CN108884466A - 基于细菌的蛋白递送 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及重组革兰氏阴性细菌菌株及其将异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域递送到真核细胞中的用途。

Description

基于细菌的蛋白递送
技术领域
本发明涉及重组革兰氏阴性细菌菌株及其将异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域递送到真核细胞中的用途。
背景技术
瞬时转染技术已经在细胞生物学研究中应用多年用来解决蛋白功能。这些方法通常导致被研究的蛋白大量过度表达，这可能产生过简化的信号模型。对于控制短寿命信号过程的蛋白，目标蛋白存在的时间远长于它控制的信号事件。甚至，基于DNA转染的瞬时过表达导致异质和不同步的细胞群，这使功能研究和阻碍组学方法复杂化。除此之外，将这些测定扩大到更大规模是非常昂贵的。以上提到的这些点由现有技术覆盖，如显微注射或纯化蛋白的蛋白转染、诱导型易位(translocation)策略快速靶向质粒出生的小GTP酶到细胞膜或添加融合ω细胞可渗透细菌毒素的纯化蛋白。但是这些技术都很耗时且麻烦，并且根据我们的知识，没有一个满足所有提到的标准。
细菌已经进化形成了不同的机制来将蛋白直接注射到靶细胞中[1]。被耶尔森氏菌、志贺氏菌和沙门氏菌[2]等细菌使用的III型分泌系统(T3SS)的功能类似于将所谓的细菌效应蛋白注射到宿主细胞中的纳米注射器。通过T3SS分泌的细菌蛋白(称为效应子)，含有短的N-末端分泌信号[3]。在细菌内，有些效应子被分子伴侣结合。分子伴侣可能掩盖毒性结构域，它们有助于分泌信号的暴露，并保持底物处于具有分泌能力的构象，因此促进分泌。在诱导分泌时，邻近T3SS的ATP酶去除分子伴侣，并且效应子通过针头展开或仅部分折叠，并在宿主细胞质中重折叠一次。
T3S已经被用来将杂交肽和蛋白递送到靶细胞中。异源细菌T3SS效应子已经被传递，以防所研究的细菌难以通过遗传学获得(如沙眼衣原体)。通常将报告蛋白融合到可能的T3SS分泌信号从而研究对T3SS依赖性蛋白递送的需求，例如百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)腺苷酸环化酶、鼠DHFR或可磷酸化标签。肽递送主要以疫苗接种为目的进行。这包括病毒表位、细菌表位(李斯特菌溶血素O)以及代表人类癌细胞表位的肽。在少数情况下，递送功能性真核蛋白来调节宿主细胞，如递送纳米抗体[4]、核蛋白(Cre重组酶，MyoD)[5,6]或Il10和ILlra[7]。上述系统中没有一个允许单蛋白递送，因为在每种情况下，均会编码一个或多个内源效应蛋白。此外，使用的载体没有设计出能简单克隆编码所选蛋白的其它DNA片段，阻碍了这种系统的广泛应用。出人意料地是，已发现，将异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的结构域的组合递送到真核细胞扩大了对所需细胞途径的影响。
发明内容
本发明主要涉及重组革兰氏阴性细菌菌株及其用于将异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域递送到真核细胞中的用途。本发明提供了革兰氏阴性细菌菌株及其用途，其允许异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域的易位，例如各种III型效应子，和IV型效应子，病毒蛋白以及最重要的功能性真核蛋白。本发明提供了用于荧光跟踪递送，用于重新定位至细胞核并且特别是用于在递送至宿主细胞之后去除细菌附属物的装置。所呈现的基于T3SS的系统导致目标异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域可扩展、快速、同步同质和可调节的递送。本发明的递送系统适合于在活动物中注射真核蛋白的重复结构域或不同真核蛋白的两个或多个结构域并且可以用于治疗目的。
在第一方面，本发明涉及用如下载体转化的重组革兰氏阴性细菌菌株，所述载体沿5'至3'方向包含：
启动子；
编码来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号的第一DNA序列，其可操作地连接到所述启动子上；以及
编码异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域的第二DNA序列，其与所述第一DNA序列的3'末端框内融合，其中所述异源蛋白选自由以下组成的组：参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白、细胞周期调节剂、锚蛋白重复蛋白、细胞信号转导蛋白、报道蛋白、转录因子、蛋白酶、小GTP酶、GPCR相关蛋白、纳米抗体融合构建体和纳米抗体、细菌T3SS效应子，细菌T4SS效应子和病毒蛋白。
在另一方面，本发明涉及用如下载体转化的重组革兰氏阴性细菌菌株，所述载体沿5'至3'方向包含：
编码来自细菌效应蛋白的递送信号或其片段的第一DNA序列；以及
编码异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域的第二DNA序列，其与所述第一DNA序列的3'末端框内融合，其中所述异源蛋白选自由以下组成的组：参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白、细胞周期调节剂、锚蛋白重复蛋白、细胞信号转导蛋白、报道蛋白、转录因子、蛋白酶、小GTP酶、GPCR相关蛋白、纳米抗体融合构建体和纳米抗体、细菌T3SS效应子、细菌T4SS效应子和病毒蛋白。
在另一方面，本发明涉及一种载体，所述载体沿5'至3'方向包含：
编码来自细菌效应蛋白的递送信号或其片段的第一DNA序列；以及
编码异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域的第二DNA序列，其与所述第一DNA序列的3'末端框内融合，其中所述异源蛋白选自由以下组成的组：参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白、细胞周期调节剂、锚蛋白重复蛋白、细胞信号转导蛋白、报道蛋白、转录因子、蛋白酶、小GTP酶、GPCR相关蛋白、纳米抗体融合构建体和纳米抗体、细菌T3SS效应子、细菌T4SS效应子和病毒蛋白。
在另一方面，本发明涉及一种载体，所述载体沿5'至3'方向包含：
启动子；
编码来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号的第一DNA序列，其可操作地连接到所述启动子上；
编码异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域的第二DNA序列，其与所述第一DNA序列的3'末端框内融合，
其中所述异源蛋白选自由以下组成的组：参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白、细胞周期调节剂、锚蛋白重复蛋白、细胞信号转导蛋白、报道蛋白、转录因子、蛋白酶、小GTP酶、GPCR相关蛋白、纳米抗体融合构建体和纳米抗体、细菌T3SS效应子、细菌T4SS效应子和病毒蛋白。
本发明还涉及将异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域递送到真核细胞中的方法，包括以下步骤：
i)培养革兰氏阴性细菌菌株；以及
ii)将真核细胞与i)的革兰氏阴性细菌菌株接触，其中革兰氏阴性细菌菌株表达融合蛋白，所述融合蛋白包含来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号和异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域，并且所述融合蛋白被易位到真核细胞中。
本发明还涉及将异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域递送到真核细胞中的方法，包括以下步骤：
i)培养革兰氏阴性细菌菌株；
ii)使真核细胞与i)的革兰氏阴性细菌菌株接触，其中革兰氏阴性细菌菌株表达融合蛋白，所述融合蛋白包含来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号和异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域，并且所述融合蛋白被易位到真核细胞中；以及
iii)切割融合蛋白，使得异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域与细菌T3SS效应蛋白的递送信号切割开来。
在另一方面，本发明涉及革兰氏阴性细菌菌株的文库，其中由革兰氏阴性细菌菌株的表达载体的第二DNA序列编码的异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域是人或鼠蛋白，并且其中由革兰氏阴性菌株表达的每个人或鼠蛋白的结构域的氨基酸序列不同。
附图说明
图1：T3SS蛋白递送的表征。(A)T3SS依赖性蛋白分泌到周围介质(体外分泌)(左侧)或真核细胞(右侧)的示意图。I：示出了3型分泌系统。II表示蛋白分泌到周围介质中，III表示蛋白通过膜易位到真核细胞的胞质溶胶中(VII)。VI示出了其中插入了T3SS的两个细菌膜的延伸和下面的细菌胞质溶胶。IV是与YopE1-138N-末端片段(V)连接的融合蛋白(B)如通过使用抗-YopE抗体对总细菌裂解物(IV)和沉淀的培养物上清液(V)进行Western印迹所揭示的I，以下的体外分泌：：小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)E40野生型，II：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd，或III：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+pBadSi_2。
图2：T3SS蛋白递送至上皮细胞中的表征。(A)HeLa细胞上的抗-Myc免疫荧光染色，其中HeLa细胞用I：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd或II：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+pBad_Si2以100的MOI感染1小时。(B)根据(A)HeLa细胞内的抗-Myc免疫荧光染色强度的定量。数据由n＝20个位点组合而成，所示误差线表示平均值的标准误差。I：未感染，II：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd或III：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+pBad_Si2。Y-轴表示抗-Myc染色强度[任意单位]，x-轴表示感染时间(单位为分钟)(C)细胞内抗-Myc免疫荧光染色强度的定量。HeLa细胞以x轴上指示的MOI，用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+pBad_Si2感染1小时。数据由n＝20个位点组合而成，所示误差线表示平均值的标准误差。Y-轴表示抗Myc染色强度[a.u.]。
图3：基于T3SS的蛋白递送的修饰允许YopE1-138融合蛋白(EGFP)的核定位。Hela细胞中的EGFP信号，所述Hela细胞以100的MOI用I：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd或II：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd ΔyopB感染，其携带有质粒III：+YopE1-138-EGFP或IV：+YopE1-138-EGFP-NLS。EGFP信号示于“a”中，“b”中对核进行了染色用于定位比较。
图4：基于T3SS的蛋白递送的修饰允许去除YopE1-138附属物。HeLa细胞同时用两种不同的小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株感染，这是通过简单混合两种细菌悬液而达到的。一种菌株递送与YopE1-138融合的TEV蛋白酶，而另一种菌株递送用连接体(linker)与YopE1-138融合的目标蛋白，所述连接体含有一个双TEV蛋白酶切割位点。在将蛋白递送到真核细胞中后，TEV蛋白酶将使YopE1-138附属物从目标蛋白切割下来(A)通过抗-INK4C蛋白印迹(示于“a”中)对毛地黄(digitonin)裂解的HeLa细胞进行分析，以分析YopE1-138–2x TEV切割位点–Flag-INK4C或其切割形式Flag-INK4C的存在，所述HeLa细胞未被感染(II)，或用以下感染(MOI为100)2h：I：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd和III：+pBadSi_2，IV：+YopE1-138-2xTEV切割位点-Flag-INK4C，V：+YopE1-138-2x TEV切割位点-Flag-INK4C并进一步用纯化的TEV蛋白酶过夜处理，和VI：+YopE1-138-2x TEV切割位点-Flag-INK4C及第二菌株+YopE1-138-TEV。作为上样对照，进行抗肌动蛋白western印迹(显示在“b”中)。在一种情况下(V)，将裂解的细胞与纯化的TEV蛋白酶孵育过夜。(B)对(A)中YopE1-138-2x TEV切割位点-Flag-INK4C全长大小处的抗-INK4C染色强度的抗肌动蛋白标准化定量(在y-轴上显示为[a.u.])，其中样品IV设置为100％。I：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd和IV：+YopE1-138-2x TEV切割位点-Flag-INK4C，V：+YopE1-138-2x TEV切割位点-Flag-INK4C并进一步用纯化的TEV蛋白酶过夜处理，和VI：+YopE1-138-2x TEV切割位点-Flag-INK4C及第二菌株+YopE1-138-TEV。数据由n＝2个独立实验组合而成，所示误差线表示平均值的标准误差。(C)通过抗-Myc蛋白印迹(示于“a”中)对毛地黄裂解的HeLa细胞进行分析，以分析YopE1-138–2x TEV切割位点–ET1–Myc或其切割形式ET1–Myc的存在，所述HeLa细胞未被感染(II)，或用以下感染(MOI为100)2小时：I：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd和III：+pBadSi_2，IV：+YopE1-138-2x TEV切割位点-ET1–Myc，V：+YopE1-138-2x TEV切割位点-ET1–Myc并进一步用纯化的TEV蛋白酶过夜处理，和VI：+YopE1-138-2x TEV切割位点-ET1–Myc及第二菌株+YopE1-138-TEV。作为上样对照，进行抗肌动蛋白western印迹(显示在“b”中)。在一种情况下(V)，将裂解的细胞与纯化的TEV蛋白酶孵育过夜。
图5：将细菌效应蛋白递送到真核细胞中(A)HeLa细胞以100的MOI用I：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd感染图上方所示的时间(2，10或60分钟)，所述小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd携带II：pBad_Si2或III：YopE1-138-SopE。固定后，将细胞进行肌动蛋白细胞骨架染色。(B)HeLa细胞未被感染(II)或以菌株下方所示的MOI(MOI 50；MOI50:MOI50或MOI50:MOI100)用携带III：YopE1-138-SopE-Myc的I：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd感染，在一些情况下与IV：YopE1-138-SptP共感染1小时。固定后，将细胞进行肌动蛋白细胞骨架染色(如“a”所示)，然后通过抗-Myc染色确定YopE1-138-SopE-Myc融合蛋白的存在(如“b”所示)。
图6：将细菌效应蛋白递送到真核细胞中(A)HeLa细胞的磷酸-p38(“a”)，总p38(“b”)和肌动蛋白(“c”)western印迹分析，所述HeLa细胞未经处理(II)，或以100的MOI用I：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd感染75分钟，所述小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMTasd携带III：pBad_Si2或IV：YopE1-138-OspF。如所示，感染的最后30分钟用TNFα刺激细胞(+表示加入TNFα，-代表未用TNFα处理)(B)HeLa细胞的磷酸-Akt T308(“a”)和S473(“b”)以及肌动蛋白(“c”)western印迹分析，所述HeLa细胞未经处理(II)，或以100的MOI用I：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd感染22.5或45分钟(如印迹下方所示)，所述小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd携带III：pBad_Si2，IV：YopE1-138-SopE或V：YopE1-138-SopB(C)HeLa细胞中的cAMP水平(在y-轴上以fmol/孔示出)，所述HeLa细胞未经处理(I)或以100的MOI用V：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+YopE1-138-BepA，VI：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMTasd+YopE1-138-BepAE305-末端，VII：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+YopE1-138-BepGBid或VIII：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+pBad_Si2感染2.5小时。加入霍乱毒素(cholera toxin，CT)1小时作为样品II(1μg/ml)，III(25μg/ml)或IV(50μg/ml)的阳性对照。数据由n＝3个独立实验组合而成，所示误差线表示平均值的标准误差。使用未配对的双尾t检验进行统计分析(ns表示非显著变化，**表示p值<0.01，***表示p值<0.001)。
图7：人tBid递送到真核细胞中诱导大量细胞凋亡。(A)对HeLa细胞进行切割的半胱天冬酶(Caspase)3p17(“a”)和肌动蛋白(“b”)western印迹分析，所述HeLa细胞未经处理(II)，或以100的MOI用I：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd感染60分钟，所述小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd携带III：pBad_Si2，IV：YopE1-138-Bid或V：YopE1-138-t-Bid。在一些情况下，细胞用VI：0.5μM星形孢菌素(Staurosporine)或VII：1μM星形孢菌素处理(B)通过抗-Bid蛋白印迹(示于“a”中)对毛地黄皂苷裂解的HeLa细胞进行分析，允许比较内源Bid水平(标记为Z)与易位的YopE1-138-Bid(标记为X)或YopE1-138-tBid(标记为Y)水平，所述HeLa细胞未经处理(II)，或以100的MOI用I：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd感染1小时，所述小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd携带III：pBad_Si2，IV：YopE1-138-Bid或V：YopE1-138-t-Bid。作为上样对照，进行抗肌动蛋白western印迹(显示在“b”中)。在一些情况下，细胞用VI：0.5μM星形孢菌素或VII：1μM星形孢菌素处理(C)HeLa细胞不经处理(I)，或用II：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+pBad_Si2，III：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMTasd+YopE1-138-Bid，IV：小肠结肠炎耶尔森氏菌+YopE1-138-tBid以100的MOI感染1小时。在一些情况下，细胞用V：0.5μM星形孢菌素或VI：1μM星形孢菌素处理固定后，对细胞进行肌动蛋白细胞骨架染色(灰色)。
图8：斑马鱼BIM的T3SS依赖性递送诱导斑马鱼胚胎的细胞凋亡。(A)通过注射约400个细菌进入后脑区用表达小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+pBad_Si1对照菌株(1)或zBIM转位菌株(II：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+YopE1-138-zBIM)感染2个dpf斑马鱼胚胎。5.5小时后，将胚胎固定，对活化的半胱天冬酶3(裂解的半胱天冬酶3，p17；以“c”表示)染色并分析细菌的存在(EGFP信号，以“b”表示)。最大强度z投影以荧光图像显示。亮场z投影以“a”表示。(B)记录的(A)z-堆叠图像在最大强度z投影上的自动图像分析。简要地，通过GFP通道检测细菌，围绕细菌斑点的每个区域产生半径为10像素的圆，重叠区域在连接构件之间平均分开。在紧密围绕细菌的那些区域中，测量半胱天冬酶3p17染色强度并在y轴上绘图(如[a.u.])使用Mann-Whitney检验进行统计分析(***表示p<0.001)。对于小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+pBad_Si1对照菌株(I)，采取n＝14数据合并或对于II：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+YopE1-138-zB1M感染的动物，采取n＝19数据合并，指示的误差条是标准误差均值。
图9：tBiD依赖性磷酸化蛋白组：HeLa细胞以100的MOI用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+YopE1-138-t-Bid和小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT+asd+pBad_Si2(作为对照)感染30分钟。(A)tBID磷酸化蛋白组的图示。在已知和预测的蛋白-蛋白相互作用(高置信，评分0.7)的STRING网络中示出了以tBid依赖性方式被显著调节的含有磷酸肽的蛋白(灰色)(q值<0.01)以及已知的细胞凋亡相关蛋白(深灰色)。仅示出了STRING中至少有一个关联的蛋白。(B)HeLa细胞的共聚焦图像揭示了tBid递送后细胞凋亡表型的诱导，所述HeLa细胞用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+pBad_Si2(I)或小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+YopE1-138-t-Bid(II)感染。使用Hoechst对细胞核进行染色(“a”)，施用鬼笔环肽(phalloidin)对F-肌动蛋白进行染色(“b”)，使用抗微管蛋白抗体对微管蛋白进行染色(“c”)，使用mitotracker对线粒体进行染色(“d”)。标尺代表40μM。
图10：基于III型分泌的递送工具盒的描述。(A)用于与YopE1-138产生融合构建体的克隆质粒pBad_Si1和pBad_Si2的载体图谱。分子伴侣SycE和YopE1-138-融合体在天然的小肠结肠炎耶尔森氏菌启动子之下。两种质粒的不同之处仅在于pBad_Si1上存在阿拉伯糖可诱导的EGFP。(B)pBad_Si1和pBad_Si2质粒上直接在yopE1-138片段之后的多个克隆位点。
