CN117757706A - 靶向改良植物性状的固氮的基因靶标 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了靶向改良植物性状的固氮的基因靶标。提供了用于生成和利用包含glnD中的修饰的基因工程菌的方法和系统，其中所述修饰选自由以下组成的组：缺失整个基因、缺失大体上整个基因、缺失ACT域、缺失ACT域的超过50％、使ACT域失活以及使UT酶域失活。

Description

靶向改良植物性状的固氮的基因靶标
本申请是中国专利申请号201880081988.5的分案申请。
交叉参考
本申请要求2017年10月25日提交的美国临时专利申请第62/577,149号的优先权，所述美国临时专利申请以全文引用的方式并入本文中。
背景技术
植物通过共享的代谢组(metabolome)与微生物组相关联。特定作物性状与底层代谢组之间的多维关系的特征在于具有许多局部极大值的概貌(landscape)。出于多种原因(如为了作物优化)，可能期望通过改变微生物组对代谢组的影响，从较差的局部极大值优化为代表更好性状的另一局部极大值。需要经济、环境和社会可持续的农业和粮食生产方法以满足日益增长的全球人口的需求。联合国粮食及农业组织(United Nations’Food andAgriculture Organization)预计，到2050年，粮食总产量必须提高70％以满足不断增长的人口的需求，这是一项挑战，因许多因素而更加严重，包括淡水资源减少、对耕地的竞争加剧、能源价格上涨、投入成本提高以及作物可能需要适应更干、更热和更加极端的全球气候的压力。
所关注的领域之一是对固氮的改进。氮气(N2)是地球大气的主要组分。另外，元素氮(N)是构成活生物体的许多化合物的重要组分。然而，许多生物体无法直接使用N2来合成生理过程(如生长和繁殖)中所使用的化学物质。为了利用N2，必须将N2与氢组合。氢与N2组合被称作固氮。无论是以化学方式还是以生物方式实现，固氮都需要大量能量投资。在生物系统中，被称为固氮酶(nitrogenase)的酶催化引起固氮的反应。固氮研究的一个重要目标是将这种表型扩展到非豆科植物(non-leguminous plant)，尤其重要的农艺禾草，如小麦、水稻和玉米。尽管在理解根瘤菌属(rhizobia)与豆科植物之间固氮共生的建立方面取得了巨大进展，但用所述知识在非豆科作物上诱导固氮根瘤(nodule)的途径仍不清楚。同时，随着对增加粮食生产的需求不断增加，提供充足的补充氮源(如在肥料中)的挑战将继续增加。
发明内容
本公开提供了包含glnD中的修饰的基因工程菌(genetically engineeredbacterium)，其中所述修饰选自由以下组成的组：缺失整个基因、缺失大体上整个基因、缺失ACT域、缺失ACT域的超过50％、使ACT域失活以及使UT酶域失活。在一些实施例中，基因工程菌包含glnA中的修饰，所述修饰引起glnA的表达或活性改变。在一些实施例中，修饰引起glnA的表达降低。在一些实施例中，修饰包含用具有较低活性的启动子置换glnA的天然启动子。在一些实施例中，修饰包含用选自由以下组成的组的启动子置换glnA的天然启动子：glnB启动子、glnD启动子以及glnE启动子。在一些实施例中，基因工程菌包含glnA中的修饰，所述修饰引起glnA的表达或活性降低。
本公开提供了包含rpoN表达改变的基因工程菌。在一些实施例中，基因工程菌的rpoN表达提高。在一些实施例中，基因工程菌的rpoN表达提高。在一些实施例中，根据权利要求1至9中任一项所述的基因工程菌，其中所述基因工程菌是基因工程固氮(diazotrophic)细菌。在一些实施例中，通过缺失天然rpoN启动子并且用强组成型启动子(strong constitutive promoter)置换来提高rpoN表达。在一些实施例中，基因工程菌是属间(intergeneric)的。在一些实施例中，基因工程菌能够在外源氮存在下固定大气氮。在一些实施例中，基因工程菌包含固氮基因网络中的修饰。在一些实施例中，基因工程菌包含NifA中的修饰。在一些实施例中，基因工程菌包含引起NifA表达提高的修饰。在一些实施例中，基因工程菌包含NifL中的修饰。在一些实施例中，基因工程菌包含引起NifL表达降低的修饰。在一些实施例中，基因工程菌包含NifH中的修饰。在一些实施例中，基因工程菌包含引起NifH表达提高的修饰。在一些实施例中，所述基因工程菌包含引起Nif簇基因表达提高的修饰。在一些实施例中，基因工程菌包含氮同化基因网络中的修饰。在一些实施例中，基因工程菌包含GlnE中的修饰。在一些实施例中，基因工程菌包含引起GlnE活性降低的修饰。在一些实施例中，基因工程菌包含引起amtB活性降低的修饰。
本公开提供了增加植物中大气源性氮的量的方法，其包含使所述植物与多种本文所描述的所述基因工程菌接触。在一些实施例中，将基因工程菌施加到所述植物的种子。在一些实施例中，将基因工程菌施加到所述植物的幼苗。在一些实施例中，将基因工程菌以液体配制物的形式施加到所述植物。在一些实施例中，在所述植物种植后但在所述植物收获前，将基因工程菌施加到所述植物。在一些实施例中，将基因工程菌作为侧施肥料(sidedressing)施加到所述植物。在一些实施例中，在发芽后一个月与八个月之间，将基因工程菌施加到所述植物。在一些实施例中，在发芽后两个月与八个月之间，将基因工程菌施加到所述植物。在一些实施例中，在发芽后一个月与三个月之间，将基因工程菌施加到所述植物。在一些实施例中，在发芽后三个月与六个月之间，将基因工程菌施加到所述植物。在一些实施例中，植物是谷类植物。在一些实施例中，植物是玉米。在一些实施例中，植物是水稻。在一些实施例中，植物是小麦。在一些实施例中，植物是大豆。
本公开提供了一种组合物，其包含种子和种子包衣；其中种子包衣包含多种如本文所描述的所述基因工程菌。在一些实施例中，种子是谷类种子。在一些实施例中，种子选自由以下组成的组：玉米种子、小麦种子、水稻种子、大豆种子、黑麦种子以及高粱种子。本公开提供了包含植物和多种本文所描述的所述基因工程菌的组合物。在一些实施例中，植物是幼苗。在一些实施例中，种子是谷类种子。在一些实施例中，种子选自由以下组成的组：玉米、水稻、小麦、大豆、黑麦以及高粱。
通过引用并入
本说明书中提及的所有公开、专利和专利申请都以引用的方式并入本文中，其引用的程度如每个单独的公开、专利或专利申请经特定并且单独地指示以引用的方式并入一般。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求书中细致阐述。将参考以下详细说明和附图来获得对本发明特征和优势的更好理解，以下详细说明阐述利用了本发明原理的说明性实施例，在附图中：
图1A-B描绘了固氮细菌的富集和分离。(A)Nfb琼脂板用于分离固氮细菌的单一菌落。(B)在鲍尔奇管(Balch tube)中浇注的半固态Nfb琼脂。箭头指向富集的固氮细菌的表膜。
图2描绘了代表性的nifH PCR筛选。在这一筛选中，针对两个菌落，在约350bp处观察到阳性带。较低的带代表引物二聚体。
图3描绘了来自CRISPR-Cas选择的诱变的菌落的PCR筛选的一个实例。用对nifL基因座具有特异性的引物筛选CI006菌落。野生型PCR产物预期在约2.2kb处，而突变体预期在约1.1kb处。所筛选的十个菌落中的七个明确显示所需缺失。
图4A-D描绘了各种菌株的体外表型。在补充有0到10mM谷氨酰胺的固氮培养基中生长的菌株CI010的突变体(图4A)和菌株CI006的突变体(图4B)的乙炔还原分析(ARA)活性。图4C中显示了其它菌株的ARA活性，并且图4D中显示了两个菌株跨时间的铵排泄概况。
图5描绘了固氮中所涉及的菌株CI006中9种不同基因的培养表达谱。数字代表每个转录物的计数。指示了各种条件(0、1、10mM谷氨酰胺和N2中0％、10％、20％大气)。
图6描绘了玉米根的CI006定殖。玉米幼苗用带有RFP表达质粒的CI006接种。生长并且通过用适当的抗生素浇灌维持质粒两周后，收获根并且通过荧光显微法成像。观察到根细胞间隙的定殖。
图7描绘了源自WT(CI050)和优化(CM002)菌株中微生物水平的氮。
图8显示了Micro-Tom结果质量分析的实验装置。
图9显示了针对增加Micro-Tom植物果实的质量的10个菌株的筛选。呈现了六次重复的结果。对于第3列，p＝0.07。对于第7列，p＝0.05。
图10A-C描绘了在补充有0到10mM谷氨酰胺的固氮培养基中生长的候选微生物和对应候选突变体的ARA活性的其它结果。
图11描绘了双重突变体，其展现比其所衍生自的单一突变体更高的氨排泄。
图12描绘了从用于测量施肥条件下玉米中的NDFA的15N气体吸收实验获得的NDFA(使用暴露天数反向外推)。
图13描绘了从用于测量施肥条件下狗尾草属(Setaria)植物中的NDFA的15N气体吸收实验获得的NDFA值(使用暴露天数反向外推)。
图14A描绘了15N气体的并入率。与未接种的植物相比，用进化型菌株接种的植物显示15N气体并入增加。
图14B描绘了种植后4周，用进化型菌株接种的植物中至多7％的氮源自微生物固定的氮。
图14C描绘了与未接种或野生型接种的植物相比，用进化型菌株接种的植物的叶面积(和其它生物量量度，数据未显示)增加。
图15A描绘了进化型菌株，其如植物转录组学研究中所测量，在根组织中显示显著更高的nifH产生。
图15B描绘了在植物组织中发现的固定氮的比率与特定植物由HoME优化菌株定殖的比率相关。
图16A描绘了测试定殖的各种田间土壤的土壤质地图。几种微生物最初来源的土壤指示为星号。
图16B描绘了遍及四种不同土壤类型(圆圈)测试的菌株l和菌株5的定殖率。两种菌株显示遍及不同土壤类型相对稳健的定殖概况。
图16C描绘了如在生长季节的跨度中在田间试验中测试的菌株1的定殖。菌株1在种植后的至多12周一直存在于玉米组织中，并且此后开始显示定殖衰退。
图17描绘了根据实施例的微生物育种的示意图。
图18描绘了如图17所示的微生物组组成测量的放大图。
图19A和19B描绘了具有糖原合成基因glgA中的修饰的蔗糖小迫氏菌(K.sacchari)菌株C1006的突变体中提高的固氮酶活性和增加的铵排泄。
图20A和20B描绘了相比于具有相同基因型但缺乏glgA修饰的亲本菌株，具有糖原合成基因glgA中的修饰的变栖克雷伯氏菌(K.variicola)菌株CI137的突变体中提高的固氮酶活性和增加的铵排泄。
图21示出了glnE基因的示意图，显示与GlnE蛋白的功能域相对应的区。
图22描绘了在具有glnD基因中的修饰的变栖克雷伯氏菌菌株CI137的突变体中，基本(minimal)无氮培养基中的铵排泄增加。
图23描绘了具有glnD基因中的修饰的蔗糖小迫氏菌菌株CI006的突变体中的铵排泄增加。
图24A描绘了在具有glnK基因中的修饰的变栖克雷伯氏菌菌株CI137的突变体中，基本无氮培养基中的铵排泄增加。
图24B描绘了在补充有5mM谷氨酰胺的基本培养基中，相比于具有glnE_KO2突变的菌株，具有glnA基因中的修饰的变栖克雷伯氏菌菌株CI137的突变体中的铵排泄增加，所述修饰通过在上游插入来自以低水平组成性表达的基因(glnE、glnD或glnB)的启动子，并且将ATG起始密码子突变为GTG而产生。
图25描绘了在补充有5mM谷氨酰胺的基本培养基中，相比于具有glnE_KO2和ΔnifL：：Prm1.2突变的菌株，具有glnA基因中的修饰的变栖克雷伯氏菌菌株CI137的突变体中的铵排泄增加，所述修饰通过在上游插入来自以低水平组成性表达的基因(glnE、glnD或glnB)的启动子，并且将ATG起始密码子突变为GTG而产生。
图26描绘了在基本无氮培养基中，相比于具有glnE_KO2和ΔnifL：：Prml.2突变的菌株，具有glnA基因中的修饰的蔗糖小迫氏菌菌株CI006的突变体中的铵排泄增加，所述修饰通过在上游插入来自以低水平组成性表达的基因(glnE、glnD或glnB)的启动子，并且将ATG起始密码子突变为GTG而产生。
图27描绘了与亲本菌株137-2084相比，具有编码GOGAT的操纵子(glnBD)中的修饰的变栖克雷伯氏菌菌株CI137的突变体中铵排泄增加，所述修饰通过在操纵子上游插入glnD启动子而产生。
图28描绘了与亲本菌株137-2084相比，具有编码GOGAT的操纵子(glnBD)中的修饰的变栖克雷伯氏菌菌株CI137的突变体中如通过ARA测量的固氮酶活性提高，所述修饰通过在操纵子上游插入glnD启动子而产生。
图29描绘了与亲本对照相比，具有谷氨酰胺酶glsA2表达的修饰的蔗糖小迫氏菌菌株CI006的突变体中铵排泄增加，所述修饰通过在glsA2基因上游插入强启动子而产生。
图30描绘了与亲本对照相比，具有谷氨酰胺酶glsA2表达的修饰的变栖克雷伯氏菌菌株CI137的突变体中铵排泄增加，所述修饰通过在glsA2基因上游插入强启动子而产生。
图31描绘了与亲本对照菌株相比，具有asnB基因中的修饰的变栖克雷伯氏菌菌株CI137突变体中铵排泄增加。
图32描绘了与亲本对照相比，具有rpoN修饰的变栖克雷伯氏菌菌株CI137的突变体中固氮酶活性提高。
图33描绘了与亲本对照相比，具有rpoN修饰的变栖克雷伯氏菌菌株CI137的突变体中氮排泄增加。
图34描绘了与亲本对照相比，具有otsB基因表达改变的蔗糖小迫氏菌菌株C1006的突变体中固氮酶活性提高。
图35描绘了与亲本对照相比，具有otsB基因表达改变的蔗糖小迫氏菌菌株CI006的突变体中氮排泄增加。
图36A和36B描绘了与亲本对照相比，具有phoB中的修饰的变栖克雷伯氏菌菌株CI137的突变体中氮排泄未改变并且定殖增加。
图37描绘了与亲本对照相比，具有yjbE中的修饰的蔗糖小迫氏菌菌株CI006的突变体中定殖增加。
图38A和B描绘了与亲本菌株相比，具有硫酸盐转运基因otsB表达的修饰的蔗糖小迫氏菌菌株CI006的突变体的固氮酶活性提高并且氮排泄增加，所述修饰通过在所述基因的直接上游插入启动子而产生。
图39A和39B描绘了与亲本菌株相比，具有硫酸盐转运基因cysZ表达的修饰的蔗糖小迫氏菌菌株CI006的突变体的固氮酶活性提高，所述修饰通过在所述基因的直接上游插入启动子而产生。
图40A和40B描绘了在具有dctA1和dctA2中的修饰的变栖克雷伯氏菌菌株CI137的突变体中铵排泄增加。
图41A和41B示出了具有在nifA上游插入的不同启动子和RBS序列的几种菌株中nifH转录物与nifA转录物的比率。
具体实施方式
术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”以及“寡核苷酸”可互换使用。其是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)或其类似物的聚合形式。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析确定的基因座(loci/locus)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、分离的具有任何序列的DNA、分离的具有任何序列的RNA、核酸探针以及引物。多核苷酸可以包含一个或多个修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，则对核苷酸结构的修饰可以在聚合物组装之前或之后赋予。核苷酸序列可以间杂有非核苷酸组分。多核苷酸可以在聚合后进一步修饰，如通过与标记组分缀合。
“杂交”是指一种或多种多核苷酸反应形成通过核苷酸残基的碱基之间的氢键键合而稳定的复合物的反应。氢键键合可以通过沃森克里克碱基配对(Watson Crick basepairing)、胡格斯坦结合(Hoogstein binding)或根据碱基互补以任何其它序列特异性方式发生。复合物可以包含形成双链体结构的两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、单个自杂交链或这些的任何组合。杂交反应可以构成更广泛过程中的一个步骤，所述过程如起始PCR或通过核酸内切酶对多核苷酸进行酶促切割。与第一序列互补的第二序列被称作第一序列的“互补序列”。如应用于多核苷酸的术语“可杂交”是指多核苷酸在杂交反应中形成通过核苷酸残基的碱基之间的氢键键合而稳定的复合物的能力。
“互补性”是指核酸通过传统的沃森-克里克或其它非传统类型与另一核酸序列形成(多个)氢键的能力。互补性百分比指示可以与第二核酸序列形成氢键(例如，沃森-克里克碱基配对)的核酸分子中的残基百分比(例如，10分之5、6、7、8、9、10分别是50％、60％、70％、80％、90％以及100％互补)。“完全互补”意指核酸序列的所有连续残基将与第二核酸序列中相同数目的连续残基氢键键合。如本文所用，“大体上互补”是指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸的区上至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的互补程度，或是指在严格条件下杂交的两个核酸。序列同一性(如出于评定互补性百分比的目的)可以通过任何合适的比对算法进行测量，所述算法包括但不限于尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(参见例如可在www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html获得的EMBOSS Needle比对器，任选地利用默认设置)、BLAST算法(参见例如可在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi获得的BLAST比对工具，任选地利用默认设置)或史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)算法(参见例如可在www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html获得的EMBOSS Water比对器，任选地利用默认设置)。最佳比对可以使用所选算法的任何合适的参数，包括默认参数进行评定。
一般来说，杂交的“严格条件”是指与靶序列具有互补性的核酸主要与靶序列杂交，并且大体上不与非靶序列杂交的条件。严格条件一般是序列依赖性的，并且根据数个因素而不同。一般来说，序列越长，序列与其靶序列特异性杂交的温度越高。严格条件的非限制性实例在Tijssen(1993)，《生物化学和分子生物学实验室技术-用核酸探针杂交(Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-HybridizationWith Nucleic Acid Probes)》，第I部分，第二章“杂交原理概述和核酸探针分析策略(Overview ofprinciples ofhybridizationand the strategy ofnucleic acid probeassay)”，纽约州爱思唯尔(Elsevier，N.Y)中详细描述。
一般来说，“序列同一性”是指两个多核苷酸或多肽序列的精确核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸的分别对应关系。典型地，用于确定序列同一性的技术包括确定多核苷酸的核苷酸序列和/或确定由此编码的氨基酸序列，并且将这些序列与第二核苷酸或氨基酸序列进行比较。可以通过确定两个或更多个序列(多核苷酸或氨基酸)的“同一性百分比”来对其进行比较。两个序列(无论是核酸序列还是氨基酸序列)的同一性百分比可以按两个比对序列之间的精确匹配数除以较短序列的长度并且乘以100计算。在一些情况下，测试序列与参考序列(无论是核酸序列还是氨基酸序列)的同一性百分比可以按两个比对序列之间的精确匹配数除以参考序列的长度并且乘以100计算。举例来说，还可以例如通过使用可从美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)获得的先进BLAST计算机程序(包括2.2.9版)比较序列信息来确定同一性百分比。BLAST程序基于Karlin和Altschul，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》87：2264-2268(1990)的比对方法并且如Altschul等人，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》215：403-410(1990)；Karlin和Altschul，《美国国家科学院院刊》90：5873-5877(1993)；和Altschul等人，《核酸研究(Nucleic AcidsRes.)》25：3389-3402(1997)中所论述。简单来说，BLAST程序将同一性定义为相同比对符号(一般为核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列中较短者的符号总数目。所述程序可以用于确定所比较的蛋白质整个长度上的同一性百分比。提供默认参数以优化短查询序列的搜索，例如在blastp程序的情况下。所述程序还允许使用SEG过滤器来掩蔽查询序列的节段，如由Wootton和Federhen，《计算机与化学(Computers and Chemistry)》17：149-163(1993)的SEG程序所确定。所需序列同一性程度的范围为大致80％到100％和其间的整数值。典型地，所公开的序列和要求保护的序列之间的同一性百分比为至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％。
如本文所用，“表达”是指从DNA模板转录多核苷酸(如转录成mRNA或其它RNA转录物)的过程和/或将转录的mRNA随后翻译成肽、多肽、或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可以统称为“基因产物”。如果多核苷酸源自基因组DNA，则表达可以包括在真核细胞中剪接mRNA。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于指代任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是直链或支链的，其可以包含修饰的氨基酸，并且其可以间杂有非氨基酸。所述术语还涵盖已修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操纵，例如与标记组分缀合。如本文所用，术语“氨基酸”包括天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D或L旋光异构体两者，以及氨基酸类似物和肽模拟物。
如本文所用，术语“约”与术语“大致”同义使用。说明性地，相对于量使用术语“约”指示稍微超出所列举的值的值，例如，加或减0.1％到10％。
术语“生物纯培养物”或“大体上纯培养物”是指本文所描述的细菌物种的培养物，其不含足以干扰培养物复制或由普通细菌学技术检测到的量的其它细菌物种。
“植物生产力”一般是指植物生长或发育的任何方面，这是植物生长的原因。对于粮食作物，如谷物或蔬菜，“植物生产力”可以指从特定作物收获的谷物或果实的产量。如本文所用，植物生产力提高广泛地指出于各种目的而收获的谷物、果实、花或其它植物部分的产量提高；植物部分，包括茎、叶和根的生长改善；促进植物生长；维持叶片中的高叶绿素含量；增加果实或种子数目；增加果实或种子单位重量；由于减少的氮肥使用而减少NO2排放；以及植物生长发育的类似改善。
粮食作物中和粮食作物周围的微生物会影响那些作物的性状。可能受微生物影响的植物性状包括：产量(例如，谷物生产、生物量生成、果实发育、花形成)；营养(例如，氮、磷、钾、铁、微量营养素获取)；非生物胁迫管理(例如，耐旱性、耐盐性、耐热性)；以及生物胁迫管理(例如，害虫、杂草、昆虫、真菌以及细菌)。改变作物性状的策略包括：提高关键代谢物浓度；改变微生物对关键代谢物影响的时间动态；将微生物代谢物产生/降解与新的环境线索相联系；减少负面代谢物；以及改善代谢物或底层蛋白质的平衡。
如本文所用，“控制序列”是指操纵子、启动子、沉默子或终止子。
在一些实施例中，本公开的基因的天然或内源控制序列由一个或多个属内控制序列置换。
如本文所用，“引入”是指通过现代生物技术引入，并且不是自然发生的引入。
在一些实施例中，本公开的细菌已被修饰，使得其不是天然存在的细菌。
在一些实施例中，本公开的细菌以每克植物鲜重或干重至少103cfu、104cfu、105cfu、106cfu、107cfu、108cfu、109cfu、1010cfu、1011cfu或1012cfu的量存在于植物中。在一些实施例中，本公开的细菌以每克植物鲜重或干重至少约103cfu、约104cfu、约105cfu、约106cfu、约107cfu、约108cfu、约109cfu、约1010cfu、约1011cfu或约1012cfu的量存在于植物中。在一些实施例中，本公开的细菌以每克植物鲜重或干重至少103到109、103到107、103到105、105到109、105到107、106到1010、106到107cfu的量存在于植物中。
本公开的肥料和外源氮可以包含以下含氮分子：铵、硝酸盐、亚硝酸盐、氨、谷氨酰胺等。本公开的氮源可以包括无水氨、硫酸氨、尿素、磷酸二铵、脲甲醛(urea-form)、磷酸一铵、硝酸铵、氮溶液、硝酸钙、硝酸钾、硝酸钠等。
如本文所用，“外源氮”是指在非氮限制条件下存在的土壤、田地或生长介质中容易获得的非大气氮，包括氨、铵、硝酸盐、亚硝酸盐、尿素、尿酸、铵酸等。
如本文所用，“非氮限制条件”是指土壤、田地、介质中可获得的非大气氮，其浓度大于约4mM氮，如Kant等人(2010.《实验生物学杂志(J.Exp.Biol.)》62(4)：1499-1509)所公开，其以引用的方式并入本文中。
如本文所用，“引入的遗传物质”意指添加到接受者基因组并且作为所述基因组的组分保留的遗传物质。
在一些实施例中，固氮和同化的基因调控网络包含多核苷酸编码基因和非编码序列，其引导、调节和/或调控微生物固氮和/或同化，并且可以包含nif簇(例如，hifA、nifB、nifC......nifZ)多核苷酸序列、编码氮调控蛋白C的多核苷酸、编码氮调控蛋白B的多核苷酸、gln簇(例如glnA和glnD)的多核苷酸序列、draT以及氨转运蛋白/通透酶。在一些情况下，Nif簇可以包含NifB、NifH、NifD、NifK、NifE、NifN、NifX、hesa以及NifV。在一些情况下，Nif簇可以包含NifB、NifH、NifD、NifK、NifE、NifN、NifX、hesa以及NifV的亚类。
在一些实施例中，本公开的肥料包含按重量计至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的氮。
在一些实施例中，本公开的肥料包含按重量计至少约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的氮。
在一些实施例中，本公开的肥料包含按重量计约5％到50％、约5％到75％、约10％到50％、约10％到75％、约15％到50％、约15％到75％、约20％到50％、约20％到75％、约25％到50％、约25％到75％、约30％到50％、约30％到75％、约35％到50％、约35％到75％、约40％到50％、约40％到75％、约45％到50％、约45％到75％或约50％到75％的氮。
在一些实施例中，相对于未暴露于本公开的细菌的对照植物，测量到植物中氮固定增加和/或产生1％或更多的氮。细菌的所有增加或减少相对于对照细菌测量。植物的所有的增加或减少相对于对照植物测量。
如本文所用，“组成型启动子”是在大部分条件下和/或在大部分发育阶段期间具有活性的启动子。在用于生物技术中的表达载体中使用组成型启动子有几个优点，如：用于选择转基因细胞或生物体的蛋白质的高产生水平；报告蛋白或可评分标记物的高表达水平，使得易于检测和定量；作为调控转录系统一部分的转录因子的高产生水平；产生在生物体中需要普遍存在的活性的化合物；以及产生在发育的所有阶段所需的化合物。非限制性示例性组成型启动子包括CaMV 35S启动子、冠瘿碱(opine)启动子、泛素启动子、醇脱氢酶启动子等。
如本文所用，“非组成型启动子”是在某些条件下、在某些类型的细胞中和/或在某些发育阶段期间具有活性的启动子。举例来说，组织特异性、组织优先、细胞类型特异性、细胞类型优先、诱导型启动子以及在发育控制下的启动子为非组成型启动子。在发育控制下的启动子的实例包括优先在某些组织中起始转录的启动子。
如本文所用，“诱导型”或“阻抑型”启动子是在化学或环境因素控制下的启动子。可能影响诱导型启动子转录的环境条件的实例包括厌氧条件、某些化学物质、光的存在、酸性或碱性条件等。
如本文所用，“组织特异性”启动子是仅在某些组织中起始转录的启动子。与基因的组成性表达不同，组织特异性表达是几个相互作用水平的基因调控的结果。因此，在所属领域中，有时优选使用来自同源或紧密相关物种的启动子以实现转基因在特定组织中的有效和可靠表达。这是大量从特定组织分离的组织特异性启动子见于科学和专利文献中的主要原因之
如本文所用，术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上的核酸序列的缔合，使得一个核酸序列的功能由另一个调控。举例来说，启动子在其能够调控编码序列的表达时与所述编码序列可操作地连接(即，编码序列在启动子的转录控制下)。编码序列可以以正义或反义方向可操作地连接到调控序列。在另一实例中，本公开的互补RNA区域可以在5′端与靶mRNA可操作地连接(直接或间接)，或在3′端与靶mRNA可操作地连接，或在靶mRNA内，或针对靶mRNA来说，第一互补区域是5′并且其互补序列是3′。
固氮调控
可以作为本文所描述的方法的调控靶标的一种性状是固氮。氮肥是农场的最大运营费用，并且是如玉米和小麦的行栽作物(row crop)更高产的最大驱动因素。本文描述了可以在非豆科作物中递送可再生形式的氮的微生物产品。尽管一些内生菌(endophyte)在纯培养中具有固氮所需的遗传学，但根本的技术挑战是谷类和草的野生型内生菌在施肥田中停止固氮。施加化肥和田间土壤中残留的氮水平用信号通知微生物关闭固氮的生化路径。
需要改变固氮调控网络的转录水平和翻译后水平，以开发能够在肥料存在下固氮并且将氮转移给玉米的微生物。为此，本文描述了宿主-微生物进化(HoME)技术，以精确地进化调控网络并且诱发新的表型。本文还描述了从玉米中分离的固氮内生菌的独特专有库，其与围绕在不同环境条件(如氮胁迫和过量)下微生物与宿主植物相互作用的广泛的组学(omics)数据配对。这项技术使得内生菌的基因调控网络能够精确进化，以产生即使在田间存在肥料的情况下也活跃地固氮的微生物。本文还描述了对定殖于玉米根部组织并且为施肥的植物产生氮的微生物的技术的潜力评估，和对内生菌与标准配制实践和不同土壤的相容性的评估，以确定将微生物整合到现代氮管理策略中的可行性。
为了利用元素氮(N)进行化学合成，生命形式将可在大气中获得的氮气(N2)与氢在被称为固氮的过程中组合。由于生物固氮的能量密集型性质，固氮生物(diazotroph)(固定大气中的氮气的细菌和古细菌)已进化出响应于环境氧气和可用氮气对nif基因簇的精密而严格的调控。Nif基因编码固氮中所涉及的酶(如固氮酶复合物)和调控固氮的蛋白质。Shamseldin(2013.《全球生物技术与生物化学杂志(Global J.Biotechnol.Biochem.)》8(4)：84-94)公开了nif基因和其产物的详细描述，并且以引用的方式并入本文中。本文描述了产生具有改良的性状的植物的方法，其包含从第一植物分离细菌，将基因变异引入到经分离细菌的nif基因中，使第二植物暴露于变异细菌，从相对于第一植物具有改良的性状的第二植物分离细菌，以及用从第二植物分离的细菌重复步骤。
