BR122023024697A2

BR122023024697A2 - Usos de uma cepa bacteriana gram-negativa recombinante de virulência atenuada e de uma composição farmacêutica compreendendo a referida cepa bacteriana

Info

Publication number: BR122023024697A2
Application number: BR122023024697-7A
Authority: BR
Inventors: Simon Ittig; Marlise Amstutz; Christoph Kasper; Guy R. Cornelis
Original assignee: Universität Basel
Priority date: 2015-11-19
Filing date: 2016-11-17
Publication date: 2023-12-26
Also published as: RS62152B1; AU2016358257A1; BR112018009753A2; ES2880431T3; EP3377094A1; CN108472348A; LT3377094T; HK1256137A1; PL3377094T3; EA201890868A1; JP2019500026A; PT3377094T; EP3903813A1; SI3377094T1; CA3003563A1; IL259052B2; SG11201803643TA; JP7060503B2; HRP20211191T1; EP3377094B1

Abstract

usos de uma cepa bacteriana gram-negativa recombinante de virulência atenuada e de uma composição farmacêutica compreendendo a referida cepa bacteriana. a presente invenção refere-se a cepas bacterianas gram-negativas recombinantes de virulência atenuada para uso em um método de tratamento de um tumor sólido maligno em um indivíduo.

Description

O CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere a cepas bacterianas Gram-negativas recombinantes de virulência atenuada para uso em um método de tratamento de um tumor sólido maligno em um indivíduo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Um dos principais problemas no tratamento de tumores sólidos malignos é a liberação de moléculas terapêuticas a células cancerígenas em quantidades suficientes, enquanto reduz os danos em células e tecidos não relacionados. As abordagens de tratamento mais comuns, cirurgia, quimioterapia e radioterapia, muitas vezes não conseguem curar pacientes, e os efeitos colaterais, como náusea e diarreia são enormes. Assim, várias outras estratégias terapêuticas foram exploradas, incluindo inibidores da angiogênese e imunoterapias.

[003] Para reduzir o dano ao tecido não cancerígeno, as abordagens que permitem o fornecimento direcionado de fármacos são de grande interesse. Por exemplo, são utilizados anticorpos que reconhecem estruturas superficiais de células tumorais e, em um caso ideal, ligam-se seletivamente a células tumorais. Para melhorar o mecanismo de tais anticorpos, eles podem ser conjugados a agentes terapêuticos ou a vesículas lipídicas embaladas com fármacos. Um dos desafios com essas vesículas é a liberação adequada do reagente ativo. Ainda mais complexo é o fornecimento de proteínas ou peptídeos terapêuticos, especialmente quando os mecanismos intracelulares são direcionados. Muitas maneiras alternativas foram tentadas para resolver o problema da liberação de proteínas terapêuticas em células eucarióticas, entre as quais estão "peptídeos de penetração celular" (CPP) ou tecnologias semelhantes, bem como várias metodologias baseadas em nanopartículas. Todas essas tecnologias têm a desvantagem de baixa eficácia e que a carga absorvida pela célula via endocitose pode acabar sendo degradada nos lisossomos. Além disso, o conflito entre a necessidade de estabilidade do carreador de carga no corpo humano e a exigência de desestabilização e liberação dentro da célula alvo constitui um problema intrínseco de tais tecnologias.

[004] Várias bactérias demonstraram se replicar dentro de tumores sólidos malignos quando administradas a partir de um local distal, incluindo Escherichia coli, Vibrio cholerae, Salmonella enterica, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa e Bifidobacteria. Atualmente, apenas o bacilo Calmette-Guérin (BCG, derivado de Mycobacterium bovis) é utilizado na prática clínica. O BCG é administrado para tratar o câncer superficial da bexiga, enquanto o mecanismo molecular subjacente permanece em grande parte desconhecido.

[005] Uma cepa bacteriana ideal para o tratamento de tumores sólidos malignos irá se acumular e proliferar especificamente no local do tumor, enquanto é erradicada em locais não relacionados. Nesse sentido, um veículo bacteriano ideal para terapia de câncer direcionada deve fornecer alto acúmulo no local de ação desejado, enquanto estiver minimamente presente em locais não relacionados. O desenvolvimento de tal cepa bacteriana para o tratamento de tumores sólidos malignos que é capaz, por exemplo, de distribuir carga produzida dentro de bactérias para o seu local de ação dentro das células cancerosas, ou seja, fora das bactérias, continua a ser um grande desafio.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] A presente invenção se refere a cepas bacterianas Gram-negativas recombinantes de virulência atenuada para uso em um método de tratamento de um tumor sólido maligno em um indivíduo. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece cepas bacterianas Gram-negativas recombinantes de virulência atenuada e o uso das mesmas para tratar um tumor sólido maligno em um indivíduo, em que as cepas bacterianas Gram-negativas recombinantes virulência de atenuada permitem a translocação de vários efetores do tipo III, mas também de efetores do tipo IV, de proteínas virais e, o mais importante, de proteínas eucarióticas funcionais em células do tumor sólido maligno.

[007] Em um primeiro aspecto, a presente invenção se refere a uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada transformada com um vetor que compreende na direção 5' para 3': um promotor; uma primeira sequência de DNA que codifica um sinal de liberação de uma proteína efetora bacteriana, operativamente ligada ao referido promotor; uma segunda sequência de DNA que codifica uma proteína heteróloga fundida na estrutura com a extremidade 3' da referida primeira sequência de DNA, para uso em um método de tratamento de um tumor sólido maligno em um indivíduo, em que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada se acumula no tumor sólido maligno, o método compreendendo administrar ao indivíduo a referida cepa bacteriana Gram- negativa recombinante de virulência atenuada, em que a cepa bacteriana Gram- negativa recombinante de virulência atenuada é administrada em uma quantidade que é suficiente para tratar o indivíduo.

[008] Do mesmo modo, a presente invenção se refere a um método de tratamento de um tumor sólido maligno em indivíduos, em que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada se acumula no tumor sólido maligno, compreendendo administrar ao indivíduo uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada transformada com um vetor que compreende na direção 5' para 3': um promotor; uma primeira sequência de DNA que codifica um sinal de liberação de uma proteína efetora bacteriana, operativamente ligada ao referido promotor; uma segunda sequência de DNA que codifica uma proteína heteróloga fundida na estrutura com a extremidade 3' da referida primeira sequência de DNA, em que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada é administrada em uma quantidade que é suficiente para tratar o indivíduo.

[009] Do mesmo modo, a presente invenção se refere ao uso de uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada transformada com um vetor que compreende na direção 5' para 3': um promotor; uma primeira sequência de DNA que codifica um sinal de liberação de uma proteína efetora bacteriana, operativamente ligada ao referido promotor; uma segunda sequência de DNA que codifica uma proteína heteróloga fundida na estrutura com a extremidade 3' da referida primeira sequência de DNA, para a fabricação de um medicamento para tratar um tumor sólido maligno em um indivíduo, em que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada se acumula no tumor sólido maligno.

[0010] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada, em que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada é deficiente na produção de pelo menos uma proteína efetora bacteriana que é virulenta para células eucarióticas ou é deficiente na produção de pelo menos uma proteína bacteriana que faz parte de uma maquinaria do sistema de secreção, para uso em um método de tratamento de um tumor sólido maligno em um indivíduo, em que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada se acumula no tumor sólido maligno, o método compreendendo administrar ao referido indivíduo a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada, em que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada é administrada em uma quantidade que é suficiente para tratar o indivíduo.

[0011] Do mesmo modo, a presente invenção se refere a um método de tratamento de um tumor sólido maligno em um indivíduo, em que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada se acumula no tumor sólido maligno, compreendendo administrar a um indivíduo uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada, em que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada é deficiente na produção de pelo menos uma proteína efetora bacteriana que é virulenta para células eucarióticas ou é deficiente na produção de pelo menos uma proteína bacteriana que é parte de uma maquinaria do sistema de secreção, em que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada é administrada em uma quantidade que é suficiente para tratar o indivíduo.

[0012] Do mesmo modo, a presente invenção se refere ao uso de uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada, em que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada é deficiente na produção de pelo menos uma proteína efetora bacteriana que é virulenta para células eucarióticas ou é deficiente na produção de pelo menos uma proteína bacteriana que faz parte de uma maquinaria do sistema de secreção, para a fabricação de um medicamento para tratar um tumor sólido maligno em um indivíduo, em que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada se acumula no tumor sólido maligno.

[0013] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica compreendendo uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada transformada com um vetor que compreende na direção 5' para 3': um promotor; uma primeira sequência de DNA que codifica um sinal de liberação de uma proteína efetora bacteriana, operativamente ligada ao referido promotor; uma segunda sequência de DNA que codifica uma proteína heteróloga fundida na estrutura com a extremidade 3' da referida primeira sequência de DNA e um carreador farmaceuticamente aceitável, para uso em um método de tratamento de um tumor sólido maligno em um indivíduo, em que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada se acumula no tumor sólido maligno, o método compreendendo administrar ao indivíduo a referida composição farmacêutica, em que a composição farmacêutica é administrada em uma quantidade que é suficiente para tratar o indivíduo.

[0014] Da mesma forma, a presente invenção se refere a um método de tratamento de um tumor sólido maligno em um indivíduo, em que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada se acumula no tumor sólido maligno, compreendendo administrar a um indivíduo uma composição farmacêutica compreendendo uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada transformada com um vetor que compreende na direção 5' para 3': um promotor; uma primeira sequência de DNA que codifica um sinal de liberação de uma proteína efetora bacteriana, operativamente ligada ao referido promotor; uma segunda sequência de DNA que codifica uma proteína heteróloga fundida na estrutura com a extremidade 3' da referida primeira sequência de DNA e um carreador farmaceuticamente aceitável, em que a composição farmacêutica é administrada em uma quantidade que é suficiente para tratar o indivíduo.

[0015] Do mesmo modo, a presente invenção se refere utilização de uma composição farmacêutica compreendendo uma cepa bacteriana Gram-negativa atenuada de virulência recombinante transformada com um vetor que compreende na direção 5 'para 3': um promotor; uma primeira sequência de DNA que codifica um sinal de liberação de uma proteína efetora bacteriana, operativamente ligada ao referido promotor; uma segunda sequência de DNA que codifica uma proteína heteróloga fundida na estrutura com a extremidade 3' da referida primeira sequência de DNA e um carreador farmaceuticamente aceitável, para a fabricação de um medicamento para tratar um tumor sólido maligno em um indivíduo, em que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada se acumula no tumor sólido maligno.

[0016] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica compreendendo uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada e um carreador farmaceuticamente aceitável, em que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada é deficiente na produção de pelo menos uma proteína efetora bacteriana que é virulenta para células eucarióticas ou é deficiente na produção de pelo menos uma proteína bacteriana que é parte de uma maquinaria do sistema de secreção, para uso em um método de tratamento de um tumor sólido maligno em um indivíduo, em que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada se acumula no tumor sólido maligno, o método compreendendo administrar ao indivíduo a referida composição farmacêutica, em que a composição farmacêutica é administrada em uma quantidade que é suficiente para tratar o indivíduo.

[0017] Da mesma forma, a presente invenção se refere a um método de tratamento de um tumor sólido maligno em um indivíduo, em que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada se acumula no tumor sólido maligno, compreendendo administrar a um indivíduo uma composição farmacêutica compreendendo uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada que é deficiente na produção de pelo menos uma proteína efetora bacteriana que é virulenta para células eucarióticas ou é deficiente na produção de pelo menos uma proteína bacteriana que faz parte de uma maquinaria do sistema de secreção e um carreador farmaceuticamente aceitável, em que a composição farmacêutica é administrada em uma quantidade que é suficiente para tratar o indivíduo.

[0018] Do mesmo modo, a presente invenção se refere ao uso de uma composição farmacêutica compreendendo uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada que é deficiente na produção de pelo menos uma proteína efetora bacteriana que é virulenta para células eucarióticas ou é deficiente na produção de pelo menos uma proteína bacteriana que faz parte de uma maquinaria do sistema de secreção e um carreador farmaceuticamente aceitável para a fabricação de um medicamento para tratar um tumor sólido maligno em um indivíduo, em que a cepa bacteriana Gram- negativa recombinante de virulência atenuada se acumula no tumor sólido maligno.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0019] Fig. 1: Caracterização da liberação da proteína T3SS. (A) Representação esquemática da secreção proteica dependente de T3SS no meio circundante (secreção in vitro) (lado esquerdo) ou em células eucarióticas (lado direito). I: mostra o sistema de secreção tipo 3. II: indica proteínas secretadas para o meio circundante. III: proteínas translocadas através da membrana para o citosol das células eucarióticas (VII). VI: mostra um trecho das duas membranas bacterianas nas quais o T3SS está inserido e o citosol bacteriano embaixo. IV: é uma proteína de fusão ligada ao fragmento N-terminal YopE1-138 (V). (B) Secreção in vitro de I: Y. enterocolitica E40 selvagem, II: Y. enterocolitica ?HOPEMT asd ou III: Y. enterocolitica ?HOPEMT asd + pBad_Si_2 tal como revelado por Western blotting em lisados bacterianos totais (IV) e sobrenadantes de cultura precipitados (V) utilizando um anticorpo anti-YopE.

[0020] Fig. 2: Caracterização da liberação da proteína T3SS em células epiteliais. (A) Coloração de imunofluorescência anti-Myc em células HeLa infectadas a uma MOI de 100 durante 1 h com I: Y. enterocolitica ?HOPEMT asd ou II: Y. enterocolitica ?HOPEMT asd + pBad_Si2. (B) Quantificação da intensidade da coloração de imunofluorescência anti-Myc de (A) nas células HeLa. Os dados foram combinados de n = 20 locais, barras de erro indicadas são erro padrão da média. I: não infectado, II: Y. enterocolitica ?HOPEMT asd ou III: Y. enterocolitica ?HOPEMT asd + pBad_Si2. O eixo y indica intensidade de coloração anti-Myc [unidade arbitrária], o eixo x indica o tempo de infecção em minutos. (C) Quantificação da intensidade da coloração de imunofluorescência de Anti-Myc nas células. Células HeLa foram infectadas por 1 hora com Y. enterocolitica ?HOPEMT asd + pBad_Si2 em um MOI indicado no eixo x. Os dados foram combinados de n = 20 locais, barras de erro indicadas são erro padrão da média. O eixo y indica intensidade de coloração anti-Myc [unidade arbitrária].

[0021] Fig. 3: Modificações da liberação de proteínas baseadas em T3SS permitem a localização nuclear de uma proteína de fusão YopE1-138 (EGFP). Sinal de EGFP em células HeLa infectadas com I: Y. enterocolitica ?HOPEMT asd ou II: Y. enterocolitica ?HOPEMT asd ?yopB contendo os plasmídeos III: + YopEi-i38- EGFP ou IV: +YopE1-138-EGFP-NLS a uma MOI de 100. O sinal de EGFP é mostrado em "a", para os núcleos de comparação de localização foram corados em "b".

[0022] Fig. 4: Modificações da liberação de proteínas baseadas em T3SS permitem a remoção do apêndice de YopE1-138. As células HeLa são infectadas com duas cepas diferentes de Y. enterocolitica ao mesmo tempo, o que é alcançado pela simples mistura das duas suspensões bacterianas. Uma cepa está distribuindo a proteínase de TEV fundida a YopE1-138, enquanto a outra cepa distribui uma proteína de interesse fundida a YopE1-138 com um ligante contendo um sítio de clivagem de protease de TEV duplo. Após a liberação de proteína na célula eucariótica, a protease de TEV clivará o apêndice de YopE1-138 da proteína de interesse. (A) células HeLa lisadas por Digitonina não infectadas (II) ou após infecção (MOI de 100) por 2 h com I: Y. enterocolitica ?HOPEMT asd e III: + pBad_Si_2, IV: + YopE1-138-2x Local de clivagem de TEV-Flag-INK4C, V: + YopE1-138- 2x Local de clivagem de TEV-Flag-INK4C e tratamento adicional durante a noite com protease de TEV purificada e VI: + YopE1-138-2x local de clivagem de TEV - Flag-INK4C e uma segunda cepa + YopE1-138-TEV foram analisadas por Western blotting anti-INK4C (mostrado em "a") quanto à presença do local de clivagem YopE1-138-2x TEV-Flag-INK4C ou a sua forma clivada Flag-INK4C. Como um Western blotting de controle de carregamento foi aplicado anti-Actina (mostrado em "b"). Em um caso (V), as células lisadas foram incubadas durante a noite com protease de TEV purificada. (B) Quantificação normalizada de actina da intensidade de coloração anti-INK4C (mostrada como [unidades arbitrárias] no eixo y) de (A) no tamanho do local de clivagem YopE1-138-2x TEV de tamanho completo-Flag-INK4C, onde a amostra IV é definida para 100%. I: Y. enterocolitica ?HOPEMT asd e IV: + YopEi-i38-2x Local de clivagem de TEV-Flag-INK4C, V: + YopE1-138-2x Local de clivagem de TEV-Flag-INK4C e tratamento adicional durante a noite com protease de TEV purificada e VI: + YopE1-138-2x Local de clivagem de TEV-Flag-INK4C e uma segunda cepa + YopE1-138-TEV. Os dados foram combinados de n = 2 experimentos independentes, as barras de erro indicadas são erro padrão da média. (C) células HeLa lisadas por Digitonina não infectadas (II) ou após infecção (MOI de 100) durante 2 h com I: Y. enterocolitica ?HOPEMT asd e III : + pBad_Si_2, IV: + YopE1-138-2x Local de clivagem de TEV-ET1-Myc, V: + YopE1-138-2x Local de clivagem de TEV-ET1-Myc e ainda tratamento noturno com protease de TEV purificada e local de clivagem de VI: + YopE1-138-2x local de clivagem TEV-ET1-Myc e uma segunda cepa + YopE1-138-TEV foram analisados por Western blotting anti-Myc (mostrado em "a") quanto à presença do local de clivagem YopE1-138-2x local de clivagem TEV- ET1-Myc ou a sua forma clivada ET1- Myc. Como um controle de carregamento Western blotting anti-Actina foi realizado (mostrada em "b"). Em um caso (V) as células lisadas foram incubadas durante a noite com protease TEV purificada.

[0023] Fig. 5: Liberação de proteínas efetoras bacterianas em células eucarióticas (A) As células HeLa foram infectadas com I: Y. enterocolitica ?HOPEMT asd portando II: pBad_Si2 ou III: YopE1-138-SopE a uma MOI de 100 durante o tempo indicado acima das imagens (2, 10 ou 60 minutos). Após a fixação, as células foram coradas para o citoesqueleto de actina (B) As células HeLa não foram infectadas (II) ou infectadas com I: Y. enterocolitica ?HOPEMT asd portando III: YopE1-138-SopE-Myc e em alguns casos co-infectadas com IV: YopE1-138-SptP no MOI indicado abaixo da tensão (MOI 50; MOI50:MOI50 ou MOI50:MOI100) por 1 h. Após fixação, as células foram coradas para o citoesqueleto de actina (mostrado em "a") e a presença da proteína de fusão YopE1-138-SopE-Myc foi seguida através de coloração anti-Myc (mostrada em "b").

[0024] Fig. 6: Liberação de proteínas efetoras bacterianas em células eucarióticas (A) Análise de Western blot de Phospho-p38 ("a"), p38 total ("b") e actina ("c") em células HeLa deixadas sem tratamento (II) ou infectadas por 75 min com I: Y. enterocolitica ?HOPEMT asdportando III: pBad_Si2 ou IV: YopEi- 138-OspF em um MOI de 100. As células foram estimuladas com TNFa nos últimos 30 minutos da infecção conforme indicado (+ significa adição de TNFa, - representa nenhum tratamento com TNFa) (B) Análise de Western blot de Phospho-Akt T308 ("a") e S473 ("b") e actina ("c") em células HeLa deixadas sem tratamento (II) ou infectadas por 22,5 ou 45 min (indicado abaixo das manchas) com I: Y. enterocolitica?HOPEMT asd portando III: pBad_Si2, IV: YopE1-138-SopE ou V: YopE1-138-SopB em um MOI de 100 (C) níveis de AMPc(em fmol/poço mostrado no eixo y) em células HeLa deixadas sem tratamento (I) ou infectadas durante 2,5 h com V: Y. enterocolitica?HOPEMT asd + YopE1-138-BepA, VI: Y. enterocolitica?HOPEMT asd + YopE1-138-BepAE305-final, VII: Y. enterocolitica ?HOPEMT asd + YopE1-138-BepGBid ou VIII: Y. enterocolitica?HOPEMT asd + pBad_Si2 em um MOI de 100. A toxina da cólera (CT) foi adicionada por 1 h como controle positivo para as amostras II (1 µg/mL), III (25 µg/mL) ou IV (50 µg/mLl). Os dados foram combinados de n = 3 experimentos independentes, barras de erro indicadas são erro padrão da média. A análise estatística foi realizada utilizando um teste t bicaudal desemparelhado (ns indica uma alteração não significativa, ** indica um valor de p < 0,01, *** indica um valor de p < 0,001).

[0025] Fig. 7: Liberação de tBid humana em células eucarióticas induz apoptose massiva. (A) Análise de Western blot de Caspase 3p17 clivada ("a") e actina ("b") em células HeLa deixadas sem tratamento (II) ou infectadas durante 60 min com I: Y. enterocolitica ?HOPEMT asd portando III: pBad_Si2, IV: YopE1- 138-Bid ou V: YopE1-138-t-Bid em um MOI de 100. Em alguns casos, as células foram tratadas com VI: 0,5 µM de Estaurosporina ou VII: 1 µM de Estaurosporina (B) Células HeLa lisadas por Digitonina não tratadas (II) ou após infecção por 1 h com I: Y. enterocolitica ?HOPEMT asdportando III: pBad_Si2, IV: YopE1-138-Bid ou V: YopE1-138-t-Bid em um MOI de 100 foram analisadas por Western blotting anti Bid ("a") permitindo a comparação de níveis de Bid endógeno (marcado com Z) para níveis de YopE1-138-Bid translocados (marcado com X) ou YopE1-138-tBid (marcado com Y). Como um controle de carregamento, foi realizado western blotting anti-Actina (mostrado em "b"). Em alguns casos, as células foram tratadas com VI: 0,5 µM de Estaurosporina ou VII: 1 µM de Estaurosporina (C) células HeLa foram deixadas sem tratamento (I) ou infectadas em um MOI de 100 por 1 h com II: Y. enterocolitica ?HOPEMT asd + pBad_Si2, III: Y. enterocolitica ?HOPEMT asd + YopE1-138-Bid, IV: Y. enterocolitica ?HOPEMT asd + YopE1-138-tBid. Em alguns casos, as células foram tratadas com V: 0,5 µM de Estaurosporina ou VI: 1 µM de Estaurosporina. Após a fixação, as células foram coradas para o citoesqueleto de actina (cinza).

[0026] Fig. 8: Fosfoproteoma dependente de tBiD: as células HeLa foram infectadas durante 30 min com Y. enterocolitica ?HOPEMT asd + YopE1-138-t-Bid em um MOI de 100 e como um controle com Y. enterocolitica ?HOPEMT asd + pBad_Si2. (A) representação gráfica do fosfoproteoma tBID. Proteínas contendo fosfopeptídeos que foram significativamente regulados de maneira dependente de tBid (cinza) (valor-q < 0,01) bem como proteínas relacionadas à apoptose conhecidas (cinza escuro) são representadas em uma rede STRING de interações proteína-proteína conhecidas e previstas (alta confiança, pontuação 0,7). Somente proteínas com pelo menos uma conexão em STRING são representadas. (B) Imagens confocais de células HeLa infectadas com Y. enterocolitica ?HOPEMT asd + pBad_Si2 (I) ou Y. enterocolitica ?HOPEMT asd + YopE1-138-t-Bid (II) revelam a indução de um fenótipo apoptótico após liberação de tBid. As células foram coradas para os núcleos com Hoechst ("a"), para F- actina com faloidina ("b"), para tubulina com um anticorpo anti-tubulina ("c") e para mitocôndrias com MitoTracker ("d"). Barra de escala representa 40µm.

[0027] Fig. 9: Descrição do arsenal de liberação baseada em secreção tipo III. (A) Mapas vetoriais dos plasmídeos de clonagem pBad_Si1 e pBad_Si2 usados para gerar construtos de fusão com YopE1-138. A chaperona SycE e a YopE1-138- fusão estão sob o promotor nativo de Y. enterocolitica. Os dois plasmídeos diferem apenas na presença de um EGFP induzido por arabinose presente no pBad_Si1 (B) local de clonagem múltipla seguindo diretamente o fragmento YopE1-138 nos plasmídeos pBad_Si1 e pBad_Si2.

[0028] Fig. 10: Caracterização da liberação de proteína T3SS em várias linhagens celulares. Coloração de imunofluorescência anti-Myc em fibroblastos Swiss 3T3 ("a"), células Jurkat ("b") e células HUVEC ("c") deixadas sem tratamento (II) ou infectadas com Y. enterocolitica?HOPEMT asd+ pBad_Si2 (I) no MOI indicado acima das imagens (MOI 25, 50, 100, 200 e 400 para HUVECs) durante 1 h.

[0029] Fig. 11: Dependência do T3SS da liberação de proteínas efetoras bacterianas em células eucarióticas. Células HeLa lisadas por Digitonina após infecção em um MOI de 100 para o tempo indicado acima das manchas (0, 5, 15, 10, 60 e 120 minutos) com Y. enterocolitica ?HOPEMT asd ?yopB + YopE1-138- SopE-Myc (I) ou Y. enterocolitica ?HOPEMT asd + YopE1-138-SopE-Myc (II) foram analisados por Western blotting anti-Myc. O tamanho correspondente a YopE1- 138-SopE-Myc é marcado com "a", enquanto o tamanho da proteína endógena c- Myc é marcado com "b".

[0030] Figs. 12 e 13: Secreção dependente de T3SS de várias outras proteínas no sobrenadante da cultura. Experimento de secreção in vitro de I: Y. enterocolitica?HOPEMT asd + YopEi-i38 fundida à proteína como indicado. O teor de proteína dos lisados bacterianos totais ("A") e dos sobrenadantes da cultura precipitada ("B") foi analisado por Western blotting utilizando um anticorpo anti-YopE. Os números escritos indicam o peso molecular em kDa na altura correspondente.

[0031] Figs. 14A a N: Cepas de Y. enterocolitica e S. enterica utilizadas neste estudo. Lista de cepas de Y. enterocolitica e S. enterica usadas neste estudo fornecendo informações sobre cepas, plasmídeos e proteínas antecedentes para liberação dependente de T3SS codificada em plasmídeos correspondentes. Além disso, são fornecidas informações sobre os oligonucleotídeos utilizados para a construção do plasmídeo correspondente, o plasmídeo de estrutura e resistências antibióticas.

[0032] Fig. 15: Liberação de tBid de murino, Bid BH3 de murino e BH3 de Bax de murino em células B16F10 induz apoptose massiva. Células B16F10 não infectadas (I) ou após infecção (MOI de 50) durante 2,5 h com Y. enterocolitica ?HOPEMT asd e II: + pBad_Si_2, III: + YopE1-138-códon otimizado de Y. enterocolitica de tBid de murino, IV: + YopE1-138- códon otimizado de Y. enterocolitica de Bid BH3 de murino ou V: + YopE1-138- códon otimizado de Y. enterocolitica de BH3 de Bax de murino. Após a fixação, as células foram coradas para o citoesqueleto de actina e núcleos (ambos em cinza).

[0033] Fig. 16: Liberação de tBid de murino, Bid BH3 de murino e BH3 de Bax de murino em células D2A1 induz apoptose massiva. Células D2A1 não infectadas (I) ou após infecção (MOI de 50) durante 2,5 h com Y. enterocolitica ?HOPEMT asd e II: + pBad_Si_2, III: + YopE1-138-códon otimizado de Y. enterocolitica de tBid de murino, IV: + YopE1-138- códon otimizado de Y. enterocolitica de Bid BH3 de murino ou V: + YopE1-138- códon otimizado de Y. enterocolitica de BH3 de Bax de murino. Após a fixação, as células foram coradas para o citoesqueleto de actina e núcleos (ambos em cinza).

[0034] Fig. 17: Liberação de tBid de murino, Bid BH3 de murino e BH3 de Bax de murino em células HeLa induz apoptose massiva. Células HeLa não infectadas (I) ou após infecção (MOI de 50) durante 2,5 h com Y. enterocolitica ?HOPEMT asd e II: + pBad_Si_2, III: + YopEi-i38- códon otimizado de Y. enterocolitica de tBid de murino, IV: + YopE1-138- códon otimizado de Y. enterocolitica de Bid BH3 de murino ou V: + YopE1-138- códon otimizado de Y. enterocolitica de BH3 de Bax de murino. Após a fixação, as células foram coradas para o citoesqueleto de actina e núcleos (ambos em cinza).

[0035] Fig. 18: Liberação de tBid de murino, Bid BH3 de murino e BH3 de Bax de murino em células 4T1 induz apoptose massiva. Células 4T1 não infectadas (I) ou após infecção (MOI de 50) durante 2,5 h com Y. enterocolitica ?HOPEMT asd e II: + pBad_Si_2, III: + YopE1-138-códon otimizado de Y. enterocolitica de tBid de murino, IV: + YopE1-138-códon otimizado de Y. enterocolitica de Bid BH3 de murino ou V: + YopE1-138-códon otimizado de Y. enterocolitica de BH3 de Bax de murino. Após a fixação, as células foram coradas para o citoesqueleto de actina e núcleos (ambos em cinza).

[0036] Fig. 19: Liberação de tBid de murino por S. enterica crescida sob condições de indução de T3SS SPI-1 em células eucarióticas induz apoptose. Análise de western blot da Caspase 3 p17 clivada em células HeLa deixadas sem tratamento (I) ou infectadas por 4 h com III: S. enterica aroA portando IV: SteA1- 20-t-Bid, V: SteAFL-Bid, VI: SopE1-81-t-Bid ou VII: SopE1-105-t-Bid em um MOI de 100. Para este experimento, todas as cepas de S. enterica aroA foram cultivadas sob condições de indução de T3SS SPI-1. Em alguns casos, as células foram tratadas com II: 1 µM de Estaurosporina. Os números escritos indicam o peso molecular em kDa na altura correspondente.

[0037] Fig. 20: Liberação de tBid de murino por S. enterica crescida sob condições de indução de T3SS SPI-2 em células eucarióticas induz apoptose. Análise de western blot da Caspase 3 p17 clivada em células HeLa deixadas sem tratamento (I) ou infectadas por 4h com III: S. enterica aroA portando IV: SteA1- 20-t-Bid, V: SteAFL-Bid, VI: SopE1-81-t-Bid ou VII: SopE1-105-t-Bid em um MOI de 100. Para este experimento, todas as cepas de S. enterica aroA foram cultivadas sob condições de indução de T3SS SPI-2. Em alguns casos, as células foram tratadas com II: 1 µM de Estaurosporina. Os números escritos indicam o peso molecular em kDa na altura correspondente.

[0038] Fig. 21: Secreção dependente de T3SS de S. enterica de várias proteínas do ciclo celular no sobrenadante da cultura. Experimento de secreção in vitro de S. enterica aroA + SteAFL (I, III, V, VII) ou SopE1-105 (II, IV, VI, VIII) fundida a proteínas como listadas a seguir. I e II: Ink4a- MycHis; III e IV: Ink4c- MycHis; V e VI: Mad2-MycHis; VII e VIII: Cdkl-MycHis. O teor de proteína dos sobrenadantes da cultura precipitada ("A") e dos lisados bacterianos totais ("B") foi analisado por Western blotting utilizando um anticorpo anti-myc. Os números escritos indicam o peso molecular em kDa na altura correspondente.

[0039] Fig. 22: Secreção dependente de T3SS de vários peptídeos conhecidos que interferem no ciclo celular no sobrenadante da cultura. Experimento de secreção in vitro de I: Y. enterocolitica ?HOPEMT asd + pBad_Si2. II-VII: Y. enterocolitica ?HOPEMT asd + YopE1-138 fundida a peptídeos como listados a seguir: II: Ink4A84-103; III: p107/RBL1657-662, IV: p21141-160D149A, V: p21145-160D149A, VI: p2117-33; VII: ciclina D2 139-147. O teor de proteína dos sobrenadantes da cultura precipitada ("A") e dos lisados bacterianos totais ("B") foi analisado por Western blotting utilizando um anticorpo anti-YopE. Os números escritos indicam o peso molecular em kDa na altura correspondente.

[0040] Fig. 23: fusão da proteína T3SS entregue para ubiquitina permite a remoção do apêndice de YopE1-138. Células HeLa são infectadas com uma cepa que distribui uma proteína de interesse fundida a YopE1-138 com uma ubiquitina diretamente fundida (YopE1-138-Ubi). Após a liberação da proteína na célula eucariótica, as proteases endógenas específicas da ubiquitina irão clivar o apêndice de YopE1-138-Ubi da proteína de interesse. Células HeLa lisadas por Digitonina não infectadas (I) ou após infecção (MOI de 100) por 1 h com II: Y. enterocolitica?HOPEMT asd + YopEi-i38-Flag-INK4C-MycHis ou III: + YopEi—i38- Marcador-Ubiquitina-INK4C-MycHis foram analisadas por Western blotting anti- INK4C para a presença de IV: YopE1-138-Marcador-Ubiquitina-INK4C-MycHis ou V: YopE1-138-Flag-INK4C-MycHis, a forma clivada VI: INK4C-MycHis e VII: o INK4C endógeno.

