CN105208866B - 使用工程化锌指蛋白核酸酶靶向断裂t细胞受体基因 - Google Patents

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Abstract

本文公开用于修饰TCR基因的方法和组合物，其使用核酸酶(锌指核酸酶或者TAL核酸酶)来修饰TCR基因。

Description

使用工程化锌指蛋白核酸酶靶向断裂T细胞受体基因
相关申请的交叉引用
本申请要求在2013年3月21日提交的美国临时申请号 61/804,076的优先权，据此该申请的公开内容通过引用整体并入。
技术领域
本公开内容是在人类细胞的基因组修饰领域中，该人类细胞包括 淋巴细胞和干细胞。
发明背景
已经描述用于基因组DNA靶向切割的各种方法和组合物。此类 靶向切割事件可用于例如诱导靶向诱变、诱导细胞DNA序列的靶向 缺失，以及促进在预先决定的染色体位点处的靶向重组。参见，例如 美国专利号7,888,121；7,972,854；7,914,796；7,951,925；8,110,379； 8,409,861；8,586,526；美国专利公开20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；20060063231；201000218264； 20120017290；20110265198；20130137104；20130122591；20130177983 和20130177960，以及美国临时申请号61/823,689，这些申请的公开 内容通过引用整体并入用于所有目的。这些方法往往涉及使用工程化 切割系统来诱导靶向DNA序列中的双链断裂(DSB)或者缺口，以便 用诸如非同源端连接(NHEJ)的错误倾向过程(error born process)对断 裂的修复或者使用修复模板(同源介导的修复或即HDR)进行的修 复可导致基因敲除或受关注序列的插入(靶向整合)。可通过使用特 异性核酸酶进行切割，如工程化锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样 效应核酸酶(TALEN)，或者使用具有工程化crRNA/tracr RNA(‘单导 向RNA’)的CRISPR/Cas系统来导向特异性切割。
T细胞受体(TCR)是选择性激活T细胞的关键部分。与抗体有些 类似，TCR一般是由两条链，即α和β组成的，该两条链共同装配 而形成杂二聚体。抗体类似处在于编码TCR链的单一基因放在一起 的方式。TCR链是由两个区域组成，即C端恒定区和N端可变区。 编码TCR链的基因座与编码抗体的基因座的类似处在于TCRα基因 包括V区段和J区段，而β链基因座除V区段和J区段之外还包括D 区段。在T细胞发育期间，各种区段重组，以便每一T细胞具有唯 一的TCR结构并且人体具有大量的T细胞，T细胞由于它们唯一的 TCR结构而能够与由抗原递呈细胞显示的唯一抗原相互作用。另外， TCR复合物构成T细胞上的CD3抗原复合物的一部分。
在T细胞激活期间，TCR与在抗原递呈细胞的主要组织相容性 复合物(MHC)上显示为肽的抗原相互作用。TCR对抗原-MHC复合物 的识别导致了T细胞刺激，该T细胞刺激反过来导致记忆淋巴细胞 和效应淋巴细胞中T辅助细胞(CD4+)和细胞毒性T淋巴细胞(CD8+)的分化。然后，这些细胞可以克隆方式扩增，以在能够对一种特定抗 原作出反应的整个T细胞群体中提供被激活的亚群。
细胞毒性T淋巴细胞(CTL)被认为在杀伤肿瘤细胞中是关键的。 这些细胞一般能够在癌细胞表面上显示出先前由抗原递呈细胞显示 在MHC上的一些抗原时诱导癌细胞的凋亡。通常，在对靶细胞作用 之后，当细胞威胁被清除时CTL将会凋亡，而保留的淋巴细胞的亚 组将进一步分化成记忆T细胞存留，以防止人体再次暴露于抗原。记 忆淋巴细胞池可能是高度异质的。近来，已经鉴别了两种类型的记忆 T细胞：效应记忆T细胞(CD45RA-CCR7-，CD62L-)和中枢记忆T 细胞，中枢记忆T细胞是特征为表达CCR7和CD62L的CD45RA阴性细胞，CCR7和CD62L是在次级淋巴器官的T细胞区中归巢所需 要的两种分子。在抗原刺激时，中枢记忆T细胞产生低水平的效应细 胞因子如IL-4和IFN-γ，但是高水平的IL-2，这能够支持中枢记忆T 细胞的快速和一致的增殖。在遇到抗原时，中枢记忆T细胞经历：1) 增殖，导致自动再生过程，目的在于增大中枢记忆T细胞池；以及 2)分化，导致效应记忆T细胞的生成，效应记忆T细胞特征为低增殖 潜能但是能够迁移到发炎的非淋巴组织并且介导免疫反应的效应期。 已经研发出能基因转移到T淋巴细胞，同时保持基因的中枢记忆功能 表型的方案(参见，欧洲专利公开号EP1956080，Kaneko等人，2009 Blood 113(5)：1006-15)。
然而，一些肿瘤细胞能够或许通过诸如表达相关TCR的某些 CTL亚组的不良克隆扩增和由癌细胞局限免疫抑制的机制来逃避免 疫系统的监视(参见，Boon等人(2006)，Annu Rev Immunol，24： 175-208)。癌症疫苗的概念是基于以下理念构建的：使用这些癌症特 异性抗原来刺激和扩增在体内表达适当TCR的CTL，以试图克服免 疫逃避，然而这些癌症疫苗尚未显示出任何显著的成果。事实上，在 2004年进行的分析研究765位已经在超过35个不同的癌症疫苗试验 中接受治疗的转移癌患者，其中仅在3.8％的患者中观察到总反应(参 见，Rosenberg等人(2004)，Nat.Med.，10(9)：909–915)。
过继性免疫疗法是以下实践：实现高度特异性T细胞对某些具有 针对肿瘤抗原的高亲合力TCR的CTL亚群的刺激，在体外刺激和扩 增亚群，以及然后将亚群导入患者体内。如果在输注肿瘤特异性细胞 之前从患者体内去除天然淋巴细胞，则过继性免疫疗法尤其有效。这 种类型的疗法背后的理念是：如果所导入的高亲合力CTL奏效，则 一旦肿瘤被清除，这些细胞中的一些将作为记忆T细胞保留并且将存 留在患者体内以防癌症复发。在2002年完成的一项研究表明在用环 磷酰胺和氟达拉滨进行免疫耗竭后，以过继性免疫疗法方案治疗的患 者的转移性黑素瘤退变(Dudley等人，(2002)Science，298(5594)： 850-854)。如果在过继性免疫疗法之间进行全身照射，则应答率会甚 至更高(Dudley等人，2008，J Clin Oncol，26(32)：5233-9)。
然而，当包含高亲合力TCR的受关注T细胞不能轻易扩增时， 无法进行过继性免疫疗法。此外，往往难以从癌症患者鉴别和分离有 治疗价值的T细胞，这是因为肿瘤抗原往往是自体抗原，针对肿瘤抗 原的患者免疫系统通过那些具有最高亲合力的T细胞克隆的缺失或 者无反应性的机制而变得耐受。因此，已经建议和证明将编码高亲合 力的TCR的基因转移到来源于患者的T细胞中(参见，Rubenstein 等人，(2003)J of Immunology，170：1209-1217)。最近，使用恶性 黑素瘤的小鼠模型，在导入已经用携带gp-100黑素瘤抗原特异性人类TCR基因的逆转录病毒载体转导过的正常淋巴细胞之后，发现具 有统计上显著的肿块质量减少(Abad等人，(2008)J Immunother， 31(1)：1–6)。TCR基因疗法还在Morgan等人(2006)Science 314(5796)：126-9和Burns等人，2009Blood 114(14)：2888-99中有 所描述。
然而，任何TCR转基因到宿主T细胞中的转移带有与大多数的 基因转移方法相关联的警告，即TCR转基因表达盒未调节和无法预 见的插入到基因组中，插入往往是低水平的。此类控制不良的所需转 基因的插入可导致转基因对周围基因的影响，以及由于来自邻近基因 的影响导致的转基因沉默。此外，在工程化T细胞中与所导入的TCR 转基因共表达的内源TCR基因可引起由内源TCR识别的抗原对T细 胞的非所需刺激、由于TCR转基因与内源性TCR亚单位错配形成具 有新识别性能的新TCR复合物导致的非预期抗原对T细胞的非所需 刺激，或者可导致由于转基因编码的TCR亚单位与内源性TCR蛋白 的异源二聚化而导致的无活性TCR的形成从而对受关注抗原的次最 优刺激。事实上，因内源链和外源链错配形成自体反应TCR而导致 严重自体免疫毒性的风险近年来已经在小鼠模型(Bendle等人，(2010) Nature Medicine，16：565-570)和人类细胞(van Loenen等人，(2010) Proc NatlAcad Sci U S A，107：10972-7)中凸显。另外，肿瘤特异 性TCR可以次最优水平在细胞表面上表达，这是由于与在细胞表面 上表达复合物所需的CD3分子的内源性和错配TCR之间的竞争。低 TCR表达影响转基因T细胞的亲合力和效应力。
Wilms肿瘤抗原(WT1抗原)是通常在胚细胞中表达的转录因 子。在产生之后，抗原的表达仅限于少量细胞类型，包括造血干细胞。 然而，已发现该抗原在许多类型的白血病和实体瘤中过表达(参见， Inoue等人(1997)Blood，89：1405-1412)并且可促成在这些细胞中 缺乏生长控制。由于WT1在正常组织中的低表达，WT1在癌细胞上 的表达使得其成为用于T细胞介导疗法的有吸引力的靶标。将具有对 包含经修饰的半胱氨酸的WT1增强的亲合力以防止内源TCR亚单位 和转基因TCR之间错配的TCR变体转导到主要T细胞中并且测试其功能(Kuball等人(2007)Blood，109(6)：2331-8)。数据表明：虽然 新近用WT1-TCR变体转导的T细胞与那些用野生型TCR域转导的T 细胞相比具有较强的抗原应答，但是在用WT1抗原进行若干轮刺激 之后，此种改善的抗原反应性丧失(参见，Thomas等人(2007)J ofImmunol 179(9)：5803-5810)。据推断，即使具有转基因特异性半胱 氨酸修饰，与内源性TCR肽的错配也可在WT1特异性TCR转导的 细胞中所见的抗WT1亲合力降低中发挥作用，还参见美国专利公开 号20110158957。
另一种肿瘤抗原是NY-ESO1。NY-ESO1是所谓的‘CT’的肿瘤抗 原组中的一个成员，意味着其在癌细胞上和在睾丸中表达。NY-ESO1 最初被识别为在食管肿瘤上表达，现在其已经被发现在若干肿瘤类型 上表达，肿瘤类型包括膀胱肿瘤、乳腺肿瘤、结直肠肿瘤、胃肿瘤、 肝癌、头部肿瘤和颈部肿瘤、多发性骨髓瘤、黑素瘤、非小细胞肺癌、 卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、肉瘤和滑膜肉瘤(参见，Gnjatic 等人(2006)，Advances in CancerResearch，第1页)，表达往往是在那 些肿瘤处于晚期时。由于在大部分组织上明显缺乏表达，NY-ESO1 已经被考虑用于癌症疫苗。因此，全长NY-ESO1蛋白和来源于序列 的肽已经并且正被用于临床试验。然而，似乎疫苗接种方法的有效性 有限，这也许是由于对抗原具有有限亲合力的T细胞的生产。此外， 许多有NY-ESO1阳性肿瘤的癌症患者血液中可检测出抗NY-ESO1 抗体，但是他们的肿瘤仍然能够逃避免疫反应。一种潜在的解决方法 可为开发对NY-ESO1抗原具有高亲合力的TCR。使用将通过三种不 同的T细胞启动技术制备的NY-ESO1特异性TCR标准TCR转移到 宿主T细胞中进行的研究(参见，Sommermeyer等人，(2012)Int.J. Cancer 132：1360-1367)发现针对过继性免疫疗法研发的稳健TCR 将需要解决大量的问题。还已经产生关于NY-ESO1特异性TCR的附 加报告(参见US8367804和EP2016102B1中的具体实施例)。还已经 进行临床试验，在临床试验中用从已经用NY-ESO1TCR转导的外周 血收获的自体淋巴细胞来治疗NY-ESO1+转移性黑素瘤或者转移性 滑膜细胞肉瘤患者。在11名黑素瘤患者中中观察到有5名有临床应 答，且在6名滑膜细胞肉瘤患者中观察到有4名有临床应答(Robbins 等人，(2011)J.Clin Oncol 29(7)：917)。
因此，仍然需要能够将所需TCR转基因导入已知的染色体座位 中的组合物。此外，需要可选择性敲除内源TCR基因的方法和组合 物。
发明概要
本文公开用于部分或者完全钝化或者断裂内源TCR基因的组合 物和方法，以及用于在断裂内源性TCR基因之后或者与断裂内源性 TCR基因同时地，将外源TCR转基因导入T淋巴细胞并且表达至所 需水平的组合物和方法。
在一个方面，本文提供锌指核酸酶(ZFN)、TALEN，或者具有用 于切割TCR基因的工程化单导向RNA的CRISPR/Cas系统。在某些 实施方案中，ZFN、TALEN或者CRIPSR/Cas核酸酶结合到人类TCR α基因中的靶位点和/或人类TCRβ基因中的靶位点。在一些实施方 案中，用这些核酸酶在TCR基因中进行切割会导致TCRα和/或β基 因的永久断裂(例如，突变/钝化)。
在某些实施方案中，核酸酶包括锌指蛋白。锌指蛋白可包括1、 2、3、4、5、6或更多个锌指，每一锌指具有结合到靶基因中的靶亚 位点的识别螺旋。在某些实施方案中，锌指蛋白包括4或者5或者6 个指状结构(从N端到C端指定为F1、F2、F3、F4、F5和F6，以 及顺序的F1到F4或者F5或者F6)，并且指状结构包括在表4和表 5中示出的识别区域的氨基酸序列和/或识别在表4和表5中示出的靶 位点。在其它实施方案中，核酸酶是可包括具有规范或者不规范的重 复序列可变的双氨基酸残基(repeat variable diresidues,RVD)的工程化重复单元的TALEN，例如如表14中所示的可操作地连接到核酸酶域 (例如，IIS型限制性内切酶和/或大范围核酸酶)的TRAC和TRBC 特异性TALEN。TALEN包括C帽序列，例如比野生型TAL C端序 列全长更小的C端区域(例如，a+17或者+63C帽)。C帽序列在美 国专利号8,586,526中有所描述。另外的实施方案包括CRIPSR/Cas 核酸酶系统的用途，其中单导向RNA已制备用于将核酸酶靶向到 TCRα序列和/或TCRβ序列中的靶位点。
本文描述的核酸酶中任一个可进一步包括切割域和/或切割半域 (例如，野生型或者工程化FokI切割半域，或者具有切割活性的大 范围核酸酶域)。因此，在本文描述的核酸酶的任一个中，核酸酶域 可包括野生型核酸酶域或者核酸酶半域(例如，FokI切割半域)。在 其它实施方案中，核酸酶(例如，ZFN和/或TALEN)包括工程化核 酸酶域或者半域，例如形成专性杂二聚体的工程化FokI切割半域。 参见，例如美国专利号7,914,796；美国专利号8034,598和美国专利 公开号20080131962。
在另一方面，本公开内容提供编码本文描述的核酸酶的任一个的 多核苷酸。本文描述的多核苷酸的任一个还可包括用于靶向插入到 TCRα和/或TCRβ基因中的外源序列(供体序列或者补丁序列)。在 某些实施方案中，供体序列包括肿瘤抗原特异性TCR转基因，其中 TCR转基因是TCRα转基因、TCRβ转基因，以及它们的组合。在 某些实施方案中，转基因包括NY-ESO1特异性转基因，其中NY-ESO1 特异性转基因是TCRα转基因、TCRβ转基因，以及它们的组合。
在又一个方面，提供包括本文描述的多核苷酸中的一个或多者的 基因递送载体(例如，供体和/或核酸酶)。在某些实施方案中，载体 是腺病毒载体(例如，Ad5/F35载体)，或者慢病毒载体(LV)(包括 整合型慢病毒载体或者整合缺陷型慢病毒载体)。因此，本文还提供 了腺病毒(Ad)载体或者LV，载体包括编码至少一个锌指蛋白核酸酶 (ZFN)、TALEN或者CRISPR/Cas核酸酶和单导向RNA的序列和/或 用于定点整合到靶基因中的供体序列。在某些实施方案中，Ad载体 是嵌合型Ad载体，例如Ad5/F35载体。在某些实施方案中，慢病毒载体是整合酶缺陷型慢病毒载体(IDLV)或者整合型慢病毒载体。在某 些实施方案中，载体是具有VSV-G包膜或者具有其它包膜的假型载 体。在另外的实施方案中，靶基因是人类TCRα基因。在某些实施 方案中，靶基因是人类TCRβ基因。本文描述的载体还可包括供体 序列。在另外的实施方案中，供体序列包括特异于受关注MHC/抗原 复合物的人类TCR基因。在一些实施方案中中，供体序列可包括特 异于受关注MHC/抗原复合物的人类TCRα基因和/或人类TCRβ基 因。在某些实施方案中，单一载体包括编码一种或多种ZFN、TALEN 或者CRISPR/Cas核酸酶复合物的序列和供体序列。在其它实施方案 中，供体序列包含于第一载体中，且ZFN-、TALEN-或者CRISPR/Cas 编码序列存在于第二载体中。在另外的实施方案中，ZFN-、TALEN- 或者CRISPR/Cas编码序列存在于第一载体中，且受关注TCRα基因 存在于第二载体中，以及受关注TCRβ基因存在于第三载体中。在 一些实施方案中，将受关注TCR基因插入内源性TCR基因的位置， 且在其它实施方案中，将受关注TCR基因插入随机选择的基因座， 或者在全基因组递送之后插入到单独基因座。在一些实施方案中，用 于TCR转基因插入的单独基因座是PPP1R12C基因座(也被称为 AAVS1，参见美国专利号8,110,379)。在其它实施方案中，将TCR 转基因插入到CCR-5基因座中。参见，美国专利号7,951,925。
在又一方面，本公开内容提供分离的T淋巴细胞，T淋巴细胞包 括稳定地整合到T淋巴细胞的基因组中的外源序列，且T淋巴细胞 中内源的TCR基因被用锌指核酸酶或者C帽TALEN(具有C端截 断的TALEN)部分地或者完全地钝化。在某些实施方案中，细胞包 括本文描述的蛋白质、多核苷酸和/或载体的任一个。在某些实施方 案中，细胞选自由以下组成的组：干细胞/祖细胞，T细胞(例如， CD4+T细胞)。在又一方面，本公开内容提供一种从如本文所描述的 细胞或者细胞系传代的细胞或者细胞系，即一种从其中TCR已经由 一个或多个ZFN、TALEN、或者特异性CRISPR/Cas核酸酶钝化和/ 或其中编码TCR的供体多核苷酸已经稳定地整合到细胞的基因组中 的细胞传代(例如，在培养物中)的细胞或者细胞系。因此，如本文 所描述的细胞的子代本身可不包括本文描述的蛋白质、多核苷酸和/ 或载体，但在这些细胞中，TCR基因被钝化和/或编码TCR的供体多 核苷酸被整合到基因组中和/或被表达。
在另一方面，本文描述了通过将一个或多个蛋白质、多核苷酸和 /或载体导入到本文所描述的细胞来钝化TCR基因的方法。在本文描 述方法的任一个中，ZFN、TALEN或者特异性CRISPR/Cas核酸酶可 诱发细胞DNA序列的靶向诱变、靶向缺失和/或在预先确定的染色体 基因座处促进靶向重组。因此，在某些实施方案中，ZFN、TALEN 或者特异性CRISPR/Cas核酸酶使靶基因中的一个或多个核苷酸缺失 或者插入一个或多个核苷酸到靶基因中。在一些实施方案中，TCR 基因由ZFN、TALEN或者特异性CRISPR/Cas核酸酶切割钝化，然 后进行非同源的端连接。在其它实施方案中，靶基因中的基因组序列 被替代，例如使用如本文所描述的ZFN、TALE或者特异性 CRISPR/Cas核酸酶(或者编码ZFN、TALEN或者特异性CRISPR/Cas 核酸酶的载体)以及由ZFN、TALEN或者特异性CRISPR/Cas核酸 酶进行靶向切割后插入到基因中的“供体”序列。在某些实施方案中， 供体序列包括NY-ESO1序列。供体序列可存在于ZFN、TALEN或者 特异性CRISPR/Cas核酸酶载体中，存在于单独载体(例如，Ad载体或者LV载体)中，或者替代地可使用不同的核酸递送机制被导入 细胞中。
在另一方面，提供使用锌指蛋白、TALEN或者特异性 CRISPR/Cas核酸酶及其融体来突变TCR基因和/或钝化细胞或者细 胞系中的TCR功能的方法。因此，提供一种用于钝化人类细胞中的 TCR基因的方法，该方法包括向细胞施用本文描述的蛋白质或者多 核苷酸的任一个。
在又一方面，本发明内容提供一种用于治疗或者预防受试者的癌 症、传染病、自身免疫性疾病和/或移植物抗宿主病(GVHD)的方法， 该方法包括：(a)将编码第一多肽的第一核酸导入细胞(例如，淋巴细 胞、干细胞、祖细胞等)，其中第一多肽包括：(i)锌指或者TALE-DNA 结合域，该锌指或者TALE DNA-结合域经工程化而结合到TCR基因 中的第一靶位点；以及(ii)切割域；在使得多肽在细胞中表达的条件 下，该多肽藉由该域结合到靶位点并且切割内源的TCR基因；以及 (b)将编码第二多肽的第二核酸导入细胞，其中第二多肽包括：(i)锌指 或者TALE DNA-结合域，该锌指或者TALE DNA-结合域经工程化而 结合到TCR基因中的第二靶位点；以及(ii)切割域；在使得多肽在细 胞中表达的条件下，该多肽藉由该域结合到靶位点并且切割内源TCR 基因；以及(c)将包括编码特异于MHC复合物中的肿瘤特异抗原的一 或多个TCR基因的核酸的第三核酸导入细胞，以便将第三核酸导入 到内源TCR基因并且具有所导入的第三核酸的细胞治疗或预防受试 者的癌症、传染病、自身免疫性疾病和/或移植物抗宿主病(GVHD)。 在某些实施方案中，步骤(a)-(c)是在体外进行的并且方法在步骤(c)之 后还包括将细胞导入受试者体内的步骤。在某些实施方案中，编码一个或多个TCR基因的第三核酸是在双向启动子(例如，PGK、EF1α 等)的控制下表达的。在其它实施方案中，一个或多个TCR基因是 在单向启动子的控制下从双顺反盒(例如，使用病毒2A肽或者IRES 序列)或者通过表达不同TCR基因的多种LV来表达的。在某些实 施方案中，该细胞选自由以下组成的组：干细胞/祖细胞，或者T细 胞。在本文描述的方法中任一个中，第一核酸可进一步编码第二多肽， 其中第二多肽包括：(i)锌指或者TALE DNA-结合域，锌指或者TALE DNA-结合域域经工程化而结合到TCR基因中的第二靶位点；以及(ii) 切割域；以便第二多肽在细胞中表达，第一和第二多肽藉由该域结合 到其各自相应的靶位点并且切割TCR基因。
在另一方面，本发明内容还提供一种用于治疗或者预防受试者的 癌症的方法，方法包括：(a)将编码第一多肽的第一核酸导入细胞，其 中第一多肽包括：(i)锌指或者TALEDNA-结合域，锌指或者TALE DNA-结合域经工程化而结合到TCR基因中的第一靶位点；以及(ii) 切割域；在使得多肽在细胞中表达的条件下，该多肽藉由该域结合到 靶位点并且切割内源TCR；以及(b)将编码第二多肽的第二核酸导入 细胞，其中第二多肽包括：(i)锌指或者TALE DNA-结合域，锌指或 者TALE DNA-结合域经工程化而结合到安全港基因座(safeharbor locus)(例如，PPP1R12C、CCR5)中的第一靶位点；以及(ii)切割域； 在使得多肽在细胞中表达的条件下，多肽藉由该域结合到靶位点并且 在安全港基因座(例如，PPP1R12C、CCR5)中进行切割；以及(c) 将包括编码特异于MHC复合物中的肿瘤特异抗原的一个或多个TCR 基因的供体核酸的第三核酸导入细胞；以及(d)将细胞导入受试者体 内。可将包括TCR特异性ZFN、TALEN或者CRISPR/Cas核酸酶系 统的核酸与特异于安全港基因座的ZFN、TALEN或者CRISPR/Cas 核酸酶系统以及供体核酸分子同时导入，或者可在第一步骤中将编码TCR特异性ZFN、TALEN或者CRISPR/Cas核酸酶系统的核酸导入 细胞，然后可在第二步骤中导入安全港基因座(例如，PPP1R12C、 CCR5)特异性ZFN、TALEN或者CRISPR/Cas核酸酶系统以及供体 核酸分子。在某些实施方案中，供体核酸分子编码肿瘤抗原如 NY-ESO1。