在变形菌门(Proteobacteria)中，固氮调控以σ54依赖性增强子结合蛋白NifA，nif簇的正转录调控子为中心。细胞内活性NifA的水平受两个关键因素控制：nifLA操纵子的转录，和通过与NifL的蛋白质-蛋白质相互作用对NifA活性的抑制。这两个过程均通过PII蛋白信号传导级联响应于细胞内谷氨酰胺水平。这一级联由GlnD介导，GlnD直接感应谷氨酰胺并且分别响应是否存在结合的谷氨酰胺，催化两种PII调控蛋白，GlnB和GlnK的尿苷酰化或去尿苷酰化。在氮过量的条件下，未修饰的GlnB用信号通知nifLA启动子失活。然而，在氮限制的条件下，GlnB经翻译后修饰，这抑制了其活性并且引起nifLA操纵子转录。以这种方式，通过PII蛋白信号传导级联，响应于环境氮紧密控制nifLA转录。在NifA调控的翻译后水平上，GlnK依赖于细胞内游离GlnK的总体水平抑制NifL/NifA相互作用。
NifA由nifLA操纵子转录，其启动子由磷酸化NTRC，另一σ54依赖性调控子活化。NtrC的磷酸化状态由组氨酸激酶NtrB介导，NtrB与去尿苷酰化的GlnB而非尿苷酰化的GlnB相互作用。在氮过量的条件下，细胞内的高谷氨酰胺水平引起GlnB的去尿苷酰化，随后GlnB与NtrB相互作用以使其磷酸化活性失活并且活化其磷酸酶活性，引起NtrC脱磷酸化和nifLA启动子失活。然而，在氮限制的条件下，低水平的细胞内谷氨酰胺引起GlnB尿苷酰化，这抑制GlnB与NtrB的相互作用，并且允许NtrC磷酸化和nifLA操纵子转录。以这种方式，通过PII蛋白信号传导级联响应于环境氮紧密控制nifLA表达。nifA、ntrB、ntrC以及glnB都是可以在本文所描述的方法中突变的基因。这些过程也可能响应于细胞内的氨、尿素或硝酸盐水平。
NifA的活性也响应于环境氮经翻译后调控，最典型地是通过NifL介导的NifA活性抑制。一般来说，NilL和NifA的相互作用受经由GlnK的PII蛋白信号传导级联影响，不过在固氮生物之间，GlnK与NifL/NifA之间的相互作用的性质差异很大。在肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中，两种形式的GlnK均抑制NifL/NifA相互作用，并且GlnK与NifL/NifA之间的相互作用由细胞内游离GlnK的总体水平决定。在氮过量的条件下，去尿苷酰化的GlnK与铵转运蛋白AmtB相互作用，这既用以阻断AmtB吸收铵，又将GlnK螯合到膜上，从而允许由NifL抑制NifA。另一方面，在棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)中，NifL/NifA相互作用和NifA抑制需要与去尿苷酰化的GlnK相互作用，而GlnK的尿苷酰化抑制其与NifL的相互作用。在缺乏nifL基因的固氮生物中，有证据表明NifA活性在氮过量的条件下直接由与GlnK和GlnB两者的去尿苷酰化形式相互作用抑制。在一些细菌中，Nif簇可能受glnR调控，并且另外在一些情况下，这可能包含负调控。无论机制如何，NifA的翻译后抑制都是大多数已知固氮生物中nif簇的重要调控子。另外，nifL、amtB、glnK以及glnR是可以在本文所描述的方法中突变的基因。
除了调控nif基因簇的转录外，许多固氮生物进化出用于直接翻译后修饰和抑制固氮酶本身的机制，被称为固氮酶关闭。这由在氮过量条件下Fe蛋白(NifH)的ADP-核糖基化介导，这破坏了Fe蛋白与MoFe蛋白复合物(NifDK)的相互作用并且废除固氮酶活性。DraT催化Fe蛋白的ADP-核糖基化和固氮酶的关闭，而DraG催化ADP-核糖的去除和固氮酶的再活化。与nifLA转录和NifA抑制一样，固氮酶关闭也通过PII蛋白信号传导级联调控。在氮过量条件下，去尿苷酰化的GlnB与DraT相互作用并且活化DraT，而去尿苷酰化的GlnK与DraG和AmtB两者相互作用，形成复合物，将DraG螯合到膜。在氮限制条件下，GlnB和GlnK的尿苷酰化形式不分别与DraT和DraG相互作用，引起DraT失活和DraG向Fe蛋白的扩散，在Fe蛋白中，DraG去除ADP-核糖并且活化固氮酶。本文所描述的方法还涵盖将基因变异引入到nifH、nifD、nifK以及draT基因中。
虽然一些内生菌能够在体外固氮，但往往遗传学在田间由高水平的外源性化肥沉默。可以将外源氮的感应与固氮酶的表达解除联系，以促进基于田间的固氮。提高固氮酶活性跨时间的积分进一步用于增加氮产生，以供作物利用。使用本文所描述的方法促进基于田间的固氮的基因变异的特定靶标包括一种或多种选自由以下组成的组的基因：nifA、nifL、ntrB、ntrC、glnA、glnB、glnK、draT、amtB、glnD、glnE、nifJ、nifH、nifD、nifK、nifY、nifE、nifN、nifU、nifS、nifV、nifW、nifZ、nifM、nifF、nifB以及nifQ。
使用本文所描述的方法促进基于田间的固氮的基因变异的另一靶标是NifA蛋白。NifA蛋白典型地是固氮基因表达的活化子。增加NifA产生(组成性地或在高氨条件期间)避开天然氨感应路径。另外，减少NifL蛋白(一种已知的NifA抑制剂)产生也引起游离活性NifA水平提高。另外，提高nifAL操纵子的转录水平(组成性地或在高氨条件期间)也引起总体较高水平的NifA蛋白。通过改变启动子本身或通过降低NtrB(原先会引起高氮条件期间nifAL操纵子关闭的ntrB和ntrC信号传导级联的一部分)表达来实现nifAL表达水平提高。通过本文所描述的这些或任何其它方法实现的高水平的NifA提高内生菌的固氮活性。
使用本文所描述的方法促进基于田间的固氮的基因变异的另一靶标是GlnD/GlnB/GlnKPII信号传导级联。细胞内谷氨酰胺水平通过GlnD/GlnB/GlnK PII信号传导级联感应。废除GlnD的尿苷酰基去除活性的GlnD中的活性位点突变破坏了氮感应级联。另外，降低GlnB浓度使谷氨酰胺感应级联短路。这些突变“欺骗”细胞感知氮限制状态，从而提高固氮水平活性。这些过程也可能响应于细胞内或细胞外的氨、尿素或硝酸盐水平。
amtB蛋白也是使用本文所描述的方法促进基于田间的固氮的基因变异的靶标。可以通过降低amtB蛋白的表达水平来减少从环境中吸收氨。没有细胞内的氨，内生菌就无法感应到高水平的氨，从而阻止固氮基因的下调。设法进入细胞内区室的任何氨都会转化成谷氨酰胺。细胞内谷氨酰胺水平是氮感应的主要通货。降低细胞内谷氨酰胺水平阻止细胞感应环境中的高铵水平。可以通过提高谷氨酰胺酶(一种将谷氨酰胺转化成谷氨酸的酶)的表达水平来实现这种效果。另外，还可以通过减少谷氨酰胺合酶(一种将氨转化成谷氨酰胺的酶)来减少细胞内谷氨酰胺。在固氮生物中，固定的氨会迅速同化成谷氨酰胺和谷氨酸，以用于细胞过程。破坏氨同化可以使固定氮的转移能够以氨的形式从细胞中输出。固定的氨主要由glnA所编码的谷氨酰胺合成酶(GS)同化成谷氨酰胺，并且随后由谷氨酰胺酮戊二酸转氨酶(GOGAT)同化成谷氨酰胺。在一些实例中，glnS编码谷氨酰胺合成酶。GS受GS腺苷酰基转移酶(GlnE)翻译后调控，GlnE是由glnE编码的双功能酶，其分别通过其腺苷酰基转移酶(AT)和腺苷酰基去除(AR)域的活性催化GS的腺苷酰化和去腺苷酰化两者。在氮限制条件下，glnA被表达，并且GlnE的AR域使GS去腺苷酰化，从而使GS具有活性。在氮过量的条件下，glnA表达被关闭，并且GlnE的AT域由谷氨酰胺变构活化，从而引起GS的腺苷酰化和失活。
此外，draT基因也可以是使用本文所描述的方法促进基于田间的固氮的基因变异的靶标。一旦固氮酶由细胞产生，则固氮酶关闭代表在高氮条件下细胞下调固定活性的另一水平。可以通过降低DraT的表达水平来去除这种关闭。
赋予新微生物表型的方法可以在转录、翻译和翻译后水平上进行。转录水平包括启动子处的改变(例如改变σ因子的亲和力或转录因子的结合位点，包括启动子的全部或部分缺失)或改变转录终止子和衰减子。翻译水平包括核糖体结合位点处的变化和改变mRNA降解信号。翻译后水平包括使酶的活性位点突变和改变蛋白质-蛋白质相互作用。这些变化可以多种方式实现。可以通过将天然核糖体结合位点(RBS)或启动子与强度/效率较低的另一个交换来实现表达水平的降低(或完全废除)。可以将ATG起始位点交换为GTG、TTG或CTG起始密码子，这引起编码区的翻译活性降低。完全废除表达可以通过敲除(缺失)基因的编码区来完成。将开放阅读框(ORF)移码可能会引起沿ORF的过早终止密码子，从而产生非功能性截短产物。插入框内终止密码子也会类似地产生非功能性截短产物。也可以在N或C端添加降解标签以降低特定基因的有效浓度。
相反，本文所描述的基因的表达水平可以通过使用更强的启动子来实现。为了确保在高氮水平条件(或任何其它条件)期间具有高启动子活性，可以获得高氮水平条件下全基因组的转录谱，并且可以从那一数据集中选出具有所需转录水平的活性启动子来置换弱启动子。弱起始密码子可与ATG起始密码子交换，以获得更好的翻译起始效率。弱核糖体结合位点(RBS)也可以与翻译起始效率更高的不同RBS交换。另外，还可以进行位点特异性诱变以改变酶的活性。
提高植物中进行的固氮的水平可以引起作物生产所需的化肥的量减少，并且减少温室气体排放(例如，一氧化二氮)。
提高固氮活性
固氮酶是负责催化固氮的酶。在各种固氮细菌中发现了三种类型的固氮酶：钼(Mo)固氮酶、钒(V)固氮酶和唯铁(Fe)固氮酶。固氮酶是由组分I(也称为双氮酶(dinitrogenase))和组分II(也称为双氮酶还原酶)构成的双组分系统。组分I是钼固氮酶中的MoFe蛋白、钒固氮酶中的VFe蛋白和唯铁固氮酶中的Fe蛋白。组分II是含有铁-硫(Fe-S)簇的Fe蛋白。
在一些情况下，改变辅因子的供应可以引起固氮增加。举例来说，增加硫吸收可以为固氮酶提供更大的辅因子库，由此增加功能性固氮酶复合物的数目。在一些情况下，可以通过上调硫酸盐转运基因来增加硫吸收。硫酸盐转运基因的一些实例可以是但不限于cysPTWA、sbp、sbp、cysZK。
在一些情况下，改变辅因子的供应可以引起固氮的增加。举例来说，增加钼(Mo)吸收可以增加功能性固氮酶复合物的数目。在一些情况下，可以通过上调Mo转运基因来增加Mo吸收。Mo转运基因的一些实例可以是但不限于modEBA、modEB和modA。
在一些情况下，辅因子供应可能受铁吸收影响。铁吸收可能受tonB转运系统影响。在一些情况下，可以通过上调tonB转运系统基因来实现影响铁吸收。tonB转运系统基因的一些实例可以是但不限于tonB和exbAB。在一些情况下，铁吸收可能受铁载体(siderophore)影响，铁载体增加微生物和植物中的铁吸收。在一些情况下，可以通过上调铁载体生物合成基因来实现影响铁吸收。铁载体生物合成基因的一些实例可以是但不限于yhfA、yusV、sbnA、flu、yfiZ以及fur。
改变到ATP的代谢通量可能引起固氮增加。举例来说，可以通过靶向糖原生物合成来增加到ATP的代谢通量。糖原生物合成可能受碳分流到糖酵解、TCA循环和/或氧化磷酸化而非糖原合成影响。在一些情况下，糖原生物合成可能受缺失或下调糖原合酶相关基因影响。糖原合酶基因的一个实例可以是但不限于glgA。
改变每个细胞的固氮酶数目可能引起固氮增加。举例来说，每个细胞的固氮酶数目可能受nif去抑制影响。Nif去抑制可以通过组成性地发出氮饥饿信号来实现。在一些情况下，可以通过缺失相关基因的UR域来实现nif去抑制。可以被靶向以去抑制nif基因的基因的一个实例可以是但不限于glnD。在一些情况下，可以通过在nifHDK或nifDK操纵子上游插入强启动子来增加(多个)nif簇的转录。
增加固氮的另一方法可以是通过增加nif簇转录来增加每个细胞的固氮酶数目。Nif簇转录可以通过增加nifA转录来增加。在一些情况下，nif簇转录可能受基因组中nifA基因拷贝数增加影响。
Nif簇转录也可以通过增加NifA翻译来增加。在一些情况下，可以通过增加nifA基因中核糖体结合位点的强度来增加NifA翻译。
改变固氮酶的氧敏感性可能引起固氮增加。可以通过减少氧感应影响氧敏感性。在一些情况下，减少氧感应可能是通过破坏氧感应基因。氧感应基因的一些实例可以是但不限于nifT/fixU、fixJ和fixL。
在一些情况下，可以通过促进细胞色素bd介导的呼吸来保持胞质氧水平低，影响氧敏感性。在一些情况下，可以通过上调编码细胞色素bd氧化酶的基因和/或敲除替代细胞色素系统影响氧敏感性。编码细胞色素bd基因的基因的一些实例可以是但不限于cydABX、cydAB和cydX。在一些情况下，可以通过改变细胞中的氧化还原平衡来保护固氮酶免受氧化。氧化还原平衡可以通过ROS清除来改变。实现ROS清除的一种策略将是上调相关基因。ROS清除基因的一些实例可以是但不限于grxABCD、trxA、trxC以及tpx。
在一些情况下，可以通过清除游离氧来影响氧敏感性。在一些情况下，可以通过上调细菌血红蛋白基因来实现清除游离氧。
血红蛋白基因的一个实例可以是但不限于glbN。在一些情况下，可以通过上调编码高亲和力血红素-铜cbb3型氧化酶的fixNOPQ基因来实现清除游离氧。
修饰IHFa可能引起固氮酶表达提高。在一些情况下，可以通过促进nifA与σ54在某些基因上游的上游活化序列之间的相互作用来提高固氮酶表达。特定来说，IHF的上调可能增加固氮酶转录。在一些情况下，IHF以及nifA和σ54的上调可能增加固氮酶操纵子的转录。在一些情况下，可以在这一提高氮表达的过程中利用的菌株可以包括但不限于水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)、蔗糖小迫氏菌和/或变栖克雷伯氏菌菌株。在一些情况下，当与编码σ54的基因中的突变叠加时，固氮酶操纵子的上调可能更有效。
修饰编码σ54的基因可能引起固氮酶表达提高。在一些情况下，σ54的基因的上调可能增加固氮酶转录。编码σ54的基因的一个实例包括但不限于rpoN。在一些情况下，可以在这一提高氮表达的过程中利用的菌株可以包括但不限于水生拉恩氏菌、蔗糖小迫氏菌和/或变栖克雷伯氏菌菌株。在一些情况下，σ54以及nifA和IHF的上调可能增加固氮酶操纵子的转录。在一些情况下，可以通过将σ54上调与IHF突变叠加来进一步改良固氮酶操纵子的转录。
在一些情况下，在菌株，如小迫氏菌菌株中缺失蛋白质(如DraT)可以提高固氮酶活性。在一些情况下，DraT可能翻译后修饰固氮酶以抑制其活性。在一些情况下，可以在这一提高固氮酶活性的过程中利用的菌株可以包括但不限于小迫氏菌菌株。
在一些情况下，修饰asnB基因可能增加铵排泄。特定来说，asnB基因的截短和上调可能将谷氨酰胺转化回铵。AsnB酶含有两个域；一个可以使谷氨酰胺脱去氨基以释放铵，并且另一个可以使用铵生成天冬酰胺。截短AsnB以缺失天冬酰胺合酶域和/或上调谷氨酰胺脱氨酶域可以帮助将细胞内的谷氨酰胺转化回铵，从而增加铵排泄。在一些情况下，可以在这一增加铵排泄的过程中利用的菌株可以包括但不限于水生拉恩氏菌、蔗糖小迫氏菌和变栖克雷伯氏菌菌株。
在一些情况下，修饰asnB基因可能增加铵排泄。特定来说，缺失asnB基因可能减少细胞中的铵储集。asnB能够使用胞质铵代替谷氨酰胺作为N供体。在一些情况下，缺失、截短或上调asnB可能增加从细胞排泄的铵的量。在一些情况下，可以在这一增加铵排泄的过程中利用的菌株可以包括但不限于水生拉恩氏菌、蔗糖小迫氏菌和变栖克雷伯氏菌菌株。
在一些情况下，修饰glnD可能有益于修改氮同化的调控。特定来说，可以使用glnD的修饰来优化通过PII蛋白信号传导路径的氮同化路径的调控。glnD所编码的酶修饰PII蛋白GlnK和GlnB。在氮限制和过量条件下，GlnD酶分别可逆地使PII蛋白尿苷酰化和去尿苷酰化。PII蛋白赋予氮代谢路径信号传导级联。受PII蛋白信号传导影响的氮代谢基因的实例包括但不限于编码谷氨酰胺合成酶的glnA、编码感觉性组氨酸激酶/磷酸酶ntrB的ntrB/glnL、结合glnG/ntrC DNA的转录调控子ntrC以及nifLA操纵子。在一些情况下，可以缺失glnD以便减少氮同化基因转录和细胞内同化的氮的量。在一些情况下，可以通过缺失ACT12区、缺失UR区和/或通过使特定氨基酸残基(例如，残基90、91和/或104)突变来使UR区失活来修饰glnD。在一些情况下，可以在这一减少氮同化的过程中利用的菌株可以包括但不限于水生拉恩氏菌、蔗糖小迫氏菌和变栖克雷伯氏菌菌株。
在一些情况下，修饰glnD可能有益于提高固氮酶活性、增加铵排泄和/或植物生长。特定来说，去除氮感应区可以提高固氮酶活性和/或增加植物生长。在一些情况下，可以缺失glnD的ACT域。在一些情况下，ACT域通过由谷氨酰胺进行的变构调控参与感应氮状态。去除ACT域可能降低尿苷酰基转移酶活性，从而发出氮过量信号并且下调氮同化基因，引起铵排泄增加。在一些情况下，可以在这一提高固氮酶活性、增加铵排泄和/或植物生长的过程中利用的菌株可以包括但不限于蔗糖小迫氏菌和变栖克雷伯氏菌菌株。
在一些情况下，修饰glnD可能有益于提高固氮酶活性、增加铵排泄和/或植物生长。特定来说，去除或去活化glnD域内的尿苷酰基转移酶(UT)区可以提高固氮酶活性、增加铵排泄和/或植物生长。去除或去活化UT域可能降低尿苷酰基转移酶活性，从而发出氮过量信号并且下调氮同化基因，引起铵排泄增加。在一些情况下，可以在这一提高固氮酶活性、增加铵排泄和/或植物生长的过程中利用的菌株可以包括但不限于水生拉恩氏菌、蔗糖小迫氏菌和变栖克雷伯氏菌菌株。
在一些情况下，修饰GlnB可能有益于增加氮化合物排泄。在一些情况下，GlnD的尿苷酰基转移酶(UT酶)域在酪氨酸-51处修饰GlnB。在一些情况下，通过修饰GlnD的UT酶域，可以减少GlnB-UMP产生。在一些情况下，通过去除GlnD的UT酶域，可以减少GlnB-UMP产生。在一些情况下，通过改变GlnD的UT酶域，可以防止GlnB-UMP产生。在一些情况下，通过去除GlnD的UT酶域，可以防止GlnB-UMP产生。在一些情况下，可以通过缺失酪氨酸51-来修饰GlnB。在一些情况下，可以通过在酪氨酸-51处修饰GlnB来修饰GlnB。在一些情况下，可以在这一增加铵排泄的过程中利用的菌株可以包括但不限于水生拉恩氏菌、蔗糖小迫氏菌和变栖克雷伯氏菌菌株。
在一些情况下，修饰GlnK可能有益于增加铵排泄。在一些情况下，基于GlnK与GlnB之间的结构相似性，GlnK可能以GlnB类似物形式在菌株内起作用。在一些情况下，修饰GlnK可以通过去除可能基于GlnK的抑制作用来增加铵排泄。在一些情况下，通过改变GlnK，可以减少对铵排泄的抑制作用。在一些情况下，通过去除GlnK，可以减少对铵排泄的抑制作用。在一些情况下，通过改变GlnK，可以防止基于GlnK的对铵排泄的抑制作用。在一些情况下，通过去除glnK基因，可以防止基于GlnK的对铵排泄的抑制作用。在一些情况下，可以在这一增加铵排泄的过程中利用的菌株可以包括但不限于水生拉恩氏菌、蔗糖小迫氏菌和变栖克雷伯氏菌菌株。
在一些情况下，修饰glnK可能有益于增加铵排泄。在一些情况下，GlnD的UT酶域在酪氨酸-51处修饰glnK。在一些情况下，通过修饰GlnD的UT酶域，可以减少glnK-UMP产生。在一些情况下，通过去除GlnD的UT酶域，可以减少glnK-UMP产生。在一些情况下，通过改变GlnD的UT酶域，可以防止glnK-UMP产生。在一些情况下，通过去除GlnD的UT酶域，可以防止glnK-UMP产生。在一些情况下，可以通过缺失酪氨酸-51来修饰GlnK。在一些情况下，可以通过在酪氨酸-51处修饰GlnK来修饰GlnK。在一些情况下，可以在这一增加铵排泄的过程中利用的菌株可以包括但不限于水生拉恩氏菌、蔗糖小迫氏菌和变栖克雷伯氏菌菌株。
在一些情况下，修饰编码NtrB蛋白的glnL可能有益于增加铵排泄。特定来说，修饰NtrB可能有益于独立于氮状态控制glnA转录。在一些情况下，可以通过缺失滴定活性的特定存在点来实现ntrB的修饰。在一些情况下，可以在这一增加铵排泄的过程中利用的菌株可以包括但不限于水生拉恩氏菌、蔗糖小迫氏菌和变栖克雷伯氏菌菌株。
在一些情况下，修饰glnA可能有益于增加铵排泄。在一些情况下，修饰NtrC可能有益于修改细胞中GlnA蛋白的水平。特定来说，通过防止NtrC的磷酸化，修饰NtrC可能有益。磷酸化NtrC可能引起glnA的转录活化。因此，修饰ntrC以便防止ntrC的磷酸化可能有益于减少glnA的转录。在一些情况下，可以通过置换天冬氨酸54来实现NtrC的修饰。在一些情况下，可以在这一增加铵排泄的过程中利用的菌株可以包括但不限于水生拉恩氏菌、蔗糖小迫氏菌和变栖克雷伯氏菌菌株。
在一些情况下，修饰谷氨酰胺酶B可能有益于增加铵排泄。特定来说，在一些情况下，可以上调谷氨酰胺由谷氨酰胺酶B转化回谷氨酸和氨，以便增加铵排泄。在一些情况下，可以在这一增加氮排泄的过程中利用的菌株可以包括但不限于水生拉恩氏菌、蔗糖小迫氏菌和变栖克雷伯氏菌菌株。
在一些情况下，修饰nifA可能有益于提高固氮酶表达。在一些情况下，修饰nifA以便增加细胞中nifA基因拷贝数可能是有益的。可以通过在组成性表达启动子前面插入nifA基因的多个拷贝，增加nifA基因拷贝数。在一些情况下，将nifA基因拷贝连接到一个或多个管家操纵子可以增加细胞中nifA基因的总数。在一些情况下，可以在这一提高固氮表达的过程中利用的菌株可以包括但不限于水生拉恩氏菌和变栖克雷伯氏菌菌株。
在一些情况下，修饰固氮酶操纵子可能有益于提高固氮酶表达。在一些情况下，上调固氮酶操纵子以便增加固氮酶转录可能有益。在一些情况下，当细菌定殖根际时，来自细菌内部的活性启动子可以插入到固氮酶操纵子的前面以上调固氮酶操纵子。在一些情况下，可以在固氮酶操纵子内缺失nifL以上调固氮酶操纵子。在一些情况下，可以在固氮酶操纵子内缺失nifA以上调固氮酶操纵子。在一些情况下，可以在固氮酶操纵子内缺失nifA和nifL以上调固氮酶操纵子。在一些情况下，可以将多个启动子直接置于nifHDK基因的前面，以避开nifA转录控制。在一些情况下，可以在这一提高固氮表达的过程中利用的菌株可以包括但不限于水生拉恩氏菌和变栖克雷伯氏菌菌株。
在一些情况下，修饰glnE可能有益于增加铵排泄。在一些情况下，glnE的AR域上的保守天冬氨酸-氨基酸-天冬氨酸(DXD)基元可能变化。在一些情况下，改变glnE的AR域上的保守DXD残基可以用于去除glnE的去腺苷酰化活性。在一些情况下，可以在glnE的AR区中的DXD基元上置换D残基。在一些情况下，置换glnE的AR区中的DXD基元上的D残基可以使GlnB结合位点保持完整，从而允许调控腺苷酰化活性，同时降低或阻止AR活性。在一些情况下，可以在这一增加铵排泄的过程中利用的菌株可以包括但不限于水生拉恩氏菌、蔗糖小迫氏菌和变栖克雷伯氏菌菌株。
在一些情况下，修饰glnA可能有益于增加AMM排泄。在一些情况下，可以通过在glnA基因的上游插入glnB、glnD和/或glnE的启动子来下调glnA。在一些情况下，修饰glnA可能使glnA表达与N状态信号传导级联解除联系，并且使表达降低到基础水平，使得更多固定的氮保持未同化。在一些情况下，可以在这一增加铵排泄的过程中利用的菌株可以包括但不限于水生拉恩氏菌、蔗糖小迫氏菌和变栖克雷伯氏菌菌株。
在一些情况下，修饰GOGAT可能有益于增加铵排泄。在一些情况下，可以通过在GOGAT基因上游插入控制glnB、glnD和/或glnE的启动子来下调GOGAT。GOGAT的下调可以反过来引起谷氨酰胺氧基戊二酸转氨酶表达降低。在一些情况下，修饰GOGAT可能使GOGAT表达与N状态信号传导级联解除联系，并且使表达降低到基础水平，使得更多固定的氮保持未同化。在一些情况下，可以在这一增加铵排泄的过程中利用的菌株可以包括但不限于水生拉恩氏菌、蔗糖小迫氏菌和变栖克雷伯氏菌菌株。
在一些情况下，修饰GDH可能有益于增加铵排泄。在一些情况下，可以通过在GDH基因上游插入控制glnB、glnD和/或glnE的启动子来下调GDH。GDH的下调可以反过来引起NAD特异性谷氨酸脱氢酶表达降低。在一些情况下，修饰GDH可能使GDH表达与N状态信号传导级联解除联系，并且使表达降低到基础水平，使得更多固定的氮保持未同化。在一些情况下，可以在这一增加铵排泄的过程中利用的菌株可以包括但不限于水生拉恩氏菌、蔗糖小迫氏菌和变栖克雷伯氏菌菌株。
通过同化增加固氮
可以通过减少微生物中的氮同化来增加提供给与微生物相关的植物的氮量。在这里，同化可能受氨的排泄率影响。通过靶向氨同化，可以提高氮可用性。在一些情况下，可以通过降低排泄后氨的再吸收率来影响氨同化。为了降低排泄后氨的再吸收率，可以敲除任何相关基因。氨再吸收基因的一个实例可以是但不限于amtB。
在一些情况下，同化可能受植物吸收率影响。通过靶向植物氮同化基因和路径，可以提高氮可用性。在一些情况下，可以通过用固氮、促进植物生长的微生物接种来改变植物的氨同化。可以进行筛选以鉴别诱导植物中氨同化的微生物。
通过定殖增加固氮
提高微生物的定殖能力可以增加提供给植物的固定的氮的量。可以通过改变携载能力(根部表面微生物丰度)和/或微生物适应性影响定殖。在一些情况下，可以通过改变有机酸转运来实现影响携载能力和微生物适应性。可以通过上调相关基因改善有机酸转运。有机酸转运基因的一个实例可以是但不限于dctA。
举例来说，定殖能力可能受凝集素表达影响。凝集素表达提高可以帮助微生物粘附到植物根部。凝集素基因的实例可以包括但不限于fhaB和fhaC。
定殖能力可能受内生进入增加影响。举例来说，内生进入可能受植物细胞壁降解酶(CDWE)影响。CDWE表达和/或分泌增加可能增加微生物的定殖和内生进入。CDWE的一些实例是但不限于聚半乳糖醛酸酶和纤维素酶。聚半乳糖醛酸酶基因的一个实例是pehA。在一些情况下，可以通过提供酶输出信号增加聚半乳糖醛酸酶和纤维素酶的输出。
改变携载能力可能引起向相关植物提供的氮的量增加。携载能力可能受生物膜形成影响。在一些情况下，携载能力可能受小RNA rsmZ影响。小RNA rsmZ是生物膜形成的负调控子。在一些情况下，可以通过缺失或下调rsmZ来促进生物膜形成，引起rsmA(次级代谢的正调控子)翻译和生物膜形成增加。
在一些情况下，可以通过增强菌株粘附到根部表面的能力影响生物膜形成。在一些情况下，可以通过上调大粘附蛋白来促进生物膜形成。大粘附蛋白的一个实例可以是但不限于lapA。
在一些情况下，携载能力可能受群体感应(quorum sensing)影响。在一些情况下，可以通过增加AHL生物合成基因的拷贝数来增强群体感应。
在一些情况下，根际定殖可能受根量影响。举例来说，根量可能受微生物IAA生物合成影响。由微生物引起的IAA生物合成增加可能刺激根生物量形成。在一些情况下，可以通过上调IAA生物合成基因(在一系列水平下)来实现影响IAA生物合成。IAA生物合成基因的一个实例可以是但不限于ipdC。
在一些情况下，乙烯信号传导可以诱导植物的系统抗性并且影响微生物的定殖能力。乙烯是一种植物信号传导分子，其可基于植物组织和乙烯水平诱发广泛范围的反应。根部乙烯反应的主导模型是，暴露于胁迫下的植物通过产生一个小的乙烯峰来快速响应，所述乙烯峰引发植物的保护性反应，例如编码防御蛋白的基因的转录。如果胁迫持续存在或剧烈，通常在几天后出现第二个大得多的乙烯峰。这种第二乙烯峰诱导如衰老、萎黄和脱落的过程，所述过程可能导致对植物生长和存活的显著抑制。在一些情况下，促进植物生长的细菌可能通过产生刺激根部中的小的乙烯反应的生长素IAA刺激根部生长。同时，细菌可能通过产生减慢植物中乙烯产生的酶(ACC脱氨酶)阻止第二个大乙烯峰，由此维持有助于刺激根部生长的乙烯水平。植物中系统抗性的诱导可能受细菌IAA影响。在一些情况下，可以通过上调IAA生物合成基因(在一系列水平下)来实现刺激IAA生物合成。生物合成基因的一个实例可以是但不限于ipdC。
在一些情况下，定殖可能受ACC脱氨酶影响。通过将ACC分流到副产物，ACC脱氨酶可以减少根部中的乙烯产生。在一些情况下，可以通过上调ACC脱氨酶基因来实现影响ACC脱氨酶。ACC脱氨酶基因的一些实例可以是但不限于dcyD。
在一些情况下，定殖可能受携载能力和/或微生物适应性影响。举例来说，携载能力和/或微生物适应性可能受海藻糖过度产生影响。海藻糖过度产生可以提高耐旱性。在一些情况下，可以通过上调海藻糖生物合成基因(在一系列水平下)来实现影响海藻糖过度产生。海藻糖生物合成基因的一些实例可以是但不限于otsA、otsB、treZ以及treY。在一些情况下，otsB的上调也可能提高固氮活性。
在一些情况下，携载能力可能受根附着影响。根附着可能受胞外多糖分泌影响。在一些情况下，可以通过上调胞外多糖产生蛋白来实现影响胞外多糖分泌。胞外多糖产生蛋白的一些实例可以是但不限于yjbE和pssM。在一些情况下，可以通过上调纤维素生物合成来影响胞外多糖分泌。纤维素生物合成基因的一些实例可以是但不限于acs基因和bcs基因簇。
在一些情况下，携载能力和/或微生物适应性可能受真菌抑制影响。真菌抑制可能受几丁质酶影响，几丁质酶会分解真菌细胞壁并且可能引起根际真菌的生物控制。在一些情况下，可以通过几丁质酶基因的上调实现影响真菌抑制。几丁质酶基因的一些实例可以是但不限于1类几丁质酶和chiA。
在一些情况下，有效的铁吸收可以帮助微生物在根际中生存，在根际中其必须与其它土壤微生物和植物竞争铁吸收。在一些情况下，高亲和力螯合(铁载体)和转运系统可以通过1)确保微生物获得足够铁和2)减少竞争物种的铁库而有助于根际胜任力。提高微生物进行这一过程的能力可以提高其在根际中的竞争适应性。在一些情况下，可以通过上调铁载体基因来影响铁吸收。铁载体基因的一些实例可以是但不限于yhfA、yusV、sbnA、fiu、yfiZ以及fur。在一些情况下，铁吸收可能受tonB转运系统影响。在一些情况下，可以通过上调tonB转运系统基因来影响铁吸收。tonB转运系统基因的一些实例可以是但不限于tonB和exbAB。
在一些情况下，携载能力和/或微生物适应性可能受氧化还原平衡和/或ROS清除影响。氧化还原平衡和/或ROS清除可能受细菌谷胱甘肽(GSH)生物合成影响。在一些情况下，可以通过上调细菌谷胱甘肽生物合成基因来影响细菌谷胱甘肽(GSH)生物合成。细菌谷胱甘肽生物合成基因的一些实例可以是但不限于gshA、gshAB和gshB。
在一些情况下，氧化还原平衡可能受ROS清除影响。在一些情况下，可以通过过氧化氢酶的上调影响ROS清除。过氧化氢酶基因的一些实例可以是但不限于katEG和Mn过氧化氢酶。
在一些情况下，生物膜形成可能受磷信号传导影响。在一些情况下，可以通过改变磷信号传导基因的表达来影响磷信号传导。磷信号传导基因的一些实例可以是但不限于phoR和phoB。
在一些情况下，携载能力可能受根附着影响。根附着可能受表面活性素生物合成影响。在一些情况下，可以通过上调表面活性素生物合成来实现影响表面活性素生物合成，以改善生物膜形成。表面活性素生物合成基因的一个实例可以是但不限于srfAA。
