EA039922B1

EA039922B1 - Доставка белка бактериями

Info

Publication number: EA039922B1
Application number: EA201890914A
Authority: EA
Inventors: Симон Иттиг; Марлиз Амштуц; Кристоф Каспер
Original assignee: Университет Базель
Priority date: 2015-11-19
Filing date: 2016-11-17
Publication date: 2022-03-28
Also published as: EP3377634B1; LT3377634T; HK1256138A1; CN108884466B; US20190194670A1; EP3377634A1; AU2016355975B2; CA3005380A1; BR112018009782A2; ES2830251T3; DK3377634T3; SG11201803642WA; SI3377634T1; IL259050B2; US11702663B2; AU2016355975A1; HRP20201792T1; PT3377634T; EA201890914A1; JP6937752B2

Abstract

Настоящее изобретение относится к рекомбинантным грамотрицательным бактериальным штаммам и их применению для доставки повторяющихся доменов гетерологичного белка или двух или более доменов различных гетерологичных белков в эукариотические клетки.

Description

Уровень техники

В течение многих лет в биологических исследованиях клеток для изучения функций белка применялись методы транзиентной трансфекции. Указанные методы как правило приводят к существенному превышению количества исследуемого белка, что может вести к чрезмерно упрощенным моделям сигнализации. Для белков, контролирующих скоротечные процессы сигнализации, данный белок живет гораздо дольше, чем контролируемое им событие сигнализации. Более того, транзиентная сверхэкспрессия на основе трансфекции ДНК приводит к гетерогенной и несинхронизированной популяции клеток, что усложняет функциональные исследования и затрудняет подходы с точки зрения -омик. Помимо этого, масштабирование таких анализов очень дорого. Некоторые из вышеупомянутых проблем решаются существующими методиками, например микроинъекциями или протеофекцией очищенных белков, стратегией индуцируемой транслокации для быстрого нацеливания передающихся через плазмиды малых ГТФаз на клеточную мембрану или добавлением очищенных белков, слитых с проникающими через мембрану бактериальными токсинами. Но все указанные методики требуют много времени и усилий, и, насколько известно авторам настоящего изобретения, ни одна из них не соответствует всем указанным критериям.

Бактерии выработали другие механизмы для непосредственного впрыскивания своих белков в клетки-мишени [1]. Секреционная система третьего типа (T3SS), используемая такими бактериями, как Yersinia, Shigella и Salmonella [2], работает как нано-шприц, который вводит так называемые бактериальные эффекторные белки в клетки-хозяева. Бактериальные белки, которые секретируются посредством T3SS, называемые эффекторами, содержат короткий N-концевой сигнал секреции [3]. Внутри бактерий некоторые эффекторы связаны шаперонами. Шапероны могут маскировать токсичные домены, они способствуют экспозиции сигнала секреции и поддерживают субстраты в компетентной для секреции конформации, тем самым облегчая секрецию. При индукции секреции АТФаза, прилегающая к T3SS, удаляет шапероны, и эффекторы движутся в несвернутом или только частично свернутом виде через иглу, а затем снова сворачиваются в цитоплазме хозяина.

Систему T3S и ранее использовали для доставки гибридных пептидов и белков в клетки-мишени. В случае если изучаемая бактерия является труднодоступной методами генетики (например, Chlamydia trachomatis), доставляли гетерологичные бактериальные эффекторы T3SS. Часто репортерные белки сливали с возможными сигналами секреции T3SS в соответствии с требованиями исследований для доставки T3SS-зависимого от белка, например, в случае аденилатциклазы Bordetella pertussis, мышиной DHFR или фосфорилируемой метки. Доставку пептидов выполняли в основном с целью вакцинации. Это касалось вирусных эпитопов, бактериальных эпитопов (листериолизин О), а также пептидов, представляющих эпитопы раковых клеток человека. В немногих случаях функциональные эукариотические белки доставлялись для модуляции клетки-хозяина, например, в случае нанотел [4], ядерных белков (Creрекомбиназа, MyoD) [5, 6] или Il10 и IL1ra [7]. Ни одна из вышеупомянутых систем не обеспечивает доставку одиночного белка, поскольку в каждом случае все равно кодируется один или несколько эндогенных эффекторных белков. Кроме того, используемые векторы не были рассчитаны на то, чтобы обеспечить простое клонирование других фрагментов ДНК, кодирующих выбранные белки, препятствуя широкому применению такой системы. Неожиданно было обнаружено, что доставка повторяющихся доменов гетерологичных белков или комбинаций доменов разных гетерологичных белков в эукариотические клетки увеличивает воздействие на желаемый клеточный путь.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение в целом относится к рекомбинантным грамотрицательным бактериальным штаммам и их применению для доставки повторяющихся доменов гетерологичного белка или двух или более доменов различных гетерологичных белков в эукариотические клетки. В настоящем изобретении предложены грамотрицательные бактериальные штаммы и их применение, позволяющее транслоцировать повторяющиеся домены гетерологичного белка или два или более доменов различных гетерологичных белков, таких как различные эффекторы типа III, но также эффекторы типа IV, вирусные белки и, самое главное, функциональные эукариотические белки. Предложены средства для флуоресцентного отслеживания доставки, для релокализации к ядру и, в частности, для удаления придатков бактерии после доставки в клетку-хозяина. Представленная система на основе T3SS обеспечивает масштабируемую, быструю, синхронизированную, гомогенную и настраиваемую доставку повторяющихся доменов гетерологичного белка или двух или более доменов различных гетерологичных белков, являющихся объектом исследования. Система доставки по настоящему изобретению пригодна для введения повторяющихся доменов эукариотического белка эукариот или двух или более доменов различных эукариотических белков у живых животных и может использоваться в терапевтических целях.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантному грамотрицательному бактериальному штамму, трансформированному вектором, который содержит в направлении от 5' до 3':

- 1 039922 промотор; первую последовательность ДНК, кодирующую сигнал доставки от бактериального T3SSэффекторного белка, функционально связанного с указанным промотором; а также вторую последовательность ДНК, кодирующую повторяющиеся домены гетерологичного белка или два или более доменов различных гетерологичных белков, слитых в рамке с 3'-концом указанной первой последовательности ДНК, причем гетерологичные белки выбраны из группы, состоящей из белков, участвующих в апоптозе или регуляции апоптоза, регуляторов клеточного цикла, белков с анкириновым повтором, белков клеточной сигнализации, репортерных белков, транскрипционных факторов, протеаз, малых ГТФаз, связанных с GPCR белков, нанотел и конструкций слияния нанотел, бактериальных эффекторов T3SS, бактериальных эффекторов T4SS и вирусных белков.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантному грамотрицательному бактериальному штамму, трансформированному вектором, который содержит в направлении от 5 ' до 3': первую последовательность ДНК, кодирующую сигнал доставки или ее фрагмент из бактериального эффекторного белка; а также вторую последовательность ДНК, кодирующую повторяющиеся домены гетерологичного белка или два или более доменов различных гетерологичных белков, слитых в рамке с 3'концом указанной первой последовательности ДНК, причем гетерологичные белки выбраны из группы, состоящей из белков, участвующих в апоптозе или регуляции апоптоза, регуляторов клеточного цикла, белков с анкириновым повтором, белков клеточной сигнализации, репортерных белков, транскрипционных факторов, протеаз, малых ГТФаз, связанных с GPCR белков, нанотел и конструкций слияния нанотел, бактериальных эффекторов T3SS, бактериальных эффекторов T4SS и вирусных белков.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к вектору, который содержит в направлении от 5' до 3': первую последовательность ДНК, кодирующую сигнал доставки или ее фрагмент из бактериального эффекторного белка; а также вторую последовательность ДНК, кодирующую повторяющиеся домены гетерологичного белка или два или более доменов различных гетерологичных белков, слитых в рамке с 3'-концом указанной первой последовательности ДНК, причем гетерологичные белки выбраны из группы, состоящей из белков, участвующих в апоптозе или регуляции апоптоза, регуляторов клеточного цикла, белков с анкириновым повтором, белков клеточной сигнализации, репортерных белков, транскрипционных факторов, протеаз, малых ГТФаз, связанных с GPCR белков, нанотел и конструкций слияния нанотел, бактериальных эффекторов T3SS, бактериальных эффекторов T4SS и вирусных белков.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к вектору, который содержит в направлении от 5' до 3': промотор;

первую последовательность ДНК, кодирующую сигнал доставки от бактериального T3SSэффекторного белка, функционально связанного с указанным промотором;

вторую последовательность ДНК, кодирующую повторяющиеся домены гетерологичного белка или два или более доменов различных гетерологичных белков, слитых в рамке с 3'-концом указанной первой последовательности ДНК, причем гетерологичные белки выбраны из группы, состоящей из белков, участвующих в апоптозе или регуляции апоптоза, регуляторов клеточного цикла, белков с анкириновым повтором, белков клеточной сигнализации, репортерных белков, транскрипционных факторов, протеаз, малых ГТФаз, связанных с GPCR белков, нанотел и конструкций слияния нанотел, бактериальных эффекторов T3SS, бактериальных эффекторов T4SS и вирусных белков.

Настоящее изобретение также относится к способу доставки повторяющихся доменов гетерологичного белка или двух или более доменов различных гетерологичных белков в эукариотическую клетку, включающему следующие указанные этапы:

i) культивирование грамотрицательного бактериального штамма; а также ii) контактирование эукариотической клетки с грамотрицательным бактериальным штаммом i), причем слитый белок, который содержит сигнал доставки от бактериального эффектора T3SS и повторяющиеся домены гетерологичного белка или два или более доменов различных гетерологичных белков, экспресируется посредством этого грамотрицательного бактериального штамма и транслоцируется в эукариотическую клетку.

i) культивирование грамотрицательного бактериального штамма;

ii) контактирование эукариотической клетки с грамотрицательным бактериальным штаммом i), причем слитый белок, который содержит сигнал доставки от бактериального эффектора T3SS и повторяющиеся домены гетерологичного белка или два или более доменов различных гетерологичных белков, экспресируется посредством этого грамотрицательного бактериального штамма и транслоцируется в эукариотическую клетку; а также iii) расщепление слитого белка, так что повторяющиеся домены гетерологичного белка или два или более доменов различных гетерологичных белков отщепляются от сигнала доставки из бактериального T3SS-эффекторного белка.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к библиотеке грамотрицательных бактериальных штаммов, причем повторяющиеся домены гетерологичного белка или два или более доменов

- 2 039922 различных гетерологичных белков, кодируемых второй ДНК-последовательностью вектора экспрессии указанных грамотрицательных бактериальных штаммов, представлены доменами человеческого или мышиного белка, и каждый домен человеческого или мышиного белка, экспрессируемый грамотрицательным бактериальным штаммом, отличается в аминокислотной последовательности.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - описание доставки белка T3SS. (А) Схематическое изображение секреции зависимого от T3SS белка в окружающую среду (секреция in vitro) (слева) или в эукариотические клетки (справа). I: показана система секреции типа 3. II: белки, секретируемые в окружающую среду, III: белки, транслоцированные через мембрану в цитозоль эукариотических клеток (VII). VI: показан участок двух бактериальных мембран, в которые введена T3SS, и цитозоль бактерии внизу. IV: слитый белок, присоединенный к N-концевому фрагменту YopE1_₁₃₈ (V) (В) In-vitro секреция I: Y. enterocolitica Е40 дикого типа, II: Y. enterocolitica AHOPEMT asd или III: Y. enterocolitica AHOPEMT asd+pBadSi_2 по данным Вестернблоттинга на совокупности бактериальных лизатов (IV) и осажденных супернатантов культуры (V) с использованием антитела к YopE.

Фиг. 2 - описание доставки белка T3SS в эпителиальные клетки. (А) Иммунофлуоресцентное окрашивание с анти-myc антителом на клетках HeLa, инфицированных при MOI=100 в течение 1 ч следующими бактериями I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd или II: Y. enterocolitica AHOPEMT asd+pBad_Si2. (В) Количественная оценка интенсивности иммунофлуоресцентного окрашивания с анти-myc антителом из (А) в клетках HeLa. Данные были объединены из n=20 сайтов, усы погрешности - стандартная погрешность среднего. I: неинфицированная клетка, II: Y. enterocolitica AHOPEMT asd или III: Y. enterocolitica AHOPEMT asd+pBad_Si2. На оси Y отложена интенсивность окрашивания с анти-myc антителом (условные единицы), на оси X - время инфицирования в минутах (С) Количественная оценка интенсивности иммунофлуоресцентного окрашивания анти-myc антителом в клетках. Клетки HeLa инфицировали в течение 1 ч бактериями Y. enterocolitica AHOPEMT asd+pBad_Si2 при MOI, обозначенной на оси X. Данные были объединены из n=20 сайтов, указанные погрешности - стандартная погрешность среднего. На оси Y отложена интенсивность окрашивания с анти-myc антителом (условные единицы).

Фиг. 3 - модификации доставки белка на основе T3SS позволяют осуществить ядерную локализацию слитого белка YopE1_₁₃₈ (EGFP). Сигнал EGFP в клетках HeLa, инфицированных бактериями I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd или II: Y. enterocolitica AHOPEMT asd АуорВ, несущими плазмиды III: +YopE1.₁₃₈-EGFP или IV: +YopE1.₁₃₈-EGFP-NLS при MOI=100. Сигнал EGFP показан в a, для сравнения локализации ядра были окрашены в b.

Фиг. 4 - модификации доставки белка на основе T3SS позволяют удалить придаток YopE1_₁₃₈. Клетки HeLa инфицированы двумя разными штаммами Y. enterocolitica одновременно, что достигается простым смешиванием двух бактериальных суспензий. Один штамм доставляет протеазу TEV, слитую с YopE1_₁₃₈, в то время как другой штамм доставляет исследуемый белок, слитый с YopE1_₁₃₈, с линкером, содержащим двойной сайт расщепления протеазой TEV. После доставки белка в эукариотическую клетку протеаза TEV будет отщеплять придаток YopE1_₁₃₈ от изучаемого белка (А) Лизированные дигитонином клетки HeLa, неинфицированные (II) или после инфицирования (MOI=100) в течение 2 ч бактериями I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd и III: +pBadSi_2, IV: +YopE1_₁₃₈-2x сайт расщепления TEV-FLAGINK4C, V: +YopE1_₁₃₈-2x сайт расщепления TEV-Flag-INK4C и дальнейшей обработки в течение ночи очищенной протеазой TEV и VI: +YopE1_₁₃₈-2x сайт расщепления TEV -Flag-INK4C и второй штамм +YopE1_₁₃₈-TEV были проанализированы вестерн-блоттингом с анти-INK4C (изображено в a) на присутствие YopE1_₁₃₈ - 2x сайт расщепления TEV-Flag-INK4C или его расщепленной формы Flag-INK4C. В качестве контроля загрузки был выполнен вестерн-блоттинг с анти-актин-антителом (изображено в b). В одном случае (V) лизированные клетки инкубировали в течение ночи с очищенной протеазой TEV. (В) Нормализованная на актин количественная оценка интенсивности окрашивания анти-INK4C (показанной в (произвольных единицах) по оси y) из (А) с размером полноразмерной YopE1_₁₃₈-2x сайт расщепления TEV-Flag-INK4C, где образец IV взят за 100%. I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd и IV: +YopE1_₁₃₈-2x TEVсайт расщепления Flag-INK4C, V: +YopE1_₁₃₈-2x сайт расщепления TEV-Flag-INK4C с дальнейшей обработкой в течение ночи очищенной протеазой TEV и VI: +YopE1_₁₃₈-2x сайт расщепления TEV-FlagINK4C и второй штамм +YopE1_₁₃₈-TEV. Данные были объединены из n=2 независимых экспериментов, обозначенные погрешности представляют стандартную ошибку среднего (С) Лизированные дигитонином клетки HeLa, неинфицированные (II) или после инфицирования (MOI=100) в течение 2 ч штаммами I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd и III: + pBadSi_2, IV: +YopE1_₁₃₈-2x сайт расщепления TEV -ET1-Myc, V: +YopE1_₁₃₈-2x сайт расщепления TEV -ET1-Myc с дальнейшей обработкой в течение ночи очищенной протеазой TEV и VI: +YopE₁.₁₃₈-2x сайт расщепления TEV-ET1-Myc и второй штамм +YopE1_₁₃₈-TEV были проанализированы вестерн-блоттингом анти-Мус (показано на а) на присутствие YopE1_₁₃₈-2x сайт расщепления TEV-ET1-Myc или его расщепленной формы ET1-Myc. В качестве контроля загрузки был выполнен вестерн-блоттинг с анти-актин антителом (изображено в b). В одном случае (V) лизированные клетки инкубировали в течение ночи с очищенной протеазой TEV.

Фиг. 5 - доставка бактериальных эффекторных белков в эукариотические клетки (А) Клетки HeLa

- 3 039922 были инфицированы I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd несущим II: pBad_Si2 или III: YopE_1-138-SopE при MOI=100 в течение времени, указанного над изображением (2, 10 или 60 мин). После фиксации клетки окрашивали для выявления актинового цитоскелета (В) Клетки HeLa были оставлены неинфицированными (II) или инфицированы I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd несущим III: YopE_1-138-SopE-Myc и в некоторых случаях коинфицированы IV: YopE_1-138-SptP при MOI, указанном под штаммом (MOI 50; MOI50:MOI50 или MOI50:MOI100) в течение 1 ч. После фиксации клетки окрашивали для выявления актинового цитоскелета (показано в а), и присутствие слитого белка YopE_1-138-SopE-Myc отслеживали по окрашиванию анти-Мус (показано в b).

Фиг. 6 - доставка бактериальных эффекторных белков в эукариотические клетки (А) Вестернблоттинг с антителами к Phospho-p38 (а), общим р38 (b) и актину (с) на клетках HeLa без инфицирования (II) или инфицированных в течение 75 мин штаммами I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd, несущим III: pBad_Si2 или IV: YopE_1-138-OspF при MOI=100. Клетки стимулировали TNFa в течение последних 30 мин инфицирования, как указано (+ означает добавление TNFa, - означает отсутствие обработки TNFa) (В) Вестерн-блоттинг Phospho-Akt T308 (а) и S473 (b) и актина (с) на клетках HeLa без инфицирования (II) или инфицированных в течение 22,5 или 45 мин (указанно под блотами) штаммами I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd, несущим III: pBad_Si2, IV: YopE_1-138-SopE или V: YopE_1-138-SopB при MOI=100 (С) уровни цАМФ (в фмоль/лунку, показано по оси Y) в клетках HeLa, оставшихся без инфицирования (I) или инфицированных в течение 2,5 ч штаммами V: Y. enterocolitica AHOPEMT asd+YopE₁.₁₃₈-ВерА, VI: Y. enterocolitica AHOPEMT asd+YopE₁.₁₃₈-BepA_E305._end, VII: Y. enterocolitica AHOPEMT asd+YopE₁.₁₃₈-BepG_Bid или VIII: Y. enterocolitica AHOPEMT asd+pBad_Si2 при MOI=100. В качестве положительного контроля для образцов добавляли холерный токсин (XT) в течение 1 ч II (1 мкг/мл), III (25 мкг/мл) или IV (50 мкг/мл). Данные были объединены из n=3 независимых экспериментов, обозначенные погрешности представляют стандартную ошибку среднего. Статистический анализ проводился с использованием непарного двухстороннего t-критерия (ns указывает на незначимое изменение, ** указывает р-значение <0.01, *** указывает р-значение <0,001).

Фиг. 7 - доставка tBid человека в эукариотические клетки индуцирует массивный апоптоз. (А) Вестерн-блоттинг с расщепляющей каспазой 3 р17 (а) и актином (b) на блоках HeLa, без инфицирования (II), или инфицированных в течение 60 мин штаммами I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd, несущим III: pBad_Si2, IV: YopE₁-₁₃₈-Bid или V: YopE₁-₁₃₈-t-Bid при MOI=100. В некоторых случаях клетки обрабатывали VI: стауроспорином 0,5 мкМ или VII: стауроспорином 1 мкМ (В) Лизированные дигитонином клетки HeLa, неинфицированные (II) или после инфицирования в течение 1 ч штаммами I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd, несущим III: pBad_Si2, IV: YopE₁-₁₃₈-Bid или V: YopE₁-₁₃₈-t-Bid при MOI=100 были проанализированы вестерн-блоттинг с анти-Bid (а), позволив сравнивать уровни эндогенных Bid (отмечены Z) с уровнями транслоцированных YopE₁-₁₃₈-Bid (обозначены X) YopE₁-₁₃₈-tBid (обозначены Y) или YopE₁-₁₃₈-tBid (обозначены Y). В качестве контроля загрузки использовался вестерн-блоттинг с антиактином (показано в b). В некоторых случаях клетки обрабатывали VI: стауроспорином 0,5 мкМ или VII: стауроспорином 1 мкМ (С) Клетки HeLa были оставлены неинфицированными (I) или инфицированы при MOI=100 в течение 1 ч штаммами II: Y. enterocolitica AHOPEMT asd+pBad_Si2, III: Y. enterocolitica AHOPEMT asd+YopE₁-₁₃₈-Bid, IV: Y. enterocolitica AHOPEMT asd+YopE₁-₁₃₈-tBid. В некоторых случаях клетки обрабатывали V: стауроспорином 0,5 мкМ или VI: стауроспорином 1 мкМ. После фиксации клетки окрашивали для выявления актинового цитоскелета (серый цвет).

Фиг. 8 - T3SS-зависимая доставка BIM рыбок данио индуцирует апоптоз у эмбрионов рыбок данио. (А) Эмбрионы рыбок данио возрастом 2 дня с момента оплодотворения были заражены экспрессирующим EGFP контрольным штаммом Y. enterocolitica AHOPEMT asd+pBadSi1 (I) или zBIMтранслоцирующим штаммом (II: Y. enterocolitica AHOPEMT asd+YopE1-138-zBIM) путем инъекции приблизительно 400 бактерий в область заднего мозга. Через 5,5 ч эмбрионы фиксировали, окрашивали на активированную каспазу 3 (расщепляющая каспаза 3, р17, показано в с) и анализировали на наличие бактерий (сигнал EGFP, показано в b). Показаны Z-проекции максимальной интенсивности для флуоресцентных изображений. Z-проекции в светлом поле показаны в а (В) Автоматизированный анализ изображений по Z-проекциям максимальной интенсивности записанных изображений срезов по оси Z (А). В кратком изложении, бактерии детектировали через канал EGFP. Вокруг каждой области бактериального пятна создавали кружок радиусом 10 пикселей. Перекрывающиеся области были разделены поровну между контактирующими элементами. В областях, близко окружающих бактерии, измеряли интенсивность окрашивания каспазой-3 р17 нанося на ось Y (в условных единицах). Статистический анализ проводили с использованием критерия Манна-Уитни (* указывает р-значение <0,001). Данные были объединены из n=14 для животных, инфицированных контрольным штаммом Y. enterocolitica АНОРЕМТ asd+pBad_Si1 (I) или n=19 для II: штаммом Y. enterocolitica AHOPEMT asd+YopE_1-138-zBIM, обозначенные погрешности представляют стандартную ошибку среднего.

Фиг. 9 - tBiD-зависимый фосфопротеом: Клетки HeLa инфицировали в течение 30 мин штаммом Y. enterocolitica АНОРЕМТ asd+YopE₁-₁₃₈-t-Bid при MOI=100 и в качестве контроля штаммом Y. enterocoli

- 4 039922 tica ΔΗΟΡΕΜΤ asd+pBad_Si2. (А) Графическое представление фосфопротема tBID. Белки, содержащие фосфопептиды, которые претерпевали значимую регуляцию tBid-зависимым образом (серый) (qзначение <0,01), а также известные связанные с апоптозом белки (темно-серый), представлены в сети STRING известных и прогнозируемых белок-белковых взаимодействий (высокая достоверность, балл 0,7). Представлены только белки с по меньшей мере одной связью в STRING. (В) Конфокальные изображения клеток HeLa, инфицированных либо штаммом Y. enterocolitica ΔΗΟΡΕΜΤ asd+pBad_Si2 (I) либо Y. enterocolitica ΔΗΟΡΕΜΤ asd+YopEM^-t-Bid (II) показывают индукцию апоптотического фенотипа при доставке tBid. Клетки были окрашены для выявления ядер красителем Hoechst (а), на F-актин - фаллоидином (b), на тубулин - антитубулиновым антителом (с) и на митохондрии - митотрекером (d). Масштабный отрезок соответствует 40 мкм.

Фиг. 10 - описание набора инструментов для доставки на основе секреции типа III. (А) Векторные карты клонирующих плазмид pBad_Si1 и pBad_Si2, использованных для генерации конструкций слияния c YopE₁.₁₃₈. Шаперон SycE и YopE₁.₁₃₈-гибрид находятся под нативным промотором Y. enterocolitica. Две плазмиды отличаются только наличием индуцируемого арабинозой EGFP, присутствующего на сайте pBad_Si1 (В) Множественный сайт клонирования непосредственно после фрагмента YopE1_₁₃₈ на плазмидах pBad_Si1 и pBad_Si2.

Фиг. 11 - характеризация доставки белка T3SS в различные клеточные линии. Иммунофлуоресцентное окрашивание с анти-Мус на фибробластах Swiss 3T3 (а), клетках Jurkat (b) и клетках HUVEC (с) без инфицирования (II), или инфицированных штаммом Y. enterocolitica ΔΗΟΡΕΜΤ asd+pBad_Si2 (I) при MOI, указанными над изображениями (MOI 25, 50, 100, 200 и 400 для HUVEC) в течение 1 ч.

Фиг. 12 - T3SS-зависимость доставки бактериальных эффекторных белков в эукариотическую клетку. Лизированные дигитонином клетки HeLa после инфицирования при MOI = 100 в течение времени, указанного над блотами (0, 5, 15, 10, 60 и 120 мин) штаммом Y. enterocolitica ΔΗΟΡΕΜΤ asd ΔyopB+YopE₁.₁₃8-SopE-Myc (I) или Y. enterocolitica ΔΗΟΡΕΜΤ asd+YopE1_₁₃₈-SopE-Myc (II) были проанализированы вестерн-блоттингом с анти-Мус. Размер, соответствующий YopE1_₁₃₈-SopE-Myc обозначен буквой а, а размер эндогенного белка с-Мус обозначен буквой b.

Фиг. 13 и 14 - T3SS-зависимαя секреция различных других белков в супернатант культуры. Эксперимент in vitro секреции I: Y. enterocolitica ΔΗΟΡΕΜΤ asd+YopE1_₁₃₈ слитого с указанным белком. Содержание белка в общей массе бактериальных лизатов (А) и осажденных супернатантов культуры (В) анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с использованием анти-YopE-антитела. Числа на диаграмме указывают молекулярную массу в кДа на соответствующей высоте.

Фиг. 15A-N - штаммы Y. enterocolitica и S. enterica, используемые в этом исследовании.

Список штаммов Y. enterocolitica и S. enterica, используемых в этом исследовании, содержит сведения об исходных штаммах, плазмидах и белках для T3SS-зависимой доставки, закодированной на соответствующих плазмидах. Кроме того, представлена информация об олигонуклеотидах, используемых для конструирования соответствующей плазмиды, основной плазмиды и резистентности к антибиотикам.

Фиг. 16 - доставка мышиного tBid, мышиного BH3 и мышиного Bax BH3 в клетки B16F10 индуцирует массивный апоптоз. Клетки B16F10, неинфицированные (I) или после инфицирования (MOI=50) в течение 2,5 ч Y. enterocolitica ΔΗΟΡΕΜΤ asd и II: +pBadSi_2, III: +YopE1_₁₃₈-Y. enterocolitica кодоноптимизированный мышиный tBid, IV: +YopE1_₁₃₈-F. enterocolitica кодон-оптимизированный мышиный Bid BH3 или V: +YopE1_₁₃₈-Y. enterocolitica кодон-оптимизированный мышиный Bax BH3. После фиксации клетки окрашивали для выявления актинового цитоскелета и ядер (оба - серым цветом).

Фиг. 17 - доставка мышиного tBid, мышиного BH3 и мышиного Bax BH3 в клетки D2A1 индуцирует массивный апоптоз. Клетки D2A1, неинфицированные (I) или после инфицирования (MOI=50) в течение 2,5 ч Y. enterocolitica ΔΗΟΡΕΜΤ asd и II: +pBadSi_2, III: +YopE1_₁₃₈-F. enterocolitica кодоноптимизированный мышиный tBid, IV: + YopE1_₁₃₈-F. enterocolitica кодон-оптимизированный мышиный Bid BH3 или V: +YopE1_₁₃₈-F. enterocolitica кодон-оптимизированный мышиный Bax BH3. После фиксации клетки окрашивали для выявления актинового цитоскелета и ядер (оба - серым цветом).

Фиг. 18 - доставка мышиного tBid, мышиного BH3 и мышиного Bax BH3 в клетки HeLa вызывает массовый апоптоз. Клетки HeLa, неинфицированные (I) или после инфицирования (MOI=50) в течение 2,5 ч Y. enterocolitica ΔΗΟΡΕΜΤ asd и II: +pBadSi_2, III: +YopE1_₁₃₈-Y. enterocolitica кодоноптимизированный мышиный tBid, IV: +YopE1_₁₃₈-F. enterocolitica кодон-оптимизированный мышиный Bid BH3 или V: +YopE1_₁₃₈-F. enterocolitica кодон-оптимизированный мышиный Bax BH3. После фиксации клетки окрашивали для выявления актинового цитоскелета и ядер (оба - серым цветом).

Фиг. 19 - доставка мышиного tBid, мышиного BH3 и мышиного Bax BH3 в клетки 4Т1 индуцирует массивный апоптоз. Клетки 4Т1, неинфицированные (I) или после инфицирования (MOI = 50) в течение 2,5 ч Y. enterocolitica ΔΗΟΡΕΜΤ asd и II: +pBadSi_2, III: +YopE1_₁₃₈-Y. enterocolitica кодоноптимизированный мышиный tBid, IV: +YopE1_₁₃₈-Y. enterocolitica кодон-оптимизированный мышиный Bid BH3 или V: +YopE1_₁₃₈-Y. enterocolitica кодон-оптимизированный мышиный Bax BH3. После фиксации клетки окрашивали для выявления актинового цитоскелета и ядер (оба - серым цветом).

Фиг. 20 - доставка мышиного tBid штаммом S. enterica, выращенным в условиях, индуцирующих

- 5 039922

SPI-1 T3SS, в эукариотические клетки индуцирует апоптоз. Вестерн-блоттинг расщепляющей каспазы 3 р17 на клетках HeLa, неинфицированные (I) или после инфицирования в течение 4 ч III: S. enterica aroA, несущим IV: SteA^o-t-Bid, V: SteA_FL-Bid, VI: SopE₁-_S1-t-Bid или VII: SopE1.₁₀₅-t-Bid при MOI=100. Для этого эксперимента все штаммы S. enterica aroA выращивали в условиях, индуцирующих T3SS SPI-1. В некоторых случаях клетки обрабатывали II: стауроспорином 1 мкМ. Указанные числа обозначают молекулярную массу в кДа на соответствующей высоте.

Фиг. 21 - доставка мышиного tBid штаммом S. enterica, выращенным в условиях, индуцирующих SPI-1 T3SS, в эукариотические клетки индуцирует апоптоз. Вестерн-блоттинг расщепляющей каспазы 3 р17 на клетках HeLa, неинфицированные (I) или после инфицирования в течение 4 ч III: S. enterica aroA, несущим IV: SteA_1-20-t-Bid, V: SteA_FL-Bid, VI: SopE₁__S1-t-Bid или VII: SopE₁_₁₀₅-t-Bid при MOI=100. Для этого эксперимента все штаммы S. enterica aroA выращивали в условиях, индуцирующих T3SS SPI-1. В некоторых случаях клетки обрабатывали II: стауроспорином 1 мкМ. Указанные числа обозначают молекулярную массу в кДа на соответствующей высоте.

