BR112020009268A2

BR112020009268A2 - plataformas de distribuição de crispr direcionadas

Info

Publication number: BR112020009268A2
Application number: BR112020009268-1A
Authority: BR
Inventors: Erik Joseph Sontheimer; Raed Ibraheim; Wen Xue; Aamir Mir; Alireza Edraki; Gainetdinov Ildar
Original assignee: University Of Massachusetts
Priority date: 2017-11-10
Filing date: 2018-11-09
Publication date: 2020-11-17
Also published as: CA3082370A1; AU2023200084A1; US20190338308A1; EP3707254A2; KR20200080314A; US20220389447A9; IL274526A; CN111868240A; JP2024019727A; EP3707254A4; JP2021502097A; AU2018364993B2; AU2018364993A1; CO2020007046A2; MX2020004777A; WO2019094791A2; WO2019094791A3; SG11202005103RA

Abstract

A presente invenção refere-se a composições e métodos para terapia de genes. Várias abordagens aqui descritas utilizam o sistema Neisseria meningitidis Cas9 que proporciona uma plataforma de edição de gene CRISPR hiperacurada. Além disso, a invenção incorpora o comprimento total e as sequências de RNA de guia única truncadas que permitem que um vetor sgRNA-Nme1Cas9 completo seja inserido em um plasmídeo viral adeno-associado que é compatível para a administração in vivo. Além disso, foi identificado os Tipo II-C Cas9 ortólogos que têm sequências de motivo adjacentes de protoespaçador alvo limitadas a entre um - quatro nucleotídeos requeridos.

Description

“PLATAFORMAS DE DISTRIBUIÇÃO DE CRISPR DIRECIONADAS” Campo da Invenção

[001]A presente invenção refere-se a composições e métodos para terapia de genes. Várias abordagens aqui descritas utilizam os sistemas Neisseria meningitidis Cas9 que proporcionam plataformas de edição de gene de CRISPR hiperacuradass.

Além disso, a invenção incorpora aperfeiçoamentos deste sistema Cas9: por exemplo, truncar sequências únicas de RNA fita, e o empacotamento de Nme1Cas9 ou Nme2Ca9 com seu RNA fita em um vetor viral adeno-associado que é compatível para administração in vivo. Além disso, os ortólogos Cas9 Tipo II-C foram identificados com sequências de motivo adjacentes de protoespaçador alvo limitadas a entre um e quatro nucleotídeos requeridos.

Fundamentos

[002]Repetições palindrômicas curtas regularmente interespaçadas agrupadas (CRISPR)-CRISPR associadas (Cas) é um sistema imune adaptativo fitado por RNA único encontrado em arqueias e bactérias. Estes sistemas proporcionam imunidade por direcionamento e inativação de ácidos nucleicos que se originam de elementos genéticos estranhos. Muitos tipos diferentes de sistemas de CRISPR-Cas foram identificados até a data e são categorizados em duas classes.

[003]Dentro dos sistemas de CRISPR de classe II, os sistemas de CRISPR- Cas Tipo II são caracterizados por uma única proteína efetora denominada Cas9, que forma um complexo de ribonucleoproteína (RNP) com RNA de CRISPR (crRNA) e RNA de ativação trans (tracrRNA) para direcionar e clivar DNA. O crRNA contém uma sequência fita programável que pode dirigir Cas9 para quase qualquer sequência de DNA em organismos vivos.

[004]Esta programabilidade de complexos RNP Cas9 tem sido explorada por muitos pesquisadores para a edição do genoma em sistemas eucarióticos. Tem sido usado para editar os genomas de células mamíferas, embriões humanos, plantas, roedores e outros organismos vivos. Os RNPs Cas9 têm sido usados para a edição precisa (com o doador padrão) e genoma impreciso, ambos os quais encontraram aplicações em terapia de genes, agricultura e outros. Além disso, as versões nuclease mortas dos ortólogos Cas9 estão sendo usadas para a modulação de transcrição, a marcação de DNA sítio-específico, e para o perfil proteoma em locais genômicos específicos. Vários Cas9s diferentes têm sido usados para estas aplicações. Central para a programabilidade de Cas9 e, portanto, suas aplicações é a capacidade de introduzir qualquer sequência fita no crRNA. O crRNA e o tracrRNA podem ser fundidos juntos para formar um único RNA-fita (sgRNA), que é mais estável e proporciona uma maior edição do genoma.

[005]O que é necessário na técnica são as sequências de Cas9s e sgRNA melhoradas que podem proporcionar a edição específica e precisa de uma faixa mais ampla de sítios alvos, especialmente quando combinadas com plataformas de distribuição de ácido nucleico confiáveis.

Resumo da Invenção

[006]A presente invenção refere-se a composições e métodos para terapia de genes. Várias abordagens aqui descritas utilizam sistemas de Neisseria meningitidis Cas9 que proporcionam plataformas de edição de gene de CRISPR hiperacuradas.

Além disso, a invenção incorpora aperfeiçoamentos deste sistema Cas9: por exemplo, truncar as sequências de RNA fita simples, e o empacotamento de Nme1Cas9 ou Nme2Cas9 com seu RNA fita em um vetor viral adeno-associado que é compatível para administração in vivo. Além disso, os ortólogos Cas9 tipo II-C foram identificados com sequências de motivo adjacentes de protoespaçador alvo limitadas a entre um e quatro nucleotídeos requeridos.

[007]Em uma modalidade, a presente invenção contempla uma sequência de ácido ribonucleico de fita única (sgRNA) que compreende uma região repetição: anti- repetição truncada. Em uma modalidade, a sequência de sgRNA compreende ainda uma região de Haste 2 truncada. Em uma modalidade, a sequência sgRNA compreende ainda uma região espaçadora truncada. Em uma modalidade, a referida sequência de sgRNA tem um comprimento de 121 nucleotídeos. Em uma modalidade, o referido comprimento de sequência de sgRNA é selecionado do grupo consistindo em 111 nucleotídeos, 107 nucleotídeos, 105 nucleotídeos, 103 nucleotídeos, 102 nucleotídeos, 101 nucleotídeos e 99 nucleotídeos. Em uma modalidade, a referida sequência de sgRNA tem um comprimento de 100 nucleotídeos. Em uma modalidade, a referida sequência de sgRNA é uma sequência de ácido ribonucleico de fita única Nme1Cas9. Em uma modalidade, a referida sequência de sgRNA é uma sequência de ácido ribonucleico de fita única Nme2Cas9. Em uma modalidade, a referida sequência de sgRNA é uma sequência de ácido ribonucleico de fita única Nme1Cas9 ou uma sequência de ácido ribonucleico de fita única Nme2Cas9.

[008] Em uma modalidade, a presente invenção contempla uma sequência de ácido ribonucleico (sgRNA) de fita única que compreende uma região de Haste 2 truncada. Em uma modalidade, a sequência de sgRNA compreende ainda uma região de repetição: anti-repetição truncada. Em uma modalidade, a sequência de sgRNA compreende ainda uma região espaçadora truncada. Em uma modalidade, a sequência sgRNA tem um comprimento selecionado do grupo que consiste em 111 nucleotídeos, 107 nucleotídeos, 105 nucleotídeos, 103 nucleotídeos, 102 nucleotídeos, 101 nucleotídeos e 99 nucleotídeos. Em uma modalidade, a referida sequência de sgRNA tem um comprimento de 100 nucleotídeos.