在一些情况下，定殖和/或微生物适应性可能受携载能力、与其它微生物的竞争和/或作物针对其它微生物的保护影响。在一些情况下，与其它微生物的竞争和/或作物针对其它微生物的保护可能受群体感应和/或群体猝灭(quorum quenching)影响。群体猝灭可以通过抑制潜在病原/竞争细菌的群体感应来影响定殖。在一些情况下，可以通过插入和/或上调编码群体猝灭酶的基因来实现影响群体猝灭。群体猝灭基因的一些实例可以是但不限于ahlD、Y2-aiiA、aiiA、ytnP以及attM。在一些情况下，修饰群体猝灭中所涉及的酶(如Y2-aiiA和/或ytnP)可能有益于定殖。在一些情况下，Y2-aiiA和/或ytnP的上调可能引起细胞外酰基-高丝氨酸内酯(AHL)水解。aiiA是一种N-酰基高丝氨酸内酯酶，其为一种分解高丝氨酸内酯的酶。分解AHL可能会停止或减慢竞争性革兰氏阴性细菌的群体信号传导能力。在一些情况下，可以在这一增加定殖的过程中利用的菌株可以包括但不限于水生拉恩氏菌、蔗糖小迫氏菌和变栖克雷伯氏菌菌株。
在一些情况下，携载能力和/或微生物适应性可能受根瘤菌毒素(rhizobitoxine)生物合成影响。根瘤菌毒素生物合成可以通过抑制ACC合酶来减少根部中的乙烯产生。在一些情况下，可以通过上调根瘤菌毒素合成基因来实现影响根瘤菌毒素合成。
在一些情况下，携载能力可能受根附着影响。根附着可能受胞外多糖分泌影响。在一些情况下，可以通过缺失mucA生成超粘液突变体来实现影响胞外多糖分泌。
在一些情况下，根附着可能受吩嗪生物合成影响。在一些情况下，可以通过上调吩嗪生物合成基因来实现影响吩嗪生物合成，以改善生物膜形成。
在一些情况下，根附着可能受环脂肽(CLP)生物合成影响。在一些情况下，可以通过上调CLP生物合成来实现影响环脂肽(CLP)生物合成，以改善生物膜形成。
在一些情况下，携载能力和/或竞争可能受抗生素合成影响。抗生素合成可以增加抗生素产生以杀死竞争微生物。在一些情况下，可以通过针对抗生素生物合成路径和上调挖掘(mining)基因组来增加抗生素产生。
在一些情况下，定殖可能受脱水耐受性影响。在一些情况下，修饰rpoE可能有益于定殖。在一些情况下，rpoE的上调可能引起胁迫耐受基因和路径的表达提高。在一些情况下，可以使用独特的可切换启动子来上调rpoE。在一些情况下，可以使用阿拉伯糖启动子上调rpoE。rpoE是类似于phyR的σ因子。当表达时，rpoE可能引起多个胁迫耐受基因上调。由于在定殖周期期间胁迫耐受酶可能不适用，因此可以使用可切换启动子。在一些情况下，启动子可能在生物量生长期间和/或种子包衣期间具有活性。在一些情况下，可以使用可切换启动子，其中可以在生物量生长的对数期期间掺入糖或化学物质，但也可以使启动子在微生物的一种或多种其它应用期间不打开。在一些情况下，可以上调rpoE，同时还下调rseA。在一些情况下，可以在这一增加定殖的过程中利用的菌株可以包括但不限于水生拉恩氏菌、蔗糖小迫氏菌和变栖克雷伯氏菌菌株。
在一些情况下，定殖可能受脱水耐受性影响。在一些情况下，修饰rseA可能有益于定殖。在一些情况下，可以使用独特的可切换启动子来下调rseA。在一些情况下，可以使用阿拉伯糖启动子下调rseA。rseA是与rpoE共表达的抗σ因子。在一些情况下，酶保持彼此结合，这可以降低rpoE充当转录因子的能力或使所述能力无效。然而，在胁迫条件期间，resA可能被切割，并且rpoE可能自由上调/下调胁迫耐受基因。通过破坏与rpoE的共转录，可以独立地滴定rpoE和resA的水平，这可能有益于优化工程菌株的定殖。在一些情况下，可以在这一增加定殖的过程中利用的菌株可以包括但不限于水生拉恩氏菌、蔗糖小迫氏菌和变栖克雷伯氏菌菌株。
细菌种群的生成
细菌的分离
可以通过从天然植物的表面或组织中提取微生物来获得适用于本文所公开的方法和组合物的微生物。可以通过研磨种子以分离微生物来获得微生物。可以通过在不同土壤样品中种植种子并且从组织中回收微生物来获得微生物。另外，可以通过用外源微生物接种植物并且确定哪些微生物出现在植物组织中来获得微生物。植物组织的非限制性实例可以包括种子、幼苗、叶、插条、植株、鳞茎或块茎。
获得微生物的方法可以是通过从土壤中分离细菌。细菌可以从各种土壤类型中收集。在一些实例中，土壤的特征可以在于如高或低肥力、水分水平、矿物质水平以及各种耕作实践的特性。举例来说，土壤可能参与轮作，在轮作中，在连续种植季节中在相同土壤中种植不同作物。不同作物在相同土壤上的依序生长可以防止某些矿物质不成比例的耗乏。可以从在选定土壤中生长的植物中分离出细菌。可以在生长2-6周后收获幼苗植株。举例来说，在一轮收获中可以收集至少400个分离株。土壤和植物类型展现植物表型以及条件，所述条件允许某些表型的下游富集。
可以从植物组织中分离出微生物以评定微生物性状。可以改变用于加工组织样品的参数，以分离不同类型的缔合微生物，如根际细菌、附生菌或内生菌。分离株可以在无氮培养基中培养，以富集进行固氮的细菌。或者，可以从全球菌株库获得微生物。
进行植物体内(In planta)分析以评定微生物性状。在一些实施例中，可以加工植物组织，以便通过高通量加工进行DNA和RNA筛选。另外，非侵入性测量可以用于评定植物特征，如定殖。可以逐株(plant-by-plant)获得对野生微生物的测量。还可以使用中等通量方法在田间获得对野生微生物的测量。测量可以随时间推移连续进行。可以使用模型植物系统，包括但不限于狗尾草属。
植物系统中的微生物可以通过进行植物系统中微生物的转录谱分析来筛选。通过转录谱分析筛选的实例是使用定量聚合酶链反应(qPCR)、用于转录物检测的分子条形码、下一代测序以及用荧光标记物进行微生物标记的方法。可以测量影响因素以评定温室中的定殖，包括但不限于微生物组、非生物因素、土壤条件、氧气、水分、温度、接种物状况以及根部定位。如本文所描述，可以通过用IRMS或NanoSIMS测量15N气体/肥料(稀释)来评定细菌中的固氮。NanoSIMS是高分辨率二次离子质谱分析。NanoSIMS技术是一种研究生物样品的化学活性的方式。可以在细胞、亚细胞、分子以及元素水平上研究驱动微生物代谢的氧化反应的还原催化。NanoSIMS可以提供大于0.1μm的高空间分辨率。NanoSIMS可以检测同位素示踪剂，如13C、15N和18O的使用。因此，NanoSIMS可以用于细胞中的化学活性氮。
自动化温室可以用于植物分析。响应于微生物暴露的植物指标包括但不限于生物量、叶绿体分析、CCD相机、体积断层摄影术测量。
富集微生物种群的一种方式是根据基因型。举例来说，利用靶向引物或特异性引物的聚合酶链反应(PCR)分析。为nifH基因设计的引物可以用于鉴别固氮生物，因为固氮生物在固氮过程中表达nifH基因。微生物种群也可以通过不依赖于单细胞培养的方法和趋化性引导的分离方法来富集。或者，可以通过在选择培养基上培养微生物来进行微生物的靶向分离。针对所需性状富集微生物种群的预先策划方法可以通过生物信息学数据引导，并且在本文中描述。
使用生物信息学富集具有固氮能力的微生物
生物信息学工具可以用于鉴别和分离促进植物生长的根际细菌(plant growthpromoting rhizobacteria；PGPR)，PGPR根据其进行固氮的能力而选择。具有高固氮能力的微生物可以促进植物的有利性状。用于鉴别PGPR的生物信息学分析模式包括但不限于基因组学、宏基因组学(metagenomics)、靶向分离、基因测序、转录组测序以及建模。
利用如本文所描述的下一代测序和微生物版本控制方法，基因组学分析可以用于鉴别PGPR和确认突变的存在。
使用定殖预测算法，宏基因组学可以用于鉴别和分离PGPR。元数据(Metadata)也可以用于鉴别环境和温室样品中工程菌株的存在。
转录组学测序可以用于预测引起PGPR表型的基因型。另外，转录组学数据用于鉴别用于改变基因表达的启动子。转录组学数据可以结合全基因组序列(WGS)分析，以生成代谢和基因调控网络模型。
微生物驯化
从自然界中分离的微生物可以经历驯化过程，在驯化过程中微生物转化为可基因追踪和鉴别的形式。驯化微生物的一种方式是用抗生素抗性对微生物进行工程改造。工程改造抗生素抗性的过程可以通过确定野生型微生物菌株中的抗生素敏感性来开始。如果细菌对抗生素敏感，则抗生素可以作为抗生素抗性工程改造的良好候选物。随后，可以使用重组工程方法将抗生素抗性基因或反向可选择(counterselectable)自杀载体并入到微生物的基因组中。反向可选择自杀载体可以由缺失所关注基因、可选择标记物和反向可选择标记物sacB组成。反向选择可以用于将天然微生物DNA序列与抗生素抗性基因交换。中等通量方法可以用于同时评估多个微生物，允许平行驯化。替代的驯化方法包括使用归巢核酸酶(homing nuclease)来防止自杀载体序列环出或获得中间载体序列。
可以通过几种方法将DNA载体引入到细菌中，包括电穿孔和化学转化。可以使用标准载体库进行转化。基因编辑方法的一个实例是CRISPR，前面存在Cas9测试，以确保Cas9在微生物中的活性。
微生物的非转基因工程改造
具有有利性状的微生物种群可以通过定向进化获得。定向进化是一种模仿自然选择过程以使蛋白质或核酸朝向自定义目标进化的方法。定向进化的一个实例是当将随机突变引入到微生物种群中时，选择具有最有利性状的微生物，并且使所选微生物的生长继续。促进生长的根际细菌(PGPR)中最有利的性状可以是固氮。基于每次迭代后的选择过程，定向进化的方法可以是迭代和自适应的。
可以生成具有高固氮能力的促进植物生长的根际细菌(PGPR)。PGPR的进化可以通过引入基因变异来进行。基因变异可以通过以下引入：聚合酶链反应诱变、寡核苷酸定向诱变、饱和诱变、片段改组诱变、同源重组、CRISPR/Cas9系统、化学诱变以及其组合。这些方法可以将随机突变引入到微生物种群中。举例来说，可以通过寡核苷酸定向诱变使用合成DNA或RNA生成突变体。可以使用质粒上含有的工具生成突变体，稍后将质粒消除(cured)。可以使用来自具有改良的性状的其它物种的库来鉴别所关注基因，所述性状包括但不限于改良的PGPR特性、改良的谷类定殖、提高的氧敏感性、增加的固氮以及增加的氨排泄。可以使用如Geneious或Platypus设计软件的软件基于这些库设计属内基因。可以借助机器学习来设计突变。可以借助代谢模型来设计突变。可以使用a la Platypus完成突变的自动化设计，并且将引导Cas定向诱变的RNA。
属内基因可以转移到宿主微生物中。另外，报告系统也可以转移到微生物中。报告系统表征启动子、确定转化成功、筛选突变体并且充当阴性筛选工具。
携载突变的微生物可以通过连续传代培养。微生物菌落含有微生物的单一变异体。借助于自动菌落选择器和液体处理器来筛选微生物菌落。具有基因重复和增加的拷贝数的突变体表达所需性状的更高基因型。
基于固氮的促进植物生长的微生物的选择
可以使用评定固氮的各种分析筛选微生物菌落。一种测量固氮的方式是通过测量氮排泄的单发酵分析。替代方法是乙炔还原分析(ARA)，其随时间在线取样。ARA可以在微管阵列的高通量板中进行。ARA可以用活植物和植物组织进行。可以在ARA分析中改变培养基配方和培养基氧浓度。筛选微生物变异体的另一方法是通过使用生物传感器。NanoSIMS和拉曼显微光谱法(Raman microspectroscopy)的使用可以用于研究微生物的活性。在一些情况下，也可以使用在生物反应器中发酵的方法培养并且扩增细菌。生物反应器被设计成提高细菌生长的稳健性并且降低细菌对氧的敏感性。基于中到高TP板的微发酵罐用于评估氧敏感性、营养需求、固氮以及氮排泄。细菌也可以与竞争性微生物或有益微生物共培养以阐明隐藏的路径。流式细胞仪可以用于使用化学、比色或荧光指示剂筛选产生高水平氮的细菌。可以在存在或不存在氮源的情况下培养细菌。举例来说，可以将细菌与谷氨酰胺、氨、尿素或硝酸盐一起培养。
微生物育种
微生物育种是一种系统地鉴别和改良作物微生物组内物种作用的方法。方法包含三个步骤：1)通过绘制植物-微生物相互作用图谱并且预测与特定表型相关的调控网络来选择候选物种，2)通过调控网络和基因簇的种内杂交，对微生物表型进行实用并且可预测的改良，以及3)筛选和选择产生所需作物表型的新微生物基因型。为了系统地评定菌株的改良，创建一个模型，所述模型将微生物群落的定殖动态与关键物种的遗传活性联系起来。所述模型用于预测遗传靶标育种，并且提高选择微生物组编码的农艺相关性状改良的频率。
可以通过连续传代来实现生产用于改k植物性状(例如，固氮)的细菌。除了鉴别能够赋予一种或多种植物一种或多种改良性状的细菌和/或组合物外，还可以通过选择具有受微生物菌群影响的特定改良性状的植物来实现这种细菌的生产。生产用于改良植物性状的细菌的一种方法包括以下步骤：(a)从第一植物的组织或土壤中分离细菌；(b)将基因变异引入到细菌中的一种或多种中，以产生一种或多种变异细菌；(c)使多种植物暴露于变异细菌；(d)从多种植物中的一种的组织或土壤中分离细菌，其中从中分离出细菌的植物相对于所述多种植物中的其它植物具有改良性状；(e)用从具有改良性状的植物中分离的细菌(步骤(d))重复步骤(b)到(d)。步骤(b)到(d)可以重复任何次数(例如，一次、两次、三次、四次、五次、十次或更多)，直到植物中的改良性状达到所需水平。此外，多种植物可以是多于两种的植物，如10到20种植物，或20种或更多、50种或更多、100种或更多、300种或更多、500种或更多或1000种或更多的植物。
除了获得具有改良性状的植物外，还获得了细菌种群，所述细菌种群包含有包含引入到一种或多种基因(例如，调控固氮的基因)中的一种或多种基因变异的细菌。通过重复上文所描述的步骤，可以获得包括与所关注的植物性状相关的种群中最适当成员的细菌种群。可以如通过遗传和/或表型分析来鉴别这一种群中的细菌并且确定其有益特性。在步骤(a)中可能会对分离出的细菌进行遗传分析。可以使用包括以下的技术获得表型和/或基因型信息：植物源的化学组分的高通量筛选、包括遗传物质的高通量测序的测序技术、差异显示技术(包括DDRT-PCR和DD-PCR)、核酸微阵列技术、RNA测序(全转录组鸟枪法测序(Whole Transcriptome Shotgun Sequencing))以及qRT-PCR(定量实时PCR)。所获得的信息可以用于获得有关所存在细菌的身份和活性的群落谱分析信息，如系统发育分析或基于微阵列的编码rRNA操纵子组分或其它分类学信息性基因座的核酸筛选。分类学信息性基因座的实例包括16S rRNA基因、23S rRNA基因、5S rRNA基因、5.8S rRNA基因、12S rRNA基因、18SrRNA基因、28S rRNA基因、gyrB基因、rpoB基因、fusA基因、recA基因、coxl基因、nifD基因。在US20140155283中描述了分类谱分析以确定种群中存在的分类单元的示例方法。细菌鉴别可以包含表征一种或多种基因或一种或多种信号传导路径，如与固氮路径相关的基因的活性。细菌种群中也可能存在不同细菌物种之间的协同相互作用(其中两种成分由于其组合而使所需效果增加的程度超过累加量)。
基因变异可以是选自基因：nifA、nifL、ntrB、ntrC、glnA、glnB、glnK、draT、amtB、glnD、glnE、nifJ、nifH、nifD、nifK、nifY、nifE、nifN、nifU、nifS、nifV、nifW、nifZ、nifM、nifF、nifB以及nifQ。基因变异可以是编码具有选自由以下组成的组的功能的蛋白质的基因中的变异：谷氨酰胺合成酶、谷氨酰胺酶、谷氨酰胺合成酶腺苷酰基转移酶、转录活化子、抗转录活化子、丙酮酸黄素氧还蛋白氧化还原酶、黄素氧还蛋白或NAD+-二氮-还原酶aDP-D-核糖基转移酶。基因变异可能是引起以下中的一种或多种的突变：NifA或谷氨酰胺酶的表达或活性提高；NifL、NtrB、谷氨酰胺合成酶、GlnB、GlnK、DraT、AmtB的表达或活性降低；GlnE的腺苷酰基去除活性降低；或GlnD的尿苷酰基去除活性降低。引入基因变异可以包含在靶位点插入和/或缺失一个或多个核苷酸，如1、2、3、4、5、10、25、50、100、250、500或更多个核苷酸。引入到本文所公开的方法的一种或多种细菌中的基因变异可以是敲除突变(例如缺失启动子、插入或缺失以产生过早的终止密码子、缺失整个基因)，或可以是消除或废除蛋白质域的活性(例如影响活性位点的点突变，或缺失编码蛋白质产物的相关部分的基因的一部分)，或其可以改变或废除靶基因的调控序列。也可以插入一个或多个调控序列，包括异源调控序列和在与引入基因变异的细菌相对应的细菌物种或属的基因组内发现的调控序列。此外，可以基于细菌培养物中或植物组织内的基因表达水平来选择调控序列。基因变异可以是特异性引入到靶位点的预定基因变异。基因变异可以是靶位点内的随机突变。基因变异可以是一个或多个核苷酸的插入或缺失。在一些情况下，在将细菌暴露于植物以评定性状改良之前，将多种不同的基因变异(例如，2、3、4、5、10种或更多)引入到一种或多种分离的细菌中。多种基因变异可以是以上类型中的任一种、相同或不同类型以及任何组合。在一些情况下，连续引入多种不同的基因变异，在第一分离步骤之后引入第一基因变异，在第二分离步骤之后引入第二基因变异，以此类推，以便在细菌中积累多种基因变异，赋予相关植物逐渐改良的性状。
一般来说，术语“基因变异”是指相对于参考多核苷酸，如参考基因组或其部分，或参考基因或其部分，引入到多核苷酸序列中的任何变化。基因变异可以被称作“突变”，并且包含基因变异的序列或生物体可以被称作“基因变异体”或“突变体”。基因变异可以具有任何数目的效应，如某一生物活性，包括基因表达、代谢和细胞信号传导的提高或降低。基因变异可以特异性引入到靶位点，或随机引入。多种分子工具和方法可用于引入基因变异。举例来说，可以通过以下来引入基因变异：聚合酶链反应诱变、寡核苷酸定向诱变、饱和诱变、片段改组诱变、同源重组、重组工程、λ红介导的重组、CRISPR/Cas9系统、化学诱变以及其组合。引入基因变异的化学方法包括使DNA暴露于化学诱变剂，例如甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)、N-亚硝基脲(EN U)、N-甲基-N-硝基-N′-亚硝基胍、4-硝基喹啉N-氧化物、硫酸二乙酯、安息香比林(benzopyrene)、环磷酰胺、博来霉素(bleomycin)、三乙基三聚氰胺、丙烯酰胺单体、氮芥、长春新碱、二环氧烷烃(例如，二环氧丁烷)、ICR-170、甲醛、盐酸丙卡巴肼、环氧乙烷、二甲基亚硝胺、7，12二甲基苯并(a)蒽、苯丁酸氮芥、六甲基磷酰胺、白消安等。辐射突变诱导剂包括紫外线辐射、γ辐射、X射线以及快中子轰击。还可使用例如三甲基补骨脂素(trimethylpsoralen)伴随紫外线将基因变异引入到核酸中。移动DNA元件，例如转座因子(transposable element)的随机或靶向插入是生成基因变异的另一合适方法。可以在无细胞体外系统中在扩增期间将基因变异引入到核酸中，例如，使用如易错PCR的聚合酶链反应(PCR)技术。可以使用DNA改组技术(例如，外显子改组、域交换等)将基因变异体外引入到核酸中。由于细胞中缺乏DNA修复酶，也可以将基因变异引入到核酸中，例如，预期在细胞中存在编码突变DNA修复酶的突变基因会在细胞基因组中生成高频突变(即，约1个突变/100个基因到1个突变/10,000个基因)。编码DNA修复酶的基因的实例包括但不限于MutH、Mut S、Mut L和Mut U，以及其在其它物种中的同源物(例如，MSH 1 6、PMS 1 2、MLH 1、GTBP、ERCC-1等)。引入基因变异的各种方法的实例描述提供于例如Stemple(2004)《自然(Namre)》5：1-7；Chiang等人(1993)《PCR方法应用(PCR Methods Appl)》2(3)：210-217；Stemmer(1994)《美国国家科学院院刊》91：10747-10751；以及美国专利第6,033,861号和第6,773,900号中。
引入到微生物中的基因变异可以分类为转基因、同源转基因、基因组内、属内、属间、合成、进化、重排或SNP。
可以将基因变异引入到微生物内的许多代谢路径中，以诱发上文所描述的性状的改良。代表性的路径包括硫吸收路径、糖原生物合成、谷氨酰胺调控路径、钼吸收路径、固氮路径、氨同化、氨排泄或分泌、氮吸收、谷氨酰胺生物合成、厌氧氨氧化(annamox)、磷酸盐溶解、有机酸转运、有机酸产生、凝集素产生、反应性氧自由基清除基因、吲哚乙酸生物合成、海藻糖生物合成、植物细胞壁降解酶或路径、根附着基因、胞外多糖分泌、谷氨酸合酶路径、铁吸收路径、铁载体路径、几丁质酶路径、ACC脱氨酶、谷胱甘肽生物合成、磷信号传导基因、群体猝灭路径、细胞色素路径、血红蛋白路径、细菌血红蛋白样路径、小RNA rsmZ、根瘤菌毒素生物合成、lapA粘附蛋白、AHL群体感应路径、吩嗪生物合成、环脂肽生物合成以及抗生素产生。
CRISPR/Cas9(规律成簇的间隔短回文重复序列)/CRISPR相关(Cas)系统可以用于引入所需突变。CRISPR/Cas9通过使用CRISPR RNA(crRNA)引导入侵核酸沉默，为细菌和古细菌提供针对病毒和质粒的适应性免疫。Cas9蛋白(或其功能等同物和/或变异体，即Cas9样蛋白)天然含有DNA核酸内切酶活性，其依赖于蛋白质与被称为crRNA和tracrRNA(也称为引导RNA)的两种天然存在的或合成的RNA分子缔合。在一些情况下，两个分子共价连接以形成单个分子(也称为单一引导RNA(“sgRNA”)。因此，Cas9或Cas9样蛋白与DNA靶向RNA(所述术语涵盖双分子引导RNA配置和单分子引导RNA配置两者)缔合，所述DNA靶向RNA激活Cas9或Cas9样蛋白并且将蛋白质引导到靶核酸序列。如果Cas9或Cas9样蛋白保留其天然酶功能，则其将切割靶DNA以产生双链断裂，这可导致基因组改变(即编辑：缺失、插入(当存在供体多核苷酸时)、置换等)，从而改变基因表达。Cas9的一些变异体(所述变异体被术语Cas9样涵盖)已被改变，使得其具有降低的DNA切割活性(在一些情况下，其切割单链而不是靶DNA的两条链，而在其它情况下，其严重降低到没有DNA切割活性)。用于引入基因变异的CRISPR系统的其它示例性描述可见于例如US8795965。
作为一种循环扩增技术，聚合酶链反应(PCR)诱变使用诱变引物来引入所需突变。通过变性、粘接和延伸的循环进行PCR。通过PCR扩增后，可以通过以下实现突变DNA的选择和亲本质粒DNA的去除：1)在PCR期间用羟甲基化-dCTP置换dCTP，接着用限制酶消化以仅去除非羟甲基化的亲本DNA；2)同时对抗生素抗性基因和所研究的基因进行诱变，将质粒改变为不同的抗生素抗性，新的抗生素抗性有助于其后选择所需突变；3)引入所需突变后，用仅切割甲基化DNA的限制性酶Dpnl消化亲本甲基化模板DNA，从而回收诱变的未甲基化链；或4)在额外的连接反应中使突变的PCR产物环化，以提高突变DNA的转化效率。示例性方法的进一步描述可见于例如US7132265、US6713285、US6673610、US6391548、US5789166、US5780270、US5354670、US5071743以及US20100267147。
寡核苷酸定向诱变，也称为定点诱变，典型地利用合成DNA引物。这种合成引物含有所需突变，并且与突变位点周围的模板DNA互补，因此其可以与所关注基因中的DNA杂交。突变可以是单个碱基改变(点突变)、多个碱基改变、缺失或插入或这些的组合。然后，使用复制基因的其余部分的DNA聚合酶延伸单链引物。如此复制的基因含有突变位点，并且然后可以将其作为载体引入到宿主细胞中并且克隆。最后，可以通过DNA测序选择突变体，以检查其含有所需突变。
可以使用易错PCR引入基因变异。在这项技术中，在缺乏序列复制的保真度的条件下，使用DNA聚合酶扩增所关注基因。结果是扩增产物在序列中含有至少一个错误。当基因被扩增并且反应的所得(多种)产物在与模板分子相比时在序列上含有一种或多种改变时，所得产物与模板相比经诱变。引入随机突变的另一手段是使细胞暴露于化学诱变剂，如亚硝基胍或甲磺酸乙酯(Nestmann，《突变研究(Mutat Res)》1975年6月；28(3)：323-30)，并且然后从宿主中分离出含有基因的载体。
饱和诱变是随机诱变的另一形式，其中人们试图在基因的特定位点或狭窄区域生成所有或几乎所有可能的突变。在广义上，饱和诱变包含诱变确定的待诱变的多核苷酸序列(其中待诱变的序列的长度是例如15到100，000个碱基)中的诱变盒的完整集合(其中每个盒的长度是例如1-500个碱基)。因此，将一组突变(例如在1到100个突变范围内)引入到每个待诱变的盒中。在应用一轮饱和诱变的过程中，待引入到一个盒中的突变的分组可以与待引入到第二盒中的突变的第二分组不同或相同。这样的分组以缺失、添加、特定密码子的分组以及特定核苷酸盒的分组为例。
片段改组诱变，也称为DNA改组，是一种快速传播有益突变的方式。在改组过程的一个实例中，DNA酶用于将一组亲本基因片段化成长度例如约50-100bp的片段。这之后是不用引物的聚合酶链反应(PCR)-具有足够重叠的同源序列的DNA片段将彼此粘接，并且然后通过DNA聚合酶延伸。在DNA分子中的一些达到亲本基因的大小后，允许进行几轮这种PCR延伸。然后可以用另一PCR扩增这些基因，这次添加了被设计成与链末端互补的引物。引物可以在其5′末端具有添加的额外序列，如连接到克隆载体中所需的限制性酶识别位点的序列。US20050266541中提供了改组技术的其它实例。
同源重组诱变涉及外源DNA片段与靶向多核苷酸序列之间的重组。双链断裂发生后，在断裂的5′末端附近的DNA区段在被称为切除的过程中被切除。在随后的链入侵步骤中，断裂的DNA分子的突出3′端然后“侵入”未断裂的相似或相同的DNA分子。所述方法可以用于缺失基因、去除外显子、添加基因以及引入点突变。同源重组诱变可以是永久性或条件性的。典型地，还提供重组模板。重组模板可以是另一载体的组分、含于单独的载体中或作为单独的多核苷酸提供。在一些实施例中，重组模板被设计成充当同源重组中的模板，如在被位点特异性核酸酶切刻(nicked)或切割的靶序列内或附近。模板多核苷酸可以具有任何合适的长度，如约或大于约10、15、20、25、50、75、100、150、200、500、1000或更多个核苷酸的长度。在一些实施例中，模板多核苷酸与包含靶序列的多核苷酸的一部分互补。当最佳比对时，模板多核苷酸可能与靶序列的一个或多个核苷酸(例如，约或大于约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多个核苷酸)重叠。在一些实施例中，当模板序列和包含靶序列的多核苷酸最佳比对时，模板多核苷酸的最接近核苷酸在靶序列的约1、5、10、15、20、25、50、75、100、200、300，400、500、1000、5000、10000或更多个核苷酸内。在同源重组方法中适用的定点核酸酶的非限制性实例包括锌指核酸酶、CRISPR核酸酶、TALE核酸酶以及大范围核酸酶(meganuclease)。关于此类核酸酶的用途的进一步描述，参见例如US8795965和US20140301990。
主要产生点突变和短缺失、插入、颠换和/或转换的诱变剂，包括化学诱变剂或辐射可以用于产生基因变异。诱变剂包括但不限于甲磺酸乙酯、甲磺酸甲酯、N-乙基-N-亚硝基脲、三乙基三聚氰胺、N-甲基-N-亚硝基脲、丙卡巴肼、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、硫酸二乙酯、丙烯酰胺单体、美法仑、氮芥、长春新碱、二甲基亚硝胺、N-甲基-N′-硝基-亚硝基胍、亚硝基胍、2-氨基嘌呤、7，12二甲基-苯并(a)蒽、环氧乙烷、六甲基磷酰胺、白消安、二环氧烷烃(二环氧辛烷、二环氧丁烷等)、2-甲氧基-6-氯-9[3-(乙基-2-氯-乙基)氨基丙氨基]吖啶二盐酸盐以及甲醛。
引入基因变异可能是一个不完全的过程，使得经过处理的细菌种群中的一些细菌携载所需突变，而其它细菌不会。在一些情况下，期望施加选择压力以便富集携载所需基因变异的细菌。传统上，成功基因变异体的选择涉及针对或反对基因变异赋予或废除的某些功能进行选择，如在插入抗生素抗性基因或废除能够将非致死化合物转化成致死代谢物的代谢活性的情况下。也有可能基于多核苷酸序列本身施加选择压力，使得仅需要引入所需基因变异(例如，不另外需要可选标记物)。在这种情况下，选择压力可以包含切割缺乏引入到靶位点的基因变异的基因组，使得选择有效地针对寻求将基因变异引入其中的参考序列。典型地，切割发生在靶位点的100个核苷酸内(例如在距靶位点75、50、25、10或更少的核苷酸内，包括在靶位点处或靶位点内的切割)。切割可以由选自由以下组成的组的位点特异性核酸酶引导：锌指核酸酶、CRISPR核酸酶、TALE核酸酶(TALEN)或大范围核酸酶。除了没有提供用于同源重组的模板之外，此类过程类似于用于在靶位点处增强同源重组的过程。结果，缺乏所需基因变异的细菌更有可能经历切割，所述切割如果不进行修复，则会导致细胞死亡。然后可以分离出经受住选择的细菌，以用于暴露于植物以评定改良性状的赋予。
CRISPR核酸酶可以用作位点特异性核酸酶以引导靶位点的切割。可以通过使用Cas9杀死未突变的细胞来获得改良的突变微生物选择。然后用突变微生物接种植物，以重新确认共生并且产生进化压力以选择有效的共生体。然后可以从植物组织中重新分离出微生物。用于针对非变异体选择的CRISPR核酸酶系统可以采用与上文关于引入基因变异所描述的那些相似的元件，不同之处在于不提供用于同源重组的模板。因此，针对靶位点的切割促进受影响细胞的死亡。
可使用特异性诱导靶位点处切割的其它选项，如锌指核酸酶、TALE核酸酶(TALEN)系统和大范围核酸酶。锌指核酸酶(ZFN)是通过将锌指DNA结合域与DNA切割域融合而产生的人工DNA核酸内切酶。可以将ZFN工程改造成靶向所需DNA序列，并且这使得锌指核酸酶能够切割独特的靶序列。当引入到细胞中时，ZFN可以用于通过诱导双链断裂来编辑细胞(例如，细胞基因组)中的靶DNA。转录活化子样效应物核酸酶(TALEN)是通过将TAL(转录活化子样)效应子DNA结合域融合到DNA切割域而生成的人工DNA核酸内切酶。TALEN可以被快速工程改造成结合几乎任何所需DNA序列，并且当引入到细胞中时，TALEN可以用于通过诱导双链断裂来编辑细胞(例如，细胞的基因组)中的靶DNA。大范围核酸酶(归巢核酸内切酶)是内切脱氧核糖核酸酶，其特征在于大识别位点(12到40个碱基对的双链DNA序列。大范围核酸酶可以用于以高度靶向方式置换、消除或修饰序列。可以通过蛋白质工程修饰靶向序列的识别序列来改变靶向序列。大范围核酸酶可以用于修饰所有基因组类型，无论是细菌、植物还是动物，并且通常分组为四个家族：LAGLIDADG家族、GIY-YIG家族、His-Cyst盒家族以及HNH家族。示例性归巢核酸内切酶包括I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII以及I-TevIII。
本公开的方法可以用于引入或改良多种期望性状中的一种或多种。可引入或改良的性状的实例包括：根生物量、根长、高度、芽长、叶数、水分利用效率、总生物量、产量、果实大小、籽粒大小、光合作用速率、耐旱性、耐热性、耐盐性、对线虫胁迫的抗性、对真菌病原体的抗性、对细菌病原体的抗性、对病毒病原体的抗性、代谢物水平以及蛋白质组表达。期望的性状，包括高度、总生物量、根和/或芽生物量、种子发芽、幼苗存活、光合效率、蒸腾速率、种子/果实数目或质量、植物籽粒或果实产量、叶片叶绿素含量、光合速率、根长或其任何组合可以用于测量生长，并且与在相同条件下生长的参考农业植物(例如，无改良性状的植物)的生长速率进行比较。
