo agricolamente aceitável. O veículo pode ser um veículo sólido ou veículo líquido, e de várias formas, incluindo microesferas, pós, emul- sões e similares. O veículo pode ser qualquer um ou mais dentre um número de veículos que conferem uma variedade de propriedades, tais como maior estabilidade, molhabilidade ou dispersibilidade. Agentes molhantes, tais como tensoativos naturais ou sintéticos, que podem ser tensoativos não iônicos ou iônicos, ou uma combinação dos mesmos, podem ser incluídos na composição. As emulsões de água em óleo tam- bém podem ser usadas para formular uma composição que inclui as bactérias isoladas (consultar, por exemplo, a Patente No. US

7.485.451). Formulações adequadas que podem ser preparadas in- cluem pós molháveis, grânulos, géis, tiras ou péletes de ágar, espes- santes e semelhantes, partículas microencapsuladas e semelhantes, lí- quidos, tais como fluidos aquosos, suspensões aquosas, emulsões de água em óleo, etc. A formulação pode incluir grãos ou produtos de le- guminosas, por exemplo, grãos moídos ou feijões, caldo ou farinha de- rivados de grãos ou feijões, amido, açúcar ou óleo.

[00229] Em algumas modalidades, o veículo agrícola pode ser solo ou um meio de crescimento de plantas. Outros veículos agrícolas que podem ser usados incluem água, fertilizantes, óleos vegetais, umectan- tes ou combinações dos mesmos. Alternativamente, o veículo agrícola pode ser um sólido, tal como terra de diatomáceas, franca, sílica, algi- nato, argila, bentonita, vermiculita, invólucros de sementes, outros pro- dutos vegetais e animais, ou combinações, incluindo grânulos, péletes ou suspensões. As misturas de qualquer um dos ingredientes mencio- nados acima também são contempladas como veículos, tais como, po- rém sem limitação, pesta (farinha e argila de caulim), ágar ou péletes à base de farinha em franca, areia ou argila etc. As formulações podem incluir fontes de alimento para as bactérias, tais como cevada, arroz ou outros materiais biológicos, tais como sementes, partes de plantas, bagaço de cana de açúcar, cascas ou pendúculos do processamento de grãos, material vegetal moído ou madeira proveniente de refugo de sítio de obras, serragem ou pequenas fibras da reciclagem de papel, tecido ou madeira.

[00230] Por exemplo, um fertilizante pode ser usado para ajudar a promover o crescimento ou fornecer nutrientes a uma semente, muda ou planta. Exemplos não limitativos de fertilizantes incluem nitrogênio, fósforo, potássio, cálcio, enxofre, magnésio, boro, cloreto, manganês, ferro, zinco, cobre, molibdênio e selênio (ou um sal do mesmo). Exem- plos adicionais de fertilizantes incluem um ou mais aminoácidos, sais, carboidratos, vitaminas, glicose, NaCl, extrato de levedura, NH4H2PO4, (NH4)2SO4, glicerol, valina, L-leucina, ácido lático, ácido propiônico, ácido succínico, ácido málico, ácido cítrico, tartarato de KH, xilose, li- xose e lecitina. Em uma modalidade, a formulação pode incluir um acen- tuador de pegajosidade ou aderente (denominado um agente adesivo) para ajudar a aglutinar outros agentes ativos a uma substância (por exemplo, uma superfície de uma semente). Tais agentes são úteis para combinar bactérias com veículos que podem conter outros compostos

(por exemplo, agentes de controle que não são biológicos), para produ- zir uma composição de revestimento. Tais composições ajudam a criar revestimentos ao redor da planta ou semente para manter contato entre o micróbio e outros agentes com a planta ou parte da planta. Em uma modalidade, os adesivos são selecionados do grupo que consiste em: alginato, gomas, amidos, lecitinas, formononetina, álcool polivinílico, for- mononetinato alcalino, hesperetina, acetato de polivinila, cefalinas, goma arábica, goma xantana, óleo mineral, polietilenoglicol (PEG), Po- livinilpirrolidona (PVP), Arabino-galactano, Metilcelulose, PEG 400, Qui- tosana, Poliacrilamida, Poliacrilato, Poliacrilonitrila, Glicerol, Trietileno glicol, Acetato de vinila, Goma de gel, Poliestireno, Polivinil, Carboxime- tilcelulose, Goma Ghatti e copolímeros em bloco de polioxietileno-poli- oxibutileno.

[00231] Em algumas modalidades, os adesivos podem ser, por exemplo, uma cera, tal como cera de carnaúba, cera de abelha, cera chinesa, cera de goma-laca, cera espermacete, cera de candelilla, cera de mamona, cera de ouricúrio e cera de farelo de arroz, um polissacarí- deo (por exemplo, amido, dextrinas, maltodextrinas, alginato e quito- sana), uma gordura, óleo, uma proteína (por exemplo, gelatina e zeí- nas), gomas aráveis e goma-laca. Os agentes adesivos podem ser com- postos de ocorrência não natural, por exemplo, polímeros, copolímeros e ceras. Por exemplo, exemplos não limitativos de polímeros que podem ser usados como agente adesivo incluem: acetatos de polivinila, copolí- meros de acetato de polivinila, copolímeros de acetato de etileno vinila (EVA), álcoois polivinílicos, copolímeros de álcool polivinílico, celuloses (por exemplo, etilcelulose, metilcelulose, hidroximetilcelulose, hidroxi- propilceluloses e carboximetilceluloses), polivinilpirrolidonas, cloreto de vinila, copolímeros de cloreto de vinilideno, lignossulfonatos de cálcio, copolímeros acrílicos, polivinilacrilatos, óxido de polietileno, polímeros e copolímeros de acilamida, acrilato de polihidroxietila, monômeros de metilacrilamida e policloropreno.

[00232] Em alguns exemplos, um ou mais agentes de adesão, agen- tes antifúngicos, agentes de regulação do crescimento e pesticidas (por exemplo, inseticida) são compostos de ocorrência não natural (por exemplo, em qualquer combinação). Exemplos adicionais de veículos agricolamente aceitáveis incluem dispersantes (por exemplo, polivinil- pirrolidona/acetato de vinila PVPIVA S-630), tensoativos, aglutinantes e agentes de enchimento.

[00233] A formulação também pode conter um tensoativo. Exemplos não limitativos de tensoativos incluem misturas de tensoativo e nitrogê- nio, tais como Prefer 28 (Cenex), Surf-N (EUA), Inhance (Brandt), P-28 (Wilfarm) e Patrol (Helena); óleos de sementes esterificados incluem Sun-It II (AmCy), MSO (UAP), Scoil (Agsco), Hasten (Wilfarm) e Mes- 100 (Drexel); e os tensoativos de organo-silicone incluem Silwet L77 (UAP), Silikin (Terra), Dyne-Amic (Helena), Kinetic (Helena), Sylgard 309 (Wilbur-Ellis) e Century (Precision). Em uma modalidade, o tensoa- tivo está presente em uma concentração entre 0,01% v/v a 10% v/v. Em outra modalidade, o tensoativo está presente em uma concentração en- tre 0,1% v/v a 1% v/v.

[00234] Em certos casos, a formulação inclui um estabilizador micro- biano. Tal agente pode incluir um dessecante, que pode incluir qualquer composto ou mistura de compostos que possa ser classificado como dessecante, independentemente de o composto ou compostos serem utilizados em tais concentrações que de fato têm um efeito dessecante em um inoculante líquido. Tais dessecantes são idealmente compatíveis com a população bacteriana utilizada e devem promover a capacidade da população microbiana de sobreviver à aplicação nas sementes e de sobreviver à dessecação. Exemplos de dessecantes adequados in- cluem um ou mais dentre trealose, sacarose, glicerol e metilenoglicol. Outros dessecantes adequados incluem, mas sem limitação, açúcares não redutores e álcoois de açúcar (por exemplo, manitol ou sorbitol). A quantidade de dessecante introduzida na formulação pode variar de cerca de 5% a cerca de 50% em peso/volume, por exemplo, entre cerca de 10% a cerca de 40%, entre cerca de 15% a cerca de 35% ou entre cerca de 20% e cerca de 30%. Em alguns casos, é vantajoso que a formulação contenha agentes, tais como um fungicida, um agente anti- bacteriano, um herbicida, um nematicida, um inseticida, um regulador de crescimento de planta, um rodenticida, um bactericida ou um nutri- ente. Em alguns exemplos, os agentes podem incluir protetores que for- necem proteção contra patógenos transmitidos pela superfície de se- mentes. Em alguns exemplos, os protetores podem fornecer algum nível de controle de patógenos transmitidos pelo solo. Em alguns exemplos, os protetores podem ser eficazes predominantemente em uma superfí- cie de semente.

[00235] Em alguns exemplos, um fungicida pode incluir um composto ou agente, químico ou biológico, que pode inibir o crescimento de um fungo ou exterminar um fungo. Em alguns exemplos, um fungicida pode incluir compostos que podem ser fungistáticos ou fungicidas. Em alguns exemplos, o fungicida pode ser um protetor ou agentes que são eficazes predominantemente na superfície de semente, fornecendo proteção contra patógenos transmitidos por superfície de semente e fornecendo algum nível de controle de patógenos transportados pelo solo. Exem- plos não limitativos de fungicidas protetores incluem captan, maneb, ti- rame ou fludioxonil.

[00236] Em alguns exemplos, o fungicida pode ser um fungicida sis- têmico, que pode ser absorvido pelas mudas emergentes e inibir ou ex- terminar o fungo dentro dos tecidos da planta hospedeira. Os fungicidas sistêmicos usados no tratamento de sementes incluem, mas sem limita- ção, azoxistrobina, carboxina, mefenoxam, metalaxila, tiabendazol, tri-

floxistrobina e vários fungicidas triazol, incluindo difenoconazol, ipcona- zol, tebuconazol e triticonazol. Mefenoxam e metalaxila são usados prin- cipalmente para alvejar os fungos em fontes de água Pythium e Phytophthora. Alguns fungicidas são preferenciais com relação a outros, dependendo das espécies de plantas, seja por causa de diferenças sutis na sensibilidade das espécies de fungos patogênicos, ou por causa das diferenças na distribuição de fungicida ou sensibilidade das plantas. Em alguns exemplos, o fungicida pode ser um agente de controle biológico, tal como uma bactéria ou fungo. Tais organismos podem ser parasitas dos fungos patogênicos ou secretar toxinas ou outras substâncias que podem exterminar ou impedir de outro modo o crescimento de fungos. Qualquer tipo de fungicida, particularmente aqueles comumente usados em plantas, pode ser usado como agente de controle em uma composi- ção de sementes.

[00237] Em alguns exemplos, a composição de revestimento de se- mente compreende um agente de controle que tem propriedades anti- bacterianas. Em uma modalidade, o agente de controle com proprieda- des antibacterianas é selecionado a partir dos compostos descritos alhures neste documento. Em outra modalidade, o composto é estrep- tomicina, oxitetraciclina, ácido oxolínico ou gentamicina. Outros exem- plos de compostos antibacterianos que podem ser usados como parte de uma composição de revestimento de sementes incluem aqueles à base de diclorofeno e álcool benzílico, hemi formal (Proxel® da ICI ou Acticide® RS da Thor Chemie e Kathon® MK 25 da Rohm & Haas) e derivados de isotiazolinona, tais como alquilisotiazolinonas e benzisoti- azolinonas (Acticide® MBS de Thor Chemie).

[00238] Em alguns exemplos, o regulador de crescimento é selecio- nado do grupo que consiste em: ácido abscísico, amidoclor, ancimidol, 6-benzilaminopurina, brassinolida, butralina, clormequat (cloreto de clor-

mequat), cloreto de colina, ciclanilida, daminozida, dikegulac, dimeti- pina, 2,6-dimetilpuridina, etefon, flumetralina, flurprimidol, fluthiacet, for- clorfenuron, ácido giberélico, inabenfide, ácido indole-3-acético, hidra- zida maleica, mefluidida, mepiquat (cloreto de mepiquat), ácido naftale- nacético, N-6-benziladenina, paclobutrazol, fosforotritioato de prohexa- diona, ácido 2,3,5-triiodobenzoico, trinexapac-etil e uniconazol. Exem- plos adicionais não limitativos de reguladores de crescimento incluem brassinoesteroides, citocininas (por exemplo, cinetina e zeatina), auxi- nas (por exemplo, ácido indolilacético e indolilacetil aspartato), flavonoi- des e isoflavanoides (por exemplo, formononetina e diosmetina), fitoai- xinas (por exemplo, gliceollina) e oligossacarídeos indutores de fitoale- xina (por exemplo, pectina, quitina, quitosana, ácido poligalacurônico e ácido oligogalacturônico) e giberelinas. Tais agentes são idealmente compatíveis com as sementes ou mudas agrícolas nas quais a formula- ção é aplicada (por exemplo, não deve ser prejudicial ao crescimento ou à saúde da planta). Além disso, o agente é idealmente aquele que não causa preocupações de segurança para uso humano, animal ou industrial (por exemplo, nenhum problema de segurança ou o composto é suficientemente lábil para que o produto vegetal derivado da planta contenha quantidades desprezíveis do composto).

[00239] Alguns exemplos de agentes de biocontrole antagonistas a nematoides incluem ARF18; 30 Arthrobotrys spp.; Chaetomium spp.; Cylindrocarpon spp.; Exophilia spp.; Fusarium spp.; Gliocladium spp.; Hirsutella spp.; Lecanicillium spp.; Monacrosporium spp.; Myrothecium spp.; Neocosmospora spp.; Paecilomyces spp.; Pochonia spp.; Stago- nospora spp.; vesicular- arbuscular mycorrhizal fungi, Burkholderia spp.; Pasteuria spp., Brevibacillus spp.; Pseudomonas spp.; e Rhizobacteria. Os agentes de biocontrole antagonistas a nematoides particularmente preferenciais incluem ARF18, Arthrobotrys oligospora, Arthrobotrys dac- tyloides, Chaetomium globosum, Cylindrocarpon heteronema, Exophilia jeanselmei, Exophilia pisciphila, Fusarium aspergilus, Fusarium solani, Gliocliocladium Catenulatum, Gliocladium Catenulatum lecanii, Mona- crosporium drechsleri, Monacrosporium gephyropagum, Myrotehcium verrucaria, Neocosmospora vasinfecta, Paecilomyces lilacinus, Pocho- nia chlamydosporia, Stagonospora heteroderae, Stagonospora phase- oli, fungos micorrizas vesicular-arbuscular, Burkholderia cepacia, Pas- teuria penetrans, Pasteuria thornei, Pasteuria nishizawae, Pasteuria ra- mosa, uso Pastrueia, cepa G4 de Brevibacillus laterosporus, Pseudo- monas fluorescens e Rhizobacteria.

[00240] Alguns exemplos de nutrientes podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em um fertilizante nitrogenado, incluindo, porém sem limitação, ureia, nitrato de amônio, sulfato de amônio, solu- ções de nitrogênio sem pressão, amônia aquosa, amônia anidra, tios- sulfato de amônio, ureia revestida com enxofre, formaldeídos de ureia, IBDU, ureia revestida de polímero, nitrato de cálcio, ureia e ureia de metileno, fertilizantes fosforados, tais como fosfato de diamônio, fosfato monoamônico, polifosfato de amônio, superfosfato concentrado e su- perfosfato triplo e fertilizantes de potássio, tais como cloreto de potássio, sulfato de potássio, sulfato potássio - magnésio, nitrato de potássio. Tais composições podem existir como sais ou íons livres dentro da composi- ção de revestimento de sementes. Alternativamente, os nutrientes/ferti- lizantes podem ser complexos ou quelados para fornecer liberação sus- tentada ao longo do tempo.

[00241] Alguns exemplos de rodenticidas podem incluir selecionados do grupo de substâncias que consistem em 2-isovalerilindan-1,3-diona, 4- (quinoxalin-2-ilamino) benzenossulfonamida, alfa-cloro-hidrina, fos- feto de alumínio, antu, óxido arsenioso, carbonato de bário, bisthiosemi, brodifacoum, bromadiolona, brometalina, cianeto de cálcio, cloralose, clorofacinona, colecalciferol, coumachlor, coumafuril, coumatetralil, cri- midina, difenacoum, difetialona, dipacinona, ergocalciferol, flocoumafen,

fluoroacetamida, flupropadina, cloridrato de flupropadina, cianeto de hi- drogênio, iodometano, lindano, fosfeto de magnésio, brometo de metila, norbormida, fosacetim, fosfina, fósforo, pindona, arsenito de potássio, pirinurão, cillirosídeo, arsenito de sódio, cianeto de sódio, fluoroacetato de sódio, estricnina, sulfato de tálio, varfarina e fosfeto de zinco.

[00242] Na forma líquida, por exemplo, soluções ou suspensões, as populações bacterianas podem ser misturadas ou suspensas em água ou em soluções aquosas. Diluentes ou veículos líquidos adequados in- cluem água, soluções aquosas, destilados de petróleo ou outros veícu- los líquidos.

[00243] As composições sólidas podem ser preparadas dispersando as populações bacterianas dentro e sobre um veículo sólido adequada- mente dividido, como turfa, trigo, farelo, vermiculita, argila, talco, bento- nita, terra de diatomáceas, terra de Fuller, solo pasteurizado e similares. Quando tais formulações são utilizadas como pós molháveis, podem ser utilizados agentes dispersantes biologicamente compatíveis, tais como agentes dispersantes e emulsificantes não iônicos, aniônicos, anfotéri- cos ou catiônicos.

[00244] Os veículos sólidos usados na formulação incluem, por exemplo, veículos minerais, tais como argila de caulim, pirofilita, bento- nita, montmorilonita, terra de diatomáceas, solo branco ácido, vermicu- lita e perlita e sais inorgânicos, tais como sulfato de amônio, fosfato de amônio, nitrato de amônio, ureia, cloreto de amônio e carbonato de cál- cio. Além disso, podem ser utilizados pós finos orgânicos, como farinha de trigo, farelo de trigo e farelo de arroz. Os veículos líquidos incluem óleos vegetais, tais como óleo de soja e óleo de semente de algodão, glicerol, etilenoglicol, polietilenoglicol, propilenoglicol, polipropilenogli- col, etc.

APLICAÇÃO DE POPULAÇÕES BACTERIANAS EM CULTURAS

[00245] A composição das bactérias ou da população bacteriana descrita neste documento pode ser aplicada em sulco, em talco ou como tratamento de sementes. A composição pode ser aplicada a um pacote de sementes a granel, minigranel, em um saco ou em talco.

[00246] O plantador pode plantar a semente tratada e cultivar a cul- tura de acordo com formas convencionais, duas fileiras ou formas que não exigem lavoura. As sementes podem ser distribuídas com uso de uma tremonha de controle ou uma tremonha individual. As sementes também podem ser distribuídas com uso de ar pressurizado ou manu- almente. A colocação de sementes pode ser desempenhada com uso de tecnologias de taxa variável. Além disso, a aplicação das bactérias ou população bacteriana descrita neste documento pode ser aplicada com uso de tecnologias de taxa variável. Em alguns exemplos, as bac- térias podem ser aplicadas a sementes de milho, soja, canola, sorgo, batata, arroz, vegetais, cereais, pseudocereais e oleaginosas. Exem- plos de cereais podem incluir cevada, fonio, aveia, grama de Palmer, centeio, milheto, sorgo, espelta, tefe, triticale e trigo. Exemplos de pseu- docereais podem incluir noz-pão, trigo sarraceno, taboa, chia, linho, amaranto em grão, hanza, quinoa e gergelim. Em alguns exemplos, as sementes podem ser organismos geneticamente modificados (GMO), não GMO, orgânicos ou convencionais.

[00247] Aditivos, tais como microfertilizantes, PGR, herbicida, inseti- cida e fungicida podem ser usados adicionalmente para tratar as cultu- ras. Exemplos de aditivos incluem protetores de culturas, tais como in- seticidas, nematicidas, fungicidas, agentes de aprimoramento, tais como corantes, polímeros, peletizantes, preparadores e desinfetantes, e outros agentes, tais como inoculante, PGR, amaciante e micronutrien- tes. Os PGRs podem ser hormônios vegetais naturais ou sintéticos que afetam o crescimento radicular, a floração ou o alongamento do caule. Os PGRs podem incluir auxinas, giberelinas, citocininas, etileno e ácido abscísico (ABA).

[00248] A composição pode ser aplicada no sulco em combinação com fertilizante líquido. Em alguns exemplos, o fertilizante líquido pode ser mantido em tanques. Os fertilizantes NPK contêm macronutrientes de sódio, fósforo e potássio.

[00249] A composição pode aprimorar os traços de plantas, tal como promover o crescimento das plantas, manter alto teor de clorofila nas folhas, aumentar o número de frutos ou sementes e aumentar o peso por unidade de fruto ou semente. Os métodos da presente divulgação podem ser usados para introduzir ou aprimorar uma ou mais dentre uma variedade de traços desejáveis. Exemplos de traços que podem ser in- troduzidos ou aprimorados incluem: biomassa radicular, comprimento de raiz, altura, comprimento de rebento, número de folhas, eficiência do uso de água, biomassa geral, rendimento, tamanho de fruto, tamanho de grão, taxa de fotossíntese, tolerância à seca, tolerância ao calor, to- lerância ao sal, tolerância ao estresse de baixo nitrogênio, eficiência no uso de nitrogênio, resistência ao estresse por nematoides, resistência a um patógeno fúngico, resistência a um patógeno bacteriano, resistência a um patógeno viral, nível de um metabólito, modulação no nível de um metabólito, expressão de proteoma. Os traços desejáveis, incluindo al- tura, biomassa geral, biomassa de raiz e/ou rebento, germinação de se- mentes, sobrevivência de mudas, eficiência fotossintética, taxa de trans- piração, número ou massa de sementes/frutos, rendimento de grãos ou frutos de plantas, teor de clorofila foliar, taxa fotossintética, comprimento de raiz, ou qualquer combinação dos mesmos, podem ser usados para medir o crescimento e comparados com a taxa de crescimento das plan- tas agrícolas de referência (por exemplo, plantas sem os traços introdu- zidos e/ou aprimorados) cultivadas sob condições idênticas. Em alguns exemplos, os traços desejáveis, incluindo altura, biomassa geral, bio- massa de raiz e/ou rebento, germinação de sementes, sobrevivência de mudas, eficiência fotossintética, taxa de transpiração, número ou massa de sementes/frutos, rendimento de grão ou fruto de plantas, teor de clo- rofila nas folhas, taxa fotossintética, comprimento das raízes ou qual- quer combinação dos mesmos, podem ser usados para medir o cresci- mento e comparados com a taxa de crescimento das plantas agrícolas de referência (por exemplo, plantas sem os traços introduzidos e/ou aprimorados) cultivadas sob condições semelhantes.

[00250] Um traço agronômico de uma planta hospedeira pode incluir, mas sem limitação, o seguinte: teor de óleo alterado, teor de proteína alterado, composição de carboidratos de sementes alterada, composi- ção de óleo de sementes alterada e composição de proteínas de se- mentes alterada, tolerância química, tolerância ao frio, senescência atrasada, resistência a doenças, tolerância à seca, peso da aurícula, aprimoramento do crescimento, refo4rço da saúde, tolerância ao calor, tolerância a herbicidas, resistência a herbívoros, fixação aprimorada de nitrogênio, utilização melhorada de nitrogênio, arquitetura de raiz me- lhorada,, eficiência de uso de água melhorada, biomassa aumentada, comprimento de raiz aumentado, peso da semente aumentado, compri- mento do rebento aumentado, rendimento aumentado, rendimento au- mentado sob condições de água limitada, massa do núcleo, teor de umi- dade do núcleo, tolerância ao metal, número de aurículas, número de grãos por aurícula, número de vagens, aprimoramento nutricional, resis- tência a patógenos, resistência a pragas, aprimoramento da capacidade fotossintética, tolerância à salinidade, permanência verde, aprimora- mento do vigor, peso seco de sementes maduras aumentado, peso fresco de sementes maduras aumentado, número de sementes madu- ras por planta aumentado, teor de clorofila aumentado, número de va- gens por planta aumentado, comprimento de vagens por planta aumen- tado, número de folhas murchas por planta diminuído, número de folhas gravemente murchas por planta diminuído e número de folhas não mur- chas por planta aumentado, uma modulação detectável no nível de um metabólito, uma modulação detectável no nível de uma transcrição e uma modulação detectável no proteoma, em comparação com uma planta de isolina cultivada a partir de uma semente sem a dita formula- ção de tratamento de sementes.