[0041] Fig. 24: O plasmídeo de virulência W227 de Yersinia enterocolitica, pYV. O plasmídeo de 69'673 bp da virulência da Yersinia (pYV) da cepa W227 desenhado à escala. Proteínas efetoras T3SS, origem de replicação e resistência ao arsênico (codificadas pelos genes arsC, B, R e H) são indicadas: I: origem de replicação, II: yopO, III: yopP, IV: yopQ, V: yopT, VI: sycT, VII: yopM, VIII: yopD, IX: yopB, X: sycD, XII: yopH, XIII: sycH, XIV: sycE, XV: yopE, XVI: yadA, XVII-XVXX: arsC, B, R e H.

[0042] Fig. 25: Validação da deleção de yop por análise de secreção in vitro. Análise de secreções in vitro de I: Y. enterocolitica?yopH,O,P,E,M,Tasd, II: Y. enterocolitica MRS40 tipo selvagem, III: Y. enterocolitica?yopH,O,P,E,M,Tasd + p-yopE. Marcas no lado direito indicam a altura de proteínas Yop específicas: IV: YopO, V: YopH, VI: YopM, VII: YopE.

[0043] Fig. 26: Estudo de escalonamento de dose em camundongos imunocompetentes: peso dos camundongos. O peso dos camundongos foi avaliado diariamente após a administração i.v. de infecção por bactérias. I: Dias, II: peso em gramas, III: Y. enterocolitica ?yopH,O,P,E,M,T asd, IV: S. enterica ?aroAadministrada por via i.v. na quantidade indicada (105, 106, 107, 108 cfu por animal).

[0044] Fig. 27: Estudo de escalonamento de dose em camundongos imunocompetentes: contagens no sangue. As contagens no sangue no momento indicado foram avaliadas por diluição seriada e contagem das unidades formadoras de colônia (CFU) resultantes. I: Dias, II: CFU por mL, III: Y. enterocolitica?yopH,O,P,E,M,T asd, IV: S. enterica AaroA administrada por via i.v. na quantidade indicada (105, 106, 107, 108cfu por animal).

[0045] Fig. 28: Estudo de escalonamento de dose em camundongos imunocompetentes: contagens no fígado. As contagens no fígado no momento indicado foram avaliadas por homogeneização de órgãos, diluição seriada e contagem das unidades formadoras de colônias (CFU) resultantes. I: Dias, II: CFU por g III: Y. enterocohtica ?yopH,O,P,E,M,T asd, IV: S. enterica AaroA administrada por via i.v. na quantidade indicada (105, 106, 107, 108cfu por animal).

[0046] Fig. 29: Estudo de escalonamento de dose em camundongos imunocompetentes: contagens no pulmão. As contagens no pulmão no momento indicado foram avaliadas por homogeneização de órgãos, diluição seriada e contagem das unidades formadoras de colônia (CFU) resultantes. I: Dias, II: CFU por g III: Y. enterocohtica?yopH,O,P,E,M,Tasd, IV:S. enterica AaroA administrada por via i.v. na quantidade indicada (105, 106, 107, 108cfu por animal).

[0047] Fig. 30: Estudo de escalonamento de dose em camundongos imunocompetentes: contagens no baço. As contagens no baço no momento indicado foram avaliadas por homogeneização de órgãos, diluição seriada e contagem das unidades formadoras de colônia (CFU) resultantes. I: Dias, II: CFU por g III: Y. enterocohtica ?yopH,O,P,E,M,T asd, IV: S. enterica AaroA administrada por via i.v. na quantidade indicada (105, 106, 107, 108cfu por animal).

[0048] Fig. 31: Biodistribuição de Y. enterocolitica subesp. palearctica no modelo de aloenxerto de camundongo de melanoma B16F10: pontuação para aparência física. I: Dias, II: pontuação, III: Y. enterocolitica MRS40 tipo selvagem, IV: Y. enterocolitica ?yopH,O,P,E,M,T. A seta indica o dia da infecção i.v. com 2 x 105bactérias.

[0049] Fig. 32: Biodistribuição de Y. enterocolitica subesp. palearctica no modelo de aloenxerto de camundongo de melanoma B16F10: pontuação para comportamento. I: Dias, II: pontuação, III: Y. enterocolitica MRS40 tipo selvagem, IV: Y. enterocolitica ?yopH,O,P,E,M,T. A seta indica o dia da infecção i.v. com 2 x 105bactérias.

[0050] Fig. 33: Biodistribuição de Y. enterocolitica subesp. palearctica no modelo de aloenxerto de camundongo de melanoma B16F10: peso dos camundongos. O peso dos camundongos foi avaliado diariamente após a administração i.v. de infecção por bactérias. I: Dias, II: peso corporal em gramas, III: Y. enterocolitica MRS40 tipo selvagem, IV: Y. enterocolitica ?yopH,O,P,E,M,T. A seta indica o dia da infecção i.v. com 2 x 105bactérias.

[0051] Fig. 34: Biodistribuição de Y. enterocolitica subesp. palearctica no modelo de aloenxerto de camundongo de melanoma B16F10: biodistribuição de Y. enterocolitica ?yopH,O,P,E,M,T. As contagens nos órgãos no momento indicado foram avaliadas por homogeneização de órgãos, diluição seriada e contagem das unidades formadoras de colônia (CFU) resultantes. I: Y. enterocolitica ?yopH,O,P,E,M,T, II: CFU por grama de tecido, III: dia 1, IV: dia 4, V: sangue, VI: baço, VII: fígado, VIII: pulmão, IX: tumor. * indica um camundongo sem tumor visível.

[0052] Fig. 35: Biodistribuição de Y. enterocolitica subesp. palearctica no modelo de aloenxerto de camundongo de melanoma B16F10: biodistribuição de Y. enterocolitica MRS40 tipo selvagem. As contagens nos órgãos no momento indicado foram avaliadas por homogeneizaçaão de órgãos, diluição em seriada e contagem de unidades formadoras de colônia (CFU) resultantes. I: Y. enterocolitica MRS40 tipo selvagem, II: CFU por grama de tecido, III: dia 1, IV: dia 4, V: sangue, VI: baço, VII: fígado, VIII: pulmão, IX: tumor.

[0053] Fig. 36: Biodistribuição de Y. enterocolitica subesp. palearctica no modelo aloenxerto de camundongo com câncer de mama 4T1: biodistribuição de Y. enterocolitica ?yopH,O,P,E,M,T. As contagens nos órgãos no dia 8 após infecção foram avaliadas por homogeneização de órgãos, diluição seriada e contagem de unidades formadoras de colônias (CFU) resultantes. I: Y. enterocolitica ?yopH,O,P,E,M,T, II: CFUporgrama de tecido, III:sangue, IV: baço, V: fígado, VI: pulmão, VII: tumor.

[0054] Fig. 37: Liberação de proteínas pró-apoptóticas aumentadas sintéticas. A liberação de proteínas sintéticas individuais consistindo em repetições simples ou em cadeia de domínios BH3 originárias de proteínas pró- apoptóticas t-BID ou BAX leva a indução de apoptose aumentada em células cancerosas 4T1 e B16F10. Células 4T1 (I) ou B16F10 (II) foram infectadas com Y. enterocolitica ?yopHOPEMTcodificando em pBad-MycHisA IV: domínio estendido de YopE1-138-BH3 de tBid, V: YopE1-138-ligante-BH3 de tBid, VI: YopE1- 138-BH3 de tBid, VII: YopE1-138-(BH3 de tBid)2, VIII: YopE1-138-BH3 de tBid - BH3 de BAX ou IX: YopE1-138-BAX BH3 - BH3 de tBid. Uma titulação das bactérias adicionadas às células (MOI) foi realizada para cada cepa, contagens celulares determinadas e IC50 calculado utilizando regressão não linear. MOI de IC50 é indicado (III).

[0055] Fig. 38: Indução de apoptose por proteínas pró-apoptóticas sintéticas codificadas por pYV. A liberação de uma repetição única ou em tandem do domínio BID BH3 codificado no pYV conduz a indução de apoptose em células cancerosas 4T1 e B16F10. Células 4T1 (I) ou B16F10 (II) foram infectadas com Y. enterocolitica?HOPEMT + IV: pYV-YopEi-i38-BH3-Bid, ou V: + pYV-YopEi—i38-(BH3-Bid)2 ou VI: com Y. enterocolitica ?HOPEMT pBad -MycHisA- YopE1-138-(BH3-Bid)2 por 3 horas. Uma titulação das bactérias adicionadas às células (MOI) foi realizada para cada cepa, contagens celulares determinadas e IC50 (III) calculados utilizando regressão não linear.

[0056] Fig. 39: Colonização de tumores de Y. enterocolitica ?yopH,O,P,E,M,T injetada i.v. no modelo de aloenxerto de câncer de mama 4T1. As contagens bacterianas em tumores são indicadas como unidades formadoras de colônia (CFU) por grama de tecido (III). As contagens foram avaliadas em tumores no dia 8 (I) e 14 (II) pós-infecção. Cada ponto representa um camundongo individual. A linha tracejada horizontal indica o limite de detecção.

[0057] Fig. 40: Biodistribuição de Y. enterocolitica ?yopH,O,P,E,M,T injetada i.v. no modelo de aloenxerto de câncer de mama 4T1. As contagens bacterianas no sangue (I), baço (II), fígado (III), pulmão (IV) e tumor (V) são indicadas como unidades formadoras de colônia (CFU) por grama de tecido ou por ml de sangue (VI). As contagens foram avaliadas no dia 14 após a infecção. Cada ponto representa um camundongo individual. A linha tracejada horizontal indica o limite de detecção. * indica um camundongo com grandes metástases encontradas no pulmão.

[0058] Fig. 41: Atraso da progressão tumoral em camundongos Balb/C do tipo selvagem aloenxertados s.c. com células de câncer de mama 4T1. Camundongos Balty/C do tipo selvagem aloenxertados s.c. com células de câncer de mama 4T1 foram injetados i.v. com I: PBS ou II: 1 x 107Y. enterocolitica ?HOPEMT+ pYV-YopE1-138 (BH3-Bid)2, uma vez que o tumor atingiu um tamanho de 150 a 250 mm3. O dia da injeção i.v. de bactérias foi definida como o dia 0. O volume do tumor foi medido ao longo dos dias seguintes (III; dia 0 a dia 9 após injeção i.v. de bactérias) com calibradores. O volume relativo do tumor, normalizado para o volume do tumor no dia 0, é indicado (IV) como mm3. A média é indicada com símbolos, as barras de erro mostradas mostram o erro padrão da média. A significância estatística é medida com ANOVA de 2 vias, * indica valor de p < 0,05, ** um valor de p < 0,005.

[0059] Fig. 42: Progressão tumoral em camundongos Balb/C de tipo selvagem aloenxertados s.c. com células de câncer de mama 4T1. Camundongos Balb/C do tipo selvagem aloenxertados s.c. com células de câncer de mama 4T1 foram injetado i.v. com I: PBS ou II: 1*107Y. enterocolitica dHOPEMT, uma vez que o tumor atingiu um tamanho de 150 a 250 mm3. O dia da injeção i.v. de bactérias foi definida como o dia 0. O volume do tumor foi medido ao longo dos dias seguintes (III; dia 0 a dia 9 após injeção i.v. de bactérias) com calibradores. O volume relativo do tumor, normalizado para o volume do tumor no dia 0, é indicado (IV) como mm3. A média é indicada com símbolos, as barras de erro mostradas mostram o erro padrão da média. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0060] A presente invenção se refere a cepas bacterianas Gram-negativas recombinantes de virulência atenuada para uso em um método de tratamento de um tumor sólido maligno em um indivíduo.

[0061] Para fins de interpretação deste relatório descritivo, as seguintes definições serão aplicadas e, sempre que apropriado, os termos usados no singular também incluirão o plural e vice-versa. É para ser entendido que a terminologia utilizada aqui é para o propósito de descrever apenas modalidades particulares e não pretende ser limitativa.

[0062] O termo "cepa bacteriana Gram-negativa" tal como aqui utilizado inclui as seguintes bactérias: Aeromonas salmonicida, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii, Anaeromyxobacter dehalogenans, Bordetella bronchiseptica, Bordetella parapertussis, Bordetella pertussis, Bradyrhizobium japonicum, Burkholderia cenocepacia, Burkholderia cepacia, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Chlamydia muridarum, Chlamydia trachmoatis, Chlamydophila abortus, Chlamydophila pneumoniae, Chromobacterium violaceum, Citrobacter rodentium, Desulfovibrio vulgaris, Edwardsiella tarda, Endozoicomonas elysicola, Erwinia amylovora, Escherichia albertii, Escherichia coli, Lawsonia intracellularis, Mesorhizobium loti, Myxococcus xanthus, Pantoea agglomerans, Photobacterium damselae, Photorhabdus luminescens, Photorabdus temperate, Pseudoalteromonas spongiae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas plecoglossicida, Pseudomonas syringae, Ralstonia solanacearum, Rhizobium sp, Salmonella enterica e outras Salmonella sp, Shigella flexneri e outras Shigella sp, Sodalis glossinidius, Vibrio alginolyticus, Vibrio azureus, Vibrio campellii, Vibrio caribbenthicus, Vibrio harvey, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio tasmaniensis, Vibrio tubiashii, Xanthomonas axonopodis, Xanthomonas campestris, Xanthomonas oryzae, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis. Cepas bacterianas Gram-negativas preferidas da invenção são cepas bacterianas Gram-negativas compostas pela família de Enterobacteriaceae e Pseudomonadaceae. A cepa bacteriana Gram-negativa da presente invenção é normalmente utilizada para liberação de proteínas heterólogas pelo T3SS bacteriano em células eucarióticas in vitro e/ou in vivo, preferivelmente in vivo.

[0063] O termo “cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada” como aqui utilizado se refere a uma cepa bacteriana Gram- negativa recombinante de virulência atenuada geneticamente transformada com um vetor. Um vetor útil da presente invenção é, por exemplo, um vetor de expressão, um vetor para inserção de plasmídeo cromossômico ou de virulência ou um fragmento de DNA ou RNA para inserção ou modificação de plasmídeo cromossômico ou de virulência. A virulência de tal cepa bacteriana Gram- negativa recombinante é usualmente atenuada por deleção de proteínas efetoras bacterianas com atividade de virulência que são transportadas por uma ou mais proteínas bacterianas, que são parte de uma maquinaria do sistema de secreção. Tais proteínas efetoras são administradas por uma maquinaria do sistema de secreção em células hospedeiras onde elas exercem sua atividade de virulência para várias proteínas hospedeiras e maquinarias celulares. Muitas proteínas efetoras diferentes são conhecidas, transportadas por vários tipos de sistemas de secreção e exibindo um grande repertório de atividades bioquímicas que modulam as funções das moléculas reguladoras do hospedeiro. A virulência da cepa bacteriana Gram-negativa recombinante aqui utilizada pode ser atenuada adicionalmente por falta de um sideróforo normalmente ou ocasionalmente produzido pela cepa bacteriana Gram-negativa de modo a que a cepa não produza o sideróforo, por exemplo, é deficiente na produção do sideróforo. Assim, em uma modalidade preferida, utiliza-se uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada nos métodos da invenção aos quais falta um sideróforo normalmente ou ocasionalmente produzido pela cepa bacteriana Gram-negativa de modo a que a cepa não produza sideróforo, por exemplo, é deficiente na produção de um sideróforo, mais preferencialmente uma cepa de Yersinia, em particular Y. enterocolitica MRS40 ?yopH,O,P,E,M,T, é utilizada nos métodos da invenção aos quais falta um sideróforo normalmente ou ocasionalmente produzido pela cepa bacteriana Gram-negativa para que a cepa não produza o sideróforo, por exemplo, é deficiente na produção de um sideróforo. A cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada utilizada nos métodos da invenção preferencialmente não produz pelo menos um, de preferência pelo menos dois sideróforos, por exemplo, é deficiente na produção de pelo menos um, de preferência pelo menos dois sideróforos, mais preferencialmente a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada utilizada nos métodos da invenção não produz qualquer sideróforo.

[0064] O termo "sideróforo", "sideróforo de ferro" ou "quelante de ferro", que são utilizados indistintamente aqui, se refere a compostos com elevada afinidade por ferro, por exemplo, compostos pequenos com alta afinidade por ferro.

[0065] Sideróforos de bactérias Gram-negativas são, por exemplo, Enterobactina e dihidroxibenzoilserina sintetizadas por Salmonella, Escherichia, Klebsiella, Shigella, Serratia (mas usadas por todas as enterobactérias), Pyoverdins sintetizadas por Pseudomonas, Vibriobactin sintetizada por Vibrio, Acinetobactin e Acinetoferrin por Acinetobacter, Yersiniabactin e Aerobactin sintetizadas por Yersinia, Ornibactin sintetizada por Burkholderia, Salmochelina sintetizada por Salmonella, Aerobactina sintetizada por Escherichia, Shigella, Salmonella e Yersinia, Alcaligina sintetizada por Bordetella, Bisucaberina sintetizada por Vibrio.

[0066] Os sideróforos incluem sideróforos de hidroxamato, catecolato e ligante misto. Vários sideróforos têm sido aprovados até o momento para uso em humanos, principalmente com o objetivo de tratar a sobrecarga de ferro. Sideróforos preferidos são Deferoxamina (também conhecida como desferoxamina B, desferroxamina B, DFO-B, DFOA, DFB ou desferal), Desferoxamina E, Deferasirox (Exjade, Desirox, Defrijet, Desifer) e Deferiprona (Ferriprox).

[0067] Os termos "cepa bacteriana Gram-negativa deficiente para produzir um aminoácido essencial para o crescimento" e "mutante auxotrófico" são aqui utilizados indistintamente e se referem a cepas bacterianas Gram-negativas que não podem crescer na ausência de pelo menos um aminoácido essencial fornecido exogenamente ou um precursor do mesmo. O aminoácido que a cepa é deficiente para produzir é, por exemplo, aspartato, ácido meso-2,6- diaminopimélico, aminoácidos aromáticos ou leucina-arginina [1]. Tal cepa pode ser gerada por, por exemplo, eliminação do gene aspartato-beta-semialdeído desidrogenase (?asd). Tal mutante auxotrófico não pode crescer na ausência de ácido meso-2,6-diaminopimélico exógeno [2]. A mutação, por exemplo, deleção do gene aspartato-beta-semialdeído desidrogenase é aqui preferida para uma cepa bacteriana Gram-negativa deficiente para produzir um aminoácido essencial para o crescimento da presente invenção.

[0068] O termo "cepa bacteriana Gram-negativa deficiente para produzir proteínas de adesão que se ligam à superfície celular ou matriz extracelular eucariótica" se refere a cepas bacterianas Gram-negativas mutantes que não expressam pelo menos uma proteína de adesão comparada com as proteínas de adesão expressas pela cepa correspondente tipo selvagem. As proteínas de adesão podem incluir, por exemplo, moléculas de adesão poliméricas estendidas como pili/fímbrias ou adesinas não fímbrias. As adesinas fimbriais incluem pili do tipo 1 (como E. coli Fim-pili com a adesina FimH), P-pili (como Pap-pili com a adesina PapG de E. coli), pili tipo 4 (como proteína pilina de, por exemplo, P. aeruginosa) ou curli (proteínas Csg com a adesina CsgA de S. enterica). Adesões não fimbriais incluem adesinas triméricas de autocarreador, tais como YadA de Y. enterocolitica, BpaA (B. pseudomallei), Hia (H. influenzae), BadA (B. henselae), NadA (N. meningitidis) ou UspAl (M. catarrhalis), bem como outras adesinas autocarreadoras, tais como AIDA-1 (E. coli), bem como outras adesinas/invasinas, tais como InvA de Y. enterocolitica ou Intimin (E. coli) ou membros da família Dr ou família Afa (E. coli). Os termos YadA e InvA como aqui utilizados se referem a proteínas de Y. enterocolitica. O autocarreador YadA [3] se liga a diferentes partes de colágeno, assim como fibronectina, enquanto a invasina InvA [4] se liga a ß-integrinas na membrana celular eucariótica. Se a cepa bacteriana Gram-negativa for uma cepa de Y. enterocolitica, a cepa é de preferência deficiente em InvA e/ou YadA.

[0069] Como aqui utilizado, o termo "família de Enterobacteriaceae" compreende uma família de bactérias Gram-negativas, em forma de bastonete, facultativamente anaeróbicas, encontradas no solo, água, plantas e animais, que frequentemente ocorrem como patógenos em vertebrados. As bactérias desta família compartilham uma fisiologia semelhante e demonstram uma conservação dentro de elementos funcionais e genes dos respectivos genomas. Além de ser oxidase negativa, todos os membros desta família são fermentadores de glicose e a maioria é redutores de nitrato.

[0070] As bactérias Enterobacteriaceae da invenção podem ser quaisquer bactérias dessa família, e especificamente inclui, mas não está limitado a, bactérias dos seguintes gêneros: Escherichia, Shigella, Edwardsiella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus, Erwinia, Morganella, Providencia ou Yersinia. Em modalidades mais específicas, a bactéria é das espécies Escherichia coli, Escherichia blattae, Escherichia fergusonii, Escherichia hermanii, Escherichia vuneris, Salmonella enterica, Salmonella bongori, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, Enterobacter aerogenes, Enterobacter gergoviae, Enterobacter sakazakii, Enterobacter cloacae, Enterobacter agglomerans, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Serratia marcescens, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica, Erwinia amylovora, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Proteus penneri, Proteus hauseri, Providencia alcalifaciens ou Morganella morganii. De um modo preferido, a cepa bacteriana Gram-negativa é selecionada do grupo consistindo nos gêneros Yersinia, Escherichia, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Chlamydia, Erwinia, Pantoea, Vibrio, Burkholderia, Ralstonia, Xanthomonas, Chromobacterium, Sodalis, Citrobacter, Edwardsiella, Rhizobiae, Aeromonas, Photorhabdus, Bordetella e Desulfovibrio, mais preferencialmente do grupo que consiste nos gêneros Yersinia, Escherichia, Salmonella e Pseudomonas, mais preferencialmente no grupo consistindo nos gêneros Yersinia e Salmonella.

[0071] O termo "Yersinia", tal como aqui utilizado, inclui todas as espécies de Yersinia, incluindo Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis e Yersinia pestis. É preferida a Yersinia enterocolitica.

[0072] O termo "Salmonella", tal como aqui utilizado, inclui todas as espécies de Salmonella, incluindo Salmonella enterica e S. bongori. A preferida é Salmonella enterica.

[0073] "Promotor", como aqui utilizado, refere'se a uma sequência de ácido nucleico que regula a expressão de uma unidade de transcrição. Uma "região promotora" é uma região reguladora capaz de ligar a RNA polimerase em uma célula e iniciar a transcrição de uma sequência codificante a jusante (direção 3'). Dentro da região promotora será encontrado um sítio de iniciação de transcrição (convenientemente definido por mapeamento com nuclease S1), bem como domínios de ligação a proteínas (sequências de consenso) responsáveis pela ligação da RNA polimerase tal como a região putativa - 35 e a caixa de Pribnow. O termo "operacionalmente ligado" quando se descreve a relação entre duas regiões de DNA significa simplesmente que elas estão funcionalmente relacionadas umas com as outras e estão localizadas no mesmo fragmento de ácido nucleico. Um promotor está operativamente ligado a um gene estrutural se ele controla a transcrição do gene e está localizado no mesmo fragmento de ácido nucleico que o gene. Normalmente o promotor é funcional na referida cepa bacteriana Gram-negativa, ou seja, o promotor é capaz de expressar a proteína de fusão da presente invenção, ou seja, o promotor é capaz de expressar a proteína de fusão da presente invenção sem engenharia genética adicional ou expressão de mais proteínas. Além disso, um promotor funcional não deve ser naturalmente contra-regulado para T3SS bacteriano.

[0074] O termo "liberação"aqui utilizado se refere ao transporte de uma proteína de uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada para uma célula eucariótica, incluindo as etapas de expressão da proteína heteróloga na cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada, secretando a(s) proteína(s) expressa(s) de tal cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada e translocando da(s) proteína(s) secretada(s) por tal cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada no citosol da célula eucariótica. Consequentemente, os termos "sinal de liberação"ou "sinal de secreção"que são utilizados de forma intercambiável se referem a uma sequência polipeptídica que pode ser reconhecida pelo sistema de secreção e translocação da cepa bacteriana Gram-negativa e dirige a liberação de uma proteína da cepa bacteriana Gram-negativa para células eucarióticas.

[0075] O termo "sinal de liberação de uma proteína efetora bacteriana" aqui utilizado se refere a um sinal de liberação de uma proteína efetora bacteriana funcional na cepa bacteriana Gram-negativa recombinante, ou seja, que permite que uma proteína heteróloga expressa na cepa bacteriana Gram- negativa recombinante seja secretada de tal cepa bacteriana Gram-negativa recombinante por um sistema de secreção como o sistema de secreção tipo III ou para ser translocado por tal cepa bacteriana Gram-negativa recombinante para o citosol de uma célula eucariótica por um sistema de secreção como o sistema de secreção tipo III. O termo "sinal de liberação de uma proteína efetora bacteriana" aqui utilizado também compreende um fragmento de um sinal de liberação de uma proteína efetora bacteriana, ou seja, versões mais curtas de um sinal de liberação, por exemplo, um sinal de liberação compreendendo até 10, de um modo preferido até 20, de um modo mais preferido até 50, de um modo ainda mais preferido até 100, em particular até 140 aminoácidos de um sinal de liberação, por exemplo, de um sinal de liberação que ocorre naturalmente. Assim, uma sequência nucleotídica, tal como, por exemplo, uma sequência de DNA que codifica um sinal de liberação de uma proteína efetora bacteriana pode codificar um sinal de liberação completo ou um fragmento do mesmo, em que o fragmento habitualmente compreende normalmente até 30, preferencialmente até 60, mais preferencialmente até 150, ainda mais preferencialmente até 300, em particular até 420 ácidos nucleicos.

[0076] Como aqui utilizado, a "secreção"de uma proteína se refere ao transporte de uma proteína heteróloga para fora através da membrana celular de uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada. A "translocação"de uma proteína se refere ao transporte de uma proteína heteróloga de uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada através da membrana plasmática de uma célula eucariótica para o citosol dessa célula eucariótica.

[0077] O termo "proteína bacteriana, que faz parte de uma maquinaria do sistema de secreção"como aqui utilizado se refere a proteínas bacterianas que constituem componentes essenciais do sistema de secreção do tipo 3 (T3SS), sistema de secreção do tipo 4 (T4SS) e sistema de secreção do tipo 6 (T6SS ) bacterianos, de preferência T3SS. Sem estas proteínas, o respectivo sistema de secreção é não funcional na translocação de proteínas para as células hospedeiras, mesmo se todos os outros componentes do sistema de secreção e a proteína efetora bacteriana a ser translocada ainda estiverem codificados e produzidos.

[0078] O termo "proteína efetora bacteriana", tal como aqui utilizado, se refere a proteínas bacterianas transportadas por sistemas de secreção, por exemplo, por proteínas bacterianas, que fazem parte de uma maquinaria do sistema de secreção em células hospedeiras. Tais proteínas efetoras são distribuídas por um sistema de secreção em uma célula hospedeira onde elas exercem, por exemplo, atividade de virulência para várias proteínas hospedeiras e maquinarias celulares. Muitas proteínas efetoras diferentes são conhecidas, transportadas por vários tipos de sistemas de secreção e exibindo um grande repertório de atividades bioquímicas que modulam as funções das moléculas reguladoras do hospedeiro. Os sistemas de secreção incluem o sistema de secreção do tipo 3 (T3SS), o sistema de secreção do tipo 4 (T4SS) e o sistema de secreção do tipo 6 (T6SS). Algumas proteínas efetoras (como Shigella flexneri IpaC) também pertencem à classe de proteína bacteriana, que fazem parte de uma maquinaria do sistema de secreção e permitem a translocação da proteína. A cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada aqui utilizada compreende normalmente proteínas bacterianas que constituem componentes essenciais do sistema de secreção do tipo 3 bacteriano (T3SS), sistema de secreção do tipo 4 (T4SS) e/ou sistema de secreção do tipo 6 (T6SS), de preferência do sistema de secreção do tipo 3 (T3SS).

[0079] O termo “proteína efetora T6SS” ou “proteína efetora T6SS bacteriana” como aqui utilizado se refere a proteínas que são injetadas naturalmente por sistemas T6S no citosol de células eucarióticas ou bactérias e a proteínas que são naturalmente secretadas por sistemas T6S que podem, por exemplo, formar poros de translocação na membrana eucariótica. O termo "proteína efetora T4SS" ou "proteína efetora T4SS bacteriana" como aqui utilizado se refere a proteínas que são injetadas naturalmente por sistemas T4S no citosol de células eucarióticas e a proteínas que são naturalmente secretadas por sistemas T4S que podem, por exemplo, formar o poro de translocação na membrana eucariótica.

[0080] O termo "proteína efetora T3SS" ou "proteína efetora T3SS bacteriana" tal como aqui utilizado se refere a proteínas que são naturalmente injetadas por sistemas T3S no citosol de células eucarióticas e a proteínas que são naturalmente secretadas por sistemas T3S que podem, por exemplo, formar o poro de translocação na membrana eucariótica (incluindo translocadores formadores de poros (como Yersinia YopB e YopD) e proteínas de ponta (como Yersinia LcrV). De um modo preferido, são utilizadas proteínas que são injetadas naturalmente por sistemas T3S no citosol de células eucarióticas. Esses fatores de virulência irão paralisar ou reprogramar a célula eucariótica em benefício do patógeno. Os efetores de T3S exibem um grande repertório de atividades bioquímicas e modulam a função de moléculas reguladoras fundamentais do hospedeiro [5,6] e incluem AvrA, AvrB, AvrBs2, AvrB3, AvrBsT, AvrD, AvrDl, AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB , AvrRpml, AvrRpt2, AvrXv3, CigR, EspF, EspG, EspH, ExoS, ExoT, GogB, GtgA, GtgE, família GALA de proteínas, HopAB2, HopAOl, Hopll, HopMl, HopNl, HopPtoD2, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, HopUl, HsvB, ICcsB, IpaA, IpaB, IpaC, IpaH, IpaH7.8, IpaH9.8, IpgB1, IpgB2, IpgD, LCRV, Mapa, OspCl, OspE2, OspF, OspG, Ospl, PipB, PipB2, PopB2, PopP2, PthXol, PthXo6, PthXo7, SifA, SifB, SipA/SspA, SipB, SipC/SspC, SipD/SspD, SlrP, SopA, SopB/SigD, Sop, SopE, SopE2, SpiC/SsaB, SptP, SpvB, SpvC, SrfH, SrfJ, Sse, SseB, SseC, SseD, SseF, SseG, Ssel/SrfH, SseJ, SseK1, SseK2, SseK3, SseL, SspH1, SspH2, SteA, SteB, SteC, SteD, SteE, TccP2, Tir, VirA, VirPphA, VopF, XopD, YopB, YopD Yop, YopH, YopJ, YopM, YopO, YopP, YopT, YpkA.

[0081] O termo "cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada que se acumula em um tumor sólido maligno" ou "a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada se acumula em um tumor sólido maligno", tal como aqui utilizado se refere a uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada que se replica dentro de um tumor sólido maligno, aumentando assim a contagem bacteriana desta cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada dentro do tumor sólido maligno. Surpreendentemente verificou-se que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada, após a administração ao indivíduo, acumula-se especificamente no tumor sólido maligno, ou seja, acumula-se especificamente no órgão onde o tumor maligno está presente, em que as contagens bacterianas da cepa bacteriana Gram- negativa recombinante de virulência atenuada em órgãos onde não existe tumor sólido maligno é baixa ou não é detectável.

[0082] No caso de bactérias residentes extracelulares como Yersinia, as bactérias se acumulam principalmente dentro do espaço intercelular formado entre as células tumorais. Bactérias de crescimento intracelular como Salmonellairão invadir principalmente células tumorais e residir dentro de tais células, enquanto acumulações extracelulares ainda podem ocorrer. Contagens bacterianas da cepa bacteriana gram-negativa recombinante de virulência atenuada acumulada dentro do tumor sólido maligno pode ser, por exemplo, na faixa de 104a 109bactéria por grama de tecido tumoral.