Фиг. 22 - T3SS-зависимая секреция S. enterica различных белков клеточного цикла в супернатант культуры. Эксперимент in vitro секреции S. enterica aroA+either SteA_FL (I, III, V, VII) или SopE_1-105 (II, IV, VI, VIII), слитых с белками, перечисленными ниже. I и II: Ink4a-MycHis; III и IV: Ink4c-MycHis; V и VI: Mad2-MycHis; VII и VIII: Cdk1-MycHis. Содержание белка в осажденных культуральных супернатантах (А) и совокупном бактериальном лизате (В) анализировали Вестерн-блоттингом с использованием анти-myc антитела. Указанные числа обозначают молекулярную массу в кДа на соответствующей высоте.

Фиг. 23 - T3SS-зависимая секреция различных известных пептидов, препятствующих клеточному циклу, в супернатант культуры. Эксперимент in vitro секреции I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd + pBad_Si2. II-VII: Y. enterocolitica AHOPEMT asd+YopE1__13S, слитых с белками, перечисленными ниже: II: ^In^k4A84.103^; III: p^107/RB^L1657.662^{; IV:} P21141-160D149A; ^V: P21145-160D149A; ^VI: р²¹17-33^{; VII: циклин D2} 139-147. Содержание белка в осажденных культуральных супернатантах (А) и совокупном бактериальном лизате (В) анализировали Вестерн-блоттингом с использованием анти-YopE антитела. Указанные числа обозначают молекулярную массу в кДа на соответствующей высоте.

Фиг. 24 - слияние доставленного T3SS белка с убиквитином позволяет удалить придаток YopE1.₁₃s. Клетки HeLa инфицированы штаммом, доставляющим изучаемый белок, присоединенный к YopE1__13S, с непосредственно слитым убиквитином (YopE1__13S-Ubi). После доставки белка в эукариотическую клетку эндогенные убиквитин-специфичные протеазы будут отщеплять придаток YopE1__13S-Ubi от изучаемого белка. Лизированные дигитонином клетки HeLa, неинфицированные (I) или после инфицирования (MOI 100) в течение 1 ч II: Y. enterocolitica AHOPEMT asd+YopE1__13S-Flag-INK4C-MycHis или III: +YopE₁._13SFlag-убиквитин-INK4C-MycHis были проанализированы вестерн-блоттингом с анти-INK4C на присутствие IV: YopE₁._13S-Flag-убиквитин-INK4C-MycHis или V: YopE1._13S-Flag-INK4C-MycHis, расщепленной формы VI: INK4C-MycHis и VII: эндогенного INK4C.

Фиг. 25 - схематическое представление гетерологичных белков и их доменов, которые могут быть доставлены через бактериальную T3SS. I: Полноразмерный белок человека/мыши с доменами, окрашенными в разные оттенки серого, II: Усеченный белок человека/мыши с доменами, окрашенными в разные оттенки серого, III: Мотив/домен только полноразмерного белка человека/мыши, IV: Мотив/домен только повторяющихся (слева) или комбинация двух разных мотивов/доменов полноразмерного белка человека/мыши (справа).

Фиг. 26 - доставка BH3-доменов мышиного TBid и мышиного Bax в эукариотические клетки и их слитые повторы индуцируют апоптоз в раковых клетках. Клетки меланомы мыши B16F10 инфицировали при MOI, составляющей 5, 10, 25 и 50 (слева направо при каждых условиях) соответствующих бактерий, как показано, в течение 4 ч. Влияние на жизнеспособность клеток оценивали путем подсчета числа клеток посредством подсчета ядер. I: число ядер. II: Y. enterocolitica AHOPEMT asd+pBad_Si2, III: Y. enterocolitica AHOPEMT asd+YopE1-13S-Bid-BH3, IV: Y. enterocolitica AHOPEMT asd+YopE1_13S-(Bid-BH3)₂ и V: Y. enterocolitica AHOPEMT asd+YopE1._13S-(Bid-BH3)-(Bax-BH3). Ядра окрашивали красителем Hoechst. Изображения были получены с использованием автоматизированного микроскопа, а число клеток автоматически определяли с помощью программы CellProfiler.

Фиг. 27 - доставка BH3-доменов мышиного TBid и мышиного Bax в эукариотические клетки и их слитые повторы индуцируют апоптоз в раковых клетках. Клетки рака молочной железы 4Т1 мыши инфицировали при MOI, составляющей 5, 10, 25 и 50 (слева направо при каждых условиях) соответствующих бактерий, как показано, в течение 4 ч. Влияние на жизнеспособность клеток оценивали путем подсчета числа клеток посредством подсчета ядер. I: число ядер. II: Y. enterocolitica AHOPEMT asd+pBad_Si2, III: Y. enterocolitica AHOPEMT asd+YopE1__13S-Bid-BH3, IV: Y. enterocolitica AHOPEMT asd+YopE1__13S-(Bid-BH3)₂ и V: Y. enterocolitica AHOPEMT asd+YopE1._13S-(Bid-BH3)-(Bax-BH3). Ядра окрашивали красителем Hoechst. Изображения были получены с использованием автоматизированного микроскопа, а число клеток автоматически определяли с помощью программы CellProfiler.

Фиг. 2S - доставка синтетических увеличенных проапоптотических белков. Доставка одиночных

- 6 039922 синтетических белков, состоящих из одиночных или тандемных повторов ВНЗ-доменов, взятых из проапоптотических белков t-BID или ВАХ, приводит к усиленной индукции апоптоза в раковых клетках 4Т1 и B16F10. Клетки 4Т1 (I) или B16F10 (II) инфицировали Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T, кодирующим на pBad-MycHisA IV: YopE1-₁₃₈-tBID BH3 расширенный домен, V: YopE1-₁₃₈-linker-tBID BH3, VI: YopE1₁₃₈-tBID BH3, VII: YopE_1-138-(tBID BH3)₂, VIII: YopE_1-138-tBID BH3 - ВАХ BH3 или IX: YopE_1-138-BAX BH3 - tBID BH3. Для каждого штамма выполняли титрование бактерий, добавленных к клеткам (MOI), определяли количество клеток и вычисляли IC₅₀ с использованием нелинейной регрессии. Показана MOI для IC50 (III).

Фиг. 29 - индукция апоптоза pYV-кодированными синтетическими проапоптотическими белками. Доставка одиночного или тандемного повторения BH3-домена BID, закодированного на pYV, приводит к индукции апоптоза в раковых клетках 4Т1 и B16F10. Клетки 4Т1 (I) или B16F10 (II) инфицировали Y. enterocolitica AHOPEMT+IV: pYV-YopE_1-138-BH3-Bid, или V: +pYV-YopE_1-138-(BH3-Bid)₂ или VI: Y. enterocolitica AHOPEMT pBad-MycHisA-YopE_1-138-(BH3-Bid)₂ в течение 3 ч. Для каждого штамма выполняли титрование бактерий, добавленных к клеткам (MOI), определяли количество клеток и вычисляли IC₅₀(III) с использованием нелинейной регрессии.

Фиг. 30 - колонизация опухолей в/в введенным Y. enterocolitica АуорН,О,Р,Е,М,Т в модели аллотрансплантата рака молочной железы 4Т1. Количества бактерий в опухолях обозначены в колониеобразующих единицах (КОЕ) на грамм ткани (III). Количества бактерий оценивали в опухолях на 8-й (I) и 14-й (II) день после инфицирования. Каждая точка представляет отдельную мышь. Горизонтальная пунктирная линия обозначает предел обнаружения.

Фиг. 31: Биораспределение в/в введенного Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T в модели аллотрансплантата рака молочной железы 4Т1. Количества бактерий в крови (I), селезенке (II), печени (III), легких (IV) и опухоли (V) обозначены в колониеобразующих единицах (КОЕ) на грамм ткани или на мл крови (VI). Количества бактерий оценивали на 14-й день после инфицирования. Каждая точка представляет отдельную мышь. Горизонтальная пунктирная линия указывает предел обнаружения. * указывает на мышь с большими метастазами, обнаруженными на легких.

Фиг. 32 - замедление прогрессирования опухоли у мышей дикого типа Balb/C после п/к аллотрансплантации клеток рака молочной железы 4Т1. дикого типа Balb/C после п/к аллотрансплантации клетками рака молочной железы 4Т1 в/в инъецировали I: PBS или II: 1х10⁷ Y. enterocolitica AHOPEMT+pYVYopE1.₁₃₈(BH3-Bid)₂, после достижения опухолью размера 150-250 мм³. День в/в инъекции бактерий определялся как день 0. Объем опухоли измеряли в течение следующих дней (III, дни 0-9 после инъекции бактерий) циркулем. Относительный объем опухоли, нормированный на объем опухоли в день 0, указан (IV) в мм³. Среднее значение обозначено символами, изображенные погрешности отображают стандартную ошибку среднего. Статистическая значимость измеряется с помощью двухстороннего дисперсионного анализа, * обозначает р-значение <0,05, ** - р-значение <0,005.

Фиг. 33 - прогрессирование опухоли у мышей дикого типа Balb/C после п/к аллотрансплантации клеток рака молочной железы 4Т1. Мышам дикого типа Balb/C после п/к аллотрансплантации клетками рака молочной железы 4Т1 в/в инъецировали I: PBS или II: 1х10⁷ Y. enterocolitica AHOPEMT, после достижения опухолью размера 150-250 мм³. День в/в инъекции бактерий определялся как день 0. Объем опухоли измеряли в течение следующих дней (III, дни 0-9 после инъекции бактерий) циркулем. Относительный объем опухоли, нормированный на объем опухоли в день 0, указан (IV) в мм³. Среднее значение обозначено символами, изображенные погрешности отображают стандартную ошибку среднего.

Подробное описание изобретения

Для целей интерпретации настоящего описания используются следующие определения, и, в соответствующих случаях, термины, используемые в единственном числе, также включают множественное число и наоборот. Следует понимать, что используемая в настоящей заявке терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не является единственно возможной.

Термин грамотрицательный бактериальный штамм, используемый в настоящей заявке, включает следующие бактерии:

- 7 039922

Aeromonas salmonicida,

Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii, Anaeromyxobacter dehalogenans, Bordetella bronchiseptica, Bordetella parapertussis, Bordetella pertussis, Bradyrhizobium japonicum, Burkholderia cenocepacia, Burkholderia cepacia, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Chlamydia muridarum, Chlamydia trachmoatis, Chlamydophila abortus, Chlamydophila pneumoniae, Chromobacterium violaceum, Citrobacter rodentium, Desulfovibrio vulgaris, Edwardsiella tarda, Endozoicomonas elysicola, Erwinia amylovora, Escherichia albertii, Escherichia coli, Lawsonia intracellularis, Mesorhizobium loti, Myxococcus xanthus, Pantoea agglomerans, Photobacterium damselae, Photorhabdus luminescens, Photorabdus temperate, Pseudoalteromonas spongiae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas plecoglossicida, Pseudomonas syringae, Ralstonia solanacearum, Rhizobium sp, Salmonella enterica и другие Salmonella sp. Shigella flexneri и другие Shigella sp, Sodalis glossinidius, Vibrio alginolyticus, Vibrio azureus, Vibrio campellii, Vibrio caribbenthicus, Vibrio harvey, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio tasmaniensis, Vibrio tubiashii, Xanthomonas axonopodis, Xanthomonas campestris, Xanthomonas oryzae, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis.

Предпочтительными грамотрицательными бактериальными штаммами, предложенными в соответствии с настоящим изобретением, являются грамотрицательные бактериальные штаммы, состоящие из семейств Enterobacteriaceae и Pseudomonadaceae. Грамотрицательный бактериальный штамм, предложенный согласно настоящему изобретению, обычно используется для доставки гетерологичных белков бактериальной T3SS в эукариотические клетки in vitro и/или in vivo, предпочтительно in vivo.

Используемый в настоящей заявке термин рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм относится к грамотрицательному бактериальному штамму, генетически трансформированному с помощью вектора. Подходящим вектором для настоящего изобретения является, например, вектор экспрессии, вектор для инсерции в хромосомы или плазмиды вирулентности или фрагмент ДНК или РНК для инсерции или модификации хромосомы или плазмиды вирулентности.

Термин рекомбинантные грамотрицательные бактериальные штаммы, дефицитные по продуцированию по меньшей мере одного функционального эффекторного белка T3SS, используемый в настоящей заявке, относится к рекомбинантному грамотрицательному бактериальному штамму, в котором по меньшей мере один эффекторный белок T3SS мутировал таким образом, что результирующий рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм больше не способен продуцировать функциональную форму, по меньшей мере, одного эффекторного белка T3SS, т.е. экспрессия такого эффекторного гена прекращена, так что полученные рекомбинантные грамотрицательные бактериальные штаммы не производят никакого из по меньшей мере одного эффекторного белка T3SS или так что каталитическая активность кодируемого эффекторного белка прекращена, так что по меньшей мере один продуцированный эффекторный белок T3SS не обладает своей каталитической активностью, например не выполняет свои эффекторные функции. Для целей доставки белков система секреции и транслокации рекомбинантных грамотрицательных бактериальных штаммов, которые дефицитны по продуцированию по меньшей мере одного функционального эффекторного белка T3SS, должна быть нативной. Используемый в настоящей заявке термин эффекторный белок T3SS или бактериальный эффекторный белок T3SS относится к белкам, которые естественным образом вводятся системами T3S в цитозоль эукариотических клеток и к белкам, которые естественным образом секретируются системами T3S, которые могут, например, образовывать пору транслокации в эукариотическую мембрану (включая порообразующие транслокаторы (такие как YopB и YopD бактерии Yersinia) и верхушечные белки, такие как LcrV Yersinia). Предпочтительно используют белки, которые естественным образом вводятся системами T3S в цитозоль эукариотических клеток. Указанные факторы вирулентности парализуют или перепрограммируют эукариотическую клетку в пользу патогена. Эффекторы T3S демонстрируют большой репертуар биохимической активности, модулируют функцию важнейших регуляторных молекул хозяина и включают

- 8 039922

AvrA, AvrB, AvrBs2, AvrBS3, AvrBsT, AvrD, AvrDl, AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, AvrRpml, AvrRpt2, AvrXv3, CigR, EspF, EspG, EspH, EspZ, ExoS, ExoT, GogB, GtgA, GtgE, семейство белков GALA, HopAB2, HopAOl, Hopll, HopMl, HopNl, HopPtoD2, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, HopUl, HsvB, IcsB, IpaA, IpaB, IpaC, IpaH, IpaH7.8, IpaH9.8, IpgBl, IpgB2, IpgD, LcrV, Map, OspCl, OspE2, OspF, OspG, OspI, PipB, PipB2, PopB, PopP2, PthXol, PthXo6, PthXo7, SifA, Siffi, SipA/SspA, SipB, SipC/SspC, SipD/SspD, SlrP, SopA, SopB/SigD, SopD, SopE, SopE2, SpiC/SsaB, SptP, SpvB, SpvC, SrfH, Srfl, Sse, SseB, SseC, SseD, SseF, SseG, SseESrfH, SseJ, SseKl, SseK2, SseK3, SseL, SspHl, SspH2, SteA, SteB, SteC, SteD, SteE, TccP2, Tir, VirA, VirPphA, VopF, XopD, YopB, YopD YopE, YopH, YopJ, YopM, YopO, YopP, YopT, YpkA.

Термины грамотрицательный бактериальный штамм, дефицитный по продуцированию аминокислоты, необходимой для роста и ауксотрофный мутант, используются в настоящей заявке взаимозаменяемо и относятся к грамотрицательным бактериальным штаммам, которые не способны расти в отсутствие по меньшей мере одной экзогенно поставляемой незаменимой аминокислоты или ее предшественника. Аминокислотой, по продуцированию которой штамм является дефицитным, может быть, например, аспартат, мезо-2,6-диаминопимелиновая кислота, ароматические аминокислоты или лейцин-аргинин [8]. Такой штамм может быть получен, например, делецией гена аспартат-бетаполуальдегиддегидрогеназы (Δasd). Такой ауксотрофный мутант не может расти в отсутствие экзогенной мезо-2,6-диаминопимелевой кислоты [9]. Мутация, например делеция гена аспартат-бетаполуальдегиддегидрогеназы, предпочтительна в данном случае для грамотрицательного бактериального штамма, дефицитного по аминокислоте, необходимой для роста, описанного в настоящем изобретении.

Термин грамотрицательный бактериальный штамм, дефицитный по продуцированию адгезивных белков, связывающимся с поверхностью эукариотической клетки или внеклеточным матриксом, относится к мутантным грамотрицательным бактериальным штаммам, которые не экспрессируют по меньшей мере один адгезивный белок по сравнению с адгезивными белками, экспрессируемыми соответствующим штаммом дикого типа. Адгезивные белки могут включать, например, удлиненные полимерные адгезивные молекулы, такие как пилусы/фимбрии или нефимбриальные адгезины. Фимбриальные адгезины включают пилусы типа 1 (такие как фим-пилусы E.coli с адгезином FimH), Р-пилусы (такие как Рар-пилусы с адгезином PapG из Е. coli), пилусы типа 4 (такие как белок пилин, например из P. aeruginosa) или карлины (белки Csg с адгезином CsgA из S. enterica). Нефимбриальные адгезивные белки включают тримерные аутотранспортерные адгезины, такие как YadA из Y. enterocolitica, ВраА (В. pseudomallei), Hia (H. influenzae), BadA (В. henselae), NadA (N. meningitidis) или UspA1 (M. catarrhalis) а также другие аутотранспортерные адгезины, такие как AIDA-1 (E. coli), а также другие адгезины/инвазины, такие как InvA от Y. enterocolitica или Intimin (E. coli), или члены семейства Dr или семейства Afa (Е . coli). Термины YadA и InvA, используемые в настоящей заявке, относятся к белкам из Y. enterocolitica. Аутотранспортер YadA [10, 11] связывается с различными формами коллагена, а также с фибронектином, тогда как инвазин InvA [12-14] связывается с β-интегринами в мембране эукариотической клетки. Если грамотрицательный бактериальный штамм представлен штаммом Y. enterocolitica, данный штамм предпочтительно дефицитен по InvA и/или YadA.

Используемый в настоящей заявке термин семейство Enterobacteriaceae включает семейство грамотрицательных, палочковидных, факультативно анаэробных бактерий, встречающихся в почве, воде, растениях и животных, которые часто являются патогенами у позвоночных животных. Бактерии этого семейства имеют сходную физиологию и демонстрируют консервативность в пределах функциональных элементов и генов соответствующих геномов. Помимо оксидаза-отрицательности, все члены этого семейства являются ферментаторами глюкозы, и большинство из них - восстановители нитратов. Бактерии семейства Enterobacteriaceae по настоящему изобретению могут быть любыми бактериями из этого семейства и в частности включают, не ограничиваясь указанными, бактерии следующих родов:

Escherichia, Shigella,

Edwardsiella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus, Erwinia, Morganella, Providencia, или Yersinia.

В более конкретных вариантах осуществления изобретения указанная бактерия представляет собой виды

- 9 039922

Escherichia coll, Escherichia blattae, Escherichia fergusonii, Escherichia hermanii, Escherichia vuneris, Salmonella enterica, Salmonella bongori, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, Enterobacter aerogenes, Enterobacter gergoviae, Enterobacter sakazakii, Enterobacter cloacae, Enterobacter agglomerans, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Serratia marcescens, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica, Erwinia amylovora, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Proteus penneri, Proteus hauseri, Providencia alcalifaciens, или Morganella morganii.

Предпочтительно грамотрицательный бактериальный штамм выбирают из группы, состоящей из родов

Yersinia, Escherichia, Salmonella, Shigella,

Pseudomonas, Chlamydia, Erwinia, Pantoea, Vibrio, Burkholderia, Ralstonia,

Xanthomonas, Chromobacterium, Sodalis, Citrobacter, Edwardsiella, Rhizobiae,

Aeromonas, Photorhabdus, Bordetella и De sulfovibrio, более предпочтительно из группы, состоящей из родов Yersinia, Escherichia, Salmonella, и Pseudomonas, наиболее предпочтительно из группы, состоящей из родов Yersinia и Salmonella.

Используемый в настоящей заявке термин Yersinia включает все виды Yersinia, включая Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis и Yersinia pestis. Предпочтительным является вид Yersinia enterocolitica.

Используемый в настоящей заявке термин Salmonella включает все виды Salmonella, включая Salmonella enterica и S. bongori. Предпочтительным является вид Salmonella enterica.

Используемый в настоящей заявке термин промотор относится к последовательности нуклеиновой кислоты, регулирующей экспрессию транскрипционной единицы. Область промотора - регуляторная область, способная связывать РНК-полимеразу в клетке и инициировать транскрипцию кодирующей последовательности в прямом направлении (в направлении 3'). В пределах области промотора находится сайт инициации транскрипции (наглядно определяемый при картировании нуклеазой S1), а также связывающие белок домены (консенсусные последовательности), ответственные за связывание РНКполимеразы, такой как предполагаемая область-35 и блок Прибнова. Термин функционально связанный при описании взаимосвязи между двумя областями ДНК просто означает, что они функционально связаны друг с другом и расположены на одном и том же фрагменте нуклеиновой кислоты. Промотор функционально связан с структурным геном, если он контролирует транскрипцию ген и расположен на том же фрагменте нуклеиновой кислоты, что и ген. Обычно промотор функционален в указанном грамотрицательном бактериальном штамме, т.е. промотор способен экспрессировать слитый белок по настоящему изобретению, т.е. промотор способен экспрессировать слитый белок по настоящему изобретению без дальнейшего применения генной инженерии или экспрессии других белков. Кроме того, функциональный промотор не должен быть естественным антагонистом бактериальной T3SS.

Используемый в настоящей заявке термин доставка относится к транспортировке белка из рекомбинантного грамотрицательного бактериального штамма в эукариотическую клетку, включая стадии экспрессии гетерологичного белка в рекомбинантном грамотрицательном бактериальном штамме, секретирования экспрессированного белка(-ов) из такого грамотрицательного бактериального штамма и транслоцирования секретируемого белка(-ов) таким грамотрицательным бактериальным штаммом в цитозоль эукариотической клетки. Соответственно, термины сигнал доставки или сигнал секреции, которые используются в настоящей заявке взаимозаменяемо, относятся к полипептидной последовательности, которая может быть распознана системой секреции и транслокации этого грамотрицательного бактериального штамма и направляет доставку белка из грамотрицательного бактериального штамма в эукариотические клетки.

Термин сигнал доставки от бактериального эффекторного белка, используемый в настоящей заявке, относится к сигналу доставки из бактериального эффекторного белка, функционального в данном рекомбинантном грамотрицательном бактериальном штамме, т.е. который позволяет экспрессируемому гетерологичному белку в рекомбинантном грамотрицательном бактериальном штамме секретироваться из такого рекомбинантного грамотрицательного бактериального штамма с помощью системы секреции, такой как, например, система секреции III типа, или транслоцироваться таким рекомбинантным грамотрицательным бактериальным штаммом в цитозоль эукариотической клетки с помощью системы секреции, такой как, например, система секреции III типа. Термин сигнал доставки от бактериального эффекторного белка, используемый в настоящей заявке, также включает фрагмент сигнала доставки от бактериального эффекторного белка, т.е. более короткие версии сигнала доставки, например сигнал доставки, содержащий до 10, предпочтительно до 20, более предпочтительно до 50, еще более предпочтительно до 100, в особенности до 140 аминокислот сигнала доставки, например природного сигнала доставки. Таким

- 10 039922 образом, нуклеотидная последовательность, такая как, например, последовательность ДНК, кодирующая сигнал доставки от бактериального эффекторного белка, может кодировать сигнал доставки полной длины или его фрагмент, причем фрагмент обычно обычно содержит до 30, предпочтительно до 60, более предпочтительно до 150, еще более предпочтительно до 300, в особенности до 420 нуклеиновых кислот.

Используемый в настоящей заявке термин секреция белка относится к транспортировке гетерологичного белка вовне через клеточную мембрану рекомбинантного грамотрицательного бактериального штамма. Транслокация белка относится к транспортировке гетерологичного белка от рекомбинантного грамотрицательного бактериального штамма через плазматическую мембрану эукариотической клетки в цитозоль такой эукариотической клетки.

Используемый в настоящей заявке термин эукариотические клетки включает, например, следующие эукариотические клетки:

Hi-5, HeLa, Hek, HUVECs, ЗТЗ, CHO, Jurkat, Sf-9, HepG2, Vero, MDCK, Mefs, THP-1, J774, RAW, Caco2, NCI60, DU145, Lncap, MCF-7, MDA-MB-438, PC3, T47D, A549, U87, SHSY5Y, Ea.Hy926, Saos-2, 4T1, D2A1, B16F10, и первичные человеческие гепатоциты.

Эукариотические клетки, упоминаемые в настоящей заявке, также называются клеткамимишенями или целевыми эукариотическими клетками.

Используемый в настоящей заявке термин эффекторный белок T3SS относится к белкам, которые в природных условиях вводятся системами T3S в цитозоль эукариотических клеток, и белки, которые в природных условиях секретируются системами T3S, которые могут, например, образовывать поры транслокации в эукариотической мембране (включая порообразующие транслокаторы (такие как YopB и YopD бактерии Yersinia) и верхушечные белки, такие как Yersinia LcrV). Предпочтительно используют белки, которые в природных условиях вводятся системами T3S в цитозоль эукариотических клеток. Указанные факторы вирулентности парализуют или перепрограммируют эукариотическую клетку в пользу патогена. Эффекторы T3S демонстрируют большой репертуар биохимической активности и модулируют функцию важнейших регуляторных молекул хозяина [2, 15] и включают

AvrA, AvrB, AvrBs2, AvrBS3, AvrBsT, AvrD, AvrDl, AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, AvrRpml, AvrRpt2, AvrXv3, CigR, EspF, EspG, EspH, EspZ, ExoS, ExoT, GogB, GtgA, GtgE, семейство белков GALA, HopAB2, HopAOl, HopH, HopMl, HopNl, HopPtoD2, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, HopUl, HsvB, IcsB, IpaA, IpaB, IpaC, IpaH, IpaH7.8, IpaH9.8, IpgBl, IpgB2, IpgD, LcrV, Map, OspCl, OspE2, OspF, OspG, OspI, PipB, PipB2, PopB, PopP2, PthXol, PthXo6, PthXo7, SifA, Siffi, SipA/SspA, SipB, SipC/SspC, SipD/SspD, SlrP, SopA, SopB/SigD, SopD, SopE, SopE2, SpiC/SsaB, SptP, SpvB, SpvC, SrfH, Srfl, Sse, SseB, SseC, SseD, SseF, SseG, SseESrfH, SseJ, SseKl, SseK2, SseK3, SseL, SspHl, SspH2, SteA, SteB, SteC, SteD, SteE, TccP2, Tir, VirA, VirPphA, VopF, XopD, YopB, YopD YopE, YopH, YopJ, YopM, YopO, YopP, YopT, YpkA.

Эффекторные гены T3SS бактерии Yersinia были клонированы, например, из Y. enterocolitica, включая YopE, YopH, YopM, YopO, YopP/YopJ и YopT [16]. Соответствующие эффекторные гены могут быть клонированы из Shigella flexneri (например, OspF, IpgD, IpgB1), Salmonella enterica (например, SopE, SopB, SptP), P. aeruginosa (например, ExoS, ExoT, ExoU, ExoY) или E. coli (например, Tir, Map, EspF, EspG, EspH, EspZ). Последовательности нуклеиновых кислот указанных генов доступны специалистам в данной области, например, в базе данных Genebank (yopH, yopO, yopE, yopP, yopM, yopT из NC_002120 GI:10955536, эффекторные белки S. flexneri из AF386526.1 GI:18462515, эффекторные белки S. enterica из NC_016810.1 GI:378697983 или FQ312003.1 GI:301156631, эффекторы Р. aeruginosa из АЕ004091.2 GI:110227054 или СР000438.1 GI:115583796 и эффекторные белки E.coli из NC_011601.1 GI:215485161).

Для целей настоящего изобретения гены обозначаются буквами в нижнем регистре и выделяются курсивом для отличия от белков. В случае если гены (обозначенные буквами в нижнем регистре и курсивом) следуют за названием бактериальных видов (например, Е. coli), они относятся к мутации соответствующего гена в соответствующих бактериальных видах. Например, YopE относится к эффекторному белку, кодируемому геном yopE. Сочетание Y. enterocolitica yopE обозначает Y. enterocolitica, имеющую мутацию в гене yopE.

Используемые в настоящей заявке термины полипептид, пептид, белок, полипептидный и пептидный используются взаимозаменяемо для обозначения ряда аминокислотных остатков, связан- 11 039922 ных друг с другом пептидными связями между альфа-амино- и карбоксигруппами смежных остатков.

Предпочтительными являются белки, которые имеют аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере 10 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 20 аминокислот.

В соответствии с настоящим изобретением домен гетерологичного белка включает домены белков природного происхождения и включает также домены искусственно сконструированных белков. Используемый в настоящей заявке термин домен гетерологичного белка относится к домену гетерологичного белка, отличному от домена эффекторного белка T3SS, или к домену, отличному от домена, содержащего его N-концевой фрагмент, с которым он может быть слит для получения слитого белка. В частности, термин домена гетерологичного белка, используемый в настоящей заявке, относится к домену гетерологичного белка, который не принадлежит к протеому, т.е. всему природному набору белков специфического рекомбинантного грамотрицательного бактериального штамма, предложенного и используемого по изобретению, например который не принадлежит к протеому, т.е. всему природному набору белков специфического бактериального штамма родов Yersinia, Escherichia, Salmonella или Pseudomonas. Обычно домен гетерологичного белка имеет животное происхождение, включая человеческое происхождение. Предпочтительно доменом гетерологичного белка является домен человеческого белка. Более предпочтительно доменом гетерологичного белка является домен белка, выбранного из группы, состоящей из белков, участвующих в апоптозе или регуляции апоптоза, регуляторов клеточного цикла, белков с анкириновым повтором, белков клеточной сигнализации, репортерных белков, транскрипционных факторов, протеаз, малых ГТФаз, связанных с GPCR белков, нанотел и конструкций слияния нанотел, бактериальных эффекторов T3SS, бактериальных эффекторов T4SS и вирусных белков. Особенно предпочтительно доменом гетерологичного белка является домен белка, выбранного из группы, состоящей из белков участвующих в апоптозе или регуляции апоптоза, регуляторов клеточного цикла, белков с анкириновым повтором, репортерных белков, малых ГТФаз, связанных с GPCR белков, конструкций слияния нанотел, бактериальных эффекторов T3SS, бактериальных эффекторов T4SS и вирусных белков. Еще более предпочтительными являются домены гетерологичных белков, выбранных из группы, состоящей из белков, участвующих в апоптозе или регуляции апоптоза, регуляторов клеточного цикла и белков с анкириновым повтором. Наиболее предпочтительными являются домены белков, участвующих в апоптозе или регуляции апоптоза, таких как животные белки, участвующие в апоптозе или регуляции апоптоза, предпочтительно домены гетерологичных белков человека, участвующих в в апоптозе или регуляции апоптоза.

