ES2830251T3

ES2830251T3 - Administración de proteínas basada en bacterias

Info

Publication number: ES2830251T3
Application number: ES16825704T
Authority: ES
Inventors: Simon Ittig; Marlise Amstutz; Christoph Kasper
Original assignee: Universitaet Basel
Current assignee: Universitaet Basel
Priority date: 2015-11-19
Filing date: 2016-11-17
Publication date: 2021-06-03
Anticipated expiration: 2036-11-17
Also published as: IL259050A; JP2019500027A; EP3377634A1; HUE051184T2; CA3005380A1; IL259050B2; HK1256138A1; KR20180081798A; WO2017085235A1; SI3377634T1; DK3377634T3; EP3377634B1; BR112018009782A2; EA201890914A1; HRP20201792T1; PL3377634T3; RS61046B1; CY1123654T1; ZA201803901B; AU2016355975B2

Abstract

Una cepa bacteriana Gram negativa recombinante transformada con un vector que comprende en la dirección 5' a 3': un promotor; una primera secuencia de ADN que codifica una señal de administración de una proteína efectora de T3SS bacteriano, unida operativamente a dicho promotor; y una segunda secuencia de ADN que codifica dominios repetidos de una proteína heteróloga, en donde los dominios repetidos de una proteína heteróloga comprenden una proteína de fusión que consiste en varias repeticiones de un dominio de una proteína heteróloga, o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes, en donde los dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes comprenden una proteína de fusión que consiste en una o varias repeticiones de al menos dos dominios de proteínas heterólogas diferentes fusionados en marco al extremo 3' de dicha primera secuencia de ADN, en donde las proteínas heterólogas son proteínas implicadas en la apoptosis o en la regulación de la apoptosis, y en donde la señal de administración de la proteína efectora de T3SS bacteriano codificada por la primera secuencia de ADN comprende la proteína efectora YopE o un fragmento N-terminal de la misma o la proteína efectora SopE o SteA o un fragmento N-terminal de la misma.

Description

d e s c r ip c ió n

Administración de proteínas basada en bacterias

Campo de la invención

La presente invención se refiere a cepas bacterianas Gram negativas recombinantes y al uso de las mismas para la administración de dominios repetidos de una proteína heteróloga o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes en células eucariotas.

Antecedentes de la invención

Las técnicas de transfección transitoria se han aplicado en la investigación de la biología celular durante muchos años para abordar las funciones de las proteínas. Estos métodos generalmente dan como resultado una sobrerrepresentación masiva de la proteína en estudio, lo que podría conducir a modelos de señalización demasiado simplificados. Para las proteínas que controlan los procesos de señalización de corta duración, la proteína de interés está presente durante mucho más tiempo que el evento de señalización que controla. Se usó un armazón de aptámero peptídico para anclar y presentar dominios BH3 de p. ej. mediador de la muerte celular que interactúa con Bcl-2 (Bim) con el fin de estudiar los dominios BH3 in vivo [88]. También se usó una proteína miembro de la familia Bcl-2 para producir una proteína de fusión que incluye un resto de proteína de unión al receptor de interleuquina-4 unido a un resto proteico de la familia Bcl-2 proapoptótica [89]. Aún más, la sobreexpresión transitoria basada en la transfección de ADN conduce a una población celular heterogénea y no sincronizada, lo que complica los estudios funcionales y obstaculiza los enfoques ómicos. Además de esto, el aumento de escala de dichos ensayos a una escala mayor es muy costoso. Algunos de los puntos mencionados anteriormente están cubiertos por las técnicas existentes como la microinyección o proteofección de proteínas purificadas, la estrategia de translocación inducible para dirigir rápidamente a las pequeñas GTPasas nacidas de plásmidos a la membrana celular o la adición de proteínas purificadas fusionadas con toxinas bacterianas permeables a las células. Pero todas estas técnicas requieren mucho tiempo y son engorrosas y, hasta donde sabemos, ninguna cumple todos los criterios mencionados.

Las bacterias han desarrollado diferentes mecanismos para inyectar proteínas directamente en las células diana [1]. El sistema de secreción de tipo III (T3SS) usado por bacterias como Yersinia, Shigella y Salmonella [2] funciona como una nano-jeringa que inyecta las denominadas proteínas efectoras bacterianas en las células huésped. Las proteínas bacterianas que se secretan a través del T3SS, llamadas efectores, albergan una señal de secreción N-terminal corta [3]. Dentro de las bacterias, algunos efectores están unidos por chaperonas. Las chaperonas pueden enmascarar dominios tóxicos, contribuyen a la exposición de la señal de secreción y mantienen los sustratos en una conformación competente para la secreción, facilitando así la secreción. Tras la inducción de la secreción, una ATPasa adyacente al T3SS elimina las chaperonas y los efectores viajan desplegados o sólo parcialmente plegados a través de la aguja, y se repliegan una vez en el citoplasma del huésped.

El T3S se ha aprovechado para administrar péptidos y proteínas híbridos a las células diana. Se han administrado efectores de T3SS bacterianos heterólogos en el caso en el que la bacteria en estudio sea difícilmente accesible por la genética (como Chlamydia trachomatis). A menudo, se fusionaron proteínas informadoras con posibles señales de secreción de T3SS para estudiar los requisitos para la administración de proteínas dependiente de T3SS, tales como la adenilato ciclasa de Bordetella pertussis, DHFR murina o una etiqueta susceptible a fosforilación. La administración de péptidos se realizó principalmente con el objetivo de la vacunación. Esto incluye epítopos virales, epítopos bacterianos (listeriolisina O), así como péptidos que representan epítopos de células cancerosas humanas. Para inmunizar ratones se han utilizado minicélulas, que son partículas acromosómicas, es decir, que no son bacterias vivas que se replican, para administrar un antígeno in vitro e in vivo, que porta una señal de administración de SopE fusionada con 16 aminoácidos del antígeno OVA [90]. Se ha descrito que Ysc T3SS de Yersinia pseudotuberculosis es capaz de translocar la proteína efectora natural YopJ y YopH en fagosomas de macrófagos, incluso después de la fagocitosis [91]. En pocos casos se han administrado proteínas eucariotas funcionales para modular la célula huésped, como se hace con nanocuerpos [4], proteínas nucleares (Cre-recombinasa, MyoD) [5,6] o Il10 e IL1ra [7]. En un caso, se describe la incubación de un una línea celular deficiente en p67phox con Pseudomonas aeruginosa que porta un plásmido que comprende una proteína híbrida ExoS-p67phox [92]. En un caso adicional, se describe el uso de Salmonella typhimurium SL1344 y SptP como señal de administración para la expresión de proteínas de seda [93]. También se ha descrito la secreción de proteínas usando un sistema de secreción de Tipo III en el cultivo celular o en células vegetales usando cepas bacterianas de Escherichia coli y Erwinia amylovara [94]. Ninguno de los sistemas mencionados anteriormente permite la administración de una única proteína ya que en cada caso todavía se codifican una o múltiples proteínas efectoras endógenas. Además, los vectores usados no se han diseñado de manera que permitan la clonación simple de otros fragmentos de ADN que codifican proteínas de elección, lo que dificulta la amplia aplicación del sistema. Sorprendentemente, se ha descubierto que la administración de dominios repetidos de proteínas heterólogas o combinaciones de dominios de proteínas heterólogas diferentes a células eucariotas aumenta el impacto sobre una ruta celular deseada.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere en general a cepas bacterianas Gram negativas recombinantes y al uso de las mismas para la administración de dominios repetidos de una proteína heteróloga o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes en células eucariotas. La presente invención proporciona cepas de bacterias Gram negativas y el uso de las mismas, que permite la translocación de dominios repetidos de una proteína heteróloga o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes tales como varios efectores de tipo III, pero también de efectores de tipo IV, proteínas virales y, lo más importante, proteínas eucariotas funcionales. Se proporcionan medios para el seguimiento fluorescente de la administración, para la relocalización al núcleo y, en particular, para la eliminación del apéndice bacteriano después de la administración a la célula huésped. El sistema basado en T3SS presentado da como resultado una administración escalable, rápida, sincronizada, homogénea y sintonizable de dominios repetidos de una proteína heteróloga o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes de interés. El sistema de administración de la presente invención es adecuado para inyectar dominios repetidos de una proteína eucariota o dos o más dominios de proteínas eucariotas diferentes en animales vivos y puede usarse con fines terapéuticos.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una cepa bacteriana Gram-negativa recombinante transformada con un vector que comprende en la dirección 5' a 3':

un promotor;

una primera secuencia de ADN que codifica una señal de administración de una proteína efectora de T3SS bacteriana, unida operativamente a dicho promotor; y

una segunda secuencia de ADN que codifica dominios repetidos de una proteína heteróloga, en donde los dominios repetidos de una proteína heteróloga comprenden una proteína de fusión que consiste en varias repeticiones de un dominio de una proteína heteróloga, o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes, en donde los dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes comprenden una proteína de fusión que consiste en una o varias repeticiones de al menos dos dominios de proteínas heterólogas diferentes fusionadas en marco al extremo 3' de dicha primera secuencia de ADN, en donde las proteínas heterólogas son proteínas implicadas en la apoptosis o en la regulación de la apoptosis, y en donde la señal de administración de la proteína efectora de T3SS bacteriano codificada por la primera secuencia de ADN comprende la proteína efectora YopE o un fragmento N-terminal de la misma o la la proteína efectora SopE o SteA o un fragmento N-terminal de la misma.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una cepa bacteriana Gram negativa recombinante transformada con un vector que comprende en la dirección 5' a 3':

una primera secuencia de ADN que codifica una señal de administración o un fragmento de la misma de una proteína efectora bacteriana; y

una segunda secuencia de ADN que codifica dominios repetidos de una proteína heteróloga, en donde los dominios repetidos de una proteína heteróloga comprenden una proteína de fusión que consiste en varias repeticiones de un dominio de una proteína heteróloga, o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes, en donde los dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes comprenden una proteína de fusión que consiste en una o varias repeticiones de al menos dos dominios de proteínas heterólogas diferentes fusionadas en marco al extremo 3' de dicha primera secuencia de ADN, en donde las proteínas heterólogas son proteínas implicadas en la apoptosis o en la regulación de la apoptosis, y

en donde la señal de administración de la proteína efectora bacteriana T3SS codificada por la primera secuencia de ADN comprende la proteína efectora YopE o un fragmento N-terminal de la misma o la proteína efectora SopE o SteA o un fragmento N-terminal de la misma.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un vector que comprende en la dirección 5' a 3':

una primera secuencia de ADN que codifica una señal de administración o un fragmento de la misma de una proteína efectora de T3SS bacteriana, en donde la señal de administración de la proteína efectora de T3SS bacteriana comprende la proteína efectora YopE o un fragmento N-terminal de la misma o la proteína efectora SopE o SteA o un fragmento N-terminal de la misma; y una segunda secuencia de ADN que codifica dominios repetidos de una proteína heteróloga, en donde los dominios repetidos de una proteína heteróloga comprenden una proteína de fusión que consiste en varias repeticiones de un dominio de una proteína heteróloga, o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes, en donde los dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes comprenden una proteína de fusión que consiste en una o varias repeticiones de al menos dos dominios de proteínas heterólogas diferentes, fusionados en marco al extremo 3' de dicha primera secuencia de ADN, en donde las proteínas heterólogas son proteínas implicadas en la apoptosis o en la regulación de la apoptosis.

un promotor;

una primera secuencia de ADN que codifica una señal de administración de una proteína efectora de T3SS bacteriana, operativamente unida a dicho promotor, en donde la señal de administración de la proteína efectora de T3SS bacteriana comprende la proteína efectora YopE o un fragmento N-terminal de la misma o la proteína efectora SopE o SteA o un fragmento N-terminal de la misma;

una segunda secuencia de ADN que codifica dominios repetidos de una proteína heteróloga, en donde los dominios repetidos de una proteína heteróloga comprenden una proteína de fusión que consiste en varias repeticiones de un dominio de una proteína heteróloga, o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes, en donde los dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes comprenden una proteína de fusión que consiste en una o varias repeticiones de al menos dos dominios de proteínas heterólogas diferentes fusionados en marco al extremo 3' de dicha primera secuencia de ADN,

en donde las proteínas heterólogas son proteínas implicadas en la apoptosis o en la regulación de la apoptosis.

La presente invención se refiere además a un método para administrar dominios repetidos de una proteína heteróloga o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes en una célula eucariota que comprende las siguientes etapas:

i) cultivar una cepa bacteriana Gram negativa; y

ii) poner en contacto una célula eucariota con la cepa bacteriana Gram negativa de i) en donde se expresa una proteína de fusión que comprende una señal de administración de una proteína efectora de T3SS bacteriano y los dominios repetidos de una proteína heteróloga o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes por la cepa bacteriana Gram negativa y se transloca en la célula eucariota.

La presente solicitud se refiere además a un método para administrar dominios repetidos de una proteína heteróloga o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes en una célula eucariota que comprende las siguientes etapas:

i) cultivar una cepa bacteriana Gram negativa;

ii) poner en contacto una célula eucariota con la cepa bacteriana Gram negativa de i) en donde se expresa una proteína de fusión que comprende una señal de administración de una proteína efectora de T3SS bacteriano y los dominios repetidos de una proteína heteróloga o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes por la cepa bacteriana Gram negativa y se transloca en la célula eucariota; y

iii) escindir la proteína de fusión de modo que los dominios repetidos de una proteína heteróloga o los dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes se escinden de la señal de administración de la proteína efectora de T3SS bacteriano.

En un aspecto adicional, la presente solicitud se refiere a una biblioteca de cepas bacterianas Gram negativas, en donde los dominios repetidos de una proteína heteróloga o los dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes codificadas por la segunda secuencia de ADN del vector de expresión de las cepas bacterianas Gram negativas son dominios de una proteína humana o murina y, en donde cada dominio de una proteína humana o murina expresada por una cepa bacteriana Gram negativa es diferente en la secuencia de aminoácidos.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1: Caracterización de la administración de proteínas por T3SS. (A) Representación esquemática de la secreción de proteínas dependiente de T3SS en el medio circundante (secreción in vitro) (lado izquierdo) o en células eucariotas (lado derecho). I: muestra el sistema de secreción de tipo 3. II indica proteínas secretadas en el medio circundante, III proteínas translocadas a través de la membrana en el citosol de células eucariotas (VII). VI muestra un tramo de las dos membranas bacterianas en las que se inserta el T3SS y el citosol bacteriano subyacente. IV es una proteína de fusión unida al fragmento N-terminal YopE1-138 (V) (B) Secreción in vitro de I: Y. enterocolitica E40 de tipo salvaje, II: Y. enterocolitica AHOPEMT asdo III: Y. enterocolitica AHOPEMT asd + pBadSi_2 según lo revelado por transferencia Western en lisados bacterianos totales (IV) y sobrenadantes de cultivos precipitados (V) usando un anticuerpo anti-YopE.

Fig. 2: Caracterización de la administración de proteínas por T3SS en células epiteliales. (A) Tinción de inmunofluorescencia anti-Myc en células HeLa infectadas a una MOI de 100 durante 1 h con I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd o II: Y. enterocolitica AHOPEMT asd + pBad_Si2. (B) Cuantificación de la intensidad de la tinción de inmunofluorescencia anti-Myc de (A) dentro de las células HeLa. Los datos se combinaron de n = 20 sitios, las barras de error indicadas son el error estándar de la media. I: no infectado, II: Y. enterocolitica AHOPEMT asd o III: Y. enterocolitica AHOPEMT asd + pBad_Si2. El eje de las y indica la intensidad de la tinción anti-Myc [unidad arbitraria], el eje de las x indica el tiempo de infección en minutos (C) Cuantificación de la intensidad de la tinción de inmunofluorescencia anti-Myc dentro de las células. Las células HeLa se infectaron durante 1 h con Y. enterocolitica AHOPEMT asd + pBad_Si2 a una MOI indicada en el eje de las x. Los datos se combinaron de n = 20 sitios, las barras de error indicadas son el error estándar de la media. El eje de las y indica la intensidad de la tinción anti-Myc [u.a.].

Fig. 3: Las modificaciones de la administración de proteínas basada en T3SS permiten la localización nuclear de una proteína de fusión YopE1-138 (EGFP). Señal de EGFP en células HeLa infectadas con I: Y. enterocolitica AHOPEMT asdo II: Y. enterocolitica AHOPEMT asdúyopB que porta los plásmidos III: YopEi-i38-EGFP o IV: YopEi-i38-EGFP-NLS a una MOI de 100. La señal de EGFP se muestra en "a", para comparar la localización, los núcleos se tiñeron en "b".

Fig. 4: Las modificaciones de la administración de proteínas basada en T3SS permiten la eliminación del apéndice YopE1-138. Las células HeLa se infectan con dos cepas de Y. enterocolitica al mismo tiempo, lo que se logra mediante el simple mezclado de las dos suspensiones bacterianas. Una cepa administra la proteasa TEV fusionada a YopE1-138, mientras que la otra cepa administra una proteína de interés fusionada con YopE1-138 con un enlazador que contiene un sitio de escisión doble de proteasa TEV. Después de la administración de proteínas a la célula eucariota, la proteasa TEV escindirá el apéndice YopE1-138 de la proteína de interés (A) Células HeLa lisas con digitonina sin infectar (II) o después de la infección (MOI de 100) durante 2 h con I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd y III: pBadSi_2, IV: YopE1-138-2x sitio de escisión de TEV-Flag-INK4C, V: YopE1-138-2x sitio de escisión de TEV-Flag-INK4C y tratamiento adicional toda la noche con proteasa TEV purificada y VI: YopE1-138-2x sitio de escisión de TEV-Flag-INK4C y una segunda cepa YopE1-138-TEV fueron analizadas por transferencia Western anti-INK4C (mostrado en "a") para determinar la presencia de YopE1-138- 2x sitio de escisión de TEV -Flag-INK4C o su forma escindida Flag-INK4C. Como control de carga, se realizó transferencia Western con anti-actina (mostrado en "b"). En un caso (V), las células lisadas se incubaron toda la noche con proteasa TEV purificada. (B) Cuantificación normalizada respecto a actina de la intensidad de la tinción anti-INK4C (mostrada como [u.a.] en el eje de las y) de (A) en el tamaño de YopE1-138 de longitud completa-2x sitio de escisión de TEV-Flag-INK4C, donde la muestra IV se ajusta a 100 %. I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd y IV: YopE1-138-2x sitio de escisión de TEV-Flag-INK4C, V: YopE1-138-2x sitio de escisión de TEV-Flag-INK4C y tratamiento adicional toda la noche con proteasa TEV purificada y VI: YopE1-138-2x sitio de escisión de TEV-Flag-INK4C y una segunda cepa YopE1-138-TEV. Los datos se combinaron de n = 2 experimentos independientes, las barras de error indicadas son el error estándar de la media (C) Células HeLa lisadas con digitonina sin infectar (II) o después de la infección (MOI de 100) durante 2 h con I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd y III: pBadSi_2, IV: YopE1-138-2x sitio de escisión de TEV-ET1-Myc, V: YopE1-138-2x sitio de escisión de TEV-ET1-Myc y tratamiento adicional toda la noche con proteasa TEV purificada y VI: YopE1-138-2x sitio de escisión de TEV-ET1-Myc y una segunda cepa YopE1-138-TEV fueron analizadas por transferencia Western con anti-Myc (mostrado en "a") para determinar la presencia de YopE1-138-2x sitio de escisión de TEV- ET1 -Myc o su forma escindida ET1-Myc. Como control de carga, se realizó transferencia Western con anti-actina (mostrado en "b"). En un caso (V), las células lisadas se incubaron toda la noche con proteasa TEV purificada.

Fig. 5: Administración de proteínas efectoras bacterianas en células eucariotas (A) Las células HeLa se infectaron con I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd que portaba II: pBad_Si2 o III: YopE1-138-SopE a una MOI de 100 durante el tiempo indicado encima de las imágenes (2, 10 o 60 minutos). Después de la fijación, las células se tiñeron para el citoesqueleto de actina (B) Las células HeLa se dejaron sin infectar (II) o se infectaron con I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd que portaba III: YopE1-138-SopE-Myc y en algunos casos se coinfectaron con IV: YopE1-138-SptP a la MOI indicada debajo de la cepa (MOI 50; MOI50:MOI50 o MOI50:MOI100) durante 1 h. Después de la fijación, las células se tiñeron para el citoesqueleto de actina (mostrado en "a") y la presencia de la proteína de fusión YopE1-138-SopE-Myc se siguió mediante tinción con anti-Myc (mostrada en "b").

Fig. 6: Administración de proteínas efectoras bacterianas en células eucariotas (A) Análisis de transferencia Western de fosfo-p38 ("a"), p38 total ("b") y actina ("c") en células HeLa dejadas sin tratar (II) o infectadas durante 75 min con I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd que portaba III: pBad_Si2 o IV: YopE1-138-OspF a una MOI de 100. Las células se estimularon con TNFa durante los últimos 30 minutos de la infección como se indica (+ representa la adición de TNFa, - representa ausencia de tratamiento con TNFa) (B) Fosfo-AkT T308 ("a") y S473 ("b") y análisis de transferencia Western de actina ("c") en células HeLa sin tratar (II) o infectadas durante 22,5 o 45 min (indicado debajo de las transferencias) con I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd que portaba III: pBad_Si2, IV: YopE1-138-SopE o V: YopE1-138-SopB a una MOI de 100 (C) Niveles de AMPc (en fmoles/pocillo que se muestran en el eje de las y) en células HeLa que no se trataron (I) o se infectaron durante 2,5 h con V: Y. enterocolitica AHOPEMT asd + YopE1-138-BepA, VI: Y. enterocolitica AHOPEMT asd + YopE1-138-BepAE305-fin, VII: Y. enterocolitica AHOPEMT asd + YopE1-138-BepGBid o VIII: Y. enterocolitica AHOPEMT asd + pBad_Si2 a una MOI de 100. Se añadió toxina del cólera (CT) durante 1 h como control positivo a las muestras II (1 pg/ml), III (25 pg/ml) o IV (50 pg/ml). Los datos se combinaron de n = 3 experimentos independientes, las barras de error indicadas son el error estándar de la media. El análisis estadístico se realizó utilizando una prueba T de dos colas no apareada (ns indica un cambio no significativo, ** indica un valor de p <0,01, *** indica un valor de p <0,001).

Fig. 7: La administración de tBid humano a células eucariotas induce una apoptosis masiva. (A) Análisis de transferencia Western de caspasa 3 escindida p17 ("a") y actina ("b") en células HeLa sin tratar (II) o infectadas durante 60 min con I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd que portaba III: pBad_Si2, IV: YopE1-138-Bid o V: YopE1-138-t-Bid a una MOI de 100. En algunos casos, las células se trataron con VI: estaurosporina 0,5 pM o VII: estaurosporina 1 pM (B) Células HeLa lisadas con digitonina sin tratar (II) o después de la infección durante 1 h con I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd que portaba III: pBad_Si2, IV: YopE1-138-Bid o V: YopE1-138-t-Bid a una MOI de 100 se analizaron mediante transferencia Western con anti-Bid ("a"), lo que permitió comparar los niveles de Bid endógenos (marcados con una Z) con los niveles de YopE1-138-Bid (marcado con una X) o YopE1-138-tBid (marcado con una Y) translocados. Como control de carga, se realizó transferencia Western con anti-actina (mostrado en "b"). En algunos casos, las células se trataron con VI: estaurosporina 0,5 pM o VII: estaurosporina 1 pM (C) Las células HeLa no se trataron (I) o se infectaron a una MOI de 100 durante 1 h con II: Y. enterocolitica AHOPEMT asd + pBad_Si2, III: Y. enterocolitica AHOPEMT asd + YopEi-138-Bid, IV: Y. enterocolitica AHOPEMT asd + YopEi-i38-tBid. En algunos casos, las células se trataron con V: estaurosporina 0,5 pM o VI: estaurosporina 1 pM. Después de la fijación, las células se tiñeron para el citoesqueleto de actina (gris).

Fig. 8: La administración dependiente de T3SS de BIM de pez cebra induce la apoptosis en embriones de pez cebra. (A) Se infectaron embriones de pez cebra 2 dpf con el EGFP que expresa la cepa control Y. enterocolitica AHOPEMT asd +pBad_Si1 (I) o cepa translocadora zBIM (II: Y. enterocolitica AHOPEMT asd + YopE1-138-zBIM) mediante la inyección de aproximadamente 400 bacterias en la región del rombencéfalo. Después de 5,5 h, los embriones se fijaron, se tiñeron para Caspasa 3 activada (Caspasa 3 escindida, p17; mostrada en "c") y se analizaron para detectar la presencia de bacterias (señal EGFP, mostrada en "b"). Las proyecciones z de máxima intensidad se muestran para imágenes fluorescentes. La proyección z de campo brillante se muestra en "a" (B) Análisis automatizado de imágenes en proyecciones z de máxima intensidad de imágenes registradas en apilamiento z de (A). Brevemente, las bacterias se detectaron a través del canal GFP. Alrededor de cada área de una mancha bacteriana se creó un círculo con un radio de 10 píxeles. Las regiones superpuestas se separaron por igual entre los miembros de conexión. En aquellas áreas que rodean estrechamente a las bacterias, se midió la intensidad de la tinción de Caspasa 3 p17 y se representó en el eje de las y (como [u.a.]). El análisis estadístico se realizó utilizando una prueba de Mann-Whitney (*** indica un valor de p <0,001). Los datos se combinaron de n = 14 para la cepa control Y. enterocolitica AHOPEMT asd + pBad_Si1 (I) o n = 19 para II: animales infectados con Y. enterocolitica AHOPEMT asd + YopE1-138-zBIM, las barras de error indicadas son el error estándar de la media.

Fig. 9: Fosfoproteoma dependiente de tBiD: Se infectaron células HeLa durante 30 min con Y. enterocolitica AHOPEMT asd + YopE1-138-t-Bid a una MOI de 100 y como control con Y. enterocolitica AHOPEMT asd + pBad_Si2. (A) Representación gráfica del fosfoproteoma tBID. Las proteínas que contienen fosfopéptidos que se regularon significativamente de una manera dependiente de tBid (gris) (valor q <0,01), así como las proteínas relacionadas con la apoptosis conocidas (gris oscuro) se representan en una red STRING de interacciones proteína-proteína conocidas y predichas (alta confianza, puntuación 0,7). Solo se representan proteínas con al menos una conexión en STRING. (B) Imágenes confocales de células HeLa infectadas bien con Y. enterocolitica AHOPEMT asd + pBad_Si2 (I) o Y. enterocolitica AHOPEMT asd + YopE1-138-t-Bid (II) revela la inducción de un fenotipo apoptótico tras la administración de tBid. Las células se tiñeron para los núcleos con HoechsT ("a"), para F-actina con faloidina ("b"), para tubulina con un anticuerpo anti-tubulina ("c") y para mitocondrias con mitotracker ("d)". La barra de escala representa 40 pm.