本发明内容还提供一种用于预防或者治疗受试者的癌症的方法， 方法包括将病毒递送颗粒导入受试者体内，其中病毒递送颗粒包括： (a)编码第一多肽的第一核酸，其中第一多肽包括：(i)锌指或者TALE DNA-结合域，锌指或者TALE DNA-结合域经工程化而结合到TCR 基因中的第一靶位点；以及(ii)切割域；在使得多肽在细胞中表达的 条件下，多肽藉由该域结合到靶位点并且切割内源TCR基因；以及 (b)编码第二多肽的第二核酸，其中第二多肽包括：(i)锌指或者TALE DNA-结合域，该锌指或者TALE DNA-结合域经工程化而结合到安全 港基因座(例如，AAVS1、CCR5、白蛋白、HPRT等(参见共有专 利权的美国专利号U.S.8,110,379和美国专利号U.S.7,951,925，以及 专利申请号13/624,193和号13/660,821)中的第一靶位点；以及(ii) 切割域；在使得多肽在细胞中表达的条件下，该多肽藉由该域结合到 靶位点并且切割安全港基因座(例如，AAVS1、CCR5、白蛋白、HPRT)； 以及(c)编码第三多肽的第三核酸，其中第三多肽包括：(i)锌指或者 TALE DNA-结合域，该锌指或者TALE DNA-结合域经工程化而结合 到安全港基因座(例如，AAVS1、CCR5、白蛋白、HPRT)中的第二 靶位点；以及(ii)切割域；在使得多肽在细胞中表达的条件下，多肽 藉由该域结合到靶位点并且在安全港基因座(例如，AAVS1、CCR5、 白蛋白、HPRT)处切割；以及(d)包括编码特异于MHC复合物中的 肿瘤特异抗原的一个或多个TCR基因的供体核酸的第三核酸；以便切割内源TCR基因并使其钝化，以及切割安全港基因(例如，AAVS1、 CCR5、白蛋白、HPRT)及将特异于MHC复合物中的肿瘤特异抗原 的TCR基因插入到内源TCR基因中。在某些实施方案中，该方法在 步骤(d)之后还包括将细胞导入受试者体内的步骤。在某些实施方案 中，供体核酸分子编码肿瘤抗原如NY-ESO1。
在本文描述的方法的任一个中，病毒递送颗粒可用于递送一个或 多个多核苷酸(编码ZFN或者TALEN的多核苷酸和/或供体多核苷 酸)。此外，在本文描述的方法和组合物的任一个中，细胞可例如为 干细胞/祖细胞(例如，CD34+细胞)，或者T细胞(例如，CD4+细胞)。
另外，本文描述的方法的任一个可在试管内、活体内和/或体外 实践。在某些实施方案中，该方法是在体外实践的，例如用于修饰 PBMC(例如，T细胞)，以使得PBMC特异于受关注肿瘤抗原/MHC 复合物，从而治疗受试者的肿瘤。可被治疗和/或预防的癌症的非限 制性实例包括肺癌、胰腺癌、肝癌、骨癌、乳腺癌、结直肠癌、白血 病、卵巢癌、淋巴瘤、脑癌等。
附图简述
图1，分图A和B描绘Wilms肿瘤抗原(WT1)特异性慢病毒载体 的构建和表达。分图A描绘了在双向PGK或者EF1α启动子的控制 下，将编码特异于来自Wilms肿瘤抗原1(WT1)的HLA-A2限制肽 的密码子优化的、用半胱氨酸修饰的TCR的基因克隆到第三代慢病 毒载体(LV)中的图形。参见，Amendola等人(2005)Nature Biotechnology，23(1)：108-116和美国专利公开号US2006200869。 分图B是描绘在5ng/ml的IL7和IL15的存在下培养的经慢病毒转导 的CD8+细胞中Vβ21TCR表达的时程的图解。将Vβ21相对荧光强度 (RFI)计算为在经PGK-WT1(空心正方形)或者EF1α-WT1(“X”) 基因修饰的淋巴细胞中测量的Vβ21的平均荧光强度(MFI)/在天然表 达Vβ21的T细胞中测量的Vβ21的MFI的比率。
图2A到图2C，是描绘用TCR构建体转导细胞的结果的图解。 图2A描绘了在暴露于来自AML患者(被指定为AML1(最左侧的 柱条)、AML2(左起第二个柱条)、和AML3(左起第三个柱条)) 的WT1+HLA-A2+或者WT1+HLA-A2-(阴性对照)原代白血病细胞 之后，用从PGK/mCMV双启动子组合(左侧4个柱条的组)或者 EF1α/mCMV双启动子(右侧4个柱条的组)表达转基因TCR的载 体转导的WT1+HLA-A2+和WT1+/HLA A2-细胞(所指示的原代AML 或者K562细胞(图中最右侧的柱条))刺激细胞以诱导γIFN产生。 图2B和图2C显示经TCR修饰的细胞对来自AML1和AML2(实线、 实心圆圈)的白血病原细胞的杀伤百分比。虚线表示在过量的装载有 适当WT1肽的冷(未标记)HLA-A2靶细胞的存在下，经TCR修饰 的细胞对白血病原细胞的剩余杀伤百分比。
图3，分图A和B，是描绘在将靶向到安全港基因座的ZFN与 GFP供体一起导入之后的GFP表达的图解。分图A和分图B显示与 所使用的Ad5/F35CCR5特异性ZFN(分图A)或者Ad5/F35AAVS1 特异性ZFN(分图B)以及-IDLV GFP供体DNA盒的量相关的GFP 阳性细胞的百分比增长。
图4，分图A和B，描绘示例性TCR-α和TCR-β供体分子(分 图A)和TCR-β基因(分图B)的图形。分图A描绘了包括WT1特 异性TCR-α和TCR-β供体分子的盒并且示出了与CCR5整合位点同 源的区域。分图B描绘了K562细胞中两个TCR-β恒定区(TRBC1 和TRBC2)的基因组排布。
图5描绘K562细胞中若干对TCR-β特异性ZFN的修饰百分比， 如用Cel-ISurveyorTM错配测定(“Cel-I测定”，Transgenomic)所测量 的。在用0.1μg或者0.4μg的ZFN质粒转染之后，最初将细胞在30℃ 孵育。在条带的的底部示出了修饰百分比。
图6，分图A和B，描绘在K562细胞中TCR-α特异性ZFN的 修饰百分比，如用Cel-I测定所测量的。分图A描绘关于其中ZFN 靶向到外显子1的细胞的Cel-I测定的结果。分图B描绘关于其中ZFN 靶向到外显子3的Cel-I错配测定的结果。“GFP”指示用仅表达GFP 的载体转染的细胞。在条带的底部指示了改变(NHEJ)百分比。如图所 示，在IL7和IL15的存在下，分选的CD3-淋巴细胞存活。
图7A到图7F，描绘ZFN介导的对TCR-β的切割。在两种载体 浓度下使用TCR-β特异性ZFN对16783和16787的未转导和经转导 Jurkat细胞显示出细胞表面处的CD3信号损失(从2.7％CD3(-)到 20.2％CD3(-)(参见实施例6)。图7A和图7B示出了Jurkat细胞中 TRBC1(图7A)和TRBC2(图7B)基因座处的Cel-I测定结果并且 显示已经发生切割。在每一条带的底部指示了所测量的基因修饰％。 图7C是描绘在IL7和IL15的存在下可存活的分选CD3-原代人淋巴 细胞的图解。“UT”指示未处理的细胞。图7D示出在用TCR-β特异 性ZFN处理过的原代T细胞池中观测到的修饰(NHEJ)百分比，如 用Cel-I测定法所测定的。“混合(Bulk)”指示对用ZFN处理过的细 胞池所观测到的NHEJ百分比，而CD3+或者CD3-示出对被分选为 CD3+或者CD3-的细胞所观测到的NHEJ。“UT”指示未处理的细胞。 在条带的底部指示用测定检测的NHEJ百分比。图7E是描绘CD3- 细胞的百分比的图解，并且显示在用浓度不断升高的ZFN处理过的 细胞中，CD3-细胞随着时间推移的存活率(甚至至第45天，CD3- 细胞的百分比保持相当恒定)。图7F是描绘已经丧失TCR/CD3功能 的CD3-细胞的图解，因为细胞不响应于非特异性促细胞分裂剂而出 现分裂。如图所示，在IL7和IL15存在多于40天的情况下，CD3- 细胞在培养物中存活并且是稳定的，CD3-细胞不响应多克隆促细胞 分裂剂并且维持TCM表型。
图8描绘编辑原代T淋巴细胞中的TCR-β基因座并且重新导入 特异性TCR转基因的实验略图和FACS结果。所使用的细胞是未处 理的原代T淋巴细胞，或者先用IDLV携带的TCR-β特异性ZFN预 处理然后分选为CD3(-)原代T细胞的淋巴细胞。根据欧洲专利公开 号EP1956080，基因转移是在用涂覆有针对CD3和CD28的抗体的 细胞大小的珠粒刺激T细胞之后而实现的，并且在IL7(5ng/ml)和 IL15(5ng/ml)的存在下进行细胞培养以促进生成经基因修饰的中枢 记忆淋巴细胞。如图所示，在用TCR-β特异性ZFN处理之后被分选 为CD3(-)，然后使用慢病毒载体将WT1-TCRβV21.3和WT1.TCRα 转基因随机整合到基因组中的细胞示出在针对CD3和Vβ21.3两者进 行染色时增多，这指示原代T淋巴细胞可经由使用TCR-β特异性ZFN 进行NHEJ而经历内源TCR断裂，随后经由导入用转基因盒 (PGK-WT1)编码的新的TCR而重新靶向成识别特异性抗原。作为对 照，UT细胞还具有插入的PGK-WT1盒并且相较于经ZFN处理的 CD3(-)群体(在多克隆刺激之后为46％、92％)表现出较小的表达 Vβ21.3的细胞的百分比(26％)，这指示内源TCR的断裂可改善细胞 表面表达及从转基因表达的TCR的功能。
图9，分图A到C，描绘Vβ21TCR的表达。分图A描绘在CD8+ TCRβ链断裂并且用WT1转导的细胞(TCR-β经编辑的)、未编辑的 WT1LV转导细胞(TCR经转移的)和用相同的培养条件处理的未转 导淋巴细胞中的Vβ21TCR表达(上方直方图)和WT1126-134五聚体 结合(下方直方图)。分图B示出了Vβ21TCR表面表达的时程。以 Vβ21RFI的平均值+标准偏差(SD)(n＝2)表示。RFI是根据在CD8+ TCR经编辑(空心三角形)或者TCR经转移(黑色圆形)的淋巴细 胞中测量的Vβ21的MFI/在天然表达Vβ21的CD8+T细胞中测量的 Vβ21的MFI的比率计算的。分图C描绘TCR经编辑和TCR经转移 的细胞的细胞毒性测定结果。功能活性是在效应物/靶标(E/T)比为12 时，用51铬释放测定标记的T2细胞的细胞溶解来测量的，其中标记 的T2细胞用不断增加浓度的WT1126-134HLA-A2限制的肽致敏，或 者用不相关的CMV-来源的pp65495- 503HLA-A2限制的肽(10μM)致 敏以作为阴性对照。结果以细胞溶解％的平均值+SD来表示(**代表 p<0.01；*代表p<0.05，使用曼-惠特尼检验，TCR经编辑的n＝6，TCR 经转移的n＝4)。
图10，分图A和B，描绘WT1TCR-阳性T细胞克隆体的功能 活性，如用γIFN酶联免疫斑点(ELISpot)测定所测试的。将克隆体暴 露于用10nM的WT1126-134HLA-A2限制的肽致敏的T2细胞(分图A)， 或者以1：1的刺激物/应答物比例暴露于同种异体的PBMC(分图B)。 所观测到的特异斑点(空心三角形和黑色圆形)的数量在y轴上示出 为在刺激物的存在下产生的斑点数量减去由效应单独产生的斑点的 数量。结果示出TCR-β经编辑的克隆体显示出比包含内源和外源TCR 基因两者的TCR经转移的细胞更高程度的抗原特异性。
图11描绘ZFN经编辑的细胞和未经编辑的细胞中的Vβ21表达。 CD3(-)细胞是从TRBC被断裂的淋巴细胞和未编辑的细胞中分选的， 并且在不断增加的MOI下经编码WT1特异性TCR的Vβ21基因和 ΔLNGFR基因的LV转导的(参见图顶端处的图形，该图形示出了 Vβ21基因和ΔLNGFR基因的双重表达)。转导效率被评定为 ΔLNGFRpos淋巴细胞％并且被示出。Vβ21表达是在ΔLNGFRpos细胞 上测量的并且显示经转导的Vβ21基因可被表达并且与内源TCRα链 一起形成有活性的CD3复合物。示出了Vβ21的平均荧光强度(MFI)。
图12，分图A到C，描绘在用靶向TCR基因的ZFN处理过 的原代淋巴细胞中的CD3表达。分图A描绘编码TCRα的人类基因 座的图形，基因座全长18kb；TRAV，即可变区基因；TRAD，即多 样性区域基因；TRAC，即恒定区基因。基因座方案上方显示的是由 每一TRAC-ZFN靶向的TRAC中的基因组DNA序列。分图A公开 蛋白序列为SEQ ID NO：109，以及DNA序列为SEQ ID NO：108。 分图B描绘了在用baCD3/CD28刺激，以5ng/ml的IL-7、5ng/ml的 IL-15培养并且暴露于TRAC-ZFN IDLV的原代人淋巴细胞中，用流 式细胞术测量的细胞表面CD3表达的下调。标绘了CD3(-)细胞的百 分比。UT是指未经转导的细胞。经分选的CD3(-)细胞用WT1-α OFP-LV转导，从而导致CD3在经转导的淋巴细胞上表达。分图C 描绘了凝胶，凝胶示出暴露于TRAC-ZFN的原代淋巴细胞中用Cel-I 测定测量的靶基因断裂水平。示出了指示野生型(w/t)基因的较高迁移 的产物。较低迁移的产物(NHEJ)指示ZFN引导的基因断裂。“UT”是 指未经转导的细胞。
图13描绘了用ZFN处理的人类淋巴细胞中的基因组TRAC ZFN 靶位点的部分序列被扩增、克隆以及测序，以确认ZFN诱导的修饰。 序列比对揭示若干在靶区内ZFN诱导的缺失和插入(indel)。左列指 示所检索的克隆数目，而右列指示缺失或者插入的核苷酸的数目。图 13按照出现次序分别公开SEQ ID NOs：110-143。
图14描绘了ZFN编辑之后的CD3表达。上方小图示出了其中 用TRAC-ZFN-AdV(MOI1000)处理激活的T淋巴细胞以分选CD3(-) 淋巴细胞，然后用3μg-p24/106个细胞的PGK-WT1-αLV转导以分选 CD3(+)细胞的研究的结果。示出了CD3在经转导的细胞中的表面表达。在一个周期的多克隆刺激之后，用TRBC-ZFN-AdV(MOI 104) 处理α经编辑的淋巴细胞以分选CD3(-)细胞，且用3μg-p24/106个细 胞的PGK-WT1-βLV转导。示出了在一个周期的多克隆刺激前后经 转导的细胞上Vβ21TCR和CD3的表面表达。示出了每一象限中测 量的事件百分比，并且在底部上示出了实验的时间线。
图15描绘了经由导入ZFN而断裂TCRα/β链以分选CD3-细胞， 随后用WT1TCR链转导以分选CD3+细胞(TCR经编辑)的CD8(+) T细胞、未编辑的经WT1LV转导的细胞(TCR经转移的)，以及用 相同培养条件处理过的未转导淋巴细胞中的Vβ21TCR表达(上方直 方图)和WT1126-134五聚体结合(下方直方图)。数据示出TCR经编 辑的细胞相较于其中存在内源和外源TCR基因两者的那些克隆体具 有更高水平的Vβ21表达。数据还显示TCR经编辑的细胞相较于具 有两组TCR基因的那些细胞展示出对WT1肽更高的结合性。
图16A到图16C，是描绘用γIFN ELISpot测定所测试的经基因修 饰的淋巴细胞的功能活性的图解。在多克隆刺激三周之后，将 TCR-α/β经编辑的淋巴细胞和TCR经转移的淋巴细胞暴露于i)用不断 增加浓度的WT1126-134HLA-A2限制的肽致敏，或者用不相关的CMV来源的pp65495-503HLA-A2肽致敏的T2细胞(参见图16A，图右侧) 或者ii)从用WT1126-134肽(50nM)致敏(虚线符号)或者未用WT1126-134肽(50nM)致敏(实线符号)的AML患者收获的WT1+HLA-A2(+) (图16B中的黑色)或者HLA-A2(-)(灰色)白血病细胞。图16C 示出了其中同种异体的PBMC用作靶标的类似结果。所有测定是以1： 1的刺激物/应答物比例完成的。特异性斑点的数目在y轴上示出为在 刺激物的存在下产生的斑点的数目减去由效应物单独产生的斑点的 数目。*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001。
图17描绘了关于用TRAC特异性ZFN进行脱靶切割的分析。在 进行用于切割的ZFN处理之后，用Cel-I错配测定来分析关于TRAC 特异性ZFN(在silicio分析中被识别的)的15个最可能的潜在脱靶 位点。每一潜在脱靶位点在以下5种样本中被分析：未转导的样本(UT)；在TRAC特异性ZFN处理和分选之后为TRAC阴性(TRAC-) 的样本；在用TRAC特异性ZFN、TRAC转基因和TRBC特异性ZFN 进行连续处理以及进行连续轮次的分选之后为TRAC阴性和TRBC 阴性的细胞(双重阴性)；在用ZFN处理之后对内源TRAC和TRBC 基因座为阴性的，以及被修饰成包括非野生型TRAC和TRBC转基 因的细胞(完全被编辑的)；或者在用TRBC特异性ZFN单独进行处 理并且经分选后为TRBC阴性的细胞(TRBC-)。潜在的脱靶位点是 如表12中所标记的。
图18描绘了关于用TRBC特异性ZFN进行脱靶切割的分析。在 进行ZFN切割处理之后，用Cel-I错配测定来分析关于TRBC特异性 ZNS(在silicio分析中被识别的)的15个潜在脱靶位点。每一潜在 脱靶位点在以下5种样本中被分析：未转导的样本(UT)；在TRAC 特异性ZFN处理和分选之后为TRAC阴性(TRAC-)的样本；在用 TRAC特异性ZFN、TRAC转基因和TRBC特异性ZFN进行连续处 理以及进行连续轮次的分选之后为TRAC阴性和TRBC阴性的细胞 (双重阴性)；在用ZFN处理之后对内源性的TRAC和TRBC基因 座为阴性的，以及被修饰成包括非野生型TRAC和TRBC转基因的 细胞(完全被编辑的)；或者在用TRBC特异性ZFN单独进行处理并 且经分选后为TRBC阴性的细胞(TRBC-)。脱靶位点如表13中所标 记的。TRBC描绘了对这些样本中预期靶位点的修饰。
图19，分图A到C，显示了NY-ESO1特异性TCR的表达以及 与适当靶标的结合。分图A示出了用NY-ESO1特异性TCR转导的T 细胞(“转移”)与在TCR转导之前首先用TRAC特异性ZFN处理以 敲除内源TCR-α链的细胞(“SE”)或者在NY-ESO1特异性TCR转 导之前TCR-α和TCR-β链两者都被敲除的细胞(“CE”)之间的比较。 示出了特异性TCR在三种T细胞群体中的表达。分图B示出了由 NY-ESO1肽组成的dextramer的结合亲合力，并且示出了已经缺失所有的内源TCR链的细胞群体(CE)具有所测试的T细胞群体中最高 的结合亲合力。分图C是描绘用3种不同的供体进行3个连续实验 的平均值的图解。最左侧的柱条示出“转移”结果，中间的柱条示出 “SE”结果，而最右侧的柱条示出“CE”结果。
图20，分图A到D，描绘了在图19中描述的T细胞群体的结合 和活性。分图A描绘了不同的T细胞群体对来源于NY-ESO1靶标的 肽的结合，而分图B描绘了T细胞对HLA-A2-、NY-ESO1-(MM1S， “A2-ESO-”)骨髓瘤细胞系或者HLA-A2+、NY-ESO1+(U266， “A2+ESO+”)骨髓瘤细胞系的结合。对MM1S细胞系的结合几乎是 无法检测到的。然后测试T细胞导致适当细胞靶细胞溶解的能力，如 用51铬释放测定所分析的(分图C和分图D)，以及观测到相较于对 不相关的细胞，经编辑的TCR T细胞对相关靶细胞的细胞溶解增强。 关于分图A、C和D，未处理的细胞(UT)是用●示出的；转移细胞是 用正方形示出的；SE细胞是用▲示出的；CE细胞是用▼示出的。
图21，分图A和B，描绘了共培养实验中不同的T细胞群体对 细胞的生长抑制。分图A描绘了相较于U266HLA-A2+、NY-ESO1+ 细胞，HLA-A2-、NY-ESO1-的不相关MM1S细胞的生长抑制。分图 B显示了在U266HLA-A2+、NY-ESO1+靶标的存在下，经编辑的T 细胞扩增2倍。
图22，分图A到D，是描绘NY-ESO1T细胞的同种异体反应性 的图解。分图A示出了效应物/靶标比为50：1时，所指示细胞类型 中的细胞溶解百分比。分图B示出了所指示细胞中的γ-干扰素(γ-IFN) ELISPOT测定。分图C示出了用NY-ESO-1特异性肽致敏的所指示 细胞中的细胞溶解百分比，而分图D示出了当细胞未被致敏时所检 测到的细胞溶解。
图23A和图23B，描绘了用所指示的细胞进行处理的小鼠骨髓中 人类多发性骨髓瘤CD138+细胞(hCD138+)的百分比(图23A)和用 所指示的细胞进行处理的小鼠的病理评分(hCD3+渗入)(图23B)。
图24，分图A到C，描绘了用编码ZFN的mRNA电穿孔进行 的TCR编辑。分图A描绘了在使用TRAC特异性ZFN mRNA(左图) 或者TRBC特异性ZFN mRNA(右图)将ZFN电穿孔到淋巴细胞中 之后第5天或第20天时，在所指示剂量处ZFN诱导的TCR断裂。 分图B描绘了经处理的细胞的数目增长倍数。用TRAC特异性ZFN 处理的细胞在最左图中示出；用TRBC-ZFN处理的细胞在中间图中 示出，而对照在最右图中示出。“UT”是指未处理的细胞；“UT+E”是 指模拟电穿孔的细胞。分图C示出了在刺激之后第18天所指示的表 面表型的百分比。用TRAC-ZFN处理的细胞在最左图中示出；用 TRBC-ZFN处理的细胞在中间图中示出，而对照在最右图中示出。T 干记忆细胞(TSCM)被定义为CD62L+CD45RA+；T中枢记忆细胞 (TCM)被定义为CD62L+CD45RA-；T效应记忆细胞(TEM)被定义为 CD62L-CD45RA-，且端效应物(TEMRA)被定义为CD62L- CD45RA+。UT：未处理的细胞；UT+E：模拟电穿孔的细胞；GFP： 用编码GFP的mRNA电穿孔的细胞。
图25A到图25D，描绘了用ZFN mRNA电穿孔进行的双重TCR 编辑。图25A示出了用于量化经共处理的细胞的CD3阴性部分中 TCR-α和TCR-β完全被编辑的细胞的量的代表性分析。单一TCR-α 或者TCR-β被编辑的细胞(在右图上以正方形示出)的部分被测量 为在用外源TCRα或者β基因进行互补时恢复CD3的表面表达的经 转导细胞的百分比。CD3阴性总群体中被完全编辑的细胞的量然后是 通过减去两种经单一编辑的细胞的百分比来计算的。图25B是示出 了在用包含专性的异源二聚体FokI域(ELD和KKR)或者它们的相 应直系同源版本(RDD和DRR)、编码TRAC特异性ZFN和TRBC 特异性ZFN的mRNA进行共同电穿孔时CD3阴性细胞的百分比的 直方图(左小图)。活细胞的百分比(在直方图的顶端上指示)被计 算为设门在单线态处的7-氨基-放线菌素D(7-AAD)阴性细胞的百分 比。7-AAD插入到双链核酸中。7-AAD被活细胞排除，但是能够穿 透濒死细胞或者死细胞的细胞膜。图25B的右侧小图示出了经编辑 的细胞在使用如上所述的LV报道基因策略计算的CD3阴性部分中的 构成。每一柱条的顶部部分示出完全被编辑的百分比(从左至右为30％、40％和49％)；每一柱条的中间部分示出β链被编辑的细胞的 百分比(从左至右的柱条为6％、44％和21％)；以及每一柱条的下部 部分示出TCR-α被编辑的细胞的百分比(从左至右的柱条为64％、 16％和30％)。图25C示出了在刺激之后第18天T细胞的表面表型。 示出了四种表型：每一柱条最底部的部分示出定义为CD62L+ CD45RA+的干记忆细胞(TSCM)；每一柱条上从底部往上第二部分示 出被定义为CD62L+CD45RA-的T中枢记忆细胞(TCM)；每一柱条上 从顶端往下第二部分示出被定义为CD62L-CD45RA-的T效应记忆 细胞(TEM)；以及每一柱条的最顶部部分示出被定义为CD62L- CD45RA+的端效应细胞(TEMRA)。“UT”是指未处理的细胞。图25D 示出用指定剂量的TRAC-特异性ZFN mRNA和TRBC特异性ZFN mRNA共同电穿孔的T细胞的生长曲线。