Термин повторяющиеся домены гетерологичного белка, в контексте настоящей заявки, относится к слитому белку, состоящему из нескольких повторов домена гетерологичного белка, где указанные домены могут быть либо непосредственно слиты друг с другом, либо между доменами может быть введен вариабельный линкер, например линкер между 1 и 30, предпочтительно между 2 и 15, более предпочтительно между 3 и 10 аминокислотами. Предпочтительно используют повторяющиеся идентичные домены или повторяющиеся домены, которые имеют идентичность аминокислотной последовательности более 80%, обычно более 85%, предпочтительно более 90%, еще более предпочтительно более 95%, в особенности - более 96%, более конкретно более 97%, еще более конкретно более 98%, наиболее конкретно более 99%. Также предпочтительными являются идентичные домены, которые имеют идентичность аминокислот 100%. Предпочтительно два повторяющихся домена, более предпочтительно два повторяющихся идентичных домена или два повторяющихся домена, имеющих идентичность аминокислотной последовательности более 90%, предпочтительно более 95%, наиболее предпочтительно 100%, содержат слитый белок, как он определен в настоящей заявке. В настоящем изобретении также рассматриваются более двух повторяющихся доменов, например три, четыре, пять или шесть повторяющихся доменов.

Термин два или более доменов различных гетерологичных белков, в контексте настоящей заявки, относится к слитому белку, состоящему из одного или нескольких повторений по меньшей мере двух доменов различных гетерологичных белков, например, по меньшей мере, двух доменов гетерологичных белков, имеющих идентичность аминокислотной последовательности 80% или менее, где указанные различные домены могут быть либо напрямую слиты друг с другом, либо где между доменами может быть введен вариабельный линкер, например линкер между 1 и 30, предпочтительно между 2 и 15, более предпочтительно между 3 и 10 аминокислотами.

Предпочтительно два домена различных гетерологичных белков содержат слитый белок, как он определен в настоящей заявке. В настоящем изобретении также рассматриваются более двух доменов различных гетерологичных белков, например три, четыре, пять или шесть доменов.

Термин гетерологичные белки, которые принадлежат к одному и тому же функциональному классу белков в контексте настоящей заявки относится к гетерологичным белкам, которые имеют одинаковую функцию, например гетерологичные белки, имеющие ферментативную активность, гетерологичные белки, которые действуют по одному и тому же пути, такому как, например, регулирование клеточного цикла или имеют общую специфическую функцию, например принадлежащие к одному и тому же классу бактериальных эффекторных белков. Функциональными классами белков являются, например, белки, участвующие в апоптозе или регуляции апоптоза, белки, которые действуют как регуляторы клеточного цикла, белки с анкириновым повтором, белки клеточной сигнализации, репортерные белки, факторы

- 12 039922 транскрипции, протеазы, малые ГТФазы, связанные с GPCR белки, нанотела и конструкции слияния нанотел, бактериальные эффекторы T3SS, бактериальные эффекторы T4SS или вирусные белки, которые действуют совместно в биологическом процессе установления вирулентности к эукариотическим клеткам.

Домен гетерологичного белка, экспрессированного рекомбинантным грамотрицательным бактериальным штаммом, обычно имеет молекулярную массу от 1 до 50 кДа, предпочтительно от 1 до 30 кДа, более предпочтительно от 1 до 20 кДа, наиболее предпочтительно от 1 до 10 кДа.

В соответствии с настоящим изобретением белки, участвующие в апоптозе или регуляции апоптоза или гетерологичные белки человека, участвующие в апоптозе или регуляции апоптоза, включают, в частности, Bad, Bcl2, Bak, Bmt, Bax, Puma, Noxa, Bim, Bcl-xL, Apafl, каспазу 9, каспазу 3, каспазу 6, каспазу 7, каспазу 10, DFFA, DFFB, ROCK1, АРР, CAD, ICAD, CAD, EndoG, AIF, HtrA2, Smac/Diablo, Arts, ATM, ATR, Bok/Mtd, Bmf, Mcl-1(S), IAP family, LC8, PP2B, 14-3-3 белки, PKA, PKC, PI3K, Erk1/2, p90RSK, TRAF2, TRADD, FADD, Daxx, каспазу 8, каспазу 2, RIP, RAIDD, MKK7, JNK, FLIPs, FKHR, GSK3, киназы CDK и их ингибиторы, такие как INK4-семейство (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)), и Cip1/Wafl/Kip1-2-семейство (p21(Cip1/Wafl), p27(Kip1), p57(Kip2). Предпочтительно используются Bad, Bmt, Bcl2, Bak, Bax, Puma, Noxa, Bim, Bcl-xL, каспаза 9, каспаза 3, каспаза 6, каспаза 7, Smac/Diablo, Bok/Mtd, Bmf, Mcl-1(S), LC8, PP2B, TRADD, Daxx, каспаза 8, каспаза 2, RIP, RAIDD, FKHR, киназы CDK и их ингибиторы, такие как INK4-семейство (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)), наиболее предпочтительно используются BIM, Bid, усеченный Bid, FADD, каспаза 3 (и их субъединицы), Bax, Bad, Akt, киназы CDK и их ингибиторы, такие как INK4-семейство (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)) [17-19]. Кроме того, белки, участвующие в апоптозе или регуляции апоптоза, включают DIVA, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bid и tBid, Egl-1, Bcl-Gs, цитохром С, беклин, CED-13, BNIP1, BNIP3, Bcl-B, Bcl-W, Ced-9, A1, NR13, Bfl-1, каспазу 1, каспазу 2, каспазу 4, каспазу 5, каспазу 8.

Белки, участвующие в апоптозе или регуляции апоптоза, выбраны из группы, состоящей из проапоптотических белков, антиапоптотических белков, ингибиторов путей предотвращения апоптоза и ингибиторов сигнализации или путей, способствующих выживанию. Проапоптотические белки включают белки, выбранные из группы, содержащей Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid и tBid, Bok, Apaf1, Smac/Diablo, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, беклин 1, Egl-1 и CED-13, цитохром С, FADD, семейство каспазы, и киназы CDK и их ингибиторы, такие как INK4-семейство (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)), или выбранные из группы, содержащей Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid и tBid, Bok, Egl-1, Apafl, Smac/Diablo, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, беклин 1, Egl-1 и CED-13, цитохром С, FADD, и семейство каспазы. Предпочтительными являются Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid и tBid, Bok, Egl-1, Apaf1, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, беклин 1, Egl-1 и CED-13, Smac/Diablo, FADD, семейство каспазы, киназы CDK и их ингибиторы, такие как INK4-семейство (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)). В равной степени предпочтительны Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid и tBid, Bok, Apaf1, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, беклин 1, Egl-1 и CED-13, Smac/Diablo, FADD, семейство каспазы.

Антиапоптотические белки включают белки, выбранные из группы, содержащей Bcl-2, Bcl-X1, BclB, Bcl-W, Mcl-1, Ced-9, A1, NR13, семейство IAP и Bfl-1. Предпочтительными являются Bcl-2, Bcl-X1, Bcl-B, Bcl-W, Mcl-1, Ced-9, A1, NR13 и Bfl-1.

Ингибиторы путей предотвращения апоптоза включают белки, выбранные из группы, состоящей из Bad, Noxa и Cdc25А. Предпочтительными являются Bad и Noxa.

Ингибиторы сигналов или путей, способствующих выживанию, включают белки, выбранные из группы, состоящей из PTEN, ROCK, PP2A, PHLPP, JNK, р38. Предпочтительными являются PTEN, ROCK, PP2A и PHLPP.

В некоторых вариантах осуществления гетерологичные белки, участвующие в апоптозе или регуляции апоптоза, выбраны из группы, состоящей из белков BH3-only, каспаз и внутриклеточных сигнальных белков регуляции рецепторов смерти апоптоза.

Белки BH3-only включают белки, выбранные из группы, состоящей из Bad, BIM, Bid и tBid, Puma, Bik/Nbk, Bod, Hrk/Dp5, BNIP1, BNIP3, Bmf, Noxa, Mcl-1, Bcl-Gs, беклина 1, Egl-1 и CED-13. Предпочтительными являются Bad, BIM, Bid и tBid.

Каспазы включают белки, выбранные из группы, содержащей каспазу 1, каспазу 2, каспазу 3, каспазу 4, каспазу 5, каспазу 6, каспазу 7, каспазу 8, каспазу 9, каспазу 10. Предпочтительными являются каспаза 3, каспаза 8 и каспаза 9. Внутриклеточные сигнальные белки регуляции рецепторов смерти апоптоза включают белки, выбранные из группы, состоящей из FADD, TRADD, ASC, ВАР31, GULP1/CED-6, CIDEA, MFG-E8, CIDEC, RIPK1/RIP1, CRADD, RIPK3/RIP3, Crk, SHB, CrkL, DAXX, семейства 14-3-3, FLIP, DFF40 и 45, РЕА-15, SODD. Предпочтительными являются FADD и TRADD.

В некоторых вариантах осуществления два домена гетерологичных белков, участвующих в апоптозе или регуляции апоптоза, включают грамотрицательный бактериальный штамм и/или вектор по настоящему изобретению, предпочтительно два повторяющихся, более предпочтительно два идентичных повторяющихся домена белка, участвующего в апоптозе или регуляции апоптоза, или два домена раз- 13 039922 личных белков, участвующих в апоптозе или регуляции апоптоза. В некоторых вариантах осуществления два домена гетерологичных белков, участвующих в апоптозе или регуляции апоптоза, включают грамотрицательный бактериальный штамм и/или вектор по настоящему изобретению, причем один представлен доменом проапоптотического белка, а другой представлен доменом белка, который является ингибитором путей предотвращения апоптоза, или один представлен доменом проапоптотического белка, а другой представлен доменом белка, который является ингибитором передачи сигналов или путей, способствующих выживаемости.

Проапоптотические белки, охватываемые настоящим изобретением, обычно имеют альфаспиральную структуру, предпочтительно гидрофобную спираль, окруженную амфипатическими спиралями, и обычно содержат по меньшей мере один из доменов ВН1, ВН2, BH3 или ВН4, предпочтительно содержат по меньшей мере один домен BH3. Обычно проапоптотические белки, охватываемые настоящим изобретением, не обладают ферментативной активностью.

Антиапоптотические белки, охватываемые настоящим изобретением, обычно имеют альфаспиральную структуру, предпочтительно гидрофобную спираль, окруженную амфипатическими спиралями и содержащую комбинацию различных доменов ВН1, ВН2, BH3 и ВН4, предпочтительно комбинацию различных доменов ВН1, ВН2, BH3 и ВН4, в которых присутствуют домен ВН1 и ВН2, более предпочтительно ВН4-ВНЗ-ВН1-ВН2, ВН1-ВН2, ВН4-ВН1-ВН2 или ВНЗ-ВН1-ВН2 (от N- до С-конца). Кроме того, также охвачены белки, содержащие по меньшей мере один BIR-домен.

Ингибиторы путей предотвращения апоптоза, охватываемых настоящим изобретением, обычно имеют альфа-спиральную структуру, предпочтительно гидрофобную спираль, окруженную амфипатическими спиралями и обычно содержат один домен BH3.

Домены ВН1, ВН2, BH3 или ВН4 обычно имеют длину от приблизительно 5 до приблизительно 50 аминокислот. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления домены гетерологичных белков выбирают из группы, состоящей из доменов гетерологичных белков, которые составляют в длину от приблизительно 5 до приблизительно 200, предпочтительно от приблизительно 5 до приблизительно 150, более предпочтительно от приблизительно 5 до приблизительно 100, наиболее предпочтительно от приблизительно 5 до приблизительно 50, в частности от приблизительно 5 до приблизительно 25 аминокислот.

Конкретным предпочтительным доменом является домен BH3 индуктора апоптоза tBID, более конкретно - домен BH3, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 209, 210, 211 и 212, предпочтительно SEQ ID NO: 211 или SEQ ID NO: 212. В равной степени предпочтительным является домен BH3 регулятора апоптоза ВАХ, более конкретно - домен ВАХ, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 213, 214, 215 и 216, предпочтительно SEQ ID NO: 215 или SEQ ID NO: 216. Человеческие и мышиные последовательности приведены в SEQ ID NO: 209-216, но в равной степени включены и домены tBID и ВАХ BH3 всех других видов.

В некоторых вариантах повторяющиеся домены гетерологичных белков представляют собой домен BH3, в частности повторяющиеся домены BH3 апоптоза индуктора tBID, более конкретно - два повторяющихся домена BH3 апоптоза индуктора tBID, наиболее конкретно - два повторяющихся домена BH3 апоптоза индуктора tBID, состоящего из последовательности SEQ ID NO: 202. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления вектор грамотрицательного бактериального штамма по настоящему изобретению содержит вторую последовательность ДНК, кодирующую два повторяющихся домена BH3, более предпочтительно два повторяющихся домена BH3 апоптоза индуктора tBID. Два повторяющихся домена предпочтительно соединены линкером длиной 1-30 аминокислот, предпочтительно длиной 2-15 аминокислот, более предпочтительно длиной 3-10 аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления два или более доменов различных гетерологичных белков представляют собой домены гетерологичных белков, которые принадлежат к одному и тому же функциональному классу белков, предпочтительно различные гетерологичные белки двух или более доменов представляют собой различные гетерологичные белки из класса белков, участвующих в апоптозе или регуляции апоптоза. В предпочтительном варианте осуществления два или более доменов различных гетерологичных белков представляют собой домен BH3 индуктора апоптоза tBID и домен BH3 регулятора апоптоза ВАХ, в частности слитые домены BH3, состоящие из последовательности SEQ ID NO: 203. Два домена различных гетерологичных белков предпочтительно связаны линкером длиной 1-30 аминокислот, предпочтительно 2-15 аминокислот, более предпочтительно 3-10 аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления гетерологичные белки представляют собой пролекарственный превращающий фермент. В указанных вариантах осуществления рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм аттенуированной вирулентности экспрессирует, а предпочтительно экспрессирует и секретирует фермент, превращающий пролекарство в лекарственное средство. Используемый в настоящей заявке термин пролекарственный превращающий фермент включает ферменты, превращающие нетоксичные пролекарства в токсическое лекарственное средство, предпочтительно ферменты, выбранные из группы, содержащей цитозиндезаминазу, пуриновую нуклеозидфосфорилазу, тимидинкиназу, бета-галактозидазу, карбоксилестеразу, нитроредуктазу, карбоксипептидазы и бетаглюкуронидазы, более предпочтительно ферменты, выбранные из группы, содержащей цитозиндезами- 14 039922 назу, пуриновую нуклеозидфосфорилазу, тимидинкиназу и бета-галактозидазу.

Используемый в настоящей заявке термин сайт расщепления протеазой относится к конкретному мотиву аминокислоты в аминокислотной последовательности, например в аминокислотной последовательности белка или слитого белка, расщепляемой специфической протеазой, которая распознает мотив аминокислоты. Обзор см. в [20]. Примерами сайтов расщепления протеазой являются аминокислотные мотивы, которые расщепляются протеазой, выбранной из группы, включающей энтерокиназу (легкую цепь), энтеропептидазу, протеазу PreScission, протеазу риновируса человека (HRV 3С), протеазу TEV, протеазу TVMV, протеазу FactorXa и тромбин.

Следующий аминокислотный мотив распознается соответствующей протеазой:

Asp-Asp-Asp-Asp-Lys: энтерокиназа (легкая цепь)/энтеропептидаза,

Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln/Gly-Pro: протеаза PreScission/протеаза риновируса человека (HRV 3С), Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Ser и модифицированные мотивы на основе Glu-X-X-Tyr-X-Gln-Gly/Ser (где X - любая аминокислота), распознаваемые протеазой TEV (вирус гравировки табака),

Glu-Thr-Val-Arg-Phe-Gln-Ser: протеаза TVMV,

De-(Glu или Asp)-Gly-Arg: протеаза фактора Ха,

Leu-Val-Pro-Arg/Gly-Ser: тромбин.

Сайт расщепления протеазой, в контексте настоящей заявки, представляет собой убиквитин. Таким образом, в некоторых предпочтительных вариантах осуществления в качестве сайта расщепления протеазой используется убиквитин, т.е. третья последовательность ДНК кодирует убиквитин в качестве сайта расщепления протеазой, который может быть расщеплен специфическими протеазами процессинга убиквитина на N-концевом сайте, например, который может быть расщеплен специфическими протеазами процессинга убиквитина, называемых деубиквитинизирующими ферментами на N-концевом сайте эндогенно в клетке, куда был доставлен слитый белок. Убиквитин подвергается процессингу на его Сконце группой эндогенных убиквитин-специфических С-концевых протеаз (деубиквитинизирующих ферментов, DUBs). Расщепление убиквитина под действием DUBs должно происходить на самом Сконце убиквитина (после G76).

Под термином индивидуум, субъект или пациент понимается позвоночное животное. В определенных вариантах осуществления позвоночное представлено млекопитающим. Млекопитающие включают, кроме прочего, приматов (включая человекообразных и нечеловекообразных приматов) и грызунов (например, мышей и крыс). В некоторых вариантах осуществления под млекопитающим понимается человек.

Термин мутация используется в настоящей заявке как общий термин и включает изменения как одиночной пары оснований, так и нескольких пар оснований. Такие мутации могут включать замещения, мутации сдвига рамки, делеции, инсерции и усечения.

Используемый в настоящей заявке термин молекула-метка или акцепторный сайт для молекулыметки относится к малому химическому соединению, связывающемуся с специфической аминокислотной последовательностью, вызывая флуоресценцию связанного химического соединения, предпочтительно лигаза кумарина/акцепторный сайт кумарина (и их производные), лигаза резоруфина/акцепторный сайт резоруфина (и его производные) и мотив тетра-цистеина (например, Cys-Cys-ProGly-Cys-Cys и производные), используемые с красителем FlAsH/ReAsH (Life Technologies) или флуоресцентным белком, таким как усиленный зеленый флуоресцентный белок (EGFP).

Используемый в настоящей заявке термин сигнал ядерной локализации относится к аминокислотной последовательности, которая маркирует белок для импорта в ядро эукариотической клетки и включает предпочтительно вирусный сигнал ядерной локализации, такой как NLS большого Т-антигена SV40 (PPKKKRKV).

Используемый в настоящей заявке термин сайт множественного клонирования относится к короткой ДНК-последовательности, содержащей несколько сайтов рестрикции для расщепления эндонуклеазами рестрикции, такими как

- 15 039922

Acll, Hindlll, SspI, MluCI, Tsp509I, Pcil, Agel, BspMI, BfuAI, SexAI, MluI, BceAI, HpyCH4IV, HpyCH4III, Bael, BsaXI, AflIII, Spel, Bsrl, BmrI, Bglll, Afel, Alul, Stul, Seal, Clal, BspDI, ΡΙ-SceI, Nsil, Asel, Swal, CspCI, Mfel, BssSI, BmgBI, Pmll, Dralll, Alel, EcoP15I, PvuII, AlwNI, BtsIMutl, TspRI, Ndel, Nlalll, CviAII, Fatl, MslI, FspEI, Xcml, BstXI, PflMI, BccI, Ncol, BseYI, Faul, Smal, Xmal, TspMI, Nt.CviPII, LpnPI, Acil, Sadi, BsrBI, MspI, Hpall, ScrFI, BssKI, StyD4I, BsaJI, BslI, Btgl, Neil, Avril, Mnll, BbvCI, Nb.BbvCI, Nt.BbvCI, Sbfl, BpulOI, Bsu36I, EcoNI, HpyAV, BstNI, PspGI, Styl, Bcgl, Pvul, BstUI, EagI, Rsrll BsiEI, BsiWI, BsmBI, Hpy99I, MspAlI, MspJI, SgrAI, Bfal, BspCNI, Xhol, Earl, Acul, PstI, Bpml, Ddel, Sfcl, AflII, BpuEI, Smll, Aval, BsoBI, MboII, BbsI, XmnI, BsmI, Nb.BsmI, EcoRI, Hgal, Aatll, Zral, Tthl 1II PflFI, PshAI, AhdI, DrdI, Eco53kl, SacI, BseRI, Piel, Nt.BstNBI, Mlyl, Hinfl, EcoRV, Mbol, Sau3AI, DpnII BfuCI, Dpnl, BsaBI, Tfil, BsrDI, Nb.BsrDI, Bbvl, BtsI, Nb.BtsI, BstAPI, SfaNI, SphI, NmeAIII, Nael, NgoMIV, Bgll, AsiSI, BtgZI, HinPlI, Hhal, BssHII, Notl, Fnu4HI, Cac8I, Mwol, Nhel, Bmtl, SapI, BspQI, Nt.BspQI, BlpI, Tsel, ApeKI, Bspl286I, Alwl, Nt.AlwI, BamHI, FokI, BtsCI, Haelll, Phol, Fsel, Sfil, Nari, KasI, Sfol, PluTI, Asci, Ecil, BsmFI, Apal, PspOMI, Sau96I, NlalV, Kpnl, Acc65I, Bsal, HphI, BstEII, Avail, BanI, BaeGI, BsaHI, Banll, Rsal, CviQI, BstZ17I, BciVI, Sall, Nt.BsmAI, BsmAI, BcoDI, ApaLI, Bsgl, AccI, Hpyl66II, Tsp45I, Hpal, Pmel, HincII, BsiHKAI, Apol, NspI, BsrFI, BstYI, Haell, CviKI-1, EcoO109I, PpuMI, ICeul, SnaBI, I-Scel, BspHI, BspEI, Mmel, TaqaI, Nrul, Hpyl88I, Hpyl88III, Xbal, Bell, HpyCH4V, FspI, PI-PspI, MscI, BsrGI, Msel, Pad, Psil, BstBI, Dral, PspXI, BsaWI, BsaAI, Eael, preferably Xhol, Xbal, Hindlll, Ncol, Notl, EcoRI, EcoRV, BamHI, Nhel, SacI, Sall, BstBI.

Используемый в настоящей заявке термин сайт множественного клонирования далее относится к короткой последовательности ДНК, используемой для событий рекомбинации как, например, в стратегии Gateway-клонирования, или для таких методик, как сборка Гиббсона или клонирование ТОРО.

Термин штамм Yersinia дикого типа, в контексте настоящей заявки, относится к встречающемуся в природных условиях варианту (такому, как Y. enterocolitica Е40), или к встречающемуся в природных условиях варианту, который содержит генетические модификации, позволяющие использовать векторы, такие как делеционные мутации в рестрикционных эндонуклеазах или гены устойчивости к антибиотикам (такой как Y. enterocolitica MRS40, чувствительный к ампициллину дериват Y. enterocolitica E40). Указанные штаммы содержат хромосомную ДНК, а также немодифицированную плазмиду вирулентности (называемую pYV).

Термин содержать обычно используется в смысле включения, т.е. допущения наличия одного или нескольких признаков или компонентов.

Термин приблизительно относится к диапазону значений ±10% от заданного значения. Например, фраза приблизительно 200 включает в себя ±10% от 200 или от 180 до 220.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм трансформируется вектором, который содержит в направлении от 5' до 3':

первую последовательность ДНК, кодирующую сигнал доставки или ее фрагмент из бактериального эффекторного белка;

вторую последовательность ДНК, кодирующую повторяющиеся домены гетерологичного белка или два или более доменов различных гетерологичных белков, слитых в рамке с 3'- концом указанной первой последовательности ДНК, где гетерологичные белки выбраны из группы, состоящей из белков, участвующих в апоптозе или регуляции апоптоза, регуляторов клеточного цикла, белков с анкириновым повтором, белков клеточной сигнализации, репортерных белков, транскрипционных факторов, протеаз, малых ГТФаз, связанных с GPCR белков, нанотел и конструкций слияния нанотел, бактериальных эффекторов T3SS, бактериальных эффекторов T4SS и вирусных белков. Предпочтительно последовательность ДНК, кодирующая повторяющиеся домены гетерологичного белка или два или более доменов различных гетерологичных белков, фланкирована на своем 3'-конце последовательностью ДНК, гомологичной последовательности ДНК хромосомы или эндогенной плазмиде вирулентности на 3'-конце сигнала доставки от бактериального эффекторного белка или ее фрагменту. Более предпочтительно указанная

- 16 039922

ДНК-последовательность, фланкирующая гомологичный белок на своем З'-конце, гомологична последовательности ДНК и лежит в пределах 10 т.п.н. на хромосоме или на эндогенной плазмиде вирулентности на 3'-конце сигнала доставки от бактериального эффекторного белка или его фрагмента. В частности, указанная нуклеотидная последовательность, фланкирующая с гомологичным белком на его 3'-конце, гомологична последовательности ДНК и находится в пределах того же оперона на хромосоме или на эндогенной плазмиде вирулентности, что и сигнал доставки от бактериального эффекторного белка или его фрагмент. В этом варианте осуществления обычно проводят трансформацию, чтобы вставить слитые первую и вторую последовательность ДНК посредством гомологичной рекомбинации на эндогенную плазмиду вирулентности или хромосому, предпочтительно на эндогенную плазмиду вирулентности, рекомбинантного грамотрицательного бактериального штамма с аттенуированной вирулентностью, и слитые первая и вторая последовательность ДНК функционально связаны с промотором эндогенной плазмиды вирулентности или хромосомы, например островка хромосомной патогенности. Предпочтительно слитые первая и вторая ДНК-последовательность функционально связаны с промотором эндогенной плазмиды вирулентности. В этом варианте осуществления первая последовательность ДНК включает в себя сигнал доставки или его фрагмент из бактериального эффекторного белка, предпочтительно его фрагмент, который обеспечивает гомологичную рекомбинацию на гомологичном сайте на хромосоме или на эндогенной плазмиде вирулентности, приводя к помещению второй последовательности ДНК в рамку к 3'-концу сигнала доставки хромосомы или эндогенной плазмиды вирулентности, функционально связанного с эндогенным промотором.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм трансформируется нуклеотидной молекулой, предпочтительно молекулой нуклеотида ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую повторяющиеся домены гетерологичного белка или два или более доменов различных гетерологичных белков и нуклеотидную последовательность, которая гомологична или идентична нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнал доставки от бактериального эффекторного белка или которая гомологична или идентична нуклеотидной последовательности, кодирующей фрагмент сигнала доставки из бактериального эффекторного белка, причем сигнал доставки от бактериального эффекторного белка закодирован на хромосоме или на эндогенной плазмиде вирулентности рекомбинантного грамотрицательного бактериального штамма с аттенуированной вирулентностью. Предпочтительно нуклеотидная последовательность, которая гомологична или идентична нуклеотидной последовательности сигнала доставки от бактериального эффекторного белка или его фрагмента, расположена на 5'-конце нуклеотидной последовательности, кодирующей повторяющиеся домены гетерологичного белка или двух или более доменов различных гетерологичных белков. Более предпочтительно нуклеотидная последовательность, кодирующая повторяющиеся домены гетерологичного белка или два или более доменов с различными гетерологичными белками, фланкирована на своем 3'-конце нуклеотидной последовательностью, гомологичной последовательности ДНК хромосомы или эндогенной плазмиды вирулентности на 3'-конце сигнала доставки от бактериального эффекторного белка или ее фрагменту. Еще более предпочтительно указанная нуклеотидная последовательность, фланкирующая с гомологичным белком на его 3'-конце, гомологична последовательности ДНК, лежащей в пределах 10 т.п.н. на хромосоме или на эндогенной плазмиде вирулентности на 3'-конце сигнала доставки от бактериального эффекторного белка или его фрагменту. В частности, указанная нуклеотидная последовательность, фланкирующая гомологичный белок на его 3'-конце, гомологична последовательности ДНК, лежащей в пределах того же оперона на хромосоме или на эндогенной плазмиде вирулентности, что и сигнал доставки от бактериального эффекторного белка или его фрагмент. В этом варианте осуществления обычно выполняют трансформацию, чтобы вставить нуклеотидную последовательность, кодирующую повторяющиеся домены гетерологичного белка или два или более доменов различных гетерологичных белков, в эндогенную плазмиду вирулентности или хромосому рекомбинантного грамотрицательного бактериального штамма с аттенуированной вирулентностью на 3'-конце сигнала доставки от бактериального эффекторного белка, кодируемого хромосомой или эндогенной плазмидой вирулентности, причем повторяющиеся домены гетерологичного белка или два или более доменов различных гетерологичных белков, слитых с сигналом доставки, экспрессируются и секретируются.

В случае когда рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм с аттенуированной вирулентностью представлен штаммом Yersinia, эндогенная плазмида вирулентности для инсерции представляет собой pYV (плазмида вирулентности Yersinia). В случае когда рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм с аттенуированной вирулентностью представлен штаммом Salmonella, эндогенной локализацией для инсерции является один из кластеров генов, называемых SpiI или SpiII (Salmonella pathogenicity island, островок патогенности сальмонеллы), место, где эффекторный белок закодирован на другом участке или, альтернативно, одна из плазмид вирулентности сальмонеллы (SVP).

Предпочтительно первую и вторую ДНК-последовательность или нуклеотидную молекулу вставляют в эндогенную плазмиду вирулентности на нативном сайте бактериального эффекторного белка, например на нативном сайте фактора вирулентности, предпочтительно в случае когда рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм с аттенуированной вирулентностью представлен штаммом

- 17 039922

Yersinia, на нативном сайте YopE или другом Yop (YopH, YopO, YopP, YopM, YopT), предпочтительно на нативном сайте YopE или в случае когда рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм с аттенуированной вирулентностью представлен штаммом Salmonella в нативном сайте эффекторного белка, кодируемого в SpiI, SpiII или закодированном на другом участке, предпочтительно на нативном сайте эффекторного белка кодируемого в SpiI или SpiII, более предпочтительно на нативном сайте SopE или SteA. Предпочтительно первая и вторая последовательности ДНК или нуклеотидная молекула функционально связаны с нативным промотором бактериального эффекторного белка, присутствующего на эндогенной плазмиде вирулентности, например, в случае когда рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм с аттенуированной вирулентностью представлен штаммом Yersinia - с нативным промотором из гена вирулона Yersinia, как описано ниже, более предпочтительно с нативным промотором YopE или другим промотором Yop (YopH, YopO, YopP, YopM, YopT), предпочтительнее нативным промотором YopE или в случае когда рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм с аттенуированной вирулентностью представлен штаммом Salmonella - с нативным промотором из островка патогенности SpiI или SpiII или из эффекторного белка, закодированном на другом участке, как описано ниже, более предпочтительно с нативным промотором SopE, InvB или SteA.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предлагает рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм, причем указанный грамотрицательный бактериальный штамм выбран из группы, состоящей из родов Yersinia, Escherichia, Salmonella и Pseudomonas. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предлагает рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм, причем указанный грамотрицательный бактериальный штамм выбран из группы, состоящей из родов Yersinia и Salmonella. Предпочтительно грамотрицательным бактериальным штаммом является Yersinia strain, более предпочтительно штамм Yersinia enterocolitica. Наиболее предпочтительным является Yersinia enterocolitica Е40 (0:9, биотип 2) [21] или его чувствительные к ампициллину производные Y. enterocolitica MRS40 (также называемые Y. enterocolitica подвид palearctica MRS40) согласно [22]. Y. enterocolitica E40 и его производное Y. enterocolitica согласно [22] идентичен Y. enterocolitica подвид palearctica E40 и его производному Y. enterocolitica подвид palearctica MRS40, согласно [23-25]. Также предпочтительно грамотрицательным бактериальным штаммом является Salmonella strain, более предпочтительно штамм Salmonella enterica. Наиболее предпочтительным является Salmonella enterica Serovar Typhimurium SL1344 согласно описанию в коллекции культур Министерства здравоохранения Англии (NCTC 13347).