[00251] Em alguns casos, as plantas são inoculadas com bactérias ou populações bacterianas que são isoladas da mesma espécie de planta que o elemento vegetal da planta inoculada. Por exemplo, uma bactéria ou população bacteriana que é normalmente encontrada em uma variedade de Zea mays (milho) está associada a um elemento ve- getal de uma planta de outra variedade de Zea mays que, em seu es- tado natural, não possui as ditas bactérias e populações bacterianas. Em uma modalidade, as bactérias e populações bacterianas são deri- vadas de uma planta de uma espécie relacionada de planta como o ele- mento vegetal da planta inoculada. Por exemplo, uma bactéria e popu- lações bacterianas normalmente encontradas em Zea diploperennis Iltis et al. (Teosinte diploperenar) são aplicadas a um Zea mays (milho) ou vice-versa. Em alguns casos, as plantas são inoculadas com bactérias e populações bacterianas heterólogas ao elemento vegetal da planta inoculada. Em uma modalidade, as bactérias e populações bacterianas são derivadas a partir de uma planta de outra espécie. Por exemplo, uma bactéria e populações bacterianas normalmente encontradas em dicotiledôneas são aplicadas a uma planta monocotiledônea (por exem- plo, inocular milho com bactérias e populações bacterianas derivadas de soja) ou vice-versa. Em outros casos, as bactérias e populações bac- terianas a serem inoculadas em uma planta são derivadas de uma es- pécie relacionada da planta que está sendo inoculada. Em uma modali- dade, as bactérias e populações bacterianas são derivadas de um táxon relacionado, por exemplo, de uma espécie relacionada. A planta de ou- tra espécie pode ser uma planta agrícola. Em outra modalidade, as bac-

térias e populações bacterianas fazem parte de uma composição proje- tada inoculada em qualquer elemento da planta hospedeira.

[00252] Em alguns exemplos, as bactérias ou população bacteriana é exógena, em que as bactérias e a população bacteriana são isoladas a partir de uma planta diferente da planta inoculada. Por exemplo, em uma modalidade, as bactérias ou a população bacteriana pode ser iso- lada de uma planta diferente da mesma espécie que a planta inoculada. Em alguns casos, as bactérias ou a população bacteriana pode ser iso- lada de uma espécie relacionada à planta inoculada.

[00253] Em alguns exemplos, as bactérias e as populações bacteri- anas descritas neste documento são capazes de mover a partir de um tipo de tecido para outro. Por exemplo, a detecção e o isolamento de bactérias e populações bacterianas, da presente invenção, nos tecidos maduros das plantas após o revestimento no exterior de uma semente demonstram sua capacidade de locomoção do exterior da semente para os tecidos vegetativos de uma planta em maturação. Portanto, em uma modalidade, a população de bactérias e populações bacterianas são ca- pazes de se mover do exterior da semente para os tecidos vegetativos de uma planta. Em uma modalidade, as bactérias e populações bacte- rianas que são revestidas na semente de uma planta são capazes, após a germinação da semente em um estado vegetativo, de se localizar em um tecido diferente da planta. Por exemplo, bactérias e populações bac- terianas podem ser capazes de se localizar em qualquer um dos tecidos da planta, incluindo: a raiz, raiz adventícia, raiz seminal 5, pelos radicu- lares, rebento, folha, flor, broto, borla, meristema, pólen, pistilo, ovários, estame, fruta, estolho, rizoma, nódulo, tubérculo, tricoma, células de guarda, hidátodo, pétala, sépala, gluma, ráquis, câmbio vascular, floema e xilema. Em uma modalidade, as bactérias e populações bacterianas são capazes de se localizar na raiz e/ou nos pelos radiculares da planta.

Em outra modalidade, as bactérias e as populações bacterianas são ca- pazes de se localizar nos tecidos fotossintéticos, por exemplo, folhas e rebentos da planta. Em outros casos, as bactérias e populações bacte- rianas estão localizadas nos tecidos vasculares da planta, por exemplo, no xilema e no floema. Em ainda outra modalidade, as bactérias e as populações bacterianas são capazes de se localizar nos tecidos repro- dutivos (flor, pólen, pistilo, ovário, estame, fruto) da planta. Em outra modalidade, as bactérias e as populações bacterianas são capazes de se localizar na raiz, rebentos, folhas e tecidos reprodutivos da planta. Ainda em outra modalidade, as bactérias e populações bacterianas co- lonizam um tecido de fruto ou semente da planta. Em ainda outra mo- dalidade, as bactérias e as populações bacterianas são capazes de co- lonizar a planta de modo que estejam presentes na superfície da planta (isto é, sua presença está presente de forma detectável no exterior da planta ou na episfera da planta). Ainda em outras modalidades, as bac- térias e as populações bacterianas são capazes de se localizar em substancialmente todos ou todos os tecidos da planta. Em certas moda- lidades, as bactérias e as populações bacterianas não estão localizadas na raiz de uma planta. Em outros casos, as bactérias e populações bac- terianas não estão localizadas nos tecidos fotossintéticos da planta.

[00254] A eficácia das composições também pode ser avaliada me- dindo a maturidade relativa da cultura ou a unidade de aquecimento da cultura (CHU). Por exemplo, a população bacteriana pode ser aplicada ao milho e o crescimento do milho pode ser avaliado de acordo com a maturidade relativa do grão de milho ou o momento em que o grão de milho está com peso máximo. A unidade de aquecimento de culturas (CHU) também pode ser usada para prever a maturação da cultura de milho. A CHU determina a quantidade de acúmulo de calor medindo as temperaturas máximas diárias no crescimento da cultura.

[00255] Em exemplos, as bactérias podem se localizar em qualquer um dos tecidos da planta, incluindo: a raiz, raiz adventícia, raiz seminal, pelos radiculares, rebento, folha, flor, borla de broto, meristema, pólen, pistilo, ovário, estame, fruto, estolho, rizoma, nódulo, tubérculo, tricoma, células de guarda, hidátodo, pétala, sépala, gluma, ráquis, câmbio vas- cular, floema e xilema. Em outra modalidade, a bactéria ou população bacteriana é capaz de se localizar nos tecidos fotossintéticos, por exem- plo, folhas e rebentos da planta. Em outros casos, as bactérias e popu- lações bacterianas estão localizadas nos tecidos vasculares da planta, por exemplo, no xilema e no floema. Em outra modalidade, as bactérias ou população bacteriana é capaz de se localizar nos tecidos reproduti- vos (flor, pólen, pistilo, ovário, estame ou fruto) da planta. Em outra mo- dalidade, as bactérias e as populações bacterianas são capazes de se localizar na raiz, rebentos, folhas e tecidos reprodutivos da planta. Em outra modalidade, as bactérias ou população bacteriana coloniza um te- cido de fruto ou semente da planta. Ainda em outra modalidade, as bac- térias ou população bacteriana é capaz de colonizar a planta de modo que esteja presente na superfície da planta. Em outra modalidade, a bactéria ou população bacteriana é capaz de se localizar em substanci- almente todos ou todos os tecidos da planta. Em certas modalidades, as bactérias ou população bacteriana não está localizada na raiz de uma planta. Em outros casos, as bactérias e populações bacterianas não es- tão localizadas nos tecidos fotossintéticos da planta.

[00256] A eficácia das composições bacterianas aplicadas às cultu- ras pode ser avaliada medindo-se várias características do crescimento da cultura, incluindo, porém sem limitação, taxa de plantio, vigor da se- meadura, resistência das raízes, tolerância à seca, altura da planta, se- cagem e peso do teste.

ESPÉCIES DE PLANTAS

[00257] Os métodos e bactérias descritos neste documento são ade- quados para qualquer uma dentre uma variedade de plantas, tais como plantas dos gêneros Hordeum, Oryza, Zea e Triticeae. Outros exemplos não limitativos de plantas adequadas incluem musgos, líquenes e algas. Em alguns casos, as plantas têm valor econômico, social e/ou ambien- tal, tais como culturas alimentícias, culturas de fibras, cultura de óleos, plantas nas indústrias florestal ou de celulose e papel, matéria-prima para a produção de biocombustíveis e/ou plantas ornamentais. Em al- guns exemplos, as plantas podem ser usadas para produzir produtos economicamente valiosos, tais como um grão, uma farinha, um amido, um xarope, uma papa, um óleo, um filme, uma embalagem, um produto nutracêutico, uma polpa, uma ração para animais, uma forragem de peixe, um material a granel para produtos químicos industriais, um pro- duto de cereais, um produto alimentício humano processado, um açú- car, um álcool e/ou uma proteína. Exemplos não limitativos de plantas de cultura incluem maís, arroz, trigo, cevada, sorgo, milho, aveia, cen- teio triticale, trigo sarraceno, milho doce, cana-de-açúcar, cebola, to- mate, morango e aspargo.

[00258] Em alguns exemplos, as plantas que podem ser obtidas ou aprimoradas com uso dos métodos e da composição divulgados neste documento podem incluir plantas que são importantes ou interessantes para agricultura, horticultura, biomassa para a produção de moléculas de biocombustível e outros produtos químicos e/ou silvicultura. Alguns exemplos dessas plantas podem incluir abacaxi, banana, coco, lírio, er- vilha, alfafa, tomatillo, melão, grão de bico, chicória, trevo, couve, lenti- lha, soja, tabaco, batata, batata doce, rabanete, repolho, colza, maciei- ras, uva, algodão, girassol, erva-estrelada, canola, cítricos (incluindo la- ranja, mandarim, kumquat, limão, lima, toranja, tangerina, tangelo, cidra e pomelo), pimentão, feijão, alface, Panicum virgatum (switch), sorgo bicolor (sorgo, sudão), Miscanthus giganteus (miscanthus), Saccharum sp. (cana energética), Populus balsamifera (choupo), Zea mays (milho), Glycine max (soja), Brassica napus (canola), Triticum aestivum (trigo),

Gossypium hirsutum (algodão), Oryza sativa (arroz), Helianthus annuus (girassol), Medicago sativa (alfafa), Beta vulgaris (beterraba sacarina), Pennisetum glaucum (milheto), Panicum spp.

Sorghum spp., Mis- canthus spp., Saccharum spp., Erianthus spp., Populus spp., Secale ce- reale (centeio), Salix spp. (salgueiro), Eucalyptus spp. (eucalipto), Triti- cosecale spp. (triticum-25 trigo X centeio), Bambu, Carthamus tinctorius (cártamo), Jatropha curcas (Jatropha), Ricinus communis (rodízio), Ela- eis guineensis (óleo de palma), Phoenix dactylifera (palma de data), Ar- chontophoenix cunninghamiana (palmeira imperial), Syagrus romanzof- fiana (jerivá), Linum usitatissimum (linho), Brassica juncea, Manihot es- culenta (mandioca), Lycopersicon esculentum (tomate), Lactuca saliva (alface), Musa paradisiaca (banana), Solanum tuberosum (batata), Brassica oleracea (brócolis couve-flor, couve-de-bruxelas), Camellia si- nensis (chá), Frágaria ananassa (morango), Theobroma cacao (cacau), Coffea arabica (café), Vitis vinifera (uva), Ananas comosus (abacaxi), Capsicum annum (pimenta doce e picante), Allium cepa (cebola), Cucu- mis melo (melão), Cucumis sativus (pepino), Cucurbita maxima (abó- bora), Cucurbita moschata (abóbora), Spinacea oleracea (espinafre), Citrullus lanatus (melancia), Abelmoschus esculentus (quiabo), Sola- num melongena (berinjela), Papaver somniferum (papoula do ópio), Pa- paver orientale, Taxus baccata, Taxus brevifolia, Artemisia annua, Can- nabis saliva, Camptotheca acuminate, Catharanthus roseus, Vinca ro- sea, Cinchona officinalis, Coichicum autumnale, Veratrum californica, Digitalis lanata, Digitalis purpurea, Dioscorea 5 spp., Andrographis pa- niculata, Andrographis paniculata Datura stomonium, Berberis spp., Cephalotaxus spp., Ephedra sinica, Ephedra spp., Erythroxylum coca, Galanthus wearorii, Scopolia spp., Lycopodium serratum (Huperzia ser- rata), Lycopodium spp. spp., Calendula officinalis, Chrysanthemum parthenium, Coleus forskohlii, Tanacetum parthenium, Parthenium ar- gentatum (guaiúle), Hevea spp. (borracha), Mentha spicata (hortelã),

Mentha piperita (hortelã), Bixa orellana, Alstroemeria spp., Rosa spp. (rosa), Dianthus caryophyllus (cravo), Petunia spp. (petúnia), Poinsettia pulcherrima (poinsétia), Nicotiana tabacum (tabaco), Lupinus albus (tre- moço), Uniola paniculata (aveia), Hordeum vulgare (cevada) e Lolium spp. (centeio).

[00259] Em alguns exemplos, uma planta monocotiledônea pode ser usada. As plantas monocotiledôneas pertencem às ordens de Alismata- les, Arales, Arecales, Bromeliales, Commelinales, Cyclanthales, Cype- rales, Eriocaulales, Hydrocharitales, Juncales, Lilliales, Najadales, Or- chidales, Pandanales, Poales, Restionales, Triuridales, Typhales e Zin- giberales. As plantas pertencentes à classe das Gimnospermas são Cycadales, Ginkgoales, Gnetales e Pinales. Em alguns exemplos, a planta monocotiledônea pode ser selecionada do grupo que consiste em milho, arroz, trigo, cevada e cana-de-açúcar.

[00260] Em alguns exemplos, uma planta dicotiledônea pode ser uti- lizada, incluindo aquelas que pertencem às ordens de Aristochiales, As- terales, Batales, Campanulales, Capparales, Caryophyllales, Casuari- nales, Celastrales, Cornales, Diapensales, Dilleniales, Dipsacales, Ebe- nales, Ericales, Eucomiales, Euphorbiales, Fabales, Fagales, Gentiana- les, Geraniales, Haloragales, Hamamelidales, Middles, Juglandales, La- miales, Laurales, Lecythidales, Leitneriales, Magniolales, Malvales, Myricales, Myrtales, Nymphaeales, Papeverales, Piperales, Plantagina- les, Plumb aginales, Podostemales, Polemoniales, Polygalales, Polygo- nales, Primulales, Proteales, Rafflesiales, Ranunculales, Rhamnales, Rosales, Rubiales, Salicales, Santales, Sapindales, Sarraceniaceae, Scrophulariales, Theales, Trochodendrales, Umbellales, Urticales e Vi- olates. Em alguns exemplos, a planta dicotiledônea pode ser selecio- nada do grupo que consiste em algodão, soja, pimentão e tomate.

[00261] Em alguns casos, a planta a ser aprimorada não é facilmente passível a condições experimentais. Por exemplo, uma planta de cultura pode demorar muito para crescer o suficiente para avaliar praticamente um traço aprimorado em série em múltiplas iterações. Por conseguinte, uma primeira planta a partir da qual as bactérias são inicialmente isola- das e/ou a pluralidade de plantas às quais as bactérias geneticamente manipuladas são aplicadas pode ser uma planta modelo, tal como uma planta mais passível à avaliação sob condições desejadas. Exemplos não limitativos de plantas modelo incluem Setaria, Brachypodium e Ara- bidopsis. A capacidade de bactérias isoladas de acordo com um método da divulgação com uso de uma planta modelo pode, então, ser aplicada a uma planta de outro tipo (por exemplo, uma planta de cultura) para confirmar a atribuição do traço aprimorado.

[00262] Os traços que podem ser aprimorados pelos métodos divul- gados neste documento incluem qualquer característica observável da planta, incluindo, por exemplo, taxa de crescimento, altura, peso, cor, sabor, aroma, alterações na produção de um ou mais compostos pela planta (incluindo, por exemplo, metabólitos, proteínas, fármacos, carboi- dratos, óleos e quaisquer outros compostos). Também é prevista a se- leção de plantas com base em informações genotípicas (por exemplo, incluindo o padrão de expressão do gene de planta em resposta às bac- térias ou identificando a presença de marcadores genéticos, tais como os associados à fixação aumentada de nitrogênio). As plantas também podem ser selecionadas com base na ausência, supressão ou inibição de uma determinada característica ou traço (tal como uma característica ou traço indesejável) em oposição à presença de uma certa caracterís- tica ou traço (tal como uma característica ou traço desejável).

EXEMPLOS

[00263] Os exemplos fornecidos neste documento descrevem méto- dos de isolamento bacteriano, análise bacteriana e de plantas e aprimo- ramento de traços de plantas. Os exemplos são apenas para fins ilus-

trativos e não devem ser interpretados como limitativos de forma al- guma. EXEMPLO 1: ISOLAMENTO DE MICRÓBIOS DE TECIDO VEGETAL

[00264] O solo superficial foi obtido de várias áreas agrícolas no cen- tro da Califórnia. Foram coletados vinte solos com diversas característi- cas de textura, incluindo muito argiloso, franco-argilo-turfoso, argilo-sil- toso e franco-arenosa. Sementes de vários milho de campo, milho doce, milho hereditário e tomate foram plantadas em cada solo, conforme mostra a Tabela 1.

TABELA 1: TIPO DE CULTURA E VARIEDADES PLANTADAS NO

SOLO COM CARACTERÍSTICAS DIVERSAS

[00265] As plantas foram desenraizadas após 2 a 4 semanas de crescimento e o excesso de solo nas superfícies das raízes foi removido com água deionizada. Após a remoção do solo, as plantas foram este- rilizadas em superfície com água sanitária e enxaguadas vigorosamente em água estéril. Uma seção de raiz limpa de 1 cm foi excisada da planta e colocada em uma solução salina tamponada com fosfato contendo esferas de aço de 3 mm. Uma pasta fluida foi gerada por agitação vigo- rosa da solução com um Qiagen TissueLyser II.

[00266] A pasta fluida de raiz e salino foi diluída e inoculada em vá- rios tipos de meios de crescimento para isolar micróbios rizosféricos, endofíticos, epifíticos e outros micróbios associados a plantas. Os meios de ágar R2A e Nfb foram utilizados para obter colônias únicas e as in- clinações semissólidas de meios Nfb foram utilizadas para obter popu- lações de bactérias fixadoras de nitrogênio. Após 2 a 4 semanas de in- cubação em inclinações semissólidas de meios Nfb, as populações mi- crobianas foram coletadas e riscadas para obter colônias únicas em ágar R2A, conforme mostrado nas Figuras 1A e 1B. Colônias únicas foram ressuspensas em uma mistura de R2A e glicerol, submetidas a análise por PCR e congeladas a -80°C para análise posterior. Aproxi- madamente 1.000 colônias individuais foram obtidas e designadas como "micróbios isolados".

[00267] Os isolados foram, então, submetidos a uma triagem de PCR de colônia para detectar a presença do gene nifH, a fim de identificar diazotróficos. O conjunto de iniciadores descrito anteriormente Ueda 19F/388R, que demonstrou detectar mais de 90% dos diazotróficos nas triagens, foi usado para sondar a presença do aglomerado de nif em cada isolado (Ueda et al. 1995; J. Bacteriol. 177: 1.414 a 1.417). Colô- nias únicas de isolados purificados foram colhidas, ressuspensas em PBS e usadas como modelo para PCR de colônia, conforme mostrado na Figura 2. As colônias de isolados que deram bandas de PCR positi- vas foram riscadas novamente, e o processo de PCR de colônia e nova risca foi repetido duas vezes para evitar a identificação positiva falsa de diazotróficos. Isolados purificados foram, então, designados "micróbios candidatos". EXEMPLO 2: CARACTERIZAÇÃO DE MICRÓBIOS ISOLADOS SEQUENCIAMENTO, ANÁLISE E CARACTERIZAÇÃO FILOGENÉ-

TICA

[00268] A sequenciação do 16S rDNA com o conjunto de iniciadores 515f-806r foi usada para gerar identidades filogenéticas preliminares para micróbios isolados e candidatos (consultar, por exemplo, Vernon et al.; BMC Microbiol. 23 de dezembro de 2002; 2: 39.). Os micróbios compreendem diversos gêneros, incluindo: Enterobacter, Burkholderia, Klebsiella, Bradyrhizobium, Rahnella, Xanthomonas, Raoultella, Pan- toea, Pseudomonas, Brevundimonas, Agrobacterium e Paenibacillus, conforme mostrado na Tabela 2.

TABELA 2: DIVERSIDADE DE MICRÓBIOS ISOLADOS DE PLANTAS DE TOMATE, CONFORME DETERMINADO POR SEQUENCIA- MENTO PROFUNDO DE 16S RDNA.

[00269] Posteriormente, os genomas de 39 micróbios candidatos fo- ram sequenciados com uso de plataforma Illumina Miseq. O DNA genô- mico de culturas puras foi extraído com uso do minikit QIAmp DNA (QI- AGEN) e as bibliotecas totais de DNA para sequenciamento foram pre- paradas por um fornecedor terceirizado (SeqMatic, Hayward). O con- junto de genoma foi, então, efetuado por meio de conduto tubular A5 (Tritt et al 2012; PLoS One 7(9):e42304). Os genes foram identificados e anotados, e os relacionados à regulação e expressão da fixação de nitrogênio foram apontados como alvos para mutagênese.

PERFIL TRANSCRIPTÔMICO DE MICRÓBIOS CANDIDATOS

[00270] O perfil transcriptômico da cepa CI010 foi desempenhado para identificar promotores que são ativos na presença de nitrogênio ambiental. A cepa CI010 foi cultivada em um meio definido, livre de ni- trogênio, suplementado com 10 mM de glutamina. O RNA total foi extra- ído dessas culturas (kit QIAGEN RNeasy) e submetido ao sequencia- mento de RNAseq por meio de Illumina HiSeq (SeqMatic, Fremont CA). As leituras de sequenciamento foram mapeadas para os dados do ge- noma CI010 com uso de Geneious, e genes altamente expressos sob controle de promotores transcricionais proximais foram identificados. As Tabelas 3A a 3C listam genes e seu nível de expressão relativo, con- forme medido através do sequenciamento de RNA total de RNASeq. As sequências dos promotores proximais foram registradas para uso na mutagênese das vias nif, vias relacionadas à utilização de nitrogênio ou outros genes com um nível de expressão desejado.

AVALIAÇÃO DA RASTREABILIDADE GENÉTICA

[00271] Os micróbios candidatos foram caracterizados com base na transformabilidade e tratabilidade genética. Primeiro, a utilização ideal da fonte de carbono foi determinada pelo crescimento em um pequeno painel de meio relevante, bem como por uma curva de crescimento em meios rico e livre de nitrogênio. Segundo, a resistência natural aos anti- bióticos de cada cepa foi determinada por através de plaqueamento lo- cal e crescimento em cultura líquida que contém um painel de antibióti- cos usado como marcadores seletivos para mutagênese. Terceiro, cada cepa foi testada quanto à sua transformabilidade através da eletropora- ção de uma coleção de plasmídeos. A coleção de plasmídeos compre- ende a expansão combinatória de sete origens de replicação, isto é, p15a, pSC101, CloDF, colA, RK2, pBBR1 e pRO1600 e quatro marca- dores de resistência a antibióticos, isto é, CmR, KmR, SpecR e TetR. Esta avaliação sistemática da compatibilidade do marcador de origem e resistência foi usada para identificar vetores para mutagênese baseada em plasmídeo em micróbios candidatos. EXEMPLO 3: MUTAGÊNESE DE MICRÓBIOS CANDIDATOS KNOCKOUTS MEDIADOS POR LAMBDA-RED

[00272] Vários mutantes de micróbios candidatos foram gerados uti- lizando o plasmídeo pKD46 ou um derivado contendo um marcador de resistência à canamicina (Datsenko et al. 2000; PNAS 97 (12): 6.640 a

6.645). Os cassetes de knockout foram projetados com homologia de 250 pb que flanqueiam o gene-alvo e gerados por PCR de extensão de sobreposição. Os micróbios candidatos foram transformados com pKD46, cultivados na presença de arabinose para induzir a expressão de máquinas Lambda-Red, preparados para eletroporação e transfor- mados com os cassetes de knockout para produzir cepas mutantes can- didatas. Quatro micróbios candidatos e uma cepa de laboratório, Kleb- siella oxytoca M5A1, foram utilizados para gerar treze mutantes candi- datos dos genes reguladores da fixação de nitrogênio nifL, glnB e amtB, conforme mostrado na Tabela 4.