具体实施方式
本文公开了靶向TCR基因的锌指核酸酶(ZFN)和TALEN (TCR-ZFN和TCR-TALEN)。这些核酸酶有效地例如在TCR编码区 中预先确定的位点处导致双链断裂(DSB)。在编码TCR基因的基因中 ZFN或者TALEN介导的位点特异性双链断裂(DSB)的导入可导致人 类细胞(包括人类T细胞)中的内源TCR复合物的特异性和永久的 断裂。这些细胞可通过选择CD3(-)细胞，然后在IL7和IL15上培养 细胞而从细胞池中选取。此外，本文公开了用于以所选择的TCR转 基因，经由随机整合或者定向靶向整合取代内源TCR基因的方法和 组合物。
概要
除非另有说明，否则本方法的实践，以及本文公开的组合物的制 备与应用采用本领域技术范围内的分子生物学、生物化学、染色质结 构和分析、计算化学、细胞培养、重组DNA和相关领域中的常规技 术。这些技术在文献中已有充分描述。参见，例如，Sambrook等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第二版， Cold Spring HarborLaboratory Press,1989和第三版，2001；Ausubel 等人，URRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY，John Wiley&Sons,New York,1987及其定期更新；METHODS IN ENZYMOLOGY系列丛书，Academic Press,San Diego；Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，第三版，Academic Press,San Diego,1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，第304卷， “Chromatin”(P.M.Wassarman和A.P.Wolffe编辑)，Academic Press, San Diego,1999；以及METHODS INMOLECULAR BIOLOGY，第 119卷，“Chromatin Protocols”(P.B.Becker编辑)，HumanaPress, Totowa,1999。
定义
术语“核酸”、“多核苷酸”和“低聚核苷酸”是可互换使用的，并且 是指脱氧核糖核苷酸或核糖核甘酸聚合物，可以是直链或环状构型 的，且是单链或双链形式的。出于本公开内容的目的，这些术语不构 成对聚合物长度的限制。术语可涵盖天然核苷酸的已知类似物，以及 在碱基、糖和/或磷酸部分中被修饰的核苷酸(例如，硫代磷酸主链)。 一般说来，特定核苷酸的类似物具有相同的碱基配对特异性；即A 的类似物将与T进行碱基配对。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”是可互换使用用于指氨基酸残基的 聚合物。该术语还适用于其中一个或多个氨基酸是相应的天然存在的 化学类似物或者经修饰衍生物的氨基酸聚合物。
“结合”是指大分子之间(例如，蛋白质和核酸之间)的序列特异 性、非共价相互作用。不要求结合相互作用的所有组分都是序列特异 性(例如，与DNA主链中的磷酸残基接触)，只要相互作用整体上 是序列特异性即可。此类相互作用一般特征为10-6M-1或者更低的电 离常数(Kd)。“亲合力”是指结合强度；增大的结合亲合力与降低的Kd有关。
“结合蛋白”是能够非共价地结合到另一分子的蛋白。结合蛋白能 够结合到例如DNA分子(DNA结合蛋白)、RNA分子(RNA结合 蛋白)和/或蛋白分子(蛋白结合蛋白)。在蛋白结合蛋白的情况下， 蛋白结合蛋白可结合到其自身(以形成同源二聚体、同源三聚体等)和/或蛋白结合蛋白可结合到一个或多个不同蛋白的一个或多个分 子。结合蛋白可具有一种以上类型的结合活性。例如，锌指蛋白具有 DNA结合、RNA结合和蛋白结合活性。
“锌指DNA结合蛋白”(或者结合域)是蛋白质或者较大蛋白质 中的域，其经由一个或多个锌指以序列特异性方式结合DNA，锌指 是其结构经由锌离子的配位作用而稳定化的结合域中的氨基酸序列 区域。术语锌指DNA结合蛋白往往缩写为锌指蛋白或者ZFP。
“TALE DNA-结合域”或者“TALE”是包括一个或多个TALE重复 域/单位的多肽。重复域是在TALE结合到其同源靶DNA序列中所涉 及的。单一“重复单元”(也被称为“重复”)通常是33-35个氨基酸长， 并且表现出与天然存在的TALE蛋白质中的其它TALE重复序列的至少一些序列同源性。TALEN优选地包括C端和/或N端截断(例如， C帽和/或N帽)。参见，例如美国专利号8,586,526，在此通过引用 整体并入。
锌指结合域和TALE结合域可“经工程化”以结合到预定的核苷酸 序列，例如经由天然存在的锌指或者TALE蛋白的识别螺旋区域的工 程化(改变一个或多个氨基酸)。因此，工程化DNA结合蛋白(锌 指或者TALE)是非天然存在的。工程化DNA结合蛋白的方法的非 限制性实例是设计和选择。经设计的DNA结合蛋白是非天然存在的， 经设计的DNA结合蛋白的设计/组合物结果主要是根据合理性准则。 设计的合理性准则包括取代规则和计算机算法的应用，计算机算法用 于处理存储现有ZFP和/或TALE设计和结合数据的数据库中的信息。参见，例如美国专利号8,586,526；6,140,081；6,453,242；和6,534,261； 以及参见WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536 和WO 03/016496。
“被选择的”锌指蛋白或者TALE是在自然界中不存在的蛋白质， 蛋白质的产生主要来源于经验过程，诸如噬菌体展示技术、相互作用 陷阱或者杂交体选择。参见例如U.S.8,586,526；U.S.5,789,538；US 5,925,523；US 6,007,988；US 6,013,453；US 6,200,759；WO 95/19431； WO 96/06166；WO 98/53057；WO 98/54311；WO 00/27878；WO 01/60970；WO 01/88197；WO 02/099084。
术语“序列”是指任何长度的核苷酸序列，该序列可为DNA或者 RNA；可为直链的、环状的或者支链的并且可为单链或者双链的。术 语“供体序列”是指插入到基因组中的核苷酸序列。供体序列可为任何 长度，例如在2个和10,000个核苷酸长度之间(或者范围之间或者 高于该范围的任何整数值)，优选地在约100个和1,000个核苷酸长 度之间(或该范围之间的任何整数)，更优选地在约200个和500个 核苷酸长度之间。
“同源但不同一的序列”是指第一序列与第二序列共享一定程度 的序列同一性，但是第一序列的序列并不与第二序列的序列同一。例 如，包括突变基因的野生型序列的多核苷酸与突变基因的序列是同源 但不同一的。在某些实施方案中，两个序列之间的同源性程度足以允 许利用正常的细胞机理进行它们之间的同源重组。两个同源但不同一 的序列可为任意长度，并且它们的非同源程度可低至单一核苷酸(例 如，对于通过靶向同源重组来校正基因组点突变来说)或者高至10kb 或者更高(例如，对于将基因插入染色体中预定异常位点来说)。对 包含同源但不同一序列的两个多核苷酸不要求为相同长度。例如，可使用20和10,000个之间的核苷酸或核苷酸对的外源多核苷酸(即， 供体多核苷酸)。
用于确定核酸和氨基酸序列同一性的技术是本领域中已知的。通 常，此类技术包括确定某基因mRNA的核苷酸序列和/或确定由其编 码的氨基酸序列，并将这些序列与第二核苷酸或氨基酸序列比较。也 可以此方式确定并比较基因组序列。一般说来，同一性分别是指两条 多核苷酸或多肽序列的核苷酸与核苷酸或氨基酸与氨基酸的确切对 应性。可通过测定两个或多个序列(多核苷酸或氨基酸)的同一性百 分比来比较这些序列。无论是核酸还是氨基酸序列，两个序列的同一 性百分比是两个比对序列之间的确切匹配数目除以较短序列的长度 并将结果乘以100。核酸序列的近似比对由Smith和Waterman, Advances in Applied Mathematics，2：482-489(1981)的局部同源算法 提供。该算法可通过使用Dayhoff，Atlas of Protein Sequences and Structure),Μ.O.Dayhoff编，增刊第5版，3：353-358，National Biomedical Research Foundation,Washington,D.C.,USA开发和通过Gribskov，Nucl.Acids Res.14(6)：6745-6763(1986)归一化的评分矩阵 应用于氨基酸序列。测定序列同一性百分比的本算法的示例性实施由 威斯康星州麦迪逊的遗传计算机公司(Genetics Computer Group, Madison,WI)在“BestFit”应用中提供。该方法的默认参数在 WisconsinSequence Analysis Package Program Manual，第8版(1995) (购自威斯康星州麦迪逊的遗传计算机公司)中描述。本公开内容中 建立同一性百分比的优选方法是使用由John F.Collins和Shane S. Sturrok开发,由爱丁堡大学版权所有,并由加州芒廷维尤的智慧遗传 公司(IntelliGenetics,Inc.,Mountain View,CA)分销的MPSRCH程序 包。这套程序包可使用Smith-Waterman算法，其中评分表使用默认 参数(例如，空位开放罚12分、空位延伸罚1分，以及一个空位罚 6分)。产生“匹配”值的数据反映了序列同一性。计算序列之间同一性 百分比或类似性百分比的其它合适程序一般是本领域已知的，例如另 一比对程序是BLAST，使用默认参数。例如，BLASTN和BLASTP 可以使用以下默认参数：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；阈 值＝60；预期值＝10；矩阵＝BL0SUM62；描述＝50个序列；分选标准＝ 高评分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。这些程序的细节可在以下互联 网网址上找到：http：//www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。考虑本文 所述的序列，所需的序列同一性程度的范围为约80％到100％以及其 中任何整数值。通常，序列之间的同一性百分比为至少70-75％，优 选地80-82％，更优选地85-90％，甚至更优选地92％，更加优选地 95％，以及最优选地98％的序列同一性。
或者，多核苷酸之间的序列相似性程度可以通过多核苷酸在允许 同源区域间形成稳定双链体的条件下杂交，然后用单链特异性核酸酶 消化并确定消化后片段的大小来确定。当按上述方法确定得到两个核 酸或两个多核苷酸序列在分子的限定长度上表现至少约70％-75％， 优选地80％-82％，更优选地85％-90％，甚至更优选地92％，更加优 选地95％，以及最优选地98％的序列同一性时，序列彼此间基本同 源。如本文所用，基本同源也指序列与特定的DNA或多肽序列显示 完全的同一性。基本同源的DNA序列可在Southern杂交实验中识别， 例如，以在对特定系统限定的严格条件下。本领域技术人员能限定适 当的杂交条件。参见例如，Sambrook等人，同上；Nucleic Acid Hybridization：A Practical Approach，B.D.Hames和S.J.Higgins编， (1985)Oxford；Washington,DC；IRL Press)。
可以如下确定两个核酸片段的选择性杂交。两个核酸分子之间的 序列同一性程度影响这两个分子之间杂交事件的效率和强度。部分同 一的核酸序列将至少部分抑制与靶分子完全同一的序列的杂交。可使 用本领域熟知的杂交测定(例如，Southern(DNA)印迹，Northern(RNA) 印迹，溶液杂交等，参见Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版，(1989)Cold Spring Harbor,N.Y.)评价对 完全同一序列的杂交抑制。可使用不同程度的选择性，例如，使用从 低到高严格性的不同条件，进行此类测定。如果应用低严格性条件， 可使用甚至缺乏部分程度序列同一性的辅助探针(例如，与靶分子具 有小于约30％序列同一性的探针)评价不存在非特异性结合，以使得 在不存在非特异性结合事件时，辅助探针将不会与靶标杂交。
当利用基于杂交的检测系统时，选择与参考核酸序列互补的核酸 探针，然后通过选择合适条件，探针和参考序列彼此选择性杂交或结 合以形成双链分子。能在适当严格杂交条件下选择性与参考序列杂交 的核酸分子通常在能检测长度至少约10-14核苷酸的靶核酸序列的条 件下杂交，靶核酸序列与所选的核酸探针的序列具有至少约70％的序 列同一性。严格杂交条件通常能检测长度至少约10-14核苷酸的靶核 酸序列，靶核酸序列与所选的核酸探针的序列具有大于约90-95％的 序列同一性。用于探针/参考序列杂交的杂交条件可由本领域已知方 法确定，其中探针和参考序列具有特定程度的序列同一性(参见例如， Nucleic Acid Hybridization：A Practical Approach，B.D.Hames和S.J. Higgins编，(1985)Oxford；Washington,DC；IRL Press)。
杂交条件是本领域技术人员熟知的。杂交严格性是指杂交条件不 利于包含错配核苷酸的杂交体形成的的程度，同时较高严格性与错配 杂交体的较低耐受性相关。影响杂交严格性的因素是本领域技术人员 熟知的，其包括但不限于温度、pH、离子强度和有机溶剂如例如甲 酰胺和二甲亚砜的浓度。如本领域技术人员已知的，杂交严格性随温 度升高、离子强度降低和溶剂浓度降低而增加。
关于杂交的严谨性条件，本领域熟知的许多等价条件可以用于通 过改变例如下列因素来建立特定严谨性：序列的长度和特性、不同序 列的碱基组成、盐和其它杂交液组分的浓度、杂交液中存在或不存在 封闭剂(例如，硫酸葡聚糖和聚乙二醇)、杂交反应温度和时间参数、 以及改变洗涤条件。根据本领域的标准方法选择一组特定的杂交条件 (参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，(1989)ColdSpring Harbor,N.Y.)。
“重组”是指两个多核苷酸之间交换遗传信息的过程。出于本公开 的目的，“同源重组(HR)”是指发生这种交换的特定形式，例如在修复 细胞内双链断裂期间发生。该过程要求核苷酸序列同源性，使用“供 体”分子作为模板修复“靶”分子(即，经历双链断裂的分子)，且该过 程也称作“非交叉基因转化”或“短道基因转化”，因为其导致遗传信息 从供体向靶标转移。不希望受限于任何特定理论，此类转移可以涉及 断裂的靶标与供体间形成的异源双链DNA的错配校正，和/或采用供 体再合成将成为部分靶的遗传信息的“合成依赖性链退火”，和/或相 关过程。此类特定HR通常导致靶分子的序列改变，而使得供体多核 苷酸的部分或全部序列被并入靶多核苷酸。
“切割”是指DNA分子共价主链的断裂。切割可以由多种方法启 动，该方法包括但不限于磷酸二酯键的酶促或化学水解。单链切割和 双链切割都可行，并且双链切割可以是两次不同的单链切割事件的结 果。DNA切割可导致产生钝端或交错末端。在某些实施方案中，将 融合多肽用于靶向双链DNA切割。
“切割半域”是能与第二多肽(两者同一或不同)连接形成具有切 割活性(优选双链切割活性)的复合物的多肽序列。术语“第一和第 二切割半域”；“+和-切割半域”和“右和左切割半域”可互换使用以指二 聚化的成对切割半域。
“工程化切割半域”是已经被修饰以便与另一切割半域(例如，另 一工程化切割半域)形成专性杂二聚体的切割半域。还参见，美国专 利号7,888,121；7,914,796；8,034,598；8,623,618和美国专利公开号 2011/0201055，这些专利在此通过引用整体并入。
术语“序列”是指任何长度的核苷酸序列，核苷酸序列可为DNA 或者RNA；可为直链，环状或支链的，以及可为单链或双链。术语“供 体序列”是指插入基因组中的核苷酸序列。供体序列可为任何长度， 例如在2和10,000个核苷酸长度之间(或者该范围间或超过该范围 的任何整数值)，优选地在约100和1,000个核苷酸长度之间(或其 间的任何整数)，更优选地在约200和500个核苷酸长度之间。
“染色质”是包含细胞基因组的核蛋白结构。细胞染色质包含核酸 和蛋白，核酸主要为DNA，蛋白包括组蛋白和非组蛋白染色体蛋白。 大部分真核细胞染色质以核小体形式存在，其中核小体核心包含与八 聚体关联的约150个碱基对的DNA，八聚体包含组蛋白H2A、H2B、 H3和H4各两份；以及在核小体核心之间延伸的接头DNA(长度根 据生物体而各有不同)。组蛋白H1分子通常与接头DNA关联。出于 本公开内容的目的，术语“染色质”意在涵盖所有类型的细胞核蛋白， 包括原核的与真核的。细胞染色质包括染色体和附加体的染色质。
“染色体”是包含细胞的全部或部分基因组的染色质复合物。细胞 的基因组通常以其核型为特征，该核型是包含细胞基因组的全部染色 体的集合。细胞的基因组可包含一个或多个染色体。
“附加体”是复制的核酸、核蛋白复合物或其它包含并非细胞染色 体核型部分的核酸的结构。附加体的实例包括质粒和某些病毒基因 组。
“可进入区”是细胞染色质中的位点，其中核酸中存在的靶位点可 被识别靶位点的外源分子结合。不希望受任何具体理论的限制，据信 可进入区是不包装在核小体结构中的区域。可进入区的不同结构往往 可通过其对化学和酶性探针如核酸酶的敏感度来检测。
“靶位点”或“靶序列”是限定结合分子将结合的核酸部分的核酸 序列，前提是存在结合的充分条件。例如，序列5’-GAATTC-3’是Eco RI限制性内切核酸酶的靶位点。
“安全港基因座”是基因组中可用于整合外源核酸的位置。将外源 核酸添加到这些安全港基因座中不会通过单独添加DNA而对宿主细 胞生长造成任何显著的影响。安全港基因的非限制性实例包括例如 CCR5基因、CXCR4基因、PPP1R12C(也被称为AAVS1)基因、白蛋白基因或者Rosa基因。参见例如，美国专利号7,951,925和 8,110,379；美国公开号201000218264；20100291048；20120017290； 20110265198；20130137104；20130122591；20130177983和 20130177960。
“外源”分子是通常不存在于细胞内的分子，但可通过一种或多种 遗传、生化或其它方法导入细胞。“通常存在于细胞内”是对于细胞的 具体发育阶段和环境条件而确定的。因此，例如，仅在肌肉的胚胎发 育期间存在的分子对于成体肌肉细胞是外源分子。类似地，通过热激 诱导的分子对于未热激细胞是外源分子。外源分子可包含例如功能失 常的内源分子的功能性形式或者正常功能的内源分子的功能失常形 式。
除了别的以外，外源分子可以是小分子或大分子等，小分子如由 组合化学方法所产生，大分子如蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质、 糖蛋白、脂蛋白、多糖、上述分子的任何经修饰衍生物，或者是包含 一个或多个上述分子的任何复合物。核酸包括DNA和RNA，可以是单链或双链，可以是直链、支链或环状；且可以是任意长度。核酸包 括那些能形成双链体以及形成三链体的核酸。参见例如，美国专利号 5,176,996和5,422,251。蛋白质包括但不限于DNA结合蛋白、转录 因子、染色质重塑因子、甲基化DNA结合蛋白、聚合酶、甲基化酶、 去甲基化酶、乙酰基转移酶、脱乙酰基酶、激酶、磷酸酶、整合酶、 重组酶、连接酶、拓扑异构酶、促旋酶和解旋酶。
外源分子可以是与内源分子同一类型的分子，例如外源蛋白或核 酸。例如，外源核酸可包含感染性病毒基因组、导入细胞内的质粒或 附加体，或包含通常不存在于细胞内的染色体。本领域技术人员已知 将外源分子导入细胞内的方法，包括但不限于脂质介导的转移(即脂 质体，包括中性和阳离子脂质)、电穿孔、直接注射、细胞融合、粒 子轰击、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转移和病毒载体介导的 转移。
相比之下，“内源”分子是通常存在于特定环境条件下特定发育阶 段的特定细胞中的分子。例如，内源核酸可包含染色体，线粒体、叶 绿体或其它细胞器的基因组，或天然存在的附加体核酸。其它内源分 子可包括蛋白质，例如转录因子和酶。
“融合”分子是其中两个或更多个亚单位分子相连(优选共价相 连)的分子。该亚单位分子可以是同一化学类型的分子，或可以是不 同化学类型的分子。第一类融合分子的实例包括但不限于融合蛋白 (例如，ZFP或者TALE DNA-结合域与切割域之间的融合体)和融合 核酸(例如，编码前述融合蛋白的核酸)。第二类融合分子的实例包 括但不限于：形成三链体的核酸与多肽之间的融合体，以及小沟结合 子与核酸之间的融合体。
细胞内融合蛋白的表达可由向细胞递送融合蛋白或通过向细胞 递送编码融合蛋白的多核苷酸引起，其中该多核苷酸被转录，且转录 物经翻译产生该融合蛋白。细胞内蛋白的表达中也可涉及反式剪接、 多肽切割和多肽连接。向细胞递送多核苷酸和多肽的方法在本公开内 容中另有描述。
出于本公开内容的目的，“基因”包括编码基因产物(见前文)的 DNA区域，以及调节基因产物生成的所有DNA区域，不论这类调节 序列是否毗邻编码和/或转录序列。因此，基因包括但未必限于：启 动子序列，终止子，翻译调节序列如核糖体结合位点和内部核糖体进 入位点、增强子、沉默子、隔离子、边界元件、复制起点、基质附着 位点和基因座控制区。
“基因表达”是指基因所含信息转化成基因产物。基因产物可以是 基因的直接转录产物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核 酶、结构RNA、或任何其它类型的RNA)或由mRNA翻译产生的蛋 白。基因产物还包括经过修饰的RNA和经过修饰的蛋白，RNA修饰 过程如加帽、聚腺苷酸化、甲基化和编辑，蛋白修饰过程如甲基化、 乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、十四烷基化和糖基化。
