JP2016515822A - 操作されたジンクフィンガータンパク質ヌクレアーゼを使用するｔ細胞受容体遺伝子の標的化された破壊 - Google Patents

操作されたジンクフィンガータンパク質ヌクレアーゼを使用するｔ細胞受容体遺伝子の標的化された破壊 Download PDF

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Abstract

ＴＣＲ遺伝子を修飾するためのヌクレアーゼ（ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬヌクレアーゼ）を使用して、ＴＣＲ遺伝子を修飾するための方法および組成物が、本明細書に開示されている。一局面において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする安定的に組み込まれた外因性配列を含む単離されたＴリンパ球が提供され、前記細胞内の少なくとも１つの内因性ＴＣＲ遺伝子が、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮによって部分的にまたは完全に不活性化され、前記ＴＡＬＥＮが、ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメインおよび開裂ドメインを含み、さらに、前記ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメインが、野生型ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡドメインと比較してＣ末端短縮を含む。

Description

関連出願への相互参照
この出願は、２０１３年３月２１日に出願された米国仮出願第６１／８０４，０７６号（この開示は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
本開示は、リンパ球および幹細胞を含む、ヒト細胞のゲノム修飾の分野に存する。
ゲノムＤＮＡの標的化された開裂のための様々な方法および組成物が説明されてきた。斯かる標的化された開裂事象を使用して、例えば、標的化された変異誘発を誘導し、細胞ＤＮＡ配列の標的化された欠失を誘導し、所定の染色体遺伝子座における標的化された組換えを容易にすることができる。例えば、あらゆる目的でその開示が参照によりその全体が組み込まれる、米国特許第７，８８８，１２１号；第７，９７２，８５４号；第７，９１４，７９６号；第７，９５１，９２５号；第８，１１０，３７９号；第８，４０９，８６１号；第８，５８６，５２６号；米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；第２００５０２０８４８９号；第２００５００２６１５７号；第２００５００６４４７４号；第２００６００６３２３１号；第２０１０００２１８２６４号；第２０１２００１７２９０号；第２０１１０２６５１９８号；第２０１３０１３７１０４号；第２０１３０１２２５９１号；第２０１３０１７７９８３号および第２０１３０１７７９６０号ならびに米国特許仮出願第６１／８２３，６８９号を参照されたい。これらの方法は、多くの場合、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）等、誤りを生じる（ｅｒｒｏｒ ｂｏｒｎ）過程による切断の修復または修復鋳型を使用した修復（相同組換え修復またはＨＤＲ）が、遺伝子のノックアウトまたは目的の配列の挿入（標的化組込み）をもたらし得るような、標的ＤＮＡ配列に二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニックを誘導するための操作された開裂系の使用に関与する。操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）等、特異的ヌクレアーゼの使用により、あるいは特異的開裂をガイドするための操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ（「単一ガイドＲＮＡ」）によるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、開裂を生じることができる。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｔ細胞の選択的活性化の必須部分である。抗体とある程度の類似点を有しながら、ＴＣＲは、典型的に、共集合してヘテロ二量体を形成する２本の鎖、αおよびβからなる。抗体類似点は、ＴＣＲ鎖をコードする単一の遺伝子を組み立てる様式にある。ＴＣＲ鎖は、２種の領域、Ｃ末端定常領域およびＮ末端可変領域で構成される。ＴＣＲ鎖をコードするゲノム遺伝子座は、ＴＣＲα遺伝子が、ＶおよびＪセグメントを含む一方、β鎖遺伝子座が、ＶおよびＪセグメントに加えてＤセグメントを含むという点において、遺伝子座をコードする抗体に似ている。各Ｔ細胞が、特有のＴＣＲ構造を有し、身体が、その特有のＴＣＲ構造により、抗原提示細胞によって表示された特有の抗原と相互作用することができるＴ細胞の大規模レパートリーを有するように、Ｔ細胞発生において、様々なセグメントが組換わる。その上、ＴＣＲ複合体は、Ｔ細胞におけるＣＤ３抗原複合体の一部を構成する。
Ｔ細胞活性化において、ＴＣＲは、抗原提示細胞の主要組織適合（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔａｂｉｌｉｔｙ）複合体（ＭＨＣ）においてペプチドとして表示された抗原と相互作用する。ＴＣＲによる抗原−ＭＨＣ複合体の認識は、Ｔ細胞刺激をもたらし、これは続いて、メモリーおよびエフェクターリンパ球におけるヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋）および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＤ８＋）の両方の分化をもたらす。次に、これらの細胞は、クローン様式で増えて、１種の特定の抗原に反応することができる活性化された亜集団を、全Ｔ細胞集団内に生じることができる。
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、腫瘍細胞の殺滅に必須であると考えられる。典型的には、がん細胞が、抗原提示細胞によりＭＨＣに以前に表示されたある抗原をその表面に表示すると、ＣＴＬ細胞は、該がん細胞におけるアポトーシスを誘導することができる。正常には、標的細胞に対する作用に続き、ＣＴＬは、細胞の脅威がなくなるとアポトーシスを起こすが、リンパ球のサブセットが残り、これはメモリーＴ細胞へとさらに分化して、身体が再度抗原に曝露される場合に備えて存続する。メモリーリンパ球のプールは、おそらく高度に不均一である。近年、２種類のメモリーＴ細胞：エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＣＲ７−、ＣＤ６２Ｌ−）と、二次リンパ系器官のＴ細胞区域におけるホーミングに必要とされる２分子であるＣＣＲ７およびＣＤ６２Ｌの発現によって特徴付けられるＣＤ４５ＲＡ陰性細胞である、セントラルメモリーＴ細胞とが同定された。抗原刺激により、セントラルメモリーＴ細胞は、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γ等、低レベルのエフェクターサイトカインを産生するが、その迅速かつ一貫した増殖を持続することができる高レベルのＩＬ−２も産生する。抗原がセントラルメモリーＴ細胞に遭遇すると、これは、１）そのプールの増加を目標とする自己再生過程をもたらす増殖と、２）低い増殖能を特徴とするが、炎症した非リンパ系組織に遊走し、免疫応答のエフェクター相を媒介することができる、エフェクターメモリーＴ細胞の生成をもたらす分化を行う。そのセントラルメモリー機能の表現型を保存しつつＴリンパ球への遺伝子移入を可能にするプロトコールが開発された（欧州特許出願公開第１９５６０８０号、Ｋａｎｅｋｏら、２００９年、Ｂｌｏｏｄ １１３巻（５号）：１００６〜１５頁を参照）。
しかし、一部の腫瘍細胞は、おそらく、関連するＴＣＲを発現するある特定のＣＴＬサブセットの不十分なクローン増大およびがん細胞による免疫抑制の局在化等の機序により、免疫系による監視を逃れることができる（Ｂｏｏｎら（２００６年）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４巻：１７５〜２０８頁を参照）。がんワクチンの概念は、免疫回避を克服する試みにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏで適切なＴＣＲを発現するＣＴＬを刺激し増やすためにこれらのがん特異的抗原を使用するという考えに立脚するが、これらのがんワクチンは、未だいかなる著しい成功も示していない。実際に、２００４年になされた解析は、３５種を超える異なるがんワクチン治験において処置された７６５名の転移性がん患者を試験しているが、全体応答が観察されたのは患者の３．８％のみであった（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（２００４年）Ｎａｔ． Ｍｅｄ．１０巻（９号）：９０９〜９１５頁を参照）。
養子免疫治療は、腫瘍抗原に対し高アビディティー（ａｖｉｄｉｔｙ）ＴＣＲを保有するＣＴＬのある特定の亜集団の高度に特異的なＴ細胞刺激の達成と、ｅｘ ｖｉｖｏにおけるその刺激および増大と、続く患者へのその導入を実施することである。養子免疫治療は、腫瘍特異的細胞の注入前に患者から天然のリンパ球を取り出す場合に特に有効である。この種類の治療法を支える考えとは、高アビディティーＣＴＬの導入が成功すれば、腫瘍が排除されると、これらの細胞の一部が、がんが再出現する場合に備えてメモリーＴ細胞として残り、患者中に存続することである。２００２年に、シクロホスファミドおよびフルダラビンによる免疫枯渇後に養子免疫治療の計画下で処置した患者における転移性メラノーマの退縮を実証した試験が完了した（Ｄｕｄｌｅｙら（２００２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９８巻（５５９４号）：８５０〜８５４頁）。養子免疫治療の前に全身照射が行われる場合、奏効率はさらに高かった（Ｄｕｄｌｅｙら、２００８年、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２６巻（３２号）：５２３３〜９頁）。
しかし、高アビディティーＴＣＲを含有する目的のＴ細胞を容易に増やすことができない場合、養子免疫治療を行うことはできない。加えて、腫瘍抗原は、最高アビディティーを有するＴ細胞クローンの欠失またはアネルギーの機序により患者の免疫系が寛容性になる自己抗原であることが多いため、多くの場合、がん患者から治療価値を有するＴ細胞を同定および単離することは困難である。よって、患者由来のＴ細胞へと高アビディティーＴＣＲをコードする遺伝子を移入することが提案され実証された（Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎら（２００３年）Ｊ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７０巻：１２０９〜１２１７頁を参照）。より近年、悪性メラノーマのマウスモデルを使用して、ｇｐ−１００メラノーマ抗原に特異的なヒトＴＣＲ遺伝子を保有するレトロウイルスベクターが形質導入された正常リンパ球の導入後、腫瘍量が統計的に有意に減少することが判明した（Ａｂａｄら（２００８年）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３１巻（１号）：１〜６頁）。ＴＣＲ遺伝子療法は、Ｍｏｒｇａｎら（２００６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１４巻（５７９６号）：１２６〜９頁およびＢｕｒｎｓら、２００９年、Ｂｌｏｏｄ １１４巻（１４号）：２８８８〜９９頁にも記載されている。
しかし、宿主Ｔ細胞に何らかのＴＣＲ導入遺伝子を移入すると、それに伴いほとんどの遺伝子移入方法に関連する懸念、即ち、ＴＣＲ導入遺伝子発現カセットの調節されない予測不可能なゲノム挿入がしばしば低レベルでも発生する。このような所望の導入遺伝子の十分に制御されない挿入は、周囲の遺伝子における導入遺伝子の効果と共に、隣接遺伝子からの効果による導入遺伝子のサイレンシングを引き起こす可能性がある。加えて、導入されたＴＣＲ導入遺伝子と共に操作されたＴ細胞において共発現される内因性ＴＣＲ遺伝子は、内因性ＴＣＲにより認識される抗原によるＴ細胞の不要な刺激や、新規認識特性を有する新規ＴＣＲ複合体を生じる内因性ＴＣＲサブユニットとＴＣＲ導入遺伝子との誤対合による、意図されない抗原によるＴ細胞の不要な刺激を引き起こし得る、あるいは内因性ＴＣＲタンパク質と導入遺伝子コードＴＣＲサブユニットとのヘテロ二量体形成による不活性ＴＣＲの生成による目的の抗原に対する最適以下の刺激をもたらし得る。実際には、内因性および外因性の鎖の誤対合による自己反応性ＴＣＲの形成に起因する重篤な自己免疫性毒性のリスクは、近年、マウスモデル（Ｂｅｎｄｌｅら（２０１０年）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １６巻：５６５〜５７０頁）およびヒト細胞（ｖａｎ Ｌｏｅｎｅｎら（２０１０年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０７巻：１０９７２〜７頁）で取り上げられている。その上、腫瘍特異的ＴＣＲは、細胞表面における複合体の発現に必要とされるＣＤ３分子をめぐって内因性および誤対合したＴＣＲと競合するため、細胞表面に最適以下のレベルで発現され得る。低いＴＣＲ発現は、トランスジェニックＴ細胞のアビディティーおよび有効性に影響を与える。
ウィルムス腫瘍抗原（ＷＴ１抗原）は、胚細胞において正常に発現される転写因子である。出生後、その発現は、造血幹細胞を含む数種の細胞型のみに限定される。しかし、この抗原は、多くの種類の白血病および固形腫瘍において過剰発現され（Ｉｎｏｕｅら（１９９７年）Ｂｌｏｏｄ ８９巻：１４０５〜１４１２頁を参照）、これらの細胞における成長制御の欠如に寄与し得ることが判明した。正常組織におけるＷＴ１の低発現のため、がん細胞におけるその発現は、Ｔ細胞媒介性治療法の目を引く標的となる。内因性ＴＣＲサブユニットおよび導入遺伝子ＴＣＲの間の誤対合を妨げるために、修飾されたシステインを含有する、ＷＴ１に対するアビディティーが増加したＴＣＲバリアントが、一次Ｔ細胞へと形質導入され、機能性が検査された（Ｋｕｂａｌｌら（２００７年）Ｂｌｏｏｄ １０９巻（６号）：２３３１〜８頁）。データは、ＷＴ１−ＴＣＲバリアントを新たに形質導入されたＴ細胞が、野生型ＴＣＲドメインを形質導入されたＴ細胞と比較して増加した抗原応答を有したが、ＷＴ１抗原による数ラウンドの刺激の後に、この改善された抗原応答性が失われたことを実証した（Ｔｈｏｍａｓら（２００７年）Ｊ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７９巻（９号）：５８０３〜５８１０頁を参照）。導入遺伝子特異的システイン修飾を用いたとしても、内因性ＴＣＲペプチドとの誤対合が、ＷＴ１特異的ＴＣＲを形質導入した細胞に観察される抗ＷＴ１アビディティーの低下における役割を果たし得ることが結論付けられた。米国特許出願公開第２０１１０１５８９５７号も参照されたい。
別の腫瘍抗原は、ＮＹ−ＥＳＯ１である。これは、腫瘍抗原のいわゆる「ＣＴ」セットのメンバーであり、がん細胞上および精巣内において発現されることを意味する。本来は食道腫瘍における発現から同定され、ＮＹ−ＥＳＯ１は、現在、多くは腫瘍が進行したステージである場合に、膀胱、乳、結腸直腸、胃、肝細胞癌、頭頸部、多発性骨髄腫、メラノーマ、非小細胞肺がん、卵巣、膵、前立腺、肉腫および滑膜肉腫を含む数種類の腫瘍型において発現されることが判明した（Ｇｎｊａｔｉｃら（２００６年）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１頁を参照）。大部分の組織においてその発現が明らかに欠如するため、ＮＹ−ＥＳＯ１が、がんワクチンにおける使用のために考慮された。よって、全長ＮＹ−ＥＳＯ１タンパク質およびこの配列に由来するペプチドの両方は、臨床治験において使用されたことがあり、現在使用されている。しかし、ワクチン接種方法は、おそらく、抗原に限定されたアビディティーを有するＴ細胞の産生のため、限定された有用性を有し得ると思われる。加えて、ＮＹ−ＥＳＯ１陽性腫瘍を有する多くのがん患者は、その血液に検出可能な抗ＮＹ−ＥＳＯ１抗体を有するが、その腫瘍は、依然として、免疫応答から逃れることができる。可能な解決策の１つは、ＮＹ−ＥＳＯ１抗原に対する高親和性ＴＣＲの開発となり得る。宿主Ｔ細胞への３種の異なるＴ細胞プライミング技法によって作製された、ＮＹ−ＥＳＯ１特異的ＴＣＲの標準ＴＣＲ移入を使用して行われた試験（Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒら（２０１２年）Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ １３２巻：１３６０〜１３６７頁を参照）は、養子免疫治療のための頑強なＴＣＲの開発が、多数の課題の克服を必要とすることを見出した。産生されたＮＹ−ＥＳＯ１特異的ＴＣＲの追加的な報告も存在する（具体例に関して、ＵＳ８３６７８０４およびＥＰ２０１６１０２Ｂ１を参照）。ＮＹ−ＥＳＯ１ ＴＣＲを形質導入した末梢血から収集した自家リンパ球により、ＮＹ−ＥＳＯ１＋転移性メラノーマまたは転移性滑膜細胞肉腫患者を処置した臨床治験も行われた。１１名のメラノーマ患者のうち５名および６名の滑膜細胞肉腫患者のうち４名において、臨床応答が観察された（Ｒｏｂｂｉｎｓら（２０１１年）Ｊ． Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２９巻（７号）：９１７頁）。
米国特許第７，８８８，１２１号明細書 米国特許第７，９７２，８５４号明細書 米国特許第７，９１４，７９６号明細書
よって、公知の染色体遺伝子座へと所望のＴＣＲ導入遺伝子を導入することができる組成物の必要が依然としてある。加えて、内因性ＴＣＲ遺伝子を選択的にノックアウトすることができる方法および組成物の必要がある。
内因性ＴＣＲ遺伝子の部分的または完全な不活性化または破壊のための組成物および方法、ならびに内因性ＴＣＲ遺伝子の破壊の後またはそれと同時に、外因性ＴＣＲ導入遺伝子をＴリンパ球に導入し、所望のレベルまで発現させるための組成物および方法が、本明細書に開示されている。
一態様において、ＴＣＲ遺伝子を開裂させる操作された単一ガイドＲＮＡを有する、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が、本明細書に提供される。ある特定の実施形態において、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、ヒトＴＣＲα遺伝子における標的部位および／またはヒトＴＣＲβ遺伝子における標的部位に結合する。一部の実施形態において、これらのヌクレアーゼによるＴＣＲ遺伝子（複数可）内の開裂は、ＴＣＲαおよび／またはβ遺伝子（複数可）の永続的破壊（例えば、変異／不活性化）をもたらす。
ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガータンパク質を含む。ジンクフィンガータンパク質は、１、２、３、４、５、６個またはそれを超えるジンクフィンガーを含むことができ、各ジンクフィンガーは、標的遺伝子における標的サブサイトに結合する認識ヘリックスを有する。ある特定の実施形態において、ジンクフィンガータンパク質は、４または５または６個のフィンガー（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５およびＦ６と命名し、Ｎ末端からＣ末端へとＦ１からＦ４またはＦ５またはＦ６を順序付ける）を含み、該フィンガーは、表４および表５に示す認識領域のアミノ酸配列を含む、および／または表４および表５に示す標的部位を認識する。他の実施形態において、ヌクレアーゼは、カノニカルまたは非カノニカルな反復可変二残基（ｒｅｐｅａｔ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ：ＲＶＤ）を有する操作された反復単位を含むことができるＴＡＬＥＮ、例えば、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼおよび／またはメガヌクレアーゼ）に作動可能に連結された、表１４に示すＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ特異的ＴＡＬＥＮである。ＴＡＬＥＮは、Ｃ−キャップ配列、例えば、野生型ＴＡＬ Ｃ末端配列の全長に満たないＣ末端領域（例えば、＋１７または＋６３Ｃ−キャップ）を含む。Ｃ−キャップ配列は、米国特許第８，５８６，５２６号に記載されている。追加的な実施形態は、ヌクレアーゼがＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ配列における標的部位を標的とするように、単一ガイドＲＮＡが作製された、ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の使用を含む。
本明細書に記載されているヌクレアーゼのいずれかは、開裂ドメインおよび／または開裂ハーフドメイン（例えば、開裂活性を有する野生型または操作されたＦｏｋＩ開裂ハーフドメインまたはメガヌクレアーゼドメイン）をさらに含んでいてもよい。よって、本明細書に記載されているヌクレアーゼのいずれかにおいて、ヌクレアーゼドメインは、野生型ヌクレアーゼドメインまたはヌクレアーゼハーフドメイン（例えば、ＦｏｋＩ開裂ハーフドメイン）を含んでいてもよい。他の実施形態において、ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮおよび／またはＴＡＬＥＮ）は、操作されたヌクレアーゼドメインまたはハーフドメイン、例えば、偏性ヘテロ二量体を形成する操作されたＦｏｋＩ開裂ハーフドメインを含む。例えば、米国特許第７，９１４，７９６号；第８０３４，５９８号および米国特許出願公開第２００８０１３１９６２号を参照されたい。
別の態様において、本開示は、本明細書に記載されているヌクレアーゼのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書に記載されているポリヌクレオチドのいずれかは、ＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ遺伝子への標的化された挿入のための外因性配列（ドナーまたはパッチ配列）を含むこともできる。ある特定の実施形態において、ドナー配列は、腫瘍抗原特異的ＴＣＲ導入遺伝子を含み、該ＴＣＲ導入遺伝子は、ＴＣＲα導入遺伝子、ＴＣＲβ導入遺伝子およびこれらの組合せである。ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、ＮＹ−ＥＳＯ１特異的導入遺伝子を含み、該ＮＹ−ＥＳＯ１特異的導入遺伝子は、ＴＣＲα導入遺伝子、ＴＣＲβ導入遺伝子およびこれらの組合せである。
さらに別の態様において、本明細書に記載されているポリヌクレオチドのうち１種または複数を含む遺伝子送達ベクターが提供される（例えば、ドナーおよび／またはヌクレアーゼ（複数可））。ある特定の実施形態において、ベクターは、アデノウイルスベクター（例えば、Ａｄ５／Ｆ３５ベクター）、または組込み可能もしくは組込み不可のレンチウイルスベクターを含むレンチウイルスベクター（ＬＶ）である。よって、少なくとも１種のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼをコードする配列と、標的遺伝子への標的化組込みのための単一ガイドＲＮＡおよび／またはドナー配列とを含む、アデノウイルス（Ａｄ）ベクターまたはＬＶも本明細書に提供される。ある特定の実施形態において、Ａｄベクターは、キメラＡｄベクター、例えば、Ａｄ５／Ｆ３５ベクターである。ある特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）または組込み可能レンチウイルスベクターである。ある特定の実施形態において、ベクターは、ＶＳＶ−Ｇエンベロープまたは他のエンベロープを有する偽型である。追加的な実施形態において、標的遺伝子は、ヒトＴＣＲα遺伝子である。ある特定の実施形態において、標的遺伝子は、ヒトＴＣＲβ遺伝子である。本明細書に記載されているベクターは、ドナー配列を含むこともできる。追加的な実施形態において、ドナー配列は、目的のＭＨＣ／抗原複合体に特異的なヒトＴＣＲ遺伝子を含む。一部の実施形態において、ドナー配列は、目的のＭＨＣ／抗原複合体に特異的なヒトＴＣＲαおよび／またはヒトＴＣＲβ遺伝子を含んでいてもよい。ある特定の実施形態において、単一のベクターは、１種または複数のＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ複合体をコードする配列と、ドナー配列（複数可）とを含む。他の実施形態において、ドナー配列（複数可）は、第１のベクターに含有され、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコード配列は、第２のベクターに存在する。さらなる実施形態において、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコード配列は、第１のベクターに存在し、目的のＴＣＲα遺伝子は、第２のベクターに存在し、目的のＴＣＲβ遺伝子は、第３のベクターに存在する。一部の実施形態において、ゲノムワイド送達後に、目的のＴＣＲ遺伝子は、内因性ＴＣＲ遺伝子の位置に挿入され、他の実施形態において、目的のＴＣＲ遺伝子は、ランダムに選択された遺伝子座または別の遺伝子座に挿入される。一部の実施形態において、ＴＣＲ導入遺伝子挿入のための別の遺伝子座は、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子座である（ＡＡＶＳ１としても公知、米国特許第８，１１０，３７９号を参照）。他の実施形態において、ＴＣＲ導入遺伝子は、ＣＣＲ−５遺伝子座に挿入される。米国特許第７，９５１，９２５号を参照されたい。
さらに別の態様において、本開示は、Ｔリンパ球のゲノムに安定的に組み込まれた外因性配列を含み、内因性ＴＣＲ遺伝子が、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＣ−キャップＴＡＬＥＮ（Ｃ末端短縮を有するＴＡＬＥＮ）により部分的にまたは完全に不活性化された、単離されたＴリンパ球を提供する。ある特定の実施形態において、細胞は、本明細書に記載されているタンパク質、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターのいずれかを含む。ある特定の実施形態において、細胞は、幹／前駆細胞、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞）からなる群から選択される。またさらなる態様において、本開示は、本明細書に記載されている細胞または細胞株の子孫である細胞または細胞株、即ち、１種または複数のＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたは特異的ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼによりＴＣＲが不活性化された、および／またはＴＣＲコードドナーポリヌクレオチドが細胞のゲノムに安定的に組み込まれた細胞の子孫である（例えば、培養における）細胞または細胞株を提供する。よって、本明細書に記載されている細胞の子孫は、それ自体は、本明細書に記載されているタンパク質、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターを含まなくてもよいが、このような細胞において、ＴＣＲ遺伝子が不活性化されている、および／またはＴＣＲコードドナーポリヌクレオチドがゲノムに組み込まれているおよび／または発現されている。
別の態様において、本明細書に記載されている通り、１種または複数のタンパク質、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターを細胞に導入することにより、細胞におけるＴＣＲ遺伝子を不活性化する方法が本明細書に記載されている。本明細書に記載されている方法のいずれかにおいて、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたは特異的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、細胞ＤＮＡ配列の標的化された変異誘発、標的化された欠失を誘導することができる、および／または所定の染色体遺伝子座における標的化された組換えを容易にすることができる。よって、ある特定の実施形態において、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたは特異的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、標的遺伝子の１個または複数のヌクレオチドを欠失または挿入する。一部の実施形態において、ＴＣＲ遺伝子は、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたは特異的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ開裂と、続く非相同末端結合によって不活性化される。他の実施形態において、例えば、本明細書に記載されているＺＦＮ、ＴＡＬＥまたは特異的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ（または前記ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたは特異的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼをコードするベクター）と、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたは特異的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼによる標的化された開裂の後に遺伝子に挿入される「ドナー」配列とを使用して、標的遺伝子におけるゲノム配列は置き換えられる。ある特定の実施形態において、ドナー配列は、ＮＹ−ＥＳＯ１配列を含む。ドナー配列は、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたは特異的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼベクターに存在し得る、別々のベクター（例えば、ＡｄまたはＬＶベクター）に存在し得る、あるいは、異なる核酸送達機序を使用して細胞に導入され得る。
別の態様において、細胞または細胞株におけるＴＣＲ遺伝子を変異させるためおよび／またはＴＣＲ機能を不活性化させるために、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥＮまたは特異的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼおよびこれらの融合体を使用する方法が提供される。よって、ヒト細胞におけるＴＣＲ遺伝子を不活性化するための方法であって、本明細書に記載されているタンパク質またはポリヌクレオチドのいずれかを細胞に投与するステップを含む方法が提供される。
さらに別の態様において、本開示は、対象におけるがん、感染症、自己免疫性障害および／または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を処置または防止するための方法であって、（ａ）細胞中でポリペプチドが発現されることによりポリペプチドが標的部位に結合し、内因性ＴＣＲ遺伝子を開裂させるような条件下で、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸を細胞（例えば、リンパ球、幹細胞、前駆細胞等）に導入するステップであって、前記第１のポリペプチドが、（ｉ）ＴＣＲ遺伝子における第１の標的部位に結合するよう操作されたジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよび（ｉｉ）開裂ドメインを含む、ステップと、（ｂ）細胞中でポリペプチドが発現されることによりポリペプチドが標的部位に結合し、内因性ＴＣＲ遺伝子を開裂させるような条件下で、第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を細胞に導入するステップであって、前記第２のポリペプチドが、（ｉ）ＴＣＲ遺伝子における第２の標的部位に結合するよう操作されたジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよび（ｉｉ）開裂ドメインを含む、ステップと、（ｃ）第３の核酸が、内因性ＴＣＲ遺伝子に導入され、導入された第３の核酸を有する細胞が、対象におけるがん、感染症、自己免疫性障害および／または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を処置または防止するように、ＭＨＣ複合体における腫瘍特異的抗原に特異的なＴＣＲ遺伝子（単数または複数）をコードする核酸を含む第３の核酸を細胞に導入するステップとを含む方法を提供する。ある特定の実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｃ）は、ｅｘ ｖｉｖｏで行われ、本方法は、ステップ（ｃ）に続き、細胞を対象に導入するステップをさらに含む。ある特定の実施形態において、ＴＣＲ遺伝子（複数可）をコードする第３の核酸は、双方向性プロモーター（例えば、ＰＧＫ、ＥＦ１α等）の制御下において発現される。他の実施形態において、ＴＣＲ遺伝子（複数可）は、バイシストロニックカセットから（例えば、ウイルス２ＡペプチドまたはＩＲＥＳ配列を使用）、または一方向性プロモーターにおいて異なるＴＣＲ遺伝子を発現する複数のＬＶにより発現される。ある特定の実施形態において、細胞は、幹／前駆細胞またはＴ細胞からなる群から選択される。本明細書に記載されている方法のいずれかにおいて、細胞において第２のポリペプチドが発現され、それにより、第１および第２のポリペプチドがそれぞれの標的部位に結合し、ＴＣＲ遺伝子を開裂するように、第１の核酸は、第２のポリペプチドをさらにコードすることができ、前記第２のポリペプチドは、（ｉ）ＴＣＲ遺伝子における第２の標的部位に結合するよう操作されたジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよび（ｉｉ）開裂ドメインを含む。
別の態様において、本開示は、対象におけるがんを処置または防止するための方法であって、（ａ）細胞中でポリペプチドが発現されることによりポリペプチドが標的部位に結合し、内因性ＴＣＲを開裂させるような条件下で、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸を細胞に導入するステップであって、前記第１のポリペプチドが、（ｉ）ＴＣＲ遺伝子における第１の標的部位に結合するよう操作されたジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよび（ｉｉ）開裂ドメインを含む、ステップと、（ｂ）細胞中でポリペプチドが発現されることによりポリペプチドが標的部位に結合し、セーフハーバー遺伝子座（例えば、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ、ＣＣＲ５）中で開裂させるような条件下で、第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を細胞に導入するステップであって、前記第２のポリペプチドが、（ｉ）セーフハーバー遺伝子座（例えば、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ、ＣＣＲ５）における第１の標的部位に結合するよう操作されたジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよび（ｉｉ）開裂ドメインを含む、ステップと、（ｃ）ＭＨＣ複合体における腫瘍特異的抗原に特異的なＴＣＲ遺伝子（単数または複数）をコードするドナー核酸を含む第３の核酸を細胞に導入するステップと、（ｄ）対象に細胞を導入するステップとを含む方法も提供する。ＴＣＲ特異的ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系を含む核酸は、セーフハーバー遺伝子座に特異的なＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系と同時に導入することができ、ドナー核酸分子またはＴＣＲ特異的ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮもしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系をコードする核酸は、第１のステップにおいて細胞に導入することができ、続いてセーフハーバー遺伝子座（例えば、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ、ＣＣＲ５）特異的ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系およびドナー核酸分子は、第２のステップにおいて導入することができる。ある特定の実施形態において、ドナー核酸分子は、ＮＹ−ＥＳＯ１等、腫瘍抗原をコードする。