TABELA 4: LISTA DE MUTANTES DE KNOCKOUT ÚNICOS CRIADOS ATRAVÉS DE MUTAGÊNESE LAMBDA-RED MUTAGÊNESE OLIGO-DIRIGIDA COM SELEÇÃO DE CAS9

[00273] A mutagênese oligo-dirigida foi usada para direcionar altera- ções genômicas ao gene rpoB em E. coli DH10B, e os mutantes foram selecionados com um sistema CRISPR-Cas. Um oligo mutagênico (ss1283: “G*T*T*G*ATCAGACCGATGTTCGGACCTTCcaagGTTT- CGATCGGACATACGCGACCGTAGTGGG- TCGGGTGTACGTCTCGAACTTCAAAGCC”, em que * indica a ligação de fosforotioato) foi projetado para conferir resistência à rifampicina atra- vés de uma mutação de 4 pb para o gene rpoB. As células contendo um plasmídeo que codifica Cas9 foram induzidas para a expressão de Cas9, preparadas para eletroporação e, em seguida, eletroporadas com o oligo mutagênico e um plasmídeo que codifica a expressão constitu- tiva de um RNA guia (gRNA) que alveja a clivagem de Cas9 da sequên- cia WT rpoB. As células eletroporadas foram recuperadas em meio não seletivo durante a noite para permitir segregação suficiente dos cromos- somos mutantes resultantes. Após plaqueamento na seleção para o plasmídeo que codifica o gRNA, duas em cada dez colônias triadas mostraram conter a mutação desejada, enquanto o restante mostrou ser mutantes de escape gerados através de mutação protospacer no plas- mídeo gRNA ou perda do plasmídeo Cas9. MUTAGÊNESE LAMBDA-RED COM SELEÇÃO DE CAS9

[00274] Mutantes dos micróbios candidatos CI006 e CI010 foram ge- rados por meio de mutagênese lambda-red com seleção por CRISPR- Cas. Os cassetes de knockout continham um promotor endógeno iden- tificado através de perfil transcricional (conforme descrito no Exemplo 2 e retratado na Tabela 3) e regiões de homologia de cerca de 250 pb que flanqueiam o alvo de deleção. CI006 e CI010 foram transformados com plasmídeos que codificam o sistema de recombinação Lambda-red (genes exo, beta, gam) sob controle de um promotor induzível por ara- binose e Cas9 sob controle de um promotor induzível por IPTG. Os sis- temas de recombinação Red e Cas9 foram induzidos nos transforman- tes resultantes e as cepas foram preparadas para eletroporação. Os cassetes de knockout e um gRNA de seleção codificado por plasmídeo foram subsequentemente transformados em células competentes. Após plaqueamento de antibióticos seletivos para o plasmídeo Cas9 e o plas- mídeo gRNA, 7 das 10 colônias triadas mostraram a mutação de knockout pretendida, conforme mostrado na Figura 3.

EXEMPLO 4: FENOTIPAGEM IN VITRO DE MOLÉCULAS CANDIDA-

TAS

[00275] O impacto do nitrogênio exógeno na biossíntese e atividade da nitrogenase em vários mutantes foi avaliado. O Ensaio de Redução de Acetileno (ARA) (Temme et. al. 2012; 109 (18): 7.085 a 7.090) foi usado para medir a atividade da nitrogenase em condições de cultura pura. As cepas foram cultivadas em tubos de ensaio herméticos e a re- dução de acetileno em etileno foi quantificada com um cromatógrafo a gás Agilent 6890. As atividades de ARA de micróbios candidatos e mu- tantes candidatos de contrapartida cultivados em meios de fixação de nitrogênio suplementados com glutamina de 0 a 10 mM são mostradas nas Figuras 4A a 4B e nas Figuras 10A a 10C.

[00276] Sob condições de cultura anaeróbica, uma faixa de concen- trações de glutamina e amônia foi testada para quantificar o impacto na atividade de fixação de nitrogênio. Em células do tipo selvagem, a ativi- dade diminuiu rapidamente à medida que as concentrações de gluta- mina aumentavam. No entanto, em uma série de mutações de knockout iniciais, uma classe de mutação foi validada permitindo a expressão de genes de fixação de nitrogênio sob concentrações de glutamina que, de outra forma, interromperiam a atividade no tipo selvagem. Este perfil foi gerado em quatro espécies diferentes de diazotróficos, conforme visto na Figura 4C. Além disso, reconectando a rede reguladora com uso de partes genéticas que foram identificadas, o nível de atividade de fixação de nitrogênio foi ajustado de forma previsível. Isso é visto na Figura 4B, que ilustra as cepas CM023, CM021, CM015 e CI006. A cepa CM023 é uma cepa evoluída baixa; a cepa CM021 é uma cepa evoluída alta; a cepa CM015 é uma cepa evoluída mediana; a cepa CI006 é uma do tipo selvagem (cepa 2). A amônia excretada em sobrenadantes de cultura foi testada com uso de um ensaio enzimático (MEGAZYME). O ensaio mede a quantidade de NADPH consumida na absorbância de 340 nm.

O ensaio foi conduzido em culturas bacterianas cultivadas em ambiente anaeróbico livre de nitrogênio com uma densidade inicial de 1E9 CFU/ml. Em um painel de seis cepas evoluídas, uma cepa excretou até 100 μM de amônia ao longo de um período de 48 horas, conforme visto na Figura 4D. Além disso, um mutante duplo exibiu maior excreção de amônia do que o único mutante a partir do qual foi derivado, conforme visto na Figura 11. Isso demonstra uma capacidade microbiana de pro- duzir amônia que excede suas necessidades fisiológicas.

PERFIL DE TRANSCRIÇÃO DE CULTURAS PURAS

[00277] A atividade transcricional do CI006 foi medida com uso da plataforma Nanostring Elements. As células foram cultivadas em meio livre de nitrogênio e células 10E8 foram coletadas após 4 horas de in- cubação. O RNA total foi extraído com uso do kit Qiagen RNeasy. O RNA purificado foi submetido ao Core Diagnostics em Palo Alto, CA, para hibridização da sonda e análise do Digital Analyzer, conforme mos- trado na Figura 5. EXEMPLO 5: FENOTIPAGEM IN PLANTA DE MICRÓBIOS CANDIDATOS

COLONIZAÇÃO DE PLANTAS POR MICRÓBIOS CANDIDATOS

[00278] A colonização das plantas hospedeiras desejadas por um mi- cróbio candidato foi quantificada através de experimentos de cresci- mento de plantas a curto prazo. As plantas de milho foram inoculadas com cepas que expressam RFP a partir de um plasmídeo ou de um cassete de expressão RFP integrada a Tn5. As plantas foram cultivadas tanto em meio de areia esterilizada quanto em turfa não estéril, e a ino- culação foi desempenhada pipetando 1 ml de cultura de células direta- mente sobre o coleóptilo emergente da planta três dias após a germina- ção. Os plasmídeos foram mantidos regando as plantas com uma solu- ção contendo o antibiótico apropriado. Após três semanas, as raízes das plantas foram coletadas, lavadas três vezes em água estéril para remo- ver o solo visível e divididas em duas amostras. Uma amostra de raiz foi analisada por meio de microscopia de fluorescência para identificar pa- drões de localização de micróbios candidatos. A microscopia foi desem- penhada em comprimentos de 10 mm das melhores raízes intactas da planta, conforme mostra a Figura 6.

[00279] Um segundo método quantitativo para avaliar a colonização foi desenvolvido. Um ensaio quantitativo de PCR foi desempenhado em preparações de DNA inteiro a partir das raízes de plantas inoculadas com os endófitos. Sementes de milho (Dekalb DKC-66-40) foram germi- nadas em areia previamente autoclavada em um vaso de 6,35 cm por 6,35 cm por 25,4 cm (2,5 polegadas por 2,5 polegadas por 10 polega- das). Um dia após o plantio, 1 ml de cultura endofítica de pernoite (meio SOB) foi encharcado bem no local onde a semente estava localizada. 1 ml dessa cultura de pernoite é aproximadamente equivalente a cerca de 10^9 cfu, variando 3 vezes entre si, dependendo de qual cepa estiver sendo usada. Cada muda foi fertilizada 3 vezes por semana com 50 ml de solução de Hoagland modificada suplementada com 2,5 mM ou 0,25 mM de nitrato de amônio. Quatro semanas após o plantio, amostras de raízes foram coletadas para extração de DNA. Os detritos do solo foram removidos por lavagem com pulverizador de água pressurizada. Estas amostras de tecido foram, então, homogeneizadas com uso de QIAGEN Tissuelyzer e o DNA foi extraído com uso de QIAmp DNA Mini Kit (QIA- GEN) de acordo com o protocolo recomendado. O ensaio de qPCR foi desempenhado com uso de Stratagene Mx3005P RT-PCR nesses ex- tratos de DNA com uso de iniciadores que foram projetados (com uso de NCBI's Iniciador BLAST) para serem específicos de um loci em cada genoma do endófito. A presença das cópias do genoma dos endófitos foi quantificada. Para confirmar ainda mais a identidade dos endófitos, os produtos de amplificação por PCR foram sequenciados e confirma- dos como tendo a sequência correta. O resumo do perfil de colonização das cepas CI006 e CI008 de micróbios candidatos é apresentado na

Tabela 5. A taxa de colonização alta de 10^7x cfu / g fw de raiz foi de- monstrada na cepa CI008.

Cepa Taxa de colonização (CFU / g fw) CI006 1,45 x 10^5 CI008 1,24 x 10^7 TABELA 5: COLONIZAÇÃO DO MILHO MEDIDA POR QPCR

PERFIL DE RNA IN PLANTA

[00280] A biossíntese dos componentes da via nif in planta foi esti- mada medindo a transcrição dos genes nif. O RNA total foi obtido a partir de tecido da raiz das plantas inoculadas com CI006 (métodos de plantio como descrito anteriormente). A extração do RNA foi desempenhada com uso do RNEasy Mini Kit, de acordo com o protocolo recomendado (QIAGEN). O RNA total desses tecidos vegetais foi, então, analisado com uso de kits Nanostring Elements (NanoString Technologies, Inc.) com uso de sondas que eram específicas dos genes nif no genoma da cepa CI006. Os dados da expressão do gene nif in planta estão resumi- dos na Tabela 6. A expressão dos genes nifH foi detectada nas plantas inoculadas pelas cepas CM013, enquanto a expressão de nifH não foi detectável nas plantas inoculadas com CI006. A cepa CM013 é um de- rivado da cepa CI006, na qual o gene nifL foi submetido a knockout.

[00281] Genes altamente expressos de CM011, classificados por transcritos por kilobase por milhão (TPM), foram medidos in planta sob condição fertilizada. Os promotores que controlam a expressão de al- guns desses genes altamente expressos foram utilizados como mode- los para recombinação homóloga em lócus de fixação e assimilação al- vejados de nitrogênio. As amostras de RNA da planta inoculada com CM011 cultivada em estufa foram extraídas, o rRNA removido com o kit Ribo-Zero, sequenciado com uso da plataforma Truseq da Illumina e mapeado de volta para o genoma de CM011. Genes altamente expres- sos de CM011 estão listados na Tabela 7.

Cepas Expressão de transcrição relativa CI006 9,4 CM013 103,25 TABELA 6: EXPRESSÃO DE NIFH IN PLANTA TABELA 7: GENES ALTAMENTE EXPRESSOS DE CM011 ENSAIO DE 15N

[00282] O método primário para demonstrar a fixação utiliza o isótopo de nitrogênio 15N, que é encontrado na atmosfera a uma taxa definida em relação a 14N. Suplementando fertilizante ou atmosfera com níveis enriquecidos de 15N, pode-se observar a fixação diretamente, em quan- tidades elevadas de 15N fixas a partir de uma atmosfera suplementada com gás 15N2 (Yoshida 1980) ou, inversamente, através da diluição de fertilizante enriquecido por gás N2 atmosférico em tecidos vegetais (Ini- guez 2004). O método de diluição permite a observação do nitrogênio fixo cumulativo ao longo do crescimento da planta, enquanto o método de gás 15N2 é restrito a medir a fixação que ocorre no curto intervalo em que uma planta pode ser cultivada em uma atmosfera contida (medição da taxa). Portanto, o método de gás é superior em especificidade (como quaisquer níveis elevados de 15N2 na planta acima da taxa atmosférica podem ser atribuídos de forma não ambígua à fixação), mas não mostra atividade cumulativa.

[00283] Ambos os tipos de ensaio foram desempenhados para medir a atividade de fixação de cepas aprimoradas em relação às plantas de milho do tipo selvagem e não inoculadas, e taxas de fixação elevadas foram observadas in planta para várias das cepas aprimoradas (Figura 12, Figura 14A e Figura 14B). Estes ensaios são fundamentais para demonstrar que a atividade das cepas observadas in vitro se traduz em resultados in vivo. Além disso, esses ensaios permitem medir o impacto do fertilizante na atividade da cepa, sugerindo funcionalidade adequada em uma configuração agrícola. Resultados semelhantes foram observa- dos quando plantas setaria foram inoculadas com cepas do tipo selva- gem e aprimoradas (Figura 13). A atividade de fixação in planta mos- trada nas Figuras 14A a 14C é ainda reforçada por dados transcriptô- micos. As cepas evoluídas exibem um nível de transcrição de nifH au- mentado em relação às contrapartes do tipo selvagem. Além disso, o nível de nitrogênio derivado de micróbios in planta também está corre- lacionado com o nível de colonização em uma base planta por planta. Esses resultados (Figura 12, Figura 13, Figuras 14A a 14C, Figura 15A e Figura 15B) sustentam a hipótese de que o micróbio, através da regulação aprimorada do aglomerado de genes nif, é a provável razão para o aumento do nitrogênio derivado da atmosfera observado no te-

cido da planta. Além de medir diretamente a fixação, foi medido o im- pacto da inoculação de plantas com as cepas aprimoradas em um en- saio de biomassa de planta sob estresse de nitrogênio. Embora a bio- massa da planta possa estar relacionada a muitas interações possíveis de micróbios com a planta, seria de esperar que a adição de nitrogênio fixo impactasse o fenótipo da planta quando o nitrogênio é limitado. As plantas inoculadas foram cultivadas na ausência completa de nitrogê- nio, e foram observados aumentos significativos na área foliar, peso fresco e seco de rebento e peso fresco e seco de raiz em plantas inocu- ladas em relação aos controles não tratados (Figura 14C). Embora es- sas diferenças não possam ser atribuídas exclusivamente à fixação de nitrogênio, as mesmas sustentam a conclusão de que as cepas aprimo- radas estão fornecendo ativamente nitrogênio à planta. Plantas de milho e setaria foram cultivadas e inoculadas conforme descrito acima. Ferti- lizantes que contêm 1,2% de 15N foram fornecidos regularmente às plan- tas por meio de rega. A fixação de nitrogênio pelos micróbios foi quanti- ficada pela medição do nível de 15N no tecido da planta. O quarto tecido da folha foi coletado e seco 4 semanas após o plantio. As amostras de folhas secas foram homogeneizadas com uso de microesferas (QIA- GEN Tissuelyzer) e divididas em alíquotas em cápsulas de estanho para IRMS (MBL Stable Isotope Laboratory no The Ecosystems Center, Wo- ods Hole, MA). O nitrogênio derivado da atmosfera (NDFA) foi calculado e a produção de nitrogênio por CI050 e CM002 é mostrada na Figura 7. ENSAIO DE PRODUÇÃO DE FITO-HORMÔNIO

[00284] O tomate anão (Solanum lycopersicum) cultivar “Micro-Tom” já foi usado anteriormente para estudar a influência do ácido indol-3- acético no amadurecimento de frutos por meio de um ensaio in vitro (Cohen 1996; J Am Soc Hortic Sci 121: 520 a 524). Para avaliar a pro- dução e secreção de fito-hormônios pelos micróbios candidatos, foi de- senvolvido um ensaio de triagem baseado em placas com uso de frutas imaturas Micro-Tom. Placas de teste para cultura de tecidos de doze cavidades foram preparadas preenchendo as cavidades com meio de ágar, permitindo a solidificação e colocando 10 µL de culturas microbia- nas de pernoite na superfície do ágar, conforme mostra a Figura 8. As cavidades com ágar continham quantidades crescentes de ácido gibe- rélico (GA), mas nenhuma cultura bacteriana foi utilizada como controle positivo e padrões. As flores, um dia após a antese, abscisas das plan- tas Micro-Tom em crescimento, foram inseridas, haste primeiro, no ágar no ponto da cultura da mancha bacteriana. Essas flores foram monito- radas por 2 a 3 semanas, em seguida, os frutos foram colhidos e pesa- dos. Um aumento na massa de frutos de plantas em várias réplicas in- dica a produção de hormônio vegetal pelo micróbio inoculante, conforme mostra a Figura 9. EXEMPLO 6: EVOLUÇÃO CÍCLICA DE MICRÓBIOS HOSPEDEIROS

[00285] As plantas de milho foram inoculadas com CM013 e cresce- ram 4 semanas até aproximadamente o estágio de crescimento V5. Aquelas que demonstraram melhor acúmulo de nitrogênio a partir de 15 fontes microbianas por meio de análise de N foram desenraizadas e as raízes foram lavadas com uso de água pressurizada para remover o solo granular. Uma seção de 0,25 g de raiz foi cortada e lavada em so- lução de PBS para remover partículas finas do solo e micróbios não aderentes. As amostras de tecido foram homogeneizadas com uso de esferas de aço de 3 mm em QIAGEN TissueLyser II. O homogenato foi diluído e plaqueado em meio de ágar SOB. Colônias individuais foram ressuspensas em meio líquido e submetidas à análise por PCR de 16s rDNA e mutações únicas para a cepa de inoculação. O processo de iso- lamento, mutagênese, inoculação e reisolamento do micróbio pode ser repetido iterativamente para aprimorar os traços microbianos, os traços de plantas e a capacidade de colonização do micróbio. EXEMPLO 7: COMPATIBILIDADE NA REGIÃO GEOGRÁFICA

[00286] A capacidade dos micróbios aprimorados para colonizar uma planta inoculada é crucial para o sucesso da planta em condições de campo. Embora os métodos de isolamento descritos sejam projetados para selecionar micróbios do solo que possam ter uma estreita relação com plantas de cultura, tais como o milho, muitas cepas podem não co- lonizar efetivamente uma faixa de genótipos de plantas, ambientes, ti- pos de solo ou condições de inoculação. Visto que a colonização é um processo complexo que requer uma faixa de interações entre uma cepa microbiana e a planta hospedeira, a triagem da competência em coloni- zação tornou-se um método central para a seleção de cepas prioritárias para posterior desenvolvimento. Os primeiros esforços para avaliar a colonização usaram a marcação fluorescente de cepas, o que foi eficaz, mas demorado e não escalonável em uma base por cepa. Como a ati- vidade de colonização não é passível de aprimoramento direto, é impe- rativo que candidatos a produtos em potencial sejam selecionados a partir de cepas que são colonizadores naturais.

[00287] Um ensaio foi projetado para testar a colonização robusta das cepas do tipo selvagem em qualquer planta hospedeira com uso de qPCR e iniciadores projetados para serem específicos da cepa em uma amostra da comunidade. Este ensaio se destina a medir rapidamente a taxa de colonização dos micróbios a partir de amostras de tecido de milho. Testes iniciais com uso de cepas avaliadas como prováveis colo- nizadores com uso de microscopia de fluorescência e técnicas basea- das em placas indicaram que uma abordagem de qPCR seria quantita- tiva e escalável.

[00288] Um ensaio típico é desempenhado da seguinte forma: as plantas, principalmente variedades de maís e trigo, são cultivadas em uma mistura de substrato para envasamento à base de turfa na estufa em réplicas de seis por cepa. Quatro ou cinco dias após o plantio, pi- peta-se uma dose de 1 ml de culturas em fase estacionária precoce de bactérias diluídas em um OD590 de 0,6 a 1,0 (aproximadamente 5E+08 CFU/ml) sobre o coleóptil emergente. As plantas são regadas apenas com água encanada e deixadas crescer por quatro semanas antes da amostragem, momento em que as plantas são desenraizadas e as raí- zes são lavadas cuidadosamente para remover a maior parte dos resí- duos de turfa. Amostras de raiz limpa são excisadas e homogeneizadas para criar uma pasta fluida de detritos de células vegetais e células bac- terianas associadas. Os requerentes desenvolveram um protocolo de extração de DNA de alto desempenho que produziu efetivamente uma mistura de DNA vegetal e bacteriano para usar como modelo para qPCR. Com base em experimentos de inserção de células bacterianas, esse processo de extração de DNA fornece uma amostra quantitativa de DNA bacteriano em relação ao peso fresco das raízes. Cada cepa é avaliada com uso de iniciadores específicos da cepa projetados com uso de Iniciador BLAST (Ye 2012) e comparada à amplificação de refe- rência de plantas não inoculadas. Visto que alguns iniciadores exibem amplificação fora do alvo em plantas não inoculadas, a colonização é determinada pela presença de amplificação ou amplificação elevada do produto correto em comparação com o nível de referência.

[00289] Este ensaio foi utilizado para medir a compatibilidade do pro- duto microbiano em diferentes geografias do solo. As qualidades do solo de campo e as condições do campo podem ter uma enorme influência no efeito de um produto microbiano. O pH do solo, a capacidade de retenção de água e os micróbios competitivos são apenas alguns exem- plos de fatores no solo que podem afetar a sobrevivência do inóculo e a capacidade de colonização. Um ensaio de colonização foi desempenha- ado com uso de três tipos diferentes de solo amostrados de campos agrícolas na Califórnia como o meio de crescimento de plantas (Figura 16A). Uma densidade de inoculação intermediária foi usada para apro- ximar condições agrícolas realistas. Em 3 semanas, a Cepa 5 colonizou todas as plantas de 1E+06 a 1E+07 CFU/g FW. Após 7 semanas de crescimento das plantas, uma versão evoluída da Cepa 1 exibiu altas taxas de colonização (1E+06 CFU/g FW) em todos os tipos de solo. (Fi- gura 16B).