[0083] O termo "tumor sólido maligno" ou "indicação de tumor sólido maligno" aqui utilizado se refere a uma massa anormal de tecido que normalmente não contém quistos ou áreas líquidas. Tumores sólidos podem ser benignos (não câncer) ou malignos (câncer). Os tumores sólidos malignos são tratados com os métodos da presente invenção. Diferentes tipos de tumores sólidos malignos são nomeados para o tipo de células que os formam. Exemplos de tumores sólidos malignos são sarcomas, carcinomas e linfomas. As leucemias (cânceres do sangue) geralmente não formam tumores sólidos malignos (definição de acordo com o instituto nacional de câncer do NIH). Os tumores malignos sólidos incluem, mas não se limitam a, massa anormal de células que podem se originar de diferentes tipos de tecidos tais como fígado, cólon, coloretal, pele, mama, pâncreas, colo uterino, corpo uterino, bexiga, vesícula biliar, rim, laringe, lábio, cavidade oral, esôfago, ovário, próstata, estômago, testículos, glândula tireóide ou pulmão e, portanto, incluem tumores sólidos malignos de fígado, cólon, coloretal, pele, mama, pâncreas, colo uterino, corpo uterino, bexiga, vesícula biliar, rim, laringe, lábio, cavidade oral, esôfago, ovário, próstata, estômago, testículos, glândula tireóide ou pulmão. Os tumores sólidos malignos preferidos que podem ser tratados com os métodos da presente invenção são tumores sólidos malignos que se originam da pele, mama, fígado, pâncreas, bexiga, próstata e cólon e então incluem tumores sólidos malignos de pele, mama, fígado, pâncreas, bexiga, próstata e cólon. Os tumores sólidos malignos igualmente preferidos que podem ser tratados com os métodos da presente invenção são tumores sólidos malignos associados a câncer de fígado, tal como carcinoma hepatocelular.

[0084] O termo "proteína efetora bacteriana que é virulenta para células eucarióticas", tal como aqui utilizado, se refere a proteínas efetoras bacterianas, que são transportadas por sistemas de secreção para células hospedeiras onde exercem a sua atividade de virulência para várias proteínas hospedeiras e maquinarias celulares. Muitas proteínas efetoras diferentes são conhecidas, transportadas por vários tipos de sistemas de secreção e exibindo um grande repertório de atividades bioquímicas que modulam as funções das moléculas reguladoras do hospedeiro. Os sistemas de secreção incluem o sistema de secreção do tipo 3 (T3SS), o sistema de secreção do tipo 4 (T4SS) e o sistema de secreção do tipo 6 (T6SS). É importante ressaltar que algumas proteínas efetoras que são virulentas para células eucarióticas (como IpaC de Shigella flexneri) também pertencem à classe de proteínas bacterianas, que são parte de uma maquinaria do sistema de secreção. No caso de a proteína efetora bacteriana que é virulenta para células eucarióticas ser também essencial para a função da maquinaria de secreção, essa proteína está excluída desta definição. Proteínas efetoras T3SS que são virulentas para células eucarióticas se referem a proteínas como Y. enterocolitica YopE, YopH, YopJ, YopM, YopO, YopP, YopT ou Shigella flexneri OspF, IpgD, IpgBl ou Salmonella enterica SopE, SopB, SptP ou P. aeruginosa ExoS , ExoT, ExoU, ExoY ou E. coli Tir, Map, EspF, EspG, EspH, EspZ. Proteínas efetoras T4SS que são virulentas para células eucarióticas se referem a proteínas como Legionella pneumophila LidA, SidC, SidG, SidH, SdhA, SidJ, SdjA, SdeA, SdeA, SdeC, LepA, LepB, WipA, WipB, ylfa, YlfB, VipA, VipF VipD, VpDa, VpdB, DrrA, LegL3, LegL5, LegL7, LegLC4, LegLC8, LegC5, LegG2, CeglO, Ceg23, Ceg29 ou Bartonella henselae BepA, BepB, BepC, BepD, BepE, BepF BepG ou Agrobacterium tumefaciens VirD2, VirE2, VirE3, VirF ou H. pylori CagA ou Bordetella pertussis toxina pertussis. Proteínas efetoras de T6SS que são virulentas para células eucarióticas se referem a proteínas como proteínas VgrG de Vibrio cholerae (como VgrGl).

[0085] O termo “proteína efetora T3SS que é virulenta para células eucarióticas” ou “proteína efetora T3SS bacteriana que é virulenta para células eucarióticas” como aqui utilizado se refere a proteínas que são injetadas naturalmente por sistemas T3S no citosol de células eucarióticas e a proteínas que são secretadas naturalmente por sistemas T3S que podem, por exemplo, formar o poro de translocação na membrana eucariótica, que são fatores de virulência para células eucarióticas, ou seja, para proteínas que paralisam ou reprogramam a célula eucariótica em benefício do patógeno. Os efetores apresentam um grande repertório de atividades bioquímicas e modulam a função de mecanismos reguladores do hospedeiro cruciais, tais como, por exemplo, fagocitose e citoesqueleto de actina, sinalização inflamatória, apoptose, endocitose ou vias secretoras [5, 6] e incluem AvrA, AvrB, AvrBs2, AvrBS3, AvrBsT, AvrD, AvrDl, AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, AvrRpml, AvrRpt2, AvrXv3, CigR, EspF, EspG, EspE, EspZ, ExoS, ExoT, GogB, GtgA, GtgE, família GALA de proteínas, HopAB2, HopAOl, Hopll, HopMl, HopNl, HopPtoD2, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, HopUl, HsvB IcsB, IpaA, IpaH, IpaH7.8, IpaH9.8, IpgB1, IpgB2, IpgD, LCRV, Mapa, OspCl, OspE2, OspF, OspG, Ospl, PipB, PipB2, PopB, PopP2, PthXol, PthXo6, PthXo7, SifA , SifB, SipA/SspA, SlrP, SopA, SopB/SigD, SopD, SopE, SopE2, SpiC/SsaB, SptP, SpvB, SpvC, SrfH, srfJ, Sse, SseB, SseC, SseD, SseF, SseG, Ssel/SrfH, SseJ, SseKl, SseK2, SseK3, SseL, SspHI, SspH2, SteA, SteB, SteC, SteD, SteE, TccP2, Tir, VirA, VirPphA, VopF, XopD, YopE, YopH, YopJ, YopM, YopO, YopP, YopT, YpkA.

[0086] Genes efetores T3SS de Yersinia que são virulentos para uma célula eucariótica e podem ser deletados/mutados a partir de, por exemplo, Y. enterocoliticasão YopE, YopH, YopM, YopO, YopP (também denominado YopJ) e YopT [7]. Os respectivos genes efetores que são virulentos para uma célula eucariótica podem ser deletados/mutados de Shigella flexneri (por exemplo, OspF, IpgD, IpgBl), Salmonella enterica (por exemplo SopE, SopB, SptP), P. aeruginosa (por exemplo ExoS, ExoT, ExoU, ExoY) ou E. coli (por exemplo, Tir, Mapa, EspF, EspG, EspH, EspZ). As sequências de ácido nucleico destes genes estão disponíveis para os técnicos no assunto, por exemplo, na Base de Dados Genebank (yopH, yopO, yopE, yopP, yopM, yopT de NC 002120 GI: 10955536; proteínas efetoras S. flexneri de AF386526.1 GI: 18462515; efetores de S. enterica de NC 016810.1 GI: 378697983 ou FQ312003.1 GI: 301156631; efetores de P. aeruginosa de AE004091.2 GI: 110227054 ou CP000438.1 GI: 115583796 e proteínas efetoras de E. coli de NC 011601.1 GI: 215485161).

[0087] Para os fins da presente invenção, os genes são indicados por letras minúsculas e em itálico para serem distinguidos das proteínas. No caso de os genes (denotados por letras minúsculas e em itálico) estarem seguindo um nome de espécie bacteriana (como E. coli), eles se referem a uma mutação do gene correspondente na espécie bacteriana correspondente. Por exemplo, YopE se refere à proteína efetora codificada pelo gene yopE. Y. enterocolitica yopE representa um Y. enterocolitica tendo uma mutação no gene yopE.

[0088] Como aqui utilizado, os termos "polipeptídeo", "peptídeo", "proteína", "polipeptídica"e "peptídica" são utilizados de forma intercambiável para designar uma série de resíduos de aminoácidos ligados uns aos outros por ligações peptídicas entre os grupos alfa-amino e carboxila de resíduos adjacentes. Preferidas são proteínas que possuem uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos 10 aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos 20 aminoácidos.

[0089] De acordo com a presente invenção, "uma proteína heteróloga"inclui proteínas de ocorrência natural ou partes das mesmas e também inclui proteínas manipuladas artificialmente ou partes das mesmas. Como aqui utilizado, o termo "proteína heteróloga"se refere a uma proteína ou uma parte da mesma diferente da proteína efetora T3SS ou fragmento N-terminal da mesma, ao qual pode ser fundida. Em particular, a proteína heteróloga, tal como aqui utilizada, refere-se a uma proteína ou parte dela, que não pertence ao proteoma, ou seja, todo o complemento de proteína natural da cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada específica fornecida e utilizada pela invenção, por exemplo, que não pertencem ao proteoma, isto é, todo o complemento proteico natural de uma cepa bacteriana específica dos géneros Yersinia, Escherichia, Salmonella ou Pseudomonas. Normalmente, a proteína heteróloga é de origem animal, incluindo origem humana. De preferência, a proteína heteróloga é uma proteína humana. Mais preferencialmente, a proteína heteróloga selecionada do grupo consistindo de proteínas envolvidas na apoptose ou regulação de apoptose, reguladores do ciclo celular, repetições de anquirina, proteínas de sinalização celular, proteínas repórteres, fatores de transcrição, proteases, GTPases pequenas, proteínas relacionadas com GPCR, construtos de fusão de nanocorpo, por exemplo, nanocorpos, efetores bacterianos T3SS, efetores bacterianos de T4SS e proteínas virais. Particularmente preferencialmente, a proteína heteróloga é selecionada do grupo consistindo de proteínas envolvidas na apoptose ou regulação de apoptose, reguladores do ciclo celular, proteínas de repetição de anquirina, proteínas repórteres, GTPases pequenas, proteínas relacionadas a GPCR, construtos de fusão de nanocorpo, efetores T3SS bacterianos, efetores T4SS bacterianos e proteínas virais. Ainda mais particularmente preferidas são as proteínas heterólogas selecionadas do grupo que consiste em proteínas envolvidas na apoptose ou regulação de apoptose, reguladores do ciclo celular e proteínas de repetição de anquirina. As mais preferidas são proteínas envolvidas na apoptose ou regulação de apoptose, como proteínas heterólogas animais, preferencialmente humanas envolvidas em apoptose ou regulação de apoptose.

[0090] Em algumas modalidades, o vetor da cepa bacteriana Gram-neagtiva da presente invenção compreende duas segundas sequências de DNA que codificam duas proteínas heterólogas idênticas ou diferentes fundidas independentemente uma da outra na estrutura com a extremidade 3' da referida primeira sequência de DNA.

[0091] Em algumas modalidades, o vetor da cepa bacteriana Gram-negativa da presente invenção compreende três segundas sequências de DNA que codificam três proteínas heterólogas idênticas ou diferentes fundidas independentemente uma da outra na estrutura com a extremidade 3' da referida primeira sequência de DNA.

[0092] A proteína heteróloga expressa pela cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada tem usualmente um peso molecular entre 1 e 150 kDa, de preferência entre 1 e 120 kDa, mais preferencialmente entre 1 e 100 kDa, mais preferencialmente entre 15 e 100 kDa.

[0093] Em algumas modalidades, o vetor da cepa bacteriana Gram-negativa da presente invenção compreende domínios repetidos de uma proteína heteróloga ou dois ou mais domínios de diferentes proteínas heterólogas fundidas na estrutura com a extremidade 3' da referida primeira sequência de DNA.

[0094] O termo "proteínas heterólogas que pertencem à mesma classe funcional de proteínas", tal como é aqui utilizado, refere-se a proteínas heterólogas que têm a mesma função, por exemplo, proteínas heterólogas possuindo atividade enzimática, proteínas heterólogas que atuam na mesma via tal como, por exemplo, regulação do ciclo celular, ou partilham uma característica específica comum como, por exemplo, pertencente à mesma classe de proteínas efetoras bacterianas. Classes funcionais de proteínas são, por exemplo, proteínas envolvidas na apoptose ou regulação de apoptose, proteínas que atuam como reguladoras do ciclo celular, proteínas de repetição de anquirina, proteínas de sinalização celular, proteínas repórteres, fatores de transcrição, proteases, GTPases pequenas, proteínas relacionadas a GPCR, construtos de fusão de nanocorpo e nanocorpos, efetores de T3SS bacterianos, efetores T4SS bacterianos ou proteínas virais que atuam conjuntamente no processo biológico de estabelecimento de virulência para células eucarióticas.

[0095] De acordo com a presente invenção, "um domínio de uma proteína heteróloga"inclui domínios de proteínas de ocorrência natural e também inclui domínios de proteínas artificialmente modificadas. Como aqui utilizado, o termo “domínio de uma proteína heteróloga” se refere a um domínio de uma proteína heteróloga diferente de um domínio de uma proteína efetora de T3SS ou um domínio diferente de um domínio compreendendo o fragmento N-terminal da mesma, ao qual pode ser fundido para conseguir uma proteína de fusão. Em particular, o domínio de uma proteína heteróloga, como aqui utilizado, refere- se a um domínio de uma proteína heteróloga, que não pertence ao proteoma, ou seja, todo o complemento proteico natural da cepa bacteriana Gram-negativa recombinante específica fornecida e utilizada pela invenção, por exemplo, que não pertencem ao proteoma, isto é, todo o complemento proteico natural de uma cepa bacteriana específica dos gêneros Yersinia, Escherichia, Salmonella ou Pseudomonas. Normalmente, o domínio da proteína heteróloga é de origem animal, incluindo origem humana. De preferência, o domínio da proteína heteróloga é um domínio de uma proteína humana. Mais preferencialmente, o domínio da proteína heteróloga um domínio de uma proteína selecionada do grupo que consiste em proteínas envolvidas na apoptose ou regulação de apoptose, reguladores do ciclo celular, proteínas de repetição de anquirina, proteínas de sinalização celular, proteínas repórteres, fatores de transcrição, proteases, GTPases pequenas, proteínas relacionadas com GPCR, construtos de fusão de nanocorpo e nanocorpos, efetores de T3SS bacterianos, efetores de T4SS bacterianos e proteínas virais. De preferência, o domínio da proteína heteróloga é um domínio de uma proteína selecionada do grupo consistindo em proteínas envolvidas na apoptose ou regulação de apoptose, reguladores do ciclo celular, proteínas repetidas de anquirina, proteínas repórteres, GTPases pequenas, proteínas relacionadas com GPCR, construtos de fusão de nanocorpo, efetores de T3SS bacterianos, efetores de T4SS bacterianos e proteínas virais. Ainda mais particularmente preferidos são domínios de proteínas heterólogas selecionadas do grupo que consiste em proteínas envolvidas na apoptose ou regulação de apoptose, reguladores do ciclo celular e proteínas de repetição de anquirina. Os mais preferidos são domínios de proteínas envolvidas na apoptose ou regulação de apoptose, como proteínas animais envolvidas na apoptose ou regulação de apoptose, preferencialmente domínios de proteínas heterólogas humanas envolvidas na apoptose ou regulação de apoptose.

[0096] O termo “domínios repetidos de uma proteína heteróloga” como aqui utilizado se refere a uma proteína de fusão consistindo em várias repetições de um domínio de uma proteína heteróloga, em que estes domínios podem estar diretamente fundidos um com o outro ou onde um ligante variável, por exemplo, um ligante entre 1 e 30, preferivelmente entre 2 e 15, mais preferivelmente entre 3 e 10 aminoácidos, pode ser introduzido entre os domínios. De preferência, domínios repetidos idênticos ou domínios repetidos que têm uma identidade de sequência de aminoácidos superior a 80%, geralmente superior a 85%, preferencialmente superior a 90%, ainda mais preferencialmente superior a 95%, em particular superior a 96%, mais particularmente superior a 97%, ainda mais particular superior a 98%, mais particularmente superior a 99% são utilizados. Também preferidos são domínios idênticos que possuem uma identidade de aminoácidos de 100%. Preferivelmente, dois domínios repetidos, mais preferencialmente dois domínios repetidos idênticos ou dois domínios repetidos possuindo uma identidade de sequência de aminoácidos superior a 90%, preferivelmente superior a 95%, mais preferencialmente 100% são constituídos pela proteína de fusão como aqui referida. Mais de dois, por exemplo, três, quatro, cinco ou seis domínios repetidos também são contemplados pela presente invenção.

[0097] O termo "dois ou mais domínios de diferentes proteínas heterólogas", tal como aqui utilizado, se refere a uma proteína de fusão que consiste em uma ou várias repetições de, pelo menos, dois domínios de diferentes proteínas heterólogas, por exemplo, pelo menos dois domínios de proteínas heterólogas possuindo uma identidade de sequência de aminoácidos de 80% ou inferior, preferencialmente 60% ou inferior, mais preferivelmente 40% ou inferior, onde esses diferentes domínios podem ser diretamente fundidos entre si ou onde ligante variável, por exemplo, um ligante entre 1 e 30, preferivelmente entre 2 e 15, mais preferivelmente entre 3 e 10 aminoácidos, pode ser introduzido entre os domínios. De preferência, dois domínios de diferentes proteínas heterólogas são constituídos pela proteína de fusão como aqui referido. Mais de dois, por exemplo, três, quatro, cinco ou seis domínios de diferentes proteínas heterólogas são também contemplados pela presente invenção.

[0098] O domínio de uma proteína heteróloga expressa pela cepa bacteriana Gram-negativa recombinante tem normalmente um peso molecular entre 1 a 50 kDa, preferivelmente entre 1 a 30 kDa, mais preferencialmente entre 1 a 20 kDa, mais preferencialmente entre 1 a 10 kDa.

[0099] De acordo com a presente invenção, "proteínas envolvidas na apoptose ou regulação de apoptose" incluem, mas não estão limitadas a Bad, Bcl2, Bak, Bmt, Bax, Puma, Noxa, Bim, Bcl-xL, Apafl, Caspase 9, Caspase 3, Caspase 6, caspase 7, caspase 10, DFFA, DFFB, ROCK1, APP, CAD, ICAD, CAD, EndoG, AIF, HtrA2, Smac/Diablo, artes, ATM, ATR, Bok/Mtd, Bmf, Mcl-1 (S ), Família IAP, LC8, PP2B, proteínas 14-3-3, PKA, PKC, PI3K, Erkl/2, p90RSK, TRAF2, TRADD, FADD, Daxx, Caspase8, Caspase2, RIP, RAIDD, MKK7, TINTA, FLIPs, FKHR, GSK3, CDKs e seus inibidores como a família INK4 (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)) e a família Cipl/Wafl/Kipl-2 (p21/Wafl), p27(Kipl), p57(Kip2). De preferência, Bad, Bmt, Bcl2, Bak, Bax, Puma, Noxa, Bim, Bcl-xL, Caspase9, Caspase3, Caspase6, Caspase7, Smac/Diablo, Bok/Mtd, Bmf, Mcl-1(S), LC8, PP2B, TRADD, Daxx, Caspase8, Caspase2, RIP, RAIDD, FKHR, CDKs e seus inibidores como a família INK4 (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)), mais preferencialmente BIM, Bid, Bid truncada, FADD, Caspase 3 (e suas subunidades), Bax, Bad, Akt, CDKs e seus inibidores como a família INK4 (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19 (Ink4d)) são utilizados [8-10]. Além disso, proteínas envolvidas na apoptose ou regulação de apoptose incluem DIVA, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bid e tBid, Egl-1, Bcl-Gs, Citocromo C, Beclin, CED-13, BNIP1, BNIP3, BclIP3. B, Bcl-W, Ced-9, Al, NR13, Bfl-1, Caspase 1, Caspase 2, Caspase 4, Caspase 5, Caspase 8. As proteínas envolvidas na apoptose ou regulação de apoptose são selecionadas do grupo que consiste em proteínas pró-apoptóticas, proteínas anti-apoptóticas, inibidores de vias de prevenção de apoptose e inibidores de sinalização ou vias pró-sobrevivência. Proteínas pró- apoptóticas compreendem proteínas selecionadas do grupo consistindo de Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid e tBid, Bok, Apafl, Smac/Diablo, BNIP1, BNIP3, Bel-Gs, Beclin 1, Egl-1 e CED-13, Citocromo C, FADD, a família Caspase e CDKs e seus inibidores como a família INK4 (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d)) ou selecionados do grupo que consiste em Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid e tBid, Bok, Egl-1, Apafl, Smac/Diablo, BNIPL, BNIP3, Bcl-Gs, Beclin 1, Egl-1 e CED-13, Citocromo C, FADD e a família Caspase. Os preferidos são Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid e tBid, Bok, Egl-1, Apafl, BNIPl, BNIP3, Bcl-Gs, Beclin 1, Egl-1 e CED-13, Smac/Diablo, FADD, a família Caspase, CDKs e seus inibidores como a família INK4 (p16(Ink4a), p15(Ink4b), p18(Ink4c), p19(Ink4d) ). Igualmente preferidos são Bax, Bak, Diva, Bcl-Xs, Nbk/Bik, Hrk/Dp5, Bmf, Noxa, Puma, Bim, Bad, Bid e tBid, Bok, Apafl, BNIPl, BNIP3, Bcl-Gs, Beclin 1, Egl-1 e CED-13, Smac/Diablo, FADD, a família Caspase.

[00100] As proteínas anti-apoptóticas compreendem proteínas selecionadas do grupo que consiste em Bcl-2, Bcl-X1, Bcl-B, Bcl-W, Mcl-1, Ced-9, Al, NR13, família IAP e Bfl-1. Os preferidos são Bcl-2, Bcl-X1, Bcl-B, Bcl-W, Mcl-1, Ced-9, Al, NR13 e Bfl-1.

[00101] Os inibidores de vias de prevenção de apoptose compreendem proteínas selecionadas do grupo que consiste em Bad, Noxa e Cdc25A. Preferidos são Bad e Noxa.

[00102] Os inibidores da sinalização ou vias pró-sobrevivência compreendem proteínas selecionadas do grupo que consiste em PTEN, ROCK, PP2A, PHLPP, JNK, p38. Os preferidos são PTEN, ROCK, PP2A e PHLPP.

[00103] Em algumas modalidades, as proteínas heterólogas envolvidas na apoptose ou regulação da apoptose são selecionadas do grupo consistindo de proteínas BH3-apenas, caspases e proteínas de sinalização intracelular do controle do receptor de morte da apoptose. Proteínas BH3-apenas são preferidas. As proteínas BH3-apenas compreendem proteínas selecionadas do grupo que consiste em Bad, BIM, Bid e tBid, Puma, Bik/Nbk, Bod, Hrk/Dp5, BNIPL, BNIP3, Bmf, Noxa, Mcl-1, Bcl-Gs, Beclin 1, Egl-1 e CED-13. Preferidos são Bad, BIM, Bid e tBid, em particular, tBid.

[00104] As caspases compreendem proteínas selecionadas do grupo que consiste em Caspase 1, Caspase 2, Caspase 3, Caspase 4, Caspase 5, Caspase 6, Caspase 7, Caspase 8, Caspase 9, Caspase 10. São preferidas Caspase 3, Caspase 8 e Caspase 9.

[00105] As proteínas de sinalização intracelular do controle do receptor de morte da apoptose compreendem proteínas selecionadas do grupo que consiste em FADD, TRADD, ASC, BAP31, GULP1/CED-6, CIDEA, MFG-E8, CIDEC, RIPK1/RIP1, CRADD, RIPK3/RIP3, Crk., SHB, CrkL, DAXX, a família 14-3-3, FLIP, DFF40 e 45, PEA-15, SODD. Preferidos são FADD e TRADD.

[00106] Em algumas modalidades, duas proteínas heterólogas envolvidas na apoptose ou regulação de apoptose são compreendidas pela cepa bacteriana Gram-negativa e/ou o vetor da presente invenção, em que uma proteína é uma proteína pró-apoptótica e a outra proteína é um inibidor de vias de prevenção ou em que uma proteína é uma proteína pró-apoptótica e a outra proteína é um inibidor de sinalização ou vias pró-sobrevivência.

[00107] Proteínas pró-apoptóticas abrangidas pela presente invenção têm normalmente uma estrutura alfa-helicoidal, de preferência uma hélice hidrofóbica rodeada por hélices anfipáticas, e usualmente compreendem pelo menos um dos domínios BH1, BH2, BH3 ou BH4, compreendem preferencialmente pelo menos um domínio BH3. Normalmente as proteínas pró- apoptóticas abrangidas pela presente invenção não têm atividade enzimática.

[00108] As proteínas anti-apoptóticas abrangidas pela presente invenção têm normalmente uma estrutura alfa-helicoidal, de preferência uma hélice hidrofóbica rodeada por hélices anfipáticas e compreende uma combinação de diferentes domínios BH1, BH2, BH3 e BH4, de preferência uma combinação de diferentes BH1, BH2, BH3 e domínios BH4 em que estão presentes um domínio BH1 e BH2, mais preferencialmente BH4-BH3-BH1-BH2, BH1-BH2, BH4-BH1-BH2 ou BH3-BH1-BH2 (de N- ao C-teminal). Adicionalmente, proteínas contendo pelo menos um domínio BIR também são abrangidas.

[00109] Os inibidores de vias de prevenção de apoptose abrangidos pela presente invenção possuem normalmente uma estrutura alfa-helicoidal, de um modo preferido, uma hélice hidrofóbica rodeada por hélices anfipáticas, e normalmente compreendem um domínio BH3.

[00110] Os domínios BH1, BH2, BH3 ou BH4 têm, cada um, geralmente entre cerca de 5 a cerca de 50 aminoácidos de comprimento. Assim, em algumas modalidades, as proteínas heterólogas envolvidas na apoptose ou regulação de apoptose são selecionadas do grupo consistindo de proteínas heterólogas envolvidas na apoptose ou regulação de apoptose que são de cerca de 5 a cerca de 200, preferencialmente cerca de 5 a cerca de 150, mais preferencialmente cerca de 5 a cerca de 100, mais preferivelmente cerca de 5 a cerca de 50, em particular cerca de 5 a cerca de 25 aminoácidos de comprimento.

[00111] Em algumas modalidades a cepa bacteriana Gram-negativa da presente invenção é transformada com dois domínios de uma proteína heteróloga envolvida na apoptose ou regulação de apoptose, preferivelmente dois repetidos, mais preferivelmente dois domínios repetidos idênticos de uma proteína envolvida na apoptose ou regulação de apoptose ou dois domínios de diferentes proteínas envolvidas na apoptose ou regulação de apoptose, mais preferencialmente dois domínios repetidos idênticos de uma proteína envolvida na apoptose ou regulação de apoptose. Em algumas modalidades, a cepa bacteriana Gram-negativa da presente invenção é transformada com dois domínios de proteínas heterólogas envolvidas na apoptose ou regulação de apoptose, em que um é um domínio de uma proteína pró-apoptótica e o outro é um domínio de uma proteína que éum inibidor de vias de prevenção de apoptose ou em que um é um domínio de uma proteína pró-apoptótica e o outro domínio é um domínio de uma proteína que é um inibidor de sinalização ou vias de pró-sobrevivência.

[00112] Um domínio particular preferido é o domínio BH3 do indutor de apoptose tBID, mais particular o domínio BH3 compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NO.s: 217, 218, 219 e 220, preferencialmente SEQ ID NO.: 219 ou SEQ ID NO.: 220.

[00113] Igualmente preferido o domínio BH3 do regulador de apoptose BAX, mais particularmente o domínio BAX compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NO.s: 221, 222, 223 e 224, preferencialmente SEQ ID NO.: 223 ou SEQ ID NO.: 224. As sequências humanas e murinas são dadas em SEQ ID NO.s 217-224, mas os domínios BH3 de tBID e BAX de todas as outras espécies são igualmente incluídos.

[00114] Em algumas modalidades, os domínios repetidos das proteínas heterólogas são o domínio BH3, preferencialmente domínios BH3 repetidos de indutor de apoptose tBID, mais preferivelmente domínios BH3 repetidos do indutor de apoptose tBID compreendido por SEQ ID NO.: 219 ou SEQ ID NO.: 220 ou SEQ ID NO.: 202, ainda mais preferencialmente dois domínios BH3 repetidos de indutor de apoptose tBID, mais preferencialmente dois domínios BH3 repetidos do indutor de apoptose tBID compreendido por SEQ ID NO.: 219 ou SEQ ID NO.: 220 ou SEQ ID NO.: 202, em particular dois domínios BH3 repetidos do indutor de apoptose tBID compreendido pela sequência da SEQ ID NO.: 202. Assim, em uma modalidade preferida, a cepa bacteriana Gram-negativa e/ou o vetor da presente invenção compreende uma segunda sequência de DNA que codifica dois domínios repetidos de um domínio BH3, mais preferencialmente dois domínios BH3 repetidos do indutor de apoptose tBID. Os dois domínios repetidos podem estar ligados por um ligante de 1 a 30 aminoácidos de comprimento, de preferência 2 a 15 aminoácidos, mais preferencialmente de 3 a 10 aminoácidos de comprimento.

[00115] Em algumas modalidades, os dois ou mais domínios de diferentes proteínas heterólogas são domínios de proteínas heterólogas que pertencem à mesma classe funcional de proteínas, de preferência as diferentes proteínas heterólogas dos dois ou mais domínios são proteínas heterólogas diferentes da classe de proteínas envolvidas na apoptose ou regulação de apoptose. Em uma modalidade preferida, os dois ou mais domínios de diferentes proteínas heterólogas são o domínio BH3 do indutor de apoptose tBID e o domínio BH3 do regulador de apoptose BAX, em particular os domínios BH3 fundidos compreendidos pela sequência das SEQ ID NO.: 203 e 211. Os dois domínios de diferentes proteínas heterólogas podem ser ligados por um ligante de 1 a 30 aminoácidos de comprimento, de um modo preferido 2 a 15 aminoácidos, de um modo preferido 3 a 10 aminoácidos de comprimento.

[00116] Em algumas modalidades, as proteínas heterólogas são uma enzima conversora de pró-fármaco. Nestas modalidades, a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada expressa, de um modo preferido, expressa e secreta uma enzima conversora de pró-fármaco. Uma enzima conversora de pró-fármaco como aqui referido compreende enzimas que convertem pró-fármacos não tóxicos em um fármaco tóxico, preferivelmente enzimas selecionadas do grupo que consiste em citosina desaminase, nucleosídeo fosforilase de purina, timidina quinase, beta-galactosidase, carboxilesterases, nitroredutase, carboxipeptidases e beta- glicuronidases, mais preferencialmente, as enzimas selecionadas do grupo que consiste em citosina desaminase, nucleosídeo fosforilase de purina, timidina quinase e beta-galactosidase.

[00117] O termo "sítio de clivagem de protease", tal como aqui utilizado, refere-se a um motivo de aminoácido específico dentro de uma sequência de aminoácidos, por exemplo, em uma sequência de aminoácidos de uma proteína ou de uma proteína de fusão, que é clivada por uma protease específica, que reconhece o motivo de aminoácido. Para revisão veja [11]. Exemplos de sítios de clivagem de protease são motivos de aminoácidos, que são clivados por uma protease selecionada do grupo consistindo em enteroquinase (cadeia leve), enteropeptidase, protease de prescisão, protease de rinovírus humano (HRV 3C), protease de TEV, protease de TVMV, protease de FatorXa e trombina.

[00118] O seguinte motivo de aminoácidos é reconhecido pela respectiva protease: - Asp-Asp-Asp-Asp-Lys: Enteroquinase (cadeia leve)/Enteropeptidase - Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln/Gly-Pro: Protease Pré-Secção/protease do Rhinovirus humano (HRV 3C) - Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Ser e motivos modificados baseados em Glu-XX- Tyr-X-Gln-Gly/Ser (onde X é qualquer aminoácido) reconhecido pela protease de TEV (vírus do tabaco) - Glu-Thr-Val-Arg-Fen-Gln-Ser: protease de TVMV - Ile- (Glu ou Asp) -Gly-Arg: protease FatorXa - Leu-Val-Pro-Arg/Gly-Ser: Trombina.

[00119] Abrangida pelos locais de clivagem da protease, tal como é aqui usada, está a ubiquitina. Assim, em algumas modalidades preferidas, a ubiquitina é utilizada como local de clivagem de protease, ou seja, a terceira sequência de DNA codifica ubiquitina como local de clivagem de protease, que pode ser clivado por uma protease de processamento de ubiquitina específica no local do terminal N, por exemplo, que pode ser clivado por uma protease de processamento de ubiquitina específica denominada enzimas deubiquitinantes no local do terminal N endogenamente na célula onde a proteína de fusão foi administrada. A ubiquitina é processada no seu terminal C por um grupo de proteases C-terminais endógenas específicas da ubiquitina (enzimas deubiquitinantes, DUBs). Supõe-se que a clivagem de ubiquitina por DUBs ocorre no próprio terminal C da ubiquitina (após G76).

[00120] Um "indivíduo", "sujeito" ou "paciente"é um vertebrado. Em certas modalidades, o vertebrado é um mamífero. Mamíferos incluem, mas não estão limitados a primatas (incluindo primatas humanos e não humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Em modalidades preferidas, um indivíduo é um humano.

[00121] O termo "mutação" é aqui utilizado como um termo geral e inclui alterações de ambos os pares de bases simples e múltiplos pares de bases. Tais mutações podem incluir substituições, mutações de frameshift, deleções, inserções e truncamentos.