图11：T3SS蛋白递送至多种细胞系中的表征。瑞士3T3成纤维细胞(“a”)、Jurkat细胞(“b”)和HUVEC细胞(“c”)的抗-Myc免疫荧光染色，所述HUVEC细胞未经处理(II)或以图像上方示出的MOI(对于HUVEC，MOI为25，50，100，200和400)用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+pBad_Si2(I)感染1小时。
图12：细菌效应蛋白向真核细胞中的T3SS递送依赖性。通过抗-Myc蛋白印迹对毛地黄皂苷裂解的HeLa细胞进行分析，所述HeLa细胞以100的MOI用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd ΔyopB+YopE1-138-SopE-Myc(I)或小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+YopE1-138-SopE-Myc(II)感染印迹上方所示的时间(0，5，15，10，60和120分钟)。与YopE1-138-SopE-Myc对应的大小用“a”标记，而内源性c-Myc蛋白的大小用“b”标记。
图13和14：各种其他蛋白向培养上清液中的T3SS依赖性分泌。与所示蛋白融合的I：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+YopE1-138体外分泌实验。使用抗-YopE抗体通过Western印迹分析总细菌裂解物(“A”)和沉淀的培养物上清液(“B”)的蛋白含量。写出的数字表示相应高度处的kDa分子量。
图15A至N：在本研究中使用的小肠结肠炎耶尔森氏菌和肠道沙门氏菌(S.enterica)菌株。本研究中使用的小肠结肠炎耶尔森氏菌和肠道沙门氏菌菌株的列表提供了在相应质粒上编码的用于T3SS依赖性递送的背景菌株、质粒和蛋白的信息。此外，提供了用于构建相应质粒的寡核苷酸、骨架质粒和抗生素抗性的信息。
图16：小鼠tBid、小鼠Bid BH3和小鼠Bax BH3递送至B16F10细胞中诱导大量细胞凋亡。B16F10细胞未被感染(I)或用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd和II：+pBadSi_2，III：+YopE1-138-小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的小鼠tBid，IV：+YopE1-138-小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的小鼠Bid BH3或V：+YopE1-138-小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的小鼠Bax BH3感染(MOI为50)2.5小时。固定后，对细胞进行肌动蛋白细胞骨架和细胞核染色(均为灰色)。
图17：小鼠tBid、小鼠Bid BH3和小鼠Bax BH3递送至D2A1细胞中诱导大量细胞凋亡。D2A1细胞未被感染(I)或用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd和II：+pBadSi_2，III：+YopE1-138-小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的小鼠tBid，IV：+YopE1-138-小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的小鼠Bid BH3或V：+YopE1-138-小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的鼠Bax BH3感染(MOI为50)2.5小时。固定后，对细胞进行肌动蛋白细胞骨架和细胞核染色(均为灰色)。
图18：小鼠tBid、小鼠Bid BH3和小鼠Bax BH3递送至HeLa细胞中诱导大量细胞凋亡。HeLa细胞未被感染(I)或用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd和II：+pBadSi_2，III：+YopE1-138-小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的小鼠tBid，IV：+YopE1-138-小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的小鼠Bid BH3或V：+YopE1-138-小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的小鼠Bax BH3感染(MOI为50)2.5小时。固定后，对细胞进行肌动蛋白细胞骨架和细胞核染色(均为灰色)。
图19：小鼠tBid、小鼠Bid BH3和小鼠Bax BH3递送至4T1细胞中诱导大量细胞凋亡。4T1细胞未被感染(I)或用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd和II：+pBadSi_2，III：+YopE1-138-小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的小鼠tBid，IV：+YopE1-138-小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的小鼠Bid BH3或V：+YopE1-138-小肠结肠炎耶尔森氏菌密码子优化的小鼠Bax BH3感染(MOI为50)2.5小时。固定后，对细胞进行肌动蛋白细胞骨架和细胞核染色(均为灰色)。
图20：由在SPI-1 T3SS诱导条件下生长的肠道沙门氏菌将小鼠tBid递送至真核细胞中诱导细胞凋亡。对HeLa细胞进行经切割的半胱天冬酶3p17western印迹分析，所述HeLa细胞未经处理(II)，或以100的MOI用III：肠道沙门氏菌aroA感染4小时，所述肠道沙门氏菌aroA携带IV：SteA1-20-t-Bid，V：SteAFL-Bid，VI：SopE1-81-t-Bid或VII：SopE1-105-t-Bid。对于该实验，所有肠道沙门氏菌aroA菌株均在SPI-1 T3SS诱导条件下生长。在一些情况下，细胞用II：1μM星形孢菌素处理。写出的数字表示相应高度处的kDa分子量。
图21：由在SPI-2 T3SS诱导条件下生长的肠道沙门氏菌将小鼠tBid递送至真核细胞中诱导细胞凋亡。对HeLa细胞进行经切割的半胱天冬酶3p17western印迹分析，所述HeLa细胞未经处理(II)，或以100的MOI用III：肠道沙门氏菌aroA感染4小时，所述肠道沙门氏菌aroA携带IV：SteA1-20-t-Bid，V：SteAFL-Bid，VI：SopE1-81-t-Bid或VII：SopE1-105-t-Bid。对于该实验，所有肠道沙门氏菌aroA菌株均在SPI-2 T3SS诱导条件下生长。在一些情况下，细胞用II：1μM星形孢菌素处理。写出的数字表示相应高度处的kDa分子量。
图22：各种细胞周期蛋白向培养上清液中的肠道沙门氏菌T3SS依赖性分泌。与如下列出的蛋白融合的肠道沙门氏菌aroA+SteAFL(I，III，V，VII)或SopE1-105(II，IV，VI，VIII)的体外分泌实验。I和II：Ink4a-MycHis；III和IV：Ink4c-MycHis；V和VI：Mad2-MycHis；VII和VIII：Cdk1-MycHis。使用抗-myc抗体通过western印迹分析沉淀的培养上清液(“A”)和总细菌裂解物(“B”)的蛋白含量。写出的数字表示相应高度处的kDa分子量。
图23：各种已知细胞周期干扰肽向培养上清液的T3SS依赖性分泌。I：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+pBad_Si2的体外分泌实验。II-VII：与如下所列的肽融合的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+YopE1-138：II：Ink4A84-103；III：p107/RBL1657-662；IV：p21141-160D149A；V：p21145-160D149A；VI：p2117-33；VII：细胞周期蛋白D2139-147。使用抗-YopE抗体通过western印迹分析沉淀的培养上清液(“A”)和总细菌裂解物(“B”)的蛋白含量。写出的数字表示相应高度处的kDa分子量。
图24：T3SS递送的蛋白与泛素的融合允许去除YopE1-138附属物。用递送目标蛋白的菌株感染HeLa细胞，所述目标蛋白与具有直接融合的泛素的YopE1-138(YopE1-138-Ubi)融合。在将蛋白递送到真核细胞中后，内源性泛素特异的蛋白酶将使YopE1-138-Ubi附属物从目标蛋白切割下来。通过抗-INK4C蛋白印迹对毛地黄皂苷裂解的HeLa细胞进行分析，以分析IV：YopE1-138-Flag-泛素-INK4C-MycHis或V：YopE1-138-Flag-INK4C-MycHis，切割形式VI：INK4C-MycHis和VII：内源INK4C的存在，所述HeLa细胞未被感染(I)，或用II:小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+YopE1-138-Flag-INK4C-MycHis或III：+YopE1-138-Flag-泛素-INK4C-MycHis感染(MOI为100)1小时。
图25：通过细菌T3SS递送的异源蛋白及其结构域的示意图。I：人/鼠全长蛋白，结构域以各种灰度着色，II：截短型人/鼠蛋白，结构域以各种灰度着色，III：仅人/鼠全长蛋白的基序/结构域，IV：人/鼠全长蛋白的仅重复基序/结构域(左)或两个不同基序/结构域的组合(右)。
图26：将鼠tBid和鼠Bax的BH3结构域递送到真核细胞中并且其融合的重复结构域诱导癌细胞中的细胞凋亡。B16F10鼠黑素瘤细胞用所示的相应细菌以5、10、25和50(各条件下从左至右)的MOI感染4小时。通过核计数来计数细胞数来评估对细胞活力的影响。I：核计数。II：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+pBad_Si2，III：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+YopE1-138-Bid-BH3，IV：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+YopE1-138-(Bid-BH3)2和V：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+YopE1-138-(Bid-BH3)-(Bax-BH3)。细胞核用Hoechst染色。使用自动显微镜获取图像，并使用CellProfiler自动确定细胞数。
图27：将鼠tBid和鼠Bax的BH3结构域递送到真核细胞中并且其融合的重复结构域诱导癌细胞中的细胞凋亡。4T1鼠乳腺癌细胞用所示的相应细菌以5、10、25和50(各条件下从左至右)的MOI感染4小时。通过核计数来计数细胞数来评估对细胞活力的影响。I：核计数。II：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+pBad_Si2，III：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+YopE1-138-Bid-BH3，IV：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+YopE1-138-(Bid-BH3)2和V：小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd+YopE1-138-(Bid-BH3)-(Bax-BH3)。细胞核用Hoechst染色。使用自动显微镜获取图像，并使用CellProfiler自动确定细胞数。
图28：合成的增加的促细胞凋亡蛋白的递送。由源自促细胞凋亡蛋白t-BID或BAX的单个或串联重复BH3结构域组成的单一合成蛋白的递送导致4T1和B16F10癌细胞中细胞凋亡诱导增强。4T1(I)或B16F10(II)细胞用小肠结肠炎耶尔森氏菌Δyop HOPEMT感染，其在pBad-MycHisA IV：YopE1-138-tBID BH3延伸结构域，V：YopE1-138-连接体-tBID BH3，VI：YopE1-138-tBID BH3，VII：YopE1-138-(tBID BH3)2，VIII：YopE1-138-tBID BH3-BAX BH3或IX：YopE1-138-BAX BH3-tBID BH3上编码。对于每种菌株，对向细胞中加入的细菌进行滴定(MOI)，确定细胞计数并使用非线性回归计算IC50。示出了IC50 MOI(III)。
图29：pYV编码的合成促细胞凋亡蛋白诱导细胞凋亡。在pYV上编码的单个或串联重复BID BH3结构域的递送导致4T1和B16F10癌细胞中的细胞凋亡诱导。4T1(I)或B16F10(II)细胞用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT+IV：pYV-YopE1-138-BH3-Bid，或V：+pYV-YopE1-138-(BH3-Bid)2或VI：用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT pBad-MycHisA-YopE1-138-(BH3-Bid)2感染3小时。对于每种菌株，对向细胞中加入的细菌进行滴定(MOI)，确定细胞计数并使用非线性回归计算IC50(III)。
图30：静脉注射的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH，O，P，E，M，T在4T1乳腺癌同种异体移植模型中的肿瘤定植。肿瘤中的细菌计数以每克组织的菌落形成单位(CFU)表示(III)。在感染后第8天(I)和第14(II)天评估肿瘤中的计数。每个点代表一个单独的小鼠。水平虚线表示检测限。
图31：静脉注射的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH，O，P，E，M，T在4T1乳腺癌同种异体移植模型中的生物分布。血液(I)、脾(II)、肝(III)、肺(IV)和肿瘤(V)中的细菌计数表示以每克组织或每ml血液的菌落形成单位(CFU)表示(VI)。在感染后第14天评估计数。每个点代表一个单独的小鼠。水平虚线表示检测限。*表示在肺上发现有大转移瘤的小鼠。
图32：用4T1乳腺癌细胞皮下注射而同种异体移植的野生型Balb/C小鼠中肿瘤进展的延迟。一旦肿瘤的大小达到150-250mm3，则用I：PBS或II：1*107个小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT+pYV-YopE1-138(BH3-Bid)2静脉注射用4T1乳腺癌细胞皮下注射而同种异体移植的野生型Balb/C小鼠。将静脉注射细菌的那一天定义为第0天。在随后的几天(III；在静脉注射细菌后的第0天至第9天)用测径器测量肿瘤体积。相对肿瘤体积(相对于第0天的肿瘤体积标准化)以mm3表示(IV)。平均值用符号表示，所示的误差线表示平均值的标准误差。用双向ANOVA测量统计显著性，*表示p值<0.05，**表示p值<0.005。
图33：用4T1乳腺癌细胞皮下注射而同种异体移植的野生型Balb/C小鼠中的肿瘤进展。一旦肿瘤的大小达到150-250mm3，则用I：PBS或II：1*107个小肠结肠炎耶尔森氏菌dHOPEMT静脉注射用4T1乳腺癌细胞皮下注射而同种异体移植的野生型Balb/C小鼠。将静脉注射细菌的那一天定义为第0天。在随后的几天(III；在静脉注射细菌后的第0天至第9天)用测径器测量肿瘤体积。相对肿瘤体积(相对于第0天的肿瘤体积标准化)以mm3表示(IV)。平均值用符号表示，所示的误差线表示平均值的标准误差。
具体实施方式
本发明提供了重组革兰氏阴性细菌菌株及其用于将异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域递送到真核细胞中的用途。
出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数使用的术语也将包括复数，反之亦然。应当理解，本文所使用的术语仅用于描述特定实施例目的，而不是限制性的。
如本文所用的术语“革兰氏阴性细菌菌株”包括以下细菌：杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)，嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)，维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)，厌氧粘细菌(Anaeromyxobacter dehalogenans)，支气管败血性博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)，副百日咳博德特氏菌(Bordetellaparapertussis)，百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)，大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)，新洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cenocepacia)，洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)，鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderiamallei)，类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)，鼠型沙眼衣原体(Chlamydia muridarum)，沙眼衣原体(Chlamydia trachmoatis)，流产衣原体(Chlamydophila abortus)，肺炎衣原体(Chlamydophila pneumoniae)，紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)，鼠类柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium)，寻常型脱硫弧菌(Desulfovibrio vulgaris)，迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)，Endozoicomonas elysicola，解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)，艾伯替埃希氏菌(Escherichia albertii)，大肠杆菌，胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis)，百脉根根瘤菌(Mesorhizobium loti)，黄色黏球菌(Myxococcus xanthus)，成团泛菌(Pantoeaagglomerans)，美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)，发光杆菌(Photorhabdusluminescens)，Photorabdus temperate，海绵假交替单胞菌(Pseudoalteromonasspongiae)，铜绿假单胞菌，变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)，丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)，青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)，根瘤菌菌种(Rhizobium sp)，肠道沙门氏菌和其他沙门氏菌菌种，福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)和其他志贺氏菌菌种，Sodalis glossinidius，溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)，天青弧菌(Vibrio azureus)，坎氏弧菌(Vibrio campellii)，Vibrio caribbenthicus，哈维氏弧菌(Vibrio harvey)，副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，塔斯马尼亚弧菌(Vibriotasmaniensis)，塔式弧菌(Vibrio tubiashii)，地毯草黄单胞菌(Xanthomonasaxonopodis)，野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)，水稻黄单胞菌(Xanthomonasoryzae)，小肠结肠炎耶尔森氏菌，鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)，假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)。本发明优选的革兰氏阴性细菌菌株是由肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和假单胞菌科(Pseudomonadaceae)包含的革兰氏阴性细菌菌株。本发明的革兰氏阴性细菌菌株通常用于在体外和/或体内，优选体内，通过细菌T3SS将异源蛋白递送到真核细胞中。
本文使用的术语“重组革兰氏阴性细菌菌株”是指用载体遗传转化的革兰氏阴性细菌菌株。本发明的有用载体是例如表达载体，用于染色体或毒力质粒插入的载体或用于染色体或毒力质粒插入或修饰的DNA或RNA片段。
本文所用的术语“在至少一种T3SS功能性效应蛋白的生产方面有缺陷的重组革兰氏阴性细菌菌株”是指一种重组革兰氏阴性细菌菌株，其中至少一种T3SS效应蛋白被突变，使得所得的重组革兰氏阴性细菌菌株不再产生至少一种T3SS效应蛋白的功能形式，即，该效应基因的表达被消除，使得所得重组革兰氏阴性细菌菌株不产生任何至少一种T3SS效应蛋白，或者所编码的效应蛋白的催化活性被消除，使得所产生的至少一种T3SS效应蛋白不具有其催化活性，例如不行使其效应子功能。为了递送蛋白，在产生至少一种T3SS功能性效应蛋白上有缺陷的重组革兰氏阴性细菌菌株的分泌和易位系统需要完整。如本文所用的术语“T3SS效应蛋白”或“细菌T3SS效应蛋白”是指由T3S系统天然地注入真核细胞或细菌的胞质溶胶中的蛋白，以及由T3S系统天然分泌的蛋白，其可能例如形成进入真核细胞膜的易位孔(包括成孔转运蛋白(如耶尔森氏菌YopB和YopD)和尖端蛋白如耶尔森氏菌LcrV)。优选使用通过T3S系统被天然注入真核细胞的胞质溶胶中的蛋白。这些毒力因子会使真核细胞瘫痪或重新编程，使病原体受益。T3S效应子显示出大量的生物化学活性，并调节重要宿主调控分子[5,6]的功能，包括AvrA，AvrB，AvrBs2，AvrBS3，AvrBsT，AvrD，AvrD1，AvrPphB，AvrPphC，AvrPphEPto，AvrPpiBPto，AvrPto，AvrPtoB，AvrRpm1，AvrRpt2，AvrXv3，CigR，EspF，EspG，EspH，EspZ，ExoS，ExoT，GogB，GtgA，GtgE，GALA家族的蛋白，HopAB2，HopAO1，HopI1，HopM1，HopN1，HopPtoD2，HopPtoE，HopPtoF，HopPtoN，HopU1，HsvB，IcsB，IpaA，IpaB，IpaC，IpaH，IpaH7.8，IpaH9.8，IpgB1，IpgB2，IpgD，LcrV，Map，OspC1，OspE2，OspF，OspG，OspI，PipB，PipB2，PopB，PopP2，PthXo1，PthXo6，PthXo7，SifA，SifB，SipA/SspA，SipB，SipC/SspC，SipD/SspD，SlrP，SopA，SopB/SigD，SopD，SopE，SopE2，SpiC/SsaB，SptP，SpvB，SpvC，SrfH，SrfJ，Sse，SseB，SseC，SseD，SseF，SseG，SseI/SrfH，SseJ，SseK1，SseK2，SseK3，SseL，SspH1，SspH2，SteA，SteB，SteC，SteD，SteE，TccP2，Tir，VirA，VirPphA，VopF，XopD，YopB，YopD YopE，YopH，YopJ，YopM，YopO，YopP，YopT，YpkA。