Fig. 10: Descripción de la caja de herramientas de administración basada en secreciones de tipo III. (A) Mapas vectoriales de los plásmidos de clonación pBad_Si1 y pBad_Si2 utilizados para generar construcciones de fusión con YopE1-138. La chaperona SycE y la fusión YopE1-138 están bajo el promotor nativo de Y. enterocolitica. Los dos plásmidos solo difieren en la presencia de una EGFP inducible por arabinosa presente en pBad_Si1 (B) Sitio de clonación múltiple directamente después del fragmento yopE1-138 en los plásmidos pBad_Si1 y pBad_Si2.

Fig. 11: Caracterización de la administración de proteínas por T3SS en varias líneas celulares. Tinción de inmunofluorescencia con anti-Myc en fibroblastos Swiss 3T3 ("a"), células JurkaT ("b") y células HUVEC ("c") sin tratar (II) o infectadas con Y. enterocolitica AHOPEMT asd + pBad_Si2 (I) a la MOI indicada encima de las imágenes (MOI 25, 50, 100, 200 y 400 para HUVEC) durante 1 h.

Fig. 12: Dependencia de T3SS de la administración de proteínas efectoras bacterianas en células eucariotas. Se analizaron células HeLa lisadas con digitonina después de la infección a una MOI de 100 durante el tiempo indicado encima de las transferencias (0, 5, 15, 10, 60 y 120 minutos) con Y. enterocolitica AHOPEMT asd AyopB + YopE1-138-SopE-Myc (I) o Y. enterocolitica AHOPEMT asd + YopE1-138-SopE-Myc (II) mediante transferencia Western con anti-Myc. El tamaño correspondiente a YopE1-138-SopE-Myc está marcado con "a", mientras que el tamaño de la proteína c-Myc endógena está marcado con "b".

Fig. 13 y 14: Secreción dependiente de T3SS de varias otras proteínas en el sobrenadante del cultivo. Experimento de secreción in vitro de I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd + YopE1-138 fusionado a la proteína como se indica. El contenido de proteína de los lisados bacterianos totales ("A") y los sobrenadantes de cultivos precipitados ("B") se analizó mediante transferencia Western usando un anticuerpo anti-YopE. Los números escritos indican el peso molecular en kDa a la altura correspondiente.

Figs. 15A a N: Cepas de Y. enterocolitica y S. enterica utilizadas en este estudio. Lista de cepas de Y. enterocolitica y S. enterica utilizadas en este estudio que proporciona información sobre cepas de fondo, plásmidos y proteínas para la administración dependiente de T3SS codificada en los plásmidos correspondientes. Además, se proporciona información sobre los oligonucleótidos utilizados para la construcción del plásmido correspondiente, el plásmido central y las resistencias a los antibióticos.

Fig. 16: La administración de tBid murino, Bid BH3 murino y Bax BH3 murino en células B16F10 induce una apoptosis masiva. Células B16F10 no infectadas (I) o después de la infección (MOI de 50) durante 2,5 h con Y. enterocolitica AHOPEMT asd y II: pBadSi_2, III: YopE1-138-Y. enterocolitica con tBid murino con codones optimizados, IV: YopE1-138-Y. enterocolitica con Bid BH3 murino con codones optimizados o V: YopE1-138-Y. enterocolitica con Bax BH3 murino con codones optimizados. Después de la fijación, las células se tiñeron para el citoesqueleto de actina y los núcleos (ambos en gris).

Fig. 17: La administración de tBid murino, Bid BH3 murino y Bax BH3 murino en células D2A1 induce una apoptosis masiva. Células D2A1 no infectadas (I) o después de la infección (MOI de 50) durante 2,5 h con Y. enterocolitica AHOPEMT asd y II: pBadSi_2, III: YopE1-138-Y'. enterocolitica con tBid murino con codones optimizados, IV: YopE1-138-Y enterocolitica con Bid BH3 murino con codones optimizados o V: YopE1-138-Y'. enterocolitica con Bax BH3 murino con codones optimizados. Después de la fijación, las células se tiñeron para el citoesqueleto de actina y los núcleos (ambos en gris).

Fig. 18: La administración de tBid murino, Bid BH3 murino y Bax BH3 murino en células HeLa induce una apoptosis masiva. Células HeLa no infectadas (I) o después de la infección (MOI de 50) durante 2,5 h con Y. enterocolitica AHOPEMT asd y II: pBadSi_2, III: YopE1-138-Y'. enterocolitica con tBid murino con codones optimizados, IV: YopE1-138-Y. enterocolitica con Bid BH3 murino con codones optimizados o V: YopE1-138-Y'. enterocolitica con Bax BH3 murino con codones optimizados. Después de la fijación, las células se tiñeron para el citoesqueleto de actina y los núcleos (ambos en gris).

Fig. 19: La administración de tBid murino, Bid BH3 murino y Bax BH3 murino en células 4T1 induce una apoptosis masiva. Células 4T1 no infectadas (I) o después de la infección (MOI de 50) durante 2,5 h con Y. enterocolitica AHOPEMT asd y II: pBadSi_2, III: YopE1-138-Y. enterocolitica con tBid murino con codones optimizados, IV: YopE1-138-Y. enterocolitica con Bid BH3 murino con codones optimizados o V: YopE1-138-Y'. enterocolitica con Bax BH3 murino con codones optimizados. Después de la fijación, las células se tiñeron para el citoesqueleto de actina y los núcleos (ambos en gris).

Fig. 20: La administración de tBid murino por S. enterica cultivado en condiciones de inducción de SPI-1 T3SS en células eucariotas induce apoptosis. Análisis de transferencia western de Caspasa 3 p17 escindida en células HeLa sin tratar (I) o infectadas durante 4 h con III: S. enterica aroA que porta IV: SteA1-20-t-Bid, V: SteAFlI-Bid, VI: SopE1-81-t-Bid o VII: SopE1-105-t-Bid a una MOI de 100. Para este experimento, todas las cepas de S. enterica aroA se cultivaron en condiciones de inducción de SPI-1 T3SS. En algunos casos, las células se trataron con II: estaurosporina 1 pM. Los números escritos indican el peso molecular en kDa a la altura correspondiente.

Fig. 21: La administración de tBid murino por S. enterica cultivado en condiciones de inducción de SPI-2 T3SS en células eucariotas induce apoptosis. Análisis de transferencia western de Caspasa 3 p17 escindida en células HeLa sin tratar (I) o infectadas durante 4 h con III: S. enterica aroA que porta IV: SteA1-20-t-Bid, V: SteAFL-Bid, VI: SopE1-81-t-Bid o VII: SopE1-105-t-Bid a una MOI de 100. Para este experimento, todas las cepas de S. enterica aroA se cultivaron en condiciones de inducción de SPI-2 T3SS. En algunos casos, las células se trataron con II: estaurosporina 1 pM. Los números escritos indican el peso molecular en kDa a la altura correspondiente.

Fig. 22: La secreción dependiente de T3SS de S. enterica de diversas proteínas del ciclo celular en el sobrenadante del cultivo. Experimento de secreción in vitro de S. enterica aroA + ya sea SteAFL (I, III, V, VII) o SopE1-105 (II, IV, VI, VIII) fusionados con las proteínas que se enumeran a continuación. I y II: Ink4a-MycHis; III y IV: Ink4c-MycHis; V y VI: Mad2-MycHis; VII y VIII: Cdkl-MycHis. El contenido de proteína de los sobrenadantes de cultivos precipitados ("A") y los lisados bacterianos totales ("B") se analizó mediante transferencia Western usando un anticuerpo anti-myc. Los números escritos indican el peso molecular en kDa a la altura correspondiente.

Fig. 23: Secreción dependiente de T3SS de varios péptidos conocidos que interfieren con el ciclo celular en el sobrenadante del cultivo. Experimento de secreción in vitro de I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd + pBad_Si2. II-VII: Y. enterocolitica AHOPEMT asd + YopE1-138 fusionado a los péptidos que se enumeran a continuación: II: Ink4A84-103; III: p107/RBL1657-662; IV: p21141-160D149A; V: p21145-160D149A; VI: p2117-33; VII: ciclina D2139-147. El contenido de proteína de los sobrenadantes de cultivos precipitados ("A") y los lisados bacterianos totales ("B") se analizó mediante transferencia Western usando un anticuerpo anti-YopE. Los números escritos indican el peso molecular en kDa a la altura correspondiente.

Fig. 24: La fusión de la proteína administrada por T3SS a ubiquitina permite la eliminación del apéndice YopE1-138. Las células HeLa se infectan con una cepa que administra una proteína de interés fusionada con YopE1-138 con una ubiquitina fusionada directamente (YopE1-138-Ubi). Después de la administración de proteínas a la célula eucariota, las proteasas endógenas específicas de ubiquitina escindirán el apéndice YopE1-138-Ubi de la proteína de interés. Las células HeLa lisadas con digitonina no infectadas (I) o después de la infección (MOI de 100) durante 1 h con II: Y. enterocolitica AHOPEMT asd + YopE1-138-Flag-INK4C-MycHis o III: YopE1-138-Flag-Ubiquitina-INK4C-MycHis fueron analizadas por transferencia Western con anti-INK4C para la presencia de IV: YopE1-138-Flag-Ubiquitina-INK4C-MycHis o V: YopE1-138-Flag-INK4C-MycHis, la forma escindida VI: INK4C-MycHis y VII: el INK4C endógeno.

Fig. 25: Representación esquemática de proteínas heterólogas y dominios de las mismas que se administrarán a través del T3SS bacteriano. I: proteína humana/murina de longitud completa con dominios coloreados en varias escalas de grises, II: proteína humana/murina truncada con dominios coloreados en varias escalas de grises, III: resto/dominio de proteína humana/murina de longitud completa solamente, IV: resto/dominio solo repetido (izquierda) o combinación de dos restos/dominios diferentes de proteína humana/murina de longitud completa (derecha).

Fig. 26: La administración de dominios BH3 de tBid murino y Bax murino en células eucariotas y las repeticiones fusionadas de los mismos inducen apoptosis en células cancerosas. Se infectaron células de melanoma murino B16F10 a una MOI de 5, 10, 25 y 50 (de izquierda a derecha en cada condición) de las bacterias correspondientes como se indica durante 4 h. El efecto sobre la viabilidad celular se evaluó contando el número de células mediante el recuento nuclear. I: recuento nuclear. II: Y. enterocolitica AHOPEMT asd + pBad_Si2, III: Y. enterocolitica AHOPEMT asd + YopE1-138-Bid-BH3, IV: Y. enterocolitica AHOPEMT asd + YopE1-138-(Bid-BH3)2 y V: Y. enterocolitica AHOPEMT asd + YopE1-138-(Bid-BH3)-(Bax-BH3). Los núcleos se tiñeron con Hoechst. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio automático y el número de células se determinó automáticamente utilizando CellProfiler.

Fig. 27: La administración de dominios BH3 de tBid murino y Bax murino en células eucariotas y las repeticiones fusionadas de los mismos inducen apoptosis en células cancerosas. Se infectaron células de cáncer de mama murino 4T1 a una MOI de 5, 10, 25 y 50 (de izquierda a derecha en cada condición) de las bacterias correspondientes como se indica durante 4 h. El efecto sobre la viabilidad celular se evaluó contando el número de células mediante el recuento nuclear. I: recuento nuclear. II: Y. enterocolitica AHOPEMT asd + pBad_Si2, III: Y. enterocolitica AHOPEMT asd + YopE1-138-Bid-BH3, IV: Y. enterocolitica AHOPEMT asd + YopE1-138-(Bid-BH3)2 y V: Y. enterocolitica AHOPEMT asd + YopE1-138-(Bid-BH3)-(Bax-BH3). Los núcleos se tiñeron con Hoechst. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio automático y el número de células se determinó automáticamente utilizando CellProfiler.

Fig. 28: Administración de proteínas proapoptóticas aumentadas sintéticas. La administración de proteínas sintéticas individuales que consisten en repeticiones únicas o en tándem de dominios BH3 que se originan a partir de proteínas proapoptóticas t-BID o BAX conduce a una inducción de apoptosis aumentada en células cancerosas 4T1 y B16F10. Se infectaron células 4T1 (I) o B16F10 (II) con Y. enterocolitica AyopHOPEMT codificación en pBad-MycHisA IV: YopE1-138-tBID BH3 con dominio extendido, V: YopE1-138-enlazador-tBID BH3, VI: YopE1-138-tBID BH3, VII: YopE1-138-(tBID BH3)2, VIII: YopE1-138-tBID BH3-BAX BH3 o IX: YopE1-138-BAX BH3-tBID BH3. Se realizó una titulación de las bacterias añadidas a las células (MOI) para cada cepa, se determinaron los recuentos de células y se calculó la CI50 usando regresión no lineal. Se indica la CI50 MOI (III).

Fig. 29: Inducción de apoptosis por proteínas proapoptóticas sintéticas codificadas por pYV. La administración de una repetición única o en tándem del dominio BID BH3 codificado en el pYV conduce a la inducción de la apoptosis en células cancerosas 4T1 y B16F10. Se infectaron células 4T1 (I) o B16F10 (II) con Y. enterocolitica AHOPEMT + IV: pYV-YopE1-138-BH3-Bid, o V: pYV-YopE1-138-(BH3-Bid)2 o VI: con Y. enterocolitica AHOPEMTpBad-MycHisA-YopE1-138-(BH3-Bid)2 durante 3 horas. Se realizó una titulación de las bacterias añadidas a las células (MOI) para cada cepa, se determinaron los recuentos de células y se calculó la CI50 (III) usando regresión no lineal.

Fig. 30: Colonización tumoral de Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,Tinyectado i.v. en el modelo de aloinjerto de cáncer de mama 4T1. Los recuentos de bacterias en los tumores se indican como unidades formadoras de colonias (CFU) por gramo de tejido (III). Los recuentos se evaluaron en los tumores el día 8 (I) y el día 14 (II) después de la infección. Cada punto representa un ratón individual. La línea discontinua horizontal indica el límite de detección.

Fig. 31: Biodistribución de Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T inyectado i.v. en el modelo de aloinjerto de cáncer de mama 4T1. Los recuentos de bacterias en sangre (I), bazo (II), hígado (III), pulmón (IV) y tumor (V) se indican como unidades formadoras de colonias (CFU) por gramo de tejido o por ml de sangre (VI). Los recuentos se evaluaron el día 14 después de la infección. Cada punto representa un ratón individual. La línea discontinua horizontal indica el límite de detección. * indica un ratón con grandes metástasis en el pulmón.

Fig. 32: Retraso de la progresión tumoral en ratones Balb/C de tipo salvaje con aloinjerto s.c. de células de cáncer de mama 4T1. A ratones Balb/C de tipo salvaje sometidos a aloinjerto s.c. de células de cáncer de mama 4T1 se les inyectó i.v. I: PBS o II: 1*107 Y. enterocolitica dHOPEMT pYV-YopE1-138(BH3-Bid)2, una vez que el tumor alcanzó un tamaño de 150-250 mm3. El día de la inyección i.v. de bacterias se definió como el día 0. Se midió el volumen del tumor durante los días siguientes (III; día 0 a día 9 después de la inyección i.v. de bacterias) con calibradores. El volumen relativo del tumor, normalizado respecto al volumen del tumor en el día 0, se indica (IV) como mm3. La media se indica con símbolos, las barras de error representadas muestran el error estándar de la media. La significancia estadística se mide con un ANOVA de 2 vías, * indica un valor de p <0,05, ** un valor de p <0,005.

Fig. 33: Progresión del tumor en ratones Balb/C de tipo salvaje sometidos a aloinjerto s.c. de células de cáncer de mama 4T1. A ratones Balb/C de tipo salvaje sometidos a aloinjerto s.c. de células de cáncer de mama 4T1 se les inyectó i.v. I: PBS o II: 1*107 Y. enterocolitica dHOPEMT, una vez que el tumor alcanzó un tamaño de 150-250 mm3. El día de la inyección i.v. de bacterias se definió como el día 0. Se midió el volumen del tumor durante los días siguientes (III; día 0 a día 9 después de la inyección i.v. de bacterias) con calibradores. El volumen relativo del tumor, normalizado respecto al volumen del tumor en el día 0, se indica (IV) como mm3. La media se indica con símbolos, las barras de error representadas muestran el error estándar de la media.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona cepas bacterianas Gram negativas recombinantes y el uso de las mismas para la administración de dominios repetidos de una proteína heteróloga o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes en células eucariotas.

Para el propósito de interpretar esta memoria descriptiva, se aplicarán las siguientes definiciones y, cuando sea apropiado, los términos utilizados en singular también incluirán el plural y viceversa. Debe entenderse que la terminología utilizada en la presente memoria tiene el propósito de describir realizaciones particulares solamente y no pretende ser limitante.

El término "cepa bacteriana Gram negativa" tal y como se usa en la presente memoria incluye las siguientes bacterias: Aeromonas salmonicida, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii, Anaeromyxobacter dehalogenans, Bordetella bronchiseptica, Bordetella parapertussis, Bordetella pertussis, Bradyrhizobium japonicum, Burkholderia cenocepacia, Burkholderia cepacia, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Chlamydia muridarum, Chlamydia trachmoatis, Chlamydophila abortus, Chlamydophila pneumoniae, Chromobacterium violaceum, Citrobacter rodentium, Desulfovibrio vulgaris, Edwardsiella tarda, Endozoicomonas elysicola, Erwinia amylovora, Escherichia albertii, Escherichia coli, Lawsonia intracellularis, Mesorhizobium loti, Myxococcus xanthus, Pantoea agglomerans, Photobacterium damselae, Photorhabdus luminescens, Photorhabdus temperate, Pseudoalteromonas spongiae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas syringae, Ralstonia solanacearum, Rhizobium sp, Salmonella enterica y otras Salmonella sp, Shigella flexneri y otras Shigella sp, Sodalis glossinidius, Vibrio alginolyticus, Vibrio azureus, Vibrio campellii, Vibrio caribbenthicus, Vibrio harvey, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio tasmaniensis, Vibrio tubiashii, Xanthomonas axonopodis, Xanthomonas campestris, Xanthomonas oryzae, Yersinia enterolitica, Yersinia pestis, Yersinia psudotuberculosis. Las cepas bacterianas Gram negativas preferidas de la invención son cepas bacterianas Gram negativas comprendidas por la familia de Enterobacteriaceae y Pseudomonadaceae. La cepa bacteriana Gram negativa de la presente invención se usa normalmente para la administración de proteínas heterólogas por el T3SS bacteriano en células eucariotas in vitro y/o in vivo, preferiblemente in vivo.

El término "cepa bacteriana Gram-negativa recombinante" que se usa en la presente memoria se refiere a una cepa bacteriana Gram-negativa transformada genéticamente con un vector. Un vector útil de la presente invención es, por ejemplo, un vector de expresión, un vector para la inserción de plásmidos cromosómicos o de virulencia o un fragmento de ADN o ARN para la inserción o modificación de plásmidos cromosómicos o de virulencia.

El término "cepas bacterianas Gram-negativas recombinantes que son deficientes en la producción de al menos una proteína efectora funcional T3SS" utilizado en la presente memoria se refiere a una cepa bacteriana Gram-negativa recombinante en la que al menos una proteína efectora de T3SS está mutada de manera que la cepa bacteriana Gram negativa resultante ya no produce una forma funcional de al menos una proteína efectora de T3SS, es decir, que la expresión de dicho gen efector se suprime de modo que las cepas bacterianas Gram-negativas recombinantes resultantes no producen ninguna de la al menos una proteína efectora de T3SS o que la actividad catalítica de la proteína efectora codificada se suprime de modo que la al menos una proteína efectora de T3SS producida no tiene su actividad catalítica, p. ej., no ejerce sus funciones efectoras. Con el fin de administrar proteínas, el sistema de secreción y translocación de las cepas bacterianas Gram-negativas recombinantes que son deficientes en la producción de al menos una proteína efectora funcional T3SS necesita estar intacto. El término "proteína efectora de T3SS" o "proteína efectora de T3SS bacteriano" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a proteínas que son inyectadas naturalmente por sistemas T3S en el citosol de células eucariotas y a proteínas que son secretadas naturalmente por los sistemas T3S que podrían, p. ej., formar el poro de translocación en la membrana eucariota (incluyendo los translocadores formadores de poros (como YopB y YopD de Yersinia) y proteínas de punta como LcrV de Yersinia). Preferiblemente, se utilizan proteínas que se inyectan naturalmente mediante sistemas T3S en el citosol de células eucariotas. Estos factores de virulencia paralizarán o reprogramarán la célula eucariota en beneficio del patógeno. Los efectores de T3S muestran un gran repertorio de actividades bioquímicas y modulan la función de moléculas reguladoras cruciales del huésped e incluyen AvrA, AvrB, AvrBs2, AvrBS3, AvrBsT, AvrD, AvrD1, AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, AvrRpm1, AvrRpt2, AvrXv3, CigR, EspF, EspG, EspH, EspZ, ExoS, ExoT, GogB, GtgA, GtgE, familia de proteínas GALA, HopAB2, HopAO1, HopI1, HopM1, HopN1, HopPtoD2, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, HopU1, HsvB, IcsB, IpaA, IpaB, IpaC, IpaH, IpaH7.8, IpaH9.8, IpgB1, IpgB2, IpgD, LcrV, Map, OspC1, OspE2, OspF, OspG, OspI, PipB, PipB2, PopB, PopP2, PthXo1, PthXo6, PthXo7, SifA, SifB, SipA/SspA, SipB, SipC/SspC, SipD/SspD, SIrP, SopA, SopB/SigD, SopD, SopE, SopE2, SpiC/SsaB, SptP, SpvB, SpvC, SrfH, SrfJ, Sse, SseB, SseC, SseD, SseF, SseG, Ssel/SrfH, SseJ, SseK1, SseK2, SseK3, SseL, SspH1, SspH2, SteA, SteB, SteC, SteD, SteE, TccP2, Tir, VirA, VirPphA, VopF, XopD, YopB, YopD, YopE, YopH, YopJ, YopM, YopO, YopP, YopT, YpkA.

Los términos "cepa bacteriana Gram negativa deficiente para producir un aminoácido esencial para el crecimiento" y "mutante auxótrofo" se utilizan en la presente memoria indistintamente y se refieren a cepas bacterianas Gram negativas que no pueden crecer en ausencia de al menos un aminoácido esencial proporcionado exógenamente o un precursor del mismo. El aminoácido para el que la cepa tiene una producción deficiente es, p. ej., aspartato, ácido meso-2,6-diaminopimélico, aminoácidos aromáticos o leucina-arginina [8]. Dicha cepa se puede generar, p. ej., por deleción del gen de la aspartato-beta-semialdehído deshidrogenasa (Aasd). Dicho mutante auxótrofo no puede crecer en ausencia del ácido meso-2,6-diaminopimélico exógeno [9]. La mutación, p. ej., La deleción del gen de la aspartatobeta-semialdehído deshidrogenasa se prefiere en la presente memoria para una cepa bacteriana Gram negativa deficiente para producir un aminoácido esencial para el crecimiento de la presente invención.

El término "cepa bacteriana Gram negativa deficiente para producir proteínas de adhesión que se unen a la superficie celular o matriz extracelular eucariota" se refiere a cepas bacterianas Gram negativas mutantes que no expresan al menos una proteína de adhesión en comparación con las proteínas de adhesión expresadas por la correspondiente cepa de tipo salvaje. Las proteínas de adhesión pueden incluir, p. ej., moléculas de adhesión poliméricas extendidas como pili/fimbrias o adhesinas no fimbriales. Las adhesinas fimbriales incluyen pili de tipo 1 (tal como pili Fim de E.

colicon la adhesina FimH), pili P (tal como como pili Pap con la adhesina PapG de E. coli), pili de tipo 4 (como proteína pilina de, p. ej., P. aeruginosa) o curli (proteínas Csg con la adhesina CsgA de S. entérica). Las adhesiones no fimbriales incluyen adhesinas autotransportadoras triméricas tal como YadA de Y. enterocolitica, BpaA (B. pseudomallei), Hia (H. influenzae), BadA (B. henselae), NadA (N. meningitidis) o UspA1 (M. catarrhalis), así como otras adhesinas autotransportadoras tales como AIDA-1 (E. coli), así como otras adhesinas/invasinas tales como InvA de Y. enterocolitica o Intimina (E. coli) o miembros de la familia Dr o la familia Afa (E. coli). Los términos YadA e InvA como se usan en la presente memoria se refieren a proteínas de Y. enterocolitica. El autotransportador YadA [10,11] se une a diferentes formas de colágeno, así como fibronectina, mientras que la invasina InvA [12-14] se une a pintegrinas en la membrana celular eucariota. Si la cepa bacteriana Gram negativa es una cepa de Y. enterocolitica, la cepa es preferiblemente deficiente en InvA y/o YadA.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "familia de Enterobacteriaceae" comprende una familia de bacterias Gram negativas, en forma de rodillo, facultativamente anaeróbicas que se encuentran en el suelo, el agua, las plantas y los animales, y que con frecuencia se presentan como patógenos en los vertebrados. Las bacterias de esta familia comparten una fisiología similar y demuestran una conservación dentro de los elementos funcionales y genes de los respectivos genomas. Además de ser oxidasa negativos, todos los miembros de esta familia son fermentadores de glucosa y la mayoría son reductores de nitratos. Las bacterias Enterobacteriaceae de la invención pueden ser cualquier bacteria de esa familia, e incluyen específicamente, pero no están limitadas a, bacterias de los siguientes géneros: Escherichia, Shigella, Edwardsiella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus, Erwinia, Morganella, Providencia, o Yersinia. En realizaciones más específicas, la bacteria es del tipo Escherichia coli, Escherichia blattae, Escherichia fergusonii, Escherichia hermanii, Escherichia vuneris, Salmonella enterica, Salmonella bongori, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, Enterobacter aerogenes, Enterobacter gergoviae, Enterobacter sakazakii, Enterobacter cloacae, Enterobacter agglomerans, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Serratia marcescens, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica, Erwinia amylovora, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Proteus penneri, Proteus hauseri, Providencia alcalifaciens, o especies de Morganella morganii.