如本文所描述，待引入或改良的优选性状是固氮。在一些情况下，与在相同条件下在土壤中生长的参考农业植物相比，由本文所描述的方法产生的植物展现性状差异大至少约5％，例如大至少约5％、至少约8％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约75％、至少约80％、至少约80％、至少约90％或至少100％、至少约200％、至少约300％、至少约400％或更大。在其它实例中，与在相似条件下在土壤中生长的参考农业植物相比，由本文所描述的方法产生的植物展现性状差异大至少约5％，例如大至少约5％、至少约8％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约75％、至少约80％、至少约80％、至少约90％或至少100％、至少约200％、至少约300％、至少约400％或更大。
可以在包括施加一种或多种生物或非生物胁迫源的条件下评定待改良的性状。胁迫源的实例包括非生物胁迫(如热胁迫、盐胁迫、干旱胁迫、冷胁迫以及低营养胁迫)和生物胁迫(如线虫胁迫、昆虫食草胁迫、真菌病原体胁迫、细菌病原体胁迫以及病毒病原体胁迫)。
通过本公开的方法和组合物改良的性状可以是固氮，包括在先前不能进行固氮的植物中。在一些情况下，与引入任何基因变异之前从第一植物中分离出的细菌相比，根据本文所描述的方法分离的细菌产生1％或更多(例如2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％或更多)的植物氮，这可以表示固氮能力提高至少2倍(例如3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍或更多)。在一些情况下，细菌产生5％或更多的植物氮。在重复引入基因变异、暴露于多种植物并且从具有改良性状的植物中分离细菌的步骤一次或多次(例如1、2、3、4、5、10、15、25或更多次)后，可以实现所需水平的固氮。在一些情况下，在补充有谷氨酰胺、氨或其它化学氮源的肥料存在下实现提高的固氮水平。评定固氮程度的方法是已知的，其实例在本文中描述。
微生物育种是一种系统地鉴别和改良作物微生物组内物种作用的方法。方法包含三个步骤：1)通过绘制植物-微生物相互作用图谱并且预测与特定表型相关的调控网络来选择候选物种，2)通过调控网络和基因簇的种内杂交，对微生物表型进行实用并且可预测的改良，以及3)筛选和选择产生所需作物表型的新微生物基因型。为了系统地评定菌株的改良，创建一个模型，所述模型将微生物群落的定殖动态与关键物种的遗传活性联系起来。所述模型用于预测遗传靶标育种，并且提高选择微生物组编码的农艺相关性状改良的频率。
固氮
本文描述增加植物中固氮的方法，其包含将植物暴露于细菌，所述细菌包含引入到一个或多个调控固氮的基因中的一种或多种基因变异，其中细菌在植物中产生1％或更多的氮(例如2％、5％、10％或更多)，这可以表示与在不存在细菌的情况下的植物相比，至少2倍的固氮能力。细菌可以在补充有谷氨酰胺、尿素、硝酸盐或氨的肥料的存在下产生氮。基因变异可以是任何数目并且呈任何组合的本文(包括以上提供的实例)中所描述的任何基因变异。可以将基因变异引入到选自由以下组成的组的基因中：nifA、nifL、ntrB、ntrC、谷氨酰胺合成酶、glnA、glnB、glnK、draT、amtB、谷氨酰胺酶、glnD、glnE、nifJ、nifH、nifD、nifK、nifY、nifE、nifN、nifU、nifS、nifV、nifW、nifZ、nifM、nifF、nifB以及nifQ。基因变异可以是引起以下中的一种或多种的突变：ni nifA或谷氨酰胺酶的表达或活性提高；nifL、ntrB谷氨酰胺合成酶、glnB、glnK、draT、amtB的表达或活性降低；GlnE的腺苷酰基去除活性降低；或GlnD的尿苷酰基去除活性降低。引入到本文所公开的方法的一种或多种细菌中的基因变异可以是敲除突变或其可以废除靶基因的调控序列，或其可以包含插入异源调控序列，例如，插入在相同细菌物种或属的基因组内发现的调控序列。可以基于细菌培养物中或植物组织内的基因表达水平来选择调控序列。基因变异可以通过化学诱变产生。步骤(c)中生长的植物可以暴露于生物或非生物胁迫源。
本文所描述的植物中发生的固氮的量可以几种方式测量，例如通过乙炔还原(AR)分析。乙炔还原分析可以在体外或体内进行。特定细菌向植物提供固定的氮的证据可以包括：1)接种后，植物总N显著增加，优选伴随植物中N浓度的提高；2)接种后，在N限制条件下氮缺乏症状减轻(其应包括干物质增加)；3)通过使用15N方法(其可以是同位素稀释实验，15N2还原分析或15N天然丰度分析)记录N2固定；4)固定的N并入到植物蛋白或代谢物中；5)所有这些效应都不见于在未接种的植物或接种了接种菌株突变体的植物中。
野生型固氮调控级联可以表示为数字逻辑电路，其中输入O2和NH4 +穿过“或非”门，或非门的输出除ATP外还进入“与”门。在一些实施例中，本文所公开的方法在调控级联中的多个点处干扰NH4 +对这一电路的影响，使得即使在施肥田地中微生物也可以产生氮。然而，本文所公开的方法还设想改变ATP或O2对电路系统的影响，或用细胞中的其它调控级联置换电路系统，或改变除固氮外的遗传电路。基因簇可以重新工程改造，以在异源调控系统的控制下生成功能性产物。通过消除基因簇编码序列之外和之内的天然调控元件，并且将其用替代调控系统置换，可以控制复合遗传操纵子和其它基因簇的功能产物且/或将所述产物移动到异源细胞，包括除衍生天然基因的物种外的其它物种的细胞。一旦经过重新工程改造，则合成基因簇可以通过遗传电路或其它诱导型调控系统进行控制，从而按需要控制产物的表达。可以将表达盒设计成充当逻辑门、脉冲发生器、振荡器、开关或存储器装置。可以将控制表达盒连接到启动子，使得表达盒充当环境传感器，如氧、温度、接触、渗透应力、膜应力或氧化还原传感器。
举例来说，可以从nif基因簇中消除nifL、nifA、nifT以及nifX基因。可以通过对编码每个氨基酸序列的DNA进行密码子随机化来设计合成基因。进行密码子选择，指定密码子使用与天然基因中的密码子使用尽可能相异。扫描所提出的序列中任何不希望的特征，如限制酶识别位点、转座子识别位点、重复序列、σ54个σ70启动子、隐藏的核糖体结合位点以及非rho依赖型终止子。选择合成核糖体结合位点以匹配每个对应的天然核糖体结合位点的强度，如通过构建荧光报告质粒，在所述质粒中基因起始密码子周围的150bp(-60到+90)与荧光基因融合。这种嵌合体可以在Ptac启动子的控制下表达，并且通过流式细胞术测量荧光。为了生成合成核糖体结合位点，生成使用合成表达盒的150bp(-60到+90)的报告质粒库。简单来说，合成表达盒可以由随机DNA间隔子、编码RBS库的简并序列以及每个合成基因的编码序列组成。筛选多个克隆以鉴别与天然核糖体结合位点最佳匹配的合成核糖体结合位点。因此构建了由与天然操纵子相同的基因组成的合成操纵子，并且对其功能互补进行了测试。US20140329326中提供了合成操纵子的进一步示例性描述。
细菌物种
可以从任何来源获得适用于本文所公开的方法和组合物的微生物。在一些情况下，微生物可以是细菌、古细菌、原生动物或真菌。本公开的微生物可以是固氮微生物，例如固氮细菌、固氮古细菌、固氮真菌、固氮酵母或固氮原生动物。适用于本文所公开的方法和组合物的微生物可以是产孢子(spore forming)微生物，例如产孢子细菌。在一些情况下，适用于本文所公开的方法和组合物的细菌可以是革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。在一些情况下，细菌可以是厚壁菌门(Firmicute phylum)的产内生孢子细菌。在一些情况下，细菌可以是固氮生物。在一些情况下，细菌可以不是固氮生物。
本公开的方法和组合物可以与古细菌(例如，嗜热自养甲烷热杆菌(Methanothermobacter thermoautotrophicus))一起使用。
在一些情况下，可能适用的细菌包括但不限于放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)、酸热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius)、酸土芽孢杆菌(Bacillusacidoterrestris)、土壤芽孢杆菌(Bacillus agri)、鲇泽芽孢杆菌(Bacillus aizawai)、乳白芽孢杆菌(Bacillus albolactis)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)、蜂房芽孢杆菌(Bacillus alvei)、氨基糖苷芽孢杆菌(Bacillus aminoglucosidicus)、噬氨基芽孢杆菌(Bacillus aminovorans)、溶淀粉芽孢杆菌(Bacillus amylolyticus)(也称为溶淀粉类芽孢杆菌(Paenibacillus amylolyficus))、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、解硫胺素芽孢杆菌(Bacillus aneurinolyticus)、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、产氮芽孢杆菌(Bacillus azotoformans)、栗褐芽孢杆菌(Bacillus badius)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)(同义词：内节律芽孢杆菌(Bacillusendorhythmos)、水母芽孢杆菌(Bacillus medusa))、角质孢子芽孢杆菌(Bacillus chitinosporus)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、内寄生芽孢杆菌(Bacillus endoparasiticus)、苛求芽孢杆菌(Bacillus fastidiosus)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、库斯塔克芽孢杆菌(Bacillus kurstaki)、栖乳芽孢杆菌(Bacillus lacticola)、乳病芽孢杆菌(Bacilluslactimorbus)、乳芽孢杆菌(Bacillus lactis)、侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)(也称为侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus))、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、缓病芽孢杆菌(Bacillus lentimorbus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、摩洛哥芽孢杆菌(Bacillus maroccanus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、穿越芽孢杆菌(Bacillus metiens)、蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)、纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)、杀线虫芽孢杆菌(Bacillusnematocida)、致黑芽孢杆菌(Bacillus nigrificans)、黑芽孢杆菌(Bacillus nigrum)、泛酸芽孢杆菌(Bacillus pantothenticus)、日本甲虫芽孢杆菌(Bacillus popillae)、冷解糖芽孢杆菌(Bacillus psychrosaccharolyticus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)、史氏芽孢杆菌(Bacillussmithii)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、单鞭毛芽孢杆菌(Bacillus uniflagellatus)、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)(侧孢芽孢杆菌)、铁杉下色杆菌(Chromobacteriumsubtsugae)、食酸代尔夫特菌(Delftia acidovorans)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、抗生素溶杆菌(Lysobacter anfibioticus)、产酶溶杆菌(Lysobacterenzymogenes)、蜂房类芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)、多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)、日本甲虫类芽孢杆菌(Paenibacillus popilliae)(原日本甲虫芽孢杆菌)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、穿刺巴斯德氏菌(Pasteuria penetrans)(原穿刺芽孢杆菌(Bacillus penetrans))、美国高尔夫球协会巴斯德氏菌(Pasteuria usgae)、胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)(原胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora))、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、致金色假单胞菌(Pseudomonasaureofaciens)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)(以前称为洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia))、绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、根支持假单胞菌(Pseudomonas proradix)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、嗜虫沙雷氏菌(Serratiaentomophila)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、哥伦比亚链霉菌(Streptomycescolombiensis)、鲜黄链霉菌(Streptomyces galbus)、五色链霉菌(Streptomycesgoshikiensis)、灰绿链霉菌(Streptomyces griseoviridis)、薰衣草链霉菌(Streptomyces lavendulae)、葱绿链霉菌(Streptomyces prasinus)、萨拉塞链霉菌(Streptomyces saraceficus)、委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、发光致病杆菌(Xenorhabdus luminescens)、嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)、球状红球菌(Rhodococcus globerulus)AQ719(ATCC寄存编号B-21663)、芽孢杆菌属AQ175(ATCC寄存编号55608)、芽孢杆菌属AQ 177(ATCC寄存编号55609)、芽孢杆菌属AQ178(ATCC寄存编号53522)以及链霉菌属菌株NRRL寄存编号B-30145。在一些情况下，细菌可以是褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、肺炎克雷伯氏菌、棕色固氮菌、红细菌(Rhodobacterspharoides)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、沼泽红细菌(Rhodobcterpalustris)、深红红螺菌(Rhodosporillum rubrum)、豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)或菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)。
在一些情况下，细菌可以是梭菌属物种，例如巴氏梭菌(Clostridiumpasteurianum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。
在一些情况下，与本公开的方法和组合物一起使用的细菌可以是蓝细菌。蓝细菌属的实例包括鱼腥藻属(Anabaena)(例如鱼腥藻属PCC7120)、念珠藻属(Nostoc)(例如点形念珠藻(Nostoc punctiforme))或集胞藻属(Synechochocystis)(例如集胞藻属PCC6803)。
在一些情况下，与本公开的方法和组合物一起使用的细菌可以属于绿菌门(Chlorobi)，例如绿硫菌(Chlorobium tepidum)。
在一些情况下，与本公开的方法和组合物一起使用的微生物可以包含与已知NifH基因同源的基因。已知NifH基因的序列可以见于例如Zehr实验室NifH数据库(Zehr labNifH database)(https：//wwwzehr.pmc.ucsc.edu/nifH_Database_Public/，2014年4月4日)，或巴克利实验室NifH数据库(Buckley lab NifH database)(http：//www.css.cornell.edu/faculty/buckley/nifh.htm，和Gaby,John Christian和DanielH.Buckley.“综合比对nifH基因数据库：研究固氮细菌的多用途工具。(A comprehensivealigned nifH gene database：a multipurpose tool for studies of nitrogen-fixingbacteria.)”《数据库(Database)》2014(2014)：bau001.)。在一些情况下，与本公开的方法和组合物一起使用的微生物可以包含与来自Zehr实验室NifH数据库(https：//wwwzehr.pmc.ucsc.edu/nifH_Database_Public/，2014年4月4日)的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、96％、98％、99％或超过99％序列同一性的编码多肽的序列。在一些情况下，与本公开的方法和组合物一起使用的微生物可以包含编码与来自巴克利实验室NifH数据库(Gaby,John Christian和Daniel H.Buckley.“综合比对nifH基因数据库：研究固氮细菌的多用途工具。”《数据库》2014(2014)：bau001.)的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、96％、98％、99％或超过99％序列同一性的编码多肽的序列。
适用于本文所公开的方法和组合物的微生物可以通过以下获得：从天然植物的表面或组织中提取微生物；研磨种子以分离微生物；在不同土壤样品中种植种子，并且从组织中回收微生物；或用外源微生物接种植物，并且确定哪些微生物出现在植物组织中。植物组织的非限制性实例包括种子、幼苗、叶、插条、植株、鳞茎或块茎。在一些情况下，从种子中分离细菌。可以改变用于加工样品的参数以分离不同类型的缔合微生物，如根际菌、附生菌或内生菌。细菌也可以来源于如环境菌株收集物的储存库(repository)中获得，而不是最初从第一植物中分离。可以通过以下对微生物进行基因分型和表型分型：对分离的微生物的基因组进行测序；进行植物中群落组成谱分析；表征群落或分离的微生物的转录组学功能；或使用选择性或表型培养基筛选微生物特征(例如，固氮或磷酸盐溶解表型)。可以通过以下获得选定候选菌株或种群：序列数据；表型数据；植物数据(例如，基因组、表型和/或产量数据)；土壤数据(例如，pH、N/P/K含量和/或非根际土壤(bulk soil)生物群落)；或这些的任何组合。
本文所描述的细菌和产生细菌的方法可以适用于能够在叶片表面、根部表面或植物组织内部有效地自我繁殖而不会诱导有害的植物防御反应的细菌，或对植物防御反应具有抗性的细菌。可以通过在不添加氮的培养基中培养植物组织提取物或叶片表面洗涤液来分离本文所描述的细菌。然而，细菌可能是不可培养的，也就是说，尚未知晓可使用所属领域中已知的标准方法培养，或难以使用所属领域中已知的标准方法培养。本文所描述的细菌可以是内生菌或附生菌或栖居于植物根际的细菌(根际细菌)。重复引入基因变异、暴露于多种植物以及从具有改良性状的植物中分离细菌的步骤一次或多次(例如1、2、3、4、5、10、15、25次或更多次)后获得的细菌可能是内生菌、附生菌或根际菌。内生菌是进入植物内部而不会引起疾病症状或诱发共生结构形成的生物，并且受农艺学关注，因为其可以增强植物生长并且改良植物的营养(例如，通过固氮)。细菌可以是种传(seed-borne)内生菌。种传内生菌包括与草或植物种子缔合或来源于其的细菌，如在成熟、干燥、未受损(例如，无裂缝、可见的真菌感染或过早发芽)的种子中发现的种传细菌内生菌。种传细菌内生菌可以与种子表面缔合或来源于种子表面；或者或另外，其可以与内部种子隔室(例如，表面除菌的种子)缔合或来源于内部种子隔室。在一些情况下，种传细菌内生菌能够在植物组织内，例如种子内部复制。此外，在一些情况下，种传细菌内生菌能够经受住脱水。
根据本公开的方法分离的细菌，或用于本公开的方法或组合物中的细菌，可以包含多种不同细菌分类群的组合。作为实例，细菌可以包括变形菌门(如假单胞菌属(Pseudomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、根瘤菌属(Rhizobium)、草螺菌属(Herbaspirillum)、泛菌属(Pantoea)、沙雷氏菌属(Serratia)、拉恩氏菌属(Rahnella)、固氮螺菌属(Azospirillum)、固氮根瘤菌属(Azorhizobium)、固氮菌属(Azotobacter)、杜擀氏菌属(Duganella)、代尔夫特菌属(Delftia)、短根瘤菌属(Bradyrhizobiun)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)以及盐单胞菌属(Halomonas))、厚壁菌门(如芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、支原体属(Mycoplasma)以及醋酸杆菌属(Acetabacterium))和放线菌门(Actinobacteria)(如链霉菌属(Streptomyces)、红球菌属(Rhodacoccus)、微杆菌属(Microbacterium)以及短小杆菌属(Curtobacterium))。在本公开的方法和组合物中使用的细菌可以包括两种或更多种物种的固氮细菌聚生体(consortia)。在一些情况下，细菌聚生体的一种或多种细菌可能能够固氮。在一些情况下，细菌聚生体的一种或多种物种可以促进或增强其它细菌固氮的能力。固氮的细菌和增强其它细菌固氮能力的细菌可以相同或不同。在一些实例中，当与不同细菌菌株组合或在某一细菌聚生体中时，细菌菌株可能能够固氮，但在单一培养中可能无法固氮。可以在固氮细菌聚生体中找到细菌的属的实例包括但不限于草螺菌属、固氮螺菌属、肠杆菌属以及芽孢杆菌属。
可以通过本文所公开的方法产生的细菌包括固氮菌属、短根瘤菌属、克雷伯氏菌属以及中华根瘤菌属。在一些情况下，细菌可以选自由以下组成的组：棕色固氮菌、慢性大豆根瘤菌、肺炎克雷伯氏菌以及苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)。在一些情况下，细菌可以是肠杆菌属或拉恩氏菌属。在一些情况下，所述细菌可以是弗兰克氏菌属(Frankia)或梭菌属。梭菌属的细菌的实例包括但不限于丙酮丁醇梭菌、巴氏梭菌、拜氏梭菌、产气荚膜梭菌以及破伤风梭菌。在一些情况下，所述细菌可以是类芽孢杆菌属的，例如固氮类芽孢杆菌(Paenibacillus azotofixans)、北方类芽孢杆菌(Paenibacillusborealis)、坚韧类芽孢杆菌(Paenibacillus durus)、浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillusmacerans)、多粘类芽孢杆菌、蜂房类芽孢杆菌、溶淀粉类芽孢杆菌、坎皮纳斯类芽孢杆菌(Paenibacillus campinasensis)、千叶类芽孢杆菌(Paenibacillus chibensis)、解葡糖类芽孢杆菌(Paenibacillus glucanolyticus)、伊利诺伊类芽孢杆菌(Paenibacillusillinoisensis)、幼虫类芽孢杆菌幼虫亚种(Paenibacillus larvae subsp.Larvae)、幼虫类芽孢杆菌生尘亚种(Paenibacillus larvae subsp.Pulvifaciens)、灿烂类芽孢杆菌(Paenibacillus lautus)、浸麻类芽孢杆菌、马阔里类芽孢杆菌(Paenibacillusmacquariensis)、饲料类芽孢杆菌(Paenibacillus pabuli)、皮尔瑞俄类芽孢杆菌(Paenibacillus peoriae)或多粘类芽孢杆菌。
在一些实例中，根据本公开的方法分离的细菌可以是以下分类群中的一种或多种的成员：无色杆菌属(Achromobacter)、嗜酸硫杆菌属(Acidithiobacillus)、食酸菌属(Acidovorax)、食酸菌属(Acidovoraz)、不动杆菌属(Acinetobacter)、游动放线菌属(Actinoplanes)、阿德勒菌属(Adlercreutzia)、气球菌属(Aerococcus)、气单胞菌属(Aeromonas)、阿波菲菌属(Afipia)、壤霉菌属(Agromyces)、屈曲杆菌属(Arthrobacter)、奇杆菌属(Atopostipes)、固氮螺菌属、芽孢杆菌属、蛭弧菌属(Bdellovibrio)、拜叶林克氏菌属(Beijerinckia)、芽生杆菌属(Bosea)、短根瘤菌属、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、伯克霍尔德氏菌属、候选属盐重构菌属(CandidatusHaloredivivus)、柄杆菌属(Caulobacter)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、纤维弧菌属(Cellvibrio)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、梭菌属、珊瑚珍珠菌属(Coraliomargarita)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、贪铜菌属(Cupriavidus)、短小杆菌属、弯曲杆菌属(Curvibacter)、异常球菌属(Deinococcus)、代尔夫特菌属、德库菌属(Desemzia)、德沃斯氏菌属(Devosia)、独岛菌属(Dokdonella)、戴氏菌属(Dyella)、栖水菌属(Enhydrobacter)、肠杆菌属、肠球菌属(Enterococcus)、欧文氏菌属(Erwinia)、埃希氏菌属(Escherichia)、埃希氏菌属/志贺氏菌属(Shigella)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、铁球菌属(Ferroglobus)、丝状单胞菌属(Filimonas)、芬戈尔德菌属(Finegoldia)、黄壤杆菌属(Flavisolibacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、冰冻小杆菌属(Frigoribacterium)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、盐棒菌属(Halobaculum)、盐单胞菌属、盐简菌属(Halosimplex)、草螺菌属、薄层菌属(Hymenobacter)、克雷伯氏菌属、考克氏菌属(Kocuria)、小迫氏菌属、乳杆菌属、勒克氏菌属(Leclercia)、伦茨氏菌属(Lentzea)、藤黄杆菌属(Luteibacter)、藤黄单胞菌属(Luteimonas)、马赛菌属(Massilia)、中间根瘤菌属(Mesorhizobium)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、微杆菌、微球菌属(Micrococcus)、微枝形杆菌属(Microvirga)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、诺卡氏菌属(Nocardia)、大洋杆菌属(Oceanibaculum)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、奥卡杆菌属(Okibacterium)、寡养菌属(Oligotropha)、稻土菌属(Oryzihumus)、食草酸菌属(Oxalophagus)、类芽孢杆菌属、泛菌属(Panteoa/Pantoea)、泥单胞菌属(Pelomonas)、透明球菌属(Perlucidibaca)、植物杆菌属(Plantibacter)、多核杆菌属(Polynucleobacter)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、产丙酸棒形菌属(Propioniciclava)、假棒形杆菌属(Pseudoclavibacter)、假单胞菌属、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、假黄单胞菌属(Pseudoxanthomonas)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、莱茵海默氏菌属(Rheinheimera)、根瘤菌属、红球菌属、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、玫瑰色不完全光合菌属(Roseateles)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、塞巴鲁德氏菌属(Sebaldella)、沉积物杆菌属(Sediminibacillus)、沉积物杆状菌属(Sediminibacterium)、沙雷氏菌属、志贺氏菌属、申氏杆菌属(Shinella)、中华根瘤菌属、中华孢囊菌属(Sinosporangium)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、鞘氨醇盒菌属(Sphingopyxis)鞘氨醇细胞菌属(Sphingosinicella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、25寡养单胞菌属、寡养单胞菌属、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属、憎叶菌属(Stygiolobus)、硫磺球形菌属(Sulfurisphaera)、塔特姆氏菌属(Tatumella)、温单胞菌属(Tepidimonas)、热单胞菌属(Thermomonas)、硫杆菌属(Thiobacillus)、贪噬菌属(Variovorax)、WPS-2属地位未定(incertae sedis)、黄单胞菌属(Xanthomonas)以及齐默尔曼氏菌属(Zimmermannella)。