术语“产生生长所必需的氨基酸缺陷的革兰氏阴性细菌菌株”和“营养缺陷型突变体”在本文中可互换使用，并且指在不存在至少一种外源提供的必需氨基酸或其前体时，不能生长的革兰氏阴性菌株。该菌株在产生氨基酸例如天冬氨酸、内消旋-2,6-二氨基庚二酸、芳香族氨基酸或亮氨酸-精氨酸方面是缺陷的[8]。这种菌株可以通过例如使天冬氨酸-β-半醛脱氢酶基因缺失(Δasd)而形成。这种营养缺陷型突变体在不存在外源性内消旋-2,6-二氨基庚二酸的情况下不能生长[9]。对于本发明的产生生长所必需的氨基酸缺陷的革兰氏阴性细菌菌株，本文优选突变，例如，天冬氨酸-β-半醛脱氢酶基因的缺失。
术语“产生与真核细胞表面或细胞外基质结合的粘附蛋白缺陷的革兰氏阴性细菌菌株”是指与由相应野生型菌株表达的粘附蛋白相比，不表达至少一种粘附蛋白的突变革兰氏阴性细菌菌株。粘附蛋白可以包括，例如，延伸的聚合物粘附分子，如纤毛(pili)/菌毛(fimbriae)或非菌毛粘附素。菌毛粘附素包括1型纤毛(例如带有FimH粘附素的大肠杆菌Fim-pili)，P-纤毛(如来自大肠杆菌的带有PapG粘附素的Pap-pili)，4型纤毛(如来自例如铜绿假单胞菌的菌毛蛋白)或curli(来自肠道沙门氏菌的具有CsgA粘附素的Csg蛋白)。非菌毛粘附素包括三聚体自转运粘附素，例如来自小肠结肠炎耶尔森氏菌的YadA，BpaA(类鼻疽伯克霍尔德氏菌(B.pseudomallei))，Hia(流感嗜血菌(H.influenzae))，BadA(汉逊氏嗜血菌(B.henselae))，NadA(脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis))或UspA1(粘膜炎莫拉氏菌(M.catarrhalis))以及其它自转运粘附素，例如AIDA-1(大肠杆菌)以及其他粘附素/侵袭素，例如来自小肠结肠炎耶尔森氏菌的InvA或Intimin(大肠杆菌)或Dr-家族或Afa-家族的成员(大肠杆菌)。如本文所用的术语YadA和InvA指来自小肠结肠炎耶尔森氏菌的蛋白。自转运蛋白YadA[10,11]与不同形式的胶原蛋白以及纤连蛋白结合，而侵袭素InvA[12-14]与真核细胞膜中的β-整合蛋白结合。如果革兰氏阴性细菌菌株是小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株，则该菌株优选缺乏InvA和/或YadA。
如本文所用，术语“肠杆菌科”包含存在于土壤、水、植物和动物中的革兰氏阴性、杆状、兼性厌氧菌家族，其常常作为脊椎动物的病原体。该细菌科具有相似的生理学特征，并且其在各自基因组的功能元件和基因内具有保守性。除了氧化酶阴性之外，该科的所有成员都是葡萄糖发酵剂，并且大部分是硝酸盐还原剂。
本发明的肠杆菌科细菌可以是来自该科的任意细菌，具体包括但不限于以下属的细菌：埃希氏菌属(Escherichia)，志贺氏菌属(Shigella)，爱德华氏菌属(Edwardsiella)，沙门氏菌属(Salmonella)，柠檬酸杆菌属(Citrobacter)，克雷伯菌属(Klebsiella)，肠杆菌属(Enterobacter)，沙雷氏菌属(Serratia)，变形杆菌属(Proteus)，欧文氏菌属(Erwinia)，摩根氏菌属(Morganella)，普罗威登氏菌属(Providencia)，或耶尔森氏菌属(Yersinia)。在更具体的实施方案中，细菌是大肠杆菌，痢疾埃希氏菌(Escherichiablattae)，福氏埃希氏菌(Escherichia fergusonii)，赫尔曼埃希氏菌(Escherichiahermanii)，Escherichia vuneris，肠道沙门氏菌，邦戈尔沙门氏菌(Salmonellabongori)，痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)，福氏志贺氏菌，鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)，索氏志贺菌(Shigella sonnei)，产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)，日沟维肠杆菌(Enterobacter gergoviae)，阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)，阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)，成团肠杆菌(Enterobacteragglomerans)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，假结核耶尔森氏菌，鼠疫耶尔森氏菌，小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)，解淀粉欧文氏菌(Erwiniaamylovora)，奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)，普通变形菌(Proteus vulgaris)，彭氏变形杆菌(Proteus penneri)，豪氏变形杆菌(Proteus hauseri)，普罗威登斯菌加利福尼亚菌(Providencia alcalifaciens)，或摩根摩根菌(Morganella morganii)菌种。
优选革兰氏阴性细菌菌株选自由以下菌属组成的组：耶尔森氏菌属，埃希氏菌属，沙门氏菌属，志贺氏菌属，假单胞菌属，衣原体属，欧文氏菌属，泛菌属(Pantoea)，弧菌属，伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)，雷尔氏菌(Ralstonia)，黄单胞菌属(Xanthomonas)，色杆菌属(Chromobacterium)，索达里氏菌属(Sodalis)，柠檬酸杆菌属，爱德华氏菌属，根瘤菌属(Rhizobiae)，气单胞菌属(Aeromonas)，光杆菌属(Photorhabdus)，博德特氏菌属(Bordetella)和脱硫弧菌属(Desulfovibrio)，更优选地选自由以下菌属组成的组：耶尔森氏菌属，埃希氏菌属，沙门氏菌属和假单胞菌属，最优选地选自由耶尔森氏菌属和沙门氏菌属组成的组。
如本文所用的术语“耶尔森氏菌属”包括耶尔森氏菌属的所有菌种，包括小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌和小鼠疫耶尔森氏菌。优选的是小肠结肠炎耶尔森氏菌。
如本文所用的术语“沙门氏菌”包括沙门氏菌的所有菌种，包括肠道沙门氏菌和布氏沙门氏菌(S.bongori)。优选的是肠道沙门氏菌。
本文所用的“启动子”是指调节转录单元表达的核酸序列。“启动子区”是能够结合细胞中的RNA聚合酶并启动下游(3’方向)编码序列的转录的调节区。在启动子区内将存在转录起始位点(通过用核酸酶S1作图很方便地定义)，以及负责结合RNA聚合酶的蛋白结合结构域(共有序列)例如假定的-35区域和Pribnow盒。当描述两个DNA区域之间的关系时，术语“可操作地连接”仅仅意味着它们在功能上彼此相关，并且它们位于相同的核酸片段上。如果启动子控制结构基因的转录，则该启动子与结构基因可操作地连接，并且其位于与该基因相同的核酸片段上。通常启动子在所述革兰氏阴性菌株中具有功能，即启动子能够表达本发明的融合蛋白，即启动子能够表达本发明的融合蛋白而无需进一步的基因工程化或其他蛋白的表达。此外，功能性启动子不得天然地反向调节细菌T3SS。
本文使用的术语“递送”是指蛋白从重组革兰氏阴性细菌菌株运送至真核细胞的输送，包括以下步骤：在重组革兰氏阴性细菌菌株中表达异源蛋白，表达的蛋白从该革兰氏阴性细菌菌株分泌，并将由该革兰氏阴性细菌菌株分泌的蛋白易位到真核细胞的胞质溶胶中。因此，术语“递送信号”或“分泌信号”在本文可互换使用，是指可被革兰氏阴性细菌菌株的分泌和易位系统识别，并指导将蛋白从革兰氏阴性细菌菌株递送到真核细胞的多肽序列。
本文使用的术语“来自细菌效应蛋白的递送信号”是指在重组革兰氏阴性细菌菌株中具有功能的来自细菌效应蛋白的递送信号，即，其允许在重组革兰氏阴性细菌菌株中表达的异源蛋白通过分泌系统(如III型分泌系统)从该重组革兰氏阴性细菌菌株中分泌，或通过分泌系统(例如III型分泌系统)被该重组革兰氏阴性细菌菌株易位到真核细胞的细胞溶质中。本文使用的术语“来自细菌效应蛋白的递送信号”还包含来自细菌效应蛋白的递送信号的片段，即递送信号的较短版本，例如，包含递送信号，例如天然存在的递送信号的多达10个，优选多达20个，更优选多达50个，甚至更优选多达100个，特别是多达140个氨基酸的递送信号。因此，编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列，例如DNA序列，可以编码全长递送信号或其片段，其中所述片段通常包含通常至多30个，优选至多60个，更优选至多150个，甚至更优选至多300个，特别是至多420个核酸。
如本文所用，蛋白的“分泌”是指异源蛋白向外穿过重组革兰氏阴性细菌菌株的细胞膜的输送。蛋白的“易位”是指将来自重组革兰氏阴性细菌菌株的异源蛋白穿过真核细胞的质膜到该真核细胞的胞质溶胶中的输送。
本文所用的术语“真核细胞”包括以下真核细胞：Hi-5，HeLa，Hek，HUVECs，3T3，CHO，Jurkat，Sf-9，HepG2，Vero，MDCK，Mefs，THP-1，J774，RAW，Caco2，NCI60，DU145，Lncap，MCF-7，MDA-MB-438，PC3，T47D，A549，U87，SHSY5Y，Ea.Hy926，Saos-2，4T1，D2A1，B16F10，和原代人肝细胞。本文使用的”真核细胞”也称为”靶细胞”或”靶真核细胞”。
如本文所用的术语“T3SS效应蛋白”是指由T3S系统天然地注入真核细胞或细菌的胞质溶胶中的蛋白，以及由T3S系统天然分泌的蛋白，其可能例如形成进入真核细胞膜的易位孔(包括成孔易位蛋白(translocator)(如耶尔森氏菌YopB和YopD)和尖端蛋白如耶尔森氏菌LcrV)。优选使用通过T3S系统被天然注入真核细胞的胞质溶胶中的蛋白。这些毒力因子会使真核细胞瘫痪或重新编程，使病原体受益。T3S效应子显示出大量的生物化学活性，并调节重要宿主调控分子[2,15]的功能，包括AvrA，AvrB，AvrBs2，AvrBS3，AvrBsT，AvrD，AvrD1，AvrPphB，AvrPphC，AvrPphEPto，AvrPpiBPto，AvrPto，AvrPtoB，AvrRpm1，AvrRpt2，AvrXv3，CigR，EspF，EspG，EspH，EspZ，ExoS，ExoT，GogB，GtgA，GtgE，GALA家族蛋白，HopAB2，HopAO1，HopI1，HopM1，HopN1，HopPtoD2，HopPtoE，HopPtoF，HopPtoN，HopU1，HsvB，IcsB，IpaA，IpaB，IpaC，IpaH，IpaH7.8，IpaH9.8，IpgB1，IpgB2，IpgD，LcrV，Map，OspC1，OspE2，OspF，OspG，OspI，PipB，PipB2，PopB，PopP2，PthXo1，PthXo6，PthXo7，SifA，SifB，SipA/SspA，SipB，SipC/SspC，SipD/SspD，SlrP，SopA，SopB/SigD，SopD，SopE，SopE2，SpiC/SsaB，SptP，SpvB，SpvC，SrfH，SrfJ，Sse，SseB，SseC，SseD，SseF，SseG，SseI/SrfH，SseJ，SseK1，SseK2，SseK3，SseL，SspH1，SspH2，SteA，SteB，SteC，SteD，SteE，TccP2，Tir，VirA，VirPphA，VopF，XopD，YopB，YopD YopE，YopH，YopJ，YopM，YopO，YopP，YopT，YpkA。
耶尔森氏菌的T3SS效应基因已经从YopE、YopH、YopM、YopO、YopP/YopJ和YopT[16]克隆。各自的效应基因可以从福氏志贺氏菌(例如OspF、IpgD、IpgB1)、肠道沙门氏菌(例如SopE、SopB、SptP)、铜绿假单胞菌(例如ExoS、ExoT、ExoU、ExoY)或大肠杆菌(Map、EspF、EspG、EspH、EspZ)克隆。这些基因的核酸序列对于本领域技术人员是可获得的，例如在Genebank数据库(来自NC 002120 GL 10955536的yopH、yopO、yopE、yopP、yopM、yopT；来自AF386526.1 GI 18462515的福氏志贺氏菌效应蛋白；来自NC_016810.1 GI:378697983或FQ312003.1GI:301156631的肠道沙门氏菌效应子；来自AE004091.2GI:110227054或CP000438.1GI:115583796的绿脓杆菌效应子和来自NC_011601.1GI:215485161的大肠杆菌效应蛋白)。
出于本发明的目的，基因用小写字母表示，斜体表示以区别于蛋白。在基因(由小写字母和斜体字母表示)遵循细菌物种名称(如大肠杆菌)的情况下，它们是指相应细菌物种中相应基因的突变。例如，YopE是指由yopE基因编码的效应蛋白。小肠结肠炎耶尔森氏菌yopE则代表在yopE基因中具有突变的肠道小肠结肠炎耶尔森氏菌。
如本文所用，术语“多肽”、“肽”、“蛋白”、“多肽的”和“肽的”可互换使用，表示相邻残基通过α-氨基和羧基之间的肽键彼此连接的一系列氨基酸残基。优选具有包含至少10个氨基酸，更优选至少20个氨基酸的氨基酸序列的蛋白。
根据本发明，“异源蛋白结构域”包括天然存在的蛋白的结构域，并且还包括人工工程化蛋白的结构域。如本文所用，术语“异源蛋白的结构域”是指除了T3SS效应蛋白的结构域之外的异源蛋白的结构域，或除了包含T3SS效应蛋白的N-末端片段(异源蛋白的结构域可以与其融合以得到融合蛋白)的结构域之外的结构域。具体而言，本文所用的异源蛋白结构域是指不属于由本发明提供并使用的特定重组革兰氏阴性细菌菌株的蛋白组(即，完整天然蛋白补体)的异源蛋白结构域，例如，不属于耶尔森氏菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属或假单胞菌属的特定细菌菌株的蛋白组(即，完整天然蛋白补体)的异源蛋白结构域。通常，异源蛋白的结构域是动物来源的，包括人类来源。优选地，异源蛋白的结构域是人蛋白的结构域。更优选地，异源蛋白结构域是选自由以下组成的组的蛋白的结构域：参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白、细胞周期调节剂、锚蛋白重复蛋白、细胞信号转导蛋白、报道蛋白、转录因子、蛋白酶、小GTP酶、GPCR相关蛋白、纳米抗体融合构建体和纳米抗体、细菌T3SS效应子、细菌T4SS效应子和病毒蛋白。特别优选地，异源蛋白结构域是选自由以下组成的组的蛋白的结构域：参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白、细胞周期调节剂、锚蛋白重复蛋白、报道蛋白、小GTP酶、GPCR相关蛋白、纳米抗体融合构建体、细菌T3SS效应子、细菌T4SS效应子和病毒蛋白。甚至更特别优选的是选自由以下组成的组的异源蛋白的结构域：参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白、细胞周期调节剂和锚蛋白重复蛋白。最优选的是参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白的结构域，如参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的动物蛋白，优选参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的人异源蛋白的结构域。
本文所用的术语“异源蛋白的重复结构域”是指由几个重复的异源蛋白的结构域组成的融合蛋白，其中这些结构域可以彼此直接融合，或者其中可以在结构域之间引入可变连接体，例如1至30个氨基酸之间，优选2至15个氨基酸之间，更优选3至10个氨基酸之间的连接体。优选地，使用重复相同结构域，或氨基酸序列一致性超过80％，通常超过85％，优选超过90％，甚至更优选超过95％，特别是超过96％，更特别超过97％，甚至更特别超过98％，最特别超过99％的重复结构域。同样优选的是氨基酸一致性为100％的相同结构域。优选地，本文提及的融合蛋白包含两个重复结构域，更优选两个重复相同结构域，或氨基酸序列一致性超过90％，优选超过95％，最优选为100％的两个重复结构域。本发明还涵盖两个以上，例如三个、四个、五个或六个重复结构域。
本文所用的术语“不同异源蛋白的两个或多个结构域”是指由不同异源蛋白的至少两个结构域的一个或几个重复组成的融合蛋白，例如具有80％或更少，的氨基酸序列一致性的异源蛋白的至少两个结构域，其中这些不同的结构域可以彼此直接融合，或者其中可以在结构域之间引入可变连接体，例如1至30个氨基酸之间，优选2至15个氨基酸之间，更优选3至10个氨基酸之间的连接体。
优选地，本文提及的融合蛋白包含了不同异源蛋白的两个结构域。本发明还涵盖不同异源蛋白的两个以上，例如三个、四个、五个或六个结构域。
如本文所用的术语“属于相同功能类别的蛋白的异源蛋白”是指具有相同功能的异源蛋白，例如，具有酶活性的异源蛋白，以相同途径(例如，细胞周期调控)起作用的异源蛋白，或者共享一个共同的特定特征，例如，属于同一类细菌效应蛋白。功能类别的蛋白是例如参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白、充当细胞周期调节剂的蛋白、锚蛋白重复蛋白、细胞信号传导蛋白、报道蛋白、转录因子、蛋白酶、小GTP酶、GPCR相关蛋白、纳米抗体融合构建体和纳米抗体、细菌T3SS效应子、细菌T4SS效应子或病毒蛋白，其在建立对真核细胞的毒力的生物过程中共同起作用。
由重组的革兰氏阴性细菌菌株表达的异源蛋白的结构域的分子量通常在1-50kDa之间，优选在1-30kDa之间，更优选在1-20kDa之间，最优选在1-10kDa之间。
根据本发明，“参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白”或“参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的人异源蛋白”包括但不限于Bad，Bcl2，Bak，Bmt，Bax，Puma，Noxa，Bim，Bcl-xL，Apaf1，半胱天冬酶9，半胱天冬酶3，半胱天冬酶6，半胱天冬酶7，半胱天冬酶10，DFFA，DFFB，ROCK1，APP，CAD，ICAD，CAD，EndoG，AIF，HtrA2，Smac/Diablo，Arts，ATM，ATR，Bok/Mtd，Bmf，Mcl-1(S)，IAP家族，LC8，PP2B，14-3-3蛋白，PKA，PKC，PI3K，Erk1/2，p90RSK，TRAF2，TRADD，FADD，Daxx，半胱天冬酶8，半胱天冬酶2，RIP，RAIDD，MKK7，JNK，FLIPs，FKHR，GSK3，CDK及其抑制剂如INK4-家族(p16(Ink4a)，p15(Ink4b)，p18(Ink4c)，p19(Ink4d))，和Cip1/Waf1/Kip1-2-家族(p21(Cip1/Waf1)，p27(Kip1)，p57(Kip2)。优选Bad，Bmt，Bcl2，Bak，Bax，Puma，Noxa，Bim，Bcl-xL，半胱天冬酶9，半胱天冬酶3，半胱天冬酶6，半胱天冬酶7，Smac/Diablo，Bok/Mtd，Bmf，Mcl-1(S)，LC8，PP2B，TRADD，Daxx，半胱天冬酶8，半胱天冬酶2，RIP，RAIDD，FKHR，CDK及其抑制剂如INK4-家族(p16(Ink4a)，p15(Ink4b)，p18(Ink4c)，p19(Ink4d))，最优选使用BIM，Bid，截短型Bid，FADD，半胱天冬酶3(及其亚基)，Bax，Bad，Akt，CDK及其抑制剂如INK4-家族(p16(Ink4a)，p15(Ink4b)，p18(Ink4c)，p19(Ink4d))[17-19]。此外，参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白包括DIVA，Bcl-Xs，Nbk/Bik，Hrk/Dp5，Bid和tBid，Egl-1，Bcl-Gs，细胞色素C(Cytochrome C)，Beclin，CED-13，BNIP1，BNIP3，Bcl-B，Bcl-W，Ced-9，A1，NR13，Bfl-1，半胱天冬酶1，半胱天冬酶2，半胱天冬酶4，半胱天冬酶5，半胱天冬酶8。
参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白选自促细胞凋亡蛋白、抗细胞凋亡蛋白、细胞凋亡预防途径的抑制剂和促存活信号或途径的抑制剂。促细胞凋亡蛋白包含选自Bax，Bak，Diva，Bcl-Xs，Nbk/Bik，Hrk/Dp5，Bmf，Noxa，Puma，Bim，Bad，Bid和tBid，Bok，Apaf1，Smac/Diablo，BNIP1，BNIP3，Bcl-Gs，Beclin 1，Egl-1和CED-13，细胞色素C，FADD，半胱天冬酶家族，和CDK及其抑制剂如INK4-家族(p16(Ink4a)，p15(Ink4b)，p18(Ink4c)，p19(Ink4d))，或选自由以下组成的组：Bax，Bak，Diva，Bcl-Xs，Nbk/Bik，Hrk/Dp5，Bmf，Noxa，Puma，Bim，Bad，Bid和tBid，Bok，Egl-1，Apaf1，Smac/Diablo，BNIP1，BNIP3，Bcl-Gs，Beclin1，Egl-1和CED-13，细胞色素C，FADD，和半胱天冬酶家族。优选的是Bax，Bak，Diva，Bcl-Xs，Nbk/Bik，Hrk/Dp5，Bmf，Noxa，Puma，Bim，Bad，Bid和tBid，Bok，Egl-1，Apaf1，BNIP1，BNIP3，Bcl-Gs，Beclin 1，Egl-1和CED-13，Smac/Diablo，FADD，半胱天冬酶家族，CDK及其抑制剂如INK4-家族(p16(Ink4a)，p15(Ink4b)，p18(Ink4c)，p19(Ink4d))。同样优选的是Bax，Bak，Diva，Bcl-Xs，Nbk/Bik，Hrk/Dp5，Bmf，Noxa，Puma，Bim，Bad，Bid和tBid，Bok，Apaf1，BNIP1，BNIP3，Bcl-Gs，Beclin 1，Egl-1和CED-13，Smac/Diablo，FADD，半胱天冬酶家族。
抗细胞凋亡蛋白包含选自由以下组成的组的蛋白：Bcl-2，Bcl-Xl，Bcl-B，Bcl-W，Mcl-1，Ced-9，A1，NR13，IAP家族和Bfl-1。优选的是Bcl-2，Bcl-Xl，Bcl-B，Bcl-W，Mcl-1，Ced-9，A1，NR13和Bfl-1。细胞凋亡预防途径的抑制剂包含选自由以下组成的组的蛋白：Bad、Noxa和Cdc25A。优选Bad和Noxa。促生存信号传导或通路的抑制剂包含选自由以下组成的组的蛋白：PTEN，ROCK，PP2A，PHLPP，JNK，p38。优选PTEN，ROCK，PP2A和PHLPP。
在有些实施方案中，参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的异源蛋白选自唯BH3蛋白、胱天蛋白酶和控制细胞凋亡的死亡受体的细胞内信号转导蛋白。
唯BH3蛋白包含选自由以下组成的组的蛋白：Bad，BIM，Bid和tBid，Puma，Bik/Nbk，Bod，Hrk/Dp5，BNIP1，BNIP3，Bmf，Noxa，Mcl-1，Bcl-Gs，Beclin1，Egl-1和CED-13。优选Bad、BIM、Bid和tBid。
半胱天冬酶包含选自由以下组成的组的蛋白：半胱天冬酶1，半胱天冬酶2，半胱天冬酶3，半胱天冬酶4，半胱天冬酶5，半胱天冬酶6，半胱天冬酶7，半胱天冬酶8，半胱天冬酶9，半胱天冬酶10。优选的是半胱天冬酶3，半胱天冬酶8和半胱天冬酶9。
控制细胞死亡受体的细胞内信号转导蛋白包含选自由以下组成的组的蛋白：FADD，TRADD，ASC，BAP31，GULP1/CED-6，CIDEA，MFG-E8，CIDEC，RIPK1/RIP1，CRADD，RIPK3/RIP3，Crk，SHB，CrkL，DAXX，14-3-3家族，FLIP，DFF40和45，PEA-15，SODD。优选的是FADD和TRADD。