Preferiblemente, la cepa bacteriana Gram negativa se selecciona del grupo que consiste en los géneros Yersinia, Escherichia, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Chlamydia, Erwinia, Pantoea, Vibrio, Burkholderia, Ralstonia, Xanthomonas, Chromobacterium, Sodalis, Citrobacter, Edwardsiella, Rhizobiae, Aeromonas, Photorhabdus, Bordetella y Desulfovibrio, más preferiblemente del grupo que consiste en los géneros Yersinia, Escherichia, Salmonella, y Pseudomonas, lo más preferiblemente del grupo que consiste en los géneros Yersinia y Salmonella.

El término "Yersinia"tal y como se usa en la presente memoria incluye todas las especies de Yersinia, incluyendo Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis y Yersinia pestis. Se prefiere Yersinia enterocolitica.

El término "Salmonella"tal y como se usa en la presente memoria incluye todas las especies de Salmonella, incluyendo Salmonella enterica y S. bongori. Se prefiere Salmonella enterica.

"Promotor", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una secuencia de ácido nucleico que regula la expresión de una unidad transcripcional. Una "región promotora" es una región reguladora capaz de unirse a la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificante cadena abajo (dirección 3'). Dentro de la región promotora se encontrará un sitio de inicio de la transcripción (convenientemente definido mediante mapeo con nucleasa S1), así como dominios de unión a proteínas (secuencias consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa como la supuesta región -35 y la caja de Pribnow. El término "unido operativamente" cuando se describe la relación entre dos regiones de ADN simplemente significa que están relacionadas funcionalmente entre sí y que están ubicadas en el mismo fragmento de ácido nucleico. Un promotor está unido operativamente a un gen estructural si controla la transcripción del gen y está ubicado en el mismo fragmento de ácido nucleico que el gen. Normalmente, el promotor es funcional en dicha cepa bacteriana Gram negativa, es decir, el promotor es capaz de expresar la proteína de fusión de la presente invención, es decir, el promotor es capaz de expresar la proteína de fusión de la presente invención sin más ingeniería genética o expresión de más proteínas. Además, un promotor funcional no debe estar naturalmente contrarregulado con el T3SS bacteriano.

El término "administración" usado en la presente memoria se refiere al transporte de una proteína desde una cepa bacteriana Gram negativa recombinante a una célula eucariota, incluyendo las etapas de expresar la proteína heteróloga en la cepa bacteriana Gram negativa recombinante, secretar la o las proteínas expresadas a partir de dicha cepa bacteriana Gram negativa y translocar la o las proteínas secretadas por dicha cepa bacteriana Gram negativa en el citosol de la célula eucariota. Por consiguiente, los términos "señal de administración" o "señal de secreción" que se usan indistintamente en la presente memoria se refieren a una secuencia polipeptídica que puede ser reconocida por el sistema de secreción y translocación de la cepa bacteriana Gram negativa y dirige la administración de una proteína desde la cepa bacteriana Gram negativa a células eucariotas.

El término "señal de administración de una proteína efectora bacteriana" usado en la presente memoria se refiere a una señal de administración de una proteína efectora bacteriana funcional en la cepa bacteriana Gram negativa recombinante, es decir, que permite que una proteína heteróloga expresada en la cepa bacteriana Gram negativa recombinante sea secretada a partir de dicha cepa bacteriana Gram negativa recombinante mediante un sistema de secreción tal como, p. ej., el sistema de secreción de tipo III o para ser translocada por dicha cepa bacteriana Gram negativa recombinante en el citosol de una célula eucariota por un sistema de secreción tal como, p. ej., el sistema de secreción de tipo III. El término "señal de administración de una proteína efectora bacteriana" usado en la presente memoria también comprende un fragmento de una señal de administración de una proteína efectora bacteriana, es decir, versiones más cortas de una señal de administración, p. ej., una señal de administración que comprende hasta 10, preferiblemente hasta 20, más preferiblemente hasta 50, incluso más preferiblemente hasta 100, en particular hasta 140 aminoácidos de una señal de administración, p. ej., de una señal de administración natural. Por tanto, una secuencia de nucleótidos tal como, p. ej., una secuencia de ADN que codifica una señal de administración de una proteína efectora bacteriana puede codificar una señal de administración de longitud completa o un fragmento de la misma en donde el fragmento normalmente comprende hasta 30, preferiblemente hasta 60, más preferiblemente hasta 150, incluso más preferiblemente hasta 300, en particular hasta 420 ácidos nucleicos.

Tal y como se usa en la presente memoria, la "secreción" de una proteína se refiere al transporte de una proteína heteróloga hacia afuera a través de la membrana celular de una cepa bacteriana Gram negativa recombinante. La "translocación" de una proteína se refiere al transporte de una proteína heteróloga desde una cepa bacteriana Gram negativa recombinante a través de la membrana plasmática de una célula eucariota en el citosol de dicha célula eucariota. El término "células eucariotas" tal y como se usa en la presente memoria incluye, p. ej., las siguientes células eucariotas: Hi-5, HeLa, Hek, HUVEC, 3T3, CHO, Jurkat, Sf-9, HepG2, Vero, MDCK, Mefs, Th P-1, J774, RAW, Caco2, NCI60, DU145, Lncap, MCF-7, MDA-MB-438, PC3, T47D, A549, U87, SHSY5Y, Ea.Hy926, Saos-2, 4T1, D2A1, B16F10 y hepatocitos humanos primarios. Las "células eucariotas", tal y como se usa en la presente memoria, también se denominan "células diana" o "células eucariotas diana".

El término "proteína efectora de T3SS" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a proteínas que son inyectadas naturalmente por sistemas T3S en el citosol de células eucariotas y a proteínas que son secretadas naturalmente por sistemas T3S que podrían, p. ej., formar el poro de translocación en la membrana eucariota (incluyendo translocadores formadores de poro (como YopB y YopD de Yersinia) y proteínas de punta como LcrV de Yersinia). Preferiblemente, se utilizan proteínas que se inyectan naturalmente mediante sistemas T3S en el citosol de células eucariotas. Estos factores de virulencia paralizarán o reprogramarán la célula eucariota en beneficio del patógeno. Los efectores de T3S muestran un amplio repertorio de actividades bioquímicas y modulan la función de moléculas reguladoras cruciales del huésped [2,15] e incluyen AvrA, AvrB, AvrBs2, AvrBS3, AvrBsT, AvrD, AvrD1, AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, AvrRpm1, AvrRpt2, AvrXv3, CigR, EspF, EspG, EspH, EspZ, ExoS, ExoT, GogB, GtgA, GtgE, proteínas de la familia GALA, HopAB2, HopAO1, HopI1, HopM1, HopN1, HopPtoD2, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, HopU1, HsvB, IcsB, IpaA, IpaB, IpaC, IpaH, IpaH7.8, IpaH9.8, IpgB1, IpgB2, IpgD, LcrV, Map, OspC1, OspE2, OspF, OspG, OspI, PipB, PipB2, PopB, PopP2, PthXo1, PthXo6, PthXo7, SifA, SifB, SipA/SspA, SipB, SipC/SspC, SipD/SspD, SIrP, SopA, SopB/SigD, SopD, SopE, SopE2, SpiC/SsaB, SptP, SpvB, SpvC, SrfH, SrfJ, Sse, SseB, SseC, SseD, SseF, SseG, Ssel/SrfH, SseJ, SseK1, SseK2, SseK3, SseL, SspH1, SspH2, SteA, SteB, SteC, SteD, SteE, TccP2, Tir, VirA, VirPphA, VopF, XopD, YopB, YopD YopE, YopH, YopJ, YopM, YopO, YopP, YopT, YpkA.

Los genes efectores de T3SS de Yersinia han sido clonados de, p. ej., Y. enterocolitica que son YopE, YopH, YopM, YopO, YopP/YopJ y YopT [16]. Los genes efectores respectivos pueden clonarse a partir de Shigella flexneri (p. ej., OspF, IpgD, IpgB1), Salmonella enterica (p. ej., SopE, SopB, SptP), P. aeruginosa (p. ej., ExoS, ExoT, ExoU, ExoY) o E. co li(p. ej., Tir, Map, EspF, EspG, EspH, EspZ). Las secuencias de ácido nucleico de estos genes están disponibles para los expertos en la técnica, p. ej., en la base de datos Genebank (yopH, yopO, yopE, yopP, yopM, yopT de NC_002120 GI: 10955536; proteínas efectoras de S. flexneri de AF386526.1 GI: 18462515; efectores de S. enterica de NC_016810.1 GI: 378697983 o FQ312003.1 GI: 301156631; efectores de P. aeruginosa de AE004091.2 GI: 110227054 o CP000438.1 GI: 115583796 y proteínas efectoras de E. coli de NC_011601.1 GI: 215485161).

Para el propósito de la presente invención, los genes se indican con letras minúsculas y en cursiva para distinguirlos de las proteínas. En el caso en el que los genes (indicados con letras minúsculas y en cursiva) sigan el nombre de una especie bacteriana (como E. coli), se refieren a una mutación del gen correspondiente en la especie bacteriana correspondiente. Por ejemplo, YopE se refiere a la proteína efectora codificada por el gen yopE. Y. enterocolitica yopE representa una Y. enterocolitica que tiene una mutación en el yopE gene.

Tal y como se usan en la presente memoria, los términos "polipéptido", "péptido", "proteína", "polipeptídico" y "peptídico" se usan indistintamente para designar una serie de residuos de aminoácidos conectados entre sí por enlaces peptídicos entre los grupos alfa-amino y carboxi de residuos adyacentes. Se prefieren las proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 10 aminoácidos, más preferiblemente al menos 20 aminoácidos.

Según la presente invención, "un dominio de una proteína heteróloga" incluye dominios de proteínas de origen natural y también incluye dominios de proteínas manipuladas artificialmente. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "dominio de una proteína heteróloga" se refiere a un dominio de una proteína heteróloga que no es un dominio de una proteína efectora de T3SS o un dominio que no es un dominio que comprende el fragmento N-terminal de la misma al que puede fusionarse para lograr una proteína de fusión. En particular, el dominio de una proteína heteróloga tal y como se usa en la presente memoria se refiere a un dominio de una proteína heteróloga, que no pertenece al proteoma, es decir, el complemento proteico natural completo de la cepa bacteriana Gram negativa recombinante específica proporcionada y utilizada por la invención, p. ej., que no pertenecen al proteoma, es decir, el complemento proteico natural completo de una cepa bacteriana específica del género Yersinia, Escherichia, Salmonella o Pseudomonas. Normalmente, el dominio de la proteína heteróloga es de origen animal, incluido el origen humano. Preferiblemente, el dominio de la proteína heteróloga es un dominio de una proteína humana. Más preferiblemente, el dominio de la proteína heteróloga es un dominio de una proteína seleccionada del grupo que consiste en proteínas implicadas en la apoptosis o en la regulación de la apoptosis, reguladores del ciclo celular, proteínas de repetición de anquirina, proteínas de señalización celular, proteínas informadoras, factores de transcripción, proteasas, pequeñas GTPasas, proteínas relacionadas con GPCR, construcciones de fusión de nanocuerpos y nanocuerpos, efectores bacterianos de T3SS, efectores bacterianos de T4SS y proteínas virales. Particularmente, preferiblemente el dominio de la proteína heteróloga es un dominio de una proteína seleccionada del grupo que consiste en proteínas implicadas en la apoptosis o en la regulación de la apoptosis, reguladores del ciclo celular, proteínas de repetición de anquirina, proteínas informadoras, pequeñas GTPasas, proteínas relacionadas con GPCR, construcciones de fusión de nanocuerpos, efectores bacterianos de T3SS, efectores bacterianos de T4SS y proteínas virales. Incluso más particularmente, se prefieren los dominios de proteínas heterólogas seleccionadas del grupo que consiste en proteínas implicadas en la apoptosis o en la regulación de la apoptosis, reguladores del ciclo celular y proteínas de repetición de anquirina. Los más preferidos son los dominios de proteínas implicadas en la apoptosis o en la regulación de la apoptosis, como las proteínas animales implicadas en la apoptosis o en la regulación de la apoptosis, preferiblemente dominios de proteínas heterólogas humanas implicadas en la apoptosis o en la regulación de la apoptosis.

El término "dominios repetidos de una proteína heteróloga" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a una proteína de fusión que consiste en varias repeticiones de un dominio de una proteína heteróloga, donde estos dominios podrían fusionarse bien directamente entre sí o donde podría introducirse un enlazador variable, p. ej., un enlazador entre 1 y 30, preferiblemente entre 2 y 15, más preferiblemente entre 3 y 10 aminoácidos entre los dominios. Preferiblemente, se usan los dominios idénticos repetidos o dominios repetidos que tienen una identidad de secuencia de aminoácidos de más del 80 %, generalmente más del 85 %, preferiblemente más del 90 %, incluso más preferiblemente más del 95 %, en particular más del 96 %, más particularmente más del 97 %, incluso más particularmente más del 98 %, más particularmente más del 99 %. También se prefieren los dominios idénticos que tienen una identidad de aminoácidos del 100 %. Preferiblemente, dos dominios repetidos, más preferiblemente dos dominios idénticos repetidos o dos dominios repetidos que tienen una identidad de secuencia de aminoácidos de más del 90 %, preferiblemente más del 95 % y lo más preferiblemente del 100 %, están compuestos por la proteína de fusión como se hace referencia en la presente memoria. La presente invención también contempla más de dos, p. ej., tres, cuatro, cinco o seis dominios repetidos.

El término "dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a una proteína de fusión que consiste en una o varias repeticiones de al menos dos dominios de proteínas heterólogas diferentes, p. ej., al menos dos dominios de proteínas heterólogas que tienen una identidad de secuencia de aminoácidos del 80 % o menos, donde estos dominios diferentes podrían fusionarse bien directamente entre sí o donde podría introducirse un enlazador variable, p. ej., un enlazador entre 1 y 30, preferiblemente entre 2 y 15, más preferiblemente entre 3 y 10 aminoácidos entre los dominios.

Preferiblemente, dos dominios de proteínas heterólogas diferentes están comprendidos por la proteína de fusión como se hace referencia en la presente memoria. También se contemplan en la presente invención más de dos, p. ej., tres, cuatro, cinco o seis dominios de proteínas heterólogas diferentes.

El término "proteínas heterólogas que pertenecen a la misma clase funcional de proteínas" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a proteínas heterólogas que tienen la misma función, p. ej., proteínas heterólogas que tienen actividad enzimática, proteínas heterólogas que actúan en la misma ruta tal como, p. ej., regulación del ciclo celular, o comparten una característica específica común como p. ej., que pertenecen a la misma clase de proteínas efectoras bacterianas. Las clases funcionales de proteínas son p. ej., proteínas implicadas en la apoptosis o en la regulación de la apoptosis, proteínas que actúan como reguladores del ciclo celular, proteínas de repetición de anquirina, proteínas de señalización celular, proteínas informadoras, factores de transcripción, proteasas, pequeñas GTPasas, proteínas relacionadas con GPCR, construcciones de fusión de nanocuerpos y nanocuerpos, efectores bacterianos de T3SS , efectores bacterianos de T4SS o proteínas virales que actúan conjuntamente en el proceso biológico del establecimiento de virulencia para las células eucariotas.

El dominio de una proteína heteróloga expresada por la cepa bacteriana Gram negativa recombinante tiene normalmente un peso molecular de entre 1 y 50 kDa, preferiblemente entre 1 y 30 kDa, más preferiblemente entre 1 y 20 kDa, lo más preferiblemente entre 1 y 10 kDa.

Según la presente invención, "proteínas implicadas en la apoptosis o en la regulación de la apoptosis" o "proteínas heterólogas humanas implicadas en la apoptosis o en la regulación de la apoptosis" incluyen, pero no están limitadas a, Bad, Bcl2, Bak, Bmt, Bax, Puma, Noxa, Bim, Bcl-xL, Apafl, Caspasa 9, Caspasa 3, Caspasa 6, Caspasa 7, Caspasa 10, DFFA, DFFB, ROCK1, APP, CAD, ICAD, CAD, EndoG, AIF, HtrA2, Smac/Diablo, Arts, ATM, ATR , Bok/Mtd, Bmf, Mcl-1 (S), familia IAP, LC8, PP2B, proteínas 14-3-3, PKA, PKC, PI3K, Erk1/2, p90RSK, TRAF2, TRADD, FADD, Daxx, Caspasa8, Caspasa2, RiP, RAiDd , MKK7, JNK, FLIP, FKh R, Gs K3, Cd K y sus inhibidores como la familia INK4 (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)) y la familia Cip1/Waf1/Kip1-2 (p21 (Cip1/Waf1), p27(Kip1), p57(Kip2). Preferiblemente, se usan Bad, Bmt, Bcl2, Bak, Bax, Puma, Noxa, Bim, Bcl-xL, Caspasa9, Caspasa3, Caspasa6, Caspasa7, Smac/Diablo, Bok/Mtd, Bmf, Mcl-1 (S), lC8, PP2B, TrAd D, Daxx, Caspasa8, Caspasa2, RlP, Ra IDD, FKHR, CDK y sus inhibidores como la familia INK4 (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)), lo más preferiblemente BIM, Bid, Bid truncado, FADD, Caspasa 3 (y las subunidades de la misma), Bax, Bad, Akt, CDK y sus inhibidores como la familia INK4 (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)) [17-19]. Además, las proteínas implicadas en la apoptosis o en la regulación de la apoptosis incluyen DIVA, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bid y tBid, Egl-1, Bcl-Gs, Citocromo C, Beclin, CED-13, BNIP1, BNIP3, Bcl-B, Bcl-W, Ced-9, A1, NR13, Bfl-1, Caspasa 1, Caspasa 2, Caspasa 4, Caspasa 5, Caspasa 8.

Las proteínas implicadas en la apoptosis o en la regulación de la apoptosis se seleccionan del grupo que consiste en proteínas proapoptóticas, proteínas antiapoptóticas, inhibidores de las rutas de prevención de la apoptosis e inhibidores de la señalización o rutas prosupervivencia. Las proteínas proapoptóticas comprenden proteínas seleccionadas del grupo que consiste en Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid y tBid, Bok, Apafl, Smac/Diablo, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, Beclin 1, Egl-1 y Ce D-13, Citocromo C, FADD, la familia Caspasa y CDK y sus inhibidores como la familia INK4 (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)) o se seleccionan del grupo que consiste en Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid y tBid, Bok, Egl-1, Apafl, Smac/Diablo, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, Beclin 1, Egl-1 y Ce D-13, Citocromo C, Fa DD y la familia Caspasa. Se prefieren Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid y tBid, Bok, Egl-1, Apafl, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, Beclin 1, Egl-1 y CED-13, Smac/Diablo, FADD, la familia Caspasa, Cd K y sus inhibidores como la familia INK4 (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d) ). Igualmente preferidos son Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid y tBid, Bok, Apafl, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, Beclin 1, Egl-1 y CED-13, Smac/Diablo, Fa Dd , la familia Caspasa.

Las proteínas antiapoptóticas comprenden proteínas seleccionadas del grupo que consiste en Bcl-2, Bc1-Xl, Bcl-B, Bcl-W, Mcl-1, Ced-9, A1, NR13, familia IAP y Bfl-1. Se prefieren Bcl-2, Bcl-Xl, Bcl-B, Bcl-W, Mcl-1, Ced-9, A1, NR13 y Bfl-1. Los inhibidores de las rutas de prevención de la apoptosis comprenden proteínas seleccionadas del grupo que consiste en Bad, Noxa y Cdc25A. Se prefieren Bad y Noxa.

Los inhibidores de la señalización o rutas de prosupervivencia comprenden proteínas seleccionadas del grupo que consiste en PTEN, ROCK, PP2A, PHLPP, JNK, p38. Se prefieren PTEN, ROCK, PP2A y PHLPP.

En algunas realizaciones, las proteínas heterólogas implicadas en la apoptosis o en la regulación de la apoptosis se seleccionan del grupo que consiste en proteínas solo BH3, caspasas y proteínas de señalización intracelular del control del receptor de muerte de la apoptosis.

Las proteínas solo BH3 comprenden proteínas seleccionadas del grupo que consiste en Bad, BIM, Bid y tBid, Puma, Bik/Nbk, Bod, Hrk/Dp5, BNIP1, BNIP3, Bmf, Noxa, Mcl-1, Bcl-Gs, Beclin 1 , Egl-1 y CED-13. Se prefieren Bad, BIM, Bid y tBid. Las caspasas comprenden proteínas seleccionadas del grupo que consiste en Caspasa 1, Caspasa 2, Caspasa 3, Caspasa 4, Caspasa 5, Caspasa 6, Caspasa 7, Caspasa 8, Caspasa 9, Caspasa 10. Se prefieren Caspasa 3, Caspasa 8 y Caspasa 9.

Las proteínas de señalización intracelular del control del receptor de muerte de la apoptosis comprenden proteínas seleccionadas del grupo que consiste en FADD, TRADD, ASC, BAP31, GULP1/CED-6, CIDEA, MFG-E8, CIDEC, RIPK1/RIP1, CRADD, RIPK3/RIP3, Crk , SHB, CrkL, DAXX, la familia 14-3-3, FLIP, DFF40 y 45, PEA-15, SODD. Se prefieren FADD y TrAd D.

En algunas realizaciones, dos dominios de proteínas heterólogas implicadas en la apoptosis o en la regulación de la apoptosis están comprendidos por la cepa bacteriana Gram negativa y/o el vector de la presente invención, preferiblemente dos dominios repetidos, más preferiblemente dos dominios repetidos idénticos, de una proteína implicada en la apoptosis o en la regulación de la apoptosis o dos dominios de diferentes proteínas implicadas en la apoptosis o en la regulación de la apoptosis. En algunas realizaciones, dos dominios de proteínas heterólogas implicadas en la apoptosis o en la regulación de la apoptosis están comprendidos por la cepa bacteriana Gram negativa y/o el vector de la presente invención, en donde uno es un dominio de una proteína proapoptótica y el otro es un dominio de una proteína que es un inhibidor de las rutas de prevención de la apoptosis o en donde uno es un dominio de una proteína proapoptótica y el otro dominio es un dominio de una proteína que es un inhibidor de la señalización o rutas de prosupervivencia.

Las proteínas proapoptóticas abarcadas por la presente invención tienen habitualmente una estructura de hélice alfa, preferiblemente una hélice hidrófoba rodeada por hélices anfipáticas y normalmente comprenden al menos uno de los dominios BH1, BH2, BH3 o BH4, preferiblemente comprenden al menos un dominio BH3. Normalmente, las proteínas proapoptóticas abarcadas por la presente invención no tienen actividad enzimática.

Las proteínas antiapoptóticas abarcadas por la presente invención tienen habitualmente una estructura de hélice alfa, preferiblemente una hélice hidrófoba rodeada por hélices anfipáticas y comprenden una combinación de diferentes dominios BH1, BH2, BH3 y BH4, preferiblemente una combinación de diferentes dominios BH1, BH2, BH3 y BH4 en los que está presente un dominio BH1 y BH2, más preferiblemente BH4-BH3-BH1-BH2, BH1-BH2, BH4-BH1-BH2 o BH3-BH1-BH2 (desde el extremo N hasta el extremo C). Además, también se incluyen proteínas que contienen al menos un dominio BIR.

Los inhibidores de las rutas de prevención de la apoptosis abarcados por la presente invención tienen habitualmente una estructura de hélice alfa, preferiblemente una hélice hidrófoba rodeada por hélices anfipáticas y habitualmente comprenden un dominio BH3.

Los dominios BH1, BH2, BH3 o BH4 tienen cada uno habitualmente entre aproximadamente 5 y aproximadamente 50 aminoácidos de longitud. Por tanto, en algunas realizaciones, los dominios de las proteínas heterólogas se seleccionan del grupo que consiste en dominios de proteínas heterólogas que tienen una longitud de aproximadamente 5 a aproximadamente 200, preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 150, más preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 100, más preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 50, en particular de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 aminoácidos.

Un dominio preferido particular es el dominio BH3 del inductor de la apoptosis tBID, más en particular el dominio BH3 que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 209, 210, 211 y 212, preferiblemente la SEQ ID NO: 211 o SEQ ID NO: 212. Igualmente preferido es el dominio BH3 del regulador de la apoptosis BAX, más en particular el dominio BAX que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 213, 214, 215 y 216, preferiblemente la SEQ ID NO: 215 o SEQ ID NO: 216. Las secuencias humana y murina se proporcionan en las SEQ ID NO 209-216, pero los dominios BH- de tBID y BAX de todas las demás especies están igualmente incluidos.

En algunas realizaciones, los dominios repetidos de las proteínas heterólogas son el dominio BH3, en particular los dominios BH3 repetidos del inductor de la apoptosis tBID, más en particular dos dominios BH3 repetidos del inductor de la apoptosis tBID, más en particular dos dominios BH3 repetidos del inductor de la apoptosis tBID comprendidos por la secuencia de SEQ ID NO: 202. Por tanto, en una realización preferida, el vector de la cepa bacteriana Gram negativa de la presente invención comprende una segunda secuencia de ADN que codifica dos dominios repetidos de un dominio BH3, más preferiblemente dos dominios BH3 repetidos del inductor de la apoptosis tBID. Los dos dominios repetidos están conectados preferiblemente por un enlazador de 1 -30 aminoácidos de longitud, preferiblemente 2-15 aminoácidos, más preferiblemente 3-10 aminoácidos de longitud.

En algunas realizaciones, los dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes son dominios de proteínas heterólogas que pertenecen a la misma clase funcional de proteínas, preferiblemente las proteínas heterólogas diferentes de los dos o más dominios son proteínas heterólogas diferentes de la clase de proteínas implicadas en la apoptosis. o en la regulación de la apoptosis. En una realización preferida, los dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes son el dominio BH3 del inductor de la apoptosis tBID y el dominio BH3 del regulador de la apoptosis BAX, en particular los dominios BH3 fusionados comprendidos por la secuencia de SEQ ID NO: 203. Los dos dominios de proteínas heterólogas diferentes están conectados preferiblemente por un enlazador de 1-30 aminoácidos de longitud, preferiblemente 2-15 aminoácidos, más preferiblemente 3-10 aminoácidos de longitud.