[00290] Além disso, para avaliar a colonização na complexidade das condições de campo, foi iniciado um teste de campo de 1 acre em San Luis Obispo em junho de 2015 para avaliar os impactos e a colonização de sete das cepas do tipo selvagem em duas variedades de milho de campo. O projeto agronômico e a execução do estudo foram desempe- nhados por uma organização de pesquisa de campo contratada, a Pa- cific Ag Research. Para inoculação, foi usada a mesma técnica de re- vestimento de sementes de cultura de turfa testada no experimento dos métodos de inoculação. Durante o curso da estação de crescimento, amostras de plantas foram coletadas para avaliar a colonização no inte- rior da raiz e do caule. As amostras foram coletadas de três parcelas de réplica de cada tratamento, quatro e oito semanas após o plantio, e de todas as seis réplicas de cada tratamento, pouco antes da colheita, em 16 semanas. Amostras adicionais foram coletadas de todas as seis par- celas de réplica de tratamentos inoculados com a Cepa 1 e Cepa 2, bem como controles não tratados, em 12 semanas. O número de células por grama de peso fresco das raízes lavadas foi avaliado como em outros ensaios de colonização com qPCR e iniciadores específicos da cepa. Duas cepas, Cepa 1 e Cepa 2, mostraram colonização radicular consis- tente e generalizada que atingiu o pico em 12 semanas e depois decli- nou precipitadamente (Figura 16C). Embora a Cepa 2 estivesse pre- sente em números em uma ordem de magnitude inferior à Cepa 1, a mesma foi encontrada em números mais consistentes de planta para planta. Nenhuma cepa parece colonizar efetivamente o interior do caule. Para dar suporte aos dados de colonização de qPCR, ambas as cepas foram reisoladas com sucesso das amostras de raiz com uso de plaque- amento e sequenciamento 16S para identificar isolados da sequência correspondente.

[00291] Exemplos de reprodução de micróbios podem ser resumidos nos esquemas da Figura 17 e da Figura 18. A Figura 17 retrata a re- produção de micróbios em que a composição do microbioma pode ser medida primeiro e uma espécie de interesse é identificada. O metabo- lismo do microbioma pode ser mapeado e enlaçado à genética. Poste- riormente, uma variação genética alvejada pode ser introduzida com uso de métodos incluindo, porém sem limitação, conjugação e recombina- ção, mutagênese química, evolução adaptativa e edição de genes. Mi- cróbios derivados são usados para inocular culturas. Em alguns exem- plos, as culturas com os melhores fenótipos são selecionadas.

[00292] Conforme fornecido na Figura 17, a composição do microbi- oma pode ser medida primeiro e uma espécie de interesse é identifi- cada. O metabolismo do microbioma pode ser mapeado e enlaçado à genética. O metabolismo do nitrogênio pode envolver a entrada de amô- nia (NH4+) da rizosfera no citosol da bactéria por meio do transportador AmtB. Amônia e L-glutamato (L-Glu) são catalisados pela glutamina sin- tetase e ATP em glutamina. A glutamina pode levar à formação de bio- massa (crescimento de plantas) e também pode inibir a expressão do óperon nif. Posteriormente, uma variação genética alvejada pode ser introduzida com uso de métodos incluindo, porém sem limitação, conju- gação e recombinação, mutagênese química, evolução adaptativa e edição de genes. Micróbios derivados são usados para inocular cultu- ras. As culturas com os melhores fenótipos são selecionadas.

[00293] O uso dos termos “um", “uma”, “a" e “o” e referentes seme- lhantes no contexto da descrição da invenção (especialmente no con- texto das reivindicações a seguir) deve ser interpretado de modo a abranger tanto o singular quanto o plural, a menos que indicado de outra forma neste documento ou claramente contradito pelo contexto. Os ter- mos "compreendendo", "tendo", "incluindo" e "contendo" devem ser in- terpretados como termos em aberto (isto é, significando "incluindo, po- rém sem limitação"), a menos que indicado de outra forma. A citação de faixas de valores neste documento visa apenas servir como um método simplificado de se referir individualmente a cada valor separado dentro da faixa, a menos que indicado de outra forma neste documento, e cada valor separado é incorporado ao relatório descritivo como se fosse ci- tado individualmente neste documento. Por exemplo, se a faixa 10 a 15 é divulgada, 11, 12, 13 e 14 também são divulgados. Todos os métodos descritos neste documento podem ser desempenhados em qualquer or- dem adequada, a menos que indicado de outra forma neste documento ou claramente contradito pelo contexto. O uso de todos e quaisquer exemplos, ou linguagem exemplar (por exemplo, “tal como") fornecida neste documento, visa apenas elucidar melhor a invenção e não repre- senta uma limitação no escopo da invenção, a menos que seja reivindi- cado de outra forma. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.

[00294] Embora modalidades preferenciais da presente invenção te- nham sido apresentadas e descritas neste documento, será evidente para aqueles versados na técnica que tais modalidade são fornecidas a título de exemplo apenas. Diversas variações, alterações e substitui- ções ocorrerão agora para os versados na técnica sem se afastar da invenção. Deve-se entender que várias alternativas para as modalida- des da invenção descritas neste documento podem ser usadas na prática da invenção. Pretende-se que as reivindicações a seguir definam o escopo da invenção e que métodos e estruturas dentro do escopo dessas reivin- dicações e seus equivalentes sejam abrangidos pelas mesmas. TABELA 3A

Nome Mínimo Máximo Comprimento Direção lipoproteína CDS de mureína 2.929.898 2.930.134 237 frontal proteína de membrana CDS 5.217.517 5.217.843 327 frontal proteína de aglutinação ao zinco/cádmio CDS 3.479.979 3.480.626 648 frontal proteína veiculadora de acila CDS 4.563.344 4.563.580 237 inversa ompX CDS 4.251.002 4.251.514 513 frontal Proteína de aglutinação ao DNA HU- beta CDS 375.156 375.428 273 frontal sspA CDS 629.998 630.636 639 inversa tatE CDS 3.199.435 3.199.638 204 inversa LexA repressor CDS 1.850.457 1.851.065 609 frontal hisS CDS <3999979 4.001.223 >1.245 frontal TABELA 3B EXEMPLO 8: DELEÇÃO DE GLGA AUMENTA A EXCREÇÃO DE NI-

TROGÊNIO

[00295] A síntese de glicogênio afasta o carbono da glicólise e do ciclo TCA. Diminuir ou abolir a síntese de glicogênio pode resultar em maior fluxo de carbono em direção à glicólise e ao ciclo TCA, levando a uma maior disponibilidade de ATP na célula. Isso pode levar à atividade aumentada da nitrogenase, pois a fixação de nitrogênio requer 16 ATP para reduzir uma molécula de N2 e pode ser limitada pela disponibili- dade de ATP. A glicogênio sintase é codificada pelo gene glgA. A regu- lação decrescente ou a deleção de glgA podem levar a um aumento na atividade de fixação de nitrogênio.

[00296] Para este fim, foram construídas cepas de Kosakonia sac- chari CI006 e Klebsiella variicola nas quais a glgA foi deletada. As cepas 6-1.694, 6-1.744 e 137-1.893 foram submetidas a um ensaio de excre- ção de amônio (AMM), em que a excreção de amônia ao longo do tempo foi medida em condições de fixação de nitrogênio, cultivando células em meio livre de nitrogênio, peletizando as células e medindo amônio livre no caldo sem células; níveis mais altos de excreção de amônio indica- ram maior fixação e excreção de nitrogênio. As cepas 6-1.681 e 137-

1.893 foram submetidas a um ensaio de ARA, conforme descrito anteri- ormente, em meio suplementado com 5mM de fosfato de amônio. A cepa 6-1.694 corresponde à cepa progenitora 6-342. A cepa 6-1.744 corresponde à cepa progenitora 6-923. A cepa 6-1.681 corresponde à cepa progenitora 6-346. A cepa 137-1.893 corresponde à cepa progeni- tora 137-1.586.

[00297] Os dados do ensaio de AMM são mostrados nas Figuras 19A a 20B. As cepas 6-1.694 e 6-1.744 apresentam capacidade aumen- tada de excreção de nitrogênio em comparação com as cepas progeni- toras (Figura 19A). As cepas 6-1.681 exibiram atividade aumentada de ARA em comparação com sua cepa progenitora (Figura 19B). As cepas 137-1.893 exibiram excreção aumentada de amônio (Figura 20A) e ati- vidade da nitrogenase aumentada, conforme medido pelo ARA (Figura 20B). Assim, a redução ou eliminação da síntese de glicogênio nas bac- térias pode aumentar a quantidade de nitrogênio excretado. Detalhes das cepas descritas neste documento podem ser encontrados nas Ta- belas 8 e 9. EXEMPLO 9: MUTAÇÕES DE GLND AUMENTAM A EXCREÇÃO DE

NITROGÊNIO

[00298] GlnD é uma enzima bifuncional para remoção de uridililtrans- ferase/uridilila que atua como o "interruptor" central para a detecção de nitrogênio na célula. Ele contém três domínios distintos: o domínio UTase, que urila as proteínas PII GlnB e GlnK; o domínio de remoção de uridilila (UR), também conhecido como domínio HD, que remove o grupo uriilila das proteínas PII; e dois domínios ACT, que regulam a ati- vidade dos outros dois domínios em resposta à aglutinação de gluta- mina (Figura 21). No excesso de nitrogênio, a glutamina se liga ao do- mínio ACT e o domínio UR é ativado; na falta de nitrogênio, o ACT não está ligado e o domínio UTase está ativo. A sinalização subsequente da proteína PII afeta a transcrição de vários aglomerados de genes, inclu- indo nitrogenase e genes de assimilação de nitrogênio.

[00299] Vários truncamentos e deleções foram desempenhados para ver como os mesmos afetam a fixação e excreção de nitrogênio. Diver- sas mutações de glnD que modificam os domínios UTase, UR e ACT1/2 (detecção de glutamina) levam a aumentos na atividade, conforme me- dido nos ensaios de ARA e excreção de amônio. A Figura 22 demonstra diversas modificações de glnD que levam à excreção aumentada de amônio em K. variicola CI137; a Figura 23 demonstra diversas modifi- cações de glnD que levam ao aumento da excreção de amônio em K. sacchari. EXEMPLO 10: DELEÇÃO DE GLNK AUMENTA A EXCREÇÃO DE NI-

TROGÊNIO

[00300] GlnK é a proteína PII que pode ser uma reguladora pós-tra- dução e pode estar envolvida na síntese de glutamina, que pode ser uma via competitiva da excreção de amônio. Níveis mais altos de GlnK podem reduzir a quantidade de NH4 excretado. A remoção de glnK pode reduzir ou eliminar os efeitos inibitórios na excreção de NH4.

[00301] GlnK foi deletado em uma cepa que já continha uma deleção de nifL::1,2 e uma deleção de glnE. Assim, a deleção de glnK foi intro- duzida em uma cepa que já possuía uma capacidade aumentada de fixar nitrogênio. A cepa com a deleção de glnK é indicada como 137-

2.225, e a cepa progenitora é indicada como 137-2.084 na Figura 24A. Uma análise de AMM foi desempenhada nessas células, de modo que a quantidade de NH4+ excretado por OD por hora (em mM) fosse me- dida. Neste ensaio, mais excreção de NH4+ pode indicar maior atividade de fixação de nitrogênio. Em particular, a cepa 137-2.225 exibiu ativi- dade de fixação de nitrogênio que foi 1,32 vezes maior que a cepa pro- genitora, conforme medido pelo ensaio de AMM. EXEMPLO 11: REGULAÇÃO DECRESCENTE DO GENE GLNA AU-

MENTA A EXCREÇÃO DE AMÔNIO

[00302] A glutamina sintetase (GS) é codificada pelo gene glnA. Uma redução na atividade da GS pode resultar em uma taxa de assimilação de nitrogênio diminuída. Em condições de fixação de nitrogênio, isso pode levar a um acúmulo de amônio intracelular e excreção de amônio.

[00303] Diversas cepas foram construídas nas quais o promotor na- tivo para glnA foi substituído por um promotor conhecido por ser consti- tutivamente expresso em um nível baixo: o promotor dos genes glnB, glnD ou glnE. Espera-se que isso leve a uma diminuição na transcrição de glnA. Em alguns casos, o códon de início de ATG do gene glnA tam- bém foi mutado para GTG para diminuir a taxa de iniciação da tradução da proteína GS. A Figura 24B, Figura 25 e Figura 26 descrevem vários mutantes de CI137 e CI006 nos quais a regulação decrescente do gene glnA levou à excreção aumentada de amônio. EXEMPLO 12: A REGULAÇÃO DECRESCENTE DA GLUTAMATO

SINTASE LEVA À EXCREÇÃO AUMENTADA DE AMÔNIO

[00304] O glutamato serve como o principal reservatório de nitrogê- nio na célula, e a via GS-GOGAT é a via principal para a assimilação de nitrogênio. O óperon gltBD codifica GOGAT. Uma cepa (137-2.215) foi construída na qual o promotor nativo do óperon gltBD foi deletado e substituído por um forte promotor constitutivo. A Figura 27 demonstra como 137-2.215 exibe excreção aumentada de amônio em comparação com o controle progenitor; a Figura 28 demonstra que 137-2.215 exibiu atividade de fixação aumentada de nitrogênio, conforme medido por ARA. EXEMPLO 13: REGULAÇÃO CRESCENTE DO GENE DA GLUTAMI- NASE GLSA2 LEVA À EXCREÇÃO AUMENTADA DE AMÔNIO

[00305] As enzimas da glutaminase clivam uma ligação C-N na glu- tamina, liberando amônio e glutamato. O aumento da atividade da glu- taminase em uma célula pode levar à liberação aumentada de amônio pela glutamina e pela excreção de amônio. O gene glsA2 codifica uma glutaminase. As cepas foram construídas nas quais o promotor nativo do gene glsA2 foi deletado e substituído por uma forte sequência pro- motora. A Figura 29 e a Figura 30 demonstram excreção aumentada de amônio por essas cepas em comparação com os controles da cepa progenitora. EXEMPLO 14: REGULAÇÃO CRESCENTE DE DOMÍNIO DA GLUTA-

MINASE DE ASNB LEVA À EXCREÇÃO DE AMÔNIO AUMENTADA

[00306] O gene asnB codifica uma enzima transaminase que têm dois domínios: um domínio glutaminase e um domínio asparagina sin- tase. A Figura 31 demonstra como a deleção do domínio da asparagina sintase ou a regulação crescente do gene asnB pode levar à excreção aumentada de amônio. EXEMPLO 15: REGULAÇÃO CRESCENTE DE RPON AUMENTA A FI-

XAÇÃO DE NITROGÊNIO

[00307] O rpoN (sigma54) é um fator de iniciação usado para promo- ver a anexação da RNA polimerase em sítios específicos de iniciação. Juntamente com nifA e ihfA/B, o mesmo transcreve nifH. A regulação crescente de rpoN pode permitir níveis aumentados de nifH, o que pode resultar em fixação aumentada de nitrogênio.

[00308] Construíram-se duas cepas de K. variicola CI137 nas quais o rpoN foi regulado de forma crescente deletando seu promotor nativo e substituindo por um forte promotor constitutivo. Os dados são mostra- dos na Figura 32 e na Figura 33. As cepas com a modificação rpoN são indicadas como 137-2.251 e 137-2.285, e a cepa progenitora é in- dicada como 137-2.084.

[00309] Na Figura 32, os dados são mostrados como o logaritmo da base 10 da quantidade de etileno formado por unidade de formação de colônias por hora, de modo que uma quantidade maior de formação de etileno indique mais fixação de nitrogênio. O ensaio foi desempenhado com 5 mM de fosfato de amônio fornecido como fonte de nitrogênio. A cepa 137-2.251 fixou nitrogênio 1,23 vezes melhor que a cepa progeni- tora (p = 0,028), enquanto a cepa 137-2.285 fixou nitrogênio 1,95 vezes melhor que a cepa progenitora (p = 0,031).

[00310] Estes resultados sugerem que a fixação de nitrogênio pode ser aprimorada aumentando a quantidade de polimerase responsável pela transcrição do RNA que codifica a enzima nifH. EXEMPLO 16: REGULAÇÃO CRESCENTE DE OTSB LEVA AO AU-

MENTO DA ATIVIDADE DE FIXAÇÃO DE NITROGÊNIO

[00311] O otsB está envolvido na biossíntese da trealose na célula, e as modificações do otsB podem aprimorar a robustez de uma cepa. Neste documento, as modificações de otsB foram criadas e testadas para determinar se essas modificações impactaram negativamente a fi- xação de nitrogênio nas células.

[00312] Três cepas de bactérias fixadoras de nitrogênio foram modi- ficadas para aumentar a expressão do gene otsB. O promotor nativo do gene otsB foi deletado e substituído por um forte promotor constitutivo. As cepas modificadas são 6-921 e 6-922 (cepa progenitora 6-435) e 6-

1.697 (cepa progenitora 6-923). Um ensaio de ARA foi desempenhado nas cepas modificadas 6-921 e 6-922 (Figura 34). Os dados são mos- trados como logaritmo da base 10 da quantidade de etileno formado por unidade de formação de colônias por hora, de modo que uma quanti- dade maior de formação de etileno indique mais fixação de nitrogênio. O ensaio foi desempenhado com 5 mM de fosfato de amônio fornecido como a fonte de nitrogênio. O CI006 foi usado como controle negativo. Surpreendentemente, a atividade de fixação de nitrogênio da cepa mo- dificada é aumentada em comparação com o progenitor.

[00313] Um ensaio de excreção de amônio foi desempenhado na cepa 6-1.697. Os dados são mostrados como a quantidade de NH4+ excretado (mM/OD) por hora, de modo que um valor mais alto indique maior excreção de nitrogênio. Os dados representam experimentos con- duzidos em dias diferentes. Os dados são mostrados na Figura 35. A atividade de excreção de nitrogênio foi aumentada em comparação com os progenitores. Surpreendentemente, a atividade de excreção de amô- nio da cepa modificada é aumentada em comparação com o progenitor. EXEMPLO 17: PHOB PODE SER MODIFICADO PARA AUMENTAR A

COLONIZAÇÃO DA RIZOSFERA

[00314] A colonização de algumas cepas pode estar associada à for- mação de biofilme, que pode ser influenciada pela sinalização de fósforo que, em alguns casos, pode ser influenciada pela alteração da expres- são de genes de sinalização de fósforo, tais como phoB. Assim, altera- ções no phoB podem afetar a colonização de algumas cepas de bacté- rias.

[00315] Uma modificação em phoB (cepa 137-1.901) foi criada em uma cepa bacteriana com alta excreção de nitrogênio, medida por um ensaio de AMM. A cepa progenitora foi indicada como 137-1.586.

[00316] Um ensaio de AMM foi desempenhado nas células para de- terminar se as modificações afetaram negativamente a atividade de ex-

creção de nitrogênio das células. As modificações não reduziram a ati- vidade de excreção de nitrogênio das células (Figura 36A). Assim, o phoB pode ser modificado sem reduzir a excreção de nitrogênio.

[00317] Foi desempenhado um ensaio de colonização da raiz do mi- lho para determinar se as modificações afetaram a capacidade da cepa de colonizar as raízes das plantas. Resumidamente, as plantas foram inoculadas com cerca de 109 células após a germinação e deixadas crescer por 4 semanas, ponto em que foram colhidas. Amostras da raiz seminal combinada e do primeiro nó foram colhidas de cerca de 2,54 cm a 5,08 cm (1 a 2 polegadas) abaixo da coroa da planta. Após a co- leta, as amostras foram lisadas e o qPCR foi desempenhado para de- terminar o número de células presentes por grama de tecido radicular (UFC/gfw). A cepa 137-1.901 exibiu aumento da colonização em com- paração com a cepa progenitora 137-1.586, conforme visto na Figura 36B. Assim, as modificações de phoB podem aumentar a colonização das células na colonização por raiz da cepa mutante que foi maior do que aquela da cepa progenitora neste caso. EXEMPLO 18: YJBE2 PODE SER MODIFICADO PARA AUMENTAR A

COLONIZAÇÃO DA RIZOSFERA

[00318] Os genes yjbE podem promover a secreção de exopolissa- carídeos, o que pode aumentar a fixação radicular de certas cepas.

[00319] Um ensaio de colonização da raiz do milho foi desempe- nhado para determinar se a modificação de yjbE afetou a capacidade da cepa de colonizar as raízes das plantas. Resumidamente, as plantas foram inoculadas com cerca de 109 células após a germinação e deixa- das crescer por 4 semanas, ponto em que foram colhidas. Amostras da raiz seminal combinada e do primeiro nó foram colhidas de cerca de 2,54 cm a 5,08 cm (1 a 2 polegadas) abaixo da coroa da planta. Após a coleta, as amostras foram lisadas e o qPCR foi desempenhado para determinar o número de células presentes por grama de tecido radicular

(UFC/gfw). A cepa 6-1.779 exibiu aumento da colonização em compa- ração com a cepa progenitora 6-848, conforme visto na Figura 37. EXEMPLO 19: OTSB O otsB está envolvido na biossíntese da trealose na célula, e as modifi- cações do otsB podem aprimorar a robustez de uma cepa. Neste docu- mento, as modificações de otsB foram criadas e testadas para determi- nar se essas modificações impactaram negativamente a fixação de ni- trogênio nas células.

[00320] Uma cepa de bactérias fixadoras de nitrogênio foi modificada para aumentar a expressão do gene otsB. Um ensaio de ARA foi de- sempenhado nas células modificadas. Os dados são mostrados como logaritmo da base 10 da quantidade de etileno formado por unidade de formação de colônias por hora, de modo que uma quantidade maior de formação de etileno indique mais fixação de nitrogênio. O ensaio foi de- sempenhado com 0 mM (painel superior) ou 5 mM (painel inferior) de fosfato de amônio fornecido como a fonte de nitrogênio. As cepas mo- dificadas são 6-1.697 e 6-1.698 (cepa progenitora 6-923). O CI006 foi usado como controle negativo. Os dados são mostrados na Figura 38A. A atividade de fixação de nitrogênio da cepa modificada é aumentada em comparação com o progenitor. Assim, as modificações de otsB po- dem ser desempenhadas sem afetar negativamente a atividade de fixa- ção de nitrogênio das células.

[00321] Foi desempenhado um ensaio de excreção de amônio nas células modificadas. Os dados são mostrados como a quantidade de NH4+ excretado (mM/OD) por hora, de modo que um valor mais alto indique maior excreção de nitrogênio. Os dados representam experi- mentos conduzidos em dias diferentes. Os dados são mostrados na Fi- gura 38B. A atividade de excreção de nitrogênio foi aumentada em com- paração com os progenitores. Assim, as modificações de otsB podem ser desempenhadas sem afetar negativamente a atividade de fixação de nitrogênio das células. EXEMPLO 20: MUTAÇÃO CYSZ AUMENTA A FIXAÇÃO DE NITRO-

GÊNIO

[00322] O CysZ medeia a absorção de sulfato, fornecendo enxofre utilizado posteriormente para a síntese de compostos contendo enxofre em células bacterianas, incluindo cofatores requeridos para a atividade da nitrogenase. Aumentar a expressão de um gene de transporte de enxofre, tal como o cysZ, pode aumentar a quantidade de complexos de nitrogenase funcionais. Para este fim, duas cepas de Kosakonia sac- chari foram criadas com modificações de cysZ, que são anotadas como 6-1.691 e 6-916. Foram desempenhados ensaios de redução de aceti- leno (ARA) e os dados foram comparados com a cepa progenitora sem mutações no cysZ (as cepas 6-346 e 6-435 foram progenitoras para 6-

1.691 e 6-916, respectivamente). A cepa CI006 foi usada como controle negativo, e os ensaios de ARA foram desempenhados de forma idêntica para ambas as cepas, exceto que 6-1.691 e seu progenitor foram testa- dos em 5mM de fosfato de amônio (Figura 39A), enquanto 6-916 e seu progenitor foram testados em 5mM de glutamina (Figura 39B). Ambas as cepas exibem atividade aumentada da nitrogenase sobre as cepas WT e progenitora. O aumento exibido por 6-1.691 foi de cerca de 14 vezes, enquanto a cepa 6-916 teve uma atividade de fixação de nitro- gênio cerca de 6 vezes maior que aquela de seu progenitor. EXEMPLO 21: FORMAÇÃO DE BIOFILME

[00323] A formação de biofilme pode influenciar a quantidade de ni- trogênio fornecida a uma planta associada. Um aumento na formação de biofilme na raiz de uma planta pode aumentar a quantidade de nitro- gênio fornecida à planta.

