JP7250031B2 - 新規ウイルスベクターおよびその製造方法と使用方法 - Google Patents

Description

本発明は、短縮されたバックボーンを有する新規アデノウイルスベクター、５個以上のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを含有する核酸ベクター、Ｃａｓタンパク質をコードする遺伝子およびＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを含有する核酸ベクター、並びにこれらのベクターを含む、ゲノム編集をするための組成物およびこれらを用いた遺伝子治療方法に関する。

原核生物の有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの１つであるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、遺伝子配列を効率よく書き換えるゲノム編集技術として、がんや遺伝病の治療などへの臨床応用が期待されている（非特許文献１）。基本的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、ＤＮＡ二本鎖を切断するＣａｓ９タンパク質と、標的ゲノム上の位置特異性を決定するＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびこれと一部相補性を有し、Ｃａｓ９タンパク質への結合の足場となる活性化ＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ）からなるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とから構成される。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡからなるガイドＲＮＡは、これらを融合した単一ガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ）として供給することも可能である。そして、当該ガイドＲＮＡは、これをコードするＤＮＡを含む適当なベクターを用いて、標的細胞内で発現することができる（非特許文献１）。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは部位特異的なゲノム切断をもたらすものの、その精度は完全ではない。理論上はガイドＲＮＡの指定する２０塩基の配列を有するゲノム部位を特異的に切断することが期待されるものの、実際には、１２塩基程度の特異性しか示さない。したがって、本来意図したゲノム領域以外の位置でゲノムを切断（オフターゲット切断）することがあり、当該切断によるオフターゲット変異が生じる。ヒトのゲノムは３０００Ｍ塩基程度の巨大なサイズを有するため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムをそのままヒトのゲノム編集治療に適用すると、標的以外の部位を数百ヶ所で切断する可能性があるため、治療方法として実用化することができない。標的部位以外での意図しない切断を抑制し、ヒトのゲノム編集治療を実用化するためには、オフターゲット変異の頻度を極めて低く抑制する必要がある（非特許文献２）。

これまで、Ｃａｓ９タンパク質のオフターゲット変異を抑制するために様々な開発が行われてきた。例えば、ガイドＲＮＡの配列を調整することや、Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を変異させることで、ＤＮＡの一方の鎖のみを切断する（ニックを入れる）Ｃａｓ９ニッカーゼ（Ｎｉｃｋａｓｅ）とし、近接する位置（例えば２個のガイドＲＮＡの５’端から３０塩基対程度以内）で、２本鎖ＤＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖にニック（一本鎖切断）を生じることにより、これら２つの位置でニックが形成された時に初めて当該部位でゲノムが切断されるように構成することで（ダブルニッキングシステム）、オフターゲット変異の頻度を大幅に低下させる試みがなされている（非特許文献２）。

上記ダブルニッキングシステムを利用することにより、実質的に２４塩基長の配列特異性を確保することが可能となり、ヒトゲノム編集に用いる場合に想定されるオフターゲット変異の頻度はほとんどゼロとなることが期待され、ゲノム編集治療の「安全性」が大幅に向上する。

また、通常のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムでは２本鎖のセンス鎖とアンチセンス鎖を同じ位置で切断することで平滑末端を生じるため、切断部位の一部は細胞の有するＤＮＡ修復機能によって再結合されてしまう。これに対して、上記ダブルニッキングシステムを、切断部位に５’オーバーハングを形成するように構成することで、切断部位の両端のセンス鎖およびアンチセンス鎖に数十塩基の５’オーバーハングが形成される（図１）。これにより細胞のＤＮＡ修復機能による切断部位の再結合が抑制され、標的を不可逆的に、確実にゲノムから欠失破壊することができる。また、上記５’オーバーハングを利用して、高効率で外来ＤＮＡ断片を挿入（ノックイン）することも可能となる。したがって、ダブルニッキング法を利用することでゲノム編集治療の「効率」は格段に向上する。

すなわち、ダブルニッキングシステムはゲノム編集治療をより「安全」かつ「高効率」にするものである。

しかしながら、これらの改善にも関わらず、ゲノム編集治療をより「安全」かつ「高効率」にする技術が求められている。

ここで、ダブルニッキングシステムでは、ゲノム上に一ヶ所のＤＮＡ２重鎖切断部位を作成するために、２個のガイドＲＮＡ（ガイドＲＮＡペア）を用いる必要があり、ゲノムから１つのＤＮＡ領域をその両端を切断して欠失させるためには、２つのガイドＲＮＡペア、すなわち４個のガイドＲＮＡが必要となる（図１）。しかしながら、単一の核酸ベクターから複数のガイドＲＮＡを同時に発現させることは困難であることが知られている。

また切断あるいはニックを入れる能力を完全に失わせたＣａｓ９変異体（デッド（ｄｅａｄ）Ｃａｓ９）を用いて遺伝子発現をノックダウンする方法が開発されている（非特許文献３）。多数のガイドＲＮＡを同時発現するベクターは多数の遺伝子の発現を同時にノックダウンさせることができ、基礎研究ではその技術が求められている。

理論に縛られるものではないが、その理由の一つは、ベクター上にある各ガイドＲＮＡ発現ユニットは、同じＤＮＡ配列を有する発現調節ユニットを含んでいるため、各ガイドＲＮＡ発現ユニットの転写方向をすべて同じに揃えないと、異なる方向に転写される隣接する発現ユニット間にパリンドローム配列が生じることとなり、当該パリンドローム配列内のＤＮＡ相補鎖形成によって、ベクターの複製が阻害されてしまうためであると考えられる。

また、他の理由は、宿主細胞のＤＮＡ組換え機能により、上記同じＤＮＡ配列を有する発現調節ユニット間で相同組換えが生じ、ガイドＲＮＡ発現ユニットの欠落が生じるためであると考えられる。特に、アデノウイルスベクターを製造する際に高効率作製法として従来利用されていたＣＯＳ－ＴＰＣ法（非特許文献４、特許文献１）では、製造工程において相同組換えが利用されるため、多数のガイドＲＮＡ発現ユニットを有するアデノウイルスベクターを製造することは困難であると考えられていた。

また、組換えアデノウイルスは遺伝子導入効率の高さ、非分裂細胞にも遺伝子導入できること、高力価のウイルス液の調製の容易さなどの利点から、動物細胞への優れた遺伝子導入用ＤＮＡベクターとして使用されており、遺伝子治療のみならず基礎分野での遺伝子機能解析などにも有用性が認められることから広く利用されている（非特許文献５、６）。

アデノウイルスベクターがウイルスとして複製し得るためには、そのサイズに上限がある。したがって、アデノウイルスベクターにペイロードとして運搬させる遺伝子断片のサイズをより大きくするためには、アデノウイルスベクターのペイロード以外の部分、すなわちバックボーン構造をできるだけ短くすることが望ましい。このため、アデノウイルスベクターのバックボーン構造を短縮するための試みが様々になされてきた（非特許文献６）。

例えば、従来用いられているアデノウイルス由来のベクターでは、ウイルス複製に必須でないＥ３領域が削除されており、公知のｐＢＨＧ１０プラスミドベクターでは、Ｅ３領域から２６８５塩基長の領域が欠落している。

Ａｄ５ベクターでは、更にウイルス遺伝子の発現に必要なＥ１遺伝子領域が欠失しており、Ｅ１遺伝子を持続的に発現するヒト胎児腎由来細胞株（２９３細胞）などの宿主細胞中のみで複製することができる。このことにより、ベクターとして用いた場合の標的細胞中でウイルスが複製することが抑制されるとともに、より大きな核酸領域をペイロードとして含むことが可能である（非特許文献６）。

しかしながら、アデノウイルスベクターのバックボーンを短縮する方法は自明ではなく、より短いバックボーンを有するアデノウイルスベクターを作成することは困難であった。例えば、アデノウイルスにおいてＥ３遺伝子自体は複製に必須ではないものの、当該遺伝子はゲノム上で必須構造タンパク質と隣接しており、Ｅ３遺伝子から欠失させる部分が多すぎると複製可能なアデノウイルスベクターが得られないことが知られていた（非特許文献７）。

特開平７－２９８８７７号公報

Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１６，Ｖｏｌ．８５：ｐｐ．２２７－２６４ Ｒａｎ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，２０１３，Ｖｏｌ．１５４，ｐｐ．１３８０－１３８９ Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，Ｖｏｌ．３３９，ｐｐ．８１９－８２３ Ｍｉｙａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９６，Ｖｏｌ．９３，ｐｐ．１３２０－１３２４ Ｇｕｌｔｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ，１９９２，ｐｐ．１８７－１９２． Ｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９４，Ｖｏｌ．９１，ｐｐ．８８０２－８８０６ 斎藤、ウイルス、１９９７、Ｖｏｌ．４７，Ｎｏ．２，ｐｐ．２３１－２３８

本発明の目的は、遺伝子治療等に用いられる、より優れたアデノウイルスベクターを提供することにある。その一つの態様として、本発明はアデノウイルスベクターのバックボーンを改変し、より長い核酸領域をペイロードして運搬することの可能なアデノウイルスベクターを提供することを目的とする。また、別の態様として、本発明はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによるゲノム編集等に用いるための、５個以上のＣａｓガイドＲＮＡを発現する核酸ベクターを提供することを目的とする。また、別の態様として、本発明はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによるゲノム編集等に用いるための、ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニット（好ましくは少なくとも３個）と、Ｃａｓタンパク質をコードする遺伝子を共に含む、一体型あるいはオールインワン型核酸ベクター（好ましくはアデノウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター）を提供することを目的とする。また、別の態様として、本発明はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによるゲノム編集等に用いるための、ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットと、Ｃａｓタンパク質をコードする遺伝子と、ノックインされるドナーＤＮＡ配列とを含む核酸ベクターを提供することを目的とする。また、別の態様において、本発明はアデノウイルスベクターのバックボーン改変を組み合わせることにより、より多種類のＣａｓガイドＲＮＡを発現し、多数の遺伝子を同時に修飾するためのアデノウイルスベクターを提供することを目的とする。

本発明者らは上記目的のために鋭意研究を行った結果、アデノウイルスベクターのバックボーンを従来用いられていたものから短縮することに成功した。具体的には、従来用いられていたＡｄ５ベクターから、Ｅ３領域において欠失部位を１５２塩基長拡大することに成功した。
前記Ｅ３領域とは、Ｅ３遺伝子および近接するＬ４遺伝子の一部のことをいう。前記Ｌ４遺伝子の一部とは、Ｅ３遺伝子群と隣り合いＬ４遺伝子群に属するｐＶＩＩＩ前駆体遺伝子においてその開始コドンから１２５番目～２７７番目の塩基のことをいう。

当該新規バックボーンを有する本発明のアデノウイルスベクターは、より長いコーディング配列を有する外来遺伝子を運搬するためのベクターとして有用である。

また、本発明者らは、５個以上の、具体的には８個またはそれ以上のガイドＲＮＡ発現ユニットを有し、動物細胞内で当該ガイドＲＮＡ発現ユニットを安定的に保持し、該ガイドＲＮＡを発現するアデノウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターを作成することに成功した。

また、本発明者らは、Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡ断片と３個以上のガイドＲＮＡ発現ユニットを有し、これらを同時に発現することのできるアデノウイルスベクターを作成することに成功した。

これら知見に基づき、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は一態様において以下のものを提供する

［１］
Ｅ３領域から２６８５塩基対長を超える領域が欠落している組換えアデノウイルスベクター。
［２］
Ｅ３領域から２８３７塩基対の領域が欠落している、上記［１］に記載の組換えアデノウイルスベクター。
［３］
Ａｄ５ベクター由来の組換えアデノウイルスベクターであって、Ｅ３領域において、Ａｄ５ベクターの位置づけで、第２７９８２番塩基～第３０８１８番塩基が欠失している、上記［１］に記載の組換えアデノウイルスベクター。
［４］
５個以上のＣａｓガイドＲＮＡを発現する核酸ベクター。
［５］
８個のＣａｓガイドＲＮＡを発現する、上記［４］に記載の核酸ベクター。
［６］
少なくとも４つのダブルニッキングを誘導することで少なくとも４ヶ所のゲノム切断を起こすように構成された、上記［５］に記載の核酸ベクター。
［７］
ゲノム上からノックダウンする標的配列の上流における近接した領域に、２つのダブルニッキングを誘導し、更に、該標的配列の下流における近接した領域に、２つのダブルニッキングを誘導することで、該標的配列をノックダウンするように設計された、上記［６］に記載の核酸ベクター。
［８］
核酸ベクターが、上記［１］～［３］のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスベクターである、上記［４］～［７］のいずれか一項に記載の核酸ベクター。
［９］
Ｃａｓタンパク質をコードする遺伝子およびＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを含む、一体型Ｃａｓ核酸ベクターである核酸ベクター。
［１０］
３個以上のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを含む、上記［９］に記載の核酸ベクター。
［１１］
４個のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを含む、上記［１０］に記載の核酸ベクター。
［１２］
該ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットの少なくとも１組が、ダブルニッキングを生じるように構成されている、上記［９］～［１１］のいずれか一項に記載の核酸ベクター。
［１３］
核酸ベクターが、上記［１］～［８］のいずれか一項に記載のベクターである、上記［９］～［１２］のいずれか一項に記載の核酸ベクター。
［１４］
ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニット、Ｃａｓタンパク質をコードする遺伝子、およびノックインされるドナーＤＮＡ配列を含む核酸ベクター。
［１５］
前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを２個以上含み、これらが、ダブルニッキングを誘導するように構成されている、上記［１４］に記載の核酸ベクター。
［１６］
前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを８個含み、これらが、４つのダブルニッキングを誘導するように構成されている、上記［１４］に記載の核酸ベクター。
［１７］
核酸ベクターが、上記［１］～［１３］のいずれか一項に記載のベクターである、上記［１４］～［１６］のいずれかに記載の核酸ベクター。

本発明の短縮された新規バックボーンを有するアデノウイルスベクターを用いることで、従来のアデノウイルスベクターよりも長いＤＮＡ断片を形質導入することが可能となり、例えば、遺伝子治療において、より長いタンパク質をコードする遺伝子を用いることや、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて、より多数のガイド発現ユニットを同時に発現させることが可能となる。

また、遺伝病治療などにおいて、異常遺伝子配列を正常遺伝子配列と置き換えるノックインが必要となるが、ノックインに用いるＤＮＡ断片は、異常配列の両側（上流および下流）に、相同組換えに利用される正常塩基配列を有している。一般的にこれらの配列は左アーム配列（上流）および右アーム配列（下流）と呼ばれている。本発明の短縮された新規バックボーンを有するアデノウイルスベクターを用いることで、ノックインに用いるＤＮＡ断片におけるこれら左アーム配列および右アーム配列の長さをより長くすることができる。これにより相同組換えの効率がより高くなり、ノックイン治療の効率を上げることが期待される。