[009]Em uma modalidade, a presente invenção contempla um vetor viral adeno-associado (AAV) que compreende um vetor de ácido nucleico de um ácido ribonucleico de única fita-Neisseria meningitidis Cas9 (sgRNA-Nme1Cas9 ou sgRNA- Nme2Cas9). Em uma modalidade, o referido vetor de ácido nucleico de ácido ribonucleico de fita única-Neisseria meningitidis Cas9 compreende pelo menos um promotor. Em uma modalidade, o referido pelo menos um promotor é selecionado do grupo consistindo em um promotor U6 e um promotor de U1a. Em uma modalidade, o referido vetor de ácido nucleico de ácido ribonucleico-Neisseria meningitidis Cas9 compreende uma sequência Kozak. Em uma modalidade, o referido sgRNA compreende uma sequência de ácido nucleico que é complementar a uma sequência gene-de-interesse. Em uma modalidade, a referida sequência gene-de-interesse é selecionada a partir do grupo que consiste em uma sequência PCSK9 e uma sequência ROSA26. Em uma modalidade, o referido sgRNA compreende uma sequência não truncada que tem um comprimento de 145 nucleotídeos. Em uma modalidade, o referido sgRNA compreende uma sequência de repetição-anti- repetição truncada. Em uma modalidade, o referido sgRNA compreende ainda uma região de Haste 2 truncada. Em uma modalidade, o referido sgRNA compreende ainda uma região espaçadora truncada. Em uma modalidade, a referida sequência de sgRNA tem um comprimento de 121 nucleotídeos. Em uma modalidade, a referida sequência de sgRNA tem um comprimento selecionado do grupo consistindo em 111 nucleotídeos, 107 nucleotídeos, 105 nucleotídeos, 103 nucleotídeos, 102 nucleotídeos, 101 nucleotídeos e 99 nucleotídeos. Em uma modalidade, a referida sequência de sgRNA tem um comprimento de 100 nucleotídeos. Em uma modalidade, o referido sgRNA compreende uma região de Haste 2 truncada. Em uma modalidade, o referido sgRNA compreende ainda uma região de repetição: anti- repetição truncada. Em uma modalidade, o referido sgRNA compreende ainda uma região espaçadora truncada. Em uma modalidade, a referida sequência de sgRNA tem um comprimento selecionado do grupo consistindo de 111 nucleotídeos, 107 nucleotídeos, 105 nucleotídeos, 103 nucleotídeos, 101 nucleotídeos e 99 nucleotídeos. Em uma modalidade, a referida sequência de sgRNA tem um comprimento de 100 nucleotídeos. Em uma modalidade, o referido sgRN compreende uma sequência não truncada que tem um comprimento de 145 nucleotídeos.

[010]Em uma modalidade, a presente invenção contempla um método, compreendendo: a) prover; i) um paciente exibindo pelo menos um sintoma de uma condição médica, em que o referido paciente compreende uma pluralidade de genes relacionados à referida condição médica; ii) uma plataforma de distribuição compreendendo um vetor de ácido nucleico de ácido ribonucleico de fita única - Neisseria meningitidis Cas9 (sgRNA-Nme1Cas9 ou sgRNA-Nme2Cas9), em que o referido sgRNA compreende uma sequência de ácido nucleico que é complementar a uma porção de pelo menos um da referida pluralidade de genes, e b) administração do referido plasmídeo AAV ao referido paciente sob condições de tal modo que o referido pelo menos um sintoma da referida condição médica seja reduzido. Em uma modalidade, a plataforma de distribuição compreende um vetor viral associado a adeno (AAV). Em uma modalidade, a plataforma de distribuição compreende uma micropartícula. Em uma modalidade, a referida condição médica compreende hipercolesterolemia. Em uma modalidade, a referida condição médica compreende tirosinemia. Em uma modalidade, o referido pelo menos um da referida pluralidade de genes é um gene PCSK9. Em uma modalidade, o referido ácido nucleico de sgRNA é complementar a uma porção do referido gene PCSK9. Em uma modalidade, pelo menos um da referida pluralidade de genes é um gene FAH. Em uma modalidade, o referido ácido nucleico de sgRN é complementar a uma porção do referido gene FAH. Em uma modalidade, o referido sgRNA compreende uma sequência de repetição-anti-repetição truncada. Em uma modalidade, o referido sgRNA compreende ainda uma região de Haste 2 truncada. Em uma modalidade, o referido sgRNA compreende ainda uma região espaçadora truncada. Em uma modalidade, a referida sequência de sgRNA tem um comprimento de 121 nucleotídeos. Em uma modalidade, a referida sequência de sgRNA tem um comprimento selecionado do grupo consistindo em 111 nucleotídeos, 107 nucleotídeos, 105 nucleotídeos, 103 nucleotídeos, 101 nucleotídeos e 99 nucleotídeos. Em uma modalidade, a referida sequência de sgRNA tem um comprimento de 100 nucleotídeos. Em uma modalidade, o referido sgRNA compreende uma região de Haste 2 truncada. Em uma modalidade, o referido sgRNA compreende ainda uma região de repetição: anti-repetição truncada. Em uma modalidade, o referido sgRNA compreende ainda uma região espaçadora truncada.

Em uma modalidade, a referida sequência de sgRNA tem um comprimento selecionado do grupo consistindo em 111 nucleotídeos, 107 nucleotídeos, 105 nucleotídeos, 103 nucleotídeos, 102 nucleotídeos, 101 nucleotídeos e 99 nucleotídeos. Em uma modalidade, a referida sequência de sgRNA tem um comprimento de 100 nucleotídeos. Em uma modalidade, o referido sgRNA compreende uma sequência não truncada que tem um comprimento de 145 nucleotídeos.

[011]Em uma modalidade, a presente invenção contempla um plasmídeo viral adeno-associado (AAV) que codifica uma proteína nuclease Cas9 Tipo II-C em que a referida proteína compreende um domínio de reconhecimento de motivo adjacente protoespaçador configurado com um sítio de ligação a uma sequência motivo adjacente protoespaçadora compreendendo entre um a quatro nucleotídeos requeridos. Em uma modalidade, a referida proteína nuclease Cas9 Tipo II-C é selecionada a partir do grupo que consiste de uma proteína nuclease de cepa Neisseria meningitidis de proteína nuclease De10444 Nme2Cas9, uma proteína nuclease Haemophilus parainfluenzae HpaCas9 e uma proteína nuclease Simonsiella muelleri SmuCas9.

[012]Em uma modalidade, a referida sequência motivo adjacente protoespaçadora compreendendo um a quatro nucleotídeos requeridos é selecionada do grupo consistindo em N4CN3, N4CT, N4CCN, N4CCA e N4GNT3. Em uma modalidade, o um a quatro nucleotídeos requeridos são selecionados do grupo consistindo em C, CT, CCN, CCA, CN3 e GNT2. Em uma modalidade, a referida proteína nuclease Cas9 Tipo II-C é ligada a um sgRNA truncado. Em uma modalidade, o plasmídeo viral adeno-associado codifica duas sequências de sgRNA.

Em uma modalidade, o plasmídeo viral adeno-associado codifica uma sequência de poli-adenosina. Em uma modalidade, o plasmídeo viral adeno-associado codifica um padrão de nucleotídeo doador de reparo dirigido por homologia. Em uma modalidade, o plasmídeo viral adeno-associado é um plasmídeo viral associado adeno-associado todo-em-um.

[013]Em uma modalidade, a presente invenção contempla um método, compreendendo: a) prover; i) um paciente exibindo pelo menos um sintoma de uma condição médica, em que o referido paciente compreende uma pluralidade de genes relacionados à referida condição médica, em que a referida pluralidade de genes compreende um motivo adjacente protoespaçador compreendendo entre um - quatro nucleotídeos requeridos , ii) uma plataforma de distribuição compreendendo pelo menos um ácido nucleico que codifica uma proteína nuclease Cas9 Tipo II-C em que a referida proteína compreende um domínio de reconhecimento de motivo adjacente protoespaçador configurado com um sítio de ligação à referida sequência motivo adjacente protoespaçadora compreendendo entre dois e quatro nucleotídeos requeridos; e b) administrar a referida plataforma de distribuição ao referido paciente sob condições de tal forma que o referido pelo menos um sintoma da referida condição médica seja reduzido.

Em uma modalidade, a referida condição médica compreende hipercolesterolemia.

Em uma modalidade, a referida condição médica compreende tirosinemia.

Em uma modalidade, o referido pelo menos um da referida pluralidade de genes é um gene PCSK9. Em uma modalidade, o referido ácido nucleico de sgRNA é complementar a uma porção do referido gene PCSK9. Em uma modalidade, pelo menos um da referida pluralidade de genes é um gene FAH.

Em uma modalidade, o referido ácido nucleico de sgRNA é complementar a uma porção do referido gene FAH.

Em uma modalidade, a referida plataforma de distribuição compreende um plasmídeo viral adeno-associado.

Em uma modalidade, a referida plataforma de distribuição compreende uma micropartícula.

Em uma modalidade, a referida proteína nuclease Cas9 Tipo II-C é selecionada a partir do grupo que consiste de uma proteína nuclease de uma cepa Neisseria meningitidis De10444 Nme2Cas9,

uma proteína nuclease Haemophilus parainfluenzae HpaCas9 e uma proteína nuclease Simonsiella muelleri SmuCas9. Em uma modalidade, a referida sequência motivo adjacente protoespaçadora compreendendo um-quatro nucleotídeos requeridos são selecionados a partir do grupo consistindo em N 4CN3, N4CT, N4CCN,

N4CCA e N4GNT3. Em uma modalidade, o um a quatro nucleotídeos requeridos são selecionados do grupo consistindo em C, CT, CCN, CCA, CN3 e GNT2. Em uma modalidade, a referida proteína nuclease Cas9 Tipo II-C é ligada a um sgRNA truncado.