[00122] O termo "sinal de localização nuclear", tal como aqui utilizado, se refere a uma sequência de aminoácidos que marca uma proteína para importar para o núcleo de uma célula eucariótica e inclui preferencialmente um sinal de localização nuclear viral, tal como o NLS derivado de antígeno-T grande SV40 (PPKKKRV).

[00123] O termo "sítio de clonagem múltipla"como aqui utilizado se refere a uma sequência de DNA curta contendo vários sítios de restrição para clivagem por endonucleases de restrição, tais como Acll, Hindlll, Sspl, MluCI, Tsp509I, Pcil, Agel, BspMI, BfuAI, SexAI, Mlul, BceAI , HpyCH4IV, HpyCH4III, Bael, BsaXI, Afllll, SpeI, Bsrl, Bmrl, Bglll, Afel, Alul, Stul, Selo, Clal, BspDI, PI-SceI, Nsil, Asel, Swal, CspCI, Mfel, BssSI, BmgBI, Pmll , Dralll, Alel, EcoP15I, PvuII, AlwNI, BtsIMutI, TspRI, Ndel, Nlalll, CviAII, Fatl, MSIl, FspEI, Xcml, BstXI, PflMI, BccI, Ncol, BseYI, Faul, Smal, Xmal, TspMI, Nt.CviPII , LpnPI, Acil, SacII, BSrBI, Mspl, Hpall, ScrFI, BssKI, StyD4I, BsaJI, BslI, Btgl, Neil, Avrll, MnII, BbvCI, Nb.BbvCI, Nt.BbvCI, Sbfl, BpulOI, Bsu36I, EcoNI, HpyAV , BstNI, PspGI, Styl, Bcgl, Pvul, BstUI, EagI, RsrII, BsiEI, BsiWI, BsmBi, Hpy99I, MspAll, MspJI, SgrAI, Bfal, BspCNl, Xhol, Earl, Acul, Pstl, Bpml, Ddel, Sfcl, Aflll , BpuEI, Smll, Aval, BsoBI, MboII, Bbsl, Xmnl, Bsml, Nb.BsmI, EcoRI, Hgal, Aatll, Zral, Tth 1 II PflFI, PshAI, Ahdl, Drdl, Eco53kI, Trs, BseRI, Plel, Nt.BstNBI, Mlyl, Hinfl, EcoRV, Mbol, Sau3AI, DpnIIBfuCl, Dpnl, BsaBI, Tffl, BsrDI, Nb.BsrDI, Bbvl, Btsl, Nb.BtsI, BstAPI, SfaNI, Sphl, NmeAllI, Nael, NgoMIV, BglII, AsiSI, BtgZI, HinPlI, Hhal, BssHII, Notl, Fnu4HI, Cac8I, Mwol, Nhel, Bmtl, Sapl, BspQI, Nt.BspQI, Blpl, Tsel, ApeKI, Bsp 1286I, AlwI, Nt.AlwI, BamHI, Fokl, BtsCI, HaeIII, Phol, FseI, Sffl, Narl, Kasl, SfoI, PluTI, Ascl, Ecil, BsmFI, Apal, PspOMI, Sau96I, NlalV , Kpnl, Acc65I, Bsal, Hphl, BstEII, Avail, Banl, BaeGI, BsaHI, Banll, Rsal, CviQI, BstZ17I, BciVI, vSalI, Nt.BsmAI, BsmAI, BcoDI, ApaLI, Bsgl, Accl, Hpyl66II, Tsp45I, Hpal , Pmel, Hindi, BsiHKAI, Apol, Nspl, BsrFI, BstYI, Haell, CviKI- 1, EcoO109I, PpuMI, I-Ceul, SnaBI, I-Scel, BspHI, BspEI, Mmel, Taqal, Nrul, Hpyl88I, Hpyl88III, Xbal , Bell, HpyCH4V, Fspl, PI-PspI, Mscl, BsrGI, Msel, Pad, Psil, BstBI, Dral, PspXI, BsaWI, BsaAI, Eael, preferencialmente XhoI, Xbal, HindIII, Ncol, Notl, EcoRI, EcoRV, BamHI, Nhel, SacI, SalI, BstBI. O termo "sítio de clonagem múltipla", tal como aqui utilizado, refere-se ainda a uma sequência de DNA curta utilizada para eventos de recombinação, por exemplo, na estratégia de clonagem de Gateway ou para métodos, tais como montagem de Gibbson ou clonagem topo.

[00124] O termo "cepa de tipo selvagem" ou "tipo selvagem da cepa bacteriana Gram-negativa", tal como aqui utilizado, refere-se a uma variante de ocorrência natural ou uma variante que ocorre naturalmente contendo modificações genéticas permitindo o uso de vetores, tais como mutações de deleção em endonucleases de restrição ou genes de resistência a antibióticos. Estas cepas contêm DNA cromossômico, bem como, em alguns casos (por exemplo, Y. enterocolitica, S. fllexneri), um plasmídeo de virulência não modificado.

[00125] O termo "cepa de Yersinia do tipo selvagem" como aqui utilizado se refere a uma variante que ocorre naturalmente (como Y. enterocolitica E40) ou uma variante que ocorre naturalmente contendo modificações genéticas permitindo a utilização de vetores, tais como mutações de deleção em endonucleases de restrição ou genes de resistência a antibióticos (como Y. enterocolitica MRS40, o derivado sensível à ampicilina de Y. enterocolitica E40). Estas cepas contêm DNA cromossômico, bem como um plasmídeo de virulência não modificado (denominado pYV).

[00126] Y. enterocoliticasubespécie palearctica se refere às cepas de Y. enterocolitica pouco patogênicas, que estão em contraste com cepas virulentas mais altas da subespécie enterocolitica [12,13]. Y. enterocolitica subesp. palearctica, em comparação com Y. enterocolitica subesp. enterocolitica, carece de uma ilha de alta patogenicidade (HPI). Este HPI codifica o sideróforo de ferro chamado yersiniabactin [14]. A falta de yersiniabactin em Y. enterocolitica subesp. palearctica torna esta subespécie menos patogênica e dependente de ferro acessível sistêmico induzido por infecção persistente, por exemplo, no fígado ou baço [14]. O ferro pode ser tornado acessível para as bactérias em um indivíduo, por exemplo, por pré-tratamento com deferoxamina, um quelante de ferro utilizado para tratar a sobrecarga de ferro em pacientes [15].

[00127] O termo "compreende"é geralmente usado no sentido de incluir, isto é, permitindo a presença de uma ou mais características ou componentes.

[00128] O termo "cerca de" se refere a um intervalo de valores ± 10% de um valor especificado. Por exemplo, a frase "cerca de 200" inclui ± 10% de 200 ou de 180 a 220.

[00129] Em um aspecto, a presente invenção fornece uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada transformada com um vetor que compreende na direção de 5' para 3': um promotor; uma primeira sequência de DNA que codifica um sinal de liberação de uma proteína efetora bacteriana, operativamente ligada ao referido promotor; uma segunda sequência de DNA que codifica uma proteína heteróloga fundida na estrutura com a extremidade 3' da referida primeira sequência de DNA, para uso em um método de tratamento de um tumor sólido maligno em um indivíduo, em que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada se acumula no tumor sólido maligno, o método compreendendo administrar ao indivíduo a referida cepa bacteriana Gram- negativa recombinante de virulência atenuada, em que a cepa bacteriana Gram- negativa recombinante de virulência atenuada é administrada em uma quantidade que é suficiente para tratar o indivíduo.

[00130] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada, em que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada é deficiente na produção de pelo menos uma proteína efetora bacteriana que é virulenta para células eucarióticas ou é deficiente na produção de pelo menos uma proteína bacteriana que faz parte de uma maquinaria do sistema de secreção, para uso em um método de tratamento de um tumor sólido maligno em um indivíduo, em que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada se acumula no tumor sólido maligno, o método compreendendo administrar ao referido indivíduo a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada, em que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada é administrada em uma quantidade que é suficiente para tratar o indivíduo. É preferida uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada, em que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada é deficiente na produção de pelo menos uma proteína efetora bacteriana que é virulenta para células eucarióticas, para uso em um método de tratamento de tumor sólido maligno em um indivíduo, em que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada se acumula no tumor sólido maligno, o método compreendendo administrar ao indivíduo a referida cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada, em que cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada é administrada em uma quantidade suficiente para tratar o indivíduo.

[00131] Em uma modalidade da presente invenção, a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada que é deficiente na produção de pelo menos uma proteína efetora bacteriana que é virulenta para células eucarióticas ou que é deficiente na produção de pelo menos uma proteína bacteriana que é parte de uma maquinaria do sistema de secreção é transformada com um vetor que compreende na direção de 5' para 3': um promotor; uma primeira sequência de DNA que codifica um sinal de liberação de uma proteína efetora bacteriana, operativamente ligada ao referido promotor; uma segunda sequência de DNA que codifica uma proteína heteróloga fundida na estrutura com a extremidade 3' da referida primeira sequência de DNA.

[00132] Em uma modalidade da presente invenção, a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada ou a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada que é deficiente na produção de pelo menos uma proteína efetora bacteriana que é virulenta para células eucarióticas ou que é deficiente na produção de pelo menos uma proteína bacteriana que faz parte de uma maquinaria do sistema de secreção, é transformada com um vetor que compreende na direção 5' para 3': uma primeira sequência de DNA que codifica um sinal de liberação ou um fragmento da mesma a partir de uma proteína efetora bacteriana; uma segunda sequência de DNA que codifica uma proteína heteróloga fundida na estrutura com a extremidade 3' da referida primeira sequência de DNA. De preferência, a sequência de DNA que codifica uma proteína heteróloga é flanqueada na sua extremidade 3' por uma sequência de DNA homóloga à sequência de DNA do cromossoma ou do plasmídeo de virulência endógeno na extremidade 3' do sinal de liberação de uma proteína efetora bacteriana ou a um fragmento da mesma. Mais preferencialmente, esta sequência de DNA que flanqueia a proteína homóloga na sua extremidade 3'é homóloga da sequência de DNA e encontra-se dentro da 10kbp no cromossoma ou em um plasmídeo de virulência endógeno na extremidade 3' do sinal de liberação de uma proteína efetora bacteriana ou para um fragmento da mesma. Em particular, esta sequência de nucleotídeos flanqueando a proteína homóloga na sua extremidade 3'é homóloga da sequência de DNA e está dentro do mesmo operão no cromossoma ou em um plasmídeo de virulência endógeno como o sinal de liberação de uma proteína efetora bacteriana ou um fragmento da mesma. Nesta modalidade, a transformação é normalmente realizada de modo a que a primeira e a segunda sequências de DNA fundidas sejam inseridas por recombinação homóloga em um plasmídeo de virulência endógeno ou um cromossoma, de um modo preferido, em um plasmídeo de virulência endógeno, da cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada, e a primeira e segunda sequências de DNA fundidas estão operativamente ligadas a um promotor de um plasmídeo de virulência endógeno ou de um cromossoma, por exemplo, de uma ilha de patogenicidade cromossômica. De um modo preferido, a primeira e segunda sequências de DNA fundidas estão operativamente ligadas a um promotor de um plasmídeo de virulência endógeno. Nesta modalidade, a primeira sequência de DNA compreende um sinal de liberação ou um fragmento da mesma a partir de uma proteína efetora bacteriana, preferencialmente um fragmento da mesma, que fornece recombinação homóloga no sítio homólogo no cromossoma ou em um plasmídeo de virulência endógeno para resultar na segunda sequência de DNA a ser colocada em uma estrutura na extremidade 3' do sinal de liberação do plasmídeo de virulência cromossômico ou endógeno que está oprativamente ligado ao promotor endógeno.

[00133] Em uma modalidade adicional da presente invenção, a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada ou a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada que é deficiente na produção de pelo menos uma proteína efetora bacteriana que é virulenta para células eucarióticas ou que é deficiente na produção de pelo menos uma proteína bacteriana que faz parte de uma maquinaria do sistema de secreção, é transformada com uma molécula nucleotídica, preferivelmente uma molécula nucleotídica de DNA, compreendendo uma sequência nucleotídica codificando uma proteína heteróloga e uma sequência nucleotídica que seja homóloga ou idêntica a uma sequência nucleotídica que codifica um sinal de liberação de uma proteína efetora bacteriana ou que é homóloga ou idêntica a uma sequência nucleotídica que codifica um fragmento de um sinal de liberação de uma proteína efetora bacteriana, em que o sinal de liberação de uma proteína efetora bacteriana é codificado no cromossoma ou em um plasmídeo de virulência endógeno da cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada. De preferência, a sequência nucleotídica que é homóloga ou idêntica a uma sequência nucleotídica de um sinal de liberação de uma proteína efetora bacteriana ou de um fragmento da mesma, está localizada na extremidade 5' da sequência nucleotídica que codifica uma proteína heteróloga. Mais preferencialmente, a sequência nucleotídica que codifica uma proteína heteróloga é flanqueada na sua extremidade 3' por uma sequência nucleotídica homóloga à sequência de DNA do cromossoma ou do plasmídeo de virulência endógena na extremidade 3' do sinal de liberação de uma proteína efetora bacteriana ou um fragmento do mesmo. Ainda mais preferencialmente, esta sequência nucleotídica flanqueando a proteína homóloga na sua extremidade 3'é homóloga à sequência de DNA situada dentro de 10 kbp no cromossoma ou em um plasmídeo de virulência endógeno na extremidade 3' do sinal de liberação de uma proteína efetora bacteriana ou um fragmento do mesmo. Em particular, esta sequência de nucleotídeos flanqueando a proteína homóloga na sua extremidade 3'é homóloga à sequência de DNA dentro do mesmo operão no cromossoma ou em um plasmídeo de virulência endógeno que o sinal de liberação de uma proteína efetora bacteriana ou um fragmento da mesma. Nesta modalidade, a transformação é normalmente realizada de modo a que a sequência nucleotídica que codifica uma proteína heteróloga seja inserida em um plasmídeo de virulência endógeno ou em um cromossoma da cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada na extremidade 3' de um sinal de liberação de uma proteína efetora bacteriana codificada pelo cromossoma ou pelo plasmídeo de virulência endógeno, em que a proteína heteróloga fundida com o sinal de liberação é expressa e secretada.

[00134] No caso de a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada ser uma cepa de Yersinia, o plasmídeo de virulência endógeno para inserção é pYV (plasmídeo de virulência de Yersinia). No caso de a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada ser uma cepa de Salmonella, a localização endógena para inserção é um dos agrupamentos de genes denominados SpiI ou SpiII (para ilha de patogenicidade de Salmonella), uma posição em que uma proteína efetora é codificada em outro local ou alternativamente dos plasmídeos de virulência de Salmonella (SVPs).

[00135] De um modo preferido, a primeira e a segunda sequência de DNA ou a molécula nucleotídica são inseridas em um plasmídeo de virulência endógeno no sítio nativo de uma proteína efetora bacteriana, por exemplo, no sítio nativo de um fator de virulência, preferencialmente no caso de a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada ser uma cepa Yersinia, no sítio nativo de YopE ou outro Yop (YopH, YopO, YopP, YopM, YopT), preferencialmente no sítio nativo de YopE ou no caso de a cepa bacteriana Gram- negativa recombinante de virulência atenuada ser uma cepa de Salmonella no sítio nativo de uma proteína efetora codificada em SpiI, Spill ou codificada em outro local, de preferência no sítio nativo de uma proteína efetora codificada em Spil ou SpiII, mais preferencialmente no sítio nativo de SopE ou SteA. De um modo preferido, a primeira e a segunda sequência de DNA ou a molécula nucleotídica estão operativamente ligadas a um promotor nativo de uma proteína efetora bacteriana presente em um plasmídeo de virulência endógeno, por exemplo, no caso de a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada ser uma cepa de Yersinia para um promotor nativo de um gene virulon de Yersinia como delineado abaixo, mais preferencialmente para o promotor YopE nativo ou outro promotor Yop (YopH, YopO, YopP, YopM, YopT) , de preferência ao promotor YopE nativo ou no caso de a cepa bacteriana Gram- negativa recombinante de virulência atenuada ser uma cepa de Salmonella a um promotor nativo da ilha de patogenicidade Spil ou Spill ou de uma proteína efetora em outro local codificada como delineado abaixo, mais preferencialmente para o promotor SopE, InvB ou SteA nativo.

[00136] Em uma modalidade da presente invenção, a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada é selecionada do grupo consistindo nos gêneros Yersinia, Escherichia, Salmonella e Pseudomonas. Em uma modalidade, a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada é selecionada do grupo consistindo nos gêneros Yersinia e Salmonella. De um modo preferido, a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada é uma cepa de Yersinia, de um modo mais preferido, uma cepa de Yersinia enterocolitica. O mais preferido é Yersinia enterocolitica E40 (O:9, biotipo 2) [16] ou derivados sensíveis à ampicilina como Y. enterocolitica MRS40 (também denominada Y. enterocolitica subesp. palearctica MRS40) como descrito em [17]. Y. enterocolitica E40 e seu derivado Y. enterocolitica MRS40 como descrito em [17] é idêntico a Y. enterocolitica subesp. palearctica E40 e seu derivado Y. enterocolitica subesp. palearctica MRS40 como descrito em [12,14,18]. Também preferencialmente a cepa bacteriana Gram-negativa atenuada por virulência recombinante é uma cepa de Salmonella, mais preferencialmente uma cepa de Salmonella enterica. O mais preferido é Salmonella enterica Serovar Typhimurium SL1344 como descrito pela Public health England culture collection (NCTC 13347).

[00137] Em algumas modalidades da presente invenção, a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada é uma cepa que não produz um sideróforo, por exemplo, é deficiente na produção de um sideróforo, de preferência não produz sideróforos, por exemplo, é deficiente na produção de qualquer sideróforo. Tal cepa é, por exemplo, Y. enterocolitica subesp. palearctica MRS40 como descrito em [14,17] que não produz yersiniabactina e que é preferida.

[00138] Em uma modalidade da presente invenção, o sinal de liberação de uma proteína efetora bacteriana compreende uma proteína efetora bacteriana ou um fragmento N-terminal da mesma.

[00139] Em uma modalidade da presente invenção, o sinal de liberação de uma proteína efetora bacteriana é uma proteína efetora T3SS bacteriana compreendendo uma proteína efetora T3SS bacteriana ou um fragmento N- terminal da mesma em que a proteína efetora T3SS ou um fragmento N-terminal da mesma pode compreender um sítio de ligação da chaperona (chaperona). Uma proteína efetora T3SS ou um fragmento N-terminal da mesma que compreende um sítio de ligação da chaperona é particularmente útil como sinal de liberação na presente invenção. As proteínas efetoras T3SS preferidas ou fragmentos N-terminais das mesmas são selecionadas do grupo que consiste em SopE, SopE2, SptP, YopE, ExoS, SipA, SipB, SipD, SopA, SopB, SopD, IpgB1, IpgD, SipC, SifA, SseJ, Sse, SrfH, YopJ, AvrA, AvrBsT, YopT, YopH, YpkA, Tir, EspF, TccP2, IpgB2, OspF, Map, OspG, Ospl, IpaH, SspHl, VopF, ExoS, ExoT, HopAB2, XopD, AvrRpt2, HopAOl, HopPtoD2 , HopUl, família GALA de proteínas, AvrBs2, AvrDl, AvrBS3, YopO, YopP, YopE, YopM, YopT, EspG, EspH, EspZ, IpaA, IpaB, IpaC, VirA, IcsB, OspCl, OspE2, IpaH9.8, IpaH7.8, AvrB, AvrD, AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, VirPphA, AvrRpml, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, PopB, PopP2, AvrBs3, XopD e AvrXv3. Proteínas efetoras T3SS mais preferidas ou fragmentos N-terminais das mesmas são selecionadas do grupo consistindo em SopE, SptP, YopE, ExoS, SopB, IpgB1, IpgD, YopJ, YopH, EspF, OspF, ExoS, YopO, YopP, YopE, YopM, YopT, em que as proteínas efetoras T3SS ou os fragmentos N-terminais das mesmas mais preferidos são selecionados do grupo consistindo em IpgBl, SopE, SopB, SptP, OspF, IpgD, YopH, YopO, YopE, YopM, YopT, em particular YopE ou um fragmento N-terminal da mesma.

[00140] As proteínas efetoras T3SS igualmente preferidas ou fragmentos N- terminais das mesmas são selecionadas do grupo que consiste em SopE, SopE2, SptP, SteA, SipA, SipB, SipD, SopA, SopB, SopD, IppBl, IpgD, SipC, SifA, SifB, SseJ, Sse, SrfH, YopJ, AvrA, AvrBsT, YopH, YpkA, Tir, EspF, TccP2, IpgB2, OspF, Map, OspG, Ospl, IpaH, VopF, ExoS, ExoT, HopAB2, AvrRpt2, HopAOl, HopUl, família GALA de proteínas, AvrBs2, AvrDl, YopO, YopP, YopE, YopT, EspG, EspH , EspZ, IpaA, IpaB, IpaC, VirA, IcsB, OspCl, OspE2, IpaH9.8, IpaH7.8, AvrB, AvrD, AvrPphB, AvrPphC, AvrPphEPto, AvrPpiBPto, AvrPto, AvrPtoB, VirPphA, AvrRpml, HopPtoD2, HopPtoE, HopPtoF, HopPtoN, PopB, PopP2, AvrBs3, XopD e AvrXv3. As proteínas efetoras T3SS igualmente mais preferidas ou fragmentos N- terminais das mesmas são selecionadas do grupo constituído por: SopE, SptP, SteA, SifB, SopB, IpgBl, Ypg, Yop, Yop, Yop, Yop, Yop , das quais as proteínas efetoras T3SS igualmente mais preferidas ou fragmentos N-terminais das mesmas são selecionadas do grupo que consiste em IpgBl, SopE, SopB, SptP, SteA, SifB, OspF, IpgD, YopH, YopO, YopP, YopE e YopT, em particular SopE, SteA ou YopE ou um fragmento N-terminal da mesma, mais particular SteA ou YopE ou um fragmento N-terminal da mesma, mais particularmente YopE ou um fragmento N-terminal da mesma.

[00141] Em algumas modalidades, o sinal de liberação da proteína efetora T3SS bacteriana codificada pela primeira sequência de DNA compreende a proteína efetora T3SS bacteriana ou um fragmento N-terminal da mesma, em que o fragmento N-terminal da mesma inclui pelo menos os primeiros 10, de preferência pelo menos os primeiros 20, mais preferencialmente pelo menos os primeiros 100 aminoácidos da proteína efetora T3SS bacteriana.

[00142] Em algumas modalidades, o sinal de liberação da proteína efetora T3SS bacteriana codificada pela primeira sequência de DNA compreende a proteína efetora T3SS bacteriana ou um fragmento N-terminal da mesma, em que a proteína efetora T3SS bacteriana ou o fragmento N-terminal da mesma compreende um sítio de ligação da chaperona.

[00143] Proteínas efetoras T3SS preferidas ou um fragmento N-terminal das mesmas, que compreende um sítio de ligação da chaperona, compreendem as seguintes combinações de sítio de ligação da chaperona e proteína efetora T3SS ou fragmento N-terminal da mesma: SycE-YopE, InvB-SopE, SicP-SptP, SycT- YopT, SycO-YopO, SycN/YscB-YopN, SycH-YopH, SpcS-ExoS, CesF-EspF, SycD- YopB, SycD-YopD. Os mais preferidos são o SycE-YopE, o InvB-SopE, o SycT-YopT, o SycO-YopO, o SycN/Y scB-YopN, o SycH-YopH, o SpcS-ExoS, o CesF-EspF. O mais preferido é um YopE ou um fragmento N-terminal da mesma compreendendo o sítio de ligação da chaperona SycE, tal como um fragmento N-terminal de uma proteína efetora YopE contendo os 138 aminoácidos N-terminais da proteína efetora YopE designada aqui como YopE1-138 e como mostrado na SEQ ID NO.: 2 ou um SopE ou fragmento N-terminal compreendendo o sítio de ligação da chaperona InvB como um fragmento N-terminal de uma proteína efetora de SopE contendo 81 ou 105 aminoácidos N-terminais da proteína efetora SopE aqui designada como SopE1-81 ou SopE1-105, respectivamente, e como mostrado na SEQ ID NO.: 142 ou 143.

[00144] Em uma modalidade da presente invenção, a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada é uma cepa de Yersinia e o sinal de liberação da proteína efetora T3SS bacteriana codificada pela primeira sequência de DNA compreende uma proteína efetora YopE ou uma parte N- terminal, de preferência a proteína efetora de Y. enterocolitica YopE ou uma parte N-terminal da mesma. De preferência, o sítio de ligação de SycE está compreendido na parte N-terminal da proteína efetora YopE. Neste contexto, um fragmento N-terminal de uma proteína efetora YopE pode compreender os 12, 16, 18, 52, 53, 80 ou 138 aminoácidos N-terminais [19-21]. O mais preferido é um fragmento N-terminal de uma proteína efetora YopE contendo os 138 aminoácidos N-terminais da proteína efetora YopE, por exemplo, como descrito em Forsberg e Wolf-Watz [22] aqui designado como YopE1-138 e como mostrado em SEQ ID NO.: 2.

[00145] Em uma modalidade da presente invenção, a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada é uma cepa de Salmonella e o sinal de liberação da proteína efetora T3SS bacteriana codificada pela primeira sequência de DNA compreende uma proteína efetora SopE ou SteA ou uma parte N-terminal da mesma, de preferência a proteína efetora é Salmonella enterica SopE ou SteA ou uma parte N-terminal da mesma. De preferência, o sítio de ligação da chaperona está compreendido na parte N-terminal da proteína efetora SopE. Neste contexto, um fragmento N-terminal de uma proteína efetora SopE pode compreender os 81 ou 105 aminoácidos N- terminais. O mais preferido é o SteA de comprimento total e um fragmento N- terminal de uma proteína efetora de SopE contendo os 105 aminoácidos N- terminais da proteína efetora, por exemplo, como descrito em SEQ ID NO.: 142 ou 143.

[00146] Um técnico no assunto está familiarizado com métodos para identificar as sequências polipeptídicas de uma proteína efetora que são capazes de distribuir uma proteína. Por exemplo, um desses métodos é descrito por Sory et al. [16]. Resumidamente, as sequências polipeptídicas de, por exemplo, várias porções das proteínas Yop podem ser fundidas dentro de uma enzima repórter, tal como o domínio adenilato ciclase (ou Cya) da ciclolisina de Bordetella pertussis ativada por calmodulina. A liberação de uma proteína híbrida de Yop- Cya no citosol de células eucarióticas é indicada pelo aparecimento de atividade de ciclase nas células eucarióticas infectadas que conduz à acumulação de AMPc. Ao empregar tal abordagem, um técnico no assunto pode, se desejado, determinar o requisito de sequência mínima, ou seja, uma sequência de aminoácidos contígua de comprimento mais curto, que é capaz de distribuir uma proteína, ver, por exemplo, [16]. Consequentemente, os sinais de liberação preferidos da presente invenção consistem em pelo menos a sequência mínima de aminoácidos de uma proteína efetora T3SS que é capaz de distribuir uma proteína.

[00147] A presente invenção fornece cepas bacterianas Gram-negativas recombinantes de virulência atenuada para uso em um método de tratamento de um tumor sólido maligno em um indivíduo, em que a cepa bacteriana Gram- negativa recombinante de virulência atenuada, que é deficiente na produção de pelo menos uma proteína efetora bacteriana que é virulenta para células eucarióticas, acumula-se no tumor sólido maligno. Em algumas modalidades cepas bacterianas Gram-negativas recombinantes de virulência atenuada são deficientes na produção de pelo menos um, de preferência pelo menos dois, mais preferencialmente pelo menos três, mais preferencialmente pelo menos quatro, em particular pelo menos cinco, mais particularmente pelo menos seis, mais particularmente todas as proteínas efetoras bacterianas virulentas para células eucarióticas, isto é, cepas bacterianas Gram-negativas recombinantes de virulência atenuada que são deficientes na produção de pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, mais preferivelmente pelo menos três, ainda mais preferencialmente pelo menos quatro, pelo menos cinco, mais particularmente pelo menos seis, mais particularmente todas as proteínas efetoras bacterianas funcionais que são virulentas para células eucarióticas, de tal modo que a cepa bacteriana Gram-negativas recombinantes de virulência atenuada resultante produz menos proteínas efetoras bacterianas ou produz proteínas efetoras bacterianas em uma menor extensão em comparação com a cepa bacteriana Gram-negativa de tipo selvagem de virulência não atenuada, ou seja, comparada com a cepa bacteriana Gram-negativa do tipo selvagem que normalmente produz proteínas efetoras bacterianas ou de tal modo que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada resultante já não produz quaisquer proteínas efetoras bacterianas funcionais que sejam virulentas para células eucarióticas.

[00148] Em algumas modalidades, as cepas bacterianas Gram-negativas recombinantes de virulência atenuada para uso em um método de tratamento de um tumor sólido maligno em um indivíduo é deficiente na produção de todas as proteínas efetoras que são virulentas para células eucarióticas e o sinal de liberação de uma proteína efetora bacteriana é o sinal de liberação de uma proteína efetora T3SS bacteriana e a proteína heteróloga é selecionada do grupo consistindo de proteínas envolvidas na apoptose ou regulação de apoptose.

[00149] De acordo com a presente invenção, tal cepa bacteriana Gram- negativa mutante, isto é, uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada que é deficiente na produção de pelo menos uma proteína efetora bacteriana que é virulenta para células eucarióticas, por exemplo, tal cepa de Yersinia mutante pode ser gerada introduzindo pelo menos uma mutação em pelo menos um gene codificador de efetor. De um modo preferido, esses genes codificadores de efetores incluem YopE, YopH, YopO/Y pkA, YopM, YopP/Y opJ e YopT, no que se refere a uma cepa de Yersinia. De preferência, esses genes codificadores de efetores incluem AvrA, CigR, GogB, GtgA, GtgE, PipB, SifB, SipA/SspA, SipB, SipC/SspC, SipD/SspD, SlrP, SopB/SigD, SopA, SpiC/SsaB, SseB, SseC, SseD, SseF, SseG, Ssel/Srph, SopD, SopE, SopE2, SspHl, SspH2, PipB2, SifA, SopD2, SseJ, SseKl, SseK2, SseK3, SseL, SteC, SteA, SteB, SteD, SteE, SpvB, SpvC, SpvD, SrfJ, SptP, no que diz respeito a uma cepa de Salmonella. Mais preferencialmente, todos os genes codificadores de efetores são deletados. O técnico no assunto pode empregar qualquer número de técnicas padrão para gerar mutações nestes genes efetores T3SS. Sambrook et al. descrevem tais técnicas de forma geral. Veja Sambrook et al. [23].

[00150] De acordo com a presente invenção, a mutação pode ser gerada na região promotora de um gene codificador de efetor de modo a que a expressão desse gene efetor seja abolida. A mutação também pode ser gerada na região codificante de um gene codificador de efetor, de tal modo que a atividade catalítica da proteína efetora codificada seja abolida. A "atividade catalítica"de uma proteína efetora se refere normalmente à função celular anti-alvo de uma proteína efetora, ou seja, toxicidade. Tal atividade é governada pelos motivos catalíticos no domínio catalítico de uma proteína efetora. As abordagens para identificar o domínio catalítico e/ou os motivos catalíticos de uma proteína efetora são bem conhecidas pelos técnicos no assunto. Veja, por exemplo, [24,25].

[00151] Por conseguinte, uma mutação preferida da presente invenção é uma deleção de todo o domínio catalítico. Outra mutação preferida é uma mutação de frameshift em um gene codificador de efetor, de tal modo que o domínio catalítico não está presente no produto proteico expresso a partir desse gene " que sofreu frameshift". Uma mutação mais preferida é uma mutação com a deleção de toda a região codificadora da proteína efetora. Outras mutações também são contempladas pela presente invenção, tais como pequenas deleções ou substituições de pares de bases, que são gerados nos motivos catalíticos de uma proteína efetora conduzindo a destruição da atividade catalítica de uma dada proteína efetora.

[00152] As mutações que são geradas nos genes das proteínas efetoras bacterianas funcionais podem ser introduzidas na cepa particular através de vários métodos. Tal método envolve clonar um gene mutado em um vetor "suicida" que é capaz de introduzir a sequência mutada na cepa através de troca alélica. Um exemplo de tal vetor "suicida"é descrito por [26].

[00153] Deste modo, as mutações geradas em múltiplos genes podem ser introduzidas sucessivamente em uma cepa bacteriana Gram-negativa dando origem ao polimutante, por exemplo, uma cepa recombinante mutante sêxtupla. A ordem em que essas sequências mutadas são introduzidas não é importante. Em algumas circunstâncias, pode ser desejado mutar apenas alguns, mas não todos, os genes efetores. Por conseguinte, a presente invenção contempla ainda Yersinia polimutante diferente de Yersinia mutante sêxtupla, por exemplo, mutantes duplos, mutantes triplos, mutantes quádruplos, mutantes quíntuplos. Com a finalidade de distribuir proteínas, o sistema de secreção e translocação da cepa mutante precisa estar intacto.

