ES2880431T3

ES2880431T3 - Bacterias de virulencia atenuada para el tratamiento de tumores sólidos malignos

Info

Publication number: ES2880431T3
Application number: ES16797930T
Authority: ES
Inventors: Simon Ittig; Marlise Amstutz; Christoph Kasper; Guy R Cornelis
Original assignee: Universitaet Basel
Current assignee: Universitaet Basel
Priority date: 2015-11-19
Filing date: 2016-11-17
Publication date: 2021-11-24
Anticipated expiration: 2036-11-17
Also published as: RS62152B1; AU2016358257A1; BR112018009753A2; EP3377094A1; CN108472348A; LT3377094T; HK1256137A1; PL3377094T3; EA201890868A1; JP2019500026A; PT3377094T; EP3903813A1; SI3377094T1; CA3003563A1; IL259052B2; SG11201803643TA; JP7060503B2; HRP20211191T1; EP3377094B1; IL259052A

Abstract

Una cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante transformada con un vector que comprende en la dirección 5' a 3': un promotor; una primera secuencia de ADN que codifica una señal de suministro de una proteína efectora bacteriana, conectada operablemente a dicho promotor; una segunda secuencia de ADN que codifica una proteína heteróloga fusionada en marco al extremo 3' de dicha primera secuencia de ADN, para su uso en un método de tratamiento de un tumor sólido maligno en un sujeto, en donde la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante es una cepa de Yersinia con producción deficiente de un sideróforo y se acumula en el tumor sólido maligno, comprendiendo el método la administración conjunta al sujeto de dicha cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante con un sideróforo, en donde la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante se administra en una cantidad suficiente para tratar al sujeto.

Description

DESCRIPCIÓN

Bacterias de virulencia atenuada para el tratamiento de tumores sólidos malignos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a cepas bacterianas Gram negativas de virulencia atenuada recombinantes para su uso en un método de tratamiento de un tumor sólido maligno en un sujeto.

Antecedentes de la invención

Un problema importante en el tratamiento de tumores sólidos malignos es el suministro de moléculas terapéuticas a las células cancerosas en cantidades suficientes, mientras se reduce el daño en células y tejidos no relacionados. Los enfoques de tratamiento más comunes, la cirugía, la quimioterapia y la radioterapia, con demasiada frecuencia no logran curar a los pacientes, y los efectos secundarios, tales como náuseas y diarrea, son masivos. Por tanto, se han aprovechado varias otras estrategias terapéuticas, incluidos los inhibidores de la angiogénesis y las inmunoterapias.

Para reducir el daño al tejido no cancerogénico, los enfoques que permiten el suministro de fármacos dirigido revisten gran interés. Por ejemplo, se utilizan anticuerpos que reconocen las estructuras superficiales de las células tumorales y, en un caso óptimo, se unen selectivamente a las células tumorales. Para mejorar el mecanismo de tales anticuerpos, se pueden conjugar con agentes terapéuticos o con vesículas lipídicas llenas de fármacos. Uno de los desafíos con tales vesículas es la liberación adecuada del reactivo activo. Aún más complejo es el suministro de proteínas o péptidos terapéuticos, especialmente cuando se dirigen a mecanismos intracelulares. Se han intentado muchas formas alternativas para resolver el problema del suministro de proteínas terapéuticas a células eucarióticas, entre las que se encuentran los "péptidos penetrantes de células" (CPP) o tecnologías similares, así como diversas metodologías basadas en nanopartículas. Todas estas tecnologías tienen el inconveniente de una baja eficacia y de que es probable que la carga absorbida por la célula a través de la endocitosis acabe degradándose en los lisosomas. Además, el conflicto entre la necesidad de estabilidad del transporte de carga en el cuerpo humano y el requisito de desestabilización y liberación dentro de la célula diana constituye un problema intrínseco de tales tecnologías.

Se ha demostrado que varias bacterias se replican dentro de los tumores sólidos malignos cuando se administran desde un sitio distal, que incluyen Escherichia coli, Vibrio cholerae, Salmonella entérica, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa y Bifidobacterias. Actualmente, solo el bacilo Calmette-Guérin (BCG, derivado de Mycobacterium bovis) se utiliza en la práctica clínica. El BCG se administra para tratar el cáncer de vejiga superficial, mientras que el mecanismo molecular subyacente sigue siendo en gran parte desconocido. El documento WO02/077249 A2 se refiere a cepas mutantes de Yersinia enterocolitica que portan mutaciones en uno, dos o tres de los genes efectores yopH, yopO, yopP, yopE, yopM, yopT. En el Ejemplo 1, las cepas mutadas generadas se probaron con respecto al efecto de YopH, YopE y YopT en la resistencia a la fagocitosis por los macrófagos. No se suministró proteína heteróloga a los macrófagos infectados.

Una cepa bacteriana óptima para el tratamiento de tumores sólidos malignos se acumulará y proliferará específicamente en el sitio del tumor, mientras se erradicará en sitios no relacionados. En este sentido, un vehículo bacteriano óptimo para la terapia dirigida contra el cáncer debería proporcionar una alta acumulación en el sitio de acción deseado y estar mínimamente presente en los sitios no relacionados. El desarrollo de tal cepa bacteriana para el tratamiento de tumores sólidos malignos que sea capaz, p. ej., de suministrar la carga producida dentro de las bacterias a su sitio de acción dentro de las células cancerosas, es decir, fuera de las bacterias, sigue siendo un gran desafío.

Compendio de la invención

La presente invención se refiere a cepas bacterianas Gram negativas de virulencia atenuada recombinantes para su uso en un método de tratamiento de un tumor sólido maligno en un sujeto. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona cepas bacterianas Gram negativas de virulencia atenuada recombinantes y el uso de las mismas para tratar un tumor sólido maligno en un sujeto en donde las cepas bacterianas Gram negativas de virulencia atenuada recombinantes permiten la translocación de varios efectores de tipo III, pero también de efectores de tipo IV, de proteínas virales y, lo más importante, de proteínas eucarióticas funcionales a las células del tumor sólido maligno.

En un primer aspecto la presente invención se refiere a una cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante transformada con un vector que comprende en la dirección 5' a 3':

un promotor;

una primera secuencia de ADN que codifica una señal de suministro de una proteína efectora bacteriana, conectada operablemente a dicho promotor;

una segunda secuencia de ADN que codifica una proteína heteróloga fusionada en marco al extremo 3' de dicha primera secuencia de ADN,

para su uso en un método de tratamiento de un tumor sólido maligno en un sujeto, en donde la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante es una cepa de Yersinia con una producción deficiente de un sideróforo y se acumula en el tumor sólido maligno, comprendiendo el método la administración conjunta al sujeto de dicha cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante con un sideróforo, en donde se administra la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante en una cantidad suficiente para tratar al sujeto.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante, en la que la virulencia recombinante atenuó la cepa bacteriana Gram negativa a Yersinia cepa con producción deficiente de un sideróforo, en la que la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante es con producción deficiente de al menos una proteína efectora bacteriana que es virulenta hacia las células eucarióticas o es con producción deficiente de al menos una proteína bacteriana que es parte de una maquinaria del sistema de secreción, para su uso en un método de tratamiento de un tumor sólido maligno en un sujeto, en donde la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante se acumula en el tumor sólido maligno, comprendiendo el método la administración conjunta al sujeto de dicha cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante con un sideróforo, en donde la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante se administra en una cantidad que es suficiente para tratar al sujeto.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1: Caracterización del suministro de proteína T3SS. (A) Representación esquemática de la secreción de proteína dependiente de T3SS al medio circundante (secreción in vitro) (lado izquierdo) o a células eucarióticas (lado derecho). I: muestra el sistema de secreción tipo 3. II indica proteínas secretadas al medio circundante, III proteínas translocadas a través de la membrana al citosol de las células eucarióticas (VII). VI muestra un tramo de las dos membranas bacterianas en las que se inserta T3SS y el citosol bacteriano debajo. IV es una proteína de fusión anclada al fragmento N-terminal YopE1-138 (V) (B) Secreción in vitro de I: Y. enterocolitica E40 tipo salvaje, II: Y. enterocolitica AHOPEMT asd o III: Y. enterocolitica AHOPEMT asd pBadSi_2 según lo revelado por transferencia Western en productos lisados bacterianos totales (IV) y sobrenadantes de cultivo precipitado (V) usando un anticuerpo anti-YopE.

Fig. 2: Caracterización del suministro de proteína T3SS a células epiteliales. (A) Tinción de inmunofluorescencia anti-Myc en células HeLa infectadas a una MOI de 100 durante 1 h con I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd o II: Y. enterocolitica AHOPEMT asd + pBad_Si2. (B) Cuantificación de la intensidad de tinción de inmunofluorescencia anti-Myc de (A) dentro de las células HeLa. Los datos se combinaron de n = 20 sitios, las barras de error indicadas son el error típico de la media. I: no infectadas, II: Y. enterocolitica AHOPEMT asd o III: Y. enterocolitica AHOPEMT asd pBad_Si2. El eje Y indica la intensidad de tinción anti-Myc [unidad arbitraria], el eje x indica el tiempo de infección en minutos (C) Cuantificación de la intensidad de tinción de inmunofluorescencia Anti-Myc dentro de las células. Las células HeLa se infectaron durante 1 h con Y. enterocolitica AHOPEMT asd pBad_Si2 a una MOI indicada en el eje x. Los datos se combinaron de n = 20 sitios, las barras de error indicadas son el error típico de la media. El eje Y indica la intensidad de tinción anti-Myc [u.a.].

Fig. 3: Las modificaciones del suministro de proteínas basadas en T3SS permiten la localización nuclear de una proteína de fusión YopE1-138 (EGFP). Señal de EGFP en células HeLa infectadas con I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd o II: Y. enterocolitica Ah Op Em T asd AyopB que porta los plásmidos III: YopE1-138-EGFP o IV: YopE1-138-EGFP-NLS a una MOI de 100. La señal de EGFP se muestra en "a", para la localización, los núcleos de comparación se tiñeron en "b".

Fig. 4: Las modificaciones del suministro de proteínas basadas en T3SS permiten la eliminación del apéndice YopE1-138. Las células HeLa se infectadas con dos cepas de Y. enterocolitica diferentes al mismo tiempo, lo que se logra mediante la simple mezcla de las dos suspensiones bacterianas. Una cepa suministra la proteasa TEV fusionada a YopE1-138, mientras que la otra cepa suministra una proteína de interés fusionada a YopE1-138 con un conector que contiene un sitio de escisión de proteasa TEV doble. Después del suministro de proteínas a la célula eucariótica, la proteasa TEV escindirá el apéndice YopE1-138 de la proteína de interés (A) Se analizaron células HeLa lisadas con digitonina no infectadas (II) o después de la infección (MOI de 100) durante 2 h con I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd y III: pBadSi_2, IV: YopE1-138-2x sitio de escisión TEV-Flag-INK4C, V: YopE1-138-2x sitio de escisión TEV-Flag-INK4C y tratamiento adicional durante la noche con proteasa TEV purificada y VI: YopE1-138-2x sitio de escisión TEV-Flag-INK4C y una segunda cepa YopE1-138-TEV mediante transferencia Western anti-INK4C (mostrada en "a") para determinar la presencia de YopE1-138-2x sitio de escisión TEV-Flag-INK4C o su forma escindida Flag-INK4C. Como control de carga, se realizó una transferencia Western anti-Actina (mostrada en "b"). En un caso (V), las células lisadas se incubaron durante la noche con proteasa TEV purificada.

(B) Cuantificación normalizada con actina de la intensidad de tinción anti-INK4C (mostrada como [u.a.] en el eje y) de (A) al tamaño de YopE1-138-2x sitio de escisión TEV-Flag-INK4C de longitud completa, donde la muestra IV se ajusta a 100%. I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd y IV: YopE1-138-2x sitio de escisión TEV-Flag-INK4C, V: YopE1-138-2x sitio de escisión TEV-Flag-INK4C y tratamiento adicional durante la noche con proteasa TEV purificada y VI: YopE1-138-2x sitio de escisión TEV-Flag-INK4C y una segunda cepa YopE1-138-TEV. Los datos se combinaron a partir de n = 2 experimentos independientes, las barras de error indicadas son el error típico de la media (C) Se analizaron células HeLa lisadas con digitonina no infectadas (II) o después de la infección (MOI de 100) durante 2 h con I: Y. enterocolitica AHOPEMT asdy III: pBadSi_2, IV: YopEi-i38-2x sitio de escisión TEV-ET1-Myc, V: YopE1-138-2x sitio de escisión TEV-ET1-Myc y tratamiento adicional durante la noche con proteasa TEV purificada y VI: YopE1-138-2x sitio de escisión TEV-Et 1 -Myc y una segunda cepa YopE1-138-TEV mediante transferencia Western anti-Myc (mostrada en "a") para la presencia de YopE1-138 - 2x sitio de escisión TEV - ET1 -Myc o su forma escindida ET1 -Myc. Como control de carga, se realizó transferencia Western anti-Actina (mostrada en "b"). En un caso (V), las células lisadas se incubaron durante la noche con proteasa TEV purificada.

Fig. 5: Suministro de proteínas efectoras bacterianas a células eucarióticas (A) Las células HeLa se infectaron con I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd que portaba II: pBad_Si2 o III: YopE1-138-SopE a una MOI de 100 durante el tiempo indicado encima de las imágenes (2, 10 o 60 minutos). Después de la fijación, las células se tiñeron para identificar el citoesqueleto de actina. (B) Las células HeLa se dejaron sin infectar (II) o se infectaron con I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd que portaba III: YopE1-138-SopE-Myc y en algunos casos se infectaron conjuntamente con IV: YopE1-138-SptP a la MOI indicada debajo de la cepa (MOI 50; MOI50:MOI50 o MOI50:MOI100) durante 1 h. Después de la fijación, las células se tiñeron para identificar el citoesqueleto de actina (que se muestra en "a") y se realizó un seguimiento de la presencia de la proteína de fusión YopE1-138-SopE-Myc mediante tinción anti-Myc (mostrada en "b").

Fig. 6: Suministro de proteínas efectoras bacterianas a células eucarióticas (A) Análisis de transferencia Western de fosfo-p38 ("a"), p38 total ("b") y actina ("c") en células HeLa dejadas sin tratar (II) o infectadas durante 75 min con I: Y. enterocolitica AHOp Em T asd que portaba III: pBad_Si2 o IV: YopE1-138-OspF a una MOI de 100. Las células se estimularon con TNFa durante los últimos 30 minutos de la infección como se indica (+ representa la adición de TNFa, - representa ausencia de tratamiento con TNFa) (B) análisis de transferencia Western de Phospho-Akt T308 ("a") y S473 ("b") y actina ("c") en células HeLa dejadas sin tratar (II) o infectadas durante 22,5 o 45 min (indicado debajo de las transferencias) con I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd que portaba III: pBad_Si2, IV: YopE1-138-SopE o V: YopE1-138-SopB a una MOI de 100 (C) niveles de AMPc (en fmol/pocillo que se muestra en el eje y) en células HeLa dejadas sin tratar (I) o infectadas durante 2,5 h con V: Y. enterocolitica AHOPEMT asd + YopE1-138-BepA, VI: Y. enterocolitica AHOPe Mt asd + YopE1-138-BepAE305-extremo, VII: Y. enterocolitica AHOPEMT asd + YopE1-138-BepGBid u VIII: Y. enterocolitica AHOPEMT asd + pBad_Si2 a una MOI de 100. Se añadió toxina del cólera (CT) durante 1 hora como control positivo a las muestras II (1 pg/ml), III (25 pg/ml) o IV (50 pg/ml). Los datos se combinaron de n = 3 experimentos independientes, las barras de error indicadas son el error típico de la media. El análisis estadístico se realizó utilizando una prueba t de dos colas no pareada (ns indica un cambio no significativo, ** indica un valor p <0,01, *** indica un valor p <0,001).

Fig. 7: El suministro de tBid humano a células eucarióticas induce una apoptosis masiva. (A) Análisis de transferencia Western de caspasa 3 p17 ("a") y actina ("b") escindidas en células HeLa que no se trataron (II) o se infectaron durante 60 min con I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd que portaba III: pBad_Si2, IV: YopE1-138-Bid o V: YopE1-138-t-Bid a una MOI de 100. En algunos casos, las células se trataron con VI: estaurosporina 0,5 pM o VII: estaurosporina 1 pM (B) Células HeLa lisadas con digitonina que no se trataron (II) o después de la infección durante 1 h con I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd que portaba III: pBad_Si2, IV: YopE1-138-Bid o V: YopE1-138-t-Bid a una MOI de 100 se analizaron mediante transferencia Western anti-Bid ("a") permitiendo la comparación de los niveles de Bid endógeno (marcados con Z) con los niveles de YopE1-138-Bid (marcado con una X) o YopE1-138-tBid (marcado con una Y) translocados. Como control de carga, se realizó una transferencia Western anti-actina (mostrada en "b"). En algunos casos, las células se trataron con VI: estaurosporina 0,5 pM o VII: estaurosporina 1 pM (C) Las células HeLa se dejaron sin tratar (I) o se infectaron a una MOI de 100 durante 1 h con II: Y. enterocolitica AHOPEMT asd pBad_Si2, III: Y. enterocolitica AHOPEMT asd + YopE1-138-Bid, IV: Y. enterocolitica AHOPEMT asd + YopE1-138-tBid. En algunos casos, las células se trataron con V: estaurosporina 0,5 pM o VI: estaurosporina 1 pM. Después de la fijación, las células se tiñeron para identificar el citoesqueleto de actina (color gris).

Fig. 8: Fosfoproteoma dependiente de tBiD: Las células HeLa se infectaron durante 30 min con Y. enterocolitica AHOPEMT asd + YopE1-138-t-Bid a una MOI de 100 y como control con Y. enterocolitica AHOPEMT asd + pBad_Si2. (A) Representación gráfica del fosfoproteoma de tBID. Las proteínas que contenían fosfopéptidos que estaban reguladas significativamente de una manera dependiente de tBid (color gris) (valor q <0,01) así como las proteínas relacionadas con apoptosis conocidas (color gris oscuro) están representadas en una red STRING de interacciones proteína-proteína conocidas y predichas (alta confianza, puntuación 0,7). Solo se representan proteínas con al menos una conexión en STRING. (B) Las imágenes confocales de células HeLa infectadas con Y. enterocolitica AHOPEMT asd + pBad_Si2 (I) o Y. enterocolitica AHOPEMT asd + YopE1-138-t-Bid (II) revelan la inducción de un fenotipo apoptótico tras el suministro de tBid. Las células se tiñeron para identificar los núcleos con Hoechst ("a"), para F-actina con faloidina ("b"), para tubulina con un anticuerpo anti-tubulina ("c") y para mitocondrias con Mitotracker ("d"). La barra de escala representa 40 pm.

Fig. 9: Descripción del repertorio de herramientas de suministro basado en secreción de tipo III. (A) Mapas de vectores de los plásmidos de clonación pBad_Si1 y pBad_Si2 utilizados para generar construcciones de fusión con YopE1-138. La chaperona SycE y la fusión con YOpE1-138- están bajo el promotor de Y. enterocolitica nativo. Los dos plásmidos solo difieren por la presencia de un EGFP inducible por arabinosa presente en pBad_Si1 (B) Múltiples sitios de clonación siguiendo directamente el fragmento

yopE1-138 en plásmidos pBad_Si1 y pBad_Si2.

Fig. 10: Caracterización del suministro de proteínas por T3SS a varias líneas celulares. Tinción de inmunofluorescencia anti-Myc en fibroblastos Swiss 3T3 ("a"), células Jurkat ("b") y células HUVEC ("c") sin tratar (II) o infectadas con Y. enterocolitica AHOPEMT asd + pBad_Si2 (I) a una MOI indicada más de las imágenes (MOI 25, 50, 100, 200 y 400 para las HUVEC) durante 1 h.

Fig. 11: Dependencia de T3SS del suministro de proteínas efectoras bacterianas a la célula eucariótica. Las células HeLa lisadas con Digitonina después de la infección a una MOI de 100 durante el tiempo indicado arriba de las transferencias (0, 5, 15, 10, 60 y 120 minutos) con Y. enterocolitica AHOPEMT asd AyopB + YopE1-138-SopE-Myc (I) o Y. enterocolitica AHOPEMT asd + YopE1-138-SopE-Myc (II) se analizaron mediante transferencia Western anti-Myc. El tamaño correspondiente a YopE1-138-SopE-Myc está marcado con "a", mientras que el tamaño de la proteína c-Myc endógena está marcado con "b".

Fig. 12 y 13: Secreción dependiente de T3SS de varias otras proteínas al sobrenadante del cultivo.

Experimento de secreción in vitro de I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd + YopE1-138 fusionado a la proteína como se indica. Se analizó el contenido de proteína de los productos lisados bacterianos totales ("A") y los sobrenadantes de cultivo precipitados ("B") mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-YopE. Los números escritos indican el peso molecular en kDa a la altura correspondiente.

Fig. 14A a N: Cepas de Y. enterocolitica y S. entérica utilizadas en este estudio. Lista de cepas de Y. enterocolitica y S. enterica utilizadas en este estudio que proporcionan información sobre fondos de cepa, plásmidos y proteínas para el suministro dependiente de T3SS codificados en los plásmidos correspondientes. Adicionalmente, se proporciona información sobre los oligonucleótidos utilizados para la construcción del plásmido correspondiente, la secuencia estructural del plásmido y las resistencias a los antibióticos.

Fig. 15: El suministro de tBid murino, BH3 de Bid murino y BH3 de Bax murino a células B16F10 induce una apoptosis masiva. Células B16F10 no infectadas (I) o después de la infección (MOI de 50) durante 2,5 h con Y. enterocolitica AHOPEMT asd y II: pBadSi_2, III: YopE1-138-tBid murino con codones optimizados para Y. enterocolitica, IV: YopE1-138-BH3 de Bid murino con codones optimizados para Y. enterocolitica o V: YopE1-138-BH3 de Bax murino con codones optimizados para Y. enterocolitica. Después de la fijación, las células se tiñeron para identificar el citoesqueleto de actina y los núcleos (ambos en color gris).

Fig. 16: El suministro de tBid murino, BH3 de Bid murino y BH3 de Bax murino a células D2A1 induce una apoptosis masiva. Células D2A1 no infectadas (I) o después de la infección (MOI de 50) durante 2,5 h con Y. enterocolitica AHOPEMT asd y II: pBadSi_2, III: YopE1-138-tBid murino con codones optimizados para Y. enterocolitica, IV: YopE1-138- BH3 de Bid murino con codones optimizados para Y. enterocolitica o V: YopE1-138-BH3 de Bax murino con codones optimizados para Y. enterocolitica. Después de la fijación, las células se tiñeron para identificar el citoesqueleto de actina y los núcleos (ambos en color gris).

Fig. 17: El suministro de tBid murino, BH3 de Bid murino y BH3 de Bax murino a células HeLa induce una apoptosis masiva. Células HeLa no infectadas (I) o después de la infección (MOI de 50) durante 2,5 h con Y. enterocolitica AHOPEMT asd y II: pBadSi_2, III: YopE1-138-tBid murino con codones optimizados para Y. enterocolitica, IV: YopE1-138-BH3 de Bid murino con codones optimizados para Y. enterocolitica o V: YopE1-138-BH3 de Bax murino con codones optimizados para Y. enterocolitica. Después de la fijación, las células se tiñeron para identificar el citoesqueleto de actina y los núcleos (ambos en color gris).

Fig. 18: El suministro de tBid murino, BH3 de Bid murino y BH3 de Bax murino a células 4T1 induce una apoptosis masiva. Células 4T1 no infectadas (I) o después de la infección (MOI de 50) durante 2,5 h con Y. enterocolitica AHOPEMT asd y II: pBadSi_2, III: YopE1-138-tBid murino con codones optimizados Y. enterocolitica, IV: YopE1-138-BH3 de Bid murino con codones optimizados para Y. enterocolitica o V: YopE1-138-BH3 de Bax murino con codones optimizados para Y. enterocolitica . Después de la fijación, las células se tiñeron para identificar el citoesqueleto de actina y los núcleos (ambos en color gris).

Fig. 19: El suministro de tBid murino por S. entérica cultivada en condiciones de inducción de T3SS de SPI-1 a células eucarióticas induce apoptosis. Análisis de transferencia Western de Caspasa 3 p17 escindida en células HeLa que no se trataron (I) o se infectaron durante 4 h con III: S. enterica aroA que portaba IV: SteA1-20-t-Bid, V: SteAFl-Bid, VI: SopE1-81-t-Bid o VII: SopE1-105-t-Bid a una MOI de 100. Para este experimento, todas las cepas de S. enterica aroA se cultivaron en condiciones de inducción de T3SS de SPI-1. En algunos casos, las células se trataron con II: estaurosporina 1 pM. Los números escritos indican el peso molecular en kDa a la altura correspondiente.

Fig. 20: El suministro de tBid murino por S. enterica cultivada en condiciones de inducción de T3SS de SPI-2 a células eucarióticas induce apoptosis. Análisis de transferencia Western de Caspasa 3 p17 escindida en células HeLa que no se trataron (I) o se infectaron durante 4 h con III: S. enterica aroA que portaba IV: SteA1-20-t-Bid, V: SteAFl-Bid, VI: SopE1-81-t-Bid o VII: SopE1-105-t-Bid a una MOI de 100. Para este experimento, todas las cepas de S. enterica aroA se cultivaron en condiciones de inducción de T3SS de SPI-2. En algunos casos, las células se trataron con II: estaurosporina 1 pM. Los números escritos indican el peso molecular en kDa a la altura correspondiente.

Fig. 21: Secreción dependiente de T3SS de S. entérica de diversas proteínas del ciclo celular al sobrenadante de cultivo. Experimento de secreción in vitro de S. entérica aroA + SteAFi (I, III, V, VII) o SopEi-105 (II, IV, VI, VIII) fusionados a las proteínas que se enumeran a continuación. I y II: Ink4a-MycHis; III y IV: Ink4c-MycHis; V y VI: Mad2-MycHis; VII y VIII: Cdk1-MycHis. El contenido de proteína de los sobrenadantes de cultivo precipitados ("A") y los productos lisados bacterianos totales ("B") se analizó mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-myc. Los números escritos indican el peso molecular en kDa a la altura correspondiente.

Fig. 22: Secreción dependiente de T3SS de varios péptidos conocidos que interfieren en el ciclo celular al sobrenadante del cultivo. Experimento de secreción in vitro de I: Y. enterocolitica AHOPEMT asd + pBad_Si2. II-VII: Y. enterocolitica AHOPEMt asd + YopE1-138 fusionado a los péptidos que se enumeran a continuación: II: Ink4A84-103; III: p107/RBL1657-662; IV: p21141-160D149A; V: p21145-160D149A; VI: p2117-33; VII: ciclina D2139-147. El contenido de proteína de los sobrenadantes de cultivo precipitados ("A") y los productos lisados bacterianos totales ("B") se analizó mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-YopE. Los números escritos indican el peso molecular en kDa a la altura correspondiente.

Fig. 23: La fusión de la proteína suministrada por T3SS a ubiquitina permite la eliminación del apéndice YopE1- 138. Las células HeLa se infectan con una cepa que suministra una proteína de interés fusionada a YopE1-138 con una ubiquitina fusionada directamente (YopE1-138-Ubi). Después del suministro de proteínas a la célula eucariótica, las proteasas endógenas específicas de ubiquitina escindirán el apéndice YopE1-138-ubi de la proteína de interés. Se analizaron células HeLa lisas con digitonina no infectadas (I) o después de la infección (MOI de 100) durante 1 h con II: Y. enterocolitica AHOPEMT asd + YopE1-138-Flag-INK4C-MycHis o III: YopE1-138-Flag-Ubiquitina-INK4C-MycHis mediante transferencia Western anti-INK4C para determinar la presencia de IV: YopE1-138-Flag-Ubiquitina-INK4C-MycHis o V: YopE1-138-Flag-INK4C-MycHis, la forma escindida VI: INK4C-MycHis y VII: INK4C endógeno.

Fig. 24: Plásmido de virulencia Yersinia enterocolitica W227, pYV. El plásmido de 69.673 pb de virulencia de Yersinia (pYV) de la cepa W227 dibujada a escala. Se indican las proteínas efectoras de T3SS, el origen de replicación y la resistencia al arsénico (codificada por los genes arsC, B, R y H): I: origen de replicación, II: yopO, III: yopP, IV: yopQ, V: yopT, VI: sycT, VII: yopM, VIII: yopD, IX: yopB, X: sycD, XII: yopH, XIII: sycH, XIV: sycE, XV: yopE, XVI: yadA, XVII-XVXX: arsC, B, R y H.

Fig. 25: Validación de la deleción de yop mediante análisis de secreción in vitro. Análisis de secreción in vitro de I: Y. enterocolitica ÚyopH, O, P, E, M, Tasd, II: Y. enterocolitica MRS40 wt, III: Y. enterocolitica ÚyopH, O, P, E, M, Tasd + p-yopE. Las marcas en el lado derecho indican la altura de proteínas Yop específicas: IV: YopO, V: YopH, VI: YopM, VII: YopE.

Fig. 26: Estudio de adaptación de dosis en ratones inmunocompetentes: peso de los ratones. El peso de los ratones se evaluó diariamente después de la infección i.v. con bacterias. I: Días, II: peso en gramos, III: Y. enterocolitica ÚyopH, O, P, E, M, T asd, IV: S. enterica úaroA administradas i.v. en la cantidad indicada (105, 106, 107, 108 ufc por animal).

Fig. 27: Estudio de adaptación de dosis en ratones inmunocompetentes: recuentos en sangre. Los recuentos en sangre en el momento indicado se evaluaron mediante dilución seriada y recuento de las unidades formadoras de colonias (UFC) resultantes. I: Días, II: UFC por ml, III: Y. enterocolitica ÚyopH, O, P, E, M, T asd, IV: S. enterica ÚaroA administradas i.v. en la cantidad indicada (105, 106, 107, 108 ufc por animal).