基因表达的“调整”指基因活性的改变。表达的调整可包括但不限 于基因激活和基因抑制。调整还可以是完全的，即其中基因表达被完 全钝化或者被激活到野生型水平或更高的水平；或者调节是部分的， 其中基因表达被部分地减少，或者被部分地激活到野生型水平的一部 分。
“真核”细胞包括但不限于真菌细胞(如酵母)、植物细胞、动物细 胞、哺乳动物细胞和人细胞(如T细胞)。
“受关注区域”是需要结合外源分子的细胞染色质的任意区域，例 如，基因，或者基因内的非编码序列，或与基因毗邻的非编码序列。 结合可以是用于靶向DNA切割和/或靶向重组的目的。例如，受关注 区域可存在于染色体、附加体、细胞器(例如，线粒体、叶绿体)基 因组或感染性病毒基因组。例如，受关注区域可以在基因的编码区内， 在转录的非编码区如前导序列、尾随序列或内含子内，或在编码区上 游或下游的非转录区内。受关注区域可以是小到单个核苷酸对长度或 大到2,000个核苷酸对长度，或任意整数值的核苷酸对长度。
当两个或多个组分(例如序列元件)并置，且该组分排列成组分 都可正常发挥作用并允许组分中至少一种能介导至少一种其它组分 发挥作用时，术语“操作性连接(operative linkage)”和“操作性相连 (operatively linked)”(或“操作性相连(operably linked)”)互换使用。例 如，若转录调节序列控制编码序列应答一种或多种转录调节因子存在 或缺失时的转录水平，则转录调节序列如启动子与编码序列操作性连接。转录调节序列通常与编码序列顺式操作性连接，但不需要与其直 接毗邻。例如，尽管并非毗连，但增强子仍是与编码序列操作性连接 的转录调节序列。
对于融合多肽，术语“操作性相连”可指各组分在与其它组分的连 接中所发挥的功能与其在未相连时的功能相同。例如，对于其中DNA 结合域(ZFP，TALE)与切割域(例如，核酸内切酶域诸如FokI， 大范围核酸酶域等)融合的融合多肽，若在融合多肽中DNA结合域部分能结合其靶位点和/或其结合位点，而切割(核酸酶)域能切割 靶位点附近的DNA，则DNA结合域与切割域操作性连接。核酸酶域 还可表现DNA结合能力(例如，融合到ZFP或者TALE域的核酸酶 还可结合到DNA)。类似地，对于其中DNA结合域与激活或者抑制 域融合的融合多肽，若在融合多肽中DNA结合域部分能结合其靶位 点和/或其结合位点，而激活域能上调基因表达或者抑制域能下调基 因表达，则DNA结合域与激活或者抑制域操作性连接。
蛋白、多肽或核酸的“功能性片段”是序列与全长蛋白、多肽或核 酸不同一但保留全长蛋白、多肽或核酸的相同功能的蛋白、多肽或核 酸。功能片段可具有比相应的天然分子更多、更少或相同数量的残基， 和/或可含有一个或多个氨基酸或核苷酸置换。确定核酸功能(例如， 编码功能、与另一核酸杂交的能力)的方法是本领域中熟知的。类似 地，确定蛋白质功能的方法也是熟知。例如，可确定多肽的DNA结 合功能，例如通过滤膜结合、电泳迁移率改变或免疫沉淀测定。DNA 切割可通过凝胶电泳测定。参见Ausubel等人，同上。可确定蛋白与 另一蛋白相互作用的能力，例如，通过免疫共沉淀、双杂交测定或互 补分析，既可以是遗传的也可以是生化的。参见例如，Fields等人， (1989)Nature，340：245-246；美国专利号5,585,245和PCT WO 98/44350。
“载体”能转移基因序列到靶细胞。通常，“载体构建体”、“表达 载体”、和“基因转移载体”指能指导受关注基因表达和能转移基因序 列到靶细胞的任何核酸构建体。因此，该术语包括克隆、和表达工具， 以及整合载体。
核酸酶
本文描述可用于钝化TCR基因的核酸酶(例如，ZFN或者TALE 核酸酶)。核酸酶可为天然存在的或者可为DNA结合域和切割域的 嵌合体。显而易见的是，在嵌合体中，组成的DNA结合域和切割域 可都为天然存在的，可都为非天然存在的，或者其中一个可为天然存在的而另一个可为非天然存在的。
因此，在本文公开的方法中可使用任何核酸酶。例如，天然存在 的归巢内切核酸酶和大范围核酸酶具有非常长的识别序列，在统计基 础上，这些识别序列的一些可能存在于人类大小的基因组中。示例性 归巢内切核酸酶包括I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、 I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。它们的识别序列是已知的。还参见美国专利号5,420,032；美国专利 号6,833,252；Belfort等人(1997)Nucleic Acids Res.，25：3379–3388； Dujon等人(1989)Gene，82：115–118；Perler等人(1994)Nucleic Acids Res.，22：1125-1127；Jasin(1996)Trends Genet.，12：224–228；Gimble 等人(1996)J.Mol.Biol.，263：163–180；Argast等人(1998)J.Mol.Biol.，280：345–353，以及新英格兰生物实验室目录。
还已经报道了归巢内切核酸酶和大范围核酸酶的特异性可被工 程化以结合到非天然的靶位点。参见，例如Chevalier等人(2002)Molec. Cell，10：895-905；Epinat等人(2003)NucleicAcids Res.，31：2952-2962； Ashworth等人(2006)Nature，441：656-659；Paques等人(2007)Current Gene Therapy，7：49-66。可在作为整体的核酸酶环境中改变归巢内 切核酸酶和大范围核酸酶的DNA结合域(即，以使得核酸酶包含相 关切割域)，或者DNA结合域可融合到异源DNA结合域(例如，锌 指蛋白或者TALE)或者异源切割域。来源于大范围核酸酶的DNA 结合域还可表现出DNA结合活性。
在某些实施方案中，核酸酶包含锌指DNA结合域和限制性内切 核酸酶域，核酸酶也被称为锌指核酸酶(ZFN)。
在其它实施方案中，核酸酶包括工程化TALE DNA-结合域和核 酸酶域(例如，内切核酸酶和/或大范围核酸酶域)，核酸酶也被称为 TALEN。已经公开了用于工程化这些TALEN蛋白质以与使用者选择 的靶序列进行稳健的、位点特异性相互作用的方法和组合物(参见美 国专利号8,586,526)。在一些实施方案中，TALEN包含内切核酸酶 (例如，FokI)切割域或者切割半域。在其它实施方案中，TALE核 酸酶是兆TAL。这些兆TAL核酸酶是包含TALEDNA-结合域和大范 围核酸酶切割域的融合蛋白。大范围核酸酶切割域作为单体具有活性的，并且不需要二聚化来获得活性。(参见Boissel等人，(2013)Nucl Acid Res：1-13,doi：10.1093/nar/gkt1224)。此外，核酸酶域还可表 现出DNA结合功能。
在其它实施方案中，核酸酶包括紧密的TALEN(cTALEN)。这些 TALEN是将TALEDNA-结合域连接到TevI核酸酶域的单链融合蛋 白。融合蛋白可用作被TALE区域局限的切割酶，或者可造成双链断 裂，取决于TALE DNA-结合域相对于TevI核酸酶域的位置(参见Beurdeley等人(2013)Nat Comm：1-8DOI：10.1038/ncomms2782)。 任何TALEN可与另外的TALEN(例如，具有一个或多个兆TAL的 一个或多个TALEN(cTALEN或者FokI-TALEN))结合使用。
因此，任何具有唯一靶位点的天然存在或者工程化的核酸酶可用 于本文描述的方法。
A.DNA结合域
本文描述的核酸酶通常包含DNA结合域和切割域。本发明实践 可用任何DNA结合域，包括但不限于锌指DNA结合域、TALE DNA- 结合域，或者来自大范围核酸酶的DNA结合域。
在某些实施方案中，采用工程化以用于结合到所选择的序列的锌 指结合域。参见，例如，Beerli等人(2002)Nature Biotechnol.，20： 135-141；Pabo等人(2001)Ann.Rev.Biochem.，70：313-340；Isalan 等人(2001)Nature Biotechnol.，19：656-660；Segal等人(2001)Curr. Opin.Biotechnol.，12：632-637；Choo等人(2000)Curr.Opin.Struct. Biol.，10：411-416。类似地，TALE DNA-结合域可工程化以用于结 合到所选择的序列。参见，例如8,586,526。与天然存在的锌指或者 TALE蛋白相比，工程化的锌指或者TALE DNA-结合域可具有新的 结合特异性。工程化方法包括但不限于合理设计与各种选择类型。合 理设计包括例如使用包含三体(或四体)核苷酸序列和个别锌指氨基 酸序列的数据库，其中各三体或四体核苷酸序列与一种或多种结合该 特定三体或四体序列的锌指氨基酸序列相关联。参见，例如共同拥有 的的美国专利8,586,526；6,453,242和6,534,261，在此通过引入整体 并入。
示例性选择方法包括噬菌体展示和双杂交系统，公开于美国专利 5,789,538；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,410,248；6,140,466； 6,200,759和6,242,568；以及WO98/37186；WO 98/53057；WO 00/27878；WO 01/88197和GB 2,338,237。锌指结合域结合特异性的 增强已经在例如共同拥有的WO 02/077227中有所描述。
在其它实施方案中，DNA结合域包括TALE DNA-结合域(参见， 共同拥有的美国专利号8,586,526，在此通过引入整体并入)。TALE DNA-结合域包含一个或多个TALE“重复单元”。单一“重复单元”(也 被称为重复)通常是33-35个氨基酸长度，其中结合到DNA核苷酸涉及"重复单元"中的12位和/或13位(被称为高变双残基区或者 “RVD”)。“非典型”RVD是在自然界中罕见存在或者从不存在的RVD 序列(12位和13位)，例如在天然存在的TALE蛋白中小于5％，优 选地在天然存在的TALE蛋白中小于2％，以及甚至更优选地在天然 存在的TALE蛋白中小于1％。非典型的RVD可为非天然存在的。 TALE DNA-结合域优选地包含C-帽序列和任选地N-帽序列。“帽”序 列优选地是在全长TALE蛋白中存在的多肽的片段(截断)，例如对 天然存在的TALE蛋白中侧接TALE重复域的C端区域和/或N端区 域的任何截断。C-帽可为例如相较于野生型C端TALE蛋白(野生型 C端TALE蛋白编号为起始于C-20)的截断，该截断包括但不限于， C-19、C-18、C-17、C-16、C-15、C-14、C-13、C-12、C-11、C-10、 C-9、C-8、C-7、C-6、C-5、C-4、C-3、C-2、C-1，递增到C+1，以 及然后递增到C+2、C+3等，朝向多肽(例如，C+63，多肽从C-20 延伸到C+63，为83个氨基酸长度)的C端。
此外，如在这些和其它参考文献中所公开的，锌指域和/或多指 锌指蛋白或者TALE可使用任何合适的接头序列连接在一起，包括例 如长度为5个或更多个氨基酸的接头。还参见美国专利号6,479,626； 6,903,185；以及7,153,949来了解长度为6个或更多个氨基酸的示例 性接头序列。本文所述的蛋白可包括该蛋白的个别锌指之间的合适接 头的任意组合。此外，锌指结合域结合特异性的增强已经在例如美国 专利号6,794,136中有所描述。
靶位点的选择；ZFP或者TALE，以及融合蛋白(和编码融合蛋 白的多核苷酸)的设计与构建方法是本领域中的技术人员已知的并且 在美国专利号6,140,081；5,789,538；6,453,242；6,534,261；5,925,523； 6,007,988；6,013,453；6,200,759；WO 95/19431；WO 96/06166；WO 98/53057；WO 98/54311；WO 00/27878；WO 01/60970；WO 01/88197； WO 02/099084；WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496中详细描述，这些专利的公开内容通过 引用整体并入用于所有目的。
此外，如在这些和其它参考文献中所公开的，锌指域和/或多指 锌指蛋白可使用任何合适的接头序列连接在一起，包括例如长度为5 个或更多个氨基酸的接头。还参见美国专利号6,479,626；6,903,185； 以及7,153,949来了解长度为6个或更多个氨基酸的示例性接头序列。 本文所述的蛋白可包括该蛋白的个别锌指之间的合适接头的任何组 合。
或者，DNA结合域可衍生于核酸酶。例如，已知归巢内切核酸 酶和大范围核酸酶的识别序列如I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、 I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、 I-TevII和I-TevIII。还参见美国专利号5,420,032；美国专利号 6,833,252；Belfort等人(1997)Nucleic Acids Res.，25：3379-3388；Dujon 等人(1989)Gene，82：115-118；Perler等人(1994)Nucleic Acids Res.， 22：1125-1127；Jasin(1996)Trends Genet.，12：224-228；Gimble等 人(1996)J.Mol.Biol.，263：163-180；Argastet等人(1998)J.Mol.Biol.， 280：345-353，以及新英格兰生物实验室目录。此外，可将归巢内切 核酸酶和大范围核酸酶的DNA结合特异性经工程化以结合到非天然 的靶位点。参见，例如Chevalier等人(2002)Molec.Cell，10：895-905； Epinat等人(2003)NucleicAcids Res.，31：2952-2962；Ashworth等人 (2006)Nature，441：656-659；等人(2007)Current Gene Therapy，7：49-66；美国专利公开号20070117128。
在某些实施方案中，DNA结合域是工程化锌指蛋白，锌指蛋白 通常包含至少一个锌指，但是也可包含多个锌指(例如，2、3、4、5、 6个或更多个锌指)。ZFP经常包含至少三个锌指。某些ZFP包含四 个、五个或者六个锌指。包含三个锌指的ZFP通常识别包含9个或 者10个核苷酸的靶位点；包含四个锌指的ZFP通常识别包含12个 或者14个核苷酸的靶位点；而具有六个锌指的ZFP能够识别包含18 个到21个核苷酸的靶位点。ZFP还可为包含一个或多个调节域的融 合蛋白，其中这些调节域可为转录激活域或者转录抑制域。
在其它实施方案中，DNA结合域包括天然存在的或者经工程化 的(非天然存在的)TAL效应DNA结合域。参见，例如美国专利号 8,586,526，在此通过引用整体并入。已知黄单胞菌属(genus Xanthomonas)的植物病原菌在重要农作物中导致很多疾病。黄单胞菌 属的病原性取决于保守的III型分泌(T3S)系统，该系统向植物细胞 内注入超过25种不同的效应蛋白。这些注入的蛋白中，有模拟植物 转录激活物并操纵植物转录组的转录激活样效应(TALE)(参见Kay 等人(2007)Science，318：648-651和美国专利公开号20110239315)。 这些蛋白含有DNA结合域和转录激活域。最为充分表征的TALE之 一是来自野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种(Xanthomonas campestgris pv.Vesicatoria)的AvrBs3(参见Bonas等人(1989)Mol Gen Genet，218：127-136和WO2010079430)。TALE含有串联重复的集 中化域，每一重复含有约34个氨基酸，它们是这些蛋白的DNA结 合特异性的关键。此外，它们含有核定位序列和酸性转录激活域(综 述参见Schornack S等人(2006)J Plant Physiol，163(3)：256-272)。此 外，在致植物病细菌烟草青枯菌(Ralstonia solanacearum)中，已发现烟草青枯菌生物变型(biovar)1菌株GMI1000和生物变型4菌株 RS1000中称为brg11和hpxl7的两个基因与黄单胞菌属(Xanthomonas) 的AvrBs3家族同源(参见Heuer等人(2007)Appl and Envir Micro， 73(13)：4379-4384)。这些基因在核苷酸序列方面彼此98.9％同一， 但区别为hpxl7重复域中的1,575bp缺失。但是，两种基因产物与黄 单胞菌属的AvrBs3家族蛋白的序列同一性都低于40％。本文描述的 锌指核酸酶结合在TCR基因中。表5和表6(参见实施例4)描述了 已经工程化而结合到人类TCR基因中的核苷酸序列的大量锌指结合域。每一行描述了单独的锌指DNA结合域。在第一列中示出了每一 域的DNA靶序列(DNA靶位点以大写字母指示；未接触的核苷酸以 小写字母指示)，以及第二到第五列示出该蛋白中每一锌指(F1到F4 或者F5或者F6)的识别区域的氨基酸序列(根据螺旋的起点，氨基 酸-1到+6)。在第一列中还提供了每一蛋白的标识号。
还描述结合到TCR基因中的TALEN。表14(参见实施例10) 描述了已经工程化而结合到人类TCR基因中的核苷酸序列的 TALEN。每一行描述具有包含RVD的域的标识号的单独的TALE DNA-结合蛋白。在第一列中示出每一域的DNA靶序列(DNA靶位 点以大写字母指示；未接触的核苷酸以小写字母指示)。在第一列中 还提供每一蛋白的标识号。
如下所述，在某些实施方案中，如表5和表6中所示的四指或五 指结合域，或者如表14中所示的TALE DNA-结合域被融合到切割半 域，诸如例如IIs型限制性内切核酸酶(诸如FokI)的切割域。一对 此类锌指或者TALE/核酸酶半域融合被用于靶向切割，如例如在美国 专利号8,586,526和美国公开号20050064474中所公开的。
对于靶向切割，结合位点的近边可以通过5个或更多核苷酸对来 分开，并且每一融合蛋白质可结合至DNA靶标的相反链。
此外，来自这些天然存在的或者工程化核酸酶的域还可被分离并 且以不同组合使用。例如，来自天然存在的或者工程化归巢内切核酸 酶或者大范围核酸酶的DNA结合域可融合到异源切割域或者半域 (例如，来自另一种归巢内切核酸酶、大范围核酸酶或者TypeIIS内 切核酸酶)。这些融合蛋白还可与如上所述的锌指核酸酶结合使用。
本文描述的核酸酶可靶向到任何TCR基因组序列中的任何序 列。
B.切割域
核酸酶可包含异源DNA结合和切割域(例如，锌指核酸酶； TALEN、大范围核酸酶DNA结合域和异源切割域)，或者可选地天 然存在的核酸酶的DNA结合域可被改变而结合到所选定的靶位点 (例如，大范围核酸酶已经被工程化而结合到与同源结合位点不同的 位点的)。在某些实施方案中，核酸酶是大范围核酸酶(归巢内切核 酸酶)。天然存在的大范围核酸酶识别15-40碱基对的切割位点并且 通常分为四个家族：LAGLIDADG家族、GIY-YIG家族、His-Cyst 盒家族与HNH家族。示例性归巢内切核酸酶包括I-SceI、I-CeuI、 PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、 I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。它们的识别序列是已知的。还参见 美国专利号5,420,032；美国专利号6,833,252；Belfort等人(1997) Nucleic Acids Res.，25：3379-3388；Dujon等人(1989)Gene，82：115-118；Perler等人(1994)Nucleic Acids Res.，22：1125-1127； Jasin(1996)TrendsGenet.，12：224-228；Gimble等人(1996)J.Mol. Biol.，263：163-180；Argastet等人(1998)J.Mol.Biol.，280：345-353， 以及新英格兰生物实验室目录。
来自天然存在的大范围核酸酶的DNA结合域，主要是来自 LAGLIDADG家族的DNA结合域，已在植物、酵母、果蝇、哺乳动 物细胞和小鼠中用于促进位点特异基因组修饰，但该方法局限于修饰 保留大范围核酸酶识别序列的同源基因(Monet等人(1999)，Biochem.Biophysics.Res.Common.，255：88-93)或已经导入识别序列预先工 程化的基因组(Route等人(1994)，Mol.Cell.Biol.，14：8096-106； Chilton等人(2003)，Plant Physiology.，133：956-65；Puchta等人(1996)， Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：5055-60；Rong等人(2002)，Genes Dev.， 16：1568-81；Gouble等人(2006)，J.Gene Med.，8(5)：616-622)。因此，已尝试工程化大范围核酸酶使其在医学或生物技术相关位点呈现 新型结合特异性(Porteus等人(2005)，Nat.Biotechnol.，23：967-73； Sussman等人(2004)，J.Mol.Biol.，342：31-41；Epinat等人(2003)， Nucleic Acids Res.，31：2952-62；Chevalier等人(2002)Molec.Cell， 10：895-905；Ashworth等人(2006)Nature，441：656-659；等人(2007)Current Gene Therapy，7：49-66；美国专利公开号 20070117128；20060206949；20060153826；20060078552；和 20040002092)。此外，天然存在或工程化来自大范围核酸酶的DNA 结合域也已和来自异源核酸酶(例如，FokI)的切割域操作性连接。
在其它实施方案中，核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)。ZFN包含已 经经工程化而结合到所选基因中的靶位点的锌指蛋白，以及切割域或 者切割半域。