また、本発明の８個以上のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを安定的に保持し、これらを同時に発現する核酸ベクターを利用することにより、単に、同時に発現されるＣａｓガイドＲＮＡコーディングＤＮＡユニットの量的な増加が得られるのみならず、これを用いたダブルニッキングシステムの使用法に、有用性の劇的な増大をもたらす質的改善を得ることができる。

すなわち、上述の通りダブルニッキングシステムでゲノムから１つのＤＮＡ領域を欠失させるためには、４個のＣａｓガイドＲＮＡコーディングＤＮＡが必要であるから、８個以上のＣａｓガイドＲＮＡコーディングＤＮＡを発現させることで初めて、ゲノム上の異なる２ヶ所以上で遺伝子破壊／挿入を同時に安全かつ高効率に行うことが可能となる。このような８個以上のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを有する単一ベクターの使用は、例えば４個のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを有するベクターを複数種類組み合わせて用いる方法に比べて、標的細胞へのベクター感染効率、発現量の調整などの点で大きな利点を有するものであり、ゲノム編集をより安全かつ高効率とするものである。

そして、ゲノム上の異なる２ヶ所以上の領域でダブルニッキング法による遺伝子破壊／挿入を行うことにより、例えば、２つ以上の異なる遺伝子を同時に破壊することが可能となる。多くの癌において、細胞の癌化には２つ以上の異なる遺伝子変異が関与していることが明らかとなっており、ゲノム編集治療において２つ以上の遺伝子を同時に編集できる能力は、癌治療において極めて有益な結果をもたらすことが理解される。また、単一の遺伝子の複数の領域を欠失させることにより、より確実な遺伝子破壊を行うことも可能となる。

また、ウイルスは変異しやすいため、患者に感染しているウイルスのゲノムの塩基配列は患者によって異なる。患者に持続感染しているウイルスの場合は、一人の患者が持つウイルス集団のゲノムの塩基配列は同一ではなく、さまざまな変異を持つ集団であることが知られている。その結果、薬剤耐性を持つウイルスが選択的に増殖し、薬剤が効果を失う原因となっている。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）がその一例であるが、この現象は、ＨＢＶのみならず、他のウイルスあるいは細菌やマラリアなど、様々な病原体において観察され、特定の病原体に限定されない。

従ってウイルスゲノムを標的とするベクターが多重にガイドＲＮＡを発現する（多数の異なるガイドＲＮＡを発現する）ことは、単に多数のウイルス必須部位を同時に破壊することにより治療効果を高めるだけでなく、（１）１つのベクター薬剤が変異ウイルスを持つ広範囲の患者のウイルスに効果をもつ広域薬剤となりうる、（２）一人の患者に持続感染している多様なウイルスのそれぞれを破壊するため残存ウイルスを減少させる、（３）ウイルスゲノム上の多数の部位を同時破壊することにより、ウイルスに変異により耐性を獲得する継代数を与えないため耐性ウイルスの出現を許さない、という効果を奏すると理解される。なお、上記（１）の効果については、本明細書の実施例４を参照されたい。

また癌についても同様の効果が考えられる。すなわち、単にがん細胞の増殖を有利にする多数の細胞遺伝子を同時に破壊することにより治療効果を高めるだけでなく、（１）１つのベクター薬剤が異なるゲノム変異によりがん細胞化している異なる患者にも効果を持つことにより、広範囲の患者のがんに効果をもつ広域薬剤となりうる、（２）一人の患者のがんにおいても、異なるゲノム部位が変異し転移能を獲得したがん細胞や、逆に増殖が遅くなり薬剤抵抗性が増すがん細胞など、多様ながん細胞のそれぞれを破壊することができる可能性がある、（３）がん細胞のゲノム上の多数の変異部位を同時切断破壊することにより、がん細胞に変異により耐性を獲得する継代数を与えないため耐性がん細胞の出現を許さない、という効果を奏すると理解される。

また、本発明のＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡ断片とＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニット（好ましくは、３個以上）の両方を有する一体型核酸ベクター（好ましくは、アデノウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター）は、安全かつ高効率なゲノム編集を行う上で、極めて有益な効果を有する。

すなわち、従来、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、Ｃａｓタンパク質をコードする遺伝子を有するベクターと、ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを含むベクターとを、標的細胞に共感染することでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを送達していた。このような共感染システムでは感染効率が低く、標的組織におけるゲノム編集の効率は低かった。これに対して、Ｃａｓタンパク質をコードする遺伝子とＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニット（好ましくは、３個以上）を有し、これらを同時に発現することのできる本発明の核酸ベクター（好ましくは、アデノウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター）は、感染した細胞において高効率でゲノム編集を達成することができ、Ｃａｓタンパク質またはガイドコーディングＤＮＡのみが送達された場合に生じ得る副作用を回避することができる。

また、本発明では上記アデノウイルスベクターのバックボーン改変と、８個以上のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットまたはＣａｓタンパク質をコードする遺伝子とＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを組み合わせることで、より多数のＣａｓガイドＲＮＡコーディングＤＮＡを同時発現させ、ゲノム編集治療の利益を増大することができる。

Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎｉｃｋＣａｓ９）によるゲノム編集の概要を示す図である。一組のニックで欠失を生ずる場合もある。 ４個のガイドＲＮＡコーディングＤＮＡユニット（ガイドＲＮＡ発現ユニット）の構成および、これらを含むアデノウイルスベクターの構成を示す図である。 Ｅ３領域の欠失をＰＣＲで確認した図である。 ４個のガイドＲＮＡ発現ユニットを有するアデノウイルスベクターが製造できたことを示すアガロースゲル電気泳動写真を示す図である。完全長ＤＮＡ導入法により生成したアデノウイルスベクターが高度に増幅した２９３細胞ＤＮＡをＢｓｐＥＩで切断した。ｍはマーカー、１～６は各アデノウイルスベクタークローン、矢印は４ガイドユニット（４ｇ）を含む断片のバンドの位置（２．２ｋｂ）を示す。クローン２～４は４個のガイドユニットを欠失なく保持していた。クローン１ではベクターの大半が１ユニットを欠失して３ユニットを保持するベクターであった（そのバンドを＊で示す）。図の右側に記載したＡはアデノウイルスベクターゲノム由来のバンド、ｃはベクター作製に用いたコスミドプラズミド由来のバンドを示す。なお別のガイドＲＮＡのセットを用いた実験では得られた６クローンはすべて欠失なく４ガイドユニットを保持していた。 ４個のガイドＲＮＡ発現ユニットを有するアデノウイルスベクターを用いたゲノム編集結果を示す図である。標的領域をＰＣＲで増幅することにより、増幅されるＤＮＡ断片長の変化（短縮）に基づいて、ゲノム編集によって生じた標的領域の変化を観察した。上段は野生型Ｃａｓ９タンパク質（ヌクレアーゼ）を発現するアデノウイルスベクターと組み合せた場合の結果を、下段はＣａｓ９ニッカーゼを発現するアデノウイルスベクターと組み合せた場合の結果を示す。図５中、左端はマーカー、他は各アデノウイルスベクタークローンを示す。Ｃａｓ９においては明らかに大きな欠失が見られたのは左から１２番目の１クローンであるが、Ｃａｓ９ニッカーゼでは左から１番目、２番目、１５番目の３クローンで明らかに大きな欠失が見られた。この結果はシークエンス解析でも確認された。 ４個のガイドＲＮＡ発現ユニットとノックインドナーＤＮＡ（挿入）を有するアデノウイルスベクターを用いたゲノム編集結果を示す図である。４個のガイドＲＮＡ発現ユニット（４ｓｇＲＮＡ）と同じベクター上に含むノックインドナー配列が、ゲノム上に挿入されたことを示す。図左上に共感染したベクターの構造を示す。図左下において２つの矢印で示したドナーＤＮＡ配列上、及びその外側の宿主細胞塩基配列上の２つのプライマーを用いたＰＣＲにより、図右下に示すように、正確なノックインが起きてはじめて検出されるバンドが、Ｃａｓ９ニッカーゼを用いた６日目（レーン２番目（６ｄａｙｓ：ＤＤ＆４Ｇ＋ｎｉｃｋ））及び１６日目（レーン６番目（１６ｄａｙｓ：ＤＤ＆４Ｇ＋ｎｉｃｋ））で観察された。左端のレーンはマーカーである。 ８個のガイドＲＮＡ発現ユニット（８ｇＲＮＡ－ｕｎｉｔ）を有するアデノウイルスベクターの構成（下段）およびこれを作成するのに用いたコスミドベクターの構成（上段）を示す図である。図中、四角形は、ガイドＲＮＡ発現ユニットを示す。Ａｄ－ＬおよびＡｄ－Ｒはそれぞれベクターのアデノウイルスゲノムの左端および右端の位置を示す。Ｓはコスミドプラズミドの大腸菌内での増殖において挿入された８個のガイド発現ユニットに欠失がないこと確認するためのＳｓｐＩの切断位置である。なおＳｓｐＩ部位はここに示す以外にもある。またＣＯＳはラムダインビトロパッケージングに必要な配列を示す。 ８個のガイドＲＮＡ発現ユニットを有するアデノウイルスベクターが製造できたことを示すアガロースゲル電気泳動写真を示す図である。図４の説明と同様にベクター増幅細胞ＤＮＡをＢｓｐＥＩで切断した。ｍはマーカー、１～６は各アデノウイルスベクタークローン、ｃは対照である。矢印は８個のガイドユニット（８ｇ）を含む断片のバンドの位置（３．８ｋｂ）を示す。また＊印は相同組換えにより欠失あるいは増幅したユニットを含む断片を示す。クローン２、３、５は８個のガイドユニットを欠失なく保持していた。クローン１と４では８個のガイドユニットをほぼ欠失なく保持するベクターが大部分であったが、一部に１ユニットが欠失し７ユニットを保持するベクターの混入によるバンド（＊印）が見られた。またクローン６では興味深いことに相同組換えによりユニット数が増加した９個のガイドユニットを保持するベクターが大部分であった（＊印）。図の右側に記載したＡはアデノウイルスベクターゲノム由来のバンド、ｃはベクター作製に用いたコスミドプラズミド由来のバンドを示す。なお別のガイドＲＮＡのセットを用いた実験では得られた６クローンはすべて欠失なく８個のガイドユニットを保持していた。 ８個のガイドＲＮＡを同時発現するアデノウイルスベクターによるＨＢＶのＸ遺伝子の切断位置を示す図である。作製したアデノウイルスベクターが発現する８個のガイドＲＮＡは標準株のゲノム配列を元にしているが、ここで標的とするＨＢＶは標準株とは異なる患者由来であり、標的配列領域に３塩基の相違が見られる。その結果４個のガイドＲＮＡはこの塩基相違により標的領域を切断することができないが、他の４個のガイドＲＮＡ配列はこの患者由来の配列と相同であるため、このベクターはこの患者由来のウイルスゲノムを４ヶ所（図のｃｕｔ１～ｃｕｔ４）で同時切断することが可能である。このように多重ガイド発現ベクターは、別の患者に持続感染しているＨＢＶゲノムが異なる位置に変異を持っていても同様に複数の切断を行うことができると考えられる。またこの標的領域はＨＢＶによる肝がん発症に関与するとされるＸ遺伝子の中にありこの遺伝子を破壊するだけでなく、ウイルスゲノム複製に必須であるＤＲ２配列とその下流を欠失破壊する。 この８個のガイドＲＮＡを同時発現するアデノウイルスベクターとＣａｓ９発現アデノウイルスベクターとの共感染による、Ｘ遺伝子内の標的領域の欠失を示す図である。肝がん由来ＨｅｐＧ２細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれたＨＢＶのＸ遺伝子内の標的領域（ｃｕｔ１からｃｕｔ４まで）は、ウイルス量ｍｏｉ１０において、ほぼ完全に欠失していた。ｍはマーカー、０、１、３、及び１０はｍｏｉ、ｃは対照を示す。図の下の数字（０、３０、７０、９０）は欠失破壊効率（％）を示す。 ４ヶ所の同時ダブルニッキング切断を行う８個のガイドＲＮＡを同時発現するアデノウイルスベクターによるＨＢＶゲノムの切断位置を示す図である。図左のＤＮ１～ＤＮ４はダブルニッキング切断の位置を示す。ＨｅｐＧ２細胞で複製中のＨＢＶゲノムから切断により生じたウイルスＤＮＡ断片は細胞内で結合し（中央の図の破線）環状化するので、その環状化ＤＮＡ（図右）を右端の２つのＰＣＲプライマーにより直鎖上ＰＣＲ断片として検出した。なお図はＤＮ１～ＤＮ４が完全切断した場合の図であるが、ウイルスゲノムは複製中であるため、新たに生成した未切断のウイルスゲノム（図左）も存在する。 ４ヶ所のダブルニッキング切断を行う８個のガイドＲＮＡを同時発現するアデノウイルスベクターによるＨＢＶゲノムの切断を示すゲル電気泳動の写真である。肝がん由来ＨｅｐＧ２細胞においてこのベクターを、Ｃａｓ９ニッカーゼを発現するアデノウイルスベクターと共感染させてダブルニッキング切断を行った。共感染７日目（ｄａｙ７）において複製中のＨＢＶゲノム量（レーンＮＣ９：右から２番目、２．８ｋｂのバンド）はコントロール（レーンｃｏｎｔ、右から３番目）に比べて約５分の１に低下し、代わりにＤＮ１とＤＮ４が同時に切断された場合に生ずる１．４ｋｂのブロードなバンドの方が濃く検出された。この結果は大部分のＨＢＶゲノムは切断破壊され、切断産物でもはや複製していないＨＢＶ ＤＮＡの方が多く存在することを示しており、ダブルニッキング切断が非常に効率よく行われたことを示す。また、Ｃａｓ９ニッカーゼ発現ベクターの代わりに本来のＣａｓ９を発現するベクターを用いた実験も併行して行った。この場合は２つの切断部位が近接した４組８ヶ所の同時切断となる。その結果興味深いことに、ダブルニッキング切断の方が本来のＣａｓ９による切断よりもＨＢＶゲノムの複製を阻止する効率が高いことが示された（レーン右から２番目のＮＣ９とレーン最右端のＣａｓ９で２．８ｋｂのバンドの濃さを比較）。ダブルニッキング切断の方がＣａｓ９切断よりも標的を破壊する効率が高いことは、アデノウイルスベクターを用いた他の実験系でも示された。 １２個のガイドＲＮＡ発現ユニットを有するアデノウイルスベクターが製造でき、培養細胞実験が行える量まで増幅しても欠失のないベクターが得られたことを示すアガロースゲル電気泳動写真を示す図である。左側の図に独立した６個のアデノウイルスベクタークローンの結果を示し、右側の図にクローン６のベクターを増幅し安定性を調べた実験結果を示す。図８の説明と同様にベクター増幅細胞ＤＮＡをＢｓｐＥＩで切断した。ｍはマーカーのレーンを示す。左側の図で１～６は初代クローンを増幅して得た２代目のクローンにおける各アデノウイルスベクタークローン、ｃは対照である。矢印は１２個のガイドユニット（１２ｇ）を含む断片のバンドの位置（５．５ｋｂ）を示す。また＊印は相同組換えにより欠失あるいは増幅したユニットを含む断片を示す。クローン６以外のクローンでは＊印で示す欠失を持つベクターが明らかに見られたが、クローン６（枠で囲んだレーン）では欠失ベクターによるバンドはほとんど検出されなかった。各図のレーン右側のＡはアデノウイルスベクターゲノム由来のバンド、ｃはベクター作製に用いたコスミドプラズミド由来のバンドを示す。右側の図の３ｒｄおよび４ｔｈのレーンはクローン６のベクターを増幅して得た３代目および４代目のベクターの結果を示す。図のレーン右側の複数の細い横線は、少量みられる欠失を持つベクター断片のバンドを示す。 １２個のガイドＲＮＡを同時発現するアデノウイルスベクターによるＨＢＶのＸ遺伝子の切断位置を示す図である。このベクターは図８に示す８個のガイドＲＮＡ発現ユニットに加えて、さらに４個のガイドＲＮＡ発現ユニットを持つ。その４個のうち２個は図の最下段に示すようにＸ遺伝子の終止コドンの近傍にＸ遺伝子の配列と重複した標的配列を持つ。一つの標的配列はこの遺伝子配列と一致しており、その切断部位をｃｕｔ５で示す。他方の標的配列はその５’端の１塩基（図の最後の塩基）がＸ遺伝子の配列と相違しているため切断することができない。５’端の１塩基が相違していなかった場合の切断位置を最下段中の縦の点線の矢印で示す。 この１２個のガイドＲＮＡを同時発現するアデノウイルスベクターとＣａｓ９発現アデノウイルスベクターとの共感染による、Ｘ遺伝子内の標的領域の欠失を示す図である。ｍはマーカー、０、１、３、及び１０はｍｏｉを示す。レーン右側の複数の細い横線は、切断効率がやや低いｃｕｔ２またはｃｕｔ３と、ｃｕｔ１またはｃｕｔ４またはｃｕｔ５との組合せにより生じた欠失によるバンドを示す。図の下の数字（０、２２、４５、７４）は欠失破壊効率（％）を示す。 Ｃａｓ９ニッカーゼをコードする遺伝子および４個のガイドＲＮＡ発現ユニットを有するアデノウイルスベクターが製造できたことを示すアガロースゲル電気泳動写真を示す図である。ｍはマーカー、１～６は各アデノウイルスベクタークローン、ｃは対照である。ｉｎｗａｒｄ、ｏｕｔｗａｒｄはそれぞれＣａｓ９ニッカーゼをコードする遺伝子の転写方向が内向きあるいは外向きであることを示す。どちらの向きでも得られた６クローンすべてが欠失なく４ユニットを保持していた（矢印で示した２．２ｋｂのバンド）。ただし図ではほとんど見えないがｉｎｗａｒｄのクローン１では欠失による３ユニットのバンドわずかに見られた。 マウスＨ２Ａａ遺伝子エクソン１を２ヶ所切断する４個のダブルニッキングガイドＲＮＡの位置を示す図である。エクソン１は５’キャップ部位および開始コドンを含み、その下流に設定した２組のダブルニッキング切断（ＤＮ切断）を行う４個のガイドＲＮＡ標的配列（１～４）の位置を示している。 ４個のガイドＲＮＡによるダブルニッキング２ヶ所切断を行う一体型アデノウイルスベクターを用いたマウスＨ２Ａａ遺伝子の破壊（ｉｎ ｖｉｖｏ）を示す図である。一体型アデノウイルスベクターの模式図、および、ベクター投与後７日目（ｄａｙ７）（Ｃｏｎｔｒｏｌ、４ｇ ｏｕｔ－ｍ１、４ｇ ｏｕｔ－ｍ２、４ｇ ｉｎ－ｍ３、４ｇ ｉｎ－ｍ４）および１５日目（ｄａｙ１５）（Ｃｏｎｔｒｏｌ、４ｇ ｏｕｔ－ｍ５、４ｇ ｏｕｔ－ｍ６、４ｇ ｉｎ－ｍ７、４ｇ ｉｎ－ｍ８）における、Ｔ７Ｅ１（Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ）アッセイによる標的部位のゲノム断片の長さを示すアガロースゲル電気泳動写真を示す。＋はＴ７Ｅ１酵素反応後、－は酵素無添加である。無修飾のゲノム断片を示す０．５６ｋｂのバンドに加えて、コントロール（ベクター無投与、マーカーのレーンを除く左から２番目の（Ｃｏｎｔｒｏｌの＋のレーン））では観察されない、ダブルニッキングされた領域（ＤＮ領域）が酵素により除去されて生じた約０．３３ｋｂおよび０．１６ｋｂのバンドが、７日目（４ｇ ｏｕｔ－ｍ１、４ｇ ｏｕｔ－ｍ２、４ｇ ｉｎ－ｍ３、４ｇ ｉｎ－ｍ４）および１５日目（４ｇ ｏｕｔ－ｍ５、４ｇ ｏｕｔ－ｍ６、４ｇ ｉｎ－ｍ７、４ｇ ｉｎ－ｍ８）において観察された。＋のレーンの下の数値（パーセント）は０．５６ｋｂＤＮＡの切断除去効率を示す。 ガイドＲＮＡ発現ユニットの構造を示す図である。Ｕ６プロモーター中の欠失させた部分（１３５ｂｐ：－２１９～－８５）を白抜きの矢印で示した囲みで示す。 マウスＮＴＣＰ遺伝子エクソン２を４ヶ所切断する８個のダブルニッキングガイドＲＮＡの位置を示す図である。エクソン２は開始コドンを含み、その下流に設定した４組のダブルニッキング切断（ＤＮ切断）を行う８個のガイドＲＮＡ標的配列（１～８）の位置を示している。 ８個のガイドＲＮＡ発現ユニットとＣａｓ９ニッカーゼ発現ユニットを持つ一体型アデノウイルスベクターが作製できたことを示す図である。一体型アデノウイルスベクターの模式図、および、アガロースゲル電気泳動写真を示す。図２１の下段の左の図における最も右側のレーン「ｃ」はアデノウイルスベクター作製に用いたコスミドを示し、図２１の下段の各図におけるゲル右側に示す「Ａ」はアデノウイルスベクターおよびコスミド由来のバンド、「ｃ」はコスミド由来のバンドであることを示す。３．０ｋｂのバンドは、ベクターが８ガイド発現ユニットを含むことを示している。図２１の下段の左側ゲルの「２ｎｄ」、右側ゲルの「３ｒｄ」、「４ｔｈ」、「５ｔｈ」は、それぞれクローンを２、３、４、５回継代して純化したことを意味している。「ｐｕｒｉｆｙ」は、動物実験が可能な量の精製ウイルスを意味している。精製ウイルスの大部分は３．０ｋｂのバンドを示し、８個のユニットを保持していることが判明した。 ８個のガイドＲＮＡによるダブルニッキング４ヶ所切断を行う一体型アデノウイルスベクターを用いたマウスＮＴＣＰ遺伝子の破壊（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）の結果を示す図である。左側に短時間露光のアガロースゲル電気泳動写真、右側に長時間露光のアガロースゲル電気泳動写真を示す。０．６５ｋｂｐの断片は、無修飾のゲノム断片を示す。０．６５ｋｂｐの断片に対して、約１５０塩基の欠失を示す０．５ｋｂｐの断片は、ガイドＲＮＡ１、２とガイドＲＮＡ３、４の同時切断による欠失、あるいはガイドＲＮＡ３、４とガイドＲＮＡ７、８の同時切断による欠失を示している。０．６５ｋｂｐの断片に対して、約３５０塩基の欠失を示す０．３ｋｂｐの断片は、ガイド１と２およびガイド７と８の間の欠失を示している。 ８個のガイドＲＮＡによるダブルニッキング４ヶ所切断を行う一体型アデノウイルスベクターを用いたマウスＮＴＣＰ遺伝子の破壊（ｉｎ ｖｉｖｏ）の結果を示す図である。１５日目における２番、３番、４番のマウスにおいて１．０５ｋｂおよび０．８５ｋｂのバンドが認められた。 Ｘ遺伝子を標的とする４ヶ所のダブルニッキング切断を行う８個のガイドＲＮＡの標的位置を示した図である。８個のガイドＲＮＡを数字１～８で示す。ダブルニッキング部位を太い横線で示す。図２４中、実線の矢印は、Ｃａｓ９ニッカーゼによるニックの位置を示し、破線の矢印は、Ｃａｓ９の場合にはその位置で２本鎖切断が起こることを示す。 ８個のガイドＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターと、Ｃａｓ９若しくはＣａｓ９ニッカーゼを発現するアデノウイルスベクターまたはコントロールアデノウイルスベクターとによる、染色体上に組込まれたＸ遺伝子の破壊を示した図である。４ヶ所８個のガイドＲＮＡ標的領域はこれを挟むフォワードおよびリバースプライマーにより０．６６ｋｂのＤＮＡ断片として増幅される。ｍはマーカー、Ｃａｓ９はＣａｓ９を発現するアデノウイルスベクター、ＮＣ９はＣａｓ９ニッカーゼを発現するアデノウイルスベクター、１ｗ１は発現ユニットを持たないコントロールアデノウイルスベクターを用いた場合の結果を示す。

以下、本発明の実施形態について説明する。以下の説明は単なる例示であり、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。

（定義）
本明細書において、複数の数値の範囲が示された場合、それら複数の範囲の任意の下限値および上限値の組み合わせからなる範囲も同様に意味する。

本発明において、「組換えアデノウイルスベクター」または「アデノウイルスベクター」とは、アデノウイルス固有の塩基配列以外の塩基配列をそのゲノム中に含有するアデノウイルスのことをいう。アデノウイルス固有の塩基配列以外の塩基配列には特に制限はなく、タンパク質をコードする遺伝子やプロモーターやポリＡ配列などの調節遺伝子であってもよいし、また何ら機能を有さない塩基配列であってもよい。

本発明の組換えアデノウイルスベクターに含まれる外来遺伝子としては、ヒトの治療用遺伝子や、ＧＦＰ遺伝子等のいわゆるレポーター遺伝子、リコンビナーゼ等が挙げられる。外来遺伝子の挿入位置としては、Ｅ１領域欠失部位、Ｅ３領域欠失部位、Ｅ４遺伝子上流挿入部位等を選択できるがこれらに限定されない。

本発明に用いる組換えアデノウイルスベクターの由来は特に限定されないが、ヒト由来のアデノウイルスであることが好ましい。ヒト由来のアデノウイルスにおいては、Ｃ型に分類される２型または５型がより好ましい。

組換えアデノウイルスベクターの作製法は特に限定されないが、アデノウイルスゲノムの全長を含むコスミドベクターに目的遺伝子を挿入後、２９３細胞へトランスフェクションすることによって組換えアデノウイルスベクターを得る方法（完全長ＤＮＡ導入法：Ｆｕｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６，Ｖｏｌ．５０，ｐｐ．４６３－４５４）を用いることが好ましい。

本発明において、「ゲノム編集」は、１つまたは複数のヌクレアーゼおよび／またはニッカーゼを用いて、ＤＮＡが、標的ＤＮＡ、例えば、細胞のゲノムから挿入、置換、または除去される一連の遺伝子操作を意味する。ヌクレアーゼは、ゲノムにおいて所望の位置に、特異的な二本鎖切断を生じさせ、細胞の内因性機構を利用して、相同組換え修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により、引き起こされた切断を修復する。ニッカーゼは、ゲノムにおいて所望の位置に特異的な一本鎖切断を生じさせる。ある態様において、２つのニッカーゼは、標的ＤＮＡの向かい合わせのストランドに２個の一本鎖切断を生じさせるために用いることができ、それにより、平滑または突出末端を生み出す。標的ＤＮＡ配列のゲノム編集を誘導するために任意の適切なヌクレアーゼを導入することができ、それらには、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、Ｃｐｆ１、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、他のエンド－またはエキソ－ヌクレアーゼ、それらのバリアント、それらの断片、およびそれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。

本発明において、「ゲノム切断」または「ゲノムの切断」とは、上述のゲノム編集に伴って、ゲノムを構成する２本鎖核酸の両方の鎖が切断されることを意味する。当該２本鎖核酸の切断は、センス鎖とアンチセンス鎖の互いに対応する塩基対での切断により、平滑末端を生じるものでもよいし、センス鎖とアンチセンス鎖が近接する異なる位置で切断されることにより、突出末端を生じるものであってもよい。

本発明において、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム」は、原核生物が有する免疫機構であるＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）核酸とＣａｓタンパク質（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）を利用したシステムを意味する。「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム」はクラス１とクラス２に分類され、クラス２の「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム」はさらにＩＩ型、Ｖ型、ＶＩ型に分類される（Ｙａｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，２０１７，Ｖｏｌ．６７，ｐｐ．６３３－６４５）。

ＩＩ型「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム」に分類される、Ｃａｓタンパク質としてＣａｓ９を利用するシステムは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質と、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびこれと部分的に相補的であり、Ｃａｓ９タンパク質への結合の足場となるトランス作動性ＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ）からなるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を利用する。上記ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡは、融合した単一のＲＮＡ分子（単一ガイドＲＮＡ）として供給されてもよいし、別々のＲＮＡ分子（「非単一ガイドＲＮＡ」と称することがある）として供給されてもよい。一つの態様において、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム」は標的細胞に対して、Ｃａｓ９タンパク質をコードするＤＮＡ断片、ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ断片およびｔｒａｃｒＲＮＡを発現するＤＮＡ断片として供給される。また、一つの態様において、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム」は、Ｃａｓ９タンパク質をコードするＤＮＡ断片および単一ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ断片として供給される。一つの態様において、これらのＤＮＡ断片は、ウイルスベクターを用いて標的細胞に供給される。これらのＤＮＡ断片は、単一のウイルスベクターあるいは、別々のウイルスベクターにより標的細胞に供給され得る。なお、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡとしては、特に制限はなく、公知のものを適宜選択することができ、例えば、Ａｄｄｇｅｎｅ社製のプラズミド（ｐＸ２６０）などを適宜選択することができる。前記プラズミド中のｔｒａｃｒＲＮＡをコードする部分のＤＮＡの具体的な配列は、配列番号５２で表される。