[00324] Alguns genes podem regular a formação de biofilme. Por exemplo, o smZ pode ser um regulador negativo da regulação do bio- filme. A mutação do smZ de modo que o smZ tenha função reduzida ou eliminada pode aumentar a formação de biofilme em bactérias. A muta- gênese pode ser desempenhada para mutar smZ em cepas com excre- ção aumentada de nitrogênio e atividade de fixação para criar uma bi- blioteca de bactérias mutantes smZ.

[00325] Algumas proteínas podem promover a formação de biofilme. Por exemplo, grandes proteínas de adesão, incluindo lapA, podem pro- mover a formação de biofilme. Um ou mais promotores que regulam a expressão de lapA podem ser regulados de forma crescente, de modo que mais lapA seja produzido, conforme detectado por western blot.

[00326] Cepas com mutações em smZ e regulação crescente de lapA podem ser geradas para gerar uma biblioteca de cepas smZ/lapA para teste. As cepas de smZ/LapA podem ter uma formação aumentada de biofilme e podem ter capacidade de formação de biofilme que é maior do que as cepas com uma mutação em smZ ou mutação em lapA iso- lada.

[00327] As cepas podem ser cultivadas em tampão de lisogenia (LB) e inoculadas no solo com uma muda. As mudas, o solo e a cepa bacte- riana podem estar em um vaso, em um campo, em ambientes fechados ou ao ar livre. As mudas podem ser plantadas na primavera, verão, ou- tono ou inverno. O ar pode ter cerca de 0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% de umidade. Pode estar chovendo, ene- voado, nublado ou ensolarado. A temperatura pode ser de cerca de 4ºC, 10ºC, 15ºC, 20ºC, 25ºC, 30ºC, 35ºC, 40ºC ou 45ºC. As mudas podem ser plantadas ao amanhecer, de manhã, ao meio-dia, à tarde, ao anoi- tecer, à noite ou durante a madrugada. A muda pode ser deixada para crescer por cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20 ou 30 dias. Após o tempo decorrido, a planta pode ser desenterrada e a quantidade de bi- ofilme nas raízes pode ser medida. EXEMPLO 22: SENSIBILIDADE AO OXIGÊNIO

[00328] A sensibilidade ao oxigênio das enzimas nitrogenase pode afetar a fixação de nitrogênio, a excreção de nitrogênio ou ambas. Dimi- nuir a sensibilidade ao oxigênio de uma enzima nitrogenase pode au- mentar a atividade de fixação de nitrogênio, aumentar a atividade de excreção de nitrogênio ou ambas. Uma cepa de bactérias que compre- ende uma ou mais enzimas da nitrogenase com oxigênio diminuído pode ser criada de modo que a cepa exiba atividade de fixação de ni- trogênio aumentada ou atividade de excreção de nitrogênio aumentada.

[00329] Modificações genéticas podem ser desempenhadas em cé- lulas bacterianas com atividade de fixação de nitrogênio de tipo selva- gem ou geneticamente aprimorada, atividade de excreção de nitrogênio ou ambas. Modificações genéticas podem ser introduzidas nas células, de modo que um ou mais genes da enzima nitrogenase sejam mutados por um protocolo de mutagênese, e uma biblioteca dessas cepas pode ser criada.

[00330] Cada cepa da biblioteca pode ser submetida a um ensaio de sensibilidade ao oxigênio. Para isso, os ensaios de AMM e ARA podem ser desempenhados sob condições com concentrações variáveis de oxi- gênio. As concentrações de oxigênio podem variar de 1 µM a 6 µM. Os dados podem ser analisados para determinar se as cepas exibem me- nor atividade de excreção ou fixação de nitrogênio como uma função da concentração de oxigênio. Algumas cepas com enzimas nitrogenase modificadas podem apresentar pouca ou nenhuma redução na atividade de excreção ou de fixação de nitrogênio à medida que a concentração de oxigênio aumenta. EXEMPLO 23: ALTERANDO MODA, MODB, MODE

[00331] A via de absorção de molibdênio pode se referir à via meta- bólica nas bactérias, o que permite a absorção de molibdênio na célula. O molibdênio pode atuar como um cofator na fixação de nitrogênio. Au- mentar a absorção de molibdênio de células pode aumentar a fixação de nitrogênio, a excreção de nitrogênio ou ambos.

[00332] As principais enzimas na via de transporte de molibdênio po- dem incluir modA, modB e modE. A modificação ou a regulação cres- cente de qualquer um, dois ou três desses genes em uma cepa bacteri- ana pode aumentar a absorção de molibdênio nas células e aumentar a fixação de nitrogênio, a excreção de nitrogênio ou ambas nas células.

[00333] Modificações genéticas podem ser desempenhadas nesses genes em células bacterianas, de modo que as modificações resultem em um transporte de molibdênio aumentado. Para identificar essas mo- dificações, a mutagênese pode ser desempenhada dentro e ao redor dos sítios ativos dos genes que codificam modA, modB ou modC. Uma biblioteca de mutantes pode ser construída para cada gene. Essas bi- bliotecas podem ser, então, triadas quanto a maior atividade de absor- ção de molibdênio. Essas bibliotecas podem ser criadas a partir de cé- lulas do tipo selvagem ou de células que já foram modificadas para exi- bir fixação aumentada de nitrogênio, excreção aumentada de nitrogênio ou ambas.

[00334] Modificações genéticas podem ser desempenhadas nessas células, de modo que um ou mais genes na via de absorção de molib- dênio sejam regulados de forma crescente. Uma biblioteca de variantes também pode ser construída de modo que a atividade do promotor para um ou mais genes na via de absorção de molibdênio seja aumentada. Por exemplo, o promotor de modABC pode ser ajustado geneticamente para aumentar a transcrição. A transferência de Western pode ser usada para determinar quais cepas têm expressão aumentada de um ou mais genes de absorção de molibdênio, e essas cepas podem ser variantes de interesse.

[00335] Para triar o aumento da atividade de absorção de molibdê- nio, cada mutante ou variante de interesse, bem como a cepa progeni- tora não mutada de cada cepa, podem ser inoculados e cultivados em três cavidades de uma placa de 96 cavidades em meio com LB. Quando as células atingem OD = 0,8, uma das cavidades de cada mutante pode ser colhida, de modo que as células sejam peletizadas, o excesso de LB seja removido por lavagem e as células sejam ressuspensas, lisadas e preparadas para espectroscopia em uma placa de 96 cavidades. O teor de molibdênio pode ser medido com uso de espectroscopia para estabelecer o teor basal de molibdênio nas amostras. Molibdênio pode ser adicionado às amostras restantes como molibdato de tetraoxianion em LB ou LB sozinho, de modo que a quantidade adicionada seja 10% ou menos do volume total em cada cavidade. A concentração final de molibdênio em cada cavidade do ensaio pode ser de 10 pM, 100 pM, 1 nM, 10nM ou 100 nM, e mais de uma concentração pode ser testada. O ensaio pode ser conduzido durante um ou mais de 1 segundo, 10 se- gundos, 30 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 mi- nutos, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos e 60 minutos.

[00336] Primeiro, para cada concentração, a quantidade de molibdê- nio transportada para cada célula como uma função do tempo pode ser plotada para determinar uma duração ideal para o ensaio. A duração ideal pode ser um intervalo de tempo em que o estado estacionário não foi atingido e a taxa de reação ainda é linear. Então, para a duração ideal, a quantidade de molibdênio transportada para cada célula como uma função da concentração pode ser plotada e uma análise de Micha- elis-Menten pode ser desempenhada. Cepas mutantes ou variantes de interesse que mostram um aumento significativo (p<0,05) no transporte de molibdênio sobre a cepa progenitora não mutada e não modificada, conforme determinado pela comparação de Km, podem ser seleciona- dos para ensaios adicionais.

[00337] Em seguida, cada cepa selecionada para ensaios adicionais pode ser submetida a um ensaio de AMM, bem como a um ensaio de ARA, conforme descrito neste documento, para medir a excreção e fi- xação de nitrogênio, respectivamente. Uma ou mais dessas mutações ou variantes podem aumentar a AMM, ARA ou ambas de uma ou mais dessas cepas bacterianas. EXEMPLO 24: AUMENTAR O TRANSPORTE DE FERRO PODE AU-

MENTAR A FIXAÇÃO DE NITROGÊNIO

[00338] A via de absorção de ferro pode se referir à via metabólica nas bactérias, o que permite a absorção de ferro na célula. O ferro pode atuar como um cofator para promover a fixação de nitrogênio. Aumentar a absorção de ferro pelas células pode aumentar a fixação de nitrogênio, a excreção de nitrogênio ou ambos.

[00339] As principais enzimas na via de transporte de ferro podem incluir exbA, exbB e tonB. A modificação ou regulação crescente de qualquer um, dois ou três desses genes em uma cepa bacteriana pode aumentar a absorção de ferro nas células e aumentar a fixação de nitro- gênio, a excreção de nitrogênio ou ambas nas células.

[00340] Modificações genéticas podem ser desempenhadas nesses genes em células bacterianas, de modo que as modificações resultem em um transporte de ferro aumentado. Para identificar essas modifica- ções, a mutagênese pode ser desempenhada dentro e ao redor dos sí- tios ativos dos genes que codificam exbA, exbB ou tonB. Uma biblioteca de mutantes pode ser construída para cada gene. Essas bibliotecas po- dem ser, então, triadas quanto à atividade de absorção de ferro aumen- tada. Essas bibliotecas podem ser criadas a partir de células do tipo selvagem ou de células que já foram modificadas para exibir fixação aumentada de nitrogênio, excreção aumentada de nitrogênio ou ambas.

[00341] Modificações genéticas podem ser desempenhadas nessas células, de modo que um ou mais genes na via de absorção de ferro sejam regulados de forma crescente. Uma biblioteca de variantes tam- bém pode ser construída de modo que a atividade do promotor para um ou mais genes na via de absorção de ferro seja aumentada. O Western blotting pode ser usado para determinar quais cepas têm expressão au- mentada de um ou mais genes de absorção de ferro, e essas cepas podem ser variantes de interesse.

[00342] Para triar o aumento da atividade de absorção de ferro, cada mutante ou variante de interesse, bem como a cepa progenitora não mutada de cada cepa, podem ser inoculados e cultivados em três cavi- dades de uma placa de 96 cavidades em meio com LB. Quando as cé- lulas atingem OD = 0,8, uma das cavidades de cada mutante pode ser colhida, de modo que as células sejam peletizadas, o excesso de LB seja removido por lavagem e as células sejam ressuspensas, lisadas e preparadas para espectroscopia em uma placa de 96 cavidades. O teor de ferro pode ser medido com uso de espectroscopia para estabelecer o teor basal de ferro nas amostras. Pode-se adicionar ferro às amostras restantes como FeSO4 em LB ou LB sozinho, de modo que a quanti- dade adicionada seja 10% ou menos do volume total em cada cavidade. 0,1 mM de ácido acético (concentração final) pode ser incluído para aju- dar na solubilidade do ferro. A concentração final de ferro em cada ca- vidade no ensaio pode ser uma dentre 10 pM, 100 pM, 1 nM, 10nM, 100 nM, 1 µM, 10 µM ou 100 µM, e mais de uma concentração pode ser testada. O ensaio pode ser conduzido durante um ou mais de 1 se- gundo, 10 segundos, 30 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos e 60 minutos.

[00343] Primeiro, para cada concentração, a quantidade de ferro transportada para cada célula como uma função do tempo pode ser plo- tada para determinar uma duração ideal para o ensaio. A duração ideal pode ser um intervalo de tempo em que o estado estacionário não foi atingido e a taxa de reação ainda é linear. Então, para a duração ideal, a quantidade de ferro transportada para cada célula como uma função da concentração pode ser plotada e uma análise de Michaelis-Menten pode ser desempenhada. As cepas mutantes ou variantes de interesse que mostram um aumento significativo (p <0,05) no transporte de ferro em relação à cepa progenitora não mutada e não modificada, conforme determinado pela comparação Km, podem ser selecionadas para en- saios adicionais.

[00344] Em seguida, cada cepa selecionada para ensaios adicionais pode ser submetida a um ensaio de AMM, bem como a um ensaio de ARA, conforme descrito neste documento, para medir a excreção e fi- xação de nitrogênio, respectivamente. Uma ou mais dessas mutações ou variantes podem aumentar a AMM, ARA ou ambas de uma ou mais dessas cepas bacterianas. EXEMPLO 25: AUMENTO DOS GENES DE BIOSSÍNTESE DE SIDE-

RÓFOROS PODE AUMENTAR A FIXAÇÃO DE NITROGÊNIO

[00345] Sideróforos yhf ou moléculas quelantes de ferro podem influ- enciar a absorção de ferro nas bactérias. Aumentar a produção de side- róforos yhf pode aumentar a absorção de ferro nas bactérias. Modifica- ções nos genes sideróforos, incluindo yhfA, yusV, sbnA, yfiZ, fiu e fur, podem aumentar a produção de sideróforos de yhf, que, por sua vez, podem aumentar a absorção de ferro nas células. Essas modificações podem levar à fixação ou excreção aumentada de nitrogênio.

[00346] Modificações genéticas podem ser desempenhadas nesses genes em células bacterianas, de modo que as modificações resultem em um aumento da produção de sideróforos. Para identificar essas mo- dificações, a mutagênese pode ser desempenhada dentro e ao redor dos sítios ativos dos genes que codificam yhfA, yusV, sbnA, yfiZ, fiu ou fur. Uma biblioteca de mutantes pode ser construída para cada gene. Essas bibliotecas podem ser, então, triadas quanto à produção aumen- tada de sideróforos. Essas bibliotecas podem ser criadas a partir de cé- lulas do tipo selvagem ou de células que já foram modificadas para exi- bir fixação aumentada de nitrogênio, excreção aumentada de nitrogênio ou ambas. Para triar a produção aumentada de sideróforos, cada mu- tante pode ser cultivado até OD = 0,8 e, depois, pode-se acrescentar uma quantidade excessiva, mas não tóxica de precursores de siderófo- ros e cada mutante pode ser incubado por 30 minutos ou 60 minutos. A quantidade de sideróforos produzidos após o período de tempo alocado pode ser normalizada, e as cepas que exibem maior produção de side- róforos podem ser triadas quanto ao transporte aumentado de ferro.

[00347] Para triar o aumento da atividade de absorção de ferro, cada mutante ou variante de interesse, bem como a cepa progenitora não mutada de cada cepa, podem ser inoculados e cultivados em três cavi- dades de uma placa de 96 cavidades em meio com LB. Quando as cé- lulas atingem OD = 0,8, uma das cavidades de cada mutante pode ser colhida, de modo que as células sejam peletizadas, o excesso de LB seja removido por lavagem e as células sejam ressuspensas, lisadas e preparadas para espectroscopia em uma placa de 96 cavidades. O teor de ferro pode ser medido com uso de espectroscopia para estabelecer o teor basal de ferro basal nas amostras. Pode-se adicionar ferro às amostras restantes como FeSO4 em LB ou LB sozinho, de modo que a quantidade adicionada seja 10% ou menos do volume total em cada cavidade. 0,1 mM de ácido acético (concentração final) pode ser inclu- ído para ajudar na solubilidade do ferro. A concentração final de ferro em cada cavidade no ensaio pode ser uma dentre 10 pM, 100 pM, 1 nM, 10nM, 100 nM, 1 µM, 10 µM ou 100 µM, e mais de uma concentração pode ser testada. O ensaio pode ser conduzido durante um ou mais de 1 segundo, 10 segundos, 30 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos e 60 minutos.

[00348] Primeiro, para cada concentração, a quantidade de ferro transportada para cada célula como uma função do tempo pode ser plo- tada para determinar uma duração ideal para o ensaio. A duração ideal pode ser um intervalo de tempo em que o estado estacionário não foi atingido e a taxa de reação ainda é linear. Então, para a duração ideal, a quantidade de ferro transportada para cada célula como uma função da concentração pode ser plotada e uma análise de Michaelis-Menten pode ser desempenhada. As cepas mutantes ou variantes de interesse que mostram um aumento significativo (p <0,05) no transporte de ferro em relação à cepa progenitora não mutada e não modificada, conforme determinado pela comparação Km, podem ser selecionadas para en- saios adicionais.

[00349] Em seguida, cada cepa selecionada para ensaios adicionais pode ser submetida a um ensaio de AMM, bem como a um ensaio de ARA, conforme descrito neste documento, para medir a excreção e fi- xação de nitrogênio, respectivamente. Uma ou mais dessas mutações ou variantes podem aumentar a AMM, ARA ou ambas de uma ou mais dessas cepas bacterianas. EXEMPLO 26: DCTA1 E DCTA2

[00350] O dctA1 e o dctA2 são responsáveis pelo transporte aeróbico de dicarboxilatos fumarato, L- e D-malato e, em menor extensão, succi- nato, do periplasma através da membrana interna. Modificações nesses genes podem influenciar a colonização de micróbios.

[00351] Modificações em dctA1 (cepa 137-1.861) e dctA2 (cepa 137-

1.905) foram criadas em uma cepa com alta excreção de nitrogênio, medida por um ensaio de AMM. A cepa progenitora foi indicada como 137-1.905.

[00352] Um ensaio de AMM foi desempenhado nas células para deter- minar se as modificações afetaram negativamente a atividade de excreção de nitrogênio das células. As modificações não reduziram a atividade de excreção de nitrogênio das células (Figura 40A). Assim, o dctA1 e o dctA2 podem ser modificados sem reduzir a excreção de nitrogênio.

[00353] Um ensaio de formação de colônias foi desempenhado nas células com uso de qPCR para determinar se as modificações afetaram as propriedades de formação de colônias das células. Resumidamente, as plantas foram inoculadas com cerca de 109 células após a germina- ção e deixadas crescer por 4 semanas, ponto em que foram colhidas. Amostras da raiz seminal combinada e do primeiro nó foram colhidas de cerca de 2,54 cm a 5,08 cm (1 a 2 polegadas) abaixo da coroa da planta. Após a coleta, as amostras foram lisadas e qPCR foi desempenhado para determinar a CFU/gfw. Os dados são mostrados na Figura 40B. Ambas as cepas apresentaram colonização aumentada. Assim, modifi- cações de dctA1 e dctA2 podem aumentar a colonização nas células. EXEMPLO 27: AUMENTANDO A TOLERÂNCIA À DESSECAÇÃO

[00354] Aprimorar a tolerância à dessecação pode aumentar a colo- nização de uma cepa usada em um revestimento de sementes ou outra aplicação a seco em uma planta ou campo. Um micróbio geneticamente modificado será criado compreendendo um promotor de arabinose ope- racionalmente enlaçado a um gene rpoE. O micróbio geneticamente mo- dificado e o controle progenitor não geneticamente modificado serão cultivados em meios suplementados com arabinose por 48 horas antes de serem dessecados. Após a dessecação, uma porção de cada uma das cepas geneticamente modificadas e não geneticamente modifica- das será reativada em meios que não contenham arabinose, e o número de micróbios nos meios após 24 horas será analisado. O meio que con- tém a cepa geneticamente modificada conterá mais micróbios do que o meio que contém a cepa progenitora não geneticamente modificada.

[00355] Micróbios dessecados serão aplicados em sementes de mi- lho e plantados no solo, com falta de arabinose, em estufa, em condi- ções adequadas para a germinação das sementes de milho. Após 4 se- manas, as mudas serão colhidas e será avaliado o número de unidades formadoras de colônias dos micróbios geneticamente modificados e não geneticamente modificados nas raízes das plantas. As plantas expostas aos micróbios modificados geneticamente serão associadas a mais mi- cróbios do que as plantas expostas à cepa progenitora não genetica- mente modificada. EXEMPLO 28: ALTERAÇÃO DE RBSS NIFA AUMENTA A TRANSCRI-

ÇÃO DE NIFH

[00356] As sequências promotoras-RBS inseridas a montante de nifA levam a razões aumentadas de transcrição de nifH:nifA, indicando um au- mento na quantidade de proteína NifA ativa devido à força aumentada do RBS inserido, levando a maiores taxas de iniciação da tradução de NifA.

[00357] As cepas foram geradas pela deleção do gene nifL e pela inserção de uma sequência a montante do nifA que continha o promotor e o sítio de aglutinação ao ribossomo (RBS) de um gene encontrado alhures no genoma do hospedeiro. Duas réplicas biológicas foram culti- vadas durante a noite em meio rico e, depois, subcultivadas em meio mínimo suplementado com 10 mM de glutamina. A cultura resultante foi dividida e usada para inocular uma cultura anaeróbica em meio com ARA sem fonte fixa de nitrogênio ou 10mM de glutamina. Após cinco horas de cultura anaeróbica, uma amostra de cada cultura foi coletada e o RNA extraído, submetido à transcrição reversa para gerar cDNA e analisado por qPCR para medir a transcrição de nifA e nifH. Os transcritos dos genes de interesse foram normalizados para o gene de manutenção helD, que mostra transcrição consistente em diferentes condições de ni- trogênio. Os dados normalizados resultantes para as quatro amostras fo- ram plotados para mostrar a relação entre a transcrição de nifA e a trans- crição de nifH em cada cepa. As cepas remodeladas nas Figuras 41A e 41B mostram uma inclinação aumentada em uma linha linear de melhor ajuste, plotando a transcrição nifH sobre nifA, indicando que cada transcri- ção nifA resulta em um número maior de transcritos nifH nessas cepas devido a um aumento na taxa de iniciação da tradução de NifA. TABELA 8: CEPAS DESCRITAS NESTE DOCUMENTO

Substituir: bp- pb TABELA 9: OUTRAS CEPAS DESCRITAS NESTE DOCUMENTO ID da Descrição do DNA Genótipo Linhagem Status de cura cepa mutagênico cromossômico Progenitor do tipo selvagem Kosakonia sac- CI006 CI006 WT N/D cari

CI137 CI137 Progenitor do tipo selvagem K. variicola WT N/D

Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene infC inserido (PinfC) a montante de nifA.

Deleção dos Mutante de 1.647pb após o códon de início do gene 137-1.036 ΔnifL::PinfC não curado CI137 glnE que contém o domínio de remoção de adenilila de glutamato-amônia-ligase-adeni- lil-transferase adenililtransferase (ΔglnE- AR_KO2).