Em uma modalidade, o plasmídeo viral adeno-associado codifica duas sequências de sgRNA.

Em uma modalidade, o plasmídeo viral adeno-associado codifica uma sequência de poli-adenosina.

Em uma modalidade, o plasmídeo viral adeno-associado codifica um padrão de nucleotídeo doador de reparo dirigido por homologia. Em uma modalidade, o plasmídeo viral adeno-associada é um plasmídeo viral adeno-associado todos-em-um.

[014]Em uma modalidade, a presente invenção contempla um plasmídeo viral adeno-associado (AAV) que codifica uma proteína nuclease Cas9 Tipo II-C, em que a referida proteína compreende um domínio de reconhecimento de motivo adjacente protoespaçador (por exemplo, um Domínio de Interação de PAM; PID) configurado para ligar-se com uma sequência motivo adjacente de protoespaçador (PAM), a referida sequência de PAM compreendendo um par de dinucleotídeos de citosina adjacente. Em uma modalidade, o par de dinucleotídeos de citosina adjacente está nas posições de PAM cinco (5) e seis (6). Em uma modalidade, a referida proteína nuclease Cas9 Tipo II-C é derivada de uma cepa Neisseria meningitidis. Em uma modalidade, a cepa Neisseria meningitidis é De10444. Em uma modalidade, a proteína nuclease Cas9 Tipo II-C é uma proteína nuclease Nme2Cas9. Em uma modalidade, a cepa Neisseria meningitidis é 98002. Em uma modalidade, a proteína nuclease Cas9 Tipo II-C é uma proteína nuclease Nme3Cas9. Em uma modalidade, a referida sequência de PAM é selecionada a partir do grupo consistindo de N 4CC, N4CC3, N4CCA, N4CC(X), N4CA3 e N10. Em uma modalidade, a sequência PAM é N3CC. Em uma modalidade, a proteína nuclease Cas9 Tipo II-C compreende ainda uma sequência de sgRNA. Em uma modalidade, a sequência de sgRNA compreende um espaçador que varia em comprimento entre aproximadamente dezessete (17) - vinte quatro (24) nucleotídeos.

[015]Em uma modalidade, a presente invenção contempla um método, compreendendo: a) prover; i) um paciente exibindo pelo menos um sintoma de uma condição médica, em que o referido paciente compreende uma pluralidade de genes relacionados à referida condição médica, em que a referida pluralidade de genes compreende um motivo adjacente protoespaçador compreendendo um par de dinucleotídeos de citosina adjacente ; ii) uma plataforma de distribuição compreendendo pelo menos um ácido nucleico que codifica uma proteína nuclease

Cas9 Tipo II-C em que a referida proteína compreende um domínio de reconhecimento de motivo adjacente protoespaçador (por exemplo, um Domínio de Interação de PAM; PID) configurado para ligar-se com a referida sequência motivo adjacente protoespaçadora compreendendo um par de dinucleotídeos de citosina adjacente; e b) administrar a referida plataforma de distribuição ao referido paciente sob condições tais que o referido pelo menos um sintoma da referida condição médica é reduzida. Em uma modalidade, a referida plataforma de distribuição compreende um vetor viral adeno-associado. Em uma modalidade, o vetor viral adeno-associado é o vetor viral adeno-associado oito (AAV8). Em uma modalidade, a referida condição médica compreende hipercolesterolemia. Em uma modalidade, a referida condição médica compreende tirosinemia. Em uma modalidade, a condição médica é doença granulomatosa crônica ligada a X. Em uma modalidade, a condição médica é a aspartilglicosaminúria. Em uma modalidade, o referido pelo menos um da referida pluralidade de genes é um gene PCSK9. Em uma modalidade, o referido ácido nucleico de sgRNA é complementar a uma porção do referido gene PCSK9. Em uma modalidade, pelo menos um da referida pluralidade de genes é um gene FAH.

Em uma modalidade, o referido ácido nucleico sgRNA é complementar a uma porção do referido gene FAH. Em uma modalidade, o plasmídeo viral adeno-associado codifica pelo menos uma sequência de sgRNA. Em uma modalidade, o plasmídeo viral adeno-associado codifica duas sequências de sgRNA. Em uma modalidade, o plasmídeo viral adeno-associado codifica uma sequência de poli-adenosina. Em uma modalidade, o plasmídeo viral adeno-associado codifica um padrão de nucleotídeo doador de reparo dirigido por homologia. Em uma modalidade, o plasmídeo viral adeno-associado é um plasmídio viral adeno-associado all-in-one. Em uma modalidade, a referida plataforma de distribuição compreende uma micropartícula.

Em uma modalidade, o par de dinucleotídeos de citosina adjacente está nas posições de PAM cinco (5) e seis (6). Em uma modalidade, a referida proteína nuclease Cas9 Tipo II-C é derivada de uma cepa Neisseria meningitidis. Em uma modalidade, a cepa Neisseria meningitidis é De10444. Em uma modalidade, a proteína nuclease Cas9

Tipo II-C é uma proteína nuclease Nme2Cas9. Em uma modalidade, a cepa Neisseria meningitidis é 98002. Em uma modalidade, a proteína nuclease Cas9 Tipo II-C é uma proteína nuclease Nme3Cas9. Em uma modalidade, a referida sequência PAM é selecionada do grupo consistindo de N4CC, N4CC3, N4CCA, N4CC(X), N4CA3 e N10.

Em uma modalidade, a sequência PAM é o N3CC. Em uma modalidade, a proteína nuclease Cas9 Tipo II-C compreende ainda uma sequência de sgRNA. Em uma modalidade, a sequência de sgRNA compreende um espaçador que varia em comprimento entre aproximadamente dezessete (17) - vinte quatro (24) nucleotídeos.

Definições

[016]Para facilitar a compreensão desta invenção, um número de termos é definido abaixo. Os termos definidos aqui têm significados como comumente entendidos por uma pessoa versada nas áreas relevantes para a presente invenção.

Os termos tais como "um", "uma" e "o/a" não se destinam a se referir a apenas uma entidade singular, mas também várias entidades e também incluem a classe geral da qual um exemplo específico pode ser usado para ilustração. A terminologia aqui é usada para descrever modalidades específicas da invenção, mas seu uso não limita a invenção, exceto como descrito nas reivindicações.

[017]O termo "cerca de" ou "aproximadamente" conforme aqui usado, no contexto de qualquer uma das medições de ensaio, refere-se a +/- 5% de uma determinada medição.

[018]Como aqui usado, o "gene ROSA26" ou "gene Rosa26" refere-se a um ser humano ou camundongo (respectivamente) local que é amplamente usado para a obtenção da expressão generalizada no camundongo. O direcionamento do locus ROSA26 pode ser obtido pela introdução de um gene desejado no primeiro íntron do locus, em um sítio XbaI único de aproximadamente 248 bp a montante da linha de captação de genes original. Uma construção pode ser construída utilizando-se um aceptor de “splice” de adenovírus seguido por um gene de interesse e um sítio de poliadenilação inserido no sítio Xbal único. Um cassete de resistência à neomicina também pode ser incluído no vetor de direcionamento.

[019]Como aqui usado, o "gene PCSK9" ou "gene Pcsk9" refere-se a um locus humano ou de camundongo (respectivamente) que codifica uma proteína PCSK9. O gene PCSK9 reside no cromossoma 1 na banda 1p32.3 e inclui 13 éxons.

Este gene pode produzir pelo menos duas isoformas através do “splicing” alternativo.

[020]O termo "pró-proteína convertase subtilisina/quexina tipo 9" e "PCSK9" refere-se a uma proteína codificada por um gene que modula níveis de lipoproteína de baixa densidade. Pró-proteína convertase subtilisina/quexina tipo 9, também conhecida como PCSK9, é uma enzima que em seres humanos é codificada pelo gene PCSK9. Seidah e colaboradores. "The secretory proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase 1 (NARC-1): liver regeneration and neuronal differentiation" Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (3): 928-933 (2003). Genes similares (ortólogos) são encontrados através de muitas espécies. Muitas enzimas, incluindo PSCK9, são inativas quando elas são primeiramente sintetizadas, porque possuem uma seção de cadeias de peptídeos que bloqueia a sua atividade; pró-proteína convertases remove aquela seção para ativar a enzima. Acredita-se que PSCK9 desempenhe um papel regulador na homeostase do colesterol. Por exemplo, PCSK9 pode se ligar ao domínio de repetição semelhante ao fator de crescimento epidermal A (EGF-A) do receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDL-R) resultando em internalização e degradação de LDL-R. Evidentemente, seria esperado que níveis reduzidos de LDL-R resultam em metabolismo diminuído de LDL-C, que poderia levar à hipercolesterolemia.