如上所述，锌指结合域可经工程化而结合到所选择的序列。参见 例如，Beerli等人(2002)Nature Biotechnol.，20：135-141；Pabo等 人(2001)Ann.Rev.Biochem.，70：313-340；Isalan等人(2001)Nature Biotechnol.，19：656-660；Segal等人(2001)Curr.Opin.Biotechnol.， 12：632-637；Choo等人(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.，10：411-416。 相较于天然存在的锌指蛋白，工程化锌指结合域可具有新型的结合特 异性。工程化方法包括但不限于合理设计与各种选择类型。合理设计 包括例如利用包含三体(或四体)核苷酸序列和个别锌指氨基酸序列 的数据库，其中各三体或四体核苷酸序列与一种或多种结合该特定三 体或四体序列的锌指氨基酸序列相关联。参见，例如美国专利 6,453,242和6,534,261，在此通过引用整体并入。
示例性选择方法包括噬菌体展示和双杂交系统，公开于美国专利 5,789,538；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,410,248；6,140,466； 6,200,759和6,242,568；以及WO98/37186；WO 98/53057；WO 00/27878；WO 01/88197和GB 2,338,237。此外，锌指结合域结合特 异性的增强已经在例如美国专利号6,794,136中有所描述。
靶位点的选择；ZFN，以及融合蛋白(和编码融合蛋白的多核苷 酸)的设计与构建方法是本领域中的技术人员已知的并且在美国专利 号7,888,121和8,409,861中详细描述，在此通过引用整体并入。
此外，如在这些和其它参考文献中所公开的，锌指域和/或多指 锌指蛋白可使用任何合适的接头序列连接在一起，包括例如长度为5 个或更多个氨基酸的接头。例如参见美国专利号6,479,626；6,903,185； 以及7,153,949来了解长度为6个或更多个氨基酸的示例性接头序列。 本文所述的蛋白可包括该蛋白的个别锌指之间的合适接头的任何组 合。
在一些实施方案中，核酸酶是工程化TALEN。已经公开用于工 程化这些蛋白质以与使用者选择的靶序列进行稳健的、位点特异性相 互作用的方法和组合物(参见美国专利号8,586,526)。
核酸酶如ZFN、TALEN和/或大范围核酸酶还包含核酸酶(切割 域，切割半域)。如上所述，切割域可以与DNA结合域是异源的， 例如锌指或者TALE DNA-结合域和来自核酸酶的切割域或大范围核 酸酶DNA结合域，以及来自另一不同的核酸酶的切割域。异源切割 域可获自任何内切核酸酶或外切核酸酶。可衍生出切割域的示例性内 切核酸酶，包括但不限于限制性内切核酸酶和归巢内切核酸酶。参见 例如，马萨诸塞州贝弗利(Beverly,MA)的NEB公司的2002-2003产 品目录；和Belfort等人(1997)Nucleic Acids Res.，25：3379-3388。已 知切割DNA的其它酶(例如，S1核酸酶；绿豆核酸酶；胰DNA酶 I；微球菌核酸酶；酵母HO内切核酸酶；还参见Linn等人编，Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993)。可将这些酶的一种或多种 (或其功能性片段)用作切割域和切割半域的来源。
类似地，需要二聚化才具有切割活性的切割半域可衍生自任何核 酸酶或其部分，如上所述。一般说来，如果融合蛋白包含切割半域， 则切割需要两个融合蛋白。或者，可使用包含两个切割半域的单个蛋 白。这两个切割半域可衍生于相同内切核酸酶(或其功能性片段)， 或各切割半域可衍生自不同的内切核酸酶(或其功能性片段)。此外， 优选地将两种融合蛋白的靶位点相对彼此排列，从而这两种融合蛋白 与其各自相应的靶位点的结合将切割半域放置为能使切割半域形成 功能性切割域(例如，通过二聚化)的彼此空间定位。因此，在某些 实施方案中，这些靶位点的近边是用5-8个核苷酸或者用15-18个核 苷酸分离的。然而，两个靶位点间可间插有任何整数数量的核苷酸或 核苷酸对(例如，2至50个核苷酸对或更多)。一般说来，切割位点 位于靶位点之间。
可将一种或多种这些酶(或其功能性片段)用作切割域和切割半 域的来源。类似地，需要二聚化才具有切割活性的切割半域可衍生自 任何核酸酶或其部分，如上所述。一般说来，如果融合蛋白包含切割 半域，则切割需要两个融合蛋白。或者，可使用包含两个切割半域的 单个蛋白。这两个切割半域可衍生自相同内切核酸酶(或其功能性片 段)，或各切割半域可衍生自不同的内切核酸酶(或其功能性片段)。 此外，优选地将两种融合蛋白的靶位点相对彼此排列，从而这两种融 合蛋白与其各自相应的靶位点的结合将切割半域放置为能使切割半 域形成功能性切割域(例如，通过二聚化)的彼此空间定位。因此， 在某些实施方案中，这些靶位点的近边是用5-8个核苷酸或者用15-18 个核苷酸分离的。然而，两个靶位点间可间插有任何整数数量的核苷 酸或核苷酸对(例如，2至50个核苷酸对或更多)。一般说来，切割 位点位于靶位点之间。
限制性内切核酸酶(限制性酶)存在于许多物种，并且能够序列 特异性结合DNA(在识别位点处)，并在结合位点处或其附近切割 DNA。某些限制性酶(例如，IIS型)在从远离识别位点的位点处切 割DNA并且具有可分离的结合与切割域。例如，IIS型酶FokI催化DNA的双链切割，在一条链上距其识别位点9个核苷酸处切割，而 在另一条链上距其识别位点13个核苷酸处切割。参见例如，美国专 利5,356,802；5,436,150和5,487,994；以及Li等人(1992)Proc.Natl. Acad.Sci.USA，89：4275-4279；Li等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2764-2768；Kim等人(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 91：883-887；Kim等人(1994b)J.Biol.Chem.，269：31,978-31,982。 因此，在一个实施方案中，融合蛋白包含来自至少一种IIS型限制性 酶的切割域(或切割半域)和一个或多个经或未经工程化的锌指结合 域。
FokI是示例性IIS型限制性酶，其切割域可与结合域分离。该特 定的酶为二聚体时有活性。Bitinaite等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci. USA，95：10,570-10,575。因此，出于本发明内容的目的，所公开的 融合蛋白中所用的FokI酶的部分被视为切割半域。因此，对于使用 锌指-FokI融合体的靶向双链切割和/或靶向细胞序列置换，可使用各 自包含某FokI切割半域的两种融合蛋白来重建催化活性的切割域。 或者，也可使用含有锌指结合域和两个FokI切割半域的单一多肽分 子。使用锌指-FokI融合体进行靶向切割和靶向序列改变的参数在本 发明内容中另行提供。
切割域或切割半域可以是保留切割活性或保留多聚化(例如，二 聚化)能力以形成功能性切割域的蛋白的任何部分。
示例性IIS型限制性酶在美国专利公开号20070134796中有所描 述，在此通过引用整体并入。其它的限制性酶还含有可分离的结合与 切割域，并且这些酶在本公开内容中也有所设想。参见例如，Roberts 等人(2003)Nucleic Acids Res.，31：418-420。
在某些实施方案中，切割域包含一个或多个工程化切割半域(也 称作二聚化域突变体)，其将同源二聚作用降至最小或阻止同源二聚 作用，例如，如美国专利号7,888,121；8,409,861；以及美国专利公 开号20080131962中所描述，所有该专利的公开内容在此通过引用整 体并入。在FokI的446、447、479、483、484、486、487、490、491、 496、498、499、500、531、534、537和538位的氨基酸残基都是影 响FokI切割半域二聚化的靶标。
形成专性杂二聚体的示例性工程化FokI切割半域包括以下一对： 第一切割半域包括FokI的490和538位氨基酸残基处的突变，和第 二切割半域包括486和499氨基酸残基处的突变。
因此，在某些实施方案中，490位的突变将Glu(E)替换为Lys(K)； 538位的突变将Iso(I)替换为Lys(K)；486位的突变将Gln(Q)替换为 Glu(E)；而499位的突变将Iso(I)替换为Lys(K)。具体地，制备本文 所述工程化切割半域是通过在一个切割半域的490位突变(E→K)和 538位突变(I→K)来产生名为“E490K：I538K”的工程化切割半域， 并通过另一切割半域的486位突变(Q→E)和499位突变(I→L)来产生 名为“Q486E：I499L”的工程化切割半域。本文所述的工程化切割半 域是专性杂二聚体突变体，其异常切割降至最低或被消除。参见例如 美国专利号7,888,121，其公开内容通过引用整体并入用于所有目的。
本文所述的工程化切割半域是使用任何合适的方法制备的，例如 如美国专利号7,888,121中所描述的通过野生型切割半域(Fok I)的 定点突变。
本文所述的工程化切割半域可为专性杂二聚体突变体，其异常切 割降至最低或被消除。参见例如，WO 07/139898的实施例1。在某 些实施方案中，工程化切割半域包含在486、499和496位(根据野 生型FokI编号)的突变，比如以下突变：将野生型486位的Gln(Q)残基替换为Glu(E)残基，野生型499位的Iso(I)残基替换为Leu(L)残 基，以及野生型496位的Asn(N)残基替换为Asp(D)或Glu(E)残基 (还分别称作“ELD”和“ELE”域)。在其它实施方案中，工程化切割半 域包括在490、538和537位(根据野生型FokI编号)的突变，比如以 下突变：将野生型490位的Glu(E)残基替换为Lys(K)残基，野生型 538位的Iso(I)残基替换为Lys(K)残基，以及野生型537位的His(H) 残基替换为Lys(K)或Arg(R)残基(还分别称作“KKK”和“KKR”域)。 在其它实施方案中，工程化切割半域包括在490和537位(根据野生 型FokI编号)的突变，比如以下突变：将野生型490位的Glu(E)残 基替换为Lys(K)残基，野生型537位的His(H)残基替换为Lys(K) 或Arg(R)残基(还分别称作“KIK”和“KIR”域)。本文所述的工程化切 割半域可用任何合适的方法制备，例如通过如美国专利号7,888,121； 和美国专利公开号20080131962；以及20110201055所描述的定点诱 变野生型切割半域(FokI)来制备。
或者，核酸酶可使用所谓的“分裂酶(split-enzyme)”的技术(参 见例如，美国专利公开号20090068164)在核酸靶位点处体内组装。 这类分裂酶的组分可在单独的表达构建体上表达，或者可以连接于个 别的组分相互分开的某一开放读框中，例如，组分由自切割2A肽或 IRES序列分开。组分可以是个别的锌指结合域或大范围核酸酶核酸 结合域的域。
或者，可使用被称为“Sharkey”的FokI核酸酶域变体(参见Guo 等人，(2010)J.Mol.Biol.doi:10.1016/j.jmb.2010.04.060)。
可使用本领域已知的方法容易地设计核酸酶表达构建体。参见例 如，美国专利号7,888,121和8,409,861，以及美国专利公开号 20030232410；20050208489；20050026157；20060063231；和 20070134796。在某些实施方案中，核酸酶的表达可以在可诱导的启 动子的控制下，例如，半乳糖激酶启动子在棉子糖和/或半乳糖的存 在下被活化(解除抑制)而在葡萄糖存在下被抑制。特别地，半乳糖 激酶启动子在碳源连续改变时(例如，从葡萄糖到棉子糖到半乳糖) 被诱导并且表达核酸酶。可诱导启动子的其它非限制性实例包括 CUP1、MET15、PHO5，以及tet反应启动子。
CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列/Cas(CRISPR关联的) 核酸酶系统是近来基于可用于基因组工程学的细菌系统的工程化核 酸酶系统。核酸酶系统是基于许多细菌和古生菌(archea)的部分适应 性免疫反应。当病毒或者质粒侵入细菌时，侵入物的DNA片段通过 ‘免疫反应’而转变为CRISPR RNA(crRNA)。此crRNA然后经由部分 互补的区域而与另一类型的RNA(被称为tracrRNA)关联，从而将 Cas9核酸酶导向靶DNA(被称为“前间区序列(protospacer)”)中与 crRNA同源的区域。Cas9切割DNA以在由crRNA转录本中含有的 20个核苷酸的导向序列规定的位点处双链断裂(DSB)产生平端。Cas9 需要crRNA和tracrRNA两者以用于位点特异性DNA识别和切割。 此系统现已经工程化，而使得crRNA和tracrRNA可结合成一个分子 (“单导向RNA”)，以及单导向RNA的crRNA等效部分可经工程化 以导向Cas9核酸酶来靶向任何所需的序列(参见Jinek等人(2012) Science，337：第816-821页；Jinek等人(2013),eLife，2：e00471； 以及David Segal(2013)eLife，2：e00563)。因此，CRISPR/Cas系统 可经工程化以在基因组中所需的靶标处引起DSB，以及DSB的修复 可受到修复抑制剂使用的影响而导致错误倾向修复增强。
A.靶位点
如上文详细描述的，ZFN和TALEN中的DNA域可经工程化而 结合到基因座中任何所选的序列。相较于天然存在的DNA结合域， 工程化DNA结合域可具有新型的结合特异性。工程化方法包括但不 限于合理设计与各种选择类型。合理设计包括例如利用包含三体(或四体)核苷酸序列和个别(例如，锌指)氨基酸序列的数据库，其中 各三体或四体核苷酸序列与结合该特定三体或四体序列的DNA结合 域的一种或多种氨基酸序列相关联。参见，例如美国专利8,586,526； 6,453,242和6,534,261，在此通过引用整体并入。还可进行TAL效应 域的合理设计。参见，例如美国专利号8,586,526。
适用于DNA结合域的示例性选择方法包括噬菌体展示和双杂交 系统，公开于美国专利5,789,538；5,925,523；6,007,988；6,013,453； 6,410,248；6,140,466；6,200,759和6,242,568；以及WO 98/37186； WO 98/53057；WO 00/27878；和WO 01/88197。
靶位点的选择；核酸酶，以及融合蛋白(和编码融合蛋白的多核 苷酸)的设计与构建方法是本领域中的技术人员已知的并且在美国专 利号7,888,121和8,409,861中详细描述，在此通过引用整体并入。
此外，如在这些和其它参考文献中所公开的，DNA结合域(例 如，多指锌指蛋白)可使用任何合适的接头序列连接在一起，包括例 如长度为5个或更多个氨基酸的接头。例如参见美国专利号 6,479,626；6,903,185；以及7,153,949来了解长度为6个或更多个氨 基酸的示例性接头序列。本文所述的蛋白可包括该蛋白的个别DNA 结合域之间的合适接头的任何组合。还参见，美国专利号8,586,526。
另外，单导向RNA可通过本领域熟知的用于产生特异RNA序 列的方法经工程化以结合到基因组中所选择的靶标。这些单导向 RNA被设计成将Cas9导向到任何选定的靶位点。
供体
如上所述，还可进行外源序列(也被称为“供体序列”或“供体”) 的插入，以例如用于校正突变基因或者用于增加野生型基因的表达。 将容易显而易见的是供体序列通常与其所位于的基因组序列并非同 一的。供体序列可包含侧接于两个同源区域的非同源序列，以允许在 受关注位置处进行有效HDR。另外，供体序列可包含含有与细胞染 色质中受关注区域并非同源的序列的载体分子。供体分子可包含若干 与细胞染色质同源的不连续区域。例如，对于通常在受关注区域中不 存在的序列的靶向插入，序列可存在于供体核酸分子中并且侧接于受 关注区域中的序列同源的多个区域。或者，供体分子可通过非同源的 端连接(NHEJ)机制而被整合到经切割的靶基因座中。参见例如，美国 专利公开号20110207221和20130326645。
供体多核苷酸可为DNA或者RNA，单链或者双链，以及可被以 直链或环状形式导入细胞中。参见例如，美国专利公开号 20100047805；20110281361；以及20110207221。如果以直链形式导 入，则可通过本领域中的技术人员已知的方法来保护供体序列的末端 (例如，防止被外切核酸降解)。例如，可将一个或多个双脱氧核苷 酸残基添加到直链分子的3’端和/或将自补的低聚核苷酸连接到一个 或者两个末端。参见例如，Chang等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci. USA，84：4959-4963；Nehls等人(1996)Science，272：886-889。用 于保护外源多核苷酸不被降解的其它方法包括但不限于添加端氨基， 以及使用经修饰的核苷酸间连接，如例如硫代磷酸、氨基磷酸酯和邻 甲基核糖或者脱氧核糖残基。
可将多核苷酸作为具有附加序列的载体分子的组成部分而导入 细胞中，附加序列为如例如复制起点、启动子和编码抗生素抗性的基 因。而且，供体多核苷酸可作为裸核酸导入，作为与药剂如脂质体或 者泊洛沙姆复合的核酸导入，或者可用病毒(例如，腺病毒、AAV、 疱疹病毒、逆转录病毒、慢病毒，以及整合酶缺陷的慢病毒(IDLV)) 递送。
一般插入供体以使得在整合位点处由内源启动子驱动供体的表 达，即供体插入到驱动内源基因表达的启动子(例如，AAVS1、CCR5、 白蛋白、HPRT等)。然而，将显而易见的是，供体可包含启动子和/ 或增强子，例如组成型启动子或者可诱导的启动子或者组织特异性启 动子。
可将供体分子插入内源基因中，以使得所有、一些或者没有内源 基因被表达。例如，可将如本文所述的转基因插入内源基因座，以使 得一些(连接到转基因的N端和/或C端)或者没有内源序列例如作 为与转基因的融合体而被表达。在其它实施方案中，将转基因(例如， 有或者没有如编码内源基因的附加编码序列)整合到任何内源基因座 例如安全港基因座中。
当内源序列(内源的转基因或者作为转基因的组成部分)与转基 因一起表达时，内源序列可为全长序列(野生型或者突变型)或者部 分序列。优选地内源序列是功能性的。这些全长或者部分序列的功能 的非限制性实例包括用转基因(例如，治疗基因)表达的多肽的血清 半衰期延长和/或充当载体。
另外，虽然不要求表达，但是外源序列也可包含转录或者翻译调 节序列，例如启动子、增强子、隔离子、内部核糖体进入位点、编码 2A肽和/或多腺苷酸化信号的序列。
递送
可用任何合适的手段将本文描述的组合物(例如，ZFP、TALE、 CRISPR/Cas)、编码组合物的多核苷酸、任何供体多核苷酸递送到包 含TCR基因的靶细胞中。用于递送包含DNA结合域的组合物的方法 在例如美国专利号6,453,242；6,503,717；6,534,261；6,599,692；6,607,882；6,689,558；6,824,978；6,933,113；6,979,539；7,013,219； 以及7,163,824中有所描述，这些公开内容在此通过引用整体并入。
还可使用包含编码锌指、TALE或者CRISPR/Cas蛋白中的一种 或多种的序列的载体来递送如本文所描述的锌指、TALE或者 CRISPR/Cas蛋白。也可类似地递送编码供体的多核苷酸。可使用任 意载体系统，包括但不限于质粒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、 腺病毒载体、痘病毒载体；疱疹病毒载体以及腺相关病毒载体等。还 参见美国专利号6,534,261；6,607,882；6,824,978；6,933,113；6,979,539； 7,013,219；和7,163,824，在此通过引用整体并入。另外，将显而易 见的是，这些载体中的任一个可包含一种或多种锌指蛋白编码序列、 一种或多种CRISPR/Cas编码序列或者一种或多种TALE编码序列。 因此，当将一种或多种核酸酶或者核酸酶系统和/或供体导入细胞时， 核酸酶或者核酸酶系统和/或供体可在相同载体上携带或者在不同载 体上携带。当使用多个载体时，每一载体可包含编码一种或多种ZFP、 TALE、CRISPR/Cas系统和/或供体的序列。
可以使用传统的基于病毒和非病毒的基因转移方法来将编码工 程化ZFP、TALE、CRISPR/Cas和/或供体的核酸导入细胞(例如， 哺乳动物细胞)和靶组织中。此类方法还可用来体外施用编码ZFP、 TALE、CRISPR/Cas和/或供体的核酸于细胞中。在某些实施方案中，编码ZFP、TALE、CRISPR/Cas和/或供体的核酸可以施用于体内或 离体基因治疗用途。非病毒载体递送系统包括DNA质粒、裸核酸， 以及与递送工具(诸如，脂质体或者泊洛沙姆)复合的核酸。病毒载 体递送系统包括DNA病毒和RNA病毒，这两种病毒在递送到细胞 后具有附加体或整合的基因组。关于基因治疗方法的概述参见 Anderson，Science，256：808-813(1992)；Nabel&Felgner,TIBTECH， 11：211-217(1993)；Mitani&Caskey,TIBTECH，11：162-166(1993)； Dillon，TIBTECH，11：167-175(1993)；Miller，Nature，357： 455-460(1992)；Van Brunt，Biotechnology，6(10)：1149-1154(1988)； Vigne，Restorative Neurologyand Neuroscience，8：35-36(1995)；Kremer &Perricaudet，British Medical Bulletin，51(1)：31-44(1995)；Haddada 等人，in Current Topics in Microbiology andImmunology，Doerfler和 编(1995)；以及Yu等人，Gene Therapy，1：13-26(1994)。
核酸的非病毒递送方法包括电穿孔、脂转染、微注射、基因枪、 病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸共轭物、裸 DNA、mRNA、人工病毒颗粒以及介质增强DNA摄取。使用例如 Sonitron2000系统(Rich-Mar)的声孔效应也可以用于核酸递送。在优 选实施方案中，一种或多种核酸是作为mRNA递送的。使用加帽的 mRNA来增加翻译效率和/或mRNA稳定性也是优选的。ARCA(抗- 反向帽类似物)帽或者其变体是尤其优选的。参见美国专利US7074596和US8153773，该专利在此以引用方式并入。