ID da Descrição do DNA Genótipo Linhagem Status de cura cepa mutagênico cromossômico Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene ompX inserido (Prm5) a montante de nifA. Deleção dos Mutante de ΔnifL::Prm5 6-412 1.287pb após o códon de início do gene Curado CI006 ΔglnE-AR_KO1 glnE que contém o domínio de remoção de adenilila de glutamato-amônia-ligase adenilil- transferase (ΔglnE-AR_KO1). Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene lpp inserido (Prm1) a montante de nifA. Deleção dos ΔnifL::Prm1 Mutante de 1.287pb após o códon de início do gene 6-435 ΔglnE-AR_KO1, CI006 glnE que contém o domínio de remoção de ΔamtB adenilila de glutamato-amônia-ligase adenilil- transferase (ΔglnE-AR_KO1). Deleção de amtB CDS inteiro. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene lpp inserido (Prm1) a montante de nifA. Deleção dos

1.287pb após o códon de início do gene Mutante de ΔnifL::Prm,1 6-1.691 glnE que contém o domínio de remoção de Não curado CI006 ΔglnE-AR_KO1, cysZ::Prm1 adenilila de glutamato-amônia-ligase adenilil- transferase (ΔglnE-AR_KO1). Deleção de 150pb a montante do gene cysZ e inserção de Prm1 diretamente a montante de cysZ. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene lpp inserido (Prm1) a montante de nifA. Deleção dos Mutante de ΔnifL:: Prm1, 6-346 1.287pb após o códon de início do gene Não curado CI006 ΔglnE-AR_KO1S glnE que contém o domínio de remoção de adenilila de glutamato-amônia-ligase adenilil- transferase (ΔglnE-AR_KO1). Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene lpp inserido (Prm1) a montante de nifA. Deleção dos

1.287pb após o códon de início do gene glnE que contém o domínio de remoção de ΔnifL::Prm1 Mutante de adenilila de glutamato-amônia-ligase adenilil- 6-923 ΔglnE-AR_KO1, Não curado CI006 transferase (ΔglnE-AR_KO1). Deleção de ΔamtB, treZ::Prm2 amtB CDS inteiro. Deleção do promotor treZ nativo e inserção de um fragmento (Prm2), da região a montante de PROKKA_04751 (uma proteína hipotética), diretamente a montante de treZ. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene ompX inserido (Prm5) a montante de nifA. Deleção dos ΔnifL::Prm5 Mutante de 1.287pb após o códon de início do gene 6-1.694 ΔglnE-AR_KO1, Não curado CI006 glnE que contém o domínio de remoção de ΔglgA adenilila de glutamato-amônia-ligase adenilil- transferase (ΔglnE-AR_KO1). Deleção de glgA CDS inteiro. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene ompX inserido (Prm5) e deleção dos 1.287pb após o códon Mutante de ΔnifL::Prm5 6-342 de início do gene glnE que contém o domí- Não curado CI006 ΔglnE-AR_KO1 nio de remoção de adenilila da glutamato- amônia-ligase adenililtransferase (ΔglnE- AR_KO1). Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene lpp inserido ΔnifL::Prm1 Mutante de 6-1.681 (Prm1) a montante de nifA. Deleção dos ΔglnE-AR_KO1, Não curado CI006

1.287pb após o códon de início do gene ΔglgA glnE que contém o domínio de remoção de

ID da Descrição do DNA Genótipo Linhagem Status de cura cepa mutagênico cromossômico adenilila de glutamato-amônia-ligase adenilil- transferase (ΔglnE-AR_KO1). Deleção de glgA CDS inteiro.

Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene lpp inserido (Prm1) a montante de nifA. Deleção dos Mutante de ΔnifL::Prm1 6-404 1.287pb após o códon de início do gene Curado CI006 ΔglnE-AR_KO1 glnE que contém o domínio de remoção de adenilila de glutamato-amônia-ligase adenilil- transferase (ΔglnE-AR_KO1). Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene lpp inserido (Prm1) a montante de nifA. Deleção dos

1.287pb após o códon de início do gene ΔnifL::Prm1 Mutante de glnE que contém o domínio de remoção de 6-921 ΔglnE-AR_KO1, Não curado CI006 adenilila de glutamato-amônia-ligase adenilil- ΔamtB, otsB::Prm1 transferase (ΔglnE-AR_KO1). Deleção de amtB CDS inteiro. Deleção do promotor na- tivo otsB e inserção de Prm1 diretamente a montante de ostB. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene lpp inserido (Prm1) a montante de nifA. Deleção dos

1.287pb após o códon de início do gene glnE que contém o domínio de remoção de ΔnifL::Prm1 Mutante de adenilila de glutamato-amônia-ligase adenilil- 6-922 ΔglnE-AR_KO1, Não curado CI006 transferase (ΔglnE-AR_KO1). Deleção de ΔamtB, otsB::Prm2 amtB CDS inteiro. Deleção do promotor na- tivo de otsB e inserção de um fragmento (Prm2), da região a montante de PROKKA_04751 (uma proteína hipotética), diretamente a montante de otsB. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene lpp inserido (Prm1) a montante de nifA. Deleção dos

1.287pb após o códon de início do gene glnE que contém o domínio de remoção de ΔnifL::Prm1 Mutante de adenilila de glutamato-amônia-ligase adenilil- ΔglnE-AR_KO1, 6-1.744 não curado CI006 transferase (ΔglnE-AR_KO1). Deleção de ΔamtB, ΔglgA, amtB CDS inteiro. Deleção de glgA CDS in- treZ::Prm2 teiro. Deleção do promotor treZ nativo e in- serção de um fragmento (Prm2), da região a montante de PROKKA_04751 (uma proteína hipotética), diretamente a montante de treZ. Interrupção do gene nifL com um fragmento Mutante de 6-322 da região a montante do gene lpp inserido ΔnifL::Prm1 não curado CI006 (Prm1) a montante de nifA. Interrupção do gene nifL com um fragmento Mutante de 6-400 da região a montante do gene lpp inserido ΔnifL::Prm1 curado CI006 (Prm1) a montante de nifA. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene lpp inserido (Prm1) a montante de nifA. Deleção dos ΔnifL::Prm1, Mutante de 1.647pb após o códon de início do gene 6-848 ΔglnE-AR_KO2, Curado CI006 glnE que contém o domínio de remoção de ΔamtB adenilila de glutamato-amônia-ligase-adeni- lil-transferase adenililtransferase (ΔglnE- AR_KO2). Deleção de amtB CDS inteiro. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene cspE inserido Mutante de ΔnifL::Prm1.2 137-2.084 (Prm1.2) a montante de nifA. Deleção dos curado CI137 ΔglnE-AR_KO2

1.647pb após o códon de início do gene glnE que contém o domínio de remoção de

ID da Descrição do DNA Genótipo Linhagem Status de cura cepa mutagênico cromossômico adenilila de glutamato-amônia-ligase-adeni- lil-transferase adenililtransferase (ΔglnE- AR_KO2).

Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene cspE inserido (Prm1.2) a montante de nifA. Deleção dos

1.647pb após o códon de início do gene glnE que contém o domínio de remoção de ΔnifL::Prm1.2 Mutante de adenilila de glutamato-amônia-ligase-adeni- 137-2.251 ΔglnE-AR_KO2, curado CI137 lil-transferase adenililtransferase (ΔglnE- rpoN::Prm8.2 AR_KO2). A deleção do promotor rpoN na- tivo e a inserção de um fragmento (Prm8.2), encontraram 77pb após o códon de início de nlpI a 376pb após o códon de início de nlpI, diretamente a montante de rpoN. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene cspE inserido (Prm1.2) a montante de nifA. Deleção dos

1.647pb após o códon de início do gene ΔnifL::Prm1.2 Mutante de glnE que contém o domínio de remoção de 137-2.285 ΔglnE-AR_KO2, curado CI137 adenilila de glutamato-amônia-ligase-adeni- rpoN::Prm1.2 lil-transferase adenililtransferase (ΔglnE- AR_KO2). Deleção do promotor rpoN nativo e inserção de um fragmento (Prm1.2) direta- mente a montante do CDS rpoN. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene cspE inserido (Prm1.2) a montante de nifA. Deleção dos ΔnifL::Prm1.2 Mutante de 1.647pb após o códon de início do gene 137-2.225 ΔglnE-AR_KO2, curado CI137 glnE que contém o domínio de remoção de ΔglnK adenilila de glutamato-amônia-ligase-adeni- lil-transferase adenililtransferase (ΔglnE- AR_KO2). Deleção de glnK CDS inteiro Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene infC inserido (PinfC) a montante de nifA. Deleção dos Mutante de 1.647pb após o códon de início do gene ΔnifL::PinfC, 137-1.586 curado CI137 glnE que contém o domínio de remoção de ΔglnE-AR_KO2 adenilila de glutamato-amônia-ligase-adeni- lil-transferase adenililtransferase (ΔglnE- AR_KO2). Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene infC inserido (PinfC) a montante de nifA. Deleção dos

1.647pb após o códon de início do gene glnE que contém o domínio de remoção de adenilila de glutamato-amônia-ligase-adeni- ΔnifL::PinfC, Mutante de lil-transferase adenililtransferase (ΔglnE- 137-1.860 ΔglnE-AR_KO2, dctA1::Prm8.2_ATG-de curado CI137 AR_KO2). A deleção do promotor dctA1 na- início tivo e a inserção de um fragmento (Prm8.2), encontraram 77pb após o códon de início de nlpI a 376pb após o códon de início de nlpI, diretamente a montante de dctA1. O códon de início nativo do dctA1 também foi alterado de GTG para ATG. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene infC inserido (PinfC) a montante de nifA. Deleção dos ΔnifL::PinfC, Mutante de 1.647pb após o códon de início do gene 137-1.905 ΔglnE-AR_KO2, dctA1::Prm1.2_ATG-de não curado CI137 glnE que contém o domínio de remoção de início adenilila de glutamato-amônia-ligase-adeni- lil-transferase adenililtransferase (ΔglnE- AR_KO2). Deleção do promotor dctA1 nativo

ID da Descrição do DNA Genótipo Linhagem Status de cura cepa mutagênico cromossômico e inserção de um fragmento (Prm1.2) direta- mente a montante do dctA1. O códon de iní- cio nativo do dctA1 também foi alterado de GTG para ATG.

Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene lpp inserido (Prm1) a montante de nifA. Deleção dos

1.287pb após o códon de início do gene glnE que contém o domínio de remoção de ΔnifL::Prm1 adenilila de glutamato-amônia-ligase adenilil- ΔglnE-AR_KO1, Mutante de transferase (ΔglnE-AR_KO1). Deleção de 6-1.697 ΔamtB, Não curado CI006 amtB CDS inteiro. Deleção do promotor treZ treZ::Prm2, nativo e inserção de um fragmento (Prm2), otsB::Prm1 da região a montante de PROKKA_04751 (uma proteína hipotética), diretamente a montante de treZ. Deleção do promotor na- tivo otsB e inserção de Prm1 diretamente a montante de ostB. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene cspE inserido (Prm1.2) a montante de nifA. Deleção dos

1.647pb após o códon de início do gene Mutante de glnE que contém o domínio de remoção de ΔnifL::Prm1.2 137-1.901 Curado CI137 adenilila de glutamato-amônia-ligase-adeni- ΔglnE-AR_KO2, phoB1::Prm1.2 lil-transferase adenililtransferase (ΔglnE- AR_KO2). Deleção do promotor phoB1 na- tivo e inserção de um fragmento (Prm1.2) di- retamente a montante do CDS phoB1. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene lpp inserido (Prm1) a montante de nifA. Deleção dos

1.647pb após o códon de início do gene glnE que contém o domínio de remoção de ΔnifL::Prm1, adenilila de glutamato-amônia-ligase-adeni- ΔglnE-AR_KO2, Mutante de lil-transferase adenililtransferase (ΔglnE- 6-1.779 ΔamtB, Não curado CI006 AR_KO2). Deleção de amtB CDS inteiro. De- bcsII::Prm2, leção do promotor nativo bcsII e inserção de yjbE2::Prm1 um fragmento (Prm2), da região a montante de PROKKA_04751 (uma proteína hipoté- tica), diretamente a montante de bcsII. Dele- ção do promotor yjbE2 nativo e inserção de Prm1 diretamente a montante de yjbE2. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene ompX inserido (Prm5) a montante de nifA. Deleção dos

1.287pb após o códon de início do gene glnE que contém o domínio de remoção de ΔnifL::Prm5 Mutante de 6-1.782 adenilila de glutamato-amônia-ligase adenilil- ΔglnE-AR_KO1, glnA::PrmglnB_ATG-de Não curado CI006 transferase (ΔglnE-AR_KO1). Deleção do início promotor nativo de glnA e inserção de um fragmento (PrmglnB) da região a montante do gene, glnB, diretamente a montante de glnA. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene ompX inserido (Prm5) a montante de nifA. Deleção dos

1.287pb após o códon de início do gene ΔnifL::Prm5 Mutante de glnE que contém o domínio de remoção de 6-1.783 ΔglnE-AR_KO1, glnA::PrmglnB_GTG-de Não curado CI006 adenilila de glutamato-amônia-ligase adenilil- início transferase (ΔglnE-AR_KO1). Deleção do promotor nativo de glnA e inserção de um fragmento (PrmglnB) da região a montante do gene, glnB, diretamente a montante de

ID da Descrição do DNA Genótipo Linhagem Status de cura cepa mutagênico cromossômico glnA. O códon de início nativo de glnA tam- bém foi alterado de ATG para GTG.

1.287pb após o códon de início do gene glnE que contém o domínio de remoção de ΔnifL::Prm1 Mutante de adenilila de glutamato-amônia-ligase adenilil- 6-1.906 ΔglnE-AR_KO1, glnA::PrmglnB_GTG-de Não curado CI006 transferase (ΔglnE-AR_KO1). Deleção do início promotor nativo de glnA e inserção de um fragmento (PrmglnB) da região a montante do gene, glnB, diretamente a montante de glnA. O códon de início nativo de glnA tam- bém foi alterado de ATG para GTG. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene lpp inserido (Prm1) a montante de nifA. Deleção dos

1.287pb após o códon de início do gene glnE que contém o domínio de remoção de ΔnifL::Prm1 Mutante de 6-1.907 adenilila de glutamato-amônia-ligase adenilil- ΔglnE-AR_KO1, glnA::PrmglnE_ATG-de Não curado CI006 transferase (ΔglnE-AR_KO1). Deleção do início promotor nativo de glnA e inserção de um fragmento (PrmglnE) da região a montante do gene, glnE, diretamente a montante de glnA. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene lpp inserido (Prm1) a montante de nifA. Deleção dos

1.287pb após o códon de início do gene glnE que contém o domínio de remoção de ΔnifL::Prm1 Mutante de adenilila de glutamato-amônia-ligase adenilil- 6-1.908 ΔglnE-AR_KO1, glnA::PrmglnE_GTG-de Não curado CI006 transferase (ΔglnE-AR_KO1). Deleção do início promotor nativo de glnA e inserção de um fragmento (PrmglnE) da região a montante do gene, glnE, diretamente a montante de glnA. O códon de início nativo de glnA tam- bém foi alterado de ATG para GTG. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene lpp inserido Mutante de (Prm1) a montante de nifA. Deleção do pro- ΔnifL::Prm1, 6-1.912 Não curado CI006 motor nativo de glnA e inserção de um frag- glnA::PrmglnE_ATG-de início mento (PrmglnE) da região a montante do gene, glnE, diretamente a montante de glnA. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene cspE inserido (Prm1.2) a montante de nifA. Deleção do Mutante de ΔnifL::Prm1.2, glnA::PrmglnB_ATG-de iní- 137-2.656 promotor nativo de glnA e inserção de um Curado CI137 cio fragmento (PrmglnB) da região a montante do gene, glnB, diretamente a montante de glnA. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene cspE inserido (Prm1.2) a montante de nifA. Deleção do Mutante de promotor nativo de glnA e inserção de um ΔnifL::Prm1.2, glnA::PrmglnB_GTG-de iní- 137-2.657 Curado CI137 fragmento (PrmglnB) da região a montante cio do gene, glnB, diretamente a montante de glnA. O códon de início nativo de glnA tam- bém foi alterado de ATG para GTG. Interrupção do gene nifL com um fragmento Mutante de ΔnifL::Prm1.2, glnA::PrmglnD_ATG-de iní- 137-2.658 da região a montante do gene cspE inserido Curado CI137 cio (Prm1.2) a montante de nifA. Deleção do

ID da Descrição do DNA Genótipo Linhagem Status de cura cepa mutagênico cromossômico promotor nativo de glnA e inserção de um fragmento (PrmglnD) da região a montante do gene, glnD, diretamente a montante de glnA. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene cspE inserido (Prm1.2) a montante de nifA. Deleção do Mutante de promotor nativo de glnA e inserção de um ΔnifL::Prm1.2, glnA::PrmglnD_GTG-de iní- 137-2.659 Curado CI137 fragmento (PrmglnD) da região a montante cio do gene, glnD, diretamente a montante de glnA. O códon de início nativo de glnA tam- bém foi alterado de ATG para GTG. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene cspE inserido (Prm1.2) a montante de nifA. Deleção do Mutante de ΔnifL::Prm1.2, glnA::PrmglnE_ATG-de iní- 137-2.660 promotor nativo de glnA e inserção de um Curado CI137 cio fragmento (PrmglnE) da região a montante do gene, glnE, diretamente a montante de glnA. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene cspE inserido (Prm1.2) a montante de nifA. Deleção do Mutante de promotor nativo de glnA e inserção de um ΔnifL:: Prm1.2, 137-2.661 Curado CI137 fragmento (PrmglnE) da região a montante glnA :: PrmglnE_GTG-de início do gene, glnE, diretamente a montante de glnA. O códon de início nativo de glnA tam- bém foi alterado de ATG para GTG. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene cspE inserido (Prm1.2) a montante de nifA. Deleção dos

1.647pb após o códon de início do gene glnE que contém o domínio de remoção de ΔnifL::Prm1.2 Mutante de 137-2.257 adenilila de glutamato-amônia-ligase-adeni- ΔglnE-AR_KO2, glnA::PrmglnB_ATG-de Curado CI137 lil-transferase adenililtransferase (ΔglnE- início AR_KO2). Deleção do promotor nativo de glnA e inserção de um fragmento (PrmglnB) da região a montante do gene, glnB, direta- mente a montante de glnA. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene cspE inserido (Prm1.2) a montante de nifA. Deleção dos

1.647pb após o códon de início do gene glnE que contém o domínio de remoção de adenilila de glutamato-amônia-ligase-adeni- ΔnifL::Prm1.2 Mutante de 137-2.259 lil-transferase adenililtransferase (ΔglnE- ΔglnE-AR_KO2, glnA::PrmglnB_GTG-de Curado CI137 AR_KO2). Deleção do promotor nativo de início glnA e inserção de um fragmento (PrmglnB) da região a montante do gene, glnB, direta- mente a montante de glnA. O códon de iní- cio nativo de glnA também foi alterado de ATG para GTG. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene cspE inserido (Prm1.2) a montante de nifA. Deleção dos

1.647pb após o códon de início do gene glnE que contém o domínio de remoção de ΔnifL::Prm1.2 Mutante de 137-2.261 adenilila de glutamato-amônia-ligase-adeni- ΔglnE-AR_KO2, glnA::PrmglnD_ATG-de Curado CI137 lil-transferase adenililtransferase (ΔglnE- início AR_KO2). Deleção do promotor nativo de glnA e inserção de um fragmento (PrmglnD) da região a montante do gene, glnD, direta- mente a montante de glnA.

ID da Descrição do DNA Genótipo Linhagem Status de cura cepa mutagênico cromossômico Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene cspE inserido (Prm1.2) a montante de nifA. Deleção dos

1.647pb após o códon de início do gene glnE que contém o domínio de remoção de adenilila de glutamato-amônia-ligase-adeni- ΔnifL::Prm1.2 Mutante de 137-2.263 lil-transferase adenililtransferase (ΔglnE- ΔglnE-AR_KO2, glnA::PrmglnD_GTG-de Curado CI137 AR_KO2). Deleção do promotor nativo de início glnA e inserção de um fragmento (PrmglnD) da região a montante do gene, glnD, direta- mente a montante de glnA. O códon de iní- cio nativo de glnA também foi alterado de ATG para GTG. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene cspE inserido (Prm1.2) a montante de nifA. Deleção dos

1.647pb após o códon de início do gene glnE que contém o domínio de remoção de ΔnifL::Prm1.2 Mutante de 137-2.281 adenilila de glutamato-amônia-ligase-adeni- ΔglnE-AR_KO2, glnA::PrmglnE_ATG-de Curado CI137 lil-transferase adenililtransferase (ΔglnE- início AR_KO2). Deleção do promotor nativo de glnA e inserção de um fragmento (PrmglnE) da região a montante do gene, glnE, direta- mente a montante de glnA. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene cspE inserido (Prm1.2) a montante de nifA. Deleção dos

1.647pb após o códon de início do gene glnE que contém o domínio de remoção de ΔnifL::Prm1.2 Mutante de adenilila de glutamato-amônia-ligase-adeni- 137-2.219 ΔglnE-AR_KO2, ΔglnD_ACT12_trunca- Curado CI137 lil-transferase adenililtransferase (ΔglnE- mento AR_KO2). Deleção dos 546pb antes do có- don de parada do gene glnD que contém o domínio ACT1/2 da enzima bifuncional uridi- liltransferase/removedora de uridilila (ΔglnD- ACT12_truncamento) Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene cspE inserido (Prm1.2) a montante de nifA. Deleção dos

1.647pb após o códon de início do gene glnE que contém o domínio de remoção de Mutante de adenilila de glutamato-amônia-ligase-adeni- ΔnifL::Prm1.2 137-2.221 Curado CI137 lil-transferase adenililtransferase (ΔglnE- ΔglnE-AR_KO2, ΔglnD_UT_truncamento AR_KO2). Deleção dos 975pb após o códon de início do gene glnD que contém o domí- nio uridililtransferase (UT) da enzima bifunci- onal uridililtransferase/de remoção de uridilila (ΔglnD-UT_truncamento) Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene cspE inserido (Prm1.2) a montante de nifA. Deleção dos Mutante de 1.647pb após o códon de início do gene ΔnifL::Prm1.2 137-2.223 Curado CI137 glnE que contém o domínio de remoção de ΔglnE-AR_KO2, ΔglnD adenilila de glutamato-amônia-ligase-adeni- lil-transferase adenililtransferase (ΔglnE- AR_KO2). Deleção de glnD CDS inteiro. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene cspE inserido (Prm1.2) a montante de nifA. Deleção dos Mutante de ΔnifL:: Prm1.2 137-2.245 1.647pb após o códon de início do gene Curado CI137 ΔglnE-AR_KO2, ΔglnD_UR_truncamento glnE que contém o domínio de remoção de adenilila de glutamato-amônia-ligase-adeni- lil-transferase adenililtransferase (ΔglnE-

ID da Descrição do DNA Genótipo Linhagem Status de cura cepa mutagênico cromossômico AR_KO2). Deleção de 66pb a partir de pb1.519 a pb1.586 do gene glnD que con- tém o domínio de remoção de uridililamina (UR) da enzima bifuncional uridililtransfe- rase/de remoção de uridilila (ΔglnD-UR_trun- camento) Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene infC inserido (PinfC) a montante de nifA. Deleção dos Mutante de 137-2.227 546pb antes do códon de parada do gene ΔnifL::PinfC, ΔglnD_ACT12_truncamento Curado CI137 glnD que contém o domínio ACT1/2 da en- zima bifuncional uridililtransferase/remove- dora de uridilila (ΔglnD-ACT12_truncamento) Interrupção do gene nifL com um fragmento Mutante de da região a montante do gene infC inserido ΔnifL::PinfC, 137-2.229 Curado CI137 (PinfC) a montante de nifA. Deleção de glnD ΔglnD CDS inteiro. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene infC inserido (PinfC) a montante de nifA. Deleção dos Mutante de 975pb após o códon de início do gene glnD 137-2.253 ΔnifL::PinfC, ΔglnD_UT_truncamento Curado CI137 que contém o domínio uridililtransferase (UT) da enzima bifuncional uridililtransferase/de remoção de uridilila (ΔglnD-UT_trunca- mento) Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene infC inserido (PinfC) a montante de nifA. Desativação do Mutante de domínio uridililtransferase (UT) da enzima bi- 137-2.283 ΔnifL::PinfC, ΔglnD_UT_desativação Curado CI137 funcional uridililtransferase/de remoção de uridilila, glnD, pela mutação dos resíduos de aminoácidos 90 e 91 de GG para DV, bem como do resíduo 104 de D para A. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene cspE inserido (Prm1.2) a montante de nifA. Deleção dos

1.647pb após o códon de início do gene Mutante de glnE que contém o domínio de remoção de ΔnifL::Prm1.2, 137-2.237 Curado CI137 adenilila de glutamato-amônia-ligase-adeni- ΔglnE-AR_KO2, glsaA2::Prm1.2 lil-transferase adenililtransferase (ΔglnE- AR_KO2). Deleção do promotor glsA2 nativo e inserção de um fragmento (Prm1.2) direta- mente a montante do CDS glsA2. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene lpp inserido (Prm1) a montante de nifA. Deleção dos