细菌可以从任何一般陆地环境中获得，包括其土壤、植物、真菌、动物(包括无脊椎动物)以及其它生物群，包括湖泊和河流的沉积物、水以及生物群；来自海洋环境，其生物群和沉积物(例如，海水、海泥、海洋植物、海洋无脊椎动物(例如，海绵)、海洋脊椎动物(例如，鱼))；陆地和海洋岩石圈(表土和岩石，例如受挤压的地下岩、砂和粘土)；低温层和其融水；大气(例如，经过滤的空气粉尘、云和雨滴)；城市、工业和其它人造环境(例如，混凝土、路边沟槽、屋顶表面以及道路表面上积聚的有机物和矿物质)。
从中获得细菌的植物可以是具有一个或多个期望性状的植物，例如在特定环境中或特定条件下天然生长的植物。作为实例，某种植物可在砂土或高盐度砂中，或在极端温度下，或在具有极少的水的情况下天然生长，或其可抵抗环境中的某些害虫或疾病，并且可能需要经济作物在这类条件中生长，尤其在这是例如特定地理位置中仅有的条件时。作为另一实例，可以从在此类环境中生长的经济作物，或更具体地说，从在任何特定环境中生长的作物中最佳显示所关注性状的个别作物植物收集细菌：例如在盐限制土壤中生长的作物中生长最快的植物，或暴露于严重昆虫损害或疾病流行的作物中受损度最低的植物，或具有所需量的某些代谢物和其它化合物(包括纤维含量、油含量等)的植物，或显示期望颜色、味道或气味的植物。细菌可以从所关注的植物或所关注的环境中出现的任何物质收集，包括真菌和其它动物和植物生物群、土壤、水、沉积物以及如先前所提及的其它环境元素。
细菌可以从植物组织中分离。这种分离可以从植物中的任何适当组织发生，包括例如根、茎和叶，以及植物生殖组织。作为实例，从植物中分离的常规方法典型地包括对所关注的植物材料(例如根或茎长、叶片)进行无菌切除，用适当溶液(例如2％次氯酸钠)进行表面灭菌，之后将植物将材料放在营养物培养基上以进行微生物生长。或者，可以在无菌液体(通常水)中将经表面灭菌的植物材料压碎，并且使液体悬浮液(包括压碎的植物材料的小片)散布在合适的一种或多种固体琼脂培养基的表面上，所述培养基可以或可以不具有选择性(例如仅含有植酸作为磷源)。这种方法尤其适用于形成分离菌落并且可以分别选取到独立的营养物培养基的板，并且通过众所周知的方法进一步纯化为单一物种的细菌。或者，可以不对植物根或叶样品进行表面灭菌，但仅对其进行温和洗涤，由此在分离过程中包括表面驻留的附生微生物，或可以通过压印和剥离植物的根、茎或叶的片到琼脂培养基表面上，并且然后如上分离个别菌落来分别地分离附生微生物。举例来说，这种方法尤其适用于细菌。或者，可以在不洗掉附着于根部的少量土壤的情况下加工根部，由此包括定殖植物根际的微生物。否则，粘附于根部的土壤可以被去除、稀释并且散布到合适的选择性和非选择性培养基的琼脂上，以分离根际细菌的个别菌落。
水生拉恩氏菌和蔗糖肠杆菌(Enterobacter sacchari)的生物纯培养物于2015年7月14日保藏在美国弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas，VA，USA)的美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection；ATCC；国际保藏机构)，并且分别指定了ATTC专利保藏指定编号PTA-122293和PTA-122294。这些保藏是根据《出于专利申请程序目的的微生物保藏取得国际承认的布达佩斯条约和法规(Budapest Treaty on the InternationalRecognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of PatentProcedure and the Regulations)》(《布达佩斯条约》)的条款进行的。
组合物
包含根据本文所描述的方法产生的细菌或细菌种群且/或具有如本文所描述的特征的组合物可以呈液体、泡沫或干燥产品形式。在一些实例中，包含细菌种群的组合物可以呈干粉、粉末和水的浆液或可流动种子处理剂形式。
组合物可以在生物反应器(如连续搅拌釜反应器、间歇反应器)和农场中制造。在一些实例中，组合物可以存储在如水罐的容器中或以小型散装存储。在一些实例中，组合物可以存储在选自由以下组成的组的物件内：瓶、广口瓶、安瓿、包装、器皿、袋子、包、盒子、储藏箱、包封、纸箱、容器、筒仓、运输容器、车厢和/或箱子。
组合物也可以用于改良植物性状。在一些实例中，可以将一种或多种组合物包被到种子上。在一些实例中，可以将一种或多种组合物包被到幼苗上。在一些实例中，可以将一种或多种组合物包被到种子的表面上。在一些实例中，可以将一种或多种组合物包被为种子表面上方的层。在一些实例中，包被到种子上的组合物可以呈液体形式、呈干燥产品形式、呈泡沫形式、呈粉末和水的浆液形式或呈可流动种子处理剂形式。在一些实例中，可以通过用一种或多种组合物对种子和/或幼苗进行喷雾、浸没、包被、囊封和/或撒粉，将一种或多种组合物施加到种子和/或幼苗。在一些实例中，可以将多种细菌或细菌种群包被到植物的种子和/或幼苗上。在一些实例中，细菌组合中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种或超过十种细菌可以选自以下属中的一种：食酸菌属、土壤杆菌属(Agrobacterium)、芽孢杆菌属、伯克霍尔德氏菌属、金黄杆菌属、短小杆菌属、肠杆菌属、埃希氏菌属、甲基杆菌属、类芽孢杆菌属、泛菌属、假单胞菌属、雷尔氏菌属、糖杆菌属(Saccharibacillus)、鞘氨醇单胞菌属以及寡养单胞菌属。
在一些实例中，内生组合中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种或超过十种细菌和细菌种群可以选自以下科中的一种：芽孢杆菌科(Bacillaceae)、伯克霍尔德氏菌科(Burkholderiaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、类芽孢杆菌科(Paenibacillileae)、假单胞菌科(Pseudomonnaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、鞘氨醇单胞菌科(Sphingomonadaceae)、黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)、枝孢霉科(Cladosporiaceae)、日规壳菌(Gnomoniaceae)、未定地位(Incertae sedis)、毛球壳科(Lasiosphaeriaceae)、丛赤壳科(Netriaceae)以及格孢菌科(Pleosporaceae)。
在一些实例中，内生组合中的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种或超过十种细菌和细菌种群可以选自以下科中的一种：芽孢杆菌科、伯克霍尔德氏菌科、丛毛单胞菌科、肠杆菌科、黄杆菌科、甲基杆菌科、微杆菌科、类芽孢杆菌科、假单胞菌科、根瘤菌科、鞘氨醇单胞菌科、黄单胞菌科、枝孢霉科、日规壳菌、未定地位、毛球壳科、丛赤壳科以及格孢菌科。
组合物的实例可以包括用于商业上重要的农作物的种子包衣，所述农作物例如高粱、芥花、番茄、草莓、大麦、水稻、玉米以及小麦。组合物的实例还可以包括用于玉米、大豆、芥花、高粱、马铃薯、水稻、蔬菜、谷类以及油籽的种子包衣。如本文所提供的种子可以是基因修饰生物体(GMO)、非GMO、有机或常规的。在一些实例中，可以将组合物喷雾在植物的地上部分上，或通过插入到种有植物种子的犁沟中、浇水到土壤中或将根浸入组合物的悬浮液中而施加到根。在一些实例中，可以以维持细胞活力和人工接种并且定殖宿主植物的能力合适的方式使组合物脱水。细菌物种可以以108到1010CFU/ml之间的浓度存在于组合物中。在一些实例中，组合物可以补充有痕量金属离子，如钼离子、铁离子、锰离子或这些离子的组合。如本文所描述的组合物的实例中的离子浓度可以在约0.1mM到约50mM之间。组合物的一些实例也可以与载剂一起配制，所述载剂如β-葡聚糖、羧甲基纤维素(CMC)、细菌细胞外聚合物质(EPS)、糖、动物乳或其它合适的载剂。在一些实例中，泥炭或种植材料可以用作载剂，或生物聚合物可以用作载剂，其中组合物包覆在所述生物聚合物中。
可以将包含本文所描述的细菌种群的组合物包被到种子的表面上。因此，也设想了包含用本文所描述的一种或多种细菌包被的种子的组合物。种子包衣可以通过将细菌种群与多孔的化学惰性颗粒状载剂混合而形成。或者，组合物可以直接插入到种有种子的犁沟中，或喷雾到植物叶片上，或通过将根浸入组合物的悬浮液中进行施加。有效量的组合物可以用于用活细菌生长来填充邻近植物根部的底土区域，或用活细菌生长来填充植物的叶片。一般来说，有效量是足以产生具有改良性状(例如所需固氮水平)的植物的量。
本文所描述的细菌组合物可以使用农业上可接受的载剂配制。适用于这些实施例的配制物可以包括选自由以下组成的组的至少一个成员：增粘剂、微生物稳定剂、杀真菌剂、抗细菌剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、抗复合剂、除草剂、杀线虫剂、杀昆虫剂、植物生长调控剂、肥料、灭鼠剂、干燥剂、杀细菌剂、营养物或其任何组合。在一些实例中，组合物可以是贮存稳定的。举例来说，本文所描述的组合物中的任一种可以包括农业上可接受的载剂(例如，肥料(如非天然存在的肥料)、粘合剂(如非天然存在的粘合剂)和农药(如非天然存在的农药)中的一种或多种)。非天然存在的粘合剂可以是例如聚合物、共聚物或合成蜡。举例来说，本文所描述的包衣种子、幼苗或植物中的任一种可以在种子包衣中含有此类农业上可接受的载剂。在本文所描述的组合物或方法中的任一种中，农业上可接受的载剂可以是或可以包括非天然存在的化合物(例如，非天然存在的肥料、非天然存在的粘合剂(如聚合物、共聚物或合成蜡)或非天然存在的农药)。以下描述了农业上可接受的载剂的非限制性实例。农业上可接受的载剂的其它实例是所属领域中已知的。
在一些情况下，细菌与农业上可接受的载剂混合。载剂可以是固体载剂或液体载剂，并且呈各种形式，包括微球、粉末、乳液等。载剂可以是赋予多种特性，如提高的稳定性、可湿性或可分散性的数种载剂中的任何一种或多种。组合物中可以包括润湿剂，如天然或合成表面活性剂，其可以是非离子或离子表面活性剂，或其组合。油包水乳液也可以用于配制包括分离的细菌的组合物(参见例如美国专利第7，485，451号)。可以制备的合适的配制物包括可湿性粉剂、颗粒、凝胶、琼脂条或团粒、增稠剂等、微囊封粒子等、液体，如水性流体、水性悬浮液、油包水乳液等。配制物可以包括谷物或豆科植物产品，例如磨碎的谷物或豆类、来源于谷物或豆类的汤或粉、淀粉、糖或油。
在一些实施例中，农业载剂可以是土壤或植物生长培养基。可以使用的其它农业载剂包括水、肥料、植物类油、保湿剂或其组合。或者，农业载剂可以是固体，如硅藻土、壤土、二氧化硅、海藻酸盐、粘土、膨润土、蛭石、种壳、其它植物和动物产品或组合，包括颗粒、团粒或悬浮液。还设想了前述成分中的任一种的混合物作为载剂，如但不限于佩斯塔(pesta)(面粉和高岭土)，壤土、砂土或粘土中基于琼脂或面粉的团粒等。配制物可以包括细菌的食物源，如大麦、水稻，或其它生物材料，如种子、植物部分、甘蔗渣、来自谷物加工的壳或茎秆、来自建筑场所垃圾的磨碎植物材料或木材、锯末或来自纸、织物或木材回收的小纤维。
举例来说，肥料可以用于帮助促进生长或为种子、幼苗或植物提供营养。肥料的非限制性实例包括氮、磷、钾、钙、硫、镁、硼、氯、锰、铁、锌、铜、钼以及硒(或其盐)。肥料的其它实例包括一种或多种氨基酸、盐、碳水化合物、维生素、葡萄糖、NaCl、酵母提取物、NH4H2PO4、(NH4)2SO4、甘油、缬氨酸、L-亮氨酸、乳酸、丙酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸氢钾、木糖、来苏糖以及卵磷脂。在一个实施例中，配制物可以包括增粘剂或粘附剂(被称作粘合剂)以帮助将其它活性剂结合到物质(例如，种子表面)。此类试剂适用于将细菌与可以含有其它化合物的载剂(例如，不是生物制剂的控制剂)组合，以产生包衣组合物。此类组合物帮助在植物或种子周围产生包衣，以维持微生物和其它试剂与植物或植物部分之间的接触。在一个实施例中，粘合剂选自由以下组成的组：海藻酸盐、树胶、淀粉、卵磷脂、芒柄花黄素(formononetin)、聚乙烯醇、芒柄花黄素碱金属盐(alkali formononetinate)、橙皮素、聚乙酸乙烯酯、脑磷脂、阿拉伯胶、黄原胶、矿物油、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、阿拉伯半乳聚糖、甲基纤维素、PEG 400、壳聚糖、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚丙烯腈、甘油、三乙二醇、乙酸乙烯酯、结冷胶(Gellan Gum)、聚苯乙烯、聚乙烯、羧甲基纤维素、印度树胶(Gum Ghatti)以及聚氧乙烯-聚氧丁烯嵌段共聚物。
在一些实施例中，粘合剂可以是例如蜡，如巴西棕榈蜡(carnauba wax)、蜂蜡、中国蜡、虫胶蜡、鲸蜡(spermaceti wax)、小烛树蜡(candelilla wax)、蓖麻蜡、小冠巴西棕蜡(ouricury wax)以及米糠蜡；多糖(例如，淀粉、糊精、麦芽糖糊精、海藻酸盐以及壳聚糖)；脂肪；油；蛋白质(例如，明胶和玉米蛋白)；阿拉伯胶；以及虫胶。粘合剂可以是非天然存在的化合物，例如聚合物、共聚物和蜡。举例来说，可以用作粘合剂的聚合物的非限制性实例包括：聚乙酸乙烯酯、聚乙酸乙烯酯共聚物、乙烯乙酸乙烯酯(EVA)共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯醇共聚物、纤维素(例如，乙基纤维素、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素以及羧甲基纤维素)、聚乙烯吡咯烷酮、氯乙烯、偏二氯乙烯共聚物、木质素磺酸钙、丙烯酸共聚物、聚乙烯基丙烯酸酯、聚环氧乙烷、酰基酰胺聚合物和共聚物、聚丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酰胺单体以及聚氯丁二烯。
在一些实例中，粘合剂、抗真菌剂、生长调控剂和农药(例如，杀昆虫剂)中的一种或多种是非天然存在的化合物(例如，以任何组合)。农业上可接受的载剂的其它实例包括分散剂(例如，聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯PVPIVA S-630)、表面活性剂、粘结剂以及填充剂。
配制物还可以含有表面活性剂。表面活性剂的非限制性实例包括氮表面活性剂掺合物，如Prefer 28(Cenex)、Surf-N(US)、Inhance(Brandt)、P-28(Wilfarm)以及Patrol(Helena)；酯化的种子油包括Sun-It II(AmCy)、MSO(UAP)、Scoil(Agsco)、Hasten(Wilfarm)以及Mes-100(Drexel)；并且有机硅表面活性剂包括Silwet L77(UAP)、Silikin(Terra)、Dyne-Amic(Helena)、Kinetic(Helena)、Sylgard 309(Wilbur-Ellis)以及Century(Precision)。在一个实施例中，表面活性剂以0.01％v/v到10％v/v之间的浓度存在。在另一实施例中，表面活性剂以0.1％v/v到1％v/v之间的浓度存在。
在某些情况下，配制物包括微生物稳定剂。此类试剂可以包括干燥剂，其可以包括可以被分类为干燥剂的任何化合物或化合物的混合物，而不管一种或多种化合物是否以实际上对液体接种菌具有干燥作用的浓度使用。此类干燥剂理想地与所使用的细菌种群相容，并且应提高微生物种群经受住在种子上施加后和经受住干燥的能力。合适的干燥剂的实例包括海藻糖、蔗糖、甘油以及亚甲二醇中的一种或多种。其它合适的干燥剂包括但不限于非还原糖和糖醇(例如，甘露糖醇或山梨糖醇)。引入到配制物中的干燥剂的量可以在按重量/体积计约5％到约50％的范围内，例如，在约10％到约40％之间、在约15％到约35％之间或在约20％到约30％之间。在一些情况下，配制物中含有如杀真菌剂、抗细菌剂、除草剂、杀线虫剂、杀昆虫剂、植物生长调控剂、灭鼠剂、杀细菌剂或营养物的试剂是有利的。在一些实例中，试剂可以包括提供对种子表面传播的病原体的防范的保护剂。在一些实例中，保护剂可以提供对土传病原体的一定水平的控制。在一些实例中，保护剂可以主要在种子表面上有效。
在一些实例中，杀真菌剂可以包括可以抑制真菌生长或杀死真菌的化合物或试剂，无论是化学还是生物的。在一些实例中，杀真菌剂可以包括可以抑制真菌或杀真菌的化合物。在一些实例中，杀真菌剂可以是保护剂，或主要在种子表面上有效的试剂，提供对种子表面传播的病原体的防范并且提供对土传病原体的一定水平的控制。保护剂杀真菌剂的非限制性实例包括克菌丹(captan)、代森锰(maneb)、福美双(thiram)或咯菌腈(fludioxonil)。
在一些实例中，杀真菌剂可以是内吸性杀真菌剂，其可以被吸收到出苗的幼苗中并且抑制或杀死宿主植物组织内的真菌。用于种子处理的内吸性杀真菌剂包括但不限于以下：嘧菌酯(azoxystrobin)、萎锈灵(carboxin)、精甲霜灵(mefenoxam)、甲霜灵(metalaxyl)、噻苯达唑(thiabendazole)、三氟敏(trifloxystrobin)以及各种三唑杀真菌剂，包括待克利(difenoconazole)、种菌唑(ipconazole)、戊唑醇(tebuconazole)以及灭菌唑(triticonazole)。精甲霜灵和甲霜灵主要用于靶向水霉菌腐霉属(Pythium)和疫霉属(Phytophthora)。视植物物种而定，一些杀真菌剂相比于其它杀真菌剂是优选的，因为病原真菌物种的敏感性存在细微差异，或因为杀真菌剂分布或植物敏感性存在差异。在一些实例中，杀真菌剂可以是生物控制剂，例如细菌或真菌。此类生物体可以寄生到病原真菌，或分泌毒素或可以杀死真菌或以其它方式阻止真菌生长的其它物质。任何类型的杀真菌剂，尤其通常在植物上使用的杀真菌剂，可用作种子组合物中的控制剂。
在一些实例中，种子包衣组合物包含具有抗细菌特性的控制剂。在一个实施例中，具有抗细菌特性的控制剂选自本文其它地方所描述的化合物。在另一实施例中，化合物是链霉素(Streptomycin)、土霉素(oxytetracycline)、欧索林酸(oxolinic acid)或庆大霉素(gentamicin)。可以用作种子包衣组合物一部分的抗细菌化合物的其它实例包括基于双氯酚和苄醇半缩甲醛(来自ICI的或来自Thor Chemie的/>RS，和来自罗门哈斯(Rohm&Haas)的/>MK 25)和异噻唑啉酮衍生物，如烷基异噻唑啉酮和苯并异噻唑啉酮(来自Thor Chemie的/>MBS)的化合物。
在一些实例中，生长调控剂选自：脱落酸(Abscisic acid)、先甲草胺(amidochlor)、环丙嘧啶醇(ancymidol)、6-苄基氨基嘌呤、芸苔素内酯(brassinolide)、比达宁(butralin)、克美素(chlormequat)(矮壮素(chlormequat chloride))、氯化胆碱、环丙酸酰胺(cyclanilide)、亚拉生长素(daminozide)、调呋酸(dikegulac)、获萎得(dimethipin)、2,6-二甲基嘌啶、益收生长素(ethephon)、氟节胺(flumetralin)、呋嘧醇(flurprimidol)、氟噻乙草酯(fluthiacet)、福芬素(forchlorfenuron)、赤霉酸(gibberellic acid)、依纳素(inabenfide)、吲哚-3-乙酸、顺丁烯二酰肼、氟磺酰草胺(mefluidide)、壮棉素(mepiquat)(缩节胺(mepiquat chloride))、萘乙酸、N-6-苄基腺嘌呤、巴克素(paclobutrazo1)、调环酸三硫代磷酸酯(prohexadionephosphorotrithioate)、2,3,5-三碘苯甲酸、抗倒酯(trinexapac-ethyl)以及烯效唑(uniconazole)。生长调控剂的其它非限制性实例包括油菜素内固醇(brassinosteroid)、细胞分裂素(例如，激动素(kinetin)和玉米素(zeatin))、生长素(例如，吲哚乙酸和吲哚基乙酰基天冬氨酸)、类黄酮和异类黄酮(例如，芒柄花黄素和香叶木素(diosmetin))、植物抗毒素(例如，大豆抗毒素(glyceolline))和诱导植物抗毒素的寡糖(例如，果胶、几丁质、壳聚糖、聚半乳糖醛酸以及寡聚半乳糖醛酸)以及吉贝素(gibellerin)。此类试剂理想地与上面施加配制物的农业种子或幼苗相容(例如，其不应对植物的生长或健康有害)。此外，试剂理想地是一种不会导致对人类、动物或工业使用的安全担忧的试剂(例如，没有安全问题，或化合物足够不稳定以至于来源于植物的商品植物产品含有可忽略量的化合物)。
线虫拮抗生物控制剂的一些实例包括ARFl8；30线虫捕捉菌属(Arthrobotrysspp.)；毛壳菌属(Chaetomium spp.)；柱孢属(Cylindrocarpon spp.)；外瓶霉属(Exophilia spp.)；镰刀菌属(Fusarium spp.)；粘帚霉属(Gliocladium spp.)；被毛孢属(Hirsutella spp.)；轮枝菌属(Lecanicillium spp.)；单顶孢属(Monacrosporium spp.)；漆斑菌属(Myrothecium spp.)；新赤壳菌属(Neocosmospora spp.)；拟青霉菌属(Paecilomyces spp.)；普可尼亚菌属(Pochonia spp.)；壳多孢属(Stagonospora spp.)；囊泡-丛枝菌根真菌(vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi)，伯克霍尔德氏菌属；巴斯德氏菌属、短芽孢杆菌属；假单胞菌属；以及根际细菌。尤其优选的线虫拮抗生物控制剂包括ARF18、少孢线虫捕捉菌(Arthrobotrys dactyloides)、球毛壳菌(Chaetomiumglobosum)、异丝藻柱孢(Cylindrocarpon heteronema)、甄氏外瓶霉(ExophiliaJeanelmei)、嗜鱼外瓶霉(Exophilia pisciphila)、曲霉镰刀菌(Fusarium aspergilus)、茄病镰刀菌(Fusarium solani)、链孢粘帚霉(Gliocladium catenulatum)、粉红粘帚霉(Gliocladium roseum)、绿粘帚霉(Gliocladium vixens)、洛斯里被毛孢(Hirsutellarhossiliensis)、明尼苏达被毛孢(Hirsutella minnesotensis)、蜡蚧轮枝菌(Lecanicillium lecanii)、掘氏单顶孢(Monacrosporium drechsleri)、桥区单顶孢(Monacrosporium gephyropagum)、疣孢漆斑菌(Myrotehcium verrucaria)、侵管新赤壳菌(Neocosmospora vasinfecta)、淡紫拟青霉菌(Paecilomyces lilacinus)、厚垣普可尼亚菌(Pochonia chlamydosporia)、异皮壳多孢菌(Stagonospora heteroderae)、菜豆壳多孢菌(Stagonospora phaseoli)、囊泡-丛枝菌根真菌、洋葱伯克霍尔德氏菌、穿刺巴斯德氏菌、多刺巴斯德氏菌(Pasteuria thornei)、西泽巴斯德氏菌(Pasteuria nishizawae)、分支巴斯德氏菌(Pasteuria ramosa)、美国高尔夫球协会巴斯德氏菌、侧孢短芽孢杆菌菌株G4、荧光假单胞菌以及根际细菌。
营养物的一些实例可以选自由以下组成的组：氮肥，包括但不限于尿素、硝酸铵、硫酸铵、无压氮溶液、氨水、无水氨、硫代硫酸铵、硫包膜尿素、脲甲醛、IBDU、聚合物包膜尿素、硝酸钙、脲醛以及亚甲脲；磷肥，如磷酸氢二铵、磷酸一铵、多磷酸铵、浓过磷酸钙和三重过磷酸钙；以及钾肥，如氯化钾、硫酸钾、硫酸钾镁、硝酸钾。此类组合物可以在种子包衣组合物中以游离盐或离子的形式存在。或者，营养物/肥料可以复合或螯合，以提供随时间推移的持续释放。
杀鼠剂的一些实例可以包括选自由以下组成的物质的组：2-异戊酰基茚满-1，3-二酮、4-(喹喔啉-2-基氨基)苯磺酰胺、α-氯醇、磷化铝、安妥(antu)、三氧化二砷、碳酸钡、双鼠脲(bisthiosemi)、溴鼠灵(brodifacoum)、溴敌隆(bromadiolone)、溴鼠胺(bromethalin)、氰化钙、氯醛糖、氯敌鼠(chlorophacinone)、胆钙化醇、氯杀鼠灵(coumachlor)、克鼠灵(coumafuryl)、杀鼠迷(coumatetralyl)、鼠立死(crimidine)、鼠得克(difenacoum)、噻鼠灵(difethialone)、敌鼠(diphacinone)、麦角钙化醇、氟鼠灵(flocoumafen)、氟乙酰胺、氟鼠啶(flupropadine)、氟鼠啶盐酸盐、氰化氢、碘甲烷、林丹(1indane)、磷化镁、溴甲烷、鼠特灵(norbormide)、毒鼠磷(phosacetim)、膦、磷、杀鼠酮(pindone)、亚砷酸钾、灭鼠优(pyrinuron)、海葱糖苷(scilliroside)、亚砷酸钠、氰化钠、氟乙酸钠、番木鳖碱(strychnine)、硫酸铊、华法林(warfarin)以及磷化锌。
在液体形式，例如溶液或悬浮液中，细菌种群可以混合或悬浮于水或水溶液中。合适的液体稀释剂或载剂包括水、水溶液、石油馏出物或其它液体载剂。
固体组合物可以通过将细菌种群分散在适当分开的固体载剂之中或之上而制备，所述固体载剂如泥炭、小麦、麸、蛭石、粘土、滑石、膨润土、硅藻土、漂白土(fuller′searth)、巴氏灭菌土壤等。当此类配制物用作可湿性粉剂时，可以使用生物相容的分散剂，如非离子、阴离子、两性或阳离子分散剂和乳化剂。
在配制时使用的固体载剂包括例如矿物载剂，如高岭土、叶蜡石、膨润土、蒙脱土、硅藻土、酸性白土、蛭石以及珍珠岩；和无机盐，如硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵、尿素、氯化铵以及碳酸钙。另外，可以使用有机细粉，如小麦面粉、麦麸和米糠。液体载剂包括植物油(如大豆油和棉籽油)、甘油、乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、聚丙二醇等。
细菌种群在作物上的施加
本文所描述的细菌或细菌种群的组合物可以施加到犁沟、滑石中或以种子处理剂形式施加。组合物可以散装、小型散装、袋装形式或在滑石中施加到种子包装。
种植器可以种植处理过的种子，并且根据常规方式、双行或不需要耕耘的方式生长作物。可以使用控制料斗或单个料斗分配种子。也可以使用压缩空气或手动分配种子。可以使用可变速率技术进行种子放置。另外，可以使用可变速率技术来施加本文所描述的细菌或细菌种群。在一些实例中，细菌可以施加到玉米、大豆、芥花、高粱、马铃薯、水稻、蔬菜、谷类、假谷物的种子以及油籽。谷类的实例可以包括大麦、福尼奥米(fonio)、燕麦、帕尔默草(palmer’s grass)、黑麦、珍珠粟(pearl millet)、高粱、斯佩尔特小麦(spelt)、画眉草(teff)、黑小麦以及小麦。假谷物的实例可以包括面包果(breadnut)、荞麦、香蒲、奇亚籽(chia)、亚麻、籽粒苋(grain amaranth)、汉扎(hanza)、藜麦以及芝麻。在一些实例中，种子可以是基因修饰生物体(GMO)、非GMO、有机或常规的。
可以另外使用添加剂(如微肥、PGR、除草剂、杀昆虫剂以及杀真菌剂)来处理作物。添加剂的实例包括作物保护剂，如杀昆虫剂、杀线虫剂、杀真菌剂；增效剂，如着色剂、聚合物、粒化剂、预激剂以及消毒剂；和其它试剂，如接种菌、PGR、软化剂以及微量营养物。PGR可以是影响根系生长、开花或茎伸长的天然或合成植物激素。PGR可以包括生长素、赤霉素、细胞分裂素、乙烯以及脱落酸(ABA)。
组合物可以与液体肥料组合施加在犁沟中。在一些实例中，液体肥料可以保持在罐中。NPK肥料含有钠、磷和钾的大量营养物。
组合物可以改良植物性状，如促进植物生长、维持叶片中高的叶绿素含量、增加果实或种子数目以及增加果实或种子单位重量。可以采用本公开的方法来引入或改良多种期望性状中的一种或多种。可引入或改良的性状的实例包括：根生物量、根长、高度、芽长、叶数、水分利用效率、总生物量、产量、果实大小、籽粒大小、光合作用速率、耐旱性、耐热性、耐盐性、对低氮胁迫的耐受性、氮使用效率、对线虫胁迫的抗性、对真菌病原体的抗性、对细菌病原体的抗性、对病毒病原体的抗性、代谢物水平、代谢物水平的调控、蛋白质组表达。期望的性状，包括高度、总生物量、根和/或芽生物量、种子发芽、幼苗存活、光合效率、蒸腾速率、种子/果实数目或质量、植物籽粒或果实产量、叶片叶绿素含量、光合速率、根长或其任何组合可以用于测量生长，并且与在相同条件下生长的参考农业植物(例如，无引入性状和/或改良性状的植物)的生长速率进行比较。在一些实例中，期望的性状，包括高度、总生物量、根和/或芽生物量、种子发芽、幼苗存活、光合效率、蒸腾速率、种子/果实数目或质量、植物籽粒或果实产量、叶片叶绿素含量、光合速率、根长或其任何组合可以用于测量生长，并且与在相似条件下生长的参考农业植物(例如，无引入性状和/或改良性状的植物)的生长速率进行比较。
宿主植物的农艺性状可以包括但不限于以下：与在没有所述种子处理配制物的情况下的由种子生长的等值线植物相比，改变的油含量、改变的蛋白质含量、改变的种子碳水化合物组成、改变的种子油组成和改变的种子蛋白质组成、耐化学性、耐寒性、延迟的衰老、抗病性、耐旱性、穗重、生长改善、健康增强4、耐热性、除草剂耐受性、草食动物抗性、改善的固氮、提高的氮利用率、改善的根系架构、提高的水分利用效率、增加的生物量、增加的根长、增加的种子重量、增加的芽长、增加的产量、在水受限条件下增加的产量、仁粒质量、仁粒含水量、金属耐受性、穗数、每只穗的仁粒数、荚数、营养增强、病原体抗性、害虫抗性、光合能力提高、耐盐性、滞绿、活力提高、增加的成熟种子的干重、增加的成熟种子的鲜重、增加的每株植物成熟种子的数目、提高的叶绿素含量、增加的每株植物的荚数、增加的每株植物的荚长、减少的每株植物枯萎叶片的数目、减少的每株植物严重枯萎叶片的数目、和增加的每株植物非枯萎叶片的数目、代谢物水平的可检测调控、转录物水平的可检测调控以及蛋白质组中的可检测调控。