Fig. 28: Estudio de adaptación de dosis en ratones inmunocompetentes: recuentos en hígado. Los recuentos en el hígado en el momento indicado se evaluaron mediante homogeneización del órgano, dilución seriada y recuento de las unidades formadoras de colonias (UFC) resultantes. I: Días, II: UFC por g III: Y. enterocolitica ÚyopH, O, P, E, M, Tasd, IV: S. enterica ÚaroA administradas i.v. en la cantidad indicada (105, 106, 107, 108 ufc por animal).

Fig. 29: Estudio de adaptación de dosis en ratones inmunocompetentes: recuentos en pulmón. Los recuentos en pulmón en el momento indicado se evaluaron mediante homogeneización del órgano, dilución seriada y recuento de las unidades formadoras de colonias (UFC) resultantes. I: Días, II: UFC por g III: Y. enterocolitica ÚyopH, O, P, E, M, T asd, IV: S. enterica ÚaroA administradas i.v. en la cantidad indicada (105, 106, 107, 108 ufc por animal).

Fig. 30: Estudio de adaptación de dosis en ratones inmunocompetentes: recuentos en bazo. Los recuentos en el bazo en el momento indicado se evaluaron mediante homogeneización del órgano, dilución seriada y recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) resultantes. I: Días, II: UFC por g III: Y. enterocolitica ÚyopH, O, P, E, M, T asd, IV: S. enterica ÚaroA administradas i.v. en la cantidad indicada (105, 106, 107, 108 ufc por animal).

Fig. 31: Biodistribución de Y. enterocolitica subsp. palearctica en el modelo de aloinjerto de ratón con melanoma B16F10: puntuación por apariencia física. I: Días, II: puntuación, III: Y. enterocolitica MRS40 peso, IV: Y. enterocolitica ÚyopH, O, P, E, M, T. La flecha indica el día de la infección i.v. con 2x105 bacterias.

Fig. 32: Biodistribución de Y. enterocolitica subsp. palearctica en el modelo de aloinjerto de ratón con melanoma B16F10: puntuación por comportamiento. I: Días, II: puntuación, III: Y. enterocolitica MRS40 peso, IV: Y. enterocolitica ÚyopH, O, P, E, M, T. La flecha indica el día de la infección i.v. con 2x105 bacterias.

Fig. 33: Biodistribución de Y. enterocolitica subsp. palearctica en el modelo de aloinjerto de ratón con melanoma B16F10: pesos de los ratones. El peso de los ratones se evaluó diariamente después de la infección i.v. con bacterias. I: días, II: peso corporal en gramos, III: Y. enterocolitica MRS40 peso, IV: Y. enterocolitica ÚyopH, O, P, E, M, T. La flecha indica el día de la infección i.v. con 2x105 bacterias.

Fig. 34: Biodistribución de Y. enterocolitica subsp. palearctica en el modelo de aloinjerto de ratón con melanoma B16F10: biodistribución de Y. enterocolitica ÚyopH, O, P, E, M, T. Los recuentos en los órganos en el momento indicado se evaluaron mediante homogeneización de órganos, dilución seriada y recuento de las unidades formadoras de colonias (UFC) resultantes. I: Y. enterocolitica ÚyopH, O, P, E, M, T, II: UFC por gramo de tejido, III: día 1, IV: día 4, V: sangre, VI: bazo, VII: hígado, VIII: pulmón, IX tumor. * indica un ratón sin tumor visible.

Fig. 35: Biodistribución de Y. enterocolitica subsp. palearctica en el modelo de aloinjerto de ratón con melanoma B16F10: biodistribución de Y. enterocolitica MRS40 wt Los recuentos en los órganos en el momento indicado se evaluaron mediante homogeneización de órganos, dilución seriada y recuento de las unidades formadoras de colonias (UFC) resultantes. I: Y. enterocolitica MRS40 wt, II: UFC por gramo de tejido, III: día 1, IV: día 4, V: sangre, VI: bazo, VII: hígado, VIII: pulmón, 1X: tumor.

Fig. 36: Biodistribución de Y. enterocolitica subsp. palearctica en el modelo de aloinjerto de ratón con cáncer de mama 4T1: biodistribución de Y. enterocolitica ÚyopH, O, P, E, M, T. Los recuentos en los órganos el día 8 después de la infección se evaluaron mediante homogeneización de órganos, dilución seriada y recuento de las unidades formadoras de colonias (UFC) resultantes. I: Y. enterocolitica ÚyopH, O, P, E, M, T, II: UFC por gramo de tejido, III: sangre, IV: bazo, V: hígado, VI: pulmón, VII: tumor.

Fig. 37: Suministro de más proteínas proapoptóticas sintéticas. El suministro de proteínas sintéticas únicas que consisten en repeticiones simples o en tándem de dominios BH3 que se originan a partir de proteínas proapoptóticas t-BID o BAX conduce a una mayor inducción de apoptosis en células cancerosas 4T1 y B16F10. Se infectaron células 4T1 (I) o B16F10 (II) con Y. enterocolitica ÚyopHOPEMTque codificaba pBad-MycHisA IV: YopE1-138-dominio extendido BH3 de tBID , V: YopE1-138-conector-BH3 de tBID, VI:

YopE1-138-BH3 de tBID, VII: YopE1-138-(BH3 de tBID)2 , VIII: YopE1-138-BH3 de tBID - BH3 de BAX o IX:

YopE1-138-BH3 de BAX - BH3 de tBID. Se realizó una titulación de las bacterias añadidas a las células (MOI) para cada cepa, se determinaron los recuentos de células y se calculó la CI50 utilizando regresión no lineal. se indica la MOI a CI50 (III).

Fig. 38: Inducción de apoptosis por proteínas proapoptóticas sintéticas codificadas por pYV. El suministro de una repetición única o en tándem del dominio BH3 de BID codificado en el pYV conduce a la inducción de apoptosis en células cancerosas 4T1 y B16F10. Se infectaron células 4T1 (I) o B16F10 (II) con Y. enterocolitica ÚHOPEMT + IV: pYV-YopE1-138-BH3-Bid, o V: pYV-YopE1-138-(BH3-Bid)2 o VI: con Y. enterocolitica ÚHOPEMT pBad-MycHisA-YopE1-138- (BH3-Bid)2 durante 3 horas. Se realizó una titulación de las bacterias añadidas a las células (MOI) para cada cepa, se determinaron los recuentos de células y se calculó la CI50 (III) utilizando regresión no lineal.

Fig. 39: Colonización tumoral de Y. enterocolitica ÚyopH, O, P, E, M, T inyectada i.v. en el modelo de aloinjerto de cáncer de mama 4T1. Los recuentos de bacterias en los tumores se indican como unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo de tejido (III). Los recuentos se evaluaron en los tumores el día 8 (I) y el día 14 (II) después de la infección. Cada punto representa un ratón individual. La línea discontinua horizontal indica el límite de detección.

Fig. 40: Biodistribución de Y. enterocolitica ÚyopH, O, P, E, M, T inyectada i.v. en el modelo de aloinjerto de cáncer de mama 4T1. Los recuentos bacterianos en sangre (I), bazo (II), hígado (III), pulmón (IV) y tumor (V) se indican como unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo de tejido o por ml de sangre (VI). Los recuentos se evaluaron el día 14 después de la infección. Cada punto representa un ratón individual. La línea discontinua horizontal indica el límite de detección. * indica un ratón con grandes metástasis en el pulmón.

Fig. 41: Retraso de la progresión tumoral en ratones Balb/C de tipo salvaje con aloinjerto s.c. de células de cáncer de mama 4T1. A los ratones Balb/C de tipo salvaje con aloinjerto s.c. de células de cáncer de mama 4T1 se les inyectaron i.v. I: PBS o II: 1*107 Y. enterocolitica dHOPEMT pYV-YopE1-138(BH3-Bid)2, una vez que el tumor alcanzó un tamaño de 150-250 mm3. El día de la inyección i.v. de bacterias se definió como el día 0. Se midió el volumen del tumor durante los días siguientes (III; día 0 a día 9 después de la inyección i.v. de bacterias) con calibradores. El volumen relativo del tumor, normalizado al volumen del tumor el día 0, se indica (IV) como mm3. La media se indica con símbolos, las barras de error representadas muestran el error típico de la media. La significación estadística se mide con un ANOVA de 2 vías, * indica un valor p <0,05, ** un valor p <0,005.

Fig. 42: Progresión del tumor en ratones Balb/C de tipo salvaje con aloinjerto s.c. de células de cáncer de mama 4T1. A los ratones Balb/C de tipo salvaje con aloinjerto s.c. de células de cáncer de mama 4T1 se les inyectó i.v. I: PBS o II: 1*107 Y. enterocolitica dHOPEMT, una vez que el tumor alcanzó un tamaño de 150-250 mm3. El día de la inyección i.v. de bacterias se definió como el día 0. Se midió el volumen del tumor durante los días siguientes (III; día 0 a día 9 después de la inyección i.v. de bacterias) con calibradores. El volumen relativo del tumor, normalizado al volumen del tumor en el día 0, se indica (IV) como mm3. La media se indica con símbolos, las barras de error representadas muestran el error típico de la media.

Descripción detallada de la invención

Con el fin de interpretar esta memoria descriptiva, se aplicarán las siguientes definiciones y cuando sea apropiado, los términos utilizados en singular también incluirán el plural y viceversa. Debe entenderse que la terminología utilizada en la presente memoria tiene el propósito de describir realizaciones particulares únicamente y no se pretende que sea limitante.

El término "cepa bacteriana Gram negativa" como se emplea en la presente memoria incluye las siguientes bacterias: Aeromonas salmonicida, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii, Anaeromyxobacter dehalogenans, Bordetella bronchiseptica, Bordetella parapertussis, Bordetella pertussis, Bradyrhizobium japonicum, Burkholderia cenocepacia, Burkholderia cepacia, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Chlamydia muridarum, Chlamydia trachmoatis, Chlamydophila abortus, Chlamydophila pneumoniae, Chromobacterium violaceum, Citrobacter rodentium, Desulfovibrio vulgaris, Edwardsiella tarda, Endozoicomonas elysicola, Erwinia amylovora, Escherichia albertii, Escherichia coli, Lawsonia intracellularis, Mesorhizobium loti, Myxococcus xanthus, Pantoea agglomerans, Photobacterium damselae, Photorhabdus luminescens, Photorabdus temperate, Pseudoalteromonas spongiae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas plecoglossicida, Pseudomonas syringae, Ralstonia solanacearum, Rhizobium sp, Salmonella enterica y otra Salmonella sp, Shigella flexneri y otra Shigella sp, Sodalis glossinidius, Vibrio alginolyticus, Vibrio azureus, Vibrio campellii, Vibrio caribbenthicus, Vibrio harvey, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio tasmaniensis, Vibrio tubiashii, Xanthomonas axonopodis, Xanthomonas campestris, Xanthomonas oryzae, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis. Las cepas bacterianas Gram negativas preferidas de la invención son cepas bacterianas Gram negativas comprendidas por la familia de Enterobacterias y Pseudomonadaceae. La cepa bacteriana Gram negativa de la presente invención se utiliza normalmente para el suministro de proteínas heterólogas por los T3SS bacterianos en células eucarióticas in vitro y/o in vivo, preferiblemente in vivo.

El término "cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante" como se emplea en la presente memoria se refiere a una cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante transformada genéticamente con un vector. Un vector útil de la presente invención es, p. ej., un vector de expresión, un vector para la inserción cromosómica o de plásmidos de virulencia o un fragmento de ADN o ARN para la inserción o modificación de plásmidos cromosómicos o de virulencia. La virulencia de tal cepa bacteriana Gram negativa recombinante usualmente se atenúa mediante la deleción de proteínas efectoras bacterianas que tienen actividad de virulencia que son transportadas por una o más proteínas bacterianas, que son parte de una maquinaria del sistema de secreción. Tales proteínas efectoras son suministrada por una maquinaria del sistema de secreción a las células anfitrionas donde ejercen su actividad de virulencia hacia diversas proteínas y mecanismos celulares del anfitrión. Se conocen muchas proteínas efectoras diferentes, transportadas por varios tipos de sistemas de secreción y que muestran un gran repertorio de actividades bioquímicas que modulan las funciones de las moléculas reguladoras del anfitrión. La virulencia de la cepa bacteriana Gram negativa recombinante utilizada en la presente memoria puede atenuarse adicionalmente por la falta de un sideróforo producido normalmente u ocasionalmente por la cepa bacteriana Gram negativa de modo que la cepa no produzca el sideróforo, p. ej. tiene una producción deficiente de sideróforo. Por tanto, en una realización preferida, en los métodos de la invención se utiliza una cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante que carece de un sideróforo producido normal u ocasionalmente por la cepa bacteriana Gram negativa, de modo que la cepa no produce el sideróforo, p. ej., tiene una producción deficiente de sideróforo, más preferiblemente una cepa de Yersinia, en particular se utiliza Y. enterocolitica MRS40 AyopH, O, P, E, M, T, en los métodos de la invención que carece de un sideróforo producido normal u ocasionalmente por la cepa bacteriana Gram negativa de modo que la cepa no produce el sideróforo, p. ej., tiene una producción deficiente de un sideróforo. La cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante utilizada en los métodos de la invención preferiblemente no produce al menos uno, preferiblemente al menos dos sideróforos, p. ej., tiene una producción deficiente de al menos uno, preferiblemente al menos dos sideróforos, más preferiblemente la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante utilizada en los métodos de la invención no produce ningún sideróforo.

Los términos "sideróforo", "sideróforo de hierro" o "quelante de hierro" que se utilizan indistintamente en la presente memoria se refieren a compuestos con alta afinidad por el hierro, p. ej., pequeños compuestos con alta afinidad por el hierro. Los sideróforos de bacterias Gram negativas son p. ej., Enterobactina y dihidroxibenzoilserina sintetizadas por Salmonella, Escherichia, Klebsiella, Shigella, Serratia (pero utilizadas por todas las enterobacterias), Pioverdinas sintetizadas por Pseudomonas, Vibriobactina sintetizada por Vibrio, Acinetobactina y Acinetoferrina por Acinetobacter, Yersiniabactina y Aerobactina sintetizados por Yersinia, Ornibactina sintetizada por Burkholderia, Salmoquelina sintetizada por Salmonela, Aerobactina sintetizada por Escherichia, Shigella, Salmonella, y Yersinia, Alcaligina sintetizada por Bórdetela, Bisucaberina sintetizada por Vibrio. Los sideróforos incluyen hidroxamato, catecolato y sideróforos de ligandos mixtos. Hasta la fecha, se han aprobado varios sideróforos para su uso en seres humanos, principalmente con el objetivo de tratar la sobrecarga de hierro. Los sideróforos preferidos son Deferoxamina (también conocida como deferrioxamina B, desferoxamina B, DFO-B, DFOA, DFB o desferal), Desferrioxamina E, Deferasirox (Exjade, Desirox, Defrijet, Desifer) y Deferiprona (Ferriprox).

Los términos "cepa bacteriana Gram negativa con deficiencia para producir un aminoácido esencial para el crecimiento" y "mutante auxótrofo" se utilizan aquí indistintamente y se refieren a cepas bacterianas Gram negativas que no pueden crecer en ausencia de al menos un aminoácido esencial o un precursor del mismo proporcionados exógenamente. El aminoácido para el cual la cepa tiene deficiencia de producción es p. ej., aspartato ácido meso-2,6-diaminopimélico, aminoácidos aromáticos o leucina-arginina [1]. Tal cepa se puede generar p. ej., mediante deleción del gen de la aspartato-beta-semialdehído deshidrogenasa (Aasd). Tal mutante auxótrofo no puede crecer en ausencia de ácido meso-2,6-diaminopimélico exógeno [2]. La mutación, p. ej., la deleción del gen de aspartato-betasemialdehído deshidrogenasa se prefiere en la presente memoria para una cepa bacteriana Gram negativa con deficiencia para producir un aminoácido esencial para el crecimiento de la presente invención.

El término "cepa bacteriana Gram negativa con deficiencia para producir proteínas de adhesión que se unen a la superficie o matriz extracelular de la célula eucariótica" se refiere a cepas bacterianas Gram negativas mutantes que no expresan al menos una proteína de adhesión en comparación con las proteínas de adhesión expresadas por la correspondiente cepa de tipo salvaje. Las proteínas de adhesión pueden incluir, p. ej., moléculas de adhesión poliméricas extendidas como las adhesinas de los pili/fimbrias o no fimbriales. Las adhesinas fimbriales incluyen pili tipo 1 (tales como Fim-pili con la adhesina FimH de E. coli), P-pili (como Pap-pili con la adhesina PapG de E. coli), pili de tipo 4 (como la proteína pilina, p. ej., de P. aeruginosa) o curli (proteínas Csg con la adhesina CsgA de S. enterica). Las adherencias no fimbriales incluyen adhesinas autotransportadoras triméricas tales como YadA de Y. enterocolitica, BpaA (B. pseudomallei), Hia (H. influenzae), BadA (B. henselae), NadA (N. meningitidis) o UspA1 (M. catarrhalis) así como otras adhesinas autotransportadoras tales como AIDA-1 (E. coli) así como otras adhesinas/invasinas tales como InvA de Y. enterocolitica o Intimina (E. coli) o miembros de la familia Dr o de la familia Afa (E. coli). Los términos YadA e InvA como se utilizan en la presente memoria se refieren a proteínas de Y. enterocolitica. El autotransportador YadA [3] se une a diferentes formas de colágeno así como de fibronectina, mientras que la invasina InvA [4] se une a pintegrinas en la membrana celular eucariótica. Si la cepa bacteriana Gram negativa es una cepa de Y. enterocolitica, la cepa tiene preferiblemente deficiencia de InvA y/o YadA.

Como se utiliza en la presente memoria, el término "familia Enterobacteriaceae" comprende una familia de bacterias Gram negativas, con forma de bastoncillo, facultativamente anaerobias que se encuentran en el suelo, el agua, las plantas y los animales, que se presentan con frecuencia como patógenos en los vertebrados. Las bacterias de esta familia comparten una fisiología similar y demuestran una conservación dentro de los elementos funcionales y genes de los respectivos genomas. Además de ser oxidasa negativos, todos los miembros de esta familia son fermentadores de glucosa y la mayoría son reductores de nitratos. Las bacterias Enterobacteriaceae de la invención pueden ser cualquier bacteria de esa familia, e incluyen específicamente, pero no se limitan a, bacterias de los siguientes géneros: Escherichia, Shigella, Edwardsiella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus, Erwinia, Morganella, Providencia, o Yersinia. En realizaciones más específicas, la bacteria es de la especie Escherichia coli, Escherichia blattae, Escherichia fergusonii, Escherichia hermanii, Escherichia vuneris, Salmonella enterica, Salmonella bongori, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, Enterobacter aerogenes, Enterobacter gergoviae, Enterobacter sakazakii, Enterobacter cloacae, Enterobacter agglomerans, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Serratia marcescens, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica, Erwinia amylovora, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Proteus penneri, Proteus hauseri, Providencia alcalifaciens o Morganella morganii. Preferiblemente, la cepa bacteriana Gram negativa se selecciona del grupo que consiste en los géneros Yersinia, Escherichia, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Chlamydia, Erwinia, Pantoea, Vibrio, Burkholderia, Ralstonia, Xanthomonas, Chromobacterium, Sodalis, Citrobacter, Edwardsiella, Rhizobiae, Aeromonas, Photorhabdus, Bordetella y Desulfovibrio, más preferiblemente de grupo que consiste en los géneros Yersinia, Escherichia, Salmonella, y Pseudomonas, lo más preferiblemente de grupo que consiste en los géneros Yersinia y Salmonela.

El término "Yersinia” como se emplea en la presente memoria incluye todas las especies de Yersinia, incluyendo Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis y Yersinia pestis. Se prefiere Yersinia enterocolitica.

El término "Salmonela"como se emplea en la presente memoria incluye todas las especies de Salmonella, incluyendo Salmonella enterica y S. bongori. Se prefiere Salmonella enterica.

"Promotor", como se emplea en la presente memoria, se refiere a una secuencia de ácido nucleico que regula la expresión de una unidad transcripcional. Una "región promotora" es una región reguladora capaz de unirse a la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificante aguas abajo (dirección 3'). Dentro de la región promotora se encontrará un sitio de inicio de la transcripción (convenientemente definido mediante mapeo con nucleasa S1), así como dominios de unión a proteínas (secuencias consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa, tales como la región putativa - 35 y la caja de Pribnow. El término "conectadas operablemente" cuando se describe la relación entre dos regiones de ADN simplemente significa que están funcionalmente relacionadas entre sí y que están ubicadas en el mismo fragmento de ácido nucleico. Un promotor está conectado operablemente a un gen estructural si controla la transcripción del gen y está ubicado en el mismo fragmento de ácido nucleico que el gen. Normalmente, el promotor es funcional en dicha cepa bacteriana Gram negativa, es decir, el promotor es capaz de expresar la proteína de fusión de la presente invención, es decir, el promotor es capaz de expresar la proteína de fusión de la presente invención sin ingeniería genética adicional o expresión de proteínas adicionales. Además, un promotor funcional no debe estar naturalmente contrarregulado por el T3SS bacteriano.

El término "suministro" utilizado en la presente memoria se refiere al transporte de una proteína desde una cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante a una célula eucariótica, incluidas las etapas de expresión de la proteína heteróloga en la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante, secreción de la proteína o proteínas expresadas a partir de tal cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante y translocación de la proteína o proteínas secretadas por tal cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante al citosol de la célula eucariótica. En consecuencia, los términos "señal de suministro" o "señal de secreción" que se utilizan indistintamente en la presente memoria se refieren a una secuencia polipeptídica que puede ser reconocida por el sistema de secreción y translocación de la cepa bacteriana Gram negativa y dirige el suministro de una proteína desde la cepa bacteriana Gram negativa a células eucarióticas.

El término "señal de suministro de una proteína efectora bacteriana" utilizado en la presente memoria se refiere a una señal de suministro de una proteína efectora bacteriana funcional en la cepa bacteriana Gram negativa recombinante, es decir, que permite que una proteína heteróloga expresada en la cepa bacteriana Gram negativa recombinante sea secretada a partir de dicha cepa bacteriana Gram negativa recombinante por un sistema de secreción tal como el sistema de secreción tipo III o sea translocada por tal cepa bacteriana Gram negativa recombinante al citosol de una célula eucariótica por un sistema de secreción tal como el sistema de secreción tipo III. El término "señal de suministro de una proteína efectora bacteriana" utilizado en la presente memoria también comprende un fragmento de una señal de suministro de una proteína efectora bacteriana, es decir, versiones más cortas de una señal de suministro, p. ej., una señal de suministro que comprende hasta 10, preferiblemente hasta 20, más preferiblemente hasta 50, incluso más preferiblemente hasta 100, en particular hasta 140 aminoácidos de una señal de suministro, p. ej., de una señal de suministro de origen natural. Por tanto, una secuencia de nucleótidos tal como p. ej., una secuencia de ADN que codifica una señal de suministro de una proteína efectora bacteriana puede codificar una señal de suministro de longitud completa o un fragmento de la misma en donde el fragmento generalmente comprende usualmente hasta 30, preferiblemente hasta 60, más preferiblemente hasta 150, incluso más preferiblemente hasta 300, en particular hasta 420 ácidos nucleicos.

Como se emplea en la presente memoria, la "secreción" de una proteína se refiere al transporte de una proteína heteróloga hacia afuera a través de la membrana celular de una cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante. La "translocación" de una proteína se refiere al transporte de una proteína heteróloga de una cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante a través de la membrana plasmática de una célula eucariótica al citosol de tal célula eucariótica.

El término "proteína bacteriana, que es parte de una maquinaria del sistema de secreción", como se emplea en la presente memoria, se refiere a proteínas bacterianas que constituyen componentes esenciales del sistema de secreción bacteriano de tipo 3 (T3SS), el sistema de secreción de tipo 4 (T4SS) y el sistema de secreción de tipo 6 (T6SS), preferiblemente T3SS. Sin tales proteínas, el sistema de secreción respectivo no es funcional en la translocación de proteínas a las células anfitrionas, incluso si todos los demás componentes del sistema de secreción y la proteína efectora bacteriana que se va a translocar todavía se codifican y se producen.

El término "proteína efectora bacteriana" como se emplea en la presente memoria se refiere a proteínas bacterianas transportadas por sistemas de secreción, p. ej., por proteínas bacterianas, que son parte de una maquinaria del sistema de secreción a células anfitrionas. Tales proteínas efectoras son suministradas por un sistema de secreción a una célula anfitriona donde ejercen, p. ej., actividad de virulencia hacia diversas proteínas y maquinarias celulares del anfitrión. Se conocen muchas proteínas efectoras diferentes, transportadas por varios tipos de sistemas de secreción y que muestran un gran repertorio de actividades bioquímicas que modulan las funciones de las moléculas reguladoras del anfitrión. Los sistemas de secreción incluyen el sistema de secreción de tipo 3 (T3SS), el sistema de secreción de tipo 4 (T4SS) y el sistema de secreción de tipo 6 (T6SS). Algunas proteínas efectoras (como IpaC de Shigella flexnen) también pertenecen a la clase de proteínas bacterianas, que forman parte de una maquinaria del sistema de secreción y permiten la translocación de proteínas. La cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante utilizada en la presente memoria generalmente comprende proteínas bacterianas que constituyen componentes esenciales del sistema de secreción bacteriano de tipo 3 (T3SS), el sistema de secreción de tipo 4 (T4SS) y/o el sistema de secreción de tipo 6 (T6SS), preferiblemente del sistema de secreción de tipo 3 (T3SS).

Los términos "proteína efectora de T6SS" o "proteína efectora de T6SS bacteriano" como se emplean en la presente memoria se refieren a proteínas que son inyectadas naturalmente por los sistemas T6S al citosol de células eucarióticas o bacterias y a proteínas que son secretadas naturalmente por sistemas T6S que podrían, por ejemplo, formar poros de translocación en la membrana eucariótica. Los términos "proteína efectora de T4SS" o "proteína efectora de T4SS bacteriano" como se emplean en la presente memoria se refieren a proteínas que son inyectadas naturalmente por los sistemas T4S al citosol de células eucarióticas y a proteínas que son secretadas naturalmente por los sistemas T4S que podrían, p. ej., formar el poro de translocación en la membrana eucariótica. Los términos "proteína efectora de T3SS" o "proteína efectora de T3SS bacteriano" como se emplean en la presente memoria se refieren a proteínas que son inyectadas naturalmente por sistemas T3S al citosol de células eucarióticas y a proteínas que son secretadas naturalmente por sistemas T3S que podrían, p. ej., formar el poro de translocación en la membrana eucariótica (incluidos los translocadores formadores de poros (como YopB y YopD de Yersinia) y proteínas de la punta como LcrV de Yersinia). Preferiblemente, se utilizan proteínas que se inyectan naturalmente mediante sistemas T3S al citosol de células eucarióticas. Estos factores de virulencia paralizarán o reprogramarán la célula eucariótica en beneficio del patógeno. Los efectores de T3S muestran un gran repertorio de actividades bioquímicas y modulan la función de moléculas reguladoras cruciales del anfitrión [5,6] e incluyen AvrA, AvrB, AvrBs2, AvrBS3, AvrBsT, AvrD, AvrD1, AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, AvrRpm1, AvrRpt2, AvrXv3, CigR, EspF, EspG, EspH, EspZ, ExoS, ExoT, GogB, GtgA, GtgE, familia GALA de proteínas, HopAB2, HopAO1, HopI1, HopM1, HopN1, HopPtoD2, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, HopU1, HsvB, IcsB, IpaA, IpaB, IpaC, IpaH, IpaH7.8, IpaH9.8, IpgB1, IpgB2, IpgD, LcrV, Map, OspC1, OspE2, OspF, OspG, OspI, PipB, PipB2, PopB, PopP2, PthXo1, PthXo6, PthXo7, SifA, SifB, SipA/SspA, SipB, SipC/SspC, SipD/SspD, S1rP, SopA, SopB/SigD, SopD, SopE, SopE2, SpiC/SsaB, SptP, SpvB, SpvC, SrfH, SrfJ, Sse, SseB, SseC, SseD, SseF, SseG, SseI/SrfH, SseJ, SseK1, SseK2, SseK3, SseL, SspH1, SspH2, SteA, SteB, SteC, SteD, SteE, TccP2, Tir, VirA, VirPphA, VopF, XopD, YopB, YopD, YopE, YopH, YopJ, YopM, YopO, YopP, YopT, YpkA.

Los términos "cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante que se acumula en un tumor sólido maligno" o "la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante se acumula en un tumor sólido maligno", como se emplean en la presente memoria, se refieren a una cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante. que se replica dentro de un tumor sólido maligno aumentando así el recuento bacteriano de esta cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante dentro del tumor sólido maligno. Sorprendentemente, se ha encontrado que la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante después de la administración al sujeto se acumula específicamente en el tumor sólido maligno, es decir, se acumula específicamente en el órgano donde está presente el tumor maligno, en donde los recuentos bacterianos de la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante en órganos donde no hay un tumor sólido maligno son bajos o no detectables. En caso de bacterias residentes extracelulares como Yersinia, las bacterias se acumulan principalmente dentro del espacio intercelular formado entre las células tumorales. Las bacterias de crecimiento intracelular como Salmonela invadirán principalmente las células tumorales y residirán dentro de tales células, si bien aún se podrían producir acumulaciones extracelulares. Los recuentos bacterianos de la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante acumulada dentro del tumor sólido maligno pueden estar, p. ej., en el intervalo de 104 a 109 bacterias por gramo de tejido tumoral.