本発明において、「Ｃａｓタンパク質」は、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム」を構成する、エフェクター分子として機能するタンパク質をおよびその誘導体を意味する。例えば、「Ｃａｓタンパク質」は、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質およびＤＮＡ切断活性を有するその変異体を意味する。一つの態様において、「Ｃａｓタンパク質」はＤＮＡ２重鎖切断活性を有するＣａｓヌクレアーゼである。一つの態様において、「Ｃａｓタンパク質」はＤＮＡ２重鎖の片方の鎖のみを切断する活性を有するＣａｓニッカーゼである。一つの態様において、ＣａｓニッカーゼはＲｕｖＣドメインに変異を有するＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）ニッカーゼ（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，Ｖｏｌ．３３７，ｎｏ６０９６，ｐｐ．８１６－８２１）であってもよい。

本発明において、「ガイドＲＮＡ発現ユニット」または「ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニット」は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて使用されるガイドＲＮＡ（「ＣａｓガイドＲＮＡ」と称することもある。）を発現するためのＤＮＡ構成単位を意味する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに利用する場合、当該ガイドＲＮＡとして、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを融合した単一ガイドＲＮＡを用いることができ、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを別々とした非単一ガイドＲＮＡを用いることもできる。前記「ガイドＲＮＡ発現ユニット」の態様としては、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを融合した単一ガイドＲＮＡを発現するための「単一ガイドＲＮＡ発現ユニット」、ｃｒＲＮＡを発現するための「ｃｒＲＮＡ発現ユニット」、ｔｒａｃｒＲＮＡを発現するための「ｔｒａｃｒＲＮＡ発現ユニット」とすることができる。前記「ガイドＲＮＡ発現ユニット」は、「単一ガイドＲＮＡ発現ユニット」のみからなるものであってもよいし、「ｃｒＲＮＡ発現ユニット」と「ｔｒａｃｒＲＮＡ発現ユニット」とからなるものであってもよいし、「単一ガイドＲＮＡ発現ユニット」と、「ｃｒＲＮＡ発現ユニット」と、「ｔｒａｃｒＲＮＡ発現ユニット」とを含むものであってもよい。ガイドＲＮＡ発現ユニットは、当該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡの他、プロモーターなどその発現を調節する発現調節領域等を含む。当該プロモーターは特に限定されないが、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ｔＲＮＡプロモーターおよびアデノウイルスＶＡプロモーター等を使用することができる。通常、ベクターに複数のガイドＲＮＡ発現ユニットを含ませる場合、これらは同じ転写方向になるように隣接してタンデムに配置される。

本発明において、ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットが「ダブルニッキングを生じるように構成される」とは、少なくとも２個のガイドＲＮＡ発現ユニットが、ゲノム上の近接する位置のセンス鎖およびアンチセンス鎖にそれぞれ一本鎖切断、すなわち「ニック」を誘導するように選択されており、それによりゲノムＤＮＡの２本鎖が当該２つのニックの付近で切断されることを意味する。

本発明において、ＤＮＡ上の２つの位置が「近接する位置」にあるとは、当該２つの位置の間に、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０塩基対が存在することを意味するが、これらに限定されない。

本発明において、「核酸」は、「ヌクレオチド」、または「ポリヌクレオチド」と同等のものとして用いられ、一本鎖、二本鎖、または多重鎖のいずれかの形での、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、およびそれらのポリマーを意味する。「核酸」には、一本鎖、二本鎖、もしくは多重鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドが含まれるが、これらに限定されない。例えば、プリン塩基および／もしくはピリミジン塩基、もしくは他の天然、化学修飾型、生化学的修飾型、非天然、合成、もしくは誘導体化のヌクレオチド塩基を含むポリマーも含む。特に言及することがない限り、特定の配列を有する核酸は、その保存的に改変されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、一塩基多型（ＳＮＰ）、および相補的配列を包含する。

本発明において、特定のＲＮＡを「コードする」ＤＮＡ配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ核酸配列である。ＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されるＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードする場合もあるし、あるいは、ＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されないＲＮＡ（例えばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、またはＤＮＡ標的化ＲＮＡ；「非コード」ＲＮＡまたは「ｎｃＲＮＡ」とも称される）をコードする場合もある。

本発明において、「遺伝子」は「ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列」と同等に用いられ、ポリペプチド鎖を産生するのに関与するＤＮＡのセグメントを意味する。当該ＤＮＡセグメントは、直接ポリペプチドをコードする領域に加えて、その転写、翻訳の調節に関与する機能を有する、コード領域の前および後の領域（リーダーおよびトレイラー）を含む。当該ＤＮＡセグメントは、また、上記コード領域（エクソン）の間の介在配列（イントロン）を含んでもよい。

本発明において、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は同等のものとして使用され、アミノ酸残基のポリマーを意味する。「ポリペプチド」は天然に存在するアミノ酸ポリマー、天然に存在しないアミノ酸ポリマー、一部のアミノ酸が対応する人工の化学的模倣体に置換されているポリマーを含む。

本発明において、「核酸ベクター」とは、外来遺伝子を標的細胞内に送達するために用いられる、核酸からなる分子を意味する。核酸ベクターは特に限定されないが、プラズミドまたはＤＮＡウイルスベクター、ＲＮＡウイルスベクター等のウイルスベクターであってもよい。当該ウイルスベクターとして、例えばアデノウイルス、レンチウイルス、バキュロウイルス、センダイウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルスまたはこれらの変異体を用いることができる。

本発明において、「ダブルニッキング」とは、近接する位置で、２本鎖ＤＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖にニック（一本鎖切断）を生じることにより、これら２つの位置でニックが形成された時に初めて当該部位でゲノムが切断されるように構成する手法をいい、当該手法を用いるために構成される複数のガイドＲＮＡ発現ユニットを含むゲノム編集システムを「ダブルニッキングシステム」と呼ぶことがある。当該ニックの間の距離は、例えば４０塩基対以内であり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０塩基対であってもよいが、これらに限定されない。

２つの「ダブルニッキング」を近接する位置で行うことにより、当該位置におけるゲノム切断を更に安全、確実とすることが可能であり、また、ゲノム上からノックダウンする標的配列の上流における近接した領域に、２つのダブルニッキングを誘導し、更に、該標的配列の下流における近接した領域に、２つのダブルニッキングを誘導することで、該標的配列をノックダウンすることで、当該標的配列を極めて安全かつ確実にノックダウンすることが可能となる。

本発明において、「一体型Ｃａｓ核酸ベクター」または「オールインワン型Ｃａｓ核酸ベクター」とは、当該核酸ベクターが、ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットと、Ｃａｓタンパク質をコードする遺伝子を共に含むことを意味する。「一体型Ｃａｓ核酸ベクター」は、単に「一体型核酸ベクター」または「オールインワン型核酸ベクター」と呼ばれることがあり、また、Ｃａｓタンパク質の種類に応じて、「一体型Ｃａｓ９核酸ベクター」または「オールインワン型Ｃａｓ９核酸ベクター」と呼ばれることがある。また、例えば核酸ベクターがアデノウイルスベクターである場合、「一体型Ｃａｓアデノウイルスベクター」などと呼ばれることもある。

「一体型Ｃａｓ核酸ベクター」が含有する、ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットと、Ｃａｓタンパク質をコードする遺伝子の数は特に限定されないが、典型的には１コピーのＣａｓタンパク質をコードする遺伝子と共に、２個以上、例えば、２、３、４、５、６個のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを含むことができる。一態様として、４個の単一ガイドＲＮＡ発現ユニットと、１個のＣａｓタンパク質をコードする遺伝子を含む態様、２個のｔｒａｃｒＲＮＡ発現ユニットと、６個のｃｒＲＮＡ発現ユニットと、１個のＣａｓタンパク質をコードする遺伝子を含む態様、４個のｔｒａｃｒＲＮＡ発現ユニットと、４個のｃｒＲＮＡ発現ユニットと、１個のＣａｓタンパク質をコードする遺伝子を含む態様、又は６個のｔｒａｃｒＲＮＡ発現ユニットと、２個のｃｒＲＮＡ発現ユニットと、１個のＣａｓタンパク質をコードする遺伝子を含む態様が好ましい。

また、本件発明の「一体型Ｃａｓ核酸ベクター」は、更にノックインされるドナーＤＮＡ配列を含むことができる。当該ドナーＤＮＡ配列は、遺伝子をコードする配列であってもよいし、遺伝子をコードしない配列であってもよい。当該「一体型Ｃａｓノックイン核酸ベクター」は、極めて高い効率で、当該ドナーＤＮＡ配列をゲノム上の特定の位置へ導入することができる。典型的には、当該一体型Ｃａｓノックイン核酸ベクターはダブルニッキングを生じるための１組（２個）のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニット、１つのドナーＤＮＡ配列および１つのＣａｓタンパク質をコードする遺伝子から構成されるが、当該構成に限定されない。

本発明において、「宿主細胞」とは、一般に外来性ＤＮＡ配列を形質移入された細胞を意味し、特に、本発明の核酸ベクターの産生に適した細胞を意味する。たとえば、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞などを使用することができる。特に哺乳類細胞を使用することが好ましい。適切な哺乳類細胞として、必ずしも限定するものではないが、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｈｕｈ－７細胞、ＢＨＫ細胞、ＰＣ１２細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ－７細胞、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞、Ｓｆ９細胞、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞、ＨｅｐＧ２細胞などを使用することができる。

本発明において、「相補性」は、核酸が、別の核酸配列と水素結合を形成する能力を指す。相補性のパーセントは、核酸分子において別の核酸配列と水素結合を形成することができる塩基のパーセンテージを示す。「完全に相補的な」とは、核酸配列の全ての連続した残基が、第２の核酸配列における連続した残基の同じ数と水素結合することを意味する。本明細書で用いられる場合、２つの核酸が「実質的に相補的」であるとは、当該２つの核酸がストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを意味する。

本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、標的配列と相補性を有する核酸が、主にその標的配列とハイブリダイズし、かつ非標的配列とは実質的にハイブリダイズしない、条件を指す。一般的に、配列が長ければ長いほど、その配列がそれの標的配列と特異的にハイブリダイズする温度は高くなる。

本発明において、「変異体」または「バリアント」は、天然に存在するものから逸脱する、生物体、菌株、遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または特性の一形態を指す。

（短縮された新規バックボーンを有するアデノウイルスベクター）
本発明の短縮された新規バックボーンを有するアデノウイルスベクターは、アデノウイルス由来のベクターであって、Ｅ３領域において、２６８５塩基対長を超える領域が欠落している組換えアデノウイルスベクターである。

このようなアデノウイルスベクターはＡｄ５ベクターをベースとして、Ａｄ５のＥ３領域においてＡｐａＩ制限酵素切断部位に隣接する第２７９８２番目塩基～第３０８１８番塩基を欠失させることで作成することができる。

当該塩基配列の欠失には、当業者が通常用いる標準的な遺伝子組み換え技術を用いることができる。

当該短縮された新規バックボーンを有するアデノウイルスベクターは、例えばＡｄ５アデノウイルスベクターと通常組み合わせて使用される細胞（例えば２９３細胞）を用いて増幅させることができる。

（５個以上のガイドＲＮＡ発現ユニットを含有する核酸ベクター）
本発明の５個以上のガイドＲＮＡ発現ユニットを含有する（５個以上のＣａｓガイドＲＮＡを発現する）核酸ベクターとして、好ましくは組換えアデノウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを用いることができる。

５個以上のガイドＲＮＡ発現ユニットを含有する核酸ベクターの製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
例えば、５個以上のガイドＲＮＡ発現ユニットを含有するアデノウイルスベクターの製造方法は特に限定されないが、好ましくはアデノウイルスゲノムＤＮＡの一部を含むコスミドベクターに、それぞれ遺伝子発現調節部位を伴った５個以上のガイドＲＮＡ発現ユニットを挿入した後、２９３細胞へトランスフェクションすることによって組換えアデノウイルスベクターを得る方法（完全長ＤＮＡ導入法：Ｆｕｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６，Ｖｏｌ．５０，ｐｐ．４６３－４５４）により作成することができる。

上記アデノウイルスベクターとして使用し得るベクターは特に限定されず、様々なアデノウイルス由来のベクターを使用することができる。

一つの態様において、上記アデノウイルスベクターとして、Ａｄ５ベクターおよびその改変体を用いることが望ましい。一つの態様において、上記本発明の短縮されたバックボーンを有するアデノウイルスベクターを用いることで、更に多数のガイドＲＮＡ発現ユニットを含有するアデノウイルスベクターを作成することができる。

また、核酸ベクターとして、レンチウイルスベクター等他のベクターを用いることもできる。これらのベクターは、当業者が通常行う方法によって製造することができ、例えば、レンチウイルスベクターの場合、後述する実施例１３に記載の方法で製造することができる。

本発明の５個以上のガイドＲＮＡ発現ユニットを含有する核酸ベクターの含有するガイドＲＮＡ発現ユニットの数は、５個以上であれば核酸ベクターに包含させられ得る限り特に限定されず、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個以上であり得る。前記「ガイドＲＮＡ発現ユニット」の態様の具体例としては、「単一ガイドＲＮＡ発現ユニット」からなる態様、「ｃｒＲＮＡ発現ユニット」及び「ｔｒａｃｒＲＮＡ発現ユニット」からなる態様が挙げられる。また、前記「ｃｒＲＮＡ発現ユニット」及び「ｔｒａｃｒＲＮＡ発現ユニット」からなる態様では、例えば、前記「ｔｒａｃｒＲＮＡ発現ユニット」を２個、前記「ｃｒＲＮＡ発現ユニット」を６個とする態様、前記「ｔｒａｃｒＲＮＡ発現ユニット」を４個、前記「ｃｒＲＮＡ発現ユニット」を４個とする態様、前記「ｔｒａｃｒＲＮＡ発現ユニット」を６個、前記「ｃｒＲＮＡ発現ユニット」を２個とする態様、前記「ｔｒａｃｒＲＮＡ発現ユニット」を４個、前記「ｃｒＲＮＡ発現ユニット」を８個とする態様とする態様などが挙げられる。
前記５個以上のガイドＲＮＡ発現ユニットを含有する核酸ベクターでは、更にノックインされるドナーＤＮＡ配列を含むことができる。前記ドナーＤＮＡ配列は、上記した「一体型Ｃａｓ核酸ベクター」におけるものと同様のものを用いることができる。