在一些情况下，用与被接种植物的植物成分相同的植物物种分离出的细菌或细菌种群来接种植物。举例来说，通常在一种玉蜀黍(Zea mays)(玉米(com))中发现的细菌或细菌种群与在自然状态下缺乏所述细菌和细菌种群的另一种玉米的植物的植物成分缔合。在一个实施例中，细菌和细菌种群来源于如被接种植物的植物成分的植物的相关物种的植物。举例来说，将通常在二倍体多年生大刍草(Zea diploperennis)Iltis等人(二倍体多年生类玉米(diploperennial teosinte))中发现的细菌和细菌种群施加到玉蜀黍(玉米)，或反之亦然。在一些情况下，用与被接种植物的植物元素异源的细菌和细菌种群来接种植物。在一个实施例中，细菌和细菌种群来源于另一物种的植物。举例来说，将通常在双子叶植物中发现的细菌和细菌种群施加到单子叶植物(例如，用大豆源性细菌和细菌种群接种玉米)，或反之亦然。在其它情况下，待接种到植物上的细菌和细菌种群来源于待接种的植物的相关物种。在一实施例中，细菌和细菌种群来源于相关分类单元，例如来源于相关物种。另一物种的植物可以是农业植物。在另一实施例中，细菌和细菌种群是接种到任何宿主植物成分中的经设计组合物的一部分。
在一些实例中，细菌或细菌种群是外源的，其中细菌和细菌种群是从与被接种植物不同的植物中分离的。举例来说，在一个实施例中，细菌或细菌种群可以从与待接种植物相同的物种的不同植物中分离。在一些情况下，细菌或细菌种群可以从与接种植物相关的物种中分离。
在一些实例中，本文所描述的细菌和细菌种群能够从一种组织类型移动到另一组织类型。举例来说，本发明在种子外部上包被后对植物成熟组织内细菌和细菌种群的检测和分离证明了细菌和细菌种群从种子外部移入成熟化植物的营养组织的能力。因此，在一个实施例中，细菌种群和细菌种群能够从种子外部移动到植物的营养组织中。在一个实施例中，包被到植物种子上的细菌和细菌种群能够在种子发芽成营养状态时定位于植物的不同组织。举例来说，细菌和细菌种群可以定位于植物中的组织中的任一种，包括：根、不定根、种子5根、根毛、芽、叶、花、苞、穗、分生组织、花粉、雌蕊、子房、雄蕊、果实、匍匐茎、根茎、根瘤、块茎、毛状体、保卫细胞、泌水孔、瓣片、萼片、颖片、叶轴、维管形成层、韧皮部以及木质部。在一实施例中，细菌和细菌种群能够定位于植物的根和/或根毛。在另一实施例中，细菌和细菌种群能够定位于光合组织，例如植物的叶和芽。在其它情况下，细菌和细菌种群定位于植物的维管组织中，例如在木质部和韧皮部中。在又一实施例中，细菌和细菌种群能够定位于植物的生殖组织(花、花粉、雌蕊、子房、雄蕊、果实)。在另一实施例中，细菌和细菌种群能够定位于植物的根、芽、叶以及生殖组织。在又一实施例中，细菌和细菌种群定殖植物的果实或种子组织。在又一实施例中，细菌和细菌种群能够定殖植物，使得其存在于植物的表面中(即，其存在可检测地呈现于植物的外部或植物的表层)。在其它实施例中，细菌和细菌种群能够定位于植物的大体上所有或所有组织。在某些实施例中，细菌和细菌种群不定位于植物的根。在其它情况下，细菌和细菌种群并不定位于植物的光合组织。
还可以通过测量作物的相对成熟度或作物热单位(CHU)来评定组合物的有效性。举例来说，可以将细菌种群施加到玉米，并且可以根据玉米粒的相对成熟度或玉米粒达到最大重量的时间来评定玉米生长。作物热单位(CHU)也可以用于预测玉米作物的成熟。CHU通过测量作物生长的每日最高温度来确定热量积累量。
在实例中，细菌可定位于植物中的任何组织，包括：根、不定根、种子根、根毛、芽、叶、花、苞穗、分生组织、花粉、雌蕊、子房、雄蕊、果实、匍匐茎、根茎、根瘤、块茎、毛状体、保卫细胞、泌水孔、瓣片、萼片、颖片、叶轴、维管形成层、韧皮部以及木质部。在另一实施例中，细菌或细菌种群能够定位于光合组织，例如植物的叶和芽。在其它情况下，细菌和细菌种群定位于植物的维管组织中，例如在木质部和韧皮部中。在另一实施例中，细菌或细菌种群能够定位于植物的生殖组织(花、花粉、雌蕊、子房、雄蕊或果实)。在另一实施例中，细菌和细菌种群能够定位于植物的根、芽、叶以及生殖组织。在另一实施例中，细菌或细菌种群定殖植物的果实或种子组织。在又一实施例中，细菌或细菌种群能够定殖植物，使得其存在于植物表面中。在另一实施例中，细菌或细菌种群能够定位于植物的大体上所有或所有组织。在某些实施例中，细菌或细菌种群不定位于植物的根。在其它情况下，细菌和细菌种群并不定位于植物的光合组织。
可以通过测量作物生长的各种特征来评定施加到作物上的细菌组合物的有效性，这些特征包括但不限于种植率、播种活力、根强度、耐旱性、株高、干燥以及试验重量。
植物物种
本文所描述的方法和细菌适用于多种植物中的任一种，如大麦属(Hordeum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属以及小麦属(Triticeae)的植物。合适植物的其它非限制性实例包括苔藓、地衣和藻类。在一些情况下，植物具有经济、社会和/或环境价值，如粮食作物、纤维作物、油料作物、林业或纸浆和造纸工业中的植物、用于生物燃料生产的原料和/或观赏植物。在一些实例中，植物可以用于生产具有经济价值的产品，如谷物、面粉、淀粉、糖浆、粗粉、油、膜、包装、营养食品产品、纸浆、动物饲料、鱼饲料、用于工业化学品的散装材料、谷类产品、经过加工的人类食品、糖、酒精和/或蛋白质。作物植物的非限制性实例包括玉米、水稻、小麦、大麦、高粱、小米、燕麦、黑麦黑小麦、荞麦、甜玉米、甘蔗、洋葱、番茄、草莓以及芦笋。
在一些实例中，可以使用本文所公开的方法和组合物获得或改良的植物可以包括对于农业、园艺、用于生产生物燃料分子和其它化学品的生物量和/或林业重要或受关注的植物。这些植物的一些实例可以包括菠萝、香蕉、椰子、百合、家山黧豆(grasspea)、苜蓿、粘果酸浆(tomatillo)、甜瓜、鹰嘴豆、菊苣、三叶草、羽衣甘蓝、小扁豆、大豆、烟草、马铃薯、甘薯、萝卜、甘蓝菜、油菜、苹果树、葡萄、棉、葵花、拟南芥、芥花、柑橘属(包括橙、柑橘(mandarin)、金橘(kumquat)、柠檬、酸橙、葡萄柚、红橘(tangerine)、橘柚(tangelo)、香橼(citron)以及柚子(pomelo))、胡椒、豆类、生菜、柳枝稷(Panicum virgatum)(风倾草(switch))、高粱(Sorghum bicolor)(高粱、苏丹草(sudan))、奇岗(Miscanthusgiganteus)(芒草)、蔗属(Saccharum sp.)(能源甘蔗(energycane))、欧洲大叶杨(Populusbalsamifera)(白杨)、玉蜀黍(玉米)、大豆(Glycine max)(大豆(soybean))、甘蓝型油菜(Brassica napus)(芥花)、普通小麦(Triticum aestivum)(小麦)、陆地棉(Gossypiumhirsutum)(棉)、水稻(Oryza sativa)(水稻(rice))、向日葵(Helianthus annuus)(葵花)、紫花苜蓿(Medicago sativa)(苜蓿)、甜菜(Beta vulgaris)(甜菜(sugarbeet))、御谷(Pennisetum glaucum)(珍珠粟)、黍属(Panicum spp.)、高粱属、芒属、蔗属、蔗茅属(Erianthus spp.)、白杨属(Populus spp.)、黑麦(Secale cereale)(黑麦(rye))、柳属(Salix spp.)(柳树)、桉属(Eucalyptus spp.)(桉树)、小黑麦属(Triticosecale spp.)(小麦属-25小麦×黑麦)、竹子、红花(Carthamus tinctorius)(红花(safflower))、桐油树(Jatropha curcas)(麻风树属(Jatropha))、蓖麻(Ricinus communis)(蓖麻(castor))、油棕(Elaeis guineensis)(油棕(oil palm))、海枣(Phoenix dactylifera)(椰枣(datepalm))、肯氏假槟榔(Archontophoenix cunninghamiana)(帝王假槟榔(king palm))、金山葵(Syagrus romanzoffiana)(皇后葵(queen palm))、亚麻(Linum usitatissimum)(亚麻(Linum usitatissimum))、芥菜(Brassica juncea)、木薯(Manihot esculenta)(木薯(cassaya))、番茄(Lycopersicon esculentum)(番茄(tomato))、莴苣(Lactuca saliva)(生菜)、大蕉(Musa paradisiaca)(香蕉)、马铃薯(Solanum tuberosum)(马铃薯(potato))、甘蓝(Brassica oleracea)(椰菜、花椰菜、球芽甘蓝)、山茶(Camelliasinensis)(茶)、草莓(Fragaria ananassa)(草莓(strawberry))、可可树(Theobromacacao)(可可(cocoa))、小粒咖啡(Coffea arabica)(咖啡)、酿酒葡萄(Vitis vinifera)(葡萄)、菠萝(Ananas comosus)(菠萝(pineapple))、辣椒(Capsicum annum)(辣椒和甜椒)、洋葱(Allium cepa)(洋葱(onion))、厚皮甜瓜(Cucumis melo)(甜瓜)、黄瓜(Cucumissativus)(黄瓜(cucumber))、笋瓜(Cucurbita maxima)(南瓜属(squash))、南瓜(Cucurbita moschata)(南瓜属)、菠菜(Spinacea oleracea)(菠菜(spinach))、咖啡黄葵(Abelmoschus esculentus)(秋葵)、甜菜(Abelmoschus esculentus)、茄(Solanummelongena)(茄子)、罂粟(Papaver somniferum)(罂粟(opium poppy))、东方罂粟(Papaverorientale)、欧洲红豆杉(Taxus baccata)、短叶红豆杉(Taxus brevifolia)、黄花蒿(Artemisia annua)、大麻(Cannabis saliva)、喜树(Camptotheca acuminate)、长春花(Catharanthus roseus)、长春花(Vinca rosea)、正鸡纳树(Cinchona officinalis)、秋水仙(Coichicum autumnale)、加州藜芦(Veratrum californica)、洋地黄(Digitalislanata)、毛地黄(Digitalis purpurea)、薯蓣属(Dioscorea)5物种、穿心莲(Andrographispaniculata)、颠茄(Atropa belladonna)、曼陀罗(Datura stomonium)、小檗属(Berberisspp.)、三尖杉属(Cephalotaxus spp.)、麻黄(Ephedra sinica)、麻黄属(Ephedra spp.)、古柯(Erythroxylum coca)、雪花莲(Galanthus womorii)、赛莨菪属(Scopolia spp.)、千层塔(Lycopodium serratum)(蛇足石杉(Huperzia serrata))、石松属(Lycopodiumspp.)、蛇根木(Rauwolfia serpentina)、萝芙木属(Rauwolfia spp.)、血根草(Sanguinaria canadensis)、天仙子属(Hyoscyamus spp.)、金盏花(Calendulaofficinalis)、短舌匹菊(Chrysanthemum parthenium)、毛喉鞘蕊花(Coleusforskohlii)、小白菊(Tanacetum parthenium)、灰白银胶菊(Parthenium argentatum)(银胶菊(guayule))、橡胶树属(Hevea spp.)(橡胶)、留兰香(Mentha spicata)(薄荷)、辣薄荷(Mentha piperita)(薄荷)、红木(Bixa orellana)、六出花属(Alstroemeria spp.)、蔷薇属(Rosa spp.)(玫瑰)、香石竹(Dianthus caryophyllus)(康乃馨)、矮牵牛属(Petuniaspp.)(矮牵牛)、一品红(Poinsettia pulcherrima)(一品红(poinsettia))、烟草(Nicotiana tabacum)(烟草(tobacco))、白羽扇豆(Lupinus albus)(羽扇豆)、海燕麦(Uniolapaniculata)(燕麦)、大麦(Hordeumvulgare)(大麦(barley))以及黑麦草属(Lolium spp.)(黑麦)。
在一些实例中，可以使用单子叶植物。单子叶植物属于以下的目：泽泻目(Alismatales)、天南星目(Arales)、棕榈目(Arecales)、凤梨目(Bromeliales)、鸭跖草目(Commelinales)、环花目(Cyclanthales)、莎草目(Cyperales)、谷精草目(Eriocaulales)、水鳖目(Hydrocharitales)、灯芯草目(Juncales)、百合目(Lilliales)、茨藻目(Naiadales)、兰目(Orchidales)、露兜树目(Pandanales)、禾本目(Poales)、帚灯草目(Restionales)、霉草目(Triuridales)、香蒲目(Typhales)以及姜目(Zingiberales)。属于裸子植物类的植物是苏铁目(Cycadales)、银杏目(Ginkgoales)、买麻藤目(Gnetales)以及松目(Pinales)。在一些实例中，单子叶植物可以选自由以下组成的组：玉米、水稻、小麦、大麦以及甘蔗。
在一些实例中，可以使用双子叶植物，包括属于以下的目的植物：马兜铃目(Aristochiales)、菊目(Asterales)、肉穗果目(Batales)、桔梗目(Campanulales)、白花菜目(Capparales)、石竹目(Caryophyllales)、木麻黄目(Casuarinales)、卫矛目(Celastrales)、山茱萸目(Cornales)、岩梅目(Diapensales)、五桠果目(Dilleniales)、川续断目(Dipsacales)、柿树目(Ebenales)、杜鹃花目(Ericales)、杜仲目(Eucomiales)、大戟目(Euphorbiales)、豆目(Fabales)、壳斗目(Fagales)、龙胆目(Gentianales)、牻牛儿苗目(Geraniales)、小二仙草目(Haloragales)、金缕梅目(Hamamelidales)、Middles、胡桃目(Juglandales)、唇形目(Lamiales)、樟目(Laurales)、玉蕊目(Lecythidales)、莱脱纳目(Leitneriales)、木兰目(Magniolales)、锦葵目(Malvales)、杨梅目(Myricales)、桃金娘目(Myrtales)、睡莲目(Nymphaeales)、罂粟目(Papeverales)、胡椒目(Piperales)、车前目(Plantaginales)、蓝雪目(Plumb aginales)、川苔草目(Podostemales)、花葱目(Polemoniales)、远志目(Polygalales)、蓼目(Polygonales)、报春花目(Primulales)、山龙眼目(Proteales)、大花草目(Rafflesiales)、毛茛目(Ranunculales)、鼠李目(Rhamnales)、蔷薇目(Rosales)、茜草目(Rubiales)、杨柳(Salicales)、檀香目(Santales)、无患子目(Sapindales)、瓶子草科(Sarraceniaceae)、玄参目(Scrophulariales)、山茶目(Theales)、昆栏树目(Trochodendrales)、伞形目(Umbellales)、荨麻目(Urticales)以及堇菜目(Violates)。在一些实例中，双子叶植物可以选自由以下组成的组：棉、大豆、胡椒以及番茄。
在一些情况下，待改良的植物不容易适合于实验条件。举例来说，作物植物可能花费过长时间才能生长到足以在多个迭代中连续地实际评定改良的性状。因此，最初从中分离出细菌的第一植物和/或向其施加了基因操纵细菌的多个植物可以是模型植物，如更适合于在所需条件下进行评估的植物。模型植物的非限制性实例包括狗尾草属、短柄草属(Brachypodium)和拟南芥属(Arabidopsis)。然后可以将根据本公开的方法使用模型植物分离的细菌的能力施加到另一类型的植物(例如作物植物)，以确认改良性状的赋予。
可以通过本文所公开的方法改良的性状包括植物的任何可观察到的特征，包括例如生长速率、高度、重量、颜色、味道、气味、植物的一种或多种化合物(包括例如代谢物、蛋白质、药物、碳水化合物、油以及任何其它化合物)产生的变化。还设想了基于基因型信息选择植物(例如，包括响应于细菌的植物基因表达模式，或鉴别遗传标记物(如与固氮增加相关的标记物)的存在)。还可以基于与某一特征或性状(如期望的特征或性状)的存在相反，不存在、遏止或抑制某一特征或性状(如不期望的特征或性状)来选择植物。
实例
本文所提供的实例描述了细菌分离、细菌和植物分析以及植物性状改良的方法。实例仅出于说明性目的，并且不被理解为以任何方式限制。
实例1：从植物组织中分离微生物
表土是从加利福尼亚(California)中部的各种农业区域获得的。收集了二十种具有不同质地特征的土壤，包括重粘土、泥炭质粘壤土、粉质粘土以及砂质壤土。如表1中所示，将各种非甜质玉米(field corn)、甜玉米、传统玉米以及番茄的种子种植到每种土壤中。
表1：种植到具有不同特征的土壤中的作物类型和品种
植物生长2-4周后连根拔起，并且用去离子水去除根部表面过量的土壤。去除土壤后，将植物用漂白剂表面灭菌，并且在无菌水中剧烈冲洗。从植物上切下清洁的1cm根段，并且将其置于含有3mm钢珠的磷酸盐缓冲生理盐水溶液中。通过用凯杰(Qiagen)TissueLyserII剧烈振摇溶液来生成浆液。
将根和生理盐水浆液稀释并且接种到各种类型的生长培养基上，以分离根际微生物、内生微生物、附生微生物和其它与植物相关的微生物。使用R2A和Nfb琼脂培养基获得单一菌落，并且使用半固态Nfb培养基斜面获得固氮细菌种群。在半固态Nfb培养基斜面中培育2-4周后，收集微生物种群并且划线，以在R2A琼脂上获得单一菌落，如图1A-B中所示。将单一菌落再悬浮于R2A和甘油的混合物中，经历PCR分析，并且在-80℃下冷冻，以供后续分析。获得了大致1,000个单一菌落并且将其命名为“分离的微生物”。
然后对分离株进行菌落PCR筛选以检测nifH基因的存在，以便鉴别固氮生物。使用已显示在筛选中检测超过90％的固氮生物的先前描述的引物组Ueda 19F/388R来探测每个分离株中nif簇的存在(Ueda等人1995；《细菌学杂志(J.Bacteriol.)》177：1414-1417)。如图2中所示，挑选出纯化分离株的单一菌落，再悬浮于PBS中，并且用作菌落PCR的模板。对产生阳性PCR带的分离株的菌落重新划线，并且重复两次PCR和重新划线过程，以防止固氮生物的假阳性鉴别。然后将纯化的分离株命名为“候选微生物”。
实例2：分离的微生物的表征
测序、分析和系统发育鉴别
用515f-806r引物组对16S rDNA进行测序被用来为分离的微生物和候选微生物生成初步的系统进化标识(参见例如Vernon等人；《BMC微生物学(BMC Microbiol.)》2002年12月23日；2：39.)。微生物包括不同的属，包括：肠杆菌属、伯克霍尔德氏菌属、克雷伯氏菌属、短根瘤菌属、拉恩氏菌属、黄单胞菌属、拉乌尔菌属、泛菌属、假单胞菌属、短波单胞菌属、土壤杆菌属以及类芽孢杆菌属，如表2中所示。
表2：如通过深16S rDNA测序确定的从番茄植物分离的微生物的多样性。
随后，使用启迪公司(Illumina)Miseq平台对39种候选微生物的基因组进行测序。使用QIAmp DNA微型试剂盒(凯杰)从纯培养物中提取基因组DNA，并且通过第三方供应商(SeqMatic，哈沃德(Hayward))准备用于测序的总DNA库。然后通过A5管线进行基因组组装(Tritt等人2012；公共科学图书馆·综合(PLoS One)7(9)：e42304)。鉴别并且标注基因，并且指出了与固氮调控和表达相关的基因作为诱变的靶标。
候选微生物的转录组谱分析
进行了菌株CI010的转录组谱分析，以鉴别在环境氮存在下具有活性的启动子。CI010菌株在补充有10mM谷氨酰胺的确定的无氮培养基中培养。从这些培养物中提取总RNA(QIAGEN RNeasy试剂盒)，并且将其通过启迪公司HiSeq(SeqMatic，加利福尼亚州弗里蒙特(Fremont CA))进行RNAseq测序。使用Geneious将测序读段映射到CI010基因组数据，并且鉴别在近端转录启动子控制下的高度表达基因。表3A-C列出了如通过总RNA的RNASeq测序测量的基因和其相对表达水平。记录近端启动子的序列以用于诱变nif路径、氮利用相关路径或具有所需表达水平的其它基因。
遗传易处理性评定
基于可转化性和遗传易处理性对候选微生物进行表征。第一，通过在一小组相关培养基上的生长以及无氮和富氮培养基中的生长曲线确定最佳碳源利用。第二，通过点板接种和在液体培养物中生长来确定每种菌株的天然抗生素抗性，所述液体培养物含有一组用作诱变选择性标记物的抗生素。第三，通过对质粒集合进行电穿孔测试每种菌株的可转化性。质粒集合包含七个复制起点，即p15a、pSC101、CloDF、colA、RK2、pBBR1以及pROl600，和四种抗生素抗性标记物，即CmR、KmR、SpecR以及TetR的组合性扩展。这种对起源和抗性标记物相容性的系统性评估用于鉴别候选微生物中基于质粒的诱变载体。
实例3：候选微生物的诱变
Lambda-Red介导的敲除
使用质粒pKD46或含有卡那霉素(kanamycin)抗性标记物的衍生物生成候选微生物的几种突变体(Datsenko等人2000；《美国国家科学院院刊(PNAS)》97(12)：6640-6645)。敲除盒设计有靶基因侧翼的250bp同源性物，并且通过重叠延伸PCR生成。候选微生物用pKD46转化，在阿拉伯糖存在下培养以诱导Lambda-Red机制性表达，准备进行电穿孔，并且用敲除盒转化以产生候选突变菌株。如表4中所示，使用了四种候选微生物和一种实验室菌株产酸克雷伯氏菌M5A1来生成十三种固氮调控基因nifL、glnB和amtB的候选突变体。
表4：通过Lambda-red诱变产生的单一敲除突变体列表
伴随Cas9选择的寡核苷酸定向诱变
寡核苷酸定向诱变用于靶向大肠杆菌(E.coli)DH10B中rpoB基因的基因组变化，并且使用CRISPR-Cas系统选择突变体。诱变寡核苷酸(ss1283：“G*T*T*G*ATCAGACCGATGTTCGGACCTTCcaagGTTTCGATCGGACATACGCGACCGTAGTGGGTCGGGTGTACGTCTCGAACTTCAAAGCC”，其中*表示硫代磷酸酯键)被设计成通过对rpoB的4-bp突变赋予利福平(rifampicin)抗性。含有编码Cas9的质粒的细胞诱导表达Cas9，准备电穿孔，并且然后用诱变寡核苷酸和编码靶向WT rpoB序列的Cas9切割的引导RNA(gRNA)的组成性表达的质粒两者电穿孔。将电穿孔的细胞在非选择性培养基中回收过夜，以使所得突变染色体充分分离。在选择了编码gRNA的质粒后，显示筛选的十个菌落中的两个含有所需突变，而其余的显示是通过gRNA质粒中原间隔子突变或Cas9质粒缺失生成的逃逸突变体。
伴随Cas9选择的Lambda-Red诱变
通过lambda-red诱变伴随通过CRISPR-Cas进行选择生成候选微生物CI006和CI010的突变体。敲除盒含有通过转录谱分析(如实例2中所描述和表3中所描绘)鉴别的内源性启动子和在缺失靶标侧翼的约250bp同源性区。在阿拉伯糖诱导型启动子的控制下，用编码Lambda-red重组系统(exo、beta、gam基因)的质粒转化CI006和CI010，并且在IPTG诱导型启动子的控制下，转化Cas9。在所得转化体中诱导Red重组和Cas9系统，并且准备菌株用于电穿孔。随后将敲除盒和质粒编码的选择gRNA转化到感受态细胞中。在对Cas9质粒和gRNA质粒均具有选择性的抗生素上接种后，筛选的10个菌落中的7个显示了预期的敲除突变，如图3中所示。
实例4：候选分子的体外表型分型
评定了外源氮对各种突变体中固氮酶生物合成和活性的影响。乙炔还原分析(ARA)(Temme等人2012；109(18)：7085-7090)用于测量纯培养条件下的固氮酶活性。使菌株在气密的试管中生长，并且用安捷伦(Agilent)6890气相色谱仪对乙炔向乙烯的还原进行定量。图4A-B和图10A-C中显示了在补充有0到10mM谷氨酰胺的固氮培养基中生长的候选微生物和对应候选突变体的ARA活性。
在厌氧培养条件下，对一系列谷氨酰胺和氨浓度进行测试以将对固氮活性的影响定量。在野生型细胞中，活性随着谷氨酰胺浓度提高而迅速降低。然而，在一系列最初的敲除突变中，验证了一类突变使得能够在原本将关闭野生型中的活性的谷氨酰胺浓度下表达固氮基因。如图4C中所见，这种概况是在四种不同的固氮生物物种中生成的。另外，通过使用已鉴别的遗传部分对调控网络重新布线，可预测地调节固氮活性水平。这见于图4B中，其示出了菌株CM023、CM021、CM015以及CI006。菌株CM023是低进化菌株；CM021菌株是高进化菌株；CM015菌株是中进化菌株；CI006菌株是野生型(菌株2)。使用基于酶的分析(MEGAZYME)测试排泄到培养上清液中的氨。分析测量在340nm吸光度中消耗的NADPH量。分析在无氮、厌氧环境下生长的起始密度为1E9 CFU/ml的细菌培养物上进行。如图4D中所见，在一组六种进化菌株中，一种菌株在48小时时段过程中排泄了高达100μM的氨。此外，如图11中所见，双突变体展现比其所源自的单突变体更高的氨排泄。这证明了微生物产生超出其生理需求的氨的能力。
纯培养的转录谱分析
使用Nanostring Elements平台测量CI006的转录活性。使细胞在无氮培养基中生长并且在4小时培育后，收集10E8个细胞。使用凯杰RNeasy试剂盒提取总RNA。纯化的RNA提交给位于加利福尼亚州帕洛阿尔托(Palo Alto，CA)的Core Diagnostics，以进行探针杂交和数字分析仪分析，如图5中所示。
实例5：候选微生物的植物中表型分型
候选微生物对植物的定殖
通过短期植物生长实验来定量候选微生物对所需宿主植物的定殖。用表达来自质粒或来自Tn5整合的RFP表达盒的RFP的菌株接种玉米。使植物在无菌砂和非无菌泥炭培养基中生长，并且通过在发芽后三天直接在新出现的植物胚芽鞘上移吸1mL细胞培养物来进行接种。通过用含有适当抗生素的溶液浇灌植物来维持质粒。三周后，收集植物根，在无菌水中冲洗三次以去除可见的土壤，并且分割成两个样品。通过荧光显微法分析一个根样品以鉴别候选微生物的定位模式。如图6中所示，对最细的完整植物根的10mm长度进行了显微法检查。
开发了评定定殖的第二定量方法。对来自接种有内生菌的植物根部的全DNA制剂进行了定量PCR分析。使玉米种子(Dekalb DKC-66-40)在2.5英寸乘2.5英寸乘10英寸的盆中在先前高压灭菌的砂中发芽。种植后一天，将1ml内生菌过夜培养物(SOB培养基)在种子所位于的准确位置处浸透。1mL的这种过夜培养物大致等效于10^9cfu，在彼此3倍内变化，视所使用的菌株而定。每株幼苗每周用补充有2.5mM或0.25mM硝酸铵的50mL修改的霍格兰氏溶液(Hoagland’s solution)施肥3次。种植后四周时，收集根样品用于DNA提取。使用加压喷水将土壤残渣冲洗掉。然后使用凯杰Tissuelyzer将这些组织样品均质化，并且然后根据推荐方案使用QIAmp DNA微型试剂盒(凯杰)提取DNA。使用Stratagene Mx3005P RT-PCR，使用被设计(使用NCBI的Primer BLAST)成对内生菌基因组中的每一个的基因座具有特异性的引物对这些DNA提取物进行qPCR分析。定量内生菌的基因组拷贝的存在。为了进一步确认内生菌的身份，对PCR扩增产物进行测序并且确认其具有正确序列。表5中呈现了来自候选微生物的菌株CI006和CI008的定殖概况的概述。菌株CI008中展现高达10^7×菌落形成单位/克根鲜重的定殖率。
菌株 定殖率(菌落形成单位/克鲜重)
CI006 1.45×10^5
CI008 1.24×10^7
表5：如通过qPCR测量的玉米定殖
植物中RNA谱分析
通过测量nif基因的转录来估算植物中nif路径组分的生物合成。从CI006接种植物的根植物组织中获得总RNA(种植方法如先前所描述)。根据推荐的方案(凯杰)，使用RNEasy微型试剂盒进行RNA提取。然后使用Nanostring Elements试剂盒(NanoStringTechnologies，Inc.)，使用对菌株CI006基因组中nif基因具有特异性的探针，对来自这些植物组织的总RNA进行分析。表6中概述了植物中nif基因表达的数据。在由CM013菌株接种的植物中检测到nifH基因的表达，而在CI006接种的植物中nifH表达不可检测。菌株CM013是菌株CI006的衍生物，其中nifL基因已被敲除。
在施肥条件下，在植物中测量了CM011的高度表达基因，基因按每百万读段千碱基转录物数(transcripts per kilobase million；TPM)排序。控制这些高度表达基因中的一些的表达的启动子用作模板，用于同源重组到靶向的氮固定和同化基因座中。提取来自温室生长的CM011接种植物的RNA样品，使用Ribo-Zero试剂盒去除rRNA，使用启迪公司的Truseq平台进行测序，并且映射回到CM011的基因组。表7中列出了来自CM011的高度表达基因。
菌株 相对转录物表达
CI006 9.4
CM013 103.25
表6：nifH在植物中的表达
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表7：来自CM011的高度表达基因
15N分析
证明固定的主要方法使用氮同位素15N，所述同位素以相对于14N固定的比率见于大气中。通过用富集水平的15N的氮补充肥料或大气，可以从补充有15N2气体的大气中升高的固定的15N的量直接观察到固定(Yoshida 1980)，或相反，通过植物组织中富集肥料由大气N2气体稀释观察到固定(Iniguez 2004)。稀释法允许在植物生长过程中观察累积的固定氮，而15N2气体法限于测量植物可以在封闭气氛中生长的短时间间隔内发生的固定(速率测量)。因此，气体法具有优越的特异性(因为高于大气比率的植物中任何升高的15N2水平都可以明确地归因于固定)，但无法显示累积活动。