En algunas realizaciones, las proteínas heterólogas son una enzima convertidora de profármaco. En estas realizaciones, la cepa bacteriana Gram negativa con virulencia atenuada recombinante expresa, preferiblemente expresa y secreta, una enzima convertidora de profármaco. Una enzima convertidora de profármaco como se menciona en la presente memoria comprende enzimas que convierten profármacos no tóxicos en un fármaco tóxico, preferiblemente enzimas seleccionadas del grupo que consiste en citosina desaminasa, purina nucleósido fosforilasa, timidina quinasa, beta-galactosidasa, carboxilesterasas, nitroreductasa, carboxipeptidasas y beta-glucuronidasas. más preferiblemente enzimas seleccionadas del grupo que consiste en citosina desaminasa, purina nucleósido fosforilasa, timidina quinasa y beta-galactosidasa.

El término "sitio de escisión de proteasa" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a un resto de aminoácido específico dentro de una secuencia de aminoácidos, p. ej., dentro de una secuencia de aminoácidos de una proteína o una proteína de fusión, que es escindido por una proteasa específica, que reconoce el resto de aminoácidos. Para una revisión, véase [20]. Los ejemplos de sitios de escisión de proteasas son restos de aminoácidos, que son escindidos por una proteasa seleccionada del grupo que consiste en enteroquinasa (cadena ligera), enteropeptidasa, proteasa de preescisión, proteasa de rinovirus humano (HRV 3C), proteasa TEV, proteasa TVMV, proteasa FactorXa y trombina. El siguiente resto de aminoácidos es reconocido por la proteasa respectiva:

- Asp-Asp-Asp-Asp-Lys: Enteroquinasa (cadena ligera)/Enteropeptidasa

- Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln/Gly-Pro: Proteasa de preescisión/proteasa de rinovirus humano (HRV 3C)

- Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Ser y restos modificados basados en Glu-X-X-Tyr-X-Gln-Gly/Ser (donde X es cualquier aminoácido) reconocidos por la proteasa TEV (virus del grabado del tabaco)

- Glu-Thr-Val-Arg-Phe-Gln-Ser: proteasa TVMV

- Ile-(Glu o Asp)-Gly-Arg: proteasa FactorXa

- Leu-Val-Pro-Arg/Gly-Ser: trombina.

Está abarcada por los sitios de escisión de proteasa, tal y como se usa en la presente memoria, la ubiquitina. Por tanto, en algunas realizaciones preferidas, la ubiquitina se usa como sitio de escisión de proteasa, es decir, la tercera secuencia de ADN codifica ubiquitina como sitio de escisión de proteasa, que puede ser escindida por proteasas de procesamiento de ubiquitina específicas en el sitio N-terminal, p. ej., que se pueden escindir mediante proteasas de procesamiento de ubiquitina específicas llamadas enzimas desubiquitinantes en el sitio N-terminal de forma endógena en la célula donde se ha administrado la proteína de fusión. La ubiquitina se procesa en su extremo C mediante un grupo de proteasas C-terminales endógenas específicas de ubiquitina (enzimas desubiquitinantes, DUB). Se supone que la escisión de la ubiquitina por las DUB ocurre en el extremo C de la ubiquitina (después de G76).

Un "individuo", "sujeto" o "paciente" es un vertebrado. En determinadas realizaciones, el vertebrado es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no están limitados a, primates (incluidos primates humanos y no humanos) y roedores (p. ej., ratones y ratas). En determinadas realizaciones, un mamífero es un ser humano.

El término "mutación" se usa en la presente memoria como un término general e incluye cambios tanto de un solo par de bases como de múltiples pares de bases. Dichas mutaciones pueden incluir sustituciones, mutaciones de cambio de marco, deleciones, inserciones y truncamientos.

El término "molécula marcadora o un sitio aceptor para una molécula marcadora" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a un pequeño compuesto químico que se une a una secuencia de aminoácidos específica que da como resultado la fluorescencia del compuesto químico unido, preferiblemente el sitio aceptor de cumarina ligasa/cumarina (y sus derivados ), el sitio aceptor de resorufina ligasa/resorufina (y sus derivados) y el resto tetra-Cisteína (como Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys y sus derivados) en uso con tinte F1AsH/ReAsH (life technologies) o una proteína fluorescente como la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP).

El término "señal de localización nuclear", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una secuencia de aminoácidos que marca una proteína para su importación en el núcleo de una célula eucariota e incluye preferiblemente una señal de localización nuclear viral tal como el NLS derivado del antígeno T grande de SV40 (PPKKKRKV) .

El término "sitio de clonación múltiple" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a una secuencia de ADN corta que contiene varios sitios de restricción para la escisión por endonucleasas de restricción tales como AclI, HindIII, Sspl, MluCI, Tsp509I, Pcil, Agel, BspMI, BfuAI, SexAI, Mlul, BceAI, HpyCH4IV, HpyCH4III, BaeI, BsaXI, AflIII, Spel, BsrI, Bmrl, BglII, Afel, AluI, StuI, Scal, Clal, BspDI, PI-Scel, NsiI, Asel, Swal, CspCI, Mfel, BssSI, BmgBI, PmlI , DraIII, AleI, EcoP15I, PvuII, AlwNI, BtsIMutI, TspRI, Ndel, NlaIII, CviAII, FatI, MslI, FspEI, Xcml, BstXI, PflMI, BccI, Ncol, BseYI, Faul, Smal, Xmal, TspMI, Nt.CviPII, LpnPI, AciI, SacII, BsrBI, Mspl, HpaII, ScrFI, BssKI, StyD4I, BsaJI, BslI, Btgl, NciI, AvrII, MnlI, BbvCI, Nb.BbvCI, Nt.BbvCI, SbfI, Bpu10l, Bsu36l, EcoNl, HpyAV, BstNI, PspGI, Styl, Bcgl, Pvul, BstUI, EagI, RsrII, BsiEI, BsiWI, BsmBI, Hpy99I, MspA1I, MspJI, SgrAI, Bfal, BspCNI, Xhol, Earl, Acul, PstI, Bpml, Ddel, Sfel. Aflll, BpuEl, SmlI, Aval, BsoBI, MboII, Bbsl, XmnI, BsmI, Nb.BsmI, EcoRI, Hgal, AatII, Zral, Tth1111 PflFI, PshAI, Ahdl, DrdI, Eco53kI, SacI, BseRI, Plel, Nt.BstNBI, MlyI, HinfI, EcoRV, Mbol, Sau3AI, DpnII BfuCI, Dpnl, BsaBI, Tfil, BsrDI, Nb.BsrDI, Bbvl, Btsl, Nb.BtsI, BstAPI, SfaNI, SphI, NmeAIII, Nael, NgoMIV, BglI, AsiSI, BtgZI, HinP11, Hhal, BssHII, NotI, Fnu4HI, Cac8I, Mwol, NheI, BmtI, Sapl, BspÓ , Nt.BspQl, Blpl, Tsel, ApeKI, Bsp12861, AlwI, Nt.AlwI, BamHI, Fokl, BtsCI, HaeIII, Phol, Fsel, SfiI, Narl, KasI, Sfol, PluTI, AscI, Ecil, BsmFI, Apal, PspOMI, Sau96I, NlaIV, Kpnl, Acc65I, Bsal, HphI, BstEII, AvaII, BanI, BaeGI, BsaHI, BanII, Rsal, CviQI, BstZ17I, BciVI, SalI, Nt.BsmAI, BsmAI, BcoDI, ApaLI, BsgI, AccI, Hpy166II, Tsp45I, Hpal, Pmel, HincII, BsiHKAI, Apol, Nspl, BsrFI, BstYI, HaeII, CviKI-1, EcoO109I, PpuMI, I-Ceul, SnaBI, I-SceI, BspHI, BspEI, MmeI, Taqal, Nrul, Hpy188I, Hpy188III, Xbal, Bcll, HpyCH4V, Fspl, PI-Pspl, MscI, BsrGI, MseI, PacI, PsiI, BstBI, Dral, PspXI, BsaWI, BsaAI, Eael, preferiblemente Xhol, Xbal, HindIII, Ncol, NotI, EcoRI, EcoRV, BamHI, NheI, SacI, SalI, BstBI. El término "sitio de clonación múltiple" tal y como se usa en la presente memoria se refiere además a una secuencia de ADN corta usada para eventos de recombinación como, p. ej., en la estrategia de clonación Gateway o para métodos tales como ensamblaje de Gibbson o clonación topo.

El término "cepa de tipo salvaje de Yersinia" tal y como se usa en la presente memoria se refiere a una variante de origen natural (como Y. enterocolitica E40) o a una variante de origen natural que contiene modificaciones genéticas que permiten el uso de vectores, tales como mutaciones por deleción en endonucleasas de restricción o genes de resistencia a antibióticos (como Y. enterocolitica MRS40, el derivado sensible a la ampicilina de Y. enterocolitica E40). Estas cepas contienen ADN cromosómico, así como un plásmido de virulencia no modificado (llamado pYV).

El término "comprender" se usa generalmente en el sentido de incluir, es decir, permitir la presencia de una o más características o componentes.

El término "aproximadamente" se refiere a un rango de valores ± 10 % de un valor especificado. Por ejemplo, la frase "aproximadamente 200" incluye ± 10 % de 200, o de 180 a 220.

En una realización de la presente invención, la cepa bacteriana Gram negativa recombinante se transforma con un vector que comprende en la dirección 5' a 3': una primera secuencia de ADN que codifica una señal de administración o un fragmento de la misma de una proteína efectora de T3SS bacteriano, en donde la señal de administración de la proteína efectora de T3SS bacteriano comprende la proteína efectora YopE o un fragmento N-terminal de la misma o la proteína efectora SopE o SteA o un fragmento N-terminal de la misma; y una segunda secuencia de ADN que codifica dominios repetidos de una proteína heteróloga, en donde los dominios repetidos de una proteína heteróloga comprenden una proteína de fusión que consiste en varias repeticiones de un dominio de una proteína heteróloga, o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes, en donde los dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes comprenden una proteína de fusión que consiste en una o varias repeticiones de al menos dos dominios de proteínas heterólogas diferentes, fusionados en marco al extremo 3' de dicha primera secuencia de ADN, en donde las proteínas heterólogas son proteínas implicadas en la apoptosis o en la regulación de la apoptosis. Preferiblemente, la secuencia de ADN que codifica dominios repetidos de una proteína heteróloga o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes está flanqueada en su extremo 3' por una secuencia de ADN homóloga a la secuencia de ADN del cromosoma o del plásmido de virulencia endógeno en el extremo 3' de la señal de administración de una proteína efectora bacteriana o de un fragmento de la misma. Más preferiblemente, esta secuencia de ADN que flanquea la proteína homóloga en su extremo 3' es homóloga a la secuencia de ADN y se encuentra dentro de 10 kpb en el cromosoma o en un plásmido de virulencia endógeno en el extremo 3' de la señal de administración de una proteína efectora bacteriana o de un fragmento de la misma. En particular, esta secuencia de nucleótidos que flanquea la proteína homóloga en su extremo 3' es homóloga a la secuencia de ADN y está dentro del mismo operón en el cromosoma o en un plásmido de virulencia endógeno que la señal de administración de una proteína efectora bacteriana o un fragmento de la misma. En esta realización, la transformación se realiza habitualmente de modo que la primera y la segunda secuencia de ADN fusionadas se insertan mediante recombinación homóloga en un plásmido de virulencia endógeno o un cromosoma, preferiblemente en un plásmido de virulencia endógeno, de la cepa bacteriana Gram negativa con virulencia atenuada recombinante, y la primera y la segunda secuencia de ADN fusionadas están unidas operativamente a un promotor de un plásmido de virulencia endógeno o de un cromosoma, p. ej., de una isla de patogenicidad cromosómica. Preferiblemente, la primera y la segunda secuencia de ADN fusionadas están unidas operativamente a un promotor de un plásmido de virulencia endógeno. En esta realización, la primera secuencia de ADN comprende una señal de administración o un fragmento de la misma de una proteína efectora bacteriana, preferiblemente un fragmento de la misma, que proporciona una recombinación homóloga en el sitio homólogo en el cromosoma o en un plásmido de virulencia endógeno para dar como resultado que la segunda secuencia de ADN se sitúe en marco respecto al extremo 3' de la señal de administración cromosómica o del plásmido de virulencia endógeno que está unida operativamente al promotor endógeno.

En una realización adicional de la presente invención, la cepa bacteriana Gram negativa recombinante, se transforma con una molécula de nucleótidos, preferiblemente una molécula de nucleótidos de ADN, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica dominios repetidos de una proteína heteróloga o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes y una secuencia de nucleótidos que es homóloga o idéntica a una secuencia de nucleótidos que codifica una señal de administración de una proteína efectora bacteriana o que es homóloga o idéntica a una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento de una señal de administración de una proteína efectora bacteriana, en donde la señal de administración de una proteína efectora bacteriana está codificada en el cromosoma o en un plásmido de virulencia endógeno de la cepa bacteriana Gram negativa con virulencia atenuada recombinante. Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos que es homóloga o idéntica a una secuencia de nucleótidos de una señal de administración de una proteína efectora bacteriana o de un fragmento de la misma está ubicada en el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica dominios repetidos de una proteína heteróloga o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes. Más preferiblemente, la secuencia de nucleótidos que codifica dominios repetidos de una proteína heteróloga o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes está flanqueada en su extremo 3' por una secuencia de nucleótidos homóloga a la secuencia de ADN del cromosoma o del plásmido de virulencia endógeno en el extremo 3' de la señal de administración de una proteína efectora bacteriana o de un fragmento de la misma. Incluso más preferiblemente, esta secuencia de nucleótidos que flanquea la proteína homóloga en su extremo 3' es homóloga a la secuencia de ADN que se encuentra dentro de los 10 kbp en el cromosoma o en un plásmido de virulencia endógeno en el extremo 3' de la señal de administración de una proteína efectora bacteriana o de un fragmento de la misma. En particular, esta secuencia de nucleótidos que flanquea la proteína homóloga en su extremo 3' es homóloga a la secuencia de ADN que se encuentra dentro del mismo operón en el cromosoma o en un plásmido de virulencia endógeno como la señal de administración de una proteína efectora bacteriana o un fragmento de la misma. En esta realización, la transformación se realiza normalmente de modo que la secuencia de nucleótidos que codifica dominios repetidos de una proteína heteróloga o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes se inserta en un plásmido de virulencia endógeno o un cromosoma de la cepa bacteriana Gram negativa con virulencia atenuada recombinante en el extremo 3' de una señal de administración de una proteína efectora bacteriana codificada por el cromosoma o el plásmido de virulencia endógeno, en donde se expresan y secretan los dominios repetidos de una proteína heteróloga o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes fusionadas con la señal de administración.

En el caso en el que la cepa bacteriana Gram negativa con virulencia atenuada recombinante sea una cepa de Yersinia, el plásmido de virulencia endógeno para la inserción es pYV (plásmido de Virulencia de Yersinia ). En el caso en el que la cepa bacteriana Gram negativa con virulencia atenuada recombinante sea una cepa de Salmonella, la ubicación endógena para la inserción es uno de los grupos de genes denominados Spil o Spill (para isla de patogenicidad de Salmonella), una posición donde una proteína efectora está codificada en otra parte o, alternativamente, uno de los plásmidos de virulencia de Salmonella (SVP).

Preferiblemente, la primera y la segunda secuencia de ADN o la molécula de nucleótidos se insertan en un plásmido de virulencia endógeno en el sitio nativo de una proteína efectora bacteriana, p. ej., en el sitio nativo de un factor de virulencia, preferiblemente en el caso en el que la cepa bacteriana Gram negativa con virulencia atenuada recombinante sea una cepa de Yersinia, en el sitio nativo de YopE u otro Yop (YopH, YopO, YopP, YopM, YopT), preferiblemente en el sitio nativo de YopE o en el caso en el que la cepa bacteriana Gram negativa con virulencia atenuada recombinante sea una cepa de Salmonella en el sitio nativo de una proteína efectora codificada dentro de SpiI, Spill o codificada en otro lugar, preferiblemente en el sitio nativo de una proteína efectora codificada dentro de Spil o Spill, más preferiblemente en el sitio nativo de SopE o SteA. Preferiblemente, la primera y la segunda secuencia de ADN o la molécula de nucleótidos están unidas operativamente a un promotor nativo de una proteína efectora bacteriana presente en un plásmido de virulencia endógeno, p. ej., en el caso en el que la cepa bacteriana Gram negativa con virulencia atenuada recombinante sea una cepa de Yersinia a un promotor nativo de un gen del virulón de Yersinia como se describe a continuación, más preferiblemente al promotor YopE nativo u otro promotor Yop (YopH, YopO, YopP, YopM, YopT), preferiblemente al promotor YopE nativo o en el caso en el que la cepa bacteriana Gram negativa con virulencia atenuada recombinante sea una cepa de Salmonella a un promotor nativo de la isla de patogenicidad Spil o Spill o de una proteína efectora codificada en otro lugar como se describe a continuación, más preferiblemente al promotor nativo SopE, InvB o SteA.

En una realización, la presente invención proporciona una cepa bacteriana Gram negativa recombinante, en la que la cepa bacteriana Gram negativa se selecciona del grupo que consiste en los géneros Yersinia, Escherichia, Salmonella y Pseudomonas. En una realización, la presente invención proporciona una cepa bacteriana Gram negativa recombinante, en la que la cepa bacteriana Gram negativa se selecciona del grupo que consiste en los géneros Yersinia y Salmonella. Preferiblemente, la cepa bacteriana Gram negativa es una cepa de Yersinia, más preferiblemente un cepa de Yersinia enterocolitica. La más preferida es Yersinia enterocolitica E40 (0:9, biotipo 2) [21] o derivados sensibles a la ampicilina de la misma como Y. enterocolitica MRS40 (también llamada Y. enterocolitica subesp. palearctica MRS40) como se describe en [22]. Y. enterocolitica E40 y su derivado Y. enterocolitica MRS40 como se describe en [22] es idéntica a Y. enterocolitica subesp. palearctica E40 y su derivado Y. enterocolitica subesp. palearctica MRS40 como se describe en [23-25]. También preferiblemente, la cepa bacteriana Gram negativa es una cepa de Salmonella, más preferiblemente una cepa de Salmonella enterica. La más preferida es Salmonella enterica Serovar Typhimurium SL1344 como se describe en la colección de cultivos de Public Health England (NCTC 13347). La señal de administración de una proteína efectora de T3SS bacteriano comprende

SopE, SteA o YopE o un fragmento N-terminal del mismo, más en particular SteA o YopE o un fragmento N-terminal del mismo, más en particular YopE o un fragmento N-terminal del mismo.

En algunas realizaciones, la señal de administración de la proteína efectora de T3SS bacteriano codificada por la primera secuencia de ADN comprende la proteína efectora de T3SS bacteriano o un fragmento N-terminal de la misma, en donde el fragmento N-terminal de la misma incluye al menos los primeros 10, preferiblemente al menos los primeros 20, más preferiblemente al menos los primeros 100 aminoácidos de la proteína efectora de T3SS bacteriano.

En algunas realizaciones, la señal de administración de la proteína efectora de T3SS bacteriano codificada por la primera secuencia de ADN comprende la proteína efectora de T3SS bacteriano o un fragmento N-terminal de la misma, en donde la proteína efectora de T3SS bacteriano o el fragmento N-terminal de la misma comprende un sitio de unión de chaperona.

Las proteínas efectoras de T3SS preferidas o un fragmento N-terminal de las mismas, que comprenden un sitio de unión de chaperona, comprenden las siguientes combinaciones de sitio de unión de chaperona y proteína efectora de T3SS o fragmento N-terminal de la misma: SycE-YopE, InvB-SopE. El más preferido es un YopE o un fragmento N-terminal del mismo que comprende el sitio de unión de chaperona SycE, tal como un fragmento N-terminal de una proteína efectora YopE que contiene los 138 aminoácidos N-terminales de la proteína efectora YopE designada en la presente memoria como YopE1-138 y como se muestra en la SEQ ID NO.2 o una SopE o un fragmento N-terminal de la misma que comprende los sitios de unión de chaperona InvB tal como un fragmento N-terminal de una proteína efectora SopE que contiene los 81 o 105 aminoácidos N-terminales de la proteína efectora SopE designada en la presente memoria como SopE1-81 o SopE1-105 respectivamente, y como se muestra en la SEQ ID NO.: 142 o 143.

En una realización de la presente invención, la cepa bacteriana Gram negativa recombinante es una cepa de Yersinia y la señal de administración de la proteína efectora de T3SS bacteriano codificada por la primera secuencia de ADN comprende una proteína efectora YopE o una parte N-terminal, preferiblemente la proteína efectora YopE de Y. enterocolitica o una parte N-terminal de la misma. Preferiblemente, el sitio de unión de SycE está comprendido dentro de la parte N-terminal de la proteína efectora YopE. A este respecto, un fragmento N-terminal de una proteína efectora YopE puede comprender los 12, 16, 18, 52, 53, 80 o 138 aminoácidos N-terminales [26-28]. El más preferido es un fragmento N-terminal de una proteína efectora YopE que contiene los 138 aminoácidos N-terminales de la proteína efectora YopE, p. ej., como se describe en Forsberg y Wolf-Watz [29] designado en la presente memoria como YopE1-138 y como se muestra en la SEQ ID NO.: 2.

En una realización de la presente invención, la cepa bacteriana Gram negativa recombinante es una cepa de Salmonella y la señal de administración de la proteína efectora de T3SS bacteriano codificada por la primera secuencia de ADN comprende una proteína efectora SopE o SteA o una parte N-terminal de la misma, preferiblemente la proteína efectora SopE o SteA de Salmonella enterica o una parte N-terminal de la misma. Preferiblemente, el sitio de unión de chaperona está comprendido dentro de la parte N-terminal de la proteína efectora SopE. A este respecto, un fragmento N-terminal de una proteína de proteína efectora SopE puede comprender los 81 o 105 aminoácidos N-terminales. El más preferido es el SteA de longitud completa y un fragmento N-terminal de una proteína efectora SopE que contiene los 105 aminoácidos N-terminales de la proteína efectora, p. ej., como se describe en la SEQ ID NO. 142 o 143.

Un experto en la técnica está familiarizado con métodos para identificar las secuencias de polipéptidos de una proteína efectora que son capaces de administrar una proteína. Por ejemplo, uno de dichos métodos es descrito por Sory et. al. [21]. Brevemente, las secuencias de polipéptidos de p. ej., varias porciones de las proteínas Yop se pueden fusionar en marco con una enzima informadora tal como el dominio de adenilato ciclasa activado por calmodulina (o Cya) de la ciclolisina de Bordetella pertussis. La administración de una proteína híbrida Yop-Cya en el citosol de células eucariotas está indicada por la aparición de actividad ciclasa en las células eucariotas infectadas que conduce a la acumulación de AMPc. Empleando este enfoque, un experto en la técnica puede determinar, si lo desea, el requisito de secuencia mínima, es decir, una secuencia de aminoácidos contigua de la longitud más corta, que es capaz de administrar una proteína, véase, p. ej., [21]. Por consiguiente, las señales de administración preferidas de la presente invención consisten en al menos la secuencia mínima de aminoácidos de una proteína efectora de T3SS que es capaz de administrar una proteína.

En una realización, la presente invención proporciona cepas bacterianas Gram negativas recombinantes mutantes, en particular, cepas bacterianas Gram negativas recombinantes que son deficientes en la producción de al menos una proteína efectora funcional de T3SS. Según la presente invención, dicha cepa bacteriana Gram negativa mutante, p. ej., dicha cepa de Yersinia mutante, se puede generar introduciendo al menos una mutación en al menos un gen que codifica el efector. Preferiblemente, dichos genes que codifican efectores incluyen YopE, YopH, YopO/YpkA, YopM, YopP/YopJ y YopT en lo que respecta a una cepa de Yersinia. Preferiblemente, dichos genes que codifican efectores incluyen AvrA, CigR, GogB, GtgA, GtgE, PipB, SifB, SipA/SspA, SipB, SipC/SspC, SipD/SspD, SlrP, SopB/SigD, SopA, SpiC/SsaB, SseB SseC, SseD, SseF, SseG, SseI/SrfH, SopD, SopE, SopE2, SspH1, SspH2, PipB2, SifA, SopD2, SseJ, SseK1, SseK2, SseK3, SseL, SteC, SteA, SteB, SteD SteE, SpvB, SpvC, SpvD, SrfJ, SptP, en lo que respecta a una cepa de Salmonella. Lo más preferiblemente, se delecionan todos los genes que codifican efectores. El experto en la técnica puede emplear cualquier número de técnicas estándar para generar mutaciones en estos genes efectores de T3SS. Sambrook et al. describen en general dichas técnicas. Véase, Sambrook et al. [30].

Según la presente invención, la mutación se puede generar en la región promotora de un gen que codifica el efector de modo que se suprima la expresión de dicho gen de efector.

La mutación también se puede generar en la región codificante de un gen que codifica el efector de manera que se suprima la actividad catalítica de la proteína efectora codificada. La "actividad catalítica" de una proteína efectora se refiere normalmente a la función anti-célula diana de una proteína efectora, es decir, toxicidad. Dicha actividad está gobernada por los restos catalíticos en el dominio catalítico de una proteína efectora. Los enfoques para identificar el dominio catalítico y/o los restos catalíticos de una proteína efectora son bien conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, [31,32].

Por consiguiente, una mutación preferida de la presente invención es una deleción del dominio catalítico completo. Otra mutación preferida es una mutación con desplazamiento de marco en un gen que codifica el efector, de manera que el dominio catalítico no está presente en el producto proteico expresado a partir de dicho gen "con desplazamiento de marco". Una mutación más preferida es una mutación con la deleción de la región codificante completa de la proteína efectora. La presente invención también contempla otras mutaciones, tales como pequeñas deleciones o sustituciones de pares de bases, que se generan en los restos catalíticos de una proteína efectora que conducen a la destrucción de la actividad catalítica de una proteína efectora dada.

Las mutaciones que se generan en los genes de las proteínas efectoras funcionales de T3SS pueden introducirse en la cepa particular mediante varios métodos. Uno de dichos métodos implica la clonación de un gen mutado en un vector "suicida" que es capaz de introducir la secuencia mutada en la cepa mediante intercambio alélico. [33] describe un ejemplo de un vector "suicida" de este tipo.

De esta manera, las mutaciones generadas en múltiples genes pueden introducirse sucesivamente en una cepa bacteriana Gram negativa dando lugar a polimutantes, p. ej., una cepa recombinante mutante séxtuple. El orden en el que se introducen estas secuencias mutadas no es importante. En algunas circunstancias, se puede desear mutar solo algunos, pero no todos, los genes efectores. Por consiguiente, la presente invención contempla además Yersinia polimutante que no sea Yersinia mutante séxtuple, p. ej., cepas mutantes dobles, mutantes triples, mutantes cuádruples y mutantes quíntuples. Con el fin de administrar proteínas, el sistema de secreción y translocación de la presente cepa mutante debe estar intacto.