Los términos "tumor sólido maligno" o "indicación de tumor sólido maligno" como se emplean en la presente memoria se refieren a una masa anormal de tejido que normalmente no contiene quistes o zonas líquidas. Los tumores sólidos pueden ser benignos (no cancerosos) o malignos (cancerosos). Los tumores sólidos malignos se tratan con los métodos de la presente invención. Los diferentes tipos de tumores sólidos malignos reciben el nombre del tipo de células que los forman. Los ejemplos de tumores sólidos malignos son sarcomas, carcinomas y linfomas. Las leucemias (cánceres de la sangre) generalmente no forman tumores sólidos malignos (definición según el instituto nacional del cáncer del NIH). Los tumores sólidos malignos incluyen, pero no se limitan a, masa anormal de células que pueden provenir de diferentes tipos de tejidos tales como hígado, colon, recto, piel, mama, páncreas, cuello uterino, cuerpo uterino, vejiga, vesícula biliar, riñón, laringe, labio, cavidad oral, esófago, ovario, próstata, estómago, testículos, glándula tiroides o pulmón y, por lo tanto, incluyen tumores sólidos malignos de hígado, colon, recto, piel, mama, páncreas, cuello uterino, cuerpo uterino, vejiga, vesícula biliar, riñón, laringe, labio, cavidad oral, esófago, ovario, próstata, estómago, testículos, glándula tiroides o pulmón. Los tumores sólidos malignos preferidos que se pueden tratar con los métodos de la presente invención son los tumores sólidos malignos que provienen de piel, mama, hígado, páncreas, vejiga, próstata y colon y, por tanto, incluyen tumores sólidos malignos de piel, mama, hígado, páncreas, vejiga, de próstata y colon. Los tumores sólidos malignos igualmente preferidos que se pueden tratar con los métodos de la presente invención son los tumores sólidos malignos asociados con el cáncer de hígado, tales como el carcinoma hepatocelular.

El término "proteína efectora bacteriana que es virulenta para células eucarióticas" como se emplea en la presente memoria se refiere a proteínas efectoras bacterianas, que son transportadas por sistemas de secreción a las células anfitrionas donde ejercen su actividad de virulencia para diversas proteínas anfitrionas y maquinarias celulares. Se conocen muchas proteínas efectoras diferentes, transportadas por varios tipos de sistemas de secreción y que muestran un gran repertorio de actividades bioquímicas que modulan las funciones de las moléculas reguladoras del anfitrión. Los sistemas de secreción incluyen el sistema de secreción de tipo 3 (T3SS), el sistema de secreción de tipo 4 (T4SS) y el sistema de secreción de tipo 6 (T6SS). Es importante destacar que algunas proteínas efectoras que son virulentas para las células eucarióticas (como Shigella flexneri IpaC) también pertenecen a la clase de proteínas bacterianas, que son parte de una maquinaria del sistema de secreción. En caso de que la proteína efectora bacteriana que es virulenta para las células eucarióticas sea también esencial para la función de la maquinaria de secreción, tal proteína se excluye de esta definición. Las proteínas efectoras de T3SS que son virulentas para las células eucarióticas se refieren a proteínas como YopE, YopH, YopJ, YopM, YopO, YopP, YopT de Y. enterocolitica u OspF, IpgD, IpgB1 de Shigella flexneri o SopE, SopB, SptP de Salmonella enterica o ExoS, ExoT, ExoU, ExoY de P. aeruginosa o Tir, Map, EspF, EspG, EspH, EspZ de E. coli. Las proteínas efectoras de T4SS que son virulentas para las células eucarióticas se refieren a proteínas como LidA, SidC, SidG, SidH, SdhA, SidJ, SdjA, SdeA, SdeA, SdeC, LepA, LepB, WipA, WipB, YlfA, YlfB, VipA, VipF, VipD, VpdA, VpdB, DrrA, LegL3, LegL5, LegL7, LegLC4, LegLC8, LegC5, LegG2, Ceg10, Ceg23, Ceg29 de Legionella pneumophila o BepA, BepB, BepC, BepD, BepE, BepF, BepG de Bartonella henselaeo VirD2, VirE2, VirE3, VirF de Agrobacterium tumefaciens o CagA de H. pylorio toxina pertussis de Bórdetela pertussis. Las proteínas efectoras de T6SS que son virulentas para las células eucarióticas se refieren a proteínas como proteínas VgrG de Vibrio cholerae (como VgrG1).

Los términos "proteína efectora de T3SS que es virulenta para células eucarióticas" o "proteína efectora de T3SS bacteriano que es virulenta para células eucarióticas" como se emplean en la presente memoria se refieren a proteínas que son inyectadas naturalmente por sistemas T3S al citosol de células eucarióticas y a proteínas que son secretada naturalmente por los sistemas T3S que podrían, p. ej., formar el poro de translocación en la membrana eucariota, que son factores de virulencia para las células eucarióticas, es decir, proteínas que paralizan o reprograman la célula eucariótica en beneficio del patógeno. Los efectores muestran un gran repertorio de actividades bioquímicas y modulan la función de mecanismos reguladores cruciales del anfitrión, tales como, p. ej., fagocitosis y el citoesqueleto de actina, señalización inflamatoria, apoptosis, endocitosis o vías secretoras [5,6] e incluyen AvrA, AvrB, AvrBs2, AvrBS3, AvrBsT, AvrD, AvrD1, AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, AvrRpm1, AvrRpt2, AvrXv3, CigR, EspF, EspG, EspH, EspZ, ExoS, ExoT, GogB, GtgA, GtgE, familia GALA de proteínas, HopAB2, HopAO1, HopI1, HopM1, HopN1, HopPtoD2, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, HopU1, HsvB, IcsB, IpaA, IpaH, IpaH7.8, IpaH9.8, IpgB1, IpgB2, IpgD, LcrV, Map, OspC1, OspE2, OspF, OspG, OspI, PipB, PipB2, PopB, PopP2, PthXo1, PthXo6, PthXo7, SifA, SifB, SipA/SspA, S1rP, SopA, SopB/SigD, SopD, SopE, SopE2, SpiC/SsaB, SptP, SpvB, SpvC, SrfH, SrfJ, Sse, SseB, SseC, SseD, SseF, SseG, SseI/SrfH, SseJ, SseK1, SseK2, SseK3, SseL, SspH1, SspH2, SteA, SteB, SteC, SteD, SteE, TccP2, Tir, VirA, VirPphA, VopF, XopD, YopE, YopH, YopJ, YopM, YopO, YopP, YopT, YpkA.

Los genes efectores de T3SS de Yersinia que son virulentos para una célula eucariótica y se pueden suprimir/mutar, p. ej., de Y. enterocolitica son YopE, YopH, YopM, YopO, YopP (también denominado YopJ) y YopT [7]. Los genes efectores respectivos que son virulentos para una célula eucariótica se pueden suprimir/mutar de Shigella flexneri (p. ej., OspF, IpgD, IpgB1), Salmonella enterica (p. ej., SopE, SopB, SptP), P. aeruginosa (p. ej., ExoS, ExoT, ExoU, ExoY) o E. coli (p. ej., Tir, Map, EspF, EspG, EspH, EspZ). Las secuencias de ácido nucleico de estos genes están disponibles para los expertos en la técnica, p. ej., en Genebank Database (yopH, yopO, yopE, yopP, yopM, yopT de NC_002120 GI: 10955536; proteínas efectoras de S. flexneri de AF386526.1 GI: 18462515; efectores de S. enterica NC_016810.1 GI: 378697983 o FQ312003.1 GI: 301156631; efectores de P. aeruginosa AE004091.2 GI: 110227054 o CP000438.1 GI:115583796 y proteínas efectoras de E. coli NC_011601.1 GI: 215485161).

A los efectos de la presente invención, los genes se indican con letras minúsculas y en cursiva para distinguirlos de las proteínas. En caso de que los genes (indicados con letras minúsculas y en cursiva) sigan el nombre de una especie bacteriana (como E. coli), se refieren a una mutación del gen correspondiente en la especie bacteriana correspondiente. Por ejemplo, YopE se refiere a la proteína efectora codificada por el gene yopE. Y. enterocolitica yopE representa una Y. enterocolitica que tiene una mutación en el gen yopE.

Como se emplean en la presente memoria, los términos "polipéptido", "péptido", ''proteína'', "polipeptídico" y "peptídico" se utilizan indistintamente para designar una serie de restos de aminoácidos conectados entre sí por enlaces peptídicos entre los grupos alfa-amino y el carboxi de restos adyacentes. Se prefieren las proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 10 aminoácidos, más preferiblemente al menos 20 aminoácidos.

Según la presente invención, "una proteína heteróloga" incluye proteínas de origen natural o partes de las mismas y también incluye proteínas modificadas genéticamente artificialmente o partes de las mismas. Como se emplea en la presente memoria, el término "proteína heteróloga" se refiere a una proteína o una parte de la misma distinta de la proteína efectora de T3SS o su fragmento N-terminal al que puede fusionarse. En particular, la proteína heteróloga como se emplea en la presente memoria se refiere a una proteína o una parte de la misma, que no pertenece al proteoma, es decir, el complemento proteico natural completo de la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante específica proporcionada y utilizada por la invención, p. ej., que no pertenecen al proteoma, es decir, el complemento proteico natural completo de una cepa bacteriana específica del género Yersinia, Escherichia, Salmonella o Pseudomonas. Por lo general, la proteína heteróloga es de origen animal, incluido el origen humano. Preferiblemente, la proteína heteróloga es una proteína humana. Más preferiblemente, la proteína heteróloga se selecciona del grupo que consiste en proteínas implicadas en la apoptosis o la regulación de la apoptosis, reguladores del ciclo celular, proteínas de repetición de anquirina, proteínas de señalización celular, proteínas informadoras, factores de transcripción, proteasas, GTPasas pequeñas, proteínas relacionadas con GPCR, construcciones de fusión de nanocuerpos y nanocuerpos, efectores bacterianos de T3SS, efectores bacterianos de T4SS y proteínas virales. Particularmente de manera preferible, la proteína heteróloga se selecciona del grupo que consiste en proteínas implicadas en la apoptosis o la regulación de la apoptosis, reguladores del ciclo celular, proteínas de repetición de anquirina, proteínas informadoras, GTPasas pequeñas, proteínas relacionadas con GPCR, construcciones de fusión de nanocuerpos, efectores bacterianos de T3SS, efectores bacterianos de T4SS y proteínas virales. Incluso más concretamente preferidas son las proteínas heterólogas seleccionadas del grupo que consiste en proteínas implicadas en la apoptosis o la regulación de la apoptosis, reguladores del ciclo celular y proteínas de repetición de anquirina. Las más preferidas son las proteínas implicadas en la apoptosis o la regulación de la apoptosis, como proteínas heterólogas animales, preferiblemente humanas implicadas en la apoptosis o la regulación de la apoptosis. En algunas realizaciones, el vector de la cepa bacteriana Gram negativa de la presente invención comprende dos segundas secuencias de ADN que codifican las dos proteínas heterólogas idénticas o diferentes fusionadas independientemente entre sí en marco al extremo 3' de dicha primera secuencia de ADN. En algunas realizaciones, el vector de la cepa bacteriana Gram negativa de la presente invención comprende tres segundas secuencias de ADN que codifican las tres proteínas heterólogas idénticas o diferentes fusionadas independientemente entre sí en marco al extremo 3’ de dicha primera secuencia de ADN.

La proteína heteróloga expresada por la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante tiene usualmente un peso molecular de entre 1 y 150 kDa, preferiblemente entre 1 y 120 kDa, más preferiblemente entre 1 y 100 kDa, lo más preferiblemente entre 15 y 100 kDa.

En algunas realizaciones, el vector de la cepa bacteriana Gram negativa de la presente invención comprende dominios repetidos de una proteína heteróloga o dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes fusionadas en marco al extremo 3’ de dicha primera secuencia de ADN.

El término "proteínas heterólogas que pertenecen a la misma clase funcional de proteínas" como se emplea en la presente memoria se refiere a proteínas heterólogas que tienen la misma función, p. ej., proteínas heterólogas que tienen actividad enzimática, proteínas heterólogas que actúan en la misma ruta, tal como, p. ej., regulación del ciclo celular, o comparten una característica específica común como, p. ej., pertenecer a la misma clase de proteínas efectoras bacterianas. Las clases funcionales de proteínas son, p. ej., proteínas implicadas en la apoptosis o la regulación de la apoptosis, proteínas que actúan como reguladores del ciclo celular, proteínas de repetición de anquirina, proteínas de señalización celular, proteínas informadoras, factores de transcripción, proteasas, GTPasas pequeñas, proteínas relacionadas con GPCR, construcciones de fusión de nanocuerpos y nanocuerpos, efectores bacterianos de T3SS, efectores bacterianos de T4SS o proteínas virales que actúan conjuntamente en el proceso biológico de establecer la virulencia para las células eucarióticas.

Según la presente invención, "un dominio de una proteína heteróloga" incluye dominios de proteínas de origen natural y también incluye dominios de proteínas modificadas genéticamente artificialmente. Como se emplea en la presente memoria, el término "dominio de una proteína heteróloga" se refiere a un dominio de una proteína heteróloga diferente de un dominio de una proteína efectora de T3SS o un dominio diferente de un dominio que comprende el fragmento N-terminal de la misma al que se puede fusionar para lograr una proteína de fusión. En particular, el dominio de una proteína heteróloga como se emplea en la presente memoria se refiere a un dominio de una proteína heteróloga, que no pertenece al proteoma, es decir, el complemento proteico natural completo de la cepa bacteriana Gram negativa recombinante específica proporcionada y utilizada por la invención, p. ej., que no pertenecen al proteoma, es decir, el complemento proteico natural completo de una cepa bacteriana específica del género Yersinia, Escherichia, Salmonella o Pseudomonas. Usualmente, el dominio de la proteína heteróloga es de origen animal, incluido el origen humano. Preferiblemente, el dominio de la proteína heteróloga es un dominio de una proteína humana. Más preferiblemente, el dominio de la proteína heteróloga es un dominio de una proteína seleccionada del grupo que consiste en proteínas implicadas en la apoptosis o la regulación de la apoptosis, reguladores del ciclo celular, proteínas de repetición de anquirina, proteínas de señalización celular, proteínas informadoras, factores de transcripción, proteasas, GTPasas pequeñas, proteínas relacionadas con GPCR, construcciones de fusión de nanocuerpos y nanocuerpos, efectores bacterianos de T3SS, efectores bacterianos de T4SS y proteínas virales. Particularmente de manera preferible, el dominio de la proteína heteróloga es un dominio de una proteína seleccionada del grupo que consiste en proteínas implicadas en la apoptosis o la regulación de la apoptosis, reguladores del ciclo celular, proteínas de repetición de anquirina, proteínas informadoras, GTPasas pequeñas, proteínas relacionadas con GPCR, construcciones de fusión de nanocuerpos, efectores bacterianos de T3SS, efectores bacterianos de T4SS y proteínas virales. Incluso más concretamente preferidos son los dominios de proteínas heterólogas seleccionadas del grupo que consiste en proteínas implicadas en la apoptosis o la regulación de la apoptosis, reguladores del ciclo celular y proteínas de repetición de anquirina. Los más preferidos son los dominios de proteínas implicadas en la apoptosis o la regulación de la apoptosis, como las proteínas animales implicadas en la apoptosis o la regulación de la apoptosis, preferiblemente dominios de proteínas heterólogas humanas implicadas en la apoptosis o la regulación de la apoptosis.

El término "dominios repetidos de una proteína heteróloga", como se emplea en la presente memoria, se refiere a una proteína de fusión que consiste de varias repeticiones de un dominio de una proteína heteróloga, donde estos dominios podrían fusionarse directamente entre sí o donde podría introducirse un conector variable, p. ej., un conector de entre 1 y 30, preferiblemente entre 2 y 15, más preferiblemente entre 3 y 10 aminoácidos entre los dominios. Preferiblemente, se utilizan dominios idénticos repetidos o dominios repetidos que tienen una identidad de secuencia de aminoácidos de más de 80%, usualmente más de 85%, preferiblemente más de 90%, incluso más preferiblemente más del 95%, en particular más de 96%, más concretamente más de 97%, incluso más concretamente más de 98%, lo más concretamente más de 99%. También se prefieren los dominios idénticos que tienen una identidad de aminoácidos de 100%. Preferiblemente, dos dominios repetidos, más preferiblemente dos dominios idénticos repetidos o dos dominios repetidos que tienen una identidad de secuencia de aminoácidos de más de 90%, preferiblemente más de 95%, lo más preferiblemente 100% están compuestos por la proteína de fusión como se hace referencia en la presente memoria. La presente invención también contempla más de dos, p. ej., tres, cuatro, cinco o seis dominios repetidos.

El término "dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes" como se emplea en la presente memoria se refiere a una proteína de fusión que consiste en una o varias repeticiones de al menos dos dominios de proteínas heterólogas diferentes, p. ej., al menos dos dominios de proteínas heterólogas que tienen una identidad de secuencia de aminoácidos de 80% o menos, preferiblemente de 60% o menos, más preferiblemente de 40% o menos, donde estos dominios diferentes podrían fusionarse directamente entre sí o donde podría introducirse un conector variable, p. ej., un conector de entre 1 y 30, preferiblemente entre 2 y 15, más preferiblemente entre 3 y 10 aminoácidos entre los dominios. Preferiblemente, dos dominios de proteínas heterólogas diferentes están comprendidos por la proteína de fusión como se hace referencia en la presente memoria. También se contemplan en la presente invención más de dos, p. ej., tres, cuatro, cinco o seis dominios de proteínas heterólogas diferentes.

El dominio de una proteína heteróloga expresada por la cepa bacteriana Gram negativa recombinante tiene normalmente un peso molecular de entre 1 y 50 kDa, preferiblemente entre 1 y 30 kDa, más preferiblemente entre 1 y 20 kDa, lo más preferiblemente entre 1 y 10 kDa.

Según la presente invención, las "proteínas implicadas en la apoptosis o la regulación de la apoptosis" incluyen, pero no se limitan a, Bad, Bcl2, Bak, Bmt, Bax, Puma, Noxa, Bim, Bcl-xL, Apafl, Caspasa 9, Caspasa 3, Caspasa 6, Caspasa 7, Caspasa 10, DFFA, DFFB, ROCK1, APP, CAD, ICAD, CAD, EndoG, AIF, HtrA2, Smac/Diablo, Arts, ATM, ATR, Bok/Mtd, Bmf, Mcl-1(S), Familia IAP, LC8, PP2B, proteínas 14-3-3, PKA, PKC, PI3K, Erk1/2, p90RSK, TRAF2, TRADD, FADD, Daxx, Caspasa8, Caspasa2, RIP, RAIDD, MKK7, Jn K, FLIps, FKHR, g Sk 3, CDK y sus inhibidores como la familia INK4 (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)) y la familia Cip1/Waf1/Kip1 -2 (p21(Cip1/Waf1), p27(Kip1), p57(Kip2). Preferiblemente se utilizan Bad, Bmt, Bcl2, Bak, Bax, Puma, Noxa, Bim, Bcl-xL, Caspasa9, Caspasa3, Caspasa6, Caspasa7, Smac/Diablo, Bok/Mtd, Bmf, Mcl-1(S), LC8, PP2B, TRADD, Daxx, Caspasa8, Caspase2, RIP, RAIDD, f Kh R, Cd K y sus inhibidores como la familia INK4 (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)), lo más preferiblemente BIM, Bid, Bid truncada, FADD, Caspasa 3 (y sus subunidades), Bax, Bad, Akt, CDK y sus inhibidores como la familia INK4 (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)) [8-10]. Además, las proteínas implicadas en la apoptosis o la regulación de la apoptosis incluyen DIVA, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bid y tBid, Egl-1, Bcl-Gs, Citocromo C, Beclina, CED-13, BNIP1, BNIP3, Bcl-B, Bcl-W, Ced-9, A1, NR13, Bfl-1, Caspasa 1, Caspasa 2, Caspasa 4, Caspasa 5, Caspasa 8. Las proteínas implicadas en la apoptosis o la regulación de la apoptosis se seleccionan del grupo que consiste en proteínas proapoptóticas, proteínas anti-apoptóticas, inhibidores de las vías de prevención de la apoptosis e inhibidores de la señalización o vías pro-supervivencia. Las proteínas proapoptóticas comprenden proteínas seleccionadas del grupo que consiste en Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid y tBid, Bok, Apafl, Smac/Diablo, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, Beclina 1, Egl-1 y CED-13, Citocromo C, FADD, la familia Caspasa y CDK y sus inhibidores como la familia INK4 (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)) o seleccionadas del grupo que consiste en Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid y tBid, Bok, Egl-1, Apafl, Smac/Diablo, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, Beclina 1, Egl-1 y CED-13, Citocromo C, FADD y la familia Caspasa. Se prefieren Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid y tBid, Bok, Egl-1, Apafl, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, Beclina 1, Egl-1 y CED-13, Smac/Diablo, FADD, la familia Caspasa, CDK y sus inhibidores como la familia INK4 (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)). Igualmente preferidos son Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid y tBid, Bok, Apafl, BNIP1, BNIP3, Bcl-Gs, Beclina 1, Egl-1 y CED-13, Smac/Diablo, FADD, la familia Caspasa. Las proteínas anti-apoptóticas comprenden proteínas seleccionadas del grupo que consiste en Bcl-2, Bcl-Xl, Bcl-B, Bcl-W, Mcl-1, Ced-9, A1, NR13, familia IAP y Bfl-1. Se prefieren Bcl-2, Bcl-Xl, Bcl-B, Bcl-W, Mcl-1, Ced-9, A1, NR13 y Bfl-1. Los inhibidores de las vías de prevención de la apoptosis comprenden proteínas seleccionadas del grupo que consiste en Bad, Noxa y Cdc25A. Se prefieren Bad y Noxa. Los inhibidores de la señalización o vías pro-supervivencia comprenden proteínas seleccionadas del grupo que consiste en PTEN, ROCK, PP2A, PHLPP, JNK, p38. Se prefieren PTEN, ROCK, PP2A y PHLPP.

En algunas realizaciones, las proteínas heterólogas implicadas en la apoptosis o la regulación de la apoptosis se seleccionan del grupo que consiste en proteínas sólo BH3, caspasas y proteínas de señalización intracelular del control de la apoptosis del receptor de muerte. Se prefieren las proteínas solo BH3. Las proteínas solo BH3 comprenden proteínas seleccionadas del grupo que consiste en Bad, BIM, Bid y tBid, Puma, Bik/Nbk, Bod, Hrk/Dp5, BNIP1, BNIP3, Bmf, Noxa, Mcl-1, Bcl-Gs, Beclina1 , Egl-1 y CED-13. Se prefieren Bad, BIM, Bid y tBid, en particular tBid. Las caspasas comprenden proteínas seleccionadas del grupo que consiste en Caspasa 1, Caspasa 2, Caspasa 3, Caspasa 4, Caspasa 5, Caspasa 6, Caspasa 7, Caspasa 8, Caspasa 9, Caspasa 10. Se prefieren Caspasa 3, Caspasa 8 y Caspasa 9.Las proteínas de señalización intracelular del control del receptor de muerte de la apoptosis comprenden proteínas seleccionadas del grupo que consiste en FADD, TRADD, ASC, BAP31, GULP1/CED-6, CIDEA, MFG-E8, CIDEC, RIPK1/RIP1, CRADD, RIPK3/RIP3, Crk, SHB, CrkL, DAXX, la familia 14-3-3, FLIP, DFF40 y 45, PEA-15, SODD. Se prefieren FADD y TRADD. En algunas realizaciones, dos proteínas heterólogas implicadas en la apoptosis o la regulación de la apoptosis están compuestas por la cepa bacteriana Gram negativa y/o el vector de la presente invención, en donde una proteína es una proteína proapoptótica y la otra proteína es un inhibidor de las vías de prevención de la apoptosis o en donde una proteína es una proteína proapoptótica y la otra proteína es un inhibidor de la señalización o vías pro-supervivencia. Las proteínas proapoptóticas abarcadas por la presente invención tienen normalmente una estructura de hélice alfa, preferiblemente una hélice hidrófoba rodeada por hélices anfipáticas y usualmente comprenden al menos una de los dominios BH1, BH2, BH3 o BH4, preferiblemente comprenden al menos un dominio BH3. Usualmente, las proteínas proapoptóticas incluidas en la presente invención no tienen actividad enzimática. Las proteínas antiapoptóticas abarcadas por la presente invención tienen usualmente una estructura de hélice alfa, preferiblemente una hélice hidrófoba rodeada por hélices anfipáticas y comprenden una combinación de diferentes dominios BH1, BH2, BH3 y BH4, preferiblemente una combinación de diferentes dominios BH1, BH2, BH3 y BH4 en donde está presente un dominio BH1 y BH2, más preferiblemente BH4-BH3-BH1-BH2, BH1-BH2, BH4-BH1BH2 o BH3-BH1-BH2 (de extremo N-terminal a C-terminal). Además, también se incluyen proteínas que contienen al menos un dominio BIR. Los inhibidores de las vías de prevención de la apoptosis abarcados por la presente invención tienen usualmente una estructura de hélice alfa, preferiblemente una hélice hidrófoba rodeada por hélices anfipáticas y normalmente comprenden un dominio BH3. Los dominios BH1, BH2, BH3 o BH4 tienen cada uno usualmente entre aproximadamente 5 y aproximadamente 50 aminoácidos de longitud. Por tanto, en algunas realizaciones, las proteínas heterólogas implicadas en la apoptosis o la regulación de la apoptosis se seleccionan del grupo que consiste en proteínas heterólogas implicadas en la apoptosis o la regulación de la apoptosis que tienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 200, preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 150, más preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 100, lo más preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 50, en particular de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 aminoácidos de longitud.

En algunas realizaciones, la cepa bacteriana Gram negativa de la presente invención se transforma con dos dominios de proteínas heterólogas implicadas en la apoptosis o la regulación de la apoptosis, preferiblemente dos dominios repetidos, más preferiblemente dos dominios repetidos idénticos de una proteína implicada en la apoptosis o la regulación de la apoptosis o dos dominios de diferentes proteínas implicadas en la apoptosis o la regulación de la apoptosis, lo más preferiblemente dos dominios repetidos idénticos de una proteína implicada en la apoptosis o la regulación de la apoptosis. En algunas realizaciones, la cepa bacteriana Gram negativa de la presente invención se transforma con dos dominios de proteínas heterólogas implicadas en la apoptosis o la regulación de la apoptosis, en donde uno es un dominio de una proteína proapoptótica y el otro es un dominio de una proteína que es un inhibidor de las rutas de prevención de la apoptosis o en donde uno es un dominio de una proteína proapoptótica y el otro dominio es un dominio de una proteína que es un inhibidor de la señalización o vías pro-supervivencia.

Un dominio preferido en particular es el dominio BH3 del inductor de apoptosis tBID, más concretamente el dominio BH3 que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 217, 218, 219 y 220, preferiblemente SEQ ID NO: 219 o SEQ ID NO: 220. Igualmente preferido es el dominio BH3 del regulador de apoptosis BAX, más concretamente el dominio BAX que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 221, 222, 223 y 224, preferiblemente SEQ ID NO: 223 o SEQ ID NO: 224. Las secuencias humana y murina se proporcionan en SEQ ID NO 217-224, pero están igualmente incluidos los dominios BH3 de tBID y BAX de todas las demás especies. En algunas realizaciones, los dominios repetidos de las proteínas heterólogas son el dominio BH3, preferiblemente dominios BH3 repetidos del inductor de apoptosis tBID, más preferiblemente dominios BH3 repetidos del inductor de apoptosis tBID comprendido por SEQ ID NO: 219 o s Eq ID NO: 220 o SEQ ID NO: 202, incluso más preferiblemente dos dominios BH3 repetidos del inductor de apoptosis tBID, lo más preferiblemente dos dominios BH3 repetidos del inductor de apoptosis tBID comprendidos por SEQ ID NO: 219 o SEQ ID NO: 220 o SEQ ID NO: 202, en particular dos dominios BH3 repetidos del inductor de apoptosis tBID comprendidos por la secuencia de SEQ ID NO: 202. Así, en una realización preferida, la cepa bacteriana Gram negativa y/o el vector de la presente invención comprenden una segunda secuencia de ADN que codifica dos dominios repetidos de un dominio BH3, más preferiblemente dos dominios BH3 repetidos del inductor de apoptosis tBID. Los dos dominios repetidos pueden estar conectados por un conector de 1-30 aminoácidos de longitud, preferiblemente 2-15 aminoácidos, más preferiblemente 3-10 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, los dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes son dominios de proteínas heterólogas que pertenecen a la misma clase funcional de proteínas, preferiblemente las proteínas heterólogas diferentes de los dos o más dominios son proteínas heterólogas diferentes de la clase de proteínas implicadas en la apoptosis o regulación de la apoptosis. En una realización preferida, los dos o más dominios de proteínas heterólogas diferentes son el dominio BH3 del inductor de apoptosis tBID y el dominio BH3 del regulador de apoptosis BAX, en particular los dominios BH3 fusionados comprendidos por la secuencia de SEQ ID NO: 203 y 211. Los dos dominios de proteínas heterólogas diferentes pueden estar conectados por un conector de 1-30 aminoácidos de longitud, preferiblemente 2-15 aminoácidos, más preferiblemente 3-10 aminoácidos de longitud.

En algunas realizaciones, las proteínas heterólogas son una enzima convertidora de profármacos. En estas realizaciones, la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante expresa, preferiblemente expresa y secreta una enzima convertidora de profármacos. Una enzima convertidora de profármacos como se menciona en la presente memoria comprende enzimas que convierten profármacos no tóxicos en un fármaco tóxico, preferiblemente enzimas seleccionadas del grupo que consiste en citosina desaminasa, purina nucleósido fosforilasa, timidina quinasa, beta-galactosidasa, carboxilesterasas, nitrorreductasa, carboxipeptidasas y beta-glucuronidasas, más preferiblemente enzimas seleccionadas del grupo que consiste en citosina desaminasa, purina nucleósido fosforilasa, timidina quinasa y beta-galactosidasa.

El término "sitio de escisión de proteasa", como se emplea en la presente memoria, se refiere a un motivo de aminoácidos específico dentro de una secuencia de aminoácidos, p. ej., dentro de una secuencia de aminoácidos de una proteína o una proteína de fusión, que es escindida por una proteasa específica, que reconoce el motivo de aminoácidos. Para una revisión, véase [11]. Los ejemplos de sitios de escisión de proteasas son motivos de aminoácidos, que son escindidos por una proteasa seleccionada del grupo que consiste en enteroquinasa (cadena ligera), enteropeptidasa, proteasa PreScission, proteasa de rinovirus humano (HRV 3C), proteasa TEV, proteasa TVMV, proteasa FactorXa y trombina. El siguiente motivo de aminoácidos es reconocido por la proteasa respectiva:

- Asp-Asp-Asp-Asp-Lys: enteroquinasa (cadena ligera)/enteropeptidasa

- Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln/Gly-Pro: Proteasa PreScission/proteasa de rinovirus humano (HRV 3C)

- Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Ser y motivos modificados basados en Glu-X-X-Tyr-X-Gln-Gly/Ser (donde X es cualquier aminoácido) reconocido por la proteasa TEV (virus del grabado del tabaco)

- Glu-Thr-Val-Arg-Phe-Gln-Ser: proteasa TVMV

- Ile-(Glu o Asp)-Gly-Arg: proteasa FactorXa

- Leu-Val-Pro-Arg/Gly-Ser: trombina.