В одном варианте осуществления настоящего изобретения сигнал доставки из бактериального эффекторного белка T3SS включает бактериальный эффекторный белок T3SS или его N-концевой фрагмент, причем эффекторный белок T3SS или его N-концевой фрагмент могут содержать сайт связывания шаперонов. Эффекторный белок T3SS или его N-концевой фрагмент, который содержит сайт связывания шаперонов, особенно полезен в качестве сигнала доставки в настоящем изобретении. Предпочтительные эффекторные белки T3SS или их N-концевые фрагменты выбирают из группы, включающей

SopE,

SopE2, SptP, YopE, ExoS, Sip A, SipB, SipD, SopA, SopB, SopD, IpgBl, IpgD,

SipC, SifA, SseJ, Sse, SrfH, YopJ, AvrA, AvrBsT, YopT, YopH, YpkA, Tir, EspF,

TccP2, IpgB2, OspF, Map, OspG, OspI, IpaH, SspHl,VopF, ExoS, ExoT, HopAB2,

XopD, AvrRpt2, HopAOl, HopPtoD2, HopUl, семейство белков GALA, AvrBs2,

AvrDl, AvrBS3, YopO, YopP, YopE, YopM, YopT, EspG, EspH, EspZ, IpaA, IpaB,

IpaC, VirA, IcsB, OspCl, OspE2, IpaH9.8, IpaH7.8, AvrB, AvrD, AvrPphB,

AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, VirPphA, AvrRpml,

HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, PopB, PopP2, AvrBs3, XopD, и AvrXv3.

Более предпочтительные эффекторные белки T3SS или их N-концевые фрагменты выбирают из группы, включающей

SopE, SptP, YopE, ExoS, SopB, IpgBl, IpgD,

YopJ, YopH, EspF, OspF, ExoS, YopO, YopP, YopE, YopM, YopT, из которых наиболее предпочтительные эффекторные белки T3SS или их N-концевые фрагменты выбраны из группы, состоящей из

IpgBl, SopE, SopB, SptP, OspF, IpgD, YopH, YopO, YopP, YopE, YopM, YopT, в частности YopE или его Nконцевой фрагмент.

В равной степени предпочтительные эффекторные белки T3SS или их N-концевые фрагменты выбирают из группы, включающей

- 18 039922

SopE, SopE2, SptP,

SteA, SipA, SipB, SipD, SopA, SopB, SopD, IpgBl, IpgD, SipC, SifA, SifB, SseJ, Sse, SrfH, YopJ, AvrA, AvrBsT, YopH, YpkA, Tir, EspF, TccP2, IpgB2, OspF, Map, OspG, OspI, IpaH, VopF, ExoS, ExoT, HopAB2, AvrRpt2, HopAOl, HopUl, семейство белков

GALA, AvrBs2, AvrDl, YopO, YopP, YopE, YopT, EspG, EspH,

EspZ, IpaA, IpaB, IpaC, VirA, IcsB, OspCl, OspE2, IpaH9.8, IpaH7.8, AvrB, AvrD,

AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, VirPphA,

AvrRpml, HopPtoD2, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, PopB, PopP2, AvrBs3, XopD, и AvrXv3.

В равной степени более предпочтительные эффекторные белки T3SS или их N-концевые фрагменты выбирают из группы, включающей SopE, SptP, SteA, SifB, SopB, IpgB1, IpgD, YopJ, YopH, EspF, OspF, ExoS, YopO, YopP, YopE, YopT, из которых в равной степени наиболее предпочтительные эффекторные белки T3SS или их N-концевые фрагменты выбраны из группы, включающей IpgB1, SopE, SopB, SptP, SteA, SifB, OspF, IpgD, YopH, YopO, YopP, YopE, и YopT, в частности SopE, SteA, или YopE или его Nконцевой фрагмент, более конкретно - SteA или YopE или его N-концевой фрагмент, наиболее конкретно YopE или его N-концевой фрагмент. В некоторых вариантах осуществления сигнал доставки от бактериального эффекторного белка T3SS, кодируемого первой ДНК-последовательностью, содержит бактериальный эффекторный белок T3SS или его N-концевой фрагмент, где его N-концевой фрагмент включает по меньшей мере первые 10, предпочтительно по меньшей мере первые 20, более предпочтительно по меньшей мере первые 100 аминокислот бактериального T3SS-эффекторного белка.

В некоторых вариантах осуществления сигнал доставки из бактериального эффекторного белка T3SS, кодируемого первой последовательностью ДНК, содержит бактериальный эффекторный белок T3SS или его N-концевой фрагмент, причем эффекторный белок T3SS или его N-концевой фрагмент содержит сайт связывания шаперонов. Предпочтительные эффекторные белки T3SS или его N-концевой фрагмент, которые содержат сайт связывания шаперонов, включают следующие комбинации сайта связывания шаперонов и эффекторного белка T3SS или его N-концевого фрагмента:

SycE-YopE, InvB-SopE, SicP-SptP, SycT-YopT, SycOYopO, SycN/YscB-YopN, SycH-YopH, SpcS-ExoS, CesF-EspF, SycD-YopB, SycDYopD. More preferred are SycE-YopE, InvB-SopE, SycT-YopT, SycO-YopO,

SycN/YscB-YopN, SycH-YopH, SpcS-ExoS, CesF-EspF.

Наиболее предпочтительным является YopE или его N-концевой фрагмент, содержащий сайт связывания шаперонов SycE, такой как N-концевой фрагмент эффекторного белка YopE, содержащий Nконцевые 138 аминокислот эффекторного белка YopE, обозначенные в настоящей заявке как YopE_1-138 и как показано в SEQ ID NO: 2, или SopE или его N-концевой фрагмент, содержащий сайт связывания шаперонов InvB, такой как N-концевой фрагмент эффекторного белка SopE, содержащий N-концевые 81 или 105 аминокислот эффекторного белка SopE, обозначенные в настоящей заявке как SopE_1-81 или SopE_1-105 соответственно, и в соответствии с SEQ ID NO: 142 или 143.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения грамотрицательный бактериальный штамм представлен штаммом Yersinia, а сигнал доставки от бактериального эффекторного белка T3SS, кодируемого первой последовательностью ДНК, содержит эффекторный белок YopE или N-концевую часть, предпочтительно эффекторный белок YopE Y. Enterocolitica или его N-концевую часть. Предпочтительно сайт связывания SycE входит в N-концевую часть эффекторного белка YopE. В связи с указанным N-концевой фрагмент эффекторного белка YopE может содержать N-концевые 12, 16, 18, 52, 53, 80 или 138 аминокислот [26-28]. Наиболее предпочтительным является N-концевой фрагмент эффекторного белка YopE, содержащий N-концевые 138 аминокислот эффекторного белка YopE, например, как описано в работе Forsberg и Wolf-Watz [29], обозначенный в настоящей заявке как YopE_1-138, и в соответствии с SEQ ID NO: 2.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения грамотрицательный бактериальный штамм представлен штаммом Salmonella, а сигнал доставки от бактериального эффекторного белка T3SS, кодируемого первой последовательностью ДНК, содержит эффекторный белок SopE или SteA или его N-концевую часть, предпочтительно эффекторный белок SopE или SteA Salmonella enterica или его N-концевую часть. Предпочтительно сайт связывания шаперонов находится в N-концевой части эффекторного белка SopE. В связи с указанным N-концевой фрагмент эффекторного белка SopE может содержать N-концевые 81 или 105 аминокислот. Наиболее предпочтительным является SteA полной длины и N-концевой фрагмент эффекторного белка SopE, содержащего N-концевые 105 аминокислот эффекторного белка, например, в соответствии с SEQ ID NO: 142 или 143.

Специалистам в данной области известны методы идентификации полипептидных последователь

- 19 039922 ностей эффекторного белка, которые способны доставлять белок. Например, один такой метод описан Sory et al. [21]. В кратком изложении, полипептидные последовательности, например, из различных частей белков Yop могут быть слиты в рамке с репортерным ферментом, таким как активированный кальмодулином аденилатциклазный домен (или Суа) циклолизина Bordetella pertussis. Доставка гибридного белка Yop-Cya в цитозоль эукариотических клеток подтверждается появлением активности циклоазы в инфицированных эукариотических клетках, что приводит к накоплению цАМФ. Используя такой подход, специалист в данной области может определить, при желании, минимальную необходимую последовательность, т.е. непрерывную аминокислотную последовательность самой короткой длины, которая способна доставлять белок, см., например, [21]. Соответственно, предпочтительные сигналы доставки по настоящему изобретению состоят, по меньшей мере, из минимальной последовательности аминокислот эффекторного белка T3SS, который способен доставлять белок.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к мутантным рекомбинантным грамотрицательным бактериальным штаммам, в частности к рекомбинантным грамотрицательным бактериальным штаммам, которые дефицитны по продуцированию по меньшей мере одного функционального эффекторного белка T3SS. В соответствии с настоящим изобретением такой мутантный грамотрицательный бактериальный штамм, например такой мутантный штамм Yersinia может быть получен путем введения по меньшей мере одной мутации в, по меньшей мере, один ген, кодирующий эффектор. Предпочтительно такие гены, кодирующие эффектор, включают YopE, YopH, YopO/YpkA, YopM, YopP/YopJ и YopT для штамма Yersinia. Предпочтительно такие гены, кодирующие эффектор, включают

AvrA, CigR, GogB, GtgA, GtgE, PipB, SifB,

SipA/SspA, SipB, SipC/SspC, SipD/SspD, SlrP, SopB/SigD, SopA, SpiC/SsaB, SseB, SseC, SseD, SseF, SseG, SseVSrfH, SopD, SopE, SopE2, SspHl, SspH2, PipB2, SifA, SopD2, SseJ, SseKl, SseK2, SseK3, SseL, SteC, SteA, SteB, SteD, SteE, SpvB, SpvC, SpvD, Srfl, SptP, для штамма Salmonella strain. Наиболее предпочтительно все гены, кодирующие эффектор, подвергаются делеции.

Специалист в данной области может использовать любое количество стандартных методов для генерации мутаций в указанных эффекторных генах T3SS. Sambrook et al. описывают в целом такие методы. См. Sambrook et al. [30]. В соответствии с настоящим изобретением мутация может быть выполнена в промоторной области гена, кодирующего эффектор, так что экспрессия такого эффекторного гена прекращается.

Мутация также может быть выполнена в кодирующей области гена, кодирующего эффектор, так что каталитическая активность кодируемого эффекторного белка прекращается. Каталитическая активность эффекторного белка обычно относится к функции против клетки-мишени эффекторного белка, т.е. токсичности. Такая активность определяется каталитическими мотивами в каталитическом домене эффекторного белка. Специалистам в данной области хорошо известны подходы к идентификации этого каталитического домена и/или каталитических мотивов эффекторного белка. См. например, [31, 32]. Соответственно, одной предпочтительной мутацией по настоящему изобретению является делеция всего каталитического домена. Другой предпочтительной мутацией является мутация сдвига рамки в гене, кодирующего эффектор, так что каталитический домен отсутствует в белковом продукте, экспрессированном из такого гена со сдвигом рамки. Наиболее предпочтительной мутацией является мутация с делецией всей кодирующей области эффекторного белка. Другие мутации также рассматриваются в настоящем изобретении, такие как небольшие делеции или замены пар оснований, которые генерируются в каталитических мотивах эффекторного белка, приводя к разрушению каталитической активности данного эффекторного белка.

Мутации, которые генерируются в генах функциональных эффекторных белков T3SS, могут быть введены в конкретный штамм с помощью ряда методов. Один из таких методов включает клонирование мутированного гена в суицидальный вектор, который способен вводить мутантную последовательность в штамм посредством аллельного обмена. Пример такого суицидального вектора описан в [33].

Таким способом мутации, генерируемые в нескольких генах, могут последовательно вводиться в грамотрицательный бактериальный штамм, приводя к получению полимутанта, например, шестикратно мутантного рекомбинантного штамма. Порядок введения указанных мутантных последовательностей не важен. В некоторых случаях может быть желательным изменить только некоторые, но не все эффекторные гены. Соответственно, настоящее изобретение дополнительно относится к полимутантам Yersinia, отличным от шестикратных мутантов Yersinia, например двойным мутантам, тройным мутантам, четверным мутантам и пятикратно мутантным штаммам. Для доставки белков система секреции и транслокации данного мутантного штамма должна быть нативной.

Предпочтительным рекомбинантным грамотрицательным бактериальным штаммом по настоящему изобретению является рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм, который дефицитен по меньшей мере, по одному, предпочтительно по меньшей мере по двум, более предпочтительно по

-20039922 меньшей мере по трем, еще более предпочтительно по меньшей мере по четырем, конкретно по меньшей мере по пяти, более конкретно по меньшей мере, по шести, наиболее конкретно всем эффекторным белкам T3SS, например шестикратно мутантный грамотрицательный бактериальный штамм, в котором все гены, кодирующие эффектор, мутированы таким образом, что полученный грамотрицательный бактериальный штамм больше не продуцирует никаких функциональных эффекторных белков.

Более предпочтительным рекомбинантным грамотрицательным бактериальным штаммом по настоящему изобретению является шестикратно мутантный штамм Yersinia, в котором все гены, кодирующие эффектор, мутированы таким образом, что полученная Yersinia больше не продуцирует никаких функциональных эффекторных белков. Подобный шестикратно мутантный штамм Yersinia обозначается как ΔυορΗ,Ο,Ρ,Ε,Μ,Τ для Y. enterocolitica. В качестве примера такой шестикратный мутант может быть получен из штамма Y. enterocolitica MRS40, с получением Y. enterocolitica MRS40 ΔуорН,О,Р,Е,М,Т, который является предпочтительным.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к вектору для использования в комбинации с рекомбинантными грамотрицательными бактериальными штаммами для доставки желаемого белка в эукариотические клетки, причем указанный вектор содержит в направлении от 5' до 3': промотор;

Промотор, гетерологичный белок и сайт расщепления протеазой, описанные выше, могут быть использованы для вектора грамотрицательного бактериального штамма.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к вектору для использования в комбинации с рекомбинантными грамотрицательными бактериальными штаммами для доставки желаемого белка в эукариотические клетки, причем указанный вектор содержит в направлении от 5' до 3': первую последовательность ДНК, кодирующую сигнал доставки или его фрагмент от бактериального эффекторного белка;

Предпочтительно последовательность ДНК, кодирующая повторяющиеся домены гетерологичного белка или два или более доменов различных гетерологичных белков вектора, фланкирована на своем 3'конце последовательностью ДНК, гомологичной последовательности ДНК хромосомы или эндогенной плазмиде вирулентности на 3'-конце сигнала доставки от бактериального эффекторного белка или ее фрагменту. Более предпочтительно указанная ДНК-последовательность, фланкирующая гомологичный белок на своем 3'-конце, гомологична последовательности ДНК и лежит в пределах 10 т.п.н. на хромосоме или на эндогенной плазмиде вирулентности на 3'-конце сигнала доставки от бактериального эффекторного белка, или ее фрагменту. В частности, указанная нуклеотидная последовательность, фланкирующая с гомологичным белком на его 3'-конце, гомологична последовательности ДНК и находится в пределах того же оперона на хромосоме или на эндогенной плазмиде вирулентности, что и сигнал доставки от бактериального эффекторного белка или его фрагмент. Гетерологичный белок и сайт расщепления протеазой, согласно описанию выше, может быть использован для вектора грамотрицательного бактериального штамма.

Векторы, которые могут использоваться в соответствии с данным изобретением, зависят от используемых грамотрицательных бактериальных штаммов, известных специалисту. Векторы, которые могут быть использованы в соответствии с изобретением, включают векторы экспрессии (включая синтетические или другие сгенерированные модифицированные версии эндогенных вирулентных плазмид), векторы для инсерции в хромосомы или плазмиды вирулентности и фрагменты ДНК для инсерции в хромосомы или плазмиды вирулентности. Экспрессирующими векторами, которые являются подходящими, например, в случае штаммов Yersinia, Escherichia, Salmonella или Pseudomonas, являются, например, PUC, pBad, pACYC, pUCP20 и плазмиды рЕТ. Векторами для инсерции в хромосомы или плазмиды вирулентности, подходящими, например, в случае штаммов Yersinia, Escherichia, Salmonella или Pseudomonas, являются, например, pKNG101. ДНК-фрагменты для инсерции в хромосомы или плазмиды вирулентно- 21 039922 сти относятся к способам, используемым, например, в случае штаммов Yersinia, Escherichia, Salmonella или Pseudomonas, например, генной инженерии с помощью системы лямбда-Red. Векторы для инсерции в хромосомы или плазмиды вирулентности или фрагментов ДНК для инсерции в хромосомы или плазмиды вирулентности могут вставлять первую, вторую и/или третью последовательность ДНК по настоящему изобретению, так что первая, вторая и/или третья последовательность ДНК функционально связывается с эндогенным промотором рекомбинантного грамотрицательного штамма бактерий. Таким образом, если используется вектор для инсерции в хромосомы или плазмиды вирулентности или фрагмент ДНК для инсерции в хромосомы или плазмиды вирулентности, эндогенный промотор может кодироваться на эндогенной бактериальной ДНК (хромосомной или плазмидной ДНК), и только первая и вторая последовательности ДНК будут обеспечены сконструированным вектором для инсерции в хромосомы или плазмиды вирулентности или фрагмента ДНК для инсерции в хромосомы или плазмиды вирулентности. Альтернативно, если используется вектор для инсерции в хромосомы или плазмиды вирулентности или нуклеотидная молекула, такая как, например, ДНК-последовательность для инсерции в хромосомы или плазмиды вирулентности, эндогенный промотор и сигнал доставки от бактериального эффекторного белка могут быть закодированы на эндогенной бактериальной ДНК (хромосомной или плазмидной ДНК) и только нуклеотидная молекула, такая как, например, последовательность ДНК, кодирующая гетерологичный белок, будет обеспечена вектором для инсерции в хромосомы или плазмиды вирулентности или нуклеотидной молекулой, такой как, например, последовательность ДНК для инсерции в хромосомы или плазмиды вирулентности. Таким образом, промотор необязательно должен содержать вектор, используемый для трансформации рекомбинантных грамотрицательных бактериальных штаммов, т.е. рекомбинантные грамотрицательные бактериальные штаммы по настоящему изобретению могут быть преобразованы вектором, который не содержит промотор. Вектор настоящего изобретения обычно используют для доставки гетерологичных белков бактериальной T3SS в эукариотические клетки in vitro и in vivo.

Предпочтительный вектор, например предпочтительный вектор экспрессии для Yersinia, выбирают из группы, состоящей из pBad_Si-1 и pBad_Si_2. Вектор pBad_Si2 был сконструирован путем клонирования фрагмента SycE-YopE₁.₁₃₈, содержащего эндогенные промоторы для YopE и SycE из очищенного pYV40 в сайт Kpnl/HindIU молекулы pBad-MycHisA (Invitrogen). Дополнительные модификации включают удаление фрагмента NcoI/BgIII из pBad-MycHisA с помощью расщепления, обработки фрагмента Кленова и повторного лигирования. Далее на 3'-конце YopE1.₁₃₈ добавляли следующие сайты расщепления: XbaI-XhoI-BstBI- (HindIII). pBad_Si1 аналогичен pBad_Si2, но кодирует EGFP, амплифицированный из pEGFP-C1 (Clontech) на сайте NcoI/BgIII под индуцибельным арабинозой промотором. В равной степени предпочтительным является использование модифицированных вариантов эндогенной плазмиды вирулентности Yersinia pYV, кодирующей гетерологичные белки, как слияния с сигнальной последовательностью T3SS. Предпочтительный вектор, например предпочтительный вектор экспрессии для Salmonella, выбирают из группы, состоящей из pSi_266, pSi_267, pSi_268 и pSi_269. Плазмиды pSi_266, pSi_267, pSi_268 и pSi_269, содержащие соответствующий эндогенный промотор и фрагмент SteA1_₂₀(pSi_266), последовательность полной длины SteA (pSi_267), фрагмент SopE1_₈₁ (pSi_268) или фрагмент SopE1_₁₀₅ (pSi_269), амплифицировали из геномной ДНК S. enterica SL1344 и клонировали в сайт NcoI/KpnI вектора pBad-MycHisA (Invitrogen).

Векторы настоящего изобретения могут включать в себя другие элементы последовательности, такие как последовательность 3'-терминации (включая стоп-кодон и поли (А)-последовательность), или ген, придающий лекарственную устойчивость, которая позволяет выбирать трансформанты, получившие данный вектор. Векторы по настоящему изобретению могут быть трансформированы рядом известных способов в рекомбинантные грамотрицательные бактериальные штаммы. Для целей настоящего изобретения указанные способы трансформации для введения вектора включают, кроме прочего, электропорацию, опосредованную фосфатом кальция трансформацию, конъюгацию или их комбинации. Например, вектор может быть трансформирован в первый штамм стандартной процедурой электропорации. Далее такой вектор можно перенести из первого штамма в желаемый штамм путем конъюгации; такой процесс также называется мобилизацией. Трансформанты (т.е. грамотрицательные бактериальные штаммы, поглотившие вектор) могут быть выбраны, например, с помощью антибиотиков. Указанные методы хорошо известны в данной области техники. См., например, [21].

В соответствии с настоящим изобретением промоторами вектора экспрессии рекомбинантного грамотрицательного бактериального штамма по изобретению может быть нативный промотор эффекторного белка T3SS соответствующего штамма или совместимого бактериального штамма или промотор, используемый в векторах экспрессии, которые являются подходящими, например, в штаммах Yersinia, Escherichia, Salmonella или Pseudomonas, например pUC и pBad. Такими промоторами являются промотор Т7, промотор Plac или промотор Ara-bad.

Если рекомбинантным грамотрицательным бактериальным штаммом является штамм Yersinia, промотор может быть взят от гена вирулона Yersinia. Гены вирулона Yersinia относятся к генам на плазмиде pYV Yersinia, экспрессия которой контролируется как температурой, так контактом с клеткоймишенью. Такие гены включают гены, кодирующие элементы механизма секреции (гены Ysc), гены, ко

- 22 039922 дирующие транслокаторы (YopB, YopD и LcrV), гены, кодирующие контрольные элементы (YopN, TyeA и LcrG), гены, кодирующие эффекторные шапероны T3SS (SycD, SycE, SycH, SycN, SycO и SycT) и гены, кодирующие эффекторы (YopE, YopH, YopO/YpkA, YopM, YopT и YopP/YopJ), а также другие белки, кодируемые pYV, такие как VirF и YadA. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения промотор является нативным промотором функционального эффекторного кодирующего гена T3SS. Если рекомбинантным грамотрицательным бактериальным штаммом является штамм Yersinia, промотор выбирают из любого из YopE, YopH, YopO/YpkA, YopM и YopP/YopJ. Более предпочтительно промотор выбирают из YopE или SycE.

Если рекомбинантным грамотрицательным бактериальным штаммом является штамм Salmonella, промотор может быть из островка патогенности SpiI или SpiII или из эффекторного белка, закодированного в другом участке. Такие гены включают гены, кодирующие элементы механизма секреции, гены, кодирующие транслокаторы, гены, кодирующие контрольные элементы, гены, кодирующие эффекторные шапероны T3SS, и гены, кодирующие эффекторы, а также другие белки, кодируемые SPI-1 или SPI2. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения промотор является нативным промотором функционального эффекторного кодирующего гена T3SS. Если рекомбинантным грамотрицательным бактериальным штаммом является штамм Salmonella, промотор выбирают из любого из эффекторных белков. Более предпочтительно промотор выбирают из SopE, InvB или SteA.

В предпочтительном варианте осуществления вектор, например вектор экспрессии, содержит последовательность ДНК, кодирующую сайт расщепления протеазой. Генерация функционального и общеприменимого сайта расщепления позволяет отщепить сигнал доставки после транслокации. Поскольку сигнал доставки может препятствовать корректной локализации и/или функционированию транслоцированного белка в клетках-мишенях, введение сайта расщепления протеазой между сигналом доставки и представляющим интерес белком впервые обеспечивает доставку почти нативных белков в эукариотические клетки. Предпочтительно сайтом расщепления протеазой является мотив аминокислоты, который расщепляется протеазой или ее каталитическими доменами, выбранными из группы, включающей энтерокиназу (легкую цепь), энтеропептидазу, протеазу PreScission, протеазу риновируса человека (HRV 3С), протеазу TEV, протеазу TVMV, протеазу FactorXa и тромбин, более предпочтительно мотив аминокислоты, который расщепляется протеазой TEV. В равной степени предпочтительным сайтом расщепления протеазой является мотив аминокислоты, который расщепляется протеазой или ее каталитическими доменами, выбранными из группы, состоящей из энтерокиназы (легкой цепи), энтеропептидазы, протеазы PreScission, протеазы риновируса человека 3С, протеазы TEV, протеазы TVMV, протеазы FactorXa, протеаза процессинга убиквитина, называемая деубиквитинизирующими ферментами, и тромбина. Наиболее предпочтительным является мотив аминокислоты, который расщепляется протеазой TEV или протеазой процессинга убиквитина.

Таким образом, в следующем варианте осуществления настоящего изобретения гетерологичный белок отщепляется от сигнала доставки эффекторного белка T3SS протеазой. Предпочтительными способами расщепления являются способы, в которых:

a) протеаза транслоцируется в эукариотическую клетку рекомбинантным грамотрицательным бактериальным штаммом, как описано в настоящей заявке, экспрессирующим слитый белок, который содержит сигнал доставки от эффекторного белка T3SS и протеазу в качестве гетерологичного белка; или

b) протеаза экспрессируется конститутивно или транзиторно в эукариотической клетке.

Обычно рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм, используемый для доставки желаемого белка в эукариотическую клетку, и рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм, транслоцирующий протеазу в эукариотическую клетку, различны.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения вектор содержит также последовательность ДНК, кодирующую молекулу-метку или акцепторный сайт для молекулы-метки. Указанная дополнительная последовательность ДНК, кодирующая молекулу-метку или акцепторный сайт для молекулметок, обычно слита с 5'-концом или с 3'-концом второй последовательности ДНК. Предпочтительную молекулу-метку или акцепторный сайт для молекулы-метки выбирают из группы, состоящей из усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP), кумарина, акцептора кумариновой лигазы, резоруфина, лигазы акцепторного сайта резоруфина, мотива тетра-цистеина, используемого с красителем FlAsH/ReAsH (Life Technologies). Наиболее предпочтительным является резоруфин и акцепторный сайт лигазы резоруфина или EGFP. Использование молекулы-метки или акцепторного сайта для молекулыметки приведет к присоединению молекулы-метки к представляющему интерес гетерологичному белку, который затем будет доставляться собственно в эукариотическую клетку, и позволит отслеживать указанный белок, например, посредством микроскопии живых клеток.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения вектор содержит дополнительную последовательность ДНК, кодирующую пептидную метку. Указанная дополнительная последовательность ДНК, кодирующая пептидную метку, обычно слита с 5'-концом или с 3'-концом второй последовательности ДНК. Предпочтительная пептидная метка выбирается из группы, состоящей из Мус-метки, His-метки, FLAGметки, НА-метки, метки Strep или метки V5 или комбинации двух или более меток из указанных групп. Наиболее предпочтительной является Мус-метка, FLAG-метка, His-метка и комбинированные Мус- и His

- 23 039922 метки. Использование пептидной метки приведет к прослеживаемости меченого белка, например, путем иммунофлуоресценции или вестерн-блоттинга с использованием антител к меткам. Кроме того, использование пептидной метки позволяет аффинную очистку желаемого белка либо после секреции в культуральный супернатант, либо после транслокации в эукариотические клетки, в обоих случаях - с использованием метода очистки, подходящего для соответствующей метки (например, металл-хелатная аффинная очистка при использовании с His-меткой или очистка с помощью анти-Flag-антител, используемая с FLAG-меткой).

В одном варианте осуществления настоящего изобретения вектор содержит дополнительную последовательность ДНК, кодирующую сигнал ядерной локализации (NLS). Указанная дополнительная последовательность ДНК, кодирующая сигнал ядерной локализации (NLS), обычно слита с 5'-концом или с 3'-концом второй последовательности ДНК, причем указанная дополнительная последовательность ДНК кодирует сигнал ядерной локализации (NLS). Предпочтительный NLS выбирают из группы, состоящей из NLS большого Т-антигена SV40 и его производных [34], а также других вирусных NLS. Наиболее предпочтительным является NLS большого Т-антигена SV40 и его производные.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения вектор содержит сайт множественного клонирования. Указанный множественный сайт клонирования обычно расположен на 3'-конце первой последовательности ДНК и/или на 5'-конце или 3'-конце второй последовательности ДНК. Один или несколько сайтов множественного клонирования может быть представлен вектором. Предпочтительный сайт множественного клонирования выбирают из группы рестрикционных ферментов, включающих XhoI, XbaI, HindIII, NcoI, NotI, EcoRI, EcoRV, BamHI, NheI, Sad, SaiI, BstBI. Наиболее предпочтительными являются XbaI, XhoI, BstBI и HindIII.

Слитый белок, экспрессированный из первой и второй и опциональной третьей последовательностей ДНК вектора, также называют слитым белком или гибридным белком, т.е. слитым белком или гибридом сигнала доставки и повторяющихся доменов гетерологичного белка или двух или более доменов различных гетерологичных белков.

Настоящее изобретение относится к способу доставки повторяющихся доменов гетерологичного белка или двух или более доменов различных гетерологичных белков, как описано выше, в эукариотические клетки в клеточной культуре, а также in-vivo.

Таким образом, в одном варианте осуществления способ доставки повторяющихся доменов гетерологичного белка или двух или более доменов различных гетерологичных белков включает:

i) культивирование грамотрицательного бактериального штамма, как описано в настоящей заявке;

ii) контактирование эукариотической клетки с грамотрицательным бактериальным штаммом i), причем слитый белок, который содержит сигнал доставки от бактериального эффекторного белка T3SS и повторяющихся доменов гетерологичного белка или двух или более доменов различных гетерологичных белков, экспрессируется указанным грамотрицательным бактериальным штаммом и транслоцируется в эукариотическую клетку; а также опционально:

iii) расщепление слитого белка, так что повторяющиеся домены гетерологичного белка или два или более доменов различных гетерологичных белков отщепляются от сигнала доставки от бактериального эффекторного белка T3SS.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере два слитых белка, каждый из которых содержат сигнал доставки от бактериального эффекторного белка и повторяющихся доменов гетерологичного белка или двух или более доменов с различными гетерологичными белками, экспрессируются рекомбинантным аттенуированным грамотрицательным бактериальным штаммом и транслоцируются в эукариотическую клетку способами настоящего изобретения.

Рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм может быть культивирован таким образом, чтобы экспрессировать слитый белок, который содержит сигнал доставки от эффекторного белка T3SS и повторяющихся доменов гетерологичного белка или двух или более доменов разных гетерологичных белков в соответствии с известными способами в области техники (например, FDA, Бактериологическое аналитическое руководство (ВАМ), глава 8: Yersinia enterocolitica). Предпочтительно рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм можно культивировать в бульоне с сердечномозговым экстрактом, например, при 28°С. Для индукции экспрессии T3SS и, например, YOPE/SycEпромотор-зависимых генов, бактерии можно выращивать при 37°С.

В предпочтительном варианте осуществления эукариотическая клетка подвергается контактированию с двумя грамотрицательными бактериальными штаммами i), причем первый грамотрицательный бактериальный штамм экспрессирует первый слитый белок, который содержит сигнал доставки от бактериального эффекторного белка T3SS и повторяющиеся домены гетерологичного белка или два или более доменов различных гетерологичных белков, а второй грамотрицательный бактериальный штамм экспрессирует второй слитый белок, который содержит сигнал доставки от бактериального эффекторного белка T3SS и повторяющиеся домены второго гетерологичного белка или двух или более доменов других вторых гетерологичных белков второго гетерологичного белка, так что первый и второй слитые белки транслоцируются в эукариотическую клетку. Указанный вариант осуществления предусматривает коинфицирование, например, эукариотических клеток двумя бактериальными штаммами в качестве действенного способа доставки, например, двух разных гибридных белков в отдельные клетки для обеспе

- 24 039922 чения их функционального взаимодействия.