本開示は、対象におけるがんを防止または処置する方法であって、ウイルス送達粒子を対象に導入するステップを含み、前記ウイルス送達粒子が、（ａ）細胞中でポリペプチドが発現されることによりポリペプチドが標的部位に結合し、内因性ＴＣＲを開裂させるような条件下で、第１のポリペプチドが、（ｉ）ＴＣＲ遺伝子における第１の標的部位に結合するよう操作されたジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよび（ｉｉ）開裂ドメインを含む、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸と、（ｂ）細胞中でポリペプチドが発現されることによりポリペプチドが標的部位に結合し、セーフハーバー遺伝子座（例えば、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、アルブミン、ＨＰＲＴ）を開裂させるような条件下で、第２のポリペプチドが、（ｉ）セーフハーバー遺伝子座（例えば、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、アルブミン、ＨＰＲＴ等（共同所有された米国特許第８，１１０，３７９号および第７，９５１，９２５号ならびに米国特許出願第１３／６２４，１９３号および第１３／６６０，８２１号を参照））における第１の標的部位に結合するよう操作されたジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよび（ｉｉ）開裂ドメインを含む、第２のポリペプチドをコードする第２の核酸と、（ｃ）細胞中でポリペプチドが発現されることによりポリペプチドが標的部位に結合し、セーフハーバー遺伝子座（例えば、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、アルブミン、ＨＰＲＴ）を開裂させるような条件下で、第３のポリペプチドが、（ｉ）セーフハーバー遺伝子座（例えば、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、アルブミン、ＨＰＲＴ）における第２の標的部位に結合するよう操作されたジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよび（ｉｉ）開裂ドメインを含む、第３のポリペプチドをコードする第３の核酸と、（ｄ）内因性ＴＣＲ遺伝子が開裂されて不活性となり、セーフハーバー遺伝子（例えば、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、アルブミン、ＨＰＲＴ）が開裂され、ＭＨＣ複合体における腫瘍特異的抗原に特異的なＴＣＲ遺伝子が、内因性ＴＣＲ遺伝子に挿入されるような、ＭＨＣ複合体における腫瘍特異的抗原に特異的なＴＣＲ遺伝子（単数または複数）をコードするドナー核酸を含む第３の核酸を含む方法も提供する。ある特定の実施形態において、本方法は、次のステップ、（ｄ）対象に細胞を導入するステップをさらに含む。ある特定の実施形態において、ドナー核酸分子は、ＮＹ−ＥＳＯ１等、腫瘍抗原をコードする。
本明細書に記載されている方法のいずれかにおいて、ウイルス送達粒子を使用して、ポリヌクレオチド（ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮコードおよび／またはドナーポリヌクレオチド）のうち１種または複数を送達することができる。さらに、本明細書に記載されている方法および組成物のいずれかにおいて、細胞は、例えば、幹／前駆細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）またはＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋細胞）となり得る。
さらに、本明細書に記載されている方法のいずれかは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｅｘ ｖｉｖｏで実施することができる。ある特定の実施形態において、本方法は、ｅｘ ｖｉｖｏで実施されて、例えば、ＰＢＭＣ、例えば、Ｔ細胞を修飾して、これを目的の腫瘍抗原／ＭＨＣ複合体に特異的にして、対象における腫瘍を処置する。処置および／または防止することができるがんの非限定例として、肺癌、膵がん、肝臓がん、骨がん、乳がん、結腸直腸がん、白血病、卵巣がん、リンパ腫、脳がんその他が挙げられる。
図１のパネルＡおよびＢは、ウィルムス腫瘍抗原（ＷＴ１）特異的レンチウイルスベクターの構築および発現を表す。図１Ａは、双方向性ＰＧＫまたはＥＦ１αプロモーターの制御下における、第三世代レンチウイルスベクター（ＬＶ）にクローニングされたウィルムス腫瘍抗原１（ＷＴ１）由来のＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドに特異的なコドン最適化されたシステイン修飾されたＴＣＲをコードする遺伝子の図表を表す。Ａｍｅｎｄｏｌａら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３巻（１号）：１０８〜１１６頁および米国特許出願公開第２００６２００８６９号を参照されたい。図１Ｂは、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ７およびＩＬ１５の存在下で培養された、レンチウイルス形質導入されたＣＤ８＋細胞におけるＶβ２１ ＴＣＲ発現の時間経過を表すグラフである。Ｖβ２１相対蛍光強度（ＲＦＩ）は、ＰＧＫ−ＷＴ１（白四角）またはＥＦ１α−ＷＴ１（「×」）遺伝子改変されたリンパ球において測定されたＶβ２１の平均蛍光強度（ＭＦＩ）／Ｖβ２１を天然に発現するＴ細胞において測定されたＶβ２１のＭＦＩの比として計算した。 図２のパネルＡ〜Ｃは、ＴＣＲ構築物を形質導入した細胞の結果を表すグラフである。図２Ａは、ＡＭＬ患者（ＡＭＬ１（最も左のバー）、ＡＭＬ２（左から２番目のバー）およびＡＭＬ３（左から３番目のバー）と命名）由来のＷＴ１＋ＨＬＡ−Ａ２＋またはＷＴ１＋ＨＬＡ−Ａ２−（陰性対照）初代白血病性芽球へと曝露した後に、ＰＧＫ／ｍＣＭＶ二重プロモーター組合せ（左側の４本のバーの群）またはＥＦ１α／ｍＣＭＶ二重プロモーター（右側の４本のバーの群）のいずれかからトランスジェニックＴＣＲを発現するベクターを形質導入されたＷＴ１＋ＨＬＡ−Ａ２＋およびＷＴ１＋／ＨＬＡ Ａ２−細胞（図示されている初代ＡＭＬまたはＫ５６２細胞（グラフにおける最も右のバー））による細胞の刺激による、γＩＦＮ産生の誘導を表す。図２Ｂおよび図２Ｃは、ＴＣＲ修飾細胞によるＡＭＬ１およびＡＭＬ２（実線、黒丸）由来の白血病性芽球殺滅のパーセントを実証する。点線は、ＷＴ１適切ペプチドをロードした過剰な非アイソトープ（ｃｏｌｄ）（標識されていない）ＨＬＡ−Ａ２標的細胞の存在下における、ＴＣＲ修飾細胞による白血病性芽球の殺滅の残存を表す。 図３のパネルＡおよびＢは、ＧＦＰドナーと共にセーフハーバー遺伝子座を標的とするＺＦＮを導入した後のＧＦＰ発現を表すグラフである。図３Ａおよび図３Ｂは、Ａｄ５／Ｆ３５ ＣＣＲ５特異的ＺＦＮ（図３Ａ）またはＡｄ５／Ｆ３５ ＡＡＶＳ１特異的ＺＦＮ（図３Ｂ）および使用した−ＩＤＬＶ ＧＦＰドナーＤＮＡカセットの量に対するＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージの増加を実証する。 図４のパネルＡおよびＢは、例示的なＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−βドナー分子（図４Ａ）ならびにＴＣＲ−β遺伝子（図４Ｂ）の図表を表す。図４Ａは、ＷＴ１特異的ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−βドナー分子を含有するカセットを表し、ＣＣＲ５組込み部位と相同性の領域を示す。図４Ｂは、Ｋ５６２細胞における２種のＴＣＲ−β定常領域のゲノム配置を表す（ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２）。 図５は、Ｃｅｌ−Ｉ Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）ミスマッチアッセイ（「Ｃｅｌ−Ｉアッセイ」Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）により測定される、Ｋ５６２細胞におけるＴＣＲ−β特異的ＺＦＮの数ペアのパーセント修飾を表す。０．１または０．４μｇのＺＦＮプラスミドでトランスフェクションした後に、最初に３０℃で細胞をインキュベートした。レーンの下部にパーセント修飾を示す。 図６のパネルＡおよびＢは、Ｃｅｌ−Ｉアッセイにより測定される、Ｋ５６２細胞におけるＴＣＲ−α特異的ＺＦＮのパーセント修飾を表す。図６Ａは、ＺＦＮがエクソン１に標的化された細胞におけるＣｅｌ−Ｉアッセイの結果を表す。図６Ｂは、ＺＦＮがエクソン３に標的化されたＣｅｌ Ｉミスマッチアッセイの結果を表す。「ＧＦＰ」は、ＧＦＰのみのベクターを形質導入した細胞を示す。レーンの下部にパーセント変更（ＮＨＥＪ）を示す。図示されている通り、選別されたＣＤ３−リンパ球は、ＩＬ７およびＩＬ１５の存在下で生存する。 図７のパネルＡ〜Ｆは、ＴＣＲ−βのＺＦＮ媒介性開裂を表す。２種の濃度のベクターにおけるＴＣＲ−β特異的ＺＦＮペア１６７８３および１６７８７を使用した、非形質導入および形質導入ジャーカット細胞は、細胞表面におけるＣＤ３シグナルの損失を実証した（２．７％ＣＤ３（−）から２０．２％ＣＤ３（−）（実施例６を参照）。図７Ａおよび図７Ｂは、ジャーカット細胞におけるＴＲＢＣ１（図７Ａ）およびＴＲＢＣ２（図７Ｂ）遺伝子座におけるＣｅｌ−Ｉアッセイの結果を示し、開裂が生じたことを実証する。各レーンの下部に、測定された％遺伝子修飾を示す。図７Ｃは、選別されたＣＤ３−初代ヒトリンパ球が、ＩＬ７およびＩＬ１５の存在下で生存し得ることを表すグラフである。「ＵＴ」は、未処理細胞を示す。図７Ｄは、ＴＣＲベータ特異的ＺＦＮで処理した初代Ｔ細胞の細胞プールにおいて観察される、Ｃｅｌ−Ｉアッセイによりアッセイされるパーセント修飾（ＮＨＥＪ）を示す。「バルク」は、ＺＦＮ処理細胞プールに観察されるＮＨＥＪのパーセントを示し、一方、ＣＤ３＋またはＣＤ３−は、ＣＤ３＋またはＣＤ３−のいずれかとして選別された細胞に観察されるＮＨＥＪを示す。「ＵＴ」は、処理しなかった細胞を示す。レーンの下部に、アッセイにより検出されたパーセントＮＨＥＪを示す。図７Ｅは、パーセントＣＤ３−細胞を表すグラフであり、増加濃度のＺＦＮで処理した細胞における、経時的なＣＤ３−細胞の持続を実証する（ＣＤ３−細胞のパーセントは、最大４５日間まで相当に一定に留まる）。図７Ｆは、ＣＤ３−細胞が、非特異的マイトジェンに応答して分裂するようには見えないため、ＴＣＲ／ＣＤ３機能性を失ったことを表すグラフである。図示されている通り、ＣＤ３−細胞は生存し、４０日間を超えてＩＬ７およびＩＬ１５存在下の培養において安定的であり、ポリクローナルマイトジェンに応答せず、ＴＣＭ表現型を維持する。 図７のパネルＡ〜Ｆは、ＴＣＲ−βのＺＦＮ媒介性開裂を表す。２種の濃度のベクターにおけるＴＣＲ−β特異的ＺＦＮペア１６７８３および１６７８７を使用した、非形質導入および形質導入ジャーカット細胞は、細胞表面におけるＣＤ３シグナルの損失を実証した（２．７％ＣＤ３（−）から２０．２％ＣＤ３（−）（実施例６を参照）。図７Ａおよび図７Ｂは、ジャーカット細胞におけるＴＲＢＣ１（図７Ａ）およびＴＲＢＣ２（図７Ｂ）遺伝子座におけるＣｅｌ−Ｉアッセイの結果を示し、開裂が生じたことを実証する。各レーンの下部に、測定された％遺伝子修飾を示す。図７Ｃは、選別されたＣＤ３−初代ヒトリンパ球が、ＩＬ７およびＩＬ１５の存在下で生存し得ることを表すグラフである。「ＵＴ」は、未処理細胞を示す。図７Ｄは、ＴＣＲベータ特異的ＺＦＮで処理した初代Ｔ細胞の細胞プールにおいて観察される、Ｃｅｌ−Ｉアッセイによりアッセイされるパーセント修飾（ＮＨＥＪ）を示す。「バルク」は、ＺＦＮ処理細胞プールに観察されるＮＨＥＪのパーセントを示し、一方、ＣＤ３＋またはＣＤ３−は、ＣＤ３＋またはＣＤ３−のいずれかとして選別された細胞に観察されるＮＨＥＪを示す。「ＵＴ」は、処理しなかった細胞を示す。レーンの下部に、アッセイにより検出されたパーセントＮＨＥＪを示す。図７Ｅは、パーセントＣＤ３−細胞を表すグラフであり、増加濃度のＺＦＮで処理した細胞における、経時的なＣＤ３−細胞の持続を実証する（ＣＤ３−細胞のパーセントは、最大４５日間まで相当に一定に留まる）。図７Ｆは、ＣＤ３−細胞が、非特異的マイトジェンに応答して分裂するようには見えないため、ＴＣＲ／ＣＤ３機能性を失ったことを表すグラフである。図示されている通り、ＣＤ３−細胞は生存し、４０日間を超えてＩＬ７およびＩＬ１５存在下の培養において安定的であり、ポリクローナルマイトジェンに応答せず、ＴＣＭ表現型を維持する。 図７のパネルＡ〜Ｆは、ＴＣＲ−βのＺＦＮ媒介性開裂を表す。２種の濃度のベクターにおけるＴＣＲ−β特異的ＺＦＮペア１６７８３および１６７８７を使用した、非形質導入および形質導入ジャーカット細胞は、細胞表面におけるＣＤ３シグナルの損失を実証した（２．７％ＣＤ３（−）から２０．２％ＣＤ３（−）（実施例６を参照）。図７Ａおよび図７Ｂは、ジャーカット細胞におけるＴＲＢＣ１（図７Ａ）およびＴＲＢＣ２（図７Ｂ）遺伝子座におけるＣｅｌ−Ｉアッセイの結果を示し、開裂が生じたことを実証する。各レーンの下部に、測定された％遺伝子修飾を示す。図７Ｃは、選別されたＣＤ３−初代ヒトリンパ球が、ＩＬ７およびＩＬ１５の存在下で生存し得ることを表すグラフである。「ＵＴ」は、未処理細胞を示す。図７Ｄは、ＴＣＲベータ特異的ＺＦＮで処理した初代Ｔ細胞の細胞プールにおいて観察される、Ｃｅｌ−Ｉアッセイによりアッセイされるパーセント修飾（ＮＨＥＪ）を示す。「バルク」は、ＺＦＮ処理細胞プールに観察されるＮＨＥＪのパーセントを示し、一方、ＣＤ３＋またはＣＤ３−は、ＣＤ３＋またはＣＤ３−のいずれかとして選別された細胞に観察されるＮＨＥＪを示す。「ＵＴ」は、処理しなかった細胞を示す。レーンの下部に、アッセイにより検出されたパーセントＮＨＥＪを示す。図７Ｅは、パーセントＣＤ３−細胞を表すグラフであり、増加濃度のＺＦＮで処理した細胞における、経時的なＣＤ３−細胞の持続を実証する（ＣＤ３−細胞のパーセントは、最大４５日間まで相当に一定に留まる）。図７Ｆは、ＣＤ３−細胞が、非特異的マイトジェンに応答して分裂するようには見えないため、ＴＣＲ／ＣＤ３機能性を失ったことを表すグラフである。図示されている通り、ＣＤ３−細胞は生存し、４０日間を超えてＩＬ７およびＩＬ１５存在下の培養において安定的であり、ポリクローナルマイトジェンに応答せず、ＴＣＭ表現型を維持する。 図８は、初代Ｔリンパ球におけるＴＣＲ−β遺伝子座の編集および特異的ＴＣＲ導入遺伝子の再導入のための、実験概略およびＦＡＣＳ結果を表す。使用した細胞は、未処理初代Ｔ細胞リンパ球、またはＩＤＬＶに保有されたＴＣＲ−β特異的ＺＦＮで前処理し、続いてＣＤ３（−）初代Ｔ細胞を選別したリンパ球のいずれかであった。欧州特許出願公開第１９５６０８０号に従って、ＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体でコーティングされた細胞サイズのビーズによるＴ細胞の刺激と、遺伝子改変されたセントラルメモリーリンパ球の作製を容易にするためのＩＬ７（５ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ１５（５ｎｇ／ｍｌ）の存在下での細胞培養の後に、遺伝子移入を達成した。図示されている通り、ＴＣＲ−β特異的ＺＦＮによる処理後にＣＤ３（−）であることに関して選別され、続いて、レンチウイルスベクターを使用してゲノムにランダムに組み込まれたＷＴ１−ＴＣＲβＶ２１．３およびＷＴ１．ＴＣＲα導入遺伝子を有する細胞は、ＣＤ３およびＶβ２１．３の両方の染色の増加を示し、初代Ｔリンパ球が、ＴＣＲ−β特異的ＺＦＮを使用してＮＨＥＪによる内因性ＴＣＲ破壊を行い、続いて導入遺伝子カセット（ＰＧＫ−ＷＴ１）にコードされる新たなＴＣＲの導入により特異的抗原を認識するために再標的化することができることを示す。対照として、ＵＴ細胞も挿入されたＰＧＫ−ＷＴ１カセットを有し、ＺＦＮ処理したＣＤ３（−）集団（４６％、ポリクローナル刺激後に９２％）と比較して、Ｖβ２１．３を発現する細胞のパーセンテージがより低い（２６％）ことを示し、内因性ＴＣＲの破壊が、導入遺伝子から発現されたＴＣＲの細胞表面発現および機能性を改善し得ることを示す。 図９のパネルＡ〜Ｃは、Ｖβ２１ ＴＣＲの発現を表す。図９Ａは、同じ培養条件で処理した、ＣＤ８＋ＴＣＲβ鎖破壊およびＷＴ１形質導入細胞（ＴＣＲ−β編集）、未編集ＷＴ１ ＬＶ形質導入細胞（ＴＣＲ移入）および非形質導入リンパ球におけるＶβ２１ ＴＣＲ発現（上ヒストグラム）およびＷＴ１１２６〜１３４五量体結合（下ヒストグラム）を表す。図９Ｂは、Ｖβ２１ ＴＣＲの表面発現の時間経過を示す。Ｖβ２１ ＲＦＩの平均＋ＳＤ（ｎ＝２）を表す。ＲＦＩは、ＣＤ８＋ＴＣＲ編集（白三角）またはＴＣＲ移入（黒丸）リンパ球において測定されたＶβ２１のＭＦＩ／Ｖβ２１を天然に発現するＣＤ８＋Ｔ細胞において測定されたＶβ２１のＭＦＩの比から計算される。図９Ｃは、ＴＣＲ編集およびＴＣＲ移入細胞による細胞傷害性アッセイの結果を表す。機能活性は、１２のエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比において、増加濃度のＷＴ１１２６〜１３４ＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドまたは陰性対照としての無関係ＣＭＶ由来ｐｐ６５４９５〜５０３ＨＬＡ−Ａ２制限ペプチド（１０μＭ）でパルスされた標識Ｔ２細胞の溶解のための５１クロム放出アッセイにより測定される。溶解％の平均＋ＳＤとして結果を表す（マン・ホイットニー検定による＊＊、ｐ＜０．０１、＊、ｐ＜０．０５、ＴＣＲ編集ｎ＝６、ＴＣＲ移入ｎ＝４）。 図１０のパネルＡおよびＢは、γＩＦＮ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって検査される、ＷＴ１ ＴＣＲ陽性Ｔ細胞クローンの機能活性を表す。１：１の刺激細胞（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）／応答細胞（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）比において、１０ｎＭのＷＴ１１２６〜１３４ＨＬＡ−Ａ２制限ペプチド（１０Ａ）をパルスしたＴ２細胞にまたは同種異系ＰＢＭＣ（１０Ｂ）にクローンを曝露した。観察された特異的スポット（白三角および黒丸）の数を、刺激細胞の存在下で産生されるスポットの数マイナスエフェクター単独によって産生されるスポットの数としてｙ軸に示す。結果は、ＴＣＲ−β編集クローンが、内因性および外因性ＴＣＲ遺伝子の両方を含有するＴＣＲ移入細胞よりも高い程度の抗原特異性を提示することを示す。 図１１は、ＺＦＮ編集および未編集細胞におけるＶβ２１発現を表す。増加するＭＯＩにおいて、ＷＴ１特異的ＴＣＲのＶβ２１遺伝子およびΔＬＮＧＦＲ遺伝子をコードするＬＶにより、ＴＲＢＣ破壊リンパ球から選別されたＣＤ３（−）細胞および未編集細胞を形質導入した（Ｖβ２１遺伝子およびΔＬＮＧＦＲ遺伝子の二重発現を示す、本図の上部の図表を参照）。ΔＬＮＧＦＲｐｏｓリンパ球の％として形質導入効率を評価し、これを示す。ΔＬＮＧＦＲｐｏｓ細胞におけるＶβ２１発現を測定し、形質導入されたＶβ２１遺伝子が発現され、内因性ＴＣＲα鎖と活性ＣＤ３複合体を形成し得ることを実証する。Ｖβ２１の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。 図１２のパネルＡ〜Ｃは、ＴＣＲα遺伝子を標的とするＺＦＮで処理した初代リンパ球におけるＣＤ３発現を表す。図１２Ａは、全体の長さ１８ｋｂのＴＣＲαをコードするヒト遺伝子座の図表を表す；ＴＲＡＶ、可変領域遺伝子、ＴＲＡＤ、多様性領域遺伝子、ＴＲＡＣ、定常領域遺伝子。遺伝子座のスキームの上に、各ＴＲＡＣ−ＺＦＮに標的化されるＴＲＡＣにおけるゲノムＤＮＡ配列が表示されている。図１２Ａは、配列番号１０９としてのタンパク質配列および配列番号１０８としてのＤＮＡ配列を開示する。図１２Ｂは、ｂａＣＤ３／ＣＤ２８で刺激し、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−７、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１５と共に培養し、ＴＲＡＣ−ＺＦＮ ＩＤＬＶに曝露した初代ヒトリンパ球における、フローサイトメトリーによって測定される細胞表面ＣＤ３発現の下方調節を表す。ＣＤ３（−）細胞のパーセントをプロットする。ＵＴ、非形質導入細胞。選別されたＣＤ３（−）細胞に、ＷＴ１−αＯＦＰ−ＬＶを形質導入し、形質導入したリンパ球におけるＣＤ３の発現をもたらした。図１２Ｃは、ＴＲＡＣ−ＺＦＮに曝露された初代リンパ球におけるＣｅｌ−Ｉアッセイによって測定される、標的化された遺伝子破壊のレベルを示すゲルを表す。野生型（ｗ／ｔ）遺伝子を示す上の方の移動産物を図示する。下の方の移動産物（ＮＨＥＪ）は、ＺＦＮ指向性遺伝子破壊を示す。「ＵＴ」は、非形質導入細胞を指す。 図１３は、ＺＦＮ処理したヒトリンパ球におけるゲノムＴＲＡＣ ＺＦＮ標的部位の部分的配列を増幅し、クローニングし、配列決定して、ＺＦＮ誘導性修飾を確認したことを表す。配列アライメントは、標的領域内のいくつかのＺＦＮ誘導性欠失および挿入（挿入欠失）を明らかにした。左側の列は、回収されたクローンの数を示し、右側の列は、欠失または挿入されたヌクレオチドの数を示す。図１３は、出現順にそれぞれ配列番号１１０〜１４３を開示する。 図１４は、ＺＦＮ編集に従ったＣＤ３の発現を表す。上のパネルは、活性化されたＴリンパ球をＴＲＡＣ−ＺＦＮ−ＡｄＶ（ＭＯＩ １０００）で処理し、ＣＤ３（−）リンパ球を選別し、３μｇ−ｐ２４／１０６細胞のＰＧＫ−ＷＴ１−αＬＶで形質導入し、ＣＤ３（＋）細胞を選別した試験の結果を示す。形質導入細胞におけるＣＤ３の表面発現を示す。１サイクルのポリクローナル刺激後に、α編集したリンパ球を、ＴＲＢＣ−ＺＦＮ−ＡｄＶ（ＭＯＩ １０４）で処理し、ＣＤ３（−）細胞を選別し、３μｇ−ｐ２４／１０６細胞のＰＧＫ−ＷＴ１−βＬＶで形質導入した。１サイクルのポリクローナル刺激の前後の形質導入細胞における、Ｖβ２１ ＴＣＲおよびＣＤ３の表面発現を示す。四分割された各領域で測定される事象のパーセントを示し、実験タイムラインを下部に示す。 図１５は、同じ培養条件で処理した、ＺＦＮの導入およびＣＤ３−細胞の選別と、続くＷＴ１ ＴＣＲ鎖による形質導入およびＣＤ３＋細胞の選別によりＴＣＲα／β鎖が破壊されたＣＤ８（＋）Ｔ細胞（ＴＣＲ編集）、未編集のＷＴ１ ＬＶ形質導入細胞（ＴＣＲ移入）および非形質導入リンパ球において、Ｖβ２１ ＴＣＲ発現（上ヒストグラム）およびＷＴ１１２６〜１３４五量体結合（下ヒストグラム）が示されることを表す。データは、ＴＣＲ編集細胞が、内因性および外因性ＴＣＲ遺伝子の両方が存在するクローンよりも高いレベルのＶβ２１発現を有することを示す。データは、ＴＣＲ編集細胞が、ＴＣＲ遺伝子の両セットを有する細胞よりも高いＷＴ１ペプチドへの結合を表示することも実証する。 図１６のパネルＡ〜Ｃは、遺伝子改変リンパ球の機能活性がγＩＦＮ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより検査されたことを表すグラフである。ポリクローナル刺激の３週間後に、ＴＣＲ−α／β編集およびＴＣＲ移入リンパ球を、ｉ）増加濃度のＷＴ１１２６〜１３４ＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドもしくは無関係ＣＭＶ由来ｐｐ６５４９５〜５０３ＨＬＡ−Ａ２ペプチドでパルスしたＴ２細胞（図１６Ａ、図の右側を参照）、またはｉｉ）ＷＴ１１２６〜１３４ペプチド（５０ｎＭ）によるパルスあり（破線記号）もしくはなし（実線記号）のＡＭＬ患者から収集されたＷＴ１＋ＨＬＡ−Ａ２（＋）（図１６Ｂにおける黒色）もしくはＨＬＡ−Ａ２（−）（灰色）白血病細胞のいずれかに曝露した。図１６Ｃは、標的として同種異系ＰＢＭＣを使用した同様の結果を示す。１：１の刺激細胞／応答細胞比で全アッセイを行った。特異的スポットの数を、刺激細胞の存在下で産生されたスポットの数、マイナス、エフェクター単独により産生されたスポットの数としてｙ軸に示す。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。 図１６のパネルＡ〜Ｃは、遺伝子改変リンパ球の機能活性がγＩＦＮ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより検査されたことを表すグラフである。ポリクローナル刺激の３週間後に、ＴＣＲ−α／β編集およびＴＣＲ移入リンパ球を、ｉ）増加濃度のＷＴ１１２６〜１３４ＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドもしくは無関係ＣＭＶ由来ｐｐ６５４９５〜５０３ＨＬＡ−Ａ２ペプチドでパルスしたＴ２細胞（図１６Ａ、図の右側を参照）、またはｉｉ）ＷＴ１１２６〜１３４ペプチド（５０ｎＭ）によるパルスあり（破線記号）もしくはなし（実線記号）のＡＭＬ患者から収集されたＷＴ１＋ＨＬＡ−Ａ２（＋）（図１６Ｂにおける黒色）もしくはＨＬＡ−Ａ２（−）（灰色）白血病細胞のいずれかに曝露した。図１６Ｃは、標的として同種異系ＰＢＭＣを使用した同様の結果を示す。１：１の刺激細胞／応答細胞比で全アッセイを行った。特異的スポットの数を、刺激細胞の存在下で産生されたスポットの数、マイナス、エフェクター単独により産生されたスポットの数としてｙ軸に示す。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。 図１７は、ＴＲＡＣ特異的ＺＦＮによるオフターゲット開裂の解析を表す。Ｃｅｌ−Ｉミスマッチアッセイによる開裂のためのＺＦＮ処理後に、ＴＲＡＣ特異的ＺＦＮに対する１５種の最も可能性が高い潜在的なオフターゲット部位（ｉｎ ｓｉｌｉｃｉｏ解析により同定）を解析した。各潜在的なオフターゲット部位を５種の試料において解析した：非形質導入試料（ＵＴ）、ＴＲＡＣ特異的ＺＦＮ処理および選別後にＴＲＡＣ陰性の試料（ＴＲＡＣ陰性）、ＴＲＡＣ特異的ＺＦＮによる、ＴＲＡＣ導入遺伝子およびＴＲＢＣ特異的ＺＦＮ逐次的処理と逐次的ラウンドの選別後にＴＲＡＣとＴＲＢＣとが陰性の細胞（二重陰性）、ＺＦＮ処理ならびに非野生型ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ導入遺伝子を含むための修飾後に内因性ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ遺伝子座が陰性の細胞（完全編集）、またはＴＲＢＣ特異的ＺＦＮ単独による処理および選別後にＴＲＢＣ陰性（ＴＲＢＣ陰性）。潜在的なオフターゲット部位は、表１２に標識されている。 図１８は、ＴＲＢＣ特異的ＺＦＮによるオフターゲット開裂の解析を表す。Ｃｅｌ−Ｉミスマッチアッセイによる開裂のためのＺＦＮ処理後に、ＴＲＢＣ特異的ＺＮＳのための１５種の潜在的なオフターゲット部位（ｉｎ ｓｉｌｉｃｉｏ解析により同定）を解析した。各潜在的なオフターゲット部位を５種の試料において解析した：非形質導入試料（ＵＴ）、ＴＲＡＣ特異的ＺＦＮ処理および選別後にＴＲＡＣ陰性の試料（ＴＲＡＣ陰性）、ＴＲＡＣ特異的ＺＦＮ、ＴＲＡＣ導入遺伝子およびＴＲＢＣ特異的ＺＦＮによる逐次的処理と逐次的ラウンドの選別後にＴＲＡＣとＴＲＢＣとが陰性の細胞（二重陰性）、ＺＦＮ処理ならびに非野生型ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ導入遺伝子を含むための修飾後に内因性ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ遺伝子座が陰性の細胞（完全編集）、またはＴＲＢＣ特異的ＺＦＮ単独による処理および選別後にＴＲＢＣ陰性（ＴＲＢＣ陰性）。オフターゲット部位は、表１３に標識されている。ＴＲＢＣは、これらの試料における企図される標的部位の修飾を表す。 図１９のパネルＡ〜Ｃは、ＮＹ−ＥＳＯ１特異的ＴＣＲの発現および適切な標的への結合を実証する。図１９Ａは、ＴＣＲ形質導入に先立ち、先ずＴＲＡＣ特異的ＺＦＮで処理して、内因性ＴＣＲアルファ鎖をノックアウトした細胞（「ＳＥ」）またはＮＹ−ＥＳＯ１特異的ＴＣＲ形質導入に先立ちＴＣＲアルファおよびＴＣＲベータ鎖の両方をノックアウトした細胞（「ＣＥ」）と、ＮＹ−ＥＳＯ１特異的ＴＣＲを形質導入したＴ細胞（「移入」）の比較を示す。これら３種のＴ細胞集団における特異的ＴＣＲの発現を示す。図１９Ｂは、ＮＹ−ＥＳＯ１ペプチドで構成されたデキストラマーに対する結合親和性を示し、全内因性ＴＣＲ鎖を欠失した細胞集団（ＣＥ）が、検査したＴ細胞集団で最高の結合親和性を有することを示す。図１９Ｃは、３名の異なるドナーの３回の継続的実験の平均を表すグラフである。最も左のバーは「移入」結果を示し、中央のバーは「ＳＥ」結果を示し、最も右のバーは「ＣＥ」結果を示す。 図２０のパネルＡ〜Ｄは、図１９に記載されているＴ細胞集団の結合および活性を表す。図２０Ａは、ＮＹ−ＥＳＯ１標的に由来するペプチドに対する異なるＴ細胞群の結合を表し、一方、図２０Ｂは、ＨＬＡ−Ａ２−、ＮＹ−ＥＳＯ１−（ＭＭ１Ｓ、「Ａ２−ＥＳＯ−」）またはＨＬＡ−Ａ２＋、ＮＹ−ＥＳＯ１＋（Ｕ２６６、「Ａ２＋ＥＳＯ＋」）のいずれかである骨髄腫細胞株へのＴ細胞の結合を表す。ＭＭ１Ｓ細胞株への結合は、ほぼ検出不能であった。次に、５１クロム放出アッセイによって解析される、適切な細胞標的の溶解を引き起こすその能力に関してＴ細胞を検査し（図２０Ｃおよび図２０Ｄ）、編集ＴＣＲ Ｔ細胞により、無関係細胞と比較して、関連する標的細胞の溶解の増加が観察された。図２０Ａ、図２０Ｃおよび図２０Ｄに関して、未処理細胞（ＵＴ）を黒丸で示し；移入細胞を四角で示し；ＳＥ細胞を黒上三角で示し；ＣＥ細胞を黒下三角で示す。 図２１のパネルＡおよびＢは、異なるＴ細胞集団による共培養実験における細胞の成長阻害を表す。図２１Ａは、Ｕ２６６ ＨＬＡ−Ａ２＋、ＮＹ−ＥＳＯ１＋細胞と比較した、ＨＬＡ−Ａ２−、ＮＹ−ＥＳＯ１−である無関係のＭＭ１Ｓ細胞の成長阻害を表す。図２１Ｂは、編集したＴ細胞が、Ｕ２６６ ＨＬＡ−Ａ２＋、ＮＹ−ＥＳＯ１＋標的の存在下で２倍に増えることを実証する。 図２２のパネルＡ〜Ｄは、ＮＹ−ＥＳＯ１ Ｔ細胞のアロ反応性を表すグラフである。図２２Ａは、５０：１のエフェクター／標的比における表示の細胞型における細胞溶解のパーセントを示す。図２２Ｂは、表示の細胞におけるγ−インターフェロン（γ−ＩＦＮ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す。図２２Ｃは、ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ペプチドをパルスした表示の細胞におけるパーセント細胞溶解を示し、一方、図２２Ｄは、細胞がパルスされない場合に検出される溶解を示す。 図２３のパネルＡおよびＢは、表示の細胞で処理したマウスの骨髄におけるヒト多発性骨髄腫ＣＤ１３８＋細胞（ｈＣＤ１３８＋）のパーセント（図２３Ａ）および表示の細胞で処理したマウスにおける病理学的スコア（ｈＣＤ３＋浸潤）（図２３Ｂ）を表す。 図２３のパネルＡおよびＢは、表示の細胞で処理したマウスの骨髄におけるヒト多発性骨髄腫ＣＤ１３８＋細胞（ｈＣＤ１３８＋）のパーセント（図２３Ａ）および表示の細胞で処理したマウスにおける病理学的スコア（ｈＣＤ３＋浸潤）（図２３Ｂ）を表す。 図２４のパネルＡ〜Ｃは、ＺＦＮコードｍＲＮＡエレクトロポレーションによるＴＣＲ編集を表す。図２４Ａは、ＴＲＡＣ特異的ＺＦＮ ｍＲＮＡ（左のグラフ）またはＴＲＢＣ特異的ＺＦＮ ｍＲＮＡ（右のグラフ）のいずれかを使用したリンパ球へのＺＦＮエレクトロポレーション５日目または２０日後の、表示の投薬量におけるＺＦＮ誘導性ＴＣＲ破壊を表す。図２４Ｂは、処理した細胞の数の増加倍率を表す。ＴＲＡＣ特異的ＺＦＮ処理細胞を最も左のグラフに示し；ＴＲＢＣ−ＺＦＮ処理細胞を中央グラフに示し、対照を最も右のグラフに示す。「ＵＴ」は、未処理細胞を指し；「ＵＴ＋Ｅ」は、ｍｏｃｋエレクトロポレーション細胞を指す。図２４Ｃは、刺激後１８日目の表示の表面表現型のパーセンテージを示す。ＴＲＡＣ−ＺＦＮ処理細胞を最も左のグラフに示し；ＴＲＢＣ−ＺＦＮ処理細胞を中央グラフに示し、対照を最も右のグラフに示す。Ｔステムメモリー細胞（ＴＳＣＭ）は、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ＋として；Ｔセントラルメモリー（ＴＣＭ）は、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ−として；Ｔエフェクターメモリー（ＴＥＭ）は、ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲＡ−として、末端エフェクター（ＴＥＭＲＡ）は、ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲＡ＋として定義する。ＵＴ：未処理細胞；ＵＴ＋Ｅ：ｍｏｃｋエレクトロポレーション細胞；ＧＦＰ：ＧＦＰコードｍＲＮＡをエレクトロポレーションした細胞。 図２５のパネルＡ〜Ｄは、ＺＦＮ ｍＲＮＡエレクトロポレーションによる二重ＴＣＲ編集を表す。図２５Ａは、共処理細胞のＣＤ３陰性画分における完全ＴＣＲ−アルファおよびＴＣＲ−ベータ編集細胞の量を定量化するための代表的解析を示す。単一ＴＣＲ−アルファまたはＴＣＲ−ベータ編集細胞の画分（右の四角に示す）を、外因性ＴＣＲアルファまたはベータ遺伝子との相補性によりＣＤ３の表面発現を回復した形質導入細胞のパーセンテージとして測定した。次に、総ＣＤ３陰性集団における完全編集細胞の量を、単一編集細胞の２種のパーセンテージを減算することにより計算する。図２５Ｂは、偏性ヘテロ二量体ＦｏｋＩドメイン（ＥＬＤおよびＫＫＲ）またはそれらそれぞれのオルソロガスバージョン（ＲＤＤおよびＤＲＲ）を含有する、ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ特異的ＺＦＮコードｍＲＮＡの同時エレクトロポレーションによるＣＤ３陰性細胞のパーセンテージを示すヒストグラムである（左のパネル）。生細胞のパーセンテージ（ヒストグラムの上部に示す）は、シングレットでゲーティングした７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）陰性細胞のパーセンテージとして計算した。７−ＡＡＤは、二本鎖核酸内にインターカレートする。これは、生細胞によって排除されるが、瀕死または死細胞の細胞膜を浸透し得る。図２５Ｂの右のパネルは、上述のＬＶレポーター戦略を使用して計算した、ＣＤ３陰性画分における編集細胞の組成を示す。各バーの上部分は、完全編集のパーセントを示し（左から右に３０％、４０％および４９％）；各バーの中央部分は、ベータ編集細胞のパーセンテージを示し（左から右のバーへと、６％、４４％および２１％）；各バーの下部分は、ＴＣＲ−アルファ編集細胞のパーセントを示す（左から右のバーへと、６４％、１６％および３０％）。図２５Ｃは、刺激後１８日目からのＴ細胞の表面表現型を示す。４種の表現型を示す：各バーの最も下の部分は、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ＋として定義されるステムメモリー（ｓｔｅｍ ｍｅｍｏｒｙ）細胞（ＴＳＣＭ）を示し；各バーの下から２番目の部分は、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ−として定義されるＴセントラルメモリー（ＴＣＭ）を示し；各バーの上から２番目の部分は、ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲＡ−として定義されるＴエフェクターメモリー（ＴＥＭ）を示し、各バーの最も上の部分は、ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲＡ＋として定義される末端エフェクター（ＴＥＭＲＡ）を示す。