[021]O termo "hipercolesterolemia", para uso na presente invenção, refere-se a qualquer condição médica em que os níveis de colesterol no sangue são elevados acima dos níveis clinicamente recomendados. Por exemplo, se o colesterol for medido usando lipoproteínas de baixa densidade (LDLs), a hipercolesterolemia pode existir se os níveis medidos de LDL estão acima, por exemplo, aproximadamente 70 mg/dL. Alternativamente, se o colesterol for medido usando colesterol de plasma livre, a hipercolesterolemia pode existir se os níveis de colesterol livre medidos forem acima, por exemplo, de aproximadamente 200-220 mg/dL.

[022]Como aqui usado, o termo "CRIPRs" ou "Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas” refere-se a um acrônimo para os locais de DNA que contêm repetições múltiplas, curtas, diretas de sequências base.

Cada repetição contém uma série de bases seguidas por 30 ou mais pares de bases conhecidos como sequência "espaçadora". Os espaçadores são segmentos curtos de DNA a partir de um vírus e podem servir como uma “memória” das exposições passadas para facilitar uma defesa adaptativa contra invasões futuras, Doudna e colaboradores. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9” Science 346(6213):1258096 (2014).

[023]Como aqui usado, o termo "Cas" ou "associado a CRISPR (cas)" refere- se a genes frequentemente associados com disposições de repetição-espaçador de CRISPR.

[024]Conforme usado aqui, o termo "Cas9" refere-se a uma nuclease a partir de sistemas de CRISPR do tipo II, uma enzima especializada para a geração de quebras de dupla fita em DNA, com dois sítios de corte ativos (os domínios HNH e RuvC), um para cada fita da hélice dupla. tracrRNA e RNA espaçador pode ser combinados em uma molécula de "RNA de fita única" (sgRNA) que, misturada com Cas9, poderia encontrar e clivar alvos de DNA através de emparelhamento de Watson-Crick entre a sequência guia dentro do sgRNA e a sequência de DNA alvo, Jinek e colaboradores. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity” Science 337(6096):816-821 (2012).

[025]Como aqui usado, o termo "Cas9 cataliticamente ativo" refere-se a uma nuclease Cas9 não modificada compreendendo atividade nuclease plena.

[026]O termo "nickase", para uso na presente invenção, refere-se a uma nuclease que cliva apenas uma única fita de DNA, devido a sua função natural ou devido à engenharia para clivar apenas uma única fita de DNA. Variantes nickase Cas9 que têm ou domínio RuvC ou o HNH mutado proporcionam controle sobre o qual a fita de DNA é clivada e que permanece intacta. Jinek e colaboradores., “A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity”

Science 337(6096):816-821 (2012) e Cong e colaboradores. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems” Science 339(6121):819-823 (2013).

[027]O termo "crRNA de ativação trans", "tracrRNA", conforme aqui usado, refere-se a um pequeno RNA trans-codificado. Por exemplo, CRISPR/Cas (proteínas associadas a repetições palindrômicas curtas agrudadas e regularmente interespaçadas/ CRISPR) constitui um sistema de defesa mediado por RNA, que protege contra vírus e plasmídeos. Esta via defensiva tem três etapas. Primeiro uma cópia do ácido nucleico invasor é integrada no locus de CRISPR. A seguir, Os RNAs de CRISPR (crRNAs) são transcritos a partir deste locus de CRISPR. Os crRNAs são então incorporados em complexos efetores, onde o crRNA guia o complexo para o ácido nucleico invasor e as proteínas Cas degradarem este ácido nucleico. Existem várias vias de ativação de CRISPR, uma das quais requer um tracrRNA, que desempenha um papel na maturação de crRNA. TracrRNA é complementar à sequência repetida do pré-crRNA, formando um duplex de RNA. Este é clivado pela RNase III, uma ribonuclease específica de RNA, para formar um híbrido crRNA/tracrRNA. Este híbrido atua como um guia para a endonuclease Cas9, que cliva o ácido nucleico invasor.

[028]O termo "motivo adjacente de protoespaçador” (ou PAM), conforme usado aqui, refere-se a uma sequência de DNA que pode ser necessária para um Cas9/sgRNA para formar uma alça R para interrogar uma sequência de DNA específica através do emparelhamento de Watson-Crick de seu RNA guia com o genoma. A especificidade de PAM pode ser função da especificidade de ligação de DNA da proteína Cas9 (por exemplo, um “domínio de reconhecimento de motivo adjacente protoespaçador" no Terminal C de Cas9).

[029]Os termos "domínio de reconhecimento de motivo adjacente de protoespaçador", "Domínio de Interação de PAM" ou "PID", conforme aqui usado, refere-se a uma sequência de aminoácidos Cas9 que compreende um sítio de ligação a uma Sequência de PAM alvo de DNA.

[030]O termo "sítio de ligação", para uso na presente invenção, refere-se a qualquer disposição molecular que tem uma estrutura terciária e/ou quaternária específica que é submetida a uma ligação física ou associação íntima com um componente de ligação. Por exemplo, o arranjo molecular pode compreender uma sequência de aminoácidos. Alternativamente, o arranjo molecular pode compreender uma sequência de ácidos nucleicos. Além disso, o arranjo molecular pode compreender uma bicamada lipídica ou outro material biológico.

[031]Conforme usado aqui, o termo "sgRNA" refere-se a um RNA fita única usado em conjunto com sistemas associados CRISPR (Cas). sgRNAs são uma fusão de crRNA e tracrRNA e contém nucleotídeos de sequência complementar ao sítio alvo desejado. Jinek e colaboradores., “A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity” Science 337(6096):816-821 (2012).

Emparelhamento de Watson-Crick do sgRNA com o sítio alvo permite a formação da alça R, que em conjunto com um PAM funcional permite a clivagem de DNA ou no caso de Cas9 deficiente em nuclease que se liga ao DNA naquele locus.

[032]Conforme aqui utilizado, o termo "ortogonal" refere-se a alvos que não são sobrepostos, não correlacionados ou independentes. Por exemplo, se duas isoformas de Cas9 ortogonais fossem utilizadas, elas empregariam sgRNAs ortogonais que só programam uma das isoformas Cas9 para o reconhecimento e clivagem de DNA. Esvelt e colaboradores., “Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing” Nat Methods 10(11):1116-1121 (2013). Por exemplo, isto permitiria uma isoforma Cas9 (por exemplo, S. pyogenes Cas9 ou Spyas9) funcionar como uma nuclease programada por um sgRNA que pode ser específica a ela, e outra Isoforma Cas9 (por exemplo, N. meningitidis Cas9 ou NmeCas9) para operar como um Cas9 de nuclease-morta que fornece o direcionamento de DNA a um sítio de ligação através de sua especificidade de PAM e sgRNA ortogonal. Outros Cas9s incluem S. aureus Cas9 ou SauCas9 e A. naeslundii Cas9 ou AnaCas9.

[033] O termo "truncado" como usado aqui, quando usado em referência a uma sequência de polinucleotídeo ou uma sequência de aminoácidos, significa que pelo menos uma porção da sequência do tipo selvagem pode estar ausente. Em alguns casos, as sequências guias truncadas dentro do sgRNA ou crRNA podem melhorar a precisão de edição de Cas9. Fu, e colaboradores. “Improving CRISPR- Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs” Nat Biotechnol. 2014 Mar;32(3):279-284 (2014).

[034]O termo "pares de bases", conforme aqui usado, refere-se a nucleobases específicas (também denominadas bases nitrogenosas), que são os blocos de construção de sequências de nucleotídeos que formam uma estrutura primária tanto de DNA quanto de RNA. O DNA de fita dupla pode ser caracterizado por padrões específicos de ligação de hidrogênio. Pares de bases podem incluir, mas não são limitados a pares de base guanina-citosina e adenina-timina

[035]O termo "alvo genômico específico", para uso na presente invenção, refere-se a qualquer sequência de nucleotídeos pré-determinada capaz de se ligar a uma proteína Cas9 aqui contemplada. O alvo pode incluir, mas não se limita a, uma sequência de nucleotídeos complementar a um domínio de ligação de DNA programável ou uma proteína Cas9 ortogonal programada com seu próprio RNA guia, uma sequência de nucleotídeos complementar a uma único RNA guia de fita única, uma sequência de reconhecimento de motivo adjacente protoespaçadora, uma sequência de ligação no alvo e uma sequência de ligação fora-alvo.