Специалисты в данной области техники также могут использовать ряд анализов для определения того, успешно ли была выполнена доставка слитого белка. Например, слитый белок может быть обнаружен с помощью иммунофлуоресценции с использованием антител, распознающих слитую метку (например, Мус-метку). Определение также может быть основано на ферментативной активности доставляемого белка.

Настоящее изобретение относится к широкому спектру эукариотических клеток, которые могут быть мишенью данного рекомбинантного грамотрицательного бактериального штамма, например Hi-5 (BTI-TN-5B1-4; Life technologies B855-02), клетки HeLa, например HeLa Ccl2 (такие, как ATCC No. CCL2), фибробласты, например 3T3 fibroblast cells (такие, как ATCC No. CCL-92) или Mef (такие, как ATCC No. SCRC-1040), Hek (такие, как ATCC No. CRL-1573), HUVECs (такие, как ATCC No. PCS-100-013), СНО (такие, как ATCC No. CCL-61), Jurkat (такие, как ATCC No. TIB-152), Sf-9 (такие, как ATCC No. CRL-1711), HepG2 (такие, как ATCC No. HB-8065), Vero (такие, как ATCC No. CCL-81), MDCK (такие, как ATCC No. CCL-34), ТНР-1 (такие, как ATCC No. TIB-202), J774 (такие, как ATCC No. TIB-67), RAW (такие, как ATCC No. TIB-71), Сасо2 (такие, как ATCC No. HtB-37), клеточные линии NCI (такие, как ATCC No. НТВ-182), DU145 (такие, как ATCC No. HTB-81), Lncap (такие, как ATCC No. CRL-1740), MCF-7 (такие, как ATCC No. HTB-22), MDA-MB cell lines (такие, как ATCC No. НТВ-128), РС3 (такие, как ATCC No. CRL-1435), T47D (такие, как ATCC No. CRL-2865), A549 (такие, как ATCC No. CCL-185), U87 (такие, как ATCC No. НТВ-14), SHSY5Y (такие, как ATCC No. CRL-2266s), Еа.Ну926 (такие, как ATCC No. CRL-2922), Saos-2 (такие, как ATCC No. HTBH-85), 4Т1 (такие, как ATCC No. CRL-2539), B16F10 (такие, как ATCC No. CRL-6475), или первичные человеческие гепатоциты (такие, как HMCPIS Life technologies), предпочтительно HeLa, Hek, HUVECs, 3T3, СНО, Jurkat, Sf-9, HepG2 Vero, THP-1, Caco2, Mef, A549, 4T1, B16F10 и первичные человеческие гепатоциты и наиболее предпочтительно HeLa, Hek, HUVECs, 3T3, СНО, Jurkat, THP-1, A549 и Mef. Под мишенью подразумевается внеклеточная адгезия рекомбинантного грамотрицательного бактериального штамма к эукариотической клетке.

В соответствии с настоящим изобретением доставка белка может быть достигнута путем контактирования эукариотической клетки с рекомбинантным грамотрицательным бактериальным штаммом в соответствующих условиях. Для специалистов в данной области техники обычно доступны различные источники и методики в отношении условий для индуцирования экспрессии и транслокации генов вирулонов, включая желаемую температуру, концентрацию Ca⁺⁺, добавление индукторов, например конгокрасного, способы, которыми смешиваются рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм и клетки-мишени и тому подобное. См., например, [35]. Условия могут варьироваться в зависимости от типа эукариотических клеток-мишеней, и используемого рекомбинантного бактериального штамма. Такие вариации могут быть реализованы специалистами в данной области с использованием обычных методик.

Специалисты в данной области техники также могут использовать ряд анализов для определения того, успешно ли была выполнена доставка слитого белка. Например, слитый белок может быть обнаружен с помощью иммунофлуоресценции с использованием антител, распознающих слитую метку (например, Мус-метку). Определение также может быть основано на ферментативной активности доставляемого белка, например, посредством анализа, описанного в [21].

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает использование описанного в настоящей заявке рекомбинантного грамотрицательного бактериального штамма в медицине.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает использование описанного в настоящей заявке рекомбинантного грамотрицательного бактериального штамма при доставке повторяющихся доменов гетерологичного белка или двух или более доменов различных гетерологичных белков в качестве лекарственного средства или вакцины субъекту. Повторяющиеся домены гетерологичного белка или два или более доменов различных гетерологичных белков могут быть доставлены субъекту в виде вакцины путем контактирования грамотрицательного бактериального штамма с эукариотическими клетками, например с живым животным in vivo, так что повторяющиеся домены гетерологичного белка или два или более доменов разных гетерологичных белков будут транслоцированы в живое животное, которое затем продуцирует антитела против повторяющихся доменов гетерологичного белка или двух или более доменов разных гетерологичных белков. Произведенные антитела могут быть непосредственно использованы или выделены и очищены и использованы в диагностике, в исследованиях, а также в терапии. В-клетки, продуцирующие антитела или содержащуюся в них ДНК-последовательность, могут быть использованы для дальнейшего получения специфических антител для использования в диагностике, в исследованиях, а также в терапии.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу доставки повторяющихся доменов гетерологичного белка или двух или более доменов различных гетерологичных белков, причем повторяющиеся домены гетерологичного белка или два или более доменов различных гетерологичных белков доставляются in vitro в эукариотическую клетку.

В следующем варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу доставки повторяющихся доменов гетерологичного белка или двух или более доменов различных гетерологичных

- 25 039922 белков, причем эукариотическая клетка принадлежит живому животному, и это живое животное контактирует с грамотрицательным бактериальным штаммом в vivo, так что слитый белок транслоцируется в это живое животное. Предпочтительным животным является млекопитающее, более предпочтительно человек.

В следующем варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает использование описанного выше рекомбинантного грамотрицательного бактериального штамма для высокопроизводительных скрининга ингибиторов для клеточного пути или события, вызванного транслоцированным гетерологичным белком(-ами).

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к библиотеке грамотрицательных бактериальных штаммов, в которой повторяющиеся домены гетерологичного белка или два или более доменов различных гетерологичных белков, кодируемые второй ДНК-последовательностью вектора экспрессии грамотрицательных бактериальных штаммов представлены собой доменами человеческого или мышиного белка, предпочтительно доменом человеческого белка, и причем каждый домен человеческого или мышиного белка, экспрессированного грамотрицательным бактериальным штаммом, отличается в аминокислотной последовательности. В качестве вектора клонирования для экспрессии можно использовать описанные выше экспрессирующие векторы.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к набору, содержащему описанный в настоящей заявке вектор и бактериальный штамм, экспрессирующий и секретирующий протеазу, способную расщеплять сайт расщепления протеазой в составе этого вектора. Конкретный используемый вектор представляет собой вектор для использования в сочетании с бактериальным штаммом для доставки желаемого белка в эукариотические клетки, как описано выше, причем указанный вектор содержит в направлении от 5' до 3': промотор;

первую последовательность ДНК, кодирующую сигнал доставки от бактериального T3SSэффектора, функционально связанного с указанным промотором;

а вторую последовательность ДНК, кодирующую повторяющиеся домены гетерологичного белка или два или более доменов различных гетерологичных белков, слитых в рамке с 3'-концом указанной первой последовательности ДНК, причем гетерологичные белки выбраны из группы, состоящей из белков, участвующих в апоптозе или регуляции апоптоза, регуляторов клеточного цикла, белков с анкириновым повтором, белков клеточной сигнализации, репортерных белков, транскрипционных факторов, протеаз, малых ГТФаз, связанных с GPCR белков, нанотел и конструкций слияния нанотел, бактериальных эффекторов T3SS, бактериальных эффекторов T4SS и вирусных белков.

Примеры

Пример 1.

А) Материалы и методы.

Бактериальные штаммы и условия роста. Штаммы, используемые в этом исследовании, приведены на фиг. 15A-N. Е. coli Top10, используемый для очистки и клонирования плазмид, и Е. coli Sm10 λ пир, используемый для конъюгации, а также Е. coli BW19610 [36], используемый для культивирования pKNG101, стандартно выращивали на чашках с агаром LB и в бульоне LB при 37°С. Для отбора векторов экспрессии применяли ампициллин в концентрации 200 мкг/мл (Yersinia) или 100 мкг/мл (Е. coli). Для отбора суицидных векторов применяли стрептомицин в концентрации 100 мкг/мл. Y. enterocolitica MRS40 [22], не устойчивый к ампициллину Е40-дериват [21] и полученные из них штаммы стандартно выращивались на сердечно-мозговом экстракте (BHI, Difco) при комнатной температуре. Ко всем штаммам Y. enterocolitica добавляли налидиксовую кислоту (35 мкг/мл), а всем штаммам Y. enterocolitica asd дополнительно добавляли 100 мкг/мл мезо-2,6-диаминопимелиновой кислоты (mDAP, Sigma Aldrich). S. enterica SL1344 обычно выращивали на чашках с агаром LB и в бульоне LB при 37°С. Для отбора векторов экспрессии в S. enterica применяли ампициллин в концентрации 100 мкг/мл.

Генетические манипуляции Y. enterocolitica. Ранее были описаны генетические манипуляции Y. enterocolitica [37, 38]. В кратком изложении, мутаторы для модификации или делеции генов в pYVплазмидах или на хромосоме были сконструированы с помощью 2-фрагментной ПЦР с перекрывающимися праймерами с использованием очищенной плазмиды pYV40 или геномной ДНК в качестве матрицы, что приводило к получению 200-250 п.н. фланкирующих последовательностей с обеих сторон удаленной или модифицированной части соответствующего гена. Полученные фрагменты клонировали в pKNG101 [33] в Е. coli BW19610 [36]. Плазмиды с верифицированной последовательностью трансформировали в Е. coli Sm10 λ pir, откуда плазмиды были мобилизованы в соответствующий штамм Y. enterocolitica. Мутанты, несущие интегрированный вектор, размножали в течение нескольких поколений без давления отбора. Затем использовали сахарозу для отбора клонов, которые потеряли вектор. Наконец, мутанты идентифицировали методом ПЦР для отбора колоний. Специфические мутаторы (pSi_408, pSi_419) перечислены в табл. III.

Конструирование плазмид. Для клонирования слитых белков с N-концевыми 138 аминокислотами YopE (SEQ ID NO: 2) использовали плазмиду pBad_Si2 или pBad_Si1 (фиг. 10). Плазмида pBad_Si2 была сконструирована путем клонирования фрагмента SycE-YopE1-₁₃₈, содержащего эндогенные промоторы

- 26 039922 для YopE и SycE из очищенного pYV40 в сайт KpnI/HindIII молекулы pBad-MycHisA (Invitrogen). Дополнительные модификации включают удаление фрагмента NcoI/BgIII pBad-MycHisA путем расщепления, обработки фрагмента Кленова и повторного лигирования. Двунаправленный транскрипционный терминатор (ВВа_В1006; фонд iGEM) клонировали в разрыв KpnI и обрабатывали фрагмент Кленова (pBad_Si2) или сайт разрыва BgIII (pBad_Si1). Далее на 3'-конце YopE₁.₁₃₈ добавляли следующие сайты расщепления: XbaI-XhoI-BstBI-(HindIII) (фиг. 10 В). pBad_Si1 аналогичен pBad_Si2, но кодирует EGFP, амплифицированный из pEGFP-C1 (Clontech) на сайте NcoI/BgIII под индуцибельным арабинозой промотором. Плазмиды pSi_266, pSi_267, pSi_268 и pSi_269, содержащие соответствующий эндогенный промотор и фрагмент SteA_1-20 (pSi_266), последовательность SteA полной длины (pSi_267), фрагмент SopE_1-81 (pSi_268) или фрагмент SopE_1-105 (pSi_269) амплифицировали из геномной ДНК S. enterica SL1344 и клонировали в сайт NcoI/KpnI молекулы pBad-MycHisA (Invitrogen).

Гены полной длины или их фрагменты амплифицировали специфическими праймерами, перечисленными в табл. I ниже, и клонировали в виде слияний с YopE_1-138 в плазмиду pBad_Si2 или в случае zBIM (SEQ iD NO: 21)- в pBad_Si1 (см. табл. II ниже). Для слияния с SteA или SopE синтетические ДНКконструкции расщепляли с помощью KpnI/HindII и клонировали в pSi_266, pSi_267, pSi_268 или pSi_269 соответственно. В случае генов бактериальных видов в качестве матрицы использовали очищенную геномную ДНК (S. flexneri M90T, Salmonella enterica подвид enterica serovar Typhimurium SL1344, Bartonella henselae ATCC 49882). Для человеческих генов использовалась универсальная кДНК-библиотека (Clontech), если не указано иное (фиг. 15A-N), гены данио были амплифицированы из библиотеки к ДНК (любезный подарок М. Аффольтера). Лигированные плазмиды клонировали в E.coli Top10. Последовательные плазмиды электропорировали в желаемый штамм Y. enterocolitica или S. enterica, используя настройки, как для стандартной электропорации Е. coli.

Таблица I. (Праймер Nr. Si_: Последовательность)

285: CATACCATGGGAGTGAGCAAGGGCGAG

286: GGAAGATCTttACTTGTACAGCTCGTCCAT

287: CGGGGTACCTCAACTAAATGACCGTGGTG

288: GTTAAAGCTTttcgaatctagactcgagCGTGGCGAACTGGTC

292: CAGTctcgagCAAATTCTAAACAAAATАСТТССAC

293: cagtTTCGAATTAATTTGTATTGCTTTGACGG

296: CAGTctcgagACTAACATAACACTATCCACCCAG

297: GTTAAAGCTTTCAGGAGGCATTCTGAAG

299: CAGTctcgagCAGGCCАТСAAGTGTGTG

00: cagtTTCGAATC ATTTTCTCTTCCTCTTCTTC A

301: CAGTctcgagGCTGCCATCCGGAA

302: cagtTTCGAATCACAAGACAAGGCACCC

306: GTT AAAGCTTGGAGGC ATTCTGAAGatacttatt

07: CAGTctcgagCAAATACAGAGCTTCTАТСACTCAG

308: GTT AAAGCTTTC AAGATGTGATT AATGAAGAAATG

317: cagtTTCGAACCCATAAAAAAGCCCTGTC

- 27 039922

318: GTTAAAGCTTCTACTCTATCATCAAACGATAAAATGg

324: CAGTctcgagTTCACTCAAGAAACGCAAA

339: cagtTTCGAATTTTCTCTTCCTCTTCTTCAcg

341: cgtaTCTAGAAAAATGATGAAAATGGAGACTG

342: GTTAAAGCTTttaGCTGGAGACGGTGAC

346: CAGTctcgagTTCCAGATCCCAGAGTTTG

347: GTTAAAGCTTTCACTGGGAGGGGG

351: CAGTctcgagctcgagTTATCTACTCATAGAAACTACTTTTGCAG

52: cgcGGATCCtcagtgtctctgcggcatta

353: CATTTATTCCTCCTAGTTAGTCAcagcaactgctgctcctttc

54: gaaaggagcagcagttgctgTGACTAACTAGGAGGAATAAATG

355: cgattcacggattgctttctCATTATTCCCTCCAGGTACTA

356: TAGTACCTGGAGGGAATAATGagaaagcaatccgtgaatcg

5 7: cgtaTCT AGAcggctttaagtgcgacattc

364: cgtaTCTAGACTAAAGTATGAGGAGAGAAAATTGAA

365: GTTAAAGCTTTCAGCTTGCCGTCGT

367: CGTAtctagaGACCCGTTCCTGGTGC

369: cgtaTCTAGAccccccaagaagaagc

373: GTTAAAGCTTGCTGGAGACGGTGACC

86: CGT AtctagaTC AGGACGCTTCGGAGGTAG

87: CGT AtctagaATGGACTGTGAGGTC AAC AA

389: CGTAtctagaGGCAACCGCAGCA

391: GTTAAAGCTTTCAGTCCATCCCATTTCTg

403: CGTAtctagatctggaatatccctggaca

406: GTTAA AGCTTgtctgtctcaatgccacagt

410: CAGTctcgagATGTCCGGGGTGGTg

413: cagtTTCGAATCACTGCAGCATGATGTC

417: CAGTctcgagAGTGGTGTTGATGATGACATG

420: cagtTTCGAATTAGTGATAAAAATAGAGTTCTTTTGTGAG

423: CAGTctcgagATGCACATAACTAATTTGGGATT

424: cagtTTCGAATTATACAAATGACGAATACCCTTT

425: GTTAAAGCTTttacaccttgcgcttcttcttgggcggGCTGGAGACGGTGAC

428: CGTAtctagaATGGACTTCAACAGGAACTTT

- 28 039922

429: CGTAtctagaGGACATAGTCCACCAGCG

430: GTT AAAGCTTTC AGTTGGATCCGAAAAAC

433: CGTAtctagaGAATTAAAAAAAACACTCATCCCA

434: CGTAtctagaCCAAAGGCAAAAGCAAAAA

435: GTTAAAGCTTTTAGCTAGCCATGGCAAGC

436: CGTAtctagaATGCCCCGCCCC

437: GTTAAAGCTTCTACCCACCGTACTCGTCAAT

8: CGT AtctagaATGTCTGAC ACGTCC AGAGAG

9: GTT AAAGCTTTC ATCTTCTTCGCAGGAAAAAG

445: cgcGGATCCttatgggttctcacagcaaaa

446: СATTTATTCCTCC TAGTTAGTCAaggcaacagccaatcaagag

447: ctcttgattggctgttgcctTGACTAACTAGGAGGAATAAATG

448: ttgattgcagtgacatggtgCATTАТТСССТСCAGGTACTA

449: TAGTACCTGGAGGGAATAATGcaccatgtcactgcaatcaa

450: cgtaTCTAGAtagccgcagatgttggtatg

451: CGTAtctagaGATCAAGTCCAACTGGTGG

463: CAGTctcgaggaaagcttgtttaaggggc

464: cagtTTCGAAttagcgacggcgacg

476: GTTAAAGCTTttACTTGTACAGCTCGTCCAT

477: CGTAtctagaGTGAGCAAGGGCGAG

478: CAGTctcgagATGGAAGATTATACCAAAATAGAGAAA

479: GTTAAAGCTTCTACATCTTCTTAATCTGATTGTCCa

482: CGTAtctagaATGGCGCTGCAGCt

483: GTT AAAGCTTTC AGTC ATTGACAGGAATTTTg

486: CGTAtctagaATGGAGCCGGCGGCG

487: GTT AAAGCTTTC AATCGGGGATGTCTg

492: CGT AtctagaATGCGCGAGGAGAAC AAGGG

493: GTTAAAGCTTTCAGTCCCCTGTGGCTGTGc

494: CGTAtctagaATGGCCGAGCCTTG

495: GTTAAAGCTTttaTTGAAGATTTGTGGCTCC

504:CGTAtctagaGAAAATCTGTATTTTCAAAGTGAAAATCTGTATTTTCAAA

GTATGCCCCGCCCC

505: GTTAAAGCTTCCCACCGTACTCGTCAATtc

- 29 039922

508:CGTAtctagaGAAAATCTGTATTTTCAAAGTGAAAATCTGTATTTTCAAA GTATGGCCGAGCCTTG

509: GTTAAAGCTTTTGAAGATTTGTGGCTCCc

511 : CGT AtctagaGAAAATCTGTATTTTC AAAGTGAAAATCTGT ATTTTC AAA GTGTGAGCAAGGGCGAG

512: CGT AtctagaGAAAATCTGTATTTTC AAAGTGAAAATCTGT ATTTTC AAA GTCCGCCGAAAAAAAAACGTAAAGTTGTGAGCAAGGGCGAG

513 :GTTAAAGCTTttAAACTTTACGTTTTTTTTTCGGCGGCTTGTACAGCTCG TCCAT

515: CGT AtctagaGAAAATCTGTATTTTC AAAGTGAAAATCTGT ATTTTC AAA GTGATTATAAAGATGATGATGATAAAATGGCCGAGCCTTG

5 8: CGTATCTAGAATGACCAGTTTTGAAGATGC

5 9: GTTAAAGCTTTCATGACTC ATTTTC ATCC AT

561:CGTATCTAGAATGAGTCTCTTAAACTGTGAGAACAG

562:GTTAAAGCTTCTACACCCCCGCATCA

580: catgccatggATTTATGGTCATAGATATGACCTC

585: CAGTctcgagATGCAGATCTTCGTCAAGAC

586: GTTAAAGCTTgctagcttcgaaACCACCACGTAGACGTAAGAC

588: cagtTTCGAAGATTATAAAGATGATGATGATAAAATGGCCGAGCCTTG

612: CGGGGTACCatgaggtagcttatttcctgataaag

613: CGGGGTACCataattgtccaaatagttatggtagc

614: catgccatggCGGCAAGGCTCCTC

615: cggggtaccTTTATTTGTCAACACTGCCC

616: cggggtaccTGCGGGGTCTTTACTCG

677:TTACTATTCGAAGAAATTATTCATAATATTGCCCGCCATCTGGCCCAA

ATTGGTGATGAAATGGATCATTAAGCTTGGAGTA

678:TACTCCAAGCTTAATGATCCATTTCATCACCAATTTGGGCCAGATGGC

GGGCAATATTATGAATAATTTCTTCGAATAGTAA

682:TTACTACTCGAGAAAAAACTGAGCGAATGTCTGCGCCGCATTGGTGAT

GAACTGGATAGCTAAGCTTGGAGTA

683: TACTCCAAGCTTAGCT ATCC AGTTC АТС ACC AATGCGGCGCAGAC ATT CGCTCAGTTTTTTCTCGAGTAGTAA

725: TTACTATTCGAAGAAATTATTCATAATATTGCC

726:

TACTCCAAGCTTACGGTTGAATATTATGATCCATTTCATCACCAATTTGG

727:

TTACTATTCGAAGCCGGTGGTGCCGAAGAAATTATTCATAATATTGCCC

728: TACTCC AAGCTTAATGATCC АТТТС АТС A

733:TTACTACTCGAGGGTGCCATCGATGCCGAAGAAATTATTCATAATATT

GCCCG

734:TACTCCTTCGAAGGCACCATGATCCATTTCATCACCAATTTGG

735:TACTCCTTCGAATTAATGATCCATTTCATCACCAATTTG

736:TTACTACTCGAGGGTGCCATCGATGCCAAAAAACTGAGCGAATGTCT

GCG

737: TACTCCTTCGAAGGC ACCGCT ATCC AGTTC АТС ACC AATG

738:TACTCCTTCGAATTAGCTATCCAGTTCATCACCAATG

- 30 039922

Таблица II. Клонированные слитые белки

Белок, который должен быть доставлен T3SS	Seq. ID. No. белка	Основная плазмида	Итоговое название плазмиды	Праймеры. Si Nr.:	Seq. ID. No. праймера
YopEl-138-MycHis	3	pBad-	pBad Si 1	285/286
		MycHis A		(EGFP),
		(Invitrogen)		287/288 (sycE-	44/45 и
				YopEl-138)	46/47
YopEl-138-MycHis	3	pBad-	pBad Si 2
		MycHis A		287/288 (sycE-
		(Invitrogen)		YopEl-138)	46/47
YopEl-138-IpgBl	4	pBad_Si_2	pSi_16	292/293	48/49
YopEl-138-SopE	5	pBad_Si_2	pSi 20	296/297	50/51
YopEl-138-Racl		pBad Si 2	pSi 22
Q61L	26			299/300	52/53
YopEl-138-RhoA		pBad Si 2	pSi_24
Q61E	27			301/302	54/55
YopEl-138-SopE-		pBad Si 2
MycHis	135		pSi 28	296/306	50/56
YopEl-138-SopB	6	pBad_Si_2	pSi 30	307/308	57/58
YopEl-138-FADD	28	pBad_Si_2	pSi 37	367/386	76/79
YopEl-138-OspF	7	pBad_Si_2	pSi 38	317/318	59/60
YopEl-138-BepG		pBad Si 2
715-end	136		pSi 43	324/351	61/67
YopEl-138-Racl		pBad Si 2	pSi 51
Q61L-MycHis	137			299/339	52/62
YopEl-138-Slmbl-	32	pBad_Si_2	pSi 53	341/342	63/64
VhH4
YopEl-138-Bad	29	pBad_Si_2	pSi 57	346/347	65/66
YopEl-138-SptP	8	pBad_Si_2	pSi 64	364/365	74/75
YopEl-138-NLS-		pBad Si 2
Slmbl-VhH4	33		pSi 70	369/342	77/64
YopEl-138-Bid	24	pBad_Si_2	pSi 85	387/391	80/82
YopEl-138-t-Bid	25	pBad_Si_2	pSi 87	389/391	81/82
Y opE 1-13 8 -каспаза		pBad Si 2
3 pl7	22		pSi 97	403/406	83/84
YopEl-138-GPCR		pBad Si 2
GNA12	30		pSi 103	410/413	85/86
Y opE 1-13 8 -каспаза		pBad Si 2
3 plO/12	23		pSi 106	417/420	87/88
YopEl-138-IpgD	9	pBad_Si_2	pSi 111	423/424	89/90
YopEl-138-Slmbl-		pBad Si 2
VhH4-NLS	34		pSi 112	341/425	63/91
YopEl-138-z-Bid	19	pBad_Si_2	pSi 116	428/430	92/94
YopEl-138-z-t-Bid	20	pBad_Si_2	pSi 117	429/430	93/94
YopEl-138-BepA		pBad_Si_2
E305-end	11		pSi 118	433/435	95/97
YopEl-138-BepA	10	pBad_Si_2	pSi 119	434/435	96/97
YopEl-138-ETl	36	pBad_Si_2	pSi 120	436/437	98/99
YopEl-138-z-BIM	21	pbadSil	pSi 121	438/439	100/101
YopEl-138-VhH4		pBad_Si_2
нанотело,
распознающее
EGFP	31		pSi 124	451/373	108/78
YopEl-138-TEV		pBad_Si_2
протеаза S219V	42		pSi 132	463/464	109/110
YopEl-138-EGFP	37	pBad_Si_2	pSi 140	477/476	112/111
YopEl-138-Cdkl	14	pBad_Si_2	pSi 143	478/479	113/114
YopEl-138-Mad2	15	pBad_Si_2	pSi 145	482/483	115/116
YopEl-138-Ink4A	16	pBad_Si_2	pSi 147	486/487	117/118
YopEl-138-Ink4B	17	pBad_Si_2	pSi 150	492/493	119/120
YopEl-138-Ink4C	18	pBad_Si_2	pSi 151	494/495	121/122
YopEl-138-TIFA	13	pBad_Si_2	pSi 153	558/559	131/132
YopEl-138-2x		pBad Si 2
ТЕУсайт - ET1	41		pSi 156	504/505	123/124
YopEl-138-		pBad Si 2
2хТЕУсайт - EGFP
-NLS	39		pSi 159	511/513	127/129
YopEl-138-		pBad Si 2
2хТЕУсайт - NLS -
EGFP	38		pSi 160	512/476	128/111
YopEl-138-2x		pBad Si 2
ТЕУсайт - INK4C	40		pSi 161	508/509	125/126
YopEl-138-2x	43	pBad_Si_2	pSi 164	515/509	130/126

- 31 039922

ТЕУсайт - Flag INK4C
YopEl-138мышиный Traf6	12	pBad_Si_2	pSi 166	561/562	133/134
ΥορΕ1-138-Υ. enterocolitica, КОДОНоптимизированный мышиный tBid, ВНЗ часть	138	pBad_Si_2	pSi 318	677/678	148/149
ΥορΕ1-138-Υ. enterocolitica, кодоноптимизированный мышиный Вах, ВНЗ часть	139	pBad_Si_2	pSi 322	682/683	150/151
SteAl-20	140	pBadMycHisA (Invitrogen)	pSi 266	580/612	152/153
SteA	141	pBadMycHisA (Invitrogen)	pSi 267	580/613	152/154
SopE 1-81	142	pBadMycHisA (Invitrogen)	pSi 268	614/615	155/156
SopEl-105	143	pBadMycHisA (Invitrogen)	pSi 269	614/616	155/157
SteAl-20-S. enterica кодоноптимизированный мышиный tBid	144	pSi 266	pSi 270	синтетическая конструкция	/
SteA-S. enterica КОДОНоптимизированный мышиный tBid	145	pSi_267	pSi 271	синтетическая конструкция	/
SopEl-81-S. enterica кодоноптимизированный мышиный tBid	146	pSi_268	pSi 272	синтетическая конструкция	/
SopEl-105-S. enterica кодоноптимизированный мышиный tBid	147	pSi_269	pSi 273	синтетическая конструкция	/
ΥορΕ1-138-Υ. enterocolitica кодон- оптимизированный мышиный Ink4A 84-103	158	pBad_Si_2	pSi 362	745/746	172/173

- 32 039922

ΥορΕ1-138-Υ. enterocolitica кодоноптимизированный P107/RBL1 657662 (ААА02489.1)	159	pBad_Si_2	pSi 363	747/748	174/175
ΥορΕ1-138-Υ. enterocolitica кодоноптимизированный р21 141-160 (ААН13967.1)	160	pBad_Si_2	pSi 364	749/750	176/177
YopEl-138-Y. enterocolitica кодоноптимизированный р21 145-160 (ААН13967.1)	161	pBad_Si_2	pSi 366	753/754	178/179
YopEl-138-Y. enterocolitica кодоноптимизированный р21 17-33 (ААН13967.1)	162	pBad_Si_2	pSi 367	755/756	180/181
YopEl-138-Y. enterocolitica кодоноптимизированный циклинО2 139-147 (САА48493.1)	163	pBad_Si_2	pSi 368	757/758	182/183
Ste A-Ink4a-MycHi s	164	pSi_267	pSi 333	703/704	184/185
SopEl-105-Ink4a- MycHis	165	pSi_269	pSi 334	703/704	184/185
Ste A-Ink4c-MycHi s	166	pSi_267	pSi 335	PCR1: 705/706; PCR2: 707/708; ПЦР c перекрыв, праймерами: 705/708	186/187, 188/189
SopEl-105-Ink4cMycHis	167	pSi_269	pSi 336	PCR1: 705/706; PCR2: 707/708; ПЦР с перекрыв, праймерами: 705/708	186/187, 188/189
SteA-Mad2-MycHis	168	pSi_267	pSi 337	709/710	190/191
SopEl-105-Mad2MycHis	169	pSi_269	pSi 338	709/710	190/191
SteA-Cdkl-MycHis	170	pSi_267	pSi 339	711/712	192/193

- 33 039922

SopEl-105-CdklMycHis	171	pSi_269	pSi 340	711/712	192/193
YopEl-138-Y. enterocolitica КОДОНоптимизированный мышиный tBid	194	pBad_Si_2	pSi 315	синтетическая конструкция	/
YopEl-138убиквитин	195	pBad_Si_2	pSi 236	585/586	197/198
YopEl-138убиквитин-FlagINK4C-MycHis	196	pSi_236	pSi 237 II	588/509	199/126
YopEl-138-(Y. enterocolitica КОДОНоптимизированный мышиный tBid ВНЗ часть) готовый для инсерции дополнительных доменов	200	pBad_Si_2	pSi 357	733/735	204/205
ΥορΕ1-138-(Υ. enterocolitica кодон- оптимизированный мышиный ВАХ ВНЗ часть) готовый для инсерции дополнительных доменов	201	pBad_Si_2	pSi 358	736/738	206/207
ΥορΕ1-138-(Υ. enterocolitica кодон- оптимизированный мышиный tBid ВНЗ часть)₂	202	pSi_357	pSi 371	733/734	204/208
ΥορΕ1-(138-Υ. enterocolitica кодон- оптимизированный мышиный tBid ВНЗ часть - Y. enterocolitica кодон- оптимизированный мышиный ВАХ ВНЗ part ΥθρΕΐ-138- кодон-	203 209	pSi_358 pBad_Si_2	pSi_373 pSi_353	733/734 725/726	204/208 212/213
оптимизированный мышиный tBid, ВНЗ расширенная часть
ΥορΕι-138-Ю Аа linker - Y. enterocolitica кодоноптимизированный мышиный tBid ВНЗ часть	210	pBad_Si_2	pSi_354	727/728	214/215
ΥορΕ1-(138-Υ. enterocolitica кодон- оптимизированный мышиный Вах, ВНЗ часть - Y. enterocolitica кодоноптимизированный мышиный tBid, ВНЗ часть	211	pSI_357	pSi_374	736/737	206/216

- 34 039922

Таблица III. Мутаторы для генетической модификации

Мутатор/к онструкци я	Вставл яется в:	Основная плазмида	Итоговое название плазмиды	Праймер biSiNr.:	Праймеры Seq.Id No.	использует ся с родительс КИМ штаммом
YopEl-138tBID ВНЗ	pYV	pKNGlOl	pSi_408	Синтетич еский ген	/	/
ΥθρΕΐ-138(tBID ВНЗ)₂	pYV	pKNGlOl	pSi_419	Синтетич еский ген	/	Штамм, мутированн ый с pSi_408

Секреция Yop. Индукцию уор-регулона проводили путем сдвига культивирования до 37°С в BHIОх (пермиссивные условия) [39]. В качестве источника углерода добавляли глюкозу (4 мг/мл).