Incluida por los sitios de escisión de proteasa como se utiliza en la presente memoria se encuentra la ubiquitina. Por tanto, en algunas realizaciones preferidas, se utiliza ubiquitina como sitio de escisión de proteasa, es decir, la tercera secuencia de ADN codifica ubiquitina como sitio de escisión de proteasa, que puede escindirse mediante proteasas de procesamiento de ubiquitina específicas en el sitio N-terminal, p. ej., que se puede escindir mediante proteasas de procesamiento de ubiquitina específicas llamadas enzimas Desubiquitinantes en el sitio N-terminal de forma endógena en la célula donde se ha suministrado la proteína de fusión. La Ubiquitina se procesa en su extremo C-terminal por un grupo de proteasas C-terminales endógenas específicas de Ubiquitina (enzimas desubiquitinantes, DUB). Se supone que la escisión de Ubiquitina por DUB ocurre en el mismo extremo C-terminal de la Ubiquitina (después de G76).

Un "individuo", "sujeto" o "paciente" es un vertebrado. En ciertas realizaciones, el vertebrado es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, primates (incluidos primates humanos y no humanos) y roedores (p. ej., ratones y ratas). En realizaciones preferidas, un sujeto es un ser humano.

El término "mutación" se utiliza en la presente memoria como un término general e incluye cambios tanto de un solo par de bases como de múltiples pares de bases. Tales mutaciones pueden incluir sustituciones, mutaciones de desplazamiento de marco, deleciones, inserciones y truncamientos.

El término "señal de localización nuclear" como se emplea en la presente memoria se refiere a una secuencia de aminoácidos que marca una proteína para su importación al núcleo de una célula eucariótica e incluye preferiblemente una señal de localización nuclear viral tal como el NLS derivado del antígeno T grande de SV40 (PPKKKRKV) .

El término "sitio de clonación múltiple" como se emplea en la presente memoria se refiere a una secuencia de ADN corta que contiene varios sitios de restricción para la escisión por endonucleasas de restricción tales como AclI, HindIII, SspI, MluCI, Tsp509I, PciI, Agel, BspMI, BfuAI, SexAI, MluI, BceAI , HpyCH4IV, HpyCH4III, BaeI, BsaXI, AflIII, SpeI, BsrI, BmrI, BglII, AfeI, AluI, StuI, Scal, ClaI, BspDI, PI-SceI, Nsil, AseI, SwaI, CspCI, MfeI, BssSI, BmgBI, PmlI, DraIII, AleI, EcoP15I, PvuII, AlwNI, BtsIMutI, TspRI, Ndel, NlaIII, CviAII, FatI, MslI, FspEI, XcmI, BstXI, PflMI, BccI, Ncol, BseYI, FauI, SmaI, XmaIt, TspMI, Nt.CviPII, LpnPI, AciI, SacII, BsrBI, MspI, HpaII, ScrFI, BssKI, StyD4I, BsaJI, BslI, Btgl, NciI, AvrII, MnlI, BbvCI, Nb.BbvCI, Nt.BbvCI, Sbfl, Bpu10I, Bsu36I, EcoNI, HpyAV, BstNI, PspGI, StyI, BcgI, PvuI, BstUI, EagI, RsrII, BsiEI, BsiWI, BsmBI, Hpy99I, MspA1I, MspJI, SgrAI, BfaI, BspCNI, XhoI, Earl, AcuI, PstI, BpmI, DdeI, SfcI, AflII, BpuEI, SmlI, AvaI, BsoBI, MboII, BbsI, XmnI, BsmI, Nb.BsmI, EcoRI, HgaI, AatII, ZraI, Tth1111, PflFI, PshAI, AhdI, DrdI, Eco53kI, SacI, BseRI, PleI, Nt.BstNBI, MlyI, HinfI, EcoRV, MboI, Sau3AI, DpnII, BfuCI, DpnI, BsaBI, TfiI, BsrDI, Nb.BsrDI, BbvI, BtsI, Nb.BtsI, BstAPI, SfaNI, SphI, NmeAIII, NaeI, NgoMIV, BglI, AsiSI, BtgZI, HinP11, HhaI, BssHII, NotI, Fnu4HI, Cac8I, MwoI, NheI, BmtI, SapI, BspQI, Nt.BspQI, BlpI, TseI, ApeKI, Bsp1286I, AlwI, Nt.AlwI, BamHI, FokI, BtsCI, HaeIII, Phol, FseI, SfiI, Narl, KasI, SfoI, PluTI, AscI, EciI, BsmFI, ApaI, PspOMI, Sau96I, NlaIV, KpnI, Acc65I, BsaI, HphI, BstEII, AvaII, BanI, BaeGI, BsaHI, BanII, RsaI, CviQI, BstZ17I, BciVI, SalI, Nt.BsmAI, BsmAI, BcoDI, ApaLI, BsgI, AccI, Hpy166II, Tsp45I, HpaI, PmeI, HincII, BsiHKAI, ApoI, NspI, BsrFI, BstYI, HaeII, CviKI-1, EcoO109I, PpuMI, I-CeuI, SnaBI, I-SceI, BspHI, BspEI, MmeI, TaqaI, NruI, Hpy188l, Hpy188III, XbaI, BclI, HpyCH4V, FspI, PI-PspI, MscI, BsrGI, MseI, PacI, PsiI, BstBI, DraI, PspXI, BsaWI, BsaAI, EaeI, preferiblemente Xhol, XbaI, HindIII, NcoI, NotI, EcoRI, EcoRV, BamHI, NheI, SacI, SalI, BstBI. El término "sitio de clonación múltiple" como se emplea en la presente memoria se refiere adicionalmente a una secuencia de ADN corta utilizada para eventos de recombinación como, p. ej., en la estrategia de clonación Gateway o para métodos tales como ensamblaje de Gibbson o clonación topo.

Los términos "cepa de tipo salvaje" o "tipo salvaje de la cepa bacteriana Gram negativa" como se emplea en la presente memoria se refiere a una variante de origen natural o una variante de origen natural que contiene modificaciones genéticas que permiten el uso de vectores, tales como mutaciones por deleción en endonucleasas de restricción o genes de resistencia a antibióticos. Estas cepas contienen ADN cromosómico y en algunos casos (p. ej., Y. enterocolitica, S. flexneri) un plásmido de virulencia no modificado.

El término "cepa de tipo salvaje de Yersinia" como se emplea en la presente memoria se refiere a una variante de origen natural (como Y. enterocolitica E40) o una variante natural que contiene modificaciones genéticas que permiten el uso de vectores, tales como mutaciones por deleción en endonucleasas de restricción o genes de resistencia a antibióticos (como Y. enterocolitica MRS40, el derivado sensible a la ampicilina de Y. enterocolitica E40). Estas cepas contienen ADN cromosómico, así como un plásmido de virulencia sin modificar (llamado pYV). Y. enterocolitica subespecie palearctica se refiere a las cepas de Y. enterocolitica poco patogénicas, que contrastan con las cepas más virulentas de la subespecies enterocolitica [12,13]. Y. enterocolitica subsp. palearctica carece, en comparación con Y.

enterocolitica subsp. enterocolitica, de una isla de alta patogenicidad (HPI). Esta HPI codifica el sideróforo de hierro llamado yersiniabactina [14]. La falta de yersiniabactina en Y. enterocolitica subsp. palearctica hace que esta subespecie sea menos patógena y dependiente del hierro accesible sistémico inducido para la infección persistente, p. ej., en hígado o bazo [14]. El hierro puede hacerse accesible para las bacterias en un individuo, por ejemplo, mediante un tratamiento previo con deferoxamina, un quelante de hierro utilizado para tratar la sobrecarga de hierro en pacientes [15].

El término "comprende" se utiliza generalmente en el sentido de incluir, es decir, permitir la presencia de una o más características o componentes.

El término "aproximadamente" se refiere a un intervalo de valores ± 10% de un valor especificado. Por ejemplo, la frase "aproximadamente 200" incluye ± 10% de 200, o de 180 a 220.

En un aspecto, la presente invención proporciona una cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante transformada con un vector que comprende en la dirección 5' a 3':

un promotor;

una segunda secuencia de ADN que codifica una proteína heteróloga fusionada en marco al extremo 3’ de dicha primera secuencia de ADN,

para su uso en un método de tratamiento de un tumor sólido maligno en un sujeto, en donde la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante es una cepa de Yersinia con producción deficiente de un sideróforo y se acumula en el tumor sólido maligno, comprendiendo el método la administración conjunta al sujeto de dicha cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante con un sideróforo, en donde se administra la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante en una cantidad suficiente para tratar al sujeto.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante, en donde la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante es una cepa de Yersinia con producción deficiente de un sideróforo, en donde la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante tiene una producción deficiente de al menos una proteína efectora bacteriana que es virulenta para las células eucarióticas o tiene una producción deficiente de al menos una proteína bacteriana que es parte de una maquinaria del sistema de secreción, para su uso en un método de tratamiento de un tumor sólido maligno en un sujeto, en donde la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante se acumula en el tumor sólido maligno, comprendiendo el método la administración conjunta al sujeto de dicha cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante con un sideróforo, en donde la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante se administra en una cantidad que es suficiente para tratar al sujeto. Se prefiere una cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante, en la que la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante es una cepa de Yersinia con producción deficiente de un sideróforo, en donde la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante tiene una producción deficiente de al menos una proteína efectora bacteriana que es virulenta para células eucarióticas, para su uso en un método de tratamiento de un tumor sólido maligno en un sujeto, en donde la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante se acumula en el tumor sólido maligno, comprendiendo el método la administración conjunta al sujeto de dicha cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante con un sideróforo, en donde la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante se administra en una cantidad suficiente para tratar al sujeto.

En una realización de la presente invención, la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante que tiene una producción deficiente de al menos una proteína efectora bacteriana que es virulenta para las células eucarióticas o que tiene una producción deficiente de al menos una proteína bacteriana que es parte de una maquinaria del sistema de secreción se transforma con un vector que comprende en la dirección 5' a 3':

un promotor;

una segunda secuencia de ADN que codifica una proteína heteróloga fusionada en marco al extremo 3’ de dicha primera secuencia de ADN.

En una realización de la presente invención, la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante o la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante que tiene una producción deficiente de al menos una proteína efectora bacteriana que es virulenta para las células eucarióticas o que tiene una producción deficiente de al menos una proteína bacteriana que forma parte de una maquinaria del sistema de secreción, se transforma con un vector que comprende en la dirección 5' a 3':

una primera secuencia de ADN que codifica una señal de suministro o un fragmento de la misma de una proteína efectora bacteriana;

una segunda secuencia de ADN que codifica una proteína heteróloga fusionada en marco al extremo 3’ de dicha primera secuencia de ADN. Preferiblemente, la secuencia de ADN que codifica una proteína heteróloga está flanqueada en su extremo 3’ por una secuencia de ADN homóloga a la secuencia de ADN del cromosoma o del plásmido de virulencia endógeno en el extremo 3' de la señal de suministro de una proteína efectora bacteriana o a un fragmento de la misma. Más preferiblemente, esta secuencia de ADN que flanquea la proteína homóloga en su extremo 3’ es homóloga a la secuencia de ADN y se encuentra a 10 kpb en el cromosoma o en un plásmido de virulencia endógeno en el extremo 3' de la señal de suministro de una proteína efectora bacteriana o a un fragmento de la misma. En particular, esta secuencia de nucleótidos que flanquea la proteína homóloga en su extremo 3’ es homóloga a la secuencia de ADN y está dentro del mismo operón en el cromosoma o en un plásmido de virulencia endógeno que la señal de suministro de una proteína efectora bacteriana o un fragmento de la misma. En esta realización, la transformación se realiza usualmente de modo que la primera y la segunda secuencias de ADN fusionadas se insertan mediante recombinación homóloga en un plásmido de virulencia endógeno o un cromosoma, preferiblemente en un plásmido de virulencia endógeno, de la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante, y la primera y la segunda secuencias de ADN fusionadas están conectadas operablemente a un promotor de un plásmido de virulencia endógeno o de un cromosoma, p. ej., de una isla de patogenicidad cromosómica. Preferiblemente, la primera y la segunda secuencias de ADN fusionadas están conectadas operablemente a un promotor de un plásmido de virulencia endógeno. En esta realización, la primera secuencia de ADN comprende una señal de suministro o un fragmento de la misma de una proteína efectora bacteriana, preferiblemente un fragmento de la misma, que proporciona recombinación homóloga en el sitio homólogo en el cromosoma o en un plásmido de virulencia endógeno para dar como resultado que la segunda secuencia de ADN se coloque en marco con respecto al extremo 3’ de la señal de suministro cromosómica o del plásmido de virulencia endógeno que está conectada operativamente al promotor endógeno.

En una realización adicional de la presente invención, la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante o la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante que tiene una producción deficiente de al menos una proteína efectora bacteriana que es virulenta para las células eucarióticas o que tiene una producción deficiente de al menos una proteína bacteriana que forma parte de una maquinaria del sistema de secreción, se transforma con una molécula de nucleótidos, preferiblemente una molécula de nucleótidos de ADN, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína heteróloga y una secuencia de nucleótidos que es homóloga o idéntica a una secuencia de nucleótidos que codifica una señal de suministro de una proteína efectora bacteriana o que es homóloga o idéntica a una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento de una señal de suministro de una proteína efectora bacteriana, en donde la señal de suministro de una proteína efectora bacteriana está codificada en el cromosoma o en un plásmido de virulencia endógeno de la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante. Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos que es homóloga o idéntica a una secuencia de nucleótidos de una señal de suministro de una proteína efectora bacteriana o de un fragmento de la misma se localiza en el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína heteróloga. Más preferiblemente, la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína heteróloga está flanqueada en su extremo 3’ por una secuencia de nucleótidos homóloga a la secuencia de ADN del cromosoma o del plásmido de virulencia endógeno en el extremo 3' de la señal de suministro de una proteína efectora bacteriana o a un fragmento de la misma. Incluso más preferiblemente, esta secuencia de nucleótidos que flanquea la proteína homóloga en su extremo 3’ es homóloga a la secuencia de ADN que se encuentra a 10 kpb en el cromosoma o en un plásmido de virulencia endógeno en el extremo 3' de la señal de suministro de una proteína efectora bacteriana o a un fragmento de la misma. En particular, esta secuencia de nucleótidos que flanquea la proteína homóloga en su extremo 3’ es homóloga a la secuencia de ADN que se encuentra dentro del mismo operón en el cromosoma o en un plásmido de virulencia endógeno como la señal de suministro de una proteína efectora bacteriana o un fragmento de la misma. En esta realización, la transformación se realiza usualmente de modo que la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína heteróloga se inserta en un plásmido de virulencia endógeno o un cromosoma de la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante en el extremo 3’ de una señal de suministro de una proteína efectora bacteriana codificada por el cromosoma o el plásmido de virulencia endógeno, en donde se expresa y secreta la proteína heteróloga fusionada a la señal de suministro.

En caso de que la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante sea una cepa de Yersinia, el plásmido de virulencia endógeno para la inserción es pYV (plásmido de Virulencia de Yersinia). En caso de que la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante sea una cepa de Salmonella, la ubicación endógena para la inserción es uno de las agrupaciones de genes llamados Spil o SpilI (para la isla de patogenicidad de Salmonela), una posición en la que una proteína efectora está codificada en otro lugar o, alternativamente, uno de los plásmidos de virulencia de Salmonella (SVP).

Preferiblemente, la primera y la segunda secuencias de ADN o la molécula de nucleótidos se insertan en un plásmido de virulencia endógeno en el sitio nativo de una proteína efectora bacteriana, p. ej., en el sitio nativo de un factor de virulencia, preferiblemente en caso de que la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante sea una cepa de Yersinia, en el sitio nativo de YopE u otro Yop (YopH, YopO, YopP, YopM, YopT), preferiblemente en el sitio nativo de YopE o en caso de que la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante sea una cepa de Salmonella en el sitio nativo de una proteína efectora codificada dentro de Spil, SpilI o codificada en otro lugar, preferiblemente en el sitio nativo de una proteína efectora codificada dentro de Spil o SpilI, más preferiblemente en el sitio nativo de SopE o SteA. Preferiblemente, la primera y la segunda secuencias de ADN o la molécula de nucleótidos están conectadas operablemente a un promotor nativo de una proteína efectora bacteriana presente en un plásmido de virulencia endógeno, p. ej., en caso de que la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante sea una cepa de Yersinia a un promotor nativo de un gen virulón de Yersinia como se describe a continuación, más preferiblemente al promotor YopE nativo u otro promotor Yop (YopH, YopO, YopP, YopM, YopT), preferiblemente al promotor YopE nativo o en caso de que la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante sea una cepa de Salmonella a un promotor nativo de la isla de patogenicidad SpiI o Spill o de una proteína efectora codificada en otro lugar como se describe a continuación, más preferiblemente al promotor SopE, InvB o SteA nativo.

Preferiblemente, la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante es una cepa de Yersinia enterocolitica. La más preferida es Yersinia enterocolitica E40 (O:9, biotipo 2) [16] o derivados sensibles a la ampicilina de la misma como Y. enterocolitica MRS40 (también denominada Y. enterocolitica subsp. palearctica MRS40) como se describe en [17]. Y. enterocolitica E40 y su derivado Y. enterocolitica MRS40 como se describe en [17] son idénticos a Y. enterocolitica subsp. palearctica E40 y su derivado Y. enterocolitica subsp. palearctica MRS40 como se describe en [12,14,18]. También preferiblemente la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante es una cepa de Salmonella, más preferiblemente una cepa de Salmonella enterica. La más preferida es Salmonella enterica Serovar Typhimurium SL1344 como se describe en la colección de cultivos de Public Health England (NCTC 13347).

En algunas realizaciones de la presente invención, la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante es una cepa que no produce sideróforos, p. ej., tiene una producción deficiente de cualquier sideróforo. Tal cepa es, por ejemplo Y. enterocolitica subsp. palearctica MRS40 como se describe en [14,17] que no produce yersiniabactina y que se prefiere.

En una realización de la presente invención, la señal de suministro de una proteína efectora bacteriana comprende una proteína efectora bacteriana o un fragmento N-terminal de la misma. En una realización de la presente invención, la señal de suministro de una proteína efectora bacteriana es una proteína efectora de T3SS bacteriano que comprende una proteína efectora de T3SS bacteriano o un fragmento N-terminal de la misma en donde la proteína efectora de T3SS o un fragmento N-terminal de la misma pueden comprender un sitio de unión a chaperona. Una proteína efectora de T3SS o un fragmento N-terminal de la misma que comprende un sitio de unión a chaperona es particularmente útil como señal de suministro en la presente invención. Las proteínas efectoras de T3SS preferidas o sus fragmentos N-terminales se seleccionan del grupo que consiste en SopE, SopE2, SptP, YopE, ExoS, SipA, SipB, SipD, SopA, SopB, SopD, IpgB1, IpgD, SipC, SifA, SseJ, Sse, SrfH, YopJ, AvrA, AvrBsT, YopT, YopH, YpkA, Tir, EspF, TccP2, IpgB2, OspF, Map, OspG, OspI, IpaH, SspH1, VopF, ExoS, ExoT, HopAB2, XopD, AvrRpt2, HopAO1, HopPtoD2, HopU1, familia de proteínas g AlA, AvrBs2, AvrD1, AvrBS3, YopO, YopP, YopE, YopM, YopT, EspG, EspH, EspZ, IpaA, IpaB, IpaC, VirA, IcsB, OspC1, OspE2, IpaH9.8, IpaH7.8, AvrB, AvrD, AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, VirPphA, AvrRpm1, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, PopB, PopP2, AvrBs3, XopD y AvrXv3. Las proteínas efectoras de T3SS más preferidas o sus fragmentos N-terminales se seleccionan del grupo que consiste en SopE, SptP, YopE, ExoS, SopB, IpgB1, IpgD, YopJ, YopH, EspF, OspF, ExoS, YopO, YopP, YopE, YopM, YopT, de las cuales las proteínas efectoras de T3SS más preferidas o sus fragmentos N-terminales se seleccionan del grupo que consiste en IpgB1, SopE, SopB, SptP, OspF, IpgD, YopH, YopO, YopP, YopE, YopM, YopT, en particular YopE o un fragmento N-terminal de la misma. Las proteínas efectoras de T3SS igualmente preferidas o sus fragmentos N-terminales se seleccionan del grupo que consiste en SopE, SopE2, SptP, SteA, SipA, SipB, SipD, SopA, SopB, SopD, IpgB1, IpgD, SipC, SifA, SifB, SseJ, Sse, SrfH, YopJ, AvrA, AvrBsT, YopH, YpkA, Tir, EspF, TccP2, IpgB2, OspF, Map, OspG, OspI, IpaH, VopF, ExoS, ExoT, HopAB2, AvrRpt2, HopAO1, HopU1, familia de proteínas GALA, AvrBs2, AvrD1, YopO, YopP, YopE, YopT, EspG, EspH, EspZ, IpaA, IpaB, IpaC, VirA, IcsB, OspC1, OspE2, IpaH9.8, IpaH7.8, AvrB, AvrD, AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, VirPphA, AvrRpm1, HopPtoD2, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, PopB, PopP2, AvrBs3, XopD y AvrXv3. Las proteínas efectoras de T3SS igualmente más preferidas o fragmentos N-terminales de las mismas se seleccionan del grupo que consiste en SopE, SptP, SteA, SifB, SopB, IpgB1, IpgD, YopJ, YopH, EspF, OspF, ExoS, YopO, YopP, YopE, YopT, de las cuales las proteínas efectoras T3SS igualmente muy preferidas o sus fragmentos N-terminales se seleccionan del grupo que consiste en IpgB1, SopE, SopB, SptP, SteA, SifB, OspF, IpgD, YopH, YopO, YopP, YopE y YopT, en particular SopE, SteA o YopE o un fragmento N-terminal de las mismas, más concretamente SteA o YopE o un fragmento N-terminal de las mismas, lo más concretamente YopE o un fragmento N-terminal de la misma. En algunas realizaciones, la señal de suministro de la proteína efectora de T3SS bacteriano codificada por la primera secuencia de ADN comprende la proteína efectora de T3SS bacteriano o un fragmento N-terminal de la misma, donde el fragmento N-terminal de la misma incluye al menos los primeros 10, preferiblemente al menos los primeros 20, más preferiblemente al menos los primeros 100 aminoácidos de la proteína efectora de T3SS bacteriano. En algunas realizaciones, la señal de suministro de la proteína efectora de T3SS bacteriano codificada por la primera secuencia de ADN comprende la proteína efectora de T3SS bacteriano o un fragmento N-terminal de la misma, en donde la proteína efectora de T3SS bacteriano o el fragmento N-terminal de la misma comprenden un sitio de unión a chaperona. Las proteínas efectoras de T3SS preferidas o un fragmento N-terminal de las mismas, que comprenden un sitio de unión a chaperona, comprenden las siguientes combinaciones de sitio de unión a chaperona y proteína efectora de T3SS o su fragmento N-terminal: SycE-YopE, InvB-SopE, SicP-SptP, SycT-YopT, SycO-YopO, SycN/YscB-YopN, SycH-YopH, SpcS-ExoS, CesF-EspF, SycD-YopB, SycD-YopD. Son más preferidas SycE-YopE, InvB-SopE, SycT-YopT, SycO-YopO, SycN/YscB-YopN, SycH-YopH, SpcS-ExoS, CesF-EspF. La más preferida es una YopE o un fragmento N-terminal de la misma que comprende el sitio de unión a chaperona de SycE, tal como un fragmento N-terminal de una proteína efectora YopE que contiene los 138 aminoácidos N-terminales de la proteína efectora YopE denominada en la presente memoria YopE1-138 y como se muestra en SEQ ID NO: 2 o una SopE o un fragmento N-terminal de la misma que comprende el sitio de unión a chaperona de InvB tal como un fragmento N-terminal de una proteína efectora SopE que contiene los 81 o 105 aminoácidos N-terminales de la proteína efectora SopE denominada en la presente memoria SopE1-81 o SopE1-105 respectivamente, y como se muestra en SEQ ID NO: 142 o 143.

En una realización de la presente invención, la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante es una cepa de Yersinia y la señal de suministro de la proteína efectora de T3SS bacteriano codificada por la primera secuencia de ADN comprende una proteína efectora YopE o una porción N-terminal, preferiblemente la proteína efectora YopE de Y. enterocolitica o una porción N-terminal de la misma. Preferiblemente, el sitio de unión de SycE está comprendido dentro de la porción N-terminal de la proteína efectora YopE denominada en la presente memoria YopE1-138 y como se muestra en SEQ ID NO: 2 o una SopE o un fragmento N-terminal de la misma que comprende los sitios de unión a chaperona de InvB tal como un fragmento N-terminal de una proteína efectora SopE que contiene los 81 o 105 aminoácidos N-terminales de la proteína efectora SopE denominada en la presente memoria SopE1-81 o SopE1-105 respectivamente, y como se muestra en SEQ ID NO: 142 o 143.

En una realización de la presente invención, la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante es una cepa de Yersinia y la señal de suministro de la proteína efectora de T3SS bacteriano codificada por la primera secuencia de ADN comprende una proteína efectora YopE o una porción N-terminal, preferiblemente la proteína efectora YopE de Y. enterocolitica o una porción N-terminal de la misma. Preferiblemente, el sitio de unión de SycE está comprendido dentro de la porción N-terminal de la proteína efectora YopE. A este respecto, un fragmento N-terminal de una proteína efectora YopE puede comprender los 12, 16, 18, 52, 53, 80 o 138 aminoácidos N-terminales [19-21]. El más preferido es un fragmento N-terminal de una proteína efectora YopE que contiene los 138 aminoácidos N-terminales de la proteína efectora YopE, p. ej., como describen Forsberg y Wolf-Watz [22] denominada en la presente memoria YopE1-138 y como se muestra en SEQ ID NO: 2.

Un experto en la técnica está familiarizado con métodos para identificar las secuencias polipeptídicas de una proteína efectora que son capaces de suministrar una proteína. Por ejemplo, Sory et al. [16] describen uno de tales método. Brevemente, las secuencias de polipéptidos de p. ej., varias porciones de las proteínas Yop se pueden fusionar en marco a una enzima informadora tal como el dominio de adenilato ciclasa activado por calmodulina (o Cya) de la ciclolisina de Bordetella pertussis. El suministro de una proteína híbrida Yop-Cya al citosol de las células eucarióticas está indicado por la aparición de actividad ciclasa en las células eucarióticas infectadas que conduce a la acumulación de AMPc. Empleando tal enfoque, un experto en la técnica puede determinar, si lo desea, el requisito de secuencia mínima, es decir, una secuencia de aminoácidos contigua de la longitud más corta, que es capaz de suministrar una proteína, véase, p. ej., [16]. Por consiguiente, las señales de suministro preferidas de la presente invención consisten en al menos la secuencia mínima de aminoácidos de una proteína efectora de T3SS que es capaz de suministrar una proteína.

En algunas realizaciones, las cepas bacterianas Gram negativas de virulencia atenuada recombinante tienen producción deficiente de al menos una, preferiblemente al menos dos, más preferiblemente al menos tres, incluso más preferiblemente al menos cuatro, en particular al menos cinco, más concretamente al menos seis, lo más concretamente todas las proteínas efectoras bacterianas que son virulentas para las células eucarióticas, es decir, cepas bacterianas Gram negativas de virulencia atenuada recombinante que tienen una producción deficiente de al menos una, preferiblemente al menos dos, más preferiblemente al menos tres, incluso más preferiblemente al menos cuatro, en particular al menos cinco, más concretamente al menos seis, lo más concretamente todas las proteínas efectoras bacterianas funcionales que son virulentas para las células eucarióticas de modo que la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante resultante produce menos proteínas efectoras bacterianas o produce proteínas efectoras bacterianas en menor medida en comparación con la cepa bacteriana Gram negativa de tipo salvaje de virulencia no atenuada, es decir, en comparación con la cepa bacteriana Gram negativa de tipo salvaje que normalmente produce proteínas efectoras bacterianas o de manera que la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante resultante ya no produce ninguna proteína efectora bacteriana funcional que sea virulenta para las células eucarióticas. En algunas realizaciones, las cepas bacterianas Gram negativas de virulencia atenuada recombinante para su uso en un método de tratamiento de un tumor sólido maligno en un sujeto tienen una producción deficiente de todas las proteínas efectoras que son virulentas para las células eucarióticas y la señal de suministro de una proteína efectora bacteriana es la señal de suministro de una proteína efectora de T3SS bacteriano y la proteína heteróloga se selecciona del grupo que consiste en proteínas implicadas en la apoptosis o la regulación de la apoptosis.