在一些实施方案中，参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的异源蛋白的两个结构域包含在本发明的革兰氏阴性细菌菌株和/或载体中，优选参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白的两个重复结构域，更优选两个相同重复结构域，或者参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的不同蛋白的两个结构域。在一些实施方案中，参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的异源蛋白的两个结构域包含在本发明的革兰氏阴性细菌菌株和/或载体中，其中一个是促细胞凋亡蛋白的结构域，另一个是作为细胞凋亡预防途径抑制剂的蛋白的结构域，或者其中一个是促细胞凋亡蛋白的结构域，而另一个是作为促生存信号传导或通路抑制剂的蛋白的结构域。
本发明所涵盖的促细胞凋亡蛋白通常具有α螺旋结构，优选由两亲性螺旋环绕的疏水螺旋，通常包含BH1、BH2、BH3或BH4结构域中的至少一个，优选包含至少一个BH3结构域。通常由本发明包括的促细胞凋亡蛋白不具有酶活性。
本发明所涵盖的抗细胞凋亡蛋白通常具有α螺旋结构，优选地具有被两亲性螺旋包围的疏水性螺旋，并且包含不同BH1、BH2、BH3和BH4结构域的组合，优选其中存在BH1和BH2结构域的不同BH1、BH2、BH3和BH4结构域的组合，更优选BH4-BH3-BH1-BH2、BH1-BH2、BH4-BH1-BH2或BH3-BH1-BH2(从N-末端到C-末端)。此外，还涵盖了含有至少一个BIR结构域的蛋白。
本发明所涵盖的细胞凋亡预防途径的抑制剂通常具有α螺旋结构，优选具有被两亲性螺旋包围的疏水性螺旋，并且通常包含一个BH3结构域。
BH1、BH2、BH3或BH4结构域的长度各自通常为约5至约50氨基酸。因此，在一些实施方案中，异源蛋白的结构域选自由以下长度的异源蛋白的结构域组成的组：约5至约200，优选约5至约150，更优选约5至约100，最优选约5至约50，特别是约5至约25个氨基酸。
特别优选的结构域是细胞凋亡诱导剂tBID的BH3结构域，更具体地是这样的BH3结构域，其包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:209，210，2119和212，优选SEQ IDNO:211或SEQ ID NO:212。同样优选的是细胞凋亡调节剂BAX的BH3结构域，更具体地是这样的BAX结构域，其包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:213，214，215和216，优选SEQID NO:215或SEQ ID NO:216。人和小鼠序列在SEQ ID NO 209-216中给出，但所有其他物种的tBID和BAX BH3结构域被同等地包括在内。
在一些实施方案中，异源蛋白的重复结构域是BH3结构域，特别是细胞凋亡诱导剂tBID的重复BH3结构域，更特别是细胞凋亡诱导剂tBID的两个重复BH3结构域，最特别是由SEQ ID NO:202序列包含的细胞凋亡诱导剂tBID的两个重复BH3结构域。因此，在优选的实施方案中，本发明的革兰氏阴性细菌菌株的载体包含这样的第二DNA序列，其编码BH3结构域的两个重复结构域，更优选细胞凋亡诱导剂tBID的两个重复BH3结构域。两个重复结构域优选通过1-30个氨基酸长度，优选2-15个氨基酸，更优选3-10个氨基酸长的连接体连接。
在一些实施方案中，不同异源蛋白的两个或更多个结构域是属于相同功能类别蛋白的异源蛋白的结构域，优选两个或更多个结构域的不同异源蛋白是来自参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白类别的不同异源蛋白。在一个优选的实施方案中，不同异源蛋白的两个或更多个结构域是细胞凋亡诱导剂tBID的BH3结构域和细胞凋亡调节剂BAX的BH3结构域，特别是由SEQ ID NO:203的序列包含的融合BH3结构域。不同异源蛋白的两个结构域优选通过1-30个氨基酸长度，优选2-15个氨基酸，更优选3-10个氨基酸长的连接体连接。
在一些实施方案中，异源蛋白是前药转化酶。在这些实施方案中，重组减毒革兰氏阴性细菌菌株表达，优选表达并分泌前药转化酶。本文所涉及的前药转化酶包括将无毒前药转化为有毒药物的酶，优选是选自由以下组成的组的酶：胞嘧啶脱氨酶，嘌呤核苷磷酸化酶，胸苷激酶，β-半乳糖苷酶，羧酸酯酶，硝基还原酶，羧肽酶和β-葡糖醛酸糖苷酶，更优选是选自由以下组成的组的酶：胞嘧啶脱氨酶，嘌呤核苷磷酸化酶，胸苷激酶和β-半乳糖苷酶。
本文所用的术语“蛋白酶切割位点”是例如指蛋白或融合蛋白氨基酸内的特定氨基酸基序。在蛋白或融合蛋白的氨基酸序列内，其被识别该氨基酸基序的特异性蛋白酶切割。综述见[20]。蛋白酶切割位点的实例是被选自肠激酶(轻链)、肠肽酶、解离蛋白酶、人鼻病毒蛋白酶(HRV 3C)、TEV蛋白酶、TVMV蛋白酶、FactorXa蛋白酶和凝血酶一组的蛋白酶切割的氨基酸基序。
以下氨基酸基序被相应的蛋白酶识别：
-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys：肠激酶(轻链)/肠肽酶
-Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln/Gly-Pro：PreScission蛋白酶/人鼻病毒蛋白酶(HRV3C)
-Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Ser和基于Glu-XX的修饰基序Tyr-X-Gln-Gly/Ser(其中X是任意氨基酸)，其被TEV蛋白酶(烟草蚀纹病毒)
-Glu-Thr-Val-Arg-Phe-Gln-Ser：TVMV蛋白酶
-Ile-(Glu或Asp)-Gly-Arg：FactorXa蛋白酶
-Leu-Val-Pro-Arg/Gly-Ser：凝血酶。
本文所用的蛋白酶切割位点涵盖泛素。因此，在一些优选的实施方案中，泛素用作蛋白酶切割位点，即第三DNA序列编码泛蛋白如蛋白酶切割位点，其可以在N-末端位点被特异性泛素加工蛋白酶切割。其可以被特异性遍在蛋白加工蛋白酶切割，所述蛋白酶在融合蛋白已被递送至其中的细胞中在N-末端位点内源性地称为去泛素化酶。泛素在其C末端由一组内源性泛素特异性C末端蛋白酶(去泛素化酶，DUB)加工。通过DUB的遍在蛋白的切割被认为发生在泛素的非常C末端(在G76之后)。
“个体”、“受试者”或“患者”是脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于灵长类(包括人和非人灵长类动物)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，哺乳动物是人。
术语“突变”在本文中用作一般术语，并且包括单个碱基对和多个碱基对的改变。这样的突变可以包括取代、移码突变、缺失、插入和截短。
本文所用的术语“标记分子或标记分子的受体位点”是指结合特定氨基酸序列的小化合物，这样导致结合的化合物产生荧光，结合的化合物优选香豆素连接酶/香豆素受体位点(及其衍生物)、试卤灵连接酶/试卤灵受体位点(及其衍生物)和四半胱氨酸基模序(如Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys及其衍生物)与FlAsH/ReAsH染料蛋白(life technologies)或如增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的荧光蛋白使用。
本文所用的术语“核定位信号”是指标记导入真核细胞核中的蛋白的氨基酸序列，并且优选包括病毒核定位信号，例如SV40大T抗原衍生的NLS(PPKKKRKV)。
本文所用的术语“多克隆位点”是指含有多个用于通过限制性内切核酸酶切割的限制性位点的短DNA序列，所述限制性内切核酸酶如AclI，HindIII，SspI，MluCI，Tsp509I，PciI，AgeI，BspMI，BfuAI，SexAI，MluI，BceAI，HpyCH4IV，HpyCH4III，BaeI，BsaXI，AflIII，SpeI，BsrI，BmrI，BglII，AfeI，AluI，StuI，ScaI，ClaI，BspDI，PI-SceI，NsiI，AseI，SwaI，CspCI，MfeI，BssSI，BmgBI，PmlI，DraIII，AleI，EcoP15I，PvuII，AlwNI，BtsIMutI，TspRI，NdeI，NlaIII，CviAII，FatI，MslI，FspEI，XcmI，BstXI，PflMI，BccI，NcoI，BseYI，FauI，SmaI，XmaI，TspMI，Nt.CviPII，LpnPI，AciI，SacII，BsrBI，MspI，HpaII，ScrFI，BssKI，StyD4I，BsaJI，BslI，BtgI，NciI，AvrII，MnlI，BbvCI，Nb.BbvCI，Nt.BbvCI，SbfI，Bpu10I，Bsu36I，EcoNI，HpyAV，BstNI，PspGI，StyI，BcgI，PvuI，BstUI，EagI，RsrII，BsiEI，BsiWI，BsmBI，Hpy99I，MspA1I，MspJI，SgrAI，BfaI，BspCNI，XhoI，EarI，AcuI，PstI，BpmI，DdeI，SfcI，AflII，BpuEI，SmlI，AvaI，BsoBI，MboII，BbsI，XmnI，BsmI，Nb.BsmI，EcoRI，HgaI，AatII，ZraI，Tth111I PflFI，PshAI，AhdI，DrdI，Eco53kI，SacI，BseRI，PleI，Nt.BstNBI，MlyI，HinfI，EcoRV，MboI，Sau3AI，DpnII BfuCI，DpnI，BsaBI，TfiI，BsrDI，Nb.BsrDI，BbvI，BtsI，Nb.BtsI，BstAPI，SfaNI，SphI，NmeAIII，NaeI，NgoMIV，BglI，AsiSI，BtgZI，HinP1I，HhaI，BssHII，NotI，Fnu4HI，Cac8I，MwoI，NheI，BmtI，SapI，BspQI，Nt.BspQI，BlpI，TseI，ApeKI，Bsp1286I，AlwI，Nt.AlwI，BamHI，FokI，BtsCI，HaeIII，PhoI，FseI，SfiI，NarI，KasI，SfoI，PluTI，AscI，EciI，BsmFI，ApaI，PspOMI，Sau96I，NlaIV，KpnI，Acc65I，BsaI，HphI，BstEII，AvaII，BanI，BaeGI，BsaHI，BanII，RsaI，CviQI，BstZ17I，BciVI，SalI，Nt.BsmAI，BsmAI，BcoDI，ApaLI，BsgI，AccI，Hpy166II，Tsp45I，HpaI，PmeI，HincII，BsiHKAI，ApoI，NspI，BsrFI，BstYI，HaeII，CviKI-1，EcoO109I，PpuMI，I-CeuI，SnaBI，I-SceI，BspHI，BspEI，MmeI，TaqαI，NruI，Hpy188I，Hpy188III，XbaI，BclI，HpyCH4V，FspI，PI-PspI，MscI，BsrGI，MseI，PacI，PsiI，BstBI，DraI，PspXI，BsaWI，BsaAI，EaeI，preferably XhoI，XbaI，HindIII，NcoI，NotI，EcoRI，EcoRV，BamHI，NheI，SacI，SalI，BstBI。本文所用的术语“多克隆位点”还指用于重组事件，例如Gateway克隆策略，或用于诸如Gibbson装配或拓扑克隆的方法的短DNA序列。
本文所用的术语“耶尔森氏菌野生型菌株”是指天然存在的变体(如小肠结肠炎耶尔森氏菌E40)或含有允许使用载体的遗传修饰的天然存在的变体，例如限制性内切核酸酶或抗生素抗性基因的缺失突变(如小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40、小肠结肠炎耶尔森氏菌E40的氨苄青霉素敏感型衍生物)。这些菌株含有染色体DNA以及未修饰的毒力质粒(称为pYV)。
术语“包含”通常在包括的意义上使用，也就是说允许一个或多个特征或组件的存在。
术语“约”是指值±特定值的10％的范围。例如，短语“约200”包括200的±10％，或180至220。
在本发明的一个实施方案中，用如下载体转化重组革兰氏阴性细菌菌株，所述载体沿5'至3'方向包含：
编码来自细菌效应蛋白的递送信号或其片段的第一DNA序列；
编码异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域的第二DNA序列，其与所述第一DNA序列的3'末端框内融合，其中所述异源蛋白选自由以下组成的组：参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白、细胞周期调节剂、锚蛋白重复蛋白、细胞信号转导蛋白、报道蛋白、转录因子、蛋白酶、小GTP酶、GPCR相关蛋白、纳米抗体融合构建体和纳米抗体、细菌T3SS效应子、细菌T4SS效应子和病毒蛋白。优选地，编码异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域的DNA序列在其3’末端侧接有DNA序列，该DNA序列与染色体或内源毒力质粒的在来自细菌效应蛋白的递送信号或其片段的3’末端处的DNA序列同源。更优选地，侧接在同源蛋白的3’末端的该DNA序列与染色体或内源毒力质粒上来自细菌效应蛋白的递送信号或其片段的3’末端的DNA序列同源并处在10kbp内。具体地，侧接在同源蛋白的3’末端的该核苷酸序列与染色体或内源毒力质粒上来自细菌效应蛋白的递送信号或其片段的DNA序列同源并处在同一操纵子内。在该实施方案中，转化通常以这样的方式进行，使得融合的第一和第二DNA序列通过通过同源重组插入重组减毒革兰氏阴性细菌菌株的内源毒力质粒或染色体上，优选插入内源毒力质粒上，并且融合的第一和第二DNA序列可操作地连接至内源毒力质粒或染色体的启动子，例如连接至染色体致病岛的启动子。优选地，融合的第一和第二DNA序列可操作地连接至内源毒力质粒的启动子。在该实施方案中，第一DNA序列包含来自细菌效应蛋白的递送信号或其片段，优选其片段，其在染色体或在内源毒力质粒的同源位点处提供同源重组，以使第二DNA序列被置于染色体或与内源启动子可操作地连接的内源毒力质粒递送信号的3’末端框内。
在本发明的另一个实施方案中，重组革兰氏阴性细菌菌株用核苷酸分子，优选DNA核苷酸分子转化，所述核苷酸分子，优选DNA核苷酸分子包含编码异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域的核苷酸序列和与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列同源或相同的核苷酸序列，或者与编码来自细菌效应蛋白的递送信号的片段的核苷酸序列同源或相同的核苷酸序列，其中来自细菌效应蛋白的递送信号在重组减毒革兰氏阴性细菌菌株的染色体上或内源毒力质粒上编码。优选地，与来自细菌效应蛋白的递送信号的核苷酸序列同源或相同的核苷酸序列或其片段位于编码异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域的核苷酸序列的5’末端。更优选地，编码异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域的核苷酸序列在其3’末端侧接有核苷酸序列，该核苷酸序列与染色体的或内源毒力质粒的在来自细菌效应蛋白的递送信号或其片段的3’末端处的DNA序列同源。甚至更优选地，侧接在同源蛋白的3’末端的该核苷酸序列与染色体或内源毒力质粒上来自细菌效应蛋白的递送信号或其片段的3’末端的DNA序列同源并处在10kbp内。具体地，侧接在同源蛋白的3’末端的该核苷酸序列与染色体或内源毒力质粒上来自细菌效应蛋白的递送信号或其片段的NDA序列同源并处在相同的操纵子内。在该实施方案中，转化通常以这样的方式进行，使得编码异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域的核苷酸序列插入在重组减毒革兰氏阴性细菌菌株的内源毒力质粒或染色体上，在来自由染色体或内源毒力质粒编码的细菌效应蛋白的递送信号的3’末端处，其中与递送信号融合的异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域被表达并分泌。
在重组减毒革兰氏阴性细菌菌株是耶尔森氏菌菌株的情况下，用于插入的内源毒力质粒是pYV(耶尔森氏菌毒力质粒)。在重组减毒革兰氏阴性细菌菌株是沙门氏菌菌株的情况下，用于插入的内源位置是称为SpiI或SpiII(沙门氏菌致病岛)的基因簇之一，效应蛋白在别处编码的位置，或者是沙门氏菌毒力质粒(SVP)的一种。
优选地，将第一和第二DNA序列或核苷酸分子插入在内源毒力质粒上细菌效应蛋白的天然位点处，例如在毒力因子的天然位点处，优选地，在重组减毒革兰氏阴性细菌菌株为耶尔森氏菌菌株的情况下，插入在YopE或另一Yop(YopH，YopO，YopP，YopM，YopT)的天然位点处，优选地YopE的天然位点处，或者，在重组减毒革兰氏阴性细菌菌株是沙门氏菌菌株的情况下，插入在SpiI、SpiII内编码的或其他位置编码的效应蛋白的天然位点处，优选在SpiI或SpiII内编码的效应蛋白的天然位点处，更优选地在SopE或SteA的天然位点处。优选地，将第一和第二DNA序列或核苷酸序列可操作地连接至内源毒力质粒上存在的细菌效应蛋白的天然启动子，例如，在重组减毒革兰氏阴性细菌菌株是耶尔森氏菌菌株的情况下，连接至如下所述来自耶尔森氏菌virulon基因的天然启动子，更优选连接至天然YopE启动子或另一种Yop(YopH，YopO，YopP，YopM，YopT)启动子，优选连接至天然YopE启动子，或者，在重组减毒革兰氏阴性细菌菌株是沙门氏菌菌株的情况下，连接至如下所述来自SpiI或SpiII致病岛或来自别处编码的效应蛋白的天然启动子，更优选地连接至天然SopE、InvB或SteA启动子。
在一个实施方案中，本发明提供了重组革兰氏阴性细菌菌株，其中所述革兰氏阴性细菌菌株选自由以下组成的组：耶尔森氏菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属和假单胞菌属。在一个实施方案中，本发明提供了重组革兰氏阴性细菌菌株，其中所述革兰氏阴性细菌菌株选自由以下组成的组：耶尔森氏菌属和沙门氏菌属。优选地，革兰氏阴性细菌菌株是耶尔森氏菌菌株，更优选是小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株。最优选的是小肠结肠炎耶尔森氏菌E40(O:9，生物型2型)[21]或其氨苄青霉素敏感衍生物，如[22]中所述的小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40(也称为小肠结肠炎耶尔森氏菌palearctica亚种MRS40)。小肠结肠炎耶尔森氏菌E40以及如[22]中所述的其衍生物小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40等同于小肠结肠炎耶尔森氏菌palearctica亚种E40以及如[23-25]中所述的其衍生物小肠结肠炎耶尔森氏菌palearctica亚种MRS40。还优选地，重组减毒革兰氏阴性细菌菌株是沙门氏菌菌株，更优选是肠道沙门氏菌菌株。最优选的是如英格兰公共卫生部培养物保藏中心(Public healthEngland culture collection)的鼠伤寒肠道沙门氏菌血清型SL1344(NCTC 13347)。
在本发明的一个实施方案中，来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号包含细菌T3SS效应蛋白或其N-末端片段，其中T3SS效应蛋白或其N-末端片段可包含分子伴侣结合位点。包含分子伴侣结合位点的T3SS效应蛋白或其N-末端片段在本发明中特别用作递送信号。优选的T3SS效应蛋白或其N-末端片段选自SopE、SopE2、SptP、YopE、ExoS、SipA、SipB、SipD、SopA、SopB、SopD、IpgB1、IpgD、SipC、SifA、SseJ、Sse、SrfH、YopJ、AvrA、AvrBsT、YopT、YopH、YpkA、Tir、EspF、TccP2、IpgB2、OspF、Map、OspG、OspI、IpaH、SspH1,VopF、ExoS、ExoT、HopAB2、XopD、AvrRpt2、HopAO1、HopPtoD2、HopU1、GALA家族的蛋白、AvrBs2、AvrD1、AvrBS3、YopO、YopP、YopE、YopM、YopT、EspG、EspH、EspZ、IpaA、IpaB、IpaC、VirA、IcsB、OspC1、OspE2、IpaH9.8、IpaH7.8、AvrB、AvrD、AvrPphB、AvrPphC、AvrPphEPto、AvrPpiBPto、AvrPto、AvrPtoB、VirPphA、AvrRpm1、HopPtoE、HopPtoF、HopPtoN、PopB、PopP2、AvrBs3、XopDandAvrXv3。更优选的T3SS效应蛋白或其N-末端片段选自由以下组成的组：SopE、SptP、YopE、ExoS、SopB、IpgB1、IpgD、YopJ、YopH、EspF、OspF、ExoS、YopO、YopP、YopE、YopM、YopT，其中最优选的T3SS效应蛋白或其N-末端片段选自由以下组成的组：IpgB1、SopE、SopB、SptP、OspF、IpgD、YopH、YopO、YopP、YopE、YopM、YopT，特别是YopE或其N-末端片段。
同样优选的T3SS效应蛋白或其N-末端片段选自由以下组成的组：SopE，SopE2，SptP，SteA，SipA，SipB，SipD，SopA，SopB，SopD，IpgB1，IpgD，SipC，SifA，SifB，SseJ，Sse，SrfH，YopJ，AvrA，AvrBsT，YopH，YpkA，Tir，EspF，TccP2，IpgB2，OspF，Map，OspG，OspI，IpaH，VopF，ExoS，ExoT，HopAB2，AvrRpt2，HopAO1，HopU1，GALA家族的蛋白，AvrBs2，AvrD1，YopO，YopP，YopE，YopT，EspG，EspH，EspZ，IpaA，IpaB，IpaC，VirA，IcsB，OspC1，OspE2，IpaH9.8，IpaH7.8，AvrB，AvrD，AvrPphB，AvrPphC，AvrPphEPto，AvrPpiBPto，AvrPto，AvrPtoB，VirPphA，AvrRpm1，HopPtoD2，HopPtoE，HopPtoF，HopPtoN，PopB，PopP2，AvrBs3，XopD，和AvrXv3。同样更优选的T3SS效应蛋白或其N-末端片段选自由以下组成的组：SopE，SptP，SteA，SifB，SopB，IpgB1，IpgD，YopJ，YopH，EspF，OspF，ExoS，YopO，YopP，YopE，YopT，其中同样最优选的T3SS效应蛋白或其N-末端片段选自由以下组成的组：IpgB1，SopE，SopB，SptP，SteA，SifB，OspF，IpgD，YopH，YopO，YopP，YopE，和YopT，特别是SopE、SteA或YopE或其N-末端片段，更特别是SteA或YopE或其N-末端片段，最特别是YopE或其N-末端片段。
在一些实施方案中，由第一DNA序列编码的细菌T3SS效应蛋白的递送信号包含细菌T3SS效应蛋白或其N-末端片段，其中其N-末端片段包括至少前10个，优选至少前20个，更优选至少前100个氨基酸。
在一些实施方案中，来自由第一DNA序列编码的细菌T3SS效应蛋白的递送信号包含细菌T3SS效应蛋白或其N-末端片段，其中细菌T3SS效应蛋白或其N-末端片段包含分子伴侣结合位点。