Совокупность фракций клеток и супернатантов разделяли центрифугированием при 20800 g в течение 10 мин при 4°С. В качестве суммарной клеточной фракции брали сгусток клеток. Белки в супернатанте осаждали 10 мас./об.% трихлоруксусной кислотой в течение 1 ч при 4°С. После центрифугирования (20 800 г в течение 15 мин) и удаления супернатанта полученный осадок промывали в ледяном ацетоне в течение ночи. Образцы снова центрифугировали, супернатант сливали и осадок высушивали на воздухе и ресуспендировали в 1 х ДСН-красителе для загрузки.

Секретируемые белки анализировали с помощью ДСН-ПААГ; в каждом случае загружали на трек белки, секретируемые 3х10⁸ бактериями. Обнаружение специфических секретируемых белков методом иммуноблоттинга проводили с использованием 12,5% гелей ДСН-ПААГ. Для детектирования белков в общей массе клеток загружали 2х10⁸ бактерий на трек, если не указано иное, и перед обнаружением методом иммуноблоттинга белки разделяли на 12,5% ДСН-ПААГ гелях.

Иммуноблоттинг проводили с использованием моноклональных антител крыс против YopE (MIPA193-13A9, 1:1000, [40]). Антисыворотку предварительно дважды абсобировали в течение ночи в отношении Y. enterocolitica AHOPEMT asd для уменьшения фонового окрашивания. Детектирование проводили с использованием вторичных антител, направленных против антител крыс и конъюгированных с пероксидазой хрена (1:5000, Southern biotech), перед проявкой хемилюминесцентным субстратом ECL (LumiGlo, KPM).

Культура клеток и инфицирование. HeLa Ccl2, фибробласты swiss 3T3, 4Т1, B16F10 и D2A1 культивировали в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% FCS (эмбриональная телячья сыворотка) и 2 мМ L-глутамина (cDMEM). Клетки HUVEC выделяли и культивировали, как описано в [41]. Клетки Jurkat и 4Т1 культивировали в RPMI 1640 с добавлением 10% FCS и 2 мМ L-глутамина. Y. enterocolitica выращивали в BHI (сердечно-мозговой экстракт) с добавками в течение ночи при комнатной температуре, разбавляли свежим BHI до OD₆₀₀=0,2 и выращивали в течение 2 ч при комнатной температуре, с последующим температурным сдвигом в шейкере с водяной баней при 37°С в течение еще 30 мин или в течение 1 ч в случае доставки EGFP. Наконец, бактерии собирали центрифугированием (6000 rcf, 30 с) и промывали один раз DMEM, с добавками 10 мМ HEPES и 2 мМ L-глутамина. S. enterica выращивали в LB с добавками в течение ночи при 37°С и разбавляли 1:40 в свежем LB и выращивали в течение 2,5 ч при 37°С (условия для индукции SpiI T3SS) или культуру после ночи дополнительно инкубировали при 37°С (условия для индукции Spill T3SS). Наконец, бактерии собирали центрифугированием (6000 rcf, 30 с) и промывали один раз DMEM с добавками 10 мМ HEPES и 2 мМ L-глутамина. Клетки, высеянные в 96-луночные (для иммунофлуоресценции) или 6-луночные (для вестерн-блоттинга) плашшеты, инфицировали при указанных MOI (множественность инфицирования) в DMEM с добавками 10 мМ HEPES и 2 мМ L-глутамина. После добавления бактерий планшеты центрифугировали в течение 1 мин при 1750 об/мин и помещали при 37°С в течение указанных периодов времени. Внеклеточные бактерии были убиты гентамицином (100 мг/мл), в указанных случаях. Для иммунофлуоресцентного метода анализы инфекционности останавливали фиксацией 4% PFA. Для Вестерн-блоттинга клетки дважды промывали ледяным PBS и добавляли буфер PhosphoSafe (Novagen) для лизиса клеток. После инкубации на льду клетки центрифугировали (16 000 rcf, 25 мин, 4°С). Супернатанты собирали и анализировали на общее содержание белка методом Брэдфорда ВСА (Pierce) перед ДСН-ПААГ и вестерн-блоттингом с использованием антител к Phospho-Akt (Ser473 и Т308, оба - Cell Signaling), к актину (Millipore), к Bid (Cell Signal), к Мус (Santa Cruz), к р38 (Cell Signaling), к Phospho-p-38 (Thrl80/Tyr182, Cell Signaling), к каспазе-3 р17 (Cell Signaling) и к Ink4C (Cell Signaling).

Анализ секреции с S. enterica. Для индукции секреции белка штаммом S. Enterica, бактерии S. enterica культивировали в течение ночи в LB, содержащем 0,3 М NaCl на орбитальном шейкере (на 150 об/мин). Затем S. enterica разбавляли 1:50 в свежем LB, содержащем 0,3 М NaCl, и выращивали в течение 4 ч при 37°С без встряхивания.

- 35 039922

Совокупность фракций клеток и супернатантов разделяли центрифугированием при 20800 g в течение 10 мин при 4°С. В качестве суммарной клеточной фракции брали сгусток клеток. Белки в супернатанте осаждали 10 мас./об.% трихлоруксусной кислотой в течение 1 ч при 4°С. После центрифугирования (20800 г в течение 15 мин) и удаления супернатанта полученный осадок промывали в ледяном ацетоне в течение ночи. Образцы снова центрифугировали, супернатант сливали и осадок высушивали на воздухе и ресуспендировали в 1хДСН- красителе.

Секретируемые белки анализировали с помощью ДСН-ПААГ; в каждом случае загружали на трек белки, секретируемые 3х10⁸ бактериями. Обнаружение специфических секретируемых белков методом иммуноблоттинга проводили с использованием 12,5% гелей ДСН-ПААГ. Для детектирования белков в общей массе клеток загружали 2х10⁸ бактерий на трек, если не указано иное, и перед обнаружением методом иммуноблоттинга белки разделяли на 12,5% ДСН-ПААГ гелях. Иммуноблоттинг проводили с использованием антител к Мус (Santa Cruz).

Вестерн-блоттинг транспонированных белков T3SS из инфицированных клеток. Клетки HeLa в 6луночных планшетах инфицировали при MOI 100, как описано выше. В случае коинфицирования штаммом Y. enterocolitica с транслокацинй TEV-протеазы, устанавливали OD₆₀₀ штаммов, и две бактериальные суспензии смешивали в пробирке в соотношении 1:1 (если не указано иное) перед добавлением в клетки. По окончании инфицирования клетки дважды промывали ледяным PBS и собирали соскребанием в небольшом объеме ледяного PBS. После центрифугирования (16000 rcf, 5 мин, 4°С) осадок растворяли в 0,002% дигитонине, с добавкой коктейля ингибиторов протеазы (Roche complete, Roche). Растворенный осадок инкубировали в течение 5 мин на льду и затем центрифугировали (16 000 rcf, 25 мин, 4°С). Супернатанты собирали и анализировали на общее содержание белка методом Брэдфорда ВСА (Pierce) перед ДСН-ПААГ и вестерн-блоттингом с использованием антитела к Мус (Santa Cruz, 9E11) или к Ink4C (Cell Signaling).

Иммунофлуоресценция. Клетки, высеянные в 96-луночные планшеты (Corning), инфицировали, как описано выше, и после фиксации 4% PFA трижды промывали PBS. Затем лунки блокировали, используя 5% козьей сыворотки в PBS 0,3% Triton X-100 в течение 1 ч при комнатной температуре. Первичное антитело (анти-Мус, Santa Cruz, 1:100) разбавляли в PBS 1% BSA и 0,3% Triton Х-100 и клетки инкубировали в течение ночи при 4°С. Клетки промывали 4 раза PBS перед добавлением вторичного антитела (антимышиные AF 488, Life technologies, 1:250), разбавленного в PBS 1% BSA и 0,3% Triton X-100. При необходимости добавляли окрашивание ДНК красителем Hoechst (Life technologies, 1:2500) и/или окрашивание актином (Dy647-Phalloidin, DyeOmics). В некоторых случаях непосредственно после промывки PFA применяли только окрашивание ДНК и/или актином. Клетки инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре, три раза промывали PBS и анализировали с помощью автоматического анализа изображений, как описано ниже.

Автоматизированная микроскопия и анализ изображений. Изображения регистрировали автоматически с помощью системы ImageXpress Micro (Molecular devices, Саннивейл, США). Количественную оценку интенсивности окрашивания анти-Мус проводили с использованием MetaXpress (Molecular devices, Саннивейл, США). Области внутри клеток, исключая области ядер и области, содержащие бактерии, выбирали вручную (кружки с площадью 40 пикселей) и регистрировали среднюю интенсивность.

Стимуляция TNFa и вестерн-блоттинг Phospho-p38. Клетки HeLa, засеянные в 6-луночных планшетах, инфицировали с MOI100, как описано выше. Через 30 мин после инфицирования добавляли гентамицин и через 45 мин после инфицирования добавляли TNFa (10 нг/мл). Через 1 ч 15 мин после инфицирования клетки дважды промывали ледяным PBS и добавляли буфер PhosphoSafe (Novagen) для лизиса клеток. После инкубации на льду клетки центрифугировали (16 000 rcf, 25 мин, 4°С). Супернатанты собирали и анализировали на общее содержание белка методом Брэдфорда ВСА (Pierce) перед ДСН-ПААГ и вестерн-блоттингом с использованием антител к Phospho-р38, total p38 (Cell Signaling) и антитела к актину (Millipore).

Определение уровня цАМФ инфицированных клеток HeLa. Клетки HeLa, засеянные в 96-луночные планшеты, инфицировали, как описано выше. За 30 мин до инфицирования cDMEM заменяли на DMEM с добавлением 10 мМ HEPES и 2 мМ L-глутамина и 100 мкМ 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX, Sigma Aldrich). Через 60 мин после инфицирования добавляли гентамицин и клетки дополнительно инкубировали при 37°С еще 90 мин. Определение цАМФ проводили методом конкурентного ИФА в соответствии с инструкциями производителя (Amersham, cAMP Biotrak, RPN225). В качестве положительного контроля добавляли указанное количество холерного токсина (С8052, Sigma Aldrich) в течение 1 ч к клеткам в DMEM с добавлением 10 мМ HEPES и 2 мМ L-глутамина и 100 мкМ IBMX.

Инфицирование эмбрионов рыбок данио, визуализация и автоматизированная количественная оценка изображений. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с утвержденными правилами. Рыбки данио содержались в стандартных условиях [42]. Эмбрионы были стадированы по часам после оплодотворения (hpf) при 28,5°С [43]. В исследовании использовались следующие линии рыбок данио: рыбка дикого типа (АВ/EK и EK/TL). Протокол инфицирования соответствовал рекомендациям, приведенным в [44]. Эмбрионы 12 hpf содержались в среде E3, содержащей 0,2 мМ N

- 36 039922 фенилтиомочевины (PTU), чтобы предотвратить образование пигмента. Эмбрионы возрастом 2 дня после оплодотворения (dpf) анестезировали 0,2 мг/мл трикаина и выкладывали на 1% агаровых пластинах в E3 с помощью инструмента из волосяной петли [44]. Y. enterocolitica выращивали в BHI с добавлением 0,4% арабинозы и антибиотиков и mDap в течение ночи при комнатной температуре, разбавляли в свежем BHI с 0,5% арабинозой и другими добавками до OD₆₀₀=0,2 и выращивали в течение 2 ч при комнатной температуре с последующим температурным сдвигом до 37°С в течение 45 мин. Наконец, бактерии собирали центрифугированием (6000 rcf, 30 с) и один раз промывали PBS. OD₆₀₀ был установлен равным 2 в PBS, содержащем mDAP. 1-2 нл этой суспензии вводили в задний мозг выровненных на пластинах эмбрионов рыбок данио с использованием микроинъектора Femtojet (Eppendorf) с помощью капилляров FemtoTips II (Eppendorf), с наконечником иглы, обломанным тонким пинцетом. Время инъекции устанавливали на 0,2 с, а давление компенсации до 15 гПа (Eppendorf, Femtojet) и давление инъекции устанавливали от 600 до 800 гПа. Размер капли и, таким образом, инокулят контролировали с помощью микроскопии и контрольного посева. После микроинъекции рыбок собирали в среде E3, содержащем трикаин и PTU, и инкубировали в течение 30 мин при 37°С, затем еще 5 ч при 28°С. Для наблюдения за флуоресценцией бактериального EGFP через 1 ч после инфицирования в заднем мозге рыбок данио использовали флуоресцентный бинокулярный микроскоп (Leica), и эмбрионы с некачественной инъекцией отбрасывали. По окончании инфицирования рыбок фиксировали 2% ледяным PFA в течение 1 ч на льду и далее свежей ледяной PFA в течение ночи при 4°С. Окрашивание антител осуществляли, как описано ранее [45, 46]. В кратком изложении, эмбрионы промывали 4 раза PBS 0,1% Tween по 5 мин и пермеабилизировали PBS-T+0,5% Triton Х-100 в течение 30 мин при комнатной температуре. Эмбрионы блокировали в блокирующем растворе (PBS 0,1% Tween 0,1% TritonX-100, 5% козьей сыворотки и 1% BSA) при 4°С в течение ночи. Антитело (расщепляющая каспаза-3 (Asp 175), Cell Signaling) разбавляли 1:100 в блокирующем растворе и инкубировали на шейкере при 4°С в темноте. Рыбок промывали 7 раз PBS 0,1% Tween в течение 30 мин, затем добавляли вторичное антитело (козье антитело против кролика AF647, Invitrogen, 1:500), разбавленном в блокирующем растворе, и инкубировали при 4°С в течение ночи. Личинок промывали PBS 0,1% Tween четыре раза 30 мин при 4°С и один раз в течение ночи и дополнительно промывали 3-4 раза. Изображения выполняли через конфокальный микроскоп Leica TCS SP5 с использованием 40х водноиммерсионного объектива. Изображения анализировали с использованием программ Imaris (Bitplane) и Image J (http ://imagej.nih.gov/ij/).

Анализ изображения (n=14 для pBad_Si2 или n=19 для z-BIM) выполняли с помощью программы CellProfiler [47] на Z-проекциях максимальной интенсивности записанных изображений срезов по оси Z. В кратком изложении, бактерии детектировали через канал EGFP. Вокруг каждой области бактериального пятна создавали кружок радиусом 10 пикселей. Перекрывающиеся области были разделены поровну между контактирующими элементами. В областях, близко окружающих бактерии, измеряли интенсивность окрашивания каспазой-3 р17.

Подготовка образца для фосфопротеомики. Для каждого набора условий выращивали два 6луночных планшета клеток HeLa CCL-2 до слияния. Клетки инфицировали в течение 30 мин, как описано выше. В указанные моменты времени планшеты помещали на лед и дважды промывали ледяным PBS. Затем образцы собирали в растворе мочевины (мочевина 8 М (AppliChem), бикарбоната аммония 0,1 М (Sigma), 0,1% RapiGest (Waters), 1х PhosSTOP (Roche)). Далее, в кратком изложении, образцы перемешивали на вортексе, обрабатывали ультразвуком при 4°С (Hielscher), перемешивали в течение 5 мин на термомиксере (Эппендорф) и центрифугировали в течение 20 мин при 4°С и 16000 g. Супернатанты собирали и хранили при -80°С для дальнейшей обработки. Для измерения концентрации белка использовали анализ белка ВСА (Pierce).

Фосфопептидное обогащение. Дисульфидные связи восстанавливали трис(2карбоксиуказанныел)фосфином при конечной концентрации 10 мМ при 37°С в течение 1 ч. Свободные тиолы алкилировали 20 мМ иодацетамидом (Sigma) при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте. Избыток иодацетамида гасили N-ацетилцистеином при конечной концентрации 25 мМ в течение 10 мин при комнатной температуре. Добавляли эндопептидазу Lys-C (Wako) до получения окончательного соотношения фермент/белок 1:200 мас./мас. и инкубировали в течение 4 ч при 37°С. Затем раствор разбавляли 0,1 М бикарбонатом аммония (Sigma) до конечной концентрации ниже 2 М мочевины и расщепляли в течение ночи при 37°С модифицированным трипсином (Promega) чистоты для секвенирования при отношении белка к ферменту 50:1. Пептиды обессоливали на картридже С18 Sep-Pak (Waters) и сушили под вакуумом. Фосфопептиды выделяли из 2 мг общей массы пептида с помощью TiO₂, как описано ранее [48]. В кратком изложении, сухие пептиды растворяли в растворе 80% ацетонитрила (ACN)2,5% трифторуксусной кислоты (TFA), насыщенного фталевой кислотой. Пептиды добавляли к равному количеству уравновешенного TiO₂ (гранулы размером 5 мкм, GL Sciences) в блокированной вращаемой колонке Mobicol (MoBiTec), которую инкубировали в течение 30 мин с вращением с донышка на крышку. Колонку дважды промывали насыщенным раствором фталевой кислоты, дважды 80% ACN и 0,1% TFA, и, наконец, дважды 0,1% TFA. Пептиды элюировали с 0,3 М раствором NH₄OH. Величину рН элюатов корректировали до уровня ниже 2,5 с помощью 5% раствора TFA и 2 М HCl. Фосфопептиды

- 37 039922 снова обессоливали с помощью микроспиновых картриджей С18 (Harvard Apparatus).

Анализ методом жидкостной хроматографии/тандемной масс-спектрометрии. Хроматографическое разделение пептидов проводили с использованием нано-ЖХ системы EASY (Thermo Fisher Scientific), оборудованной колонкой ОФ-ВЭЖХ с подогревом (75 мкмх45 см), наполняемой внутри лаборатории смолой С18 с размером частиц 1,8 мкм (Reprosil-AQ Pur, Dr. Maisch). Аликвоты 1 мкг общего образца фосфопептида анализировали в установке ЖХ-МС/МС с использованием линейного градиента в диапазоне от 98% растворителя А (0,15% муравьиной кислоты) и 2%-ного растворителя В (98% ацетонитрила, 2% воды, 0,15% муравьиной кислоты) до 30% растворителя В в течение 120 мин при величине расхода 200 нл/мин. Масс-спектрометрический анализ проводили на масс-спектрометре с двойным давлением LTQ-Orbitrap, с источником ионизации наноэлектрораспылением (оба - Thermo Fisher Scientific). Каждое сканирование MS1 (полученное в Orbitrap) сопровождалось диссоциацией, вызванной столкновениями (CID, полученная в LTQ), 20 наиболее распространенных ионов-предшественников с динамическим исключением в течение 30 с. Для фосфопептидного анализа 10 наиболее распространенных ионовпредшественников подвергали CID с активированной многоступенчатой активацией. Общее время цикла составляло приблизительно 2 с. Для MS1 в ячейке Orbitrap накапливали 10⁶ ионов в течение максимального времени 300 мс и сканировали с разрешением 60 000 ПШПВ (при 400 m/z). Сканы MS2 получали в нормальном режиме сканирования, при целевом значении 10⁴ ионов и времени накопления 25 мс. Однозарядные ионы и ионы с не определенным зарядовым состоянием исключали из инициирования событий MS2. Нормализованная энергия столкновения была установлена равной 32%, и для каждого спектра получали один микроскан.

Безмаркерное количественное определение и поиск в базе данных.

Полученные исходные файлы импортировали в программный инструмент Progenesis (Nonlinear Dynamics, версия 4.0) для безмаркерной количественной оценки с использованием параметров по умолчанию. Спектры MS2 экспортировали непосредственно из программного обеспечения Progenesis в формате mgf и выполняли по ним поиск с использованием алгоритма MASCOT (Matrix Science, версия 2.4) с помощью имитационной базы данных [49], содержащей нормальные и обратные последовательности предсказанных записей SwissProt Homo sapiens (www.ebi.ac.uk, дата выпуска 16/05/2012) и обычно наблюдаемые загрязняющие вещества (всего 41 250 последовательностей), сгенерированной с использованием инструмента SequenceReverser из программного обеспечения MaxQuant (версия 1.0.13.13). Чтобы идентифицировать белки, происходящие из Y. enterocolitica, для не обогащенных фосфопептидом образцов, выполняли поиск в той же самой базе данных, включая предсказанные записи SwissProt для Y. enterocolitica (www.ebi.ac.uk, дата выпуска 15/08/2013). Допустимое отклонение для ионов-предшественников было установлено равным 10 м.д., для фрагментарных ионов - равным 0,6 Да. Критерии поиска были установлены следующим образом: требовалась полная триптическая специфичность (расщепление после остатков лизина или аргинина, за исключением следования за пролином), допускались 2 пропущенных расщепления, карбамидометилирование (С) устанавливали в качестве фиксированной модификации, а фосфорилирование (S, T, Y) или окисление (М) - в качестве переменной модификации для обогащенных или не обогащенных образцов TiO₂ соответственно. В заключение, результаты поиска по базе данных экспортировали в виде XML-файла и импортировали обратно в программное обеспечение Progenesis для отнесения сигналов MS1. Для количественной оценки фосфопептидов экспортировали csv-файл, содержащий пиковые интенсивности всех обнаруженных сигналов MS1, а для не обогащенных образцов был создан csv-файл, содержащий все измерения белка, основанные на суммарных интенсивностях сигналов всех обнаруженных пептидов на каждый белок. Важно отметить, что программное обеспечение Progenesis было установлено таким образом, что белки, идентифицированные схожими наборами пептидов, сгруппированы вместе и что для количественного определения белка использованы только неконфликтующие пептиды со специфическимии последовательностями для отдельных белков в базе данных. Оба файла дополнительно обрабатывали с использованием самостоятельно разработанного скрипта SafeQuant v1.0 R (неопубликованные данные, доступные по адресу https://github.com/eahrne/SafeQuant/). В кратком изложении, это программное обеспечение устанавливает частоту ложноположительных результатов обнаружения False Discovery Rate на 1% (с учетом количества совпадений с имитационной базой данных последовательностей белка) и нормализует уровни идентифицированных пиков MS1 (экстрагированная ионная хроматограмма, XIC) по всем образцам, т.е. просуммированная XIC всех уверенно идентифицированных сигналов пептидов масштабируется, чтобы быть равной для всех ЖХ-МС-опытов. Затем всем количественно оцененным фосфопептидам/белкам присваивается коэффициент относительного содержания для каждого момента времени, исходя из медианной XIC в каждый момент времени. Статистическая значимость каждого отношения определяется его q-значением (скорректированные рзначения чатсоты False Discovery Rate), полученным вычислением модифицированных р-значений в tстатистике [50] и корректировки для множественных сравнений [51]. Локализация фосфорилированных остатков автоматически присваивалась алгоритмом MASCOT (балл>10). Все аннотированные спектры вместе с исходными файлами МС и использованными параметрами поиска будут занесены в базу консорциума ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) через партнерский репозиторий PRIDE [52].

- 38 039922

Выравнивание последовательностей выполняли с использованием доступного через интернет инструмента института EMBL-EBI для выравнивания нескольких последовательностей ClustalW2 http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/.

Биораспределение в мышиных моделях аллотрансплантатов опухолей 4Т1.

Все эксперименты на животных были одобрены (лицензия 1908, ветеринарное управление кантона Базель-Штадт) и выполнялись в соответствии с местными руководствами (Tierschutz-Verordnung, BaselStadt) и швейцарским законом о защите животных (Tierschutz-Gesetz). Шестинедельных мышаей BALB/c заказывали из Janvier Labs. После по меньшей мере одной недели адаптации мышей BALB/c анестезировали изофлураном и подкожно вводили в бок 100 мкл клеток 4Т1 (1х10⁵-1х10⁶ клеток). На протяжении всего эксперимента мышей оценивали по поведению, физическому состоянию и температуре, а также измеряли массу тела.

После развития опухоли, мышам вводили раствор десферала 8 мг/мл (10 мл/кг) внутрибрюшинной инъекцией. На следующий день мышей инфицировали Y. enterocolitica MRS40 или Y. enterocolitica MRS40 AHOPEMT (2х10⁵, 1х10⁶ или 1х10⁷ бактерии) путем инъекции в хвостовую вену. Инокулум в/в вводимый мышам, проверяли путем посева методом разведения. В некоторых экспериментах прогрессирование опухоли отслеживалось ежедневными измерениями длины и ширины опухоли с помощью цифрового циркуля. Объем опухоли определяли как 0,523хдлинахширина². В соответствующие дни после инфицирования мышей умерщвляли вдыханием CO2. Образец крови немедленно изолировали путем аспирации из сердца. Изолировали печень, селезенку, легкие и опухоль и определяли их вес. Органы и опухоль гомогенизировали. В каждом образце определяли КОЕ путем нанесения последовательных разведений на чашки с агаром LB, содержащие налидиксовую кислоту (35 мкг/мл).

В) Результаты.

Система доставки белка на основе секреции 3 типа слитых белков YopE.

Хотя сам N-конец T3SS-эффектора Y. enterocolitica YopE (SEQ ID NO: 1) содержит сигнал секреции, достаточный для транслокации гетерологичного белка [26], сайт связывания шаперонов (CBS) для его шаперона (SycE) не включен [53]. Авторы настоящего изобретения выбрали N-концевые 138 аминокислот YopE (SEQ ID NO: 2) для слияния с белками, предназначенными для доставки, так как было показано, что это дает наилучшие результаты для транслокации других гетерологичных субстратов T3S [28]. Поскольку указанные N-концевые 138 аминокислот YopE содержат CBS, авторы настоящего изобретения также решили коэкспрессировать SycE. Фрагмент SycE-YopE1_₁₃₈, клонированный из очищенной плазмиды вирулентности Y. enterocolitica pYV40, содержит эндогенные промоторы YopE и его шаперона SycE (фиг. 10). Таким образом, SycE и любые слитые белки YopE₁.₁₃₈ индуцируются быстрым изменением температуры роста от комнатной до 37°С. Время культивирования при 37°С влияет на количество слитого белка, присутствующего в бактериях. На 3'-конце YopE1_₁₃₈ был добавлен сайт множественного клонирования (MCS) (фиг. 10В), за которым следуют myc и 6х His-метка и стоп-кодон.

Исходный штамм тщательно отбирали. Во-первых, для ограничения транслокации эндогенных эффекторов авторы настоящего изобретения использовали штамм Y. enterocolitica, с удалением всех известных эффекторов Yop Н, О, Р, Е, М и Т (обозначаемый АНОРЕМТ) [54]. Кроме того, авторы настоящего изобретения иногда использовали аусотрофный мутант, который не может расти при отсутствии экзогенной мезо-2,6-диаминопимелевой кислоты [55]. Указанный штамм был удален для гена аспартатбета-полуальдегиддегидрогеназы (Aasd) и классифицирован как уровень биобезопасности 1 швейцарским агентством по безопасности (поправка к А010088/2). Кроме того, авторы настоящего изобретения удалили белки адгезии YadA и/или InvA чтобы предложить больший выбор исходных штаммов. Использование штаммов yadA или yadA/invA уменьшает индуцированную фоновую сигнализацию [56], а также влияет на доставляемое количество белка [57].

Характеризация доставки слитого белка YopE в эукариотические клетки.

В анализе секреции in vitro (см. фиг. 1А) искусственно индуцируется секреция белка в окружающую жидкость. После осаждения белка с помощью трихлоруксусной кислоты (ТСА) использовали Вестерн-блот-анализ с анти-YopE-антителом для определения секретируемого количества белка (фиг. 1В). В Если штамм wt выделяет полноразмерное YopE, штаммы АНОРЕМТ asd не делают этого. В присутствии YopE₁_₁₃₈-Myc-His (далее обозначается YopE1_₁₃₈-Myc; SEQ_ID_No._3) становится видна меньшая полоса YopE (фиг. 1B). Следовательно, фрагмент YopE1_₁₃₈ хорошо секретируется в описанных в настоящей заявке условиях. Чтобы проанализировать гомогенность транслокации белка в эукариотические клетки, авторы настоящего изобретения инфицировали клетки HeLa кодирующим YopE1_₁₃₈-Myc штаммом и окрашивали Мус-меткой посредством иммунофлуоресценции (фиг. 2А и В). Если вначале окрашивались только бактерии, то через 30 мин после инфицирования (п.и.) становились видимыми контуры клеток, что усиливалось с увеличением времени инфицирования (фиг. 2В). Указанная тенденция хорошо отражена интенсивностью окрашивания Мус-меткой внутри клеток HeLa (фиг. 2А и В). YopE1_₁₃₈-Myc обнаруживается повсеместно в клетках (фиг. 2А), за исключением ядер [58]. Примечательно, что такой подход действовал на большинство, если не на все клетки, сходным образом. Поскольку известно, что Y. enterocolitica инфицирует многие типы клеток [59], авторы настоящего изобретения отследили доставку

- 39 039922

YopE₁.₁₃₈-Мyс в различные клеточные линии. Такое же гомогенное окрашивание анти-Мус посредством иммунофлуоресценции наблюдалось в инфицированных мышиных фибробластах, клетках Jurkat и HUVEC (фиг. 11). Более того, подстройка значения MOI в сторону повышения или понижения позволяет модулировать количество поставляемого белка, (фиг. 2С), хотя большинство клеток все же остаются затронутыми. Низкое количество бактерий приводит не к малому количеству клеток с большим количеством доставленного белка, а скорее к большинству клеток, содержащих небольшое количество доставленного белка (фиг. 2С).

Перенаправление доставленных белков T3SS в ядро.

Поскольку сам YopE локализован в цитоплазме (фиг. 2А), представляет особый интерес проверить, не блокирует ли фрагмент YopE1-₁₃₈ локализацию ядерных слитых белков. Поэтому авторы настоящего изобретения добавили SV40 NLS к С-концу (и N-концу, с аналогичными результатами) YopE1-₁₃₈-EGFP (SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 38 соответственно). В то время как добавление YopE1-₁₃₈-EGFP (SEQ ID NO: 37) приводило к слабому цитоплазматическому окрашиванию, добавление YopE1.₁₃₈-EGFP-NLS вызывало более сильный ядерный EGFP-сигнал в инфицированных клетках HeLa (фиг. 3). Это указывает на то, что фрагмент YopE1-₁₃₈ совместим с использованием NLS. Хотя mCherry ранее уже использовался в патогенах растений [60], указанный опыт представляет собой успешную доставку GFP-подобного белка с помощью патогенных бактерий человека или животных, кодирующих T3SS. Это подтверждает перспективность зависимой от SycE и YopE1-₁₃₈ стратегии для доставки многих подходящих белков.