[036]O termo "sequência de ligação no alvo", conforme aqui usado, refere-se a uma subsequência de um alvo genômico específico que pode ser completamente complementar a um domínio de ligação de DNA programável e/ou uma sequência de RNA guia de fita única.

[037]O termo "sequência de ligação fora-alvo", conforme aqui usado, refere- se a uma subsequência de um alvo genômico específico que pode ser parcialmente complementar a um domínio de ligação de DNA programável e/ou uma sequência de RNA guia de fita única.

[038]O termo "falha para ligar" como usado aqui, refere-se a qualquer interação de nucleotídeo-nucleotídeo ou uma interação de nucleotídeo-aminoácido que exibe complementaridade parcial, mas tem complementaridade insuficiente para reconhecimento para desencadear a clivagem do sítio alvo pela nuclease Cas9. Tal insuficiência de ligação pode resultar em ligação fraca ou parcial de duas moléculas tal que uma função biológica esperada (por exemplo, atividade nuclease) falha.

[039]O termo "clivagem", conforme aqui usado, pode ser definido como a geração de uma quebra no DNA. Esta poderia ser uma quebra de fita simples ou uma quebra de fita dupla dependendo do tipo de nuclease que pode ser empregada.

[040]Como usado aqui, o termo "editar", "edição" ou "editado" refere-se a um método de alterar uma sequência de ácido nucleico de um polinucleotídeo (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico de ocorrência natural do tipo selvagem ou uma sequência de ocorrência natural mutada) por deleção seletiva de um alvo genômico específico ou a inclusão específica de nova sequência através do uso de um padrão de DNA fornecido de forma exógena. Tal alvo genômico específico inclui, mas não se limita a, região cromossômica, DNA mitocondrial, um gene, um promotor, uma estrutura de leitura aberta ou qualquer sequência de ácido nucleico.

[041]O termo "deletar", "deletado", "deletando" ou "deleção", conforme aqui usado, pode ser definido como uma mudança na sequência de nucleotídeos ou aminoácidos na qual um ou mais nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos, respectivamente, são, ou se tornam, ausentes.

[042]O termo "gene de interesse", para uso na presente invenção, refere-se a qualquer gene pré-determinado para o qual pode ser desejada a deleção.

[043] O termo "alelo", conforme aqui usado, refere-se qualquer um de um número de formas alternativas do mesmo gene ou mesmo locus genético.

[044]O termo "quantidade efetiva", para uso na presente invenção, refere-se a uma quantidade particular de uma composição farmacêutica que compreende um agente terapêutico que alcança um resultado clinicamente benéfico (isto é, por exemplo, uma redução de sintomas). A toxicidade e a eficácia terapêutica de tais composições podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrões em culturas celulares ou animais experimentais, por exemplo, para determinar a LD 50 (a dose letal a 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente efetiva em 50% da população). A relação de dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico, e pode ser expressa como a relação LD50/ED50. Os compostos que exibem grandes índices terapêuticos são preferidos. Os dados obtidos destes ensaios de cultura celular e estudos animais adicionais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagem para uso humano. A dosagem de tais compostos situa-se, preferivelmente, dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem varia dentro desta faixa, dependendo da forma de dosagem empregada, da sensibilidade do paciente e da via de administração.

[045]O termo "sintoma", conforme aqui usado, refere-se a qualquer evidência subjetiva ou objetiva de doença ou distúrbio físico observado pelo paciente. Por exemplo, evidência subjetiva é usualmente baseada no auto-relato do paciente e pode incluir, mas não está limitada a dor de cabeça, perturbações visuais, náusea e/ou vômito. Alternativamente, a evidência objetiva é usualmente um resultado de testes médicos incluindo, mas não limitados a temperatura corporal, contagem completa de sangue, painéis lipídicos, painéis da tiroide, pressão sanguínea, frequência cardíaca, eletrocardiograma, varreduras de imagens de tecido e/ou corpo.

[046]O termo "doença" ou "condição médica", conforme aqui usado, refere- se a qualquer deterioração do estado normal do animal vivo ou corpo vegetal ou uma de suas partes que interrompe ou modifica o desempenho das funções vitais.

Tipicamente manifestado pela distinção de sinais e sintomas, é usualmente uma resposta a: i) fatores ambientais (como má nutrição, riscos industriais, ou clima); ii) agentes infecciosos específicos (como vermes, bactérias ou vírus) ; iii) defeitos inerentes do organismo (como anomalias genéticas); e/ou iv) combinações destes fatores.

[047]Os termos "reduzir", "inibir" " diminuir "," suprimir "," baixar ", "prevenir" e equivalentes gramaticais (incluindo "inferior", "menor" etc) quando em referência à expressão de qualquer sintoma em um indivíduo não tratado com relação a um indivíduo tratado, significa que a quantidade e/ou magnitude dos sintomas no indivíduo tratado é menor do que no indivíduo não tratado por qualquer quantidade que é reconhecida como clinicamente relevante por qualquer pessoal médico treinado. Em uma modalidade, a quantidade e/ou magnitude dos sintomas no indivíduo tratado é pelo menos 10% menor que, pelo menos 25% menor que, pelo menos 50% menor que, pelo menos 75% menor que, e/ou pelo menos 90% menor que a quantidade e/ou magnitude dos sintomas no indivíduo não tratado.

[048]O termo "ligado", para uso na presente invenção, refere-se a qualquer interação entre um meio (ou veículo) e um fármaco. A ligação pode ser reversível ou irreversível. Tal ligação inclui, mas não se limita a, ligação covalente, ligação iônica, forças de Van der Waals ou atrito, e semelhantes. Um fármaco é ligado a um meio (ou veículo) se ele for impregnado, incorporado, revestido, em suspensão com, em solução com, misturado com etc.

[049] O termo "fármaco" ou "composto", para uso na presente invenção, refere-se a qualquer substância farmacologicamente ativa capaz de ser administrada que alcança um efeito desejado. Fármacos ou compostos podem ser sintéticos ou de ocorrência natural, não-peptídeo, proteínas ou peptídeos, oligonucleotídeos ou nucleotídeos, polissacarídeos ou açúcares.

[050]O termo "administrado" ou "administração", conforme aqui usado, refere- se a qualquer método de fornecimento de uma composição a um paciente, de modo que a composição tenha seu efeito pretendido no paciente. Um método exemplar de administrar é por um mecanismo direto tal como, administração local de tecido (isto é, por exemplo, colocação extravascular), ingestão oral, emplastro transdérmico, tópico, inalação, supositório etc.

[051]O termo "paciente" ou "indivíduo", conforme aqui usado, é um ser humano ou animal e não precisa ser hospitalizado. Por exemplo, pacientes externos, pessoas em casas de enfermeiras são "pacientes". Um paciente pode compreender qualquer idade de um humano ou animal não humano e, portanto, inclui ambos os adultos e jovens (isto é, crianças). Não se pretende que o termo "paciente" conote uma necessidade de tratamento médico, portanto, um paciente pode voluntariamente ou involuntariamente ser parte de experimentação se clínica ou em suporte de estudos de ciência básica.

[052]O termo "afinidade", para uso na presente invenção, refere-se a qualquer força atrativa entre substâncias ou partículas que faz com que elas entrem e permaneçam em combinação química. Por exemplo, um composto inibidor que tem alta afinidade para um receptor proverá maior eficácia na prevenção do receptor de interagir com seus ligantes naturais, do que um inibidor com baixa afinidade.

[053]O termo "derivado de", conforme aqui usado, refere-se à fonte de um composto ou sequência. Em um aspecto, um composto ou sequência pode ser derivado de um organismo ou espécie particular. Em outro aspecto, um composto ou sequência pode ser derivado de um complexo ou sequência maior.

[054]O termo "proteína", conforme aqui usado, refere-se a qualquer das várias substâncias extremamente complexas que ocorrem naturalmente (como uma enzima ou anticorpo) que consistem de resíduos de aminoácidos unidos por ligações peptídicas, contêm os elementos carbono, hidrogênio, nitrogênio, oxigênio, usualmente enxofre. Em geral, uma proteína compreende aminoácidos tendo uma ordem de grandeza dentro das centenas.