「ＵＴ」は、未処理細胞を指す。図２５Ｄは、表示用量のＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ特異的ＺＦＮ ｍＲＮＡを同時エレクトロポレーションしたＴ細胞の成長曲線を示す。 図２５のパネルＡ〜Ｄは、ＺＦＮ ｍＲＮＡエレクトロポレーションによる二重ＴＣＲ編集を表す。図２５Ａは、共処理細胞のＣＤ３陰性画分における完全ＴＣＲ−アルファおよびＴＣＲ−ベータ編集細胞の量を定量化するための代表的解析を示す。単一ＴＣＲ−アルファまたはＴＣＲ−ベータ編集細胞の画分（右の四角に示す）を、外因性ＴＣＲアルファまたはベータ遺伝子との相補性によりＣＤ３の表面発現を回復した形質導入細胞のパーセンテージとして測定した。次に、総ＣＤ３陰性集団における完全編集細胞の量を、単一編集細胞の２種のパーセンテージを減算することにより計算する。図２５Ｂは、偏性ヘテロ二量体ＦｏｋＩドメイン（ＥＬＤおよびＫＫＲ）またはそれらそれぞれのオルソロガスバージョン（ＲＤＤおよびＤＲＲ）を含有する、ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ特異的ＺＦＮコードｍＲＮＡの同時エレクトロポレーションによるＣＤ３陰性細胞のパーセンテージを示すヒストグラムである（左のパネル）。生細胞のパーセンテージ（ヒストグラムの上部に示す）は、シングレットでゲーティングした７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）陰性細胞のパーセンテージとして計算した。７−ＡＡＤは、二本鎖核酸内にインターカレートする。これは、生細胞によって排除されるが、瀕死または死細胞の細胞膜を浸透し得る。図２５Ｂの右のパネルは、上述のＬＶレポーター戦略を使用して計算した、ＣＤ３陰性画分における編集細胞の組成を示す。各バーの上部分は、完全編集のパーセントを示し（左から右に３０％、４０％および４９％）；各バーの中央部分は、ベータ編集細胞のパーセンテージを示し（左から右のバーへと、６％、４４％および２１％）；各バーの下部分は、ＴＣＲ−アルファ編集細胞のパーセントを示す（左から右のバーへと、６４％、１６％および３０％）。図２５Ｃは、刺激後１８日目からのＴ細胞の表面表現型を示す。４種の表現型を示す：各バーの最も下の部分は、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ＋として定義されるステムメモリー（ｓｔｅｍ ｍｅｍｏｒｙ）細胞（ＴＳＣＭ）を示し；各バーの下から２番目の部分は、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ−として定義されるＴセントラルメモリー（ＴＣＭ）を示し；各バーの上から２番目の部分は、ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲＡ−として定義されるＴエフェクターメモリー（ＴＥＭ）を示し、各バーの最も上の部分は、ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲＡ＋として定義される末端エフェクター（ＴＥＭＲＡ）を示す。「ＵＴ」は、未処理細胞を指す。図２５Ｄは、表示用量のＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ特異的ＺＦＮ ｍＲＮＡを同時エレクトロポレーションしたＴ細胞の成長曲線を示す。 図２５のパネルＡ〜Ｄは、ＺＦＮ ｍＲＮＡエレクトロポレーションによる二重ＴＣＲ編集を表す。図２５Ａは、共処理細胞のＣＤ３陰性画分における完全ＴＣＲ−アルファおよびＴＣＲ−ベータ編集細胞の量を定量化するための代表的解析を示す。単一ＴＣＲ−アルファまたはＴＣＲ−ベータ編集細胞の画分（右の四角に示す）を、外因性ＴＣＲアルファまたはベータ遺伝子との相補性によりＣＤ３の表面発現を回復した形質導入細胞のパーセンテージとして測定した。次に、総ＣＤ３陰性集団における完全編集細胞の量を、単一編集細胞の２種のパーセンテージを減算することにより計算する。図２５Ｂは、偏性ヘテロ二量体ＦｏｋＩドメイン（ＥＬＤおよびＫＫＲ）またはそれらそれぞれのオルソロガスバージョン（ＲＤＤおよびＤＲＲ）を含有する、ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ特異的ＺＦＮコードｍＲＮＡの同時エレクトロポレーションによるＣＤ３陰性細胞のパーセンテージを示すヒストグラムである（左のパネル）。生細胞のパーセンテージ（ヒストグラムの上部に示す）は、シングレットでゲーティングした７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）陰性細胞のパーセンテージとして計算した。７−ＡＡＤは、二本鎖核酸内にインターカレートする。これは、生細胞によって排除されるが、瀕死または死細胞の細胞膜を浸透し得る。図２５Ｂの右のパネルは、上述のＬＶレポーター戦略を使用して計算した、ＣＤ３陰性画分における編集細胞の組成を示す。各バーの上部分は、完全編集のパーセントを示し（左から右に３０％、４０％および４９％）；各バーの中央部分は、ベータ編集細胞のパーセンテージを示し（左から右のバーへと、６％、４４％および２１％）；各バーの下部分は、ＴＣＲ−アルファ編集細胞のパーセントを示す（左から右のバーへと、６４％、１６％および３０％）。図２５Ｃは、刺激後１８日目からのＴ細胞の表面表現型を示す。４種の表現型を示す：各バーの最も下の部分は、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ＋として定義されるステムメモリー（ｓｔｅｍ ｍｅｍｏｒｙ）細胞（ＴＳＣＭ）を示し；各バーの下から２番目の部分は、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ−として定義されるＴセントラルメモリー（ＴＣＭ）を示し；各バーの上から２番目の部分は、ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲＡ−として定義されるＴエフェクターメモリー（ＴＥＭ）を示し、各バーの最も上の部分は、ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲＡ＋として定義される末端エフェクター（ＴＥＭＲＡ）を示す。「ＵＴ」は、未処理細胞を指す。図２５Ｄは、表示用量のＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ特異的ＺＦＮ ｍＲＮＡを同時エレクトロポレーションしたＴ細胞の成長曲線を示す。
ＴＣＲ遺伝子を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）およびＴＡＬＥＮ（ＴＣＲ−ＺＦＮおよびＴＣＲ−ＴＡＬＥＮ）が、本明細書に開示されている。このようなヌクレアーゼは、例えば、ＴＣＲコード領域における所定の部位に、二本鎖切断（ＤＳＢ）を効率的に生じる。ＴＣＲ遺伝子をコードする遺伝子における部位特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）のＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ媒介性導入は、ヒトＴ細胞を含むヒト細胞における内因性ＴＣＲ複合体の特異的かつ永続的な破壊をもたらし得る。これらの細胞は、ＣＤ３（−）細胞を選択し、これをＩＬ７およびＩＬ１５において培養することにより、プールから選択することができる。加えて、ランダム組込みまたは部位指定標的化組込みのいずれかにより、選択したＴＣＲ導入遺伝子に内因性ＴＣＲ遺伝子を置き換えるための方法および組成物が、本明細書に開示されている。
概要
本明細書に開示されている方法の実施ならびに組成物の調製および使用は、他に断りがなければ、分子生物学、生化学、クロマチン構造および解析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡならびに関連分野における従来技法を当業者の技能範囲内で用いる。これらの技法は、文献中で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年および第３版、２００１年；Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７年および定期更新；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹシリーズ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ、ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ、第３版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９８年；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、３０４巻、「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ」（Ｐ．Ｍ． ＷａｓｓａｒｍａｎおよびＡ． Ｐ． Ｗｏｌｆｆｅ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９９年；ならびにＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、１１９巻、「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｐ．Ｂ． Ｂｅｃｋｅｒ編）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、１９９９年を参照されたい。
定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用されており、直鎖状または環状コンフォメーションの、一本または二本鎖型のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的に解釈するべきではない。この用語は、天然ヌクレオチドの公知のアナログと共に、塩基、糖および／またはリン酸部分で修飾されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格）を包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対形成特異性を有する、即ち、Ａのアナログは、Ｔと塩基対形成する。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すよう互換的に使用されている。この用語は、１個または複数のアミノ酸が相当する天然起源のアミノ酸の化学的アナログまたは修飾誘導体となった、アミノ酸ポリマーにも適用される。
「結合」は、高分子間（例えば、タンパク質と核酸の間）の配列特異的な非共有結合相互作用を指す。全体としての相互作用が配列特異的である限り、結合相互作用のあらゆる構成成分が、配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格におけるリン酸残基との接触）。そのような相互作用は、一般に、１０−６Ｍ−１またはそれ未満の解離定数（Ｋｄ）によって特徴付けられる。「親和性」は、結合の強度を指す：結合親和性の増加は、より低いＫｄに相関する。
「結合タンパク質」は、別の分子に非共有結合的に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、これは、同じタンパク質に結合（してホモ二量体、ホモ三量体等を形成）することができる、および／または１種または複数の異なるタンパク質の１個または複数の分子に結合することができる。結合タンパク質は、２種類以上の結合活性を有することができる。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合およびタンパク質結合活性を有する。
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、亜鉛イオンの配位によりその構造が安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１個または複数のジンクフィンガーを介して配列特異的様式でＤＮＡに結合する、タンパク質または大きいタンパク質内のドメインである。用語、ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質は、多くの場合、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと省略される。
「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１個または複数のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインは、ＴＡＬＥのその同族標的ＤＮＡ配列への結合に関与する。単一の「反復単位」（「反復」とも称される）は、典型的には、３３〜３５アミノ酸長であり、天然起源のＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列と少なくともある程度の配列相同性を提示する。ＴＡＬＥＮは、好ましくは、Ｃ末端ならびに／またはＮ末端短縮（例えば、Ｃ−キャップおよび／もしくはＮ−キャップ）を含む。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。
ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ結合ドメインは、例えば、天然起源のジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域を操作（１個または複数のアミノ酸を変更）することにより、所定のヌクレオチド配列に結合するよう「操作」することができる。したがって、操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、非天然起源のタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は、その設計／組成が主に合理的基準に起因する、天然には発生しないタンパク質である。設計の合理的基準は、現存するＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥ設計および結合データの情報を記憶するデータベース内の情報を処理するための置換規則およびコンピュータ処理アルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号、第６，１４０，０８１号、第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号を参照されたい；ＷＯ９８／５３０５８、ＷＯ９８／５３０５９、ＷＯ９８／５３０６０、ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６も参照されたい。
「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その産生が主にファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択等の経験的プロセスに起因する、天然には存在しないタンパク質である。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号、第５，７８９，５３８号、第５，９２５，５２３号、第６，００７，９８８号、第６，０１３，４５３号、第６，２００，７５９号、ＷＯ９５／１９４３１、ＷＯ９６／０６１６６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ９８／５４３１１、ＷＯ００／２７８７８、ＷＯ０１／６０９７０、ＷＯ０１／８８１９７、ＷＯ０２／０９９０８４を参照されたい。
用語「配列」は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく；直鎖状であっても環状であっても分枝状であってもよく、一本鎖であっても二本鎖であってもよい、いずれかの長さのヌクレオチド配列を指す。用語「ドナー配列」は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、いかなる長さであってもよく、例えば、２〜１０，０００ヌクレオチドの間の長さ（またはその間もしくはそれを超えるいずれかの整数値）、好ましくは、約１００〜１，０００ヌクレオチドの間の長さ（またはその間のいずれかの整数）、より好ましくは、約２００〜５００ヌクレオチドの間の長さとなり得る。
「相同非同一配列」は、第２の配列とある程度の配列同一性を共有するが、その配列が第２の配列と同一ではない第１の配列を指す。例えば、変異体遺伝子の野生型配列を含むポリヌクレオチドは、変異体遺伝子の配列と相同かつ非同一である。ある特定の実施形態において、２種の配列の間の相同性の程度は、正常な細胞機序を利用して、その間の相同組換えを可能にするために十分なものである。２種の相同非同一配列は、いかなる長さであってもよく、それらの非相同性の程度は、単一のヌクレオチドほどに小さくても（例えば、標的化相同組換えによるゲノム点変異の補正のため）、１０キロベースまたはそれを超えるほどに大きくてもよい（例えば、染色体の所定の異所性部位における遺伝子の挿入のため）。相同非同一配列を含む２種のポリヌクレオチドは、同じ長さである必要はない。例えば、２０〜１０，０００ヌクレオチドまたはヌクレオチド対の間の外因性ポリヌクレオチド（即ち、ドナーポリヌクレオチド）を使用することができる。
核酸およびアミノ酸配列同一性を決定するための技法は、本技術分野において公知である。典型的には、斯かる技法は、遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列の決定および／またはそれにコードされるアミノ酸配列の決定、ならびに第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列とのこのような配列の比較を含む。この様式でゲノム配列を決定および比較することもできる。一般に、同一性は、それぞれ２種のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の、正確なヌクレオチド−対−ヌクレオチドまたはアミノ酸−対−アミノ酸の一致を指す。２種またはそれを超える配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらのパーセント同一性を決定することにより比較することができる。核酸であれアミノ酸配列であれ、２種の配列のパーセント同一性は、２種の整列した配列の間の正確なマッチの数を短い方の配列の長さで割り、１００を乗じたものである。核酸配列のおよそのアライメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２巻：４８２〜４８９頁（１９８１年）の局所的相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｍ．Ｏ． Ｄａｙｈｏｆｆ編、５巻、追補３号：３５３〜３５８頁、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．、ＵＳＡにより開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４巻（６号）：６７４５〜６７６３頁（１９８６年）により規格化されたスコアリング行列を使用することにより、アミノ酸配列に適用することができる。配列のパーセント同一性を決定するためのこのアルゴリズムの例示的な実行は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティアプリケーションにおけるＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）により提供される。この方法のためのデフォルトパラメータは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ、バージョン８（１９９５年）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手できる）に記載されている。本開示の文脈におけるパーセント同一性を確立する好ましい方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈが著作権を有し、Ｊｏｈｎ Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋにより開発され、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）により提供されるプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使用することである。このパッケージ一式から、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いることができ、スコアリング表のためにデフォルトパラメータを使用する（例えば、ギャップオープンペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ１およびギャップ６）。作成されたデータから、「マッチ」値は、配列同一性を反映する。配列間のパーセント同一性または類似性を計算するための他の適したプログラムは、一般に、本技術分野において公知であり、例えば、別のアライメントプログラムは、デフォルトパラメータで使用したＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、次のデフォルトパラメータを使用して使用することができる：遺伝暗号＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予想＝１０；行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；選別＝高スコアによる；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、次のインターネットアドレスに見出すことができる：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。本明細書に記載されている配列に関して、配列同一性の所望の程度の範囲は、およそ８０％〜１００％およびその間のいずれかの整数値である。典型的には、配列間のパーセント同一性は、少なくとも７０〜７５％、好ましくは８０〜８２％、より好ましくは８５〜９０％、さらにより好ましくは９２％、なおより好ましくは９５％、最も好ましくは９８％配列同一性である。
あるいは、ポリヌクレオチド間の配列類似性の程度は、相同領域間に安定的二重鎖の形成を可能にする条件下におけるポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションと、続く一本鎖特異的ヌクレアーゼ（複数可）による消化および消化した断片のサイズ決定により決定することができる。上述の方法を使用して決定される通り、配列が、定義される長さの分子にわたり少なくとも約７０％〜７５％、好ましくは８０％〜８２％、より好ましくは８５％〜９０％、さらにより好ましくは９２％、なおより好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性を提示する場合、２種の核酸または２種のポリペプチド配列は、互いに実質的に相同である。本明細書において、実質的に相同とは、指定のＤＮＡまたはポリペプチド配列に対し完全な同一性を示す配列も指す。実質的に相同なＤＮＡ配列は、例えば、このような特定の系に定義されるストリンジェントな条件下のサザンハイブリダイゼーション実験において同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件の定義は、当業者の技能範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記参照；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、編集者Ｂ．Ｄ． ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９８５年）Ｏｘｆｏｒｄ； Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ； ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい。
２種の核酸断片の選択的ハイブリダイゼーションは、次の通り決定することができる。２種の核酸分子間の配列同一性の程度は、斯かる分子間のハイブリダイゼーション事象の効率および強度に影響を与える。部分的に同一の核酸配列は、標的分子への完全に同一の配列のハイブリダイゼーションを少なくとも部分的に阻害する。完全に同一の配列のハイブリダイゼーションの阻害は、本技術分野において周知のハイブリダイゼーションアッセイを使用して評価することができる（例えば、サザン（ＤＮＡ）ブロット、ノーザン（ＲＮＡ）ブロット、溶液ハイブリダイゼーションその他、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９年）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照）。斯かるアッセイは、変動する程度の選択性を使用して、例えば、低から高ストリンジェンシーに変動する条件を使用して行うことができる。低ストリンジェンシーの条件が用いられる場合、非特異的結合の非存在は、非特異的結合事象の非存在下で二次プローブが標的にハイブリダイズしないように、部分的な程度の配列同一性さえも欠く二次プローブ（例えば、標的分子と約３０％未満の配列同一性を有するプローブ）を使用して評価することができる。
ハイブリダイゼーションに基づく検出系を利用する場合、参照核酸配列に相補的な核酸プローブが選択され、続いて適切な条件の選択により、プローブおよび参照配列は、互いに選択的にハイブリダイズまたは結合して、二重鎖分子を形成する。中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で参照配列に選択的にハイブリダイズすることができる核酸分子は、典型的に、選択された核酸プローブの配列と少なくともおよそ７０％配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４ヌクレオチドの長さの標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的に、選択された核酸プローブの配列と約９０〜９５％を超える配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４ヌクレオチドの長さの標的核酸配列の検出を可能にする。特異的な程度の配列同一性を有するプローブ／参照配列ハイブリダイゼーションに有用なハイブリダイゼーション条件は、本技術分野において公知の通りに決定することができる（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、編集者Ｂ．Ｄ． ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９８５年）Ｏｘｆｏｒｄ； Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ； ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓを参照）。
ハイブリダイゼーションの条件は、当業者に周知のものである。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション条件が、ミスマッチしたヌクレオチドを含有するハイブリッドの形成を嫌う程度を指し、より高いストリンジェンシーは、ミスマッチしたハイブリッドに対するより低い耐容能と相関する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える因子は、当業者に周知のものであり、その例として、温度、ｐＨ、イオン強度ならびに例えば、ホルムアミドおよびジメチルスルホキシド等の有機溶媒の濃度が挙げられるがこれらに限定されない。当業者に公知の通り、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、より高い温度、より低いイオン強度およびより低い溶媒濃度により増加する。
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件に関して、多数の均等な条件を用いて、例えば、次の因子を変動させることにより、特定のストリンジェンシーを確立することができることが本技術分野において周知である：配列の長さおよび性質、様々な配列の塩基組成、塩および他のハイブリダイゼーション溶液構成成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液におけるブロッキング剤の有無（例えば、デキストラン硫酸およびポリエチレングリコール）、ハイブリダイゼーション反応温度および時間パラメータならびに変動する洗浄条件。ハイブリダイゼーション条件の特定のセットの選択は、本技術分野における標準方法に従って選択される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９年）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照）。
「組換え」は、２種のポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換過程を指す。本開示の目的のため、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、細胞における二本鎖切断の修復の際に行われる、斯かる交換の特殊化された形態を指す。この過程は、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（即ち、二本鎖切断を経験した分子）の鋳型修復のために「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の移入をもたらすため、「非乗換え遺伝子変換」または「ショートトラクト（ｓｈｏｒｔ ｔｒａｃｔ）遺伝子変換」として様々に公知である。いかなる特定の理論に制約されることも望まないが、斯かる移入は、切断された標的およびドナー間に形成するヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／またはドナーが、標的の一部となる遺伝情報の再合成に使用される「合成依存性鎖アニーリング」、および／または関連する過程に関与し得る。斯かる特殊化されたＨＲは、多くの場合、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全体が標的ポリヌクレオチドに組み入れられるように、標的分子の配列の変更をもたらす。
「開裂」は、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の切断を指す。開裂は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解が挙げられるがこれらに限定されない、種々の方法により開始することができる。一本鎖開裂および二本鎖開裂の両方が可能であり、二本鎖開裂は、２種の明確に異なる一本鎖開裂事象の結果として起こり得る。ＤＮＡ開裂は、平滑末端または付着末端のいずれかの産生をもたらし得る。ある特定の実施形態において、融合ポリペプチドは、標的化二本鎖ＤＮＡ開裂のために使用される。
「開裂ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一であっても異なっていてもよい）と併せて開裂活性（好ましくは、二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。用語「第１および第２の開裂ハーフドメイン」、「＋および−開裂ハーフドメイン」ならびに「右および左開裂ハーフドメイン」は、二量体化する開裂ハーフドメインの対を指すよう互換的に使用される。
「操作された開裂ハーフドメイン」は、別の開裂ハーフドメイン（例えば、別の操作された開裂ハーフドメイン）と偏性（ｏｂｌｉｇａｔｅ）ヘテロ二量体を形成するよう修飾された開裂ハーフドメインである。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，８８８，１２１号、第７，９１４，７９６号、第８，０３４，５９８号、第８，６２３，６１８号および米国特許出願公開第２０１１／０２０１０５５号も参照されたい。
用語「配列」は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく；直鎖状、環状または分枝状であってよく、一本鎖または二本鎖のいずれかであってよい、いずれかの長さのヌクレオチド配列を指す。用語「ドナー配列」は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、いかなる長さを有していてもよく、例えば、２〜１０，０００の間のヌクレオチド長（またはその間もしくはそれを上回るいずれかの整数値）、好ましくは約１００〜１，０００の間のヌクレオチド長（またはその間のいずれかの整数）、より好ましくは、約２００〜５００の間のヌクレオチド長であってもよい。
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含むヌクレオプロテイン構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡと、ヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質とを含む。真核細胞クロマチンの大部分は、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４をそれぞれ２個ずつ含む八量体に会合したおよそ１５０塩基対のＤＮＡを含み、リンカーＤＮＡ（生物に応じた可変性の長さである）は、ヌクレオソームコア間に延在する。ヒストンＨ１分子は、一般に、リンカーＤＮＡに会合する。本開示の目的のため、用語「クロマチン」とは、原核生物および真核生物両方のあらゆる種類の細胞ヌクレオプロテインを包含することを意味する。細胞クロマチンは、染色体およびエピソームクロマチンの両方を含む。
「染色体」は、細胞のゲノムの全体または一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、多くの場合、細胞のゲノムを含む全染色体のコレクションであるその核型により特徴付けられる。細胞のゲノムは、１本または複数の染色体を含むことができる。
「エピソーム」は、複製する核酸、ヌクレオプロテイン複合体または細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む他の構造である。エピソームの例として、プラスミドおよびある特定のウイルスゲノムが挙げられる。
「到達できる領域」は、核酸に存在する標的部位が、該標的部位を認識する外因性分子に結合され得る、細胞クロマチンにおける部位である。いかなる特定の理論に制約されることも望まないが、到達できる領域が、ヌクレオソーム構造へとパッケージされない領域であることが考えられる。到達できる領域の明確な構造は、多くの場合、化学的および酵素的プローブ、例えば、ヌクレアーゼに対するその感受性により検出することができる。
「標的部位」または「標的配列」は、結合に十分な条件が存在する場合に結合分子が結合する核酸の部分を規定する核酸配列である。例えば、配列５’−ＧＡＡＴＴＣ−３’は、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼの標的部位である。
「セーフハーバー遺伝子座」は、外因性核酸を組み込むために使用することができるゲノム内の位置である。セーフハーバー遺伝子座への外因性核酸の付加は、ＤＮＡ単独の付加により、宿主細胞の成長にいかなる有意な効果も引き起こさない。セーフハーバー遺伝子の非限定例として、例えば、ＣＣＲ５遺伝子、ＣＸＣＲ４遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても公知）遺伝子、アルブミン遺伝子またはＲｏｓａ遺伝子が挙げられる。例えば、米国特許第７，９５１，９２５号および第８，１１０，３７９号；米国特許出願公開第２０１０００２１８２６４号；第２０１００２９１０４８号；第２０１２００１７２９０号；第２０１１０２６５１９８号；第２０１３０１３７１０４号；第２０１３０１２２５９１号；第２０１３０１７７９８３号および第２０１３０１７７９６０号を参照されたい。