[00154] Uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada preferida da presente invenção é uma cepa de Yersinia mutante sêxtupla, na qual todos os genes codificadores de efetores estão mutados de tal modo que a Yersinia resultante já não produz quaisquer proteínas efetoras funcionais. Tal cepa de Yersinia mutante sêxtupla é designada como ?yopH,O,P,E,M,T para Y. enterocolitica. Como exemplo, tal mutante sêxtupla pode ser produzido a partir da cepa Y. enterocolitica MRS40 dando origem a Y. enterocolitica MRS40 ?yopH,O,P,E,M,T (também denominado Y. enterocolitica subesp. palearctica MRS40 ?yopH,O,P,E,M,T aqui) que é preferido. Igualmente preferido é Y. enterocolitica MRS40 ?yopH,O,P,E,M,T ?asd (também denominado Y. enterocolitica subesp. palearctica MRS40 ?yopH,O,P,E,M,T ?asd aqui).

[00155] Os vetores que podem ser utilizados de acordo com a invenção para transformar uma cepa bacteriana Gram-negativa dependem das cepas bacterianas Gram-negativas utilizadas como é do conhecimento do especialista. Promotor, sítio de clivagem de proteína e protease heteróloga como aqui descrito pode ser utilizado para o vetor da cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada. Os vetores que podem ser utilizados de acordo com a invenção incluem vetores de expressão (incluindo versões modificadas sintéticas ou geradas de outro modo de plasmídeos de virulência endógena), vetores para inserção de plasmídeo cromossômico ou de virulência e fragmentos de DNA para inserção de plasmídeo cromossômico ou de virulência. Vetores de expressão que são úteis, por exemplo, as cepas de Yersinia, Escherichia, Salmonella ou Pseudomonas são, por exemplo, plasmídeos pUC, pBad, pACYC, pUCP20 e pET. Vetores para inserção de plasmídeo cromossômico ou de virulência que são úteis, por exemplo, nas cepas de Yersinia, Escherichia, Salmonella ou Pseudomonas são, por exemplo, pKG101. Os fragmentos de DNA para inserção de plasmídeo cromossômico ou de virulência se referem a métodos utilizados, por exemplo, em cepas de Yersinia, Escherichia, Salmonella ou Pseudomonas como, por exemplo, engenharia genética lambda- vermelha. Vetores para inserção de plasmídeo cromossômico ou de virulência ou fragmentos de DNA para inserção de plasmídeo cromossômico ou de virulência podem inserir a primeira, segunda e/ou terceira sequência de DNA da presente invenção, de modo que a primeira, segunda e/ou terceira sequência de DNA estejam operativamente ligadas a um promotor endógeno da cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada. Assim, se for utilizado um vetor para inserção de plasmídeo cromossômico ou de virulência ou um fragmento de DNA para inserção de plasmídeo cromossômico ou de virulência, um promotor endógeno pode ser codificado no DNA bacteriano endógeno (DNA cromossômico ou plasmídico) e apenas a primeira e segunda sequência de DNA serão fornecidas pelo vetor manipulado para inserção de plasmídeo cromossômico ou de virulência ou fragmento de DNA para inserção de plasmídeo cromossômico ou de virulência. Alternativamente, se um vetor para inserção de plasmídeo cromossômico ou de virulência ou uma molécula de nucleotídeo, tal como, por exemplo, uma sequência de DNA para inserção de plasmídeo cromossômico ou de virulência for usada, um promotor endógeno e o sinal de liberação de uma proteína efetora bacteriana podem ser codificados no DNA bacteriano endógeno (DNA cromossômico ou plasmídico) e apenas a molécula nucleotídica, tal como, por exemplo, uma sequência de DNA que codifica a proteína heteróloga é fornecida por um vetor para inserção de plasmídeo cromossômico ou de virulência ou por uma molécula nucleotídica, tal como, por exemplo, uma sequência de DNA para inserção de plasmídeo cromossômico ou de virulência. Assim, não é necessariamente requerido que um promotor seja compreendido pelo vetor utilizado para a transformação das cepas bacterianas gram-negativas recombinantes de virulência atenuada, isto é, as cepas bacterianas Gram-negativas recombinantes de virulência atenuada da presente invenção podem ser transformadas com um vetor cuja dose não compreende um promotor.

[00156] Em uma modalidade preferida, o vetor da presente invenção compreende na direção 5' para 3': uma primeira sequência de DNA que codifica um sinal de liberação ou um fragmento da mesma a partir de uma proteína efetora bacteriana; uma segunda sequência de DNA que codifica uma proteína heteróloga fundida na estrutura com a extremidade 3' da referida primeira sequência de DNA.

[00157] Um vetor preferido, por exemplo, um vetor de expressão preferido para Yersiniaé selecionado do grupo que consiste em pBad_Si_1 e pBad_Si_2. O pBad_Si2 foi construído por clonagem do fragmento SycE-YopE1-138 contendo promotores endógenos para YopE e SycE do pYV40 purificado no sítio Kpnl/HindIII de pBad-MycHisA (Invitrogen). Modificações adicionais incluem a remoção do fragmento NcoI/BgIII de pBad-MycHisA por digestão, tratamento e religação de fragmento Klenow. Além disso, na extremidade 3' de YopE1-138 foram adicionados os seguintes sítios de clivagem: Xbal-XhoI-BstBI- (HindIII). pBad_Si1 é igual a pBad_Si2 mas codifica EGFP amplificado a partir de pEGFP-Cl (Clontech) no sítio NcoI/BgIII sob o promotor indutível de Arabinose. Igualmente preferido é o uso de versões modificadas do plasmídeo de virulência Yersinia endógeno pYV que codifica proteínas heterólogas como fusões com uma sequência de sinal T3SS. Um vetor preferido, por exemplo, um vetor de expressão preferido para Salmonellaé selecionado do grupo consistindo de pSi_266, pSi_267, pSi_268 e pSi_269. Os plasmídeos pSi_266, pSi_267, pSi_268 e pSi_269 contendo o promotor endógeno correspondente e o fragmento SteA1- 20 (pSi_266), a sequência SteA inteira (pSi_267), o fragmento SopE1-81 (pSi_268) ou o fragmento SopE1-105 (pSi_269) foram amplificados a partir do DNA genômico de S. enterica SL1344 e clonados no sítio Ncol/Kpnl de pBad-MycHisA (Invitrogen).

[00158] Os vetores da presente invenção podem incluir outros elementos de sequências, tais como uma sequência de terminação 3' (incluindo um códon de parada e uma sequência poli A), ou um gene que confere uma resistência a fármaco que permite a seleção de transformantes que receberam o vetor instantâneo. Os vetores da presente invenção podem ser transformados por vários métodos conhecidos nas cepas bacterianas gram-negativas recombinantes de virulência atenuada. Para o objetivo da presente invenção, os métodos de transformação para a introdução de um vetor incluem, mas não estão limitados a eletroporação, transformação mediada por fosfato de cálcio, conjugação ou combinações dos mesmos. Por exemplo, um vetor pode ser transformado em uma primeira cepa bacteriana por um procedimento padrão de eletroporação. Subsequentemente, tal vetor pode ser transferido da primeira cepa bacteriana para a cepa desejada por conjugação, um processo também denominado "mobilização". O transformante (ou seja, cepas bacterianas Gram- negativas contendo o vetor) pode ser selecionado, por exemplo, com antibióticos. Estas técnicas são bem conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, [16].

[00159] De acordo com a presente invenção, o promotor do vetor da cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada da invenção pode ser um promotor nativo de uma proteína efetora T3SS da respectiva cepa ou uma cepa bacteriana compatível ou um promotor utilizado na expressão de vetores que são úteis em, por exemplo, cepa de Yersinia, Escherichia, Salmonella ou Pseudomonas, por exemplo, pUC e pBad. Tais promotores são o promotor T7, o promotor Plac ou o promotor Ara-bad indutível por arabinose.

[00160] Se a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada for uma cepa de Yersinia, o promotor pode ser de um gene de Yersinia virulon. Um "gene Yersinia virulon" se refere a genes no plasmídeo Yersinia pYV, cuja expressão é controlada tanto por temperatura como por contato com uma célula alvo. Tais genes incluem genes que codificam elementos da maquinaria de secreção (os genes Ysc), genes que codificam translocadores (YopB, YopD e LcrV), genes que codificam os elementos de controle (YopN, TyeA e LcrG), genes que codificam chaperonas efetoras T3SS (SycD, SycE, SycH, SycN, SycO e SycT) e genes que codificam efetores (YopE, YopH, YopO/Y pkA, YopM, YopT e YopP/Y op J), bem como outras proteínas codificadas por pYV como VirF e YadA.

[00161] Em uma modalidade preferida da presente invenção, o promotor é o promotor nativo de um gene codificador de efetor funcional T3SS. Se a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada for uma cepa de Yersinia, o promotor é selecionado de qualquer um dentre YopE, YopH, YopO/YpkA, YopM e YopP/YpJ. Mais preferencialmente, o promotor é de YopE ou SycE.

[00162] Se a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada for uma cepa de Salmonella, o promotor pode ser da ilha de patogenicidade de Spil ou Spill ou de uma proteína efetora em outro local codificado. Esses genes incluem genes que codificam elementos da maquinaria de secreção, genes que codificam translocadores, genes que codificam os elementos de controle, genes que codificam chaperonas efetores T3SS e genes que codificam efetores, assim como outras proteínas codificadas por SPI-1 ou SPI-2. Em uma modalidade preferida da presente invenção, o promotor é o promotor nativo de um gene codificador de efetor funcional T3SS. Se a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada for uma cepa de Salmonella, o promotor é selecionado de qualquer uma das proteínas efetoras. Mais preferivelmente, o promotor é de SopE, InvB ou SteA.

[00163] Em uma modalidade da presente invenção, o vetor, por exemplo, o vetor de expressão, compreende uma sequência de DNA que codifica um sítio de clivagem de protease. A criação de um sítio de clivagem funcional e geralmente aplicável permite separar o sinal de liberação após a translocação. Como o sinal de liberação pode interferir com a correta localização e/ou função da proteína translocada dentro das células alvo, a introdução de um sítio de clivagem de protease entre o sinal de liberação e a proteína de interesse fornece a primeira liberação de proteínas quase nativas em células eucarióticas. De um modo preferido, o sítio de clivagem de protease é um motivo de aminoácido que é clivado por uma protease ou domínios catalíticos da mesma selecionados do grupo consistindo de enteroquinase (cadeia leve), enteropeptidase, protease de PreScission, protease de rinovírus humano 3C, protease de TEV, protease de TVMV, protease de FatorXa e trombina, mais preferencialmente um motivo de aminoácido que é clivado por protease de TEV. Igualmente preferível o sítio de clivagem de protease é um motivo de aminoácido que é clivado por uma protease ou seus domínios catalíticos selecionados do grupo consistindo de enteroquinase (cadeia leve), enteropeptidase, protease de PreScission, protease de rinovírus humano 3C, protease de TEV, protease de TVMV, protease de FatorXa, protease processadora de ubiquitina, denominada enzimas deubiquitinantes e trombina. O mais preferido é um motivo de aminoácido que é clivado pela protease de TEV ou por uma protease de processamento de ubiquitina.

[00164] Assim, em outra modalidade da presente invenção, a proteína heteróloga é clivada do sinal de liberação de uma proteína efetora T3SS bacteriana por uma protease. Os métodos de clivagem preferidos são métodos em que: a) a protease é translocada para a célula eucariótica por uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada como aqui descrita que expressa uma proteína de fusão que compreende o sinal de liberação da proteína efetora T3SS bacteriana e a protease como proteína heteróloga; ou b) a protease é expressa constitutivamente ou transitoriamente na célula eucariótica.

[00165] Normalmente, a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada utilizada para distribuir uma proteína desejada em uma célula eucariótica e a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada que transloca a protease para a célula eucariótica, são diferentes.

[00166] Em uma modalidade da presente invenção, o vetor compreende outra sequência de DNA que codifica uma molécula de marcação ou um sítio receptor para uma molécula de marcação. A outra sequência de DNA que codifica uma molécula de marcação ou um sítio receptor para uma molécula de marcação é geralmente fundida à extremidade 5' ou à extremidade 3' da segunda sequência de DNA. Uma molécula de marcação preferida ou um sítio receptor para uma molécula de marcação é selecionada do grupo consistindo em proteína fluorescente verde melhorada (EGFP), cumarina, sítio receptor da ligase cumarina, resorufina, sítio receptor da ligase resorufina, o motivo tetra- cisteína em uso com o corante FlAsH/ReAsH (tecnologias da vida). A mais preferida é a resorufina e um sítio receptor da ligase resorufina ou EGFP. A utilização de uma molécula de marcação ou de um sítio receptor para uma molécula de marcação conduzirá à ligação de uma molécula de marcação à proteína heteróloga de interesse, que será então distribuída como tal na célula eucariótica e permite o rastreio da proteína por, por exemplo, microscopia de células vivas.

[00167] Em uma modalidade da presente invenção, o vetor compreende outra sequência de DNA que codifica um TAG peptídico. A outra sequência de DNA que codifica uma TAG peptídica é usualmente fundida à extremidade 5' ou à extremidade 3' da segunda sequência de DNA. Uma TAG peptídica preferido é selecionada do grupo que consiste em TAG Myc, TAG His, TAG Flag, TAG HA, TAG Strep ou TAG V5 ou uma combinação de duas ou mais TAGs destes grupos. A mais preferida é a TAG Myc, a TAG Flag, a TAG His e as TAGs Myc e His combinadas. A utilização de uma TAG peptídica conduzirá à rastreabilidade da proteína marcada, por exemplo, por imunofluorescência ou Western blotting, utilizando anticorpos anti-TAG. Além disso, a utilização de uma TAG peptídica permite a purificação por afinidade da proteína desejada após a secreção no sobrenadante da cultura ou após translocação para células eucarióticas, em ambos os casos utilizando um método de purificação adequado à TAG correspondente (por exemplo, purificação por afinidade de quelato metálico em uso com uma purificação baseada em anticorpos de TAG His ou anti-Flag em uso com a TAG Flag).

[00168] Em uma modalidade da presente invenção, o vetor compreende outra sequência de DNA que codifica um sinal de localização nuclear (NLS). A outra sequência de DNA que codifica um sinal de localização nuclear (NLS) está fundida habitualmente à extremidade 5' ou extremidade 3' da segunda sequência de DNA, em que a sequência de DNA adicional codifica um sinal de localização nuclear (NLS). Um NLS preferido é selecionado do grupo que consiste em NLS de antígeno T grande SV40 e derivados do mesmo [27], bem como outros NLS virais. O mais preferido é o NLS de antígeno T grande SV40 e os derivados do mesmo.

[00169] Em uma modalidade da presente invenção, o vetor compreende um sítio de clonagem múltipla. O sítio de clonagem múltipla é usualmente localizado na extremidade 3' da primeira sequência de DNA e/ou na extremidade 5' ou na extremidade 3' da segunda sequência de DNA. Um ou mais de um sítio de clonagem múltipla pode ser compreendido pelo vetor. Um sítio de clonagem múltipla preferido é selecionado do grupo de enzimas de restrição consistindo em Xhol, Xbal, HindIII, Ncol, Notl, EcoRI, EcoRV, BamHI, Nhel, Sad, Sail, BstBI. O mais preferido é Xbal, Xhol, BstBI e Hindlll.

[00170] A proteína fundida expressa a partir das primeira e segunda sequências de DNA opcionais do vetor é também denominada "proteína de fusão"ou "proteína híbrida", isto é, uma proteína fundida ou híbrido de sinal de liberação e uma proteína heteróloga. A proteína de fusão também pode compreender, por exemplo, um sinal de liberação e duas ou mais proteínas heterólogas diferentes.

[00171] A presente invenção contempla métodos para liberação de proteínas heterólogas, como aqui descrito acima, em células de um tumor sólido maligno. As proteínas podem ser distribuídas, ou seja, translocadas na célula de um tumor sólido maligno no momento da administração da cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada a um indivíduo ou podem ser distribuídas, ou seja, translocadas para a célula de um tumor sólido maligno mais tarde, por exemplo, após a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada ter alcançado o sítio do tumor sólido maligno e/ou ter atingido o sítio do tumor sólido maligno e replicado como descrito acima. O tempo de liberação pode ser regulado, por exemplo, pelo promotor utilizado para expressar as proteínas heterólogas na cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada. No primeiro caso, um promotor constitutivo ou, mais preferencialmente, um promotor endógeno de uma proteína efetora bacteriana pode conduzir a proteína heteróloga. No caso de liberação tardia de proteína, um promotor artificialmente indutível, como o promotor indutível por arabinose, pode conduzir a proteína heteróloga. Neste caso, a arabinose será administrada a um indivíduo assim que as bactérias atingirem e se acumularem no local desejado. A arabinose induzirá, então, a expressão bacteriana da proteína a ser distribuída.

[00172] Assim, em uma modalidade, o método para distribuir proteínas heterólogas a células de um tumor sólido maligno compreende i) cultivar a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada como aqui descrito; ii) contatar uma célula de um tumor sólido maligno com a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada de (i) em que uma proteína de fusão que compreende um sinal de liberação de uma proteína efetora bacteriana e a proteína heteróloga é expressa pela cepa bacteriana Gram- negativa recombinante de virulência atenuada e é translocado para a célula de um tumor sólido maligno; e, opcionalmente, iii) clivar a proteína de fusão de modo a que a proteína heteróloga seja clivada do sinal de liberação da proteína efetora bacteriana dentro da célula de um tumor sólido maligno.

[00173] Em algumas modalidades, pelo menos duas proteínas de fusão que compreendem cada uma um sinal de liberação de uma proteína efetora bacteriana e uma proteína heteróloga são expressas pela cepa bacteriana Gram- negativa recombinante de virulência atenuada e são translocadas para a célula eucariótica pelos métodos da presente invenção.

[00174] A cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada pode ser cultivada de modo a que seja expressa uma proteína de fusão que compreende o sinal de liberação da proteína efetora bacteriana e da proteína heteróloga de acordo com métodos conhecidos na técnica (por exemplo, FDA, Bacteriological Analytical Manual (BAM), capítulo 8: Yersinia enterocolitica). De um modo preferido, a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada pode ser cultivada em caldo de infusão de Cérebro e Coração, por exemplo, a 28 °C. Para indução da expressão de T3SS e, por exemplo, genes dependentes do promotor YopE/SycE, as bactérias podem ser cultivadas a 37 °C.

[00175] Em uma modalidade, a célula de um tumor sólido maligno é colocada em contato com duas cepas bacterianas Gram-negativas recombinantes de virulência atenuada de (i), em que a primeira cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada expressa uma primeira proteína de fusão que compreende o sinal de liberação da proteína efetora T3SS bacteriana e uma primeira proteína heteróloga e a segunda cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada expressa uma segunda proteína de fusão que compreende o sinal de liberação da proteína efetora bacteriana e uma segunda proteína heteróloga, de modo que a primeira e a segunda proteínas de fusão são translocadas para a célula de um tumor sólido maligno. Esta modalidade forneceu a coinfecção de, por exemplo, uma célula de um tumor sólido maligno com duas cepas bacterianas como um método válido para distribuir, por exemplo, duas proteínas híbridas diferentes em células individuais para abordar sua interação funcional.

[00176] Os técnicos no assunto podem também utilizar vários ensaios para determinar se a liberação de uma proteína de fusão é bem-sucedida. Por exemplo, a proteína de fusão pode ser detectada via imunofluorescência usando anticorpos reconhecendo uma TAG fundida (como TAG Myc). A determinação também pode ser baseada na atividade enzimática da proteína a ser administrada, por exemplo, o ensaio descrito por [16].

[00177] A presente invenção também fornece uma composição farmacêutica compreendendo uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada para uso em um método de tratamento de um tumor sólido maligno em um indivíduo, em que a cepa bacteriana Gram- negativa recombinante de virulência atenuada se acumula no tumor sólido maligno.

[00178] As bactérias Gram-negativas recombinantes de virulência atenuada podem ser compostas para administração conveniente e eficaz em uma quantidade que é suficiente para tratar o indivíduo como composição farmacêutica com um carreador farmaceuticamente aceitável adequado. Uma forma de dosagem unitária da bactéria Gram-negativa recombinante de virulência atenuada ou da composição farmacêutica a ser administrada pode, por exemplo, conter a bactéria Gram-negativa recombinante de virulência atenuada em uma quantidade de cerca de 105a cerca de 109bactérias por mL, de preferência cerca de 106 a cerca de 108 bactérias por mL, mais preferivelmente cerca de 107 a cerca de 108 bactérias por mL, mais preferivelmente cerca de 108bactérias por mL.

[00179] Por "quantidade que é suficiente para tratar o indivíduo"ou "quantidade eficaz" que são aqui utilizados de forma intercambiável, pretende- se que seja uma quantidade de bactéria ou bactérias, suficientemente elevada para modificar de forma significativa e positiva a condição a ser tratada, mas suficientemente baixa para evitar efeitos colaterais sérios (com uma proporção benefício/risco razoável), dentro do escopo do julgamento médico correto.

[00180] Uma quantidade eficaz de uma bactéria irá variar com o objetivo particular a ser atingido, a idade e a condição física do indivíduo a ser tratado, a duração do tratamento, a natureza da terapia concorrente e a bactéria específica utilizada. A quantidade eficaz de uma bactéria será, portanto, a quantidade mínima, que fornecerá o efeito desejado. Normalmente, uma quantidade de cerca de 105a cerca de 109bactérias, por exemplo, de cerca de 105a cerca de 109bactérias/m2de superfície corporal, de preferência de 106a cerca de 108 bactérias, por exemplo, de cerca de 106a cerca de 108bactérias/m2da superfície corporal, mais preferivelmente de cerca de 107a cerca de 108bactérias, por exemplo, de cerca de 107a cerca de 108bactérias/m2da superfície corporal, do modo mais preferido, 108bactérias, por exemplo, 108bactérias/m2de superfície corporal são administradas ao indivíduo.

[00181] Uma dose única da cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada para administrar a um indivíduo, por exemplo, para um humano para tratar um tumor sólido maligno é geralmente de cerca de 104a cerca de 1010bactérias, por exemplo, de cerca de 104bactérias/m2de superfície corporal a cerca de 1010bactérias/m2de superfície corporal, de preferência de cerca de 105a cerca de 109bactérias/m2de superfície corporal, mais preferivelmente de cerca de 106a cerca de 108bactérias, por exemplo, de cerca de 106a cerca de 108bactérias/m2da superfície corporal, ainda mais preferencialmente de cerca de 107a cerca de 108bactérias, por exemplo, de cerca de 107a cerca de 108bactérias/m2de superfie corporal, de um modo muito preferido, 108bactérias, por exemplo, 108bactérias/m2de superfície corporal de bactérias Gram-negativas recombinantes de virulência atenuada.

[00182] Exemplos de substâncias que podem servir como carreadores farmacêuticos são açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose; amidos como amido de milho e amido de batata; celulose e seus derivados, tais como carboximetilcelulose de sódio, acetados de etilcelulose e de celulose; tragacanto em pó; malte; gelatina; talco; ácidos esteáricos; estearato de magnésio; sulfato de cálcio; carbonato de cálcio; óleos vegetais, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de sésamo, azeite, óleo de milho e óleo de teobroma; polióis, tais como propilenoglicol, glicerina, sorbitol, manitol e polietilenoglicol; ágar; ácidos algínicos; água isenta de pirogênio; solução salina isotônica; extratos de cranberry e solução tampão de fosfato; leite desnatado em pó; bem como outras substâncias compatíveis não tóxicas utilizadas em formulações farmacêuticas, como vitamina C, estrogênio e equinácea, por exemplo. Agentes umectantes e lubrificantes, tais como lauril sulfato de sódio, bem como agentes corantes, agentes aromatizantes, lubrificantes, excipientes, agentes de formação de comprimidos, estabilizadores, antioxidantes e conservantes, podem também estar presentes.

[00183] Os modos de administração das bactérias Gram-negativas recombinantes de virulência atenuada a um indivíduo podem ser selecionados do grupo consistindo em administração intravenosa, intratumoral, intraperitoneal e per-oral. Embora esta invenção não se destine a ser limitada a qualquer modo particular de aplicação, é preferida a administração intravenosa ou intratumoral das bactérias ou das composições farmacêuticas.

[00184] Dependendo da via de administração, pode ser necessário que os ingredientes ativos que compreendem bactérias sejam revestidos em um material para proteger os referidos organismos da ação de enzimas, ácidos e outras condições naturais que podem inativar os referidos organismos. Para administrar bactérias por administração diferente da parenteral, elas devem ser revestidas ou administradas com um material para prevenir a inativação. Por exemplo, as bactérias podem ser coadministradas com inibidores enzimáticos ou em lipossomas. Inibidores da enzima incluem inibidor da tripsina pancreática, diisopropilfluorofosfato (DFP) e trasilol. Os lipossomas incluem emulsões P40 de água em óleo em água bem como lipossomas convencionais e especificamente projetados que transportam bactérias, tais como Lactobacillus, ou seus subprodutos para um alvo interno de um indivíduo hospedeiro. Uma bactéria pode ser administrada sozinha ou em conjunto com uma segunda bactéria diferente. Qualquer número de bactérias diferentes pode ser usado em conjunto. Por "em conjunto com" entende-se juntos, substancialmente simultaneamente ou sequencialmente. As composições podem também ser administradas na forma de comprimido, pílula ou cápsula, por exemplo, tal como uma cápsula liofilizada compreendendo as bactérias ou as composições farmacêuticas da presente invenção ou como solução congelada de bactérias ou as composições farmacêuticas da presente invenção contendo DMSO ou glicerol. Outra forma preferida de aplicação envolve a preparação de uma cápsula liofilizada das bactérias ou das composições farmacêuticas da presente invenção. Ainda outra forma preferida de aplicação envolve a preparação de uma cápsula seca por calor das bactérias ou das composições farmacêuticas da presente invenção.

[00185] As bactérias Gram-negativas recombinantes de virulência atenuada ou a composição farmacêutica a ser administrada podem ser administradas por injeção. Formas adequadas para uso injetável incluem soluções aquosas estéreis (quando solúveis em água) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões estéreis injetáveis. Em todos os casos, a forma deve ser estéril e deve ser fluida na medida em que seja fácil ser colocada em seringas. Deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento. O carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol líquido e semelhantes), misturas adequadas dos mesmos e óleos vegetais. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser conseguida pela utilização nas composições de agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

[00186] Em algumas modalidades da presente invenção, a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada é coadministrada com um sideróforo ao indivíduo. Estas modalidades são preferidas. Os sideróforos que podem ser coadministrados são sideróforos incluindo hidroxamato, catecolato e sideróforos de ligantes mistos. Os sideróforos preferidos são deferoxamina (também conhecida como desferrioxamina B, desferoxamina B, DFO-B, DFOA, DFB ou desferal), desferoxamina E, deferasirox (Exjade, Desirox, Defrijet, Desifer) e deferiprona (Ferriprox), mais preferida é deferoxamina. A deferoxamina é um sideróforo bacteriano produzido pela Actinobactéria Streptomyces pilosus e está disponível comercialmente a partir de, por exemplo, Novartis Pharma Schweiz AG (Suíça).

[00187] A coadministração com um sideróforo pode ser antes, simultânea ou após a administração da cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada. De preferência, um sideróforo é administrado antes da administração de cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada, mais preferencialmente é administrada pelo menos 1 hora, preferencialmente pelo menos 6 horas, mais preferencialmente pelo menos 12 horas, em particular pelo menos 24 horas antes da administração da cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada para o indivíduo. Em uma modalidade particular, o indivíduo é pré-tratado com desfreoxamina 24 h antes da infecção com a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada de modo a permitir o crescimento bacteriano. Normalmente, um sideróforo é coadministrado em uma dose única de cerca de 0,5 x 10-5Mol a cerca de 1 x 10-3Mol, mais preferencialmente de cerca de 1 x 10-5Mol a cerca de 1 x 10-4Mol de preferência de cerca de 3,5 x 10 5Mol a cerca de 1,1 x 10-4Mol por kg de peso corporal. Normalmente, a desferoxamina é coadministrada em uma dose única de cerca de 20 mg a cerca de 60 mg, de preferência de cerca de 20 mg a cerca de 60 mg por kg de peso corporal.

[00188] Os regimes de dosagem da administraçaão da cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada ou a composição farmacêutica aqui descrita irá variar com o objetivo particular a ser alcançado, a idade e o estado físico do indivíduo a ser tratado, a duração do tratamento, a natureza da terapia concorrente e a bactéria específica utilizada, como é do conhecimento do técnico no assunto. A cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada é usualmente administrada ao indivíduo de acordo com um regime de dosagem consistindo em uma dose única a cada 2 a 20 dias, preferivelmente de 6 a 10 dias, mais preferivelmente a cada 7 a 9 dias, preferencialmente de acordo com um regime de dosagem consistindo em uma dose única a cada 2 a 8 semanas, de preferência a cada 2 a 6 semanas, mais preferencialmente a cada 3 a 4 semanas. O período de administração é geralmente de cerca de 20 a cerca de 60 dias, de preferência cerca de 30 a 40 dias. Alternativamente, o período de administração habitualmente de cerca de 8 a cerca de 32 semanas, de preferência de cerca de 8 a cerca de 24 semanas, mais preferivelmente de cerca de 12 a cerca de 16 semanas.

[00189] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um kit para o tratamento de tumores sólidos malignos, de preferência em humanos. Tais kits geralmente compreenderão a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada ou a composição farmacêutica aqui descrita, e instruções para usar o kit. Em algumas modalidades, kits incluem um carreador, pacote ou recipiente que é compartimentado para receber um ou mais recipientes, tais como frascos, tubos e similares, cada um dos recipientes, incluindo um dos elementos separados para ser usado em um método descrito aqui. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas e tubos de ensaio. Em outras modalidades, os recipientes são formados a partir de uma variedade de materiais, tais como vidro ou plástico.

Exemplos Exemplo 1: A) Materiais e Métodos

[00190] Cepas bacterianas e condições de crescimento. As cepas utilizadas neste estudo estão listadas nas Figs. 14A a N. E coli Top 10, utilizada para purificação e clonagem de plasmídeo, e E. coli Sm10 X pir, utilizado para conjugação, bem como E. coli BW19610 [28], utilizado para propagar pKNG101, foram rotineiramente cultivados em placas de ágar LB e em caldo LB a 37 °C. A ampicilina foi usada na concentração de 200 µg/mL (Yersinia) ou 100 µg/mL (E. coli) para selecionar vetores de expressão. A estreptomicina foi utilizada na concentração de 100 µg/mL para selecionar vetores de suicídio. Y. enterocolitica MRS40 (O:9, biotipo 2) [17] um derivado E40 não resistente à ampicilina [16] e cepas derivadas destas foram rotineiramente cultivadas em Infusão de Coração e Cérebro (BHI; Difco) à temperatura ambiente. Para todas as cepas de Y. enterocolitica foi adicionado ácido nalidíxico (35 µg/mL) e todas as cepas de Y. enterocolitica asd foram adicionalmente suplementadas com 100 µg/mL de ácido meso-2,6-diaminopimélico (mDAP, Sigma Aldrich). S. enterica SL1344 foram rotineiramente cultivadas em placas de ágar LB e em caldo LB a 37 °C. A ampicilina foi utilizada na concentração de 100 µg/mL para selecionar vetores de expressão em S. enterica.

[00191] Manipulações genéticas de Y. enterocolitica. Manipulações genéticas de Y. enterocolitica foram descritas [29,30]. Resumidamente, os mutadores para modificação ou deleção de genes nos plasmídeos pYV ou no cromossomo foram construídos por PCR de sobreposição de 2 fragmentos utilizando plasmídeo pYV40 purificado ou DNA genômico como modelo, conduzindo a 200 a 250 pb de sequências flanqueadoras em ambos os lados da sequência deletada ou parte modificada do respectivo gene. Os fragmentos resultantes foram clonados em pKNG101 [26] em E. coli BW19610 [28]. Os plasmídeos verificados na sequência foram transformados em E. coliSm10 X pir, de onde os plasmídeos foram mobilizados na cepa de Y. enterocolitica correspondente. Os mutantes portadores do vetor integrado foram propagados por gerações severas sem pressão de seleção. Em seguida, a sacarose foi utilizada para selecionar clones que perderam o vetor. Finalmente mutantes foram identificados por PCR de colônia. Mutadores específicos (pSi_408, pSi_419) estão listados na Tabela III.