其它示例性的核酸递送系统包括由Biosystems公司(德 国科隆(Cologne,Germany))、Maxcyte公司(马里兰罗克威尔(Rockville, Maryland))、BTXMolecular Delivery Systems公司(马萨诸塞州霍利 斯顿(Holliston,MA))以及CopernicusTherapeutics公司(参见例如 US6008336)提供的那些。脂转染描述于例如US5,049,386、US 4,946,787；以及US 4,897,355)中，并且脂转染试剂市场上有售(例 如，TransfectamTM、LipofectinTM和LipofectamineTM RNAiMAX)。适 用于多核苷酸有效受体识别脂转染的阳离子和中性脂质包括 Felgner，WO 91/17424、WO 91/16024中描述的那些。递送可以是到 细胞(离体施用)或靶组织(体内施用)。
脂质：核酸复合物，包括靶向的脂质体如免疫脂质复合物的制备 是本领域中的技术人员熟知的(参见，例如Crystal,Science，第270： 404-410(1995)；Blaese等人，CancerGene Ther.，2：291-297(1995)； Behr等人，Bioconjugate Chem.，5：382-389(1994)；Remy等人， Bioconjugate Chem.，5：647-654(1994)；Gao等人，Gene Therapy，2： 710-722(1995)；Ahmad等人，Cancer Res.，52：4817-4820(1992)； 美国专利号4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、 4,501,728、4,774,085、4,837,028以及4,946,787)。
其它的递送方法包括使用将待递送的核酸包装至EnGeneIC递送 工具(EDV)中。这些EDV使用双特异性抗体特异性地向靶组织递送， 其中该抗体的一个臂具有对于靶组织具有特异性，并且另一个臂具有 对于EDV的特异性。抗体将EDV带入靶细胞表面，然后通过胞吞作 用将EDV带入细胞中。一旦在细胞中，就将释放内含物(参见 MacDiarmid等人(2009)Nature Biotechnology，27(7)：第643页)。
使用基于RNA病毒或者DNA病毒的系统来递送编码工程化 ZFP、TALE和/或供体的核酸利用将病毒靶向到人体中的特异细胞并 且将病毒有效负载运输到细胞核中的高度进化过程。可将病毒载体直 接施用于患者(体内)，或者病毒可用于体外处理细胞，然后将经修 饰的细胞施用于患者(离体)。用于递送ZFP的传统的基于病毒的系 统包括但不限于用于基因转移的逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病 毒载体、腺相关病毒载体、牛痘载体和单纯性疱疹病毒载体。可能用 逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒基因转移方法整合入宿主基因组， 这常常导致插入的转基因的长期表达。另外，在许多不同细胞类型和 靶组织中已经观测到高转导效率。
可通过引入外来的包膜蛋白、扩展靶细胞的潜在靶群体来改变逆 转录病毒向性(tropism)。慢病毒载体是能够转导或感染非分裂细胞的 逆转录病毒载体，并且一般产生高病毒效价。逆转录病毒基因转移系 统的选择取决于靶组织。逆转录病毒载体由顺式作用长端重复组成， 其包装容量高达6-10kb的外来序列。最小的顺式作用LTR足以复制 和包装载体，然后用LTR将治疗基因整合入靶细胞，以提供永久的 转基因表达。广泛采用的逆转录病毒载体包括基于鼠白血病病毒 (MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、人体免 疫缺陷病毒(HIV)，以及其组合的那些载体(参见例如Buchscher等人，J.Virol.，66：2731-2739(1992)；Johann等人，J.Virol.，66： 1635-1640(1992)；Sommerfelt等人，Virol.，176：58-59(1990)；Wilson 等人，J.Virol.，63：2374-2378(1989)；Miller等人，J.Virol.，65： 2220-2224(1991)；PCT/US94/05700)。在优选瞬时表达的应用中，可 采用基于腺病毒的系统。基于腺病毒的载体能够在许多细胞类型中非 常高效地转导，并且不需要细胞分裂。已经用这种载体获得了高效价 和高水平表达。可在相对简单的系统中大量产生此类载体。腺相关病 毒(“AAV”)载体也用于以靶核酸转导细胞，例如在体外产生核酸和肽， 以及用于体内和离体基因治疗方法(参见例如West等人，Virology， 160：38-47(1987)；美国专利No.4,797,368；WO 93/24641；Kotin， Human GeneTherapy，5：793-801(1994)；Muzyczka，J.Clin.Invest.， 94：1351(1994)。许多公开，包括美国专利号5,173,414；Tratschin等 人，Mol.Cell.Biol.，5：3251-3260(1985)；Tratschin等人，Mol.Cell.Biol.， 4：2072-2081(1984)；Hermonat和Muzyczka，PNAS，81： 6466-6470(1984)；和Samulski等人，J.Virol.，63：03822-3828(1989) 中描述了重组AAV载体的构建。
在临床试验中，目前至少有六种病毒载体方式可用于基因转移， 它们利用的方法涉及用插入辅助细胞系的基因补充缺陷载体，以产生 转导物质。
pLASN和MFG-S是已经用于临床试验的逆转录病毒载体的实例 (Dunbar等人，Blood，85：3048-305(1995)；Kohn等人，Nat.Med.， 1：1017-102(1995)；Malech等人，PNAS，94：22 12133-12138(1997))。 PA317/pLASN是用于基因治疗试验的第一种治疗载体。(Blaese等人， Science，270：475-480(1995))。在MFG-S包装载体中观察到的转导 效率为50％或更高。(Ellem等人，Immunol Immunother.，44(1)： 10-20(1997)；Dranoff等人，Hum.GeneTher.，1：111-2(1997)。
本文描述的适用于导入多核苷酸的载体还包括非整合的慢病毒 载体(IDLV)。参见例如，Ory等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 93：11382-11388；Dull等人(1998)J.Virol.，72：8463-8471；Zufferyet 等人(1998)J.Virol.，72：9873-9880；Follenzi等人(2000)Nature Genetics，25：217-222；美国专利公开号20090117617。
重组腺相关病毒载体(rAAV)是有希望的可选的基因递送系统，它 基于缺陷型和非致病性细小病毒腺相关型病毒。所有载体都来源于仅 保留侧接于转基因表达盒的AAV145bp末端反向重复的质粒。由于 整合入转导细胞的基因组中，有效的基因转移和稳定的转基因递送是 这种载体系统的关键特征。(Wagner等人，Lancet，351：9117 1702-3(1998)；Kearns等人，Gene Ther.，9：748-55(1996))。还可根 据本发明使用其它AAV血清型，包括AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、 AAV6和AAV8、AAV8.2、AAV9和AAV rh10，以及假病毒AAV， 诸如AAV2/8、AAV2/5以及AAV2/6。
在某些实施方案中，载体是慢病毒载体。如本文所用的慢病毒载 体是包含来源于慢病毒的至少一个组成部分的载体。慢病毒的详细列 表可在Coffin等人(1997)“Retroviruses”Cold Spring Harbour Laboratory Press，JM Coffin、SM Hughes、HEVarmus编，第758-763)中找到。 慢病毒载体一般可用本领域中熟知的方法产生。参见例如美国专利号 5,994,136；6,165,782；和6,428,953。优选地，慢病毒载体是整合酶 缺陷的慢病毒载体(IDLV)。参见例如美国专利公开2009/0117617。 IDLV可如所描述的，例如使用包含天然慢病毒整合酶基因中的一个 或多个突变的慢病毒载体来产生，例如如在Leavitt等人(1996)J. Virol.，70(2)：721-728；Philippe等人(2006)Proc.Natl Acad.Sci USA， 103(47)：17684-17689；以及WO 06/010834中所公开的。在某些实 施方案中，IDLV是包含整合酶蛋白的64位处的突变的HIV慢病毒 载体(D64V)，如在Leavitt等人(1996)J.Virol.，70(2)：721-728中所 描述的。
在某些实施方案中，载体是腺病毒载体。可用于本申请案中的 Ad载体的非限制性实例包括重组Ad载体(诸如E1缺失的)、有条 件复制能力Ad载体(诸如，溶瘤细胞的)和/或来源于人类或者非人 类血清型的复制型Ad载体(例如，Ad5、Ad11、Ad35，或者猪腺病 毒-3)；和/或嵌合的Ad载体(诸如Ad5/F35)，或者趋性改变的Ad 载体，趋性改变的Ad载体具有工程化纤维(例如，节结或者轴)蛋 白(诸如，节结蛋白的HI环中的肽插入物)。“无病毒基因的”Ad载 体也是可用的，例如其中已经去除所有腺病毒基因以减少免疫原性和 增加DNA有效负载的大小的Ad载体。这允许例如同时递送编码ZFN 的序列和供体序列。此类“无病毒基因的”载体在供体序列包括待经由 靶向整合来整合的大型转基因时尤其有用。
可产生高效价的复制缺陷型重组腺病毒载体(Ad)，它们容易感染 许多不同细胞类型。将大部分腺病毒载体工程化，以使转基因替代Ad E1a、E1b和/或E3基因；随后在反式提供一种或多种缺失的基因 功能的细胞中增殖复制缺陷型载体。例如，人293细胞提供E1功能。 Ad载体可体内转导多种组织类型，包括非分裂、分化细胞，如肝、 肾和肌肉中存在的那些细胞。常规Ad载体具有大容纳量。临床试验 中使用Ad载体的一个实例包括用肌肉内注射进行抗肿瘤免疫的多核 苷酸治疗(Sterman等人，Hum.Gene Ther.，7：1083-1089(1998))。
使用包装细胞形成能够感染宿主细胞的病毒颗粒。这种细胞包括 293细胞、ψ2细胞或PA317细胞，293细胞能包装腺病毒，PA317细 胞能包装逆转录病毒。通常用将核酸载体包装到病毒颗粒中的生产细 胞系来产生用于基因治疗的病毒载体。载体通常含有用于包装和随后 整合入宿主(如果可行)所需的最小病毒序列，其它病毒序列被编码待 表达蛋白的表达盒所替代。包装细胞系反式提供丧失的病毒功能。例 如，用于基因治疗的AAV载体通常仅具有来自AAV基因组的、包装 和整合入宿主基因组所必需的端反向重复(ITR)序列。将病毒DNA包 装到含有辅助质粒的细胞系中，该辅助质粒编码其它AAV基因，即 rep和cap，但没有ITR序列。也用腺病毒作为辅助者感染该细胞系。 辅助病毒促进AAV载体的复制和来自辅助质粒的AAV基因的表达。 由于缺少ITR序列，不能大量包装辅助质粒。可通过(例如)热处理降 低腺病毒污染，腺病毒对热处理的敏感性高于AAV。另外，可使用 杆状病毒系统以临床规模产生AAV(参见美国专利号U.S. 7,479,554)。
在临床试验中使用腺病毒载体进行基因转移的其它实例包括 Rosenecker等人，Infection，24：1 5-10(1996)；Welsh等人，Hum.Gene Ther.，2：205-18(1995)；Alvarez等人，Hum.Gene Ther.，5：597-613 (1997)；Topf等人，Gene Ther.，5：507-513(1998)。
在某些实施方案中，Ad载体是嵌合的腺病毒载体，包含来自两 种或更多种不同的腺病毒基因组的序列。例如，Ad载体可为Ad5/F35 载体。Ad5/F35是通过用来自B亚族腺病毒(诸如，例如Ad35)的 相应纤维蛋白质基因替代Ad5的一个或多个纤维蛋白基因(节结， 轴、尾部、五邻体)而创建的。Ad5/F35载体和此载体的特性在例如 Ni等人，(2005)“Evaluationof biodistribution and safety of adenovirus vectors containing group B fibersafter intravenous injection into baboons,”Hum Gene Ther，16：664-677；Nilsson等人(2004) “Functionally distinct subpopulations of cord blood CD34+cells aretransduced by adenoviral vectors with serotype 5or 35tropism,”Mol Ther，9：377-388；Nilsson等人(2004)“Development of an adenoviral vector system withadenovirus serotype 35tropism；efficient transient gene transfer into primarymalignant hematopoietic cells,”J Gene Med， 6：631-641；Schroers等人(2004)“Genetransfer into human T lymphocytes and natural killer cells by Ad5/F35chimericadenoviral vectors,”Exp Hematol，32：536-546；Seshidhar等人(2003) “Developmentof adenovirus serotype 35as a gene transfer vector,” Virology，311：384-393；Shayakhmetov等人(2000)“Efficient gene transfer into human CD34(+)cells by aretargeted adenovirus vector,”J Virol，74：2567-2583；以及Sova等人(2004),“Atumor-targeted and conditionally replicating oncolytic adenovirus vectorexpressing TRAIL for treatment of liver metastases,”Mol Ther，9：496-509中有所描述。 如上所述，ZFN和编码这些ZFN的多核苷酸可被递送到任何靶细胞。 一般来说，为了钝化基因CCR-5，细胞是免疫细胞，例如淋巴细胞(B 细胞，T细胞如T辅助细胞(TH)和T细胞毒性细胞(TC)，裸细胞如自 然杀伤(NK)细胞)；单核细胞(大单核细胞、巨噬细胞)；粒细胞(粒 性白细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)；肥大细胞； 和/或树突状细胞(郎格罕氏细胞、间质树突状细胞、指突状树突细 胞、外周血树突细胞)。巨噬细胞、B淋巴细胞和树突状细胞是TH细 胞激活中所涉及的示例性抗原递呈细胞。在某些实施方案中，靶细胞 是TH细胞，特征为CD4在细胞表面上的表达。靶细胞还可为造血干 细胞，造血干细胞可产生任何免疫细胞。
在许多基因治疗应用中，需要以高度特异性将基因治疗载体递送 至特定组织类型。因此，可修饰病毒载体，使其通过表达配体而具有 对给定细胞类型的特异性，该配体与病毒外表面上的病毒外壳蛋白形 成为融合蛋白。选择配体，使其对已知存在于受关注细胞类型上的受 体具有亲合力。例如Han等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92： 9747-9751(1995)报道，可修饰莫洛尼鼠白血病病毒以表达融合于gp70 的人调蛋白，并且该重组病毒能感染表达人表皮生长因子受体的某些 人乳腺癌细胞。这个原理可延用于其它病毒-靶细胞对，其中靶细胞 表达一种受体，而病毒表达包含该细胞表面受体的配体的融合蛋白。 例如，可工程化丝状噬菌体，以呈现对基本上任何所选细胞受体都具 有特异性结合亲合力的抗体片段(如FAB或Fv)。虽然上述描述主 要应用于病毒载体，但同样的原理也可应用于非病毒载体。可工程化 此类载体，使其含有有利于特靶向细胞摄取的特异性摄取序列。
可通过给予单个患者，一般是通过全身给药(例如，静脉内、腹 膜内、肌内、皮下或颅内输注)或局部应用来体内递送基因治疗载体， 如下所述。或者，可将载体离体递送至细胞中，例如，从单个患者体 内取出细胞(例如，淋巴细胞、骨髓吸取物、组织活检)或通用供体 造血干细胞，然后，通常在选择并入载体的细胞后将细胞再植入患者。
本领域技术人员熟知用于诊断、研究或基因治疗的离体细胞转染 (如通过将转染细胞再输注到宿主生物体中)。在一个优选实施方案 中，从受试者生物体中分离细胞，用ZFP核酸(基因或cDNA)转染， 再输注回受试者生物体(例如，患者)内。本领域技术人员熟知适用 于离体转染的各种细胞类型(参见例如Freshney等人，Culture of Animal Cells，AManual of Basic Technique(第3版，1994))，其中引 用的参考文献是关于如何分离和培养患者细胞的论述)。
合适的细胞包括但不限于真核和原核细胞和/或细胞系。此类细 胞或者从此类细胞产生的细胞系的非限制性实例包括COS、CHO(例 如，CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11、CHO-DUKX、CHOK1SV)、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、 HaK、NS0、SP2/0-Ag14、HeLa、HEK293(例如，HEK293-F、 HEK293-H、HEK293-T)，以及perC6细胞，以及昆虫细胞诸如草地 贪夜蛾(Spodoptera fugiperda)(Sf)，或真菌细胞诸如酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)和裂殖酵母属 (Schizosaccharomyces)。在某些实施方案中，细胞系是CHO-K1、 MDCK或HEK293细胞系。另外，可分离和离体使用原代细胞，以在用核酸酶(例如，ZFN或者TALEN)或者核酸酶系统(例如， CRISPR/Cas)进行处理之后将细胞再导入待治疗的受试者体内。合 适的原代细胞包括外周血单核细胞(PBMC)，以及其它的血细胞亚群， 诸如但不限于T淋巴细胞，如CD4+T细胞或者CD8+T细胞。合适 的细胞还包括干细胞，诸如，举例来说，胚胎干细胞、诱导性多能干 细胞、造血干细胞(CD34+)、神经干细胞和间充质干细胞。
在一个实施方案中，干细胞用于离体细胞转染和基因治疗的方 法。采用干细胞的优点是它们可在体外分化为其它细胞类型，或者可 被导入哺乳动物(诸如细胞供体)中，随后可移入骨髓中。使用细胞 因子如GM-CSF、IFN-γ和TNF-α使CD34+细胞体外分化为临床上重 要的免疫细胞类型的方法是已知的(参见Inaba等人，J.Exp.Med.， 176：1693-1702(1992))。
用已知方法分离用于转导和分化的干细胞。例如，用结合不需要 的细胞，如CD4+和CD8+(T细胞)、CD45+(泛B细胞(panB cell))、 GR-1(粒细胞)和Iad(分化的抗原递呈细胞)的抗体淘选骨髓细胞，从而 从骨髓细胞中分离干细胞(参见Inaba等人，J.Exp.Med.，176： 1693-1702(1992))。
在一些实施方案中还可使用已经修饰的干细胞。例如，已经对凋 亡具有抗性的干细胞可被用作治疗性组合物，其中干细胞还包含本发 明的ZFP、TALE、CRISPR/Cas系统和/或供体。对凋亡的抗性可例 如通过以下方式发生：使用BAX-的核酸酶或者BAK-特异性核酸酶(参见，美国专利公开号2010/0003756)敲除干细胞中的BAX和/ 或BAK，或者干细胞再用例如半胱天冬酶-6特异性ZFN敲除半胱天 冬酶中断裂的BAX和/或BAK。或者，还可通过使用半胱天冬酶抑 制剂如Z-VAD-FMK(苄氧羰基-缬氨酰-丙氨酰-天冬氨酰[邻甲基]-氟 甲基酮)来实现对凋亡的抗性。
也可向生物体直接施用含有治疗性ZFP、TALE、CRISPR/Cas系 统和/或供体核酸的载体(例如，逆转录病毒、腺病毒、脂质体等)以 体内转导细胞。或者，可施用裸DNA或者mRNA。可通过常用于将 分子导入成与血液或组织细胞最终接触的任何途径施用，包括但不限 于注射、输注、局部施用和电穿孔。施用此类核酸的合适方法可用并 且为本领域中的技术人员熟知，并且，虽然可使用一种以上的途径施 用特定组合物，但是一种特定途径往往可提供比另一种途径更直接且 更有效的反应。
例如，在美国专利号5,928,638中公开了将DNA导入造血干细 胞中的方法。将转基因导入造血干细胞(例如，CD34+细胞)中有用的 载体包括35型腺病毒。
将转基因导入免疫细胞(例如，T细胞)中的合适载体包括非整合 慢病毒载体。参见，例如，Ory等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 93：11382-11388；Dull等人(1998)J.Virol.，72：8463-8471；Zuffery 等人(1998)J.Virol.，72：9873-9880；Follenzi等人(2000)Nature Genetics，25：217-222。
医药学上可接受的载体是部分地由施用的特定组合物，以及用于 施用组合物的特定方法所确定的。因此，如下所述，存在多种多样的 可用医药组合物的合适制剂(参见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，第17版，1989)。
应用
所公开的方法和组合物可用于钝化TCR基因组序列。如上所述， 钝化包括部分或者完全抑制细胞(例如，T淋巴细胞)中内源TCRα 和/或β基因的表达。TCR基因的钝化可通过例如以下方式来实现： 通过单一切割事件；通过切割后进行非同源末端连接；通过在两个位 点处切割后连接，以便使两个切割位点之间的序列缺失；通过将错义 或者无义密码子靶向重组到编码区域中；通过将不相关的序列(即， “填充物”序列)或者另一受关注编码序列靶向重组到基因或者基因的 调节区域，以便使基因或者调节区域断裂；或者通过将剪接受体序列 靶向重组到内含子中以造成转录本的错误剪接。内源TCR基因的钝 化还可通过靶向重组一个或多个特异于受关注肿瘤抗原/MHC复合 物的TCR基因来实现。