「外因性」分子は、細胞に通常存在しないが、１種または複数の遺伝学的、生化学的または他の方法により細胞に導入することができる分子である。「細胞における通常の存在」は、細胞の特定の発生ステージおよび環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生においてのみ存在する分子は、成体筋肉細胞に関して外因性分子である。同様に、熱ショックにより誘導される分子は、非熱ショック細胞に関して外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全内因性分子の機能化型または正常に機能する内因性分子の機能不全型を含むことができる。
外因性分子は、とりわけ、コンビナトリアルケミストリープロセスにより作製された小分子等の小分子、またはタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖等の高分子、上述の分子のいずれかの修飾誘導体、または上述の分子のうち１種もしくは複数を含むいずれかの複合体であってもよい。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、直鎖状、分枝状または環状であってもよく、いかなる長さであってもよい。核酸は、二重鎖を形成することができる核酸と共に三重鎖形成核酸を含む。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質として、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼが挙げられるがこれらに限定されない。
外因性分子は、内因性分子と同じ種類の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であってもよい。例えば、外因性核酸は、感染ウイルスゲノム、細胞に導入されたプラスミドもしくはエピソームまたは細胞に通常存在しない染色体を含むことができる。細胞への外因性分子の導入のための方法は、当業者に公知のものであり、その例として、脂質媒介性移入（即ち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注射、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性移入およびウイルスベクター媒介性移入が挙げられるがこれらに限定されない。
対照的に、「内因性」分子は、特定の環境条件下の特定の発生ステージの特定の細胞に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体や、ミトコンドリア、葉緑体もしくは他の細胞小器官のゲノムまたは天然起源のエピソーム核酸を含むことができる。追加的な内因性分子は、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を含むことができる。
「融合」分子は、２個またはそれ超のサブユニット分子が好ましくは共有結合により連結された分子である。サブユニット分子は、同じ化学型の分子であっても、異なる化学型の分子であってもよい。第１の型の融合分子の例として、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよび開裂ドメインの間の融合体）ならびに融合核酸（例えば、上記参照の融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられるがこれらに限定されない。第２の型の融合分子の例として、三重鎖形成核酸およびポリペプチドの間の融合体、ならびに副溝結合体および核酸の間の融合体が挙げられるがこれらに限定されない。
細胞における融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質の送達または細胞への融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達に起因することができ、そのような送達において、ポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて、融合タンパク質を生成する。トランススプライシング、ポリペプチド開裂およびポリペプチドライゲーションも、細胞におけるタンパク質の発現に関与し得る。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチド送達のための方法は、本開示の他の箇所に示されている。
本開示の目的における「遺伝子」は、遺伝子産物（下記参照）をコードするＤＮＡ領域と共に、遺伝子産物の産生を調節するあらゆるＤＮＡ領域を、そのような調節配列がコードおよび／または転写される配列に隣接するか否かにかかわらず含む。したがって、遺伝子として、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位等の翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位ならびに遺伝子座制御領域が挙げられるがこれらに必ずしも限定されない。
「遺伝子発現」は、遺伝子に含有される情報から遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的な転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡまたは他のいずれかの種類のＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳により産生されるタンパク質であってもよい。遺伝子産物は、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化および編集等のプロセスにより修飾されるＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリストイル化（ｍｙｒｉｓｔｉｌａｔｉｏｎ）およびグリコシル化により修飾されるタンパク質も含む。
遺伝子発現の「調節」は、遺伝子の活性の変化を指す。発現の調節として、遺伝子活性化および遺伝子抑制を挙げることができるがこれらに限定されない。調節は、完全であってもよく、即ち、遺伝子発現が完全に不活性化されるまたは野生型レベルまでもしくはそれを超えて活性化される；あるいは部分的であってもよく、遺伝子発現が部分的に低下されるまたは野生型レベルのある割合まで部分的に活性化される。
「真核」細胞として、真菌細胞（酵母等）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられるがこれらに限定されない。
「目的の領域」は、例えば、外因性分子に結合することが望ましい、遺伝子または遺伝子内もしくはそれに隣接する非コード配列等、細胞クロマチンのいずれかの領域である。結合は、標的化されたＤＮＡ開裂および／または標的化された組換えの目的のためとなり得る。目的の領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官のゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）または感染ウイルスゲノムに存在し得る。目的の領域は、遺伝子のコード領域内、例えば、リーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロン等、転写される非コード領域内、またはコード領域の上流もしくは下流いずれかの非転写領域内に存在し得る。目的の領域は、単一ヌクレオチド対の小ささであっても、最大２，０００ヌクレオチド対の長さであっても、いかなる整数値のヌクレオチド対であってもよい。
用語「作動可能な連結」および「作動可能に連結された」（または「操作可能に連結された」）は、２個またはそれ超の構成成分（配列エレメント等）の並置に関連して互換的に使用され、ここでは両方の構成成分が正常通り機能しつつ、構成成分のうち少なくとも１つがそれ以外の構成成分のうち少なくとも１つに働く機能を媒介することが可能になるように構成成分が配置されていることをいう。図解として、転写調節配列が、１種または複数の転写調節因子の存在または非存在に応答してコード配列の転写のレベルを制御する場合、プロモーター等、転写調節配列は、コード配列に作動可能に連結されている。転写調節配列は、一般に、コード配列とシスで作動可能に連結されるが、これと直接隣接している必要はない。例えば、エンハンサーは、近接していなくても、コード配列に作動可能に連結された転写調節配列である。
融合ポリペプチドに関して、用語「作動可能に連結された」は、構成成分のそれぞれが、他の構成成分と連結した状態で、このように連結されていない場合の機能と同じ機能を実行するという事実を指すことができる。例えば、ＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦＰ、ＴＡＬＥ）が開裂ドメイン（例えば、ＦｏｋＩ、メガヌクレアーゼドメイン等、エンドヌクレアーゼドメイン）に融合した融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチドにおいて、開裂（ヌクレアーゼ）ドメインが、標的部位近傍のＤＮＡを開裂することができる一方で、ＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位および／またはその結合部位に結合することができる場合、ＤＮＡ結合ドメインおよび開裂ドメインは、作動可能な連結状態にある。ヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ結合能（例えば、ＤＮＡに結合することもできるＺＦＰまたはＴＡＬＥドメインに融合したヌクレアーゼ）を提示することもできる。同様に、ＤＮＡ結合ドメインが活性化または抑制ドメインに融合した融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチドにおいて、活性化ドメインが、遺伝子発現を上方調節することができる、または抑制ドメインが、遺伝子発現を下方調節することができる一方で、ＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位および／またはその結合部位に結合することができる場合、ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化または抑制ドメインは、作動可能な連結状態にある。
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、その配列は全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を保持するタンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、相当する天然型分子より多い、より少ないもしくは同じ数の残基を保有することができる、および／または１個もしくは複数のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含有することができる。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当該分野において周知のものである。同様に、タンパク質機能を決定するための方法は、周知のものである。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフトまたは免疫沈降アッセイにより決定することができる。ＤＮＡ開裂は、ゲル電気泳動によりアッセイすることができる。Ａｕｓｕｂｅｌら、上記を参照されたい。別のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力は、例えば、免疫共沈降、ツーハイブリッドアッセイまたは遺伝学および生化学両方の相補性により決定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ ３４０巻：２４５〜２４６頁；米国特許第５，５８５，２４５号およびＰＣＴ ＷＯ９８／４４３５０を参照されたい。
「ベクター」は、標的細胞に遺伝子配列を移入することができる。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子移入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を誘導することができ、標的細胞に遺伝子配列を移入することができるいずれかの核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニングおよび発現媒体と共に組み込みベクターを含む。
ヌクレアーゼ
ＴＣＲ遺伝子の不活性化に使用することができるヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮまたはＴＡＬＥヌクレアーゼ）が、本明細書に記載されている。ヌクレアーゼは、天然起源となり得る、あるいはＤＮＡ結合ドメインおよび開裂ドメインのキメラとなり得る。キメラ内において、構成成分であるＤＮＡ結合ドメインおよび開裂ドメインは、両者ともに天然起源であっても、両者ともに非天然起源であっても、一方が天然起源で他方が非天然起源であってもよいことが明らかとなる。
よって、本明細書に開示されている方法において、いかなるヌクレアーゼを使用することもできる。例えば、天然起源のホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼは、非常に長い認識配列を有し、そのうち一部は、統計的基盤で、ヒトサイズのゲノムに１回存在する可能性が高い。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼとして、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩが挙げられる。その認識配列は公知のものである。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５巻：３３７９〜３３８８頁；Ｄｕｊｏｎら（１９８９年）Ｇｅｎｅ ８２巻：１１５〜１１８頁；Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２巻、１１２５〜１１２７頁；Ｊａｓｉｎ（１９９６年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２巻：２２４〜２２８頁；Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２６３巻：１６３〜１８０頁；Ａｒｇａｓｔら（１９９８年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２８０巻：３４５〜３５３頁およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照されたい。
非天然標的部位に結合するようホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの特異性を操作することができることも報告された。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００２年）Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ １０巻：８９５〜９０５頁；Ｅｐｉｎａｔら（２００３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１巻：２９５２〜２９６２頁；Ａｓｈｗｏｒｔｈら（２００６年）Ｎａｔｕｒｅ ４４１巻：６５６〜６５９頁；Ｐａｑｕｅｓら（２００７年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７巻：４９〜６６頁を参照されたい。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、全体としてヌクレアーゼの文脈において変更することができる（即ち、ヌクレアーゼが、同族開裂ドメインを含むように）、あるいは異種ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥ）または異種開裂ドメインに融合することができる。メガヌクレアーゼに由来するＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡ結合活性を提示することもできる。
ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）とも称される、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよび制限エンドヌクレアーゼヌクレアーゼドメインを含む。
他の実施形態において、ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮとも称される、操作されたＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼドメイン（例えば、エンドヌクレアーゼおよび／またはメガヌクレアーゼドメイン）を含む。使用者が選択する標的配列との頑強な部位特異的相互作用のためにこのようなＴＡＬＥＮタンパク質を操作するための方法および組成物が公表された（米国特許第８，５８６，５２６号を参照）。一部の実施形態において、ＴＡＬＥＮは、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインを含む。他の実施形態において、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼは、メガＴＡＬである。このようなメガＴＡＬヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよびメガヌクレアーゼ開裂ドメインを含む融合タンパク質である。メガヌクレアーゼ開裂ドメインは、単量体として活性を有し、活性のために二量体形成を必要としない（Ｂｏｉｓｓｅｌら（２０１３年）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ：１〜１３巻、ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１２２４を参照）。加えて、ヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ結合機能性を提示することもできる。
またさらなる実施形態において、ヌクレアーゼは、コンパクトＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮ）を含む。これは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインをＴｅｖＩ ヌクレアーゼドメインに連結する単鎖融合タンパク質である。融合タンパク質は、ＴＡＬＥ領域により局在化されるニッカーゼとして作用することができる、あるいはＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに対するＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの位置に応じて二本鎖切断を生じることができる（Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙら（２０１３年）Ｎａｔ Ｃｏｍｍ：１〜８巻、ＤＯＩ： １０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ２７８２を参照）。追加的なＴＡＬＥＮ（例えば、１種または複数のメガＴＡＬを有する１種または複数のＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮまたはＦｏｋＩ−ＴＡＬＥＮ））と組み合わせて、いかなるＴＡＬＥＮを使用することもできる。
よって、本明細書に記載されている方法において、特有の標的部位を有するいかなる天然起源または操作されたヌクレアーゼを使用することもできる。
Ａ．ＤＮＡ結合ドメイン
本明細書に記載されているヌクレアーゼは、典型的に、ＤＮＡ結合ドメインおよび開裂ドメインを含む。本発明の実施において、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ由来のＤＮＡ結合ドメイン等が挙げられるがこれらに限定されない、いかなるＤＮＡ結合ドメインを使用することもできる。
ある特定の実施形態において、最適な配列に結合するよう操作されたジンクフィンガー結合ドメインを用いる。例えば、Ｂｅｅｒｌｉら（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０巻：１３５〜１４１頁；Ｐａｂｏら（２００１年）Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０巻：３１３〜３４０頁；Ｉｓａｌａｎら（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９巻：６５６〜６６０頁；Ｓｅｇａｌら（２００１年）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２巻：６３２〜６３７頁；Ｃｈｏｏら（２０００年）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．１０巻：４１１〜４１６頁を参照されたい。同様に、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、最適な配列に結合するよう操作することができる。例えば、８，５８６，５２６を参照されたい。操作されたジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、天然起源のジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質と比較して、新規結合特異性を有し得る。操作方法として、合理的設計および様々な種類の選択が挙げられるがこれらに限定されない。合理的設計は、例えば、各トリプレットまたはクアドラプレットヌクレオチド配列が、特定のトリプレットまたはクアドラプレット配列に結合するジンクフィンガーの１種または複数のアミノ酸配列と関連付けられた、トリプレット（またはクアドラプレット）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用を含む。例えば、参照によりその全体が組み込まれる、共同所有された米国特許第８，５８６，５２６号；第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号を参照されたい。
ファージディスプレイおよびツーハイブリッド系を含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；第５，９２５，５２３号；第６，００７，９８８号；第６，０１３，４５３号；第６，４１０，２４８号；第６，１４０，４６６号；第６，２００，７５９号；および第６，２４２，５６８号；ならびにＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／８８１９７およびＧＢ２，３３８，２３７に開示されている。ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、共同所有されたＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。
他の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む（参照によりその全体が組み込まれる、共同所有された米国特許第８，５８６，５２６号を参照）。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、１個または複数のＴＡＬＥ「反復単位」を含む。単一の「反復単位」（「反復」とも称される）は、典型的に、３３〜３５アミノ酸の長さであり、その１２および／または１３位（高頻度可変性二残基領域または「ＲＶＤ」と称される）が、ＤＮＡヌクレオチドへの結合に関与する。「異型」ＲＶＤは、天然にまれに生じるまたは全く生じないＲＶＤ配列（１２および１３位）であり、例えば、５％未満の天然起源のＴＡＬＥタンパク質、好ましくは、２％未満の天然起源のＴＡＬＥタンパク質、さらにより好ましくは、１％未満の天然起源のＴＡＬＥタンパク質に生じる。異型ＲＶＤは、非天然起源となり得る。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、好ましくは、Ｃ−キャップ配列および任意選択でＮ−キャップ配列を含む。「キャップ」配列は、好ましくは、全長ＴＡＬＥタンパク質に存在するポリペプチドの断片（短縮）、例えば、天然起源のＴＡＬＥタンパク質におけるＴＡＬＥ反復ドメインに隣接するＣおよび／またはＮ末端領域のいずれかの短縮である。Ｃ−キャップは、例えば、野生型Ｃ末端ＴＡＬＥタンパク質（Ｃ−２０から開始して番号をつける）と比較した短縮となることができ、その例として、Ｃ−１９、Ｃ−１８、Ｃ−１７、Ｃ−１６、Ｃ−１５、Ｃ−１４、Ｃ−１３、Ｃ−１２、Ｃ−１１、Ｃ−１０、Ｃ−９、Ｃ−８、Ｃ−７、Ｃ−６、Ｃ−５、Ｃ−４、Ｃ−３、Ｃ−２、Ｃ−１、ポリペプチドのＣ末端に向けた、Ｃ＋１へのインクリメントと、続くＣ＋２、Ｃ＋３等へのインクリメント（例えば、Ｃ＋６３、これはＣ−２０からＣ＋６３へと延長するため、８３アミノ酸の長さである）等が挙げられるがこれらに限定されない。
加えて、上述および他の参考文献に開示される通り、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガージンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、例えば、５個またはそれを超えるアミノ酸の長さのリンカーを含む、いずれか適したリンカー配列を使用して、一体に連結することができる。６個またはそれを超えるアミノ酸の長さの例示的なリンカー配列に関して、米国特許第６，４７９，６２６号；第６，９０３，１８５号；および第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されているタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガーの間に、適したリンカーのいずれかの組合せを含んでいてもよい。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、米国特許第６，７９４，１３６号に記載されている。
標的部位；ＺＦＰＳまたはＴＡＬＥの選択、ならびに融合タンパク質（およびこれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、当業者に公知のものであり、あらゆる目的でその開示が参照によりその全体が組み込まれる、米国特許第６，１４０，０８１号；第５，７８９，５３８号；第６，４５３，２４２号；第６，５３４，２６１号；第５，９２５，５２３号；第６，００７，９８８号；第６，０１３，４５３号；第６，２００，７５９号；ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０；ＷＯ０１／８８１９７；ＷＯ０２／０９９０８４；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６に詳細に記載されている。
加えて、上述および他の参考文献に開示されている通り、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガージンクフィンガータンパク質は、例えば、５個またはそれを超えるアミノ酸の長さのリンカーを含む、いずれか適したリンカー配列を使用して、一体に連結することができる。６個またはそれを超えるアミノ酸の長さの例示的なリンカー配列に関して、米国特許第６，４７９，６２６号；第６，９０３，１８５号；および第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されているタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガーの間に、適したリンカーのいずれかの組合せを含んでいてもよい。
あるいは、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼに由来し得る。例えば、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩ等、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列が公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５巻：３３７９〜３３８８頁；Ｄｕｊｏｎら（１９８９年）Ｇｅｎｅ ８２巻：１１５〜１１８頁；Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２巻、１１２５〜１１２７頁；Ｊａｓｉｎ（１９９６年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２巻：２２４〜２２８頁；Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２６３巻：１６３〜１８０頁；Ａｒｇａｓｔら（１９９８年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２８０巻：３４５〜３５３頁およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照されたい。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然標的部位に結合するよう操作することができる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００２年）Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ １０巻：８９５〜９０５頁；Ｅｐｉｎａｔら（２００３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１巻：２９５２〜２９６２頁；Ａｓｈｗｏｒｔｈら（２００６年）Ｎａｔｕｒｅ ４４１巻：６５６〜６５９頁；Ｐａｑｕｅｓら（２００７年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７巻：４９〜６６頁；米国特許出願公開第２００７０１１７１２８号を参照されたい。
ある特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、少なくとも１個のジンクフィンガーを典型的に含むが、複数のジンクフィンガー（例えば、２、３、４、５、６またはそれ超のフィンガー）を含み得る、操作されたジンクフィンガータンパク質である。通常、ＺＦＰは、少なくとも３個のフィンガーを含む。ある特定のＺＦＰは、４、５または６個のフィンガーを含む。３個のフィンガーを含むＺＦＰは、９または１０ヌクレオチドを含む標的部位を典型的に認識し；４個のフィンガーを含むＺＦＰは、１２〜１４ヌクレオチドを含む標的部位を典型的に認識し；一方、６個のフィンガーを有するＺＦＰは、１８〜２１ヌクレオチドを含む標的部位を認識することができる。ＺＦＰは、１個または複数の調節ドメインを含む融合タンパク質であってもよく、このような調節ドメインは、転写活性化または抑制ドメインであってもよい。
他の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、天然のまたは操作された（天然に存在しない）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，５８６，５２６号を参照）。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の植物病原性細菌は、重要作物植物において多くの疾患を引き起こすことが公知である。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの病原性は、２５種を超える異なるエフェクタータンパク質を植物細胞に注射する、保存されたタイプＩＩＩ分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注射されたタンパク質の中には、植物転写活性化因子を模倣し、植物トランスクリプトームを操作する、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）がある（Ｋａｙら（２００７年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８巻：６４８〜６５１頁および米国特許出願公開第２０１１０２３９３１５を参照）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最もよく特徴付けられたＴＡＬＥの１種は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｇｒｉｓ ｐｖ．Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ由来のＡｖｒＢｓ３である（Ｂｏｎａｓら（１９８９年）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２１８巻：１２７〜１３６頁およびＷＯ２０１００７９４３０を参照）。ＴＡＬＥは、中心に集められた縦列反復のドメインを含有し、各反復は、このタンパク質のＤＮＡ結合特異性の要となるおよそ３４アミノ酸を含有する。加えて、これは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（総説に関しては、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ Ｓら（２００６年）Ｊ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １６３巻（３号）：２５６〜２７２頁を参照）。加えて、植物病原性細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍにおいて、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同のｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と名付けられた２種の遺伝子が、Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ次亜種１系統ＧＭＩ１０００および次亜種４系統ＲＳ１０００において見出された（Ｈｅｕｅｒら（２００７年）Ａｐｐｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒ Ｍｉｃｒｏ ７３巻（１３号）：４３７９〜４３８４頁を参照）。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列が互いに９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の反復ドメインにおける１，５７５ｂｐの欠失により異なる。しかし、両方の遺伝子産物は、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。本明細書に記載されているジンクフィンガーヌクレアーゼは、ＴＣＲ遺伝子において結合する。表５および表６（実施例４を参照）は、ヒトＴＣＲ遺伝子におけるヌクレオチド配列に結合するよう操作された、多数のジンクフィンガー結合ドメインについて記載する。各行は、別々のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインについて記載されている。ドメイン毎のＤＮＡ標的配列を第１の列に示し（ＤＮＡ標的部位を大文字で示し；接触されないヌクレオチドを小文字で示す）、第２から第５の列は、タンパク質におけるジンクフィンガー（Ｆ１からＦ４またはＦ５またはＦ６）それぞれの認識領域（ヘリックスの開始に関してアミノ酸−１から＋６）のアミノ酸配列を示す。第１の列には、タンパク質毎の識別番号も提示される。