1.287pb após o códon de início do gene glnE que contém o domínio de remoção de ΔnifL::Prm1, Mutante de 6-2552 adenilila de glutamato-amônia-ligase adenilil- ΔglnE-AR_KO1, Curado CI006 transferase (ΔglnE-AR_KO1). Deleção dos ΔglnD-ACT12_truncamento 549pb antes do códon de parada do gene glnD que contém o domínio ACT1/2 da en- zima bifuncional uridililtransferase/remove- dora de uridilila (ΔglnD-ACT12_truncamento) Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene lpp inserido (Prm1) a montante de nifA. Deleção dos

1.287pb após o códon de início do gene Mutante de ΔnifL::Prm1, 6-2597 glnE que contém o domínio de remoção de Curado CI006 ΔglnE-AR_KO1, ΔglnD_UT_truncamento adenilila de glutamato-amônia-ligase adenilil- transferase (ΔglnE-AR_KO1). Deleção dos 987pb após o códon de início do gene glnD que contém o domínio uridililtransferase (UT)

ID da Descrição do DNA Genótipo Linhagem Status de cura cepa mutagênico cromossômico da enzima bifuncional uridililtransferase/de remoção de uridilila (ΔglnD-UT_trunca- mento) Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene lpp inserido (Prm1) a montante de nifA. Deleção dos ΔnifL::Prm1, Mutante de 1.287pb após o códon de início do gene 6-2587 ΔglnE-AR_KO1, Curado CI006 glnE que contém o domínio de remoção de ΔglnD adenilila de glutamato-amônia-ligase adenilil- transferase (ΔglnE-AR_KO1). Deleção de glnD CDS inteiro. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene lpp inserido (Prm1) a montante de nifA. Deleção dos

1.287pb após o códon de início do gene glnE que contém o domínio de remoção de Mutante de adenilila de glutamato-amônia-ligase adenilil- ΔnifL::Prm1, 6-2636 Curado CI006 transferase (ΔglnE-AR_KO1). Desativação ΔglnE-AR_KO1, ΔglnD_UT_desativação do domínio uridililtransferase (UT) da enzima bifuncional uridililtransferase/de remoção de uridilila, glnD, pela mutação dos resíduos de aminoácidos 90 e 91 de GG para DV, bem como do resíduo 104 de D para A. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene ompX inserido (Prm5) a montante de nifA. Deleção dos

1.287pb após o códon de início do gene glnE que contém o domínio de remoção de ΔnifL::Prm5, Mutante de 6-2.090 adenilila de glutamato-amônia-ligase adenilil- ΔglnE-AR_KO1, Curado CI006 transferase (ΔglnE-AR_KO1). Deleção dos ΔglnD-ACT12_truncamento 549pb antes do códon de parada do gene glnD que contém o domínio ACT1/2 da en- zima bifuncional uridililtransferase/remove- dora de uridilila (ΔglnD-ACT12_truncamento) Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene ompX inserido (Prm5) a montante de nifA. Deleção dos ΔnifL::Prm5, Mutante de 1.287pb após o códon de início do gene 6-2.122 ΔglnE-AR_KO1, Curado CI006 glnE que contém o domínio de remoção de ΔglnD adenilila de glutamato-amônia-ligase adenilil- transferase (ΔglnE-AR_KO1). Deleção de glnD CDS inteiro. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene ompX inserido (Prm5) a montante de nifA. Deleção dos

1.287pb após o códon de início do gene glnE que contém o domínio de remoção de Mutante de adenilila de glutamato-amônia-ligase adenilil- ΔnifL::Prm5, 6-2.411 Curado CI006 transferase (ΔglnE-AR_KO1). Deleção dos ΔglnE-AR_KO1, ΔglnD_UT_truncamento 987pb após o códon de início do gene glnD que contém o domínio uridililtransferase (UT) da enzima bifuncional uridililtransferase/de remoção de uridilila (ΔglnD-UT_trunca- mento) Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene ompX inserido (Prm5) a montante de nifA. Deleção dos Mutante de 1.287pb após o códon de início do gene ΔnifL::Prm5, 6-2.615 Curado CI006 glnE que contém o domínio de remoção de ΔglnE-AR_KO1, ΔglnD_UT_desativação adenilila de glutamato-amônia-ligase adenilil- transferase (ΔglnE-AR_KO1). Desativação do domínio uridililtransferase (UT) da enzima

ID da Descrição do DNA Genótipo Linhagem Status de cura cepa mutagênico cromossômico bifuncional uridililtransferase/de remoção de uridilila, glnD, pela mutação dos resíduos de aminoácidos 90 e 91 de GG para DV, bem como do resíduo 104 de D para A.

Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene ompX inserido (Prm5) a montante de nifA. Deleção dos

1.287pb após o códon de início do gene glnE que contém o domínio de remoção de Mutante de adenilila de glutamato-amônia-ligase adenilil- ΔnifL::Prm5, 6-2.627 Curado CI006 transferase (ΔglnE-AR_KO1). Desativação ΔglnE-AR_KO1, ΔglnD_UR_desativação do domínio de remoção de uridilila (UR) da enzima bifuncional uridililtransferase/de re- moção de uridilila, glnD, pela mutação dos resíduos de aminoácidos 515 e 516 de HD para AA. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene lpp inserido (Prm1) a montante de nifA. Deleção dos

1.287pb após o códon de início do gene ΔnifL::Prm1 Mutante de glnE que contém o domínio de remoção de 6-916 ΔglnE-AR_KO1, curado CI006 adenilila de glutamato-amônia-ligase adenilil- ΔamtB, cysZ::Prm1 transferase (ΔglnE-AR_KO1). Deleção de amtB CDS inteiro. Deleção do promotor na- tivo cysZ e inserção de Prm1 diretamente a montante de cysZ. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene infC inserido (PinfC) a montante de nifA. Deleção dos ΔnifL::PinfC, Mutante de 1.647pb após o códon de início do gene 137-1.893 ΔglnE-AR_KO2, curado CI137 glnE que contém o domínio de remoção de ΔglgA adenilila de glutamato-amônia-ligase-adeni- lil-transferase adenililtransferase (ΔglnE- AR_KO2). Deleção de glgA CDS inteiro. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene lpp inserido Mutante de ΔnifL::Prm1, 6-2.118 (Prm1) a montante de nifA. Deleção do pro- curado CI006 glsA2::Prm1 motor glsA2 nativo e inserção de Prm1 dire- tamente a montante de glsA2. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene cspE inserido (Prm1.2) a montante de nifA. Deleção dos

1.647pb após o códon de início do gene ΔnifL::Prm1.2 Mutante de glnE que contém o domínio de remoção de 137-2.502 ΔglnE-AR_KO2, curado CI137 adenilila de glutamato-amônia-ligase-adeni- ΔasnB-truncamento lil-transferase adenililtransferase (ΔglnE- AR_KO2). Deleção de 1.011pb antes do có- don de parada do gene asnB que codifica a asparagina sintetase B. Interrupção do gene nifL com um fragmento da região a montante do gene cspE inserido (Prm1.2) a montante de nifA. Deleção dos

1.647pb após o códon de início do gene ΔnifL::Prm1.2, Mutante de glnE que contém o domínio de remoção de 137-2.504 ΔglnE-AR_KO2, curado CI137 adenilila de glutamato-amônia-ligase-adeni- asnB::Prm1.2 lil-transferase adenililtransferase (ΔglnE- AR_KO2). Deleção do promotor nativo asnB e inserção de um fragmento (Prm1.2) direta- mente a montante do CDS asnB.

1.647pb após o códon de início do gene glnE que contém o domínio de remoção de ΔnifL::Prm1.2 Mutante de adenilila de glutamato-amônia-ligase-adeni- 137-2.215 ΔglnE-AR_KO2, gltBD::PrmglnD_ATG-de curado CI137 lil-transferase adenililtransferase (ΔglnE- início AR_KO2). Deleção do promotor do óperon gltBD nativo e inserção de um fragmento (PrmglnD) da região a montante do gene, glnD, diretamente a montante do óperon gltBD.

[00358] Não obstante às reivindicações anexas, a divulgação esta- belecida neste documento também é definida pelas seguintes cláusulas:

[00359] 1. Cepa microbiana com tolerância aprimorada à desse- cação.

[00360] 2. Cepa microbiana, em que a expressão de rpoE é regu- lada por um promotor comutável.

[00361] 3. Cepa microbiana, de acordo com a cláusula 2, em que o dito promotor comutável é um promotor de arabinose.

[00362] 4. Cepa microbiana, de acordo com a cláusula 2, em que um gene rseA é regulado de forma decrescente.

[00363] 5. Cepa microbiana, de acordo com a cláusula 2, em que o dito promotor comutável é um promotor que pode ser ativado com um produto químico.

[00364] 6. Cepa microbiana, de acordo com a cláusula 2, em que o dito promotor comutável é um promotor que pode ser ativado com um açúcar.

[00365] 7. Cepa microbiana, de acordo com a cláusula 2, em que o dito promotor comutável é um promotor que pode ser ativado com arabinose.

[00366] 8. Método para aumentar a tolerância à dessecação de um micróbio, o método compreendendo modificar geneticamente o dito micróbio para conter um gene rpoE operacionalmente enlaçado a um promotor comutável, ativando o dito promotor comutável durante a fase logarítmica de crescimento de biomassa, aumentando, assim, a tolerân- cia à dessecação do dito micróbio.

[00367] 9. Método para aumentar a tolerância à dessecação de um micróbio durante o revestimento de sementes, o método compreen- dendo modificar geneticamente o dito micróbio para conter um gene rpoE operacionalmente enlaçado a um promotor comutável, ativando o dito promotor comutável antes da dessecação, aumentando, assim, a tolerância à dessecação do dito micróbio.

[00368] 10. Método, de acordo com a cláusula 9, em que o dito pro- motor comutável é um promotor que pode ser ativado com um produto químico.

[00369] 11. Método, de acordo com a cláusula 9, em que o dito pro- motor comutável é um promotor que pode ser ativado com um açúcar.

[00370] 12. Método, de acordo com a cláusula 9, em que o dito pro- motor comutável é um promotor que pode ser ativado com arabinose.

[00371] 13. Método, de acordo com a cláusula 9, em que o dito pro- motor comutável é ativado durante a fase logarítmica de crescimento de biomassa.

[00372] 14. Método, de acordo com a cláusula 9, em que o dito pro- motor comutável é ativado durante o revestimento de sementes.

[00373] 15. Método, de acordo com a cláusula 9, em que o dito mi- cróbio também é geneticamente modificado para diminuir a expressão de rseA.

[00374] 16. Bactéria geneticamente modificada que compreende um elemento regulador heterólogo operacionalmente enlaçado ao cysP.

[00375] 17. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 16, em que o dito elemento regulador heterólogo é um promo- tor.

[00376] 18. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 16, em que o dito elemento regulador heterólogo é nativo da dita bactéria geneticamente modificada.

[00377] 19. Bactéria geneticamente modificada que compreende uma variação genética que resulta no aumento da expressão de uma proteína que catalisa o transporte de componentes de cofatores de ni- trogenase para a célula.

[00378] 20. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 19, em que a dita proteína que catalisa o transporte de compo- nentes de cofatores de nitrogenase para a célula é um gene transporta- dor de enxofre.

[00379] 21. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 20, em que o dito gene transportador de enxofre é cysZ.

[00380] 22. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 20, em que o dito gene transportador de enxofre é cysK.

[00381] 23. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 20, em que o dito gene transportador de enxofre é cysT.

[00382] 24. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 20, em que o dito gene transportador de enxofre é cysW.

[00383] 25. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 20, em que o dito gene transportador de enxofre é cysA.

[00384] 26. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 20, em que o dito gene transportador de enxofre é sbp.

[00385] 27. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 19, em que a dita variação genética resulta em expressão au- mentada de um óperon cysZK.

[00386] 28. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 19, em que a dita variação genética resulta em expressão au- mentada de um óperon cysPTWA.

[00387] 29. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 19, em que a dita proteína que catalisa o transporte de compo-

nentes de cofatores de nitrogenase para a célula é um gene transporta- dor de molibdênio.

[00388] 30. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 29, em que o dito gene transportador de molibdênio é modE.

[00389] 31. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 29, em que o dito gene transportador de molibdênio é modB.

[00390] 32. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 29, em que o dito gene transportador de molibdênio é modA.

[00391] 33. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 19, em que a dita variação genética resulta em expressão au- mentada de um óperon modEB.

[00392] 34. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 19, em que a dita variação genética resulta em expressão au- mentada de um óperon modEBA.

[00393] 35. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 19, em que a dita proteína que catalisa o transporte de compo- nentes de cofatores de nitrogenase para a célula é um gene transporta- dor de ferro.

[00394] 36. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 35, em que o dito gene transportador de ferro é exbA.

[00395] 37. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 35, em que o dito gene transportador de ferro é exbB.

[00396] 38. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 35, em que o dito gene transportador de ferro é tonB.

[00397] 39. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 19, em que a dita variação genética resulta em expressão au- mentada de um óperon exbAB.

[00398] 40. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das cláusulas 19 a 39, em que a dita variação genética compreende a inserção de um promotor.

[00399] 41. Bactéria geneticamente modificada, em que a dita bac- téria geneticamente modificada compreende expressão alterada de um gene de biossíntese de sideróforos.

[00400] 42. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 41, em que o dito gene de biossíntese de sideróforo é isyhfA.

[00401] 43. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 41, em que o dito gene de biossíntese de sideróforo é yusV.

[00402] 44. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 41, em que o dito gene de biossíntese de sideróforo é sbnA.

[00403] 45. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 41, em que o dito gene de biossíntese de sideróforo é yfiZ.

[00404] 46. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 41, em que o dito gene de biossíntese de sideróforo é fiu.

[00405] 47. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 41, em que o dito gene de biossíntese de sideróforo é fur.

[00406] 48. Bactéria geneticamente modificada que compreende uma variação genética em glgA; em que a dita bactéria geneticamente modificada tem atividade aumentada de fixação de nitrogênio em com- paração com uma bactéria da mesma espécie sem a dita variação ge- nética em glgA.

[00407] 49. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 47, em que a dita variação genética resulta em expressão re- duzida de glgA.

[00408] 50. Bactéria geneticamente modificada que compreende um sítio de aglutinação ao ribossomo não nativo que resulta em tradu- ção aumentada de NifA.

[00409] 51. Bactéria geneticamente modificada que compreende pelo menos duas cópias do gene NifA.

[00410] 52. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 51, em que a dita bactéria geneticamente modificada compre- ende pelo menos três cópias do gene NifA.

[00411] 53. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 51, em que a dita bactéria geneticamente modificada compre- ende pelo menos quatro cópias do gene NifA.

[00412] 54. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 51, em que a dita bactéria geneticamente modificada compre- ende pelo menos cinco cópias do gene NifA.

[00413] 55. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 51, em que a dita bactéria geneticamente modificada compre- ende pelo menos seis cópias do gene NifA.

[00414] 56. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 51, em que a dita bactéria geneticamente modificada compre- ende pelo menos sete cópias do gene NifA.

[00415] 57. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 51, em que a dita bactéria geneticamente modificada compre- ende mais de dez cópias do gene NifA.

[00416] 58. Bactéria geneticamente modificada que compreende um promotor heterólogo operacionalmente enlaçado a pelo menos um gene selecionado do grupo que consiste em nifH, nifD e nifK; em que o dito promotor heterólogo é derivado do material genético do micróbio hospedeiro.

[00417] 59. Bactéria geneticamente modificada que compreende uma variante genética em um gene de sequestro de espécies reativas de oxigênio.

[00418] 60. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 59, em que o dito gene de sequestro de espécies reativas de oxigênio é grxA.

[00419] 61. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 59, em que o dito gene de sequestro de espécies reativas de oxigênio é grxB.

[00420] 62. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 59, em que o dito gene de sequestro de espécies reativas de oxigênio é grxC.

[00421] 63. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 59, em que o dito gene de sequestro de espécies reativas de oxigênio é grxD.

[00422] 64. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 59, em que o dito gene de sequestro de espécies reativas de oxigênio é trxA.

[00423] 65. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 59, em que o dito gene de sequestro de espécies reativas de oxigênio é trxC.

[00424] 66. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 59, em que o dito gene de sequestro de espécies reativas de oxigênio é tpx.

[00425] 67. Bactéria geneticamente modificada que compreende uma genética que resulta em expressão alterada de um óperon grxABCD.

[00426] 68. Bactéria geneticamente modificada que compreende uma variante genética que resulta em um nível maior de atividade de nitrogenase sob condições de pelo menos 0,05% de oxigênio do que em uma bactéria diazotrófica não geneticamente modificada da mesma espécie.

[00427] 69. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 68, em que a dita variante genética resulta em um nível maior de atividade de nitrogenase sob condições de pelo menos 0,1% de oxi- gênio do que em uma bactéria diazotrófica não geneticamente modifi- cada da mesma espécie.

[00428] 70. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 68, em que a dita variante genética resulta em um nível maior de atividade de nitrogenase sob condições de pelo menos 0,5% de oxi- gênio do que em uma bactéria diazotrófica não geneticamente modifi- cada da mesma espécie.

[00429] 71. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 68, em que a dita variante genética resulta em um nível maior de atividade de nitrogenase sob condições de pelo menos 1% de oxigê- nio do que em uma bactéria diazotrófica não geneticamente modificada da mesma espécie.

[00430] 72. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 68, em que a dita variante genética resulta em expressão alte- rada de um óperon cydABX.

[00431] 73. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 68, em que a dita variante genética resulta em expressão alte- rada de um óperon cydAB.

[00432] 74. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 68, em que a dita variante genética resulta em expressão alte- rada de um gene cydX.

[00433] 75. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 68, em que a dita variante genética resulta em expressão alte- rada de um gene cydA.

[00434] 76. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 68, em que a dita variante genética resulta em expressão alte- rada de um gene cydB.

[00435] 77. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 68, em que a dita variante genética resulta em expressão alte- rada de um gene glbN.

[00436] 78. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 68, em que a dita variante genética resulta em expressão alte- rada de um óperon fixNOPQ.

[00437] 79. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 68, em que a dita variante genética resulta em expressão alte- rada de um gene fixN.

[00438] 80. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 68, em que a dita variante genética resulta em expressão alte- rada de um gene fixO.

[00439] 81. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 68, em que a dita variante genética resulta em expressão alte- rada de um gene fixP.

[00440] 82. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 68, em que a dita variante genética resulta em expressão alte- rada de um gene fixQ.

[00441] 83. Bactéria geneticamente modificada que compreende uma modificação em asnB.

[00442] 84. Bactéria geneticamente modificada que compreende uma modificação em um gene selecionado do grupo que consiste em: asnB, asnA, glnL, uridilil-transferase amtB e GDH.

[00443] 85. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 84, em que a dita variante genética resulta em expressão alte- rada de um gene asnB.

[00444] 86. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 84, em que a dita variante genética resulta em expressão alte- rada de um gene asnA.

[00445] 87. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 84, em que a dita variante genética resulta em expressão alte- rada de um gene glnL.

[00446] 88. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 84, em que a dita variante genética resulta em expressão alte- rada de um gene uridilil-transferase.

[00447] 89. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 84, em que a dita variante genética resulta em expressão alte- rada de um gene GDH.

[00448] 90. Bactéria geneticamente modificada que compreende uma modificação em glnK, em que a dita modificação é selecionada do grupo que consiste em: deleção de todo o gene, deleção de substanci- almente todo o gene, deleção de um domínio ACT, deleção de mais de 50% de um domínio ACT, desativação de um domínio ACT e desativa- ção de um domínio UTase.

[00449] 91. Bactéria geneticamente modificada que compreende uma modificação em glnD, em que a dita modificação é selecionada do grupo que consiste em: deleção de todo o gene, deleção de substanci- almente todo o gene, deleção de um domínio ACT, deleção de mais de 50% de um domínio ACT, desativação de um domínio ACT e desativa- ção de um domínio UTase.

[00450] 92. Bactéria geneticamente modificada com sobrevivência aprimorada em uma rizosfera em comparação com uma bactéria não geneticamente modificada da mesma espécie, a bactéria compreen- dendo uma variação genética que resulta em expressão aumentada de um transportador de açúcar.

[00451] 93. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 92, em que o dito transportador de açúcar é dctA.

[00452] 94. Bactéria geneticamente modificada que compreende uma variação genética que resulta em expressão aumentada de um transportador de açúcar.

[00453] 95. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 94, em que o dito transportador de açúcar é dctA.

[00454] 96. Bactéria geneticamente modificada com sobrevivência aprimorada em uma rizosfera em comparação com uma bactéria não geneticamente modificada da mesma espécie, a bactéria compreen-

dendo uma variação genética que resulta na sinalização de quórum al- terada.

[00455] 97. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 96, em que a dita variação genética que resulta em sinalização de quórum alterada resulta em arrefecimento brusco de quórum alte- rado.

[00456] 98. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 96, em que a dita variação genética que resulta em sinalização de quórum alterada resulta em expressão alterada de Y2-aiiA.

[00457] 99. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 96, em que a dita variação genética que resulta em sinalização de quórum alterada resulta em expressão alterada de ytnP.

[00458] 100. Bactéria geneticamente modificada com sobrevivência aprimorada em uma rizosfera em comparação com uma bactéria não geneticamente modificada da mesma espécie, a bactéria compreen- dendo uma variação genética que resulta em fixação radicular aumen- tada.

[00459] 101. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 100, em que a dita variação genética que resulta em fixação radicular aumentada compreende uma variação genética que resulta em biossíntese de fenazina alterada.

[00460] 102. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 100, em que a dita variação genética que resulta em fixação radicular aumentada compreende uma variação genética que resulta em biossíntese de lipopeptídeos cíclicos alterados.

[00461] 103. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 100, em que a dita variação genética que resulta em fixação radicular aumentada compreende uma variação genética que resulta em expressão alterada de aglutaninas.

[00462] 104. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 100, em que a dita variação genética que resulta em fixação radicular aumentada compreende uma variação genética que resulta em expressão alterada de fhaB.

[00463] 105. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 100, em que a dita variação genética que resulta em fixação radicular aumentada compreende uma variação genética que resulta em expressão alterada de fhaC.

[00464] 106. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 100, em que a dita variação genética que resulta em fixação radicular aumentada compreende uma variação genética que resulta em expressão alterada de yjbE.

[00465] 107. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 100, em que a dita variação genética que resulta em fixação radicular aumentada compreende uma variação genética que resulta em expressão alterada de pssM.

[00466] 108. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 100, em que a dita variação genética que resulta em fixação radicular aumentada compreende uma variação genética que resulta em expressão alterada de genes acs.

[00467] 109. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 100, em que a dita variação genética que resulta em fixação radicular aumentada compreende uma variação genética que resulta em expressão alterada de otsA.

[00468] 110. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 100, em que a dita variação genética que resulta em fixação radicular aumentada compreende uma variação genética que resulta em expressão alterada de um óperon compreendendo otsA.

[00469] 111. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 100, em que a dita variação genética que resulta em fixação radicular aumentada compreende uma variação genética que resulta em expressão alterada de treY.

[00470] 112. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 100, em que a dita variação genética que resulta em fixação radicular aumentada compreende uma variação genética que resulta em expressão alterada de um óperon compreendendo treY.

[00471] 113. Bactéria geneticamente modificada que compreende uma variação genética que resulta em formação aumentada de biofilme.

[00472] 114. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 113, em que a dita variação genética que resulta em formação aumentada de biofilme compreende uma variação genética que resulta em expressão alterada de smZ.

[00473] 115. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 113, em que a dita variação genética que resulta em formação aumentada de biofilme compreende uma variação genética que resulta em expressão alterada de lapA.

[00474] 116. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 113, em que a dita variação genética que resulta em formação aumentada de biofilme compreende uma variação genética que resulta em expressão alterada de genes de biossíntese de AHL.

[00475] 117. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 113, em que a dita variação genética que resulta em formação aumentada de biofilme compreende uma variação genética que resulta em expressão alterada de phoB.