优选的包含分子伴侣结合位点的T3SS效应蛋白或其N-末端片段包含分子伴侣结合位点和T3SS效应蛋白或其N-末端片段的以下组合：SycE-YopE，InvB-SopE，SicP-SptP，SycT-YopT，SycO-YopO，SycN/YscB-YopN，SycH-YopH，SpcS-ExoS，CesF-EspF，SycD-YopB，SycD-YopD。更优选的是SycE-YopE，InvB-SopE，SycT-YopT，SycO-YopO，SycN/YscB-YopN，SycH-YopH，SpcS-ExoS，CesF-EspF。最优选的是包含SycE伴侣蛋白结合位点的YopE或其N-末端片段，例如YopE效应蛋白的N-末端片段，其含有YopE效应蛋白的N-末端138个氨基酸，本文称为YopE1-138，如SEQ ID NO.2所示，或者是包含InvB伴侣蛋白结合位点的SopE或其N-末端片段，如SopE效应蛋白的N-末端片段，其含有SopE效应蛋白的N-末端81或105个氨基酸，本文称为SopE1-81或SopE1-105，如SEQ ID NO.142或143所示。
在本发明的一个实施方案中，重组革兰氏阴性细菌菌株是耶尔森氏菌菌株，并且由第一DNA序列编码的细菌T3SS效应蛋白的递送信号，包含YopE效应蛋白或N-末端片段，优选为小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株YopE效应蛋白或其N-末端片段。优选地，SycE结合位点包含在YopE效应蛋白的N-末端片段内。在这方面，YopE效应蛋白的N-末端片段可以包含N-末端的12、16、18、52、53、80或138个氨基酸[26-28]。最优选的是如在Forsberg和Wolf-Watz[29]中所描述的，在本文中称为YopE1-138以及如SEQ ID NO.:2所示的YopE效应蛋白的N-末端片段，其含有YopE效应蛋白的N-末端138个氨基酸。
在本发明的一个实施方案中，重组革兰氏阴性细菌菌株是沙门氏菌菌株，并且由第一DNA序列编码的细菌T3SS效应蛋白的递送信号包含SopE或SteA效应蛋白或其N-末端片段，优选肠道沙门氏菌SopE或SteA效应蛋白或其N-末端片段。优选地，分子伴侣结合位点包含在SopE效应蛋白的N-末端片段内。在这方面，SopE效应蛋白的N-末端片段可以包含N-末端81或105个氨基酸。最优选的是全长SteA和含有如SEQ ID NO.142或143所描述的效应蛋白的N-末端105个氨基酸的SopE效应蛋白的N-末端片段。
本领域技术人员熟悉鉴定能够递送蛋白的效应蛋白的多肽序列的方法。例如，由Sory等人[21]描述的一种这样的方法。简言之，Yop蛋白的各种部分可以框内融合到报告子酶，例如百日咳博德特氏菌脂环化酶的钙调蛋白激活的腺苷酸环化酶结构域(或Cya)。Yop-Cya杂合蛋白到真核细胞的胞质溶胶中的递送通过在受感染的真核细胞中出现导致cAMP积累的环化酶活性来指示。通过采用这种方法，如果需要，本领域技术人员可以确定能够递送蛋白的最小序列需求，即最短长度的连续氨基酸序列，参见例如[21]。因此，本发明的优选递送信号至少由能够递送蛋白的T3SS效应蛋白的最小氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，本发明提供突变体重组革兰氏阴性细菌菌株，特别是重组革兰氏阴性细菌菌株，其对于至少一种T3SS功能性效应蛋白的产生是缺陷的。
根据本发明，这种突变体革兰氏阴性细菌菌株如这样的突变型耶尔森氏菌菌株可以通过将至少一个突变引入至少一种效应子编码基因中来产生。优选地，就耶尔森氏菌菌株而言，这种效应子编码基因包括YopE、YopH、YopO/YpkA、YopM、YopP/YopJ和YopT。优选地，就沙门氏菌菌株而言，这些效应子编码基因包括AvrA、CigR、GogB、GtgA、GtgE、PipB、SifB、SipA/SspA、SipB、SipC/SspC、SipD/SspD、SlrP、SopB/SigD、SopA、SpiC/SsaB、SseB、SseC、SseD、SseF、SseG、SseI/SrfH、SopD、SopE、SopE2、SspH1、SspH2、PipB2、SifA、SopD2、SseJ、SseK1、SseK2、SseK3、SseL、SteC、SteA、SteB、SteD、SteE、SpvB、SpvC、SpvD、SrfJ、SptP。最优选地，所有效应子编码基因都缺失。本领域技术人员可以使用任何数量的标准技术在这些T3SS效应基因中产生突变。Sambrook等描述了这样的技术。参见Sambrook等[30]。
根据本发明，突变可以在效应子编码基因的启动子区产生，使得这种效应基因的表达被消除。
突变也可以在效应子编码基因的编码区中产生，使得编码的效应蛋白的催化活性被消除。效应蛋白的“催化活性”通常指效应蛋白的抗靶细胞功能，即毒性。这种活性由效应蛋白的催化结构域中的催化基序控制。用于鉴定效应蛋白的催化结构域和/或催化基序的方法是本领域技术人员公知的。例如参见[31,32]。
因此，本发明的一个优选的突变是整个催化结构域的缺失。另一个优选的突变是效应子编码基因中的移码突变，使得催化结构域不存在于由这种“移码”基因表达的蛋白产物中。最优选的突变是具有效应蛋白的整个编码区缺失的突变。本发明还涵盖其它突变，例如小缺失或碱基对取代，其在效应蛋白的催化基序中产生，导致破坏给定效应蛋白的催化活性。
在T3SS功能效应蛋白的基因中产生的突变可以通过许多方法引入特定菌株。一种这样的方法包括将突变基因克隆到“自杀”载体中，该载体能够通过等位基因交换将突变序列引入菌株。这种“自杀”载体的一个例子描述在[33]中。
以这种方式，可将多个基因中产生的突变连续地引入产生多突变体的革兰氏阴性细菌菌株中，例如六重突变重组菌株。这些突变序列的引入顺序并不重要。在有些情况下，可能需要仅突变一些但不是所有的效应基因。因此，本发明进一步考虑除六突变型耶尔森氏菌以外的多突变体耶尔森氏菌，例如双突变体、三突变体、四突变体和五重突变株。为了递送蛋白的目的，本发明突变株的分泌和易位系统需要是完整的。
本发明优选的重组革兰氏阴性菌株是这样的重组革兰氏阴性细菌菌株：其在产生至少一种，优选至少两种，更优选至少三种，甚至更优选至少四种，特别是至少五种，更特别是至少六种，最特别是所有T3SS效应蛋白方面有缺陷，例如六突变体革兰氏阴性细菌菌株，其中所有效应子编码基因均被突变，使得所得革兰氏阴性细菌菌株不再产生任何功能性效应蛋白。
本发明更优选的重组革兰氏阴性细菌菌株是六突变体耶尔森氏菌菌株，其中所有效应子编码基因均被突变，使得所得的耶尔森氏菌不再产生任何功能效应蛋白。对于小肠结肠炎耶尔森氏菌，这种六突变体耶尔森氏菌菌株被命名为ΔyopH、O、P、E、M、T。作为一个实例，这样的六突变体可以从小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40菌株产生，产生小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40ΔyopH、O、P、E、M、T，这是优选的。
本发明的另一方面涉及与重组革兰氏阴性细菌菌株组合使用以将所需蛋白递送到真核细胞中的载体，其中载体沿5'至3'方向包含：
启动子；
编码来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号的第一DNA序列，其可操作地连接到所述启动子上；
编码异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域的第二DNA序列，其与所述第一DNA序列的3'末端框内融合，
其中所述异源蛋白选自由以下组成的组：参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白，细胞周期调节剂，锚蛋白重复蛋白、细胞信号转导蛋白、报道蛋白、转录因子、蛋白酶、小GTP酶、GPCR相关蛋白、纳米抗体融合构建体和纳米抗体、细菌T3SS效应子、细菌T4SS效应子和病毒蛋白。
如上所述的启动子、异源蛋白和蛋白酶切割位点可用于革兰氏阴性细菌菌株的载体。
本发明的另一方面涉及与重组革兰氏阴性细菌菌株组合使用以将所需蛋白递送到真核细胞中的载体，其中载体沿5'至3'方向包含：
编码来自细菌效应蛋白的递送信号或其片段的第一DNA序列；
编码异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域的第二DNA序列，其与所述第一DNA序列的3'末端框内融合，
其中所述异源蛋白选自由以下组成的组：参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白、细胞周期调节剂、锚蛋白重复蛋白、细胞信号转导蛋白、报道蛋白、转录因子、蛋白酶、小GTP酶、GPCR相关蛋白、纳米抗体融合构建体和纳米抗体、细菌T3SS效应子、细菌T4SS效应子和病毒蛋白。
优选地，载体的编码异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域的DNA序列在其3’末端侧接有与染色体或内源毒力质粒在来自细菌效应蛋白的递送信号或其片段的3’末端处的DNA序列同源的DNA序列。更优选地，侧接在同源蛋白的3’末端的该DNA序列与DNA序列同源并且位于染色体或内源毒力质粒上来自细菌效应蛋白的递送信号或其片段的3’末端的10kbp内。具体地，侧接在同源蛋白的3’末端的该核苷酸序列与DNA序列同源并且位于染色体或内源毒力质粒上与来自细菌效应蛋白的递送信号或其片段相同的操纵子内。如上所述的异源蛋白和蛋白酶切割位点可用于革兰氏阴性细菌菌株的载体。
根据本发明可以使用的载体取决于本领域技术人员已知的革兰氏阴性细菌菌株。根据本发明可以使用的载体包括表达载体(包括合成的或以其他方式产生的内源性毒力质粒的修饰形式)、用于染色体或毒力质粒插入的载体和用于染色体或毒力质粒插入的DNA片段。在例如耶尔森氏菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属或假单胞菌属菌株上有用的表达载体是pUC、pBad、pACYC、pUCP20和pET质粒。在例如耶尔森氏菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属或假单胞菌属菌株上有用的用于染色体或毒力质粒插入的载体是例如pKNG101。用于染色体或毒力质粒插入的DNA片段适用于在例如耶尔森氏菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属或假单胞菌属菌株中使用的方法，如λ-红色基因工程。用于染色体或毒力质粒插入的载体或用于染色体或毒力质粒插入的DNA片段可以插入本发明的第一、第二和/或第三DNA序列，使得第一、第二和/或第三DNA序列可操作地连接到内源重组革兰氏阴性细菌菌株的启动子。因此，如果使用用于染色体或毒力质粒插入的载体或用于染色体或毒力质粒插入的DNA片段，则可以在内源细菌DNA(染色体或质粒DNA)上编码内源启动子，并且用于染色体或毒力质粒插入的工程化载体或用于染色体或毒力质粒插入的DNA片段将仅提供第一和第二DNA序列。或者，如果使用用于染色体或毒力质粒插入的载体或用于染色体或毒力质粒插入的核酸分子(如DNA片段)，则可以在内源细菌DNA(染色体或质粒DNA)上编码内源启动子和来自细菌效应蛋白的递送信号，并且用于染色体或毒力质粒插入的载体或用于染色体或毒力质粒插入的核酸分子(如DNA片段)将仅提供编码外源蛋白的核酸分子(如DNA片段)。因此，用于转化重组革兰氏阴性细菌菌株的载体未必需要包含启动子，即本发明的重组革兰氏阴性细菌菌株可以用不包含启动子的载体转化。本发明的载体通常用于通过细菌T3SS将异源蛋白在体外和体内递送到真核细胞中。
用于耶尔森氏菌的优选的载体，例如优选的表达载体，选自pBad_Si1和pBad_Si2。通过将含有用于YopE和SycE的内源启动子的SycE-YopE1-138片段从纯化的pYV40克隆到pBad-MycHisA(Invitrogen)的KpnI/HindIII位点中构建pBad_Si2。另外的修饰包括通过消化、Klenow片段处理和重连接去除pBad-MycHisA的NcoI/BgUI片段。此外在YopE1-138的3'端，添加以下切割位点：XbaI-XhoI-BstBI-(HindIII)。pBad_Si1与pBad_Si2相同，但在阿拉伯糖诱导型启动子下在NcoI/BglII位点中编码从pEGFP-C1(Clontech)扩增的EGFP。同样优选的是使用编码异源蛋白的内源耶尔森氏菌毒力质粒pYV的修饰形式作为与T3SS信号序列的融合体。用于沙门氏菌的优选载体，例如优选表达载体，选自由以下组成的组：pSi_266、pSi_267、pSi_268和pSi_269。含有相应内源启动子和SteA1-20片段(pSi_266)、全长SteA序列(pSi_267)、SopE1-81片段(pSi_268)或SopE1-105片段(pSi_269)的质粒pSi_266、pSi_267、pSi_268和pSi_269分别为从肠道沙门氏菌SL1344基因组DNA扩增并克隆到pBad-MycHisA(Invitrogen)的NcoI/KpnI位点中。
本发明的载体可包括其它序列元件，例如3'终止序列(包括终止密码子和poly A序列)或赋予药物抗性的基因，其允许选择已接受本载体的转化体。
本发明的载体可以通过许多已知的方法转化到重组革兰氏阴性细菌菌株中。为了本发明的目的，用于导入载体的转化方法包括但不限于电穿孔、磷酸钙介导的转化、缀合或其组合。例如，可以通过标准电穿孔程序将载体转化入第一细菌菌株。随后，这样的载体可以通过缀合，也称为“移动(mobilization)”，的过程从第一细菌菌株转移到期望的菌株中。可以用例如抗生素选择转化体(即：吸收载体的革兰氏阴性细菌菌株)。这些技术是本领域公知的。参见例如[21]。
根据本发明，本发明重组革兰氏阴性菌株的表达载体启动子可以是相应菌株或兼容性细菌菌株的T3SS效应蛋白的天然启动子，或在例如耶尔森氏菌、埃希氏菌属、沙门氏菌属或假单胞菌属菌株中使用的表达载体中使用的启动子，例如pUC和pBad。此类启动子是T7启动子、Plac启动子或Ara-bad启动子。
如果重组革兰氏阴性细菌菌株是耶尔森氏菌菌株，则启动子可以来自耶尔森氏菌virulon基因。“耶尔森氏菌virulon基因”是指耶尔森氏菌pYV质粒上的基因，其表达受到温度和与靶细胞接触的控制。这些基因包括编码分泌机器元件的基因(Ysc基因)，编码易位蛋白(translocator)的基因(YopB，YopD和LcrV)，编码控制元件的基因(YopN，TyeA和LcrG)，编码T3SS效应子伴侣的基因(SycD，SycE，SycH，SycN，SycO和SycT)，和编码效应子的基因(YopE，YopH，YopO/YpkA，YopM，YopT和YopP/YopJ)以及编码其他pYV编码的蛋白的基因如VirF和YadA。
在本发明的优选实施方案中，启动子是T3SS功能性效应子编码基因的天然启动子。如果重组革兰氏阴性细菌菌株是耶尔森氏菌菌株，则该启动子选自YopE，YopH，YopO/YpkA，YopM和YopP/YopJ中的任一种。更优选地，启动子来自YopE或SycE。
如果重组革兰氏阴性细菌菌株是沙门氏菌菌株，则启动子可以来自SpiI或SpiII致病性岛或来自其他地方编码的效应蛋白。这些基因包括编码分泌机制元件的基因、编码易位蛋白的基因、编码控制元件的基因、编码T3SS效应子分子伴侣的基因、编码效应子的基因以及由SPI-1或SPI-2编码的其它蛋白。在本发明的一个优选实施方案中，启动子是T3SS功能效应子编码基因的天然启动子。如果重组革兰氏阴性细菌菌株是沙门氏菌菌株，则启动子选自任何一种效应蛋白。更优选地，启动子来自SopE、InvB或SteA。
在优选的实施方案中，载体，例如表达载体包含编码蛋白酶切割位点的DNA序列。功能性和通常适用的切割位点的产生允许在易位后切割递送信号。由于递送信号可干扰靶细胞内易位蛋白的正确定位和/或功能，在递送信号和目标蛋白之间引入蛋白酶切割位点提供了几乎天然蛋白首次递送到真核细胞中。优选地，蛋白酶切割位点是被选自肠激酶(轻链)、肠肽酶、解离蛋白酶、人鼻病毒蛋白酶3C、TEV蛋白酶、TVMV蛋白酶、因子Xa的蛋白酶或其催化结构域切割的氨基酸基序蛋白酶和凝血酶，更优选由TEV蛋白酶切割的氨基酸基序。同样优选的蛋白酶切割位点是被选自肠激酶(轻链)、肠肽酶、解离蛋白酶、人类鼻病毒蛋白酶3C、TEV蛋白酶、TVMV蛋白酶、因子Xa蛋白酶、泛素加工蛋白酶(称为去泛素化酶)和凝血酶一组的蛋白酶或催化结构域切割的氨基酸基序。最优选的是被TEV蛋白酶或泛素加工蛋白酶切割的氨基酸基序。
因此，在本发明的另一个实施方案中，异源蛋白通过蛋白酶从细菌T3SS效应蛋白的递送信号裂解。优选的裂解方法是这样的方法，其中：
a)蛋白酶通过本文所述的重组革兰氏阴性细菌菌株被易位到真核细胞中，其表达包含来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号和作为异源蛋白的蛋白酶的融合蛋白；或者
b)蛋白酶在真核细胞中为组成型或瞬时表达。
通常，用于将期望的蛋白递送到真核细胞中的重组革兰氏阴性细菌菌株和将蛋白酶易位到真核细胞中的重组革兰氏阴性菌株是不同的。
在本发明的一个实施方案中，载体包含编码标记分子或标记分子的受体位点的另外的DNA序列。编码标记分子或标记分子的受体位点的另外的DNA序列通常与第二DNA序列的5’末端或3’末端融合。优选的标记分子或标记分子的受体位点选自由以下组成的组：增强型绿色荧光蛋白(EGFP)，香豆素，香豆素连接酶受体位点，试卤灵(resorufin)，试卤灵连接酶受体位点，与FlAsH/ReAsH染料一起使用的四-半胱氨酸基序(life technologies)。最优选的是试卤灵和试卤灵连接酶受体位点或EGFP。标记分子或标记分子的受体位点的使用将导致标记分子与目标异源蛋白的连接，其然后将原样递送到真核细胞中，并能够通过例如活细胞显微镜检查来追踪蛋白。
在本发明的一个实施方案中，载体包含编码肽标签的另外的DNA序列。编码肽标签的另外的DNA序列通常与第二DNA序列的5’末端或3’末端融合。优选的肽标签选自由以下组成的组：Myc-标签，His-标签，Flag-标签，HA-标签，Strep-标签或V5-标签，或这些组中的两个或更多个标签的组合。最优选的是Myc-标签、Flag-标签、His-标签和组合的Myc-标签和His-标签的组合。肽标签的使用将导致带标签蛋白的可追溯性，例如通过使用抗标签抗体的免疫荧光或Western印迹。此外，肽标签的使用允许在分泌到培养物上清液中后或在易位到真核细胞中后，对所需蛋白进行亲和纯化，在两种情况下均使用适合相应标签的纯化方法(例如，金属螯合物亲和纯化与His-标签一起使用；或，基于抗-Flag抗体的纯化与Flag-标签一起使用)。
在本发明的一个实施方案中，载体包含编码核定位信号(NLS)的另外的DNA序列。编码核定位信号(NLS)的另外的DNA序列通常与第二DNA序列的5’末端或3’末端融合，其中所述另外的DNA序列编码核定位信号(NLS)。优选的NLS选自由以下组成的组：SV40大T抗原NLS及其衍生物[34]以及其他病毒NLS。最优选的是SV40大T抗原NLS及其衍生物。
在本发明的一个实施方案中，载体包含多克隆位点。多克隆位点通常位于第一DNA序列的3’末端和/或第二DNA序列的5’末端或3’末端。载体可以包含一个或不止一个多克隆位点。优选的多克隆位点选自由以下组成的限制酶组：XhoI，XbaI，HindIII，NcoI，NotI，EcoRI，EcoRV，BamHI，NheI，SacI，SalI，BstBI。最优选的是XbaI，XhoI，BstBI和HindIII。
由载体的第一和第二和任选的第三DNA序列表达的融合蛋白也称为“融合蛋白”或“杂合蛋白”，即递送信号和异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域的融合蛋白或杂合物。
本发明涉及用于将如上所述的异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域递送到细胞培养物以及体内的真核细胞中的方法。
因此，在一个实施方案中，递送异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域的方法包括
i)培养如本文所述的革兰氏阴性细菌菌株；
ii)使真核细胞与i)的革兰氏阴性细菌菌株接触，其中革兰氏阴性细菌菌株表达融合蛋白，所述融合蛋白包含来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号和异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域，并且所述融合蛋白被易位到真核细胞中；以及任选地
iii)切割所述融合蛋白，使得异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域与菌T3SS效应蛋白的递送信号切割开来。
在一些实施方案中，包含来自细菌效应蛋白的递送信号和异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域的至少两种融合蛋白由重组减毒革兰氏阴性细菌菌株表达，并通过本发明的方法易位到真核细胞中。
可以根据本领域已知的方法(例如：FDA、Bacteriological Analytical Manual(BAM)、第8章：小肠结肠炎耶尔森氏菌)培养重组革兰氏阴性细菌菌株从而表达包含来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号和异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域的融合蛋白。优选地，重组革兰氏阴性细菌菌株可以在脑心浸液肉汤中在如在28℃时培养。为了诱导T3SS以及如YopE/SycE启动子依赖基因的表达，细菌可以在37℃生长。
在优选的实施方案中，使真核细胞与i)的两种革兰氏阴性细菌菌株接触，其中第一革兰氏阴性细菌菌株表达第一融合蛋白，其包含来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号和异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域，并且第二革兰氏阴性细菌菌株表达第二融合蛋白，其包含来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号和第二异源蛋白的重复结构域或第二异源蛋白的不同的第二异源蛋白的两个或多个结构域，使得第一和第二融合蛋白易位到真核细胞中。该实施方案提供了例如真核细胞与两种细菌菌株共感染如递送例如两个不同的杂交蛋白进入细胞以解决它们的功能性互作的有效方法。
本领域技术人员还可以使用多种测定法来确定融合蛋白的递送是否成功。例如，可以使用识别融合标签(如Myc-标签)的抗体通过免疫荧光来检测融合蛋白。测定也可以基于被递送的蛋白的酶活性。
本发明考虑大范围的真核细胞，其可以被本发明的重组革兰氏阴性细菌菌株靶向，例如Hi-5(BTI-TN-5B1-4；life technologies B855-02)，HeLa细胞，例如HeLa Ccl2(如ATCC No.CCL-2)，成纤维细胞，例如3T3成纤维细胞(as ATCC No.CCL-92)或Mef(如ATCCNo.SCRC-1040)，Hek(如ATCC No.CRL-1573)，HUVECs(如ATCC No.PCS-100-013)，CHO(如ATCC No.CCL-61)，Jurkat(如ATCC No.TIB-152)，Sf-9(如ATCC No.CRL-1711)，HepG2(如ATCC No.HB-8065)，Vero(如ATCC No.CCL-81)，MDCK(如ATCC No.CCL-34)，THP-1(如ATCCNo.TIB-202)，J774(如ATCC No.TIB-67)，RAW(如ATCC No.TIB-71)，Caco2(如ATCC No.HTB-37)，NCI细胞系(如ATCC No.HTB-182)，DU145(如ATCC No.HTB-81)，Lncap(如ATCC No.CRL-1740)，MCF-7(如ATCC No.HTB-22)，MDA-MB细胞系(如ATCC No.HTB-128)，PC3(如ATCCNo.CRL-1435)，T47D(如ATCC No.CRL-2865)，A549(如ATCC No.CCL-185)，U87(如ATCCNo.HTB-14)，SHSY5Y(如ATCC No.CRL-2266s)，Ea.Hy926(如ATCC No.CRL-2922)，Saos-2(如ATCC No.HTBH-85)，4T1(如ATCC No.CRL-2539)，B16F10(如ATCC No.CRL-6475)，或原代人干细胞(如life technologies HMCPIS)，优选HeLa，Hek，HUVECs，3T3，CHO，Jurkat，Sf-9，HepG2Vero，THP-1，Caco2，Mef，A549，4T1，B16F10和原代人干细胞，并且最优选HeLa，Hek，HUVECs，3T3，CHO，Jurkat，THP-1，A549和Mef。“靶”是指重组革兰氏阴性细菌菌株对真核细胞的细胞外粘附。