Una cepa bacteriana Gram negativa recombinante preferida de la presente invención es una cepa bacteriana Gram negativa recombinante que es deficiente para la producción de al menos una, preferiblemente al menos dos, más preferiblemente al menos tres, incluso más preferiblemente al menos cuatro, en particular menos cinco, más en particular al menos seis, más en particular todas las proteínas efectoras de T3SS, p. ej., una cepa bacteriana Gram negativa mutante séxtuple en la que todos los genes que codifican efectores están mutados de manera que la cepa bacteriana Gram negativa resultante ya no produce ninguna proteína efectora funcional.

Una cepa bacteriana Gram negativa recombinante más preferida de la presente invención es una cepa de Yersinia muíante séxtuple en la que todos los genes que codifican efectores están mutados de modo que la Yersinia resultante ya no produce proteínas efectoras funcionales. Dicha cepa de Yersinia mutante séxtuple se designa como AyopH,O,P,E,M,T para Y. enterocolitica. Como ejemplo, un mutante séxtuple se puede producir a partir de la cepa de Y. enterocolitica MRS40 que da lugar a Y. enterocolitica MRS40 AyopH,O,P,E,M,T, que se prefiere.

Un aspecto adicional de la presente invención está dirigido a un vector para su uso en combinación con las cepas bacterianas Gram negativas recombinantes para administrar una proteína deseada en células eucariotas, en donde el vector comprende en la dirección 5' a 3':

un promotor;

una primera secuencia de ADN que codifica una señal de administración de una proteína efectora de T3SS bacteriano, unida operativamente a dicho promotor;

en donde la señal de administración de la proteína efectora de T3SS bacteriano comprende la proteína efectora YopE o un fragmento N-terminal de la misma o la proteína efectora SopE o SteA o un fragmento N-terminal de la misma;

una segunda secuencia de ADN que codifica dominios repetidos de una proteína heteróloga, en donde los dominios repetidos de una proteína heteróloga comprenden una proteína de fusión que consiste en varias repeticiones de un dominio de una proteína heteróloga, o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes, en donde los dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes comprenden una proteína de fusión que consiste en una o varias repeticiones de al menos dos dominios de proteínas heterólogas diferentes fusionados en marco al extremo 3' de dicha primera secuencia de ADN, en donde las proteínas heterólogas son proteínas implicadas en la apoptosis o e la regulación de la apoptosis.

El promotor, la proteína heteróloga y el sitio de escisión de proteasa como se ha descrito anteriormente pueden usarse para el vector de la cepa bacteriana Gram negativa.

una primera secuencia de ADN que codifica una señal de administración o un fragmento de la misma de una proteína efectora de T3SS bacteriano, en donde la señal de administración de la proteína efectora de T3SS bacteriano comprende la proteína efectora YopE o un fragmento N-terminal de la misma o la proteína efectora SopE o SteA o un fragmento N-terminal de la misma; y

una segunda secuencia de ADN que codifica dominios repetidos de una proteína heteróloga, en donde los dominios repetidos de una proteína heteróloga comprenden una proteína de fusión que consiste en varias repeticiones de un dominio de una proteína heteróloga, o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes, en donde los dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes comprenden una proteína de fusión que consiste en una o varias repeticiones de al menos dos dominios de proteínas heterólogas diferentes, fusionados en marco al extremo 3' de dicha primera secuencia de ADN, en donde las proteínas heterólogas son proteínas implicadas en la apoptosis o en la regulación de la apoptosis.

Preferiblemente, la secuencia de ADN que codifica dominios repetidos de una proteína heteróloga o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes del vector está flanqueada en su extremo 3' por una secuencia de ADN homóloga a la secuencia de ADN del cromosoma o del plásmido de virulencia endógeno en el extremo 3' de la señal de administración de una proteína efectora bacteriana o de un fragmento de la misma. Más preferiblemente, esta secuencia de ADN que flanquea la proteína homóloga en su extremo 3' es homóloga a la secuencia de ADN y se encuentra dentro de 10 kpb en el cromosoma o en un plásmido de virulencia endógeno en el extremo 3' de la señal de administración de una proteína efectora bacteriana o un fragmento de la misma. En particular, esta secuencia de nucleótidos que flanquea la proteína homóloga en su extremo 3' es homóloga a la secuencia de ADN y está dentro del mismo operón en el cromosoma o en un plásmido de virulencia endógeno como la señal de administración de una proteína efectora bacteriana o un fragmento de la misma. La proteína heteróloga y el sitio de escisión de proteasa como se ha descrito anteriormente se pueden usar para el vector de la cepa bacteriana Gram negativa.

Los vectores que pueden usarse según la invención dependen de las cepas bacterianas Gram negativas usadas como es conocido por el experto. Los vectores que pueden usarse según la invención incluyen vectores de expresión (incluidas versiones sintéticas o modificadas generadas de otro modo de plásmidos de virulencia endógenos), vectores para la inserción de cromosómica o plásmidos de virulencia y fragmentos de ADN para la inserción cromosómica o de plásmidos de virulencia. Los vectores de expresión que son útiles, p. ej., en cepas de Yersinia, Escherichia, Salmonella o Pseudomonas son, p. ej., plásmidos pUC, pBad, pACYC, pUCP20 y pET. Los vectores para la inserción cromosómica o de plásmidos de virulencia que son útiles p. ej., en cepas de Yersinia, Escherichia, Salmonella o Pseudomonas son, p. ej., pKNG101. Los fragmentos de ADN para la inserción cromosómica o de plásmidos de virulencia se refieren a métodos utilizados, p. ej., en cepas de Yersinia, Escherichia, Salmonella o Pseudomonas como, p. ej., ingeniería genética lambda-rojo. Los vectores para la inserción cromosómica o de plásmidos de virulencia o los fragmentos de ADN para la inserción cromosómica o de plásmidos de virulencia pueden insertar la primera, segunda y/o tercera secuencia de ADN de la presente invención de modo que la primera, segunda y/o tercera secuencia de ADN esté unida operativamente a un promotor endógeno de la cepa bacteriana Gram negativa recombinante. Por lo tanto, si se usa un vector para la inserción cromosómica o de plásmidos de virulencia o un fragmento de ADN para la inserción cromosómica o de plásmidos de virulencia, se puede codificar un promotor endógeno en el ADN bacteriano endógeno (ADN cromosómico o plasmídico) y solo la primera y segunda secuencia de ADN serán proporcionadas por el vector diseñado para la inserción cromosómica o de plásmido de virulencia o fragmento de ADN para la inserción cromosómica o de plásmido virulencia. Alternativamente, si se usa un vector para la inserción cromosómica o de plásmido de virulencia o una molécula de nucleótidos como p. ej. una secuencia de ADN para la inserción cromosómica o de plásmido de virulencia, un promotor endógeno y la señal de administración de una proteína efectora bacteriana pueden codificarse en el ADN bacteriano endógeno (ADN cromosómico o plasmídico) y solo la molécula de nucleótido, tal como, p. ej., una secuencia de ADN que codifica la proteína heteróloga será proporcionada por un vector para la inserción cromosómica o de plásmido de virulencia o por una molécula de nucleótidos tal como, p. ej., una secuencia de ADN para la inserción cromosómica o de plásmido de virulencia. Por tanto, no es necesario que un promotor esté comprendido por el vector usado para la transformación de las cepas bacterianas Gram negativas recombinantes, es decir, las cepas bacterianas Gram negativas recombinantes de la presente invención pueden transformarse con un vector cuya dosis no comprende un promotor. El vector de la presente invención se usa normalmente para la administración de proteínas heterólogas por el T3SS bacteriano en células eucariotas in vitro e in vivo.

Un vector preferido, p. ej., un vector de expresión preferido para Yersinia se selecciona del grupo que consiste en pBad_Si_1 y pBad_Si_2. pBad_Si2 se construyó mediante la clonación del fragmento SycE-YopE1-138 que contiene promotores endógenos para YopE y SycE de pYV40 purificado en el sitio KpnI/HindIII de pBad-MycHisA (Invitrogen). Las modificaciones adicionales incluyen la eliminación del fragmento NcoI/BglII de pBad-MycHisA por digestión, tratamiento del fragmento Klenow y religación. Más allá en el extremo 3' de YopE1-138 se añadieron los siguientes sitios de escisión: XbaI-XhoI-BstBI-(HindIII). pBad_Si1 es igual a pBad_Si2 pero codifica EGFP amplificado a partir de pEGFP-C1 (Clontech) en el sitio NcoI/BglII bajo el promotor inducible por arabinosa. Igualmente preferido es el uso de versiones modificadas del plásmido de virulencia de Yersinia endógeno pYV que codifica proteínas heterólogas como fusiones con una secuencia señal de T3SS. Un vector preferido, p. ej., un vector de expresión preferido para Salmonella se selecciona del grupo que consiste en pSi_266, pSi_267, pSi_268 y pSi_269. Los plásmidos pSi_266, pSi_267, pSi_268 y pSi_269 que contienen el promotor endógeno correspondiente y el fragmento SteA1-20 (pSi_266), la secuencia SteA de longitud completa (pSi_267), el fragmento SopE1-81 (pSi_268) o el fragmento SopE1-105 (pSi_269) fueron amplificados a partir del ADN genómico de S. entérica SL1344 y se clonaron en el sitio NcoI/KpnI de pBad-MycHisA (Invitrogen).

Los vectores de la presente invención pueden incluir otros elementos de secuencia tales como una secuencia de terminación en 3' (que incluye un codón de parada y una secuencia poli A), o un gen que confiere una resistencia a fármaco que permite la selección de transformantes que han recibido el presente vector .

Los vectores de la presente invención pueden transformarse mediante varios métodos conocidos en las cepas bacterianas Gram negativas recombinantes. Para el propósito de la presente invención, los métodos de transformación para introducir un vector incluyen, pero no están limitadas a, electroporación, transformación mediada por fosfato de calcio, conjugación o combinaciones de las mismas. Por ejemplo, un vector se puede transformar en una primera cepa bacteriana mediante un procedimiento de electroporación estándar. Posteriormente, dicho vector se puede transferir desde la primera cepa bacteriana a la cepa deseada por conjugación, un proceso también llamado "movilización". El transformante (es decir, las cepas bacterianas Gram negativas que han captado el vector) se puede seleccionar, p. ej., con antibióticos. Estas técnicas son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, [21].

Según la presente invención, el promotor del vector de expresión de la cepa bacteriana Gram negativa recombinante de la invención puede ser un promotor nativo de una proteína efectora de T3SS de la respectiva cepa o una cepa bacteriana compatible o un promotor usado en vectores de expresión. que son útiles p. ej., en cepas de Yersinia, Escherichia, Salmonella o Pseudomonas, p. ej., pUC y pBad. Dichos promotores son el promotor T7, el promotor Plac o el promotor Ara-bad.

Si la cepa bacteriana Gram negativa recombinante es una cepa de Yersinia el promotor puede ser de ungen de virulón de Yersinia. Un "gen de virulón de Yersinia" se refiere a genes en el plásmido pYV de Yersinia, cuya expresión está controlada tanto por la temperatura como por el contacto con una célula diana. Dichos genes incluyen genes que codifican elementos de la maquinaria de secreción (los genes Ysc), genes que codifican translocadores (YopB, YopD y LcrV), genes que codifican elementos de control (YopN, TyeA y LcrG), genes que codifican chaperonas efectoras de T3SS (SycD, SycE, SycH, SycN, SycO y SycT), y genes que codifican efectores (YopE, YopH, YopO/YpkA, YopM, YopT y YopP/YopJ), así como otras proteínas codificadas por pYV como VirF y YadA.

En una realización preferida de la presente invención, el promotor es el promotor nativo de un gen que codifica el efector funcional de T3SS. Si la cepa bacteriana Gram negativa recombinante es una cepa de Yersinia el promotor se selecciona de uno cualquiera de YopE, YopH, YopO/YpkA, YopM y YopP/YopJ. Más preferiblemente, el promotor es de YopE o SycE.

Si la cepa bacteriana Gram negativa recombinante es una cepa de Salmonella el promotor puede ser de la isla de patogenicidad Spil o Spill o de una proteína efectora codificada en otro lugar. Dichos genes incluyen genes que codifican elementos de la maquinaria de secreción, genes que codifican translocadores, genes que codifican elementos de control, genes que codifican chaperonas efectoras de T3SS y genes que codifican efectores, así como otras proteínas codificadas por SPI-1 o SPI-2. En una realización preferida de la presente invención, el promotor es el promotor nativo de un gen que codifica el efector funcional de T3SS. Si la cepa bacteriana Gram negativa recombinante es una cepa de Salmonella el promotor se selecciona de una cualquiera de las proteínas efectoras. Más preferiblemente, el promotor es de SopE, InvB o SteA.

En una realización preferida, el vector, p. ej., el vector de expresión comprende una secuencia de ADN que codifica un sitio de escisión de proteasa. La generación de un sitio de escisión funcional y generalmente aplicable permite la eliminación por escisión de la señal de administración después de la translocación. Como la señal de administración puede interferir con la localización y/o función correctas de la proteína translocada dentro de las células diana, la introducción de un sitio de escisión de proteasa entre la señal de administración y la proteína de interés proporciona por primera vez la administración de proteínas casi nativas en células eucariotas. Preferiblemente, el sitio de escisión de proteasa es un resto de aminoácidos que es escindido por una proteasa, o los dominios catalíticos de la misma, seleccionada del grupo que consiste en enteroquinasa (cadena ligera), enteropeptidasa, proteasa de precisión, proteasa de rinovirus humano 3C, proteasa TEV, proteasa TVMV, proteasa FactorXa y trombina, más preferiblemente un resto de aminoácidos que es escindido por la proteasa de TEV. Igualmente preferible, el sitio de escisión de proteasa es un resto de aminoácidos que es escindido por una proteasa, o los dominios catalíticos de la misma, seleccionada del grupo que consiste en enteroquinasa (cadena ligera), enteropeptidasa, proteasa de precisión, proteasa de rinovirus humano 3C, proteasa TEV, proteasa TVMV, proteasa FactorXa, proteasa de procesamiento de ubiquitina, llamadas enzimas desubiquitinantes y trombina. El más preferido es un resto de aminoácidos que es escindido por la proteasa TEV o por una proteasa de procesamiento de ubiquitina.

Por tanto, en una realización adicional de la presente invención, la proteína heteróloga se escinde de la señal de administración de una proteína efectora de T3SS bacteriano mediante una proteasa. Los métodos preferidos de escisión son métodos en los que:

a) la proteasa se transloca en la célula eucariota por una cepa bacteriana Gram negativa recombinante como se describe en la presente memoria que expresa una proteína de fusión que comprende la señal de administración de la proteína efectora de T3SS bacteriano y la proteasa como proteína heteróloga; o

b) la proteasa se expresa de forma constitutiva o transitoria en la célula eucariota. Normalmente, la cepa bacteriana Gram negativa recombinante usada para administrar una proteína deseada en una célula eucariota y la cepa bacteriana Gram negativa recombinante que transloca la proteasa en la célula eucariota son diferentes.

En una realización de la presente invención, el vector comprende una secuencia de ADN adicional que codifica una molécula marcadora o un sitio aceptor para una molécula marcadora. La secuencia de ADN adicional que codifica una molécula marcadora o un sitio aceptor para una molécula marcadora normalmente se fusiona con el extremo 5' o con el extremo 3' de la segunda secuencia de ADN. Una molécula marcadora preferida o un sitio aceptor para una molécula marcadora se selecciona del grupo que consiste en proteína fluorescente verde mejorada (EGFP), cumarina, sitio aceptor de cumarina ligasa, resorufina, sitio aceptor de resurofina ligasa, el resto tetra-cisteína en uso con tinte FlAsH/ReAsH (life technologies). El más preferido es resorufina y un sitio aceptor de resurofina ligasa o EGFP. El uso de una molécula marcadora o un sitio aceptor para una molécula marcadora conducirá a la unión de una molécula marcadora a la proteína heteróloga de interés, que luego se administrará como tal en la célula eucariota y permitirá el seguimiento de la proteína, p. ej., por microscopía en células vivas.

En una realización de la presente invención, el vector comprende una secuencia de ADN adicional que codifica una etiqueta peptídica. La secuencia de ADN adicional que codifica una etiqueta peptídica normalmente se fusiona con el extremo 5' o con el extremo 3' de la segunda secuencia de ADN. Una etiqueta peptídica preferida se selecciona del grupo que consiste en etiqueta Myc, etiqueta His, etiqueta Flag, etiqueta HA, etiqueta Strep o etiqueta V5 o una combinación de dos o más etiquetas de estos grupos. Las más preferidas son etiqueta Myc, etiqueta Flag, etiqueta His y etiquetas Myc e His combinadas. El uso de una etiqueta peptídica conducirá a la trazabilidad de la proteína etiquetada, p. ej., mediante inmunofluorescencia o transferencia Western usando anticuerpos anti-etiqueta. Además, el uso de una etiqueta peptídica permite la purificación por afinidad de la proteína deseada, ya sea después de la secreción en el sobrenadante del cultivo o después de la translocación en células eucariotas, en ambos casos utilizando un método de purificación adecuado a la etiqueta correspondiente (p. ej., purificación por afinidad de quelatos metálicos en uso con una purificación basada en anticuerpos frente a la etiqueta His o anti-Flag en uso con la etiqueta Flag).

En una realización de la presente invención, el vector comprende una secuencia de ADN adicional que codifica una señal de localización nuclear (NLS). La secuencia de ADN adicional que codifica una señal de localización nuclear (NLS) normalmente se fusiona con el extremo 5' o con el extremo 3' de la segunda secuencia de ADN en donde dicha secuencia de ADN adicional codifica una señal de localización nuclear (NLS). Una NLS preferida se selecciona del grupo que consiste en NLS de antígeno T grande de SV40 y derivados del mismo [34], así como otras NLS virales. El más preferido es la NLS del antígeno T grande de SV40 y los derivados del mismo.

En una realización de la presente invención, el vector comprende un sitio de clonación múltiple. El sitio de clonación múltiple se localiza normalmente en el extremo 3' de la primera secuencia de ADN y/o en el extremo 5' o 3' de la segunda secuencia de ADN. El vector puede comprender uno o más de un sitio de clonación múltiple. Un sitio de clonación múltiple preferido se selecciona del grupo de enzimas de restricción que consisten en XhoI, Xbal, HindIII, Ncol, NotI, EcoRI, EcoRV, BamHI, Nhel, SacI, SalI, BstBI. Los más preferidos son Xbal, Xhol, BstBI y HindIII.

La proteína fusionada expresada a partir de la primera y segunda y tercera secuencia de ADN opcional del vector también se denomina una "proteína de fusión" o una "proteína híbrida", es decir, una proteína fusionada o híbrido de la señal de administración y dominios repetidos de una proteína heteróloga o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes.

La presente solicitud contempla un método para administrar dominios repetidos de una proteína heteróloga o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes como se ha descrito anteriormente en la presente memoria en células eucariotas en cultivo celular así como in vivo.

Por tanto, en una realización, el método para administrar dominios repetidos de una proteína heteróloga o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes comprende

i) cultivar la cepa bacteriana Gram negativa como se describe en la presente memoria;

ii) poner en contacto una célula eucariota con la cepa bacteriana Gram negativa de i) en donde una proteína de fusión que comprende una señal de administración de una proteína efectora de T3SS bacteriano y los dominios repetidos de una proteína heteróloga o los dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes es expresada por la cepa bacteriana Gram negativa y se transloca en la célula eucariota; y opcionalmente

En algunas realizaciones, al menos dos proteínas de fusión que comprenden, cada una, una señal de administración de una proteína efectora bacteriana y dominios repetidos de una proteína heteróloga o los dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes son expresadas por la cepa bacteriana Gram negativa con virulencia atenuada recombinante y son translocadas en la célula eucariota mediante los métodos de la presente invención.

La cepa bacteriana Gram negativa recombinante se puede cultivar de modo que se exprese una proteína de fusión que comprende la señal de administración de la proteína efectora de T3SS bacteriano y los dominios repetidos de una proteína heteróloga o los dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes según métodos conocidos. en la técnica (p. ej., FDA, Bacteriological Analytical Manual (BAM), capítulo 8: Yersinia enterocolitica). Preferiblemente, la cepa bacteriana Gram negativa recombinante se puede cultivar en caldo de infusión Cerebro Corazón, p. ej., a 28 °C. Para la inducción de la expresión de T3SS y, p. ej., de genes dependientes del promotor YopE/SycE, las bacterias pueden cultivarse a 37 °C. En una realización preferida, la célula eucariota se pone en contacto con dos cepas bacterianas Gram negativas de i), en donde la primera cepa bacteriana Gram negativa expresa una primera proteína de fusión que comprende la señal de administración de la proteína efectora de T3SS bacteriano y dominios repetidos de una proteína heteróloga o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes y la segunda cepa bacteriana Gram negativa expresa una segunda proteína de fusión que comprende la señal de administración de la proteína efectora de T3SS bacteriano y dominios repetidos de una segunda proteína heteróloga o dos o más dominios de una segunda proteína heteróloga diferente de una segunda proteína heteróloga, de modo que la primera y la segunda proteína de fusión se translocan en la célula eucariota. Esta realización proporcionó la coinfección de, p. ej., células eucariotas con dos cepas bacterianas como un método válido para administrar, p. ej., dos proteínas híbridas diferentes en células individuales para abordar su interacción funcional.

Los expertos en la técnica también pueden utilizar una serie de ensayos para determinar si la administración de una proteína de fusión es exitosa. Por ejemplo, la proteína de fusión puede detectarse mediante inmunofluorescencia usando anticuerpos que reconocen una etiqueta fusionada (como la etiqueta Myc). La determinación también puede basarse en la actividad enzimática de la proteína que se administra.

La presente solicitud contempla una amplia gama de células eucariotas que pueden ser la diana de la presente cepa bacteriana Gram negativa recombinante , p. ej., Hi-5 (BTI-TN-5B1-4; life technologies B855-02), células HeLa, p. ej., HeLa Ccl2 (como ATCC No. CCL-2), células de fibroblastos, p. ej., células de fibroblastos 3T3 (como ATCC No. CCL-92) o Mef (como ATCC No. SCRC-1040), Hek (como ATCC No. CRL-1573), HUVEC (como ATCC No. PCS-100-013), CHO (como ATCC No. CCL-61), Jurkat (como ATCC No. TIB-152), Sf-9 (como ATCC No. CRL-1711), HepG2 (como ATCC No. HB-8065), Vero (como ATCC No. CCL-81), MDCK (como ATCC No. CCL-34), THP-1 (como ATCC No. TIB-202), J774 (como At CC No. TIB-67), RAW (como ATCC No. TIB-71), Caco2 (como ATCC No. HTB-37), líneas celulares n C i (como ATCC No. HTB-182), DU145 (como ATCC No. h Tb -81), Lncap (como ATCC No. CRL-1740), MCF-7 (como At CC No. HTB-22), líneas celulares MDA-MB (como ATCC No. Ht B-128), PC3 (como ATCC No. CRL-1435), T47D (como ATCC No. CRL-2865), A549 (como ATCC No. CCL-185), U87 (como ATCC No. HTB-14), SHSY5Y (como ATCC No. CRL-2266s), Ea.Hy926 (como ATCC No. CRL-2922), Saos-2 (como ATCC No. HTBH-85), 4T1 (como ATCC No. CRL-2539), B16F10 (como ATCC No. CRL-6475), o hepatocitos humanos primarios (como life technologies HMCPIS), preferiblemente HeLa, Hek, HUVEC, 3T3, c Ho , Jurkat, Sf-9, HepG2 Vero, THP-1, Caco2, Mef, A549, 4T1, B 16F10 y hepatocitos humanos primarios y lo más preferiblemente HeLa, Hek, HUVEC, 3T3, CHO, Jurkat, THP-1, A549 y Mef. Por "diana" se entiende la adhesión extracelular de la cepa bacteriana Gram negativa recombinante a una célula eucariota.

Según la presente solicitud, la administración de una proteína puede lograrse poniendo en contacto una célula eucariota con una cepa bacteriana Gram negativa recombinante en condiciones apropiadas. Las diversas referencias y técnicas están disponibles convencionalmente para los expertos en la técnica con respecto a las condiciones para inducir la expresión y translocación de genes de virulón, incluida la temperatura deseada, concentración de Ca++, adición de inductores como rojo Congo, formas en las que se mezclan la cepa bacteriana Gram negativa recombinante y las células diana, y similares. Véase, por ejemplo, [35]. Las condiciones pueden variar dependiendo del tipo de células eucariotas a las que se dirija y la cepa bacteriana recombinante que se utilice. Los expertos en la técnica pueden abordar dichas variaciones utilizando técnicas convencionales.

Los expertos en la técnica también pueden utilizar una serie de ensayos para determinar si la administración de una proteína de fusión es exitosa. Por ejemplo, la proteína de fusión puede detectarse mediante inmunofluorescencia usando anticuerpos que reconocen una etiqueta fusionada (como la etiqueta Myc). La determinación también puede basarse en la actividad enzimática de la proteína que se administra, p. ej., el ensayo descrito por [21].

En una realización, la presente invención proporciona la cepa bacteriana Gram negativa recombinante como se describe en la presente memoria para su uso en medicina.

En una realización, la presente invención proporciona la cepa bacteriana Gram negativa recombinante como se describe en la presente memoria para su uso en la administración de dominios repetidos de una proteína heteróloga o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes como medicamento o como vacuna a un sujeto. Los dominios repetidos de una proteína heteróloga o los dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes pueden administrarse a un sujeto como una vacuna poniendo en contacto la cepa bacteriana Gram negativa con células eucariotas, p. ej., con un animal vivo in vivo de modo que los dominios repetidos de una proteína heteróloga o los dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes se transloquen en el animal vivo que luego produce anticuerpos frente a los dominios repetidos de una proteína heteróloga o los dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes. Los anticuerpos producidos pueden usarse directamente o aislarse y purificarse y usarse en diagnóstico, en investigación, así como en terapia. Las células B que producen los anticuerpos o la secuencia de ADN contenida en ellos pueden usarse para la producción adicional de anticuerpos específicos para uso en diagnóstico, uso en investigación, así como en terapia.

En una realización, la presente solicitud proporciona un método para administrar dominios repetidos de una proteína heteróloga o los dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes, en donde los dominios repetidos de una proteína heteróloga o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes se administran in vitro en una célula eucariota.