De acuerdo con la presente invención, tal cepa bacteriana Gram negativa mutante, es decir, tal cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante que tiene una producción deficiente de al menos una proteína efectora bacteriana que es virulenta para las células eucarióticas, p. ej., tal cepa de Yersinia mutante se puede generar introduciendo al menos una mutación en al menos un gen que codifica el efector. Preferiblemente, tales genes que codifican efectores incluyen YopE, YopH, YopO/YpkA, YopM, YopP/YopJ y YopT por lo que respecta a la cepa de Yersinia. Preferiblemente, tales genes que codifican efectores incluyen AvrA, CigR, GogB, GtgA, GtgE, PipB, SifB, SipA/SspA, SipB, SipC/SspC, SipD/SspD, SlrP, SopB/SigD, SopA, SpiC/SsaB, SseB, SseC, SseD, SseF, SseG, Ssel/SrfH, SopD, SopE, SopE2, SspH1, SspH2, PipB2, SifA, SopD2, SseJ, SseK1, SseK2, SseK3, SseL, SteC, SteA, SteB, SteD, SteE, SpvB, SpvC, SpvD, SrfJ, SptP, por lo que respecta a la cepa de Salmonela. Lo más preferiblemente, se eliminan todos los genes que codifican efectores. El experto en la técnica puede emplear cualquier número de técnicas convencionales para generar mutaciones en estos genes efectores de T3SS. Sambrook et al. describen en general tales técnicas. Véase Sambrook et al. [23]. De acuerdo con la presente invención, la mutación se puede generar en la región promotora de un gen que codifica un efector de modo que se suprima la expresión de dicho gen efector. La mutación también se puede generar en la región codificante de un gen que codifica el efector de manera que se suprima la actividad catalítica de la proteína efectora codificada. La "actividad catalítica" de una proteína efectora se refiere normalmente a la función anti-célula diana de una proteína efectora, es decir, toxicidad. Tal actividad está gobernada por los motivos catalíticos en el dominio catalítico de una proteína efectora. Los enfoques para identificar el dominio catalítico y/o los motivos catalíticos de una proteína efectora son bien conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, [24,25]. Por consiguiente, una mutación preferida de la presente invención es una deleción del dominio catalítico completo. Otra mutación preferida es una mutación con desplazamiento del marco en un gen que codifica el efector, de manera que el dominio catalítico no está presente en el producto proteico expresado a partir de dicho gen "con desplazamiento de marco". La mutación más preferida es una mutación con la deleción de toda la región codificante de la proteína efectora. La presente invención también contempla otras mutaciones, tales como pequeñas deleciones o sustituciones de pares de bases, que se generan en los motivos catalíticos de una proteína efectora que conducen a la destrucción de la actividad catalítica de una proteína efectora dada. Las mutaciones que se generan en los genes de las proteínas efectoras bacterianas funcionales pueden introducirse en la cepa concreta mediante varios métodos. Uno de tales métodos implica la clonación de un gen mutado en un vector "suicida" que es capaz de introducir la secuencia mutada en la cepa mediante intercambio alélico. Un ejemplo de tal vector "suicida" se describe en [26]. De esta manera, las mutaciones generadas en múltiples genes pueden introducirse sucesivamente en una cepa bacteriana Gram negativa dando lugar a polimutantes, por ejemplo, una cepa recombinante mutante séxtuple. El orden en el que se introducen estas secuencias mutadas no es importante. En algunas circunstancias, se puede desear mutar solo algunos, pero no todos, los genes efectores. En consecuencia, la presente invención contempla adicionalmente polimutantes de Yersinia que no sea mutante séxtuple de Yersinia, p. ej., cepas mutantes dobles, mutantes triples, mutantes cuádruples y mutantes quíntuples. Con el fin de suministrar proteínas, el sistema de secreción y translocación de la cepa mutante actual debe estar intacto. Una cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante preferida de la presente invención es una cepa mutante séxtuple de Yersinia en la que todos los genes que codifican efectores están mutados de manera que la Yersinia resultante ya no produce proteínas efectoras funcionales. Tal cepa de Yersinia mutante séxtuple se denomina AyopH, O, P, E, M, T para Y. enterocolitica. Como ejemplo, tal mutante séxtuple se puede producir a partir de la cepa MRS40 de Y. enterocolitica que da lugar a Y. enterocolitica MRS40 AyopH, O, P, E, M, T, (también denominada Y. enterocolitica subsp. palearctica MRS40 AyopH, O, P, E, M, T en la presente memoria) que se prefiere. Igualmente preferida es Y. enterocolitica MRS40 AyopH, O, P, E, M, T Aasd (también denominada Y. enterocolitica subsp. palearctica MRS40 AyopH, O, P, E, M, T Aasd en la presente memoria).

Los vectores que se pueden utilizar de acuerdo con la invención para transformar una cepa bacteriana Gram negativa dependen de las cepas bacterianas Gram negativas utilizadas como es conocido por el experto en la técnica. El promotor, la proteína heteróloga y el sitio de escisión de la proteasa como se describen en la presente memoria se pueden utilizar para el vector de la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante. Los vectores que se pueden utilizar de acuerdo con la invención incluyen vectores de expresión (incluidas versiones sintéticas o generadas de otro modo modificadas de plásmidos de virulencia endógenos), vectores para la inserción cromosómica o de plásmidos de virulencia y fragmentos de ADN para la inserción cromosómica o de plásmidos de virulencia. Los vectores de expresión que son útiles, p. ej., en cepas de Yersinia, Escherichia, Salmonella o Pseudomonas son, p. ej., plásmidos pUC, pBad, pACYC, pUCP20 y pET. Los vectores para la inserción cromosómica o de plásmidos de virulencia que son útiles, p. ej., en cepas de Yersinia, Escherichia, Salmonella o Pseudomonas son, p. ej., pKNG101. Los fragmentos de ADN para la inserción cromosómica o de plásmidos de virulencia se refieren a métodos utilizados, p. ej., en cepas de Yersinia, Escherichia, Salmonella o Pseudomonas como, p. ej., ingeniería genética lambda-red. Los vectores para la inserción cromosómica o de plásmidos de virulencia o los fragmentos de ADN para la inserción cromosómica o de plásmidos de virulencia pueden insertar la primera, segunda y/o tercera secuencias de ADN de la presente invención de modo que la primera, segunda y/o tercera secuencias de ADN estén conectadas operablemente a un promotor endógeno de la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante. Por lo tanto, si se utilizan un vector para la inserción cromosómica o de plásmidos de virulencia o un fragmento de ADN para la inserción cromosómica o de plásmidos de virulencia, se puede codificar un promotor endógeno en el ADN bacteriano endógeno (ADN cromosómico o plasmídico) y solo la primera y la segunda secuencias de ADN serán proporcionadas por el vector modificado genéticamente para la inserción cromosómica o de plásmidos de virulencia o fragmento de ADN para la inserción cromosómica o de plásmidos de virulencia. Alternativamente, si se utiliza un vector para la inserción cromosómica o de plásmidos de virulencia o una molécula de nucleótidos tal como, p. ej., una secuencia de ADN para la inserción cromosómica o de plásmidos de virulencia, pueden ser codificados un promotor endógeno y la señal de suministro de una proteína efectora bacteriana en el ADN bacteriano endógeno (ADN cromosómico o plasmídico) y solo la molécula de nucleótido, tal como p. ej., una secuencia de ADN que codifica la proteína heteróloga será proporcionada por un vector para la inserción cromosómica o de plásmidos de virulencia o por una molécula de nucleótidos tal como, p. ej., una secuencia de ADN para la inserción cromosómica o de plásmidos de virulencia. Por tanto, no es necesario que un promotor esté comprendido por el vector utilizado para la transformación de las cepas bacterianas Gram negativas de virulencia atenuada recombinantes, es decir, las cepas bacterianas Gram negativas de virulencia atenuada recombinantes de la presente invención pueden ser transformadas con un vector cuya dosis no comprende un promotor. En una realización preferida, el vector de la presente invención comprende en la dirección 5' a 3':

Un vector preferido, p. ej., un vector de expresión preferido para Yersinia se selecciona del grupo que consiste en pBad_Si_1 y pBad_Si_2. pBad_Si2 se construyó mediante la clonación de SycE-fragmento YopEi-138 que contiene promotores endógenos para YopE y SycE de pYV40 purificado en el sitio Kpnl/HindIII de pBad-MycHisA (Invitrogen). Las modificaciones adicionales incluyen la eliminación del fragmento NcoI/BglII de pBad-MycHisA por digestión, tratamiento del fragmento de Klenow y religación. Adicionalmente, en el extremo 3’ de YopE1-138 se añadieron los siguientes sitios de escisión: XbaI-XhoI-BstBI-(HindIII). pBad_Si1 es igual a pBad_Si2, pero codifica EGFP amplificado a partir de pEGFP-C1 (Clontech) en el sitio NcoI/BglII bajo el promotor inducible por arabinosa. Igualmente preferido es el uso de versiones modificadas del plásmido de virulencia endógeno de Yersinia pYV que codifica proteínas heterólogas como fusiones a una secuencia señal de T3SS. Un vector preferido, p. ej., un vector de expresión preferido para Salmonela se selecciona del grupo que consiste en pSi_266, pSi_267, pSi_268 y pSi_269. Los plásmidos pSi_266, pSi_267, pSi_268 y pSi_269 que contienen el promotor endógeno correspondiente y el fragmento SteA1-20 (pSi_266), la secuencia SteA completa (pSi_267), el fragmento SopE1-81 (pSi_268) o el fragmento SopE1-105 (pSi_269) se amplificaron a partir de ADN genómico de S. entérica SL1344 y se clonaron en el sitio NcoI/KpnI de pBad-MycHisA (Invitrogen). Los vectores de la presente invención pueden incluir otros elementos de secuencia tales como una secuencia de terminación 3’ (que incluye un codón de parada y una secuencia poli A), o un gen que confiere una resistencia al fármaco que permite la selección de transformantes que han recibido el presente vector. Los vectores de la presente invención pueden transformarse mediante varios métodos conocidos en cepas bacterianas Gram negativas de virulencia atenuada recombinante. Para el propósito de la presente invención, los métodos de transformación para introducir un vector incluyen, pero no se limitan a, electroporación, transformación mediada por fosfato de calcio, conjugación o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, un vector se puede transformar en una primera cepa de bacterias mediante un procedimiento de electroporación convencional. Posteriormente, tal vector se puede transferir de la primera cepa de bacterias a la cepa deseada por conjugación, un proceso también denominado "movilización". El transformante (es decir, las cepas bacterianas Gram negativas que han absorbido el vector) puede seleccionarse, por ejemplo, con antibióticos. Estos mecanismos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, [16].

De acuerdo con la presente invención, el promotor del vector de la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante de la invención puede ser un promotor nativo de una proteína efectora de T3SS de la cepa respectiva o una cepa bacteriana compatible o un promotor utilizado en vectores expresión que son útiles, p. ej., en cepas de Yersinia, Escherichia, Salmonella o Pseudomonas, p. ej., pUC y pBad. Tales promotores son el promotor T7, el promotor Plac o el promotor Ara-bad inducible por arabinosa. Si la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante es una cepa de Yersinia el promotor puede ser de un gen virulón de Yersinia. Un "gen virulón de Yersinia" se refiere a genes en el plásmido pYV de Yersinia, cuya expresión está controlada tanto por la temperatura como por el contacto con una célula diana. Tales genes incluyen genes que codifican elementos de la maquinaria de secreción (los genes Ysc), genes que codifican translocadores (YopB, YopD y LcrV), genes que codifican elementos de control (YopN, TyeA y LcrG), genes que codifican chaperonas efectoras de T3SS (SycD, SycE, SycH, SycN, SycO y SycT) y genes que codifican los efectores (YopE, YopH, YopO/YpkA, YopM, YopT y YopP/Yopj), así como otras proteínas codificadas por pYV como VirF y YadA. En una realización preferida de la presente invención, el promotor es el promotor nativo de un gen que codifica el efector funcional de T3SS. Si la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante es una cepa de Yersinia el promotor se selecciona entre uno cualquiera de YopE, YopH, YopO/YpkA, YopM y YopP/YopJ. Más preferiblemente, el promotor es de YopE o SycE. Si la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante es una cepa de Salmonela el promotor puede ser de la isla de patogenicidad Spil o Spill o de una proteína efectora codificada en otro lugar. Tales genes incluyen genes que codifican elementos de la maquinaria de secreción, genes que codifican translocadores, genes que codifican elementos de control, genes que codifican chaperonas efectoras de T3SS y genes que codifican efectores, así como otras proteínas codificadas por SPI-1 o SPI-2. En una realización preferida de la presente invención, el promotor es el promotor nativo de un gen que codifica el efector funcional de T3SS. Si la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante es una cepa de Salmonela el promotor se selecciona entre una cualquiera de las proteínas efectoras. Más preferiblemente, el promotor es de SopE, InvB o SteA.

En una realización de la presente invención, el vector, p. ej., el vector de expresión, comprende una secuencia de ADN que codifica un sitio de escisión de proteasa. La generación de un sitio de escisión funcional y generalmente aplicable permite escindir la señal de suministro después de la translocación. Puesto que la señal de suministro puede interferir en la localización y/o función correctas de la proteína translocada dentro de las células diana, la introducción de un sitio de escisión de proteasa entre la señal de suministro y la proteína de interés proporciona por primera vez el suministro de proteínas casi nativas a células eucarióticas. Preferiblemente, el sitio de escisión de la proteasa es un motivo de aminoácido que es escindido por una proteasa o los dominios catalíticos de la misma seleccionados del grupo que consiste en enteroquinasa (cadena ligera), enteropeptidasa, proteasa PreScission, proteasa de rinovirus humano 3C, proteasa TEV, proteasa TVMV, proteasa FactorXa y trombina, más preferiblemente un motivo de aminoácido que es escindido por la proteasa TEV. Igualmente preferible, el sitio de escisión de la proteasa es un motivo de aminoácidos que es escindido por una proteasa o los dominios catalíticos de la misma seleccionados del grupo que consiste en enteroquinasa (cadena ligera), enteropeptidasa, proteasa PreScission, proteasa 3C de rinovirus humano, proteasa TEV, proteasa TVMV, proteasa FactorXa, proteasa de procesamiento de ubiquitina, enzimas denominadas desubiquitinantes y trombina. El más preferido es un motivo de aminoácidos que se escinde por la proteasa TEV o por una proteasa de procesamiento de ubiquitina. Por tanto, en una realización adicional de la presente invención, la proteína heteróloga se escinde de la señal de suministro de una proteína efectora de T3SS bacteriano mediante una proteasa. Los métodos preferidos de escisión son métodos en donde:

a) la proteasa se transloca a la célula eucariótica por una cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante como se describe en la presente memoria que expresa una proteína de fusión que comprende la señal de suministro de la proteína efectora de T3SS bacteriano y la proteasa como proteína heteróloga; o

b) la proteasa se expresa de forma constitutiva o transitoria en la célula eucariótica.

Usualmente, la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante utilizada para suministrar una proteína deseada a una célula eucariótica y la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante que transloca la proteasa a la célula eucariótica son diferentes.

En una realización de la presente invención, el vector comprende una secuencia de ADN adicional que codifica una molécula marcadora o un sitio aceptor para una molécula marcadora. La secuencia de ADN adicional que codifica una molécula marcadora o un sitio aceptor para una molécula marcadora normalmente se fusiona al extremo 5' o al extremo 3' de la segunda secuencia de ADN. Una molécula marcadora preferida o un sitio aceptor para una molécula marcadora se selecciona del grupo que consiste en proteína fluorescente verde mejorada (EGFP), cumarina, sitio aceptor de cumarina ligasa, resorufina, sitio aceptor de resorufina ligasa, el motivo tetra-cisteína en uso con colorante FlAsH/ReAsH (Life Technologies). La más preferido es resorufina y un sitio aceptor de resorufina ligasa o EGFP. El uso de una molécula marcadora o un sitio aceptor para una molécula marcadora conducirá a la unión de una molécula marcadora a la proteína heteróloga de interés, que a continuación, se suministrará tal cual a la célula eucariótica y permitirá el seguimiento de la proteína, p. ej., mediante microscopía de células vivas.

En una realización de la presente invención, el vector comprende una secuencia de ADN adicional que codifica una etiqueta peptídica. La secuencia de ADN adicional que codifica una etiqueta peptídica se fusiona usualmente al extremo 5' o al extremo 3' de la segunda secuencia de ADN. Una etiqueta peptídica preferida se selecciona del grupo que consiste en etiqueta Myc, etiqueta His, etiqueta Flag, etiqueta HA, etiqueta Strep o etiqueta V5 o una combinación de dos o más etiquetas de estos grupos. Las más preferidas son etiqueta Myc, etiqueta Flag, etiqueta His y etiquetas Myc e His combinadas. El uso de una etiqueta peptídica conducirá a la trazabilidad de la proteína etiquetada, p. ej., mediante inmunofluorescencia o transferencia de Western utilizando anticuerpos anti-etiqueta. Adicionalmente, el uso de una etiqueta peptídica permite la purificación por afinidad de la proteína deseada, ya sea después de la secreción al sobrenadante del cultivo o después de la translocación a células eucarióticas, en ambos casos utilizando un método de purificación adecuado a la etiqueta correspondiente (p. ej., purificación por afinidad de quelatos metálicos en el uso con una etiqueta His o una purificación basada en anticuerpos anti-Flag en el uso con la etiqueta Flag).

En una realización de la presente invención, el vector comprende una secuencia de ADN adicional que codifica una señal de localización nuclear (NLS). La secuencia de ADN adicional que codifica una señal de localización nuclear (NLS) usualmente se fusiona al extremo 5' o al extremo 3' de la segunda secuencia de ADN, en donde dicha secuencia de ADN adicional codifica una señal de localización nuclear (NLS). Una NLS preferida se selecciona del grupo que consiste en NLS de antígeno T grande de SV40 y sus derivados [27], así como otras NLS virales. La más preferida es la NLS del antígeno T grande de SV40 y sus derivados.

En una realización de la presente invención, el vector comprende un sitio de clonación múltiple. El sitio de clonación múltiple se encuentra usualmente en el extremo 3’ de la primera secuencia de ADN y/o en el extremo 5' o el extremo 3’ de la segunda secuencia de ADN. El vector puede comprender uno o más de un sitio de clonación múltiple. Un sitio de clonación múltiple preferido se selecciona del grupo de enzimas de restricción que consiste en Xhol, Xbal, HindlII, Ncol, Notl, EcoRI, EcoRV, BamHI, Nhel, SacI, Salí, BstBI. Los más preferidos son Xbal, Xhol, BstBI y HindlII.

La proteína fusionada expresada a partir de la primera y segunda y opcionalmente tercera secuencias de ADN del vector también se denomina "proteína de fusión" o "proteína híbrida", es decir, una proteína fusionada o híbrido de señal de suministro y una proteína heteróloga. La proteína de fusión también puede comprender p. ej., una señal de suministro y dos o más proteínas heterólogas diferentes.

La presente invención contempla métodos para suministrar proteínas heterólogas como se describió anteriormente a las células de un tumor sólido maligno. Las proteínas se pueden suministrar, es decir, translocar a la célula de un tumor sólido maligno en el momento de administrar la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante a un sujeto o se pueden suministrar, es decir, translocar a la célula de un tumor sólido maligno en un momento posterior, p.ej., después de que la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante haya alcanzado el sitio del tumor sólido maligno y/o haya alcanzado el sitio del tumor sólido maligno y se haya replicado como se describió anteriormente. El tiempo de suministro se puede regular, p. ej., por medio del promotor utilizado para expresar las proteínas heterólogas en la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante. En el primer caso, un promotor constitutivo o, más preferiblemente, un promotor endógeno de una proteína efectora bacteriana podrían impulsar la proteína heteróloga. En el caso del suministro retardado de proteínas, un promotor inducible artificialmente, como el promotor inducible por arabinosa, podría impulsar la proteína heteróloga. En este caso, la arabinosa se administrará a un sujeto una vez que las bacterias hayan alcanzado y se hayan acumulado en el sitio deseado. A continuación, la arabinosa inducirá la expresión bacteriana de la proteína que se vaya a suministrar.

Por tanto, en una realización, el método para suministrar proteínas heterólogas a células de un tumor sólido maligno comprende

i) cultivar la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante como se describe en la presente memoria;

ii) poner en contacto una célula de un tumor sólido maligno con la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante de i) en donde una proteína de fusión que comprende una señal de suministro de una proteína efectora bacteriana y la proteína heteróloga es expresada por la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante y es translocada a la célula de un tumor sólido maligno; y opcionalmente

iii) escindir la proteína de fusión de modo que la proteína heteróloga se escinda de la señal de suministro de la proteína efectora bacteriana dentro de la célula de un tumor sólido maligno.

En algunas realizaciones, al menos dos proteínas de fusión que comprenden cada una una señal de suministro de una proteína efectora bacteriana y una proteína heteróloga se expresan mediante la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante y se translocan a la célula eucariótica mediante los métodos de la presente invención.

La cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante se puede cultivar de modo que se exprese una proteína de fusión que comprenda la señal de suministro de la proteína efectora bacteriana y la proteína heteróloga según métodos conocidos en la técnica (p. ej., FDA, Bacteriological Analytical Manual (BAM)), Capítulo 8: Yersinia enterocolitica). Preferiblemente, la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante se puede cultivar en caldo de infusión de Cerebro y Corazón, p. ej., a 28°C. Para la inducción de la expresión de T3SS y p. ej., los genes dependientes del promotor YopE/SycE, las bacterias se pueden cultivar a 37°C.

En una realización, la célula de un tumor sólido maligno se pone en contacto con dos cepas bacterianas Gram negativas de virulencia atenuada recombinante de i), en donde la primera cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante expresa una primera proteína de fusión que comprende la señal de suministro de la proteína efectora de T3SS bacteriano y una primera proteína heteróloga y la segunda cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante expresa una segunda proteína de fusión que comprende la señal de suministro de la proteína efectora bacteriana y una segunda proteína heteróloga, de modo que la primera y la segunda proteína de fusión se translocan a la célula de un tumor sólido maligno. Esta realización proporcionó la infección conjunta de, p. ej., una célula de un tumor sólido maligno con dos cepas bacterianas como método válido para administrar, p. ej., dos proteínas híbridas diferentes a células individuales para abordar su interacción funcional.

Los expertos en la técnica también pueden utilizar varios ensayos para determinar si el suministro de una proteína de fusión es satisfactorio. Por ejemplo, la proteína de fusión puede detectarse mediante inmunofluorescencia utilizando anticuerpos que reconocen una etiqueta fusionada (como una etiqueta Myc). La determinación también puede basarse en la actividad enzimática de la proteína que se está suministrando, p. ej., el ensayo descrito por [16].

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante para su uso en un método de tratamiento de un tumor sólido maligno en un sujeto, en donde la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante se acumula en el tumor sólido maligno.

Las bacterias Gram negativas de virulencia atenuada recombinantes pueden combinarse para una administración conveniente y eficaz en una cantidad que sea suficiente para tratar al sujeto en forma de una composición farmacéutica con un portador farmacéuticamente aceptable adecuado. Una forma de dosificación unitaria de las bacterias Gram negativas de virulencia atenuada recombinantes o de la composición farmacéutica que se va a administrar puede contener, por ejemplo, las bacterias Gram negativas de virulencia atenuada recombinantes en una cantidad de aproximadamente 105 a aproximadamente 109 bacterias por ml, preferiblemente de aproximadamente 106 a aproximadamente 108 bacterias por ml, más preferiblemente de aproximadamente 107 a aproximadamente 108 bacterias por ml, lo más preferiblemente aproximadamente 108 bacterias por ml.

Por "cantidad que es suficiente para tratar al sujeto" o "cantidad eficaz" que se utilizan en la presente memoria indistintamente se entiende que es una cantidad de bacteria o bacterias, lo suficientemente alta para modificar significativamente de manera positiva la afección que se vaya a tratar, pero lo suficientemente baja para evitar efectos secundarios graves (con una razón beneficio/riesgo razonable), dentro del alcance del buen juicio médico. La cantidad eficaz de una bacteria variará con el objetivo particular que se vaya a alcanzar, la edad y la condición física del sujeto que se esté tratando, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia concurrente y la bacteria específica empleada. Por tanto, la cantidad eficaz de bacteria será la cantidad mínima que proporcionará el efecto deseado. Usualmente, se administra al sujeto una cantidad de aproximadamente 105 a aproximadamente 109 bacterias, p. ej., de aproximadamente 105 a aproximadamente 109 bacterias/m2 de superficie corporal, preferiblemente de aproximadamente 106 a aproximadamente 108 bacterias, p. ej., de aproximadamente 106 a aproximadamente 108 bacterias/m2 de superficie corporal, más preferiblemente de aproximadamente 107 a aproximadamente 108 bacterias, p. ej., de aproximadamente 107 a aproximadamente 108 bacterias/m2 de superficie corporal, lo más preferiblemente 108 bacterias, p. ej., 108 bacterias/m2 de superficie corporal.

Una dosis única de la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante para administrar a un sujeto, p. ej., a un ser humano para tratar un tumor sólido maligno es usualmente de aproximadamente 104 a aproximadamente 1010 bacterias, p. ej., de aproximadamente 104 bacterias/m2 de superficie corporal a aproximadamente 1010 bacterias/m2 de superficie corporal, preferiblemente de aproximadamente 105 a aproximadamente 109 bacterias, p. ej., de aproximadamente 105 a aproximadamente 109 bacterias/m2 de superficie corporal, más preferiblemente de aproximadamente 106 a aproximadamente 108 bacterias, p. ej., de aproximadamente 106 a aproximadamente 108 bacterias/m2 de superficie corporal, incluso más preferiblemente de aproximadamente 107 a aproximadamente 108 bacterias, p. ej., de aproximadamente 107 a aproximadamente 108 bacterias/m2 de superficie corporal, lo más preferiblemente 108 bacterias, p. ej., 108 bacterias/m2 de superficie corporal de bacterias Gram negativas de virulencia atenuada recombinantes totales.

Los ejemplos de sustancias que pueden servir como portadores farmacéuticos son azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetatos de celulosa; tragancanto en polvo; malta; gelatina; talco; ácidos esteáricos; estearato de magnesio; sulfato de calcio; carbonato de calcio; aceites vegetales, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de teobroma; polioles tales como propilenglicol, glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; agar; ácidos algínicos; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; extractos de arándano y solución tampón de fosfato; leche desnatada en polvo; así como otras sustancias compatibles no tóxicas utilizadas en formulaciones farmacéuticas tales como vitamina C, estrógenos y equinácea, por ejemplo. También pueden estar presentes agentes humectantes y lubricantes tales como laurilsulfato de sodio, así como agentes colorantes, agentes aromatizantes, lubricantes, excipientes, agentes de formación de comprimidos, estabilizadores, antioxidantes y conservantes.

Los modos de administración de las bacterias Gram negativas de virulencia atenuada recombinantes a un sujeto se pueden seleccionar del grupo que consiste en administración intravenosa, intratumoral, intraperitoneal y peroral. Aunque no se pretende que esta invención esté limitada a ningún modo particular de aplicación, se prefiere la administración intravenosa o intratumoral de las bacterias o las composiciones farmacéuticas. Dependiendo de la ruta de administración, se puede requerir que los ingredientes activos que comprenden bacterias estén recubiertos con un material para proteger dichos organismos de la acción de enzimas, ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar dichos organismos. Con el fin de administrar bacterias mediante una administración distinta a la parenteral, estos se deben recubrir o administrar con un material para evitar la inactivación. Por ejemplo, las bacterias pueden administrarse conjuntamente con inhibidores de enzimas o en liposomas. Los inhibidores de enzimas incluyen inhibidor de tripsina pancreática, diisopropilfluorofosfato (DFP) y trasilol. Los liposomas incluyen emulsiones P40 de agua en aceite en agua así como liposomas convencionales y diseñados específicamente que transportan bacterias, tales como Lactobacillus, o sus subproductos a una diana interna de un sujeto anfitrión. Una bacteria se puede administrar sola o en conjunto con una segunda bacteria diferente. Se puede utilizar en conjunto cualquier número de bacterias diferentes. Por "en conjunto con" se entiende juntos, sustancialmente de forma simultánea o secuencial. Las composiciones también se pueden administrar en forma de comprimido, píldora o cápsula, por ejemplo, tal como una cápsula liofilizada que comprende las bacterias o las composiciones farmacéuticas de la presente invención o como una solución congelada de bacterias o las composiciones farmacéuticas de la presente invención que contienen DMSO o glicerol. Otra forma de aplicación preferida implica la preparación de una cápsula liofilizada de las bacterias o las composiciones farmacéuticas de la presente invención. Otra forma de aplicación preferida más implica la preparación de una cápsula secada con calor de las bacterias o las composiciones farmacéuticas de la presente invención.

Las bacterias Gram negativas de virulencia atenuada recombinantes o la composición farmacéutica que se va a administrar se pueden administrar mediante inyección. Las formas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando sean solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una fácil jeringabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión. En muchos casos será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede producir mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

En algunas realizaciones de la presente invención, la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante se administra conjuntamente con un sideróforo al sujeto. Se prefieren estas realizaciones. Los sideróforos que se pueden administrar conjuntamente son sideróforos que incluyen hidroxamato, catecolato y sideróforos de ligandos mixtos. Los sideróforos preferidos son Deferoxamina (también conocida como deferrioxamina B, desferoxamina B, DFO-B, DFOA, DFB o desferal), Desferrioxamina E, Deferasirox (Exjade, Desirox, Defrijet, Desifer) y Deferiprona (Ferriprox), es más preferida la Deferoxamina. La deferoxamina es un sideróforo bacteriano producido por la Actinobacteria Streptomyces pilosus y está disponible comercialmente, p. ej., en Novartis Pharma Schweiz AG (Suiza). La administración conjunta con un sideróforo puede ser antes, simultáneamente o después de la administración de la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante. Preferiblemente, se administra un sideróforo antes de la administración de cepas bacterianas Gram negativas de virulencia atenuada recombinantes, más preferiblemente se administra al menos 1 hora, preferiblemente al menos 6 horas, más preferiblemente al menos 12 horas, en particular al menos 24 horas antes de la administración de la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante al sujeto. En una realización particular, el sujeto se pretrata con desferoxamina 24 h antes de la infección con la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante para permitir el crecimiento bacteriano. Usualmente, se administra conjuntamente un sideróforo en una sola dosis de aproximadamente 0,5 x 10-5 Moles a aproximadamente 1x10-3 Moles, más preferiblemente de aproximadamente 1x10-5 Moles a aproximadamente 1x10-4 Moles, preferiblemente de aproximadamente 3,5x10-5 Moles a aproximadamente 1,1x10-4 Moles por kg de peso corporal. Usualmente, la desferoxamina se administra conjuntamente en una sola dosis de aproximadamente 20 mg a aproximadamente 60 mg, preferiblemente de aproximadamente 20 mg a aproximadamente 60 mg por kg de peso corporal. Los regímenes de dosificación de la administración de la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante o la composición farmacéutica descrita en la presente memoria variarán con el objetivo particular que se debe alcanzar, la edad y condición física del sujeto que está siendo tratado, la duración del tratamiento, la naturaleza de terapia concurrente y la bacteria específica empleada, como conoce el experto en la técnica. La cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante se administra usualmente al sujeto de acuerdo con un régimen de dosificación que consiste en una dosis única cada 2-20 días, preferiblemente cada 6-10 días, más preferiblemente cada 7-9 días, preferiblemente de acuerdo con un régimen de dosificación que consiste en una dosis única cada 2-8 semanas, preferiblemente cada 2-6 semanas, más preferiblemente cada 3-4 semanas. El período de administración es usualmente de aproximadamente 20 a aproximadamente 60 días, preferiblemente de aproximadamente 30 a 40 días. Alternativamente, el período de administración es usualmente de aproximadamente 8 a aproximadamente 32 semanas, preferiblemente de aproximadamente 8 a aproximadamente 24 semanas, más preferiblemente de aproximadamente 12 a aproximadamente 16 semanas.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un kit para tratar tumores sólidos malignos, preferiblemente en seres humanos. Tales kits generalmente comprenderán la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante o la composición farmacéutica descrita en la presente memoria, y las instrucciones para utilizar el kit. En algunas realizaciones, los kits incluyen un portador, paquete o recipiente que está compartimentado para recibir uno o más recipientes tales como viales, tubos y similares, cada uno de los recipientes incluye uno de los elementos separados que se utilizarán en un método descrito en la presente memoria. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas y tubos de ensayo. En otras realizaciones, los recipientes se forman a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico.