[055]O termo "peptídeo", para uso na presente invenção, refere-se a qualquer uma das várias amidas derivadas de dois ou mais aminoácidos por combinação do grupo amino de um ácido com o grupo carboxila de outro e são usualmente obtidas por hidrólise parcial de proteínas. Em geral, um peptídeo compreende aminoácidos tendo uma ordem de magnitude com as dezenas.

[056]O termo "polipeptídeo" refere-se a qualquer uma das várias amidas derivadas de dois ou mais aminoácidos por combinação do grupo amino de um ácido com o grupo carboxila de outro e são usualmente obtidas por hidrólise parcial de proteínas. Em geral, um peptídeo compreende aminoácidos tendo uma ordem de magnitude com as dezenas ou maiores.

[057]O termo "farmaceuticamente" ou "farmacologicamente aceitável", como aqui usado, refere-se a entidades moleculares e composições que não produzem reações adversas, alérgicas ou outras reações adversas quando administradas a um animal ou um humano.

[058]O termo "veículo farmaceuticamente aceitável", como aqui usado, inclui qualquer e todos os solventes, ou um meio de dispersão incluindo, mas não limitado a, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido, e semelhantes), misturas adequadas dos mesmos, e óleos vegetais, revestimentos, agentes isotônicos e de retardo de absorção, lipossoma, limpadores comercialmente disponíveis, e semelhantes. Ingredientes bioativos suplementares também podem ser incorporados em tais veículos.

[059]"Sequência de ácidos nucleicos" e "sequência de nucleotídeo", para uso na presente invenção, referem-se a um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo, e fragmentos ou porções dos mesmos, e a DNA ou RNA de origem genômica ou sintética que pode ser de fita simples ou dupla, e representa a fita de sentido ou antessentido.

[060]O termo "um ácido nucleico isolado", conforme aqui usado, refere-se a qualquer molécula de ácido nucléico que tenha sido removida de seu estado natural (por exemplo, removida de uma célula e é, em uma modalidade preferida, livre de outro ácido nucleico genômico).

[061]Os termos "sequência de aminoácidos" e "sequência de polipeptídeo", conforme aqui usados, são intercambiáveis e referem-se a uma sequência de aminoácidos.

[062]Como aqui usado, o termo "porção" quando em referência a uma proteína (como em "uma porção de uma determinada proteína") se refere a fragmentos dessa proteína. Os fragmentos podem variar em tamanho de quatro resíduos de aminoácidos para toda a sequência de aminoácidos menos um aminoácido.

[063]O termo "porção" quando usado em referência a uma sequência de nucleotídeos se refere a fragmentos daquela sequência de nucleotídeos. Os fragmentos podem variar em tamanho de 5 resíduos de nucleotídeos para toda a sequência de nucleotídeos menos um resíduo de ácido nucleico.

[064]O termo "biologicamente ativo" refere-se a qualquer molécula tendo funções estruturais, reguladoras ou bioquímicas. Por exemplo, a atividade biológica pode ser determinada, por exemplo, pela restauração do crescimento do tipo selvagem em células sem atividade de proteína. As células com ausência de atividade de proteína podem ser produzidas por muitos métodos (isto é, por exemplo, mutação pontual e mutação por mudança de matriz de leitura). A complementação é obtida por transfectar células com ausência de atividade de proteína com um vetor de expressão que expressa a proteína, um derivado do mesmo, ou uma porção do mesmo.

[065]Como aqui usado, os termos "complementar" ou "complementaridade" são usados em referência a "polinucleotídeos" e "oligonucleotídeos" (que são termos intercambiáveis que se referem a uma sequência de nucleotídeos) relacionadas pelas regras de emparelhamento de base. Por exemplo, a sequência "C-A-G-T" é complementar à sequência "G-T-C-A". Complementaridade pode ser "parcial" ou "total". Complementaridade "Parcial" é onde uma ou mais bases de ácido nucléico não são combinadas de acordo com as regras de emparelhamento de base, Complementaridade "total" ou "completa" entre ácidos nucleicos é onde cada e toda a base de ácido nucleico é emparelhada com outra base sob as regras de emparelhamento de base. O grau de complementaridade entre as fitas de ácido nucleico tem efeitos significantes na eficiência e resistência da hibridização entre as fitas de ácido nucleico. Isto é de importância particular em reações de amplificação, bem como métodos de detecção que dependem da ligação entre ácidos nucleicos.

[066]Como aqui usado, o termo "hibridização" é usado com referência ao emparelhamento de ácidos nucleicos complementares usando qualquer processo pelo qual uma fita de ácido nucleico une-se com uma fita complementar através de pareamento de bases para formar um complexo de hibridização. Hibridização e a resistência da hibridização (isto é, a resistência da associação entre os ácidos nucleicos) é afetada por fatores tais como o grau de complementaridade entre os ácidos nucleicos, a estringência das condições envolvidas, a Tm do híbrido formado e a relação G: C dentro dos ácidos nucleicos.

[067]Como aqui usado, o termo "complexo de hibridização" refere-se a um complexo formado entre duas sequências de ácido nucleico em virtude da formação de limites de hidrogênio entre bases G e C complementares e entre bases A e T complementares; estas ligações de hidrogênio podem ser adicionalmente estabilizadas por interações de empilhamento de base. As duas sequências de ácido nucleico complementares contêm ligação de hidrogênio em uma configuração antiparalela. Um complexo de hibridização pode ser formado em solução (por exemplo , análise C0 t ou R0 t) ou entre uma sequência de ácido nucleico presente em solução e outra sequência de ácido nucleico imobilizada em suporte sólido (por exemplo, uma membrana de náilon ou um filtro de nitrocelulose como empregado em Southern and Northern blotting, dot blotting ou uma lâmina de vidro como empregado em hibridização in situ, incluindo FISH (hibridização in situ fluorescente)).

[068]Os sinais de controle transcricionais em eucariotos compreendem elementos "promotores" e "intensificadores". Promotores e intensificadores consistem em conjuntos curtos de sequências de DNA que interagem especificamente com proteínas celulares envolvidas na transcrição. Maniatis, T. e colaboradores, Science 236: 1237 (1987). Os elementos promotores e intensificadores foram isolados a partir de uma variedade de fontes eucarióticas incluindo genes em plantas, leveduras, insetos e células de mamíferos e vírus (elementos de controle análogos, isto é, promotores também são encontrados em procariotos). A seleção de um promotor e intensificador particular depende de qual tipo de célula deve ser usado para expressar a proteína de interesse.

[069]O termo "sítio poli A" ou "sequência poli A" como aqui usado denota uma sequência de DNA que direciona tanto a terminação quanto a poliadenilação da transcrição de RNA nascente. A poliadenilação eficiente da transcrição recombinante é desejável já que os transcritos com ausência de uma cauda poli A são instáveis e são rapidamente degradados. O sinal de poli A utilizado em um vetor de expressão pode ser "heterólogo" ou "endógeno". Um sinal de poli A endógeno é aquele que é encontrado naturalmente na extremidade 3' da região de codificação de um dado gene no genoma. Um sinal heterólogo de poli A é um que é isolado de um gene e colocado 3' de outro gene. A expressão eficiente de sequências de DNA recombinantes em células eucarióticas envolve a expressão de sinais que direcionam a terminação eficiente e a poliadenilação do transcrito resultante. Os sinais de terminação de transcrição são geralmente encontrados a jusante do sinal de poliadenilação e são de poucas centenas de nucleotídeos no comprimento.

[070]O termo "transfecção" ou "transfectado" refere-se à introdução de DNA estranho em uma célula.

[071]Como aqui usado, os termos "codificação de molécula de ácido nucleico", "codificação de sequência de DNA" e "codificação de DNA" referem-se à ordem ou sequência de desoxirribonucleotídeos ao longo de uma fita de ácido desoxirribonucleico. A ordem destes desoxirribonucleotídeos determina a ordem de aminoácidos ao longo da cadeia de polipeptídeo (proteína). A sequência de DNA codifica assim a sequência de aminoácidos.

[072]Conforme aqui usado, o termo "região de codificação", quando usado em referência a um gene estrutural, refere-se às sequências de nucleotídeos que codificam os aminoácidos encontrados no polipeptídeo nascente como resultado da tradução de uma molécula de mRNA. A região de codificação é ligada, em eucariotos, no lado 5' pelo tripleto de nucleotídeo "ATG" que codifica a metionina iniciadora e no lado 3' por um dos três tripletos que especificam códons de parada (isto é, TAA, TAG, TGA).