En una realización adicional, la presente solicitud proporciona un método para administrar dominios repetidos de una proteína heteróloga o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes, en donde la célula eucariota es un animal vivo en donde el animal vivo se pone en contacto con la cepa bacteriana Gram negativa in vivo de modo que una proteína de fusión se transloque en el animal vivo. El animal preferido es un mamífero, más preferiblemente un ser humano.

En una realización adicional, la presente solicitud proporciona el uso de la cepa bacteriana Gram negativa recombinante como se ha descrito anteriormente para los cribados de alto rendimiento de inhibidores para una ruta celular o evento desencadenado por la proteína o proteínas heterólogas translocadas.

En un aspecto adicional, la presente solicitud proporciona una biblioteca de cepas bacterianas Gram negativas, en donde los dominios repetidos de una proteína heteróloga o los dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes codificadas por la segunda secuencia de ADN del vector de expresión de las cepas bacterianas Gram negativas son dominios de una proteína humana o murina, preferiblemente un dominio de una proteína humana y, en donde cada dominio de una proteína humana o murina expresado por una cepa bacteriana Gram negativa es diferente en la secuencia de aminoácidos. Como vector de clonación para la expresión, se pueden usar los vectores de expresión descritos anteriormente.

En un aspecto adicional, la presente solicitud proporciona un kit que comprende un vector como se describe en la presente memoria y una cepa bacteriana que expresa y secreta una proteasa capaz de escindir el sitio de escisión de proteasa comprendido por el vector. Un vector útil particular es un vector para su uso en combinación con la cepa bacteriana para administrar una proteína deseada en células eucariotas como se ha descrito anteriormente, en donde el vector comprende en la dirección 5' a 3':

un promotor;

una segunda secuencia de ADN que codifica dominios repetidos de una proteína heteróloga o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes fusionados en marco al extremo 3' de dicha primera secuencia de ADN,

en donde las proteínas heterólogas se seleccionan del grupo que consiste en proteínas implicadas en la apoptosis o en la regulación de la apoptosis, reguladores del ciclo celular, proteínas de repetición de anquirina, proteínas de señalización celular, proteínas informadoras, factores de transcripción, proteasas, pequeñas GTPasas, proteínas relacionadas con GPCR, construcciones de fusión de nanocuerpos y nanocuerpos, efectores de T3SS bacteriano, efectores de T4SS bacteriano y proteínas virales.

Ejemplos

Ejemplo 1:

A) Materiales y métodos

Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento. Las cepas utilizadas en este estudio se enumeran en las Fig. 15A a N. E. coli Top10, utilizada para la purificación y clonación de plásmidos, y E. coli Sm10 A pir, utilizada para la conjugación, así como E. coli BW19610 [36], utilizada para propagar pKNG101, se cultivaron de forma rutinaria en placas de agar LB y en caldo LB a 37 °C. Se utilizó ampicilina a una concentración de 200 pg/ml (Yersinia) o 100 pg/ml (E. coli) para seleccionar vectores de expresión. Se utilizó estreptomicina a una concentración de 100 pg/ml para seleccionar vectores suicidas. Y. enterocolitica MRS40 [22], un derivado de E40 no resistente a ampicilina [21] y las cepas derivadas del mismo se cultivaron de forma rutinaria en infusión de cerebro y corazón (BHI; Difco) a temperatura ambiente. A todas las cepas de Y. enterocolitica se añadió ácido nalidíxico (35 pg/ml) y todas las cepas de Y. enterocolitica asd se complementaron adicionalmente con 100 pg/ml de ácido meso-2,6-diaminopimélico (mDAP, Sigma Aldrich). S. enterica SL1344 se cultivó de forma rutinaria en placas de agar LB y en caldo LB a 37 °C. Se utilizó ampicilina a una concentración de 100 pg/ml para seleccionar vectores de expresión en S. enterica.

Manipulaciones genéticas de Y. enterocolitica. Las manipulaciones genéticas de Y. enterocolitica han sido descritas [37,38]. Brevemente, se construyeron mutadores para la modificación o deleción de genes en los plásmidos pYV o en el cromosoma mediante PCR superpuesta de 2 fragmentos utilizando el plásmido pYV40 purificado o ADN genómico como molde, lo que conduce a 200-250 pb de secuencias flanqueantes en ambos lados de la parte delecionada o modificada del gen respectivo. Los fragmentos resultantes se clonaron en pKNG101 [33] en E. coli BW19610 [36]. Los plásmidos de secuencia verificada se transformaron en E. coli Sm10 A pir, desde donde se movilizaron los plásmidos a la cepa correspondiente de Y. enterocolitica. Los mutantes que portaban el vector integrado se propagaron durante varias generaciones sin presión de selección. Después, se usó sacarosa para seleccionar los clones que habían perdido el vector. Finalmente, los mutantes se identificaron mediante PCR de colonias. Los mutadores específicos (pSi_408, pSi_419) se enumeran en la Tabla III.

Construcción de plásmidos. Se usó el plásmido pBad_Si2 o pBad_Si1 (Fig. 10) para la clonación de proteínas de fusión con los 138 aminoácidos N-terminales de YopE (SEQ ID No. 2). pBad_Si2 se construyó mediante la clonación del fragmento SycE-YopE1-138 que contiene promotores endógenos para YopE y SycE de pYV40 purificado en el sitio KpnI/HindIII de pBad-MycHisA (Invitrogen). Las modificaciones adicionales incluyen la eliminación del fragmento NcoI/BglII de pBad-MycHisA por digestión, tratamiento del fragmento Klenow y religación. Se clonó un terminador transcripcional bidireccional (BBa_B1006; fundación iGEM) en el corte Kpnl y se trató con Klenow (pBad_Si2) o en el sitio de corte BglII (pBad_Si1). Más allá en el extremo 3' de YopE1-138 se añadieron los siguientes sitios de escisión: XbaI-XhoI-BstBI-(HindIII) (Fig. 10 B). pBad_Si1 es igual a pBad_Si2 pero codifica EGFP amplificado a partir de pEGFP-C1 (Clontech) en el sitio NcoI/BglII bajo el promotor inducible por arabinosa. Los plásmidos pSi_266, pSi_267, pSi_268 y pSi_269 que contienen el promotor endógeno correspondiente y el fragmento SteA1-20 (pSi_266), la secuencia SteA de longitud completa (pSi_267), el fragmento SopE1-81 (pSi_268) o el fragmento SopE1-105 (pSi_269) fueron amplificados a partir del ADN genómico de S. enterica SL1344 y se clonaron en el sitio NcoI/KpnI de pBad-MycHisA (Invitrogen).

Los genes de longitud completa o fragmentos de los mismos se amplificaron con los cebadores específicos enumerados en la Tabla I a continuación y se clonaron como fusiones con YopE.1-138 en el plásmido pBad_Si2 o en el caso de z-BIM (SEQ ID No. 21) en pBad_Si1 (véase la Tabla II a continuación). Para la fusión con SteA o SopE, se escindieron las construcciones de ADN sintético con KpnI/HindII y se clonaron en pSi_266, pSi_267, pSi_268 o pSi_269 respectivamente. En el caso de genes de especies bacterianas, se utilizó como molde ADN genómico purificado (S. flexneri M90T, Salmonella enterica subesp. enterica serovar Typhimurium SL1344, Bartonella henselae ATCC 49882). Para los genes humanos, se usó una biblioteca de ADNc universal (Clontech) si no se indica lo contrario (Fig. 15A a N), los genes de pez cebra se amplificaron a partir de una biblioteca de ADNc (un regalo amable de M. Affolter). Los plásmidos ligados se clonaron en E. coli Top10. Los plásmidos secuenciados se electroporaron en la cepa deseada de Y. enterocolitica o S. enterica usando los ajustes como para la electroporación estándar en E. coli.

Tabla I (Cebador Nr. Si_: Secuencia)

285: CATACCATGGGAGTGAGCAAGGGCGAG

: GGAAGATCTttACTTGTACAGCTCGTCCAT

: CGGGGTACCTCAACTAAATGACCGTGGTG

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: CGT AtctagaGGACAT AGTCCACCAGCG

: GTT AAAGCTTT CAGTTGGATCCGAAAAAC

: CGT AtctagaGAATT AAAAAAAACACT CATCCCA

: CGT Atctag aCCAAAG G CAAAAG CAAAAA

: GTT AAAG CTTTT AGCTAGCCATGGCAAGC

: CGTAtctagaATGCCCCGCCCC

Tabla II: Proteínas de fusión clonadas

Tabla III: Mutadores para modificación genética

Secreción de Yop. La inducción del regulón yop se realizó cambiando el cultivo a 37 °C en BHI-Ox (condiciones permisivas para la secreción) [39]. Como fuente de carbono se añadió glucosa (4 mg/ml).

Las fracciones de células totales y sobrenadantes se separaron mediante centrifugación a 20.800 g durante 10 min a 4 °C. El sedimento celular se tomó como fracción celular total. Las proteínas en el sobrenadante se precipitaron con ácido tricloroacético al 10 % (p/v) final durante 1 h a 4 °C. Después de la centrifugación (20.800 g durante 15 min) y la eliminación del sobrenadante, el sedimento resultante se lavó en acetona enfriada con hielo toda la noche. Las muestras se centrifugaron de nuevo, el sobrenadante se descartó y el sedimento se secó al aire y se resuspendió en 1 x SDS con colorante de carga.

Las proteínas secretadas se analizaron mediante SDS-PAGE; en cada caso, las proteínas secretadas por 3 x 108 bacterias se cargaron por carril. La detección de proteínas secretadas específicas mediante inmunotransferencia se realizó utilizando geles de SDS-PAGE al 12,5 %. Para la detección de proteínas en células totales, 2 x 108 bacterias se cargaron por carril, si no se indica lo contrario, y las proteínas se separaron en geles de SDS-PAGE al 12,5 % antes de la detección mediante inmunotransferencia.

La inmunotransferencia se llevó a cabo utilizando anticuerpos monoclonales de rata frente a YopE (MIPA193 - 13A9; 1: 1.000, [40]). El antisuero se preabsorbió dos veces toda la noche frente a Y. enterocolitica AHOPEMT asd para reducir la tinción de fondo. La detección se realizó con anticuerpos secundarios dirigidos frente a anticuerpos de rata y conjugados con peroxidasa de rábano picante (1:5.000; Southern biotech), antes del revelado con sustrato quimioluminiscente ECL (LumiGlo, KPM).

Cultivo celular e infecciones. Se cultivaron HeLa Ccl2, células de fibroblastos swiss 3T3, 4T1, B16F10 y D2A1 en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con FCS al 10 % y L-glutamina 2 mM (cDMEM). Las HUVEC se aislaron y cultivaron como se describe [41]. Se cultivaron células Jurkat y 4T1 en RPMI 1640 suplementado con FCS al 10 % y L-glutamina 2 mM. Y. enterocolitica se cultivaron en BHI con aditivos toda la noche a TA, se diluyeron en BHI fresco hasta una DO600 de 0,2 y se cultivaron durante 2 ha TA antes de un cambio de temperatura a un agitador de baño de agua a 37 °C durante 30 min más o durante 1 h en el caso de la administración de EGFP. Finalmente, las bacterias se recogieron por centrifugación (6.000 rcf, 30 seg) y se lavaron una vez con DMEM suplementado con HEPES 10 mM y L-glutamina 2 mM. S. enterica se cultivaron en LB con aditivos toda la noche a 37 °C y se diluyeron 1:40 en LB fresco y se cultivaron durante 2,5 h a 37 °C (condiciones de inducción de SpiI T3SS) o el cultivo de toda la noche se incubó adicionalmente a 37 °C (condiciones de inducción de Spill T3SS). Finalmente, las bacterias se recogieron por centrifugación (6.000 rcf, 30 seg) y se lavaron una vez con DMEM suplementado con HEPES 10 mM y L-glutamina 2 mM. Las células sembradas en placas de 96 pocillos (para inmunofluorescencia) o de 6 pocillos (para transferencia Western) se infectaron a las MOI indicadas en DMEM suplementado con HEPES 10 mM y L-glutamina 2 mM. Después de añadir las bacterias, las placas se centrifugaron durante 1 min a 1.750 rpm y se colocaron a 37 °C durante los períodos de tiempo indicados. Las bacterias extracelulares se destruyeron con gentamicina (100 mg/ml) si se indica. En el caso del análisis de inmunofluorescencia, los ensayos de infección se detuvieron mediante la fijación con PFA al 4 %. Para el análisis de transferencia Western, las células se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo y se añadió tampón de lisis Phospho-safe (Novagen) para lisar las células. Después de la incubación en hielo, las células se centrifugaron (16.000 rcf, 25 min, 4 °C). Los sobrenadantes se recogieron y se analizaron para determinar el contenido de proteína total mediante el ensayo BCA de Bradford (Pierce) antes de SDS PAGE y transferencia Western utilizando anticuerpos anti-Fosfo-Akt (Ser473 y T308, ambos Cell Signalling), anti-Actina (Millipore), Anti-Bid (Cell Signaling), anti-Myc (Santa Cruz), anti-p38 (Cell Signaling), anti-fosfo-p-38 (Thr180/Tyr182; Cell Signaling), anti-Caspasa-3 p17 (Cell Signaling) y anti-Ink4C (Cell Signaling) .

Análisis de secreción con S. enterica. Para la inducción de la secreción de proteínas por S. enterica, S. enterica se cultivaron toda la noche en LB que contenía NaCl 0,3 M en un agitador orbital (ajustado a 150 rpm). Después, S. enterica se diluyeron 1:50 en LB fresco que contenía NaCl 0,3 M y se cultivaron durante 4 h a 37 °C sin agitar.

Las fracciones de células totales y sobrenadantes se separaron mediante centrifugación a 20.800 g durante 20 min a 4 °C. El sedimento celular se tomó como fracción celular total. Las proteínas del sobrenadante se precipitaron con ácido tricloroacético al 10 % (p/v) final durante 1 h a 42C. Después de la centrifugación (20.800 g durante 15 min) y la eliminación del sobrenadante, el sedimento resultante se lavó en acetona enfriada con hielo toda la noche. Las muestras se centrifugaron de nuevo, el sobrenadante se descartó y el sedimento se secó al aire y se resuspendió en 1x SDS con carga de colorante.

Las proteínas secretadas se analizaron mediante SDS-PAGE; en cada caso, las proteínas secretadas por 3 x 108 bacterias se cargaron por carril. La detección de proteínas secretadas específicas mediante inmunotransferencia se realizó utilizando geles de SDS-PAGE al 12,5 %. Para la detección de proteínas en células totales, 2 x 108 bacterias se cargaron por carril, si no se indica lo contrario, y las proteínas se separaron en geles de SDS-PAGE al 12,5 % antes de la detección mediante inmunotransferencia. La inmunotransferencia se realizó utilizando anticuerpo anti-Myc (Santa Cruz).

T ransferencia Western de proteínas translocadas de T3SS de células infectadas. Se infectaron células HeLa en placas de 6 pocillos a una MOI de 100 como se ha descrito anteriormente. En el caso de coinfección con la proteasa TEV translocando la cepa de Y. enterocolitica, la DO600 de las cepas se ajustó y las dos suspensiones bacterianas se mezclaron en un tubo en una relación de 1:1 (si no se indica lo contrario) antes de la adición a las células. Al final de la infección, las células se lavaron dos veces con PBS enfriado en hielo y se recogieron raspando en un pequeño volumen de PBS enfriado en hielo. Después de la centrifugación (16.000 rcf, 5 min, 4 °C), el sedimento se disolvió en digitonina al 0,002 % suplementada con una mezcla de inhibidores de proteasas (Roche complete, Roche). Los sedimentos disueltos se incubaron durante 5 minutos en hielo y luego se centrifugaron (16.000 rcf, 25 min, 4 °C). Los sobrenadantes se recogieron y se analizaron para determinar el contenido de proteína total mediante el ensayo BCA de Bradford (Pierce) antes de SDS PAGE y transferencia Western usando un anticuerpo anti-Myc (Santa Cruz, 9E11) o anti-Ink4C (Cell Signaling).

Inmunofluorescencia. Las células sembradas en placas de 96 pocillos (Corning) se infectaron como se ha descrito anteriormente y, después de la fijación con PFA al 4 %, las células se lavaron tres veces con PBS. A continuación, los pocillos se bloquearon usando suero de cabra al 5 % en PBS Triton X-100 al 0,3 % durante 1 h a TA. El anticuerpo primario (anti-Myc, Santa Cruz, 1:100) se diluyó en PBS con BSA al 1 % y Triton X-100 al 0,3 % y las células se incubaron toda la noche a 4 °C. Las células se lavaron 4 veces con PBS antes de que se añadiera el anticuerpo secundario (AF 488 anti-ratón, life technologies, 1:250) diluido en PBS con BSA al 1 % y Triton X-100 al 0,3 %. Si era necesario, se incluyó tinción de ADN Hoechst (life technologies, 1:2.500) y/o tinción de actina (Dy647-Faloidina, DyeOmics). En algunos casos, solo se aplicó la tinción de ADN y/o actina directamente después de retirar el PFA por lavado. Las células se incubaron durante 1 h a TA, se lavaron tres veces con PBS y se analizaron mediante análisis de imágenes automatizado como se describe a continuación.

Microscopía automatizada y análisis de imágenes. Las imágenes se adquirieron automáticamente con un ImageXpress Micro (Molecular devices, Sunnyvale, EE. UU.). La cuantificación de las intensidades de tinción anti-Myc se realizó utilizando MetaXpress (Molecular devices, Sunnyvale, EE. UU.). Las regiones dentro de las células que excluyen las regiones nucleares y las regiones que contienen bacterias se eligieron manualmente (círculos con un área de 40 píxeles) y se registró la intensidad promedio.

Estimulación con TNFa y transferencia Western de fosfo-p38. Las células HeLa sembradas en placas de 6 pocillos se infectaron con una MOI de 100 como se ha descrito anteriormente. Se añadió gentamicina 30 min p.i y 45 min p.i. Se añadió TNFa (10 ng/ml). 1 h 15 min p.i., las células se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo y se añadió tampón de lisis Phospho-safe (Novagen) para lisar las células. Después de la incubación en hielo, las células se centrifugaron (16.000 rcf, 25 min, 4 °C). Los sobrenadantes se recogieron y se analizaron para determinar el contenido de proteína total mediante el ensayo BCA de Bradford (Pierce) antes de SDS PAGE y transferencia Western usando un anti-Fosfo-p38, anticuerpos para p38 total (Cell Signaling) y anticuerpo anti-actina (Millipore).

Determinación del nivel de AMPc de células HeLa infectadas. Las células HeLa sembradas en placas de 96 pocillos se infectaron como se ha descrito anteriormente. 30 minutos antes de la infección, el cDMEM se cambió a DMEM suplementado con HEPES 10 mM y L-glutamina 2 mM y 3-isobutil-1-metilxantina 100 uM (IBMX, Sigma Aldrich). Se añadió gentamicina 60 min p.i. y las células se incubaron adicionalmente a 37 °C durante otros 90 min. La determinación de AMPc se realizó usando un ELISA competitivo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Amersham, cAMP Biotrak, RPN225). Como control positivo se añadió la cantidad indicada de toxina del cólera (C8052, Sigma Aldrich) durante 1 h a las células en DMEM suplementado con HEPES 10 mM y L-glutamina 2 mM e IBMX 100 uM.

Infecciones de embriones de pez cebra, imagenología y cuantificación automática de imágenes. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices aprobadas. El pez cebra se mantuvo en condiciones estándar [42]. Los embriones se estadificaron por horas después de la fertilización (hpf) a 28,5 °C [43]. En este estudio se utilizaron las siguientes líneas de pez cebra: peces de tipo salvaje (AB/EK y EK/TL). El protocolo de infección siguió las directrices dadas en [44]. Se mantuvieron embriones 12 hpf en medio E3 que contenía N-feniltiourea (PTU) 0,2 mM para prevenir la formación de pigmentos. 2 días después de la fertilización (dpf), los embriones se anestesiaron con 0,2 mg/ml de tricaína y se alinearon en placas de agar al 1 % en E3 utilizando una herramienta de bucle de pelo [44]. Se cultivó Y. enterocolitica en BHI suplementado con arabinosa al 0,4 % y antibióticos y mDap toda la noche a TA, se diluyó en BHI fresco con arabinosa al 0,5 % y otros aditivos hasta una DO600 de 0,2 y se cultivó durante 2 h a TA antes de un cambio de temperatura a un agitador de baño de agua a 37 °C durante 45 min más. Finalmente, las bacterias se recogieron por centrifugación (6.000 rcf, 30 seg) y se lavaron una vez con PBS. La DO600 se estableció en 2 en PBS que contenía mDAP. Se inyectaron 1-2 nL de esta suspensión en el rombencéfalo de embriones de pez cebra alineados usando un microinyector Femtojet (Eppendorf) usando Femtotips II (Eppendorf), donde la punta de la aguja se había roto con pinzas finas. El tiempo de inyección se fijó en 0,2 s y la presión de compensación en 15 hPa (Eppendorf, Femtojet) y la presión de inyección se ajustó entre 600 y 800 hPa. El tamaño de la gota y, por tanto, del inóculo se comprobó mediante microscopía y mediante sembrado en placa de control. Después de la microinyección, los peces se recogieron en E3 que contenía tricaína y PTU y se incubaron durante 30 minutos a 37 °C y se incubaron durante 5 h más a 28 °C. Se usó un binocular de fluorescencia (Leica) para observar la fluorescencia de EGFP bacteriana 1 h después de la infección en los rombencéfalos del pez cebra, y se descartaron los embriones que no se inyectaron correctamente. Al final de la infección, los peces se fijaron con PFA al 2 % enfriado en hielo durante 1 h en hielo y adicionalmente con PFA fresco enfriado en hielo toda la noche a 4 °C. La tinción de anticuerpos se realizó como se ha descrito anteriormente [45,46]. Básicamente, los embriones se lavaron 4 veces con PBS Tween al 0,1 % durante 5 min en cada lavado y se permeabilizaron con PBS-T Triton X-100 al 0,5 % durante 30 min a TA. Los embriones se bloquearon en disolución de bloqueo (PBS Tween al 0,1 % TritonX-100 al 0,1 % suero de cabra al 5 % y BSA al 1 %) a 4 °C toda la noche. El anticuerpo (Caspasa 3 escindida (Asp175), Cell Signaling) se diluyó 1:100 en disolución de bloqueo y se incubó con agitación a 4 °C en la oscuridad. Los peces se lavaron 7 veces con PBS Tween al 0,1 % durante 30 min antes de que se añadiera el anticuerpo secundario (anti-conejo de cabra AF647, Invitrogen, 1:500) diluido en disolución de bloqueo y se incubase a 4 °C toda la noche. Las larvas se lavaron con PBS Tween al 0,1 % cuatro veces durante 30 min a 4 °C y una vez toda la noche y se lavaron adicionalmente 3-4 veces. Las imágenes se tomaron con un microscopio confocal Leica TCS SP5 utilizando un objetivo de inmersión en agua 40x. Las imágenes se analizaron usando el software Imaris (Bitplane) e Image J (http://imagej.nih.gov/ij/).

El análisis de las imágenes (en n = 14 para pBad_Si2 o n = 19 para z-BIM) se realizó a través de CellProfiler [47] en proyecciones z de intensidad máxima de imágenes de apilamientos z registrados. Brevemente, las bacterias se detectaron a través del canal GFP. Alrededor de cada área de una mancha bacteriana se creó un círculo con un radio de 10 píxeles. Las regiones superpuestas se separaron por igual entre los miembros de conexión. En aquellas áreas que rodean estrechamente a las bacterias, se midió la intensidad de tinción de Caspasa 3 p17.

Preparación de muestras para fosfoproteómica. Para cada condición, dos placas de 6 pocillos de células HeLa CCL-2 se cultivaron hasta la confluencia. Las células se infectaron durante 30 min como se ha descrito anteriormente. En los puntos de tiempo indicados, las placas se pusieron en hielo y se lavaron dos veces con PBS enfriado en hielo. A continuación, las muestras se recogieron en disolución de urea [urea 8 M (AppliChem), bicarbonato amónico 0,1 M (Sigma), RapiGest al 0,1 % (Waters), 1 x PhosSTOP (Roche)]. Las muestras se agitaron brevemente en vórtex, se sonicaron a 4 °C (Hielscher), se agitaron durante 5 min en un termomezclador (Eppendorf) y se centrifugaron durante 20 min a 4 °C y 16.000 g. Los sobrenadantes se recogieron y se almacenaron a -80 °C para su posterior procesamiento. Se utilizó el ensayo de proteína BCA (Pierce) para medir la concentración de proteína.

Enriquecimiento de fosfopéptidos. Los enlaces disulfuro se redujeron con tris(2-carboxietil)fosfina a una concentración final de 10 mM a 37 °C durante 1 h. Los tioles libres se alquilaron con yodoacetamida (Sigma) 20 mM a temperatura ambiente durante 30 min en la oscuridad. El exceso de yodoacetamida se inactivó con N-acetilcisteína a una concentración final de 25 mM durante 10 min a temperatura ambiente. Se añadió endopeptidasa Lys-C (Wako) hasta una relación final de enzima/proteína de 1:200 (p/p) y se incubó durante 4 h a 37 °C. Posteriormente, la disolución se diluyó con bicarbonato de amonio 0,1 M (Sigma) hasta una concentración final por debajo de urea 2 M y se digirió toda la noche a 37 °C con tripsina modificada de grado de secuenciación (Promega) en una relación de proteína a enzima de 50:1. Los péptidos se desalaron en un cartucho C18 Sep-Pak (Waters) y se secaron en vacío. Se aislaron fosfopéptidos de 2 mg de masa total de péptidos con TiO2 como se ha descrito anteriormente [48]. Brevemente, los péptidos secos se disolvieron en una disolución de acetonitrilo (ACN) al 80 %-ácido trifluoroacético (TFA) al 2,5 % saturada con ácido ftálico. Los péptidos se añadieron a la misma cantidad de TiO2 equilibrado (tamaño de la perla de 5 gm, GL Sciences) en una columna de centrifugación Mobicol bloqueada (MoBiTec) que se incubó durante 30 min con rotación vertical. La columna se lavó dos veces con la disolución saturada de ácido ftálico, dos veces con ACN al 80 % y TFA al 0,1 % y finalmente dos veces con TFA al 0,1 %. Los péptidos se eluyeron con disolución de NH4OH 0,3 M. El pH de los eluatos se ajustó para que fuera inferior a 2,5 con una disolución de TFA al 5 % y HCl 2 M. Los fosfopéptidos se desalaron de nuevo con cartuchos microspin C18 (Harvard Apparatus).