Ejemplos

Ejemplo 1:

A) Materiales y métodos

Cepas y condiciones de crecimiento bacteriano. Las cepas utilizadas en este estudio se enumeran en las Fig. 14A a N. Se cultivaron de forma rutinaria E. co liTop 10, utilizada para la purificación y clonación de plásmidos, y E. co liSm10 A pir, utilizada para la conjugación, así como E. coli BW19610 [28], utilizada para propagar pKNG101, sobre placas de agar LB y en caldo LB a 37°C. Se utilizó ampicilina a una concentración de 200 pg/ml (Yersinia) o 100 pg/ml (E. coli) para seleccionar vectores de expresión. Se utilizó estreptomicina a una concentración de 100 pg/ml para seleccionar vectores suicidas. Se cultivaron de forma rutinaria Y. enterocolitica MRS40 (O:9, biotipo 2) [17], un derivado de E40 no resistente a ampicilina [16] y las cepas derivadas del mismo en infusión de Cerebro y Corazón (BHI; Difco) a temperatura ambiente. A todas las cepas de Y. enterocolitica se les añadió ácido Nalidíxico (35 pg/ml) y todas las cepas de Y. enterocolitica asdse complementaron adicionalmente con 100 pg/ml de ácido meso-2,6-Diaminopimélico (mDAP, Sigma Aldrich). Se cultivó S. enterica SL1344 de forma rutinaria sobre placas de agar LB y en caldo LB a 37°C. Se utilizó ampicilina a una concentración de 100 pg/ml para seleccionar los vectores de expresión en S. enterica.

Manipulaciones genéticas de Y. enterocolitica. Las manipulaciones genéticas de Y. enterocolitica ha sido descritas [29,30]. Brevemente, se construyeron mutadores para la modificación o deleción de genes en los plásmidos pYV o en el cromosoma mediante PCR solapante de 2 fragmentos utilizando el plásmido pYV40 purificado o ADN genómico como molde, lo que conduce a 200-250 pb de secuencias flanqueantes en ambos lados de la porción suprimida o modificada del gen respectivo. Los fragmentos resultantes se clonaron en pKNG101 [26] en E. co liBW19610 [28]. Los plásmidos de secuencia verificada se transformaron en E. co liSm10 A pir, desde donde se movilizaron los plásmidos a la correspondiente cepa de Y. enterocolitica. Los mutantes que portaban el vector integrado se propagaron durante varias generaciones sin presión de selección. A continuación, se utilizó sacarosa para seleccionar los clones que habían perdido el vector. Finalmente, los mutantes se identificaron mediante PCR de colonias. Los mutantes específicos (pSi_408, pSi_419) se enumeran en la Tabla III.

Construcción de plásmidos. Se utilizaron el plásmido pBad_Si2 o pBad_Si1 (Fig. 9) para la clonación de proteínas de fusión con los 138 aminoácidos N-terminales de YopE (SEQ ID NO: 2). pBad_Si2 se construyó mediante la clonación de SycE-fragmento YopE1-138 que contenía promotores endógenos para YopE y SycE de pYV40 purificado en el sitio KpnI/HindIII de pBad-MycHisA (Invitrogen). Las modificaciones adicionales incluyen la eliminación del fragmento NcoI/BglII de pBad-MycHisA mediante digestión, tratamiento del fragmento Klenow y religación. Se clonó un terminador transcripcional bidireccional (BBa_B1006; base iGEM) en el sitio de corte KpnI y se trató con Klenow (pBad_ Si2) o en el sitio de corte BglII (pBad_Si1). Adicionalmente en el extremo 3’ de YopE1-138 se añadieron los siguientes sitios de escisión: XbaI-XhoI-BstBI-(HindIII) (Fig. 9 B). pBad_Si1 es igual a pBad_Si2, pero codifica EGFP amplificado a partir de pEGFP-C1 (Clontech) en el sitio NcoI/BglII bajo el promotor inducible por arabinosa. Los plásmidos pSi_266, pSi_267, pSi_268 y pSi_269 que contenían el promotor endógeno correspondiente y el fragmento SteA1-20 (pSi_266), la secuencia SteA completa (pSi_267), el fragmento SopE1-81 (pSi_268) o el fragmento SopE1-105 (pSi_269) se amplificaron a partir de ADN genómico de S. entérica SL1344 y se clonaron en el sitio NcoI/KpnI de pBad-MycHisA (Invitrogen).

Los genes completos o fragmentos de los mismos se amplificaron con los cebadores específicos enumerados en la Tabla I a continuación y se clonaron como fusiones a YopE1-138 en el plásmido pBad_Si2 o en el caso de z-BIM (SEQ ID NO: 21) en pBad_Si1 (véase la Tabla II a continuación). Para la fusión a SteA o SopE, las construcciones de ADN sintético se escindieron mediante KpnI/HindII y se clonaron en pSi_266, pSi_267, pSi_268 o pSi_269 respectivamente. En el caso de genes de especies bacterianas, se utilizó como molde ADN genómico purificado (S. flexneri M90T, Salmonella entérica subsp. enterica serovar Typhimurium SL1344, Bartonella henselae ATCC 49882). Para los genes humanos, se utilizó una biblioteca de ADNc universal (Clontech) si no se indicaba lo contrario (Figuras 14A a N), los genes de pez cebra se amplificaron a partir de una biblioteca de ADNc (una amable donación de M. Affolter). Los plásmidos ligados se clonaron en E. coli Top10. Los plásmidos secuenciados se sometieron a electroporación en la cepa de Y. enterocolitica o S. enterica deseadas utilizando los ajustes para la electroporación convencional en E. coli.

Tabla I (Cebador Nr. Si_: Secuencia)

285: CATACCATGGGAGTGAGCAAGGGCGAG

286: GGAAGATCTttACTTGTACAGCTCGTCCAT

287: CGGGGTACCTCAACTAAATGACCGTGGTG

288: GTTAAAGCTTttcgaatctagactcgagCGTGGCGAACTGGTC

292: CAGTctcgag CAAATT CT AAACAAAAT ACTTCCAC

293: cagtTTCGAATT AATTT GT ATTGCTTT GACGG

296: CAGT ctcgagACT AACAT AACACT ATCCACCCAG

297: GTT AAAG CTTT CAGGAGG CATT CTGAAG

299: CAGT ctcgagCAGGCCATCAAGT GT GT G

300: cagtTTCGAAT CATTTT CT CTTCCT CTT CTT CA

301: CAGTctcgagGCTGCCATCCGGAA

302: cagtTTCGAATCACAAGACAAGGCACCC

306: GTTAAAGCTTGGAGGCATTCTGAAGatacttatt

307: CAGTctcgag CAAAT ACAGAGCTTCTATCACTCAG

308: GTT AAAGCTTT CAAGAT GT GATT AAT GAAGAAAT G

317: cagtTTCGAACCCAT AAAAAAGCCCT GTC

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87: GTT AAAGCTTT CAAT CGGGGAT GT CT g

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95: GTT AAAGCTTttaTT GAAGATTT GT GGCTCC 504:CGTAtctagaGAAAATCTGTATTTTCAAAGTGAAAATCTGTATTTTCAAAGTATG CCCCGCCCC

05: GTT AAAGCTT CCCACCGT ACT CGT CAA Ttc 508:CGTAtctagaGAAAATCTGTATTTTCAAAGTGAAAATCTGTATTTTCAAAGTATG GCCGAGCCTTG

09: GTT AAAGCTTTT GAAGATTT GTGGCT CCc

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59:GTTAAAGCTTTCATGACTCATTTTCATCCAT

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62:GTTAAAGCTTCTACACCCCCGCATCA

80: catgccatggATTTATGGTCATAGATATGACCTC

85: CAGT ctcgagAT GCAGAT CTT CGT CAAGAC

86: GTTAAAGCTTgctagcttcgaaACCACCACGTAGACGTAAGAC

88: cagtTTCGAAGATTATAAAGATGATGATGATAAAATGGCCGAGCCTTG

12: CGGGGTACCatgaggtagcttatttcctgataaag

13: CGGGGTACCataattgtccaaatagttatggtagc

14: catgccatggCGGCAAGGCTCCTC

15: cggggtaccTTT ATTT GT CAACACT GCCC

16: cggggtaccTGCGGGGTCTTTACTCG

677:TTACTATTCGAAGAAATTATTCATAATATTGCCCGCCATCTGGCCCAAATTGG TGATGAAATGGATCATTAAGCTTGGAGTA

678:TACTCCAAGCTTAATGATCCATTTCATCACCAATTTGGGCCAGATGGCGGGCA AT ATT AT G AAT AATTT CTTCG AAT AGT AA

682:TTACTACTCGAGAAAAAACTGAGCGAATGTCTGCGCCGCATTGGTGATGAAC TGGATAGCTAAGCTTGGAGTA

683:TACTCCAAGCTTAGCTATCCAGTTCATCACCAATGCGGCGCAGACATTCGCTC AGTTTTTTCTC G AGT AGT AA

25: TT ACT ATTCGAAGAAATT ATT CAT AAT ATT GCC

26: T ACT CCAAGCTT ACGGTT GAAT ATT AT GATCCATTTCATCACCAATTT GG

27: TT ACT ATTCGAAGCCGGT GGTGCCGAAGAAATT ATT CAT AAT ATT GCCC

28: TACT CCAAGCTT AAT GATCCATTTC AT CA

33 :TT ACT ACTCGAGGGT GCCAT CGAT GCCGAAGAAATT ATT CAT AAT ATT GCCCG

34 :T ACTCCTT CGAAGGCACCAT GATCCATTTCAT CACCAATTT GG

35 :T ACTCCTT CGAATT AAT GAT CCATTT CAT CACCAATTT G

36:TT ACT ACTCGAGGGT GCCAT CGAT GCCAAAAAACT GAGCGAAT GT CT GCG

37:TACTCCTTCGAAGGCACCGCTATCCAGTTCATCACCAATG

38:TACTCCTTCGAATTAGCTATCCAGTTCATCACCAATG

Tabla II: Proteínas de fusión clonadas

Tabla III: Mutadores para modificación genética

Secreción de Yop. La inducción del regulón de yop se realizó cambiando el cultivo a 37°C en BHI-Ox (condiciones de secreción permisiva) [31]. Como fuente de carbono se añadió glucosa (4 mg/ml). Las fracciones de células totales y sobrenadantes se separaron mediante centrifugación a 20800 g durante 10 min a 4°C. El sedimento celular se tomó como fracción celular total. Las proteínas del sobrenadante se precipitaron con ácido tricloroacético al 10% (p/v) final durante 1 h a 4°C. Después de la centrifugación (20800 g durante 15 min) y la eliminación del sobrenadante, el sedimento resultante se lavó en acetona enfriada con hielo durante la noche. Las muestras se centrifugaron de nuevo, el sobrenadante se descartó y el sedimento se secó al aire y se resuspendió en un colorante de carga 1x SDS. Las proteínas secretadas se analizaron mediante SDS-PAGE; en cada caso, se cargaron las proteínas secretadas por 3 x 108 bacterias por calle. La detección de proteínas secretadas específicas mediante inmunotransferencia se realizó utilizando geles SDS-PAGE al 12,5%. Para la detección de proteínas en células totales, se cargaron 2 x 108 bacterias por calle, si no se indica lo contrario, y las proteínas se separaron en geles de SDS-PAGE al 12,5% antes de la detección por inmunotransferencia.

La inmunotransferencia se llevó a cabo utilizando anticuerpos monoclonales de rata contra YopE (MIPA193 - 13A9; 1:1000, [32]). El antisuero se preabsorbió dos veces durante la noche frente a Y. enterocolitica AHOPEMT asd para reducir la tinción de fondo. La detección se realizó con anticuerpos secundarios dirigidos contra anticuerpos de rata y conjugados con peroxidasa de rábano picante (1:5000; Southern biotech), antes del revelado con sustrato quimioluminiscente ECL (LumiGlo, KPM).

Cultivo celular e infecciones. Se cultivaron células de fibroblastos HeLa Ccl2, swiss 3T3, 4T1, B16F10 y D2A1 en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con un suplemento de FCS al 10% y L-glutamina 2 mM (cDMEM). Las HUVEC se aislaron y cultivaron como se describe [33]. Se cultivaron células Jurkat y 4T1 en RPMI 1640 con un suplemento de FCS al 10% y L-glutamina 2 mM. Las Y. enterocolitica se cultivaron en BHI con aditivos durante la noche a temperatura ambiente, se diluyeron en BHI de nueva aportación a una DO600 de 0,2 y se cultivaron durante 2 horas a RT antes de un cambio de temperatura a un agitador de baño de agua a 37°C durante 30 minutos adicionalmente o durante 1 hora en caso de suministro de EGFP. Finalmente, las bacterias se recogieron por centrifugación (6000 rcf, 30 s) y se lavaron una vez con DMEM con un suplemento de HEPES 10 mM y L-glutamina 2 mM. Las S. enterica se cultivaron en LB con aditivos durante la noche a 37°C y se diluyeron 1:40 en LB de nueva aportación y se cultivaron durante 2,5 h a 37°C (condiciones de inducción de T3SS de Spil) o el cultivo de toda la noche se incubó adicionalmente a 37°C (condiciones de T3SS de Spill). Finalmente, las bacterias se recogieron por centrifugación (6000 rcf, 30 s) y se lavaron una vez con DMEM con un suplemento de HEPES 10 mM y L-glutamina 2 mM. Las células sembradas en placas de 96 pocillos (para inmunofluorescencia) o de 6 pocillos (para transferencia Western) se infectaron a las MOI indicadas en DMEM con un suplemento de HEPES 10 mM y L-glutamina 2 mM. Después de añadir las bacterias, las placas se centrifugaron durante 1 min a 1750 rpm y se colocaron a 37°C durante los períodos de tiempo indicados. Las bacterias extracelulares se destruyeron con gentamicina (100 mg/ml) si estaba indicado. En caso de análisis de inmunofluorescencia, los ensayos de infección se detuvieron mediante la fijación de PFA al 4%. Para el análisis de transferencia Western, las células se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo y se añadió tampón de lisis PhosphoSafe (Novagen) para lisar las células. Después de la incubación sobre hielo, las células se centrifugaron (16000 rcf, 25 min, 4°C). Los sobrenadantes se recolectaron y analizaron para determinar el contenido de proteína total mediante el ensayo Bradford BCA (Pierce) antes de SDS PAGE y transferencia Western utilizando anticuerpo anti-Phospho-Akt (Ser473 y T308, ambos Cell Signalling), anti-Actin (Millipore), Anti-Bid (Cell Signaling), anti-Myc (Santa Cruz), anti-p38 (Cell Signaling), anti-fosfo-p-38 (Thr180/Tyr182; Cell Signaling), anti-Caspase-3 p17 (Cell Signaling) y anti-Ink4C (Cell Signaling).

Transferencia de Western de proteínas translocadas por T3SS a partir de células infectadas. Se infectaron células HeLa en placas de 6 pocillos a una MOI de 100 como se describió anteriormente. En caso de co-infección con la proteasa TEV que se transloca a la cepa de Y. enterocolitica, la DO600 de las cepas se ajustó y las dos suspensiones bacterianas se mezclaron en un tubo a una razón de 1:1 (si no se indica lo contrario) antes de la adición a las células. Al final de la infección, las células se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo y se recogieron raspando en un pequeño volumen de PBS enfriado con hielo. Después de la centrifugación (16000 rcf, 5 min, 4°C), el sedimento se disolvió en digitonina al 0,002% con un suplemento de cóctel inhibidor de proteasa (Roche complete, Roche). Los sedimentos disueltos se incubaron durante 5 minutos sobre hielo y a continuación se centrifugaron (16000 rcf, 25 min, 4°C). Los sobrenadantes se recogieron y analizaron para determinar el contenido de proteína total mediante el ensayo Bradford BCA (Pierce) antes de la SDS PAGE y la transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-Myc (Santa Cruz, 9E11) o anti-Ink4C (Cell Signaling).

Inmunofluorescencia. Las células sembradas en placas de 96 pocillos (Corning) se infectaron como se describió anteriormente y, después de la fijación con PFA al 4%, las células se lavaron tres veces con PBS. A continuación, los pocillos se bloquearon utilizando suero de cabra al 5% en PBS Triton X-100 al 0,3% durante 1 hora a temperatura ambiente. El anticuerpo primario (anti-Myc, Santa Cruz, 1:100) se diluyó en PBS con BSA al 1% y T riton X-100 al 0,3% y las células se incubaron durante la noche a 4°C. Las células se lavaron 4 veces con PBS antes de que se añadiera el anticuerpo secundario (AF 488 anti-ratón, Life Technologies, 1:250) diluido en PBS con BSA al 1% y Triton X-100 al 0,3%. Si fue necesario, se incluyeron tinción de ADN Hoechst (Life Technologies, 1:2500) y/o tinción de actina (Dy647-Phalloidin, DyeOmics). En algunos casos, solo se aplicó la tinción de ADN y/o actina directamente después de lavar el PFA. Las células se incubaron durante 1 hora a RT, se lavaron tres veces con PBS y se analizaron mediante análisis de imágenes automatizado como se describe a continuación.

Microscopía automatizada y análisis de imágenes. Las imágenes se adquirieron automáticamente con un ImageXpress Micro (Molecular Devices, Sunnyvale, EE.UU.). La cuantificación de las intensidades de tinción anti-Myc se realizó utilizando MetaXpress (Molecular Devices, Sunnyvale, EE. UU.). Las regiones dentro de las células que excluyen las regiones nucleares y las regiones que contienen bacterias se eligieron manualmente (círculos con un área de 40 píxeles) y se registró la intensidad media.

Estimulación con TNFa y transferencia Western de phospho-p38. Las células HeLa sembradas en placas de 6 pocillos se infectaron a una MOI de 100 como se describió anteriormente. Se añadió gentamicina p.i. durante 30 min y se añadió TNFa p.i. durante 45 min (10 ng/ml). Se lavaron las células p.i. dos veces 1 h 15 min con PBS enfriado con hielo y se añadió tampón de lisis PhosphoSafe (Novagen) para lisar las células. Después de la incubación sobre hielo, las células se centrifugaron (16000 rcf, 25 min, 4°C). Los sobrenadantes se recogieron y analizaron para determinar el contenido de proteína total mediante el ensayo Bradford BCA (Pierce) antes de la SDS PAGE y la transferencia Western utilizando anticuerpos contra p38 total anti-Phospho-p38, (Cell Signalling) y anticuerpo anti-Actina (Millipore).

Determinación del nivel de AMPc de células HeLa infectadas. Las células HeLa sembradas en placas de 96 pocillos se infectaron como se describió anteriormente. Treinta minutos antes de la infección, se cambió cDMEM por DMEM con un suplemento de HEPES 10 mM y L-glutamina 2 mM y 3-isobutil-1-metilxantina 100 uM (IBMX, Sigma Aldrich). Se añadió gentamicina p.i. durante 60 min y las células se incubaron adicionalmente a 37°C durante otros 90 min. La determinación de AMPc se realizó utilizando un ELISA competitivo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Amersham, cAMP Biotrak, RPN225). Como control positivo, se añadió la cantidad indicada de toxina del cólera (C8052, Sigma Aldrich) durante 1 hora a las células en DMEM con un suplemento de HEPES 10 mM y L-glutamina 2 mM e IBMX 100 uM.

Preparación de muestras para fosfoproteómica. Para cada condición, se cultivaron dos placas de 6 pocillos de células HeLa CCL-2 hasta la confluencia. Las células se infectaron durante 30 min como se describió anteriormente. En los puntos de tiempo indicados, las placas se pusieron sobre hielo y se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo. A continuación, las muestras se recogieron en solución de urea [urea 8 M (AppliChem), bicarbonato amónico 0,1 M (Sigma), RapiGest al 0,1% (Waters), 1 x PhosSTOP (Roche)]. Las muestras se sometieron a vórtice brevemente, se sometieron a sonicación a 4°C (Hielscher), se agitaron durante 5 min en un termomezclador (Eppendorf) y se centrifugaron durante 20 min a 4°C y 16.000 g. Los sobrenadantes se recogieron y almacenaron a -80°C para su posterior procesamiento. Se utilizó el BCA Protein Assay (Pierce) para medir la concentración de proteína.

Enriquecimiento de fosfopéptidos. Los enlaces disulfuro se redujeron con tris(2-carboxietil)fosfina a una concentración final de 10 mM a 37°C durante 1 h. Los tioles libres se alquilaron con yodoacetamida (Sigma) 20 mM a temperatura ambiente durante 30 min en la oscuridad. El exceso de yodoacetamida se inactivó con N-acetilcisteína a una concentración final de 25 mM durante 10 min a temperatura ambiente. Se añadió endopeptidasa Lys-C (Wako) a una razón final enzima/proteína de 1:200 (p/p) y se incubó durante 4 h a 37°C. Posteriormente, la solución se diluyó con bicarbonato de amonio 0,1 M (Sigma) hasta una concentración final por debajo de 2 M de urea y se digirió durante la noche a 37°C con tripsina modificada de grado de secuenciación (Promega) a una razón de proteína respecto a enzima de 50:1. Los péptidos se desalaron en un cartucho C18 Sep-Pak (Waters) y se secaron al vacío. Se aislaron fosfopéptidos de 2 mg de masa total de péptido con TiO2 como se describió anteriormente [34]. Brevemente, los péptidos secos se disolvieron en una solución de acetonitrilo (ACN) al 80% - ácido trifluoroacético (TFA) al 2,5% saturada con ácido ftálico. Los péptidos se añadieron a la misma cantidad de TiO2 equilibrado (tamaño de la cuenta de 5 gm, GL Sciences) en una columna giratoria Mobicol bloqueada (MoBiTec) que se incubó durante 30 min con rotación de un extremo a otro. La columna se lavó dos veces con la solución saturada de ácido ftálico, dos veces con ACN al 80% y TFA al 0,1% y finalmente dos veces con TFA al 0,1%. Los péptidos se eluyeron con una solución de NH4OH 0,3 M. El pH de los productos eluidos se ajustó por debajo de 2,5 con una solución de TFA al 5% y HCl 2 M. Los fosfopéptidos se desalaron nuevamente con cartuchos microspin C18 (Harvard Apparatus).

Análisis LC-MS/MS. La separación cromatográfica de péptidos se llevó a cabo utilizando un sistema EASY nano-LC (Thermo Fisher Scientific), equipado con una columna RP-HPLC calentada (75 gm x 45 cm) empaquetada internamente con 1,9 gm de resina C18 (Reprosil-AQ Pur, Dr. Maisch). Se analizaron alícuotas de 1 gg de muestra de fosfopéptido total por ronda de LC-MS/MS utilizando un gradiente lineal que varía de 98% de disolvente A (ácido fórmico al 0,15%) y 2% de disolvente B (acetonitrilo al 98%, agua al 2%, ácido fórmico al 0,15%) a 30% de disolvente B durante 120 minutos a un caudal de 200 nl/min. El análisis de espectrometría de masas se realizó en un espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap de doble presión equipado con una fuente de iones de nanoelectronebulización (ambos Thermo Fisher Scientific). Cada escaneo de MS1 (adquirido en el Orbitrap) estuvo seguido por la disociación inducida por colisión (CID, adquirida en el LTQ) de los 20 iones precursores más abundantes con exclusión dinámica durante 30 segundos. Para el análisis de fosfopéptidos, los 10 iones precursores más abundantes se sometieron a CID con activación multietapa habilitada. El tiempo total del ciclo fue de aproximadamente 2 s. Para MS1, se acumularon 106 iones en la celda Orbitrap durante un tiempo máximo de 300 ms y se escanearon a una resolución de 60.000 FWHM (a 400 m/z). Los escaneos MS2 se adquirieron utilizando el modo de escaneo normal, un ajuste de onjetivos de 104 iones y tiempo de acumulación de 25 ms. Los iones con carga única y los iones con estado de carga no asignada se excluyeron del desencadenamiento de eventos de MS2. La energía de colisión normalizada se estableció en 32% y se adquirió un microescaneo para cada espectro.

Cuantificación sin marcas y búsqueda en bases de datos. Los archivos sin procesar adquiridos se importaron a la herramienta de soporte lógico Progenesis (Nonlinear Dynamics, Versión 4.0) para la cuantificación sin marcas utilizando los parámetros predeterminados. Los espectros de MS2 se exportaron directamente desde Progenesis en formato mgf y se buscaron utilizando el algoritmo MASCOT (Matrix Science, Versión 2.4) frente una base de datos señuelo [35] que contenía secuencias normales e inversas de las entradas de SwissProt predichas de Homo sapiens (www.ebi.ac.uk, fecha de publicación 16/05/2012) y contaminantes comúnmente observados (en total 41.250 secuencias) generados utilizando la herramienta SequenceReverser del soporte lógico MaxQuant (Versión 1.0.13.13). Para identificar las proteínas que se originaban a partir de Y. enterocolitica, se buscaron muestras no enriquecidas con fosfopéptidos frente a la misma base de datos anterior, incluidas las entradas de SwissProt predichas de Y. enterocolitica (www.ebi.ac.uk, fecha de publicación 15/08/2013). La tolerancia a iones precursores se estableció en 10 ppm y la tolerancia a iones fragmento se estableció en 0,6 Da. Los criterios de búsqueda se establecieron de la siguiente manera: se requirió una especificidad tríptica completa (escisión después de restos de lisina o arginina a menos que estuvieran seguidos de prolina), se permitieron 2 escisiones omitidas, la carbamidometilación (C) se estableció como modificación fija y la fosforilación (S, T, Y) u oxidación (M) como una modificación variable para muestras enriquecidas o no enriquecidas con TiO2, respectivamente. Finalmente, los resultados de la búsqueda en la base de datos se exportaron como un archivo xml y se volvieron a importar al soporte lógico Progenesis para la asignación de características de MS1. Para la cuantificación de fosfopéptidos, se exportó un archivo csv que contiene las abundancias máximas de MS1 de todas las características detectadas y, para las muestras no enriquecidas, se creó un archivo csv que contenía todas las mediciones de proteínas basadas en las intensidades de características sumadas de todos los péptidos identificados por proteína. Es importante destacar que el soporte lógico Progenesis estableció que las proteínas identificadas por conjuntos similares de péptidos se agrupan y que solo se emplean péptidos no conflictivos con secuencias específicas para proteínas individuales en la base de datos para la cuantificación de proteínas. Ambos archivos se procesaron posteriormente utilizando la secuencia de comandos SafeQuant v1.0 R desarrollado internamente (datos no publicados, disponibles en https://github.com/eahrne/SafeQuant/). En resumen, el soporte lógico establece el nivel de identificación de Tasa de Descubrimientos Falsos en 1% (según el número de aciertos de la base de datos de secuencias de proteínas señuelo) y normaliza las abundancias máximas de MS1 identificadas (Cromatograma de Iones Extraídos, “XIC en sus siglas en inglés”) en todas las muestras, es decir el XIC sumado de todas las características peptídicas identificadas con seguridad se adapta para que sea igual para todas las ejecuciones de LC-MS. A continuación, a todos los fosfopéptidos/proteínas cuantificados se les asigna una razón de abundancia para cada punto de tiempo, basada en la mediana de XIC por punto de tiempo. La significación estadística de cada razón viene dada por su valor q (valores p ajustados de la Tasa de Descubrimientos Falsos), obtenido calculando los valores p estadísticos de t modificados [36] y ajustando para pruebas múltiples [37]. MASCOT asignó automáticamente la ubicación de los residuos fosforilados (puntuación > 10). Todos los espectros anotados, junto con los archivos sin procesar de MS y los parámetros de búsqueda empleados, se depositarán en el Consorcio ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) a través del repositorio de socios de PRIDE [38]. El alineamiento de secuencia se realizó utilizando la herramienta de alineamiento de secuencia múltiple ClustaW2 basada en la web EMBL-EBI en http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/.