Удаление придатка YopE1-₁₃₈ после транслокации слитого белка в эукариотическую клетку.

Хотя для бактериальной доставки фрагмент YopE1-₁₃₈ весьма полезен, он может затруднить функционирование и/или локализацию слитых белков.

Поэтому было бы оптимальным его удаление после доставки белка. С этой целью авторы настоящего изобретения ввели два сайта расщепления TEV (ENLYFQS) [61-63] между YopE1-₁₃₈ и партнером по слиянию (транскрипционный регулятор ET1-Myc (SEQ ID NO: 36 и 41) [64] и человеческим INK4C (SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 43)). Чтобы сохранить преимущества представленного метода, авторы настоящего изобретения дополнительно сливали протеазу TEV (вариант S219V [65]) с YopE1-₁₃₈ (SEQ ID NO: 42) в другом штамме Y. enterocolitica. Клетки HeLa были инфицированы обоими штаммами сразу. Чтобы допустить анализ только транслоцированной фракции белков, инфицированные клетки HeLa лизировали через 2 ч после инфицирования (фиг. 4) с дигитонином, который, как известно, не лизирует бактерии ([66], см. контроль на фиг. 12). Вестерн-блоттинг показал присутствие YopE₁.₁₃₈-2χTEV-сайт расщепления-ЕТ1-Мус или YopE₁.₁₃₈-2χTEV-сайт расщепления-Flag-INK4C-Мyс только тогда, когда клетки были инфицированы соответствующим штаммом (фиг. 4А и С). После расщепления в течение ночи этого клеточного лизата очищенной протеазой TEV можно наблюдать сдвинутую полосу (фиг. 4А и С). Указанная полоса соответствует ЕТ1-Мус (фиг. 4С) или Flag-INK4C (фиг. 4А) с N-концевыми остатками сайта расщепления TEV, скорее всего, только одним серином. После коинфицирования клеток штаммом, доставляющим протеазу TEV, стал видимым тот же расщепленный фрагмент ET1-Myc или Flag-INK4C, указывая на то, что протеаза TEV, доставляемая посредством T3SS, является функциональной и что отдельные клетки были инфицированы обоими бактериальными штаммами (фиг. 4А и С). Хотя расщепление не является полным, большинство транслоцированных белков расщепляется уже через 2 ч после инфицирования, и даже ночное расщепление очищенной протеазой TEV не дает лучшей скорости расщепления (фиг. 4В). Как сообщалось ранее, TEV-протеаза-зависимое расщепление может нуждаться в оптимизации, зависящей от слитого белка [67, 68]. Следовательно зависимое от TEV-протеазы удаление придатка YopE1-₁₃₈ после транслокации впервые обеспечивает доставку белка T3SS почти нативных гетерологичных белков, изменяя аминокислотный состав на одну N-концевую аминокислоту. Альтернативный подход к зависимому от TEV-протеазы расщеплению YopE-фрагмента состоял во включении убиквитина в исследуемый слитый белок.

Действительно, убиквитин подвергается процессингу на своем С-конце группой эндогенных убиквитин-специфических С-концевых протеаз (деубиквитинизирующих ферментов, DUBs). Поскольку расщепление должно происходить на самом С-конце убиквитина (после G76), исследуемый белок должен быть свободен от дополнительной аминокислотной последовательности. Указанный метод тестировали на слитом белке YopE₁.₁₃₈-yбиквитин-FLAG-INK4C-MycHis. В контрольных клетках, инфицированных YopE₁_₁₃₈-Flag-INK4C-MycHis-экспрессирyющими бактериями, была обнаружена полоса, соответствующая YopE1_₁₃₈-Flag-INK4C-MycHis, что указывает на эффективную транслокацию слитого белка (фиг. 24). Когда клетки инфицировали в течение 1 ч экспрессирующими YopE₁_₁₃₈-yбиквитин-FLAG-INK4CMycHis бактериями, была обнаружена дополнительная полоса, соответствующая размеру Flag-INK4CMycHis, что указывает на то, что часть слитого белка была расщеплена. Указанный результат показывает, что введение убиквитина в слитый белок позволяет отщепить фрагмент YopE1-₁₃₈ без необходимости в экзогенной протеазе.

Транслокация бактериальных эффекторов типа III и типа IV SopE из Salmonella enterica представляет собой хорошо охарактеризованный фактор обмена гуаниновых нуклеотидов (GEF), который взаимодействует с Cdc42, способствуя ремоделированию актинового цитоскелета [69]. В то время как трансло

- 40 039922 кация YopE1-₁₃₈-Myc в клетки HeLa не оказывает эффекта, транслоцированные YopE_1-138-SopE (SEQ ID NO: 5 и 135) вызывали драматические изменения в актиновой сети (фиг. 5А). Аналогичные результаты были получены с другим эффекторным белком GEF, IpgB1 из Shigella flexneri (SEQ ID NO: 4). Примечательно, что первые изменения в актиновом цитоскелете наблюдались уже через 2 мин после инфицирования (фиг. 5А). Таким образом, можно сделать вывод, что доставка T3SS-зависимого белка происходит сразу же после того, как инфицирование инициируется центрифугированием. Для строгого доказательства зависящего именно от T3SS транспорта один из белков T3SS, образующих поры транслокации в эукариотическую клеточную мембрану, был удален (YopB, см. [70]) (фиг. 12).

При инфицировании Salmonella транслокация SopE сопровождается транслокацией SptP, которая функционирует как активирующий ГТФазу белок (GAP) для Cdc42 [71]. В то время как транслокация только YopEl.l₃₈-SopE-Мус (SEQ ID NO: 135) вызывала массовые реаранжировки F-актина, коинфицирование бактериями, экспрессирующими YopE1-₁₃₈-SptP (SEQ ID NO: 8), устраняет указанный эффект дозозависимым образом (фиг. 5В). Окрашивание антителом Анти-Мус показало, что это ингибирование не было связано с уменьшением уровня транслокации YopE1_₁₃₈-SopE-Myc (фиг. 5В). В сочетании указанные результаты показали, что коинфицирование клеток двумя бактериальными штаммами является действенным методом доставки двух разных эффекторов в отдельные клетки для обеспечения их функционального взаимодействия.

Эффектор типа III S. flexneri OspF функционирует как фосфотреонилин-лиаза, которая дефосфорилирует МАР-киназы р38 и ERK [72]. Для тестирования функциональности транслоцированного YopE1-₁₃₈-OspF (SEQ ID NO: 7) авторы настоящего изобретения проследили фосфорилирование р38 после стимуляции TNFa. В неинфицированных клетках или в клетках, инфицированных экспрессирующими YopE1-₁₃₈-Myc бактериями, TNFa индуцировал фосфорилирование р38. Напротив, после транслокации YopE1-₁₃₈-OspF фосфорилирование, индуцированное TNFa, прекратилось, что показывает, что доставленный OspF активен в отношении р38 (фиг. 6А).

При инфицировании Salmonella эффектор SopB типа III защищает эпителиальные клетки от апоптоза за счет продолжительной активации Akt [73]. В то время как транслокация YopE1-₁₃₈-Myc или YopE1-₁₃₈-SopE не влияла на Akt, транслокация YopE1-₁₃₈-SopB (SEQ ID NO: 6) вызывала сильное фосфорилирование Akt на Т308 и S473, указывая на активную форму (фиг. 6В). Аналогичные результаты были получены с SopB-гомологом из S. flexneri (IpgD, SEQ ID NO: 9). В совокупности, результаты, полученные авторами настоящего изобретения, показывают, что система доставки на основе YopE1-₁₃₈ функционирует для всех протестированных до настоящего времени эффекторов T3S и позволяет исследовать белки, участвующие в контроле над центральными клеточными функциями, включая цитоскелет, воспаление и выживание клетки.

Ряд бактерий, включая Agrobacterium tumefaciens, Legionella pneumophila и Bartonella henselae, используют секрецию типа IV для инъекции эффекторов в клетки, авторы настоящего изобретения протестировали, можно ли транслоцировать эффектор типа IV ВерА из В. henselae в клетки HeLa с помощью инструмента, разработанного авторами настоящего изобретения. Полноразмерные ВерА (SEQ ID NO: 10) и BepAE305-end (SEQ ID NO: 11), содержащие С-концевой домен Bid, были клонированы, и клетки инфицировали соответствующими штаммами. Поскольку показано, что ВерА индуцирует образование циклического АМФ (цАМФ) [74], после инфицирования измеряли уровень цАМФ в клетках HeLa. Принимая во внимание, что транслокация Bid-домена эффектора В. henselae BepG (SEQ ID NO: 136) не индуцировала цАМФ, полноразмерные ВерА и BepAE305-end инициировали производство цАМФ в ожидаемых количествах [74] (фиг. 6С). Указанный результат показывает, что эффекторы типа IV также могут быть эффективно доставлены системой доставки на основе YopE1-₁₃₈ в целевые клетки-хозяева, и что они являются функциональными.

Транслокация эукариотических белков в эпителиальные клетки.

Чтобы показать, что человеческие белки могут транслоцироваться посредством секреции типа III, авторы настоящего изобретения гибридизировали индукторы апоптоза человека для доставки бактерией Y. enterocolitica в YopE1-₁₃₈ или для доставки бактерией S. enterica с SteA_1-20, SteA, SopE1-₈₁ или SopE1.₁₀₅. Затем авторы настоящего изобретения отслеживали транслокацию человеческого BH3взаимодействующего агониста домена смерти (BID, SEQ ID NO: 24), который является проапоптотическим членом семейства белков Bcl-2. Он является медиатором повреждения митохондрий, вызванного каспазой-8 (CASP8). CASP8 расщепляет BID, а усеченный ВГО (tBID, SEQ ID NO: 25) транслоцируется в митохондрии, где он вызывает выброс цитохрома с. Последнее приводит к свойственному способу активации каспазы 3 (CASP3), при которой он расщепляется на субъединицы 17 и 12 кДа [75]. В то время как инфицирование в течение 1 ч Y. enterocolitica, экспрессирующей YopE₁_₁₃₈-Мус или YopE1_₁₃₈-BID, не вызывала апоптоза, транслокация человеческого tBID вызывала гибель клеток в большей степени, чем хорошо охарактеризованный индуктор апоптоза стауроспорин (фиг. 7А и С). Как и ожидалось, транслокация tBID приводит к производству субъединицы CASP3 р17 даже в больших количествах, чем для стауроспорина (фиг. 7А). Чтобы иметь возможность сравнивать транслоцированные количества белка с эндогенной Bid, клетки HeLa лизировали дигитонином и анализировали методом Вестерн-блоттинга с

- 41 039922 использованием антитела к Bid (фиг. 7В). YopE_1-138-tBID, доставленный системой T3SS, почти достигал эндогенных уровней Bid в клетках HeLa, тогда как доставленный YopE₁-₁₃₈-BID присутствовал в еще более высоких количествах (в 2,5 раза) (фиг. 7В). Глубокое картирование протеом и транскриптов клеток HeLa показало в 4,4x105 копий BID на одну клетку [76]. Таким образом, можно сделать вывод, что T3SSзависимая доставка человеческого белка достигает 105-106 копий белка на клетку. Указанные цифры соответствуют числу копий нанотел на клетку, транслоцированных посредством T3SS Е. coli [4]. С учетом коэффициента 10 для MOI и продолжительности инфицирования, коэффициента 3,2 для момента добавления антибиотика и для времени культивирования при 37°С перед инфицированием, доставленные копии белка/клетку могут регулироваться от 1000 копий/клетку до примерно 106 копий/клетку. В совокупности указанные результаты показали, что транслоцированный tBID был функциональным и доставлялся в адекватных количество. Это подтвердило пригодность разработанного авторами настоящего изобретения инструмента транслокации для изучения роли белков в регуляции апоптоза, центрального аспекта цитобиологии.

Далее авторы настоящего изобретения гибридизировали мышиный tBID (кодон, оптимизированный под Y. enterocolitica, SEQ ID NO: 194) или BH3-домены мышиного tBID или мышиного ВАХ (в обоих случаях - кодон, оптимизированный под Y. enterocolitica, SEQ ID NO: 138 и 139), с YopE₁.₁₃₈ для доставки Y. enterocolitica. В то время как инфицирование в течение 2,5 ч Y. enterocolitica AHOPEMT asd, не доставляющей белка, или YopE₁-₁₃₈-Myc, не вызывало апоптоза, транслокация мышиного tBID (кодона, оптимизированного под Y. enterocolitica, SEQ ID NO: 194) вызывала гибель в клетках B16F10 (фиг. 16), D2A1 (фиг. 17), HeLa (фиг. 18) и 4Т1 (фиг. 19). Было установлено, что транслокация домена BH3 мышиного кодона BID, оптимизированного под Y. enterocolitica (SEQ ID NO: 138) или мышиного кодона ВАХ, оптимизированного под Y. enterocolitica (SEQ ID NO: 139), также вызывает гибель в клетках B16F10 (фиг. 16), D2A1 (фиг. 17), HeLa (фиг. 18) и 4Т1 (фиг. 19).

В то время как инфицирование в течение 4 ч бактерией S. enterica aroA не вызывала апоптоза, транслокация мышиного tBID вызывала апоптоз, поскольку транслокация мышиного tBID приводит к производству субъединицы CASP3 р17 (фиг. 20 и 21). Степень индукции апоптоза для слитых белков SopE была больше при использовании условий индуцирования SpiI T3SS (фиг. 20), что отражает транспорт SopE исключительно системой SpiI T3SS. Слитый с SteA₁-₂₀ мышиный tBID не вызывал апоптоза, скорее всего потому, что сигнал секреции в 20 N-концевых аминокислотах SteA недостаточен для доставки слитого белка (фиг. 20 и 21). Мышиный tBID, слитый с полноразмерным SteA, приводил к индукции апоптоза в клетках HeLa (фиг. 20 и 21), в условиях как SpiI, так и в SpiII T3SS, что отражает способность SteA транспортироваться обеими T3SS. Следует отметить, что даже в условиях индуцирования SpiII T3SS ожидается частичная активность SpiI T3SS, как видно из активности слитых белков SopE в условиях индуцирования SpiII T3SS (фиг. 21).

Помимо усовершенствованных в настоящей заявке функционально транслоцированных эукариотических белков, было секретировано несколько других эукариотических белков с использованием описанного в настоящей заявке инструмента. Это включает доставку белков бактерией Y. enterocolitica (фиг. 13, 14 и 23) из регуляции клеточного цикла (Mad2 (SEQ ID NO: 15), CDK1 (SEQ ID NO: 14), INK4A (SEQ ID NO: 16), INK4B (SEQ ID NO: 17) и INK4C (SEQ ID NO: 18)) а также их части (INK4A 84-103 (SEQ ID NO: 158), p107 657-662 (SEQ ID NO: 159), p21 141-160 (SEQ ID NO: 160), p21 145-160 (SEQ ID NO: 161), p21 17-33 (SEQ ID NO: 162) и циклин d2 139-147 (SEQ ID NO: 163)), связанные с апоптозом белки (Bad (SEQ ID NO: 29), FADD (SEQ ID NO: 28), и каспазу З р17 (SEQ ID NO: 22) и p12 (SEQ ID NO: 23), Bid рыбки данио (SEQ ID NO: 19) и t-Bid (SEQ ID NO: 20)) а также их части (fBid BH3 (SEQ ID NO: 138), Bax BH3 (SEQ ID NO: 139)), сигнальные белки (мышиные TRAF6 (SEQ ID NO: 12), TIFA (SEQ ID NO: 13)), GPCR Go. субъединицу (GNA12, самую короткую изоформу, (SEQ ID NO: 30)), нанотело (vhhGFP4, (SEQ ID NO: 31)) и конструкции на основе слитых нанотел для деградации целевого белка (SlmbvhhGFP4; (SEQ ID NO: 32, 33, 34) [77]) (фиг. 13 и 14) а также малые ГТФазы (Rac1 Q61E (SEQ ID NO: 26 и 137) и RhoA Q63L (SEQ ID NO: 27) и плекстрин-гомологичный домен из Akt человека (SEQ ID NO: 35). Помимо функционально усовершенствованных связанных с апоптозом белков (murine tBid, SEQ ID NO: 144-147), это дополнительно включает в себя белки S. enterica (фиг. 22) из регуляции клеточного цикла (Mad2 (SEQ ID NO: 168-169), CDK1 (SEQ ID NO: 170-171), INK4A (SEQ ID NO: 164-165) и INK4C (SEQ ID NO: 166-167)). Хотя указанные белки не были подтверждены на функциональность, возможность T3SS-зависимой секреции различных эукариотических белков в сочетании с возможным удалением придатка YopE открывает новые перспективы для широкой применимости T3SS в цитобиологии и терапевтических применениях.

Транслокация in vivo усеченного Bid в эмбрионах рыбок данио индуцирует апоптоз.

Интересной особенностью этого бактериального инструмента является потенциал использования в живых животных. Данио в их эмбриональном состоянии можно сохранять прозрачными, позволяя выполнять флуоресцентное окрашивание и микроскопию [44, 78, 79]. Ранее было подробно описано несколько индукторов апоптоза рыбок данио, из которых наиболее мощным является z-BIM [80]. Поэтому авторы настоящего изобретения решили клонировать z-BIM в систему авторов настоящего изобретения.

- 42 039922

Несмотря на его слабую гомологичность человеческому BIM, авторы настоящего изобретения проанализировали эффективность индукции апоптоза YopE1_₁₃₈-z-BIM (SEQ ID NO: 21) в эпителиальных клетках человека. Клетки HeLa, инфицированные в течение 1 ч штаммом, транслоцирующим YopE1_₁₃₈-z-BIM, показали явные признаки гибели клеток. Затем авторы настоящего изобретения проводили эксперименты in vivo с эмбрионами рыбок данио после 2 дней после оплодотворения (dpf), используя модель локализованного инфицирования путем микроинъекции бактерий в задний мозг [44]. После инфицирования в течение 5,5 ч рыбок фиксировали, пермеабилизировали и окрашивали на присутствие CASP3 р17. При инфицировании штаммом, экспрессирующим YopE1_₁₃₈-Myc, бактерии были видны в области заднего мозга (окрашивание b, фиг. 8 AI), но индукции апоптоза вокруг бактерий обнаружено не было (окрашивание с, фиг. 8 AI). Напротив, при инфицировании штаммом, доставляющим YopE1_₁₃₈-z-BIM, в областях, окружающих бактерии, наблюдалось сильное увеличение присутствия расщепляющей CASP3 (фиг. 8 АЙ). Автоматический анализ изображений на z-проекциях максимальной интенсивности подтверждает, что бактерии транслоцирующие YopE1_₁₃₈-z-BIM, индуцируют апоптоз в соседних клетках гораздо больше, чем контрольные бактерии (фиг. 8В). Это указывает на функциональность z-BIM у рыбок данио при бактериальной транслокации. Данные результаты дополнительно подтверждают применимость T3SS для доставки эукариотного белка у живых животных.

Фосфопротеомика выявляет глобальное влияние транспонированных белков на фосфорилирование белка.

Фосфорилирование представляет собой широко распространенную посттрансляционную модификацию, которая может либо активировать, либо инактивировать биологические процессы и, следовательно, является подходящей мишенью для изучения событий сигнализации [81, 82]. Несмотря на это, на сегодня не имеется системного анализа фосфорилирования при апоптозе. Чтобы проанализировать влияние человеческого tBid, доставленного в клетки HeLa, авторы настоящего изобретения использовали безмаркерный фосфопротеомический подход с помощью ЖХ/МС/МС. В трех независимых экспериментах клетки либо не подвергали обработке, либо инфицировали АНОРЕМТ asd+YopE₁.₁₃₈-Мус, либо АНОРЕМТ asd+YopE1_₁₃₈-tBid в течение 30 мин. Клетки лизировали с последующим ферментативным расщеплением, обогащением фосфопептидами и количественной оценкой и идентификацией отдельных фоспепептидов. авторы настоящего изобретения сравнивали клетки, инфицированные АНОРЕМТ asd+YopE₁-₁₃₈-Myc, с клетками, инфицированными АНОРЕМТ asd+YopE1_₁₃₈-tBid, что позволяло идентифицировать 363 tBid-зависимых события фосфорилирования. При этом 286 фосфопептидов показали увеличение фосфорилирования, тогда как 77 были менее фосфорилированы после доставки tBid, что соответствует 243 различным белкам, которые авторы настоящего изобретения и определили как фосфопротеом tBid. Для создания сети белок-белкового взаимодействия фосфопротема tBid была использована база данных STRING [83] (фиг. 9А). Кроме того, к этой сети были добавлены 27 белков, связанных с митохондриальным апоптозом, которые создают центральный кластер. Интересно, что к этому центральному кластеру подсоединены лишь несколько белков из фосфопротема tBid, указывая на то, что изменению при фосфорилировании подвергаются многие белки, которые до сих пор не были напрямую связаны с апоптотическими белками. Чтобы охарактеризовать биологические функции, охваченные указанным tBid-фосфопротеомом, авторы настоящего изобретения провели онтологический анализ генов с использованием инструмента функциональной аннотации базы данных для аннотации, визуализации и интегрированного обнаружения (DAVID, http://david.abcc.ncifcrf.gov/) [84, 85]. Выявленные биологические функции показывают, что tBid влияет на различные клеточные процессы. Многие белки, участвующие в реаранжировке хроматина и регуляции транскрипции подвергаются изменению при фосфорилировании (т.е. СВХ3, СВХ5, TRIM28, HDAC1). Например, HDAC1 представляет собой гистондезацетилазу, играющую роль в регуляции транскрипции. Было показано, что HDAC1 может модулировать транскрипционную активность NF-kB, белка, также участвующего в апоптозе. авторы настоящего изобретения дополнительно идентифицировали кластер белков, участвующих в процессинге РНК, который, как было ранее показано, играет важную роль в регуляции апоптоза [86]. HNRPK, например, опосредует ответ р53/ТР53 на повреждение ДНК и необходим для индукции апоптоза [87]. Кроме того, влияние также испытывает фосфорилирование белков, участвующих в трансляции белка. Несколько факторов эукариотической инициации (т.е. EIF4E2, EIF4B, EIF3A, EIF4G2) претерпевают изменения при фосфорилировании, что согласуется с наблюдением, что в апоптотических клетках общий синтез белка снижается. Интересно отметить, что фосфорилирование многих белков, участвующих в ремоделировании цитоскелета (например, PXN, MAP1B9, изменяется при доставке tBid. Это согласуется с наблюдением, что морфология клеток драматически изменяется при доставке tBid (фиг. 9В). Сжатие клеток и потеря ими контакта отражается тем фактом, что авторы настоящего изобретения наблюдаем фосфорилирование связанных с адгезией белков, таких как ZO2 и паксиллин. Аналогичным образом сжатие ядер сопровождается фосфорилированием ламинарных белков, таких как ламин А/С и ламин В1. В целом, доставка tBID индуцирует быстрый апоптотический ответ, также отмеченный разрывом целостности митохондрий (фиг. 9В). авторы настоящего изобретения показали, что индуцированный tBid апоптоз влияет на сотни событий фосфорилирования, участвующих в различных клеточных процессах. Хотя многие идентифицированные белки и

- 43 039922 ранее были ассоциированы с апоптозом, отонсительно лишь немногих было известно, что они фосфорилируются при индукции апоптоза. Таким образом, фосфопротеомический подход дает полезный ресурс для дальнейших исследований по апоптозу.

Транслокация эукариотических гетерологичных слитых белков, состоящих из повторяющихся идентичных или вариабельных белковых доменов в эпителиальные клетки Чтобы показать, что гетерологичные слитые белки, состоящие из повторяющихся идентичных или вариабельных доменов, могут транслоцировать посредством секреции типа III, авторы настоящего изобретения гибридизировали индукторы апоптоза мыши для доставки бактерией Y. enterocolitica с YopE1.₁₃8. В качестве контроля авторы настоящего изобретения гибридизировали мышиный tBID (кодон, оптимизированный под Y. enterocolitica, SEQ ID NO: 194) или BH3-домены мышиного tBID или мышиного ВАХ (в обоих случаях кодон оптимизирован под Y. enterocolitica, SEQ ID NO: 200 и 201) с YopE_1-138 для доставки бактерией Y. enterocolitica. Гетерологичный слитый белок состоял в одном случае из мышиного домена BH3 tBID, слитого с самим собой, образуя YopE_1-138-(tBID-BH3)₂ (SEQ ID NO: 202). о втором случае гетерологичные слитые белки состояли из мышиного домена BH3 tBID, слитого с BH3-доменом мыши ВАХ, образуя YopE_1-138-(tBID-BH3)-(ВАХ-BH3) (SEQ ID NO: 203). В случае мышиного tBID и мышиного ВАХ кодон был оптимизирован для Y. enterocolitica. Схематическое изображение повторяющихся идентичных доменов или комбинации различных доменов приведено на фиг. 25.

В то время как инфицирование в течение 4 ч бактерией Y. enterocolitica ΔΗΟΡΕΜΤ asd, доставляющей YopE_1-138-Myc не вызывала апоптоз, транслокация мышиного домена BH3 tBID (кодон, оптимизированный под Y. enterocolitica, SEQ ID NO: 194) вызвала гибель клеток в клетках B16F10 и 4Т1 (фиг. 26 и 27), с четким дозозависимым эффектом при увеличении множественности инфицирования (MOI). Неожиданно было обнаружено, что доставленные YopE_1-138-(tBID-BH3)-(BAX-BH3) или YopE_1-138-(tBIDBH3)₂ были более активными, чем YopE_1-138-(tBID-BH3) при более низком MOI (фиг. 27). Это указывает на то, что при доставке повторяющихся идентичных доменов или комбинации различных доменов белка влияние на целевой клеточный путь, такой как апоптоз, может быть увеличено.

Генерация усиленных проапоптотических бактерий.

В вышеупомянутых экспериментах показано, что доставка проапоптотических белков на основе T3SS (например, t-BID (SEQ ID NO: 25) или BIM (SEQ ID NO: 21)) эффективно индуцирует гибель клеток как в мышиных, так и в человеческих клетках, включая раковые клетки, и что указанный эффект может быть увеличен при использовании мышиного t-BID, оптимизированного для использования бактериального кодона (SEQ ID NO: 138). Это увеличение киллинга клеток, скорее всего, отражает увеличение объема производства белка и последующую доставку посредством T3SS благодаря использованию оптимальных кодонов.

Для оптимизации доставки проапоптотических белков были получены штаммы, трансформированные различными проапоптотическими белками, в соответствии с табл. IV.

Таблица IV. Штаммы, трансформированные _________различными проапоптотическими белками _______

Название штамма	Исходный штамм	Белок, доставляем ый T3SS	Основная плазмида	Итогово е названи е плазмид ы	Прайме ры. Si_Nr.:	резистент ность
YopEl-138(Y. enterocolitica кодон-	Y. enterocolitic а ΔγορΗ,Ο,Ρ,	YopEl-138Y. enterocolitic а кодон-	pBadSi _2	pSi_353	725/726	Nai Amp

- 44 039922

оптимизиро ванный мышиный tBid, ВИЗ расширенна я часть)	Ε,Μ,Τ Aasd	оптимизиро ванный мышиный tBid ВНЗ расширенн ый (с 4 Аа)
YopEl-13810 Аа линкер -(Y. enterocolitica кодоноптимизиро ванный мышиный tBid ВНЗ часть)	Y enterocolitic a ΔγορΗ,Ο,Ρ, Ε,Μ,Τ Aasd	YopEl-13810 Аа линкер -Y. enterocolitic а кодоноптимизиро ванный мышиный tBid ВНЗ	pBadSi _2	pSi_354	727/728	Nai Amp
YopE 1-(13 8Y enterocolitica кодоноптимизиро ванный мышиный Вах ВНЗ часть - Y. enterocolitica кодоноптимизиро ванный мышиный tBid ВНЗ часть	Y enterocolitic a ΔγορΗ,Ο,Ρ, Ε,Μ,Τ Aasd	YopEl-138Y enterocolitic а кодоноптимизиро ванный мышиный Вах ВНЗ-. enterocolitic а кодоноптимизиро ванный мышиный tBid ВНЗ	pSi_357	pSi_37 4	736/737	Nai Amp

Укорачивание доставленных белков до эссенциальных доменов, необходимых для сигнализации (SEQ ID NO: 138 или 200), могло бы повысить эффективность киллинга клеток (фиг. 28). Безотносительно к какой-либо теории, это увеличение эффективности, вероятно, связано с увеличением количества продуцирования белка и последующей доставкой через T3SS из-за меньшего размера доставленного белка. Введение линкера между частью YopE и BH3-доменом tBID (SEQ ID NO: 218) снижало эффективность, а также увеличивало BH3-домен на еще 4 аминокислоты (SEQ ID NO: 217) (фиг. 28). Кроме того, были получены синтетические карго с повторами таких незаменимых доменов (например, BH3-домен tBID (SEQ ID NO: 202))) или комбинации указанных незаменимых доменов (например, BH3-домен t-BID и BH3-домен ВАХ (SEQ ID NO: 203 и 219)). Неожиданно было обнаружено, что тандемные повторы указанных же или разных доменов BH3 приводят к усиленной индукции апоптоза на раковых клеточных линиях (включая клетки 4Т1 и B16F10, фиг. 28). Было обнаружено, что IC₅₀ (полумаксимальная ингибирующая концентрация), обозначающая число бактерий на эукариотную клетку (MOI), необходимое для уничтожения 50% таких клеток, снижалась при доставке тандемных повторов BH3-домена tBID по сравнению с единственным BHS-доменом t-BID (фиг. 28). Это открытие было неожиданным, так как размер белка увеличивался при слиянии в качестве второго BH3-домена t-BID. В связи с указанныем можно ожидать снижения уровней экспрессии и доставки YopE_1-138-(tBro BH3)₂ (SEQ ID NO: 202) по сравнению с YopE_1-138-tBID BH3 (SEQ ID NO: 138 или 200), и максимум может достичь эквивалентных уровней. Чтобы достичь увеличения активности в отношении киллинга клеток, слитые BH3-домены tBID должны одновременно действовать параллельно при доставке системой T3SS в эукариотические клетки. В случае если в конструкции YopE_1-138-(tBro BH3)₂ будет функционировать только один BH3-домен t-BID, в лучшем случае ожидается такая же эффективность, как и для YopE_1-138-tBID BH3. Для повышения генетической стабильности YopE_1-138-(tBID BH3)₂ (SEQ ID NO: 202) для исследований in vivo авторы настоящего

- 45 039922 изобретения клонировали YopEhB^tBro BH3)₂ (SEQ ID NO: 202) гомологичной рекомбинацией на плазмиде вирулентности pYV Yersinia на нативном сайте YopE и под нативным промотором YopE (с использованием мутаторных плазмид pSI_408 и pSI_419).

Такие мутаторы содержат последовательность ДНК, кодирующую желаемый белок, фланкированную последовательностями 200-250 пар оснований с обеих сторон, отвечая сайту соответствующего гена, где происходит интеграция. Указанные плазмиды трансформируются в Е. coli Sm10 λ pir, откуда плазмиды были мобилизованы в соответствующий штамм Y. enterocolitica. Мутанты, несущие интегрированный вектор, размножались в течение нескольких поколений без давления отбора. Затем использовали сахарозу для отбора клонов, которые потеряли вектор. В заключение, мутанты идентифицировали ПЦР для отбора колоний. Эндогенные белки для транспорта системой T3SS (называемые Внешние белки Yersinia, Yersinia outer proteins - Yops) кодируются бактерией Y. enterocolitica на этой плазмиде из 70 тыс.о., названной плазмидой вирулентности Yersinia (plasmid of Yersinia virulence, pYV), которая далее кодирует аппарат T3SS.