相对于野生型和未接种的玉米，已经进行了两种类型的分析以测量改良菌株的固定活性，并且对于几种改良菌株在植物中观察到固定率升高(图12、图14A和图14B)。这些分析起到证明在体外观察到的菌株的活性转化为体内结果的作用。此外，这些分析允许测量肥料对菌株活性的影响，表明在农业环境中具有合适的功能。当用野生型和改良菌株接种狗尾草属植物时，观察到相似的结果(图13)。图14A-14C中所示的植物中固定活性进一步由转录组数据支持。进化型菌株展现相对于野生型对应物提高的nifH转录物水平。此外，逐植物来看，植物中微生物源性氮水平也与定殖水平相关。这些结果(图12、图13、图14A-14C、图15A以及图15B)支持以下假设：微生物通过改良nif基因簇的调控，是引起见于植物组织中大气源性氮增加的可能原因。除了直接测量固定外，还测量了在氮胁迫的植物生物量分析中用改良菌株接种植物的影响。尽管植物生物量可能与许多可能的微生物与植物的相互作用相关，但人们将预期当氮受限时，固定氮的添加会影响植物的表型。接种的植物在完全不存在氮的条件下生长，并且观察到相对于未处理的对照，接种植物中叶面积、芽鲜重和干重以及根鲜重和干重显著增加(图14C)。尽管这些差异不能排他地归因于固氮，但其支持以下结论：改良菌株正在向植物积极提供氮。如上文所描述生长并且接种玉米和狗尾草属植物。通过浇水将包含1.2％15N的肥料有规律地供应给植物。通过测量植物组织中的15N水平来定量通过微生物进行的固氮。种植后4周收集第四叶片组织并且将其干燥。使用珠粒将干燥的叶片样品均质化(凯杰Tissuelyzer)，并且然后等分到用于IRMS的锡胶囊中(位于马萨诸塞州伍兹霍尔生态系统中心(The Ecosystems Center，Woods Hole，MA)的MBL稳定同位素实验室(MBL Stable Isotope Laboratory))。计算了源自大气的氮(NDFA)，并且图7中显示了由CI050和CM002产生的氮。
植物激素产生分析
先前使用矮番茄(番茄(Solanum lycopersicum))栽培品种‘Micro-Tom’来通过体外分析研究吲哚-3-乙酸对果实成熟的影响(Cohen 1996；《美国园艺科学会杂志(JAm SocHortic Sci)》121：520-524)。为了评估候选微生物的植物激素产生和分泌，开发了使用未成熟Micro-Tom果实的基于培养板的筛选分析。通过用琼脂培养基填充孔，使其固化，并且将10uL过夜微生物培养物点样到琼脂表面上来制备十二孔组织培养测试培养板，如图8中所示。琼脂中含有增加量的赤霉酸(GA)，但不含细菌培养物的孔用作阳性对照和标准品。在开花后一天切除生长中的Micro-Tom植物的花，将其茎干先插入细菌点培养点处的琼脂中。监测这些花2-3周，之后收获果实并且称重。如图9中所示，几次重复实验中植物果实质量的增加表明接种菌微生物产生植物激素。
实例6：周期性宿主-微生物进化
用CM013接种玉米植株，并且使其生长4周到大致V5生长期。通过15N分析证明来自微生物源的氮积累改良的植物被连根拔起，并且使用加压水洗涤根部以去除非根际土壤。切下0.25g的根段，并且在PBS溶液中冲洗，以去除细微土壤粒子和不粘附的微生物。在凯杰TissueLyser II中使用3mm钢珠均质化组织样品。将匀浆稀释并且接种在SOB琼脂培养基上。使单一菌落再悬浮于液体培养基中，并且经历16s rDNA PCR分析和对于接种菌株唯一的突变。可以迭代地重复进行微生物分、诱变、接种以及重新分离的过程，以改良微生物性状、植物性状和微生物的定殖能力。
实例7：跨地理的相容性
改良的微生物在接种植物上定殖的能力对于植物在田间条件下的成功至关重要。尽管所描述的分离方法被设计成从可能与作物植物(如玉米)有密切关系的土壤微生物中进行选择，但许多菌株可能不在一系列植物基因型、环境、土壤类型或接种条件下有效地定殖。由于定殖是一个复杂的过程，需要微生物菌株与宿主植物之间进行一系列相互作用，因此筛选定殖能力已成为选择用于进一步开发的优先菌株的中心方法。评定定殖的早期努力使用了菌株的荧光标记，其有效但耗时并且不能在每菌株的基础上进行扩展。由于定殖活性不适合直接的提高，因此有必要从作为天然定殖体的菌株中选择潜在产品候选物。
设计了一种分析，以使用qPCR和被设计成在群落样品中具有菌株特异性的引物来测试任何给定宿主植物中野生型菌株的稳健定殖。这一分析旨在快速测量玉米组织样品中微生物的定殖率。使用荧光显微法和基于培养板的技术，使用被评定为可能定殖体的菌株进行的初始测试表明，qPCR方法既定量又可扩展。
一种典型的分析如下进行：在温室中的泥炭盆栽混合物中生长植物，主要是玉米和小麦品种，每菌株重复六次。种植后四或五天，将1mL稀释到OD590为0.6-1.0(大致5E+08CFU/mL)的细菌的早期固定相培养物浸液移吸新出现的胚芽鞘上。仅用自来水浇灌植物，并且使其生长四周，随后取样，这时，将植物连根拔起，彻底洗涤根部以去除大部分泥炭残留物。切下清洁的根样品并且均质化以产生植物细胞碎片和相关细菌细胞的浆液。我们开发了一种高通量DNA提取方案，其可有效产生植物和细菌DNA的混合物，以用作qPCR的模板。基于细菌细胞掺入实验，这种DNA提取过程提供相对于根的鲜重的定量细菌DNA样品。使用用Primer BLAST(Ye 2012)设计的菌株特异性引物评定每种菌株，并且将其与来自未接种植物的背景扩增进行比较。由于一些引物在未接种的植物中展现脱靶扩增，因此定殖可以通过存在扩增或与背景水平相比正确产物的升高扩增来确定。
这一分析用于测量微生物产品跨不同土壤地理的相容性。田间土壤质量和田间条件可能会对微生物产品的效果产生巨大影响。土壤的pH值、保水能力和竞争性微生物只是土壤中可能影响接种物存活和定殖能力的因素的几个实例。使用从加利福尼亚州的农田取样的三种不同土壤类型作为植物生长培养基进行了定殖分析(图16A)。使用中等接种密度来近似实际的农业条件。在3周内，菌株5以1E+06到1E+07菌落形成单位/克鲜重定殖了所有植物。植物生长7周后，菌株1的进化形式在所有土壤类型中均展现高定殖率(1E+06菌落形成单位/克鲜重)。(图16B)。
此外，为了评定在田间条件的复杂性下的定殖，于2015年6月在圣路易斯·奥比斯波(San Luis Obispo)进行了1英亩的田间试验，以评定两种非甜质玉米品种中七种野生型菌株的影响和定殖。农艺设计和试验的执行是由合同田地研究组织Pacific Ag Research进行的。对于接种，采用在接种方法实验中测试的相同的泥炭培养种子包衣技术。在生长季节过程中，收集植物样品以评定在根和茎内部的定殖。在种植后四周和八周从每种处理的三个重复小块土地收集样品，并且在16周收获前不久从每种处理的所有六次重复收集样品。在第12周时，从接种有菌株1和菌株2的所有六个重复处理小块土地以及未处理对照中收集额外样品。与其它利用qPCR和菌株特异性引物的定殖分析一样，评定每克鲜重的经洗涤的根的细胞数。两种菌株，菌株1和菌株2，显示一致且广泛的根部定殖，在12周时达到峰值，并且然后突然下降(图16C)。虽然菌株2的存在数目似乎比菌株1的低一个数量级，但发现其在植物之间的数目更一致。似乎没有菌株有效地定殖茎内部。支持qPCR定殖数据，使用铺板和16S测序成功地从根样品中重新分离了两个菌株，以鉴别匹配序列的分离株。
微生物育种的实例可以概述于图17和图18的示意图中。图17描绘了微生物育种，其中可以首先测量微生物组的组成并且鉴别所关注的物种。微生物组的代谢可以作图并且与遗传学联系。之后，可以使用包括但不限于缀合和重组、化学诱变、适应性进化以及基因编辑的方法引入靶向基因变异。衍生微生物用于接种作物。在一些实例中，选择具有最佳表型的作物。
如图17中所提供，可以首先测量微生物组的组成并且鉴别所关注的物种。微生物组的代谢可以作图并且与遗传学联系。氮的代谢可能涉及通过AmtB转运蛋白使氨(NH4 +)从根际进入细菌的胞质溶胶。谷氨酰胺合成酶和ATP将氨和L-谷氨酸(L-Glu)催化成谷氨酰胺。谷氨酰胺可以引起生物量的形成(植物生长)，并且其也可以抑制nif操纵子的表达。之后，可以使用包括但不限于缀合和重组、化学诱变、适应性进化以及基因编辑的方法引入靶向基因变异。衍生微生物用于接种作物。选择具有最佳表型的作物。
除非在本文中另外指示或明显与内容相矛盾，否则在描述本发明的情况下(尤其是在所附权利要求书的情况下)，使用术语“一(a/an)”和以及“所述”和类似指示语应理解为涵盖单数与复数。除非另外指出，否则术语“包含”、“具有”、“包括”以及“含有”应被解释为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。除非在本文中另外指示，否则对本文中值范围的叙述仅意图充当个别提及属于所述范围的每一单独值的速记方法，且每一单独值并入本说明书中，如同在本文中个别地叙述一般。举例来说，如果公开了范围10-15，则也公开了11、12、13以及14。除非在本文中另外指示或另外明显与内容相矛盾，否则本文描述的所有方法都可以以任何合适的顺序执行。除非另外主张，否则本文中所提供的任何和所有实例或例示性语言(例如，“如”)仅意图更好地阐明本发明并且不对本发明的范围造成限制。本说明书中的任何语言都不应理解为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
虽然已经在本文中显示和描述本发明的优选实施例，但所属领域的技术人员应清楚这类实施例仅是作为实例而提供的。所属领域的技术人员现在将在不脱离本发明的情况下意识到大量变型、变化以及取代。应理解，本文所描述的本发明的实施例的各个替代方案都可以用于实践本发明。所附权利要求书旨在限定本发明的范围，并且由此覆盖这些权利要求和其等效物的范围内的方法和结构。
表3A
名称 最小值 最大值 长度 方向
胞壁质脂蛋白CDS 2,929,898 2,930,134 237 正向
膜蛋白CDS 5,217,517 5,217,843 327 正向
锌/镉结合蛋白CDS 3,479,979 3,480,626 648 正向
酰基载体蛋白CDS 4,563,344 4,563,580 237 反向
ompX CDS 4,251,002 4,251,514 513 正向
DNA结合蛋白HU-βCDS 375,156 375,428 273 正向
sspA CDS 629,998 630,636 639 反向
tatE CDS 3,199,435 3,199,638 204 反向
LexA阻遏子CDS 1,850,457 1,851,065 609 正向
hisS CDS <3999979 4,001,223 ＞1245 正向
表3B
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实例8：glgA缺失增加氮排泄
糖原合成使碳分流远离糖酵解和TCA循环。减少或废除糖原合成可能引起更大的碳通向糖酵解和TCA循环，从而引起细胞中的ATP可用性更高。这可能引起固氮酶活性提高，因为固氮需要16ATP还原一分子N2，并且可能受ATP可用性的限制。糖原合酶由基因glgA编码。glgA的下调或缺失可能引起固氮活性提高。
为此，构建了缺失glgA的蔗糖小迫氏菌CI006和变栖克雷伯氏菌菌株。对菌株6-1694、6-1744和137-1893进行铵排泄(AMM)分析，其中在固氮条件下通过在无氮培养基中培养细胞，沉淀细胞并且测量无细胞培养液中的游离铵来测量随时间推移的氨排泄量；较高的铵排泄水平表明较高的固氮和氮排泄。在补充有5mM磷酸铵的培养基中对菌株6-1681和137-1893进行了如先前所描述的ARA分析。菌株6-1694对应于亲本菌株6-342。菌株6-1744对应于亲本菌株6-923。菌株6-1681对应于亲本菌株6-346。菌株137-1893对应于亲本菌株137-1586。
来自AMM分析的数据显示在图19A-20B中。与其亲本菌株相比，菌株6-1694和6-1744显示提高的氮排泄能力(图19A)。与其亲本菌株相比，菌株6-1681展现提高的ARA活性(图19B)。如通过ARA测量，菌株137-1893展现增加的铵排泄(图20A)和提高的固氮酶活性(图20B)。因此，减少或消除细菌中糖原的合成，可以增加氮的排泄量。本文所描述的菌株的细节可见于表8和9中。
实例9：glnD突变增加氮排泄
GlnD是一种双功能尿苷酰基转移酶/尿苷酰基去除酶，其充当细胞中氮感应的中心“开关”。其含有三个不同的域：UT酶域，其尿苷酰化PII蛋白GlnB和GlnK；尿苷酰基去除(UR)域，也称为HD域，其可以从PII蛋白中去除尿苷酰基；和两个ACT域，其响应于谷氨酰胺结合来调控另外两个域的活性(图21)。在氮过量的情况下，谷氨酰胺结合ACT域，并且UR域被活化；在氮饥饿的情况下，ACT未结合并且UT酶域具有活性。后续PII蛋白信号传导影响几个基因簇的转录，包括固氮酶和氮同化基因。
进行了各种截短和缺失，以查看其如何影响固氮和氮排泄。如ARA和铵排泄分析中所测量，修饰UT酶、UR和ACT1/2(谷氨酰胺感应)域的几个glnD突变引起活性提高。图22展现了几种glnD修饰，其引起变栖克雷伯氏菌CI137中的铵排泄增加；图23展现了几种glnD修饰，其引起蔗糖小迫氏菌中的铵排泄增加。
实例10：glnK缺失增加氮排泄
GlnK是PII蛋白，其可能是翻译后调控子，并且可能参与谷氨酰胺合成，谷氨酰胺合成可能是铵排泄的竞争性路径。较高水平的GlnK可能减少NH4的排泄量。去除glnK可能减少或消除对NH4排泄的抑制作用。
在已含有nifL：：1.2缺失和glnE缺失的菌株中缺失GlnK。因此，将glnK的缺失引入到已具有提高的固氮能力的菌株中。在图24A中，具有glnK缺失的菌株指示为137-2225，并且亲本菌株指示为137-2084。对这些细胞进行AMM分析，使得测量到每小时每OD排泄的NH4+量(以mM为单位)。在这一分析中，更多的NH4+排泄可以表明更高的固氮活性。特定来说，如通过AMM分析测量，137-2225菌株显示的固氮活性比亲本菌株高1.32倍。
实例11：glnA基因的下调增加铵排泄
谷氨酰胺合成酶(GS)由glnA基因编码。GS活性降低可能引起氮同化率降低。在固氮条件下，这可能引起细胞内铵积累和铵排泄。
构建了几种菌株，其中glnA的天然启动子被已知以低水平组成性表达的启动子置换：glnB、glnD或glnE基因的启动子。预期这会引起glnA转录减少。在一些情况下，glnA基因的ATG起始密码子也突变为GTG，以降低GS蛋白的翻译起始速率。图24B、图25和图26描述了CI137和CI006的几种突变体，其中glnA基因的下调引起增加的铵排泄。
实例12：谷氨酸合酶的下调引起增加的铵排泄
谷氨酸充当细胞中的主要氮库，并且GS-GOGAT路径是氮同化的主要路径。gltBD操纵子编码GOGAT。构建了菌株(137-2215)，其中缺失了gltBD操纵子的天然启动子，并且用强组成型启动子置换。图27展现了137-2215与亲本对照相比如何展现增加的铵排泄；图28展现了137-2215展现如通过ARA测量的提高的固氮活性。
实例13：谷氨酰胺酶基因glsA2的上调引起增加的铵排泄
谷氨酰胺酶切割谷氨酰胺中的C-N键，释放铵和谷氨酸。提高细胞中谷氨酰胺酶活性可能引起增加的来自谷氨酰胺的铵释放和铵排泄。glsA2基因编码谷氨酰胺酶。构建菌株，其中缺失glsA2基因的天然启动子并且用强启动子序列置换。图29和图30展现了与亲本菌株对照相比，这些菌株的铵排泄增加。
实例14：asnB的谷氨酰胺酶域的上调引起增加的铵排泄
asnB基因编码转氨酶，其具有两个域：谷氨酰胺酶域和天冬酰胺合酶域。图31展现了天冬酰胺合酶域的缺失或asnB基因的上调如何可能引起铵排泄增加。
实例15：rpoN上调增加固氮
rpoN(σ54)是用于促进RNA聚合酶连接到特定起始位点的起始因子。其与nifA和ihfA/B一起转录nifH。上调rpoN可能会使nifH水平提高，这可能引起固氮增加。
构建了两个变栖克雷伯氏菌CI137菌株，其中通过缺失其天然启动子并且用强组成型启动子置换来上调rpoN。数据在图32和图33中显示。具有rpoN修饰的菌株指示为137-2251和137-2285，并且亲本菌株指示为137-2084。
在图32中，数据显示为每小时每个菌落形成单位形成的乙烯量的以10为底的对数，使得更高量的乙烯形成指示更多的固氮。用作为氮源提供的5mM磷酸铵进行分析。137-2251菌株的固氮能力比亲本菌株好1.23倍(p＝0.028)，而137-2285菌株的固氮能力比亲本菌株好1.95倍(p＝0.031)。
这些结果表明，可以通过增加负责转录编码酶nifH的RNA的聚合酶的量来增强固氮。
实例16：otsB的上调引起提高固氮活性
otsB参与细胞中的海藻糖生物合成，并且otsB的修饰可以提高菌株的稳健性。在这里，产生并且测试了otsB的修饰，以确定这些修饰是否对细胞中的固氮产生负面影响。
修饰了三个固氮细菌菌株以提高otsB基因表达。缺失了otsB基因的天然启动子，并且用强组成型启动子置换。修饰的菌株是6-921和6-922(亲本菌株6-435)以及6-1697(亲本菌株6-923)。对修饰的菌株6-921和6-922进行了ARA分析(图34)。数据显示为每小时每个菌落形成单位形成的乙烯量的以10为底的对数，使得更高量的乙烯形成指示更多的固氮。作为氮源提供的5mM磷酸铵进行分析。CI006用作阴性对照。令人惊讶地，与亲本相比，修饰的菌株的固氮活性提高。
对菌株6-1697进行铵排泄分析。数据显示为每小时排泄的NH4+量(mM/OD)，使得较高值指示较大氮排泄。数据代表在不同日进行的实验。数据如图35中所示。与亲本相比，氮排泄活性提高。令人惊讶地，与亲本相比，修饰的菌株的铵排泄活性提高。
实例17：可以修饰phoB以增加根际的定殖
一些菌株的定殖可能与生物膜形成有关，生物膜形成可能受磷信号传导的影响，在一些情况下，可以通过改变磷信号传导基因(如phoB)的表达影响磷信号传导。因此，phoB的改变可能影响一些细菌菌株的定殖。
如通过AMM分析所测量，在具有高氮排泄的细菌菌株中产生对phoB的修饰(菌株137-1901)。亲本菌株指示为137-1586。
对细胞进行AMM分析，以确定修饰是否对细胞的氮排泄活性产生负面影响。修饰没有降低细胞的氮排泄活性(图36A)。因此，可以在不减少氮排泄的情况下修饰phoB。
进行玉米根定殖分析，以确定修饰是否影响菌株定殖植物根的能力。简单来说，在发芽后，用约109个细胞接种植物，并且使其生长4周，在这时收获植物。从植物茎的基部以下约1-2英寸处取种子根和第一节点的组合样品。收集后，将样品裂解并且进行qPCR，以确定每克根组织中存在的细胞数(菌落形成单位/克鲜重)。如图36B中所见，与亲本菌株137-1586相比，菌株137-1901显示增加的定殖。因此，在这种情况下，phoB的修饰可以增加细胞的在根上的定殖，突变菌株的定殖高于亲本菌株的定殖。
实例18：可以修饰yjbE2以增加根际的定殖
yjbE基因可以促进胞外多糖分泌，这可能增加某些菌株的根附着。
进行玉米根定殖分析，以确定yjbE的修饰是否影响菌株定殖植物根的能力。简单来说，在发芽后，用约109个细胞接种植物，并且使其生长4周，在这时收获植物。从植物茎的基部以下约1-2英寸处取种子根和第一节点的组合样品。收集后，将样品裂解并且进行qPCR，以确定每克根组织中存在的细胞数(菌落形成单位/克鲜重)。如图37中所见，与亲本菌株6-848相比，菌株6-1779显示增加的定殖。
实例19：otsB
otsB参与细胞中的海藻糖生物合成，并且otsB的修饰可以提高菌株的稳健性。在这里，产生并且测试了otsB的修饰，以确定这些修饰是否对细胞中的固氮产生负面影响。
修饰了固氮细菌菌株以提高otsB基因表达。对修饰的细胞进行ARA分析。数据显示为每小时每个菌落形成单位形成的乙烯量的以10为底的对数，使得更高量的乙烯形成指示更多的固氮。用作为氮源提供的0mM(上图)或5mM(下图)磷酸铵进行分析。修饰的菌株是6-1697和6-1698(亲本菌株6-923)。CI006用作阴性对照。数据示于图38A中。与亲本相比，修饰的菌株的固氮活性提高。因此，可以进行otsB的修饰而不会负面影响细胞的固氮活性。
对修饰的细胞进行铵排泄分析。数据显示为每小时排泄的NH4+量(mM/OD)，使得较高值指示较大氮排泄。数据代表在不同日进行的实验。数据示于图38B中。与亲本相比，氮排泄活性提高。因此，可以进行otsB的修饰而不会负面影响细胞的固氮活性。
实例20：cysZ突变增加固氮
CysZ介导硫酸盐的吸收，提供硫，硫随后用于细菌细胞中含硫化合物，包括固氮酶活性所需的辅因子的合成。提高硫转运基因(如cysZ)的表达可能增加功能性固氮酶复合物的量。为此，产生了两种具有cysZ修饰的蔗糖小迫氏菌菌株，其分别用符号表示为6-1691和6-916。进行乙炔还原分析(ARA)，并且将数据与cysZ中无突变的亲本菌株进行比较(菌株6-346和6-435分别是6-1691和6-916的亲本)。将CI006菌株用作阴性对照，并且除了6-1691和其亲本在5mM磷酸铵中进行分析(图39A)，而6-916和其亲本在5mM谷氨酰胺中进行分析(图39B)外，对两种菌株相同地进行ARA分析。两种菌株均展现相比于WT和亲本菌株提高的固氮酶活性。6-1691所显示的提高是约14倍，而菌株6-916的固氮活性比其亲本高约6倍。
实例21：生物膜形成
生物膜形成会影响提供给相关植物的氮的量。植物根部生物膜形成的增加会增加提供给植物的氮的量。
一些基因可以调控生物膜形成。举例来说，smZ可以是生物膜调控的负调控子。使得smZ降低或消除功能的smZ突变可以增加细菌中的生物膜形成。可以进行诱变来使具有增加的氮排泄和固定活性的菌株中的smZ突变，以产生细菌的smZ突变体库。
一些蛋白质可以促进生物膜形成。举例来说，包括lapA的大粘附蛋白可以促进生物膜形成。可以上调一种或多种调控lapA表达的启动子，使得产生更多的lapA，如通过蛋白质印迹检测。
可以生成具有smZ突变和lapA上调的菌株，以生成用于测试的菌株的smZ/lapA库。smZ/LapA菌株可以具有增加的生物膜形成，并且可以具有比仅具有smZ突变或lapA突变的菌株更高的生物膜形成能力。
菌株可以在溶原性缓冲液(LB)中生长，并且接种到具有幼苗的土壤中。幼苗、土壤和细菌菌株可以在盆中、田间、室内或室外。可以在春季、夏季、秋季或冬季种植幼苗。空气可以具有约0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％湿度。可以是雨天、有雾、多云或晴天。温度可以是约4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃或45℃。可以在黎明、早晨、中午、下午、黄昏、晚上或夜间种植幼苗。可以使幼苗生长约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20或30天。时间过去后，可以挖出植物，并且测量根上的生物膜量。
实例22：氧敏感性
固氮酶的氧敏感性会影响固氮、氮排泄或两者。降低固氮酶的氧敏感性可以提高固氮活性、提高氮排泄活性或两者。可以产生包含具有减少的氧的一种或多种固氮酶的细菌菌株，使得所述菌株显示提高的固氮活性或提高的氮排泄活性。
可以在具有野生型或遗传改良的固氮活性、氮排泄活性或两者的细菌细胞中进行基因修饰。可以将基因修饰引入细胞，使得通过诱变方案使一个或多个固氮酶基因沉默，并且可以产生此类菌株的库。
库中的每个菌株都可以进行氧敏感性分析。为此，可以在氧气浓度变化的条件下进行AMM和ARA分析。氧气浓度范围可以是1μM到6μM。可以分析数据以确定菌株是否显示随氧浓度变化降低的氮排泄或固氮活性。一些带有修饰的固氮酶的菌株可能几乎不显示或不显示随氧浓度提高氮排泄或固氮活性降低。
实例23：改变modA、modB、modE
钼吸收路径可以指使得能够将钼吸收到细胞中的细菌中的代谢路径。钼可以充当固氮的辅因子。增加细胞的钼吸收可能增加固氮、氮排泄或两者。
钼转运路径中的关键酶可以包括modA、modB和modE。细菌菌株中这些基因中任何一个、两个或三个的修饰或上调可能增加细胞中的钼吸收，并且可能增加细胞中的固氮、氮排泄或两者。
可以对细菌细胞中的这些基因进行基因修饰，以使得修饰引起钼转运增加。为了鉴别此类修饰，可以在编码modA、modB或modC的基因的活性位点中和周围进行诱变。可以为每个基因构建突变体库。然后可以针对提高的钼吸收活性筛选这些库。这些库可以由野生型细胞或已经被修饰以显示增加的固氮、增加的氮排泄或两者的细胞产生。
可以在这些细胞中进行基因修饰，使得钼吸收路径中的一个或多个基因上调。还可以构建变异体库，使得钼吸收路径中一个或多个基因的启动子活性提高。举例来说，可以对modABC启动子进行遗传调节以增加转录。蛋白质印迹法可以用于确定哪些菌株具有提高的一种或多种钼吸收基因的表达，并且这些菌株可以是所关注的变异体。
为了筛选提高的钼吸收活性，可以将所关注的每种突变体或变异体以及每种菌株的未突变亲本菌株接种到96孔板的三个孔中的LB培养基中并且使其生长。一旦细胞达到OD＝0.8，就可以收获每种突变体的孔之一，从而沉淀细胞，将过量LB洗掉，并且将细胞再悬浮、裂解并且准备在96孔板中进行光谱分析。可以使用光谱法测量钼含量，以建立样品中的基线钼含量。其余样品可以外加呈LB中四氧阴离子钼酸盐形式的钼或单独的LB，使得添加量为每个孔中总容积的10％或更少。分析中每个孔中的钼的最终浓度可以是10pM、100pM、1nM、10nM或100nM中的一种，并且可以测试超过一种的浓度。分析可以历时1秒、10秒、30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟以及60分钟中的一个或多个进行。
首先，对于每种浓度，可以绘制随时间变化转运到每个细胞中的钼量，以确定分析的最佳持续时间。最佳持续时间可以是尚未达到稳态，并且反应速率仍然是线性的时间间隔。然后，对于最佳持续时间，可以绘制随浓度变化转运到每个细胞中的钼量，并且可以进行米-蒙分析(Michaelis-Menten analysis)。可以选择所关注的突变菌株或变异体用于进一步分析，如通过Km比较确定，相比于未突变和未修饰的亲本菌株，所述突变菌株或变异体显示钼转运显著增加(p<0.05)。
接下来，可以对选择用于进一步分析的每个菌株进行如本文所描述的AMM分析以及ARA分析，以分别测量氮排泄和固定。这些突变或变异体中的一种或多种可能增加这些细菌菌株的一种或多种的AMM、ARA或两者。
实例24：增加铁转运可以增加固氮
铁吸收路径可以指使得能够将铁吸收到细胞中的细菌中的代谢路径。铁可以充当促进固氮的辅因子。增加细胞的铁吸收可能增加固氮、氮排泄或两者。
铁转运路径中的关键酶可以包括exbA、exbB和tonB。细菌菌株中这些基因中任何一个、两个或三个的修饰或上调可能增加细胞中的铁吸收，并且可能增加细胞中的固氮、氮排泄或两者。
可以对细菌细胞中的这些基因进行基因修饰，以使得修饰引起铁转运增加。为了鉴别此类修饰，可以在编码exbA，exbB或tonB的基因的活性位点中和周围进行诱变。可以为每个基因构建突变体库。然后可以针对提高的铁吸收活性筛选这些库。这些库可以由野生型细胞或已经被修饰以显示增加的固氮、增加的氮排泄或两者的细胞产生。
可以在这些细胞中进行基因修饰，使得铁吸收路径中的一个或多个基因上调。还可以构建变异体库，使得铁吸收路径中一个或多个基因的启动子活性提高。蛋白质印迹法可以用于确定哪些菌株具有提高的一种或多种铁吸收基因的表达，并且这些菌株可以是所关注的变异体。
为了筛选提高的铁吸收活性，可以将所关注的每种突变体或变异体以及每种菌株的未突变亲本菌株接种到96孔板的三个孔中的LB培养基中并且使其生长。一旦细胞达到OD＝0.8，就可以收获每种突变体的孔之一，从而沉淀细胞，将过量LB洗掉，并且将细胞再悬浮、裂解并且准备在96孔板中进行光谱分析。可以使用光谱法测量铁含量，以建立样品中的基线铁含量。其余样品可以外加呈LB中FeSO4形式的铁或单独的LB，使得添加量为每个孔中总容积的10％或更少。可以包括0.1mM的乙酸(最终浓度)以有助于铁的溶解性。分析中每个孔中的铁的最终浓度可以是10pM、100pM、1nM、10nM、100nM、1μM、10μM或100μM中的一种，并且可以测试超过一种的浓度。分析可以历时1秒、10秒、30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟以及60分钟中的一个或多个进行。
首先，对于每种浓度，可以绘制随时间变化转运到每个细胞中的铁量，以确定分析的最佳持续时间。最佳持续时间可以是尚未达到稳态，并且反应速率仍然是线性的时间间隔。然后，对于最佳持续时间，可以绘制随浓度变化转运到每个细胞中的铁量，并且可以进行米-蒙分析。可以选择所关注的突变菌株或变异体用于进一步分析，如通过Km比较确定，相比于未突变和未修饰的亲本菌株，所述突变菌株或变异体显示铁转运显著增加(p<0.05)。
接下来，可以对选择用于进一步分析的每个菌株进行如本文所描述的AMM分析以及ARA分析，以分别测量氮排泄和固定。这些突变或变异体中的一种或多种可能增加这些细菌菌株的一种或多种的AMM、ARA或两者。
实例25：增加铁载体生物合成基因可以增加固氮
yhf铁载体或铁螯合分子可能影响细菌中的铁吸收。增加yhf铁载体的产生可能增加细菌中的铁吸收。铁载体基因，包括yhfA、yusV、sbnA、yfiZ、fiu以及fur的修饰，可能增加yhf铁载体的产生，其继而增加细胞中的铁吸收。这些修饰可能引起固氮或氮排泄增加。
可以对细菌细胞中的这些基因进行基因修饰，以使得修饰引起铁载体产生增加。为鉴别此类修饰，可以在编码yhfA、yusV、sbnA、yfiZ、fiu或fur的基因的活性位点中和周围进行诱变。可以为每个基因构建突变体库。然后可以针对增加的铁载体产生筛选这些库。这些库可以由野生型细胞或已经被修饰以显示增加的固氮、增加的氮排泄或两者的细胞产生。为了针对增加的铁载体进行筛选，可以使每个突变体生长到OD＝0.8，并且然后外加过量但非毒性量的铁载体前体并且培育30分钟或60分钟。在分配的时段之后产生的铁载体的量可以被标准化，并且可以针对增加的铁转运筛选显示增加的铁载体产生的菌株。
为了筛选提高的铁吸收活性，可以将所关注的每种突变体或变异体以及每种菌株的未突变亲本菌株接种到96孔板的三个孔中的LB培养基中并且使其生长。一旦细胞达到OD＝0.8，就可以收获每种突变体的孔之一，从而沉淀细胞，将过量LB洗掉，并且将细胞再悬浮、裂解并且准备在96孔板中进行光谱分析。可以使用光谱法测量铁含量，以建立样品中的基线铁含量。其余样品可以外加呈LB中FeSO4形式的铁或单独的LB，使得添加量为每个孔中总容积的10％或更少。可以包括0.1mM的乙酸(最终浓度)以有助于铁的溶解性。分析中每个孔中的铁的最终浓度可以是10pM、100pM、1nM、10nM、100nM、1μM、10μM或100μM中的一种，并且可以测试超过一种的浓度。分析可以历时1秒、10秒、30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟以及60分钟中的一个或多个进行。
首先，对于每种浓度，可以绘制随时间变化转运到每个细胞中的铁量，以确定分析的最佳持续时间。最佳持续时间可以是尚未达到稳态，并且反应速率仍然是线性的时间间隔。然后，对于最佳持续时间，可以绘制随浓度变化转运到每个细胞中的铁量，并且可以进行米-蒙分析。可以选择所关注的突变菌株或变异体用于进一步分析，如通过Km比较确定，相比于未突变和未修饰的亲本菌株，所述突变菌株或变异体显示铁转运显著增加(p<0.05)。
接下来，可以对选择用于进一步分析的每个菌株进行如本文所描述的AMM分析以及ARA分析，以分别测量氮排泄和固定。这些突变或变异体中的一种或多种可能增加这些细菌菌株的一种或多种的AMM、ARA或两者。
实例26：dctA1和dctA2
dctA1和dctA2负责将二羧酸富马酸、L-苹果酸和D-苹果酸，以及在更轻微程度上，琥珀酸从周质穿过内膜的好氧转运。对这些基因的修饰可能影响微生物的定殖。
如通过AMM分析测量，在具有高氮排泄的菌株中，产生对dctA1(菌株137-1861)和dctA2(菌株137-1905)的修饰。亲本菌株指示为137-1905。
对细胞进行AMM分析，以确定修饰是否对细胞的氮排泄活性产生负面影响。修饰没有降低细胞的氮排泄活性(图40A)。因此，可以在不减少氮排泄的情况下修饰dctA1和dctA2。