（Ｃａｓタンパク質をコードする遺伝子とガイドＲＮＡ発現ユニットを含有する核酸ベクター）
本発明のＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡ断片とガイドＲＮＡ発現ユニットを含有する核酸ベクターは、様々な核酸ベクターに基づいて作成することができる。一態様において、核酸ベクターはアデノウイルスベクターまたはレンチベクターであることが好ましい。アデノウイルスベクターに基づいて作成する場合は、上記完全長ＤＮＡ導入法を用いて作成することが好ましいが、これに限定されない。２９３細胞を用いた完全長ＤＮＡ導入法を用いる場合、２９３細胞による培養期間は、好ましくは１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４日間以上継続される。また、レンチウイルスベクターに基づいて作成する場合、後述する実施例１３に記載の方法と同様にして作成することができる。

Ｃａｓタンパク質をコードする遺伝子とガイドＲＮＡ発現ユニットの位置関係については適宜選択することができ、例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする遺伝子に対して上流にガイドＲＮＡ発現ユニットを位置させることもできるし、Ｃａｓタンパク質をコードする遺伝子に対して下流にガイドＲＮＡ発現ユニットを位置させることもできる。

Ｃａｓタンパク質としては特に限定されず、様々なものを使用することができ、好ましくはＣａｓ９ヌクレアーゼまたはＣａｓ９ニッカーゼを使用することができる。

本発明のＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡ断片とガイドＲＮＡ発現ユニットを含有する核酸ベクターに含まれるガイドＲＮＡ発現ユニットの個数は、核酸ベクターに含有させ得る範囲であれば特に限定されない。好ましくは、３個、４個、５個、６個、７個、８個以上のガイドＲＮＡ発現ユニットを含ませることができる。前記「ガイドＲＮＡ発現ユニット」の態様の具体例としては、「単一ガイドＲＮＡ発現ユニット」からなる態様、「ｃｒＲＮＡ発現ユニット」及び「ｔｒａｃｒＲＮＡ発現ユニット」からなる態様が挙げられる。また、前記「ｃｒＲＮＡ発現ユニット」及び「ｔｒａｃｒＲＮＡ発現ユニット」からなる態様では、例えば、前記「ｔｒａｃｒＲＮＡ発現ユニット」を２個、前記「ｃｒＲＮＡ発現ユニット」を６個とする態様、前記「ｔｒａｃｒＲＮＡ発現ユニット」を４個、前記「ｃｒＲＮＡ発現ユニット」を４個とする態様、前記「ｔｒａｃｒＲＮＡ発現ユニット」を６個、前記「ｃｒＲＮＡ発現ユニット」を２個とする態様、前記「ｔｒａｃｒＲＮＡ発現ユニット」を４個、前記「ｃｒＲＮＡ発現ユニット」を８個とする態様、前記「ｔｒａｃｒＲＮＡ発現ユニット」を２個、前記「ｃｒＲＮＡ発現ユニット」を２個とする態様などが挙げられる。本発明のＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡ断片とガイドＲＮＡ発現ユニットを含有する核酸ベクターとして、好ましくは組換えアデノウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを用いることができる。

本発明のＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡ断片とガイドＲＮＡ発現ユニットを含有するアデノウイルスベクターは、様々なアデノウイルスベクターに基づいて製造することができる。例えば、本発明の短縮されたバックボーン構造を有するアデノウイルスベクターを用いることで、更に含有するガイドＲＮＡ発現ユニットを増加することができる。

本発明のＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡ断片とガイドＲＮＡ発現ユニットを含有する核酸ベクターは、様々な宿主細胞において製造、増幅することができる。本発明のＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡ断片とガイドＲＮＡ発現ユニットを含有する核酸ベクターは、宿主細胞においてもＣａｓタンパク質のゲノム編集活性を生じ得るため、当該活性の生じにくい培養条件にて培養することが好ましい。また、当該Ｃａｓタンパク質の発現を抑制し得るような条件で培養することも望ましい。一態様において、当該培養細胞にＣａｓタンパク質の発現を抑制するｓｉＲＮＡを発現するベクターを導入することで、本発明の核酸ベクターの製造工程における、Ｃａｓタンパク質の発現を抑制することができる。好ましくは、当該ｓｉＲＮＡはＣａｓタンパク質をコードする遺伝子の複数の異なる領域、例えば、２、３、４、５、６ヶ所以上に対して用いられる。

本発明の核酸ベクターまたはアデノウイルスベクターは、有効量を培養細胞に適用することでゲノム編集実験に用いることができる他、有効量をヒト以外の動物に投与することによるゲノム編集実験または疾患治療、有効量をヒトに投与することによるゲノム編集疾患治療に適用することなどができる。

（治療方法）
本発明において、「投与すること」には、対象への経口投与、局所的接触、坐剤としての投与、静脈内、腹腔内、筋肉内、病巣内、髄腔内、鼻腔内、または皮下の投与が挙げられる。投与は、非経口および経粘膜（例えば、頬側、舌下、口蓋、歯肉、鼻、膣、直腸、または経皮）を含む任意の経路による。非経口投与には、例えば、静脈内、筋肉内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、および頭蓋内が挙げられる。送達の他の様式には、リポソーム製剤の使用、静脈内注入、経皮パッチなどが挙げられるが、それらに限定されない。

本発明において、「有効量」または「十分な量」は、有益な、または所望の結果をもたらすのに十分である作用物質（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡなど）の量を指す。治療的有効量は、処置されている対象および疾患状態、対象の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与の様式などの１つまたは複数に依存して変わり得、それは、当業者により容易に決定することができる。特定の量は、選択された特定の作用物質、標的細胞型、対象における標的細胞の位置、従われるべき投与計画、それが他の作用物質と併用して投与されるかどうか、投与のタイミング、およびそれが運ばれる物理的送達系の１つまたは複数に依存して変わり得る。

本発明において、「薬学的に許容される担体」は、作用物質（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡなど）の細胞、生物体、または対象への投与を助ける物質を意味する。薬学的に許容される担体としては、水、ＮａＣｌ、生理食塩水、乳酸リンゲル液、規定のスクロース、規定のグルコース、結合剤、増量剤、崩壊剤、潤滑剤、コーティング剤、甘味剤、香料および着色剤などが挙げられるが、これらに限定されない。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。

［実施例１］
短縮された新規バックボーンを有するアデノウイルスベクターの製造

市販のＥ１／Ｅ３欠落型Ａｄ５ベクターを元に、Ｅ３領域において、Ａｄ５ベクターの位置づけで、第２７９８２番塩基～第３０８１８番塩基が欠落した組換えアデノウイルスベクターを製造した。

作製方法は以下の通りである。市販のｐＡｘｃｗｉｔ２のアデノウイルスゲノムからＳｐｅＩ（２７０８２）－ＮｄｅＩ（３１０８９）断片をプラズミドにクローン化した。このプラズミドをＡｐａＩ（２７９８４）とＢｇｌＩＩ（３０８１９）で二重切断した後にクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）ポリメラーゼで両端を平滑化し結合することにより、Ｅ３領域から２８３７塩基対が欠落したプラズミドを得た。ｐＡｘｃｗｉｔ２をＳｐｅＩとＮｄｅＩで切断しこの部分が欠落した断片と、ｐＡｘｃｗｉｔ２からプラズミド部分を含むＮｄｅＩ－ＰｍｅＩ（１３２５８）断片、およびＰｍｅＩ－ＳｐｅＩ断片の３者を同時結合することにより、上記のＥ３領域欠落を含みそれ以外のアデノウイルスＤＮＡを保持したプラズミドｐＡｘｃｗ３ｄａｉｔ２を得た。このプラズミドをＮｄｅＩで切断しＥ３欠落領域を含む断片を調製した後、Ｅ４領域にＳｗａＩクローン化部位を持つｐＡｘｃ４ｗｉｔ２（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２０１５，Ｖｏｌ．２２，ｐｐ．４２１－４２９）を同様にＮｄｅＩで切断しＥ３領域を置換することにより、Ｅ３領域に当該の欠落を持ちＥ４にＳｗａＩクローン化部位を持つアデノウイルスベクター作製用プラズミドｐＡｘｃ３ｄａ４ｗを得た。

Ｅ３領域を欠落したアデノウイルスベクターと同じ領域の配列を持つ上述のｐＡｘｃ３ｄａ４ｗの当該部位を市販のｐＡｘｃｗｉｔ２の対応する領域をＰＣＲにより増幅しＥ３領域の欠失を比較確認した（図３）。またこの欠落部分の配列はシークエンスを行い確認した。

当該アデノウイルスベクターは、２９３細胞内で複製可能であることが確認された。

このプラズミドに外来遺伝子発現ユニットを組み込み、アデノウイルスゲノムの両端をＰａｃＩで切断した後に２９３細胞へトランスフェクションすることにより外来遺伝子を発現するアデノウイルスベクターを得ることができた。図９に示すＣａｓ９ニッカーゼ発現ユニットをＥ１領域に、４個のガイドＲＮＡ発現ユニット（単一ガイドＲＮＡ）をＥ４遺伝子上流挿入部位に持つアデノウイルスベクターはその一例である。

［実施例２］
複数のガイドＲＮＡを同時発現するアデノウイルスベクターによるゲノム編集
アデノウイルスゲノムは、約３６ｋｂｐの２本鎖線状ＤＮＡであって、ＤＮＡ鎖両端にはＥ２Ｂ遺伝子産物が切断加工された５５ｋのタンパク質が共有結合しているという特異な構造をしている。複数のガイドＲＮＡを同時に発現するアデノウイルスベクターを作成するために、ラムダファージがｃｏｓ部位を持つ３８ｋｂ～５２ｋｂのＤＮＡ断片だけを取り込む性質を用いて、アデノウイルスゲノムの断片および４個のガイドＲＮＡ発現ユニットをタンデムにつないだコスミドプラズミドを作製し、ベクターゲノムの全長をプラズミドから切り出して２９３細胞へトランスフェクションを行い（完全長ＤＮＡ導入法）、４個のガイドＲＮＡ発現ユニット（単一ガイドＲＮＡ）を含むアデノウイルスベクターを作成した。

当該ガイドＲＮＡは、マウスＨ２－Ａα遺伝子のエクソン１を標的とするものであり、多重ガイドＲＮＡ発現ユニットは、５’－ＧＣＧＧＣＡＴＣＣＴＧＧＴＣＴＣＴＧＧＧ－３’（配列番号１）および５’－ＧＣＡＧＣＡＧＡＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣＴＧ－３’（配列番号２）からなる第１のダブルニッキング用ガイドコーディングＤＮＡ、ならびに５’－ＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＴＧＧＴＧＧＴＣＡ－３’（配列番号３）および５’－ＧＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡＣＡＴＴＧＡ－３’（配列番号４）からなる第２のダブルニッキング用ガイドコーディングＤＮＡ配列を含んでいた（図２）。

各ガイドＲＮＡ発現ユニットは、上記ガイドコーディングＤＮＡ配列以外に、Ｕ６プロモーター（約２６１塩基対）およびガイドＲＮＡの足場部分（標的２０塩基対以外の配列）（約８３塩基対）を含んでいた。

作製した多重ガイドＲＮＡ発現ユニットを持つコスミドを用いて、アデノウイルスベクター（ＡｄＶ）を作製したところ、ガイドＲＮＡ発現ユニットを欠失することなくアデノウイルスベクターを調製することができた（図４）。

このＡｄＶは動物実験が可能な量までスケールアップすることが可能だった。そこで、ＡｄＶをマウスの静脈から投与するとそのほとんどが肝臓に感染することを利用し、４個のガイドＲＮＡを発現するＡｄＶを、Ｃａｓ９またはＣａｓ９ニッカーゼを発現するＡｄＶとともにマウスに接種し、肝臓における標的遺伝子のゲノム編集効率について解析を行った。

その結果、肝臓において高効率で遺伝子破壊が観察され、Ｃａｓ９発現ベクターと組み合せた場合に比べて、Ｃａｓ９ニッカーゼ発現ベクターと組み合せた場合により大きな領域での欠失が観察され、Ｃａｓ９ニッカーゼ発現ベクターを用いることで、より完全な遺伝子破壊が行われたことが示唆された（図５）。また、多重ガイドＲＮＡ発現ＡｄＶにドナーＤＮＡをさらに含有させすることで、当該ドナーＤＮＡを標的部位に遺伝子ノックインすることも可能であることを見出した（図６）。

これらの結果は、多数のガイドＲＮＡを発現するアデノウイルスベクターを用いて、ｉｎ ｖｉｖｏで安全性の高いがん遺伝子破壊実験や遺伝病のゲノム編集治療実験が可能であることを示している。

［実施例３］
８個のガイドＲＮＡを同時発現するアデノウイルスベクターの作成
完全長ＤＮＡ導入法を用いて、ＨＢＶのＸ遺伝子内のＤＲ２領域を標的とした８個のガイドＲＮＡ発現ユニット（単一ガイドＲＮＡ）を含有するアデノウイルスベクターの作成を試みた（図７参照）。使用したガイドコーディングＤＮＡ配列は、配列番号５～１２に示す通りであった。
配列番号５ ＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣＡＣＡＣＧＧＴＣ
配列番号６ ＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣＡＣＡ
配列番号７ ＧＧＴＴＴＣＣＡＴＧＣＧＡＣＧＴＧＣＡＧ
配列番号８ ＧＧＣＡＧＡＴＧＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＡ
配列番号９ ＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣＡＣＡＣＧＧＴＣ
配列番号１０ ＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣＡＣＡ
配列番号１１ ＧＧＴＴＴＣＣＡＴＧＣＧＡＣＧＴＧＣＡＧ
配列番号１２ ＧＡＣＣＴＧＧＴＧＧＧＣＧＴＴＣＡＣＧＧ

細胞内に導入されたＤＮＡは相同組換えを起こすことが知られており、ノックインはその現象を利用して広く行われている。またアデノウイルスゲノムにおいても従来行われていたＣＯＳ－ＴＰＣ法では、発現ユニットを含んだコスミドと、切断した親ウイルスＤＮＡ－末端蛋白複合体（ＤＮＡ－ＴＰＣ）を最終段階で２９３細胞に共形質導入し、コスミドと親ウイルスＤＮＡ－末端蛋白複合体の間の共通配列の間で生じる相同組換えを利用して、目的のＤＮＡ断片を含むウイルスＤＮＡ－末端蛋白複合体をアデノウイルスベクターとして回収している。
したがって、８つのガイドＲＮＡ発現ユニットを含有するアデノウイルスベクターを作成する際には、これらの発現ユニットが共通ＤＮＡ配列を含んでいるために、相同組換えによって発現ユニットの一部が脱落することが予想された。