Análisis LC-MS/MS. La separación cromatográfica de péptidos se llevó a cabo utilizando un sistema EASY nano-LC (Thermo Fisher Scientific), equipado con una columna RP-HPLC calentada (75 gm x 45 cm) empaquetada internamente con resina C18 de 1,9 gm (Reprosil-AQ Pur, Dr. Maisch). Se analizaron partes alícuotas de 1 gg de muestra de fosfopéptido total por ciclo de LC-MS/MS usando un gradiente lineal que variaba de disolvente A al 98 % (ácido fórmico al 0,15 %) y disolvente B al 2 % (acetonitrilo al 98 %, agua al 2 %, ácido fórmico al 0,15 %) a disolvente B al 30 % durante 120 minutos a una velocidad de flujo de 200 nl/min. El análisis de espectrometría de masas se realizó en un espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap de doble presión equipado con una fuente de iones de nanoelectropulverización (ambos Thermo Fisher Scientific). Cada escaneo de MS1 (adquirido en el Orbitrap) fue seguido por la disociación inducida por colisión (CID, adquirida en el LTQ) de los 20 iones precursores más abundantes con exclusión dinámica durante 30 segundos. Para el análisis de fosfopéptidos, los 10 iones precursores más abundantes se sometieron a CID con activación multietapa habilitada. El tiempo total del ciclo fue de aproximadamente 2 s. Para MS1, 106 iones se acumularon en la celda Orbitrap durante un tiempo máximo de 300 ms y se escanearon a una resolución de 60.000 FWHM (a 400 m/z). Los escaneos de MS2 se adquirieron utilizando el modo de escaneo normal, una configuración diana de 104 iones, y tiempo de acumulación de 25 ms. Los iones con carga única y los iones con estado de carga no asignada se excluyeron de desencadenar eventos de MS2. La energía de colisión normalizada se estableció en 32 % y se adquirió un microescaneo para cada espectro.

Cuantificación sin marcadores y búsqueda en bases de datos. Los archivos sin procesar adquiridos se importaron a la herramienta de software Progenesis (Nonlinear Dynamics, Versión 4.0) para la cuantificación sin marcadores utilizando los parámetros por defecto. Los espectros de MS2 se exportaron directamente desde Progenesis en formato mgf y se buscaron usando el algoritmo MASCOT (Matrix Science, Versión 2.4) contra una base de datos señuelo [49] que contiene secuencias normales e inversas de las entradas de SwissProt predichas de Homo sapiens (www.ebi.ac.uk, fecha de lanzamiento 16/05/2012) y contaminantes comúnmente observados (en total 41.250 secuencias) generados usando la herramienta SequenceReverser del software MaxQuant (Versión 1.0.13.13). Para identificar proteínas que se originan en Y. enterocolitica, se buscaron muestras no enriquecidas con fosfopéptidos en la misma base de datos anterior, incluidas las entradas de SwissProt predichas de Y. enterocolitica (www.ebi.ac.uk, fecha de lanzamiento 15/08/2013). La tolerancia al ion precursor se estableció en 10 ppm y la tolerancia al ion fragmento se estableció en 0,6 Da. Los criterios de búsqueda se establecieron de la siguiente manera: se requirió una especificidad tríptica completa (escisión después de residuos de lisina o arginina a menos que fueran seguidos de prolina), se permitieron 2 escisiones omitidas, la carbamidometilación (C) se estableció como modificación fija y fosforilación (S,T,Y) u oxidación (M) como una modificación variable para muestras enriquecidas o no enriquecidas en TiO2, respectivamente. Finalmente, los resultados de la búsqueda en la base de datos se exportaron como un archivo xml y se volvieron a importar al software Progenesis para la asignación de funciones de MS1. Para la cuantificación de fosfopéptidos, se exportó un archivo csv que contiene las abundancias máximas de MS1 de todas las características detectadas y, para las muestras no enriquecidas, se creó un archivo csv que contiene todas las mediciones de proteínas basadas en las intensidades de características sumadas de todos los péptidos identificados por proteína. Es importante destacar que el software Progenesis se estableció de manera que las proteínas identificadas por conjuntos similares de péptidos se agrupan conjuntamente y que solo se emplean péptidos no conflictivos con secuencias específicas para proteínas individuales en la base de datos para la cuantificación de proteínas. Ambos archivos se procesaron aún más utilizando el script SafeQuanT v1.0 R desarrollado internamente (datos no publicados, disponibles en https://github.com/eahrne/SafeQuant/). En resumen, el software establece el nivel de identificación de tasa de descubrimiento falso en el 1 % (basado en el número de aciertos de la base de datos de secuencias de proteínas señuelo) y normaliza las abundancias máximas de MS1 identificadas (cromatograma de iones extraídos, XIC) en todas las muestras, es decir, el XIC sumado de todas las características peptídicas identificadas con seguridad se escala para que sea igual para todas las ejecuciones de LC-MS. A continuación, a todos los fosfopéptidos/proteínas cuantificados se les asigna una relación de abundancia para cada punto de tiempo, basada en la mediana de XIC por punto de tiempo. La significancia estadística de cada relación viene dada por su valor q (valores p ajustados de la tasa de descubrimiento falso), obtenido calculando los valores p del estadístico t modificado [50] y ajustando para ensayo múltiple [51]. MASCOT asignó automáticamente la ubicación de los residuos fosforilados (puntuación >10). Todos los espectros anotados, junto con los archivos sin procesar de MS y los parámetros de búsqueda empleados, se depositarán en el Consorcio ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) a través del repositorio de socios PRIDE [52]. La alineación de secuencias se realizó utilizando la herramienta de alineación de secuencias múltiples ClustalW2 basada en la web EMBL-EBI en http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/c)usta)w2/.

Biodistribución en modelos de ratón de aloinjerto de tumor 4T1

Todos los experimentos con animales fueron aprobados (licencia 1908; Kantonales Veterinaramt Basel-Stadt) y se realizaron de acuerdo con las directrices locales (Tierschutz-Verordnung, Basel-Stadt) y la ley suiza de protección animal (Tierschutz-Gesetz). Se encargaron ratones BALB/c de 6 semanas en Janvier Labs. Después de al menos una semana de acomodación, los ratones fueron anestesiados con isoflurano y 100 ul de células 4T1 (1 x105-1 x106 células) se inyectaron por vía subcutánea en el flanco de los ratones BALB/c. A lo largo del experimento, se calificó a los ratones por comportamiento y apariencia física, y se midió la temperatura de la superficie, así como el peso corporal.

Una vez que se desarrollaron los tumores, se administró a los ratones una disolución de desferal de 8 mg/ml (10 ml/kg) mediante inyección i.p. Al día siguiente, los ratones se infectaron con Y. enterocolitica MRS40 o Y. enterocolitica MRS40 AHOPEMT (2x105, 1x106 o 1x107 bacterias) por inyección en la vena de la cola. El inóculo i.v. administrado a los ratones se validó mediante dilución en placa. En algunos experimentos, la progresión del tumor fue seguida por mediciones diarias de la longitud y la anchura del tumor con calibradores digitales. El volumen del tumor se determinó como 0,523 x largo x ancho2. En los días respectivos después de la infección, los ratones fueron sacrificados por inhalación de CO2. Inmediatamente, se aisló una muestra de sangre mediante aspiración del corazón. Se aislaron hígado, bazo, pulmón y el tumor y se determinó su peso. Se homogeneizaron los órganos y el tumor. Las CFU en cada muestra se determinaron colocando diluciones en serie en placas de agar LB que contenían ácido nalidíxico (35 ug/ml).

B) Resultados

Un sistema de administración de proteínas basado en la secreción de tipo 3 de proteínas de fusión YopE Aunque el mismo N-terminal del efector YopE de T3SS de Y. enterocolitica (SEQ ID No. 1) contiene la señal de secreción suficiente para translocar proteínas heterólogas [26], el sitio de unión a chaperona (CBS) para su chaperona (SycE) no está incluido [53]. Seleccionamos los 138 aminoácidos N-terminales de YopE (SEQ ID No. 2) para fusionarlos con las proteínas que se van a administrar, ya que se ha mostrado que da los mejores resultados para la translocación de otros sustratos de T3S heterólogos [28]. Como estos 138 aminoácidos N-terminales de YopE contienen el CBS, decidimos además coexpresar SycE. El fragmento SycE-YopE1-138 clonado de plásmido de virulencia pYV40 purificado de Y. enterocolitica contiene los promotores endógenos de YopE y de su chaperona SycE (Fig. 10). Por lo tanto, SycE y cualquier proteína de fusión de YopE1-138 son inducidas por un rápido cambio de temperatura desde el crecimiento a TA hasta 37 °C. El tiempo de cultivo a 37 °C afectará la cantidad de proteína de fusión presente en las bacterias. Se añadió un sitio de clonación múltiple (MCS) en el extremo 3' de YopE1-138 (Fig. 10 B) seguido de una etiqueta Myc y 6xHis y un codón de parada.

La cepa de fondo se seleccionó cuidadosamente. Primero, para limitar la translocación de efectores endógenos, usamos una cepa de Y. enterocolitica de la que se delecionaron todos los efectores conocidos, Yop H, O, P, E, M y T (denominada AHOPEMT) [54]. Además, ocasionalmente utilizamos un mutante auxótrofo que no puede crecer en ausencia de ácido meso-2,6-diaminopimélico exógeno [55]. De esta cepa se delecionó el gen de la aspartato-betasemialdehído deshidrogenasa (Aasd), y se clasificó como nivel 1 de bioseguridad por la agencia de seguridad suiza (enmienda a A010088/2). Además, delecionamos las proteínas de adhesión YadA y/o InvA para ofrecer una mayor variedad de cepas de fondo. Si bien el uso de las cepas yadA o yadA/invA reduce la señalización de fondo inducida [56], la cantidad de proteína administrada también se ve afectada [57].

Caracterización de la administración de la proteína de fusión YopE en células eucariotas

En un ensayo de secreción in vitro (véase la Fig. 1 A), se induce artificialmente la secreción de proteínas en el líquido circundante. Después de la precipitación de proteínas basada en TCA, se utilizó el análisis de transferencia Western con anticuerpo anti-YopE para determinar las cantidades de proteína secretadas (Fig. 1 B). Mientras que una cepa wt secreta YopE de longitud completa, las cepas AHOPEMT asd no lo hicieron. Ante la presencia de YopE1-138-Myc-His (también denominado YopE1-138-Myc; SEQ_ID_No._3) se hizo visible una banda de YopE más pequeña (Fig.1 B). Por lo tanto, el fragmento YopE1-138 se secreta bien en la configuración descrita aquí. Para analizar la homogeneidad de la translocación de proteínas en células eucariotas, infectamos células HeLa con la cepa que codifica YopE1-138-Myc y teñimos la etiqueta Myc por IF (Fig. 2A y B). Mientras que al principio solo se tiñeron las bacterias, a los 30 min después de la infección (p.i.) comienzan a ser visibles los contornos de las células, lo que se mejora con el aumento del tiempo de infección (Fig. 2 B). Esta tendencia se refleja bien en la intensidad de tinción de la etiqueta Myc dentro de las células HeLa (Fig. 2 A y B). El YopE1-138-Myc se puede detectar en todas partes de las células (Fig.2 A), excepto en los núcleos [58]. Sorprendentemente, la mayoría, si no todas, las células, fueron alcanzadas por este enfoque de una manera comparable. Como se sabe que Y. enterocolitica infecta muchos tipos de células diferentes [59], seguimos la administración de YopE1-138-Myc en varias líneas celulares. Se observó la misma tinción homogénea anti-Myc IF en fibroblastos murinos infectados, células JurkaT y HUVEC (Fig. 11). Aún más, el ajuste de la MOI hacia arriba o hacia abajo permite modular la cantidad de proteína administrada (Fig. 2 C), mientras que la mayoría de las células siguen siendo la diana. Un número de bacterias bajo no resultará en pocas células con mucha proteína administrada, sino que la mayoría de las células contienen una cantidad baja de proteína administrada (Fig. 2 C).

Redirección de las proteínas administradas por T3SS al núcleo

Como el propio YopE se localizó en el citoplasma (Fig.2 A), es de especial interés ensayar si el fragmento YopE1-138 dificulta la localización de proteínas de fusión nucleares. Por lo tanto, añadimos la NLS de SV40 al extremo C (y extremo N, resultados similares) de YopE1-138-EGFP (SEQ ID No. 39 y SEQ ID No. 38, respectivamente). Mientras YopE1-138-EGFP (SEQ ID No. 37) condujo a una tinción citoplásmica débil, YopE1-138-EGFP-NLS dio lugar a una señal nuclear EGFP más fuerte en células HeLa infectadas (Fig. 3). Esto indica que el fragmento YopE1-138 es compatible con el uso de una NLS. Si bien mCherry ya se había utilizado en patógenos de plantas [60], esto representa una administración exitosa de una proteína similar a GFP a través de bacterias patógenas humanas o animales que codifican un T3SS. Esto valida la estrategia dependiente de SycE y YopE1-138 como muy prometedora para la administración de muchas proteínas de elección.

Eliminación del apéndice YopE1-138 después de la translocación de la proteína de fusión en la célula eucariota

Aunque para la administración bacteriana el fragmento YopE1-138 es muy beneficioso, podría obstaculizar la función y/o localización de las proteínas de fusión. Por tanto, su eliminación después de la administración de proteínas sería óptima. Para este fin, introdujimos dos sitios de escisión de TEV (ENLYFQS) [61 -63] entre YopE1-138 y un compañero de fusión (el regulador transcripcional ETI-Myc (SEQ ID No. 36 y 41) [64] e INK4C humano (SEQ ID No. 40 y SeQ ID No. 43)). Para mantener las ventajas del método presentado, fusionamos además la proteasa TEV (variante S219V;

[65]) a YopE 1-138 (SEQ ID No. 42) en otra cepa de Y. enterocolitica. Las células HeLa se infectaron con ambas cepas a la vez. Para permitir el análisis de la fracción translocada de proteínas únicamente, las células HeLa infectadas se lisaron a 2 h p.i. (Fig. 4) con digitonina, que se sabe que no lisa las bacterias ([66]; véase la Fig. 12 para el control). El análisis de transferencia Western reveló la presencia de YopE1-138-2xTEV-sitio de escisión-ET1-Myc o YopE1-138-2xTEV-sitio de escisión-Flag-INK4C-Myc sólo cuando las células se habían infectado con la cepa correspondiente (Fig. 4A y C). Tras la digestión durante la noche de este lisado celular con proteasa TEV purificada, se pudo observar una banda desplazada (Fig. 4A y C). Esta banda corresponde a ET1-Myc (Fig. 4 C) o Flag-INK4C (Fig. 4 A) con los remanentes N-terminales del sitio de escisión de TEV, muy probablemente sólo una serina. Tras la coinfección de células con la cepa que administra la proteasa TEV, el mismo fragmento ET1-Myc o Flag-INK4C escindido se hizo visible, lo que indica que la proteasa TEV administrada a través de T3SS es funcional y que las células individuales habían sido infectadas por ambas cepas bacterianas (Fig. 4A y C). Aunque la escisión no es completa, la mayoría de la proteína translocada ya se escinde 2 h después de la infección e incluso la digestión durante la noche con proteasa TEV purificada no produjo mejores tasas de escisión (Fig. 4 B). Como se informó, la escisión dependiente de la proteasa TEV podría necesitar una optimización dependiente de la proteína de fusión [67,68]. La eliminación del apéndice YopE1-138 dependiente de la proteasa TEV después de la translocación proporciona, por tanto, por primera vez, una administración de proteína por T3SS de proteínas heterólogas casi nativas, cambiando la composición de aminoácidos en un solo aminoácido N-terminal.

Un enfoque alternativo para la escisión dependiente de la proteasa TEV del fragmento YopE consistió en incorporar ubiquitina en la proteína de fusión de interés. De hecho, la ubiquitina se procesa en su extremo C mediante un grupo de proteasas C-terminales endógenas específicas de ubiquitina (enzimas desubiquitinantes, DUB). Como se supone que la escisión ocurre en el mismo extremo C de la ubiquitina (después de G76), la proteína de interés debería carecer de secuencias de aminoácidos adicionales. Este método se ensayó en la proteína de fusión YopE1-138-Ubiquitina-Flag-INK4C-MycHis. En las células de control infectadas por bacterias que expresan YopE1 -138-Flag-INK4C-MycHis, se encontró una banda correspondiente a YopE1-138-Flag-INK4C-MycHis, indicativa de una translocación eficiente de la proteína de fusión (Figura 24). Cuando las células se infectaron durante 1 h con bacterias que expresan YopE1-138-Ubiquitina-Flag-INK4C-MycHis, se vio una banda adicional correspondiente al tamaño de Flag-INK4C-MycHis, lo que indica que se escindió parte de la proteína de fusión. Este resultado muestra que la introducción de ubiquitina en la proteína de fusión permite eliminar por escisión el fragmento YopE1-138 sin la necesidad de una proteasa exógena.

Translocación de efectores bacterianos tipo III y tipo IV

SopE de Salmonella entérica es un factor de intercambio de nucleótidos de guanina (GEF) bien caracterizado que interacciona con Cdc42, promoviendo la remodelación citoesquelética de actina [69]. Considerando que la translocación de YopE1-138-Myc en células HeLa no tiene efecto, el YopE1-138-SopE translocado1 (SEQ ID No. 5 y 135) indujo cambios dramáticos en la red de actina (Fig. 5 A). Se obtuvieron resultados similares con otra proteína efectora GEF, IpgB1 de Shigella flexneri (SEQ ID No. 4). De forma importante, los primeros cambios en el citoesqueleto de actina se observaron tan rápido como 2 min p.i. (Figura 5 A). Por lo tanto, se puede concluir que la administración de proteínas dependiente de T3SS ocurre inmediatamente después de que se inicia la infección por centrifugación. Para probar el transporte estricto dependiente de T3SS, se delecionó una de las proteínas T3SS que forman el poro de translocación en la membrana de la célula eucariota (YopB, véase [70]) (Fig. 12).

Durante la infección con Salmonella, la translocación de SopE va seguida de la translocación de SptP, que funciona como una proteína activadora de GTPasa (GAP) para Cdc42 [71]. Mientras la translocación de YopE1-138-SopE-Myc (SEQ ID No. 135) solo desencadenó reordenamientos masivos de F-actina, la coinfección con bacterias que expresan YopE1-138-SptP (SEQ ID No. 8) suprimió este efecto de una manera dependiente de la dosis (Fig. 5 B). Una tinción anti-Myc indicó que esta inhibición no se debía a un nivel reducido de translocación de YopE1-138-SopE-Myc (Fig. 5 B). Conjuntamente, estos resultados mostraron que la coinfección de células con dos cepas bacterianas es un método válido para administrar dos efectores diferentes en células individuales para abordar su interacción funcional.

El efector OspF de tipo III de S. flexneri funciona como una fosfotreonina liasa que desfosforila las MAP quinasas p38 y ERK [72]. Para ensayar la funcionalidad de YopE1-138-OspF translocado (SEQ ID No. 7), monitorizamos la fosforilación de p38 después de la estimulación con TNFa. En células no infectadas o en células infectadas con bacterias que expresan YopE1-138-Myc, el TNFa indujo la fosforilación de p38. Por el contrario, después de la translocación de YopE1-138-OspF, se suprimió la fosforilación inducida por TNFa, mostrando que el OspF administrado es activo frente a p38 (Fig. 6 A).

Durante la infección con Salmonella, el efector SopB de tipo III protege a las células epiteliales de la apoptosis mediante la activación sostenida de Akt [73]. Mientras la translocación de YopE1-138-Myc o YopE1-138-SopE no tuvo ningún efecto sobre Akt, la translocación de YopE1-138-SopB (SEQ ID No. 6) indujo una fuerte fosforilación de Akt en T308 y S473, reflejando la forma activa (Fig. 6 B). Se obtuvieron resultados similares con el homólogo SopB de S. flexneri (IpgD, SEQ ID No. 9). Conjuntamente, nuestros resultados muestran que el sistema de administración basado en YopE1-138 funciona para todos los efectores de T3S ensayados hasta ahora, y que permite investigar proteínas implicadas en el control de funciones celulares centrales, incluyendo el citoesqueleto, la inflamación y la supervivencia celular.

Varias bacterias, incluyendo Agrobacterium tumefaciens, Legionella pneumophila y Bartonella henselae, usan la secreción de tipo IV para inyectar efectores en las células. Ensayamos si el efector BepA de tipo IV de B. henselae podría translocarse en células HeLa utilizando nuestra herramienta. Se clonaron BepA de longitud completa (SEQ ID No. 10) y BepAE305-fin (SEQ ID No. 11) que contenían el dominio Bid C-terminal, y las células se infectaron con las cepas respectivas. Como se mostró que BepA induce la producción de AMP cíclico (AMPc) [74], se midió el nivel de AMPc en las células HeLa después de la infección. Mientras la translocación del dominio Bid del efector BepG de B. henselae (SEQ ID No. 136) no pudo inducir AMPc, el BepA de longitud completa y BepAE305-fin desencadenaron la producción de AMPc en las cantidades esperadas [74] (Fig. 6 C). Este resultado muestra que los efectores de tipo IV también pueden ser administrados eficazmente por el sistema de administración basado en YopE1-138 en células huésped diana y que son funcionales.

Translocación de proteínas eucariotas en células epiteliales

Para mostrar que las proteínas humanas pueden translocarse a través de la secreción de tipo III, fusionamos inductores de apoptosis humanos para su administración por Y. enterocolitica a YopE1-138 o para la administración por S. entérica a SteA1-20, SteA, SopE1-81 o SopE1-105. A continuación, monitorizamos la translocación del agonista del dominio de muerte que interacciona con BH3 humano (BID, SEQ ID No. 24), que es un miembro proapoptótico de la familia de proteínas Bcl-2. Es un mediador del daño mitocondrial inducido por caspasa-8 (CASP8). CASP8 escinde BID, y el BID truncado (tBID, SEQ ID No. 25) se transloca a las mitocondrias donde desencadena la liberación del citocromo c. Este último conduce al modo intrínseco de la activación de la caspasa 3 (CASP3) durante el cual se escinde en subunidades de 17 y 12 kDa [75]. Mientras que la infección durante 1 h con Y. enterocolitica que expresan YopE1-138-Myc o YopE1-138-BID no pudo inducir la apoptosis, la translocación del tBID humano desencadenó la muerte celular en un grado mayor que la estaurosporina, un inductor de la apoptosis bien caracterizado (Fig. 7A y C). Como era de esperar, la translocación de tBID da lugar a la producción de la subunidad p17 de CASP3, incluso en cantidades mayores que con la estaurosporina (Fig. 7 A). Para poder comparar las cantidades de proteína translocada con Bid endógeno, las células HeLa se lisaron con digitonina y se analizaron mediante transferencia Western usando un anticuerpo anti Bid (Fig. 7 B). El YopE1-138-tBID administrado por T3SS alcanzó casi niveles de Bid endógenos en células HeLa, mientras que el YopE1-138-BID administrado estaba presente en cantidades aún mayores (2,5 veces) (Fig. 7 B). Un mapeo profundo del proteoma y transcriptoma de células HeLa estimó 4,4 veces 105 copias de BID por célula individual [76]. Por lo tanto, se puede concluir que la administración de proteína humana dependiente de T3SS alcanza 105 a 106 proteínas por célula. Estos números se ajustan a las copias por célula de nanocuerpos translocados a través del T3SS de E. coli [4]. Asumiendo una nivelación de un factor de 10 para la MOI y para la duración de la infección, un factor de 3,2 para el punto de tiempo de la adición de antibiótico y para el tiempo de cultivo a 37 °C antes de la infección, las copias de proteína administradas/célula se pueden ajustar desde unas 1.000 copias/célula hasta unas 106 copias/célula. Conjuntamente, estos resultados indicaron que el tBID translocado era funcional y se administraba a niveles relevantes. Esto validó la herramienta de translocación para estudiar el papel de las proteínas en la regulación de la apoptosis, un aspecto central de la biología celular.

Además, fusionamos tBID murino (con codones optimizados para Y. enterocolitica; SEQ ID No. 194) o los dominios BH3 de tBID murino o BAX murino (en ambos casos, con codones optimizados para Y. enterocolitica;SEQ ID No. 138 y 139) a YopE1 -138 para la administración por Y. enterocolitica. Mientras que la infección durante 2,5 h con Y. enterocolitica AHOPEMT asd no administró proteínas ni YopE1-138-Myc pudo inducir la apoptosis, la translocación de tBID murino (con codones optimizados para Y. enterocolitica, SEQ ID No. 194) desencadenó la muerte celular en células B16F10 (Fig.16), D2A1 (Fig.17), HeLa (Fig.18) y 4T1 (Fig. 19). Se encontró que la translocación del dominio BH3 del BID murino con codones optimizados para Y. enterocolitica (SEQ ID 138) o BAX murino con codones optimizados para Y. enterocolitica (SEQ ID 139) también induce la muerte celular masiva en células B16F10 (Fig. 16), D2A1 (Fig. 17), HeLa (Fig. 18) y 4T1 (Fig. 19).

Mientras que la infección durante 4 h con bacterias S. enterica aroA no indujo la apoptosis, la translocación de tBID murino desencadenó la apoptosis, ya que la translocación de tBID murino condujo a la producción de la subunidad p17 de CASP3 (Figs. 20 y 21). El grado de inducción de la apoptosis para las proteínas de fusión de SopE fue mayor cuando se utilizaron condiciones de inducción de Spil T3SS (Fig. 20), lo que refleja el transporte de SopE exclusivamente por Spil T3SS. El tBID murino fusionado con SteA1-20 no indujo la apoptosis, muy probablemente porque la señal de secreción dentro de los 20 aminoácidos N-terminales de SteA no es suficiente para permitir la administración de una proteína de fusión (Fig. 20 y 21). El tBID murino fusionado con SteA de longitud completa conduce a la inducción de la apoptosis en células HeLa (Fig. 20 y 21), tanto en condiciones de inducción de SpiI como de Spill T3SS, lo que refleja la capacidad de SteA para ser transportado por ambos T3SS. Debe observarse que incluso en condiciones de inducción de Spill T3SS, se espera una actividad parcial de Spil T3SS como se ve por la actividad de las proteínas de fusión de SopE en condiciones de inducción de SpiII T3SS (Fig. 21).