使用qPCR对细胞进行集落形成分析，以确定修饰是否影响细胞的集落形成特性。简单来说，在发芽后，用约109个细胞接种植物，并且使其生长4周，在这时收获植物。从植物茎的基部以下约1-2英寸处取种子根和第一节点的组合样品。收集后，将样品裂解并且进行qPCR，以确定菌落形成单位/克鲜重。数据示于图40B中。两种菌株均显示增加的定殖。因此，dctA1和dctA2的修饰可以增加细胞中的定殖。
实例27：提高脱水耐受性
提高脱水耐受性可以增加用于种子包衣或其它干施加到植物或田地的菌株的定殖。将产生包含与rpoE基因可操作连接的阿拉伯糖启动子的基因工程微生物。基因工程微生物和非工程亲本对照将在补充有阿拉伯糖的培养基中培养48小时，随后进行干燥。干燥后，工程菌株和非工程菌株中的每一种的一部分将在不含阿拉伯糖的培养基中复活，并且将分析24小时后培养基中的微生物数目。与含有非工程亲本菌株的培养基相比，含有工程菌株的培养基将含有更多的微生物。
将干燥的微生物施加到玉米种子，并且在适合于玉米种子发芽的条件下，在温室中在不具有阿拉伯糖的土壤中种植。4周后，将收获幼苗，并且评定植物根上的工程微生物和非工程微生物两者的菌落形成单位数。与暴露于非工程亲本菌株的植物相比，暴露于工程微生物的植物将与更多微生物缔合。
实例28：改变nisA RBS增加nifH转录
插入nifA上游的启动子-RBS序列引起nifH：nifA转录比率提高，表明由于插入的RBS强度增加引起更高的NifA的翻译起始率，活性NifA蛋白的量增加。
通过缺失nifL基因并且在nifA上游插入序列来生成菌株，所述序列含有宿主基因组中其它地方发现的基因的启动子和核糖体结合位点(RBS)两者。将两个生物学重复样品在富培养基中生长过夜，然后继代培养到补充有10mM谷氨酰胺的基本培养基中。将所得培养物分割，并且用于在无固定氮源或具有10mM谷氨酰胺的ARA培养基中接种厌氧培养物。厌氧培养五小时后，取出每种培养物的样品，并且将RNA提取，进行反转录以生成cDNA，并且通过qPCR分析以测量nifA和nifH的转录。将所关注基因的转录物相对于管家基因helD标准化，helD在不同氮条件下显示一致的转录。将所得的四个样品的标准化数据作图，以显示每个菌株中nifA转录与nifH转录之间的关系。图41A和41B中的重构菌株显示了绘制nifH相对于nifA转录的线性最佳拟合线的斜率增加，表明由于NifA的翻译起始率提高，每个nifA转录物引起这些菌株中更大数目的nifH转录物。
表8：本文所描述的菌株
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表9：本文所描述的其它菌株
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尽管有所附权利要求书，但本文所阐述的公开内容也由以下条款限定：
1.一种具有改k的脱水耐受性的微生物菌株。
2.一种微生物菌株，其中rpoE表达由可切换启动子调控。
3.根据条款2所述的微生物菌株，其中所述可切换启动子是阿拉伯糖启动子。
4.根据条款2所述的微生物菌株，其中rseA基因被下调。
5.根据条款2所述的微生物菌株，其中所述可切换启动子是可以用化学物活化的启动子。
6.根据条款2所述的微生物菌株，其中所述可切换启动子是可以用糖活化的启动子。
7.根据条款2所述的微生物菌株，其中所述可切换启动子是可以用阿拉伯糖活化的启动子。
8.一种提高微生物的脱水耐受性的方法，所述方法包含对所述微生物进行工程改造以含有可操作地连接到可切换启动子的rpoE基因，在生物量生长的对数期期间活化所述可切换启动子，从而提高所述微生物的脱水耐受性。
9.一种提高微生物在种子包衣期间的脱水耐受性的方法，所述方法包含对所述微生物进行工程改造以含有可操作地连接到可切换启动子的rpoE基因，在脱水之前活化所述可切换启动子，从而提高所述微生物的脱水耐受性。
10.根据条款9所述的方法，其中所述可切换启动子是可以用化学物活化的启动子。
11.根据条款9所述的方法，其中所述可切换启动子是可以用糖活化的启动子。
12.根据条款9所述的方法，其中所述可切换启动子是可以用阿拉伯糖活化的启动子。
13.根据条款9所述的方法，其中所述可切换启动子在生物量生长的对数期期间被活化。
14.根据条款9所述的方法，其中所述可切换启动子在种子包衣期间被活化。
15.根据条款9所述的方法，其中所述微生物还被工程改造以降低rseA的表达。
16.一种基因工程菌，其包含可操作地连接到cysP的异源调控元件。
17.根据条款16所述的基因工程菌，其中所述异源调控元件是启动子。
18.根据条款16所述的基因工程菌，其中所述异源调控元件原产于所述基因工程菌。
19.一种基因工程菌，其包含引起蛋白质表达提高的基因变异，所述蛋白质催化固氮酶辅因子的组分向细胞中的转运。
20.根据条款19所述的基因工程菌，其中催化固氮酶辅因子的组分向细胞中的转运的所述蛋白是硫转运蛋白基因。
21.根据条款20所述的基因工程菌，其中所述硫转运蛋白基因是cysZ。
22.根据条款20所述的基因工程菌，其中所述硫转运蛋白基因是cysK。
23.根据条款20所述的基因工程菌，其中所述硫转运蛋白基因是cysT。
24.根据条款20所述的基因工程菌，其中所述硫转运蛋白基因是cysW。
25.根据条款20所述的基因工程菌，其中所述硫转运蛋白基因是cysA。
26.根据条款20所述的基因工程菌，其中所述硫转运蛋白基因是sbp。
27.根据条款19所述的基因工程菌，其中所述基因变异引起cysZK操纵子的表达提高。
28.根据条款19所述的基因工程菌，其中所述基因变异引起cysPTWA操纵子的表达提高。
29.根据条款19所述的基因工程菌，其中催化固氮酶辅因子的组分向细胞中的转运的所述蛋白是钼转运蛋白基因。
30.根据条款29所述的基因工程菌，其中所述钼转运蛋白基因是modE。
31.根据条款29所述的基因工程菌，其中所述钼转运蛋白基因是modB。
32.根据条款29所述的基因工程菌，其中所述钼转运蛋白基因是modA。
33.根据条款19所述的基因工程菌，其中所述基因变异引起modEB操纵子的表达提高。
34.根据条款19所述的基因工程菌，其中所述基因变异引起modEBA操纵子的表达提高。
35.根据条款19所述的基因工程菌，其中催化固氮酶辅因子的组分向细胞中的转运的所述蛋白是铁转运蛋白基因。
36.根据条款35所述的基因工程菌，其中所述铁转运蛋白基因是exbA。
37.根据条款35所述的基因工程菌，其中所述铁转运蛋白基因是exbB。
38.根据条款35所述的基因工程菌，其中所述铁转运蛋白基因是的tonB。
39.根据条款19所述的基因工程菌，其中所述基因变异引起exbAB操纵子的表达提高。
40.根据条款19到39中任一项所述的基因工程菌，其中所述基因变异包含启动子的插入。
41.一种基因工程菌，其中所述基因工程菌包含铁载体生物合成基因的改变的表达。
42.根据条款41所述的基因工程菌，其中所述铁载体生物合成基因是isyhfA。
43.根据条款41所述的基因工程菌，其中所述铁载体生物合成基因是yusV。
44.根据条款41所述的基因工程菌，其中所述铁载体生物合成基因是sbnA。
45.根据条款41所述的基因工程菌，其中所述铁载体生物合成基因是yfiZ。
46.根据条款41所述的基因工程菌，其中所述铁载体生物合成基因是fiu。
47.根据条款41所述的基因工程菌，其中所述铁载体生物合成基因是fur。
48.一种基因工程菌，其包含glgA中的基因变异；其中与不具有glgA中的所述基因变异的相同物种的细菌相比，所述基因工程菌具有提高的固氮活性。
49.根据条款47所述的基因工程菌，其中所述基因变异引起glgA的表达降低。
50.一种基因工程菌，其包含引起NifA翻译增加的非天然核糖体结合位点。
51.一种基因工程菌，其包含NifA基因的至少两个拷贝。
52.根据条款51所述的基因工程菌，其中所述基因工程菌包含所述NifA基因的至少三个拷贝。
53.根据条款51所述的基因工程菌，其中所述基因工程菌包含所述NifA基因的至少四个拷贝。
54.根据条款51所述的基因工程菌，其中所述基因工程菌包含所述NifA基因的至少五个拷贝。
55.根据条款51所述的基因工程菌，其中所述基因工程菌包含所述NifA基因的至少六个拷贝。
56.根据条款51所述的基因工程菌，其中所述基因工程菌包含所述NifA基因的至少七个拷贝。
57.根据条款51所述的基因工程菌，其中所述基因工程菌包含所述NifA基因的大于十个拷贝。
58.一种基因工程菌，其包含可操作地连接到至少一种选自由以下组成的组的基因的异源启动子：nifH、nifD以及nifK；其中所述异源启动子来源于宿主微生物的遗传物质。
59.一种基因工程菌，其包含反应性氧物种清除基因中的基因变异体。
60.根据条款59所述的基因工程菌，其中所述反应性氧物种清除基因是grxA。
61.根据条款59所述的基因工程菌，其中所述反应性氧物种清除基因是grxB。
62.根据条款59所述的基因工程菌，其中所述反应性氧物种清除基因是grxC。
63.根据条款59所述的基因工程菌，其中所述反应性氧物种清除基因是grxD。
64.根据条款59所述的基因工程菌，其中所述反应性氧物种清除基因是trxA。
65.根据条款59所述的基因工程菌，其中所述反应性氧物种清除基因是trxC。
66.根据条款59所述的基因工程菌，其中所述反应性氧物种清除基因是tpx。
67.一种基因工程菌，其包含引起grxABCD操纵子的改变的表达的基因。
68.一种基因工程菌，其包含基因变异体，所述基因变异体引起与相同物种的非工程固氮细菌相比，在至少0.05％氧的条件下，固氮酶活性水平提高。
69.根据条款68所述的基因工程菌，其中所述基因变异体引起与相同物种的非工程固氮细菌相比，在至少0.1％氧的条件下，固氮酶活性水平提高。
70.根据条款68所述的基因工程菌，其中所述基因变异体引起与相同物种的非工程固氮细菌相比，在至少0.5％氧的条件下，固氮酶活性水平提高。
71.根据条款68所述的基因工程菌，其中所述基因变异体引起与相同物种的非工程固氮细菌相比，在至少1％氧的条件下，固氮酶活性水平提高。
72.根据条款68所述的基因工程菌，其中所述基因变异体引起cydABX操纵子的改变的表达。
73.根据条款68所述的基因工程菌，其中所述基因变异体引起cydAB操纵子的改变的表达。
74.根据条款68所述的基因工程菌，其中所述基因变异体引起cydX基因的改变的表达。
75.根据条款68所述的基因工程菌，其中所述基因变异体引起cydA基因的改变的表达。
76.根据条款68所述的基因工程菌，其中所述基因变异体引起cydB基因的改变的表达。
77.根据条款68所述的基因工程菌，其中所述基因变异体引起glbN基因的改变的表达。
78.根据条款68所述的基因工程菌，其中所述基因变异体引起fixNOPQ操纵子的改变的表达。
79.根据条款68所述的基因工程菌，其中所述基因变异体引起fixN基因的改变的表达。
80.根据条款68所述的基因工程菌，其中所述基因变异体引起fixO基因的改变的表达。
81.根据条款68所述的基因工程菌，其中所述基因变异体引起fixP基因的改变的表达。
82.根据条款68所述的基因工程菌，其中所述基因变异体引起fixQ基因的改变的表达。
83.一种基因工程菌，其包含asnB中的修饰。
84.一种基因工程菌，其包含选自由以下组成的组的基因中的修饰：asnB、asnA、glnL、尿苷酰基转移酶amtB以及GDH。
85.根据条款84所述的基因工程菌，其中所述基因变异体引起asnB基因的改变的表达。
86.根据条款84所述的基因工程菌，其中所述基因变异体引起asnA基因的改变的表达。
87.根据条款84所述的基因工程菌，其中所述基因变异体引起glnL基因的改变的表达。
88.根据条款84所述的基因工程菌，其中所述基因变异体引起尿苷酰基转移酶基因的改变的表达。
89.根据条款84所述的基因工程菌，其中所述基因变异体引起GDH基因的改变的表达。
90.一种基因工程菌，其包含glnK中的修饰，其中所述修饰选自由以下组成的组：缺失整个基因、缺失大体上整个基因、缺失ACT域、缺失ACT域的超过50％、使ACT域失活以及使UT酶域失活。
91.一种基因工程菌，其包含glnD中的修饰，其中所述修饰选自由以下组成的组：缺失整个基因、缺失大体上整个基因、缺失ACT域、缺失ACT域的超过50％、使ACT域失活以及使UT酶域失活。
92.一种基因工程菌，与相同物种的非工程菌相比，其具有改良的根际中存活率，细菌包含引起糖转运蛋白的表达提高的基因变异。
93.根据条款92所述的基因工程菌，其中所述糖转运蛋白是dctA。
94.一种基因工程菌，其包含引起糖转运蛋白的表达提高的基因变异。
95.根据条款94所述的基因工程菌，其中所述糖转运蛋白是dctA。
96.一种基因工程菌，与相同物种的非工程菌相比，其具有改良的根际中存活率，细菌包含引起改变的群体信号传导的基因变异。
97.根据条款96所述的基因工程菌，其中引起改变的群体信号传导的所述基因变异引起改变的群体猝灭。
98.根据条款96所述的基因工程菌，其中引起改变的群体信号传导的所述基因变异引起改变的Y2-aiiA表达。
99.根据条款96所述的基因工程菌，其中引起改变的群体信号传导的所述基因变异引起改变的ytnP表达。
100.一种基因工程菌，与相同物种的非工程菌相比，其具有改良的根际中存活率，细菌包含引起增加的根附着的基因变异。
101.根据条款100所述的基因工程菌，其中引起增加的根附着的所述基因变异包含引起改变的吩嗪生物合成的基因变异。
102.根据条款100所述的基因工程菌，其中引起增加的根附着的所述基因变异包含引起改变的环脂肽生物合成的基因变异。
103.根据条款100所述的基因工程菌，其中引起增加的根附着的所述基因变异包含引起凝集素改变的表达的基因变异。
104.根据条款100所述的基因工程菌，其中引起增加的根附着的所述基因变异包含引起fhaB改变的表达的基因变异。
105.根据条款100所述的基因工程菌，其中引起增加的根附着的所述基因变异包含引起fhaC改变的表达的基因变异。
106.根据条款100所述的基因工程菌，其中引起增加的根附着的所述基因变异包含引起yjbE改变的表达的基因变异。
107.根据条款100所述的基因工程菌，其中引起增加的根附着的所述基因变异包含引起pssM改变的表达的基因变异。
108.根据条款100所述的基因工程菌，其中引起增加的根附着的所述基因变异包含引起acs基因改变的表达的基因变异。
109.根据条款100所述的基因工程菌，其中引起增加的根附着的所述基因变异包含引起otsA改变的表达的基因变异。
110.根据条款100所述的基因工程菌，其中引起增加的根附着的所述基因变异包含引起包含otsA的操纵子改变的表达的基因变异。
111.根据条款100所述的基因工程菌，其中引起增加的根附着的所述基因变异包含引起treY改变的表达的基因变异。
112.根据条款100所述的基因工程菌，其中引起增加的根附着的所述基因变异包含引起包含trey的操纵子改变的表达的基因变异。
113.一种基因工程菌，其包含引起增加的生物膜形成的基因变异。
114.根据条款113所述的基因工程菌，其中引起增加的生物膜形成的所述基因变异包含引起smZ改变的表达的基因变异。
115.根据条款113所述的基因工程菌，其中引起增加的生物膜形成的所述基因变异包含引起lapA改变的表达的基因变异。
116.根据条款113所述的基因工程菌，其中引起增加的生物膜形成的所述基因变异包含引起AHL生物合成基因改变的表达的基因变异。
117.根据条款113所述的基因工程菌，其中引起增加的生物膜形成的所述基因变异包含引起phoB改变的表达的基因变异。
118.根据条款113所述的基因工程菌，其中引起增加的生物膜形成的所述基因变异包含引起phoR改变的表达的基因变异。
119.根据条款113所述的基因工程菌，其中引起增加的生物膜形成的所述基因变异包含引起MucA改变的表达的基因变异。
120.一种基因工程菌，与相同物种的非工程菌相比，其具有改良的根际中存活率，细菌包含引起细胞壁降解酶的表达提高的基因变异。
121.根据条款120所述的基因工程菌，其中所述细胞壁降解酶包含聚半乳糖醛酸酶。
122.根据条款120所述的基因工程菌，其中所述细胞壁降解酶包含纤维素酶。
123.根据条款120所述的基因工程菌，其中所述细胞壁降解酶包含pehA。
124.根据条款19到123中任一项所述的基因工程菌，其中所述基因工程菌是基因工程固氮细菌。
125.根据条款19到123中任一项所述的基因工程菌，其中所述基因工程菌是非属间的。
126.根据条款19到123中任一项所述的基因工程菌，其中所述基因工程菌是属间的。
127.根据条款19到123中任一项所述的基因工程菌，其中所述基因工程菌能够在外源氮存在下固定大气氮。
128.根据条款19到123中任一项所述的基因工程菌，其中所述基因工程菌包含固氮基因网络中的修饰。
129.根据条款19到123中任一项所述的基因工程菌，其中所述基因工程菌包含NifA中的修饰。
130.根据条款19到123中任一项所述的基因工程菌，其中所述基因工程菌包含引起NifA的表达提高的修饰。
131.根据条款19到123中任一项所述的基因工程菌，其中所述基因工程菌包含NifL中的修饰。
132.根据条款19到123中任一项所述的基因工程菌，其中所述基因工程菌包含引起NifL的表达降低的修饰。
133.根据条款19到123中任一项所述的基因工程菌，其中所述基因工程菌包含NifH中的修饰。
134.根据条款19到123中任一项所述的基因工程菌，其中所述基因工程菌包含引起NifH的表达提高的修饰。
135.根据条款19到123中任一项所述的基因工程菌，其中所述基因工程菌包含引起Nif簇基因的表达提高的修饰。
136.根据条款19到123中任一项所述的基因工程菌，其中所述基因工程菌包含氮同化基因网络中的修饰。
137.根据条款19到123中任一项所述的基因工程菌，其中所述基因工程菌包含GlnE中的修饰。
138.根据条款19到123中任一项所述的基因工程菌，其中所述基因工程菌包含引起GlnE的活性降低的修饰。
139.根据条款19到123中任一项所述的基因工程菌，其中所述基因工程菌包含引起amtB的活性降低的修饰。
140.一种增加植物中大气源性氮的量的方法，其包含使所述植物与多种根据条款19到139中任一项所述的基因工程菌接触。
141.根据条款140所述的方法，其中将所述基因工程菌施加到所述植物的种子。
142.根据条款140所述的方法，其中将所述基因工程菌施加到所述植物的幼苗。
143.根据条款140所述的方法，其中将所述基因工程菌以液体配制物的形式施加到所述植物。
144.根据条款140所述的方法，其中在所述植物种植后但在所述植物收获前将所述基因工程菌施加到所述植物。
145.根据条款140所述的方法，其中将所述基因工程菌作为侧施肥料施加到所述植物。
146.根据条款140所述的方法，其中在发芽后一个月与八个月之间将所述基因工程菌施加到所述植物。
147.根据条款140所述的方法，其中在发芽后两个月与八个月之间将所述基因工程菌施加到所述植物。
148.根据条款140所述的方法，其中在发芽后一个月与三个月之间将所述基因工程菌施加到所述植物。
149.根据条款140所述的方法，其中在发芽后三个月与六个月之间将所述基因工程菌施加到所述植物。
150.根据条款140所述的方法，其中所述植物是谷类植物。
151.根据条款140所述的方法，其中所述植物是玉米。
152.根据条款140所述的方法，其中所述植物是水稻。
153.根据条款140所述的方法，其中所述植物是小麦。
154.根据条款140所述的方法，其中所述植物是大豆。
155.一种组合物，其包含种子和种子包衣；其中种子包衣包含多种根据条款19到39中任一项所述的基因工程菌。
156.根据条款155所述的组合物，其中所述种子是谷类种子。
157.根据条款155所述的组合物，其中所述种子选自由以下组成的组：玉米种子、小麦种子、水稻种子、大豆种子、黑麦种子以及高粱种子。
158.一种组合物，其包含植物和多种根据条款19到39中任一项所述的基因工程菌。
159.根据条款158所述的组合物，其中所述植物是幼苗。
160.根据条款158所述的组合物，其中所述种子是谷类种子。
161.根据条款158所述的组合物，其中所述种子选自由以下组成的组：玉米、水稻、小麦、大豆、黑麦以及高粱。
162.一种增加微生物中的固氮的方法，所述方法包含引入引起硫转运蛋白改变的活性的基因修饰。
163.一种增加微生物中的固氮的方法，所述方法包含引入引起硫转运基因改变的表达的基因修饰。
164.一种增加微生物中的固氮的方法，所述方法包含引入引起钼转运蛋白改变的活性的基因修饰。
165.一种增加微生物中的固氮的方法，所述方法包含引入引起钼转运基因改变的表达的基因修饰。
166.一种增加微生物中的固氮的方法，所述方法包含引入引起铁转运蛋白改变的活性的基因修饰。
167.一种增加微生物中的固氮的方法，所述方法包含引入引起铁转运基因改变的表达的基因修饰。
168.一种增加微生物中的固氮的方法，所述方法包含引入引起改变的铁载体生物合成的基因修饰。
169.一种增加微生物中的固氮的方法，所述方法包含引入引起控制铁载体生物合成的基因改变的表达的基因修饰。
170.一种增加微生物中的固氮的方法，所述方法包含引入引起反应性氧物种清除子改变的活性的基因修饰。
171.一种增加微生物中的固氮的方法，所述方法包含引入引起反应性氧物种清除基因改变的表达的基因修饰。
172.一种增加微生物中的固氮的方法，所述方法包含引入引起群体信号传导中所涉及的蛋白质改变的活性的基因修饰。
173.一种增加微生物中的固氮的方法，所述方法包含引入引起群体信号传导基因改变的表达的基因修饰。
174.一种增加微生物中的固氮的方法，所述方法包含引入引起凝集素改变的活性的基因修饰。
175.一种增加微生物中的固氮的方法，所述方法包含引入引起凝集素改变的表达的基因修饰。
176.一种增加微生物中的固氮的方法，所述方法包含引入引起生物膜形成中所涉及的蛋白质改变的活性的基因修饰。
177.一种增加微生物中的固氮的方法，所述方法包含引入引起生物膜形成基因改变的表达的基因修饰。
178.一种增加微生物中的固氮的方法，所述方法包含引入引起AHL生物合成蛋白改变的活性的基因修饰。
179.一种增加微生物中的固氮的方法，所述方法包含引入引起AHL生物合成基因改变的表达的基因修饰。
180.一种增加微生物中的固氮的方法，所述方法包含引入引起细胞壁降解酶改变的活性的基因修饰。
181.一种增加微生物中的固氮的方法，所述方法包含引入引起细胞壁降解酶的基因改变的表达的基因修饰。
182.一种增加微生物中的固氮的方法，所述方法包含引入引起改变的固氮基因网络的基因修饰。
183.一种增加微生物中的固氮的方法，所述方法包含引入引起改变的氮同化基因网络的基因修饰。
184.一种增加由微生物进行的固氮的方法，所述方法包含将基因修饰引入选自由以下组成的组中的基因：rpoE、rseA、cysP、cysZ、cysK、cysT、cysW、cysA、sbp、cysZK操纵子、cysPTWA操纵子、modE、modB、modA、modEB操纵子、modEBA操纵子、exbA、exbB、tonB、exbAB操纵子、isyhfA、yusV、sbnA、yfiZ、fiu、fur、glgA、NifA、nifH、nifD、nifK、grxA、grxB、grxC、grxD、trxA、trxC、tpx、grxABCD操纵子、cydABX操纵子、cydAB操纵子cydX、cydA、cyddB、glbN、fixNOPQ、fixN、fixO、foxP、fixQ、asnB、asnA、glnL、尿苷酰基转移酶、amtB、glnK、GDH以及glnD。
186.一种增加由微生物进行的铵排泄的方法，所述方法包含引入引起硫转运蛋白改变的活性的基因修饰。
187.一种增加由微生物进行的铵排泄的方法，所述方法包含引入引起硫转运基因改变的表达的基因修饰。
188.一种增加由微生物进行的铵排泄的方法，所述方法包含引入引起钼转运蛋白改变的活性的基因修饰。
189.一种增加由微生物进行的铵排泄的方法，所述方法包含引入引起钼转运基因改变的表达的基因修饰。
190.一种增加由微生物进行的铵排泄的方法，所述方法包含引入引起铁转运蛋白改变的活性的基因修饰。
191.一种增加由微生物进行的铵排泄的方法，所述方法包含引入引起铁转运基因改变的表达的基因修饰。
192.一种增加由微生物进行的铵排泄的方法，所述方法包含引入引起改变的铁载体生物合成的基因修饰。
193.一种增加由微生物进行的铵排泄的方法，所述方法包含引入引起控制铁载体生物合成的基因改变的表达的基因修饰。
194.一种增加由微生物进行的铵排泄的方法，所述方法包含引入引起反应性氧物种清除子改变的活性的基因修饰。
195.一种增加由微生物进行的铵排泄的方法，所述方法包含引入引起反应性氧物种清除基因改变的表达的基因修饰。
196.一种增加由微生物进行的铵排泄的方法，所述方法包含引入引起群体信号传导中所涉及的蛋白质改变的活性的基因修饰。
197.一种增加由微生物进行的铵排泄的方法，所述方法包含引入引起群体信号传导基因改变的表达的基因修饰。
198.一种增加由微生物进行的铵排泄的方法，所述方法包含引入引起凝集素改变的活性的基因修饰。
199.一种增加由微生物进行的铵排泄的方法，所述方法包含引入引起凝集素改变的表达的基因修饰。
200.一种增加由微生物进行的铵排泄的方法，所述方法包含引入引起生物膜形成中所涉及的蛋白质改变的活性的基因修饰。
201.一种增加由微生物进行的铵排泄的方法，所述方法包含引入引起生物膜形成基因改变的表达的基因修饰。
202.一种增加由微生物进行的铵排泄的方法，所述方法包含引入引起AHL生物合成蛋白改变的活性的基因修饰。
203.一种增加由微生物进行的铵排泄的方法，所述方法包含引入引起AHL生物合成基因改变的表达的基因修饰。
204.一种增加由微生物进行的铵排泄的方法，所述方法包含引入引起细胞壁降解酶改变的活性的基因修饰。
205.一种增加由微生物进行的铵排泄的方法，所述方法包含引入引起细胞壁降解酶的基因改变的表达的基因修饰。
206.一种增加由微生物进行的铵排泄的方法，所述方法包含引入引起改变的固氮基因网络的基因修饰。
207.一种增加由微生物进行的铵排泄的方法，所述方法包含引入引起改变的氮同化基因网络的基因修饰。
208.一种增加由微生物进行的铵排泄的方法，所述方法包含将基因修饰引入选自由以下组成的组中的基因：rpoE、rseA、cysP、cysZ、cysK、cysT、cysW、cysA、sbp、cysZK操纵子、cysPTWA操纵子、modE、modB、modA、modEB操纵子、modEBA操纵子、exbA、exbB、tonB、exbAB操纵子、isyhfA、yusV、sbnA、yfiZ、fiu、fur、glgA、NifA、nifH、nifD、nifK、grxA、grxB、grxC、grxD、trxA、trxC、tpx、grxABCD操纵子、cydABX操纵子、cydAB操纵子cydX、cydA、cyddB、glbN、fixNOPQ、fixN、fixO、foxP、fixQ、asnB、asnA、glnL、尿苷酰基转移酶、amtB、glnK、GDH以及glnD。
209.一种提高微生物在根际中的存活率的方法，所述方法包含引入引起根附着中所涉及的蛋白质改变的活性的基因修饰。
210.一种提高微生物在根际中的存活率的方法，所述方法包含引入引起根附着中所涉及的蛋白质的基因改变的表达的基因修饰。
211.一种提高微生物在根际中的存活率的方法，所述方法包含引入引起钼转运蛋白改变的活性的基因修饰。
212.一种提高微生物在根际中的存活率的方法，所述方法包含引入引起钼转运基因改变的表达的基因修饰。
213.一种提高微生物在根际中的存活率的方法，所述方法包含引入引起铁转运蛋白改变的活性的基因修饰。
214.一种提高微生物在根际中的存活率的方法，所述方法包含引入引起铁转运基因改变的表达的基因修饰。
215.一种提高微生物在根际中的存活率的方法，所述方法包含引入引起改变的铁载体生物合成的基因修饰。
216.一种提高微生物在根际中的存活率的方法，所述方法包含引入引起控制铁载体生物合成的基因改变的表达的基因修饰。
217.一种提高微生物在根际中的存活率的方法，所述方法包含引入引起反应性氧物种清除子改变的活性的基因修饰。
218.一种提高微生物在根际中的存活率的方法，所述方法包含引入引起反应性氧物种清除基因改变的表达的基因修饰。
219.一种提高微生物在根际中的存活率的方法，所述方法包含引入引起群体信号传导中所涉及的蛋白质改变的活性的基因修饰。
220.一种提高微生物在根际中的存活率的方法，所述方法包含引入引起群体信号传导基因改变的表达的基因修饰。
221.一种提高微生物在根际中的存活率的方法，所述方法包含引入引起凝集素改变的活性的基因修饰。
222.一种提高微生物在根际中的存活率的方法，所述方法包含引入引起凝集素改变的表达的基因修饰。
223.一种提高微生物在根际中的存活率的方法，所述方法包含引入引起生物膜形成中所涉及的蛋白质改变的活性的基因修饰。
224.一种提高微生物在根际中的存活率的方法，所述方法包含引入引起生物膜形成基因改变的表达的基因修饰。
225.一种提高微生物在根际中的存活率的方法，所述方法包含引入引起AHL生物合成蛋白改变的活性的基因修饰。
226.一种提高微生物在根际中的存活率的方法，所述方法包含引入引起AHL生物合成基因改变的表达的基因修饰。
227.一种提高微生物在根际中的存活率的方法，所述方法包含引入引起细胞壁降解酶改变的活性的基因修饰。
228.一种提高微生物在根际中的存活率的方法，所述方法包含引入引起细胞壁降解酶的基因改变的表达的基因修饰。
229.一种提高微生物在根际中的存活率的方法，所述方法包含引入引起改变的固氮基因网络的基因修饰。
230.一种提高微生物在根际中的存活率的方法，所述方法包含引入引起改变的氮同化基因网络的基因修饰。
231.一种提高微生物在根际中的存活率的方法，所述方法包含将基因修饰引入选自由以下组成的组中的基因：fhaB、fhaC、yjbE、pssM、otsA、trey、smZ、lapA、phoB、phoR、MucA以及pehA。

Claims (10)

1.一种基因工程菌，其包含glnD中的修饰，其中所述修饰选自由以下组成的组：缺失整个基因、缺失大体上整个基因、缺失ACT域、缺失ACT域的超过50％、使ACT域失活以及使UT酶域失活。
2.一种基因工程菌，其包含glnA中的修饰，所述修饰引起glnA的表达或活性改变。
3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其中所述修饰引起glnA的表达降低。
4.根据权利要求2所述的基因工程菌，其中所述修饰包含用具有较低活性的启动子置换glnA的天然启动子。
5.根据权利要求2所述的基因工程菌，其中所述修饰包含用选自由以下组成的组的启动子置换glnA的天然启动子：glnB启动子、glnD启动子以及glnE启动子。
6.一种基因工程菌，其包含glnA中的修饰，所述修饰引起glnA的表达或活性降低。
7.一种基因工程菌，其包含rpoN表达的改变。
8.根据权利要求7所述的基因工程菌，其中所述基因工程菌的rpoN表达提高。
9.根据权利要求8所述的基因工程菌，其中所述基因工程菌的rpoN表达提高。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的基因工程菌，其中所述基因工程菌是基因工程固氮细菌。
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