存在各种用于核酸酶介导的TCR基因钝化(敲除或敲减)的应 用。例如，本文描述的方法和组合物允许细胞系的生成和/或修饰(用 于治疗和非治疗用途)。一个或多个内源TCR基因的钝化可与编码高 亲合力TCR或者抗已知靶标的嵌合抗原受体(CARS，参见Cartellieri 等人(2010)J Biomed and Biotech，第2010卷，文章编号956304)的 基因的插入相结合，以及生成的转基因细胞(或者具有相同特性的这 些细胞的子代)可用作细胞治疗剂。或者，可使用递送供体核酸上编 码TCR特异核酸酶和高亲合力TCR的基因的病毒载体，在体内进行 T细胞的重新靶向。不论哪种情况，都可使用本发明的材料和方法来 治疗癌症。体外修饰细胞还可用于模型研究或者用于筛选以找到还可 与TCR修饰协同作用的其它类型的治疗剂。可治疗任何类型的癌症， 包括但不限于肺癌、胰腺癌、肝癌、骨癌、乳腺癌、结直肠癌、白血 病、卵巢癌、淋巴瘤、脑癌等。可用本发明的技术治疗的其它疾病包 括真菌、细菌和病毒感染，以及身免疫性疾病和/或移植物抗宿主病 (GvHD)。
此外，本文描述的方法和组合物可用于生成模式生物体和细胞 系，包括在任何给定的生物体中生成稳定的敲除细胞。虽然 ZFN/TALEN/CRISPR/Cas系统提供在细胞系或者模式生物体中敲除 任何给定基因的能力，但是在不存在选择标记的情况下，这些事件是非常罕见的。因此，本文所描述的方法显著升高了靶基因断裂率，该 方法可用于生成具有新特性的细胞系。此方法包括用于产生生物样仓 鼠(CHO)细胞系的细胞系或者用于产生若干AAV血清型样人类 HEK 293细胞或者昆虫细胞样Sf9或者Sf21的细胞系。
本发明的方法和组合物还可用于产生转基因生物体。转基因动物 可包括开发用于疾病模型的那些转基因动物，以及具有所需性状的动 物。可使用本发明的方法和组合物处理胚胎，以开发转基因动物。在 一些实施方案中，合适的胚胎可包括来自小型哺乳动物(例如，啮齿 动物，兔子等)、同伴动物、家畜和灵长类动物的胚胎。啮齿动物的 非限制性实例可包括小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠和豚鼠。同伴动物的非 限制性实例可包括猫、狗、兔子、刺猬，以及雪貂。家畜的非限制性 实例可包括马、山羊、绵羊、猪、骆驼、羊驼，以及牛。灵长类动物 的非限制性实例可包括卷尾猴属、黑猩猩、狐猴、猕猴、绒猴、金丝 猴、蜘蛛猿、松鼠猴，以及长尾黑颌猴。在其它实施方案中，合适的 胚胎可包括来自鱼、爬行动物、两栖动物或者禽类的胚胎。或者，合 适的胚胎可为昆虫胚胎，例如果蝇胚胎或者蚊虫胚胎。
实施例
实施例1：经优化的、高亲合力WT-1TCR构建体的表达
将编码特异于HLA-A2限制的Wilms肿瘤抗原1(WT1)肽(具 体地，WT1126-134肽(Kuball等人(2007)Blood，109(6)：2331-8))的 密码子优化的、用半胱氨酸修饰的TCR的基因和WT1特异性TCR α21或者β21单链克隆到双向自钝化转移载体pCCLsin.PPT.ΔLNGFR.minCMV.WPGK.eGFP.Wpre或者pCCLsin.cPPT.ΔLNGFR.min.CMV.h EF1a.eGFP.Wpre，如在Amendola等人(2005)Nature Biotechnology， 23(1)：108-116；Thomas等人(2007)J.Immunol，179(9)：5803-5810； 以及美国专利公开NoUS2006200869中所描述的(参见图1分图A)。
使用整合酶型的第三代慢病毒载体系统包装载体，以及用VZV 包膜假型化，基本上如Follenzi和Naldini(2002)，Methods in Enzy mology346：454-465中所描写的。随后使用标准技术(见下文)来用 慢病毒载体转导细胞，并且细胞特征为FACs分析以确定外源TCR 是否正在细胞表面上表达。
如下表1所示，无论是由PGK/mCMV双启动子组合还是由 EF1α/mCMV双启动子构建体驱动，WT-1特异性TCR构建体都高度 表达。表中的数字呈现为在针对VB21表达和WT1-HLA-A2五聚体 结合设门的象限中存在的总信号的百分比。
表1：WT-1TCR的表达
T细胞的转导是通过用抗CD3/抗CD28抗体共轭的磁性珠粒 (Clin ExVivo CD3/CD28；Invitrogen)(baCD3/CD28)激活细胞而实 现的，其中细胞是在含有低剂量IL-7/IL-15和10％FCS的IMDM (GIBCO-BRL)培养基中培养的，如在欧洲专利公开No EP1956080 和Kaneko等人(2009)Blood，113：1006-1015中所描述的。此方法保 留早期T细胞分化表型(CD45RA-/+CD62L+、CD28+CD27+、IL7Ra+、 IL-2+γIFN-/+)，并且细胞从未转导的淋巴细胞无差别地增殖。在这 些条件下，PGK双启动子被证明在支持WT1特异性TCR链的化学 计量表达方面优于EF1a双启动子，这表明沿反义方向，PGK双向启 动子比双向EF1α启动子发挥更高的活性。然而，当在慢病毒载体的 背景下测试时这两种启动子，在初始刺激超过70天之后，支持在适 合于有效的HLA-A2/WT1五聚体结合的水平的TCR表达(16％)(参 见图1分图B)。
TCR转导细胞还能够表现出抗来自AML患者的WT1+HLA-A2+ 原代白血病细胞的特异γIFN产生和细胞毒素活性。特别地，在用以 PGK/mCMV双启动子组合或者EF1α/mCMV双启动子表达转基因 TCR的载体转导的细胞中γIFN的产量增多(图2A)，γIFN的产量被 表示为TCR修饰的细胞的杀伤(细胞溶解)％(图2B和图2C)。此 外，在表达HLA限制元件的未标记靶标的存在下，并且用靶肽致敏 时，经编辑淋巴细胞中的γIFN产生被抑制。
实施例2：转基因到中枢记忆T细胞的CCR5基因座中的有效 整合
为了测试将WT-1特异性TCR基因整合到中枢记忆T细胞中的 想法，首先使用GFP作为供体核酸来监测转导效率和整合位点的GFP 表达。选择CCR5基因座是因为已经示出CCR5敲除细胞是全功能性 的(参见美国专利号7,951,925)。此外，PPP1R12C(AAVS1)基因座 类似地被靶向的(参见美国专利公开20080299580)。使用IDLV载体 将编码GFP的供体转导到细胞中，以及使用Ad5/F35载体将CCR5 特异性ZFN或者AAVS1特异性ZFN导入细胞，如上所述。在转导 20天之后测量GFP表达。
如图3所示，ZFN介导的GFP转基因整合导致GFP信号增多， 包括涉及与所使用的Ad5/F35供体的量(分图A和分图B)。下表2 示出在供体或者供体加ZFN的存在下，GFP阳性细胞的百分比增加。
表2.GFP信号，阳性细胞百分比
插入位点 UT +供体 供体+ZFN
CCR5 0.038 0.083 6.11
AAVS1 0.015 0.18 4.38
实施例3：WT-1特异性TCR转基因到Jurkat TCRβ-阴性细胞 的CCR5基因座中的整合
随后将WT-1特异性TCR转基因构建体靶向整合到用TCR-β特 异性ZFN处理后呈TCRβ-阴性的Jurkat细胞的CCR5基因座中。使 用标准技术，用类似于实施例1中所描述的WT-1TCR构建体转染细 胞。
如从表3可看出的，在导入WT-1TCR供体(WT1-TCR IDLV) 和CCR5特异性ZFN(Ad-ZFN)之后，存在Vβ21染色或者信号显 著的增加，而在没有供体或者ZFN时，仅看到背景Vβ21信号。因此， ZFN介导的WT-1特异TCR整合到CCR5基因座中，这在相当大百 分比的细胞中存在。
表3：Vβ21+表达的总信号的百分比
实施例4：TCR特异性ZFN的设计
TCR特异性ZFN被构建成能在TCRα和/或TCRβ基因处双链断 裂的位点特异性导入。ZFN被设计和并入到质粒或IDLV载体中，基 本上如在Urnov等人(2005)Nature，435(7042)：646-651；Lombardo 等人(2007)Nat Biotechnol.Nov，25(11)：1298-306；以及美国专利公开2008/0131962中所描述的。示例性ZFN对的识别螺旋和靶序列在 下表4和下表5中示出。TCR锌指设计的靶位点在第一列中示出。 与ZFP识别螺旋接触的靶位点中的核苷酸以大写字母指示，而未接 触的核苷酸以小写字母指示。
表4：TCR-α锌指设计
表5：TCR-β锌指设计
实施例5：体外ZFN活性
使用表4和表5中描述的ZFN来测试K562细胞中的核酸酶活性。 为了检测切割活性，将编码如上所述的成对人类TCR特异ZFN的质 粒转染到K562细胞中。K562细胞获自美国典型培养物保藏中心并 且如所建议的在补充有10％合格的胎牛血清(FBS，Cyclone)的RPMI 培养基(Invitrogen)中生长。对于转染，将一百万个K562细胞与2μg 的锌指核酸酶质粒和100μL的Amaxa溶液V(Amaxa Solution V)混合。 在Amaxa核转染仪IITM(AmaxaNucleofector IITM)中使用程序T-16转 染细胞，然后将细胞回收到1.4mL温热的RPMI培养基+10％FBS中。
收获基因组DNA，并且对涵盖预期切割位点的TCR基因座部分 进行PCR扩增，PCR扩增是使用购自Invitrogen的Accuprime HiFi 聚合酶如下进行的：在94℃下最初3分钟变性后，经94℃下30秒二 次变性步骤，接着是58℃下30秒二次退火步骤，接着是68℃下30 秒二次延伸步骤进行30个PCR循环。完成30个循环后，在68℃下 使反应孵育7分钟，然后无限期地在4℃下孵育。
通过例如在美国专利公开号20080015164、20080131962和 20080159996中描述的Cel-I测定来检查来自经K562TCR特异性ZFN 处理的细胞的基因组DNA。
K562细胞中的TCRβ基因座具有两个具有高度序列相似性的功 能性拷贝(TRBC1和TRBC2)，功能性拷贝都由TCRβ特异ZFN靶 向。参见图4分图B。因此最初，将特异地扩增特异地来自TRBC1 基因或者TRBC2基因的预期ZFN切割位点的周围区域的PCR引物 被用于分别分析对这两种基因进行ZFN驱动切割之后的NHEJ活性。 关于ZFN对16787和16783的示例性结果提供于下表6中。
表6：成对TCRβ-特异ZFN的NHEJ活性：对TRBC1和TRBC2 的分析
在表6中提供的数据显示ZFN基本上平均地切割TRBC1和 TRBC2基因。
此外，我们通过在转染之后3天和10天时收获样本而测试了 K562细胞中ZFN介导修饰的TRBC的存活率。结果提供于下表7中， 并且显示对于ZFN对16787和16783，靶基因修饰在转染后10天时 是稳定的。
表7：K562细胞中的TCRβ特异性ZFN
在输入不同数量的ZFN(各ZFN为0.4μg或者0.1μg)之后，分 析靶向TRBC的若干ZFN对的NHEJ活性。如图5所示，所有检测 的ZFN对表现出高活性。在本实验中，细胞在用ZFN转导之后，用 30℃的孵育期进行处理(参见美国专利公开号：20110129898)。在 对K562细胞中的TCRβ特异性ZFN切割进行分析之后，在CD4+ 或者CD8+成熟T细胞中检测若干ZFN对。简言之，CD8+或者CD4+ 细胞是从AllCells购买的，并且在RPMI+10％FBS+1％L-谷氨酰胺(30mg/mL)+IL-2(30μg/mL，Sigma)中培养并允许休息4-24小时。
慢病毒载体被构建成包含受关注ZFN对。慢病毒载体是从HIV 来源的自钝化载体构建体产生的，并且使用携带D64V突变体的HIV 整合酶包装，然后用VSV-G包膜假型化，如上所述。Ad5/F35腺病 毒载体是在使用2A序列和巨细胞病毒内部启动子克隆两组ZFN之后如先前所描述的产生的(Perez等人，(2008)，Nature Biotechnology， 26：808-816。参见例如，Holst J等人(2006)Nat Protoc.，1(1)：406-17。 1e6细胞/核转染是按照制造商的规定与AmaxaTM核转染试剂盒(AmaxaTM Nucleofection kit)一起用于每一转导的。在核转染12-24小 时之后，根据制造商的方案(Invitrogen公司)用抗CD3/CD28珠粒 激活细胞，然后使细胞在包含补充有的5ng/mL的IL-7和IL-15 (Peprotech公司)的10％FCS的IMDM(GIBCO-BRL公司)培养 基中生长。
在核转染后3天时收获细胞，并且使用Cel-I测定确定基因修饰 效率，测定如在国际性专利公开WO 07/014275中所描述的进行。还 参见Oleykowski等人(1998)NucleicAcids Res.，26：4597-4602；Qui 等人(2004)BioTechniques，36：702-707；Yeung等人(2005) BioTechniques，38：749-758。若干ZFN对具有良好的活性，如用Cel-I 测定所测量的(NHEJ为4-11.9％)。
还体外检测TCR-α特异性ZFN，如上。在转导之后，孵育在将 孵育温度变换到30℃之前，在37℃孵育下孵育细胞1天，如上所述。 参见，美国专利公开号20110129898。这些ZFN靶向到TRAC基因， 对接受如上所述的这些ZFN的各种组合的K562细胞进行的Cel-I测 定的结果显示出高活性。参见图6。
实施例6：细胞中TCR-β的断裂
然后在实验中使用TCR-β特异性ZFN来特异地靶向TCR基因 座。初始实验被设计用于使Jurkat细胞中的TCR基因座断裂。将 TCR-β特异性ZFNS 16783和16787导入到整合酶缺陷型慢病毒载体 (IDLV)上，以瞬时表达TRBC靶向的ZFN。在激活后48小时，基于 对载体制备中的HIV Gag p24的测量，用0.25μg或者0.5μg剂量的 IDLV进行转导。在293T细胞上用载体DNA滴定法测得的载体感染 性处在从1到5×104个转导单位/ng p24的范围中。然后用FACS分析 测定细胞中CD3标记物的损失，以及根据制造商的说明使用具有抗 CD3MACS微珠(Miltenyi Biotec公司)的LD型细胞分选柱来富集 CD3(-)细胞。
如下表8所示，在用ZFN转导之后，在高达20％的经处理细胞 中存在对TCR/CD3复合物细胞表面表达的载体剂量依赖性抑制。
表8：用TCR-β特异性ZFN IDLV处理过的Jurkat细胞中的 CD3信号损失
未转化的 0.25μg IDLV 0.5μg IDLV
CD3(-)百分比 2.7 13.4 20.2
进行Cel-I测定，以及确认这些结果具有高达26％的TRBC等位 基因(18％的TRBC1和8％的TRBC2)在经ZFN处理的细胞中断裂 (参见图7A和图7B中的“混合”)。
接着，将TRBC ZFN(16783和16787)导入原代人类T淋巴细 胞，并且如在Jurkat细胞中所看到的，用FACS观测到类似水平的 CD3断裂。从健康供体收获外周血T细胞，以及用CD3和CD28共 轭珠粒激活细胞。在激活后48小时，将细胞暴露于剂量不断增加的 包含TRBC特异性ZFN的IDLV。然后在低剂量(5ng/mL)IL-7和 IL-15的存在下培养细胞以促进细胞存活和生长。在原代淋巴细胞中 高达7％的经处理细胞是CD3阴性的，而在未处理的对照中几乎未观 测到CD3(-)细胞，这些数据呈现在下表9中。
表9：用TCR-β特异性ZFN IDLV处理过的原代人类T淋巴细胞中 的CD3信号损失
UT 2.5μg IDLV 5μg IDLV 18.5μg IDLV
CD3(-)百分比 0.17 2.94 3.26 7.07
在IL7和IL15的存在下，所分选的CD3(-)淋巴细胞可随着时间 的推移而扩增和存活(参见图7C和图7D)，其中修饰百分比在图7D 中指示。图7E还表明CD3(-)细胞在群体中存留至少45天，并且还 示出在时间段期间在群体中保持为比较恒定的CD3(-)细胞的百分比。CD3(-)细胞似乎对非特异性促细胞分裂剂刺激不反应，因为由于CD3(+)淋巴细胞的扩增PHA刺激使细胞池中CD3(-)细胞的百分比减 小(图7F)。此结果显示CD3(-)细胞中不存在CD3功能信号。在表 现类似CD4/CD8比率的CD3(+)淋巴细胞和CD3(-)淋巴细胞中未观测 到表型差异。CD3(-)细胞还保持中枢记忆表型，因为它们对CD62L、 CD28和IL-7RA仍然是阳性的(参见下表10)。
表10：保持中枢记忆表型的CD3(-)细胞占总荧光强度的百分比
相较于初始T细胞，记忆T淋巴细胞较少取决于稳态增殖的TCR 信号；因此我们研究在不存在TCR表达的情况下，稳态性细胞因子 是否可促进先前激活的细胞的存活和生长。明显地，经TRBC-ZFN 处理的细胞可在补充有低剂量IL-7和IL-15的培养基中扩增，其中在 不存在TCR触发的情况下，CD3(-)细胞的比例保持稳定达50天以上。 因此，在原代淋巴细胞中ZFN暴露是被良好耐受的，并且导致靶向 TRBC基因的稳定断裂。因此，CD3(-)细胞被分选成几乎纯的，并且 在IL-7和IL-15存在下，以类似于CD3(+)细胞的生长速率进一步扩增3周以上，这显示稳态性细胞因子不需要TCR信号功能来促进先 前激活的细胞的存活/增殖。
这些数据显示成功产生了具有TCM的表型特性但是内源TCR的 表面表达被永久断裂的新型CD8T细胞群体。
实施例7：将WT-1特异性TCR导入到具有先前已永久断裂的 内源TCR的细胞中
在用TCRβ特异性ZFN和用于随机整合WT1-TCRβ转基因的 慢病毒处理之后，分选CD3(-)T淋巴细胞，如图1所述(49.5±30％ 平均值±标准偏差的转导效率，n＝4)。因此，在经TCRβ编辑的细胞 中，来自整合载体的转移WT1-TCR的表达挽救CD3的表面转位(图 8，第1行)。
相较于其中相对于多克隆扩增的未转导细胞没有表达所导入的 TCR的固有的生长优势的未编辑TCR经转移的淋巴细胞(图8，第2 行)，包含WT1-TCR的TCRβ链被断裂的细胞可通过多克隆刺激而 富集到大于90％的纯度，这指示TCRβ经编辑的细胞中转移TCR/CD3复合物的表面表达是必需的并且足以促进TCR介导的基因修饰细胞 扩增(图8，第1行)。外源WT1-TCR Vβ链(Vβ21)是在TCRβ链被 断裂的淋巴细胞中以相较于未编辑TCR经转移的细胞高大约2倍的 平均水平表达的，并且达到了类似于对照T细胞的内源Vβ21链的表 达水平，表达水平在培养期间被稳定地保持(图9分图A和图9分 图B)。因此，在用相同剂量的PGK-WT1LV转导之后，相较于仅2.6％ 的未编辑细胞结合WT1126-134五聚体，高达22％的TCR-β经编辑的淋 巴细胞结合WT1126-134五聚体(图9分图A，下方直方图)。
因此，在不存在来自内源TCRβ链的竞争的情况下，转基因TCR β链的表面表达达到生理学水平。为了验证TCR-β经编辑的淋巴细胞 的功能和亲合力，我们比较TCRβ链断裂的细胞与用相同PGK-WT1 LV转导以获得细胞溶解HLA-A2+靶标的能力的未编辑细胞， HLA-A2+靶标是用不断增加的WT1126-134肽浓度致敏的(参见图9分 图C)。此功能测定在效应物/靶标(E/T)比为12时，针对标记的T2 细胞的细胞溶解用51铬释放测定来测量活性，其中标记的T2细胞用 不断增加浓度的WT1126-134HLA-A2限制的肽致敏，或者用不相关的 CMV-来源的pp65494-503HLA-A2限制的肽(10μM，Proimmune公司) 致敏以作为阴性对照。
经编辑的T细胞被刺激以及在3周后进行检测，孵育以通过共孵 育5小时来识别所标记的T2细胞。TCRβ链断裂的细胞(在图9分 图C中表示为TCR经编辑的)相较于未编辑的(表示为TCR经转移 的)WT1LV经转导的细胞更为有效地杀伤靶标(EC50：经编辑的细 胞：90.51nM，具有95％CI：48.84-167.7；未编辑的TCR转移细胞： 269.1nM，具有95％CI；175.1-413.5)，这可能反映了转基因WT1TCR 在TCR-β经编辑的样本中具有较高的频率和表达水平。EC50是通过 使用GraphPad Prism软件的S形曲线剂量-应答公式对51铬释放数据 进行非线性回归分析而计算的。
结果被表示为细胞溶解％的平均SD(*＝p<0.05，**＝p<0.01，TCR 经编辑的n＝6，TCR经转移的n＝4)。为了在单细胞水平评价反应性， 分析细胞的Vβ21表达(参见下表11)，该表达显示，虽然载体拷贝 数完全相等，但是在TCR经编辑的细胞中Vβ21表达更高。
表11：TCR经转移淋巴细胞和TCR经编辑淋巴细胞中的TCR表达 和载体拷贝数/细胞
*通过流式细胞计术法测量TCR表达并且将其绘制为相对荧光 强度(RFI＝经转导细胞的Vβ21MFI/未转导细胞的VβMFI)。
§每细胞的载体拷贝(CpC)是通过如所描述的定量PCR测量的 (Kessels等人，(2001)Nature Immunol，2(10)：957-61)。
为了评价单细胞水平的同种异体反应性，从先前针对WT1126-134五聚体结合分选的TCR-β经编辑细胞和TCR经转移细胞分离和扩增 克隆体，以富集展示最优的外源TCR表达的细胞。将克隆体暴露于 用10nM的WT1125-134HLA-A2限制的肽致敏的T2细胞(左侧小图)， 或者以为1的刺激物/反应物比暴露于异源的PRMC(右侧小图)。特 异性斑点的数目在y轴上示出为在刺激物的存在下产生的斑点的数 目减去由效应物单独产生的斑点的数目(**＝p<0.01)。相较于TCR 经转移的细胞，TCRβ经编辑的克隆体显示出较低的同种异体反应性 (参见图10，比较分图A到分图B)，可能反映在不存在一个内源性 TCR链的情况下TCR错配的风险降低。
这些数据显示通过在具有受抑制的内源性TCR-β链表达的宿主 CTL中表达肿瘤特异性外源TCR提供了功能优势。
理论上，在TCR基因转移之后，未编辑的内源TCRα链的表面 重表达可仍然存在于TCR-β经编辑的细胞中。为了直接评价TCR-β 链断裂的淋巴细胞中错配的可能性，用编码仅WT1特异性TCRβ链 基因和ΔLNGFR标记物的LV(WT1-β-ΔLNGFR-LV)转导CD3(-)细胞。 转导效率是以ΔLNGFR+淋巴细胞的百分比来评价的(参见图11)。测 量ΔLNGFR+细胞上的Vβ21表达。指示Vβ21的平均荧光强度(MFI)。 虽然不存在WT1特异性α链，但是在高达83％的ΔLNGFR+TRBC断 裂细胞中检测到Vβ21表达，这显示甚至被插入具有TRBC断裂的细 胞中的经半胱氨酸修饰的TCRβ链能够与内源性TCRα链错配。
接着，使用CD3(-)淋巴细胞来将WT1-TCRβ供体构建体导入内 源TCR基因座。供体是如上所述构建的，并且与TCR-β特异性ZFN 结合使用以使得TCR-β转基因被整合到内源基因座处。细胞变成对 CD3和Vβ21.3TCRβ链两者是阳性的。