ところが実験の結果、驚くべきことに８個のガイドＲＮＡ発現ユニットを含有するアデノウイルスベクターを、発現ユニットの欠落なく作成し得ることが見いだされた（図８）。
すなわち、アデノウイルスベクターの作製で一般的に行われている方法では、外来ＤＮＡを込む込んだウイルスゲノムを２９３細胞にトランスフェクションし、そこで生じたベクターウイルスを個々に分離することなく生じたウイルスをプールとして作製している。しかし図８に見られるように一部のユニットが欠失したウイルスが生じるのは免れないため、ウイルスを個々のクローンとして得ることが必要である。具体的には、トランスフェクションした２９３細胞を次の日に培養皿から剥がして希釈し、トランスフェクションしていない多量の２９３細胞と混合して９６穴プレートへまき直す。増殖してきたウイルスによって死滅した２９３細胞が９６穴プレートの３分の１以下の個数であるプレートからのみウイルスを分離した。
この最初のウイルスストックを分離するステップでは、図８に示すようにユニットが欠失したウイルスストックと８ユニットを保っているストックが生ずるが、８ユニットのみのウイルスストックを更に大きいステップで２９３細胞に感染する場合に通常量の３倍の量を感染させることで、ユニットの欠失のない高濃度のウイルスストックが得られた。この感染条件でウイルス増幅を繰り返すことにより、動物実験に十分な量の欠失のないウイルスベクターを得ることができた。

［実施例４］
８個のガイドＲＮＡを同時発現するアデノウイルスベクターによる染色体上のＨＢＶ－Ｘ遺伝子の効率的破壊

ＨＢＶ－Ｘ遺伝子はこのウイルスによる肝がん発症に関与しているとされており、しばしば肝がん細胞においてＸ遺伝子ＤＮＡが組み込まれている。そこで肝がん治療のモデルケースとして、Ｘ遺伝子が染色体に組み込まれているＨｅｐＧ２細胞株Ｇｘ１１（Ｓｈｉｎｔａｎｉ，Ｓａｉｔｏ，Ｋｏｉｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９９９，Ｖｏｌ．８０，ｐｐ．３２５７－３２６５）に対して、実施例３で作製された８個のガイドＲＮＡを同時発現するアデノウイルスベクター（８ガイド発現ベクター）およびＣａｓ９発現アデノウイルスベクターを共感染し、Ｘ遺伝子の破壊を試みた。

当該８ガイド発現ベクターで発現する８個のガイドＲＮＡは、標準株ウイルスゲノムの塩基配列（図９の塩基配列）を元にして作られているが、患者間におけるウイルスゲノム配列の相違のため、Ｇｘ１１細胞染色体に組み込まれているウイルスの配列は、この領域の標的領域の塩基配列において、標準株ウイルスゲノムの塩基配列と３塩基の相違がある（図９の１段目、Ａ→Ｔ、２段目、Ａ→ＧおよびＴ→Ｃ；該当塩基を枠で囲み、その枠の外側にＧｘ１１細胞株における塩基を記載した。）。この８個のガイドＲＮＡの各２０塩基の標的配列はオーバーラップしており、８個のガイドＲＮＡのうち４個のガイドＲＮＡは、これら塩基の相違のため切断することができない（破線矢印）。しかし標準株ウイルスゲノムの塩基配列とＧｘ１１細胞染色体上のウイルスゲノム塩基配列は、残りの４個のガイドＲＮＡの塩基配列においては一致していたため、この領域をそれぞれの標的部位で切断できる（切断位置をｃｕｔ１～ｃｕｔ４で示す）。もしｃｕｔ１からｃｕｔ４までのすべての位置で切断がおきれば、ｃｕｔ１からｃｕｔ４の間の約１２０塩基が欠失することになる。図９の４段目にＸ遺伝子の終止コドンＴＡＡ、およびその上流のＸ遺伝子コード領域を太線で示す。この太線の領域で欠失がおきればＸ遺伝子は機能を失う。４段目右端のＭｓｌＩはＧｘ１１細胞内に組み込まれたウイルスＤＮＡの末端の位置を示す。

８ガイド発現ベクターとＣａｓ９発現ベクターを異なる量で共感染する実験を行った。この領域を含むＰＣＲプライマーによりＰＣＲを行った結果、ウイルス量（ｍｏｉで表す）３において、非感染（ｍｏｉ０）の場合と比較して明らかに本来のサイズ（０．５３ｋｂ）のバンドの減少が見られ、ｍｏｉ１０ではほぼ完全に消失し、１１０塩基の欠失で見られる０．４２ｋｂのバンドに移行した（図１０参照）。この結果は、８ガイド発現ベクターとＣａｓ９発現ベクターによる染色体上Ｘ遺伝子の破壊が高い効率で行われたことを示す。ＰＣＲに用いたプライマーの配列は、配列番号１３、１４に示す通りであった。
フォワードプライマー：
配列番号１３ ＡＡＣＴＧＧＡＴＣＣＴＧＣＧＣＧＧＧＡＣＧＴＣＣＴＴＴＧＴＣ

リバースプライマー：
配列番号１４ ＧＡＡＡＡＡＧＡＴＣＴＣＡＧＴＧＧＴＡＴＴＴＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧ

［実施例５］
４ヶ所のダブルニッキング切断を行う８ガイド発現ベクターによる複製中のＨＢＶゲノムの切断破壊
ＨＢＶは複製のプロセス中に環状２本鎖ＤＮＡゲノム（ｃｃｃ）の形態をとる。複製増幅中のＨＢＶ ｃｃｃゲノムを４ヶ所でダブルニッキング切断を行う８ガイドＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡ）発現ベクターを作製した。およその切断部位を図１１の左側に示す。ＤＮはダブルニッキングを意味する。使用したガイドコーディングＤＮＡ配列は、配列番号１５～２２であった。
ＤＮ１部位：
配列番号１５ ＧＡＣＣＴＧＧＴＧＧＧＣＧＴＴＣＡＣＧＧ
配列番号１６ ＧＴＣＴＴＡＴＡＴＡＡＧＡＧＧＡＣＴＣＴ
ＤＮ２部位：
配列番号１７ ＧＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＧＡＴＧＡＴＴ
配列番号１８ ＧＣＴＧＴＧＣＣＴＴＧＧＧＴＧＧＣＴＴＴ
ＤＮ３部位：
配列番号１９ ＧＡＴＴＧＡＧＡＣＣＴＴＣＧＴＣＴＧＣＧ
配列番号２０ ＧＴＣＧＣＡＧＡＡＧＡＴＣＴＣＡＡＴＣＴ
ＤＮ４部位：
配列番号２１ ＧＡＴＡＴＧＧＧＴＧＡＧＧＣＡＧＴＡＧＴ
配列番号２２ ＧＴＣＡＡＴＣＴＴＣＴＣＧＡＧＧＡＣＴＧ

複製中のＨＢＶ ｃｃｃゲノムが４ヶ所のダブルニッキング切断を受けると、完全切断の場合４つのＤＮＡ断片となる。それぞれの断片は細胞内の修復機構により両端が結合して環状化する（図１１中央、点線で最大断片の結合部位を示す）。それぞれの環状ＤＮＡはＨＢＶゲノムの大半が欠失しており、ＤＮＡ複製することができない。その中で最大環状ＤＮＡ（図１１、右側）をＰＣＲにより検出した。この場合、複製ＨＢＶゲノム生成アデノウイルスベクターにより生じたばかりでまだ切断を受けていない複製中の全長環状ＤＮＡゲノム（図１１、左端）も同時に検出される。ＰＣＲプライマーの配列は、配列番号２３および２４であった。

フォワードプライマー：
配列番号２３ ＴＴＡＡＣＴＴＣＡＴＧＧＧＡＴＡＴＧＴＡＡＴＴＧＧ

リバースプライマー：
配列番号２４ ＡＣＴＣＡＡＧＡＴＧＴＴＧＴＡＣＡＧＡＣＴＴＧＧＣ

ＨＢＶ複製ゲノムを得るために、ＨＢＶのＳ遺伝子の一部を欠失する、複製ＨＢＶゲノム生成アデノウイルスベクターＡｘ－ＣＭ１０３Ｇ－ΔｐｒｅＳ（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｓａｉｔｏ， ｅｔ． ａｌ．，２０１７，Ｖｏｌ．７，ｐｐ．４１８５１）をＨｅｐＧ２細胞へｍｏｉ３で感染し、環状ＨＢＶゲノムが複製している３日後（ｄａｙ０）に、４ヶ所でダブルニッキング切断を行う８ガイド発現ベクターとＣａｓ９ニッカーゼ（ＮＣ９）あるいは本来のＣａｓ９を発現するアデノウイルスベクターをそれぞれｍｏｉ７で共感染させた。そして共感染後３日目、および７日目で細胞全ＤＮＡを抽出し、図１１右端で示したプライマーを用いて環状ＤＮＡを検出した。

図１２における「ｃｏｎｔ」はインサートをＤＮＡ持たないいわゆる空ベクターを感染したコントロールであり、複製ＨＢＶゲノム生成アデノウイルスベクターにより生成したＨＢＶゲノムが複製した（２．８ｋｂ、全レーンに共通（図１２））。一方、４ヶ所でダブルニッキング切断を行う８ガイド発現ベクターとＣａｓ９ニッカーゼ発現ベクターの共感染を行った場合は、その感染後７日目において、複製ＨＢＶゲノム生成ベクターから生ずる未切断のＨＢＶゲノム（２．８ｋｂ）の量は、ＨＢＶゲノムが自由に複製するコントロールにくらべて約５分の１に減少していた（図１２、マーカー（ｍ）のレーンを除いた左から４番目と５番目のレーン、ｄａｙ７のｃｏｎｔとＮＣ９で２．８ｋｂのバンドの濃さを比較）。一方、ダブルニッキング切断によりＨＢＶゲノムの大部分を失った欠失環状ＤＮＡ（１．４ｋｂ、図１１の右端）が出現し、その量は複製中の２．８ｋｂＨＢＶゲノムの量よりはるかに多かった。また＊印のバンドはコントロールでも見られることから非特異的に生じるバンドである。この実験系ではＨＢＶゲノムは、複製ＨＢＶゲノム生成アデノウイルスベクターから常に供給され続けているため２．８ｋｂのバンドがなくなることはないこと、不完全切断で生じるバンドがほとんど検出されないことを考えると、４ヶ所のダブルニッキング切断を行うアデノウイルスベクターでの切断効率は非常に高いと考えられた。

Ｃａｓ９ニッカーゼ発現ベクターの代わりに本来のＣａｓ９発現ベクターを共感染させた実験も同時に行った。この場合は、本来のＣａｓ９により４組８ヶ所の同時切断が行われるが、その切断効率は４ヶ所ダブルニッキング切断を行った場合より低かった（マーカー（ｍ）のレーンを除いた左から５番目と６番目のレーン、ｄａｙ７のＮＣ９とＣａｓ９を比較）。この結果は本来のＣａｓ９の切断の末端は平滑端であり容易に再結合し元の構造に戻るのに対し、ダブルニッキング切断の末端は数十塩基の１本鎖ＤＮＡが生じる結果、修復されにくいためと考えられる。
またその修復時には数十塩基の欠失が起こる結果、本来のＣａｓ９では予想される１．５ｋｂの欠失ＤＮＡが検出されるのに対し、ダブルニッキングではそれより短い１．４ｋｂのバンドが検出されることが説明できる。以上の結果により、４ヶ所のダブルニッキング切断を起こす８ガイド発現アデノウイルスベクターは、高い切断効率と安全性を兼ね備えている可能性が示唆された。

［実施例６］
１２個のガイドＲＮＡを同時発現するアデノウイルスベクターの作成
８個のガイドＲＮＡ発現ユニットを含有するアデノウイルスベクターの作成（図７参照）と同じ方法で、１２個のガイドＲＮＡ発現ユニット（単一ガイドＲＮＡ）を含有するアデノウイルスベクターの作成を試みた。使用したガイドコーディングＤＮＡ配列は、上記した配列番号５～１２に示す８個と、Ｘ遺伝子終止コドン近傍及びその下流にある以下の配列番号３９～４２に示す４個であった。
配列番号３９ ＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＣＡ
配列番号４０ ＧＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＧＡＴＧＡＴＴ
配列番号４１ ＧＣＴＧＴＧＣＣＴＴＧＧＧＴＧＧＣＴＴＴ
配列番号４２ ＧＡＡＧＣＴＣＣＡＡＡＴＴＣＴＴＴＡＴＡ

図７に示す８個のガイドＲＮＡ発現ユニットを含有するアデノウイルスベクターの作成に用いたコスミドは、その８個のガイドＲＮＡ発現ユニットの左端に、他に切断配列のないＳｇｒＤＩクローン化部位を持っていた。そこでこの部位に上記した配列番号３９～４２に示すガイドコーディングＤＮＡ配列を有する４個のガイドＲＮＡ発現ユニットを挿入し、得られたコスミドを用いて１２個のガイドＲＮＡ発現ユニットを含有するアデノウイルスベクターを検討した。

分離した６個の独立したアデノウイルスベクタークローンを調べた結果、図１３の左側の図に示すように、５個のクローンでは１２個のユニットのいくつかが欠失して生じたと見られるウイルスゲノムによる断片（＊印で示す）が見られた。しかし１個のクローン（クローン６、レーンを囲みで示す）ではこの欠失を示すバンドがほとんど見られなかったこと、１２個のユニットを持つ５．５ｋｂの断片の量は近接した５ｋｂ弱のベクターバックボーンに由来するバンド（５ｋｂ弱の２個の近接したＡで示す）の量よりやや少ない程度であったため、このウイルス調製ストックはユニットを欠失したベクターの混入がほとんどなくその大部分が１２個のユニットを欠失なく保持したベクターであると考えられた。すなわち１２個のガイドＲＮＡ発現ユニットを持つアデノウイルスベクターの作成では８個の場合と異なり、ほとんどのクローン調製では欠失をもつベクターの混入が明らかに認められたが、驚くべきことに１２個ものガイドＲＮＡ発現ユニットを持つアデノウイルスベクターの作成において欠失をもつベクターの混入が非常に少ないウイルス調製ストックを得ることが可能であった。

当該ウイルスストックは初代のウイルスストックを１回継代してベクターを増幅させた２代継代ストックである。さらに継代による増幅を行い、３代継代ストック、４代継代ストックで１２個のガイドＲＮＡ発現ユニットは安定に保たれているかを検討した。その結果を図１３の右側の図に示す。その結果、４代継代ストックに置いても１２個のユニットを持つ５．５ｋｂの断片は明らかなバンドとして認められ、その量は近接した５ｋｂ弱のベクターバックボーンに由来するバンドの１／２から１／３程度であると考えられた。本実験では６クローンを調べただけであり、さらに多くのクローンを調べれば、より欠失ベクターの混入が少ないストックを得ることが可能であろうと考えられた。