ＴＣＲ遺伝子において結合するＴＡＬＥＮについても記載する。表１４（実施例１０を参照）は、ヒトＴＣＲ遺伝子におけるヌクレオチド配列に結合するよう操作されたＴＡＬＥＮについて記載する。各行は、表示数のＲＶＤ含有ドメインを有する別々のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合タンパク質について記載する。ドメイン毎のＤＮＡ標的配列を第１の列に示す（ＤＮＡ標的部位を大文字で示し；接触されないヌクレオチドを小文字で示す）。第１の列には、タンパク質毎の識別番号も提示される。
後述する通り、ある特定の実施形態において、表５および表６に示す４もしくは５フィンガー結合ドメイン、または表１４に示すＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、ＦｏｋＩ等のＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼの開裂ドメイン等、開裂ハーフドメインに融合される。斯かるジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ／ヌクレアーゼハーフドメイン融合体のペアは、例えば、米国特許第８，５８６，５２６号および米国特許出願公開第２００５００６４４７４号に開示される通り、標的化された開裂に使用される。
標的化された開裂のために、結合部位の縁付近は、５またはそれを超えるヌクレオチド対で隔てることができ、融合タンパク質のそれぞれは、ＤＮＡ標的の反対側の鎖に結合することができる。
加えて、これらの天然起源または操作されたヌクレアーゼ由来のドメインは、様々な組合せで単離および使用することもできる。例えば、天然起源または操作されたホーミングエンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼ由来のＤＮＡ結合ドメインは、異種開裂ドメインまたはハーフドメイン（例えば、別のホーミングエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼまたはＩＩＳ型エンドヌクレアーゼに由来）に融合することができる。これらの融合タンパク質は、上述のジンクフィンガーヌクレアーゼと組み合わせて使用することもできる。
本明細書に記載されているヌクレアーゼは、いずれかのＴＣＲゲノム配列におけるいずれかの配列に標的化することができる。
Ｂ．開裂ドメイン
ヌクレアーゼは、異種ＤＮＡ結合および開裂ドメイン（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ；ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインと異種開裂ドメイン）を含むことができる、あるいは、天然起源のヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、選択された標的部位に結合するよう変更することができる（例えば、同族結合部位とは異なる部位に結合するよう操作されたメガヌクレアーゼ）。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）である。天然起源のメガヌクレアーゼは、１５〜４０塩基対開裂部位を認識し、一般に、４種のファミリーにグループ化される：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−ＣｙｓｔボックスファミリーおよびＨＮＨファミリー。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼは、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩを含む。これらの認識配列は公知のものである。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５巻：３３７９〜３３８８頁；Ｄｕｊｏｎら（１９８９年）Ｇｅｎｅ ８２巻：１１５〜１１８頁；Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２巻、１１２５〜１１２７頁；Ｊａｓｉｎ（１９９６年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２巻：２２４〜２２８頁；Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２６３巻：１６３〜１８０頁；Ａｒｇａｓｔら（１９９８年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２８０巻：３４５〜３５３頁およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓのカタログも参照されたい。
主にＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー由来の天然起源のメガヌクレアーゼに由来するＤＮＡ結合ドメインを使用して、植物、酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、哺乳動物細胞およびマウスにおける部位特異的ゲノム修飾を促進してきたが、このアプローチは、メガヌクレアーゼ認識配列を保存するいずれかの相同遺伝子（Ｍｏｎｅｔら（１９９９年）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｏｎ．２５５巻：８８〜９３頁）の修飾または認識配列が導入された操作前ゲノム（Ｒｏｕｔｅら（１９９４年）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．１４巻：８０９６〜１０６頁；Ｃｈｉｌｔｏｎら（２００３年）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．１３３巻：９５６〜６５頁；Ｐｕｃｈｔａら（１９９６年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３巻：５０５５〜６０頁；Ｒｏｎｇら（２００２年）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１６巻：１５６８〜８１頁；Ｇｏｕｂｌｅら（２００６年）Ｊ． Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．８巻（５号）：６１６〜６２２頁）に限定されていた。したがって、医学的または生物工学的に関連する部位において新規結合特異性を提示するよう、メガヌクレアーゼを操作する試みが為された（Ｐｏｒｔｅｕｓら（２００５年）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３巻：９６７〜７３頁；Ｓｕｓｓｍａｎら（２００４年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．３４２巻：３１〜４１頁；Ｅｐｉｎａｔら（２００３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１巻：２９５２〜６２頁；Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００２年）Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ １０巻：８９５〜９０５頁；Ａｓｈｗｏｒｔｈら（２００６年）Ｎａｔｕｒｅ ４４１巻：６５６〜６５９頁；Ｐａｑｕｅｓら（２００７年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７巻：４９〜６６頁；米国特許出願公開第２００７０１１７１２８号、第２００６０２０６９４９号、第２００６０１５３８２６号、第２００６００７８５５２号および第２００４０００２０９２号）。加えて、メガヌクレアーゼ由来の天然起源のまたは操作されたＤＮＡ結合ドメインは、また、異種ヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）由来の開裂ドメインと作動可能に連結されている。
他の実施形態において、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。ＺＦＮは、選択した遺伝子における標的部位に結合するよう操作されたジンクフィンガータンパク質と、開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインとを含む。
上に記す通り、ジンクフィンガー結合ドメインは、選択した配列に結合するよう操作することができる。例えば、Ｂｅｅｒｌｉら（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０巻：１３５〜１４１頁；Ｐａｂｏら（２００１年）Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０巻：３１３〜３４０頁；Ｉｓａｌａｎら（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９巻：６５６〜６６０頁；Ｓｅｇａｌら（２００１年）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２巻：６３２〜６３７頁；Ｃｈｏｏら（２０００年）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．１０巻：４１１〜４１６頁を参照されたい。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然起源のジンクフィンガータンパク質と比較して、新規結合特異性を有することができる。操作方法として、合理的設計および様々な種類の選択が挙げられるがこれらに限定されない。合理的設計は、例えば、三つ組（または四つ組）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用を含み、データベースにおいて、各三つ組または四つ組ヌクレオチド配列は、特定の三つ組または四つ組配列に結合するジンクフィンガーの１種または複数のアミノ酸配列に関連付けられている。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号を参照されたい。
ファージディスプレイおよびツーハイブリッド系を含む例示的選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、第５，９２５，５２３号、第６，００７，９８８号、第６，０１３，４５３号、第６，４１０，２４８号、第６，１４０，４６６号、第６，２００，７５９号および第６，２４２，５６８号ならびにＷＯ９８／３７１８６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ００／２７８７８、ＷＯ０１／８８１９７およびＧＢ２，３３８，２３７に開示されている。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、米国特許第６，７９４，１３６号に記載されている。
標的部位；ＺＦＮの選択ならびに融合タンパク質（およびこれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、当業者に公知のものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，８８８，１２１号および同第８，４０９，８６１号に詳細に記載されている。
加えて、上述および他の参考文献に開示されている通り、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質は、例えば、５個またはそれ超のアミノ酸長のリンカーを含むいずれかの適したリンカー配列を使用して、一緒に連結することができる。例えば、６個またはそれ超のアミノ酸長の例示的なリンカー配列に関して、米国特許第６，４７９，６２６号、第６，９０３，１８５号および第７，１５３，９４９号を参照されたい。本明細書に記載されているタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガーの間に適したリンカーのいずれかの組合せを含むことができる。
一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、操作されたＴＡＬＥＮである。使用者が選択する標的配列との頑強な部位特異的相互作用のためにこのようなタンパク質を操作するための方法および組成物が公表された（米国特許第８，５８６，５２６号を参照）。
ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよび／またはメガヌクレアーゼ等、ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ（開裂ドメイン、開裂ハーフドメイン）も含む。上に記す通り、開裂ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに対し異種であってもよく、例えば、ジンクフィンガーもしくはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ由来の開裂ドメイン、またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼ由来の開裂ドメインであってもよい。異種開裂ドメインは、いずれかのエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。開裂ドメインを得ることができる例示的なエンドヌクレアーゼとして、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、２００２〜２００３年カタログ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ；およびＢｅｌｆｏｒｔら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５巻：３３７９〜３３８８頁を参照されたい。ＤＮＡを開裂させる追加的な酵素は、公知のものである（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；マングビーンヌクレアーゼ；膵臓ＤＮａｓｅＩ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ； Ｌｉｎｎら（編）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９３年も参照）。これらの酵素（またはその機能的断片）のうち１種または複数は、開裂ドメインおよび開裂ハーフドメインの供給源として使用することができる。
同様に、開裂ハーフドメインは、開裂活性のために二量体化を要求する、上に表記されているいずれかのヌクレアーゼまたはその部分に由来するものでもよい。一般に、融合タンパク質が、開裂ハーフドメインを含む場合、開裂のために２個の融合タンパク質が要求される。あるいは、２個の開裂ハーフドメインを含む単一のタンパク質を使用することができる。２個の開裂ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来するものでもよいし、あるいは各開裂ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来するものでもよい。加えて、２個の融合タンパク質の標的部位は、好ましくは、２個の融合タンパク質のそれぞれの標的部位への結合が、例えば二量体化により、開裂ハーフドメインに機能的開裂ドメインを形成させる空間的配向で互いに開裂ハーフドメインを置くように、互いに対して配置される。したがって、ある特定の実施形態において、標的部位の縁付近同士は、５〜８ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチド離間する。しかし、いかなる整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２個の標的部位間に介在してもよい（例えば、２〜５０ヌクレオチド対またはそれ超）。一般に、開裂の部位は、標的部位間に位置する。
これらの酵素（またはその機能断片）のうち１種または複数は、開裂ドメインおよび開裂ハーフドメインの供給源として使用することができる。同様に、開裂ハーフドメインは、開裂活性のために二量体形成を必要とする上記したようなあらゆるヌクレアーゼまたはその部分から得ることができる。一般に、融合タンパク質が、開裂ハーフドメインを含む場合、２個の融合タンパク質が開裂に必要とされる。あるいは、２個の開裂ハーフドメインを含む単一のタンパク質を使用してもよい。２個の開裂ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能断片）から得てもよいし、あるいは各開裂ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能断片）から得てもよい。加えて、２種の融合タンパク質の標的部位は、好ましくは、それぞれの標的部位への２個の融合タンパク質の結合が、開裂ハーフドメインを互いに、開裂ハーフドメインに例えば二量体形成により機能的開裂ドメインを形成させる空間的配向性に置くように、互いに対して配置される。よって、ある特定の実施形態において、標的部位の縁付近は、５〜８ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチド隔てられる。しかし、いかなる整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２個の標的部位の間に介在してもよい（例えば、２〜５０ヌクレオチド対またはそれを超える）。一般に、開裂の部位は、標的部位の間に位置する。
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、（認識部位の）ＤＮＡに配列特異的に結合し、結合の部位またはその付近のＤＮＡを開裂することができる。ある特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から離れた部位のＤＮＡを開裂し、分離可能な結合および開裂ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖のその認識部位から９ヌクレオチドおよび他方の鎖のその認識部位から１３ヌクレオチドにおけるＤＮＡの二本鎖開裂を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、第５，４３６，１５０号および第５，４８７，９９４号ならびにＬｉら（１９９２年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９巻：４２７５〜４２７９頁；Ｌｉら（１９９３年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０巻：２７６４〜２７６８頁；Ｋｉｍら（１９９４年ａ）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１巻：８８３〜８８７頁；Ｋｉｍら（１９９４年ｂ）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２６９巻：３１，９７８−３１、９８２頁を参照されたい。したがって、一実施形態において、融合タンパク質は、操作されていてもされていなくてもよい、少なくとも１種のＩＩＳ型制限酵素由来の開裂ドメイン（または開裂ハーフドメイン）および１種または複数のジンクフィンガー結合ドメインを含む。
その開裂ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的なＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性を有する。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅら（１９９８年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５巻：１０，５７０〜１０，５７５頁。したがって、本開示の目的のため、開示されている融合タンパク質に使用されているＦｏｋＩ酵素の部分は、開裂ハーフドメインとみなされる。したがって、ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合体を使用した細胞配列の標的化二本鎖開裂および／または標的化置き換えのため、それぞれＦｏｋＩ開裂ハーフドメインを含む２個の融合タンパク質を使用して、触媒的に活性な開裂ドメインを再構成することができる。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメインおよび２個のＦｏｋＩ開裂ハーフドメインを含有する単一のポリペプチド分子を使用することもできる。ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合体を使用した標的化開裂および標的化配列変更のためのパラメータは、本開示の他の箇所に提供される。
開裂ドメインまたは開裂ハーフドメインは、開裂活性を保持する、または多量体形成（例えば、二量体化）して機能的開裂ドメインを形成する能力を保持するタンパク質のいずれかの部分であってもよい。
例示的なＩＩＳ型制限酵素は、その全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００７０１３４７９６号に記載されている。追加的な制限酵素は、分離可能な結合および開裂ドメインも含有し、これらは、本開示により企図されている。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら（２００３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１巻：４１８〜４２０頁を参照されたい。
ある特定の実施形態において、例えば、その全ての開示が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，８８８，１２１号；同第８，４０９，８６１号および米国特許出願公開第２００８０１３１９６２号に記載されている通り、開裂ドメインは、ホモ二量体化を最小化または防止する１個または複数の操作された開裂ハーフドメイン（二量体化ドメイン変異体とも称される）を含む。ＦｏｋＩの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７および５３８位におけるアミノ酸残基は全て、ＦｏｋＩ開裂ハーフドメインの二量体化に影響を与えるための標的である。
偏性ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの例示的な操作された開裂ハーフドメインは、第１の開裂ハーフドメインがＦｏｋＩの４９０および５３８位のアミノ酸残基に変異を含み、第２の開裂ハーフドメインがアミノ酸残基４８６および４９９に変異を含む対を含む。
したがって、特定の実施形態において、４９０位における変異は、Ｇｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）に置き換え；５３８位における変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に置き換え；４８６位における変異は、Ｇｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）に置き換え；４９９位における変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）に置き換える。特に、ある開裂ハーフドメインにおいて４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）を変異させて、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と名付けられた操作された開裂ハーフドメインを産生することにより、また、別の開裂ハーフドメインにおいて４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を変異させて、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と名付けられた操作された開裂ハーフドメインを産生することにより、本明細書に記載されている操作された開裂ハーフドメインを調製した。本明細書に記載されている操作された開裂ハーフドメインは、異常な開裂が最小化または消滅した偏性ヘテロ二量体変異体である。例えば、あらゆる目的でその開示が参照によりその全体が組み込まれる、米国特許第７，８８８，１２１号を参照されたい。
本明細書に記載されている操作された開裂ハーフドメインは、いずれか適した方法を使用して、例えば、米国特許第７，８８８，１２１号に記載されている野生型開裂ハーフドメイン（ＦｏｋＩ）の部位指定変異誘発により調製することができる。
本明細書に記載されている操作された開裂ハーフドメインは、異常開裂が最小化または消失した、偏性ヘテロ二量体変異体となり得る。例えば、ＷＯ０７／１３９８９８の実施例１を参照されたい。ある特定の実施形態において、操作された開裂ハーフドメインは、４８６、４９９および４９６位（野生型ＦｏｋＩに対して番号を付ける）における変異、例えば、４８６位における野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基に、４９９位における野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基に、４９６位における野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基に置き換える変異（それぞれ「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ドメインとも称される）を含む。他の実施形態において、操作された開裂ハーフドメインは、４９０、５３８および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して番号を付ける）における変異、例えば、４９０位における野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基に、５３８位における野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基に、５３７位における野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基に置き換える変異（それぞれ「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインとも称される）を含む。他の実施形態において、操作された開裂ハーフドメインは、４９０および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して番号を付ける）における変異、例えば、４９０位における野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基に、５３７位における野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基に置き換える変異（それぞれ「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインとも称される）を含む。米国特許第７，８８８，１２１号ならびに米国特許出願公開第２００８０１３１９６２号および同第２０１１０２０１０５５号に記載されている通り、本明細書に記載されている操作された開裂ハーフドメインは、いずれかの適した方法を使用して、例えば、野生型開裂ハーフドメイン（ＦｏｋＩ）の部位特異的変異誘発により調製することができる。
あるいは、ヌクレアーゼは、いわゆる「分割酵素」技術（例えば、米国特許出願公開第２００９００６８１６４号を参照）を使用して、核酸標的部位にｉｎ ｖｉｖｏで組み立てることができる。このような分割酵素の構成成分は、別々の発現構築物において発現させることができる、あるいは、例えば自己開裂性２ＡペプチドまたはＩＲＥＳ配列により個々の構成成分を離間させて、１個のオープンリーディングフレーム内に連結することができる。構成成分は、個々のジンクフィンガー結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであってもよい。
あるいは、「シャーキー」として公知のＦｏｋＩヌクレアーゼドメインバリアントを使用することができる（Ｇｕｏら（２０１０年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｍｂ．２０１０．０４．０６０を参照）。
ヌクレアーゼ発現構築物は、当該分野で公知の方法を使用して容易に設計することができる。例えば、米国特許第７，８８８，１２１号および同第８，４０９，８６１号ならびに米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号、第２００５０２０８４８９号、第２００５００２６１５７号、第２００６００６３２３１号および同第２００７０１３４７９６号を参照されたい。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼの発現は、誘導性プロモーター、例えば、ラフィノースおよび／またはガラクトースの存在下で活性化（抑制解除）され、グルコースの存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーターの制御下にある。特に、炭素源の逐次的な変化（例えば、グルコース〜ラフィノース〜ガラクトース）に応じて、ガラクトキナーゼプロモーターが誘導され、ヌクレアーゼ（複数可）が発現される。誘導性プロモーターの他の非限定的な例として、ＣＵＰ１、ＭＥＴ１５、ＰＨＯ５およびｔｅｔ応答性プロモーターが挙げられる。
ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ；クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ；ＣＲＩＳＰＲ関連）ヌクレアーゼ系は、ゲノム操作に使用することができる細菌系に基づく、近年操作されたヌクレアーゼ系である。これは、多くの細菌および古細菌の適応免疫応答の一部に基づく。ウイルスまたはプラスミドが、細菌に侵入すると、侵入者のＤＮＡのセグメントは、「免疫」応答によってＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に変換される。次に、このｃｒＲＮＡは、部分的相補性の領域を介して、ｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれる別の種類のＲＮＡと会合して、「プロトスペーサー」と呼ばれる標的ＤＮＡにおけるｃｒＲＮＡと相同な領域へとＣａｓ９ヌクレアーゼをガイドする。Ｃａｓ９は、ＤＮＡを開裂させて、ｃｒＲＮＡ転写物内に含有される２０ヌクレオチドガイド配列によって指定されるＤＳＢ部位に平滑断端を生じる。Ｃａｓ９は、部位特異的ＤＮＡ認識および開裂のために、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方を必要とする。この系は、現在、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを１分子に組み合わせ（「単一ガイドＲＮＡ」）、単一ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ相当部分を、いずれか所望の配列を標的化するためにＣａｓ９ヌクレアーゼをガイドするよう操作することができるように、操作されている（Ｊｉｎｅｋら（２０１２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７巻、８１６〜８２１頁、Ｊｉｎｅｋら（２０１３年）ｅＬｉｆｅ ２巻：ｅ００４７１頁およびＤａｖｉｄ Ｓｅｇａｌ（２０１３年）ｅＬｉｆｅ ２巻：ｅ００５６３頁を参照）。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ゲノムにおける所望の標的にＤＳＢを作製するよう操作することができ、ＤＳＢの修復は、修復阻害剤の使用により影響されて、誤りがちな修復の増加を引き起こし得る。
Ａ．標的部位
上に詳細に記載されている通り、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮにおけるＤＮＡドメインは、遺伝子座におけるいずれかの選択した配列に結合するよう操作することができる。操作されたＤＮＡ結合ドメインは、天然起源のＤＮＡ結合ドメインと比較して、新規結合特異性を有することができる。操作方法として、合理的設計および様々な種類の選択が挙げられるがこれらに限定されない。合理的設計は、例えば、三つ組（または四つ組）ヌクレオチド配列および個々の（例えば、ジンクフィンガー）アミノ酸配列を含むデータベースの使用を含み、該データベースにおいて、各三つ組または四つ組ヌクレオチド配列は、特定の三つ組または四つ組配列に結合するＤＮＡ結合ドメインの１種または複数のアミノ酸配列に関連付けられている。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５８６，５２６号、同第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号を参照されたい。ＴＡＬエフェクタードメインの合理的設計を行うこともできる。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。
ファージディスプレイおよびツーハイブリッド系を含む、ＤＮＡ結合ドメインに適用可能な例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、第５，９２５，５２３号、第６，００７，９８８号、第６，０１３，４５３号、第６，４１０，２４８号、第６，１４０，４６６号、第６，２００，７５９号および第６，２４２，５６８号ならびにＷＯ９８／３７１８６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ００／２７８７８、およびＷＯ０１／８８１９７に開示されている。
標的部位；ヌクレアーゼの選択ならびに融合タンパク質（およびこれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、当業者に公知のものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，８８８，１２１号および第８，４０９，８６１号に詳細に記載されている。
加えて、上述および他の参考文献に開示されている通り、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、マルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質）は、例えば、５個またはそれ超のアミノ酸のリンカーを含むいずれかの適したリンカー配列を使用して、一緒に連結することができる。例えば、６個またはそれ超のアミノ酸長の例示的なリンカー配列に関して、米国特許第６，４７９，６２６号、第６，９０３，１８５号および第７，１５３，９４９号を参照されたい。本明細書に記載されているタンパク質は、該タンパク質の個々のＤＮＡ結合ドメインの間に適したリンカーのいずれかの組合せを含むことができる。米国特許第８，５８６，５２６号も参照されたい。
その上、単一ガイドＲＮＡは、特異的ＲＮＡ配列を作製するための当該分野で公知の一般に知られた方法により、ゲノムにおける選択した標的に結合するよう操作することができる。このような単一ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９をいずれかの選ばれた標的部位へとガイドするよう設計される。
ドナー
上に記す通り、例えば、変異体遺伝子の補正のためまたは野生型遺伝子の発現増加のために、外因性配列（「ドナー配列」または「ドナー」とも呼ばれる）の挿入を行うこともできる。ドナー配列は、典型的に、該ドナー配列が配置されるゲノム配列と同一ではないことが容易に明らかとなる。ドナー配列は、相同性の２領域に隣接する非相同配列を含有して、目的の位置における効率的ＨＤＲを可能にすることができる。その上、ドナー配列は、細胞クロマチンにおける目的の領域と相同ではない配列を含有するベクター分子を含むことができる。ドナー分子は、細胞クロマチンに対し相同性のいくつかの不連続領域を含有することができる。例えば、目的の領域に通常存在しない配列の標的化挿入のため、前記配列は、ドナー核酸分子に存在し、目的の領域における配列に対し相同性の領域に隣接することができる。あるいは、ドナー分子は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）機序によって、開裂された標的遺伝子座に組み込むことができる。例えば、米国特許出願公開第２０１１０２０７２２１号および第２０１３０３２６６４５号を参照されたい。
ドナーポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、直鎖状または環状形態で細胞に導入することができる。例えば、米国特許出願公開第２０１０００４７８０５号、第２０１１０２８１３６１号および第２０１１０２０７２２１号を参照されたい。直鎖状形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者に公知の方法により（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）保護することができる。例えば、１個または複数のジデオキシヌクレオチド残基を直鎖状分子の３’末端に付加したり、および／または自己相補的オリゴヌクレオチドを片方または両方の末端にライゲーションしたりする。例えば、Ｃｈａｎｇら（１９８７年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４巻：４９５９〜４９６３頁；Ｎｅｈｌｓら（１９９６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２巻：８８６〜８８９頁を参照されたい。分解から外因性ポリヌクレオチドを保護するための追加的な方法として、末端アミノ基（複数可）の付加、ならびに例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミデートおよびＯ−メチルリボースまたはデオキシリボース残基等の修飾されたヌクレオチド間連結の使用が挙げられるがこれらに限定されない。
ポリヌクレオチドは、例えば、複製起点、プロモーターおよび抗生物質抵抗性をコードする遺伝子等、追加的な配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入することができる。さらに、ドナーポリヌクレオチドは、ネイキッド核酸としてまたはリポソームもしくはポロキサマー等の薬剤と複合体形成した核酸として導入することができる、あるいはウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスおよびインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））により送達することができる。
組込み部位における内因性プロモーター、即ち、ドナーが挿入される内因性遺伝子（例えば、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、アルブミン、ＨＰＲＴなど）の発現を駆動するプロモーターによってその発現が駆動され得るように、ドナーは、一般に挿入される。しかし、ドナーが、プロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば、構成的プロモーターまたは誘導性もしくは組織特異的プロモーターを含むことができることが明らかとなる。
ドナー分子は、内因性遺伝子の全てもしくは一部が発現されるまたは全く発現されないように、内因性遺伝子に挿入することができる。例えば、本明細書に記載されている導入遺伝子は、例えば導入遺伝子との融合体として、内因性配列の一部（導入遺伝子に対しＮ末端および／またはＣ末端）が発現されるまたは全く発現されないように、内因性遺伝子座に挿入することができる。他の実施形態において、導入遺伝子（例えば、内因性遺伝子等の追加的なコード配列ありまたはなしの）は、いずれかの内因性遺伝子座、例えば、セーフハーバー遺伝子座に組み込まれる。
内因性配列（内因性または導入遺伝子の一部）が、導入遺伝子と共に発現される場合、内因性配列は、全長配列（野生型または変異体）または部分的配列であってもよい。好ましくは、内因性配列は、機能的である。このような全長または部分的配列の機能の非限定的な例として、導入遺伝子（例えば、治療遺伝子）により発現されるポリペプチドの血清半減期の増加および／または担体としての作用が挙げられる。
さらに、発現には必須ではないが、外因性配列は、転写または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列および／またはポリアデニル化シグナルを含むこともできる。
送達
本明細書に記載されている組成物（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）、これをコードするポリヌクレオチド、いずれかのドナーポリヌクレオチドは、いずれか適した手段により、ＴＣＲ遺伝子を含有する標的細胞に送達することができる。ＤＮＡ結合ドメインを含む組成物を送達する方法は、例えば、参照によりこれら全ての開示全体が組み込まれる、米国特許第６，４５３，２４２号；第６，５０３，７１７号；第６，５３４，２６１号；第６，５９９，６９２号；第６，６０７，８８２号；第６，６８９，５５８号；第６，８２４，９７８号；第６，９３３，１１３号；第６，９７９，５３９号；第７，０１３，２１９号；および第７，１６３，８２４号に記載されている。
本明細書に記載されているジンクフィンガー、ＴＡＬＥまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質（複数可）のうち１種または複数をコードする配列を含有するベクターを使用して送達することもできる。ドナーコードポリヌクレオチドを同様に送達することができる。プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター等が挙げられるがこれらに限定されない、いずれかのベクター系を使用することができる。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５３４，２６１号、第６，６０７，８８２号、第６，８２４，９７８号、第６，９３３，１１３号、第６，９７９，５３９号、第７，０１３，２１９号および第７，１６３，８２４号も参照されたい。さらに、これらのベクターのうちいずれかが、１種もしくは複数のジンクフィンガータンパク質コード配列、１種もしくは複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコード配列または１種もしくは複数のＴＡＬＥコード配列を含み得ることが明らかとなる。したがって、１種または複数のヌクレアーゼまたはヌクレアーゼ系および／またはドナーが、細胞に導入される場合、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼ系および／またはドナーは、同じベクターまたは異なるベクターにおいて運ばれ得る。複数のベクターが使用される場合、各ベクターは、１種または複数種のＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、および／またはドナーをコードする配列を含むことができる。
従来のウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子移入方法を使用して、操作されたＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、および／またはドナーをコードする核酸を細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的組織に導入することができる。このような方法を使用して、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、および／またはドナーをコードする核酸を細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで投与することもできる。ある特定の実施形態において、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、および／またはドナーをコードする核酸は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子療法使用のために投与される。非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミド、ネイキッド核酸、およびリポソームまたはポロキサマー等の送達ビヒクルと複合体形成した核酸を含む。ウイルスベクター送達系は、細胞への送達後にエピソームとなるかまたは組み込まれるゲノムのいずれかを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含む。遺伝子療法手順の総説に関して、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６巻：８０８〜８１３頁（１９９２年）；ＮａｂｅｌおよびＦｅｌｇｎｅｒ、ＴＩＢＴＥＣＨ １１巻：２１１〜２１７頁（１９９３年）；ＭｉｔａｎｉおよびＣａｓｋｅｙ、ＴＩＢＴＥＣＨ １１巻：１６２〜１６６頁（１９９３年）；Ｄｉｌｌｏｎ、ＴＩＢＴＥＣＨ １１巻：１６７〜１７５頁（１９９３年）；Ｍｉｌｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ ３５７巻：４５５〜４６０頁（１９９２年）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６巻（１０号）：１１４９〜１１５４頁（１９８８年）；Ｖｉｇｎｅ、Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８巻：３５〜３６頁（１９９５年）；ＫｒｅｍｅｒおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１巻（１号）：３１〜４４頁（１９９５年）；Ｈａｄｄａｄａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ内、ＤｏｅｒｆｌｅｒおよびＢｏｅｈｍ（編）（１９９５）；ならびにＹｕら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １巻：１３〜２６頁（１９９４年）を参照されたい。
核酸の非ウイルス送達方法は、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、人工ビリオンおよび薬剤増強されたＤＮＡ取込みを含むことができる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用したソノポレーションは、核酸の送達のために使用することもできる。好まれる実施形態において、１種または複数の核酸がｍＲＮＡとして送達される。翻訳効率および／またはｍＲＮＡ安定性を増加させるためのキャッピングされたｍＲＮＡの使用も好まれる。ＡＲＣＡ（アンチリバースキャップアナログ）キャップまたはそのバリアントが特に好まれる。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７０７４５９６号および第８１５３７７３号を参照されたい。
追加的な例示的な核酸送達系は、Ａｍａｘａ（登録商標）Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ、Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．（例えばＵＳ６００８３３６を参照）によって提供される送達系を含む。リポフェクションは、例えば、ＵＳ５，０４９，３８６、ＵＳ４，９４６，７８７およびＵＳ４，８９７，３５５に記載されており、リポフェクション試薬は、商業的に販売されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標），Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適したカチオン性および中性脂質は、Ｆｅｌｇｎｅｒ、ＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４の脂質を含む。細胞（ｅｘ ｖｉｖｏ投与）または標的組織（ｉｎ ｖｉｖｏ投与）に送達することができる。
免疫脂質（ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｉｄ）複合体等、標的化リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知のものである（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０巻：４０４〜４１０頁（１９９５年）；Ｂｌａｅｓｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２巻：２９１〜２９７頁（１９９５年）；Ｂｅｈｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５巻：３８２〜３８９頁（１９９４年）；Ｒｅｍｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５巻：６４７〜６５４頁（１９９４年）；Ｇａｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２巻：７１０〜７２２頁（１９９５年）；Ａｈｍａｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２巻：４８１７〜４８２０頁（１９９２年）；米国特許第４，１８６，１８３号、第４，２１７，３４４号、第４，２３５，８７１号、第４，２６１，９７５号、第４，４８５，０５４号、第４，５０１，７２８号、第４，７７４，０８５号、第４，８３７，０２８号および第４，９４６，７８７号を参照）。
送達の追加的な方法は、ＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）への送達すべき核酸のパッケージングの使用を含む。このようなＥＤＶは、抗体の一方のアームが標的組織に対する特異性を有し、他方のアームがＥＤＶに対する特異性を有する二特異性抗体を使用して、標的組織へと特異的に送達される。抗体は、標的細胞表面へとＥＤＶを運び、続いてＥＤＶは、エンドサイトーシスにより細胞内に運ばれる。細胞内に入ると、内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄら（２００９年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７巻（７号）６４３頁を参照）。
操作されたＺＦＰ、ＴＡＬＥおよび／またはドナーをコードする核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスに基づく系の使用は、体内の特異的な細胞にウイルスを標的化し、核へとウイルスペイロードを輸送するための高度に進化したプロセスを活用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与されてもよいし（ｉｎ ｖｉｖｏ）、あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞の処理に使用して、修飾された細胞が患者に投与されてもよい（ｅｘ ｖｉｖｏ）。ＺＦＰの送達のための従来のウイルスに基づく系として、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴、ワクシニアおよび単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられるがこれらに限定されない。宿主ゲノムにおける組込みは、レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス遺伝子移入方法により可能となり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。その上、多くの異なる細胞型および標的組織において、高い形質導入効率が観察された。
レトロウイルスの向性は、外来性エンベロープタンパク質を組み入れ、標的細胞の潜在的標的集団を増やすことにより変更することができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入または感染し、典型的に高ウイルス力価を産生することができるレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子移入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外来性配列のパッケージング能力を有するシス作用性末端反復配列で構成される。最小シス作用性ＬＴＲは、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、これは次に、標的細胞への治療遺伝子の組み込みに使用されて、永続的導入遺伝子発現をもたらす。広く使用されるレトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびこれらの組合せに基づくベクターを含む（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．６６巻：２７３１〜２７３９頁（１９９２年）；Ｊｏｈａｎｎら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．６６巻：１６３５〜１６４０頁（１９９２年）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら、Ｖｉｒｏｌ．１７６巻：５８〜５９頁（１９９０年）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．６３巻：２３７４〜２３７８頁（１９８９年）；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．６５巻：２２２０〜２２２４頁（１９９１年）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照）。一過性発現が好まれる適用において、アデノウイルスに基づく系を使用することができる。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型における非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を要求しない。このようなベクターにより、高力価および高レベルの発現が得られた。このベクターは、比較的単純な系において多量に産生することができる。例えば、核酸およびペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生において、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子療法手順のために、アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターも使用して標的核酸を細胞に形質導入する（例えば、Ｗｅｓｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０巻：３８〜４７頁（１９８７年）；米国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ９３／２４６４１；Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５巻：７９３〜８０１頁（１９９４年）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．９４巻：１３５１頁（１９９４年）を参照）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．５巻：３２５１〜３２６０頁（１９８５年）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．４巻：２０７２〜２０８１頁（１９８４年）；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ、ＰＮＡＳ ８１巻：６４６６〜６４７０頁（１９８４年）；ならびにＳａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．６３巻：０３８２２〜３８２８頁（１９８９年）を含む多数の刊行物に記載されている。
臨床治験における遺伝子移入のために、少なくとも６種のウイルスベクターアプローチが現在利用でき、これらは、ヘルパー細胞株に挿入された遺伝子による欠損ベクターの相補性に関与するアプローチを利用して、形質導入媒介物（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を作製するものである。
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床治験において使用されたレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒら、Ｂｌｏｏｄ ８５巻：３０４８〜３０５頁（１９９５年）；Ｋｏｈｎら、Ｎａｔ． Ｍｅｄ．１巻：１０１７〜１０２頁（１９９５年）；Ｍａｌｅｃｈら、ＰＮＡＳ ９４巻：２２号、１２１３３〜１２１３８頁（１９９７年））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子療法治験において使用された最初の治療ベクターであった（Ｂｌａｅｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０巻：４７５〜４８０頁（１９９５年））。ＭＦＧ−Ｓパッケージングベクターには、５０％またはそれ超の形質導入効率が観察された（Ｅｌｌｅｍら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４巻（１号）：１０〜２０頁（１９９７年）；Ｄｒａｎｏｆｆら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１巻：１１１−２頁（１９９７年））。
本明細書に記載されているポリヌクレオチドの導入に適したベクターは、非組み込み型レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）も含む。例えば、Ｏｒｙら（１９９６年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３巻：１１３８２〜１１３８８頁；Ｄｕｌｌら（１９９８年）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．７２巻：８４６３〜８４７１頁；Ｚｕｆｆｅｒｙら（１９９８年）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．７２巻：９８７３〜９８８０頁；Ｆｏｌｌｅｎｚｉら（２０００年）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５巻：２１７〜２２２頁；米国特許出願公開第２００９０１１７６１７号を参照されたい。
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損および非病原性パルボウイルスアデノ随伴型ウイルスに基づく有望な代替的遺伝子送達系である。ベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶ １４５ｂｐ逆位末端配列のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入細胞のゲノムへの組込みによる効率的遺伝子移入および安定的導入遺伝子送達は、このベクター系の要となる特色である（Ｗａｇｎｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ ３５１巻：９１１７号、１７０２〜３頁（１９９８年）、Ｋｅａｒｎｓら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９巻：７４８〜５５頁（１９９６年））。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６およびＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９およびＡＡＶ ｒｈ１０、ならびにＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６等の偽型ＡＡＶを含む他のＡＡＶ血清型を本発明に従って使用することもできる。
ある特定の実施形態において、ベクターは、レンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターは、本明細書において、レンチウイルスに由来し得る少なくとも１種の構成部分を含むベクターである。レンチウイルスの詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎら（１９９７年）「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、編：ＪＭ Ｃｏｆｆｉｎ， ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ， ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ、７５８〜７６３頁）に見出すことができる。レンチウイルスベクターは、一般に、本技術分野において周知の方法により産生することができる。例えば、米国特許第５，９９４，１３６号；第６，１６５，７８２号；および第６，４２８，９５３号を参照されたい。好ましくは、レンチウイルスベクターは、インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）である。例えば、米国特許出願公開第２００９／０１１７６１７号を参照されたい。ＩＤＬＶは、記載されている通りに、例えば、天然のレンチウイルスインテグラーゼ遺伝子に１個または複数の変異を含むレンチウイルスベクターを使用して、例えば、Ｌｅａｖｉｔｔら（１９９６年）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．７０巻（２号）：７２１〜７２８頁；Ｐｈｉｌｉｐｐｅら（２００６年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ １０３巻（４７号）：１７６８４〜１７６８９頁；およびＷＯ０６／０１０８３４に開示されている通りに、産生することができる。ある特定の実施形態において、ＩＤＬＶは、Ｌｅａｖｉｔｔら（１９９６年）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．７０巻（２号）：７２１〜７２８頁に記載されている通り、インテグラーゼタンパク質の６４位に変異を含む（Ｄ６４Ｖ）ＨＩＶレンチウイルスベクターである。
ある特定の実施形態において、ベクターは、アデノウイルスベクターである。本願において使用することができるＡｄベクターの非限定例として、ヒトまたは非ヒト血清型（例えば、Ａｄ５、Ａｄ１１、Ａｄ３５またはブタアデノウイルス−３）に由来する組換え（Ｅ１欠失等）、条件的な複製可能（腫瘍溶解性等）および／または複製可能Ａｄベクター；および／またはキメラＡｄベクター（Ａｄ５／Ｆ３５等）または操作された線維（例えば、ｋｎｏｂまたはｓｈａｆｔ）タンパク質（ｋｎｏｂタンパク質のＨＩループ内のペプチド挿入等）を有するトロピズム変更Ａｄベクターが挙げられる。「ｇｕｔｌｅｓｓ」Ａｄベクター、例えば、免疫原性を低下させ、ＤＮＡペイロードのサイズを増加させるために全アデノウイルス遺伝子が除去されたＡｄベクターも有用である。これは、例えば、ＺＦＮをコードする配列およびドナー配列の同時送達を可能にする。ドナー配列が、標的化組込みにより組み込むための大型の導入遺伝子を含む場合、斯かるｇｕｔｌｅｓｓベクターが特に有用である。
複製欠損組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）を高力価で産生し、多数の異なる細胞型を容易に感染させることができる。導入遺伝子が、Ａｄ Ｅ１ａ、Ｅ１ｂおよび／またはＥ３遺伝子を置き換え、その後、欠失した遺伝子機能の１つ以上をトランスで提供する細胞に複製欠損ベクターが伝播されるように、大部分のアデノウイルスベクターが操作される。例えば、ヒト２９３細胞は、Ｅ１機能を供給する。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓および筋肉に存在する細胞等、非分裂分化細胞を含む、複数の型の組織にｉｎ ｖｉｖｏで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きな運搬能力を有する。臨床治験におけるＡｄベクターの使用例は、筋肉内注射による抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド治療法に関与した（Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７巻：１０８３〜１０８９頁（１９９８年））。
パッケージング細胞は、宿主細胞に感染することができるウイルス粒子の形成に使用される。このような細胞は、アデノウイルス、ＡＡＶをパッケージングする２９３細胞と、レトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞とを含む。遺伝子療法において使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングする産生株の細胞株によって作製される。ベクターは、典型的に、パッケージングおよびその後の宿主への組込み（適用可能であれば）に要求される最小ウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現させようとするタンパク質をコードする発現カセットに置き換えられている。失われているウイルス機能は、パッケージング細胞株によりトランスで供給される。例えば、遺伝子療法において使用されるＡＡＶベクターは、典型的に、パッケージングおよび宿主ゲノムへの組込みに要求されるＡＡＶゲノム由来の逆位末端（ＩＴＲ）配列のみを保有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、即ち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列が欠失したヘルパープラスミドを含有する細胞株にパッケージングされる。細胞株は、ヘルパーとしてのアデノウイルスにも感染される。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如により、相当量ではパッケージングされない。アデノウイルスの混入は、例えば、アデノウイルスの方がＡＡＶよりも感受性が高い熱処理により低下させることができる。その上、ＡＡＶは、バキュロウイルス系を使用して、臨床スケールで産生することができる（米国特許第７，４７９，５５４号を参照）。
臨床治験における遺伝子移入のためのアデノウイルスベクターの使用の追加的な例として、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２４巻：１ ５〜１０頁（１９９６年）；Ｗｅｌｓｈら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２巻：２０５〜１８頁（１９９５年）；Ａｌｖａｒｅｚら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５巻：５９７〜６１３頁（１９９７年）；Ｔｏｐｆら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５巻：５０７〜５１３頁（１９９８年）が挙げられる。
ある特定の実施形態において、Ａｄベクターは、２種またはそれを超える異なるアデノウイルスゲノムに由来する配列を含有するキメラアデノウイルスベクターである。例えば、Ａｄベクターは、Ａｄ５／Ｆ３５ベクターとなり得る。Ａｄ５／Ｆ３５は、Ａｄ５の線維タンパク質遺伝子（ｋｎｏｂ、ｓｈａｆｔ、ｔａｉｌ、ｐｅｎｔｏｎ）のうち１種または複数を、例えばＡｄ３５等、Ｂ群アデノウイルスに由来する相当する線維タンパク質遺伝子と置き換えることにより作製される。Ａｄ５／Ｆ３５ベクターおよびこのベクターの特徴は、例えば、Ｎｉら（２００５年）「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｇｒｏｕｐ Ｂ ｆｉｂｅｒｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｂａｂｏｏｎｓ」Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １６巻：６６４〜６７７頁；Ｎｉｌｓｓｏｎら（２００４年）「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ＣＤ３４＋ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ｂｙ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ５ ｏｒ ３５ ｔｒｏｐｉｓｍ」Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ９巻：３７７〜３８８頁；Ｎｉｌｓｓｏｎら（２００４年）「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ３５ ｔｒｏｐｉｓｍ； ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｐｒｉｍａｒｙ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ」Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ６巻：６３１〜６４１頁；Ｓｃｈｒｏｅｒｓら（２００４年）「Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｈｕｍａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ａｄ５／Ｆ３５ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ」Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ３２巻：５３６〜５４６頁；Ｓｅｓｈｉｄｈａｒら（２００３年）「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ３５ ａｓ ａ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｖｅｃｔｏｒ」Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３１１巻：３８４〜３９３頁；Ｓｈａｙａｋｈｍｅｔｏｖら（２０００年）「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｈｕｍａｎ ＣＤ３４（＋） ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ ｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ」Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７４巻：２５６７〜２５８３頁；およびＳｏｖａら（２００４年）「Ａ ｔｕｍｏｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｎｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＴＲＡＩＬ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ」Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ９巻：４９６〜５０９頁に記載されている。上に記す通り、ＺＦＮおよびこのようなＺＦＮをコードするポリヌクレオチドは、いずれかの標的細胞に送達することができる。一般に、遺伝子ＣＣＲ−５を不活性化するために、細胞は、免疫細胞、例えば、リンパ球（Ｂ細胞、Ｔヘルパー（ＴＨ）およびＴ細胞傷害性細胞（ＴＣ）等のＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞等のヌル細胞）；単核細胞（単球、マクロファージ（ｍａｒｃｏｐｈａｇｅ））；顆粒球細胞（顆粒球、好中球、好酸球、好塩基球）；マスト細胞；および／または樹状細胞（ランゲルハンス細胞、間質性樹状細胞、指状嵌入樹状細胞、循環樹状細胞）である。マクロファージ、Ｂリンパ球および樹状細胞は、ＴＨ細胞活性化に関与する例示的な抗原提示細胞である。ある特定の実施形態において、標的細胞は、表面におけるＣＤ４の発現によって特徴付けられるＴＨ細胞である。標的細胞は、いずれかの免疫細胞を生じ得る造血幹細胞となることもできる。