[00192] Construção de plasmídeos. O plasmídeo pBad_Si2 ou pBad_Si1 (Fig. 9) foi utilizado para clonagem de proteínas de fusão com os 138 aminoácidos N-terminais de YopE (SEQ ID N2). O pBad_Si2 foi construído por clonagem do fragmento SycE-YopE1-138 contendo promotores endógenos para YopE e SycE do pYV40 purificado no sítio Kpnl/HindIII de pBad-MycHisA (Invitrogen). Modificações adicionais incluem a remoção do fragmento NcoI/BgIII de pBad-MycHisA por digestão, tratamento e religação com fragmento de Klenow. Um terminador de transcrição bidirecional (BBa_B1006; fundação iGEM) foi clonado no corte Kpnl e tratado com Klenow (pBad_Si2) ou no sítio de corte BglII (pBad_Si1). Além disso, na extremidade 3' de YopE1-138 foram adicionados os seguintes sítios de clivagem: Xbal-XhoI-BstBI- (HindIII) (Fig. 9B). pBad_Si1 é igual a pBad_Si2 mas codifica EGFP amplificado a partir de pEGFP-Cl (Clontech) no sítio NcoI/BgIII sob o promotor indutível de Arabinose. Os plasmídeos pSi_266, pSi_267, pSi_268 e pSi_269 contendo o promotor endógeno correspondente e o fragmento SteA1-20 (pSi_266), a sequência SteA inteira (pSi_267), o fragmento SopE1-81 (pSi_268) ou o fragmento SopE1-105 (pSi_269) foram amplificados de DNA genômico de S. enterica SL1344 e clonados no sítio Ncol/Kpnl de pBad-MycHisA (Invitrogen).

[00193] Genes de tamanho total ou fragmentos dos mesmos foram amplificados com os primers específicos listados na Tabela I abaixo e clonados como fusões para YopE1-138 no plasmídeo pBad_Si2 ou no caso de z-BIM (SEQ ID NO: 21) em pBad_Si1 (ver Tabela II abaixo). Para a fusão com SteA ou SopE, as construtos de DNA sintético foram clivadas por Kpnl/Hindll e clonadas em pSi_266, pSi_267, pSi_268 ou pSi_269, respectivamente. No caso de genes de espécies bacterianas, utilizou-se DNA genômico purificado como molde (S. flexneri M90T, Salmonella enterica subesp. enterica sorovar Typhimurium SL1344, Bartonella henselae ATCC 49882). Para genes humanos utilizou-se uma biblioteca de DNAc universal (Clontech), se não declarado o contrário (Figs. 14A a N), os genes do peixe-zebra foram amplificados a partir de uma biblioteca de DNAc (uma presente gentil de M. Affolter). Os plasmídeos ligados foram clonados em E. coli Top 10. Os plasmídeos sequenciados foram eletroporados na cepa desejada de Y. enterocolitica ou S. enterica utilizando configurações como para eletroporação convencional de E. coli.

[00194] Secreção de Yop. A indução do regulão yop foi realizada deslocando a cultura para 37 °C em BHI-Ox (condições permissivas de secreção) [31]. Como fonte de carbono, foi adicionada glicose (4 mg/mL).

[00195] As frações totais de células e sobrenadantes foram separadas por centrifugação a 20 800 g durante 10 min a 4 °C. O pélete celular foi tomado como fração celular total. As proteínas no sobrenadante foram precipitadas com ácido tricloroacético a 10% (p/v) no final durante 1 h a 4 °C. Após centrifugação (20 800 g durante 15 min) e remoção do sobrenadante, o pélete resultante foi lavado em acetona gelada durante a noite. As amostras foram novamente centrifugadas, o sobrenadante foi descartado e o pélete foi seco ao ar e ressuspenso em corante de carga com 1x SDS.

[00196] As proteínas secretadas foram analisadas por SDS-PAGE; em cada caso, as proteínas secretadas por 3 x 108bactérias foram carregadas por faixa. A detecção de proteínas secretadas específicas por immunoblotting foi realizada utilizando geis SDS-PAGE a 12,5%. Para detecção de proteínas em células totais, 2 x 108bactérias foram carregadas por faixa, se não foi indicado o contrário, e as proteínas foram separadas em geis de SDS-PAGE a 12,5% antes da detecção por immunoblotting.

[00197] Imunoblotting foi realizado utilizando anticorpos monoclonais de rato contra YopE (MIPA193 - 13A9; 1: 1000, [32]). O anti-soro foi pré-absorvido duas vezes durante a noite contra Y. enterocolitica?HOPEMT asd para reduzir a coloração de fundo. A detecção foi realizada com anticorpos secundários dirigidos contra anticorpos de rato e conjugados com peroxidase de rábano silvestre (1:5000; biotecnologia Southern), antes do desenvolvimento com substrato quimioluminescente ECL (LumiGlo, KPM).

[00198] Cultura celular e infecções. HeLa Ccl2, células de fibroblastos 3T3 da Swiss, 4T1, B16F10 e D2A1 foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de FCS e 2mM de L-Glutamina (cDMEM). As HUVECs foram isoladas e cultivadas como descrito [33]. As células Jurkat e 4T1 foram cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10% de FCS e 2 mM de L-Glutamina. Y. enterocolitica foram cultivadas em BHI com aditivos durante a noite à temperatura ambiente, diluídas em BHI fresco para uma OD600 de 0,2 e cultivadas por 2 h à temperatura ambiente antes de uma mudança de temperatura para um agitador de banho-maria a 37 °C por mais 30 min ou por 1 h no caso de liberação de EGFP. Finalmente, as bactérias foram coletadas por centrifugação (6000 rcf, 30 seg) e lavadas uma vez com DMEM suplementado com HEPES 10 mM e L-glutamina 2 mM. S. enterica foram cultivadas em LB com aditivos durante a noite a 37 °C e diluídas a 1:40 em LB fresco e crescidas durante 2,5 h a 37 °C (condições de indução Spil T3SS) ou a cultura durante a noite foi adicionalmente incubada a 37 °C (condições de indução SpiII T3SS). Finalmente, as bactérias foram coletadas por centrifugação (6000 rcf, 30 seg) e lavadas uma vez com DMEM suplementado com HEPES 10 mM e L-glutamina 2 mM. As células semeadas em placas de 96 poços (para imunofluorescência) ou de 6 poços (para Western blotting) foram infectadas nos MOIs indicados em DMEM suplementado com HEPES 10 mM e L-glutamina 2 mM. Depois de adicionar bactérias, as placas foram centrifugadas durante 1 minuto a 1750 rpm e colocadas a 37 °C durante os períodos de tempo indicados. Bactérias extracelulares foram mortas por gentamicina (100 mg/mL), se indicado. No caso de análise de imunofluorescência, os ensaios de infecção foram interrompidos por fixação de PFA a 4%. Para análise de Western blot, as células foram lavadas duas vezes com PBS gelado e foi adicionado tampão de lise Phospho-safe (Novagen) para lisar as células. Após incubação em gelo, as células foram centrifugadas (16000 rcf, 25 min, 4 °C). Os sobrenadantes foram coletados e analisados quanto ao teor de proteína total pelo ensaio Bradford BCA (Pierce) antes de SDS PAGE e Western blotting utilizando anticorpo anti-Phospho-Akt (Ser473 e T308, ambos Cell Signaling), anti-Actina (Millipore), Anti-Bid (Cell Signaling), anti-Myc (Santa Cruz), anti-p38 (Cell Signaling), anti-fosfo-p-38 (Thr180/Tyr182; Cell Signaling), anti-Caspase-3 p17 (Cell Signaling) e anti-Ink4C (Cell Signaling).

[00199] Western blotting de proteínas T3SS translocadas de células infectadas. As células HeLa em placas de 6 poços foram infectadas a um MOI de 100, como descrito acima. No caso de coinfecção com a protease de TEV que transloca a cepa de Y. enterocolitica, a OD600 das cepas foi fixada e as duas suspensões bacterianas foram misturadas em um tubo na proporção de 1:1 (se não indicado) antes da adição às células. No final da infecção, as células foram lavadas duas vezes com PBS gelado e coletadas por raspagem em um pequeno volume de PBS gelado. Após centrifugação (16000 rcf, 5 min, 4 °C) o pélete foi dissolvido em digitonina suplementada a 0,002% com um coquetel de inibidor de protease (Roche complete, Roche). Os péletes dissolvidos foram incubados durante 5 minutos em gelo e depois centrifugados (16000 rcf, 25 min, 4 °C). Os sobrenadantes foram coletados e analisados quanto ao teor de proteína total pelo ensaio Bradford BCA (Pierce) antes de SDS PAGE e Western blotting, utilizando um anticorpo anti-Myc (Santa Cruz, 9E11) ou anti-Ink4C (Cell Signaling).

[00200] Imunofluorescência. As células semeadas em placas de 96 poços (Corning) foram infectadas como descrito acima e após fixação com PFA a 4%, as células foram lavadas três vezes com PBS. Os poços foram então bloqueados utilizando soro de cabra a 5% em PBS a 0,3% de Triton X-100 durante 1 hora à temperatura ambiente. O anticorpo primário (anti-Myc, Santa Cruz, 1:100) foi diluído em PBS com 1% de BSA e 0,3% de Triton X-100 e as células foram incubadas durante a noite a 4 °C. As células foram lavadas 4 vezes com PBS antes de ser adicionado o anticorpo secundário (AF 488 anti-camundongo, tecnologias de vida, 1:250) diluído em PBS com BSA a 1% e Triton X-100 a 0,3%. Se necessário, coloração com DNA de Hoechst (tecnologias de vida, 1:2500) e/ou coloração com actina (Dy647-Phalloidin, DyeOmics) foram incluídas. Em alguns casos, apenas o DNA e/ou corante de actina foi aplicado diretamente após a lavagem da PFA. As células foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente, lavadas três vezes com PBS e analisadas por análise de imagem automatizada como descrito abaixo.

[00201] Microscopia Automatizada e Análise de Imagens. As imagens foram adquiridas automaticamente com um ImageXpress Micro (Molecular devices, Sunnyvale, EUA). A quantificação das intensidades de coloração anti- Myc foi realizada utilizando MetaXpress (Molecular devices, Sunnyvale, USA). Regiões dentro das células excluindo regiões nucleares e regiões contendo bactérias foram escolhidas manualmente (círculos com uma área de 40 pixels) e a intensidade média foi registrada.

[00202] Estimulação de TNFa e Western blotting de phospho-p38. As células HeLa semeadas em placas de 6 poços foram infectadas com um MOI de 100, como descrito acima. 30min p.i gentamicina foi adicionada e 45 min p.i. (após infecção) TNFa (10 ng/mL) foi adicionada. 1 h 15 min p.i. as células foram lavadas duas vezes com PBS gelado e adicionou-se tampão de lise Phospho-safe (Novagen) para lisar as células. Após incubação em gelo, as células foram centrifugadas (16000 rcf, 25 min, 4 °C). Os sobrenadantes foram coletados e analisados quanto ao teor de proteína total pelo ensaio Bradford BCA (Pierce) antes de SDS PAGE e Western blotting utilizando um anticorpo anti-Phospho-p38, p38 total (Cell Signaling) e anticorpo anti-Actina (Millipore).

[00203] Determinação do nível de AMPc de células HeLa infectadas. As células HeLa semeadas em placas de 96 poços foram infectadas como descrito acima. 30 min antes da infecção, o cDMEM foi alterado para DMEM suplementado com 10 mM de HEPES e 2 mM de L-glutamina e 100 uM de 3- isobutil-1-metilxantina (IBMX, Sigma Aldrich). 60 min p.i. gentamicina foi adicionada e as células foram ainda incubadas a 37 °C durante mais 90 min. A determinação de AMPcfoi realizada utilizando um ELISA competitivo de acordo com as instruções do fabricante (Amersham, AMPcBiotrak, RPN225). Como um controle positivo indicou-se a quantidade de toxina da cólera (C8052, Sigma Aldrich) adicionada durante 1 h às células em DMEM suplementado com HEPES 10 mM e L-glutamina 2 mM e IBMX 100 uM.

[00204] Preparação de Amostra para Análise Fosfoproteômica. Para cada condição, duas placas de 6 poços de células HeLa CCL-2 foram cultivadas até à confluência. As células foram infectadas durante 30 min como descrito acima. Nos pontos de tempo indicados, as placas foram colocadas em gelo e lavadas duas vezes com PBS gelado. As amostras foram então coletadas em solução de ureia [ureia 8 M (AppliChem), bicarbonato de amônio 0,1 M (Sigma), RapiGest 0,1% (Waters), 1 x PhosSTOP (Roche)]. As amostras foram brevemente agitadas em vórtex, sonicadas a 4 °C (Hielscher), agitadas durante 5 min em um termomisturador (Eppendorf) e centrifugadas durante 20 min a 4 °C e 16.000 g. Os sobrenadantes foram coletados e armazenados a -80 °C para posterior processamento. O Ensaio de Proteína BCA (Pierce) foi utilizado para medir a concentração de proteína.

[00205] Enriquecimento de Fosfopeptídeos. As ligações dissulfeto foram reduzidas com tris(2-carboxietil)fosfina a uma concentração final de 10 mM a 37 °C durante 1 h. Os tióis livres foram alquilados com iodoacetamida 20 mM (Sigma) à temperatura ambiente durante 30 min no escuro. O excesso de iodoacetamida foi extinto com N-acetilcisteína a uma concentração final de 25 mM durante 10 min à temperatura ambiente. A endopeptidase Lys-C (Wako) foi adicionada a uma proporção final enzima/proteína de 1:200 (p/p) e incubada durante 4 h a 37 °C. A solução foi subsequentemente diluída com bicarbonato de amônio 0,1 M (Sigma) até uma concentração final abaixo de ureia 2 M e digerida durante a noite a 37 °C com tripsina modificada de grau de sequenciação (Promega) a uma proporção de proteína para enzima de 50:1. Os peptídeos foram dessalinizados em um cartucho C18 Sep-Pak (Waters) e secos sob vácuo. Fosfopeptídeos foram isolados a partir de 2 mg de massa peptídica total com TiO2 conforme descrito anteriormente [34]. Resumidamente, os peptídeos secos foram dissolvidos em uma solução de acetonitrila a 80% (ACN) - 2,5% de ácido trifluoroacético (TFA) saturada com ácido ftálico. Os peptídeos foram adicionados à mesma quantidade de TiO2 equilibrado (tamanho dos grânulos de 5 µm, GL Sciences) em uma coluna de rotação Mobicol bloqueada (MoBiTec) que foi incubada durante 30 min com rotação de extremidade a extremidade. A coluna foi lavada duas vezes com a solução saturada de ácido ftálico, duas vezes com 80% de ACN e 0,1% de TFA, e finalmente duas vezes com 0,1% de TFA. Os peptídeos foram eluídos com uma solução de NH4OH a 0,3 M. O pH dos eluatos foi ajustado para ser inferior a 2,5 com solução de TFA a 5% e HCl 2 M. Os fosfopeptídeos foram novamente dessalinizados com cartuchos Microspin C18 (Harvard Apparatus).

[00206] Análise por LC-MS/MS. A separação cromatográfica dos peptídeos foi realizada utilizando um sistema EASY nano-LC (Thermo Fisher Scientific), equipado com uma coluna de RP-HPLC aquecida (75 µm x 45 cm) embalada internamente com 1,9 µm C18 de resina (Reprosil-AQ Pur, Dr. Maisch). Alíquotas de 1 µg de amostra de fosfopeptídeo total foram analisadas por LC-MS/MS usando um gradiente linear de 98% de solvente A (0,15% de ácido fórmico) e 2% de solvente B (98% de acetonitrila, 2% de água, 0,15% de ácido fórmico) a 30% de solvente B durante 120 minutos a um taxa de fluxo de 200 nL/min. A análise de espectrometria de massa foi realizada em um espectrômetro de massa de pressão dupla LTQ-Orbitrap equipado com uma fonte de íons nanoelectrospray (ambos Thermo Fisher Scientific). Cada escaneamento do MSI (adquirido no Orbitrap) foi seguido por dissociação induzida por colisão (CID, adquirida no LTQ) dos 20 íons precursores mais abundantes com exclusão dinâmica por 30 segundos. Para análise de fosfopeptídeo, os 10 íons precursores mais abundantes foram submetidos ao CID com ativação demultiestágio habilitada. O tempo total do ciclo foi de aproximadamente 2 s. Para MSI, 106íons foram acumulados na célula Orbitrap ao longo de um tempo máximo de 300 ms e digitalizados com uma resolução de 60.000 FWHM (a 400 m/z). As varreduras MS2 foram adquiridas usando o modo de varredura normal, uma configuração alvo de 104e tempo de acúmulo de 25 ms. Íons e íons carregados isoladamente com estado de carga não atribuído foram excluídos do desencadeamento de eventos MS2. A energia de colisão normalizada foi ajustada para 32% e um microscan foi adquirido para cada espectro.

[00207] Quantificação livre de marcação e pesquisa de banco de dados. Os arquivos raw adquiridos foram importados para a ferramenta de software Progenesis (Nonlinear Dynamics, Versão 4.0) para quantificação livre de marcação usando os parâmetros padrão. Os espectros de MS2 foram exportados diretamente do Progenesis no formato mgf e pesquisados usando o algoritmo MASCOT (Matrix Science, Versão 2.4) contra um banco de dados de chamariz [35] contendo sequências normais e reversas das entradas de SwissProt previstas do Homo sapiens (www.ebi.ac. data de lançamento 16/05/2012) e contaminantes comumente observados (no total, 41.250 sequências) gerados usando a ferramenta SequenceReverser do software MaxQuant (Versão 1.0.13.13). Para identificar as proteínas provenientes de Y. enterocolitica, foram pesquisadas amostras enriquecidas com não fosfopeptídeo contra a mesma base de dados acima, incluindo entradas de SwissProt previstas de Y. enterocolitica (www.ebi.ac.uk, data de lançamento 15/08/2013). A tolerância de íon precursores foi ajustada para 10 ppm e a tolerância do fragmento iônico foi ajustada para 0,6 Da. Os critérios de pesquisa foram estabelecidos da seguinte forma: especificidade tríptica completa foi necessária (clivagem após resíduos de lisina ou arginina a menos que seguida por prolina), 2 clivagens perdidas foram permitidas, carbamidometilação (C) foi definida como modificação fixa e fosforilação (S, T, Y) ou oxidação (M) como uma modificação variável para amostras enriquecidas ou não enriquecidas com TiO2, respectivamente. Finalmente, os resultados da pesquisa de banco de dados foram exportados como um arquivo .xml e importados de volta para o software Progenesis para atribuição de recursos MSI. Para a quantificação de fosfopeptídeos, foi exportado um arquivo .csv contendo as abundâncias de pico MSI de todas as características detectadas e para amostras não enriquecidas, foi criado um arquivo .csv contendo todas as medições de proteína com base nas intensidades de características somadas de todos os peptídeos identificados por proteína. É importante ressaltar que o software Progenesis foi definido que as proteínas identificadas por conjuntos semelhantes de peptídeos são agrupadas e que apenas peptídeos não conflitantes com sequências específicas para proteínas únicas no banco de dados foram empregadas para a quantificação de proteínas. Ambos os arquivos foram processados usando o roteiro SafeQuant v1.0 R desenvolvido internamente (dados não publicados, disponível em https://github.com/eahrne/SafeQuant/). Em resumo, o software define o nível de identificação da Taxa de Descoberta Falsa para 1% (com base no número de ocorrências do banco de dados de sequências de proteínas) e normaliza as abundâncias de pico do MSI identificadas (Extracted Ion Chromatogram, XIC) em todas as amostras, ou seja, o XIC somado de todos os recursos de peptídeos identificados com segurança são dimensionados para serem iguais para todas as execuções de LC-MS. Em seguida, todos os fosfopeptídeos/proteínas quantificados são atribuídos a uma razão de abundância para cada ponto de tempo, com base no XIC mediano por ponto de tempo. A significância estatística de cada razão é dada pelo seu valor-q (valores-p ajustados da Taxa de Descoberta Falsa), obtidos pelo cálculo os valores-p modificados pela estatística- t [36] e pelo ajuste para múltiplos testes [37]. A localização dos resíduos fosforilados foi automaticamente atribuída pela MASCOT (pontuação > 10). Todos os espectros anotados, juntamente com os arquivos raw MS e os parâmetros de pesquisa empregados, serão depositados no Consomeium ProteomeXchange (http://proteomecentralproteomexchange.org) através do repositório de parceiros PRIDE [38].

[00208] O alinhamento da sequência foi realizado utilizando a ferramenta de alinhamento de sequência múltipla ClustalW2 baseada na web EMBL-EBI em htt://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/.

Estudo de escalonamento de dose

[00209] Todos os experimentos com animais foram aprovados (licença 1908; Kantonales Veterinaramt Basel-Stadt) e realizados de acordo com as diretrizes locais (Tierschutz-Verordnung, Basel-Stadt) e Lei suíça de proteção animal (Tierschutz-Gesetz). Camundongos C57B1/6 e BALB/c com 6 semanas de idade e foram encomendados à Janvier Labs. Após pelo menos uma semana de alojamento, os camundongos foram infectados com Y. enterocolitica MRS40 ?HOPEMT ou S. typhimurium ?aroA por injeção na veia da cauda. Ao longo da experiência, os camundongos foram pontuados quanto ao comportamento e aparência física, e a temperatura da superfície, bem como o peso corporal foi medido. O inóculo administrado i.v. aos camundongos foi validado por diluição de placas. Nos respectivos dias pós-infecção, os camundongos foram sacrificados por inalação de CO2. Uma amostra de sangue foi imediatamente isolada através de aspiração do coração. Fígado, baço, pulmão e tumor foram isolados e seu peso determinado. Os órgãos e o tumor foram homogeneizados. A CFU em cada amostra foi determinada por manchas de diluições em série em placas de ágar LB contendo ácido nalidíxico (35 ug/mL).

Biodistribuição nos modelos de camundongos de aloenxerto de tumor B16-F10 e 4T1

[00210] Todos os experimentos com animais foram aprovados (licença 1908; Kantonales Veterinaramt Basel-Stadt) e realizados de acordo com as diretrizes locais (Tierschutz-Verordnung, Basel-Stadt) e a lei suíça de proteção animal (Tierschutz-Gesetz). Camundongos C57B1/6 e BALB/c com 6 semanas de idade foram encomendados à Janvier Labs. Após pelo menos uma semana de acomodação, os camundongos foram anestesiados com isoflurano e 100 µl de células B16-F10 ou 4T1 (1 x 105 - 1 x 106células) foram injetadas subcutaneamente no flanco de C57B1/6 e BALB/c, respectivamente. Ao longo da experiência, os camundongos foram pontuados quanto ao comportamento e aparência física, e a temperatura da superfície, bem como o peso corporal foi medido.

[00211] Uma vez desenvolvidos os tumores, administrou-se aos camundongos uma solução desferal a 8 mg/mL (10 mL/kg) através de injeção i.p. No dia seguinte, os camundongos foram infectados com Y. enterocolitica MRS40 ou Y. enterocolitica MRS40 ?HOPEMT (2 x 105, 1 x 106ou 1 x 107 bactérias) por injeção na veia da cauda. O inóculo i.v. administrado aos camundongos foi validado por diluição de placas. Em algumas experiências, a progressão do tumor foi seguida por medições diárias do comprimento e largura do tumor com pinças digitais. O volume do tumor foi determinado como 0,523 x comprimento x largura2. Nos respectivos dias pós-infecção, os camundongos foram sacrificados por inalação de CO2. Uma amostra de sangue foi imediatamente isolada através de aspiração do coração. Fígado, baço, pulmão e tumor foram isolados e seu peso determinado. Os órgãos e o tumor foram homogeneizados. A CFU em cada amostra foi determinada por manchas de diluições em série em placas de ágar LB contendo ácido nalidíxico (35 ug/mL).

B) RESULTADOS Um sistema de liberação de proteína baseado na secreção do tipo 3 de proteínas de fusão de YopE

[00212] Enquanto o próprio terminal N do efetor YopE de Y. enterocolitica T3SS (SEQ ID No. 1) contém o sinal de secreção suficiente para translocar proteínas heterólogas [19], o sítio de ligação da chaperona (CBS) para o seu da chaperona (SycE) não é incluído [39]. Foram selecionados os 138 aminoácidos N- terminais de YopE (SEQ ID No. 2) a serem fundidos com as proteínas a serem distribuídas, uma vez que isso mostrou dar os melhores resultados para a translocação de outros substratos de T3S heterólogos [21]. Como estes 138 aminoácidos N-terminais de YopE contêm o CBS, foi decidido ainda coexpressar o SycE. O fragmento SycE-YopE1-138 clonado a partir do plasmídeo de virulência Y. enterocolitica pYV40 purificado contém os promotores endógenos de YopE e do seu da chaperona SycE (Fig. 9). Portanto, SycE e qualquer proteína de fusão YopE1-138 são induzidas por uma rápida mudança de temperatura do crescimento à temperatura ambiente para 37 °C. O tempo de cultura a 37 °C afetará a quantidade de proteína de fusão presente nas bactérias. Adicionou-se um sítio de clonagem múltipla (MCS) na extremidade 3' de YopE1-138 (Fig. 9B) seguido por uma TAG Myc e 6xHis e um códon de parada.

[00213] A cepa antecedente foi cuidadosamente selecionada. Primeiro, para limitar a translocação de efetores endógenos, foi utilizada uma cepa de Y. enterocolitica que foi deletada para todos os efetores conhecidos, Yop H, O, P, E, M e T (nomeados ?HOPEMT) [40]. Além disso, ocasionalmente foi utilizado um mutante auxotrófico que não pode crescer na ausência de ácido meso-2,6- diaminopimélico exógeno [41]. Esta cepa foi deletada para o gene aspartato- beta-semialdeído desidrogenase (?asd) e classificada como biossegurança nível 1 pela agência suíça de segurança (emenda ao A010088/2). Além disso, foram excluídas as proteínas de adesão YadA e/ou InvA para oferecer uma maior variedade de cepas antecedentes. Embora o uso das cepas yadA ou yadA/invA reduza a sinalização antecedente induzida [42], a quantidade de proteína administrada também é afetada [43].

Caracterização da liberação da proteína de fusão de YopE em células eucarióticas

[00214] Em um ensaio de secreção in vitro (ver Fig. 1 A), a secreção de proteína no líquido circundante é induzida artificialmente. Após precipitação de proteína baseada em TCA, utilizou-se análise de Western blot com anticorpo anti-YopE para determinar as quantidades de proteína secretadas (Fig. 1B). Enquanto uma cepa do tipo selvagem secretava o YopE, as cepas ?HOPEMT asd não o fizeram. Após a presença de YopE1-138-Myc-His (adicionalmente denominado YopE1-138-Myc; SEQ_ID_NO._3), uma banda YopE menor tornou-se visível (Fig. 1B). Assim, o fragmento YopE1-138 é bem secretado na configuração descrita aqui. Para analisar a homogeneidade da translocação da proteína em células eucarióticas, as células HeLa foram infectadas com a cepa codificadora YopE1-138-Myc e coradas com o marcador Myc por IF (Fig. 2A e B). Enquanto no início apenas as bactérias foram coradas, aos 30 minutos após a infecção (p.i.), os contornos das células começam a ser visíveis, o que é melhorado com o aumento do tempo de infecção (Fig. 2B). Esta tendência é bem refletida pela intensidade da coloração da TAG Myc dentro das células HeLa (Fig. 2A e B). O YopE1-138-Myc pode ser detectado em todos os lugares nas células (Fig. 2A), exceto nos núcleos [44]. Notavelmente, a maioria, se não todas as células foram alcançadas por esta abordagem de forma comparável. Como a Y. enterocolitica é conhecida por infectar muitos tipos diferentes de células [45], a liberação de YopE1-138-Myc foi seguida em várias linhagens celulares. A mesma coloração homogênea IF anti-Myc foi observada em fibroblastos de murinos infectados, células Jurkat e HUVECs (Fig. 11). Ainda mais, o ajuste do MOI para cima ou para baixo permite modular a quantidade de proteína administrada (Fig. 2C), enquanto a maioria das células permanece direcionada. Um baixo número bacteriano não resultará em poucas células com muita proteína entregue, mas sim com a maioria das células contendo uma baixa quantidade de proteína entregue (Fig. 2C).

Redirecionamento do proteínas T3SS distribuídas ao núcleo

[00215] Como o próprio YopE se localiza no citoplasma (Fig. 2A), é de especial interesse testar se o fragmento YopE1-138 dificulta a localização de proteínas de fusão nuclear. Por isso, adicionamos o SV40 NLS ao terminal C (e ao terminal N, resultados semelhantes) de YopE1-138-EGFP (SEQ ID NO.: 39 e SEQ ID NO.: 38, respectivamente). Enquanto YopE1-138-EGFP (SEQ ID NO.: 37) conduziu a uma fraca coloração citoplásmica, YopE1-138-EGFP-NLS deu origem a um sinal nuclear EGFP mais forte em células HeLa infectadas (Fig. 3). Isso indica que o fragmento de YopE1-138 é compatível com o uso de um NLS. Enquanto mCherry já tinha sido usado em patógenos de plantas [46], isso representa uma liberação bem-sucedida de uma proteína semelhante a GFP através de bactérias patogênicas humanas ou animais que codificam um T3SS. Isso valida a estratégia dependente de SycE e YopE1-138 de ser muito promissora para a liberação de várias proteínas de escolha.

Remoção do apêndice de YopE1-138 após translocação da proteína de fusão para a célula eucariótica

[00216] Enquanto para a liberação bacteriana o fragmento YopE1-138 é de grande benefício, ela pode dificultar a função e/ou localização das proteínas de fusão. Portanto, sua remoção após o fornecimento de proteína seria ótima. Para este fim, foram introduzidos dois sítios de clivagem de TEV (ENLYFQS) [47-49] entre YopE1-138 e um parceiro de fusão (o regulador transcricional ET1-Myc (SEQ ID No. 36 e 41) [50] e INK4C humano (SEQ ID NO.: 40 e SEQ ID NO.: 43)). Para manter as vantagens do método apresentado, foi ainda fundida a protease de TEV (variante S219V; [51]) a YopE1-138 (SEQ ID NO. 42) em outra cepa de Y. enterocolitica. Células HeLa foram infectadas com ambas as cepas de uma só vez. Para permitir a análise apenas da fração translocada de células, as células HeLa infectadas foram lisadas às 2 h p.i. (Fig. 4) com digitonina, que é conhecida por não lisar as bactérias ([52]; ver Fig. 11 para controle). A análise de Western blot revelou a presença do sítio de clivagem YopE1-138-2xTEV-sítio de clivagem-ET1- Myc ou YopE1-138-2xTEV-sítio de clivagem-Flag-INK4C-Myc apenas quando as células foram infectadas com a cepa correspondente (Fig. 4A e C). Após a digestão durante a noite deste lisado de células com protease de TEV purificada, foi observada uma banda deslocada (Fig. 4A e C). Esta banda corresponde a ET1- Myc (Fig. 4C) ou Flag-INK4C (Fig. 4A) com os restos do terminal N do sítio de clivagem de TEV, muito provavelmente apenas uma Serina. Após a coinfecção das células com a cepa de liberação da protease de TEV, o mesmo fragmento ET1-Myc ou Flag-INK4C clivado tornou-se visível, indicando que a protease de TEV liberada via T3SS é funcional e que as células individuais foram infectadas por ambas as cepas bacterianas (Fig. 4A e C). Embora a clivagem não esteja completa, a maioria da proteína translocada já é clivada 2 h após a infecção e mesmo a digestão noturna com protease de TEV purificada não produziu melhores taxas de clivagem (Fig. 4B). Conforme relatado, a clivagem dependente de protease de TEV pode precisar de otimização dependente da proteína de fusão [53,54]. A remoção dependente da protease de TEV do apêndice de YopE1- 138 após a translocação, portanto, fornece pela primeira vez uma liberação de proteína T3SS de proteínas heterólogas quase nativas, alterando a composição de aminoácidos por apenas um aminoácido N-terminal.

[00217] Uma abordagem alternativa à clivagem dependente da protease de TEV do fragmento YopE consistiu em incorporar ubiquitina na proteína de fusão de interesse. De fato, a ubiquitina é processada no seu terminal C por um grupo de proteases C-terminais endógenas específicas da ubiquitina (enzimas deubiquitinantes, DUBs). Como se supõe que a clivagem ocorra no mesmo terminal C da ubiquitina (após G76), a proteína de interesse deve estar livre de sequência adicional de aminoácidos. Este método foi testado na proteína de fusão YopE1-138-Ubiquitina-Flag-INK4C-MycHis. Nas células de controle infectadas por bactérias que expressam YopE1-138-Flag-INK4C-MycHis, foi encontrada uma banda correspondente a YopE1-138-Flag-INK4C-MycHis, indicativa de translocação eficiente da proteína de fusão (Fig. 23). Quando as células foram infectadas durante 1 h com bactérias que expressam YopE1-138- ubiquitina-Flag-INK4C-MycHis, foi visível uma banda adicional correspondendo ao tamanho de Flag-INK4C-MycHis, indicando que parte da proteína de fusão foi clivada. Este resultado mostra que a introdução da ubiquitina na proteína de fusão permite clivar o fragmento YopE1-138 sem a necessidade de uma protease exógena.