［実施例７］
１２個のガイドＲＮＡを同時発現するアデノウイルスベクターによる染色体上のＨＢＶ－Ｘ遺伝子の効率的破壊

４代あるいは５代継代ストックは一般的に通常の培養細胞を用いた実験に使われる。このベクターストックを図９および図１０で示した８個のガイド発現ユニットをも持つベクター用いたものと同じ細胞に同じ実験条件で感染させ、染色体ＤＮＡに組みこまれているＸ遺伝子を対象として、このベクターから発現する１２個のガイドＲＮＡの全てが機能しているかを検討した。新たに加えられた４個のガイドＲＮＡは図１４の最下段に示すｃｕｔ５の配列、およびＸ遺伝子から染色体上に組み込まれたＤＮＡ末端のＭｓｌＩ部位までの配列の２つの配列を標的とする（他の２個のガイドＲＮＡの標的配列はＸ遺伝子の外にあり、この細胞の染色体上には存在しない）。ＭｓｌＩ部位までの標的配列はその５’端の１塩基が異なっているため、８ガイドＲＮＡ発現ユニットで標的配列が１塩基異なる場合と同様に切断を起こさないと考えられた。

１２個のガイドＲＮＡ発現ユニットを持つアデノウイルスベクターを用いた上記の感染実験の結果を図１５に示す。８個のガイドＲＮＡ発現ユニットを持つアデノウイルスベクターを用いた実験結果（図１０）と同様に、ｃｕｔ１からｃｕｔ４までの欠失を示す０．４２ｋｂのバンドは予想通り確認された。さらに新たに加えた４個のガイド発現ユニットで予想されるｃｕｔ５の切断からｃｕｔ１の切断までの欠失を示す０．３０ｋｂのバンドが明らかに見られた。また未切断から生ずる０．５４ｋｂのバンド、上記の０．４２ｋｂおよび０．３０ｋｂのバンドの中間にある複数のバンドの位置は、これらのｃｕｔ１、ｃｕｔ４およびｃｕｔ５以外のｃｕｔ２、ｃｕｔ３がこれらと同時に切断された時に生ずるバンドの位置とほぼ一致していた。以上のことから、１２個ものガイドＲＮＡ発現ユニットを持つアデノウイルスベクターで切断を起こすことが予想されるガイドＲＮＡはすべて機能していたことが示された。

［実施例８］
Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡ断片とガイドＲＮＡ発現ユニットを含有する一体型アデノウイルスベクターの作成
完全長ＤＮＡ導入法を用いて、Ｃａｓ９タンパク質をコードするＤＮＡ断片と４個のガイドＲＮＡ発現ユニット（単一ガイドＲＮＡ）を含有するアデノウイルスベクターの作成を試みた。使用したガイドコーディングＤＮＡ配列は、配列番号１～４と同一であった。Ｃａｓ９タンパク質をコードするＤＮＡ断片が、４個のガイドＲＮＡ発現ユニットの上流に位置するように構成されたアデノウイルスベクター（ｉｎｗａｒｄ）と、Ｃａｓ９タンパク質をコードするＤＮＡ断片が、４個のガイドＲＮＡ発現ユニットの下流に位置する（ｏｕｔｗａｒｄ）ように構成されたアデノウイルスベクターの二種類を取得した。図１６の上段にはアデノウイルスベクターのゲノム構造を示し、右側の四角形は４個のガイドＲＮＡ発現ユニットを、また中央下の三角形はＥ３領域の欠失を示す。

通常、完全長ＤＮＡ導入法を用いたアデノウイルスベクターの作製では、最終段階のコスミド及び親アデノウイルスベクターを共形質導入した２９３細胞の組換え培養において、形質導入後１０日間培養した後に目的の組換えアデノウイルスベクターを取得する。

今回、当該培養期間を２０～２４日継続することで、初めて目的の組換えアデノウイルスベクターを取得することが可能となった。一般に２９３細胞を２０～２４日間継続培養することは困難であり、また、Ｃａｓ９タンパク質をコードするＤＮＡ断片のみを含有するアデノウイルスベクターを製造することも単純なプロセスではないことに鑑みれば、上記Ｃａｓ９タンパク質をコードするＤＮＡ断片と４個のガイドＲＮＡ発現ユニットを含有するアデノウイルスベクターを取得できたことは驚くべき結果である。

また、上述のとおり、ガイドＲＮＡ発現ユニットは共通ＤＮＡ配列を有しており、２０～２４日間もの長期間培養後に、４個のガイドＲＮＡ発現ユニットを維持されていたことも予想外の結果であり、その理由は不明である。

［実施例９］
４個のガイドＲＮＡによるダブルニッキング２ヶ所切断を行う一体型アデノウイルスベクターを用いたマウスＨ２Ａａ遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ破壊
ノックアウトする標的遺伝子であるマウスＨ２Ａａ遺伝子のエクソン１の配列を図１７に示す。エクソン１は５’キャップ部位および開始コドンを含み、その下流に設定した２組のダブルニッキング切断（ＤＮ切断）を行う４個のガイドＲＮＡ標的配列（１～４）の位置を示している。ガイドコーディング標的配列は既に記した配列番号１～４である。またＰＣＲ増幅に用いたプライマー配列を以下に示す。

フォワードプライマー（Ｆ－ｐｒｉｍｅｒ）
配列番号２５ ＴＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＴＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡＡＣＴＴＴＧＡＣＧ

リバースプライマー（Ｒ－ｐｒｉｍｅｒ）
配列番号２６ ＡＡＡＧＡＡＴＴＣＴＡＣＡＣＴＡＣＡＧＧＴＡＣＡＡＡＧＧＧＣＴＴＣＡＧ

上記で作製された、マウスＨ２Ａａ遺伝子を標的とする４個のガイドＲＮＡ発現ユニット（単一ガイドＲＮＡ）とＣａｓ９ニッカーゼ発現ユニットを併せ持つ一体型アデノウイルスベクターを精製し、新生仔マウスに静注することにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおける遺伝子破壊効率および４個のガイドが機能しているかについてＴ７Ｅ１アッセイ法により検討した（図１８）。

その結果、ベクター投与後７日目において、無修飾のゲノム断片を示す０．５６ｋｂのバンドに加えて、コントロール（ベクター無投与、マーカーのレーンを除く左から２番目のレーン（Ｃｏｎｔｒｏｌの＋））では観察されない、ＤＮ領域が酵素により除去されて生じた約０．３３ｋｂおよび０．１６ｋｂのバンドが、４匹のマウス（４ｇ ｏｕｔ－ｍ１、４ｇ ｏｕｔ－ｍ２、４ｇ ｉｎ－ｍ３、４ｇ ｉｎ－ｍ４）全てにおいて観察された。また、ベクター投与後１５日目でも、同様のシグナルが観察された（下段）。一般的に行われているＣａｓ９酵素と１個のガイドＲＮＡによるゲノムＤＮＡ切断では、切断されたゲノムＤＮＡは末端結合（ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ）修復とＣａｓ９切断を繰り返すうちに微小挿入欠失を生じ、標的２０塩基配列と異なる配列となるため反応が停止する。Ｔ７Ｅ１アッセイは２本鎖ＤＮＡであるＰＣＲ断片を熱変性し対合させることにより生じた１本鎖ＤＮＡと２本鎖ＤＮＡの分岐部を切断し２本のバンドを生じるため、この２本のバンドのサイズは未切断の断片のサイズと微小しか違わない。しかしＣａｓ９ニッカーゼによるダブルニッキングは１ヶ所の切断で標的ＤＮＡ部位に数十塩基のランダムな長さの欠失を引き起こすことが発明者の実験から明らかにされている。その結果として生ずるＤＮＡ断片は、上流端から約１６０塩基下流のガイド１とガイド２によるランダムなＤＮ切断の周辺まで、およびガイド３とガイド４によるランダムなＤＮ切断周辺から約３３０塩基下流の下流端までの幅広いバンドになると考えられる。すなわち二つのＤＮ切断の間のＤＮＡが欠失除去される結果、この２つのバンドサイズの差は除去される領域のサイズを示していると考えられる。本実験では予想された０．３３ｋｂおよび０．１６ｋｂのバンドが認められたことから、二つのＤＮ切断間の約７０塩基が欠失していること、従って４個のすべてのガイドＲＮＡが同時に機能していることが示された。８匹全てのマウスのレーンについて、欠失効率は１７％および１９％であった。これらの結果から４ガイド発現一体型ベクターによりダブルニッキング切断が起こったと考えられた。

［実施例１０］
８個のガイドＲＮＡ発現ユニットとＣａｓ９ニッカーゼ発現ユニットを持つ一体型アデノウイルスベクターの作製
アデノウイルスゲノムがウイルス粒子にパッケージされる上限のサイズは３８．０ｋｂであり、Ｅ３領域を短縮したベクターゲノムのサイズは３０．２ｋｂであった。従って組み込める外来ＤＮＡは最長で約７．８ｋｂである。またＣａｓ９ニッカーゼの発現ユニットは５．３ｋｂあるため、多重ガイド発現ユニットに使える長さは２．５ｋｂまでである。一方、１個の通常のガイド発現ユニットのサイズは約０．４ｋｂであるから、８個のユニットの長さは３．２ｋｂであり、２．５ｋｂをはるかに超えるため、通常の発現ユニットでは作製することは不可能である。

そこで発現ユニットの中にあるＵ６プロモーターの短縮を試みた。図１９はガイドＲＮＡ発現ユニットの構造を示す。Ｕ６プロモーターは２つの必須エレメント（ＤＳＥおよびＰＳＥ）を持ち，その中間の領域は欠失しても活性を保持することが基礎研究において知られている（例：Ｓｔｕｎｌｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．，１９９７，ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．８，ｐｐ．４３９７－４４０５）。しかしＵ６プロモーターの大きさは通常の目的には十分に小さいため、中間領域の欠失したＵ６プロモーターは応用研究ではほとんど使われていない。通常のＵ６プロモーターをもつプラズミドに、下記および図１９に示すＰＣＲプライマーを用いて、このＤＳＥおよびＰＳＥエレメントの中間部分の１３５塩基を含まず、これ以外のプラズミド部分全体を持つ断片を調製した。次いでこの断片をＢｓｒＧＩで切断し、さらにＫｌｅｎｏｗ酵素により平滑化した後セルフライゲーションすることにより、結合端がＳｎａＢＩ配列（ＴＧＴＡＣＧＴＡＣＡ）となる短縮Ｕ６プロモーターを持つプラズミドを得た。図１９では欠失させた部分を白抜きの矢印で示した囲みで示す。またＵ６プロモーターの３’端６塩基（－６から－１の位置）をＢａｍＨＩ認識配列とした。用いたプライマーの塩基配列を下記に示す。

ＤＳＥ配列を含むリバースプライマー
配列番号２７ ＧＣＧＴＧＴＡＣＡＧＴＡＴＡＴＧＣＡＡＡＴＡＴＧＡＡＧＧＡＡＴＣＡＴＧＧＧ

ＰＳＥ配列を一部含むフォワードプライマー
配列番号２８ ＧＣＧＴＧＴＡＣＡＡＡＡＴＧＧＡＣＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＴＴＡＣＣＧＴＡＡＣ

この結果各ガイドＲＮＡ発現ユニットのサイズは０．４ｋｂから約０．２８ｋｂに短縮され、８ガイド発現ユニットの長さは約２．３ｋｂとなり、ベクターに組み込める上限サイズの２．５ｋｂをわずかに下回ったため、８個のガイドＲＮＡ発現ユニットを持つ一体型ベクターが作製できる可能性が得られた。

ノックアウトする標的遺伝子であるマウスＮＴＣＰ遺伝子のエクソン２の配列を図２０に示す。エクソン２は開始コドンを含み、その下流に４組のダブルニッキング切断（ＤＮ切断）を行う８個のガイドＲＮＡ標的配列（１～８）を設定した。本実験では４ヶ所のダブルニッキング切断を１つのエクソン内に近接して設定しているが、２つの遺伝子の２ヶ所切断による破壊、あるいは４つの異なる遺伝子の同時破壊を行うように設定することも可能である。この標的配列をもつ８ガイドＲＮＡ発現ユニット作製に用いた標的２０塩基の配列を以下に示す。
配列番号２９ ＧＣＧＧＣＡＧＧＧＡＧＡＡＡＴＴＧＡＡＧ
配列番号３０ ＧＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＴＴＧＧＣＣＡＣＣ
配列番号３１ ＧＡＴＧＡＡＡＧＡＣＣＴＴＧＣＣＣＡＧＡ
配列番号３２ ＧＣＴＣＴＧＧＣＣＡＴＣＣＴＣＡＴＣＴＧ
配列番号３３ ＧＡＴＡＣＣＧＴＡＣＴＧＧＧＣＣＡＣＴＡ
配列番号３４ ＧＣＣＣＣＴＣＡＧＴＧＣＴＴＴＣＣＴＴＣ
配列番号３５ ＧＡＧＧＴＴＣＡＴＧＴＣＣＣＣＣＴＴＣＡ
配列番号３６ ＧＧＡＣＣＧＡＧＧＧＴＴＡＡＧＡＧＧＡＡ

上記短縮Ｕ６プロモーターを持つ８個のガイドＲＮＡ発現ユニットおよびＣａｓ９ニッカーゼ発現ユニットを持つ一体型アデノウイルスベクター（図２１上段）の作製を行った。２９３細胞へベクターゲノム全長ＤＮＡをトランスフェクションしウイルスベクターを得たが、ウイルスが増殖してクローンが得られるまでの期間は通常２週間であるのに対し、４ガイド発現一体型ベクターと同様にやはり３週間を要した。しかし４ガイド一体型ではすべてのクローンが欠失なく４ガイドユニットを保持していたのに対し、８ガイド一体型では６クローンのほとんどのクローンでユニットの欠失が見られたが（図２１下段の左）、欠失なく増幅していたクローンを得ることができた〔Ｎｏ．６；３．０ｋｂのバンドが８ガイド発現ユニットを含む。このクローン以外では＊で示す欠失ユニットを含むバンドが見られる）。このウイルスクローンを継代することにより動物実験が可能な量の精製ウイルスを調製したところ、大部分のウイルスＤＮＡは８個のユニットを保持しており（図２１下段の右；３．０ｋｂのバンド）、８ガイドＲＮＡ同時発現実験が可能であることが示唆された。現在までに３種類の８ガイドＲＮＡ発現一体型ベクターの作製に成功したが、ほぼ同様な結果であった。