多くの遺伝子療法適用において、遺伝子療法ベクターが、特定の組織型へと高度な特異性で送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターは、ウイルスの外表面におけるウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させることにより、所定の細胞型に対する特異性を有するよう修飾することができる。リガンドは、目的の細胞型上に存在することが公知の受容体に対する親和性を有するよう選ばれる。例えば、Ｈａｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２巻：９７４７〜９７５１頁（１９９５年）は、モロニーマウス白血病ウイルスを、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリンを発現するよう修飾することができ、組換えウイルスが、ヒト上皮増殖因子受容体を発現するある特定のヒト乳がん細胞に感染することを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが該細胞表面受容体のリガンドを含む融合タンパク質を発現する、他のウイルス−標的細胞ペアへと拡張することができる。例えば、繊維状ファージは、実質的にいかなる選ばれた細胞受容体に対しても特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示するよう操作することができる。上述は、主にウイルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することができる。このようなベクターは、特異的標的細胞による取込みを好む特異的取込み配列を含有するよう操作することができる。
遺伝子療法ベクターは、後述する通り、典型的には全身性投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、真皮下または頭蓋内注入）または局所適用による個々の患者への投与により、ｉｎ ｖｉｖｏで送達することができる。あるいは、ベクターは、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）または普遍的ドナー造血幹細胞等の細胞にｅｘ ｖｉｖｏで送達し、続いて通常、該ベクターを組み入れた細胞の選択後に、該細胞を患者に再移植することができる。
診断、研究または遺伝子療法（例えば、宿主生物へのトランスフェクト細胞の再注入による）のためのｅｘ ｖｉｖｏ細胞トランスフェクションは、当業者に周知のものである。好まれる実施形態において、細胞は、対象生物から単離され、ＺＦＰ核酸（遺伝子またはｃＤＮＡ）をトランスフェクトされ、該対象生物（例えば、患者）へと再注入して戻される。ｅｘ ｖｉｖｏトランスフェクションに適した様々な細胞型は、当業者に周知のものである（例えば、患者から細胞を単離し培養する仕方の記述に関して、Ｆｒｅｓｈｎｅｙら、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ， Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（第３版、１９９４年）およびこれに引用されている参考文献を参照）。
適した細胞として、真核および原核細胞および／または細胞株が挙げられるがこれらに限定されない。このような細胞またはこのような細胞から作製された細胞株の非限定的な例として、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）およびｐｅｒＣ６細胞、ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）等の昆虫細胞またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ等の真菌細胞が挙げられる。ある特定の実施形態において、細胞株は、ＣＨＯ−Ｋ１、ＭＤＣＫまたはＨＥＫ２９３細胞株である。その上、初代細胞を単離し、ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ）またはヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）による処理後に、処置すべき被験体への再導入のためにｅｘ ｖｉｖｏで使用することができる。適した初代細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞等のＴリンパ球が挙げられるがこれらに限定されない他の血液細胞サブセットを含む。適した細胞は、例として挙げる胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞（ＣＤ３４＋）、神経幹細胞および間葉系幹細胞等、幹細胞も含む。
一実施形態において、幹細胞は、細胞トランスフェクションおよび遺伝子療法のためのｅｘ ｖｉｖｏ手順において使用される。幹細胞使用の利点は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで他の細胞型へと分化させることができること、あるいは哺乳動物（細胞のドナー等）へと導入することができ、その骨髄に生着することである。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α等、サイトカインを使用して、ＣＤ３４＋細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで臨床的に重要な免疫細胞型へと分化させるための方法は公知のものである（Ｉｎａｂａら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．１７６巻：１６９３〜１７０２頁（１９９２年）を参照）。
幹細胞は、公知の方法を使用した形質導入および分化のために単離される。例えば、幹細胞は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（ｐａｎＢ細胞）、ＧＲ−１（顆粒球）およびＩａｄ（分化した抗原提示細胞）等、望まれない細胞に結合する抗体により骨髄細胞をパニングすることにより、骨髄細胞から単離される（Ｉｎａｂａら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．１７６巻：１６９３〜１７０２頁（１９９２年）を参照）。
一部の実施形態において、修飾された幹細胞を使用することもできる。例えば、アポトーシスに対し抵抗性となるよう作製された幹細胞を治療用組成物として使用することができ、該幹細胞は、本発明のＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および／またはドナーも含有する。アポトーシスに対する抵抗性は、例えば、幹細胞においてＢＡＸまたはＢＡＫ特異的ヌクレアーゼを使用してＢＡＸおよび／またはＢＡＫをノックアウトすることにより（米国特許出願公開第２０１０／０００３７５６号を参照）、あるいは例えば、再度カスパーゼ６特異的ＺＦＮを使用したカスパーゼの破壊により生じ得る。あるいは、アポトーシスに対する抵抗性は、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（カルボベンゾキシ−バリル−アラニル−アスパルチル−［Ｏ−メチル］−フルオロメチルケトン）等、カスパーゼ阻害剤の使用により達成することもできる。
治療用ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および／またはドナー核酸を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム等）は、細胞のｉｎ ｖｉｖｏにおける形質導入のために生物に直接投与されてもよい。あるいは、ネイキッドＤＮＡまたはｍＲＮＡを投与することができる。投与は、注射、注入、局所適用およびエレクトロポレーションが挙げられるがこれらに限定されない、血液または組織細胞との最終接触へと分子を導入するために通常使用される経路のうちいずれかにより為される。このような核酸を投与する適した方法を利用することができ、これは当業者に周知のものであり、２種以上の経路を使用して、特定の組成物を投与することができるが、多くの場合、特定の経路が、別の経路よりも即時かつより有効な反応をもたらすことができる。
造血幹細胞へのＤＮＡの導入のための方法は、例えば、米国特許第５，９２８，６３８号に開示されている。造血幹細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞への導入遺伝子の導入に有用なベクターは、アデノウイルス３５型を含む。
免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）への導入遺伝子の導入に適したベクターは、非組み込み型レンチウイルスベクターを含む。例えば、米国特許出願公開第２００９０１１７６１７号を参照されたい。例えば、Ｏｒｙら（１９９６年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３巻：１１３８２〜１１３８８頁；Ｄｕｌｌら（１９９８年）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．７２巻：８４６３〜８４７１頁；Ｚｕｆｆｅｒｙら（１９９８年）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．７２巻：９８７３〜９８８０頁；Ｆｏｌｌｅｎｚｉら（２０００年）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５巻：２１７〜２２２頁を参照されたい。
薬学的に許容される担体は、一部には、投与されている特定の組成物と、組成物の投与に使用される特定の方法により決定される。したがって、後述する通り、利用できる医薬組成物の幅広い適した製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、１９８９年を参照）。
適用
開示されている方法および組成物は、ＴＣＲゲノム配列の不活性化に使用することができる。上に記す通り、不活性化は、細胞（例えば、Ｔリンパ球）における内因性ＴＣＲαおよび／またはβ遺伝子発現の部分的または完全抑圧を含む。ＴＣＲ遺伝子の不活性化は、例えば、単一の開裂事象により、開裂と続く非相同末端結合により、２個の部位における開裂と、続く斯かる２個の開裂部位間の配列を欠失させ得る連接により、コード領域へのミスセンスもしくはナンセンスコドンの標的化された組換えにより、遺伝子または調節領域を破壊し得る、遺伝子もしくはその調節領域への無関係配列（即ち、「スタッファー」配列）もしくは別の目的のコード配列の標的化された組換えにより、または転写物のミススプライシングを引き起こすための、イントロンへのスプライスアクセプター配列の標的化組換えにより達成することができる。内因性ＴＣＲ遺伝子の不活性化は、目的の腫瘍抗原／ＭＨＣ複合体に特異的なＴＣＲ遺伝子（複数可）の標的化された組換えにより達成することもできる。
ＴＣＲ遺伝子のヌクレアーゼ媒介性不活性化（ノックアウトまたはノックダウン）のために種々の適用が存在する。例えば、本明細書に記載されている方法および組成物は、細胞株の作製および／または修飾を可能にする（治療的および非治療的使用のため）。内因性ＴＣＲ遺伝子（複数可）の不活性化は、公知標的に対する高アビディティーＴＣＲまたはキメラ抗原受容体（ＣＡＲＳ、Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉら（２０１０年）Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０１０巻、論文番号９５６３０４を参照）をコードする遺伝子の挿入とカップルすることができ、その結果得られるトランスジェニック細胞（または同じ特徴を有するこのような細胞の子孫）は、細胞治療法として使用することができる。あるいは、ドナー核酸においてＴＣＲ特異的ヌクレアーゼおよび高アビディティーＴＣＲをコードする遺伝子の両方を送達するためのウイルスベクターを使用して、Ｔ細胞の再標的化をｉｎ ｖｉｖｏで行うことができる。いずれの場合においても、本発明の材料および方法は、がんの処置において使用することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏで修飾された細胞は、モデル化試験またはスクリーニングのために使用して、ＴＣＲ修飾に呼応して機能し得る他の種類の治療法を見出すこともできる。肺癌、膵がん、肝臓がん、骨がん、乳がん、結腸直腸がん、卵巣がん、白血病、リンパ腫、脳がんその他等が挙げられるがこれらに限定されない、いずれかの種類のがんを処置することができる。本発明の技術により処置することができる他の疾患は、真菌、細菌およびウイルス感染症ならびに自己免疫性疾患および移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を含む。
加えて、本明細書に記載されている方法および組成物を使用して、いかなる所定の生物中でも安定なノックアウト細胞の作製など、モデル生物および細胞株の作製を可能にすることができる。ＺＦＮ／ＴＡＬＥＮ／ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、細胞株またはモデル生物におけるいずれか所定の遺伝子をノックアウトする能力を提供するが、選択マーカーの非存在下では、このような事象は極めて稀である場合がある。したがって、標的化遺伝子破壊の比率を有意に増加させる本明細書に記載されている方法を使用して、新たな特性を有する細胞株を作製することができる。これは、ハムスター（ＣＨＯ）細胞株等の生物製剤の産生に使用される細胞株、またはヒトＨＥＫ２９３細胞等の数種類のＡＡＶ血清型の産生のための細胞株、またはＳｆ９もしくはＳｆ２１等の昆虫細胞を含む。
本発明の方法および組成物は、トランスジェニック生物の産生において使用することもできる。トランスジェニック動物は、疾患モデルのために開発された動物と共に、望ましい形質を有する動物を含むことができる。本発明の方法および組成物を使用して胚を処理して、トランスジェニック動物を発生させることができる。一部の実施形態において、適した胚は、小型の哺乳動物（例えば、齧歯類、ウサギ等）、コンパニオンアニマル、家畜および霊長類由来の胚を含むことができる。齧歯類の非限定的な例として、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミおよびモルモットを挙げることができる。コンパニオンアニマルの非限定的な例として、ネコ、イヌ、ウサギ、ハリネズミおよびフェレットを挙げることができる。家畜の非限定的な例として、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ラマ、アルパカおよびウシを挙げることができる。霊長類の非限定的な例として、オマキザル、チンパンジー、キツネザル、マカク、マーモセット、タマリン、クモザル、リスザルおよびサバンナモンキーを挙げることができる。他の実施形態において、適した胚は、魚類、爬虫類、両生類または鳥類由来の胚を含むことができる。あるいは、適した胚は、昆虫胚、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ胚または蚊の胚であってもよい。
実施例１：最適化された高親和性ＷＴ−１ ＴＣＲ構築物の発現
Ａｍｅｎｄｏｌａら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３巻（１号）：１０８〜１１６頁、Ｔｈｏｍａｓら（２００７年）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ １７９巻（９号）：５８０３〜５８１０頁および米国特許出願公開第２００６２００８６９号に記載されている通り、ウィルムス腫瘍抗原１（ＷＴ１）、特にＷＴ１１２６〜１３４ペプチド（Ｋｕｂａｌｌら（２００７年）Ｂｌｏｏｄ １０９巻（６号）：２３３１〜８頁）由来のＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドに特異的なコドン最適化されたシステイン修飾ＴＣＲおよび単一のα２１またはβ２１ ＷＴ１特異的ＴＣＲ鎖をコードする遺伝子を、双方向性自己不活性化移入ベクター、ｐＣＣＬｓｉｎ．ＰＰＴ．ΔＬＮＧＦＲ．ｍｉｎＣＭＶ．ＷＰＧＫ．ｅＧＦＰ．ＷｐｒｅまたはｐＣＣＬｓｉｎ．ｃＰＰＴ．ΔＬＮＧＦＲ．ｍｉｎ．ＣＭＶ．ｈＥＦ１ａ．ｅＧＦＰ．Ｗｐｒｅにクローニングした（図１Ａを参照）。
基本的にＦｏｌｌｅｎｚｉ ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ（２００２年）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３４６巻：４５４〜４６５頁に記載されている通りに、インテグラーゼ可能第三世代レンチウイルスベクター系を使用してベクターをパッケージし、ＶＺＶエンベロープにより偽型化した。次に、レンチウイルスベクターを使用して、標準技法（後述を参照）を使用して細胞を形質導入し、ＦＡＣｓ解析により細胞を特徴付けして、細胞表面に外因性ＴＣＲが発現されているか決定した。
下表１に示す通り、ＰＧＫ／ｍＣＭＶ二重プロモーター組合せまたはＥＦ１α／ｍＣＭＶ二重プロモーター構築物から駆動されて、ＷＴ−１特異的ＴＣＲ構築物が高度に発現された。表における数は、ＶＢ２１発現およびＷＴ１−ＨＬＡ−Ａ２五量体結合のためにゲーティングした四半部に存在する総シグナルのパーセントとして示す。
欧州特許出願公開第１９５６０８０号およびＫａｎｅｋｏら（２００９年）Ｂｌｏｏｄ １１３巻：１００６〜１０１５頁に記載されている通り、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体コンジュゲートした磁気ビーズ（Ｃｌｉｎ ＥｘＶｉｖｏ ＣＤ３／ＣＤ２８；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ｂａＣＤ３／ＣＤ２８）により細胞を活性化することにより、Ｔ細胞の形質導入を達成し、ＩＭＤＭ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）、１０％ＦＣＳと低用量ＩＬ−７／ＩＬ−１５において細胞を培養した。この手順は、初期Ｔ細胞分化表現型（ＣＤ４５ＲＡ−／＋ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２８＋ＣＤ２７＋、ＩＬ７Ｒａ＋、ＩＬ−２＋γＩＦＮ−／＋）を保存し、細胞は、非形質導入リンパ球と識別不能に増殖した。これらの条件において、ＰＧＫ二重プロモーターは、ＷＴ１特異的ＴＣＲ鎖の化学量論的（ｓｔｏｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ）発現の持続においてＥＦ１α二重プロモーターよりも優れていることを証明し、ＰＧＫ双方向性プロモーターが、アンチセンス方向において、双方向性ＥＦ１αプロモーターよりも高い活性を発揮することを示唆する。しかし、両方のプロモーターは、レンチウイルスベクターの文脈において検査すると、初回刺激後＞７０日間にわたり、効率的ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１五量体結合（１６％）に適切なレベルにおけるＴＣＲ発現を支持した（図１Ｂを参照）。
ＴＣＲ形質導入細胞は、特異的γＩＦＮ産生およびＡＭＬ患者由来のＷＴ１＋ＨＬＡ−Ａ２＋初代白血病性芽球に対する細胞傷害性活性を提示することもできた。特に、ＰＧＫ／ｍＣＭＶ二重プロモーター組合せまたはＥＦ１α／ｍＣＭＶ二重プロモーターのいずれかからトランスジェニックＴＣＲを発現するベクターを形質導入した細胞におけるγＩＦＮ産生が増加し（図２Ａ）、ＴＣＲ修飾細胞による殺滅％（溶解）も同様であった（図２Ｂおよび図２Ｃ）。加えて、ＨＬＡ制限エレメントを発現する非標識標的の存在下で、標的ペプチドをパルスした、編集されたリンパ球におけるγＩＦＮ産生は阻害された（図２Ｄ）。
実施例２：セントラルメモリーＴ細胞のＣＣＲ５遺伝子座への導入遺伝子の効率的組込み
セントラルメモリーＴ細胞へとＷＴ−１特異的ＴＣＲ遺伝子を組み込むという考えを検査するため、先ずドナー核酸としてＧＦＰを使用して、形質導入効率および組込み部位からのＧＦＰ発現をモニターした。ＣＣＲ５ノックアウト細胞が十分に機能的であることが示されたため、ＣＣＲ５遺伝子座を選択した（米国特許第７，９５１，９２５号を参照）。加えて、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１）遺伝子座を同様に標的化した（米国特許出願公開第２００８０２９９５８０号を参照）。ＩＤＬＶベクターを使用して、ＧＦＰコードドナーを細胞に形質導入し、上述の通りＡｄ５／Ｆ３５ベクターを使用して、ＣＣＲ５特異的ＺＦＮまたはＡＡＶＳ１特異的ＺＦＮを導入した。形質導入２０日後にＧＦＰ発現を測定した。
図３に示す通り、ＧＦＰ導入遺伝子のＺＦＮ媒介性組込みは、使用したＡｄ５／Ｆ３５ドナーの量に対して等、ＧＦＰシグナル増加をもたらした（図３Ａおよび図３Ｂ）。下表２は、ドナーまたはドナープラスＺＦＮの存在下におけるＧＦＰ陽性細胞のパーセントの増加を示す。
実施例３：ジャーカットＴＣＲβ陰性細胞のＣＣＲ５遺伝子座へのＷＴ−１特異的ＴＣＲ導入遺伝子の組込み
次に、ＴＣＲ−β特異的ＺＦＮによる処理後に、ＴＣＲβ陰性であるジャーカット細胞のＣＣＲ５遺伝子座への標的化組込みのために、ＷＴ−１特異的ＴＣＲ導入遺伝子構築物を使用した。標準技法を使用して、実施例１と同様のＷＴ−１ ＴＣＲ構築物を細胞にトランスフェクトした。
表３から分かる通り、ＷＴ−１ ＴＣＲドナー（ＷＴ１−ＴＣＲ ＩＤＬＶ）およびＣＣＲ５特異的ＺＦＮ（Ａｄ−ＺＦＮ）の導入後に、Ｖβ２１染色またはシグナルの著しい増加が得られる一方、ドナーまたはＺＦＮなしでは、バックグラウンドＶβ２１シグナルのみが観察される。よって、ＣＣＲ５遺伝子座へのＷＴ−１特異的ＴＣＲのＺＦＮ媒介性組込みは、実質的なパーセンテージの細胞に生じた。
実施例４：ＴＣＲ特異的ＺＦＮの設計
ＴＣＲ特異的ＺＦＮを構築して、ＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ遺伝子のいずれかにおける二本鎖切断の部位特異的導入を可能にした。基本的にＵｒｎｏｖら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ ４３５巻（７０４２号）：６４６〜６５１頁、Ｌｏｍｂａｒｄｏら（２００７年）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｎｏｖ；２５巻（１１号）：１２９８〜３０６頁および米国特許出願公開第２００８／０１３１９６２号に記載されている通りにＺＦＮを設計し、プラスミドまたはＩＤＬＶベクターに組み入れた。例示的なＺＦＮペアのための認識ヘリックスおよび標的配列を下表４および表５に示す。ＴＣＲジンクフィンガー設計の標的部位を第１の列に示す。ＺＦＰ認識ヘリックスによって接触される標的部位におけるヌクレオチドを大文字で示す；接触されないヌクレオチドは小文字で示す。
実施例５：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＺＦＮ活性
表４および表５に記載されているＺＦＮを使用して、Ｋ５６２細胞におけるヌクレアーゼ活性を検査した。開裂活性を検査するために、上述のヒトＴＣＲ特異的ＺＦＮのペアをコードするプラスミドをＫ５６２細胞にトランスフェクトした。アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）からＫ５６２細胞を入手して、１０％認定ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｃｙｃｌｏｎｅ）を補充したＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において、推奨される通りに育成した。トランスフェクションのため、百万個のＫ５６２細胞を、２μｇのジンクフィンガーヌクレアーゼプラスミドおよび１００μＬのＡｍａｘａ溶液Ｖと混合した。プログラムＴ−１６を使用して、Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ（商標）において細胞をトランスフェクトし、１．４ｍＬの温かいＲＰＭＩ培地＋１０％ＦＢＳに回収した。
ゲノムＤＮＡを収集し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＡｃｃｕｐｒｉｍｅ ＨｉＦｉポリメラーゼを使用して、次の通りに、企図される開裂部位を包含するＴＣＲ遺伝子座の部分をＰＣＲ増幅した：９４℃における最初の３分間の変性後に、９４℃における３０秒間の変性ステップと、続く５８℃における３０秒間のアニーリングステップと、続く６８℃における３０秒間の伸長ステップによる３０サイクルのＰＣＲを行った。３０サイクルの完了後に、反応液を６８℃で７分間、続いて４℃で無期限にインキュベートした。
例えば、米国特許出願公開第２００８００１５１６４号；第２００８０１３１９６２号および第２００８０１５９９９６号に記載されている通り、Ｃｅｌ−Ｉアッセイにより、Ｋ５６２ ＴＣＲ特異的ＺＦＮ処理細胞から得られるゲノムＤＮＡを試験した。
Ｋ５６２細胞におけるＴＣＲベータ遺伝子座は、高い配列類似性を有する２個の機能的コピーを有し（ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２）、これら両者共に、ＴＣＲベータ特異的ＺＦＮによって標的化される。図４Ｂを参照されたい。よって、最初に、特にＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２遺伝子のいずれかから、企図されるＺＦＮ開裂部位の前後の領域を特異的に増幅するＰＣＲプライマーを使用して、両方の遺伝子のＺＦＮ駆動開裂後のＮＨＥＪ活性を別々に解析した。ＺＦＮペア１６７８７および１６７８３に関して、例示的な結果を下表６に示す。
表６に示すデータは、ＺＦＮが、ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２遺伝子を基本的に等しく開裂することを実証する。
加えて、本出願人らは、トランスフェクション後の３および１０日目に試料を収集することにより、Ｋ５６２細胞におけるＴＲＢＣのＺＦＮ媒介性修飾の持続性を検査した。結果を下表７に示し、ＺＦＮペア、１６７８７および１６７８３により、トランスフェクション１０日後に標的遺伝子修飾が安定的であることを実証する。
変動量のインプットＺＦＮに続いて、ＮＨＥＪ活性に関して、ＴＲＢＣを標的とするいくつかのＺＦＮペアを解析した（０．４または０．１μｇのいずれかの各ＺＦＮ）。図５に示す通り、検査した全ＺＦＮペアは、高い活性を提示した。本実験において、ＺＦＮによる形質導入後に、細胞を３０℃のインキュベーション期間により処理した（米国特許出願公開第２０１１０１２９８９８号を参照）。Ｋ５６２細胞におけるＴＣＲベータ特異的ＺＦＮ開裂の解析後に、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋成熟Ｔ細胞のいずれかにおいていくつかのＺＦＮペアを検査した。簡潔に説明すると、ＡｌｌＣｅｌｌｓからＣＤ８＋またはＣＤ４＋細胞を購入し、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｌ−グルタミン（３０ｍｇ／ｍＬ）＋ＩＬ−２（３０μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）において培養し、４〜２４時間休ませた。
目的のＺＦＮペアを含有するレンチウイルスベクターを構築した。上述の通り、ＨＩＶ由来自己不活性化ベクター構築物からこれを作製し、Ｄ６４Ｖ変異を保有するＨＩＶインテグラーゼを使用してパッケージし、ＶＳＶ−Ｇエンベロープにより偽型化した。２Ａ配列およびサイトメガロウイルス内部プロモーターを使用した２セットのＺＦＮのクローニング後に、以前に記載された通りに（Ｐｅｒｅｚら（２００８年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６巻：８０８〜８１６頁）、Ａｄ５／Ｆ３５アデノウイルスベクターを作製した。例えば、Ｈｏｌｓｔ Ｊら（２００６年）Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．１巻（１号）：４０６〜１７頁を参照されたい。Ａｍａｘａ（商標）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎキットを用いて、形質導入毎にメーカーに指定される通りに、１ｅ６細胞／ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎを使用した。ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ１２〜２４時間後に、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズにより、メーカーのプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って細胞を活性化し、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７およびＩＬ−１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充したＩＭＤＭ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）、１０％ＦＣＳ培地において育成した。
ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ３日後に細胞を収集し、国際公開第０７／０１４２７５号に記載されている通りに行われたＣｅｌ−Ｉアッセイを使用して遺伝子修飾効率を決定した。Ｏｌｅｙｋｏｗｓｋｉら（１９９８年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６巻：４５９７〜４６０２頁；Ｑｕｉら（２００４年）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３６巻：７０２〜７０７頁；Ｙｅｕｎｇら（２００５年）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３８巻：７４９〜７５８頁も参照されたい。ＺＦＮペアのうちいくつかは、Ｃｅｌ−Ｉアッセイにより測定される優れた活性を有した（ＮＨＥＪ、４から１１．９％）。
上述の通り、ＴＣＲ−α特異的ＺＦＮもｉｎ ｖｉｔｒｏで検査した。形質導入後に、上述の通りインキュベーション温度を３０℃にシフトする前に、細胞を３７℃で１日間インキュベートした。米国特許出願公開第２０１１０１２９８９８号を参照されたい。これらのＺＦＮは、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とし、上述の通りこれらのＺＦＮの様々な組合せを与えたＫ５６２細胞において行われたＣｅｌ−Ｉアッセイの結果は、高い活性を示した。図６を参照されたい。
実施例６：細胞におけるＴＣＲ−βの破壊
続いて、ＴＣＲ−β特異的ＺＦＮを実験において使用して、ＴＣＲ遺伝子座を特異的に標的化した。ジャーカット細胞におけるＴＣＲ遺伝子座を破壊するよう初期実験を設計した。ＴＣＲ−β特異的ＺＦＮＳ、１６７８３および１６７８７をインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）に導入して、ＴＲＢＣ標的ＺＦＮを一過的に発現させた。活性化４８時間後に、ベクター調製物におけるＨＩＶ Ｇａｇ ｐ２４の測定に基づき０．２５μｇまたは０．５μｇ用量のＩＤＬＶにより形質導入を行った。ベクター感染力は、２９３Ｔ細胞におけるベクターＤＮＡ力価測定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）による１〜５×１０４形質導入単位／ｎｇ ｐ２４に及んだ。次に、ＣＤ３マーカーの損失に関してＦＡＣＳ解析により細胞をアッセイし、抗ＣＤ３ ＭＡＣＳ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によるＬＤカラムを使用して、メーカーの説明書に従ってＣＤ３（−）細胞を濃縮した。
下表８に示す通り、ＺＦＮによる形質導入後に、処理細胞の最大２０％に達する、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の細胞表面発現のベクター用量依存性抑止が見られた。
Ｃｅｌ−Ｉアッセイを行い、ＺＦＮ処理細胞において破壊されたＴＲＢＣアレルの最大２６％（１８％ＴＲＢＣ１および８％のＴＲＢＣ２）により、これらの結果を確認した（図７Ａおよび図７Ｂ、「バルク」を参照）。
次に、ＴＲＢＣ ＺＦＮ（１６７８３および１６７８７）を初代ヒトＴリンパ球に導入したところ、ジャーカット細胞に観察されたものと同様のレベルのＣＤ３破壊がＦＡＣＳにより観察された。健康なドナーから末梢血Ｔ細胞を収集し、ＣＤ３およびＣＤ２８コンジュゲートビーズにより活性化させた。活性化４８時間後に、ＴＲＢＣ特異的ＺＦＮを含有する増加用量のＩＤＬＶに細胞を曝露させた。次に、低用量（５ｎｇ／ｍＬ）ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で細胞を培養して、細胞生存および成長を促進した。初代リンパ球において、処理細胞の最大７％はＣＤ３陰性であった一方、未処理対照においてＣＤ３（−）細胞はほとんど観察されず、このデータを下表９に示す。
選別されたＣＤ３（−）リンパ球は、ＩＬ７およびＩＬ１５の存在下で経時的に増えて生存することができ（図７Ｃおよび図７Ｄを参照）、パーセント修飾を図７Ｄに示す。図７Ｅは、ＣＤ３（−）細胞が、集団において少なくとも４５日間持続することをさらに実証し、集団におけるＣＤ３（−）細胞のパーセントは、この期間にわたり相当に一定のままであることも示す。ＰＨＡ刺激は、ＣＤ３（＋）リンパ球の増大によりプールにおけるＣＤ３（−）細胞のパーセントの減少をもたらすため、ＣＤ３（−）細胞は、非特異的マイトジェン刺激に応答するとは思われない（図７Ｆ）。この結果は、ＣＤ３（−）細胞におけるＣＤ３機能的シグナル伝達の非存在を実証する。同様のＣＤ４／ＣＤ８比を表示したＣＤ３（＋）およびＣＤ３（−）リンパ球において、表現型の差は観察されなかった。ＣＤ３（−）細胞は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２８およびＩＬ−７ＲＡの陽性を維持するため、セントラルメモリー表現型も維持する（下表１０を参照）。
メモリーＴリンパ球は、ナイーブＴ細胞よりも、恒常性増殖のためのＴＣＲシグナルへの依存性が低い；よって、本出願人らは、恒常性サイトカインが、ＴＣＲ発現の非存在下で、以前に活性化された細胞の生存および成長を促進し得るか調査した。注目すべきことに、ＴＲＢＣ−ＺＦＮ処理細胞は、低用量ＩＬ−７およびＩＬ−１５の補充により培養において増やすことができ、ＣＤ３（−）細胞の比率は、ＴＣＲ誘発の非存在下で５０日間を超えて安定的なままである。よって、ＺＦＮ曝露は、初代リンパ球において耐容性に優れ、標的化されたＴＲＢＣ遺伝子の安定的破壊をもたらした。したがって、ＣＤ３（−）細胞をほぼ純粋となるまで選別し、ＣＤ３（＋）細胞と同様の成長速度で、３週間を超えてＩＬ−７およびＩＬ−１５によりさらに増やし、恒常性サイトカインが、以前に活性化された細胞の生存／増殖を促進するために、ＴＣＲシグナル伝達機能を必要としないことを実証した。
これらのデータは、ＴＣＭの表現型特徴を有するが、内因性ＴＣＲの表面発現が永続的に破壊されたＣＤ８ Ｔ細胞の新規集団作製の成功を実証する。
（実施例７）
以前に内因性ＴＣＲが永続的に破壊された細胞におけるＷＴ−１特異的ＴＣＲの導入
図１に記載されている通り、ＴＣＲβ特異的ＺＦＮおよびＷＴ１−ＴＣＲβ導入遺伝子のランダムな組み込みに使用したレンチウイルスによる処理後に、ＣＤ３（−）Ｔリンパ球を選別した（４９．５±３０％平均±ＳＤ形質導入効率、ｎ＝４）。よって、ＴＣＲ−β編集細胞において、組み込まれたベクターから移入されたＷＴ１−ＴＣＲの発現は、ＣＤ３の表面転位置をレスキューした（図８、第１の行）。