根据本发明，蛋白的递送可以通过在适当的条件下使真核细胞与重组革兰氏阴性细菌菌株接触来实现。关于诱导virulon基因的表达和易位的条件，包括期望的温度、Ca++浓度、添加刚果红的诱导剂。本领域技术人员通常可获得各种参考文献和技术，其中重组将革兰氏阴性细菌菌株和靶细胞混合等。参见例如[35]。条件可以根据待靶向的真核细胞的类型和待使用的重组细菌菌株而变化。这些变化可以由本领域技术人员使用常规技术来解决。
本领域技术人员还可以使用多种测定来确定融合蛋白的递送是否成功。例如：可以使用识别融合标签(如Myc-标签)的抗体通过免疫荧光检测融合蛋白。测定还可以基于被递送的蛋白的酶活性如[21]所述的测定。
在一个实施方案中，本发明提供本文所述的重组革兰氏阴性细菌菌株用于药物。
在一个实施方案中，本发明提供了本文所述的重组革兰氏阴性细菌菌株，其用于将异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域作为药物或作为疫苗递送至受试者。异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域可以通过使革兰氏阴性细菌菌株与真核细胞例如真菌细胞接触而如疫苗递送给受试者，例如与活的动物在体内接触，以使得异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域被易位到活动物中，然后产生针对异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域的抗体。产生的抗体可以直接使用或分离和纯化并用于诊断、研究以及治疗用途。包含抗体或其中含有的DNA序列的B细胞可以用于进一步产生特异性抗体用于诊断、研究以及治疗用途。
在一个实施方案中，本发明提供了递送异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域的方法，其中异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域在体外被递送到真核细胞中。
在另一个实施方案中，本发明提供了递送异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域的方法，其中真核细胞是活的动物，其中活体动物与革兰氏阴性细菌菌株在体内接触使得融合蛋白被易位到活的动物中。优选的动物是哺乳动物，更优选人。
在另一个实施方案中，本发明提供了如上所述的重组革兰氏阴性细菌菌株用于由递送的异源蛋白引发的细胞途径或事件的抑制剂的高通量筛选的用途。
在另一方面，本发明提供了革兰氏阴性细菌菌株的文库，其中由革兰氏阴性细菌菌株的表达载体的第二DNA序列编码的异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域是人或鼠蛋白的结构域，优选人蛋白的结构域，并且其中由革兰氏阴性细菌菌株表达的每种人或鼠蛋白的结构域的氨基酸序列不同。如用于表达的克隆载体可以使用上述表达载体。
在另一个方面，本发明提供了试剂盒，其包含本文所述的载体及表达和分泌能够切割载体包含的蛋白酶裂解位点的蛋白酶的细菌菌株。特别有用的载体是与细菌菌株组合用于将所需蛋白递送到如上所述的真核细胞中的载体，其中所述载体沿5'至3'方向包含：
启动子；
编码来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号的第一DNA序列，其可操作地连接到所述启动子上；
编码异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域的第二DNA序列，其与所述第一DNA序列的3'末端框内融合，
其中所述异源蛋白选自由以下组成的组：参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白，细胞周期调节剂，锚蛋白重复蛋白，细胞信号转导蛋白，报道蛋白，转录因子，蛋白酶，小GTP酶，GPCR相关蛋白，纳米抗体融合构建体和纳米抗体，细菌T3SS效应子，细菌T4SS效应子和病毒蛋白。
实施例
实施例1
A)材料和方法
细菌菌株和生长条件。本研究中使用的菌株列于图15A至N中。用于质粒纯化和克隆的大肠杆菌Top10，和用于缀合的大肠杆菌Sm10λ pir，以及用于繁殖pKNG101的大肠杆菌BW19610[36]在LB琼脂平板上和LB培养基中在37℃下常规生长。使用浓度为200μg/ml(耶尔森氏菌)或100μg/ml(大肠杆菌)的氨苄青霉素来选择表达载体。使用浓度为100μg/ml的链霉素来选择自杀载体。小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40[22]，非氨苄青霉素抗性E40-衍生物[21]及其衍生菌株在室温下在脑心浸液(BHI；Difco)上常规生长。向所有小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株添加萘啶酮酸(35μg/ml)，并且所有小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株额外补充100μg/ml内消旋-2,6-二氨基庚二酸(mDAP，Sigma Aldrich)。肠道沙门氏菌SL1344通常在LB琼脂平板和LB培养液中在37℃下常规生长。使用浓度为100μg/ml的氨苄青霉素来选择肠道沙门氏菌中的表达载体。
小肠结肠炎耶尔森氏菌的遗传操作。已经描述了小肠结肠炎耶尔森氏菌的遗传操作[37,38]。简言之，使用纯化的pYV40质粒或基因组DNA作为模板，通过2-片段重叠PCR构建了用于修饰pYV质粒中或染色体上的基因或使其缺失的增变基因(mutator)，得到200–250bp的在相应基因的缺失或修饰部分的两侧上的侧接序列。将所得片段克隆入大肠杆菌BW19610[36]中的pKNG101[33]中。将序列验证的质粒转化到大肠杆菌Sm10λ pir中，质粒从其中被动员到相应的小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株中。携带整合载体的突变体在没有选择压力的情况下繁殖数代。然后使用蔗糖来选择已经失去载体的克隆。最后通过菌落PCR鉴定突变体。表III列出了特定的增变基因(pSi_408，pSi_419)。
质粒的构建。使用质粒pBad_Si2或pBad_Si1(图10)来克隆具有YopE的N-末端138个氨基酸(SEQ ID NO:2)的融合蛋白。通过将含有来自纯化的pYV40的针对YopE和SycE的内源启动子的SycE-YopE1-138片段克隆到pBad-MycHisA(Invitrogen)的KpnI/HindIII位点中来构建pBad_Si2。另外的修饰包括通过消化、Klenow片段处理和再连接而去除pBad-MycHisA的NcoI/BglII片段。将双向转录终止子(BBa_B1006；iGEM foundation)克隆到被KpnI切割并被Klenow处理(pBad_Si2)或被BglII切割的位点(pBad_Si1)中。进一步在YopE1-138的3’末端添加以下切割位点：XbaI-XhoI-BstBI-(HindIII)(图10B)。pBad_Si1与pBad_Si2相同，但在阿拉伯糖诱导型启动子下在NcoI/BglII位点中编码从pEGFP-C1(Clontech)扩增的EGFP。含有相应内源启动子和SteA1-20片段(pSi_266)、全长SteA序列(pSi_267)、SopE1-81片段(pSi_268)或SopE1-105片段(pSi_269)的质粒pSi_266、pSi_267、pSi_268和pSi_269从肠道沙门氏菌SL1344基因组DNA扩增并克隆到pBad-MycHisA(Invitrogen)的NcoI/KpnI位点中。
用下表I中列出的特异性引物扩增全长基因或其片段，并将其作为与YopE1-138的融合物克隆到质粒pBad_Si2中，或者在z-BIM(SEQ ID NO:21)的情况下，克隆到pBad_Si1中(参见下表II)。为了与SteA或SopE融合，用KpnI/HindII切割合成的DNA构建体，并将其分别克隆到pSi_266、pSi_267、pSi_268或pSi_269中。在细菌菌种基因的情况下，使用纯化的基因组DNA作为模板(福氏志贺氏菌M90T，肠道沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌血清型SL1344，汉斯巴尔通体ATCC 49882)。对于人类基因，如果没有另外说明，则使用通用cDNA文库(Clontech)(图15A至N)，从cDNA文库(M.Afeolter的赠品)扩增斑马鱼基因。将连接的质粒克隆入大肠杆菌Top10中。使用标准大肠杆菌电穿孔的设置，将测序的质粒电穿孔到所需小肠结肠炎耶尔森氏菌或肠道沙门氏菌中。
表I(引物Nr.Si_:序列)
285:CATACCATGGGAGTGAGCAAGGGCGAG
286:GGAAGATCTttACTTGTACAGCTCGTCCAT
287:CGGGGTACCTCAACTAAATGACCGTGGTG
288:GTTAAAGCTTttcgaatctagactcgagCGTGGCGAACTGGTC
292:CAGTctcgagCAAATTCTAAACAAAATACTTCCAC
293:cagtTTCGAATTAATTTGTATTGCTTTGACGG
296:CAGTctcgagACTAACATAACACTATCCACCCAG
297:GTTAAAGCTTTCAGGAGGCATTCTGAAG
299:CAGTctcgagCAGGCCATCAAGTGTGTG
300:cagtTTCGAATCATTTTCTCTTCCTCTTCTTCA
301:CAGTctcgagGCTGCCATCCGGAA
302:cagtTTCGAATCACAAGACAAGGCACCC
306:GTTAAAGCTTGGAGGCATTCTGAAGatacttatt
307:CAGTctcgagCAAATACAGAGCTTCTATCACTCAG
308:GTTAAAGCTTTCAAGATGTGATTAATGAAGAAATG
317:cagtTTCGAACCCATAAAAAAGCCCTGTC
318:GTTAAAGCTTCTACTCTATCATCAAACGATAAAATGg
324:CAGTctcgagTTCACTCAAGAAACGCAAA
339:cagtTTCGAATTTTCTCTTCCTCTTCTTCAcg
341:cgtaTCTAGAAAAATGATGAAAATGGAGACTG
342:GTTAAAGCTTttaGCTGGAGACGGTGAC
346:CAGTctcgagTTCCAGATCCCAGAGTTTG
347:GTTAAAGCTTTCACTGGGAGGGGG
351:CAGTctcgagctcgagTTATCTACTCATAGAAACTACTTTTGCAG352:cgcGGATCCtcagtgtctctgcggcatta
353:CATTTATTCCTCCTAGTTAGTCAcagcaactgctgctcctttc
354:gaaaggagcagcagttgctgTGACTAACTAGGAGGAATAAATG
355:cgattcacggattgctttctCATTATTCCCTCCAGGTACTA
356:TAGTACCTGGAGGGAATAATGagaaagcaatccgtgaatcg
357:cgtaTCTAGAcggctttaagtgcgacattc
364:cgtaTCTAGACTAAAGTATGAGGAGAGAAAATTGAA
365:GTTAAAGCTTTCAGCTTGCCGTCGT
367:CGTAtctagaGACCCGTTCCTGGTGC
369:cgtaTCTAGAccccccaagaagaagc
373:GTTAAAGCTTGCTGGAGACGGTGACC
386:CGTAtctagaTCAGGACGCTTCGGAGGTAG
387:CGTAtctagaATGGACTGTGAGGTCAACAA
389:CGTAtctagaGGCAACCGCAGCA
391:GTTAAAGCTTTCAGTCCATCCCATTTCTg
403:CGTAtctagatctggaatatccctggaca
406:GTTAAAGCTTgtctgtctcaatgccacagt
410:CAGTctcgagATGTCCGGGGTGGTg
413:cagtTTCGAATCACTGCAGCATGATGTC
417:CAGTctcgagAGTGGTGTTGATGATGACATG
420:cagtTTCGAATTAGTGATAAAAATAGAGTTCTTTTGTGAG
423:CAGTctcgagATGCACATAACTAATTTGGGATT
424:cagtTTCGAATTATACAAATGACGAATACCCTTT
425:GTTAAAGCTTttacaccttgcgcttcttcttgggcggGCTGGAGACGGTGAC428:CGTAtctagaATGGACTTCAACAGGAACTTT
429:CGTAtctagaGGACATAGTCCACCAGCG
430:GTTAAAGCTTTCAGTTGGATCCGAAAAAC
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表II：克隆的融合蛋白
表III：用于遗传修饰的增变基因
Yop分泌。通过将培养物移至37℃下BHI-Ox中(允许分泌的条件)来进行yop调节子的诱导[39]。作为碳源，加入葡萄糖(4mg/ml)。
通过在4℃下以20 800g离心10分钟来分离总细胞和上清液部分。将细胞沉淀物作为总细胞部分。上清液中的蛋白用终浓度为10％(w/v)的三氯乙酸在4℃下沉淀1小时。离心(20 800g，15分钟)并除去上清液后，将所得沉淀物用冰冷丙酮洗涤过夜。将样品再次离心，弃去上清液，将沉淀物风干并重悬于1x SDS上样染料中。
通过SDS-PAGE分析所分泌的蛋白；在每种情况下，每泳道加载由3×108个细菌分泌的蛋白。使用12.5％SDS-PAGE凝胶进行免疫印迹来检测具体分泌蛋白。为了检测总细胞中的蛋白，如果没有另外说明，则每个泳道加载2×108个细菌，并在12.5％SDS-PAGE凝胶上分离蛋白，然后通过免疫印迹检测。
使用针对YopE的大鼠单克隆抗体(MIPA193-13A9；1:1000，[40])进行免疫印迹。抗血清针对小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd过夜预吸附两次，以减少背景染色。用针对大鼠抗体并与辣根过氧化物酶缀合的二抗进行检测(1:5000；Southern biotech)，然后用ECL化学发光底物(LumiGlo，KPM)显色。
细胞培养和感染。将HeLa Ccl2、瑞士3T3成纤维细胞、4T1、B16F10和D2A1在补充有10％FCS和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco’s改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modifiedEagle’s medium,DMEM)(cDMEM)中培养。如[41]所述分离并培养HUVEC。将Jurkat和4T1细胞在补充有10％FCS和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640中培养。小肠结肠炎耶尔森氏菌在具有添加剂的BHI中生长过夜，在新鲜BHI中稀释至OD600为0.2，在室温下生长2小时，然后温度转移至37℃水浴振荡器中再持续30分钟，或在递送EGFP的情况下持续1小时。最后，通过离心(6000rcf，30秒)收集细菌并用补充有10mM HEPES和2mM L-谷氨酰胺的DMEM洗涤一次。肠道沙门氏菌在具有添加剂的LB中在37℃下生长过夜，在新鲜LB中以1:40稀释，并在37℃下生长2.5小时(SpiI T3SS诱导条件)，或者将过夜培养物在37℃下进一步孵育(SpiII T3SS诱导条件)。最后，通过离心(6000rcf，30秒)收集细菌并用补充有10mM HEPES和2mM L-谷氨酰胺的DMEM洗涤一次。接种于96孔板(用于免疫荧光)或6孔板(用于蛋白印迹)的细胞以指定的MOI在补充有10mM HEPES和2mM L-谷氨酰胺的DMEM中感染。加入细菌后，将平板以1750rpm离心1分钟并置于37℃下指定时间段。如果指出，则用庆大霉素(100mg/ml)杀死细胞外细菌。在免疫荧光分析的情况下，通过4％PFA固定来终止感染测定。对于western印迹分析，用冰冷的PBS洗涤细胞两次，并加入Phospho-safe裂解缓冲液(Novagen)以裂解细胞。在冰上孵育后，将细胞离心(16000rcf，25分钟，4℃)。收集上清液，并通过Bradford BCA测定(Pierce)来分析总蛋白含量，然后使用抗磷酸-Akt(Ser473和T308，均为CellSignaling)、抗肌动蛋白(Millipore)、抗-Bid(Cell Signaling)、抗-Myc(Santa Cruz)、抗-p38(Cell Signaling)、抗-磷酸化-p-38(Thr180/Tyr182；Cell Signaling)、抗-半胱天冬酶-3p17(Cell Signaling)和抗-Ink4C(Cell Signaling)抗体进行SDS PAGE和Western印迹。
肠炎沙门氏菌的分泌分析。为了诱导肠炎沙门氏菌的蛋白分泌，将肠杆菌在定轨振荡器(设定为150rpm)上在含有0.3M NaCl的LB中培养过夜。然后将肠杆菌在含有0.3MNaCl的新鲜LB中以1:50稀释，并在37℃下振荡生长4小时。
通过在4℃下以80000g离心20min来分离总细胞和上清液部分。将细胞沉淀作为总细胞级分。上清液中的蛋白用三氯乙酸10％(w/v)最终在4℃沉淀1小时。在离心(20800g，15min)并除去上清液后，将所得沉淀在冰冷的丙酮中洗涤过夜。将样品再次离心，弃去上清液，将沉淀物空气干燥并重悬于1x SDS装载染料中。
通过SDS-PAGE分析分泌的蛋白；在每种情况下，每个泳道加载由3×108个细菌分泌的蛋白。使用12.5％SDS-PAGE凝胶进行免疫印迹检测特异性分泌蛋白。为了检测总细胞中的蛋白，如果没有另外说明，每个泳道加载2×108个细菌，并且在免疫印迹检测之前在12.5％SDS-PAGE凝胶上分离蛋白。免疫印迹使用抗Myc抗体(Santa Cruz)进行。
感染细胞中被T3SS易位的蛋白的Western印迹。如上所述，以100的MOI感染6孔板中的HeLa细胞。在与TEV蛋白酶易位小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株共同感染的情况下，设定菌株的OD600，并将两种细菌悬液以1:1的比例(如果未另外指出)混合在管中，然后加入到细胞中。在感染结束时，将细胞用冰冷的PBS洗涤两次，并通过刮擦在小体积的冰冷PBS中来收集。离心(16000rcf，5分钟，4℃)后，将沉淀溶解在补充有蛋白酶抑制剂混合物(Rochecomplete，Roche)的0.002％毛地黄皂苷中。将溶解的沉淀在冰上孵育5分钟，然后离心(16000rcf，25分钟，4℃)。收集上清液，并通过Bradford BCA测定(Pierce)来分析总蛋白含量，然后使用抗-Myc(Santa Cruz，9E11)或抗-Ink4C(Cell Signaling)抗体进行SDS PAGE和Western印迹。
免疫荧光。如上所述感染接种在96孔板(Corning)中的细胞，并用4％PFA固定后，用PBS洗涤细胞三次。然后在室温下用PBS 0.3％Triton X-100中的5％山羊血清封闭孔1小时。用含有1％BSA和0.3％Triton X-100的PBS稀释一抗(抗-Myc，Santa Cruz，1：100)，细胞在4℃孵育过夜。用PBS洗涤细胞4次，然后加入用含有1％BSA和0.3％Triton X-100的PBS稀释的二抗(AF488抗小鼠，life technologies，1:250)。如果需要，还包括Hoechst DNA染色(life technologies，1:2500)和/或肌动蛋白染色(Dy647-Phalloidin，DyeOmics)。在一些情况下，在洗掉PFA后仅直接应用DNA和/或肌动蛋白染色。细胞在室温孵育1小时，用PBS洗涤三次，并通过如下所述的自动图像分析进行分析。
自动显微镜和图像分析。使用ImageXpress Micro(Molecular devices，Sunnyvale，USA)自动获取图像。使用MetaXpress(Molecular devices，Sunnyvale，USA)进行抗-Myc染色强度的定量。手动选择除核区域和含细菌区域之外的细胞内的区域(面积为40个像素的圆圈)并记录平均强度。
TNFα刺激和磷酸-p38的Western印迹。如上所述，用100的MOI感染接种在6孔板中的HeLa细胞。感染后(p.i)30分钟，加庆大霉素，感染后45分钟，加入TNFα(10ng/ml)。感染后1小时15分钟，用冰冷的PBS洗涤细胞两次，并加入Phospho-safe裂解缓冲液(Novagen)以裂解细胞。在冰上孵育后，将细胞离心(16000rcf，25分钟，4℃)。收集上清液，并通过BradfordBCA测定(Pierce)来分析总蛋白含量，然后使用抗-磷酸-p38、总p38抗体(Cell Signaling)和抗-Actin抗体(Millipore)进行SDS PAGE和Western印迹。
感染HeLa细胞的cAMP水平测定。如上所述，感染接种在96孔板中的HeLa细胞。感染前30分钟，将cDMEM更换为补充有10mM HEPES和2mM L-谷氨酰胺和100μM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，Sigma Aldrich)的DMEM。感染60分钟后，加入庆大霉素，并将细胞在37℃下再孵育90分钟。根据制造商的说明书(Amersham，cAMP Biotrak，RPN225)，使用竞争性ELISA进行cAMP的测定。作为阳性对照，将指定量的霍乱毒素(C8052，Sigma Aldrich)加入到补充有10mM HEPES和2mM L-谷氨酰胺和100μM IBMX的DMEM中的细胞中1小时。
斑马鱼胚胎感染、成像和自动图像定量。所有动物实验根据批准的指南进行。斑马鱼保持在标准条件下[42]。胚胎在28.5℃下按小时受精后(hpf)分期[43]。在本研究中使用以下斑马鱼系：野生型鱼(AB/EK和EK/TL)。感染方案遵循[44]中给出的指南。将12hpf胚胎保持在含有0.2mM N-苯基硫脲(PTU)的E3培养基中以防止色素形成。受精2天(dpf)的胚胎用0.2mg/mL三卡因麻醉并使用发环工具在E3中的1％琼脂板上对齐[44]。使小肠结肠炎耶尔森氏菌在补充有0.4％阿拉伯糖和抗生素的BHI和mDap中生长，并在室温下过夜，用含有0.5％阿拉伯糖和其他添加剂的新鲜BHI稀释至OD 600为0.2，在室温下生长2小时，然后温度转变为37℃水浴振荡45分钟。最后，通过离心(6000rcf，30秒)收集细菌，并用PBS洗涤一次。在含有mDAP的PBS中OD 600设定为2。使用Femtojet Microinjector(Eppendorf)使用Femtotips II(Eppendorf)将1-2nL的该悬浮液注射到对齐的斑马鱼胚胎的后脑中，其中针尖用细镊子折断。注射时间设置为0.2s，补偿压力为15hPa(Eppendorf，Femtojet)，注射压力调节在600和800hPa之间。通过显微镜检查和通过对照板检查液滴大小以及相应的接种物。显微注射后，将鱼收集在含有Tricaine和PTU的E3中，并在37℃孵育30分钟，并在28℃下孵育另外5小时。荧光双目(Leica)用于在斑马鱼后脑中感染后1小时观察细菌EGFP荧光，并且丢弃未正确注射的胚胎。在感染结束时，将鱼用2％冰冷的PFA在冰上固定1小时，然后在4℃下用新鲜冰冷的PFA固定过夜。如前所述进行抗体染色[45,46]。毫无疑问，胚胎用0.1％吐温PBS洗涤4次，每次洗涤5分钟，并在室温下用PBS-T+0.5％Triton X-100透化30分钟。将胚在封闭溶液(PBS 0.1％Tween 0.1％TritonX-100 5％山羊血清和1％BSA)中在4℃封闭过夜。将抗体(裂解的胱天蛋白酶-3(Asp 175)，Cell Signaling)在封闭溶液中以1:100稀释，并在4℃下在黑暗中振荡孵育。将鱼用0.1％吐温PBS洗涤7次，持续30分钟，然后加入在封闭溶液中稀释的二抗(山羊抗兔AF647，Invitrogen，1：500)，并在4℃温育过夜。将幼虫用0.1％Tween的PBS在4℃下洗涤4次，每次30分钟，并洗涤过夜，并进一步洗涤3-4次。使用40<x>水浸物镜用Leica TCS SP5共聚焦显微镜拍摄图像。使用Imaris(Bitplane)和Image J软件(http://imagej.nih.gov/ij/)分析图像。