Estudio de adaptación de dosis

Todos los experimentos con animales fueron aprobados (licencia 1908; Kantonales Veterinaramt Basel-Stadt) y se realizaron de acuerdo con las directrices locales (Tierschutz-Verordnung, Basel-Stadt) y la ley suiza de protección animal (Tierschutz-Gesetz). Se solicitaron ratones C57Bl/6 y BALB/c de 6 semanas de Janvier Labs. Después de al menos una semana de acomodación, los ratones se infectaron con Y. enterocolitica MRS40 AHOPEMT o S. typhimurium AaroA mediante inyección en la vena de la cola. A lo largo del experimento, se evaluó el comportamiento y la apariencia física de los ratones, y se midió la temperatura de la superficie, así como el peso corporal. El inóculo i.v. administrado a los ratones se validó mediante dilución en placas. En los días respectivos después de la infección, los ratones fueron sacrificados por inhalación CO2. Inmediatamente se aisló una muestra de sangre mediante aspiración del corazón. Se aislaron hígado, bazo, pulmón y el tumor y se determinó su peso. Se homogeneizaron los órganos y el tumor. Se determinaron las UFC en cada muestra aplicando diluciones seriadas sobre placas de agar LB que contenían ácido nalidíxico (35 ug/ml).

Biodistribución en modelos de ratón de aloinjerto tumoral B16-F10 y 4T1

Todos los experimentos con animales fueron aprobados (licencia 1908; Kantonales Veterinaramt Basel-Stadt) y se realizaron de acuerdo con las directrices locales (Tierschutz-Verordnung, Basel-Stadt) y la ley suiza de protección animal (Tierschutz-Gesetz). Se solicitaron ratones C57Bl/6 y BALB/c de 6 semanas de Janvier Labs. Después de al menos una semana de acomodación, los ratones fueron anestesiados con isoflurano y se inyectaron subcutáneamente 100 ul de células B16-F10 o 4T1 (1x105-1x106 células) en el flanco de C57Bl/6 y BALB/c, respectivamente. A lo largo del experimento, se evaluó el comportamiento y la apariencia física de los ratones, y se midió la temperatura de la superficie, así como el peso corporal.

Una vez que se desarrollaron los tumores, se administró a los ratones una solución de desferal de 8 mg/ml (10 ml/kg) mediante inyección i.p. Al día siguiente, los ratones se infectaron con Y. enterocolitica MRS40 o Y. enterocolitica MRS40 AHOPEMT (2x105, 1x106 o 1x107 bacterias) mediante inyección en la vena de la cola. El inóculo i.v. administrado a los ratones se validó mediante dilución en placa. En algunos experimentos, la progresión del tumor fue seguida por mediciones diarias de la longitud y el ancho del tumor con calibradores digitales. El volumen del tumor se determinó como 0,523 x largo x ancho2. En los días respectivos después de la infección, los ratones fueron sacrificados mediante inhalación de CO2. Inmediatamente se aisló una muestra de sangre mediante aspiración de corazón. Se aislaron el hígado, el bazo, el pulmón y el tumor y se determinó su peso. Se homogeneizaron los órganos y el tumor. Se determinaron las UFC en cada muestra aplicando diluciones seriadas sobre placas de agar LB que contenían ácido nalidíxico (35 ug/ml).

B)RESULTADOS

Un sistema de suministro de proteínas basado en la secreción de tipo 3 de proteínas de fusión de YopE

Mientras que el mismo extremo N-terminal del efector de T3SS de Y. enterocolitica YopE (SEQ ID NO: 1) contiene la señal de secreción suficiente para translocar proteínas heterólogas [19], el sitio de unión a chaperona (CBS) para su chaperona (SycE) no está incluido [39]. Los autores de la presente invención seleccionaron los 138 aminoácidos N-terminales de YopE (SEQ ID NO: 2) para fusionarlos a las proteínas que se iban a suministrar, ya que se había demostrado que daba mejores resultados para la translocación de otros sustratos de T3S heterólogos [21]. Puesto que estos 138 aminoácidos N-terminales de YopE contienen CBS, los autores de la presente invención decidieron adicionalmente expresar conjuntamente SycE. SycE-fragmento YopE1-138 clonado a partir del plásmido de virulencia pYV40 de Y. enterocolitica purificado contiene los promotores endógenos de YopE y de su chaperona SycE (Fig. 9). Por lo tanto, SycE y cualquier proteína de fusión de YopE1-138 son inducidas por un rápido cambio de temperatura desde el crecimiento a RT a 37°C. El tiempo de cultivo a 37°C afectará a la cantidad de proteína de fusión presente en las bacterias. Se añadió un sitio de clonación múltiple (MCS) en el extremo 3’ de YopE1-138 (Fig. 9 B) seguido de una etiqueta Myc y 6xHis y un codón de Parada. El fondo de cepa se seleccionó cuidadosamente. Primero, para limitar la translocación de efectores endógenos, los autores de la presente invención utilizaron una cepa de Y. enterocolitica de la que se habían eliminado todos los efectores conocidos, Yop H, O, P, E, M y T (denominada AHOPPEMT [40]. Además, ocasionalmente los autores de la presente invención utilizaron un mutante auxótrofo que no podía crecer en ausencia de ácido meso-2,6-diaminopimélico exógeno [41]. En esta cepa se suprimió el gen de la aspartato-betasemialdehído deshidrogenasa (Aasd), y se clasificó como nivel de bioseguridad 1 por la agencia de seguridad Suiza (enmienda a A010088/2). Además, los autores de la presente invención suprimieron las proteínas de adhesión YadA y/o InvA para ofrecer una mayor variedad de fondos de cepa. Si bien el uso de las cepas yadA o yadA/invA reduce la señalización de fondo inducida [42], la cantidad de proteína suministrada también se ve afectada [43].

Caracterización del suministro de la proteína de fusión de YopE a células eucarióticas

En un ensayo de secreción in vitro (véase la Fig. 1 A), se induce artificialmente la secreción de proteínas al líquido circundante. Después de la precipitación de proteínas basada en TCA, se utilizó el análisis de transferencia Western con anticuerpo anti-YopE para determinar las cantidades de proteínas secretadas (Fig. 1 B). Mientras que una cepa wt secreta YopE completa, las cepas AHOPEMT asd no lo hicieron. Ante la presencia de YopE1-138-Myc-His (también denominada YopE1-138-Mic; SEQ_ID_No._3) se hizo visible una banda YopE más pequeña (Fig.1 B). Por lo tanto, el fragmento YopE1-138 está bien secretado en la configuración que se describe aquí. Para analizar la homogeneidad de la translocación de proteínas a células eucarióticas, los autores de la presente invención infectaron células HeLa con la cepa que codificaba YopE1-138-Myc y tiñeron la etiqueta Myc mediante IF (Fig. 2 A y B). Mientras que al principio sólo se tiñeron las bacterias, a los 30 minutos después de la infección (p.i.) comienzan a ser visibles los contornos de las células, lo que se intensifica con el aumento del tiempo de infección (Fig. 2 B). Esta tendencia se refleja bien en la intensidad de tinción de la etiqueta Myc dentro de las células HeLa (Fig. 2 A y B). YopE1-138-Myc se puede detectar en todas partes de las células (Fig. 2 A), excepto en los núcleos [44]. Sorprendentemente, la mayoría de las células, si no todas, fueron alcanzadas por este enfoque de una manera comparable. Puesto que se sabe que Y. enterocolitica infecta muchos tipos de células diferentes [45], los autores de la presente invención siguieron el suministro de YopE1-138-Myc en varias líneas celulares. Se observó la misma tinción IF homogénea anti-Myc en fibroblastos murinos, células Jurkat y HUVEC infectados (Fig. 11). Aún más, el ajuste de la MOI hacia arriba o hacia abajo permite la modulación de la cantidad de proteína suministrada (Fig. 2 C), mientras que la mayoría de las células siguen siendo elegidas como diana. Un número de bacterias bajo no dará como resultado pocas células con mucha proteína suministrada, sino que la mayoría de las células contienen una cantidad baja de proteína suministrada (Fig. 2 C).

Redirección de las proteínas suministradas por T3SS al núcleo

Puesto que la propia YopE se localizó en el citoplasma (Fig. 2 A), reviste especial interés probar si el fragmento YopE1-138 dificulta la localización de proteínas de fusión nuclear. Por lo tanto, los autores de la presente invención añadieron la NLS de SV40 al extremo C-terminal (y extremo N-terminal, resultados similares) de YopE1-138-EGFP (SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 38, respectivamente). Si bien YopE1-138-EGFP (SEQ ID NO: 37) condujo a una tinción citoplásmica débil, YopE1-138-EGFP-NLS dio lugar a una señal nuclear EGFP más fuerte en células HeLa infectadas (Fig. 3). Esto indica que el fragmento YopE1-138 es compatible con el uso de una NLS. Si bien mCherry ya se había utilizado en patógenos vegetales [46], esta representa un suministro satisfactorio de una proteína similar a GFP a través de bacterias patógenas humanas o animales que codifican un T3SS. Esto valida que la estrategia dependiente de SycE y YopE1-138 es muy prometedora para el suministro de muchas proteínas de elección.

Eliminación del apéndice YopE1-138 después de la translocación de la proteína de fusión a la célula eucariótica

Mientras que para el suministro bacteriano el fragmento YopE1-138 es muy beneficioso, este podría dificultar la función y/o localización de las proteínas de fusión. Por lo tanto, su eliminación después del suministro de proteínas sería óptima. Con este fin, los autores de la presente invención introdujeron dos sitios de escisión de TEV (ENLYFQS) [47 49] entre YopE1-138 y un compañero de fusión (el regulador transcripcional ET1-Myc (SEQ ID NO: 36 y 41) [50] e INK4C humano (SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 43)). Para mantener las ventajas del método presentado, los autores de la presente invención fusionaron adicionalmente la proteasa TEV (variante S219V; [51]) a YopE1-138 (SEQ ID NO: 42) en otra cepa de Y. enterocolitica. Las células HeLa se infectaron con ambas cepas a la vez. Para permitir el análisis de la fracción translocada de proteínas únicamente, las células HeLa infectadas se lisaron 2 h p.i. (Fig. 4) con Digitonina, que se sabe que no lisa las bacterias ([52]; véase la Fig. 11 para el control). El análisis de transferencia Western reveló la presencia de YopE1-138-2x sitio de escisión de TEV-ET1-Myc o YopE1-138-2x sitio de escisión de TEV-Flag-INK4C-Myc sólo cuando las células se habían infectado con la cepa correspondiente (Fig. 4 A y C). Tras la digestión durante la noche de este producto lisado celular con proteasa TEV purificada, se pudo observar una banda desplazada (Fig. 4 A y C). Esta banda corresponde a ET1 -Myc (Fig. 4 C) o Flag-INK4C (Fig. 4 A) con los remanentes N-terminales del sitio de escisión de TEV, muy probablemente sólo una Serina. Tras la infección conjunta de las células con la cepa que suministraba la proteasa TEV, se hizo visible el mismo fragmento ET1-Myc o Flag-INK4C escindido, lo que indica que la proteasa TEV suministrada a través de T3SS es funcional y que las células individuales habían sido infectadas por ambas cepas bacterianas (Fig. 4 A y C). Aunque la escisión no es completa, la mayoría de la proteína translocada ya se escinde 2 h después de la infección e incluso la digestión durante la noche con proteasa TEV purificada no produjo mejores tasas de escisión (Fig. 4 B). Como se informó, la escisión dependiente de la proteasa TEV podría necesitar una optimización dependiente de la proteína de fusión [53, 54]. La eliminación del apéndice YopE1-138 dependiente de la proteasa TEV después de la translocación proporciona, por tanto, por primera vez un suministro de proteínas de T3SS de proteínas heterólogas casi nativas, cambiando la composición de aminoácidos en solo un aminoácido N-terminal. Un enfoque alternativo para la escisión dependiente de la proteasa TEV del fragmento YopE consistió en incorporar Ubiquitina a la proteína de fusión de interés. De hecho, la Ubiquitina se procesa en su extremo C-terminal mediante un grupo de proteasas C-terminales endógenas específicas de Ubiquitina (enzimas Desubiquitinantes, DUB). Como se supone que la escisión se produce en el extremo C-terminal de la Ubiquitina (después de G76), la proteína de interés debe estar libre de secuencias de aminoácidos adicionales. Este método se probó en la proteína de fusión YopE1-138-Ubiquitina-Flag-INK4C-MycHis. En las células de control infectadas por bacterias que expresan YopE1-138-Flag-INK4C-MycHis, se encontró una banda correspondiente a YopE1-138-Flag-INK4C-MycHis, indicativa de una translocación eficaz de la proteína de fusión (Figura 23). Cuando las células se infectaron durante 1 h con bacterias que expresaban YopE1-138-Ubiquitina-Flag-INK4C-MycHis, se vio una banda adicional correspondiente al tamaño de Flag-INK4C-MycHis, lo que indica que se escindió parte de la proteína de fusión. Este resultado muestra que la introducción de Ubiquitina en la proteína de fusión permite escindir el fragmento YopE1-138 sin necesidad de una proteasa exógena.

Translocación de efectores bacterianos tipo III y tipo IV

SopE de Salmonella entérica es un factor de intercambio de nucleótidos de guanina (GEF) bien caracterizado que interactúa con Cdc42, promoviendo la remodelación citoesquelética de actina [55]. Considerando que la translocación de YopE1-138-Myc a células HeLa no tiene ningún efecto, YopE1-138-SopE translocada (SEQ ID NO: 5 y 135) indujo cambios drásticos en la red de actina (Fig. 5 A). Se obtuvieron resultados similares con otra proteína efectora de GEF, IpgB1 de Shigella flexneri (SEQ ID NO: 4). Sorprendentemente, los primeros cambios en el citoesqueleto de actina se observaron tan rápido como 2 min p.i. (Fig. 5 A). Por lo tanto, se puede concluir que el suministro de proteína dependiente de T3SS ocurre inmediatamente después de que se inicie la infección por centrifugación. Para probar el transporte estricto dependiente de T3SS, se eliminó una de las proteínas de T3SS que forman el poro de translocación en la membrana de la célula eucariótica (YopB, véase [56]) (Fig. 11).

Durante la infección por Salmonella, la translocación de SopE va seguida de la translocación de SptP, que funciona como una proteína activadora de GTPasa (GAP) para Cdc42 [57]. Considerando que la translocación de YopE1-138-SopE-Myc (SEQ ID NO: 135) solo desencadenó reordenamientos masivos de F-actina, la infección conjunta con las bacterias que expresan YopE1-138-SptP (SEQ ID NO: 8) abolió este efecto de una manera dependiente de la dosis (Fig. 5 B). Una tinción anti-Myc indicó que esta inhibición no se debió a un nivel reducido de translocación de YopE1-138-SopE-Myc (Fig. 5 B). Juntos, estos resultados mostraron que la infección conjunta de células con dos cepas bacterianas es un método válido para suministrar dos efectores diferentes a células individuales para abordar su interacción funcional.

El efector de tipo III de S. flexneri OspF funciona como una fosfotreonina liasa que desfosforila las MAP quinasas p38 y ERK [58]. Para probar la funcionalidad de YopE1-138-OspF (SEQ ID NO: 7) translocado, los autores de la presente invención verificaron la fosforilación de p38 después de la estimulación con TNFa. En células no infectadas o en células infectadas con bacterias que expresaban YopE1-138-Myc, TNFa indujo la fosforilación de p38. Por el contrario, después de la translocación de YopE1-138-OspF, se abolió la fosforilación inducida por TNFa, lo que muestra que el suministro de OspF es activo hacia p38 (Fig. 6 A). Durante la infección con Salmonela, el efector de tipo III SopB protege a las células epiteliales de la apoptosis mediante la activación sostenida de Akt [59]. Considerando que la translocación de YopE1-138-Myc o YopE1-138-SopE no tuvo ningún efecto sobre Akt, la translocación de YopE1-138-SopB (SEQ ID NO: 6) indujo una fuerte fosforilación de Akt en T308 y S473, reflejando la forma activa (Fig. 6 B). Se obtuvieron resultados similares con el homólogo SopB de S. flexneri (IpgD, SEQ ID NO: 9). En conjunto, los resultados de los autores de la presente invención muestran que el sistema de suministro basado en YopE1-138 funciona para todos los efectores de T3S probados hasta ahora, y que esto permite investigar proteínas implicadas en el control de funciones celulares centrales, incluido el citoesqueleto, la inflamación y la supervivencia celular.

Varias bacterias, incluidas Agrobacterium tumefaciens, Legionella pneumophila y Bartonella henselae, utilizan la secreción de tipo IV para inyectar efectores en las células. Los autores de la presente invención probaron si el efector tipo IV BepA de B. henselae podría ser translocado a células HeLa utilizando su herramienta. Se clonaron BepA completo (SEQ ID NO: 10) y BepAE305-extremo (SEQ ID NO: 11) que contenía el dominio Bid C-terminal, y las células se infectaron con las cepas respectivas. Puesto que se demostró que BepA inducía la producción de AMP cíclico (AMPc) [60], se midió el nivel de AMPc en las células HeLa después de la infección. Considerando que la translocación del dominio Bid del efector BepG de B. henselae (SEQ ID NO: 136) no pudo inducir AMPc, BepA completo y BepAE305-extremo desencadenaron la producción de AMPc en las cantidades esperadas [60] (Fig. 6 C). Este resultado muestra que los efectores de tipo IV también pueden ser suministrados de manera eficaz por el sistema de suministro basado en YopE1-138 a dianas de células anfitrionas y que son funcionales.

Translocación de proteínas eucarióticas a células epiteliales.

Para demostrar que las proteínas humanas pueden translocarse a través de la secreción de tipo III, los autores de la presente invención fusionaron inductores de apoptosis humana para su suministro mediante Y. enterocolitica a YopE1-138 o para el suministro por S. enterica a SteA1-20, SteA, SopE1-81 o SopE1-105. A continuación, los autores de la presente invención verificaron la translocación del agonista de muerte del dominio de interacción de BH3 humano (BID, SEQ ID NO: 24), que es un miembro proapoptótico de la familia de proteínas Bcl-2. Es un mediador del daño mitocondrial inducido por caspasa-8 (CASP8). c As P8 escinde BID y el BID truncado (tBID, SEQ ID NO: 25) se transloca a las mitocondrias donde desencadena la liberación del citocromo c. Este último conduce al modo intrínseco de activación de la caspasa 3 (CASP3) durante el cual se escinde en subunidades de 17 y 12 kDa [61]. Mientras que la infección durante 1 h con Y. enterocolitica que expresa YopE1-138-Myc o YopE1-138-BID no pudo inducir la apoptosis, la translocación de la tBID humana desencadenó la muerte celular en mayor extensión que la estaurosporina, inductora de apoptosis bien caracterizada (Fig. 7 A y C). Como era de esperar, la translocación de tBID conduce a la producción de la subunidad p17 de CASP3, incluso en cantidades mayores, como ocurre con la estaurosporina (Fig. 7 A). Para poder comparar las cantidades de proteínas translocadas con las Bid endógenas, las células HeLa se lisaron con Digitonina y se analizaron mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-Bid (Fig. 7 B). YopE1-138-tBID suministrado por T3SS alcanzó aproximadamente niveles de Bid endógenos en células HeLa, mientras que YopE1-138-BID suministrado estuvo presente en cantidades aún mayores (2,5 veces) (Fig. 7 B). Un mapeo profundo de proteoma y transcriptoma de células HeLa estimó en 4,4 veces 105 copias de BID por célula individual [62]. Por lo tanto, se puede concluir que el suministro de proteína humana dependiente de T3SS alcanza 105 a 106 proteínas por célula. Estos números se ajustan a las copias por célula de nanocuerpos translocados a través de T3SS de E. coli [63]. Suponiendo una nivelación de un factor de 10 para la MOI y durante la duración de la infección, un factor de 3,2 para el punto de tiempo de la adición de antibiótico y para el tiempo de cultivo a 37°C antes de la infección, las copias de proteína suministradas/célula se pueden calibrar desde unas 1000 copias/célula hasta unas 106 copias/célula. En conjunto, estos resultados indicaron que el tBID translocado era funcional y se suministraba a niveles relevantes. Esto validó la herramienta de translocación para estudiar el papel de las proteínas en la regulación de la apoptosis, un aspecto central de la biología celular. Los autores de la presente invención fusionaron adicionalmente tBID murino (con codones optimizados para Y. enterocolitica; SEQ ID NO: 194) o los dominios BH3 de tBID murino o BAX murino (en ambos casos, con codones optimizados para Y. enterocolitica; SEQ ID NO: 138 y 139) a YopE1-138 para el suministro por Y. enterocolitica. Mientras que la infección durante 2,5 h con Y. enterocolitica AHOPEMT asd no suministró proteínas ni YopE1-138-Myc pudo inducir la apoptosis, la translocación de tBID murino (con codones optimizados para Y. enterocolitica, s Eq ID NO: 194) desencadenó la muerte celular en células B16F10 (Fig. 15), D2A1 (Fig. 16), HeLa (Fig. 17) y 4T1 (Fig. 18). También se encontró que la translocación del dominio BH3 de BID murino con codones optimizados para Y. enterocolitica (SEQ ID 138) o BAX murino con codones optimizados para Y. enterocolitica (SEQ ID 139) inducía la muerte celular masiva en células B16F10 (Fig. 15), D2A1 (Fig. 16), HeLa (Fig. 17) y 4T1 (Fig. 18). Otras versiones incluyen una repetición en tándem del dominio BH3 de BID murino con codones optimizados para Y. enterocolitica fusionado a YopE1-138 (SEQ ID 202) o una conexión del dominio BH3 de BID murino con codones optimizados para Y. enterocolitica al dominio BH3 de BAX murino con codones optimizados para Y. enterocolitica, fusionados a YopE1-138 (SEQ ID 203). Mientras que la infección durante 4 h con bacterias S. enterica aroA no logró inducir la apoptosis, la translocación de tBID murino desencadenó la apoptosis, ya que la translocación de tBID murino condujo a la producción de la subunidad p17 de CASP3 (Fig. 19 y 20). El grado de inducción de la apoptosis para las proteínas de fusión de SopE fue mayor cuando se utilizaron las condiciones de inducción de T3SS de Spil (Fig. 19), que refleja el transporte de SopE exclusivamente por T3SS de Spil. El tBID murino fusionado a SteA1-20 no logró inducir la apoptosis, muy probablemente debido a que la señal de secreción dentro de los 20 aminoácidos N-terminales de SteA no es suficiente para permitir el suministro de una proteína de fusión (Fig. 19 y 20). tBID murino fusionado a SteA de longitud completa condujo a la inducción de apoptosis en células HeLa (Fig. 19 y 20), tanto en condiciones de inducción de T3SS de Spil como de Spill, lo que refleja la capacidad de SteA para ser transportado por ambos T3SS. Debe observarse que incluso en condiciones de inducción de T3SS de Spill, se espera una actividad parcial de T3SS de Spil como se observa por la actividad de las proteínas de fusión de SopE en condiciones de inducción de T3SS de SpiII (Fig. 20).

Además de las proteínas eucarióticas translocadas elaboradas funcionalmente aquí, se han secretado varias otras proteínas eucarióticas utilizando la herramienta aquí descrita. Esto incluye, para el suministro por Y. enterocolitica (Figs. 12, 13 y 22), proteínas de regulación del ciclo celular (Mad2 (SEQ ID NO: 15), CDK1 (SeQ ID NO: 14), INK4A (SEQ ID NO: 16), INK4B (SEQ ID NO: 17) e INK4C (SEQ ID NO: 18)) así como porciones de las mismas (INK4A 84 103 (SEQ ID NO: 158), p107 657-662 (SEQ ID NO: 159), p21 141-160 (SEQ ID NO: 160), p21 145-160 (SEQ ID NO:161), p21 17-33 (SEQ ID NO:162) y ciclina D2139-147 (SEQ ID NO:163)), proteínas relacionadas con la apoptosis (Bad (SEQ ID NO:29), FADD (SEQ ID NO: 28) y p17 (SEQ ID NO: 22) y p12 (SEQ ID NO: 23) de Caspasa 3, Bid (SEQ ID NO: 19) y t-Bid (SEQ ID n O: 20) de pez cebra) así como porciones de las mismas ( BH3 de tBid (SEQ ID NO:138), BH3 de Bax (SEQ ID NO:139)), proteínas de señalización (TRAF6 (SEQ ID NO:12), TIFA (SEQ ID NO:13) murinas), Subunidad Ga de GPCR (GNA12, isoforma más corta, (SeQ ID NO: 30)), nanocuerpo (vhhGFP4, (SEQ ID NO: 31)) y construcciones de fusión de nanocuerpos para la degradación dirigida de proteínas (Slmb-vhhGFP4; (SEQ_ID_NO: 32), 33, 34) [64]) (Fig. 12 y 13) así como GTPasas pequeñas (Rac1 Q61E (SeQ ID n O: 26 y 137) y RhoA Q63L (SEQ ID NO: 27) y dominio de homología de Pleckstrina de Akt humana (SEQ ID NO: 35). Además de las proteínas relacionadas con la apoptosis funcionalmente elaboradas (tBid murino, SEQ ID NO: 144-147), esto incluye adicionalmente para el suministro por S. enterica (Fig.21) proteínas de la regulación del ciclo celular (Mad2 (SEQ ID NO: 168-169), CDK1 (SEQ ID NO: 170-171), INK4A (SEQ ID NO: 164-165) e INK4C (SEQ ID NO: 166-167)). Si bien esas proteínas no se han validado funcionalmente, la posibilidad de secreción dependiente de T3SS de diversas proteínas eucarióticas combinada con la posible eliminación del apéndice YopE abre nuevas perspectivas sobre la amplia aplicabilidad de T3SS en biología celular y aplicaciones terapéuticas, especialmente para el tratamiento de tumores sólidos malignos.

La fosfoproteómica revela el impacto global de las proteínas translocadas sobre la fosforilación de proteínas

La fosforilación es una modificación postraduccional muy extendida que puede activar o desactivar procesos biológicos y, por lo tanto, es una diana adecuada para estudiar eventos de señalización [65]. A pesar de esto, en la actualidad no se dispone de un análisis a nivel de sistemas de la fosforilación en la apoptosis. Para analizar el impacto del tBid humano suministrado a células HeLa, los autores de la presente invención utilizaron un enfoque fosfoproteómico sin marca mediante LC-MS/MS. En tres experimentos independientes, las células se dejaron sin tratar, se infectaron con AHOPEMT asd + YopE1-138-Myc o con AHOPEMT asd + YopE1-138-tBid durante 30 minutos. Las células se lisaron, seguido de digestión enzimática, enriquecimiento de fosfopéptidos y cuantificación e identificación de fosfopéptidos individuales. Los autores de la presente invención compararon las células infectadas con AHOPEMT asd + YopE1-138-Myc con las células infectadas con AHOPEMT asd + YopE1-138-tBid, lo que les permitió identificar 363 eventos de fosforilación dependientes de tBid. 286 fosfopéptidos mostraron un aumento en la fosforilación, mientras que 77 estaban menos fosforilados tras el suministro de tBid, lo que corresponde a 243 proteínas diferentes, que los autores de la presente invención definieron como fosfoproteoma de tBid. La base de datos STRING se utilizó para crear una red de interacción proteína-proteína del fosfoproteoma de tBid [66] (Fig. 8 A). Además, se añadieron a la red 27 proteínas que se sabe están relacionadas con la apoptosis mitocondrial, creando un agrupamiento central. Curiosamente, solo unas pocas proteínas del fosfoproteoma de tBid están conectadas a este agrupamiento central, lo que indica que muchas proteínas experimentan un cambio en la fosforilación que hasta ahora no se vinculaba directamente a las proteínas apoptóticas. Para caracterizar las funciones biológicas cubiertas por el fosfoproteoma de tBid, los autores de la presente invención realizaron un análisis de ontología genética utilizando la herramienta de anotación funcional de la Base de Datos de Anotación, Visualización y Descubrimiento Integrado (DAVID, http://david.abcc.ncifcrf.gov/) [67,68]. Las funciones biológicas identificadas muestran que tBid afecta a diversos procesos celulares. Muchas proteínas implicadas en el reordenamiento de la cromatina y la regulación de la transcripción sufren un cambio en la fosforilación (es decir, CBX3, CBX5, TRIM28, HDAC1). HDAC1, por ejemplo, es una histona desacetilasa que desempeña un papel en la regulación de la transcripción. Se ha demostrado que HDAC1 puede modular la actividad transcripcional de NF-kB, una proteína que también participa en la apoptosis. Además, los autores de la presente invención identificaron un agrupamiento de proteínas implicadas en el procesamiento del ARN que previamente se había demostrado que desempeña un papel importante en la regulación de la apoptosis [69]. HNRPK, por ejemplo, media una respuesta de p53/TP53 al daño del ADN y es necesaria para la inducción de la apoptosis [70]. Además, la fosforilación de proteínas implicadas en la traducción de proteínas también se ve afectada. Varios factores de iniciación eucarióticos (es decir, EIF4E2, EIF4B, EIF3A, EIF4G2) experimentan un cambio en la fosforilación, que está en línea con la observación de que la síntesis de proteínas general se reduce en las células apoptóticas. Curiosamente, la fosforilación de muchas proteínas implicadas en la remodelación del citoesqueleto (p. ej., PXN, MAP1B9 se alteran con el suministro de tBid. Esto concuerda con la observación de que la morfología de las células cambia drásticamente con el suministro de tBid (Figura 8 B). La contracción de las células y la pérdida de contacto se reflejan en el hecho de que los autores de la presente invención observan la fosforilación de proteínas relacionadas con la adhesión como ZO2 y Paxillina. De manera similar, la contracción de los núcleos se acompaña de la fosforilación de proteínas laminares como LaminaA/C y Lamina B1. En conjunto, el suministro de tBID también induce una rápida respuesta apoptótica indicada por la ruptura de la integridad mitocondrial (Fig. 8 B). Los autores de la presente invención demostraron que la apoptosis inducida por tBid afecta a cientos de eventos de fosforilación que participan en diversos procesos celulares. Si bien muchas proteínas identificadas se han relacionado con la apoptosis, se sabe que solo unas pocas se fosforilan durante la inducción de la apoptosis. El enfoque fosfoproteómico, por lo tanto, proporciona un recurso útil para futuros estudios sobre apoptosis.