[073]Como aqui usado, o termo "gene estrutural" refere-se a uma sequência de DNA que codifica RNA ou uma proteína. Em contraste, "genes reguladores" são genes estruturais que codificam produtos que controlam a expressão de outros genes (por exemplo, fatores de transcrição).

[074]Como aqui usado, o termo "gene" significa as sequências de desoxirribonucleotídeo que compreendem a região de codificação de um gene estrutural e incluindo sequências localizadas adjacentes à região de codificação em ambas as extremidades 5' e 3' para uma distância de cerca de 1 kb em cada extremidade, de modo que o gene corresponda ao comprimento do mRNA de comprimento total. As sequências que estão localizadas 5' da região de codificação e que estão presentes no mRNA são referidas como sequências não traduzidas 5'. As sequências que estão localizadas 3' ou a jusante da região de codificação e que estão presentes no mRNA são referidas como sequências não traduzidas 3'. O termo "gene" abrange tanto o cDNA quanto as formas genômicas de um gene. Uma forma genômica ou clone de um gene contém a região de codificação interrompida com sequências não codificantes denominadas "íntrons" ou "regiões intervenientes" ou "sequências intervenientes". "Íntrons" são segmentos de um gene que são transcritos em RNA nuclear heterogêneo (hnRNA); os íntrons podem conter elementos reguladores tais como intensificadores. Os íntrons são removidos ou "spliced out" do transcrito nuclear ou primário, os íntrons, portanto, estão ausentes na transcrição do RNA mensageiro (mRNA). O mRNA funciona durante a tradução para especificar a sequência ou ordem de aminoácidos em um polipeptídeo nascente.

[075]Além de conter íntrons, as formas genômicas de um gene também podem incluir sequências localizadas em ambas as extremidades 5' e 3' das sequências que estão presentes na transcrição de RNA.

[076]Estas sequências são referidas como sequências ou regiões "flanqueadoras" (estas sequências flanqueadoras estão localizadas 5' ou 3' para as sequências não traduzidas presentes na transcrição de mRNA). A região flanqueadora 5' pode conter sequências reguladoras, tais como promotores e intensificadores que controlam ou influenciam a transcrição do gene. A região flanqueadora 3' pode conter sequências que direcionam o término da transcrição, a clivagem pós-transcrição e a poliadenilação.

[077]O termo "vetor viral" abrange qualquer construção de ácido nucleico derivada de um genoma de vírus capaz de incorporar sequências heterólogas de ácidos nucleicos para expressão em um organismo hospedeiro. Por exemplo, tais vetores virais podem incluir, mas não estão limitados a vetores virais adeno- associados, vetores lentivírus, vetores virais SV40, vetores retrovirais, vetores adenovirais.

[078]Embora os vetores virais sejam ocasionalmente criados a partir de vírus patogênicos, eles podem ser modificados de tal maneira a minimizar o seu risco global de saúde. Isto usualmente envolve a deleção de uma parte do genoma viral envolvido com replicação viral. Tal um vírus pode infectar eficientemente células, mas, uma vez que a infecção tenha ocorrido, o vírus pode requerer um vírus auxiliar para fornecer as proteínas perdidas para a produção de novos vírions. Preferivelmente, os vetores virais devem ter um efeito mínimo sobre a fisiologia da célula que ele infecta e exibe propriedades geneticamente estáveis (por exemplo, não sofrem rearranjo de genoma espontâneo). A maioria dos vetores virais é construída para infectar uma ampla faixa de tipos de células quanto possível. Mesmo assim, um receptor viral pode ser modificado para direcionar o vírus a um tipo específico de célula. Os vírus modificados desta maneira são referidos serem pseudotipados. Os vetores virais são frequentemente construídos para incorporar certos genes que ajudam a identificar que quais células trazem os genes virais. Estes genes são denominados genes marcadores. Por exemplo, um gene marcador comum confere resistência a antibiótico a um determinado antibiótico.

Breve Descrição das Figuras

[079]O arquivo desta patente contém pelo menos um desenho executado em cores. Cópias desta patente com desenhos coloridos serão fornecidas pelo Escritório de Patentes e Marcas, mediante solicitação e pagamento da taxa necessária.

[080]Figura 1 apresenta uma sequência representativa de um total, de comprimento completo, 145 nt Nme1Cas9 e Nme2Cas9 sgRNA.

[081]Figura 2 apresenta sequências de Nme1Cas9 sgRNA exemplares e a atividade de edição de gene associada tendo uma região de repetição: anti-repetição truncada ou uma região de Haste 2 truncada.

[082]Série de deleção/truncagem de Nme1Cas9 sgRNAs. Superior: sequências alinhadas, codificadas por cores como na Figura 1. Inferior: ensaios T7E1 de edição no sítio alvo de Nme1Cas9 7 (NTS7), usando os sgRNAs indicados como guias.

[083]Figura 3 apresenta sequências de Nme1Cas9 sgRNA exemplares e a atividade de edição de genes associada com uma região de repetição: anti-repetição truncada ou região de Haste 2 truncada. Os Nme1Cas9 sgRNAs mais curtos (# 10 - 101 nt; 24 nt de sequência guia; e # 11-100 nt; 23 nt de sequência guia) editam eficientemente três sítios alvos distintos (NTS7, NTS27 e NTS55) no genoma humano. Topo: sequências de sgRNAs do tipo selvagem e minimizados, utilizando o mesmo esquema de cor como nas figuras anteriores. Inferior: ensaios T7E1 de eficiência de edição nos três sítios alvos em células HEK293T.

[084]Figura 4 apresenta sequências exemplares (como estruturas secundárias) de Nme1Cas9 wt sgRNA, e sgRNAs truncados 11 e 12 e edição de gene associada para fornecimento de RNP de Nme1Cas9 e sgRNAs. Três sítios genômicos (N-TS72, N-TS55 e N-TS40), e um sítio repórter de luz de tráfego foram dirigidos no genoma humano utilizando células HEK293T. Superior: sequências mostradas como estruturas secundárias de sgRNAs do tipo selvagem e minimizados.

Inferior: as eficiências de edição medidas por ensaio T7E1 ou citometria de fluxo são representadas como gráficos de barra.

[085]Figura 5 apresenta a edição de genes em células PLB985 usando sgRNA 11 minimizado, e transcrição in vitro de wt sgRNA. Células foram transfectadas com complexos de RNP de Nme1Cas9 e sgRNAs e edição de genes no local genômico N-TS72 medido por TIDE.

[086]Figura 6 apresenta um esquema de uma modalidade de um vetor de AAV que compreende um complexo completo de edição de gene de CRISPR/Cas9.

Sequências representativas das várias regiões do vetor AAV são codificadas em cores no Apêndice 1.

[087] Figura 7 apresenta uma modalidade de uma sequência codificada por cores de RNA de guia de fita única Nme e promotor conforme representado na Figura 4, em que a cadeia principal é linearizada utilizando Sapl para inserir um espaçador alvo de 24-nt.

Promotor U6: Turquesa.

RNA guia de fita única Nme: Roxo Sítios de restrição SapI: Negrito

[088]Figura 8 apresenta uma modalidade de uma sequência codificada por cores de um Nme1Cas9 e promotor conforme representado na Figura 4, em que os Códons de Início e de Parada sublinhados em negrito.

Promotor de U1a: Azul Sequência de Kozak: Cinza Nme1Cas9 humanizado: Vermelho SV40 NLS: Verde Nucleoplasmina (NP) NLS: Amarela Etiquetas HA (3X): Laranja em Negrito NLS Sintético: Turquesa Sinal de poliadenilação de Beta-globina: Azul-Petróleo

[089]Figura 9 apresenta dados exemplares que mostram a eficiência de edição de vários sítios alvo utilizando os plasmídeos de AAV com construções sgRNA-Nme1Cas9 guiados para o gene pcsk9 ou o gene Rosa26 (controle).

[090]Figura 10 apresenta uma modalidade de sequências de sítio alvo codificadas por cores para construções de sgRNA-Nme1Cas9 guiadas para um gene Pcsk9 ou gene Rosa26 (controle).