通过CellProfiler[47]对记录的z-堆叠图像的最大强度z投影执行图像分析(对于pBad_Si2 n＝14或对于z-BIM n＝19)。简而言之，通过GFP通道检测细菌。围绕细菌斑点的每个区域创建具有10个像素的半径的圆。重叠区域在连接构件之间相等地分开。在紧密围绕细菌的那些区域中，测量半胱天冬酶3p17染色强度。
用于磷酸化蛋白组学的样品制备。对于每种情况，使HeLa CCL-2细胞的两个6孔板生长至汇合。如上所述感染细胞30分钟。在指定的时间点，将平板置于冰上并用冰冷的PBS洗涤两次。然后将样品收集在尿素溶液[8M尿素(AppliChem)，0.1M碳酸氢铵(Sigma)，0.1％RapiGest(Waters)，1×PhosSTOP(Roche)]中。将样品短暂涡旋，在4℃(Hielscher)超声处理，在混匀仪(Eppendorf)上振荡5分钟，并在4℃和16'000g下离心20分钟。收集上清液并储存在-80℃下用于进一步处理。使用BCA Protein Assay(Pierce)测量蛋白浓度。
磷酸肽富集。二硫键用终浓度为10mM的三(2-羧乙基)膦在37℃下还原1小时。游离硫醇在室温下用20mM碘乙酰胺(Sigma)在黑暗中烷基化30分钟。过量的碘乙酰胺在室温下用终浓度为25mM的N-乙酰半胱氨酸淬灭10分钟。加入Lys-C内肽酶(Wako)至最终酶/蛋白比例为1:200(w/w)，并在37℃孵育4小时。随后溶液用0.1M碳酸氢铵(Sigma)稀释至尿素终浓度低于2M，并在37℃下用测序级改性胰蛋白酶(Promega)以50:1的蛋白与酶比例消化过夜。肽在C18 Sep-Pak柱(Waters)上脱盐，并在真空下干燥。如前所述[48]，用TiO2使磷酸肽从2mg的总肽质量中分离。简而言之，将干燥的肽溶解在用邻苯二甲酸饱和的80％乙腈(ACN)-2.5％三氟乙酸(TFA)溶液中。在封闭的Mobicol旋转柱(MoBiTec)中将肽加入到等量的平衡的TiO2(5μM珠尺寸，GL Sciences)中，所述Mobicol旋转柱(MoBiTec)以翻滚旋转(end-over-end rotation)方式孵育了30分钟。所述柱用饱和邻苯二甲酸溶液洗涤两次，用80％ACN和0.1％TFA洗涤两次，最后用0.1％TFA洗涤两次。肽用0.3M NH4OH溶液洗脱。用5％TFA溶液和2M HCl将洗脱液的pH调节至2.5以下。磷酸肽再次用C18微型离心柱(microspinC18cartridges,Harvard Apparatus)脱盐。
LC-MS/MS分析。使用EASY nano-LC系统(Thermo Fisher Scientific)进行肽的色谱分离，该系统配备有加热的RP-HPLC柱(75μm x 45cm)，内部装有1.9μM C18树脂(Reprosil-AQ Pur，Dr.Maisch)。每个LC-MS/MS使用如下线性梯度范围：在120分钟内由98％溶剂A(0.15％甲酸)和2％溶剂B(98％乙腈，2％水，0.15％甲酸)至30％溶剂B，以200μl/min的流速运行，来分析1μg总磷酸肽样品的等分试样。在配备有纳电喷雾离子源的双压LTQ-Orbitrap质谱仪(均为Thermo Fisher Scientific)上进行质谱分析。在每个MS1扫描(在Orbitrap中获得)之后，进行20种最丰富的前体离子的碰撞诱导解离(collision-induced dissociation,CID，在LTQ中获得)，动态排除30秒。对于磷酸肽分析，使10种最丰富的前体离子进行CID并启用多阶段激活。总循环时间约为2秒。对于MS1，在300ms的最大时间内在Orbitrap单元中累积了106个离子，并以60,000FWHM(以400m/z)的分辨率扫描。使用正常扫描模式获取MS2扫描，目标设置为104个离子，累积时间为25ms。单电荷离子和带有未指定电荷状态的离子被排除在触发MS2事件之外。标准化碰撞能量设定为32％，并且为每个光谱获取一个微扫描。
无标记量化和数据库搜索。将获取的原始文件导入Progenesis软件工具(Nonlinear Dynamics，版本4.0)中，使用默认参数进行无标记定量。MS2谱直接从Progenesis以mgf格式输出，并使用MASCOT算法(Matrix Science，版本2.4)针对含有智人(Homo sapiens)的预测SwissProt条目(www.ebi.ac.uk，发布日期6/05/2012)的正常和反向序列的诱饵数据库[49]进行搜索，并使用MaxQuant软件(版本1.0.13.13)中的SequenceReverser工具生成常见的污染物(总共41,250个序列)。为了鉴定源自小肠结肠炎耶尔森氏菌的蛋白，在以上相同数据库中搜索了富含非磷酸肽的样品，包括小肠结肠炎耶尔森氏菌的预测的SwissProt条目(www.ebi.ac.uk，发布日期15/08/2013)。前体离子耐受性设定为10ppm，片段离子耐受性设定为0.6Da。搜索标准设置如下：需要完整的胰蛋白酶特异性(在赖氨酸或精氨酸残基后切割，除非随后是脯氨酸)，允许2个错过的切割，将脲甲基化(carbamidomethylation,C)设定为固定修饰，并且磷酸化(S，T，Y)或氧化(M)作为富集TiO2或未富集样品的可变修饰。最后，将数据库搜索结果以xml文件形式导出，并导回到Progenesis软件中，用于MS1特征分配。对于磷酸肽定量，含有所有检测到的特征的MS1峰丰度的csv文件被导出，并且对于未富集的样品，创建了包含基于每种蛋白的所有已鉴定的肽的总特征强度的所有蛋白测量值的csv文件。重要的是，设定Progenesis软件，将由相似肽集鉴定的蛋白组合在一起，并且仅将数据库中具有单个蛋白的特定序列的非冲突肽用于蛋白定量。两个文件均使用内部开发的SafeQuant v1.0 R脚本(未发布的数据，可在https://github.com/eahrne/SafeQuant/获得)进行进一步对处理。简而言之，该软件将识别级错误发现率(identification level False Discovery Rate)设置为1％(基于诱饵蛋白序列数据库命中的数量)，并标准化所有样品中识别的MS1峰丰度(Extracted Ion Chromatogram，XIC)，即，对于所有LC-MS运行，所有可靠鉴定的肽特征的总XIC被缩放为相等。接下来，基于每个时间点的中位数XIC，对于每个时间点，所有量化的磷酸肽/蛋白分配一个丰度比。每个比例的统计显著性由其q-值(错误发现率调整后的p值)给出，所述q-值通过计算修改后的t-统计p-值[50]和多次测试调整[51]而得到。MASCOT自动分配磷酸化残基的位置(得分>10)。所有带注释的光谱以及MS原始文件和所采用的搜索参数将通过PRIDE合作伙伴存储库[52]存入ProteomeXchange Consortium(http://proteomecentral.proteomexchange.org)。
序列比对使用http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/上基于EMBL-EBI网的ClustalW2多序列比对工具进行。
4T1肿瘤同种异体移植小鼠模型中的生物分布
所有动物实验均获得批准(许可证1908；Kantonales Basel-Stadt)并根据当地指南(Tierschutz-Verordnung，Basel-Stadt)和瑞士动物保护法(Tierschutz-Gesetz)进行。6周龄的BALB/c小鼠从Janvier实验室订购。在适应至少一周后，使用异氟烷麻醉小鼠，并将100μl 4T1细胞(1×105-1×106个细胞)分别皮下注射到BALB/c小鼠的侧翼中。在整个实验中，对小鼠的行为和外观进行评分，并测量表面温度以及体重。
一旦肿瘤形成，则通过腹腔注射向小鼠施用8mg/ml的得斯芬溶液(10ml/kg)。第二天，通过注射到尾静脉中用小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40或小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40ΔHOPEMT(2×105、1×106或1×107个细菌感染小鼠)。向小鼠静脉施用的接种物通过稀释铺板进行验证。在一些实验中，肿瘤进展之后，用数字卡尺每日测量肿瘤的长度和宽度。肿瘤体积确定为0.523x长x宽2。在感染后的相应日期，通过CO2吸入处死小鼠。立即通过抽吸从心脏分离血液样本。分离肝、脾、肺和肿瘤并确定它们的重量。对器官和肿瘤进行均质化。通过将连续稀释液点样到含有萘啶酮酸(35ug/ml)的LB琼脂平板上来测定每个样品中的CFU。
B)结果
基于YopE融合蛋白的3型分泌的蛋白递送系统
虽然小肠结肠炎耶尔森氏菌T3SS效应子YopE的非常N-末端(very N-terminus)(SEQ ID NO:1)含有足以使异源蛋白易位的分泌信号[26]，但不包括其伴侣蛋白(SycE)的伴侣蛋白-结合位点(CBS)[53]。我们选择了与待递送的蛋白融合的YopE的N-末端138个氨基酸(SEQ ID NO:2)，因为其显示出使其他异源T3S底物易位的最佳结果[28]。由于YopE的这些N-末端138个氨基酸含有CBS，我们进一步决定共表达SycE。从纯化的小肠结肠炎耶尔森氏菌pYV40毒力质粒克隆的SycE-YopE1-138片段含有YopE和其伴侣SycE的内源启动子(图10)。因此，SycE和任意YopE1-138融合蛋白均通过从在室温下生长快速温度变化至37℃而诱导。在37℃下的培养时间会影响细菌中存在的融合蛋白量。在YopE1-138的3’末端添加多克隆位点(MCS)(图10B)，然后添加Myc和6xHis标签和终止密码子。
仔细选择背景菌株。首先，为了限制内源性效应子的易位，我们使用了缺失了所有已知效应子——Yop H、O、P、E、M和T(命名为ΔHOPEMT)的小肠结肠炎耶尔森氏菌菌菌株[54]。另外，我们偶尔使用在不存在外源性内消旋-2,6-二氨基庚二酸的情况下不能生长的营养缺陷型突变体[55]。该菌株缺失了天冬氨酸-β-半醛脱氢酶基因(Δasd)，并被瑞士安全机构(修正案A010088/2)归类为生物安全级别1级。另外，我们使粘附蛋白YadA和/或InvA缺失以提供更多的背景菌株选择。虽然使用yadA或yadA/invA菌株会降低背景信号诱导[56]，但所递送的蛋白量也受到影响[57]。
递送到真核细胞中的YopE融合蛋白的表征
在体外分泌测定中(参见图1A)，人工诱导向周围液体中分泌蛋白。在基于TCA的蛋白沉淀之后，使用抗-YopE抗体的蛋白印迹分析来确定分泌的蛋白量(图1B)。虽然野生型菌株分泌全长YopE，但是ΔHOPEMT asd菌株没有分泌。当存在YopE1-138-Myc-His(还称为YopE1-138-Myc；SEQ_ID_No._3)时，可见更小的YopE条带(图1B)。因此，在本文描述的设置中很好地分泌了YopE1-138片段。为了分析蛋白易位到真核细胞中的同质性，我们用YopE1-138-Myc编码菌株感染了HeLa细胞，并通过IF对Myc标签染色(图2A和B)。尽管开始时只有细菌被染色，但是感染后(p.i)30分钟细胞轮廓开始可见，随着感染时间增加，细胞轮廓增强(图2B)。HeLa细胞内的Myc标签染色强度很好地反映了这一趋势(图2A和B)。可以在细胞中的任何地方检测到YopE1-138-Myc(图2A)，除了细胞核[58]。值得注意的是，大多数(如果不是所有的话)细胞都是以类似的方式通过这种方法达到的。由于已知小肠结肠炎耶尔森氏菌感染许多不同的细胞类型[59]，我们将YopE1-138-Myc递送到各种细胞系中。在感染的小鼠成纤维细胞、Jurkat细胞和HUVEC中观察到了相同的同质的抗-Myc IF染色(图11)。更重要的是，向上或向下调节MOI允许调节递送的蛋白量(图2C)，而大部分细胞仍然是靶标。细菌数量低不会导致少量细胞具有大量递送的蛋白，而是大多数细胞含有少量的递送的蛋白(图2C)。
T3SS递送的蛋白重定向至细胞核
由于YopE本身定位于细胞质(图2A)，因此测试YopE1-138片段是否妨碍核融合蛋白的定位是特别感兴趣的。因此，我们将SV40 NLS添加到YopE1-138-EGFP的C-末端(和N-末端，类似结果)(分别为SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:38)。虽然YopE1-138-EGFP(SEQ ID NO:37)导致弱的细胞质染色，但YopE1-138-EGFP-NLS在感染的HeLa细胞中产生更强的核EGFP信号(图3)。这表明YopE1-138片段与NLS的使用兼容。虽然mCherry已经被用于植物病原体[60]，但这代表了通过编码T3SS的人或动物致病菌成功递送了GFP样蛋白。这验证了SycE和YopE1-138依赖性策略，对于递送许多选择蛋白是非常有前景的。
在将融合蛋白易位到真核细胞后，去除YopE1-138附属物
虽然YopE1-138片段对于细菌递送具有很大的益处，但是它可能妨碍融合蛋白功能和/或定位。因此，最好在蛋白递送后将其去除。为此，我们在YopE1-138和融合伙伴(转录调节因子ET1-Myc(SEQ ID NO:36和41)[64]和人INK4C(SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.43))之间引入了两个TEV切割位点(ENLYFQS)[61-63]。为了保持所提出的方法的优点，我们进一步将TEV蛋白酶(S219V变体；[65])与另一种小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株中的YopE1-138(SEQ IDNO:42)融合。一次用两种菌株感染HeLa细胞。为了仅分析易位的蛋白部分，在感染后2小时用毛地黄皂苷裂解感染的HeLa细胞(图4)，已知毛地黄皂苷不裂解细菌([66]；参见图12中的对照)。蛋白印迹分析显示只有当细胞用相应菌株感染时，才存在YopE1-138-2xTEV-切割-位点-ET1-Myc或YopE1-138-2xTEV-切割-位点-Flag-INK4C-Myc(图4A和C)。在用纯化的TEV蛋白酶过夜消化该细胞裂解物后，可以观察到移位的条带(图4A和C)。该条带对应于具有TEV切割位点的N-末端残基的ET1-Myc(图4C)或Flag-INK4C(图4A)，最可能仅有一个丝氨酸。在与递送TEV蛋白酶的菌株共感染细胞后，相同的切割的ET1-Myc或Flag-INK4C片段变得可见，表明通过T3SS递送的TEV蛋白酶是功能性的，并且单细胞已经被两种细菌菌株感染(图4A和C)。虽然切割不完全，但大部分易位蛋白在感染后2小时已经被切割，甚至用纯化的TEV蛋白酶过夜消化也不会产生更好的切割速率(图4B)。据报道，TEV蛋白酶依赖性切割可能需要依赖于融合蛋白的优化[67,68]。因此，易位后YopE1-138附属物的TEV蛋白酶依赖性去除，首次提供了几乎天然异源蛋白(氨基酸组成的变化仅在于一个N-末端氨基酸)的T3SS蛋白递送。
YopE片段的TEV蛋白酶依赖性切割的另一种方法在于将泛素掺入目标融合蛋白中。实际上，泛素在其C-末端被一组内源泛素特异性C-末端蛋白酶(去泛素化酶，DUB)处理。由于切割应该发生在泛素的非常C-末端(G76之后)，因此目标蛋白应该没有额外的氨基酸序列。在YopE1-138-泛素-Flag-INK4C-MycHis融合蛋白上对该方法进行了检测。在被YopE1-138-Flag-INK4C-MycHis表达细菌感染的对照细胞中，发现了对应于YopE1-138-Flag-INK4C-MycHis的条带，指示融合蛋白的有效易位(图24)。当用YopE1-138-泛素-Flag-INK4C-MycHis-表达细菌感染细胞1小时时，可见对应于Flag-INK4C-MycHis大小的额外条带，表明融合蛋白的一部分被切割。该结果表明，将泛素引入融合蛋白能够切掉YopE1-138片段而不需要外源蛋白酶。
III型和IV型细菌效应子的易位
来自肠道沙门氏菌的SopE是一种充分表征的鸟嘌呤核苷酸交换因子(guaninenucleotide exchange factor,GEF)，其与Cdc42相互作用，促进肌动蛋白细胞骨架重塑[69]。虽然YopE1-138-Myc易位到HeLa细胞中没有效果，但是易位的YopE1-138-SopE(SEQ IDNO:5和135)诱导肌动蛋白网络的显著变化(图5A)。用另一种GEF效应蛋白——来自福氏志贺氏菌的IpgB1(SEQ ID NO:4)获得了类似的结果。值得注意的是，在感染后2分钟就观察到了肌动蛋白细胞骨架的第一次变化。(图5A)。因此，可以得出结论，在通过离心引发感染后，立即发生T3SS依赖性蛋白递送。为证实严格的T3SS依赖性转运，使形成进入真核细胞膜的易位孔的一种T3SS蛋白缺失(YopB，参见[70])(图12)。
在沙门氏菌感染期间，SopE易位伴随着SptP易位，SptP作为Cdc42的GTP酶激活蛋白(GAP)起作用[71]。虽然单独的YopE1-138-SopE-Myc(SEQ ID NO:135)易位触发了大量的F-肌动蛋白重排，但与YopE1-138-SptP(SEQ ID NO:8)表达细菌共感染以剂量依赖性方式消除了这种效果(图5B)。抗-Myc染色表明这种抑制不是由于YopE1-138-SopE-Myc易位水平降低引起的(图5B)。这些结果一起表明，用两种细菌菌株共感染细胞是将两种不同的效应子递送到单个细胞中以解决其功能相互作用的有效方法。
福氏志贺氏菌III型效应子OspF起到磷酸苏氨酸裂解酶的作用，其使MAP激酶p38和ERK脱磷酸化[72]。为了测试易位的YopE1-138-OspF(SEQ ID NO:7)的功能性，我们监测了用TNFα刺激后p38的磷酸化。在未感染的细胞或用YopE1-138-Myc表达细菌感染的细胞中，TNFα诱导了p38磷酸化。相反，在YopE1-138-OspF易位后，TNFα诱导的磷酸化被消除，表明递送的OspF对p38有活性(图6A)。
在沙门氏菌感染期间，III型效应子SopB通过持续激活Akt来保护上皮细胞免于细胞凋亡[73]。虽然YopE1-138-Myc或YopE1-138-SopE的易位对Akt没有影响，但YopE1-138-SopB(SEQ ID NO:6)的易位在Akt的T308和S473诱导了强烈的磷酸化，反映了活性形式(图6B)。用来自福氏志贺氏菌(S.flexneri)的SopB同系物(IpgD，SEQ ID NO:9)获得了类似的结果。总之，我们的研究结果表明，基于YopE1-138的递送系统对于迄今为止测试的所有T3S效应子均起作用，并且允许研究参与控制核心细胞功能(包括细胞骨架、炎症和细胞存活)的蛋白。
许多细菌，包括根癌土壤杆菌、嗜肺军团菌和汉斯巴尔通体，使用IV型分泌将效应子注入细胞中。我们测试了来自汉斯巴尔通体(B.henselae)的IV型效应子BepA是否可以使用我们的工具易位到HeLa细胞中。克隆全长BepA(SEQ ID NO:10)和含有C-末端Bid结构域的BepAE305-末端(SEQ ID NO:11)，并用相应的菌株感染细胞。由于BepA显示可诱导产生环状AMP(cAMP)[74]，因此测量了感染后HeLa细胞中的cAMP水平。虽然汉斯巴尔通体效应子BepG的Bid结构域(SEQ ID NO.136)的易位未能诱导cAMP，但是全长BepA和BepAE305-末端触发了预期量的cAMP产生[74](图6C)。该结果表明，IV型效应子也可以通过基于YopE1-138的递送系统被有效地递送到宿主细胞靶标中，并且它们是功能性的。
真核蛋白易位到上皮细胞中
为了表明人蛋白可以通过III型分泌易位，我们将人类细胞凋亡诱导剂与YopE1-138融合用于通过小肠结肠炎耶尔森氏菌递送，或与SteA1-20、SteA、SopE1-81或SopE1-105融合用于通过肠道沙门氏菌递送。然后，我们监测了人BH3相互作用结构域死亡激动剂(BID，SEQID NO:24)的易位，其是Bcl-2蛋白家族的促细胞凋亡成员。它是由半胱天冬酶-8(CASP8)诱导的线粒体损伤的中介物。CASP8切割BID，截短型BID(tBID，SEQ ID NO:25)易位至线粒体，在线粒体中它触发细胞色素c释放。后者导致固有模式的半胱天冬酶3(CASP3)激活，在此期间它被切割成17kDa和12kDa亚基[75]。虽然用表达YopE1-138-Myc或YopE1-138-BID的小肠结肠炎耶尔森氏菌感染1小时未能诱导细胞凋亡，但人tBID的易位触发了比良好表征的细胞凋亡诱导剂星形孢菌素更大程度的细胞死亡(图7A和C)。正如所料，tBID的易位导致CASP3p17亚基的产生，甚至比用星形孢菌素的量更大(图7A)。为了能够比较易位蛋白量与内源性Bid，用毛地黄皂苷裂解HeLa细胞，并使用抗Bid抗体进行Western印迹分析(图7B)。T3SS递送的YopE1-138-tBID在HeLa细胞中达到了约内源Bid的水平，但递送的YopE1-138-BID的存在量甚至更高(2.5倍)(图7B)。HeLa细胞的深层蛋白组和转录组图谱估计每个单细胞有4.4倍105个拷贝的BID[76]。因此，可以推断，T3SS依赖性人蛋白递送达到了每个细胞105至106个蛋白。这些数值符合通过大肠杆菌T3SS易位的纳米抗体的每个细胞的拷贝数[4]。假定调平MOI和感染持续时间的因子为10，抗生素添加的时间点和感染前在37℃的培养时间的因子为3.2，则递送的蛋白拷贝/细胞可以从大约1000个拷贝/细胞调整到高达106个拷贝/细胞。总之，这些结果表明易位的tBID是功能性的并且在相关性水平上递送。这验证了易位工具以研究蛋白在细胞凋亡(细胞生物学的核心方面)调控中的作用。
我们进一步将鼠tBID(针对小肠结肠炎耶尔森氏菌进行了密码子优化；SEQ IDNO:194)或鼠tBID或鼠BAX的BH3结构域(在两种情况下均针对小肠结肠炎耶尔森氏菌进行了密码子优化；SEQ ID NO:138和139)与YopE1-138融合以用于通过小肠结肠炎耶尔森氏菌递送。虽然用不递送蛋白的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd或者YopE1-138-Myc感染2.5小时未能诱导细胞凋亡，但鼠tBID(针对小肠结肠炎耶尔森氏菌进行了密码子优化，SEQ IDNO:194)的易位触发了B16F10(图16)、D2A1(图17)、HeLa(图18)和4T1(图19)细胞的细胞死亡。同样发现，针对小肠结肠炎耶尔森氏菌进行了密码子优化的鼠BID的BH3结构域(SEQ ID138)的易位或针对小肠结肠炎耶尔森氏菌进行了密码子优化的鼠BAX的BH3结构域(SEQ ID139)的易位在B16F10(图16)、D2A1(图17)、HeLa(图18)和4T1(图19)细胞中诱导大量细胞死亡。
虽然用肠道沙门氏菌aroA细菌感染4小时未能诱导细胞凋亡，但鼠tBID的易位引发了细胞凋亡，因为鼠tBID的易位导致CASP3 p17亚基的产生(图20和21)。当使用SpiIT3SS诱导条件时，SopE融合蛋白的细胞凋亡诱导程度更大(图20)，这反映了SpiI T3SS专门转运SopE。SteA1-20融合的小鼠tBID未能诱导细胞凋亡，很可能是因为SteA的20个N-末端氨基酸内的分泌信号不足以允许递送融合蛋白(图20和21)。在SpiI和SpiII T3SS诱导条件下，与全长SteA融合的鼠tBID导致HeLa细胞中的细胞凋亡诱导(图20和21)，反映了两种T3SS都能够转运SteA。必须指出的是，即使在SpiII T3SS诱导条件下，也可以预期SpiIT3SS的部分活性，如SopE融合蛋白在SpiII T3SS诱导条件下的活性所见(图21)。