Translocação de efetores bacterianos tipo III e tipo IV

[00218] SopE de Salmonella entericaé um fator de troca de nucleotídeos de guanina (GEF) bem caracterizado que interage com Cdc42, promovendo a remodelação do citoesqueleto de actina [55]. Enquanto a translocação de YopE1- 138-Myc em células HeLa não tem efeito, YopE1-138-SopE (SEQ ID No. 5 e 135) translocado induziu mudanças dramáticas na rede de actina (Fig. 5A). Resultados semelhantes foram obtidos com outra proteína efetora de GEF, IpgB1 da Shigella flexneri (SEQ ID NO.: 4). Notavelmente, as primeiras alterações no citoesqueleto de actina foram observadas tão rapidamente quanto 2 min p.i. (Fig. 5A). Portanto, pode-se concluir que a liberação da proteína dependente de T3SS ocorre imediatamente após a infecção ser iniciada por centrifugação. Para comprovar o transporte dependente do T3SS estrito, uma das proteínas T3SS que forma o poro de translocação na membrana da célula eucariótica foi eliminada (YopB, ver [56]) (Fig. 11).

[00219] Durante a infecção por Salmonella, a translocação SopE é seguida por translocação de SptP, que funciona como uma proteína ativadora de GTPase (GAP) para Cdc42 [57]. Considerando que a translocação de YopE1-138-SopE-Myc (SEQ ID No. 135) desencadeou rearranjos maciços de F-actina, a coinfecção com bactérias que expressam YopE1-138-SptP (SEQ ID No. 8) aboliu este efeito de uma maneira dependente da dose (Fig. 5B). Uma coloração anti-Myc indicou que esta inibição não foi devida a um nível reduzido de translocação YopE1-138-SopE-Myc (Fig. 5B). Juntos, esses resultados mostraram que a coinfecção de células com duas cepas bacterianas é um método válido para distribuir dois efeitos diferentes em células individuais para tratar sua interação funcional.

[00220] O efetores de S. flexneri tipo III, OspF, funciona como uma fosfatidonina liase que desfosforila MAP quinases p38 e ERK [58]. Para testar a funcionalidade do YopE1-138-OspF translocado (SEQ ID No. 7), foi monitorada a fosforilação da p38 após estimulação com TNFa. Em células não infectadas ou em células infectadas com bactérias que expressam YopEi-i38-Myc, o TNFa induziu fosforilação de p38. Em contraste, após a translocação de YopE1-138-OspF, a fosforilaçaão induzida por TNFa foi abolida, mostrando que o OspF distribuído é ativo em relação a p38 (Fig. 6A).

[00221] Durante a infecção por Salmonella, o efetor tipo III SopB protege as células epiteliais da apoptose pela ativação sustentada de Akt [59]. Enquanto a translocação de YopE1-138-Myc ou YopE1-138-SopE não teve efeito sobre Akt, a translocação de YopE1-138-SopB (SEQ ID No. 6) induziu uma forte fosforilação de Akt em T308 e S473, refletindo a forma ativa (Fig. 6B). Resultados semelhantes foram obtidos com o homólogo de SopB de S. flexneri (IpgD, SEQ ID No. 9). Em conjunto, os resultados mostram que o sistema de liberação baseado em YopE1- 138 funciona para todos os efetores T3S testados até o momento, e que permite investigar proteínas envolvidas no controle de funções celulares centrais, incluindo o citoesqueleto, inflamação e sobrevivência celular.

[00222] Várias bactérias, incluindo Agrobacterium tumefaciens, Legionella pneumophila e Bartonella henselae, utilizam secreção do tipo IV para injetar efetores nas células. Foi testado se o efetor tipo BepA de B. henselae poderia ser translocado para células HeLa usando a presente ferramenta. O Comprimento total de BepA (SEQ ID No. 10) e BepAE305-final (SEQ ID No. 11) contendo o domínio C-terminal Bid, foram clonados e as células foram infectadas com as respectivas cepas. Como o BepA mostrou induzir a produção de AMP cíclico (AMPc) [60], o nível de AMPc nas células HeLa foi medido após a infecção. Considerando que a translocação do domínio Bid do efetor BepG de B. henselae (SEQ ID No. 136) falhou em induzir AMPc, produção de AMPc desencadeada na extremidade completa de BepA e BepAE305-final em quantidades esperadas [60] (Fig. 6C). Este resultado mostra que os efetores do tipo IV também podem ser eficazmente distribuídos pelo sistema de liberação baseado em YopE1-138 nos alvos da célula hospedeira e que eles são funcionais.

Translocação de proteínas eucarióticas em células epiteliais

[00223] Para mostrar que as proteínas humanas podem translocar através da secreção do tipo III, indutores de apoptose humana foram fundidos para liberação por Y. enterocolitica a YopE1-138 ou para liberação por S. enterica a SteA1-20, SteA, SopE1-81 ou SopE1-105. Em seguida, a translocação do agonista de morte no domínio de interacção com BH3 humano (BID, SEQ ID No. 24) foi monitorada, que é um membro pró-apoptótico da família de proteínas Bcl-2. É um mediador do dano mitocondrial induzido pela caspase-8 (CASP8). O CASP8 cliva o BID, e o BID truncado (tBID, SEQ ID No. 25) transloca-se para a mitocôndria, onde desencadeia a liberação do citocromo c. Este último leva ao modo intrínseco de ativação da caspase 3 (CASP3) durante o qual é clivado em subunidades de 17 e 12 kDa [61]. Enquanto a infecção por 1 h com YopE1-138-Myc ou YopE1-138-BID que expressa Y. enterocolitica falhou em induzir apoptose, a translocação de tBID humana desencadeou morte celular em maior extensão do que a estaurosporina indutora de apoptose bem caracterizada (Fig. 7A e C). Como esperado, a translocação de tBID leva à produção da subunidade CASP3 p17, mesmo em quantidades maiores, como com estaurosporina (Fig. 7A). Para ser capaz de comparar as quantidades de proteína translocada ao Bid endógeno, as células HeLa foram lisadas com digitonina e analisadas por Western blotting utilizando um anticorpo anti-Bid (Fig. 7B). T3SS YopE1-138-tBID distribuído alcançou níveis de lance endógeno em células HeLa, enquanto YopE1-138-BID distribuído estava presente em quantidades ainda maiores (2,5 vezes) (Fig. 7B). Um mapeamento profundo de proteoma e transcriptoma de células HeLa estimou 4,4 vezes 105cópias de BID por célula única [62]. Portanto, pode-se concluir que a liberação de proteína humana dependente de T3SS atinge 105a 106proteínas por célula. Estes números ajustam as cópias por célula de nanocorpos translocados via T3SS de E. coli [63]. Assumindo um nivelamento de um fator de 10 para o MOI e para a duração da infecção, um fator de 3,2 para o ponto de tempo de adição de antibiótico e para o tempo de cultura a 37 °C antes da infecção, as cópias de proteína distribuídas/célula podem ser ajustadas de cerca de 1000 cópias/célula até cerca de 106cópias/célula. No total, esses resultados indicaram que o tBID translocado era funcional e distribuído em níveis relevantes. Isso validou a ferramenta de translocação para estudar o papel das proteínas na regulação da apoptose, um aspecto central da biologia celular.

[00224] Ainda foi fundido tBID de camundongo (códon otimizado para Y. enterocolitica; SEQ ID No. 194) ou os domínios BH3 de tBID murino ou BAX murino (em ambos os casos o códon otimizado para Y. enterocolitica; SEQ ID No. 138 e 139) para YopE1-138 para liberação por Y. enterocolitica. Enquanto a infecção por 2,5 h com Y. enterocolitica?HOPEMT asd que não distribui proteína ou YopE1-138-Myc falhou em induzir apoptose, a translocação de tBID de murino (códon otimizado para Y. enterocolitica, SEQ ID No. 194) desencadeou morte celular em células B16F10 (Fig. 15), D2A1 (Fig. 16), HeLa (Fig. 17) e 4T1 (Fig. 18). A translocação do domínio BH3 do códon otimizado para Y. enterocolitica de BID de murino (SEQ ID 138) ou códon otimizado para Y. enterocolitica de BAX de murino (SEQ ID 139) foi também bem encontrada para induzir morte celular massiva em células B16F10 (Fig. 15), D2A1 (Fig. 16), HeLa (Fig. 17) e 4T1 (Fig. 18). Versões adicionais incluem uma repetição em tandem do domínio BH3 de códon otimizado para Y. enterocolitica de BID de murino fundida a YopE1-138 (SEQ ID 202) ou ligando o domínio BH3 de códon otimizado para Y. enterocolitica de BID de murino ao domínio BH3 de códon otimizado para Y. enterocolitica de BAX de murino, fundido a YopE1-138 (SEQ ID 203).

[00225] Enquanto a infecção por 4 h com a bactéria S. enterica aroA falhou em induzir apoptose, a translocação de tBID de murino desencadeou apoptose, já que a translocação de tBID de murino levou à produção da subunidade CASP3 p17 (Figs. 19 e 20). A extensão da indução de apoptose para proteínas de fusão SopE foi maior quando se utilizaram condições de indução de Spil T3SS (Fig. 19), que reflete o transporte de SopE exclusivamente por Spil T3SS. O tBID de murino fundido SteA1-20 falhou na indução de apoptose, muito provavelmente porque o sinal de secreção nos 20 aminoácidos N-terminais de SteA não é suficiente para permitir a liberação de uma proteína de fusão (Figs. 19 e 20). O tBID de murino fundido com SteA de comprimento total leva à indução de apoptose em células HeLa (Figs. 19 e 20), ambas em condições de indução Spil e Spill T3SS, refletindo a capacidade de SteA de ser transportado por ambos os T3SS. Deve se notar que, mesmo sob condições de indução de Spill T3SS, uma atividade parcial do Spil T3SSé esperada, tal como observado pela atividade das proteínas de fusão de SopE nas condições de indução de Spill T3SS (Fig. 20).

[00226] Além das proteínas eucarióticas translocadas aqui funcionalmente elaboradas, várias outras proteínas eucarióticas foram secretadas utilizando a ferramenta aqui descrita. Isto inclui para liberação por proteínas Y. enterocolitica (Figs. 12, 13 e 22) da regulação do ciclo celular (Mad2 (SEQ ID No. 15), CDK1 (SEQ ID No. 14), INK4A (SEQ ID No. 16), INK4B (SEQ ID No. 17) e INK4C (SEQ ID No. 18)), bem como partes da mesma (INK4A84-103 (SEQ ID No. 158), p107657-662 (SEQ ID No. 159), p21141-160 (SEQ ID No. 160), p21145-160 (SEQ ID No. 161), p2117-33 (SEQ ID NO. 162) e ciclina D2139-147 (SEQ ID No. 163)), proteínas relacionadas com apoptose (Bad (SEQ ID No. 29), FADD (SEQ ID No. 28) e Caspase 3 p17 (SEQ ID No. 22) e p12 (SEQ ID No. 23), Bid de peixe-zebra (SEQ ID No. 19) e t-Bid (SEQ ID No. 20)), assim como partes do mesmo (BH3 de tBid (SEQ ID No. 138), BH3 de Bax (SEQ ID No. 139)), proteínas sinalizadoras (TRAF6 de murino (SEQ ID No. 12), TIFA (SEQ ID No. 13)), subunidade GPCR Ga (GNA12, isoforma mais curta, (SEQ ID No. 30)), nanocorpo (vhhGFP4, (SEQ ID No. 31)) e construtos de fusão de nanocorpo para degradação da proteína alvo (Slmb-vhhGFP4; (SEQ ID Nos. 32, 33, 34) [64]) (Fig. 12 e 13) bem como GTPases pequenas (Racl Q61E (SEQ ID No. 26 e 137) e RhoA Q63L (SEQ ID No. 27) e domínio de homologia de Pleckstrin da Akt humana (SEQ ID No. 35). Além das proteínas relacionadas com apoptose funcionalmente elaboradas (tBid de murino, SEQ ID No. 144 a 147), isto inclui ainda para liberação por proteínas de S. enterica (Fig. 21) da regulação do ciclo celular (Mad2 (SEQ ID No. 168 a 169), CDK1 (SEQ ID No. 170 a 171), INK4A (SEQ ID No. 164 a 165) e INK4C (SEQ ID No. 166 a 167)). Embora essas proteínas não tenham sido funcionalmente validadas, a possibilidade de secreção dependente de T3SS de diversas proteínas eucarióticas em combinação com a possível remoção do apêndice YopE abre novas perspectivas sobre a ampla aplicabilidade do T3SS na biologia celular e aplicações terapêuticas, especialmente para o tratamento de tumores malignos sólidos.

A análise fosfoproteômica revela o impacto global de proteínas translocadas na fosforilação de proteínas

[00227] A fosforilação é uma modificação pós-translacional generalizada que pode ativar ou inativar processos biológicos e é, portanto, um alvo adequado para estudar eventos de sinalização [65]. Apesar disso, nenhuma análise de nível de sistemas de fosforilação na apoptose está disponível hoje. Para analisar o impacto do tBid humano distribuído em células HeLa, usamos uma abordagem fosfoproteômica livre de marcadores por LC-MS/MS. Em três experimentos independentes, as células foram deixadas sem tratamento, infectadas com ?HOPEMT asd + YopEi-i38-Myc ou com ?HOPEMT asd + YopEi- 138-tBid durante 30 minutos. As células foram lisadas, seguidas de digestão enzimática, enriquecimento de fosfopeptídeo e quantificação e identificação de fosfopeptídeos individuais. Foram comparadas células infectadas com ?HOPEMT asd + YopE1-138-Myc com células infectadas com ?HOPEMT asd + YopE1-138-tBid, permitindo identificar 363 eventos de fosforilação dependentes de tBid. 286 fosfopeptídeos mostraram um aumento na fosforilação, enquanto 77 foram menos fosforilados na liberação de tBid, correspondendo a 243 proteínas diferentes, que foram definidas como o fosfoproteoma de tBid. O banco de dados STRING foi usado para criar uma rede de interação proteína- proteína do fosfoproteoma de tBid [66] (Fig. 8A). Adicionalmente 27 proteínas conhecidas por estar relacionadas com a apoptose mitocondrial foram adicionados à rede, construindo um conjunto central. Curiosamente, apenas poucas proteínas do fosfoproteoma de tBid estão ligadas a este conjunto central, indicando que muitas proteínas sofrem uma alteração na fosforilação que até agora não estava diretamente conectada às proteínas apoptóticas. Para caracterizar as funções biológicas cobertas pelo fosfoproteoma de tBid, foi realizada uma análise de ontologia gênica utilizando a ferramenta de anotação funcional do Banco de Dados para Anotação, Visualização e Descoberta Integrada (DAVID, http://david.Abcc.ncifcrf.gov/) [67,68]. Funções biológicas identificadas mostram que diversos processos celulares são afetados pelo tBid. Muitas proteínas envolvidas no rearranjo da cromatina e na regulação da transcrição sofrem uma alteração na fosforilação (isto é, CBX3, CBX5, TRIM28, HDAC1). A HDAC1, por exemplo, é uma histona desacetilase que desempenha um papel na regulação da transcrição. Foi demonstrado que o HDAC1 pode modular a atividade transcricional do NF-kB, uma proteína que também participa da apoptose. Além disso, foi identificado um grupo de proteínas envolvidas no processamento de RNA, que anteriormente demonstrou ter um papel importante na regulação da apoptose [69]. O HNRPK, por exemplo, medeia uma resposta p53/TP53 aos danos no DNA e é necessário para a indução da apoptose [70]. Além disso, a fosforilação de proteínas envolvidas na tradução de proteínas também é afetada. Vários fatores de iniciação eucarióticos (isto é, EIF4E2, EIF4B, EIF3A, EIF4G2) sofrem uma alteração na fosforilação, o que está de acordo com a observação de que a síntese global de proteína está diminuída em células apoptóticas. Curiosamente, a fosforilação de muitas proteínas envolvidas na remodelação do citoesqueleto (por exemplo, PXN, MAP1B9 são alteradas na liberação de tBid. Isto está em concordância com a observação de que a morfologia das células muda drasticamente na liberação de tBid (Figura 8B). O encolhimento das células e a perda de contato são refletidos pelo fato de observarmos a fosforilação de proteínas relacionadas à adesão, como ZO2 e Paxilina. Assim, o encolhimento dos núcleos é acompanhado pela fosforilação de proteínas laminares como LaminaA/C e Lamina B1. Ao mesmo tempo, a liberação de tBID induz uma rápida resposta apoptótica também indicado pela ruptura da integridade mitocondrial (Fig. 8B). Foi mostrado que a apoptose induzida por tBid afeta centenas de eventos de fosforilação que participam de diversos processos celulares. Embora muitas proteínas identificadas tenham sido relacionadas à apoptose, apenas algumas eram conhecidas por ser fosforiladas após a apoptose. A abordagem fosfoproteômica, portanto, fornece um recurso útil para estudos adicionais em apoptose.

Translocação de proteínas de fusão heterólogas eucarióticas consistindo em domínios proteicos repetidos idênticos ou variáveis em células epiteliais

[00228] Para mostrar que as proteínas de fusão heterólogas consistindo em domínios proteicos repetidos idênticos ou variáveis podem translocar através de secreção do tipo III, foram fundidos indutores de apoptose de murino para liberação por Y. enterocolitica a YopE1-138. Como controle, foi fundido tBID murino (códon otimizado para Y. enterocolitica; SEQ ID No. 194) ou os domínios BH3 de tBID murino ou de BAX murino (em ambos os casos códon otimizado para Y. enterocolitica; SEQ ID No. 200 e 201) para YopE1-138 para liberação por Y. enterocolitica. A proteína de fusão heteróloga consistiu em um caso de domínio de BH3 de tBID murino fundido a si próprio, resultando em YopE1-138-(tBID-BH3)2 (SEQ ID No. 220). Em um segundo caso, as proteínas de fusão heterólogas consistiam no domínio BH3 de tBID murino fundido com domínio BH3 de BAX murino, resultando em YopE1-138-(tBID-BH3)-(BAX-BH3) (SEQ ID No. 203). No caso de tBID murino e BAX murino, o códon foi otimizado para Y. enterocolitica.

[00229] Enquanto a infecção por 4 h com Y. enterocolitica ?HOPEMT asd distribuindo YopE1-138-Myc falhou em induzir apoptose, a translocação do domínio BH3 murino tBID (códon otimizado para Y. enterocolitica, SEQ ID No. 194) desencadeou morte celular em células B16F10 e 4T1, com um claro efeito dose-resposta e aumentando a multiplicidade de infecção (MOI). Curiosamente, YopE1-138-(tBID-BH3)-(BAX-BH3) ou YopE1-138-(tBID-BH3)2 distribuídos foram mais ativos do que YopE1-138-(tBID-BH3) em menor MOI. Isto indica que, na liberação de domínios idênticos repetidos ou combinação de domínios proteicos diferentes, o impacto em uma via celular desejada como apoptose pode ser aumentado.

Atenuação na virulência por deleção/mutação de proteínas efetoras bacterianas com atividade de virulência para células eucarióticas

[00230] No caso de Y. enterocolitica, a virulência foi reduzida pela deleção das seis proteínas efetoras endógenas, chamadas "proteínas externas de Yersinia" (Yops), em detalhe YopH, O, P, E, M, T (MRS40 pIML421 [yopH?i-352, yopO?65-558, yopP23, yopE21, yopM23, yopT135]) [40]. Estas Yops são codificadas no "plasmídeo de virulência de Yersinia" (pYV), um plasmídeo com cerca de 70 kbp, no qual o sistema de secreção do tipo 3 completo (T3SS), bem como outros atores de virulência, estão codificados (Fig. 24). YopH, O, P, E, M e T são as seis proteínas efetoras, que são distribuídas às células hospedeiras pelo sistema de secreção do tipo bacteriano três, a fim de modular e amortecer o sistema imunológico. Cada Yop tem uma atividade bioquímica específica na célula hospedeira. A YopT cliva a cisteína C-terminal das GTPases Rho e, desse modo, remove o grupo isporenil que ancora as GTPases à membrana. Esta inativação da Rho devido à falta de localização evita a fagocitose por células imunes como macrófagos e neutrófilos [71]. Na mesma via, a YopE atua como proteína ativadora de GTPase (GAP) para as Rho GTPases, desativando-as. Isso resulta em diminuição da fagocitose e inibição da liberação de IL-1 beta pelas células do sistema imunológico [71]. Além disso, a YopO atua como inibidor da dissociação de nucleotídeos guanidina (GDI), desativando GTPases Rho. A YopO também possui um domínio serina/treonina quinase atuando de forma ainda não definida no citoesqueleto de actina [71]. A YopH é uma tirosina fosfatase que atua em proteínas de adesão focal como a quinase de adesão focal (Fak), paxilina e outras, prevenindo fortemente a fagocitose por macrófagos e neutrófilos [71]. YopP, denominado YopJ em Y. pseudotuberculosis ou Y. pestis, foi encontrada para inativar a via MAPK/NFkB em células imunes, prevenindo a liberação de TNFa e IL-8 de células imunes estimuladas pela presença da bactéria. Além disso, descobriu-se que a YopP induz a apoptose em células imunes, o que pode estar relacionado ao efeito da via da MAPK, que em seu estado ativado protege as células da apoptose [71]. O papel de YopM ainda não está completamente claro, mas foi encontrado associado à S6 quinase ribossômica 1 (RSK1) e à proteína quinase C-tipo 2 (PRK2). Parece que a YopM poderia estimular a fosforilação da RSK1 e, assim, afetar os alvos a jusante, como, por exemplo, a progressão do ciclo celular [71]. Ao eliminar uma ou várias dessas Yops, o mecanismo de defesa das bactérias contra o sistema imunológico é dramaticamente afetado [72]. A mutação das respectivas yops foi confirmada por PCR na respectiva região e por ensaio de secreção in vitro (Fig. 25). A análise da secreção in vitro por SDS-PAGE e coloração de Coomassie-blue confirmou a ausência de YopH,O,M e YopE de comprimento total.

[00231] Além disso, uma cepa de Y. enterocolitica com deleções em asd (aspartato semialdeído desidrogenase) foi construída. A mutação em asd leva a uma perda completa da capacidade de crescimento sem adição de ácido meso- diamino-pimélico. Isto permite gerar sistemas de manutenção de plasmídeos isentos de antibióticos com base na presença de asd no respectivo plasmídeo. De um modo semelhante, outros mutantes auxotróficos podem ser utilizados.

Estudo de escalonamento de dose em camundongos saudáveis

[00232] A fim de avaliar a toxicidade aguda, foi realizado um estudo de escalonamento de dose em camundongos imunocompetentes saudáveis (C57BL/6). Neste experimentos, Y. enterocolitica subesp. palearctica MRS40 ?yopH,O,P,E,M,T ?asd(replicação deficiente devido a ?asd emais virulência atenuada devido a ?yopH,O,P,E,M,T) foi comparada com S. typhimurium ?aroA (crescimento atenuado devido a ?aroA, como usado por outros [73-75]). A toxicidade aguda pós-infecção foi avaliada com base no ganho de peso ou perda de peso dos camundongos após a administração i.v. de injeção de bactérias. Além disso, a contagem bacteriana em vários órgãos foi determinada por homogeneização de órgãos, diluição seriada e plaqueamento. Como a toxicidade aguda foi avaliada e o crescimento bacteriano não foi de interesse principal, nenhum pré-tratamento com desferoxamina foi aplicado. Quatro diferentes cargas bacterianas foram testadas para cada cepa (105, 106, 107, 108cfu por animal). Y. enterocolitica subesp. palearctica MRS40 ?yopH,O,P,E,M,T?asdnão levou a uma redução de peso nas duas doses mais baixas (105, 106cfu) (Fig. 26). Na dose de 107bactérias, o peso caiu cerca de 6% nas primeiras 24 horas, antes da estabilização e aumento contínuo. Com a dose mais alta, o peso foi encontrado reduzido em 7,5% 48 horas após a infecção (Fig. 26). Como Y. enterocolitica subesp. palearctica MRS40 ?yopH,O,P,E,M,T ?asdnão pode estabelecer uma infecção, ainda mais na ausência do pré-tratamento com desferroxamina, era esperado que as contagens bacterianas caíssem rapidamente, o que foi encontrado (Figs. 27 a 30). No entanto, uma forte toxicidade aguda devida a, por exemplo, choque endotóxico não foi observada mesmo para a maior dose de Y. enterocolitica aplicada. Isto está em contraste com o S. typhimurium ?aroAcompetente para o crescimento e infecção, que tem sido muitas vezes utilizado em estudos de murinos por outros [73-75] e o aroA e aroD duplo mutante, mesmo em ensaios clínicos (NCT01099631). As pontuações de aparência física e de comportamento incentivaram a sacrificar todos os camundongos infectados com a dose mais alta de S. typhimurium ?aroA no dia 1 após a infecção e no dia 4 para a dose de 107cfu. Peso descendente progressivo foi encontrado para as três doses mais altas (Fig. 26), enquanto a menor dose foi encontrada para induzir apenas uma perda de peso leve e permanente (Fig. 26). Mesmo com a menor dose testada, S. typhimurium ?aroA foi encontrado no fígado, baço e pulmão até 8 dias após a infecção (Figs. 27 a 30). Isso pode refletir a biodistribuição não ótima de S. typhimurium ?aroA vista por outros [76].

[00233] Nos experimentos de escalonamento de dose em toxicidade aguda feitos com camundongos imunocompetentes, Y. enterocolitica ?yopH,O,P,E,M,T ?asd mostrou tolerar com segurança até 108bactérias por camundongo em administração i.v.. Tal dose pode ser usada também em ensaios clínicos em humanos [77], com uma diferença de peso de camundongos para homens de várias milhares de vezes. Como se sabe que os camundongos sentem as bactérias gram-negativas da mesma forma que os humanos via TLR4 e tendem a responder de maneira semelhante ao mesmo estímulo lipídico [78], uma toxicidade inicial devido a um choque séptico causado pelo lipídio A em pacientes humanos é improvável a cargas bacterianas usadas até agora em ensaios clínicos [77]. Além disso, a falta de lipídio A imunoestimulante normal foi proposta para explicar a variância observada nos testes clínicos com S. enterica VNP20009 [79]. Assim, pode ser mais favorável reduzir a carga bacteriana inicial administrada aos pacientes, mantendo ao mesmo tempo a estrutura lipídica A do tipo selvagem, a fim de alcançar uma colonização ótima do tumor, onde cargas maiores podem ser obtidas por meio da replicação bacteriana.

[00234] No local da presença bacteriana no corpo, uma resposta imune será lançada para combater as bactérias. Após acumulação e crescimento bacterianos no local dos tumores sólidos [76,80-82]), o sistema imunológico, após a disseminação inicial da bactéria, será acionado no sítio do tumor. Embora um choque séptico e uma toxicidade aguda em pacientes devam ser evitados pela redução da carga bacteriana inicial e/ou pela redução da endotoxicidade da bactéria por meio de modificações do lipídio A, a estimulação do sistema imune no sítio do tumor é altamente desejada, já que auxilia na depuração do tecido canceroso (imunoterapia, imunossensibilização). O presente ensaio clínico de fase piloto 11 (EudraCT No. 2005-005775-15) com S. enterica se baseia neste efeito imunoterapêutico e na toxicidade natural das bactérias [83]. A imunossensibilização é um dos mecanismos chave da Salmonella geneticamente não equipada que atua nos tumores, como, por exemplo, Salmonella choleraesuis se acumula nos tumores e induz a infiltração de neutrófilos e uma resposta imune antitumoral [84]. Além disso, a ativação do sistema imune no sítio do tumor mostrou não impedir uma aplicação múltipla de bactérias na oncoterapia [85].

[00235] Em resumo, a resposta imune desencadeada pela terapêutica bacteriana contra o câncer deve ser subdividida em uma fase aguda não desejada, que deve ser mantida baixa, e uma ativação tardia desejada, que auxilia a erradicação do tumor. Isso pode ser alcançado pela administração de altas doses de bactérias endotóxicas inferiores ou pela administração de níveis mais baixos de bactérias endotóxicas normais, que têm maior capacidade de colonização e replicação em tumores sólidos [79].

Estudos de biodistribuição em modelo de murino de melanoma

[00236] Para validar bactérias gram-negativas com mutação(ões) em determinantes de virulência chave como os efetores de T3SS como veículo específico de tumor, estudos de tumor de aloenxerto de murino utilizando o modelo de melanoma B16F10 bem estabelecido ([86], ATCC N° CRL-6475) foram realizados. Quando s.c. os tumores atingiram certo tamanho (cerca de 100 a 200 mm3), os camundongos foram infectados i.v. com 2 x 105cfu de Y. enterocolitica subesp. palearctica MRS40 ou Y. enterocolitica subesp. palearctica MRS40 ?yopH,O,P,E,M,T. De modo a permitir o crescimento bacteriano, os camundongos foram pré-tratados 24 horas antes da infecção com desfreoxamina. Camundongos infectados com Y. enterocolitica subesp. palearctica MRS40 tipo selvagem aumentou a pontuação para aparência física e comportamento (Figs. 31 a 32) e exibiu perda de peso significativa em relação às primeiras 48 h da infecção (Fig. 33), o que incentivou a sacrificar todos os camundongos nesse grupo já no dia 2 após infecção. Em contraste, camundongos infectados com a cepa Y. enterocolitica subesp. palearctica MRS40 ?yopH,O,P,E,M,Tde virulência atenuada não apresentou perda de peso significativa e pontuou normalmente para aparência fisica e comportamento (Figs. 31 a 33) ainda no dia 4 após infecção. Nos camundongos infectados com a cepa do tipo selvagem (Y. enterocolitica subesp. palearctica MRS40) foram detectadas bactérias vivas em todos os órgãos avaliados e, além disso, no sangue (Fig. 35). Enquanto bactérias tipo selvagem foram encontradas no tumor sólido maligno, contagens igualmente altas ou mais altas foram encontradas em outros órgãos, maiores no baço (Fig. 35). Em contraste acentuado, em camundongos infectados com Y. enterocolitica subesp. palearctica MRS40 ?yopH,O,P,E,M,T bactérias vivas foram encontradas principalmente no tumor sólido maligno no dia 1 após a infecção, com baixa contagem bacteriana observada no baço, fígado e pulmão. Notavelmente, no dia 4 após a infecção, a contagem bacteriana no tumor sólido maligno aumentou em algumas ordens de magnitude (atingindo mais de 10 CFU/g de tecido tumoral), enquanto em todos os outros órgãos avaliados a contagem bacteriana caiu abaixo do limite de detecção (Fig. 34). Y. enterocolitica subesp palearctica MRS40 ?yopH,O,P,E,M,T, assim, acumulou-se no dia 4 após a infecção com uma proporção (mínima) de cerca de 1 milhão de vezes no sítio do tumor sólido maligno em comparação com o baço ou fígado (ao calcular a proporção contra o limite de detecção).

[00237] Estes resultados validam esta estratégia para atenuação de virulência por mutação de determinantes chave de virulência para gerar um veículo bacteriano visando especificamente o tumor sólido maligno.

Estudos de biodistribuição em um modelo murino de câncer de mama

[00238] Para validar bactérias gram-negativas com mutação(ões) em determinantes de virulência chave como os efetores de T3SS como veículo específico de tumor, estudos de tumor de aloenxerto de murino usando o modelo 4T1 de câncer de mama bem estabelecido (ATCC No. CRL-2539) foram realizados. Quando s.c. os tumores atingiram certo tamanho (cerca de 100 a 200 mm3), os camundongos foram infectados i.v. com 2 x 105cfu de Y. enterocolitica subesp. palearctica MRS40 AyopH,O,P,E,M,T. De modo a permitir o crescimento bacteriano, os camundongos foram pré-tratados 24 horas antes da infecção com desfreoxamina. Camundongos infectados a cepa de Y. enterocolitica subesp. palearctica MRS40 AyopH,O,P,E,M,T de virulência atenuada não apresentaram perda de peso significativa e pontuaram normalmente por aparência física e comportamento ainda no dia 8 após infecção. Nestes camundongos infectados com Y. enterocolitica subesp. palearctica MRS40 AyopH,O,P,E,M,T as bactérias vivas foram encontradas exclusivamente no tumor sólido maligno no dia 8 após infecção (Fig. 36). Y. enterocolitica subesp. palearctica MRS40 AyopH,O,P,E,M,T, assim, acumulou-se no dia 8 após a infecção com uma proporção de cerca de (minimamente) 10.000 vezes no sítio do tumor sólido maligno em comparação com o baço ou fígado (ao calcular a proporção contra o limite de detecção).

[00239] Estes resultados validam esta estratégia para atenuação de virulência por mutação de determinantes chave de virulência para gerar um veículo bacteriano visando especificamente o tumor sólido maligno.

Geração de bactérias pró-apoptóticas melhoradas

[00240] Nos experimentos acima mencionados é mostrado que a liberação baseada em T3SS de proteínas pró-apoptóticas (por exemplo, t-BID (SEQ ID No. 25) ou BIM (SEQ ID No. 21)) induz eficientemente morte celular em células murinas e humanas, incluindo células cancerígenas, e que este efeito pode ser aumentado quando se utiliza t-BID murino otimizado para uso de códons bacterianos (SEQ ID No. 138). Este aumento da morte celular reflete muito provavelmente o aumento da produção de proteína e a consequente liberação via T3SS devido aos códons ótimos utilizados.