[00476] 118. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 113, em que a dita variação genética que resulta em formação aumentada de biofilme compreende uma variação genética que resulta em expressão alterada de phoR.

[00477] 119. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 113, em que a dita variação genética que resulta em formação aumentada de biofilme compreende uma variação genética que resulta em expressão alterada de MucA.

[00478] 120. Bactéria geneticamente modificada com sobrevivência aprimorada em uma rizosfera em comparação com uma bactéria não geneticamente modificada da mesma espécie; a bactéria compreende uma variação genética que resulta em expressão aumentada de uma enzima de degradação de parede celular.

[00479] 121. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 120, em que a dita enzima de degradação de parede celular compreende uma poligalacturonase.

[00480] 122. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 120, em que a dita enzima de degradação de parede celular compreende uma celulase.

[00481] 123. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a cláusula 120, em que a dita enzima de degradação de parede celular compreende pehA.

[00482] 124. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das cláusulas 19 a 123, em que a dita bactéria genetica- mente modificada é uma bactéria diazotrófica geneticamente modifi- cada.

[00483] 125. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das cláusulas 19 a 123, em que a dita bactéria genetica- mente modificada é não intergenérica.

[00484] 126. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das cláusulas 19 a 123, em que a dita bactéria genetica- mente modificada é intergenérica.

[00485] 127. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das cláusulas 19 a 123, em que a dita bactéria genetica- mente modificada é capaz de fixar nitrogênio atmosférico na presença de nitrogênio exógeno.

[00486] 128. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das cláusulas 19 a 123, em que a dita bactéria genetica- mente modificada compreende uma modificação em uma rede genética de fixação de nitrogênio.

[00487] 129. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das cláusulas 19 a 123, em que a dita bactéria genetica- mente modificada compreende uma modificação em NifA.

[00488] 130. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das cláusulas 19 a 123, em que a dita bactéria genetica- mente modificada compreende uma modificação que resulta em expres- são aumentada de NifA.

[00489] 131. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das cláusulas 19 a 123, em que a dita bactéria genetica- mente modificada compreende uma modificação em NifL.

[00490] 132. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das cláusulas 19 a 123, em que a dita bactéria genetica- mente modificada compreende uma modificação que resulta em expres- são reduzida de NifL.

[00491] 133. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das cláusulas 19 a 123, em que a dita bactéria genetica- mente modificada compreende uma modificação em NifH.

[00492] 134. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das cláusulas 19 a 123, em que a dita bactéria genetica- mente modificada compreende uma modificação que resulta em expres- são aumentada de NifH.

[00493] 135. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das cláusulas 19 a 123, em que a dita bactéria genetica- mente modificada compreende uma modificação que resulta em expres- são aumentada de aglomerado de genes de Nif.

[00494] 136. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das cláusulas 19 a 123, em que a dita bactéria genetica- mente modificada compreende uma modificação em uma rede genética de assimilação de nitrogênio.

[00495] 137. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das cláusulas 19 a 123, em que a dita bactéria genetica- mente modificada compreende uma modificação em GlnE.

[00496] 138. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das cláusulas 19 a 123, em que a dita bactéria genetica- mente modificada compreende uma modificação que resulta em ativi- dade reduzida de GlnE.

[00497] 139. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das cláusulas 19 a 123, em que a dita bactéria genetica- mente modificada compreende uma modificação que resulta em ativi- dade reduzida de amtB.

[00498]

[00499] 140. Método para aumentar a quantidade de nitrogênio de- rivado da atmosfera em uma planta, compreendendo colocar a dita planta em contato com uma pluralidade da dita bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das cláusulas 19 a 139.

[00500] 141. Método, de acordo com a cláusula 140, em que a dita bactéria geneticamente modificada é aplicada a uma semente da dita planta.

[00501] 142. Método, de acordo com a cláusula 140, em que a dita bactéria geneticamente modificada é aplicada a uma muda da dita planta.

[00502] 143. Método, de acordo com a cláusula 140, em que a dita bactéria geneticamente modificada é aplicada à dita planta em uma for- mulação líquida.

[00503] 144. Método, de acordo com a cláusula 140, em que a dita bactéria geneticamente modificada é aplicada à dita planta após o plan- tio, mas antes da colheita da dita planta.

[00504] 145. Método, de acordo com a cláusula 140, em que a dita bactéria geneticamente modificada é aplicada à dita planta como uma adubação de cobertura.

[00505] 146. Método, de acordo com a cláusula 140, em que a dita bactéria geneticamente modificada é aplicada à dita planta entre um mês e oito meses após a germinação.

[00506] 147. Método, de acordo com a cláusula 140, em que a dita bactéria geneticamente modificada é aplicada à dita planta entre dois meses e oito meses após a germinação.

[00507] 148. Método, de acordo com a cláusula 140, em que a dita bactéria geneticamente modificada é aplicada à dita planta entre um mês e três meses após a germinação.

[00508] 149. Método, de acordo com a cláusula 140, em que a dita bactéria geneticamente modificada é aplicada à dita planta entre três meses e seis meses após a germinação.

[00509] 150. Método, de acordo com a cláusula 140, em que a dita planta é uma planta de cereal.

[00510] 151. Método, de acordo com a cláusula 140, em que a dita planta é uma planta de milho.

[00511] 152. Método, de acordo com a cláusula 140, em que a dita planta é uma planta de arroz.

[00512] 153. Método, de acordo com a cláusula 140, em que a dita planta é uma planta de trigo.

[00513] 154. Método, de acordo com a cláusula 140, em que a dita planta é uma planta de soja.

[00514] 155. Composição que compreende uma semente e um re- vestimento de semente; em que o revestimento de sementes compre- ende uma pluralidade da dita bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das cláusulas 19 a 39.

[00515] 156. Composição, de acordo com a cláusula 155, em que a dita semente é uma semente de cereal.

[00516] 157. Composição, de acordo com a cláusula 155, em que a dita semente é selecionada do grupo que consiste em: uma semente de milho, uma semente de trigo, uma semente de arroz, uma semente de soja, uma semente de centeio e uma semente de sorgo.

[00517] 158. Composição que compreende uma planta e uma plura- lidade da dita bactéria geneticamente modificada, de acordo com qual- quer uma das cláusulas 19 a 39.

[00518] 159. Composição, de acordo com a cláusula 158, em que a dita planta é uma muda.

[00519] 160. Composição, de acordo com a cláusula 158, em que a dita semente é uma semente de cereal.

[00520] 161. Composição, de acordo com a cláusula 158, em que a dita semente é selecionada do grupo que consiste em milho, arroz, trigo, soja, centeio e sorgo.

[00521] 162. Método para aumentar a fixação de nitrogênio em um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em atividade alterada de um transportador de en- xofre.

[00522] 163. Método para aumentar a fixação de nitrogênio em um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em expressão alterada de um gene transportador de enxofre.

[00523] 164. Método para aumentar a fixação de nitrogênio em um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em atividade alterada de um transportador de mo- libdênio.

[00524] 165. Método para aumentar a fixação de nitrogênio em um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em expressão alterada de um gene transportador de molibdênio.

[00525] 166. Método para aumentar a fixação de nitrogênio em um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em atividade alterada de um transportador de ferro.

[00526] 167. Método para aumentar a fixação de nitrogênio em um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em expressão alterada de um gene transportador de ferro.

[00527] 168. Método para aumentar a fixação de nitrogênio em um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em biossíntese alterada de sideróforos.

[00528] 169. Método para aumentar a fixação de nitrogênio em um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em expressão alterada do gene controlador de bi- ossíntese de sideróforos.

[00529] 170. Método para aumentar a fixação de nitrogênio em um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em atividade alterada de um sequestrador de es- pécies reativas de oxigênio.

[00530] 171. Método para aumentar a fixação de nitrogênio em um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em expressão alterada de um gene de sequestro de espécies reativas de oxigênio.

[00531] 172. Método para aumentar a fixação de nitrogênio em um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em atividade alterada de uma proteína envolvida em sinalização de quórum.

[00532] 173. Método para aumentar a fixação de nitrogênio em um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em expressão alterada de um gene de sinalização de quórum.

[00533] 174. Método para aumentar a fixação de nitrogênio em um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em atividade alterada de aglutaninas.

[00534] 175. Método para aumentar a fixação de nitrogênio em um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em expressão alterada de aglutaninas.

[00535] 176. Método para aumentar a fixação de nitrogênio em um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em atividade alterada de uma proteína envolvida na formação de biofilme

[00536] 177. Método para aumentar a fixação de nitrogênio em um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em expressão alterada de um gene de formação de biofilme.

[00537] 178. Método para aumentar a fixação de nitrogênio em um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em atividade alterada de uma proteína de biossín- tese de AHL.

[00538] 179. Método para aumentar a fixação de nitrogênio em um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em expressão alterada de um gene de biossíntese de AHL.

[00539] 180. Método para aumentar a fixação de nitrogênio em um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em atividade alterada de uma enzima de degrada- ção de parede celular.

[00540] 181. Método para aumentar a fixação de nitrogênio em um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em expressão alterada de um gene para uma en- zima de degradação de parede celular.

[00541] 182. Método para aumentar a fixação de nitrogênio em um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em uma rede genética de fixação de nitrogênio al- terada.

[00542] 183. Método para aumentar a fixação de nitrogênio em um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em uma rede genética de assimilação de nitrogênio alterada.

[00543] 184. Método para aumentar a fixação de nitrogênio em um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética em um gene no grupo que consiste em rpoE, rseA, cysP, cysZ, cysK, cysT, cysW, cysA, sbp, um óperon cysZK, um óperon cysPTWA, modE, modB, modA, um óperon modEB, um óperon modEBA, exbA, exbB, tonB, um óperon exbAB, isyhfA, yusV, sbnA, yfiZ, fiu, fur, glgA, NifA, nifH, nifD, nifK, grxA, grxB, grxC, grxD, trxA, trxC, tpx, um óperon grxABCD, um óperon cydABX, um cydAB óperon cydX, cydA, cyddB, glbN, fixNOPQ, fixN, fixO, foxP, fixQ, asnB, asnA, glnL, uridilil-transfe- rase, amtB, glnK, GDH e glnD.

[00544] 186. Método para aumentar a excreção de amônio por um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em atividade alterada de um transportador de en- xofre.

[00545] 187. Método para aumentar a excreção de amônio por um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em expressão alterada de um gene de transporte de enxofre.

[00546] 188. Método para aumentar a excreção de amônio por um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em atividade alterada de um transportador de mo- libdênio.

[00547] 189. Método para aumentar a excreção de amônio por um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em expressão alterada do gene de transporte de molibdênio.

[00548] 190. Método para aumentar a excreção de amônio por um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em atividade alterada de um transportador de ferro.

[00549] 191. Método para aumentar a excreção de amônio por um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em expressão alterada de um gene de transporte de ferro.

[00550] 192. Método para aumentar a excreção de amônio por um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em biossíntese alterada de sideróforos.

[00551] 193. Método para aumentar a excreção de amônio por um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em expressão alterada de um gene que controla a biossíntese de sideróforos.

[00552] 194. Método para aumentar a excreção de amônio por um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em atividade alterada de um sequestrador de es- pécies reativas de oxigênio.

[00553] 195. Método para aumentar a excreção de amônio por um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em expressão alterada de um gene de sequestro de espécies reativas de oxigênio.

[00554] 196. Método para aumentar a excreção de amônio por um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em atividade alterada de uma proteína envolvida em sinalização de quórum.

[00555] 197. Método para aumentar a excreção de amônio por um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em expressão alterada de um gene de sinalização de quórum.

[00556] 198. Método para aumentar a excreção de amônio por um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em atividade alterada de aglutaninas.

[00557] 199. Método para aumentar a excreção de amônio por um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em expressão alterada de aglutaninas.

[00558] 200. Método para aumentar a excreção de amônio por um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em atividade alterada de uma proteína envolvida na formação de biofilme.

[00559] 201. Método para aumentar a excreção de amônio por um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em expressão alterada de um gene de formação de biofilme.

[00560] 202. Método para aumentar a excreção de amônio por um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em atividade alterada de uma proteína de biossín- tese de AHL.

[00561] 203. Método para aumentar a excreção de amônio por um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em expressão alterada de um gene de biossíntese de AHL.

[00562] 204. Método para aumentar a excreção de amônio por um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em atividade alterada de uma enzima de degrada- ção de parede celular.

[00563] 205. Método para aumentar a excreção de amônio por um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em expressão alterada de um gene para uma en- zima de degradação de parede celular.

[00564] 206. Método para aumentar a excreção de amônio por um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em uma rede genética de fixação de nitrogênio al- terada.

[00565] 207. Método para aumentar a excreção de amônio por um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética que resulta em uma rede genética de assimilação de nitrogênio alterada.

[00566] 208. Método para aumentar a excreção de amônio por um micróbio, o método compreendendo a introdução de uma modificação genética em um gene no grupo que consiste em rpoE, rseA, cysP, cysZ, cysK, cysT, cysW, cysA, sbp, um cysZK óperon, um cysPTWA óperon, modE, modB, modA, um modEB óperon, um modEBA óperon, exbA, exbB, tonB, um exbAB óperon, isyhfA, yusV, sbnA, yfiZ, fiu, fur, glgA, NifA, nifH, nifD, nifK, grxA, grxB, grxC, grxD, trxA, trxC, tpx, um grxABCD óperon, um cydABX óperon, um cydAB óperon cydX, cydA, cyddB, glbN, fixNOPQ, fixN, fixO, foxP, fixQ, asnB, asnA, glnL, uridilil-transferase, amtB, glnK, GDH e glnD.

[00567] 209. Método para aumentar a sobrevivência de um micróbio em uma rizosfera, o método compreendendo a introdução de uma mo- dificação genética que resulta em atividade alterada de uma proteína envolvida em fixação da raiz.

[00568] 210. Método para aumentar a sobrevivência de um micróbio em uma rizosfera, o método compreendendo a introdução de uma mo- dificação genética que resulta em expressão alterada de um gene para uma proteína envolvida na fixação da raiz.

[00569] 211. Método para aumentar a sobrevivência de um micróbio em uma rizosfera, o método compreendendo a introdução de uma mo- dificação genética que resulta em atividade alterada de um transporta- dor de molibdênio.

[00570] 212. Método para aumentar a sobrevivência de um micróbio em uma rizosfera, o método compreendendo a introdução de uma mo- dificação genética que resulta em expressão alterada de um gene de transporte de molibdênio.

[00571] 213. Método para aumentar a sobrevivência de um micróbio em uma rizosfera, o método compreendendo a introdução de uma mo- dificação genética que resulta em atividade alterada de um transporta- dor de ferro.

[00572] 214. Método para aumentar a sobrevivência de um micróbio em uma rizosfera, o método compreendendo a introdução de uma mo- dificação genética que resulta em expressão alterada de um gene de transporte de ferro.

[00573] 215. Método para aumentar a sobrevivência de um micróbio em uma rizosfera, o método compreendendo a introdução de uma mo- dificação genética que resulta em biossíntese alterada de sideróforos.

[00574] 216. Método para aumentar a sobrevivência de um micróbio em uma rizosfera, o método compreendendo a introdução de uma mo- dificação genética que resulta em expressão alterada de um gene que controla a biossíntese de sideróforos.

[00575] 217. Método para aumentar a sobrevivência de um micróbio em uma rizosfera, o método compreendendo a introdução de uma mo- dificação genética que resulta em atividade alterada de um sequestra- dor de espécies reativas de oxigênio.

[00576] 218. Método para aumentar a sobrevivência de um micróbio em uma rizosfera, o método compreendendo a introdução de uma mo- dificação genética que resulta em expressão alterada de um gene de sequestro de espécies reativas de oxigênio.

[00577] 219. Método para aumentar a sobrevivência de um micróbio em uma rizosfera, o método compreendendo a introdução de uma mo- dificação genética que resulta em atividade alterada de uma proteína envolvida em sinalização de quórum.

[00578] 220. Método para aumentar a sobrevivência de um micróbio em uma rizosfera, o método compreendendo a introdução de uma mo- dificação genética que resulta em expressão alterada de um gene de sinalização de quórum.

[00579] 221. Método para aumentar a sobrevivência de um micróbio em uma rizosfera, o método compreendendo a introdução de uma mo- dificação genética que resulta em atividade alterada de aglutaninas.

[00580] 222. Método para aumentar a sobrevivência de um micróbio em uma rizosfera, o método compreendendo a introdução de uma mo- dificação genética que resulta em expressão alterada de aglutaninas.

[00581] 223. Método para aumentar a sobrevivência de um micróbio em uma rizosfera, o método compreendendo a introdução de uma mo- dificação genética que resulta em atividade alterada de uma proteína envolvida na formação de biofilme

[00582] 224. Método para aumentar a sobrevivência de um micróbio em uma rizosfera, o método compreendendo a introdução de uma mo- dificação genética que resulta em expressão alterada de um gene de formação de biofilme.

[00583] 225. Método para aumentar a sobrevivência de um micróbio em uma rizosfera, o método compreendendo a introdução de uma mo- dificação genética que resulta em atividade alterada de uma proteína de biossíntese de AHL.

[00584] 226. Método para aumentar a sobrevivência de um micróbio em uma rizosfera, o método compreendendo a introdução de uma mo- dificação genética que resulta em expressão alterada de um gene de biossíntese de AHL.

[00585] 227. Método para aumentar a sobrevivência de um micróbio em uma rizosfera, o método compreendendo a introdução de uma mo- dificação genética que resulta em atividade alterada de uma enzima de degradação de parede celular.

[00586] 228. Método para aumentar a sobrevivência de um micróbio em uma rizosfera, o método compreendendo a introdução de uma mo- dificação genética que resulta em expressão alterada de um gene para uma enzima de degradação de parede celular.

[00587] 229. Método para aumentar a sobrevivência de um micróbio em uma rizosfera, o método compreendendo a introdução de uma mo- dificação genética que resulta em uma rede genética de fixação de ni- trogênio alterada.

[00588] 230. Método para aumentar a sobrevivência de um micróbio em uma rizosfera, o método compreendendo a introdução de uma mo- dificação genética que resulta em uma rede genética de assimilação de nitrogênio alterada.

[00589] 231. Método para aumentar a sobrevivência de um micróbio em uma rizosfera, o método compreendendo a introdução de uma mo- dificação genética em um gene no grupo que consiste em fhaB, fhaC, yjbE, pssM, otsA, treY, smZ, lapA, phoB, phoR, MucA e pehA.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Bactéria geneticamente modificada, caracterizada pelo fato de que compreende uma modificação em glnD, em que a dita mod- ificação é selecionada a partir do grupo que consiste em: deleção do gene inteiro, deleção do gene substancialmente inteiro, deleção de um domínio de ACT, deleção de mais de 50% de um domínio de ACT, de- sativação de um domínio de ACT e desativação de um domínio de UTase.

2. Bactéria geneticamente modificada, caracterizada pelo fato de que compreende uma modificação em gInA que resulta em ex- pressão ou atividade alterada de gInA.

3. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a dita modificação resulta em diminuição de expressão de gInA.

4. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a dita modificação com- preende substituir o promotor nativo de gInA por um promotor com ati- vidade mais baixa.

5. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a dita modificação com- preende substituir o promotor nativo de gInA por um promotor selecio- nado a partir do grupo que consiste em: um promotor de gInB, um pro- motor de gInD e um promotor de gInE.

6. Bactéria geneticamente modificada, caracterizada pelo fato de que compreende uma modificação em gInA que resulta em diminuição de atividade ou expressão de gInA.

7. Bactéria geneticamente modificada, caracterizada pelo fato de que compreende expressão alterada de rpoN.

8. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a dita bactéria genetica- mente modificada tem expressão aumentada de rpoN.

9. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a dita bactéria genetica- mente modificada tem expressão aumentada de rpoN.

10. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a dita bactéria geneticamente modificada é uma bactéria diazotrófica geneticamente modificada.

11. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a expressão de rpoN é aumentada deletando-se o promotor nativo de rpoN e substituindo-se por um promotor constitutivo forte.

12. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a dita bactéria geneticamente modificada é intergenérica.

13. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a dita bactéria geneticamente modificada é capaz de fixar nitrogênio at- mosférico na presença de nitrogênio exógeno.

14. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a dita bactéria geneticamente modificada compreende uma modificação em uma rede genética de fixação de nitrogênio.

15. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a dita bactéria geneticamente modificada compreende uma modificação em NifA.

16. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a dita bactéria geneticamente modificada compreende uma modificação que resulta em expressão aumentada de NifA.

17. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a dita bactéria geneticamente modificada compreende uma modificação em NifL.

18. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a dita bactéria geneticamente modificada compreende uma modificação que resulta em expressão diminuída de NifL.

19. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a dita bactéria geneticamente modificada compreende uma modificação em NifH.

20. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a dita bactéria geneticamente modificada compreende uma modificação que resulta em expressão aumentada de NifH.

21. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a dita bactéria geneticamente modificada compreende uma modificação que resulta em expressão aumentada de aglomerado de genes de Nif.

22. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a dita bactéria geneticamente modificada compreende uma modificação em uma rede genética de assimilação de nitrogênio.

23. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a dita bactéria geneticamente modificada compreende uma modificação em GlnE.

24. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a dita bactéria geneticamente modificada compreende uma modificação que resulta em atividade diminuída de GlnE.

25. Bactéria geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a dita bactéria geneticamente modificada compreende uma modificação que resulta em atividade diminuída de amtB.

26. Método de aumento da quantidade de nitrogênio deri- vado da atmosfera em uma planta, caracterizado pelo fato de que com- preende colocar a dita planta em contato com uma pluralidade da dita bactéria geneticamente modificada, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 25.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a dita bactéria geneticamente modificada é aplicada a uma semente da dita planta.

28. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a dita bactéria geneticamente modificada é aplicada a uma muda da dita planta.

29. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a dita bactéria geneticamente modificada é aplicada à dita planta em uma formulação líquida.

30. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a dita bactéria geneticamente modificada é aplicada à dita planta após o plantio, mas antes da colheita da dita planta.

31. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a dita bactéria geneticamente modificada é aplicada à dita planta como adubação de cobertura.

32. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a dita bactéria geneticamente modificada é aplicada à dita planta entre um mês e oito meses após a germinação.

33. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a dita bactéria geneticamente modificada é aplicada à dita planta entre dois meses e oito meses após a germinação.

34. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a dita bactéria geneticamente modificada é aplicada à dita planta entre um mês e três meses após a germinação.

35. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a dita bactéria geneticamente modificada é aplicada à dita planta entre três meses e seis meses após a germinação.

36. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a dita planta é uma planta de cereal.

37. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a dita planta é uma planta de milho.

38. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a dita planta é uma planta de arroz.

39. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a dita planta é uma planta de trigo.

40. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a dita planta é uma planta de soja.

41. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma semente e um revestimento de semente; em que o revestimento de semente compreende uma pluralidade da dita bactéria genetica- mente modificada, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 25.

42. Composição, de acordo com a reivindicação 41, carac- terizada pelo fato de que a dita semente é uma semente de cereal.

43. Composição, de acordo com a reivindicação 41, carac- terizada pelo fato de que a dita semente é selecionada a partir do grupo que consiste em: uma semente de milho, uma semente de trigo, uma semente de arroz, uma semente de soja, uma semente de centeio e uma semente de sorgo.

44. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma planta e uma pluralidade da dita bactéria geneticamente modifi- cada, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 25.

45. Composição, de acordo com a reivindicação 44, carac- terizada pelo fato de que a dita planta é uma muda.

46. Composição, de acordo com a reivindicação 44, carac- terizada pelo fato de que a dita semente é uma semente de cereal.

47. Composição, de acordo com a reivindicação 44, carac- terizada pelo fato de que a dita semente é selecionada a partir do grupo que consiste em milho, arroz, trigo, soja, centeio e sorgo.