Штаммы Yersinia, кодирующие YopE_1-138-(tBID BH3) (SEQ ID NO: 138 или 200) или YopE_1-138-(tBID BH3)2 (SEQ ID NO: 202) на плазмиде вирулентности pYV Yersinia на нативном сайте YopE и под нативным промотором YopE, оценивали на их способность индуцировать апоптоз в раковых клетках (включая клетки 4Т1 и B16F10, фиг. 29). Было обнаружено, что IC₅₀ (полумаксимальная ингибирующая концентрация), обозначающая число бактерий на эукариотную клетку (MOI), необходимое для уничтожения 50% таких клеток, снижена при доставке тандемных повторов BH3-домена iBID по сравнению с одиночным BH3-доменом iBID, когда оба белка закодированы на плазмиде вирулентности pYV Yersinia на нативном сайте YopE и под нативным промотором YopE (фиг. 29). Это согласуется с результатами несущей плазмиду экспрессии доставки указанных белков (фиг. 28). Опять же, это открытие было неожиданным, так как размер белка увеличивается за счет слияния второго BH3-домена t-BID. В связи с указанныем ожидается снижение уровней экспрессии и доставки YopE_1-138-(tBro BH3)₂ (SEQ ID NO: 202) по сравнению с Yop E₁-₁₃₈-tBID BH3 (SEQ ID NO: 138 или 200) и максимум может достичь эквивалентных уровней. Чтобы достичь увеличения активности гибели клеток, слитые BH3-домены t-BID должны одновременно действовать параллельно при доставке T3SS в эукариотические клетки. В случае если будет функционален только один BH3 домен t-BID в конструкции YopE_1-138-(tBID ВНЗ)г, можно ожидать в лучшем случае такой же эффективности, как и с Yop E₁-₁₃₈-t-BID BH3. Кроме того, штаммы Yers E_1-138-(tBID BH3)₂ (SEQ ID NO: 202) на плазмиде вирулентности pYV Yersinia на нативном сайте YopE и под нативным промотором YopE были сравнены по их способности индуцировать апоптоз в раковых клетках с доставкой YopE_1-138-(tBID BH3)₂ на плазмиде экспрессии (на основе pBad-MycHisA). В соответствии с более высоким числом копий pBad-MycHisA (20-25 копий) по сравнению с pYV (сообщается о 1-6 копий), доставка YopE_1-138-(tBID BH3)₂ (SEQ ID NO: 202) на основе pBad-MycHisA приводила к небольшому снижению значения IC₅₀ в клетках 4Т1 и B16F10 (фиг. 29).

Валидация специфического роста опухоли in vivo до 14 дней после введения бактерий.

Эксперимент по колонизации опухоли генетически модифицированной Y. enterocolitica был повторен в мышиной модели сингенетического аллотрансплантата (модель рака молочной железы 4Т1), причем бактериальная колонизация отслеживалась в течение двух недель. На указанный раз мышей инфицировали дозой 1x106 колониеобразующих единиц (КОЕ) Y. enterocolitica АуорН,О,Р,Е,М,Т. Получив сходные результаты с моделью B16F10 на ранних стадиях после инфицирования, авторы настоящего изобретения смогли также показать, что колонизация опухоли стабильно обнаруживается с 8-го дня и до 14-го дня после инфицирования (фиг. 30). Кроме того, указанная колонизация остается высокоспецифичной, так во всех других оцененных органах обнаруживаются только низкие количества бактерий, (фиг. 31). Указанные данные показывают, что Y. enterocolitica AyopH,O,P,E,M,T способна установить стойкую колонизацию опухоли, при этом противодействуя клиренсу под действием иммунной системы.

Эффективность Y. enterocolitica AHOPEMT в замедлении прогрессирования опухоли

Чтобы оценить влияние YopE₁-₁₃₈-(tBID BH3)2 (SEQ ID NO: 202), доставленного в опухолевые клетки in vivo, авторы настоящего изобретения провели исследования у мышей Balb/C дикого типа с подкожным аллотрансплантатом клеток рака груди 4Т1. авторы настоящего изобретения стремились оценить штамм Y. enterocolitica АНОРЕМТ, кодирующий YopE_1-138-(tBID BH3)₂ (SEQ ID NO: 202) на плазмиде вирулентности pYV Yersinia на нативном сайте YopE и под нативным промотором YopE. Мышам внутривенно вводили PBS или 1x10⁷ бактерий Y. enterocolitica AHOPEMT pYV-Yop E1-138-(tBID BH3)2, как только опухоль достигала размера 150-250 мм³. День внутривенной инъекции бактерий определялся как день 0. В течение следующих дней (дни от 0 до 9 после инъекции бактерий) объем опухоли измеряли циркулем. Объем опухоли был нормализован на объем опухоли в день 0, чтобы компенсировать любую начальную гетерогенность в размере опухоли. Обработка Y. enterocolitica AHOPEMT pYV-YopE1-₁₃₈-(tBID BH3)₂ показала влияние на прогрессирование объема опухоли со статистически значимым уменьшением опухоли на 8-й, 9-й и 10-й день после введения бактерий (фиг. 32). Важно отметить, что просто Y. enterocolitica AHOPEMT не влияла на прогрессирование опухоли в модели рака мыши 4Т1 (фиг. 33). Указанные данные показывают, что такие бактерии и их T3SS могут использоваться для замедления прогрессирования опухоли.

- 46 039922

Список источников

Hayes, С. S., Aoki, S. К. & Low, D. A. Bacterial contact-dependent delivery systems. Annu Rev Genet 44, 71-90, doi: 10.1146/annurev.genet.42.110807.091449 (2010).

Cornelis, G. R The type III secretion injectisome. Nat Rev Microbiol 4, 811825, doi:nrmicrol526 [pii]10.1038/nrmicrol526 (2006).

Michiels, T, Wattiau, P., Brasseur, R, Ruysschaert, J. M. & Cornelis, G. Secretion ofYop proteins by Yersiniae. Infect Immun 58, 2840-2849 (1990).

Blanco-Toribio, A., Muyldermans, S., Frankel, G. & Fernandez, L. A. Direct injection offunctional single-domain antibodies from E. coli into human cells. PLoS One 5, el5227, doi: 10.137l/journal.pone.0015227 (2010).

Bichsel, C. et al. Direct reprogramming of fibroblasts to myocytes via bacterial injection of MyoD protein. Cell Reprogram 15, 117-125, doi:10.1089/cell.2012.0058 (2013).

Bichsel, C. et al. Bacterial delivery of nuclear proteins into pluripotent and differentiated cells. PLoS One 6, el6465, doi: 10.137 l/journal.pone.0016465 (2011).

Chamekh, M. et al. Delivery of biologically active anti-inflammatory cytokines IL-10 and IL-Ira in vivo by the Shigella type III secretion apparatus. J Immunol 180, 4292-4298, doi: 180/6/4292 [pii] (2008).

Hoffman, R. M. Tumor-seeking Salmonella amino acid auxotrophs. Curr Opin Biotechnol 22, 917-923, doi:S0958-1669(l1)00061-9 [pii] 10.1016/j.copbio.2011. 03.009 (2011).

Hoang, T. T, Williams, S., Schweizer, Η. P. & Lam, J. S. Molecular genetic analysis of the region containing the essential Pseudomonas aeruginosa asd gene encoding aspartate-beta-semialdehyde dehydrogenase. Microbiology 143 (Pt 3), 899-907 (1997).

Skurnik, M. & Wolf-Watz, H. Analysis of the у op A gene encoding the Yopl virulence determinants of Yersinia spp. Mol Microbiol 3, 517-529 (1989).

Tertti, R., Skurnik, M., Vartio, T. & Kuusela, P. Adhesion protein YadA of Yersinia species mediates binding of bacteria to fibronectin. Infect Immun 60, 3021-3024 (1992).

Isberg, R. R. & Leong, J. M. Multiple beta 1 chain integrins are receptors for invasin, a protein that promotes bacterial penetration into mammalian cells. Cell 60, 861-871, doi:0092-8674(90)90099-Z [pii] (1990).

Isberg, R. R., Voorhis, D. L. & Falkow, S. Identification of invasin: a protein that allows enteric bacteria to penetrate cultured mammalian cells. Cell 50, 769-778, doi:0092-8674(87)90335-7 [pii] (1987).

Leong, J. M., Fournier, R. S. & Isberg, R R. Identification of the integrin binding domain of the Yersinia pseudotuberculosis invasin protein. EMBO J 9, 1979-1989 (1990).

Mota, L. J. & Cornelis, G. R. The bacterial injection kit: type III secretion systems. AnnMed37, 234-249, doi:R673752030212825 [pii]10.1080/07853890510037329 (2005).

Trosky, J. E., Liverman, A. D. & Orth, K. Yersinia outer proteins: Yops. Cell Microbiol 10, 557-565, doi:CMIU09 [pii] 10.1111/j. 1462-5822.2007.01109.x (2008).

- 47 039922

Brenner, D. & Mak, T. Щ Mitochondrial cell death effectors. Curr Opin Cell

Biol 21, 871-877, doi:S0955-0674(09)00160-4 [pii] 10.1016/j.ceb.2009.09.004 (2009).

Chalah, A. & Khosravi-Far, R. The mitochondrial death pathway. Adv Exp Med Biol 615, 25-45, doi: 10.1007/978-1-4020-6554-5 3 (2008).

Fuchs, Y. & Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell 147, 742-758, doi:S0092-8674(l1)01283-9 [pii] 10.1016/j.cell.2011.10.033 (2011).

Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. Protein Expr Purif80, 283-293, doi:S1046-5928(l1)00203-8 [pii] 10.1016/j.pep.2011.08.005 (2011).

Sory, Μ. P. & Cornelis, G. R Translocation of a hybrid YopE-adenylate cyclase from Yersinia enterocolitica into HeLa cells. Mol Microbiol 14, 583594 (1994).

Sarker, M. R, Neyt, C, Stainier, I. & Cornelis, G. R The Yersinia Yop virulon: LcrV is requiredfor extrusion of the translocators YopB and YopD. J Bacteriol 180, 1207-1214 (1998).

Howard, S. L. et al. Application of comparative phylogenomics to study the evolution of Yersinia enterocolitica and to identify genetic differences relating to pathogenicity. Journal of bacteriology 188, 3645-3653, doi: 10.1128/JB.188.10.3645-3653.2006 (2006).

Neubauer, H, Aleksic, S., Hensel, A., Finke, E. J. & Meyer, H. Yersinia enterocolitica 16S rRNA gene types belong to the same genospecies but form three homology groups. Int J Med Microbiol 290, 61-64, doi: 10.1016/S14384221(00)80107-1 (2000).

Pelludat, C., Hogardt, M. & Heesemann, J. Transfer of the core region genes of the Yersinia enterocolitica WA-C serotype 0:8 high-pathogenicity island to Y. enterocolitica MRS40, a strain with low levels of pathogenicity, confers a yersiniabactin biosynthesis phenotype and enhanced mouse virulence. Infect Immun 70, 1832-1841 (2002).

Feldman, M. F, Muller, S., Wuest, E. & Cornelis, G. R SycE allows secretion ofYopE-DHFR hybrids by the Yersinia enterocolitica type III Ysc system. Mol Microbiol 46, 1183-1197, doi:3241 [pii] (2002).

Ramamurthi, K. S. & Schneewind, O. A synonymous mutation in Yersinia enterocolitica yopE affects the function of the YopE type III secretion signal. J Bacteriol 187, 707-715, doi: 187/2/707 [pii] 10.1128/JB.187.2.707-715.2005 (2005).

Wolke, S., Ackermann, N. & Heesemann, J. The Yersinia enterocolitica type 3 secretion system (T3SS) as toolbox for studying the cell biological effects of bacterial Rho GTPase modulating T3SS effector proteins. Cell Microbiol 13, 1339-1357, doi: 10.1111/j. 1462-5822.2011.01623.x (2011).

Forsberg, A. & Wolf-Watz, H. Genetic analysis of the yopE region of Yersiniaspp.: identification of a novel conserved locus, yer A, regulating yopE expression. JBacteriol 172, 1547-1555 (1990).

Sambrook, J. (ed David W. Russell) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. :, 2001).

Alto, N. M. & Dixon, J. E. Analysis ofRho-GTPase mimicry by a family of bacterial type III effector proteins. Methods Enzymol 439, 131-143, doi :S0076-6879(07)00410-7 [pii] 10.1016/S0076-6879(07)00410-7 (2008).

- 48 039922

Alto, N. M. et al. Identification of a bacterial type III effector family with G protein mimicry functions. Cell 124, 133-145, doi:S0092-8674(05)01229-8

[pii] 10.1016/j.cell.2005.10.031 (2006).

Kaniga, K, Delor, I. & Cornelis, G. R. A wide-host-range suicide vector for improving reverse genetics in gram-negative bacteria: inactivation of the blaA gene of Yersinia enter ocolitica. Gene 109, 137-141, doi:0378-l119(91)905997 [pii] (1991).

Yoneda, Y. et al. A long synthetic peptide containing a nuclear localization signal and its flanking sequences of SV40 T-antigen directs the transport of IgM into the nucleus efficiently. Exp Cell Res 201, 313-320 (1992).

Cornelis, G. R in Molecular aspects of host-pathoge interactions (ed SAUNDERSMoCRAE, SMYTH, STOW) (Cambridge University Press, 1997).

Metcalf, W. W., Jiang, W. & Wanner, B. L. Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance ofR6K gamma origin plasmids at different copy numbers. Gene 138, 1-7 (1994).

Diepold, A. et al. Deciphering the assembly of the Yersinia type III secretion injectisome. EMBO J 29, 1928-1940, doi:emboj201084 [pii]10.1038/emboj.2010.84 (2010).

Iriarte, M., Stainier, I. & Cornelis, G. R The rpoS gene from Yersinia enterocolitica and its influence on expression of virulence factors. Infect Immun 63, 1840-1847 (1995).

Cornelis, G., Vanootegem, J. C. & Sluiters, C. Transcription of the yop regulon from Y. enterocolitica requires trans actingpYV and chromosomal genes. Microb Pathog 2, 367-379, doi:0882-4010(87)90078-7 [pii] (1987).

Grosdent, N, Maridonneau-Parini, I., Sory, Μ. P. & Cornelis, G. R. Role of Yops and adhesins in resistance of Yersinia enterocolitica to phagocytosis. Infect Immun 70, 4165-4176 (2002).

Dehio, C, Meyer, M., Berger, J., Schwarz, H. & Lanz, C. Interaction of Bartonella henselae with endothelial cells results in bacterial aggregation on the cell surface and the subsequent engulftnent and internalisation of the bacterial aggregate by a unique structure, the invasome. J Cell Sci 110 (Pt 18), 2141-2154 (1997).

Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish Danio rerio (University of Oregon Press, Eugene, OR, 2000).

Kimmel, С. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R, Ullmann, B. & Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn 203, 253-310, doi:10.1002/aja.l002030302 (1995).

Benard, E. L. et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp, doi:3781 [pii]10.3791/3781 (2012).

Blum, Y. et al. Complex cell rearrangements during intersegmental vessel sprouting and vessel fusion in the zebrafish embryo. Dev Biol 316, 312-322, doi:S0012-1606(08)00079-1 [pii] 10.1016/j.ydbio.2008.01.038 (2008).

Herwig, L. et al. Distinct cellular mechanisms of blood vessel fusion in the zebrafish embryo. CurrBiol21, 1942-1948, doi:S0960-9822(l 1)01140-7 [pii] 10.1016/j.cub.2011.10.016 (2011).

Carpenter, A. E. et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol 7, R100, doi:gb-2006-7-10rlOO [pii] 10.1186/gb-2006-7-10-r 100 (2006).

- 49 039922

Bensimon, A. et al. ATM-dependent and -independent dynamics of the nuclear phosphoproteome after DNA damage. Sci Signal 3, rs3, doi: 10.1126/scisignal.20010343/15l/rs3 [pH] (2010).

Perkins, D. N., Pappin, D. J., Creasy, D. M. & Cottrell, J. S. Probabilitybased protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis 20, 3551-3567, doi: 10.1002/(SICI)15222683(19991201)20:18<3551::AID-ELPS3551>3. 0. CO; 2-2 [pii]10.1002/(SICI)1522-2683(19991201)20:18<3551::AIDELPS3551>3.0.CO;2-2 (1999).

Smyth, G. K. Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Stat Appl Genet Mol Biol 3, Articles, doi: 10.2202/1544-6115.1027 (2004).

Ting, L. et al. Normalization and statistical analysis of quantitative proteomics data generated by metabolic labeling. Mol Cell Proteomics 8, 2227-2242, doi: 10.1074/mcp.M800462-MCP200M800462-MCP200 [pH] (2009).

Vizcaino, J. A. et al. The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013. Nucleic Acids Res 41, D1063-1069, doi:gksl262 [pH]10.1093/nar/gksl262 (2013).

Boyd, A. P., Lambermont, I. & Cornelis, G. R. Competition between the Yops of Yersinia enterocolitica for delivery into eukaryotic cells: role of the SycE chaperone binding domain of YopE. JBacteriol 182, 4811-4821 (2000).

Iriarte, M. & Cornelis, G. R. YopT, a new Yersinia Yop effector protein, affects the cytoskeleton of host cells. Mol Microbiol 29, 915-929 (1998).

Kudryashev, M. et al. In situ structural analysis of the Yersinia enterocolitica injectisome. Elife 2, e00792, doi: 10.7554/eLife.0079200792 [pH] (2013).

Schulte, R. et al. Yersinia enterocolitica invasin protein triggers IL-8 production in epithelial cells via activation of Rei p65-p65 homodimers. FASEBJ14, 1471-1484 (2000).

Mota, L. J., Journet, L., Sorg, I, Agrain, C. & Cornelis, G. R Bacterial injectisomes: needle length does matter. Science 30 7, 1278, doi:30 7/5713/1278 [pH] 10.1126/science.l107679 (2005).

Isaksson, E. L. et al. The membrane localization domain is requiredfor intracellular localization and autoregulation of YopE in Yersinia pseudotuberculosis. InfectImmun 77, 4740-4749, doi:IAI.00333-09 [pH] 10.1128/IAI. 00333-09 (2009).

Denecker, G. et al. Effect of low- and high-virulence Yersinia enterocolitica strains on the inflammatory response of human umbilical vein endothelial cells. Infect Immun 70, 3510-3520 (2002).

Sharma, S. et al. Deployment of the Burkholderia glumae type III secretion system as an efficient tool for translocating pathogen effectors to monocot cells. Plant J 74, 701-712, doi: 10.1111/tpj. 12148 (2013).

Carrington, J. C. & Dougherty, W. G. A viral cleavage site cassette: identification of amino acid sequences requiredfor tobacco etch virus polyprotein processing. Proc Natl Acad Sci U S A 85, 3391-3395 (1988).

Kapust, R. B., Tozser, J., Copeland, T. D. & Waugh, D. S. The Pl'specificity of tobacco etch virus protease. Biochem Biophys Res Commun 294, 949-955, doi:10.1016/S0006-291X(02)00574-0S0006-291X(02)00574-0 [pH] (2002).

- 50 039922

Liang, H., Gao, H., Maynard, С. A. & Powell, W. A. Expression of a selfprocessing, pathogen resistance-enhancing gene construct in Arabidopsis.

BiotechnolLett 27, 435-442, doi: 10.1007X10529-005-1884-9 (2005).

Weber, W. et al. Macrolide-based transgene control in mammalian cells and mice. Nat Biotechnol 20, 901-907, doi: 10.1038/nbt731nbt731 [pii] (2002).

Kapust, R. B. et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng 14, 993-1000 (2001).

Lee, V. T, Anderson, D. M. & Schneewind, O. Targeting of Yersinia Yop proteins into the cytosol ofHeLa cells: one-step translocation ofYopE across bacterial and eukaryotic membranes is dependent on SycE chaperone. Mol Microbiol 28, 593-601 (1998).

Gray, D. C., Mahrus, S. & Wells, J. A. Activation of specific apoptotic caspases with an engineered small-molecule-activated protease. Cell 142, 637-646, doi:S0092-8674(10)00783-X[pii] 10.1016/j.cell.2010.07.014 (2010).

Henrichs, T. et al. Target-directed proteolysis at the ribosome. Proc Natl Acad Sci USA 102, 4246-4251, doi: 102/12/4246 [pii]10.1073/pnas.0408520102 (2005).

Hardt, W. D., Chen, L. M., Schuebel, К. E., Bustelo, X. R. & Galan, J. E. S. typhimurium encodes an activator of Rho GTPases that induces membrane ruffling and nuclear responses in host cells. Cell 93, 815-826, doi:S00928674(00)81442-7 [pii] (1998).

Hakansson, S. et al. The YopB protein of Yersinia pseudotuberculosis is essential for the translocation of Yop effector proteins across the target cell plasma membrane and displays a contact-dependent membrane disrupting activity. EMBO J15, 5812-5823 (1996).

Stebbins, С. E. & Galan, J. E. Structural mimicry in bacterial virulence. Nature 412, 701-705, doi: 10.1038/3508900035089000 [pii] (2001).

Li, H. et al. The phosphothreonine lyase activity of a bacterial type III effector family. Science 315, 1000-1003, doi:315/5814/1000 [pii] 10.1126/science. 1138960 (2007).

Norris, F. A., Wilson, Μ. P., Wallis, T. S., Galyov, E. E. & Majerus, P. W. SopB, a protein requiredfor virulence of Salmonella dublin, is an inositol phosphate phosphatase. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 14057-14059 (1998).

Pulliainen, A. T. et al. Bacterial effector binds host cell adenylyl cyclase to potentiate Galphas-dependent cAMP production. Proc Natl Acad Sci USA 109, 9581-9586, doi: 1117651109 [pii]10.1073/pnas.l117651109 (2012).

Li, H., Zhu, H., Xu, C. J. & Yuan, J. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell 94, 491-501, doi:S0092-8674(00)81590-l [pii] (1998).

Nagar aj, N. et al. Deep proteome and transcriptome mapping of a human cancer cell line. Mol Syst Biol 7, 548, doi:msb201181 [pii]10.1038/msb.2011.81 (2011).

Caussinus, E., Kanca, O. & Affolter, M. Fluorescent fusion protein knockout mediated by anti-GFP nanobody. Nat Struct Mol Biol 19, 117-121, doi:nsmb.2180 [pii]10.1038/nsmb.2180 (2011).

Cosma, C. L., Swaim, L. E., Volkman, H., Ramakrishnan, L. & Davis, J. M. Zebrafish andfrog models of Mycobacterium marinum infection. Curr Protoc Microbiol Chapter 10, Unit 10B 12, doi:10.1002/0471729256.mcl0b02s3 (2006).

- 51 039922

Mathias, J. R. et al. Characterization of zebrafish larval inflammatory macrophages. Dev Comp Immunol 33, 1212-1217, doi: SO145-305X(09)001499 [pii] 10.1016/j.dci.2009.07.003 (2009).

Jette, C. A. et al. BIM and other BCL-2 family proteins exhibit cross-species conservation of function between zebrafish and mammals. Cell Death Differ 15, 1063-1072, doi:cdd200842 [pii]10.1038/cdd.2008.42 (2008).

Olsen, J. V. et al. Global, in vivo, and site-specific phosphorylation dynamics in signaling networks. Cell 127, 635-648, doi:S0092-8674(06)01274-8 [pii] 10.1016/j.cell. 2006.09.026 (2006).

Schmutz, C. et al. Systems-Level Overview of Host Protein Phosphorylation During Shigella flexneri Infection Revealed by Phosphoproteomics. Mol Cell Proteomics 12, 2952-2968, doiMl13.029918 [pii]10.1074/mcp.Ml13.029918 (2013).

Szklarczyk, D. et al. The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored. Nucleic Acids Res 39, D561-568, doi:gkq973 [pii]10.1093/nar/gkq973 (2011).

Huang da, W., Sherman, В. T. & Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res 37, 1-13, doi:gkn923 [pii]10.1093/nar/gkn923 (2009).

Huang da, W. et al. DAVID gene ID conversion tool. Bioinformation 2, 428-

430 (2008).

Schwerk, C. & Schulze-0 sthoff K. Regulation of apoptosis by alternative pre- mRNA splicing. Mol Cell 19, 1-13, doi:S1097-2765(05)01375-4

[pii] 10.1016/j.molceL 2005.05.026 (2005).

Papagiannakopoulos, T, Shapiro, A. & Kosik, K. S. MicroRNA-21 targets a network of key tumor-suppressive pathways in glioblastoma cells. Cancer Res 68, 8164-8172, doi:68/19/8164 [pii]10.1158/0008-5472.CAN-08-1305 (2008).

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Вектор для трансформации рекомбинантного грамотрицательного бактериального штамма, который содержит в направлении от 5' до 3':

промотор;

первую последовательность ДНК, кодирующую сигнал доставки или его фрагмент от бактериального T3SS-эффекторного белка, функционально связанного с указанным промотором;

при этом указанный сигнал доставки или его фрагмент от бактериального T3SS-эффекторного белка содержит эффекторный белок, выбранный из группы, состоящей из эффекторного белка YopE или его N-концевого фрагмента, эффекторного белка SopE или его N-концевого фрагмента, и эффекторного белка SteA или его N-концевого фрагмента, и вторую последовательность ДНК, кодирующую повторяющиеся домены гетерологичного белка, причем указанные повторяющиеся домены гетерологичного белка содержат слитый белок, состоящий из нескольких повторов домена гетерологичного белка, или два или более доменов различных гетерологичных белков, причем указанные два или более доменов различных гетерологичных белков содержат слитый белок, состоящий из одного или нескольких повторов по меньшей мере двух доменов различных гетерологичных белков, слитых в рамке с 3'-концом указанной первой последовательности ДНК, причем гетерологичные белки представляют собой белки, участвующие в апоптозе или регуляции апоптоза.
2. Вектор для трансформации рекомбинантного грамотрицательного бактериального штамма, который содержит в направлении от 5' до 3':

первую последовательность ДНК, кодирующую сигнал доставки или его фрагмент из бактериального T3SS-эффекторного белка;

при этом указанный сигнал доставки или его фрагмент от бактериального T3SS-эффекторного белка содержит эффекторный белок, выбранный из группы, состоящей из эффекторного белка YopE или его N-концевого фрагмента, эффекторного белка SopE или его N-концевого фрагмента, и эффекторного белка SteA или его N-концевого фрагмента; и вторую последовательность ДНК, кодирующую повторяющиеся домены гетерологичного белка, причем указанные повторяющиеся домены гетерологичного белка содержат слитый белок, состоящий из нескольких повторов домена гетерологичного белка, или два или более доменов различных гетерологичных белков, причем указанные два или более доменов различных гетерологичных белков содержат слитый белок, состоящий из одного или нескольких повторов по меньшей мере двух доменов различных гетерологичных белков, слитых в рамке с 3'-концом указанной первой последовательности ДНК, причем гетерологичные белки представляют собой белки, участвующие в апоптозе или регуляции апоптоза.
3. Вектор по п.1 или 2, где белки, участвующие в апоптозе или регуляции апоптоза, выбраны из

- 52 039922 группы, состоящей из белков BH3-only, выбранных из группы, состоящей из Bad, BIM, Bid и tBid, Puma,

Bik/Nbk, Bod, Hrk/Dp5, BNIP1, BNIP3, Bmf, Noxa, Mcl-1, Bcl-Gs, Beclin 1, Egl-1 и CED-13, каспаз и внутриклеточных сигнальных белков регуляции рецепторов смерти при апоптозе.
4. Вектор по п.1 или 2, где повторяющиеся домены идентичны или где повторяющиеся домены представляют собой по меньшей мере два повторяющихся домена, имеющих идентичность аминокислотной последовательности более 80%.
5. Вектор по п.1 или 2, где повторяющийся домен представляет собой BH3-домен индуктора апоптоза tBID.
6. Вектор по п.1 или 2, где два или более доменов различных гетерологичных белков представляют собой домены гетерологичных белков, принадлежащих к одному и тому же функциональному классу белков.
7. Вектор по п.1 или 2, где два или более доменов различных гетерологичных белков представляют собой BH3-домен индуктора апоптоза tBID и BH3-домен регулятора апоптоза ВАХ.
8. Вектор по п.1 или 2, где указанный вектор содержит третью последовательность ДНК, кодирующую сайт расщепления протеазой, где третья последовательность ДНК расположена между 3'-концом указанной первой последовательности ДНК и 5'-концом указанной второй последовательности ДНК.
9. Рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм для доставки повторяющихся доменов гетерологичного белка или двух или более доменов различных гетерологичных белков в эукариотические клетки, трансформированный вектором по п.1.
10. Рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм для доставки повторяющихся доменов гетерологичного белка или двух или более доменов различных гетерологичных белков в эукариотические клетки, трансформированный вектором по п.2.
11. Рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм по п.9 или 10, где указанный рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм дефицитен по продуцированию по меньшей мере одного эффекторного белка T3SS.
12. Рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм по любому из пп.9-11, где указанный рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм выбран из группы, состоящей из родов Yersinia, Escherichia, Salmonella и Pseudomonas.
13. Рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм по любому из пп.9-11, где указанный рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм выбран из группы, состоящей из родов Yersinia и Salmonella.
14. Рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм по любому из пп.9-11, где указанный рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм представлен штаммом Yersinia.
15. Рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм по любому из пп.9-11, где указанный рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм представлен штаммом Salmonella.
16. Рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм по п.9 или 10, где указанный рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм представлен штаммом Yersinia дикого типа, трансформированным вектором по п.1, или штаммом Yersinia, дефицитным по продуцированию по меньшей мере одного эффекторного белка T3SS, трансформированным вектором по п.1, и где сигнал доставки от бактериального T3SS-эффекторного белка содержит N-концевые 138 аминокислот эффекторного белка Y. enterocolitica YopE.
17. Рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм по п.9 или 10, где указанный рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм представлен штаммом Salmonella дикого типа, трансформированным вектором по п.1, или штаммом Salmonella, дефицитным по продуцированию по меньшей мере одного эффекторного белка T3SS, трансформированным вектором по п.1, и в котором сигнал доставки из эффекторного белка бактерий T3SS содержит эффекторный белок S. enterica SteA или N-концевые 81 или 105 аминокислот эффекторного белка S. enterica SopE.
18. Рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм по любому из пп.9-17, где белки, участвующие в апоптозе или регуляции апоптоза, выбраны из группы, состоящей из белков BH3-only, выбранных из группы, состоящей из Bad, BIM, Bid и tBid, Puma, Bik/Nbk, Bod, Hrk/Dp5, BNIP1, BNIP3, Bmf, Noxa, Mcl-1, Bcl-Gs, Beclin 1, Egl-1 и CED-13, каспаз и внутриклеточных сигнальных белков регуляции рецепторов смерти при апоптозе.
19. Рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм по любому из пп.9-17, где повторяющиеся домены идентичны или где повторяющиеся домены представляют собой по меньшей мере два повторяющихся домена, имеющих идентичность аминокислотной последовательности более 80%.
20. Рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм по любому из пп.9-17, где повторяющийся домен представляет собой BH3-домен индуктора апоптоза tBID.
21. Рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм по любому из пп.9-17, где два или более доменов различных гетерологичных белков представляют собой домены гетерологичных белков, принадлежащих к одному и тому же функциональному классу белков.
22. Рекомбинантный грамотрицательный бактериальный штамм по любому из пп.9-17, где два или более доменов различных гетерологичных белков представляют собой BH3-домен индуктора апоптоза