实施例8：TCR-α链的断裂和靶向整合
为了排除TCR链错配的可能，我们设计靶向到TCRα链基因 (TRAC)的恒定区的一对ZFN(图6)，且按照关于TCR-β编辑所描述 的相同方案)获得了TCR-α经编辑的T淋巴细胞(参见图12分图A)， 以及按照关于TCR-β编辑所描述的相同方案获得TCR-α经编辑的T 淋巴细胞(图12分图B、图12分图C和图13)。为了设计在每一链 断裂/置换步骤处允许快速分离工程化细胞的完整α/βTCR编辑方案， 我们产生一组携带WT1特异性TCRα或β单链的LV，并且使用IDLV 或者腺病毒载体(AdV)来在淋巴细胞中瞬时表达靶向到TRBC或者 TRAC的ZFN(图14示出了完整TCR编辑的时间线和代表性流程条 件/结果)。
CD3(-)细胞是由所测试的每一包含ZFN的载体有效产生的，并 且对核酸酶切割位点处的序列测序揭示在通过NHEJ修复之后存在 小型插入和缺失(indel)(图13)。为了进行完整的TCR编辑，选择被 证明比IDLV更有效地调节TCR基因断裂的AdV。首先在用baCD3/CD28激活后，将从健康供体收获的T细胞暴露于 TRAC-ZFN-Ad5/F35达48小时，然后在IL-7和IL-15的存在下培养， 以及用编码WT1-α链的LV(WT1-αLV)来转导通过分选分离所得的CD3(-)细胞(49±29&平均值±标准偏差的转导频率，n＝3)。
然后分选具有所挽救的CD3表达的细胞，用baCD3/CD28刺激 一个周期，以及然后暴露于TRBC-ZFN-Ad5/F35。第二周期ZFN暴 露产生了高达23±4％的新型CD3(-)细胞，指示原代T淋巴细胞容许 多周期ZFN调控。分选CD3(-)细胞，以及用WT1TCR-β链LV转导 CD3(-)细胞(18±7％平均值±标准偏差的转导效率，n＝3)。经转移的 WT1-β链的表达再次挽救CD3的表面转位，该表达现与TCR经编辑 细胞中的WT1-TCR Vβ链以均衡比例共表达(图14和图15)。与未 编辑的TCR经转移的淋巴细胞相比，TCR-α/β断裂的细胞可在TCR 基因转移之后通过多克隆刺激富集成几乎纯的，并且均匀地表达结合 WT1126-134五聚体所需的高水平WT1特异性TCR(参见图15)。
这些结果指示经转移的TCR/CD3复合物在TCR经编辑的细胞中 的表面表达是必需的并且足以促进具有WT1所需特异性的细胞的扩 增(图14，右侧绘图)。通过Cel-I分析来确认TCR-α/β经编辑的细 胞中的TCRα和β链的断裂。在TCR经转移和TCRα/β经编辑的淋 巴细胞中未观测到表型差异，淋巴细胞呈现TCM表面表型，由CD62L、 CD27、CD28和IL-7rα的高度表达所证明的。为了验证完全编辑的淋 巴细胞的功能和同种异体反应，对TCRα/β经编辑的和TCR经转移 的淋巴细胞进行多克隆刺激。
在多克隆刺激三周之后，将TCR-α/β经编辑的淋巴细胞和TCR 经转移的淋巴细胞暴露于i)用不断增加浓度的WT1126-134HLA-A2限 制的肽致敏，或者用不相关的CMV来源的pp65495-503HLA-A2肽致 敏的T2细胞(参见图16A，图式的右侧)或者ii)从用WT1126-134肽(50nM)致敏(虚线符号)或者未用WT1126-134肽(50nM)致敏(实 线符号)的AML患者收获的WT1+HLA-A2+(图16B中的黑色)或 者HLA-A2-(灰色)白血病细胞。图16C示出其中异源PBMC用作靶标的类似结果。所有测定是以1的刺激物/反应物比率进行的。特 异性斑点在y轴上示出为在刺激物的存在下产生的斑点减去由效应 单独产生的斑点。*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001。
实施例9：潜在的脱靶切割分析。
使用计算机模拟分析(In silico analysis)来识别TRAC特异性ZFN 和TRBC特异性ZFN对最可能的潜在脱靶切割位点，如在Perez等 人(同上)中所描述的。识别杂二聚体ZFN对或者同型二聚体对中包含 多达10个识别位点错配的位点，但是这些ZFN对最可能的潜在脱靶 位点是ZFN同型二聚体的所有靶标。被识别的最可能的潜在脱靶位 点示出于下表12(TRAC)和下表13(TRBC)中。
表12：TRAC特异性ZFN的潜在脱靶位点
表13：TRBC特异性ZFN的潜在脱靶位点
如图17和图18所示，相较于没有用ZFN表达载体转导的那些 脱靶位点样本(还相较于TRAC和TRBC基因座)，在已经用ZFN 处理的脱靶位点样本中不存在附加条带。因此，显而易见TRAC特 异性ZFN和TRBC特异性ZFN特异于其预期靶标。
实施例10：TRAC特异性TALEN和TRBC特异性TALEN
TRAC特异性TALEN和TRBC特异性TALEN是基本上如美国 专利号8,586,526所描述进行开发和组装的。碱基识别是使用规范 RVD碱基对应来实现的(“TALE编码”：NI对应A、HD对应C、NN 对应G(NK是半重复的)，NG对应T)。TALEN被构建在TALEN 主链的TAL效应DNA结合域的“+63”C-帽(C端截断)中，如美国 专利号8,586,526所描述的。所测试的TALEN的靶标和数字标识符 示出于下表14中。
表14：TRAC特异性TALEN和TRBC特异性TALEN
随后在K562细胞中成对地测试TALEN诱导内源TRAC和TRBC 染色体靶标修饰的能力，测试是通过如上文在实施例5中描述的Cel-I 测定来分析的。结果示出几乎所有的蛋白对是有活性的，并且TALEN 和ZFN具有在大致相同的范围中的活性。表15和表16示出了在用Cel 1测定检测的NHEJ％方面对成对TALEN的矩阵比较。
表15：TRAC特异性TALEN和TRBC特异性TALEN的活性
16A-TRAC(NHEJ％)
101511 101512 101513
101514 3.4 5.3 5.9
101515 5.9 8.9 8.3
101516 5.3 12.0 16.4
表16：TRBC(NHEJ％)
101536 101537
101539 8.5 0.0
101540 9.9 9.6
101541 15.0 9.9
实施例11：NY-ESO-1TCR修饰的T细胞
T细胞是由NY-ESO-1特异性TCR Vβ13所修饰的(参见，例如 Robbins等人(2011)JClin Oncol，29(7)：917-924)，并且监测工程化 TCR的表达。在该实验中，从健康志愿者分离T淋巴细胞，以及用 CD3和CD28抗体共轭珠粒激活T淋巴细胞。随后根据在Kaneko等 人(Blood(2009)，113(5)：第1006页)和在Bondanza等人(Blood(2011)， 117(24)：第6469页)中描述的方法，在5ng/mL的IL-7和5ng/mL 的IL-15的存在下培养细胞。随后用以下三种方式其中一种来处理细 胞：组1用包含NY-ESO1特异性、HLA-A2限制的TCRα链和TCR β链的第三代双向慢病毒载体(TCR-PGK-NYESO1LV)(参见 Amendola等人(2005)Nat.Biotechnol，23：108-116)进行转导，以产 生TCR‘经转移’的“TR”T细胞。组2在LV转导之前用包含特异于TRAC的ZFN(参见实施例6，ZFN 25539和25540)的腺病毒处理， 以及随后根据CD3信号的损失对组2进行分选。随后用 TCR-PGK-NYESO1 LV载体转导CD3-细胞，以产生“经单一编辑的”或者“SE”细胞群体。组3首先用包含如上所述的TRAC ZFN对25539/25540的腺病毒处理，然后根据CD3信号进行分选。CD3-细胞 随后用包含NY-ESO-1TCRα链的LV载体转导，以及再次根据CD3 信号进行分选。在这种情况下，CD3+细胞随后用baCD3/CD28珠粒 刺激，并暴露于包含TRBC ZFN对16787/16783的腺病毒，然后分选 不存在CD3表面转位的细胞。CD3-细胞随后用包含NY-ESO-1TCRβ 链的LV载体转导。因此，组3在没有任何内源的TCR复合物的情 况下唯一地表达NY-ESO-1特异性TCR，并且被称为“经完全编辑的” 或者“CE”群体。
用细胞荧光分析法来分析这三组细胞对外源Vβ13TCR的表达， 其中使用抗NY-ESO-1特异性Vβ13.1链的抗体来标记蛋白。未转导 的T细胞用作对照，以及数据可被表示为在经转导的T细胞中观测 到的平均荧光强度(MFI)比对照中观测到的MFI。经完全编辑的群体 显示最高的表达(参见，图19分图A)。
还测试了T细胞群体对MHC HLA-A2-NY-ESO1dextramer的结 合。MHC Dextramer由携带数量优化的MHC和荧光染料分子的右旋 糖苷聚合物主链构成。MHC Dextramer反应物比常规的MHC多聚体 携带更多的MHC分子和更多的荧光染料。这增强对特异性T细胞的 亲合力并且增强染色强度，从而增大了分辨度和信噪比。按照制造商 供应的方案(例如，Immudex肿瘤-睾丸抗原集合)来进 行染色。样本通过FACS Canto II流式细胞仪(BD Biosciences公司) 跑样，以及用Flow Jo软件(Tree star公司)分析数据。结果显示经 完全编辑的群体具有对NY-ESO1dextramer最大的亲合力(参见图19 分图B)。图19中的数据被表示为相对荧光强度(RFI)，意思是在样本 群体(经转移、经单一编辑或者经完全编辑的T细胞)中观测到的平 均荧光强度(MFI)与未转导T细胞中观测到的MFI之间的比率。使用 3个不同的供体进行三组连续实验。结果(图19分图C)显示CE群 体具有最高的信号。
另外，用FACS分析来分析细胞的表型标记，如在Cieri等人((2013) Blood，121：第573-584页)中所述。分析显示部分经修饰的T细胞 表现干记忆T(TSCM)细胞的表型，特征为CD45RA、CD62L和CD95 的共表达。
TCR经编辑的淋巴细胞的经完全编辑群体当用不断增加剂量的 NY-ESO1 157-165肽致敏时，在γ-IFN ELISpot测定(例如，人类 IFNγELISPOT Ready-SET-)中显示对同源抗原的 高亲合力。所使用的效应细胞是未转导的(UT)、经转移的、经单一编 辑的T细胞(SE)，以及经完全编辑的T细胞(CE)。结果示出于图20分图A，并且显示TCR经完全编辑(CE)的群体表现对肽的高亲合力。 T2细胞加载有不断增加浓度的NY-ESO-1 157-165肽，或者加载有来 源于Wilms肿瘤抗原1的无关WT1126-134肽(“T2-WT1126-134”)。
NY-ESO1重定向T细胞1随后由NY-ESO1+.HLA-A2+骨髓瘤细 胞系(U266)致敏，以验证其识别天然表达NY-ESO1抗原的肿瘤细胞 的能力。首先使用U266或者MM1S细胞系作为靶标来进行γ-IFN ELISpot(如上所述)(参见图20分图B)，测定显示相较于未转导的 T细胞，NY-ESO1重定向T细胞具有对相关HLA-A2+、NY-ESO1+ 细胞的高亲合力，并且几乎未检测到与MM1S细胞的结合。未观测 到对抗MM1S(HLA-A2-和NY-ESO1-)不相关靶细胞的识别。接着，使用如下标准方法进行51铬释放：在V形底96孔培养平板中将效应 子T细胞与骨髓瘤细胞系(MM1S和U266)一起孵育5小时，骨髓 瘤细胞系事先用51铬标记。特异性细胞溶解是根据以下公式表示的： 100×(平均实验溶解-平均天然溶解)/(平均最大溶解-平均天然溶解)。
结果(图20分图C和分图D)显示不同的群体能够引起相关靶 细胞U266的细胞溶解(图20分图C)，但是不能够造成不相关的靶 细胞MM1S的胞溶(图20分图D)。经完全编辑T细胞(CE)表现出 溶解适当的靶细胞的最大能力。
还在共培养实验中检测NY-ESO1重定向T细胞特异地杀伤NY-ESO1+、HLA-A2+肿瘤细胞的能力(参见图21)。在这个实验中， 在效应物/靶标比为1：1时，将效应T细胞与相关的U266细胞系 (“A2+ESO+”)或者不相关的MM1S细胞系(“A2-ESO-”)共培养4 天。结果显示重定向T细胞效应子能够阻遏相关的HLA-A2+、 NY-ESO1+细胞系的生长。图21分图B显示在U266HLA-A2+、 NY-ESO1+靶标的存在下经编辑的T细胞扩增2倍，而在不相关的 A2-ESO-对照的存在下经编辑的T细胞不扩增。
实施例12：经编辑T细胞的同种异体反应性
为了比较三个NY-ESO-1重定向T细胞群体的同种异体反应潜 能，在抗经辐射的同种异体外周血单核细胞(PBMC)的混合淋巴细胞 反应(MLR)中分别平板培养TCR经转移(转移)、TCR经单一编辑(SE) 和TCR经完全编辑(CE)的T细胞。将供体匹配的PBMC和mock经 转导的T细胞(UT)用作对照。在两个周期的刺激(S1 10天，S2 7天) 之后，在51Cr释放和γ干扰素(γ-IFN)Elispot测定中检测效应细胞对 用以相同同种异体靶标获得的PHA细胞系和自体同源细胞的反应。
同时，用以NY-ESO-1157-165致敏的HLA-A2+经辐射细胞刺激 NY-ESO-1重定向T细胞和对照。在两个周期的刺激(S1 10天，S2 7 天)之后，测试效应细胞对用以细胞对用以NY-ESO-1157-165肽致 敏(C)或者未致敏(D)的HLA-A2+T2细胞系的反应。
未观测到对自体同源细胞的反应。另外，如图22所示，转移T 细胞对异源靶标的细胞溶解作用显著高于SE和CE T细胞对异源靶 标的细胞溶解作用(p＝0.05)(图22分图A)。此外，γ-IFN Elispot 确证当同种异体刺激时转移T细胞和经编辑T细胞之间在分泌γ-IFN 方面存在统计上显著的差异，这表明剩余的内源多克隆TCR和在 TCR经转移T细胞的细胞表面上表达的可能错配的TCR可导致脱靶 反应性，而SE和CE T细胞则没有此类反应性。NY-ESO-1重定向T 细胞(转移、SE和CE)同样能够相较于溶解未致敏细胞(图22分 图D)以高特异性溶解用NY-ESO-1特异性肽致敏的T2细胞(图22 分图C)。
实施例13：体内实验
为了比较NY-ESO-1经单一编辑(SE)、经完全编辑(CE)和TCR经 转移(转移)的T细胞的体内效力和安全性，我们设置了基于以下步 骤的小鼠模型：注射多发性骨髓瘤(MM)U266细胞系(HLA-A2+、 NY-ESO-1+、hCD138+)，然后向经亚致死辐射的NSG小鼠施用T细 胞。简言之，在第0天通过尾静脉注射注入10×106个U266细胞。在 第3天小鼠接受静脉内注射以下物质：PBS(U266)，或者10×106 NY-ESO-1转移T细胞、SE T细胞、CE T细胞，或者供体匹配PBMC， 或者作为对照的供体匹配mock转导T细胞(UT)。最终一组小鼠接受 重定向到不由U266表达的WT1 126-134肽的10×106个经完全编辑的 T细胞(CEWT1)。每周至少3次监测小鼠的异种移植物抗宿主病 (GvHD)病征，并且在第70天没有任何病理性的病征的情况下处死小 鼠。由于将U266植入小鼠需要较长的时间，所以我们考虑仅评估在 第70天处死的动物的抗肿瘤反应。所有小鼠可视为是GvHD评价可 评估的。
结果示于图23A和23B。图23A示出通过对从安乐死小鼠的骨 髓收获的细胞进行细胞荧光分析识别的人类CD138+MM细胞的百 分比。在用NY-ESO1重定向T细胞处理的小鼠中，在骨髓中或者在 处死时的脾脏(未示出)中未检测到残留疾病，这显示NY-ESO1重 定向细胞具有体内效力。相较而言，注入PBS(U266)或者CE WT1T 细胞的所有小鼠在其骨髓中具有可检测出的肿瘤细胞。
在处死时所有器官被收集，用福尔马林固定，用苏木色素/伊红 染色，并且在用单克隆抗hCD3抗体和过氧化物酶共轭的第二步反应 物复染之后，通过免疫组织化学法同时分析，以检测任何可能的 GvHD活性和检查T细胞特异性。小鼠器官中的渗透物将指示T细胞的不适当归巢，以及潜在地GvHD的初始阶段。病理分级在从0(无 hCD3+细胞渗入)到3(大量和扩散的hCD3+细胞渗入)的范围内。 有趣的是，已发现人类CD3+T细胞渗入到注入传统的TCR转移T 细胞的5只动物中的3只的肺和肝中(“转移”)，这类似于在注入供 体匹配的未操纵PBMC(“PBMC”)的4只小鼠中的4只中或者注入 未转导的淋巴细胞(5只小鼠中的5只，“UT”)中观测到的渗入。相 反地，在用NY-ESO-1SE或者CE T细胞处理的小鼠的器官中未检测 淋巴细胞渗入(图23B)。
实施例14：使用mRNA电穿孔的TCR编辑
A.单一TCR编辑
通过核酸酶信息的mRNA电穿孔进行的TCR编辑是由如下评估 的。简言之，用抗CD3/CD28珠粒刺激来自外周血的人类T淋巴细 胞，并且在两天后用不断减少剂量的体外转录mRNA进行电穿孔， mRNA编码特异于TRAC基因或者TRBC基因的ZFN对。
处理时ZFN诱导的TCR断裂的程度被测量为在用TRAC-ZFN 处理(图24分图A中的左小图)和用TRBC-ZFN处理(图24分图 A中的右小图)的淋巴细胞中电穿孔后5天或者20天时CD3阴性细 胞的百分比。此外，还评估了在用TRAC-ZFN处理过的细胞(图24 分图B的左小图)中；在用TRBC-ZFN处理过的细胞(图24分图B 的中间小图)中；以及在对照细胞(图24分图B的右小图)中培养 期间经处理细胞的数目的成倍增加。另外，还评估刺激后第18天时的T细胞表面表型。T干记忆细胞(TSCM)被定义为CD62L+ CD45RA+(参见Gattinoni等人(2011)Nat Med.，17(10)：1290-7；以 及Cieri(2013)Blood，121(4)：573-84)；T中枢记忆(TCM)被定义为 CD62L+CD45RA-；T效应因子记忆(TEM)被定义为CD62L- CD45RA-，以及端效应因子(TEMRA)被定义为CD62L-CD45RA+。 UT：未处理的细胞；UT+E：mock电穿孔细胞；GFP：用编码GFP 的mRNA电穿孔的细胞。在所利用的mRNA剂量处，用TRAC ZFN 处理的细胞和用TRBC ZFN处理的细胞的表型组成不存在统计上显 著的差异(双向方差分析)。
B.TCR双重编辑
用抗CD3/CD28珠粒刺激来自外周血的人类T淋巴细胞，并且在两 天后用体外转录mRNA进行共同电穿孔，mRNA编码TRAC特异性 ZFN对和TRBC特异性ZFN对两者，如上所述。接着，进行分析以 量化经共处理的细胞中为CD3阴性部分的TCR-α和TCR-β经完全编 辑的细胞的量。简言之，在电穿孔后5天时，分别用编码α或者β NY-ESO特异性TCR链和报道基因(分别为LNGFR或GFP，在图 25A中示意性地描绘)的双向慢病毒载体(LV)分选和转导CD3阴性细胞。单一α或者β编辑的细胞分数被测量为当与外源TCRα或者β 互补时修复CD3表面表达的经转导细胞的百分比。CD3阴性总群体 中经完全编辑的细胞的量随后是通过减去两种单一编辑的细胞的百 分比来计算的。结果示出于图25A中，显示40％的经完全编辑细胞 群体在TCR-α基因和TCR-β基因两者处断裂。
在用包含专性的异源二聚体FokI域(ELD和KKR)或者它们的 相应直系同源版本(RDD和DRR)的TRAC特异性ZFN和TRBC 特异性ZFN mRNA进行共同电穿孔时CD3阴性(CD3-)细胞的百分 比。活细胞的百分比被计算为设门在单线态处的7-AAD阴性细胞的 百分比。此外，经编辑细胞在CD3阴性部分中的组成是使用如上所 述的LV报道基因策略计算的。结果示出在图25B中。
还在刺激后第18天确定如上所述T细胞的表面表型。T干记忆 细胞(TSCM)被定义为CD62L+CD45RA+(参见Gattinoni等人(2011) 同上；Cieri等人(2013)，同上)；T中枢记忆(TCM)被定义为CD62L+ CD45RA-；T效应记忆(TEM)被定义为CD62L-CD45RA-，以及端效 应子(TEMRA)被定义为CD62L-CD45RA+。UT：未处理的细胞。结 果示出于图25C。
还确定用所指示剂量的TRAC特异性ZFN mRNA和TRBC特异 性ZFN mRNA共同电穿孔的T细胞的生长曲线，生长曲线示出在共 同电穿孔次日细胞消亡的初始急性期之后，存活的细胞以与未处理的 (UT)对照类似的动力学继续在培养基中扩增(图25D)。
本文提及的所有专利、专利申请和出版物据此通过引用整体并 入。
虽然已经出于透彻了解的目的以图示和举例说明的方式相当详 细地提供了本公开内容，但是对本领域中的技术人员将显而易见的是 在不脱离本公开的精神或者范围的情况下可实现各种改变和修改。因 此，上述描述和实施例不应被理解为限制。

Claims (12)

1.一种分离的T淋巴细胞，其包含稳定整合的、编码T细胞受体α(TRAC)的外源序列，其中所述细胞中的至少一个内源TRAC基因由TALEN部分或者完全地钝化，所述TALEN包括TAL效应DNA结合域和切割域，所述结合域结合SEQ ID NO:147-149中所示的靶位，其中所述TAL效应DNA结合域相较于野生型TAL效应DNA域包含C端截断。
2.如权利要求1所述的分离的T淋巴细胞，其中，内源TCRβ基因被钝化。
3.如权利要求2中所述的分离的T淋巴细胞，其中，所述TCRβ基因被结合SEQ ID NO:150-153中所示靶位的TALEN钝化。
4.如权利要求1所述的分离的T淋巴细胞，其中使用整合酶缺陷的慢病毒载体(IDLV)、AAV、质粒或者mRNA将编码所述TALEN的多核苷酸导入所述细胞。
5.如权利要求1所述的分离的T淋巴细胞，其中将所述外源序列导入内源TCR基因、CCR5基因或者AAVS1基因。
6.如权利要求1所述的分离的T淋巴细胞，其中所述外源序列还包含肿瘤抗原特异性TCRβ转基因。
7.如权利要求6所述的分离的T淋巴细胞，其中所述肿瘤抗原包括NY-ESO1。
8.如权利要求1所述的分离的T淋巴细胞，所述外源序列编码肿瘤抗原特异性TRAC，所述肿瘤抗原包含NY-ESO1。
9.一种药物组合物，其包含：如权利要求1至8中任一项所述分离的T淋巴细胞。
10.一种生成如权利要求1至8中任一项所述的T淋巴细胞的方法，所述方法包括：
使用编码一种或多种TALEN的一个或多个多核苷酸钝化T淋巴细胞中的内源TRAC基因，所述TALEN包括TAL效应DNA结合域和切割域，所述结合域结合SEQ ID NO:147-149中所示的靶位，其中所述TAL效应DNA结合域相较于野生型TAL效应DNA域包含C端截断，其中所述TALEN切割所述内源TRAC基因；以及
将所述外源序列稳定地整合到所述T淋巴细胞的所述基因组中。
11.如权利要求10所述的方法，其中使用整合酶缺陷的慢病毒载体(IDLV)、逆转录病毒载体(RV)或者慢病毒载体(LV)将所述外源序列导入所述细胞。
12.权利要求1至8中任一项所述分离的T淋巴细胞用于制备药物的用途，所述药物用于治疗癌症、传染病、自身免疫性病症和/或移植物抗宿主病(GVHD)。
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