[00241] De modo a otimizar a liberação de proteínas pró-apoptóticas, as cepas transformadas com diferentes proteínas pró-apoptóticas foram geradas de acordo com a Tabela IV. Tabela IV: Cepas transformadas com diferentes proteínas pró-apoptóticas

[00242] O encurtamento das proteínas distribuídas aos domínios essenciais requeridos para sinalização (por exemplo, o domínio BH3 de t-BID (SEQ ID No. 138 ou 200)) pode aumentar a eficiência da morte celular (Fig. 37). Sem estar limitado pela teoria, este aumento na eficácia está provavelmente relacionado com o aumento da produção de proteína e após a liberação via T3SS devido ao tamanho menor da proteína distribuída. A introdução de um ligante entre a parte YopE e o domínio BH3 de tBID (SEQ ID No. 210) diminuiu a eficácia, assim como estendeu o domínio BH3 por mais 4 aminoácidos (SEQ ID No. 209) (Fig. 37).

[00243] Além disso, cargas sintéticas com repetições de tais domínios essenciais (por exemplo, o domínio BH3 de t-BID (SEQ ID No. 202)) ou combinações desses domínios essenciais (por exemplo, o domínio BH3 de t-BID e o domínio BH3 de BAX (SEQ ID No. 203 e 211)) foram gerados. Surpreendentemente, verificou-se que as repetições em cadeia dos mesmos ou diferentes domínios BH3 resultam em uma indução aumentada da apoptose em linhagens celulares cancerosas (incluindo células 4T1 e B16F10, Fig. 37). A IC50 (metade da concentração inibitória máxima), referindo-se ao número de bactérias por célula eucariótica (MOI) necessárias para matar 50% dessas células, mostrou estar diminuída na liberação de repetições em tandem do domínio BH3 de tBid em comparação com um domínio BH3 de tBid único (Fig. 37). Esta constatação foi surpreendente, uma vez que o tamanho da proteína é aumentado por fusão como segundo domínio BH3 de t-BID. Devido a isto, níveis de expressão e liberação diminuídos de YopE1-138-(BH3 de tBid)2 (SEQ ID No. 202) em comparação com YopE1-138-BH3 de tBid (SEQ ID No. 138 ou 200) seriam esperados, e podem atingir o máximo de níveis equivalentes. De modo a atingir um aumento na atividade de morte celular, os domínios fundidos de BH3 de tBid devem atuar simultaneamente lado a lado após liberação por T3SS em células eucarióticas. No caso de apenas um domínio BH3 de tBid na estrutura YopE1-138- (BH3 de tBid)2 ser funcional, na melhor das hipóteses, a mesma eficiência que com YopE1-138-BH3 de tBid pode ser esperada.

[00244] Para aumentar a estabilidade genética de YopE1-138-(BH3 de tBid)2 (SEQ ID No. 202) para estudos in vivo, foi clonado YopE1-138-(BH3 de tBid)2 (SEQ ID No. 202) por recombinação homóloga no plasmídeo de virulência de Yersinia pYV no sítio nativo de YopE e sob o promotor YopE nativo (utilizando os plamídeos mutantes pSI_408 e pSI_419). Tais mutantes contêm a sequência de DNA que codifica a proteína desejada, flanqueada por 200 a 250 pb de sequências em ambos os lados correspondentes ao sítio do respectivo gene, onde a integração deve ocorrer. Estes plasmídeos são transformados em E. coli Sm10 Àpir, a partir de onde os plasmídeos foram mobilizados para a correspondente cepa de Y. enterocolitica. Os mutantes portadores do vetor integrado foram propagados por gerações severas sem pressão de seleção. Em seguida, a sacarose foi utilizada para selecionar clones que perderam o vetor. Finalmente mutantes foram identificados por PCR de colônia. As proteínas endógenas para o transporte pelo T3SS (denominadas "proteínas externas de Yersinia", Yops) são codificadas por Y. enterocolitica neste plasmídeo de 70 kb, denominado plasmídeo de virulência Yersinia (pYV), que codifica adicionalmente o aparelho T3SS.

[00245] Cepas de Yersinia que codificam YopE1-138-(BH3 de tBid) (SEQ ID No. 138 ou 200) ou YopE1-138-(BH3 de tBid)2 (SEQ ID No. 202) no plasmídeo de virulência de Yersinia pYV no sítio nativo de YopE e sob o promotor de YopE nativo foram avaliados quanto à sua capacidade de induzir apoptose em células cancerígenas (incluindo células 4T1 e B16F10, Fig. 38). A IC50 (metade da concentração inibitória máxima), referindo-se ao número de bactérias por célula eucariótica (MOI) necessárias para matar 50% dessas células, mostrou estar diminuída na liberação de repetições em tandem do domínio BH3 de tBid em comparação com um domínio BH3 de tBid único, quando ambas as proteínas são codificadas no plasmídeo de virulência de Yersinia pYV no sítio nativo de YopE e sob o promotor YopE nativo (Fig. 38). Isto está de acordo com as constatações da expressão de liberação destas proteínas pelo plasmídeo de expressão (Fig. 37). Mais uma vez, esta constatação foi surpreendente, uma vez que o tamanho da proteína é aumentado pela fusão de um segundo domínio BH3 de t-BID. Devido a isto, níveis de expressão e liberação reduzidos de YopE1-138-(BH3 de tBid)2 (SEQ ID No. 202) em comparação com YopE1-138-BH3 de tBid (SEQ ID No. 138 ou 200) seriam esperados, e podem atingir níveis equivalentes ao máximo. De modo a atingir um aumento na atividade de morte celular, os domínios fundidos de BH3 de tBid devem atuar simultaneamente lado a lado após liberação pelo T3SS em células eucarióticas. No caso de apenas um domínio BH3 de tBid na estrutura YopE1-138-(BH3 de tBid)2 ser funcional, na melhor das hipóteses, a mesma eficiência que com YopE1-138-BH3 de tBid pode ser esperada. Além disso, as cepas de Yersinia que codificam YopE1-138-(BH3 de tBid)2 (SEQ ID No. 202) no plasmídeo de virulência de Yersinia pYV no sítio nativo de YopE e sob o promotor YopE nativo foram comparadas por sua capacidade de induzir apoptose em células cancerosas à liberação derivada do plasmídeo de expressão (baseado em pBad-MycHisA) de YopE1-138-(BH3 de tBid)2. De acordo com o maior número de cópias de pBad-MycHisA (20 a 25 cópias) em comparação com o pYV (1 a 6 cópias são relatadas), liberação baseada em pBad-MycHisA de YopE1-138- (BH3 de tBid)2 (SEQ ID No. 202) resultou em um valor de IC50 ligeiramente diminuído nas células 4T1 e B16F10 (Fig. 38).

Validação do crescimento específico do tumor in vivoaté o dia 14 após administração bacteriana

[00246] O experimento de colonização tumoral por Y. enterocolitica geneticamente modificada foi repetido em um modelo murino de aloenxerto singeneico (modelo de câncer de mama 4T1) e a colonização bacteriana foi seguida durante duas semanas. Desta vez, os camundongos foram infectados com 1 x 106unidades formadoras de colônia (CFU) de Y. enterocolitica ?yopH,O,P,E,M,T.Enquanto se obtém resultados semelhantes ao modelo B16F10 nos primeiros dias pós-infecção, podes-se mostrar ainda que a colonização do tumor é consistentemente encontrada no dia 8 e até o dia 14 após a infecção (Fig. 39). Além disso, a colonização permanece altamente específica, com apenas baixas contagens de bactérias detectadas em todos os outros órgãos avaliados (Fig. 40). Esses achados indicam que Y. enterocolitica ?yopH,O,P,E,M,Té capaz de estabelecer uma colonização persistente do tumor, evitando assim a depuração pelo sistema imune.

Eficácia de Y. enterocolitica ?HOPEMTem retardar a progressão tumoral

[00247] De modo a avaliar o impacto de YopE1-138-(BH3 de tBid)2 (SEQ ID No. 202) distribuído a células tumorais in vivo, foram realizados estudos em camundongos Balb/C de tipo selvagem de aloenxertos s.c. com células de câncer de mama 4T1. Objetivou-se avaliar a cepa de Y. enterocolitica ?HOPEMT codificando YopE1-138-(BH3 de tBid)2 (SEQ ID No. 202) no plasmídeo de virulência de Yersinia pYV no sítio nativo de YopE e sob o promotor nativo de YopE. Os camundongos foram injetados i.v. com PBS ou 1 x 107de Y. enterocolitica ?HOPEMT pYV-YopE1-138-(BH3 de tBid)2, uma vez que o tumor atingiu um tamanho de 150 a 250 mm3. O dia da injeção i.v. de bactérias foi definida como o dia 0. O volume do tumor foi medido ao longo dos dias seguintes (dia 0 até o dia 9 após injeção i.v. de bactérias) com calibrador. O volume do tumor foi normalizado para o volume do tumor no dia 0 para compensar qualquer heterogeneidade inicial no tamanho do tumor. O tratamento com Y. enterocolitica ?HOPEMTpYV-YopEi-i38-(BH3 de tBid)2 mostrou um impacto na progressão do volume do tumor, com redução estatisticamente significativa do tumor no dia 8, 9 e 10 após administração bacteriana (Fig. 41). Importante, foi descoberto que Y. enterocolitica ?HOPEMTisoladamente não afeta a progressão tumoral no modelo de câncer murino 4T1 (Fig. 42). Esses achados destacam que tais bactérias e seus T3SS podem ser empregados para interferência na progressão tumoral. Lista de referências 1 Hoffman, R. M. Tumor-seeking Salmonella amino acid auxotrophs. Curr Opin Biotechnol 22, 917-923, doi: 10.1016/j.copbio.2011.03.009 (2011). 2 Hoang, T. T, Williams, S., Schweizer, H. P. & Lam, J. S. Molecular genetic analysis of the region containing the essential Pseudomonas aeruginosa asd gene encoding aspartate-beta-semialdehyde dehydrogenase. Microbiology 143 (Pt 3), 899-907 (1997). 3 Skurnik, M. & Wolf-Watz, H. Analysis of the yop A gene encoding the Yopl virulence determinants of Yersinia spp. Mol Microbiol 3, 517-529 (1989). 4 Isberg, R. R., Voorhis, D. L. & Falkow, S. Identification ofinvasin: a protein that allows enteric bacteria to penetrate cultured mammalian cells. Cell 50, 769 778 (1987). 5 Cornelis, G. R. The type III secretion injetisome. Nat Rev Microbiol 4, 811 825, doi:nrmicrol526 [pii] 10.1038/nrmicrol526 (2006). 6 Mota, L. J. & Cornelis, G. R. The bacterial injetion kit: type III secretion systems. Ann Med 37, 234-249, doi:R673752030212825 [pii] 10.1080/07853890510037329 (2005). 7 Trosky, J. E., Liverman, A. D. & Orth, K. Yersinia outer proteins: Yops. Cell Microbiol 10, 557-565, dovAO.l 111/j.1462-5822.2007.01109.x (2008). 8 Brenner, D. & Mak, T. W. Mitochondrial cell death effectors. Curr Opin Cell Biol 21, 871-877, doi:S0955-0674(09)00160-4 [pii]10.1016/j.ceb.2009.09.004 (2009). 9 Chalah, A. & Khosravi-Far, R. The mitochondrial death pathway. Adv Exp Med Biol 615, 25-45, doi:10.1007/978-l-4020-6554-5_3 (2008). 10 Fuchs, Y. & Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell 147, 742-758, doi:S0092-8674(l 1)01283-9 [pii] 10.1016/j.cell.2011.10.033 (2011). 11 Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. Protein Expr Purif 80, 283-293, doi:S1046-5928(l 1)00203-8 [pii] 10.1016/ j. pep.2011.08.005 (2011). 12 Howard, S. L. et al. Application of comparative phylogenomics to study the evolution of Yersinia enterocolitica and to identify genetic differences relating to pathogenicity. J Bacteriol 188, 3645-3653, doi.AOA 128/JB.188.10.3645- 3653.2006 (2006). 13 Thomson, N. R. et al. The complete genome sequence and comparative genome analysis of the high pathogenicity Yersinia enterocolitica strain 8081. PLoS Genet 2, e206, doi: 10.137 l/journal.pgen.0020206 (2006). 14 Pelludat, C, Hogardt, M. & Heesemann, J. Transfer of the core region genes of the Yersinia enterocolitica WA-C serotype 0:8 high-pathogenicity island to Y. enterocolitica MRS40, a strain with low levels of pathogenicity, confers a yersiniabactin biosynthesis phenotype and enhanced mouse virulence. Infect Immun 70, 1832-1841 (2002). 15 Mulder, B., Michiels, T, Simonet, M., Sory, M. P. & Cornelis, G. Identification of additional virulence determinants on the pYV plasmid of Yersinia enterocolitica W227. Infect Immun 57, 2534-2541 (1989). 16 Sory, M. P. & Cornelis, G. R. Translocation of a hybrid YopE- adenylate cyclase from Yersinia enterocolitica into HeLa cells. Mol Microbiol 14, 583-594 (1994). 17 Sarker, M. R., Neyt, C, Stainier, I. & Cornelis, G. R. The Yersinia Yop virulon: LcrV is required for extrusion of the translocators YopB and YopD. J Bacteriol 180, 1207- 1214 (1998). 18 Neubauer, H, Aleksic, S., Hensel, A., Finke, E. J. & Meyer, H. Yersinia enterocolitica 16S rRNA gene types belong to the same genospecies but form three homology groups. Int J Med Microbiol 290, 61-64, doi: 10.1016/S1438- 4221(00)80107-1 (2000). 19 Feldman, M. F., Muller, S., Wuest, E. & Cornells, G. R. SycE allows secretion of YopE-DHFR hybrids by the Yersinia enterocolitica type III Ysc system. Mol Microbiol 46, 1183-1197, doi:3241 fpiij (2002). 20 Ramamurthi, K. S. & Schneewind, O. A synonymous mutation in Yersinia enterocolitica yopE affects the function of the YopE type III secretion signal. J Bacteriol 187, 707-715, doi: 10.1128/ JB.187.2.707-715.2005 (2005). 21 Wolke, S., Ackermann, N. & Heesemann, J. The Yersinia enterocolitica type 3 secretion system (T3SS) as toolbox for studying the cell biological effects of bacterial Rho GTPase modulating T3SS effector proteins. Cell Microbiol 13, 1339-1357, doi: 10.1 lll/j.1462-5822.2011.01623.x (2011). 22 Forsberg, A. & Wolf-Watz, H. Genetic analysis of the yopE region of Yersinia spp.: identification of a novel conserved locus, yerA, regulating yopE expression. J Bacteriol 172, 1547-1555 (1990). 23 Sambrook, J. (ed David W. Russell) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 2001). 24 Alto, N. M. & Dixon, J. E. Analysis of Rho-GTPase mimicry by a family of bacterial type III effector proteins. Methods Enzymol 439, 131-143, doi:S0076- 6879(07)00410- 7 [pii] 10.1016/S0076-6879(07)00410-7 (2008). 25 Alto, N. M. et al. Identification of a bacterial type III effector family with G protein mimicry functions. Cell 124, 133-145, doi:S0092-8674(05)01229-8 [pii] 10.1016/j.cell.2005.10.031 (2006). 26 Kaniga, K., Delor, I. & Cornells, G. R. A wide-host-range suicide vetor for improving reverse genetics in gram-negative bacteria: inativation of the blaA gene of Yersinia enterocolitica. Gene 109, 137-141, doi:0378-l 119(91)90599-7 fpiij (1991). 27 Yoneda, Y. et al. A long synthetic peptide containing a nuclear localization signal and its flanking sequences of SV40 T-antigen direts the transport of IgM into the nucleus efficiently. Exp Cell Res 201, 313-320 (1992). 28 Metcalf W. W., Jiang, W. & Wanner, B. L. Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6K gamma origin plasmids at different copy numbers. Gene 138, 1-7 (1994). 29 Diepold, A. et al. Deciphering the assembly of the Yersinia type III secretion injetisome. Embo J 29, 1928-1940, doi:emboj201084 fpiij 10.1038/emboj.2010.84 (2010). 30 Iriarte, M., Stainier, I. & Cornells, G. R. The rpoS gene from Yersinia enterocolitica and its influence on expression of virulence fators. Infect Immun 63, 1840-1847 (1995). 31 Cornells, G., Vanootegem, J. C. & Sluiters, C. Transcription of the yop regulon from Y. enterocolitica requires trans acting pYV and chromosomal genes. Microb Pathog 2, 367-379, doi:0882-4010(87)90078-7 fpiij (1987). 32 Grosdent, N., Maridonneau-Parini, I, Sory, M. P. & Cornells, G. R. Role of Yops and adhesins in resistance of Yersinia enterocolitica to phagocytosis. Infect Immun 70, 4165-4176 (2002). 33 Dehio, C, Meyer, M., Berger, J., Schwarz, H. & Lanz, C. Interaction of Bartonella henselae with endothelial cells results in bacterial aggregation on the cell surface and the subsequent engulfment and internalisation of the bacterial aggregate by a unique structure, the invasome. J Cell Sci 110 (Pt 18), 2141-2154 (1997). 34 Bensimon, A. et al. ATM-dependent and -independent dynamics of the nuclear phosphoproteome after DNA damage. Sci Signal 3, rs3, doi:10.1126/scisignal.20010343/151/rs3 fpiij (2010). 35 Perkins, D. N, Pappin, D. J., Creasy, D. M. & Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis 20, 3551-3567, doi: 10.1002/(SICI) 1522- 2683(19991201)20:18<3551::AID-ELPS3551>3.0.CO;2-2 fpiij 10.1002/ (SICI) 1522- 2683(19991201)20:18<3551::AID-ELPS3551>3.0.CO;2-2 (1999). 36 Smyth, G. K. Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Stat Appl Genet Mol Biol 3, Article3, doi: 10.2202/1544-6115.1027 (2004). 37 Ting, L. et al. Normalization and statistical analysis of quantitative proteomics data generated by metabolic labeling. Mol Cell Proteomics 8, 2227-2242, doi: 10.1074/mcp.M800462-MCP200M800462-MCP200 fpiij (2009). 38 Vizcaino, J. A. et al. The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013. Nucleic Acids Res 41, D1063 1069, doi:10.1093/nar/gksl262gksl262 fpiij (2013). 39 Boyd, A. P., Lambermont, I. & Cornells, G. R. Competition between the Yops of Yersinia enterocolitica for delivery into eukaryotic cells: role of the SycE chaperone binding domain of YopE. J Bacteriol 182, 4811-4821 (2000). 40 Iriarte, M. & Cornells, G. R. Yop a new Yersinia Yop effector protein, affects the cytoskeleton of host cells. Mol Microbiol 29, 915-929 (1998). 41 Kudryashev, M. et al. In situ structural analysis of the Yersinia enterocolitica injetisome. Elife 2, e00792, doi: 10.7554/eLife.0079200792 fpiij (2013). 42 Schulte, R. et al. Yersinia enterocolitica invasin protein triggers IL-8 production in epithelial cells via ativation of Rel p65-p65 homodimers. FASEB J 14, 1471-1484 (2000). 43 Mota, L. J., Journet, L., Sorg, I, Agrain, C. & Cornells, G. R. Bacterial injetisomes: needle length does matter. Science 307, 1278, doi:30775713/1278 fpiij 10.1126/science.l 107679 (2005). 44 Isaksson, E. L. et al. The membrane localization domain is required for intracellular localization and autoregulation ofYopE in Yersinia pseudotuberculosis. Infect Immun 77, 4740-4749, doi.TAI.00333-09 fpiij 10.1128/IAI.00333-09 (2009). 45 Denecker, G. et al. Effect of low- and high-virulence Yersinia enterocolitica strains on the inflammatory response of human umbilical vein endothelial cells. Infect Immun 70, 3510-3520 (2002). 46 Sharma, S. et al. Deployment of the Burkholderia glumae type III secretion system as an efficient tool for translocating pathogen effectors to monocot cells. Plant J 74, 701- 712, doi: 10.1111/tpj.12148 (2013). 47 Carrington, J. C. & Dougherty, W. G. A viral cleavage sítio cassette: identification of amino acid sequences required for tobacco etch virus polyprotein processing. Proc Natl Acad Sci USA 85, 3391-3395 (1988). 48 Kapust, R. B., Tozser, J., Copeland, T. D. & Waugh, D. S. The PI ' specificity of tobacco etch virus protease. Biochem Biophys Res Commun 294, 949 955, doi:10.1016/S0006-291X(02)00574-0S0006-291X(02)00574-0 fpiij (2002). 49 Liang, H., Gao, H., Maynard, C. A. & Powell, W. A. Expression of a self-processing, pathogen resistance-enhancing gene construct in Arabidopsis. Biotechnol Lett 27, 435-442, doi:10.1007/sl0529-005-1884-9 (2005). 50 Weber, W. et al. Macrolide-based transgene control in mammalian cells and mice. Nat Biotechnol 20, 901-907, doi: 10.1038/nbt731nbt731 fpiij (2002). 51 Kapust, R. B. et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng 14, 993- 1000 (2001). 52 Lee, V. T, Anderson, D. M. & Schneewind, O. Targeting of Yersinia Yop proteins into the cytosol ofHeLa cells: one-step translocation ofYopE across bacterial and eukaryotic membranes is dependent on SycE chaperone. Mol Microbiol 28, 593-601 (1998). 53 Gray, D. C., Mahrus, S. & Wells, J. A. Ativation of specific apoptotic caspases with an engineered small-molecule-ativated protease. Cell 142, 637-646, doi:S0092- 8674(10)00783-X [pii] '10.1016/j.cell.2010.07.014 (2010). 54 Henrichs, T. et al. Target-direted proteolysis at the ribosome. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 4246-4251, doi: 102/12/4246 [pii] 10.1073/pnas.0408520102 (2005). 55 Hardt, W. D., Chen, L. M., Schuebel, K. E., Bustelo, X. R. & Galan, J. E. S. typhimurium encodes an ativator of Rho GTPases that induces membrane ruffling and nuclear responses in host cells. Cell 93, 815-826, doi:S0092- 8674(00)81442-7 [pii] (1998). 56 Hakansson, S. et al. The YopB protein of Yersinia pseudotuberculosis is essential for the translocation of Yop effector proteins across the target cell plasma membrane and displays a contat-dependent membrane disrupting ativity. Embo J 15, 5812-5823 (1996). 57 Stebbins, C. E. & Galan, J. E. Structural mimicry in bacterial virulence. Nature 412, 701-705, doi: 10.1038/3508900035089000 [pii] (2001). 58 Li, H. et al. The phosphothreonine lyase ativity of a bacterial type III effector family. Science 315, 1000-1003, doi:315/5814/1000 [pii] 10.1126/science.l 138960 (2007). 59 Norris, F. A., Wilson, M. P., Wallis, T. S, Galyov, E. E. & Majerus, P. W. SopB, a protein required for virulence of Salmonella dublin, is an inositol phosphate phosphatase. Proc Natl Acad Sci USA 95, 14057-14059 (1998). 60 Pulliainen, A. T. et al. Bacterial effector binds host cell adenylyl cyclase to potentiate Galphas-dependent AMPcproduction. Proc Natl Acad Sci USA 109, 9581-9586, doi: 1117651109 [pii] 10.1073/pnas.1117651109 (2012). 61 Li, H, Zhu, H, Xu, C. J. & Yuan, J. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell 94, 491-501, doi:S0092- 8674(00)81590-1 [pii] (1998). 62 Nagaraj, N. et al. Deep proteome and transcriptome mapping of a human cancer cell line. Mol Syst Biol 7, 548, doi:msb201181 [pii] 10.1038/msb.2011.81 (2011). 63 Blanco-Toribio, A., Muyldermans, S., Frankel, G. & Fernandez, L. A. Diret injetion of functional single-domain antibodies from E. coli into human cells. PLoS One 5, el5227, doi:10.1371/journal.pone.0015227 (2010). 64 Caussinus, E., Kanca, O. & Affolter, M. Fluorescent fusion protein knockout mediated by anti-GFP nanobody. Nat Struct Mol Biol 19, 117-121, doi:nsmb.2180 [pii]10.1038/nsmb.2180 (2011). 65 Schmutz, C. et al. Systems-Level Overview of Host Protein Phosphorylation During Shigella flexneri Infection Revealed by Phosphoproteomics. Mol Cell Proteomics 12, 2952-2968, doi:Ml 13.029918 [pii] 10.1074/mcp.Ml 13.029918 (2013). 66 Szklarczyk, D. et al. The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored. Nucleic Acids Res 39, D 561 568, doi:gkq973 [pii]10.1093/nar/gkq973 (2011). 67 Huang da, W., Sherman, B. T. & Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res 37, 1-13, doi:gkn923 [pii] 10.1093/nar/gkn923 (2009). 68 Huang da, W. et al. DA VID gene ID conversion tool. Bioinformation 2, 428-430 (2008). 69 Schwerk, C. & Schulze-Osthoff, K. Regulation of apoptosis by alternative pre-mRNA splicing. Mol Cell 19, 1-13, doi:S1097-2765(05)01375- 4 [pii]10.1016/j.molcel.2005.05.026 (2005). 70 Papagiannakopoulos, T, Shapiro, A. & Kosik, K. S. MicroRNA-21 targets a network of key tumor- suppressive pathways in glioblastoma cells. Cancer Res 68, 8164-8172, doi: 68/19/8164 [pii]10.1158/0008-5472.CAN-08-1305 (2008). 71 Aepfelbacher, M., Trasak, C. & Ruckdeschel, K. Effector functions of pathogenic Yersinia species. Thromb Haemost 98, 521-529 (2007). 72 Trulzsch, K., Sporleder, T, Igwe, E. I, Russmann, H. & Heesemann, J. Contribution of the major secreted yops of Yersinia enterocolitica 0:8 to pathogenicity in the mouse infection model. Infect Immun 72, 5227-5234, doi: 10.1128/IAI.72.9.5227-5234.2004 (2004). 73 Cao, H. D. et al. Attenuated Salmonella typhimurium carrying TRAIL and VP 3 genes inhibits the gropesoh of gastric cancer cells in vitro and in vivo. Tumori 96, 296-303 (2010). 74 Massa, P. E., Paniccia, A., Monegal, A., de Marco, A. & Rescigno, M. Salmonella engineered to express CD20-targeting antibodies and a drug-converting enzyme can eradicate human lymphomas. Blood 122, 705-714, doi: 10.1182/blood-2012-12- 474098 (2013). 75 Yoon, W. S., Chae, Y. S., Hong, J. & Park, Y. K. Antitumor therapeutic effects of a genetically engineered Salmonella typhimurium harboring TNF-alpha in mice. Appl Microbiol Biotechnol 89, 1807-1819, doi: 10.1007 /s00253-010- 3006-4 (2011). 76 Forbes, N. S., Munn, L. L., Fukumura, D. & Jain, R. K. Sparse initial entrapment of systemically injeted Salmonella typhimurium leads to heterogeneous accumulation within tumors. Cancer Res 63, 5188-5193 (2003). 77 Toso, J. F. et al. Phase I study of the intravenous administration of attenuated Salmonella typhimurium to patients with metastatic melanoma. J Clin Oncol 20, 142- 152 (2002). 78 Miller, S. I, Ernst, R. K. & Bader, M. W. LPS, TLR4 and infectious disease diversity. Nat. Rev. Microbiol. 3, 36-46, doi :nrmicro 1068 [pii] 10.1038/nrmicrol068 (2005). 79 Zhang, M., Swofford, C. A. & Forbes, N. S. Lipid A controls the robustness of intratumoral accumulation of attenuated Salmonella in mice. Int J Cancer 135, 647- 657, doi:10.1002/ijc.28700 (2014). 80 Clairmont, C. et al. Biodistribution and genetic stability of the novel antitumor agent VNP20009, a genetically modified strain of Salmonella typhimurium. J Infect Dis 181, 1996-2002, doi: 10.1086/315497 (2000). 81 Lee, C. H, Wu, C. L. & Shiau, A. L. Endostatin gene therapy delivered by Salmonella choleraesuis in murine tumor models. J Gene Med 6, 1382-1393, doi: 10.1002/jgm.626 (2004). 82 Zheng, L. M. et al. Tumor amplified protein expression therapy: Salmonella as a tumor-seletive protein delivery vetor. Oncol Res 12, 127-135 (2000). 83 Forbes, N. S. Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy. Nat Rev Cancer 10, 785-794, doi:nrc2934 [pii] 10.1038/nrc2934 (2010). 84 Lee, C. H, Wu, C. L. & Shiau, A. L. Salmonella choleraesuis as an anticancer agent in a syngeneic model of orthotopic hepatocellular carcinoma. Int J Cancer 122, 930-935, doi:10.1002/ijc.23047 (2008). 85 Thamm, D. H. et al. Systemic administration of an attenuated, tumor-targeting Salmonella typhimurium to dogs with spontaneous neoplasia: phase I evaluation. Clin Cancer Res 11, 4827-4834, doi:10.1158/1078-0432.CCR-04-2510 (2005). 86 Fidler, I. J. Biological behavior of malignant melanoma cells correlated to their survival in vivo. Cancer Res 35, 218-224 (1975).

Claims

1. Uso de uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada transformada com um vetor que compreende na direção 5' para 3': um promotor; uma primeira sequência de DNA que codifica um sinal de liberação de uma proteína efetora bacteriana, operativamente ligada ao referido promotor; uma segunda sequência de DNA que codifica uma proteína heteróloga fundida na estrutura à extremidade 3' da referida primeira sequência de DNA, caracterizado pelo fato de ser para preparação de um medicamento para o tratamento de um tumor sólido maligno em um indivíduo, em que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada se acumula no tumor sólido maligno, o uso compreendendo administrar ao indivíduo a referida cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada, em que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada é administrada em uma quantidade que é suficiente para tratar o indivíduo.

2. Uso de uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada é selecionada do grupo consistindo nos gêneros Yersinia, Escherichia, Salmonella e Pseudomonas.

3. Uso de uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada é deficiente na produção de pelo menos uma proteína efetora bacteriana que é virulenta para células eucarióticas.

4. Uso de uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada é deficiente na produção de todas as proteínas efetoras bacterianas que são virulentas para células eucarióticas.

5. Uso de uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada é uma cepa de Yersinia mutante na qual todos os genes codificadores de efetores que codificam proteínas efetoras bacterianas, que são virulentas para células eucarióticas, estão mutadas de tal modo que a Yersinia resultante não produz mais quaisquer proteínas efetoras bacterianas funcionais que sejam virulentas para as células eucarióticas.

6. Uso de uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a cepa de Yersinia mutante é Y. enterocolitica e o sinal de liberação de uma proteína efetora bacteriana é o sinal de liberação de uma proteína efetora T3SS bacteriana em que o sinal de liberação da proteína efetora T3SS bacteriana compreende os 138 aminoácidos N-terminais da proteína efetora YopE de Y. enterocolitica.

7. Uso de uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a proteína heteróloga é selecionada do grupo consistindo em proteínas envolvidas na apoptose ou regulação da apoptose, reguladores do ciclo celular, proteínas de repetição de anquirina, proteínas de sinalização celular, proteínas repórteres, fatores de transcrição, proteases, GTPases pequenas, proteínas relacionadas à GPCR, construtos de fusão em nanocorpo e nanocorpos, efetores T3SS bacterianos, efetores T4SS bacterianos e proteínas virais.

8. Uso de uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada, em que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada é deficiente na produção de pelo menos uma proteína efetora bacteriana que é virulenta para células eucarióticas ou é deficiente na produção de pelo menos uma proteína bacteriana que faz parte de uma maquinaria do sistema de secreção, caracterizado pelo fato de ser para preparação de um medicamento para o tratamento de um tumor sólido maligno em um indivíduo, em que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada se acumula no tumor sólido maligno, o uso compreendendo administrar ao indivíduo a referida cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada, em que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada é administrada em uma quantidade que é suficiente para tratar o indivíduo.

9. Uso de uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada é selecionada do grupo consistindo nos gêneros Yersinia, Escherichia, Salmonella e Pseudomonas e em que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada é deficiente na produção de todas as proteínas efetoras T3SS bacterianas que são virulentas para as células eucarióticas.

10. Uso de uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada é deficiente na produção de todas as proteínas efetoras que são virulentas para as células eucarióticas e a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada expressa uma enzima conversora de pró-fármaco.

11. Uso de uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que cerca de 105a cerca de 109bactérias da cepa bacteriana Gram- negativa recombinante de virulência atenuada são administradas ao indivíduo.

12. Uso de uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada é coadministrada com um sideróforo ao indivíduo.

13. Uso de uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada é administrada ao indivíduo de acordo com um regime de dosagem consistindo em uma dose única a cada 2 a 20 dias dentro de um período de cerca de 20 a 60 dias.

14. Uso de uma cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que as contagens bacterianas da cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada em órgãos onde nenhum tumor sólido maligno está presente estão abaixo do limite de detecção após pelo menos quatro dias da última administração da cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada ao indivíduo.

15. Uso de uma composição farmacêutica compreendendo a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 14 e um carreador farmaceuticamente aceitável, caracterizado pelo fato de ser para preparação de um medicamento para o tratamento de um tumor sólido maligno em um indivíduo, em que a cepa bacteriana Gram-negativa recombinante de virulência atenuada se acumula no tumor sólido maligno, o uso compreendendo administrar ao indivíduo a referida composição farmacêutica, em que a composição farmacêutica é administrada em uma quantidade que é suficiente para tratar o indivíduo.