［実施例１１］
ダブルニッキング法による４ヶ所同時切断を行う一体型アデノウイルスベクターを用いたマウスＮＴＣＰ遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける破壊
４ヶ所のダブルニッキング切断を行うよう設計された一体型アデノウイルスベクターによる標的遺伝子の破壊を検討した。アデノウイルスはヒトに感染するウイルスであり、図９に示すようにヒト由来の培養細胞株（ＨｅｐＧ２）の染色体上にあるＨＢＶ遺伝子の破壊効率は約９０％であった。しかし今回の標的はマウス遺伝子であるためマウス培養細胞での実験が必要であるが、マウス細胞へのアデノウイルスベクターの導入効率はヒト細胞にくらべて約１００分の１以下であり、実験が難しい。しかしながらこのベクターをマウス初代繊維芽細胞（ＭＥＦ細胞）に図９の実験の３０倍量のベクターを感染させることにより、５６％の遺伝子の欠失破壊効率が得られた（図２２左）。また約１５０塩基の欠失が見られたことから、ガイドＲＮＡ１、２とガイドＲＮＡ３、４の同時切断による欠失、あるいはガイドＲＮＡ３、４とガイドＲＮＡ７、８の同時切断による欠失が効率よく行われていることが示唆された（図２０参照）。１つの欠失は４個のガイドＲＮＡが同時に機能してニックをいれたことを示すものであるから、複数のダブルニッキング切断による１つの欠失が示されたことは、効率のよい安全な遺伝子の破壊が可能であることを示唆していると考えられる。またウイルス感染量（ｍｏｉ）１００および３００のレーンに置いてＰＣＲ断片全長の６．５ｋｂのバンドの直下に数十塩基短いＤＮＡ領域を認めたが（＊印で示す）、ダブルニッキングによる１ヶ所の切断は数十塩基の欠失を引き起こすことが発明者の実験から明らかにされており、この領域は複数ヶ所の同時切断による大きな欠失のみならず、４ヶ所あるいはいくつかの個々の切断部位において短い欠失による遺伝子破壊が行われたことを示唆するものである。
さらにウイルス感染量１００および３００において、０．５ｋｂの位置にスメアの領域が観察されたが、このスメアの領域は長時間露光の同じ電気泳動ゲルの写真において、感染ウイルス量の増加に伴い濃くなることが示された（図２２右の０．５）。また感染量１００および３００において０．３ｋｂの領域を認めた。本ＰＣＲでは欠失がない場合は０．６５ｋｂのバンドを生ずるが、０．５ｋｂおよび０．３ｋｂの領域はそれぞれ約１５０塩基および３５０塩基の欠失により生じたと考えられる。この長さは予想された（図２０の３つの点線で示す）ガイド１と２およびガイド３と４の間の欠失、あるいはガイド３と４およびガイド７と８の間の欠失、そしてガイド１と２およびガイド７と８の間の欠失の長さと一致した。すなわち８個のガイドのほとんどが同時に機能して欠失を引き起こしたと考えられた。以上の結果から、４ヶ所のダブルニッキング切断を行う８ガイドユニット搭載一体型アデノウイルスベクターにより、感染効率が低いマウス細胞においても複数の部位の同時切断が可能性あることが示された。

［実施例１２］
８個のガイドＲＮＡによるダブルニッキング４ヶ所切断を行う一体型アデノウイルスベクターを用いたマウスＮＴＣＰ遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏにおける破壊
上記８個のガイドＲＮＡによるダブルニッキング４ヶ所切断を行う一体型アデノウイルスベクターを新生仔マウスへ静注し、マウスＮＴＣＰ遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏにおける破壊実験を行なった。その結果を図２３に示す。１５日目（ｄａｙ１５）において２番（８ｇ ｍ２）、３番（８ｇ ｍ３）、４番（８ｇ ｍ４）のマウスとも１．０５ｋｂおよび０．８５ｋｂのバンドが認められた。この結果から８個のガイドＲＮＡは多くのガイドＲＮＡが機能して欠失を引き起こしたと考えられた。用いたプライマーの塩基配列を以下に示す。

プライマーｍＮＴＣＰｉｎｔ１－ＢｂｓＩ
配列番号３７
ＧＴＣＡＴＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＴＣＴＣＣＴＧＡＡＧＡＣＡＧＣ

プライマーｍＮＴＣＰｉｎｔ２－ＡｌｗＩ
配列番号３８
ＣＣＴＴＴＡＣＡＧＴＧＡＴＣＣＴＧＴＡＧＡＧＡＣＴＴＣＴＧＧ

［実施例１３］
４ヶ所のダブルニッキング切断を行う８個のガイドＲＮＡ発現ユニット（単一ガイドＲＮＡ）を有するレンチウイルスベクターの作成
目的遺伝子を発現させるためのＥＦ１αプロモーターを持ち、かつピューロマイシン（Ｐｕｒ）を発現するレンチウイルスベクター ｐＬＶＳＩＮ－ＥＦ１αＰｕｒ（タカラバイオ社）をＥｃｏＲＩとＳｂｆＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により平滑化して結合することにより、ＥＦ１αプロモーター領域を欠失させたプラズミド ｐＬＶＳＩＮｗＰｕｒを得た。これをＳｇｒＤＩで切断しＫｌｅｎｏｗ酵素で平滑化した末端とＮｈｅＩ末端を持つレンチウイルスベクター断片を、ｃｈａｒｏｍｉｄ９－３６（Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９６， ｖｏｌ． ８３， ｐｐ． ８６６４－８６６８）のＳｍａＩとＸｂａＩの間にクローン化して、コスミド ｃｈＬＶｐｕｒ－ｗを得た。このコスミドをＢｓｔＸＩで切断しＫｌｅｎｏｗ酵素処理後環状化して、ＢｓｔＸＩ部位を持たない４０．１ｋｂのコスミドカセットｃｈＬＶｐｕｒｋｘ－ｗを得た。このコスミドは多重ガイドＲＮＡ発現ユニット断片をレンチウイルスベクターのＳｗａＩクローン化部位に組み込むことにより、８ガイドＲＮＡ発現ユニットを持つアデノウイルスベクター作製用コスミドと同様に、ラムダファージのｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングを用いて、多重ガイドＲＮＡ発現ユニット断片を欠失させることなく大腸菌内で増幅させることができる。

下記に記載した、Ｘ遺伝子を標的として４ヶ所のダブルニッキング切断を行う、８個のガイドＲＮＡにおけるガイドコーディングＤＮＡ配列を含む８個のガイドＲＮＡ発現ユニットを含む断片を調製し、ｃｈＬＶｐｕｒｋｘ－ｗのＳｗａＩ部位に組込んだ４３．２ｋｂのコスミドｃｈＬＶｐｕｒｋ－ｇ８ＤＮＨＢｘＫＫを得た。このコスミドは約３０ｋｂの不要なスペーサー配列を持つためトランスフェクションでレンチウイルスベクターを得るには不向きである。そこでスペーサー配列を切断するＰｈｓＡＩでスペーサーを除去し、得られた８重ガイドＲＮＡ発現ユニットを持ちレンチウイルスベクターを含む１４．４ｋｂの断片が３個連結した４３．２ｋｂの三角形コスミドをＮａｋａｎｉｓｈｉらの方法で作製した（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．， ２０１９， ｅ３１１５）。このコスミドは多重ガイドＲＮＡ発現ユニットを欠失させることなく大腸菌で増幅させることができる。このＤＮＡをＡｐａＩで切断し直鎖状にしてから２９３Ｔ細胞にトランスフェクションして、レンチウイルスベクター ＬＶｐｕｒ－ｇ８ＤＮＨＢｘＫＫを得た。

図２４にＸ遺伝子上のガイドＲＮＡ標的配列の位置を示す。またダブルニッキングに用いた８個のガイドＲＮＡにおけるガイドコーディングＤＮＡ配列を以下に示す。
配列番号４３ ＡＧＡＣＡＡＡＧＧＡＣＧＴＣＣＣＧＣＧＣ
配列番号４４ ＧＡＣＣＣＧＴＣＴＣＧＧＧＧＣＣＧＴＴＴ
配列番号４５ ＧＣＣＧＧＡＡＣＧＧＣＡＧＡＴＧＡＡＧＡ
配列番号４６ ＧＧＧＧＣＧＣＡＣＣＴＣＴＣＴＴＴＡＣＧ
配列番号４７ ＧＧＴＣＴＣＣＡＴＧＣＧＡＣＧＴＧＣＡＧ
配列番号４８ ＧＡＣＣＡＣＣＧＴＧＡＡＣＧＣＣＣＡＣＣ
配列番号４９ ＧＴＣＣＴＣＴＴＡＴＧＴＡＡＧＡＣＣＴＴ
配列番号５０ ＧＡＴＧＴＣＡＡＣＧＡＣＣＧＡＣＣＴＴＧ

また欠失を検討するＰＣＲのフォワードプライマーは、Ｘ遺伝子の上流でこのＸ遺伝子発現ユニットの染色体導入に用いたネオ遺伝子内にある以下の配列番号５１に示すものを用いた。
フォワードプライマー：
配列番号５１ ＡＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＧＡＴＣＡＡＡＴＣＣＧＡＡＣＧＣ
なお、リバースプライマーは実施例４においてＸ遺伝子を増幅したときに用いた配列番号１４のプライマーを用いた。
この２つのプライマーにより４通りのダブニッキング切断を行うためのＸ遺伝子を含む０．６６ｋｂの断片が生成される。しかし配列番号４３でＵ６プロモーターにより生成するガイドＲＮＡ（図２４における「１」のガイドＲＮＡ）の５’端はＡであり、Ｕ６プロモーターから生成するＲＮＡの５’端はＧが至適であるため、このガイドＲＮＡの産生量は少ないと予想された。その結果このガイドＲＮＡを片方にもつダブルニッキングの切断効率は低いことが予想された。

細胞染色体ＤＮＡに組込まれたレンチウイルスベクターは８個のガイドＲＮＡを発現し、そこにアデノウイルスベクターによりＣａｓ９、またはＣａｓ９ニッカーゼが供給されると、染色体上のＸ遺伝子ＤＮＡ上の標的配列を認識し、８ヶ所の切断（Ｃａｓ９）、または４ヶ所のダブルニッキング切断（Ｃａｓ９ニッカーゼ）を起こすと考えられた（図２４）。当該レンチウイルスベクターを含む２９３Ｔ細胞の培養上清を、Ｘ遺伝子を染色体上に持つＧＸ１１細胞に感染させ、６日後にＣａｓ９、若しくはＣａｓ９ニッカーゼを発現するアデノウイルスベクター（Ｃａｓ９またはＮＣ９と表記）または発現ユニットを持たないコントロールベクター（１ｗ１と表記）をｍｏｉ５で感染させた。実験結果を図２５に示す。

図２５は、Ｃａｓ９、若しくはＣａｓ９ニッカーゼを発現するアデノウイルスベクター（Ｃａｓ９またはＮＣ９と表記）または発現ユニットを持たないコントロールベクター（１ｗ１と表記）を感染させた６日後の結果を示す図である。ＨＢＶのＸ遺伝子および８ガイドＲＮＡ発現ユニットを持つレンチウイルスベクターを染色体上に持つ当該細胞にＣａｓ９発現アデノウイルスベクターを感染させた場合（レーンにＣａｓ９と記載）ではＰＣＲで得られた０．６６ｋｂの全長断片が複数ヶ所切断されて生じたバンドが検出された。そのサイズから、０．５８ｋｂのバンドは「１」のガイドＲＮＡと「３」のガイドＲＮＡ、または「５」のガイドＲＮＡと「８」のガイドＲＮＡとの同時切断により生成したと考えられた。同様に０．４８ｋｂのバンドは「１」のガイドＲＮＡと「５」のガイドＲＮＡ、または「３」のガイドＲＮＡと「８」のガイドＲＮＡとの同時切断、０．３８ｋｂのバンドは「１」のガイドＲＮＡと「８」のガイドＲＮＡとの同時切断により生じたと考えられた。従って８個のガイドＲＮＡのうち少なくとも「１」のガイドＲＮＡと「８」のガイドＲＮＡを含む複数のガイドＲＮＡが機能していることが示された。一方Ｃａｓ９ニッカーゼ発現アデノベクターの場合（レーンＮＣ９）は、０．６６ｋｂの全長断片の下に特に０．６０ｋｂから０．５５ｋｂにかけてスメアの領域が見られ、複数のダブルニッキングによる多様なサイズの欠失が生じて、複数のダブルニッキング切断が起こっていることが示唆された。
本実験での結果は標的遺伝子の切断効率が一見高くないように見えるが必ずしもそうではない。通常レンチウイルスベクターを用いた実験ではベクターにピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んで発現させることにより、レンチウイルスベクターが染色体内に組み込まれた細胞だけを選択した上で実験を行う。本実験に用いたレンチウイルスベクターもピューロマイシン耐性酵素を発現させているが、この実験ではピューロマイシン選択を行なっていない。そのため大多数の細胞はこのレンチウイルスベクターを持っていないため非常の効率が低いように見えると考えられる。従ってピューロマイシン選択を行う一般的な実験においては、遺伝子切断破壊効率は本実験の結果より格段に高い可能性があると考えられる。

Claims (10)

1. ８個以上のＣａｓガイドＲＮＡを発現する核酸ベクターであって、
   前記核酸ベクターが、組換えアデノウイルスベクターである核酸ベクター。
2. ８個以上のＣａｓガイドＲＮＡを発現する核酸ベクターであって、
   前記核酸ベクターが、組換えレンチウイルスベクターである核酸ベクター。
3. 少なくとも４つのダブルニッキングを誘導することで少なくとも４ヶ所のゲノム切断を起こすように構成された、請求項１から２のいずれかに記載の核酸ベクター。
4. ゲノム上からノックダウンする標的配列の上流における近接した領域に、２つのダブルニッキングを誘導し、更に、該標的配列の下流における近接した領域に、２つのダブルニッキングを誘導することで、該標的配列をノックダウンするように設計された、請求項３に記載の核酸ベクター。
5. Ｃａｓタンパク質をコードする遺伝子および８個以上のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを含む、一体型Ｃａｓ核酸ベクターであって、
   前記核酸ベクターが、組換えアデノウイルスベクターである核酸ベクター。
6. Ｃａｓタンパク質をコードする遺伝子および８個以上のＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを含む、一体型Ｃａｓ核酸ベクターであって、
   前記核酸ベクターが、組換えレンチウイルスベクターである核酸ベクター。
7. 前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットの少なくとも１組が、ダブルニッキングを生じるように構成されている、請求項５から６のいずれかに記載の核酸ベクター。
8. ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニット、Ｃａｓタンパク質をコードする遺伝子、およびノックインされるドナーＤＮＡ配列を含む核酸ベクターであって、
   前記核酸ベクターが、組換えアデノウイルスベクターまたは組換えレンチウイルスベクターである核酸ベクター。
9. 前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを２個以上含み、これらが、ダブルニッキングを誘導するように構成されている、請求項８に記載の核酸ベクター。
10. 前記ＣａｓガイドＲＮＡ発現ユニットを８個含み、これらが、４つのダブルニッキングを誘導するように構成されている、請求項８に記載の核酸ベクター。

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