Translocación de proteínas de fusión heterólogas eucarióticas que consisten en dominios de proteínas repetidos idénticos o variables a células epiteliales

Para mostrar que las proteínas de fusión heterólogas que consisten en dominios de proteínas idénticos o variables repetidos pueden translocarse a través de la secreción de tipo III, los autores de la presente invención fusionaron inductores de apoptosis murinos para su suministro por Y. enterocolitica a YopE1-138. Como control, los autores de la presente invención fusionaron tBID murino (con codones optimizados para Y. enterocolitica; SEQ ID NO: 194) o los dominios BH3 de tBID murino o BAX murino (en ambos casos, con codones optimizados para Y. enterocolitica; SEQ ID NO: 200 y 201) a YopE1-138 para el suministro por Y. enterocolitica. La proteína de fusión heteróloga consistió en un caso en un dominio BH3 murino de tBID fusionado a sí mismo, que daba como resultado YopE1-138-(tBID-BH3)2 (SEQ ID NO: 202). En un segundo caso, las proteínas de fusión heterólogas consistieron en el dominio BH3 murino de tBID fusionado al dominio BH3 murino de BAX, que daba como resultado YopE1-138-(tBID-BH3)-(BAX-BH3) (SEQ ID NO: 203). En el caso de tBID murino y BAX murino, se optimizaron los codones para Y. enterocolitica.

Mientras que la infección durante 4 h con Y. enterocolitica AHOPEMT asd suministrando YopE1-138-Myc no pudo inducir la apoptosis, la translocación del dominio BH3 murino de tBID (con codones optimizados para Y. enterocolitica, SEQ ID NO: 194) desencadenó la muerte celular en las células B16F10 y 4T1, con un claro efecto de respuesta a la dosis hasta aumentar la multiplicidad de infección (MOI). Curiosamente, se encontró que YopE1-138- (tBID-BH3)-(BAX-BH3) o YopE1-138-(tBID-BH3)2 suministrados eran más activos que YopE1-138-(tBID-BH3) a una MOI más baja. Esto indica que tras el suministro de dominios idénticos repetidos o la combinación de diferentes dominios de proteínas, se puede agrandar el impacto sobre una ruta celular deseada como apoptosis puede.

Atenuación de la virulencia por deleción/mutación de proteínas efectoras bacterianas con actividad de virulencia para células eucarióticas

En caso de Y. enterocolitica, la virulencia se redujo por la deleción de las seis proteínas efectoras endógenas, llamadas "proteínas externas de Yersinia" (Yop), en detalle YopH, O, P, E, M, T (MRS40 pIML421 [yopHA1 -352, yopOA65-558, yopP23, yopE21, yopM23, yopT135]) [40]. Estas Yop están codificadas en el "plásmido de virulencia de Yersinia" (pYV), un plásmido de aproximadamente 70 kpb de tamaño, en el que están codificados el sistema completo de secreción de tipo 3 (T3SS), así como otros protagonistas en la virulencia (Fig. 24). YopH, O, P, E, M y T son las seis proteínas efectoras, que son suministradas a las células anfitrionas por el sistema de secreción de tipo tres bacteriano para modular y amortiguar el sistema inmunitario. Cada Yop tiene una actividad bioquímica específica en la célula anfitriona. YopT escinde la cisteína C-terminal de Rho GTPasas y, por lo tanto, elimina el grupo isoprenilo que ancla las GTPasas a la membrana. Esta inactivación de Rho debido a una mala localización evita la fagocitosis por células inmunitarias como macrófagos y neutrófilos [71]. En la misma vía, YopE actúa como proteína activadora de GTPasa (GAP) para Rho GTPasas, desactivándolas. Esto da como resultado una disminución de la fagocitosis y la inhibición de la liberación de IL-1 beta por las células inmunitarias [71]. Además, YopO actúa como inhibidor de la disociación de nucleótidos de guanidina (GDI), desactivando Rho GTPasas. YopO adicionalmente tiene un dominio de serina/treonina quinasa que actúa de una manera aún no definida sobre el citoesqueleto de actina [71]. YopH es una tirosina fosfatasa que actúa sobre proteínas de adhesión focal como la quinasa de adhesión focal (Fak), paxilina y otras, por lo que previene fuertemente la fagocitosis por macrófagos y neutrófilos [71]. Se encontró que YopP, denominada YopJ en Y. pseudotuberculosis o Y. pestis, inactivaba la vía MAPK/NFkB en las células inmunitarias, evitando la liberación de TNFa e IL-8 de las células inmunitarias estimuladas por la presencia de la bacteria. Además, se encontró que YopP inducía la apoptosis en las células inmunitarias, lo que podría estar relacionado con los efectos en la vía MAPK, que en su estado activado protege a las células de la apoptosis [71]. El papel de YopM aún no está completamente claro, pero se encontró que estaba asociada con la quinasa 1 ribosomal S6 (RSK1) y la proteína quinasa C tipo 2 (PRK2). Parece que YopM podría estimular la fosforilación de RSK1 y, por lo tanto, afectaría a las dianas aguas abajo, como p. ej., la progresión del ciclo celular [71]. Al eliminar una o varias de estas Yop, el mecanismo de defensa de las bacterias contra el sistema inmunitario se ve drásticamente afectado [72]. La mutación de las respectivas yop se confirmó mediante PCR en la región respectiva y mediante un ensayo de secreción in vitro (Fig.

25). El análisis de la secreción in vitro mediante SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie confirmó la ausencia de YopH, O, M y YopE completas.

Además, se construyó una cepa de Y. enterocolitica con deleciones en asd (aspartato semialdehído deshidrogenasa). La mutación en asd conduce a una pérdida completa de la capacidad de crecimiento sin la adición de ácido mesodiamino-pimélico. Esto permite generar sistemas de mantenimiento de plásmidos libres de antibióticos basados en la presencia de asd en el plásmido respectivo. De manera similar, podrían utilizarse otros mutantes auxótrofos.

Estudio de adaptación de dosis en ratones sanos

Para evaluar la toxicidad aguda, se realizó un estudio de adaptación de dosis en ratones inmunocompetentes sanos (C57BL/6). En estos experimentos, se comparó Y. enterocolitica subsp. palearctica MRS40 ÚyopH, O, P, E, M, Túasd (replicación deficiente debido a ú asd y una virulencia atenuada adicionalmente debida a ÚyopH, O, P, E, M, T con S. typhimurium ÚaroA (crecimiento atenuado debido a ÚaroA, como lo utilizan otros [73-75]). La toxicidad aguda posterior a la infección se evaluó basándose en el aumento de peso o la pérdida de peso de los ratones después de la inyección i.v. de las bacterias. Además, los recuentos bacterianos en varios órganos se determinaron mediante homogeneización de órganos, dilución seriada y cultivo en placa. Puesto que se evaluó la toxicidad aguda y el crecimiento bacteriano no tuvo un mayor interés, no se aplicó ningún pretratamiento con desferoxamina. Se probaron cuatro cargas bacterianas diferentes para cada cepa (105, 106, 107, 108 ufc por animal). Y. enterocolitica subsp. palearctica MRS40 ÚyopH, O, P, E, M, Túasd no dio lugar a una reducción de peso con las dos dosis más bajas (105, 106 ufc) (Fig. 26). A la dosis de 107 bacterias, el peso se redujo en aproximadamente 6% en las primeras 24 h, antes de la estabilización y el aumento continuo. Con la dosis más alta, el peso se redujo en 7,5% 48 horas después de la infección. (Fig. 26). Puesto que Y. enterocolitica subsp. palearctica MRS40 ÚyopH, O, P, E, M, T úasd no puede establecer una infección, más aún en ausencia de un pretratamiento con desferoxamina, se esperaba que los recuentos bacterianos descendieran rápidamente, lo que de hecho se encontró (Figura 27-30). Sin embargo, no se observó una fuerte toxicidad aguda debida, p. ej., a choque endotóxico ni siquiera para la dosis más alta de Y. enterocolitica aplicada. Esto contrasta S. typhimurium ÚaroA de crecimiento e infección competente, que ha sido muchas veces utilizada en estudios murinos por otros [73-75] y el doble mutante aroA y aroB incluso en ensayos clínicos (NCT01099631). La puntuación de la apariencia física y comportamiento instó a los autores de la presente invención a sacrificar todos los ratones infectados con la dosis más alta de S. typhimurium ÚaroA el día 1 después de la infección y el día 4 para la dosis de 107 ufc. Se encontró una disminución progresiva del peso para las tres dosis más altas (Fig.26), mientras que se encontró que la dosis más baja inducía solo una pérdida de peso leve permanente (Fig. 26). Incluso a la dosis más baja probada, S. typhimurium ÚaroA se encontró presente en hígado, bazo y pulmón hasta 8 días después de la infección (Figura 27-30). Esto podría reflejar la biodistribución no óptima de S. typhimurium ÚaroA observada por otros [76].

En los experimentos de adaptación de dosis sobre toxicidad aguda realizados con ratones inmunocompetentes Y. enterocolitica ÚyopH, O, P, E, M, T úasd demostró ser tolerada con seguridad hasta 108 bacterias por ratón tras la administración por vía i.v.. Tal dosis se podría utilizar también en ensayos clínicos en seres humanos [77], con una diferencia de peso de varios miles de veces entre los ratones y el hombre. Como se sabe que los ratones detectan las bacterias Gram negativas de la misma manera que los seres humanos a través de TLR4 y tienden a responder de manera similar al mismo estímulo del lípido A [78], es poco probable que se produzca una toxicidad inicial debida a un choque séptico causado por el lípido A en pacientes humanos a las cargas bacterianas utilizadas hasta ahora en los ensayos clínicos [77]. Además, se ha propuesto que la falta de lípido A inmunoestimulador normal explica la variación observada en las pruebas clínicas con S. enterica VNP20009 [79]. Por tanto, podría ser más favorable reducir la carga bacteriana inicial administrada a los pacientes mientras se mantiene la estructura del lípido A de tipo salvaje para alcanzar una colonización tumoral óptima, donde se pueden obtener cargas más altas mediante la replicación bacteriana.

En el sitio de presencia bacteriana en el organismo, se lanzará una respuesta inmunitaria para combatir las bacterias. Tras la acumulación y el crecimiento bacteriano en el sitio de los tumores sólidos [76, 80-82]), el sistema inmunitario, después de la diseminación inicial de la bacteria, se activará en el sitio del tumor. Mientras que el choque séptico y la toxicidad aguda en los pacientes deben evitarse reduciendo la carga bacteriana inicial y/o reduciendo la endotoxicidad de las bacterias por modificaciones del lípido A, la estimulación del sistema inmunitario en el sitio del tumor es muy deseada, ya que ayuda al aclaramiento del tejido canceroso (inmunoterapia, inmunosensibilización). El actual ensayo clínico piloto de fase II (EudraCT Núm. 2005-005775-15) con S. entérica se basa en este efecto inmunoterapéutico y la toxicidad natural de las bacterias [83]. La inmunosensibilización es uno de los mecanismos clave de la Salmonela no equipada genéticamente que actúa sobre los tumores, ya que p. ej., Salmonella choleraesuis se acumula en los tumores e induce la infiltración de neutrófilos y una respuesta inmunitaria antitumoral [84]. Además, se ha demostrado que la activación del sistema inmunitario en el sitio del tumor no previene una aplicación múltiple de bacterias en la oncoterapia [85]. En resumen, la respuesta inmunitaria desencadenada por la terapéutica del cáncer bacteriano debe subdividirse en una fase aguda no deseada, que debe mantenerse baja, y una activación en fase posterior deseada, que ayuda a la erradicación del tumor. Esto se puede lograr mediante la administración de dosis altas de bacterias endotóxicas inferiores o mediante la administración de niveles inferiores de bacterias endotóxicas normales, que tienen una mayor capacidad para colonizar y replicarse en tumores sólidos [79].

Estudios de biodistribución en un modelo murino de melanoma

Para validar bacterias Gram negativas con una o varias mutaciones en determinantes clave de virulencia como los efectores de T3SS como vehículo específico del tumor, se realizaron estudios de tumores de aloinjerto murino utilizando el modelo de melanoma B16F10 bien establecido ([86], ATCC Núm. CRL-6475). Cuando los tumores s.c. habían alcanzado un cierto tamaño (aproximadamente 100-200 mm3), los ratones fueron infectados i.v. con 2x105 ufc de Y. enterocolitica subsp. palearctica MRS40 o Y. enterocolitica subsp. palearctica MRS40 ÚyopH, O, P, E, M, T. Para permitir el crecimiento bacteriano, los ratones se pretrataron 24 h antes de la infección con desferoxamina. Los ratones infectados con la cepa MRS40 de Y. enterocolitica subsp. palearctica wt tuvieron una mayor puntuación para la apariencia física y el comportamiento (Figura 31-32) y mostraron una pérdida de peso significativa durante las primeras 48 de infección (Fig.33), lo que instó a los autores de la presente invención a sacrificar todos los ratones de este grupo ya el día 2 después de la infección. Por el contrario, los ratones infectados con la cepa MRS40 ÚyopH, O, P, E, M, Tde Y. enterocolitica subsp. palearctica de virulencia atenuada no mostraron una pérdida de peso significativa y obtuvieron una puntuación normal para la apariencia física y el comportamiento. (Figura 31-33) todavía el día 4 después de la infección. En los ratones infectados con la cepa wt (Y. enterocolitica subsp. palearctica MRS40) se detectaron bacterias vivas en todos los órganos evaluados y, además, en la sangre (Fig. 35). Si bien se encontraron bacterias wt presentes en el tumor sólido maligno, se encontraron recuentos igualmente altos o más altos en otros órganos, los más altos en el bazo (Fig. 35). En marcado contraste, en ratones infectados con Y. enterocolitica subsp. palearctica MRS40 ÚyopH, O, P, E, M, T las bacterias vivas se encontraron principalmente en el tumor sólido maligno el día 1 después de la infección, con recuentos bacterianos bajos observados en el bazo, el hígado y los pulmones. En particular, el día 4 después de la infección, el recuento bacteriano en el tumor sólido maligno había aumentado en algunos órdenes de magnitud (alcanzando más de 108 ufc/g de tejido tumoral), mientras que en todos los demás órganos evaluados los recuentos bacterianos cayeron por debajo del límite de detección (Fig. 34). Y. enterocolitica subsp. palearctica MRS40 ÚyopH, O, P, E, M, T se acumuló así el día 4 después de la infección con una razón de aproximadamente (como mínimo) un millón de veces en el sitio del tumor sólido maligno en comparación con el bazo o el hígado (cuando se calcula la razón frente al límite de detección). Estos resultados validan esta estrategia para la atenuación de la virulencia mediante la mutación de determinantes clave de la virulencia para generar un vehículo bacteriano dirigido específicamente al tumor sólido maligno.

Estudios de biodistribución en un modelo murino de cáncer de mama

Para validar bacterias Gram negativas con una o varias mutaciones en determinantes clave de virulencia como los efectores de T3SS como vehículo específico del tumor, se realizaron estudios de aloinjertos de tumores murinos utilizando el modelo 4T1 bien establecido de cáncer de mama (ATCC Núm. CRL-2539). Cuando los tumores s.c. habían alcanzado un cierto tamaño (aproximadamente 100-200 mm3), los ratones fueron infectados i.v. con 2x105 ufc Y. enterocolitica subsp. palearctica MRS40 ÚyopH, O, P, E, M, T. Para permitir el crecimiento bacteriano, los ratones se pretrataron 24 h antes de la infección con desferoxamina. Los ratones infectados con la cepa MRS40 ÚyopH, O, P, E, M, T de Y. enterocolitica subsp. palearctica de virulencia atenuada no mostraron una pérdida de peso significativa y puntuaron normalmente en apariencia física y comportamiento aún el día 8 después de la infección. En estos ratones infectados con Y. enterocolitica subsp. palearctica MRS40 ÚyopH, O, P, E, M, T se encontraron bacterias vivas exclusivamente en el tumor sólido maligno el día 8 después de la infección (Fig. 36). Y. enterocolitica subsp. palearctica MRS40 ÚyopH, O, P, E, M, T se acumuló así el día 8 después de la infección con una razón de aproximadamente (como mínimo) un múltiplo de 10.000 veces en el sitio del tumor sólido maligno en comparación con el bazo o el hígado (cuando se calcula la razón frente al límite de detección). Estos resultados validan esta estrategia para la atenuación de la virulencia mediante la mutación de determinantes clave de la virulencia para generar un vehículo bacteriano dirigido específicamente al tumor sólido maligno.

Generación de bacterias proapoptóticas mejoradas

En los experimentos mencionados anteriormente, se muestra que el suministro basado en T3SS de proteínas proapoptóticas (p. ej., t-BID (SEQ ID NO: 25) o BIM (SEQ ID NO: 21)) induce eficazmente la muerte celular tanto en células murinas como humanas, incluyendo células cancerosas, y que este efecto podría incrementarse cuando se utiliza t-BID murino optimizado para el uso de codones bacterianos (SEQ ID NO: 138). Es muy probable que este aumento de la muerte celular refleje una mayor cantidad de producción de proteínas y el suministro posterior a través de T3SS debido a los codones óptimos utilizados. Con el fin de optimizar el suministro de proteínas proapoptóticas, se han generado cepas transformadas con diferentes proteínas proapoptóticas según la Tabla IV.

Tabla IV: Cepas transformadas con diferentes proteínas proapoptóticas

El acortamiento de las proteínas suministradas a los dominios esenciales requeridos para la señalización (p. ej., el dominio BH3 de t-BID (SEQ ID NO: 138 o 200)) podría aumentar la eficacia de la destrucción celular. (Fig. 37). Sin desear vincularse a ninguna teoría, es probable que este aumento de la eficacia esté relacionado con una mayor cantidad de producción de proteína y después del suministro a través de T3SS debido al tamaño más pequeño de la proteína suministrada. La introducción de un conector entre la porción YopE y el dominio BH3 de tBID (SEQ ID NO: 210) disminuyó la eficacia, así como la extensión del dominio BH3 en 4 aminoácidos más (SEQ ID NO: 209) (Fig.37).

Además, se generaron cargas sintéticas con repeticiones de tales dominios esenciales (p. ej., el dominio BH3 de t-BID (SEQ ID NO: 202)) o combinaciones de estos dominios esenciales (p. ej., el dominio BH3 de t-BID y el dominio BH3 de BAX (SEQ ID NO: 203 y 211)). Sorprendentemente, se encontró que las repeticiones en tándem de los mismos o diferentes dominios BH3 daba como resultado una inducción mejorada de la apoptosis en líneas celulares cancerosas (incluidas las células 4T1 y B16F10, Fig. 37). Se encontró que la CI50 (concentración inhibidora semimáxima), que se refiere al número de bacterias por célula eucariótica (MOI) necesarias para destruir 50% de tales células, disminuyó con el suministro de repeticiones en tándem del dominio BH3 de tBID en comparación con un dominio único BH3 de tBID (Fig. 37). Este hallazgo fue sorprendente, ya que el tamaño de la proteína aumenta al fusionarse como segundo dominio BH3 de t-BID. Debido a esto, se esperarían menores niveles de expresión y suministro de YopE1-138-(BH3 de tBID)2 (SEQ ID NO: 202) en comparación con YopE1-138-BH3 de tBID (SEQ ID NO: 138 o 200), y podrían alcanzar como máximo niveles equivalentes. Con el fin de alcanzar un aumento en la actividad de destrucción de células, los dominios BH3 de tBID fusionados deben actuar simultáneamente uno al lado del otro tras el suministro por el T3SS a las células eucarióticas. En caso de que solo un dominio BH3 de tBID en la construcción YopEi-i38-(BH3 de tBID)2 fuera funcional, en el mejor de los casos se podría esperar la misma eficacia que con YopE1-138-BH3 de tBID. Para aumentar la estabilidad genética de YopE1-138-(BH3 de tBID)2 (SEQ ID NO: 202) para estudios in vivo, los autores de la presente invención clonaron YopE1-138-(BH3 de tBID)2 (SEQ ID NO: 202) mediante recombinación homóloga en el plásmido de virulencia de Yersinia pYV en el sitio nativo de YopE y bajo el promotor de YopE nativo (utilizando plásmidos mutadores pSI_408 y pSI_419). Tales mutadores contienen la secuencia de ADN que codifica la proteína deseada, flanqueada por 200-250 pb de secuencias en ambos lados correspondientes al sitio del gen respectivo, donde tendrá lugar la integración. Estos plásmidos se transforman en E. coli Sm10 A pir, desde donde se movilizaron los plásmidos a la correspondiente cepa de Y. enterocolitica. Los mutantes que portaban el vector integrado se propagaron durante varias generaciones sin presión de selección. A continuación se utilizó sacarosa para seleccionar los clones que habían perdido el vector. Finalmente, los mutantes se identificaron mediante PCR de colonias. Las proteínas endógenas para el transporte por el T3SS (denominadas "proteínas externas de Yersinia", Yop) están codificadas por Y. enterocolitica en este plásmido de 70 kb, denominado plásmido de Virulencia de Yersinia (pYV), que adicionalmente codifica el aparato T3SS. Las cepas de Yersinia que codificaban YopE1-138-(BH3 de tBID) (s Eq ID NO: 138 o 200) o YopE1-138-(BH3 de tBID)2 (SEQ ID NO: 202) en el plásmido de virulencia de Yersinia pYV en el sitio nativo de YopE y bajo el promotor de YopE nativo se evaluaron para determinar su capacidad de inducir apoptosis en células cancerosas (incluidas las células 4T1 y B16F10, Fig. 38). Se encontró que la CI50 (concentración inhibidora semimáxima), que se refiere al número de bacterias por célula eucariótica (MOI) necesario para destruir 50% de tales células, disminuyó con el suministro de repeticiones en tándem del dominio BH3 de tBID en comparación con un dominio único BH3 de tBID, cuando ambas proteínas están codificadas en el plásmido de virulencia de Yersinia pYV en el sitio nativo de YopE y bajo el promotor nativo de YopE (Fig. 38). Esto está de acuerdo con los hallazgos del suministro de estas proteínas a través de plásmidos de expresión (Fig. 37). Nuevamente, este hallazgo fue sorprendente, ya que el tamaño de la proteína aumenta al fusionar un segundo dominio BH3 de t-BID. Debido a esto, se esperarían menores niveles de expresión y suministro de YopE1-138-(BH3 de tBID)2 (SEQ ID NO: 202) en comparación con YopE1-138-BH3 de tBID (SEQ ID NO: 138 o 200), y podrían alcanzar como máximo niveles equivalentes. Con el fin de alcanzar un aumento en la actividad de destrucción de células, los dominios BH3 de tBID fusionados deben actuar simultáneamente uno al lado del otro tras el suministro por el T3SS a las células eucarióticas. En caso de que solo un dominio BH3 de tBID en la construcción YopE1-138-(BH3 de tBID)2 fuera funcional, en el mejor de los casos se podría esperar la misma eficacia que con YopE1-138-BH3 de tBID. Además, las cepas de Yersinia que codificaban YopE1-138-(BH3 de tBID)2 (SEQ ID NO: 202) en el plásmido de virulencia de Yersinia pYV en el sitio nativo de YopE y bajo el promotor de YopE nativo se compararon en cuanto a su capacidad de inducir apoptosis en células cancerosas con el suministro derivado del plásmido de expresión (basado en pBad-MycHisA) de YopE1-138-(BH3 de tBID)2. De acuerdo con el mayor número de copias de pBad-MycHisA (20-25 copias) en comparación con pYV (se informan de 1 a 6 copias), el suministro de YopE1-138-(BH3 de tBID)2 (SEQ ID n O: 202) basado en pBad-MycHisAd dio como resultado un valor de CI50 ligeramente menor en las células 4T1 y B16F10 (Fig. 38).

Validación del crecim iento específico del tumor in vivo hasta el día 14 después de la administración bacteriana

El experimento de colonización tumoral por medio Y. enterocolitica modificada genéticamente se repitió en un modelo de aloinjerto murino singénico (modelo de cáncer de mama 4T1) y se siguió la colonización bacteriana durante dos semanas. Esta vez, los ratones se infectaron con 1*106 unidades formadoras de colonias (UFC) de Y. enterocolitica AyopH, O, P, E, M, T. Si bien los autores de la presente invención obtuvieron resultados similares al modelo B16F10 los primeros días posteriores a la infección, pudieron demostrar adicionalmente que la colonización tumoral se encuentra sistemáticamente el día 8 y hasta el día 14 después de la infección (Fig.39). Además, la colonización sigue siendo muy específica y solo se detectan recuentos bajos de bacterias en todos los demás órganos evaluados. (Fig. 40). Estos hallazgos indican que Y. enterocolitica AyopH, O, P, E, M, T es capaz de establecer una colonización persistente del tumor evitando así la eliminación por parte del sistema inmunitario.

Eficacia de Y. enterocolitica AHOPEMTen el retraso de la progresión del tumor

Para evaluar el impacto de YopE1-138-(BH3 de tBID)2 (SEQ ID NO: 202) suministrada a células tumorales in vivo, los autores de la presente invención realizaron estudios en ratones Balb/C de tipo salvaje con aloinjerto s.c. con células de cáncer de mama 4T1. El objetivo de los autores de la presente invención era evaluar la cepa Y. enterocolitica AHOPEMT que codificaba YopE1-138-(BH3 de tBID)2 (SEQ ID NO: 202) en el plásmido de virulencia de Yersinia pYV en el sitio nativo de YopE y bajo el promotor de YopE nativo. A los ratones se les inyectó i.v. PBS o 1*107 Y. enterocolitica AHOPPEM pYV-YopE1-138-(BH3 de tBID)2, una vez que el tumor alcanzó un tamaño de 150-250 mm3. El día de la inyección i.v. de las bacterias se definió como el día 0. Se midió el volumen del tumor durante los días siguientes (día 0 a día 9 después de la inyección i.v. de las bacterias) con calibradores. El volumen del tumor se normalizó al volumen del tumor el día 0 para compensar cualquier heterogeneidad inicial en el tamaño del tumor. El tratamiento con Y. enterocolitica AHOPPEM pYV-YopE1-138-(BH3 de tBID)2 mostró un impacto en la progresión del volumen tumoral, con una reducción tumoral estadísticamente significativa los días 8, 9 y 10 después de la administración bacteriana (Fig. 41). De manera importante, se encontró que Y. enterocolitica AHOPEMT sola no afectaba a la progresión del tumor en el modelo de cáncer murino 4T1 (Fig. 42). Estos hallazgos destacan que tales bacterias y su T3SS se pueden utilizarse para interferir en la progresión del tumor.

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67 Huang da, W, Sherman, B. T. y Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res 37, 1-13, doi:gkn923 [pii]10.1093/nar/gkn923 (2009).

68 Huang da, W. et al. DAVID gene ID conversion tool. Bioinformation 2, 428-430 (2008).

69 Schwerk, C. y Schulze-Osthoff, K. Regulation of apoptosis by alternative pre-mRNA splicing. Mol Cell 19, 1-13, doi:S1097-2765(05)01375-4 [pii]10.1016/j.molcel.2005.05.026 (2005).

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71 Aepfelbacher, M., Trasak, C. y Ruckdeschel, K. Effector functions of pathogenic Yersinia species. Thromb Haemost 98, 521-529 (2007).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante transformada con un vector que comprende en la dirección 5' a 3':

un promotor;

para su uso en un método de tratamiento de un tumor sólido maligno en un sujeto, en donde la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante es una cepa de Yersinia con producción deficiente de un sideróforo y se acumula en el tumor sólido maligno, comprendiendo el método la administración conjunta al sujeto de dicha cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante con un sideróforo, en donde la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante se administra en una cantidad suficiente para tratar al sujeto.

2. La cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante para uso según la reivindicación 1, en donde la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante tiene una producción deficiente de al menos una proteína efectora bacteriana que es virulenta para células eucarióticas.

3. La cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante para su uso según la reivindicación 1, en donde la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante tiene una producción deficiente de todas las proteínas efectoras bacterianas, que son virulentas para las células eucarióticas.

4. La cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante para su uso según la reivindicación 1, en donde la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante es una cepa de Yersinia mutante en la que todos los genes que codifican efectores que codifican proteínas efectoras bacterianas que son virulentas para las células eucarióticas se mutan de tal manera que la Yersinia resultante ya no produce ninguna proteína efectora bacteriana funcional que sea virulenta para las células eucarióticas.

5. La cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante para su uso según la reivindicación 4, en donde la cepa de Yersinia mutante es Y. enterocolitica y la señal de suministro de una proteína efectora bacteriana es la señal de suministro de una proteína efectora de T3SS bacteriano en donde la señal de suministro de la proteína efectora de T3SS bacteriano comprende los 138 aminoácidos N-terminales de la proteína efectora de Y. enterocolitica YopE.

6. La cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la proteína heteróloga se selecciona del grupo que consiste en proteínas implicadas en la apoptosis o la regulación de la apoptosis, reguladores del ciclo celular, proteínas de repetición de anquirina, proteínas de señalización celular, proteínas informadoras, factores de transcripción, proteasas, GTPasas pequeñas, proteínas relacionadas con GPCR, construcciones de fusión de nanocuerpos y nanocuerpos, efectores de T3SS bacteriano, efectores de T4SS bacteriano y proteínas virales.

7. Una cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante, en donde la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada es una cepa de Yersinia con producción deficiente de un sideróforo, en donde la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante tiene una producción deficiente de al menos una proteína efectora bacteriana que es virulenta para las células eucarióticas o tiene una producción deficiente de al menos una proteína bacteriana que es parte de una maquinaria del sistema de secreción, para su uso en un método de tratamiento de un tumor sólido maligno en un sujeto, en donde la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante se acumula en el tumor sólido maligno, comprendiendo el método la administración conjunta al sujeto de dicha cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante con un sideróforo, en donde la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante se administra en una cantidad que es suficiente para tratar al sujeto.

8. La cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante para su uso según la reivindicación 7, en donde la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante tiene una producción deficiente de todas las proteínas efectoras que son virulentas para las células eucarióticas y la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante expresa una enzima convertidora de profármacos.

9. La cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde se administran al sujeto de aproximadamente 105 a aproximadamente 109 bacterias de la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante.

10. La cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante se administra al sujeto según un régimen de dosificación que consiste en una sola dosis cada 2-20 días en un periodo de aproximadamente 20 a 60 días.

11. La cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -10, en donde los recuentos bacterianos de la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante en órganos donde no está presente ningún tumor sólido maligno están por debajo del límite de detección después de al menos cuatro días después de la última administración de la cepa bacteriana Gram negativa de virulencia atenuada recombinante al sujeto.