Además de las proteínas eucariotas translocadas elaboradas funcionalmente aquí, se han secretado varias otras proteínas eucariotas usando la herramienta aquí descrita. Esto incluye para la administración por Y. enterocolitica (Fig. 13, 14 y 23) de proteínas de la regulación del ciclo celular (Mad2 (s Eq ID No. 15), CDK1 (SEQ ID No. 14), INK4A (s Eq iD No. 16), INK4B (SEQ ID No. 17) e INK4C (SEQ ID No. 18)), así como partes de las mismas (INK4A 84-103 (SEQ ID No. 158), p107 657-662 (SEQ ID No. 159), p21 141-160 (SEQ ID No. 160), p21 145-160 (SEQ ID No 161), p21 17-33 (SEQ ID No 162) y ciclina D2 139-147 (SEQ ID No 163)), proteínas relacionadas con la apoptosis (Bad (SEQ ID No 29 ), FADD (SEQ ID No. 28) y Caspasa 3 p17 (SEQ ID No. 22) y p12 (SEQ ID No. 23), Bid de pez cebra (SEQ ID No. 19) y t-Bid (SEQ ID No. 20)), así como partes de los mismos (tBid Bh 3 (SEQ ID No.138), Bax Bh 3 (SEQ ID No.139)), proteínas de señalización (TRAF6 murino (SEQ ID No. 12), TIFA (SEQ ID No. 13)), subunidad Ga de GPCR (GNA12, isoforma más corta, (SEQ ID No. 30)), nanocuerpo (vhhGFP4, (SEQ ID No. 31)) y construcciones de fusión de nanocuerpos para la degradación de proteínas dirigida (Slmb-vhhGFP4; (SEQ_ID_Nos. 32, 33, 34) [77]) (Fig. 13 y 14), así como pequeñas GTPasas (Rac1 Q61E (SEQ ID No. 26 y 137) y RhoA Q63L (SeQ ID No. 27) y dominio de homología de pleckstrina de Akt humano (SEQ ID No. 35). Además de las proteínas relacionadas con la apoptosis elaboradas funcionalmente (tBid murino, SEQ ID No. 144-147), esto incluye además la administración por S. entérica (Fig. 22) de proteínas de la regulación del ciclo celular (Mad2 (SEQ ID No. 168-169), CDK1 (SEQ ID No.

170-171), iNk4A (SEQ ID No. 164-165) e INK4C (SEQ ID No. 166-167)). Si bien esas proteínas no se han validado funcionalmente, la posibilidad de secreción dependiente de T3SS de diversas proteínas eucariotas en combinación con la posible eliminación del apéndice YopE abre nuevas perspectivas sobre la amplia aplicabilidad de T3SS en biología celular y aplicaciones terapéuticas.

La translocación in vivo de Bid truncado en embriones de pez cebra induce la apoptosis

Una característica interesante de esta herramienta bacteriana es el uso potencial en animales vivos. El pez cebra en su estado embrionario se puede mantener transparente, lo que permite la tinción fluorescente y la microscopía [44,78,79]. Se han descrito con detalle pocos inductores de la apoptosis en el pez cebra, de los cuales z-BIM es el más potente [80]. Por lo tanto, decidimos clonar z-BIM en nuestro sistema. Incluso si es débilmente homólogo a BIM humano, ensayamos la potencia de inducción de la apoptosis de YopE1-138-z-BIM (SEQ ID No.21) en células epiteliales humanas. Las células HeLa infectadas durante 1 h con la cepa que transloca YopE1-138-z-BIM mostraron signos claros de muerte celular. Después, realizamos experimentos in vivo con embriones de pez cebra 2 días después de la fertilización (dpf), utilizando un modelo de infección localizada mediante microinyección de bacterias en el rombencéfalo [44]. Después de la infección durante 5,5 h, los peces se fijaron, se permeabilizaron y se tiñeron para detectar la presencia de CASP3 p17. Tras la infección con la cepa que expresa YopE1-138-Myc, las bacterias eran visibles en la región del rombencéfalo (tinción "b", Fig. 8 A I) pero no se detectó inducción de la apoptosis alrededor de las bacterias (tinción "c", Fig. 8 A I). Por el contrario, tras la infección con la cepa que administra YopE1-138-z-BIM se observó un fuerte aumento en la presencia de CASP3 escindida en las regiones que rodean a las bacterias (Fig. 8 A II). El análisis de imágenes automatizado en proyecciones z de máxima intensidad confirma que las bacterias que translocan YopE1-138-z-BIM inducen la apoptosis en las células cercanas mucho más que las bacterias de control (Fig. 8 B). Esto indica que z-BIM es funcional en el pez cebra tras la translocación bacteriana. Estos resultados validan aún más el uso de T3SS para la administración de proteínas eucariotas en animales vivos.

La fosfoproteómica revela el impacto global de las proteínas translocadas en la fosforilación de proteínas

La fosforilación es una modificación posterior a la traducción muy extendida que puede activar o inactivar procesos biológicos y, por lo tanto, es una diana adecuada para estudiar eventos de señalización [81,82]. A pesar de esto, en la actualidad no se dispone de un análisis a nivel de sistemas de la fosforilación en la apoptosis. Para analizar el impacto del tBid humano administrado a las células HeLa, utilizamos un enfoque fosfoproteómico sin marcaje mediante LC-MS/MS. En tres experimentos independientes, las células se dejaron sin tratar, se infectaron con AHOPEMT asd + YopE1-138-Myc o con AHOPEMT asd + YopE1-138-tBid durante 30 minutos. Las células se lisaron, seguido de digestión enzimática, enriquecimiento de fosfopéptidos y cuantificación e identificación de fosfopéptidos individuales. Comparamos las células infectadas con AHOPEMT asd + YopE1-138-Myc con células infectadas con AHOPEMT asd + YopE1-138-tBid, lo que nos permite identificar 363 eventos de fosforilación dependientes de tBid. 286 fosfopéptidos mostraron un aumento en la fosforilación, mientras que 77 fueron menos fosforilados tras la administración de tBid, lo que corresponde a 243 proteínas diferentes, que definimos como el fosfoproteoma de tBid. La base de datos STRING se utilizó para crear una red de interacción proteína-proteína del fosfoproteoma de tBid [83] (Fig. 9 A). Además, se añadieron a la red 27 proteínas que se sabe que están relacionadas con la apoptosis mitocondrial, creando un grupo central. Curiosamente, solo unas pocas proteínas del fosfoproteoma de tBid están conectadas con este grupo central, lo que indica que muchas proteínas experimentan un cambio en la fosforilación que hasta ahora no estaban directamente vinculadas a proteínas apoptóticas. Para caracterizar las funciones biológicas cubiertas por el fosfoproteoma de tBid, realizamos un análisis de ontología génica utilizando la herramienta de anotación funcional de la Base de Datos para Anotación, Visualización y Descubrimiento Integrado (DAVID, http://david.abcc.ncifcrf.gov/) [84,85]. Las funciones biológicas identificadas muestran que tBid afecta a diversos procesos celulares. Muchas proteínas implicadas en el reordenamiento de la cromatina y la regulación de la transcripción sufren un cambio en la fosforilación (es decir, CBX3, CBX5, TRIM28, HDAC1). HDAC1, por ejemplo, es una histona desacetilasa que desempeña un papel en la regulación de la transcripción. Se ha mostrado que HDAC1 puede modular la actividad transcripcional de NF-kB, una proteína que también participa en la apoptosis. Además, identificamos un grupo de proteínas implicadas en el procesamiento del ARN que previamente se ha mostrado que desempeñan un papel importante en la regulación de la apoptosis [86]. HNRPK, por ejemplo, media una respuesta de p53/TP53 al daño del ADN y es necesaria para la inducción de la apoptosis [87]. Además, la fosforilación de proteínas implicadas en la traducción de proteínas también se ve afectada. Varios factores de iniciación eucariotas (es decir, EIF4E2, EIF4B, EIF3A, EIF4G2) experimentan un cambio en la fosforilación, lo que está en línea con la observación de que la síntesis de proteínas global está disminuida en las células apoptóticas. Curiosamente, la fosforilación de muchas proteínas implicadas en la remodelación del citoesqueleto (p. ej., PXN, MAP1B9 se alteran con la administración de tBid. Esto está en concordancia con la observación de que la morfología de las células cambia drásticamente con la administración de tBid (Figura 9 B). La contracción de las células y la pérdida de contacto se refleja por el hecho de que observamos la fosforilación de proteínas relacionadas con la adhesión como ZO2 y paxilina. De manera similar, la contracción de los núcleos se acompaña de la fosforilación de proteínas laminares como LáminaA/C y Lámina B1. Conjuntamente, la administración de tBID induce una rápida respuesta apoptótica también indicado por la ruptura de la integridad mitocondrial (Fig. 9 B). Mostramos que la apoptosis inducida por tBid afecta a cientos de eventos de fosforilación que participan en diversos procesos celulares. Si bien muchas proteínas identificadas se han relacionado con la apoptosis, se sabe que solo unas pocas se fosforilan después de la inducción de la apoptosis . El enfoque fosfoproteómico proporciona, por tanto, un recurso útil para futuros estudios sobre la apoptosis.

Translocación de proteínas de fusión heterólogas eucariotas que consisten en dominios de proteínas repetidos idénticos o variables en células epiteliales

Para mostrar que las proteínas de fusión heterólogas que consisten en dominios de proteínas repetidos idénticos o variables pueden translocarse a través de la secreción de tipo III, fusionamos inductores de la apoptosis murina para su administración por Y. enterocolitica a YopE1-138. Como control, fusionamos tBID murino (con codones optimizados para Y. enterocolitica; SEQ ID No. 194) o los dominios BH3 de tBID murino o BAX murino (en ambos casos, con codones optimizados para Y. enterocolitica; SEQ ID No. 200 y 201) a YopE1-138 para la administración por Y. enterocolitica. La proteína de fusión heteróloga consistió en un caso en el dominio BH3 murino de tBID fusionado a sí mismo, dando como resultado YopE1-138-(tBID-BH3)2 (SEQ ID No. 202). En un segundo caso, las proteínas de fusión heterólogas consistieron en el dominio BH3 murino de tBID fusionado con el dominio BH3 murino de BAX, dando como resultado YopE1-138-(tBID-BH3)-(BAX-BH3) (SEQ ID No. 203). En el caso de tBID murino y BAX murino, los codones se optimizaron para Y. enterocolitica. En la Fig. 25 se muestra una representación esquemática de dominios idénticos repetidos o una combinación de diferentes dominios de proteínas.

Mientras que la infección durante 4 h con Y. enterocolitica AHOPEMT asdadministrando YopE1-138-Myc no pudo inducir la apoptosis, la translocación del dominio BH3 murino de tBID (con codones optimizados para Y. enterocolitica, SEQ ID No. 194) desencadenó la muerte celular en las células B16F10 y 4T1 (Fig. 26 y 27), con una claro efecto de respuesta a la dosis sobre el aumento de la multiplicidad de infección (MOI). Sorprendentemente, se encontró que el YopE1-138-(tBID-BH3)-(BAX-BH3) o YopE1-138-(tBID-BH3)2 administrado eran más activos que YopE1-138-(tBID-BH3) con MOI más baja (Fig. 26 y 27). Esto indica que tras la administración de dominios idénticos repetidos o la combinación de diferentes dominios proteicos, puede aumentar el impacto sobre una ruta celular deseada como la apoptosis.

Generación de bacterias proapoptóticas mejoradas

En los experimentos mencionados anteriormente, se muestra que la administración basada en T3SS de proteínas proapoptóticas (p. ej., t-BID (SEQ ID No. 25) o BIM (SEQ ID No. 21)) induce eficazmente la muerte celular tanto en células murinas como humanas, incluyendo las células cancerosas, y que este efecto podría aumentarse cuando se usa t-BID murino optimizado para el uso de codones bacterianos (SEQ ID No. 138). Es muy probable que este aumento de la muerte celular refleje una mayor cantidad de producción de proteínas y la administración posterior a través de T3SS debido a los codones óptimos utilizados.

Con el fin de optimizar la administración de proteínas proapoptóticas, se han generado cepas transformadas con diferentes proteínas proapoptóticas según la Tabla IV.

Tabla IV: Cepas transformadas con diferentes proteínas proapoptóticas

El acortamiento de las proteínas administradas a los dominios esenciales requeridos para la señalización (SEQ ID No.

138 o 200)) podría aumentar la eficiencia de la muerte celular. (Fig. 28). Sin estar ligado a la teoría, es probable que este aumento en la eficacia esté relacionado con una mayor cantidad de producción de proteína y después de la administración a través de T3SS debido al tamaño más pequeño de la proteína administrada. La introducción de un enlazador entre la parte YopE y el dominio BH3 de tBID (SEQ ID No. 218) disminuyó la eficacia, así como la extensión del dominio BH3 en 4 aminoácidos adicionales (SEQ ID No. 217) (Fig. 28).

Además, se generaron cargas sintéticas con repeticiones de dichos dominios esenciales (p. ej., el dominio BH3 de t-BID (SEQ ID No. 202))) o combinaciones de estos dominios esenciales (p. ej., el dominio BH3 de t-BID y el dominio BH3 de BAX (SEQ ID No. 203 y 219)). Sorprendentemente, se encontró que las repeticiones en tándem de los mismos o diferentes dominios BH3 dan como resultado una inducción mejorada de la apoptosis en líneas celulares cancerosas (incluyendo las células 4T1 y B16F10, Fig.28). Se encontró que la CI50 (concentración inhibitoria mitad de la máxima), que se refiere al número de bacterias por célula eucariota (MOI) necesaria para matar el 50 % de dichas células, disminuyó después de la administración de repeticiones en tándem del dominio BH3 de tBID en comparación con un dominio único BH3 de tBID (Fig. 28). Este hallazgo fue sorprendente, ya que el tamaño de la proteína aumenta al fusionarse como segundo dominio BH3 de t-BID. Debido a esto, se esperarían niveles disminuidos de expresión y administración de YopE1-138-(tBID BH3)2 (SEQ ID No. 202) en comparación con YopE1-138-tBID BH3 (SEQ iD No. 138 o 200), y podría alcanzar como máximo niveles equivalentes. Con el fin de alcanzar un aumento en la actividad de muerte celular, los dominios BH3 de tBID fusionados deben actuar simultáneamente uno al lado del otro tras la administración por el T3SS en células eucariotas. En el caso en el que solo un dominio BH3 de tBID en la construcción YopE1-138-(tBID BH3)2 fuera funcional, podría esperarse, en el mejor de los casos, la misma eficiencia que con YopE1-138-tBID BH3.

Con el fin de aumentar la estabilidad genética de YopE1-138-(tBID BH3)2 (SEQ ID No. 202) para los estudios in vivo, clonamos YopE1-138-(tBID BH3)2 (SEQ ID No. 202) mediante recombinación homóloga en el plásmido de virulencia de Yersinia pYV en el sitio nativo de YopE y bajo el promotor de YopE nativo (usando plásmidos mutadores pSI_408 y pSI_419). Dichos mutadores contienen la secuencia de ADN que codifica la proteína deseada, flanqueada por 200 250 pb de secuencias en ambos lados correspondientes al sitio del gen respectivo, donde tendrá lugar la integración. Estos plásmidos se transforman en E. coli Sm10 A pir, desde donde se movilizaron los plásmidos a la cepa correspondiente de Y. enterocolitica. Los mutantes que portaban el vector integrado se propagaron durante varias generaciones sin presión de selección. Después, se usó sacarosa para seleccionar los clones que habían perdido el vector. Finalmente, los mutantes se identificaron mediante PCR de colonias. Las proteínas endógenas para el transporte por el T3SS (llamadas 'proteínas externas de Yersinia", Yops) están codificadas por Y. enterocolitica en este plásmido de 70 kb, llamado plásmido de virulencia de Yersinia (pYV), que además codifica el aparato T3SS. Las cepas de Yersinia que codifican YopE1-138-(tBID BH3) (SEQ ID No. 138 o 200) o YopE1-138-(tBID b H3)2 (SEQ ID No.

202) en el plásmido de virulencia de Yersinia pYV en el sitio nativo de YopE y bajo el promotor de YopE nativo se evaluaron para determinar su capacidad de inducir la apoptosis en células cancerosas (incluyendo las células 4T1 y B16F10, Fig. 29). Se encontró que la CI50 (concentración inhibidora mitad de la máxima), que se refiere al número de bacterias por célula eucariota (MOI) necesaria para matar el 50 % de dichas células, disminuyó después de la administración de repeticiones en tándem del dominio BH3 de tBID en comparación con un dominio único BH3 de tBID, cuando ambas proteínas están codificadas en el plásmido de virulencia de Yersinia pYV en el sitio nativo de YopE y bajo el promotor nativo de YopE (Fig. 29). Esto está de acuerdo con los hallazgos de la administración de estas proteínas por plásmido de expresión. (Fig. 28). De nuevo, este hallazgo fue sorprendente, ya que el tamaño de la proteína aumenta al fusionar un segundo dominio BH3 de t-BID. Debido a esto, se esperaría una disminución de los niveles de expresión y administración de YopE1-138-(tBID BH3)2 (SEQ ID No. 202) en comparación con YopE1-138-tBID BH3 (SEQ ID No. 138 o 200), y podría alcanzar como máximo niveles equivalentes. Con el fin de alcanzar un aumento en la actividad de muerte celular, los dominios BH3 de tBID fusionados deben actuar simultáneamente uno al lado del otro después de la administración por el T3SS en células eucariotas. En el caso en el que solo un dominio BH3 de tBID en la construcción YopE1-138-(tBID BH3)2 fuera funcional, se esperaría, en el mejor de los casos, la misma eficiencia que con YopE1-138-tBID BH3. Además, las cepas de Yersinia que codifican YopE1-138-(tBID BH3)2 (SEQ ID No. 202) en el plásmido de virulencia de Yersinia pYV en el sitio nativo de YopE y bajo el promotor de YopE nativo se compararon para determinar su capacidad de inducir apoptosis en células cancerosas con la administración derivada del plásmido de expresión (basado en pBad-MycHisA) de YopE1-138-(tBID BH3)2. De acuerdo con el mayor número de copias de pBad-MycHisA (20-25 copias) en comparación con pYV (se reportan de 1 a 6 copias), la administración de YopE1-138-(tBID b H3)2 basada en pBad-MycHisA (SEQ ID No. 202) dio como resultado un valor de CI50 ligeramente disminuido en las células 4T1 y B16F10 (Fig. 29).

Validación del crecimiento específico del tumor in vivo hasta el día 14 después de la administración bacteriana

El experimento de colonización tumoral por Y. enterocolitica modificada genéticamente se repitió en un modelo de aloinjerto murino singénico (modelo de cáncer de mama 4T1) y se siguió la colonización bacteriana durante dos semanas. Esta vez, los ratones se infectaron con 1*106 unidades formadoras de colonias (CFU) de Y. enterocolitica úyopH,O,P,E,M,T. Si bien obtuvimos resultados similares al modelo B16F10 en los primeros días posteriores a la infección, pudimos mostrar además que la colonización del tumor se encuentra consistentemente en el día 8 y hasta el día 14 después de la infección (Fig. 30). Además, la colonización sigue siendo muy específica y solo se detectan recuentos bajos de bacterias en todos los demás órganos evaluados (Fig. 31). Estos hallazgos indican que Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T es capaz de establecer una colonización persistente del tumor evitando así el aclaramiento por parte del sistema inmune.

Eficacia de Y. enterocolitica AHOPEMTen el retraso de la progresión del tumor

Con el fin de evaluar el impacto de YopE1-138-(tBID BH3)2 (SEQ ID No. 202) administrado a células tumorales in vivo, realizamos estudios en ratones Balb/C de tipo salvaje aloinjertados s.c. con células de cáncer de mama 4T1. Nuestro objetivo era evaluar la cepa de Y. enterocolitica AHOPEm T que codifica YopE1-138-(tBID BH3)2 (SEQ ID No. 202) en el plásmido pYV de virulencia de Yersinia en el sitio nativo de YopE y bajo el promotor de YopE nativo. Se inyectó a los ratones i.v. PBS o 1*107 Y. enterocolitica AHOPEMT pYV-YopE1-138-(tBID BH3)2, una vez que el tumor alcanzó un tamaño de 150-250 mm3. El día de la inyección i.v. de bacterias se definió como el día 0. Se midió el volumen del tumor durante los días siguientes (día 0 a día 9 después de la inyección i.v. de bacterias) con calibradores. El volumen del tumor se normalizó respecto al volumen del tumor en el día 0 para compensar cualquier heterogeneidad inicial en el tamaño del tumor. El tratamiento con Y. enterocolitica AHOPEMT pYV-YopE1-138-(tBID BH3)2 mostró un impacto en la progresión del volumen del tumor, con una reducción del tumor estadísticamente significativa en los días 8, 9 y 10 después de la administración bacteriana (Fig. 32). De forma importante, se encontró que Y. enterocolitica AHOPEMT sola no afectaba la progresión del tumor en el modelo de cáncer murino 4T1 (Fig. 33). Estos hallazgos destacan que dichas bacterias y su T3SS pueden emplearse para interferir con la progresión del tumor.

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89 WO 2015/042705 A1

90 US 2015/140037 A1

Claims

r e iv in d ic a c io n e s

1. Una cepa bacteriana Gram negativa recombinante transformada con un vector que comprende en la dirección 5' a 3':

un promotor;

una primera secuencia de ADN que codifica una señal de administración de una proteína efectora de T3SS bacteriano, unida operativamente a dicho promotor; y

una segunda secuencia de ADN que codifica dominios repetidos de una proteína heteróloga, en donde

los dominios repetidos de una proteína heteróloga comprenden una proteína de fusión que consiste en varias repeticiones de un dominio de una proteína heteróloga, o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes, en donde los dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes comprenden una proteína de fusión que consiste en una o varias repeticiones de al menos dos dominios de proteínas heterólogas diferentes fusionados en marco al extremo 3' de dicha primera secuencia de ADN, en donde las proteínas heterólogas son proteínas implicadas en la apoptosis o en la regulación de la apoptosis, y

en donde la señal de administración de la proteína efectora de T3SS bacteriano codificada por la primera secuencia de ADN comprende la proteína efectora YopE o un fragmento N-terminal de la misma o la proteína efectora SopE o SteA o un fragmento N-terminal de la misma.

2. Una cepa bacteriana Gram negativa recombinante transformada con un vector que comprende en la dirección 5' a 3':

una primera secuencia de ADN que codifica una señal de administración o un fragmento de la misma de una proteína efectora de T3SS bacteriano; y

una segunda secuencia de ADN que codifica dominios repetidos de una proteína heteróloga, en donde los dominios repetidos de una proteína heteróloga comprenden una proteína de fusión que consiste en varias repeticiones de un dominio de una proteína heteróloga, o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes, en donde los dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes comprenden una proteína de fusión que consiste en una o varias repeticiones de al menos dos dominios de proteínas heterólogas diferentes fusionados en marco al extremo 3' de dicha primera secuencia de ADN, en donde las proteínas heterólogas son proteínas implicadas en la apoptosis o en la regulación de la apoptosis, y

3. La cepa bacteriana Gram negativa recombinante de la reivindicación 1 o 2, en donde dicha cepa bacteriana Gram negativa recombinante es deficiente en la producción de al menos una proteína efectora de T3SS.

4. La cepa bacteriana Gram negativa recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la cepa bacteriana Gram negativa recombinante se selecciona del grupo que consiste en los géneros Yersinia, Escherichia, Salmonella y Pseudomonas.

5. La cepa bacteriana Gram negativa recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la cepa bacteriana Gram negativa recombinante es una cepa de Yersinia o en donde la cepa bacteriana Gram negativa recombinante es una cepa de Salmonella.

6. La cepa bacteriana Gram negativa recombinante de la reivindicación 1 o 2, en donde la cepa bacteriana Gram negativa recombinante es una cepa de Yersinia y donde dicha cepa de Yersinia es de tipo salvaje o deficiente en la producción de al menos una proteína efectora de T3SS y en donde la señal de administración de la proteína efectora de T3SS bacteriano comprende los 138 aminoácidos N-terminales de la proteína efectora YopE de Y. enterocolitica o, en donde la cepa bacteriana Gram negativa recombinante es una cepa de Salmonella y en donde dicha cepa de Salmonella es de tipo salvaje o deficiente en la producción de al menos una proteína efectora de T3SS y en donde la señal de administración de la proteína efectora de T3SS bacteriano comprende la proteína efectora SteA de S. enterica o los 81 o 105 aminoácidos N-terminales de la proteína efectora SopE de S. enterica.

7. Un vector que comprende en la dirección 5' a 3':

un promotor;

una primera secuencia de ADN que codifica una señal de administración de una proteína efectora de T3SS bacteriano, unida operativamente a dicho promotor, en donde la señal de administración de la proteína efectora de T3SS bacteriano comprende la proteína efectora YopE o un fragmento N-terminal de la misma o la proteína efectora SopE o SteA o un fragmento N-terminal de la misma;

8. Un vector que comprende en la dirección 5' a 3':

9. La cepa bacteriana Gram negativa recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o el vector de las reivindicaciones 7 u 8, en donde las proteínas implicadas en la apoptosis o en la regulación de la apoptosis se seleccionan del grupo que consiste en proteínas solo BH3 seleccionadas del grupo que consiste en Bad, BIM, Bid y tBid, Puma, Bik/Nbk, Bod, Hrk/Dp5, BNIP1, BNIP3, Bmf, Noxa, Mcl-1, Bcl-Gs, Beclina 1, Egl-1 y CED-13; caspasas y proteínas de señalización intracelular del control del receptor de muerte de la apoptosis.

10. La cepa bacteriana Gram negativa recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o el vector de la reivindicación 7 u 8, en donde el dominio repetido es el dominio BH3 del inductor de la apoptosis tBID.

11. La cepa bacteriana Gram negativa recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o el vector de la reivindicación 7 u 8, en donde los dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes son dominios de proteínas heterólogas que pertenecen a la misma clase funcional de proteínas.

12. La cepa bacteriana Gram negativa recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o el vector de la reivindicación 7 u 8, en donde los dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes son el dominio BH3 del inductor de la apoptosis tBID y el dominio BH3 del regulador de la apoptosis BAX.

13. La cepa bacteriana Gram negativa recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o el vector de la reivindicación 7 u 8, en donde el vector comprende una tercera secuencia de ADN que codifica un sitio de escisión de proteasa, en donde la tercera secuencia de ADN está ubicada entre el extremo 3' de dicha primera secuencia de ADN y el extremo 5' de dicha segunda secuencia de ADN.