ポリクローナル増大における非形質導入細胞と比べて導入されたＴＣＲの発現への固有の成長利点がない未編集ＴＣＲ移入リンパ球（図８、第２の行）と対照的に、ＷＴ１−ＴＣＲを含有するＴＣＲβ鎖破壊細胞は、ポリクローナル刺激により＞９０％純度まで濃縮することができ、ＴＣＲ−β編集細胞における移入されたＴＣＲ／ＣＤ３複合体の表面発現が、遺伝子改変細胞のＴＣＲ媒介性増大の促進に必要かつ十分であることを示す（図８、第１の行）。外因性ＷＴ１−ＴＣＲ Ｖβ鎖（Ｖβ２１）は、ＴＣＲ−β鎖破壊リンパ球において、未編集ＴＣＲ移入細胞よりもおよそ２倍高い平均レベルで発現され、対照Ｔ細胞の内因性Ｖβ２１鎖と同様の発現レベルに達し、培養において安定的に維持された（図９Ａおよび図９Ｂ）。したがって、同じ用量のＰＧＫ−ＷＴ１ ＬＶによる形質導入後に、未編集細胞のほんの２．６％と比較して、最大２２％のＴＣＲ−β編集リンパ球が、ＷＴ１１２６〜１３４五量体に結合した（図９Ａ、下ヒストグラム）。
よって、内因性ＴＣＲβ鎖との競合の非存在下で、トランスジェニックＴＣＲβ鎖の表面発現は、生理的レベルに達する。ＴＣＲ−β編集リンパ球の機能およびアビディティーを検証するために、本出願人らは、増加するＷＴ１１２６〜１３４ペプチド濃度をパルスしたＨＬＡ−Ａ２＋標的を溶解する能力に関して、ＴＣＲβ鎖破壊細胞を、同じＰＧＫ−ＷＴ１ ＬＶを形質導入した未編集細胞と比較した（図９Ｃを参照）。この機能アッセイは、エフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比１２で、増加濃度のＷＴ１１２６〜１３４ＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドまたは陰性対照として無関係ＣＭＶ由来ｐｐ６５４９４〜５０３ＨＬＡ−Ａ２制限ペプチド（１０μＭ、Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ）をパルスした、標識されたＴ２細胞の溶解に関する５１クロム放出アッセイにより活性を測定する。
編集したＴ細胞を刺激し、３週間後に、５時間の同時インキュベーションにより、標識されたＴ２細胞の認識に関して検査した。ＴＣＲβ鎖破壊細胞（図９ＣにおいてＴＣＲ編集と表示）は、未編集（ＴＣＲ移入と表示）ＷＴ１ ＬＶ形質導入細胞よりも有効に標的を殺滅し（ＥＣ５０：編集細胞：９０．５１ｎＭ、９５％ＣＩによる：４８．８４〜１６７．７；未編集ＴＣＲ移入細胞：２６９．１ｎＭ、９５％ＣＩによる：１７５．１〜４１３．５）、ＴＣＲ−β編集試料におけるトランスジェニックＷＴ１ ＴＣＲのより高い頻度および発現レベルを反映する可能性が高い。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアのシグモイド用量応答方程式を使用することにより、５１クロム放出データの非線形回帰解析によりＥＣ５０を計算した。
％溶解の平均ＳＤとして結果を表す（＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、ＴＣＲ編集、ｎ＝６、ＴＣＲ移入、ｎ＝４）。単細胞レベルにおける反応性を評価するために、Ｖβ２１発現に関して細胞を解析したところ（下表１１を参照）、相当に等しいコピー数のベクターにもかかわらず、Ｖβ２１発現がＴＣＲ編集細胞においてより優れていたことを示した。
単細胞レベルにおけるアロ反応性を評価するために、最適外因性ＴＣＲ発現を表示する細胞を濃縮するためにＷＴ１１２６〜１３４五量体結合のために以前に選別したＴＣＲ−β編集およびＴＣＲ移入細胞の両方からクローンを単離し増やした。刺激細胞／応答細胞比１において、１０ｎＭのＷＴ１１２５〜１３４ＨＬＡ−Ａ２制限ペプチド（左のパネル）をパルスしたＴ２細胞にまたは同種異系ＰＲＭＣ（右のパネル）にクローンを曝露した。特異的スポットの数を、刺激細胞の存在下で産生されたスポットの数、マイナス、エフェクター単独により産生されたスポットの数としてｙ軸に示す（＊＊＝ｐ＜０．０１）。ＴＣＲβ編集クローンは、ＴＣＲ移入細胞と比較して低下したアロ反応性を表示し（図１０を参照、１０Ａを１０Ｂと比較）、おそらく、一方の内因性ＴＣＲ鎖の非存在下におけるＴＣＲ誤対合のリスク低下を反映する。
これらのデータは、抑止された内因性ＴＣＲ−β鎖発現を有する宿主ＣＴＬにおける腫瘍特異的外因性ＴＣＲの発現により提供される機能的利点を実証する。
理論的には、未編集内因性ＴＣＲα鎖の表面再発現は、ＴＣＲ遺伝子移入後に、ＴＣＲ−β編集細胞において依然として起こり得る。ＴＣＲ−β鎖破壊リンパ球における誤対合の可能性を直接的に評価するために、ＣＤ３（−）細胞に、ＷＴ１特異的ＴＣＲβ鎖遺伝子およびΔＬＮＧＦＲマーカーのみをコードするＬＶ（ＷＴ１−β−ΔＬＮＧＦＲ−ＬＶ）を形質導入した。形質導入効率を、ΔＬＮＧＦＲｐｏｓリンパ球のパーセンテージとして評価した（図１１を参照）。ΔＬＮＧＦＲｐｏｓ細胞におけるＶβ２１発現を測定した。Ｖβ２１の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。ＷＴ１特異的α鎖の非存在にもかかわらず、Ｖβ２１発現は、ΔＬＮＧＦＲｐｏｓＴＲＢＣ破壊細胞の最大８３％において検出され、ＴＲＢＣが破壊された細胞に挿入されたシステイン修飾ＴＣＲβ鎖であっても、内因性ＴＣＲα鎖と誤対合することができることを実証する。
次に、ＣＤ３（−）リンパ球を使用して、内因性ＴＣＲ遺伝子座にＷＴ１−ＴＣＲβドナー構築物を導入する。ドナーを上述の通りに構築し、ＴＣＲ−β特異的ＺＦＮと併せて使用して、内因性遺伝子座におけるＴＣＲ−β導入遺伝子の組込みを引き起こす。細胞は、ＣＤ３およびＶβ２１．３ＴＣＲβ鎖の両方が陽性となる。
実施例８：ＴＣＲ−α鎖の破壊および標的化組込み
ＴＣＲ鎖誤対合の可能性を排除するために、本出願人らは、ＴＣＲα鎖（ＴＲＡＣ）遺伝子の定常領域を標的とするＺＦＮのペアを設計し（図６）、ＴＣＲ−β編集のために記載されている同じプロトコールに従って、ＴＣＲ−α編集Ｔリンパ球を得て（図１２Ａを参照）、ＴＣＲ−β編集に関して記載されている同じプロトコールに従って、ＴＣＲ−α編集Ｔリンパ球を得た（図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１３）。鎖破壊／置き換えの各ステップにおける操作された細胞の迅速単離を可能にする完全α／βＴＣＲ編集プロトコールを設計するために、本出願人らは、単一のαまたはβＷＴ１特異的ＴＣＲ鎖を保有するＬＶのセットを作製し、ＩＤＬＶまたはアデノウイルスベクター（ＡｄＶ）を使用して、リンパ球においてＴＲＢＣまたはＴＲＡＣ標的ＺＦＮを一過的に発現させた（十分なＴＣＲ編集のタイムラインおよび代表的フロー条件／結果に関して、図１４を参照）。
検査したＺＦＮ含有ベクター毎に、ＣＤ３（−）細胞を効率的に作製し、ヌクレアーゼ開裂部位における配列決定は、ＮＨＥＪによる修復後に存在する小さい挿入および欠失（挿入欠失）を明らかにする（図１３）。ＴＣＲ遺伝子破壊の媒介においてＩＤＬＶよりも効率的であることを証明したＡｄＶを、完全ＴＣＲ編集の目的のために選択した。健康なドナーから収集したＴ細胞を先ず、ｂａＣＤ３／ＣＤ２８による活性化４８時間後に、ＴＲＡＣ−ＺＦＮ−Ａｄ５／Ｆ３５に曝露し、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で培養し、選別により単離された得られたＣＤ３（−）細胞に、ＷＴ１−α鎖をコードするＬＶ（ＷＴ１−αＬＶ）を形質導入した（４９±２９＆平均±ＳＤ形質導入頻度、ｎ＝３）。
次に、レスキューされたＣＤ３発現を有する細胞を選別し、ｂａＣＤ３／ＣＤ２８で１サイクル刺激し、続いてＴＲＢＣ−ＺＦＮ−Ａｄ５／Ｆ３５に曝露した。ＺＦＮ曝露の第２ラウンドは、最大２３±４％の新たなＣＤ３（−）細胞を生じ、初代Ｔリンパ球が、複数ラウンドのＺＦＮ操作に許容的であることを示す。ＣＤ３（−）細胞を選別し、ＷＴ１ ＴＣＲ−β鎖ＬＶを形質導入した（１８±７％平均±ＳＤ形質導入効率、ｎ＝３）。移入されたＷＴ１−β鎖の発現は、ＣＤ３の表面転位置を再度レスキューし、これは次に、ＴＣＲ編集細胞においてＷＴ１−ＴＣＲ Ｖβ鎖とバランスのとれた比率で共発現された（図１４および図１５）。未編集ＴＣＲ移入リンパ球とは対照的に、ＴＣＲ−α／β破壊細胞は、ＴＣＲ遺伝子移入後のポリクローナル刺激により、ほぼ純粋になるまで濃縮することができ、ＷＴ１１２６〜１３４五量体の結合に必要とされる高レベルのＷＴ１特異的ＴＣＲを均質に発現した（図１５を参照）。
これらの結果は、ＴＣＲ編集細胞における移入されたＴＣＲ／ＣＤ３複合体の表面発現が、ＷＴ１に対し所望の特異性を有する細胞の増大の促進に必要かつ十分であることを示す（図１４、右のプロット）。Ｃｅｌ−Ｉ解析により、ＴＣＲ−α／β編集細胞におけるαおよびβＴＣＲ鎖の破壊を確認した。ＴＣＲ移入およびＴＣＲα／β編集リンパ球において表現型の差は観察されず、これは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７、ＣＤ２８およびＩＬ−７ｒαの高発現によって証明される通り、ＴＣＭ表面表現型を表示した。十分に編集されたリンパ球の機能および同種異系応答を検証するために、ＴＣＲα／β編集およびＴＣＲ移入リンパ球をポリクローナルに刺激した。
ポリクローナル刺激の３週間後に、ＴＣＲ−α／β編集およびＴＣＲ移入リンパ球を、ｉ）増加濃度のＷＴ１１２６〜１３４ＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドもしくは無関係ＣＭＶ由来ｐｐ６５４９５〜５０３ＨＬＡ−Ａ２ペプチドをパルスしたＴ２細胞（図１６Ａを参照）、またはｉｉ）ＷＴ１１２６〜１３４ペプチド（５０ｎＭ）によるパルスあり（破線記号）もしくはなし（実線記号）のＡＭＬ患者から収集されたＷＴ１＋ＨＬＡ−Ａ２＋（図１６Ｂにおける黒色）もしくはＨＬＡ−Ａ２−（灰色）白血病細胞のいずれかに曝露した。図１６Ｃは、同種異系ＰＢＭＣを標的として使用した同様の結果を示す。刺激細胞／応答細胞比１で全アッセイを行った。特異的スポットを、刺激細胞の存在下で産生されたスポット、マイナス、エフェクター単独により産生されたスポットとしてｙ軸に示す。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
実施例９：潜在的なオフターゲット開裂の解析
Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ解析を使用して、Ｐｅｒｅｚら（同書に）に記載されている通りに、ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ特異的ＺＦＮペアの両方のために、最も可能性が高い潜在的なオフターゲット開裂部位を同定した。ヘテロ二量体ＺＦＮペアまたはホモ二量体ペアのいずれかのために最大１０個の認識部位ミスマッチを含有した部位を同定したが、これらＺＦＮペアのための最も可能性が高い潜在的なオフターゲット部位は全て、ＺＦＮホモ二量体の標的であった。同定された最も可能性が高い潜在的なオフターゲット部位を、下表１２（ＴＲＡＣ）および表１３（ＴＲＢＣ）に示す。
図１７および図１８に示す通り、ＺＦＮ発現ベクターを形質導入しなかった試料と比較して（ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ遺伝子座とも比較）、ＺＦＮで処理したオフサイト（ｏｆｆ−ｓｉｔｅ）試料に追加的なバンドは存在しなかった。よって、ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ特異的ＺＦＮは、その企図される標的に特異的であると思われる。
実施例１０：ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ特異的ＴＡＬＥＮ
基本的に米国特許第８，５８６，５２６号に記載されている通りに、ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ特異的ＴＡＬＥＮを開発し、アセンブルした。カノニカルＲＶＤ−塩基一致（「ＴＡＬＥコード」：ＡはＮＩ、ＣはＨＤ、ＧはＮＮ（半分の反復におけるＮＫ）、ＴはＮＧ）を使用して、塩基認識を達成した。米国特許第８，５８６，５２６号に記載されている通り、ＴＡＬＥＮ骨格内のＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメインの「＋６３」Ｃ−キャップ（Ｃ末端短縮）において、ＴＡＬＥＮを構築した。検査したＴＡＬＥＮの標的および数的識別子を下表１４に示す。
次に、内因性ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ染色体標的に修飾を誘導する能力に関して、Ｋ５６２細胞においてＴＡＬＥＮをペアで検査し、上述の実施例５の通り、Ｃｅｌ−Ｉアッセイにより解析した。結果は、ほぼ全てのタンパク質ペアが活性を有し、ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮが同じおよその範囲の活性を有することを示した。表１５および表１６は、Ｃｅｌ１アッセイによって検出される％ＮＨＥＪの観点から、ＴＡＬＥＮのペアの行列比較を示す。
実施例１１：ＮＹ−ＥＳＯ−１ ＴＣＲ修飾されたＴ細胞
ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＴＣＲ Ｖβ１３（例えば、Ｒｏｂｂｉｎｓら（２０１１年）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２９巻（７号）：９１７〜９２４頁を参照）によりＴ細胞を修飾し、操作されたＴＣＲの発現をモニターした。本実験において、健康な志願者からＴリンパ球を単離し、ＣＤ３およびＣＤ２８抗体コンジュゲートビーズにより活性化した。次に、Ｋａｎｅｋｏら（Ｂｌｏｏｄ（２００９年）１１３巻（５号）１００６頁）およびＢｏｎｄａｎｚａら（Ｂｌｏｏｄ（２０１１年）１１７巻（２４号）６４６９頁）における方法に従って、５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−７および５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１５の存在下で細胞を培養した。次に、次の３種のうち１種で細胞を処理した：群１は、ＮＹ−ＥＳＯ１特異的ＨＬＡ−Ａ２制限αおよびβＴＣＲ鎖（ＴＣＲ−ＰＧＫ−ＮＹＥＳＯ１ ＬＶ）を含む第三世代双方向性レンチウイルスベクター（Ａｍｅｎｄｏｌａら（２００５年）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３巻：１０８〜１１６頁を参照）を形質導入して、ＴＣＲ「移入」「ＴＲ」Ｔ細胞を作製した。群２は、ＬＶ形質導入に先立ち、ＴＲＡＣに特異的なＺＦＮを含むアデノウイルス（実施例６を参照、ＺＦＮ２５５３９および２５５４０）で処理し、続いてＣＤ３シグナルの損失に関して選別した。続いて、ＣＤ３ｎｅｇ細胞に、ＴＣＲ−ＰＧＫ−ＮＹＥＳＯ１ ＬＶベクターを形質導入して、「単一編集」または「ＳＥ」細胞集団を作製した。群３は、先ず、上述の通りＴＲＡＣ ＺＦＮペア２５５３９／２５５４０を含むアデノウイルスで処理し、ＣＤ３シグナルに関して選別した。次に、ＣＤ３ｎｅｇ細胞に、ＮＹ−ＥＳＯ−１ ＴＣＲα鎖を含むＬＶベクターを形質導入し、ＣＤ３シグナルに関して再度選別した。この事例において、次に、ＣＤ３ｐｏｓ細胞をｂａＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激し、ＴＲＢＣ ＺＦＮペア１６７８７／１６７８３を含むアデノウイルスに曝露し、ＣＤ３の表面転位置の非存在に関して細胞を選別した。次に、ＣＤ３ｎｅｇ細胞に、ＮＹ−ＥＳＯ−１ ＴＣＲβ鎖を含むＬＶベクターを形質導入した。よって、群３は、いかなる内因性ＴＣＲ複合体も持たずに、ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＴＣＲを独自に発現し、これを「完全編集」または「ＣＥ」集団と命名した。
ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的Ｖベータ１３．１鎖に対する抗体を使用してタンパク質を標識した細胞蛍光解析により、外因性Ｖβ１３ ＴＣＲの発現に関して３群の細胞を解析した。非形質導入Ｔ細胞を対照として使用し、形質導入Ｔ細胞、対、対照において観察される平均蛍光強度（ＭＦＩ）としてデータを表した。完全編集集団は、最高発現を実証した（図１９Ａを参照）。
ＭＨＣ ＨＬＡ−Ａ２−ＮＹ−ＥＳＯ１デキストラマーへの結合に関してもＴ細胞集団を検査した。ＭＨＣデキストラマーは、最適化された数のＭＨＣおよび蛍光色素分子を保有するデキストランポリマー骨格からなる。ＭＨＣデキストラマー試薬は、従来のＭＨＣ多量体よりも多くのＭＨＣ分子および多くの蛍光色素を保有する。この構成は、特異的Ｔ細胞に対するアビディティーを増加させ、染色強度を増強し、これにより、分解能およびシグナル・ノイズ比を増加させる。染色のため、メーカーから供給されるプロトコール（例えば、Ｉｍｍｕｄｅｘがん−精巣抗原デキストラマー（登録商標）コレクション）に従った。試料をＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に通し、Ｆｌｏｗ Ｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ ｓｔａｒ Ｉｎｃ）によりデータを解析した。結果は、完全編集集団が、ＮＹ−ＥＳＯ１デキストラマーに対し最高の親和性を有することを実証した（図１９Ｂを参照）。図１９におけるデータは、非形質導入Ｔ細胞と比較した試料集団（移入、単一編集または完全編集Ｔ細胞）において観察される平均蛍光強度（ＭＦＩ）間の比を意味する相対蛍光強度（ＲＦＩ）として表す。３種の異なるドナーを使用して、３回の連続的実験を行った。結果（図１９Ｃ）は、ＣＥ集団が最高シグナルを有することを実証した。
その上、Ｃｉｅｒｉら（（２０１３年）Ｂｌｏｏｄ １２１巻、５７３〜５８４頁）の通りに、ＦＡＣＳ解析により表現型マーカーに関して細胞を解析した。この解析は、ある比率の修飾Ｔ細胞が、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ９５の共発現によって特徴付けられる、ステムメモリーＴ（ＴＳＣＭ）細胞の表現型を表示することを実証した。
ＴＣＲ編集リンパ球の完全編集集団は、γ−ＩＦＮ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（例えば、ヒトＩＦＮガンマＥＬＩＳＰＯＴ Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−Ｇｏ！（登録商標）、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（登録商標））において、ＮＹ−ＥＳＯ１ １５７〜１６５ペプチドで用量を増加させながら刺激すると、同族抗原に対し高アビディティーを表示した。使用したエフェクター細胞は、非形質導入（ＵＴ）、移入、単一編集Ｔ細胞（ＳＥ）および完全編集Ｔ細胞（ＣＥ）であった。結果を図２０Ａに示し、ＴＣＲ完全編集（ＣＥ）集団が、ペプチドに対する高アビディティーを表示したことを実証した。Ｔ２細胞に、増加濃度のＮＹ−ＥＳＯ−１ １５７〜１６５ペプチドまたはウィルムス腫瘍抗原１に由来する無関係ＷＴ１１２６〜１３４ペプチド（「Ｔ２−ＷＴ１１２６〜１３４」）をロードした。
次に、ＮＹ−ＥＳＯ１リダイレクトＴ細胞を、ＮＹ−ＥＳＯ１＋、ＨＬＡ−Ａ２＋骨髄腫細胞株（Ｕ２６６）で刺激して、ＮＹ−ＥＳＯ１抗原を天然に発現する腫瘍細胞を認識するその能力を検証した。先ず、標的としてＵ２６６またはＭＭ１Ｓ細胞株を使用して、ガンマ−ＩＦＮ ＥＬＩＳｐｏｔ（上述の）を行い（図２０Ｂを参照）、ＮＹ−ＥＳＯ１リダイレクトＴ細胞が、非形質導入Ｔ細胞と比較して、関連するＨＬＡ−Ａ２＋、ＮＹ−ＥＳＯ１＋細胞に対し高アビディティーを有し、ＭＭ１Ｓ細胞への結合がほとんど検出されなかったことを実証した。ＭＭ１Ｓ（ＨＬＡ−Ａ２−およびＮＹ−ＥＳＯ１−）無関係標的細胞に対する認識は観察されなかった。次に、標準方法を使用して、次の通りに５１クロム放出を行った：Ｖ字底９６ウェルプレートにおいて５時間、５１クロムで以前に標識した骨髄腫細胞株（ＭＭ１ＳおよびＵ２６６）と共に、エフェクターＴ細胞をインキュベートした。次式に従って特異的溶解を表した：１００×（平均実験的ｃｐｍ−平均自発的ｃｐｍ）／（平均最大ｃｐｍ−平均自発的ｃｐｍ）。
結果（図２０Ｃおよび図２０Ｄ）は、異なる集団が、関連する標的細胞Ｕ２６６の溶解を引き起こすことができ（図２０Ｃ）、無関係標的細胞ＭＭ１Ｓは溶解できなかった（図２０Ｄ）ことを実証した。完全編集Ｔ細胞（ＣＥ）は、適切な標的細胞を溶解する最高の能力を示した。
共培養実験においてＮＹ−ＥＳＯ１＋、ＨＬＡ−Ａ２＋腫瘍細胞を特異的に殺滅するその能力に関してもＮＹ−ＥＳＯ１リダイレクトＴ細胞を検査した（図２１を参照）。本実験において、エフェクターＴ細胞を、エフェクター／標的比１：１で、関連するＵ２６６細胞株（「Ａ２＋ＥＳＯ＋」）または無関係ＭＭ１Ｓ系列（「Ａ２−ＥＳＯ−」）と４日間共培養した。結果は、リダイレクトＴ細胞エフェクターが、関連するＨＬＡ−Ａ２＋、ＮＹ−ＥＳＯ１＋細胞株の成長を禁止することができることを実証する。図２１Ｂは、編集されたＴ細胞が、Ｕ２６６ ＨＬＡ−Ａ２＋、ＮＹ−ＥＳＯ１＋標的の存在下で２倍に増えたが、無関係Ａ２−ＥＳＯ−対照の存在下で増えなかったことを実証する。
実施例１２：編集されたＴ細胞のアロ反応性
３種のＮＹ−ＥＳＯ−１リダイレクトＴ細胞集団のアロ反応性潜在力を比較するために、照射された同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対する混合リンパ球反応（ＭＬＲ）においてＴＣＲ移入（移入）、ＴＣＲ単一編集（ＳＥ）およびＴＣＲ完全編集（ＣＥ）Ｔ細胞を別々に蒔いた。ドナーマッチＰＢＭＣおよびｍｏｃｋ形質導入Ｔ細胞（ＵＴ）を対照として使用した。２サイクルの刺激（Ｓ１ １０日間、Ｓ２ ７日間）後に、同じ同種異系標的により得られたＰＨＡ細胞株に対し、また、自家細胞に対し、５１Ｃｒ放出およびγ−インターフェロン（γ−ＩＦＮ）Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにおいて、エフェクター細胞を検査した。
同時に、ＮＹ−ＥＳＯ−１１５７−１６５パルスＨＬＡ−Ａ２＋照射細胞に対し、ＮＹ−ＥＳＯ−１リダイレクトＴ細胞および対照を刺激した。２サイクルの刺激（Ｓ１ １０日間、Ｓ２ ７日間）後に、ＮＹ−ＥＳＯ−１１５７−１６５ペプチドをパルスした（Ｃ）または未パルスの（Ｄ）ＨＬＡ−Ａ２＋Ｔ２細胞株に対しエフェクター細胞を検査した。
自家細胞に対する応答は観察されなかった。さらに、図２２に示す通り、移入Ｔ細胞による同種異系標的の溶解は、ＳＥおよびＣＥ Ｔ細胞の両方による溶解よりも有意に高かった（ｐ＝０．０５）（図２２Ａ）。加えて、γ−ＩＦＮ Ｅｌｉｓｐｏｔは、同種異系刺激によるγ−ＩＦＮの分泌において、移入および編集Ｔ細胞の間に統計的有意差を確認し（図２２Ｂ）、ＴＣＲ移入Ｔ細胞の細胞表面に発現される残存する内因性ポリクローナルＴＣＲおよびおそらくは誤対合したＴＣＲが、オフターゲット反応性をもたらし得る一方、ＳＥおよびＣＥ Ｔ細胞が、斯かる反応性を欠くことを示唆する。ＮＹ−ＥＳＯ−１リダイレクトＴ細胞（移入、ＳＥおよびＣＥ）は等しく、未パルス細胞（図２２Ｄ）と比較して、ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ペプチドをパルスしたＴ２細胞を高い特異性で溶解することができる（図２２Ｃ）。
実施例１３：Ｉｎ ｖｉｖｏ実験
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＮＹ−ＥＳＯ−１単一編集（ＳＥ）、完全編集（ＣＥ）およびＴＣＲ移入（移入）Ｔ細胞の有効性および安全性を比較するために、本出願人らは、亜致死的に照射されたＮＳＧマウスにおける、多発性骨髄腫（ＭＭ）Ｕ２６６細胞株（ＨＬＡ−Ａ２＋、ＮＹ−ＥＳＯ−１＋、ｈＣＤ１３８＋）の注射と、続くＴ細胞の投与に基づくマウスモデルを準備した。簡潔に説明すると、０日目に尾静脈を介して１０×１０６個のＵ２６６細胞を注射した。３日目に、マウスに、次のいずれかを静脈内に与えた：ＰＢＳ（Ｕ２６６）、または１０×１０６個のＮＹ−ＥＳＯ−１移入、ＳＥ、ＣＥ Ｔ細胞、または対照としてドナーマッチしたＰＢＭＣもしくはドナーマッチしたｍｏｃｋ形質導入Ｔ細胞（ＵＴ）。最後に、マウスの群に、Ｕ２６６によって発現されない（ＣＥＷＴ１）、ＷＴ１ １２６〜１３４ペプチドにリダイレクトされた、１０×１０６個の完全編集Ｔ細胞を与えた。異種移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）兆候に関してマウスを１週間に少なくとも３回モニターし、病理学的兆候が全くなければ、７０日目までに屠殺した。マウスにおけるＵ２６６の生着に必要とされる長い時間のため、本出願人らは、７０日目に屠殺された動物のみを抗腫瘍応答に評価可能と考慮した。全マウスをＧｖＨＤ評価に評価可能と考慮した。
図２３に結果を示す。図２３Ａは、安楽死させたマウスの骨髄から収集された細胞の細胞蛍光解析により同定された、ヒトＣＤ１３８＋ＭＭ細胞のパーセントを示す。ＮＹ−ＥＳＯ１リダイレクトＴ細胞で処理したマウスにおいて、屠殺時に、残存する疾患を骨髄において検出することはできず、脾臓においても検出できず（図示せず）、ＮＹ−ＥＳＯ１リダイレクト細胞のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を実証する。対照的に、ＰＢＳ（Ｕ２６６）またはＣＥ ＷＴ１ Ｔ細胞を注射した全マウスは、その骨髄に検出可能な腫瘍細胞を有した。
屠殺時に、全臓器を採取し、ホルマリンに固定し、ヘマトキシリン／エオシンで染色し、モノクローナル抗ｈＣＤ３抗体およびペルオキシダーゼコンジュゲートした第２ステップ試薬による対比染色後に免疫組織化学により同時に解析して、あらゆる可能なＧｖＨＤ活性を検出し、Ｔ細胞特異性を試験した。マウス臓器への浸潤は、Ｔ細胞の不適切なホーミングと、潜在的に、ＧｖＨＤの初期ステージを示す。病理学的グレード分類は、０（ｈＣＤ３＋細胞浸潤なし）から３（大規模かつ拡散したｈＣＤ３＋細胞浸潤）に及んだ。興味深いことに、ドナーマッチした未操作ＰＢＭＣ（「ＰＢＭＣ」）または非形質導入リンパ球（５匹のマウスのうち５匹、「ＵＴ」）を注射した４匹のマウスのうち４匹において観察されたものと同様に、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞は、従来のＴＣＲ移入Ｔ細胞（「移入」）を注入した５匹の動物のうち３匹の肺および肝臓への浸潤が判明した。逆に、ＮＹ−ＥＳＯ−１ ＳＥまたはＣＥ Ｔ細胞のいずれかで処理したマウスの臓器におけるリンパ球浸潤は検出されなかった（図２３Ｂ）。
実施例１４：ｍＲＮＡエレクトロポレーションによるＴＣＲ編集
Ａ．単一ＴＣＲ編集
ヌクレアーゼメッセージのｍＲＮＡエレクトロポレーションによるＴＣＲ編集を次の通りに評価した。簡潔に説明すると、末梢血由来のヒトＴリンパ球を抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激し、２日後にＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子に特異的なＺＦＮペアをコードする減少用量のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡをエレクトロポレーションした。
処理によるＺＦＮ誘導性ＴＣＲ破壊の程度を、ＴＲＡＣ−ＺＦＮ（図２４Ａの左のパネル）およびＴＲＢＣ−ＺＦＮ（図２４Ａの右のパネル）で処理したリンパ球における、エレクトロポレーション後５または２０日目のＣＤ３陰性細胞のパーセンテージとして測定した。加えて、ＴＲＡＣ−ＺＦＮ処理細胞（図２４Ｂの左のパネル）；ＴＲＢＣ−ＺＦＮ処理細胞（図２４Ｂの中央パネル）；および対照細胞（図２４Ｂの右のパネル）における、培養中に処理した細胞の数の増加倍率も評価した。さらに、刺激後１８日目のＴ細胞の表面表現型も評価した。Ｔステムメモリー細胞（ＴＳＣＭ）は、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ＋として定義され（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉら（２０１１年）Ｎａｔ Ｍｅｄ．１７巻（１０号）：１２９０〜７頁；およびＣｉｅｒｉ（２０１３年）Ｂｌｏｏｄ １２１巻（４号）：５７３〜８４頁を参照）；Ｔセントラルメモリー（ＴＣＭ）は、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ−として；Ｔエフェクターメモリー（ＴＥＭ）は、ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲＡ−として、末端エフェクター（ＴＥＭＲＡ）は、ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲＡ＋として定義される。ＵＴ：未処理細胞；ＵＴ＋Ｅ：ｍｏｃｋエレクトロポレーション細胞；ＧＦＰ：ＧＦＰコードｍＲＮＡをエレクトロポレーションした細胞。利用したｍＲＮＡ用量では、ＴＲＡＣ−ＺＦＮおよびＴＲＢＣ−ＺＦＮ処理細胞の表現型組成に統計的有意差は見出されなかった（二元Ａｎｏｖａ）。
Ｂ．ＴＣＲ二重編集
上述の通り、末梢血由来のヒトＴリンパ球を抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激し、２日後に、ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ特異的ＺＦＮペアの両方をコードするｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡを同時エレクトロポレーションした。次に、解析を行って、共処理細胞のＣＤ３陰性画分における完全ＴＣＲ−アルファおよびＴＣＲ−ベータ編集細胞の量を定量化した。簡潔に説明すると、エレクトロポレーション５日後に、ＣＤ３陰性細胞を選別し、アルファまたはベータＮＹ−ＥＳＯ特異的ＴＣＲ鎖およびレポート用遺伝子（それぞれＬＮＧＦＲまたはＧＦＰ、図２５Ａに図式的に表する）をコードする双方向性レンチウイルスベクター（ＬＶ）を別々に形質導入した。単一アルファまたはベータ編集細胞の画分を、外因性ＴＣＲアルファまたはベータとの相補性によりＣＤ３の表面発現を回復する形質導入細胞のパーセンテージとして測定した。次に、単一編集細胞の２種のパーセンテージを減算することにより、総ＣＤ３陰性集団における完全編集細胞の量を計算した。結果を図２５Ａに示し、ＴＣＲ−アルファおよびＴＣＲ−ベータ遺伝子の両方において、完全編集細胞集団の４０％が破壊されたことを実証する。
偏性ヘテロ二量体ＦｏｋＩドメイン（ＥＬＤおよびＫＫＲ）またはそれぞれのオルソロガスバージョン（ＲＤＤおよびＤＲＲ）を含有するＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ特異的ＺＦＮ ｍＲＮＡの同時エレクトロポレーションによる、ＣＤ３陰性（ＣＤ３−）細胞のパーセンテージ。生細胞のパーセンテージを、シングレットにおいてゲーティングされた７−ＡＡＤ陰性細胞のパーセンテージとして計算した。加えて、上述のＬＶレポーター戦略を使用して、ＣＤ３陰性画分における編集された細胞の組成を計算した。結果を図２５Ｂに示す。
刺激後１８日目に、上述のＴ細胞の表面表現型も決定した。Ｔステムメモリー細胞（ＴＳＣＭ）は、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ＋として定義され（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉら（２０１１年）、同書に；Ｃｉｅｒｉら（２０１３年）同書に）、Ｔセントラルメモリー（ＴＣＭ）は、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ−として、Ｔエフェクターメモリー（ＴＥＭ）は、ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲＡ−として、末端エフェクター（ＴＥＭＲＡ）は、ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲＡ＋として定義される。ＵＴ：未処理細胞。結果を図２５Ｃに示す。
表示用量のＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ特異的ＺＦＮ ｍＲＮＡを同時エレクトロポレーションしたＴ細胞の成長曲線も決定し、同時エレクトロポレーション翌日の細胞損失の初期急性期の後に、生存細胞は、未処理（ＵＴ）対照と比較して同様の動態で、培養において増え続けることを示した（図２５Ｄ）。
本明細書に言及されているあらゆる特許、特許出願および刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
理解を明確にする目的のため、図解および例として本開示を詳細に示してきたが、当業者であれば、本開示の精神または範囲から逸脱することなく、様々な変更および修正を実施することができることが明らかである。したがって、先の記載および実施例は、限定的に解釈するべきではない。

Claims (12)

  1. Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする安定的に組み込まれた外因性配列を含む単離されたＴリンパ球であって、前記細胞内の少なくとも１つの内因性ＴＣＲ遺伝子が、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮによって部分的にまたは完全に不活性化され、前記ＴＡＬＥＮが、ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメインおよび開裂ドメインを含み、さらに、前記ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメインが、野生型ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡドメインと比較してＣ末端短縮を含む、単離されたＴリンパ球。
  2. 前記内因性ＴＣＲ遺伝子が、ＴＣＲαまたはＴＣＲβ遺伝子である、請求項１に記載の単離されたＴリンパ球。
  3. 前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが、表５または表６の単一の行に示す認識ヘリックス領域を有するジンクフィンガータンパク質を含む、請求項１または２に記載の単離されたＴリンパ球。
  4. 前記ＴＡＬＥＮが、配列番号１４４〜１５３からなる群から選択される標的配列に結合する、請求項１または２のいずれかに記載の単離されたＴリンパ球。
  5. 前記ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチドが、インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）、ＡＡＶ、プラスミドまたはｍＲＮＡを使用して前記細胞に導入される、請求項１〜４のいずれかに記載の単離されたＴリンパ球。
  6. 前記外因性配列が、内因性ＴＣＲ遺伝子、ＣＣＲ５遺伝子またはＡＡＶＳ１遺伝子に導入される、請求項１〜５のいずれかに記載の単離されたＴリンパ球。
  7. 前記外因性配列が、腫瘍抗原特異的ＴＣＲ導入遺伝子からなる群から選択され、前記ＴＣＲ導入遺伝子が、ＴＣＲα導入遺伝子、ＴＣＲβ導入遺伝子およびこれらの組合せである、請求項１〜６のいずれかに記載の単離されたＴリンパ球。
  8. 前記腫瘍抗原が、ＮＹ−ＥＳＯ１を含む、請求項７に記載の単離されたＴリンパ球。
  9. 請求項１〜８のいずれかに記載の単離されたＴリンパ球を含む医薬組成物。
  10. 請求項１〜８のいずれかに記載のＴリンパ球を生成する方法であって、
    １種または複数のヌクレアーゼをコードする１種または複数のポリヌクレオチドを使用して、前記Ｔリンパ球における内因性ＴＣＲ遺伝子を不活性化するステップであって、前記ヌクレアーゼが、前記内因性ＴＣＲ遺伝子を開裂する、ステップと、
    外因性配列を前記Ｔリンパ球のゲノムに安定的に組み込むステップと
    を含む、方法。
  11. 前記外因性配列が、インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）、レトロウイルスベクター（ＲＶ）またはレンチウイルスベクター（ＬＶ）を使用して前記細胞に導入される、請求項１０に記載の方法。
  12. がん、感染症、自己免疫性障害または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の処置のための、請求項１〜８のいずれかに記載の単離されたＴリンパ球の使用または請求項９に記載の医薬組成物の使用。
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