除了本文功能上细化的易位的真核蛋白之外，使用本文描述的工具还已经分泌了几种其他真核蛋白。这包括用于通过小肠结肠炎耶尔森氏菌递送的(图13，14和3)来自细胞周期调节的蛋白(Mad2(SEQ ID No.15)，CDK1(SEQ ID No.14)，INK4A(SEQ ID No.16)，INK4B(SEQ ID No.17)和INK4C(SEQ ID No.18))及其部分(INK4A 84-103(SEQ IDNo.158)，p107 657-662(SEQ ID No.159)，p21 141-160(SEQ ID No.160)，p21 145-160(SEQ ID No.161)，p2117-33(SEQ ID No.162)和周期素D2 139-147(SEQ ID No 163))，细胞凋亡相关蛋白(Bad(SEQ ID No.29)，FADD(SEQ ID No.28)，和半胱天冬酶3p17(SEQ IDNo.22)和p12(SEQ ID No.23)，斑马鱼Bid(SEQ ID No.19)和t-Bid(SEQ ID No.20))及其部分(tBid BH3(SEQ ID No.138)，Bax BH3(SEQ ID No.139))，信号转导蛋白(鼠TRAF6(SEQID No.12)，TIFA(SEQ ID No.13))，GPCR Gα亚基(GNA12，最短同种型，(SEQ ID No.30))，纳米抗体(vhhGFP4，(SEQ ID No.31))和用于靶向蛋白降解的纳米抗体融合构建体(Slmb-vhhGFP4；(SEQ_ID_No.32，33，34)[77])(图13和14)以及小GTP酶(Rac1Q61E(SEQ ID No.26和137)和RhoA Q63L(SEQ ID No.27)和来自人Akt的Pleckstrin同源结构域(SEQ IDNo.35)。除了功能上细化的细胞凋亡相关蛋白(小鼠tBid，SEQ ID NO:144-147)之外，这还包括用于通过肠道沙门氏菌递送的(图22)来自细胞周期调控的蛋白(Mad2(SEQ IDNO.168-169)，CDK1(SEQ ID NO.170-171)，INK4A(SEQ ID NO.164-16)和INK4C(SEQ IDNO.166-167))。虽然这些蛋白尚未得到功能验证，但是各种真核蛋白的T3SS依赖性分泌的可能性与YopE附属物的可能去除结合，为T3SS在细胞生物学和治疗应用中的广泛适用性开辟了新的前景。
在斑马鱼胚胎中截短型Bid的体内转运诱导细胞凋亡
这种细菌工具的一个有趣的特点是活动物的潜在用途。斑马鱼在其胚胎状态可以保持透明允许荧光染色和显微镜[44,78,79]。已经详细描述了几种斑马鱼细胞凋亡诱导剂，其中z-BIM是最有效的[80]。因此，我们决定将z-BIM克隆到我们的系统中。即使与人BIM弱同源，我们测定人上皮细胞中YopE1-138-z-BIM(SEQ ID No.21)的细胞凋亡诱导的效力。用菌株转运的YopE1-138-z-BIM感染1小时的HeLa细胞显示出细胞死亡的明显迹象。然后我们进行体内实验与受精后(dpf)斑马鱼胚胎，使用局部感染模型通过显微注射细菌进入后脑的[44]。在感染5.5小时后，将鱼固定，透化并对存在的CASP3 p17染色。在用表达YopE1-138-Myc的菌株感染时，在后脑区域可见细菌(染色“b”，图8A I)检测到细菌周围的细胞凋亡诱导(染色“c”，图8A I)。相比之下，在递送YopE1-138-z-BIM的菌株感染时，在细菌周围的区域中观察到存在裂解的CASP3的强烈增加(图8A II)。在最大强度z投影上的自动图像分析证实，YopE1-138-z-BIM转运细菌远远超过对照细菌，在附近细胞中诱导细胞凋亡(图8B)。这表明z-BIM在细菌转运时在斑马鱼中有功能。这些结果进一步验证了T3SS在活的动物中的真核蛋白递送的用途。
磷酸化蛋白组学揭示了易位蛋白对蛋白磷酸化的总体影响
磷酸化是一种广泛的翻译后修饰，其可以激活或灭活生物过程，因此是研究信号转导事件的合适靶标[81,82]。尽管如此，目前还没有关于细胞凋亡中磷酸化的系统级分析。为了分析人tBid递送到HeLa细胞中的影响，我们使用了LC-MS/MS无标记磷酸化蛋白组学方法。在三次独立实验中，细胞不经处理，ΔHOPEMT asd+YopE1-138-Myc或用ΔHOPEMT asd+YopE1-138–tBid感染30分钟。裂解细胞，然后进行酶消化、磷酸肽富集和定量，并鉴定单个磷酸肽。我们将用ΔHOPEMT asd+YopE1-138-Myc感染的细胞与用ΔHOPEMT asd+YopE1-138-tBid感染的细胞进行比较，使我们能够鉴定363个tBid依赖性磷酸化事件。在tBid递送后，286个磷酸肽显示出磷酸化增加，而77个被较少磷酸化，对应于243种不同的蛋白，我们将其定义为tBid磷酸化蛋白组。使用STRING数据库来创建tBid磷酸化蛋白组的蛋白-蛋白相互作用网络[83](图9A)。另外还有27种已知与线粒体细胞凋亡相关的蛋白被添加到网络中，构建了一个中心簇。有趣的是，只有少数来自tBid磷酸化蛋白组的蛋白与该中心簇连接，表明许多蛋白经历磷酸化改变，迄今为止它们与细胞凋亡蛋白不直接相关。为了表征tBid磷酸化蛋白组所涵盖的生物学功能，我们使用Database for Annotation,Visualization,andIntegrated Discovery(DAVID，http://david.abcc.ncifcrf.gov/)的功能注释工具进行了基因本体分析[84,85]。已鉴定的生物功能表明tBid影响了不同的细胞过程。参与染色质重排和转录调节的许多蛋白经历磷酸化改变(即CBX3，CBX5，TRIM28，HDAC1)。例如，HDAC1是组蛋白脱乙酰酶，其在转录调节中发挥作用。已经显示，HDAC1可以调节NF-kB的转录活性，NF-kB也是参与细胞凋亡的蛋白。我们还鉴定了一组参与RNA加工的蛋白，该组蛋白先前已被证明在调节细胞凋亡中发挥重要作用[86]。例如，HNRPK介导p53/TP53对DNA损伤的应答，并且是诱导细胞凋亡所必需的[87]。此外，参与蛋白翻译的蛋白的磷酸化也受到了影响。几种真核起始因子(即EIF4E2，EIF4B，EIF3A，EIF4G2)经历了磷酸化变化，这与细胞凋亡细胞中整体蛋白合成减少这一观察结果一致。有趣的是，许多参与细胞骨架重塑的蛋白(例如PXN，MAP1B9)的磷酸化在tBid递送后发生改变。这与tBid递送后细胞形态发生显著变化这一观察结果一致(图9B)。我们观察到粘附相关蛋白如ZO2和桩蛋白(Paxillin)的磷酸化，这反映了细胞收缩和失去接触。同时，细胞核的收缩伴随着层状蛋白如LaminA/C和Lamin B1的磷酸化。总之，线粒体完整性的破坏还表明tBID递送诱导快速细胞凋亡反应(图9B)。我们发现tBid诱导的细胞凋亡会影响参与不同细胞过程的数百种磷酸化事件。虽然许多已鉴定的蛋白与细胞凋亡有关，但已知只有少数蛋白在细胞凋亡诱导后被磷酸化。因此，磷酸化蛋白组学方法为进一步研究细胞凋亡提供了有用的资源。
将由重复相同或可变蛋白结构域组成的真核异源融合蛋白易位到上皮细胞中
为了表明由重复相同或可变蛋白结构域组成的异源融合蛋白可以通过III型分泌易位，我们将小鼠细胞凋亡诱导剂与YopE1-138融合以用于被小肠结肠炎耶尔森氏菌递送。作为对照，我们将小鼠tBID(针对小肠结肠炎耶尔森氏菌进行了密码子优化；SEQ ID NO:154)或小鼠tBID或小鼠BAX的BH3结构域(在两种情况下均针对小肠结肠炎耶尔森氏菌进行了密码子优化；SEQ ID NO:200和201)与YopE1-138融合以用于被小肠结肠炎耶尔森氏菌递送。在一种情况下，异源融合蛋白包含与其自身融合的小鼠tBID BH3结构域，得到YopE1-138-(tBID-BH3)2(SEQ ID NO.202)。在第二种情况下，异源融合蛋白由与小鼠BAX BH3结构域融合的小鼠tBID BH3结构域组成，得到YopE1-138-(tBID-BH3)-(BAX-BH3)(SEQ ID NO.203)。在小鼠tBID和小鼠BAX的情况下，密码子针对小肠结肠炎耶尔森氏菌进行了优化。重复相同结构域或不同蛋白结构域组合的示意图示于图25中。
虽然用递送YopE1-138-Myc的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT asd感染4小时未能诱导细胞凋亡，但小鼠BH3结构域tBID(针对小肠结肠炎耶尔森氏菌进行了密码子优化，SEQID NO:154)的易位触发了B16F10和4T1细胞中的细胞死亡(图26和27)，在增加感染复数(MOI)时，具有明显的剂量反应效应。出人意料地是，发现在较低的MOI，所递送的YopE1-138-(tBID-BH3)-(BAX-BH3)获YopE1-138-(tBID-BH3)2比YopE1-138-(tBID-BH3)更加活跃(图26和27)。这表明，在递送重复相同结构域或不同蛋白结构域的组合时，可以扩大对期望细胞途径(如细胞凋亡)的影响。
增强型促细胞凋亡细菌的产生
在上述实验中显示，基于T3SS的促细胞凋亡蛋白(例如t-BID(SEQ ID NO.25)或BIM(SEQ ID NO.21))的递送有效地诱导了小鼠和人细胞(包括癌细胞)的细胞死亡，并且当使用针对细菌密码子用法而优化的小鼠t-BID(SEQ ID NO:138)时该效应可以增加。这种细胞杀伤的增加很可能反映了由于使用优化密码子而引起的蛋白生产以及随后经由T3SS递送的增加。
为了优化递送或促细胞凋亡蛋白，根据表IV形成了用不同促细胞凋亡蛋白转化的菌株。
表IV：用不同促细胞凋亡蛋白转化的菌株
将递送的蛋白缩短至信号传导所需的必需结构域(SEQ ID NO.138或200)可以提高细胞杀伤效率(图28)。不受理论束缚，这种效力的增加很可能与由于递送的蛋白的大小较小而引起的蛋白生产以及随后经由T3SS递送的增加有关。在YBE部分和tBID的BH3结构域之间引入连接体(SEQ ID NO.218)降低了效率，以及将BH3结构域延伸4个另外的氨基酸(SEQ ID NO.217)也降低了效率(图28)。
另外，产生了具有这些基本结构域的重复(例如t-BID的BH3结构域(SEQ IDNO.202))或这些基本结构域的组合(例如t-BID的BH3结构域和BAX的BH3结构域(SEQ IDNO.203和219))的合成货物。令人惊讶的是，发现串联重复的相同或不同BH3结构域导致对癌细胞系(包括4T1和B16F10细胞，图28)的细胞凋亡诱导增强。与递送单一tBID BH3结构域相比，在递送串联重复tBID BH3结构域后，发现IC50(半数最大抑制浓度)降低，IC50指杀死50％的真核细胞所需的细菌/真核细胞数(MOI)(图28)。这一发现是令人惊讶的，因为通过融合t-BID的第二个BH3结构域增加了蛋白大小。由此，预期与YopE1-138-tBID BH3(SEQ IDNO:138或200)相比，YopE1-138-(tBID BH3)2(SEQ ID NO:202)的表达和递送水平会降低，并且可能会最大限度地达到同等水平。
为了达到细胞杀伤活性增加，融合的tBID BH3结构域必须在被T3SS递送到真核细胞中后同时并行起作用。在YopE1-138-(tBID BH3)2构建体中只有一个tBID BH3结构域起作用的情况下，可以至多预期与与YopE1-138-tBID BH3相同的效率。为了增加YopE1-138-(tBIDBH3)2(SEQ ID NO.202)的遗传稳定性以进行体内研究，我们通过在耶尔森氏菌毒力质粒pYV上在YopE的天然位点处和天然YopE启动子下(使用突变体质粒pSI_408和pSI_419)同源重组而克隆了YopE1-138-(tBID BH3)2(SEQ ID NO.202)。这种突变体含有编码所需蛋白的DNA序列，在对应于相应基因位点的两侧侧接有200-250bp的序列，在其中应发生整合。将这些质粒转化到大肠杆菌Sm10λ pir中，质粒从其中被动员到相应的小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株中。携带整合载体的突变体在没有选择压力的情况下繁殖数代。然后使用蔗糖来选择已经失去载体的克隆。最后通过菌落PCR鉴定突变体。被T3SS转运的内源蛋白(称为“耶尔森氏菌外部蛋白”，Yop)由小肠结肠炎耶尔森氏菌在这一70kb质粒上编码，命名为耶尔森氏菌毒力质粒(pYV)，其进一步编码T3SS装置。
对于在耶尔森氏菌毒力质粒pYV上在YopE的天然位点处和天然YopE启动子下编码YopE1-138-(tBID BH3)2(SEQ ID NO.138或200)的耶尔森氏菌菌株，评估了其诱导癌细胞凋亡的能力(包括4T1和B16F10细胞，图29)。当两个蛋白均在耶尔森氏菌毒力质粒pYV上在YopE的天然位点处和天然YopE启动子下编码时，与递送单一tBID BH3结构域相比，在递送串联重复tBID BH3结构域后，发现IC50(半数最大抑制浓度)降低，IC50指杀死50％的真核细胞所需的细菌/真核细胞数(MOI)(图29)。这与在这些蛋白的表达质粒携带的递送中的发现一致(图37)。同样，这一发现是令人惊讶的，因为通过融合t-BID的第二个BH3结构域增加了蛋白大小。由此，预期与YopE1-138-tBID BH3(SEQ ID NO:138或200)相比，YopE1-138-(tBIDBH3)2(SEQ ID NO:202)的表达和递送水平会降低，并且可能会最大限度地达到同等水平。为了达到细胞杀伤活性的增加，融合的tBID BH3结构域必须在被T3SS递送到真核细胞中后同时并行起作用。在YopE1-138-(tBID BH3)2构建体中只有一个tBID BH3结构域起作用的情况下，可以至多预期与与YopE1-138-tBID BH3相同的效率。此外，对于在耶尔森氏菌毒力质粒pYV上在YopE的天然位点处和天然YopE启动子下编码YopE1-138-(tBID BH3)2(SEQ IDNO.202)的耶尔森氏菌菌株，将其与表达质粒(基于pBad-MycHisA)衍生的YopE1-138-(tBIDBH3)2的递送进行比较，以比较其诱导癌细胞凋亡的能力。与pBad-MycHisA(20-25个拷贝)相比于pYV(报道了1-6个拷贝)的更高拷贝数一致，基于pBad-MycHisA的YopE1-138-(tBIDBH3)2(SEQ ID NO.202)的递送对4T1和B16F10细胞的IC50值略有下降(图29)。
直至细菌施用后第14天体内肿瘤特异性生长的验证
在同源小鼠同种异体移植模型(4T1乳腺癌模型)中重复进行了基因修饰型小肠结肠炎耶尔森氏菌定殖肿瘤的实验，并且细菌在两周后定植。这次，用1×106个菌落形成单位(CFU)的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH，O，P，E，M，T感染小鼠。虽然在感染后的早期数天获得了与B16F10模型相似的结果，但我们可以进一步显示，在感染后第8天和直至第14天始终发现了肿瘤定殖(图30)。此外，定殖仍具有高度特异性，在所评估的所有其他器官中仅检测到了低计数的细菌(图31)。这些发现表明，小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔyopH，O，P，E，M，T能够建立肿瘤的持续定殖，从而防止被免疫系统清除。
小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT在延缓肿瘤进展中的功效
为了评估递送至肿瘤细胞的YopE1-138-(tBID BH3)2(SEQ ID NO:202)的体内影响，我们在用4T1乳腺癌细胞皮下注射而同种异体移植化的野生型Balb/C小鼠中进行了研究。我们旨在评估在耶尔森氏菌毒力质粒pYV上在YopE的天然位点处和天然YopE启动子下编码YopE1-138-(tBID BH3)2(SEQ ID NO.202)的耶尔森氏菌菌株。一旦肿瘤的大小达到150-250mm3，则用PBS或1*107个小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT pYV-YopE1-138-(tBID BH3)2静脉注射小鼠。将静脉注射细菌的那一天定义为第0天。在随后的几天(在静脉注射细菌后的第0天至第9天)用测径器测量肿瘤体积。将肿瘤体积相对于第0天的肿瘤体积标准化，以补偿肿瘤大小上的任意初始不均匀性。用小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT pYV-YopE1-138-(tBID BH3)2处理显示对肿瘤体积进展具有影响，在细菌施用后第8、9和10天具有统计学显著的肿瘤减少(图32)。重要的是，发现单独的小肠结肠炎耶尔森氏菌ΔHOPEMT不会影响4T1小鼠癌症模型中的肿瘤进展(图33)。这些发现强调了这些细菌及其T3SS可用于干扰肿瘤进展。
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Claims (17)

1.用如下载体转化的重组革兰氏阴性细菌菌株，所述载体沿5'至3'方向包含：
启动子；
编码来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号的第一DNA序列，其可操作地连接到所述启动子上；以及
编码异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域的第二DNA序列，其与所述第一DNA序列的3'末端框内融合，其中所述异源蛋白选自由以下组成的组：参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白、细胞周期调节剂、锚蛋白重复蛋白、细胞信号转导蛋白、报道蛋白、转录因子、蛋白酶、小GTP酶、GPCR相关蛋白、纳米抗体融合构建体和纳米抗体、细菌T3SS效应子、细菌T4SS效应子和病毒蛋白。
2.用如下载体转化的重组革兰氏阴性细菌菌株，所述载体沿5'至3'方向包含：
编码来自细菌效应蛋白的递送信号或其片段的第一DNA序列；以及
编码异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域的第二DNA序列，其与所述第一DNA序列的3'末端框内融合，其中所述异源蛋白选自由以下组成的组：参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白、细胞周期调节剂、锚蛋白重复蛋白、细胞信号转导蛋白、报道蛋白、转录因子、蛋白酶、小GTP酶、GPCR相关蛋白、纳米抗体融合构建体和纳米抗体、细菌T3SS效应子、细菌T4SS效应子和病毒蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的重组革兰氏阴性细菌菌株，其中所述重组革兰氏阴性细菌菌株在产生至少一种T3SS效应蛋白方面有缺陷。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的重组革兰氏阴性细菌菌株，其中所述革兰氏阴性细菌菌株选自由以下组成的组：耶尔森氏菌属(Yersinia)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)和假单胞菌属(Pseudomonas)。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的重组革兰氏阴性细菌菌株，其中所述革兰氏阴性细菌菌株选自由以下组成的组：耶尔森氏菌属和沙门氏菌属。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的重组革兰氏阴性细菌菌株，其中所述重组革兰氏阴性细菌菌株是耶尔森氏菌菌株，并且由第一DNA序列编码的细菌T3SS效应蛋白的递送信号包含YopE效应蛋白或其N-末端片段，或者，其中所述重组革兰氏阴性细菌菌株是沙门氏菌菌株，并且由第一DNA序列编码的细菌T3SS效应蛋白的递送信号包含SopE或SteA效应蛋白或其N-末端片段。
7.根据权利要求1或2所述的重组革兰氏阴性细菌菌株，其中所述重组革兰氏阴性细菌菌株是耶尔森氏菌菌株，并且其中所述耶尔森氏菌菌株是野生型或在至少一种T3SS功能性效应蛋白的生产方面有缺陷，并且其中来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号包含小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)YopE效应蛋白的其N-末端138个氨基酸，或者其中所述重组革兰氏阴性细菌菌株是沙门氏菌菌株，并且其中所述沙门氏菌菌株是野生型或在至少一种T3SS效应蛋白的生产方面有缺陷，并且其中来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号包含肠道沙门氏菌(S.enterica)SteA效应蛋白或的肠道沙门氏菌SopE效应蛋白的N-末端81或105个氨基酸的。
8.一种载体，所述载体沿5'至3'方向包含：
启动子；
编码来自细菌T3SS效应蛋白的递送信号的第一DNA序列，其可操作地连接到所述启动子上；
编码异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域的第二DNA序列，其与所述第一DNA序列的3'末端框内融合，
其中所述异源蛋白选自由以下组成的组：参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白、细胞周期调节剂、锚蛋白重复蛋白、细胞信号转导蛋白、报道蛋白、转录因子、蛋白酶、小GTP酶、GPCR相关蛋白、纳米抗体融合构建体和纳米抗体、细菌T3SS效应子、细菌T4SS效应子和病毒蛋白。
9.一种载体，所述载体沿5'至3'方向包含：
编码来自细菌效应蛋白的递送信号或其片段的第一DNA序列；以及
编码异源蛋白的重复结构域或不同异源蛋白的两个或多个结构域的第二DNA序列，其与所述第一DNA序列的3'末端框内融合，其中所述异源蛋白选自由以下组成的组：参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白、细胞周期调节剂、锚蛋白重复蛋白、细胞信号转导蛋白、报道蛋白、转录因子、蛋白酶、小GTP酶、GPCR相关蛋白、纳米抗体融合构建体和纳米抗体、细菌T3SS效应子、细菌T4SS效应子和病毒蛋白。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的重组革兰氏阴性细菌菌株或权利要求8或9所述的载体，其中异源蛋白选自由以下组成的组：参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白。
11.根据权利要求10所述的重组革兰氏阴性细菌菌株或载体，其中所述参与细胞凋亡或细胞凋亡调节的蛋白选自由以下组成的组：唯BH3蛋白、胱天蛋白酶和控制细胞凋亡的死亡受体的细胞内信号转导蛋白。
12.根据权利要求1-7中任一项所述的重组革兰氏阴性细菌菌株或权利要求8或9所述的载体，其中所述重复结构域相同或具有大于80％的氨基酸序列同一性。
13.根据权利要求1-7中任一项所述的重组革兰氏阴性细菌菌株或权利要求8或9所述的载体，其中所述重复结构域是细胞凋亡诱导因子tBID的BH3结构域。
14.根据权利要求1-7中任一项所述的重组革兰氏阴性细菌菌株或权利要求8或9所述的载体，其中不同异源蛋白的两个或多个结构域是属于相同功能类别蛋白的异源蛋白的结构域。
15.根据权利要求1-7中任一项所述的重组革兰氏阴性细菌菌株或权利要求8或9所述的载体，其中不同异源蛋白的两个或多个结构域是细胞凋亡诱导因子tBID的BH3结构域和细胞凋亡诱导因子BAX的BH3结构域。
16.根据权利要求1-7中任一项所述的重组革兰氏阴性细菌菌株或权利要求8或9所述的载体，其中载体包含编码蛋白酶切割位点的第三DNA序列，其中所述第三DNA序列位于所述第一DNA序列的3'末端和所述第二DNA序列的5'末端之间。
17.根据权利要求1-7中任一项所述的重组革兰氏阴性细菌菌株或权利要求8或9所述的载体、其中所述细菌T3SS效应蛋白选自由以下组成的组：SopE、SopE2、SptP、SteA、ExoS、SipA、SipB、SipD、SopA、SopB、SopD、IpgB1、IpgD、SipC、SifA、SseJ、Sse、SrfH、SspH1、YopJ、AvrA、AvrBsT、YopT、YopH、YpkA、Tir、EspF、TccP2、IpgB2、OspF、Map、OspG、OspI、VirA、IpaA、IpaH、SspH1,VopF、ExoS、ExoT、HopAB2、XopD、AvrRpt2、HopAO1、HopPtoD2、HopU1、GALA家族蛋白、AvrBs2、AvrD1、AvrBS3、YopO、YopP、YopE、YopT、EspG、EspH、EspZ、IpaA、IpaB、IpaC、VirA、IcsB、OspC1、OspE2、IpaH9.8、IpaH7.8、AvrB、AvrD、AvrPphB、AvrPphC、AvrPphEPto、AvrPpiBPto、AvrPto、AvrPto、AvrPtoB、VirPphA、AvrRpm1、AvrRpt2、AvrRpt2、HopPtoD2、HopPtoE、HopPtoF、HopPtoN、PopB、PopP2、AvrBs3、XopD和AvrXv3。
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