24 -nt Nme1Cas9-espaçador alvo, azul em negrito Nme1Cas9 PAM sublinhado [NNNNGATT) Sítios de ligação de iniciadores T7E1: verde itálico

Sítios de ligação iniciadores de TIDE: roxo itálico

[091] Figura 11 apresenta dados exemplares que mostram a eficiência de edição de genes seguindo-se a injeção hidrodinâmica in vivo pela veia de cauda de camundongo de 30 μg de plasmídeo direcionado para Pcsk9 sgRNA-Nme1Cas9-AAV livre de endotoxina.

[092]Figura 12A apresenta dados exemplares que mostram a eficiência de edição de genes no fígado no gene Pcsk9 e no gene Rosa26 por vetor Nme1-Cas9 embalado em sorotipo AAV8 específico de hepatócitos, em uma dose de 4x10 11 cópias genômicas (gc) por camundongo 14 dias pós-administração do vetor. Figura 12B apresenta dados exemplares que mostram a eficiência de edição de genes no fígado em gene Pcsk9 e gene Rosa26 por um vetor Nme1-Cas9 embalado em sorotipo AAV8 específico de hepatócitos, em uma dose de 4x10 11 cópias genômicas (gc) por camundongo 50 dias pós-administração do vetor.

[093] Figura 13 apresenta dados exemplares que mostram a redução nos níveis de colesterol do camundongo após a injeção de vetores sgRNA-Cas9-AAV que objetivam um gene Pcsk9, um gene Rosa26 e um grupo controle de PBS a 0,25 e 50 dias.

[094]Figuras 14A e 14B apresentam dados exemplares que mostram uma identificação sem desvio de genoma-largo de quebras de fita dupla (DSBs) possibilitadas por um ensaio de sequenciamento (por exemplo, GUIDE-Seq) que pesquisou para os sítios de edição fora de alvos tanto para a Pcsk9-sgRNA-Cas9- AAV (A) e a Rosa26-sgRNA-Cas9-AAV (B).

[095]Figura 15 apresenta dados exemplares que mostram análises de TIDE alvo em camundongos 14 dias após a injeção tanto da Pcsk9-sgRNA-Cas9-AAV e a Rosa26-sgRNA-Cas9-AAV que revelou uma clivagem mínima. OnT, local no-alvo; OT1, OT2 etc. sítios fora do alvo.

[096]Figura 16 apresenta dados exemplares que mostram um ensaio de coloração hematoxilina e eosina nas seções hepáticas de camundongos sacrificados no dia 14 subsequentemente à injeção de vetores que alvejam o gene Pcsk9 e um gene Rosa26. Nenhuma evidência para uma resposta imune hospedeira é observada.

[097]Figura 17 ilustra uma modalidade de um fluxo de trabalho de identificação de biblioteca de PAM in vitro. NGS, sequenciamento de próxima geração.

[098]Figura 18 apresenta uma sequência putativa de um ensaio de descoberta de PAM in vitro representado na Figura 17. Cas9 recombinantemente purificado de cada bactéria foi incubado com um sgRNA e um alvo com PAM randomizado. Nme1Cas9 foi usado como um controle.

[099]Figura 19 apresenta dados exemplares que mostram a edição percentual do genoma em um único local (painel superior) no genoma humano em células HEK293T. As percentagens mostram a formação indel estimada usando um ensaio De endonuclease T7E1 (Nme2Cas9, HpaCas9) ou um ensaio fluorescente (para SmuCas9) com base no repórter de "luz de tráfego" integrado no genoma de células HEK293T.

[0100]Figura 20 apresenta dados exemplares que mostram a edição do genoma em células HEK293T de um repórter de luz de tráfego integrado com Nme2Cas9 objetivando vários protoespaçadores com várias PAMs (Eixo X). Os resultados sugerem um PAM de NNNNCC preferido para Nme2Cas9 em células humanas.

[0101]Figura 21 apresenta dados exemplares que mostram a edição do genoma em células HEK293T na presença de várias proteínas anti-CRISPR (Acr). A digestão de T7E1 mostra a edição do genoma após a transfecção de plasmídeo (para expressar Nme2Cas9 e seu sgRNA) ou distribuição de RNA/proteína (HpaCas9 e seu sgRNA). Nme2Cas9 é robustamente inibido por duas proteínas Acr (AcrIIC3 Nme e AcrIIC4Hpa), enquanto HpaCas9 é inibida por quatro do Acrs do tipo II-C previamente reportado. Estes resultados mostram que estas duas proteínas Cas9 são submetidas ao controle “off-switch” por anti-CRISPRs.

[0102]Figura 22 apresenta dados de exemplo de edição de gene de repórter de luz de tráfego (TLR) utilizando o complexo Nme2Cas9-sgRNA em dinucleotídeo PAMs "CC". Figura 22A. Barras azuis são a % de células que exibem fluorescência, enquanto barras vermelhas indicam % de edição com base mais precisamente no sequenciamento ("análise de TIDE").

[0103]Figura 23 apresenta dados exemplares de edição de genes por Nme2Cas9 utilizando ensaios T7E1 no local AAVS1, cromossomo 14 NTS4, loci VEGF e CFTR.

[0104]Figura 24 apresenta uma modalidade de uma sequência de DNA de quadro de leitura aberta bacteriana Nme2Cas9 tipo selvagem.

[0105]Figura 25 apresenta uma modalidade de uma sequência de proteína bacteriana Nme2Cas9 do tipo selvagem.

[0106] Figura 26 apresenta uma modalidade de uma sequência de DNA de quadro de leitura aberta otimizada por códon humano Nme2Cas9. Amarelo - SV40 NLS; Verde - 3X-HA-Tag; Azul: cMyc-tipo NLS.

[0107]Figura 27 apresenta uma modalidade de uma sequência de proteína humanizada Nme2Cas9. Amarelo-SV40 NLS, Verde - 3X-HA-Tag; Azul; cMyc-tipo NLS.

[0108]Figura 28 apresenta uma modalidade de uma sequência de proteína bacteriana de HpaCas9.

[0109] Figura 29 apresenta uma modalidade de uma sequência de DNA de quadro de leitura aberta bacteriana nativa de SmuCas9.

[0110] Figura 30 apresenta uma modalidade de uma sequência de proteína bacteriana SmuCas9.

[0111] Figura 31 apresenta uma modalidade de uma sequência de DNA de quadro de leitura aberta otimizada por códon humano SmuCas9. Amarelo - SV40 NLS; Verde - 3X-HA-Tag; Azul: cMyc-tipo NLS.

[0112]Figura 32 apresenta uma modalidade de uma sequência de proteína humanizada SmuCas9. Amarelo - SV40 NLS; Verde - 3X-HA-Tag; Azul: cMyc-tipo NLS.

[0113]Figura 33 apresenta sequências de RNA guia de fita única Tipo-II C Cas9 ortólogos compatíveis com PAMs ricas em C curtos. Amarelo - crRNA; Cinza - Ligador; Roxo - tracrRNA.

[0114]Figura 34 ilustra três ortólogos de Neisseria meningitidis Cas09 intimamente relacionados que têm PAMs distintas.

[0115]Figura 34A: Esquema mostrando resíduos mutados (esferas laranja) entre Nme2Cas9 (esquerda) e Nme3Cas9 (direita) mapeados na estrutura predita de Nme1Cas9, revelando o agrupamento de mutações no PID (preto).

[0116]Figura 34B: fluxo de trabalho experimental do ensaio de descoberta de PAM in vitro com uma sequência de PAM randomizada de 10 nt a jusante de um protoespaçador. Os adaptadores foram ligados ao produto clivado e sequenciados.

[0117]Figura 34C: Sequência logos do ensaio de descoberta de PAM in vitro demonstrando um N4GATT PAM para Nme1Cas9, como mostrado previamente em células.

[0118]Figura 34D: Sequência logos mostrando Nme1Cas9 com seu PID trocado com aqueles de Nme2Cas9 (esquerda) e Nme3Cas9 (direita) reconhecem um C na posição.

[0119] 5. Os nucleotídeos restantes foram determinados com confiança inferior devido à eficiência de clivagem modesta das quimeras de proteína (Figura 35C).

[0120]Figura 34E: Sequência logo ilustrando que Nme2Cas9 de comprimento total reconhece um PAM de N4CC com base no ensaio de descoberta de PAM com um C fixo na posição 5, e PAM nts 1-4 e 6-8 randomizados.

[0121]Figura 35 mostra uma caracterização de Neisseria meningitidis Cas9 ortólogos com PIDs que evoluem rapidamente de acordo com a Figura 34.

[0122] Figura 35A: árvore filogenética não enraizada de ortólogos NmeCas9 que são > 80% idênticas a Nme1Cas9. Três ramificações distintas surgiram, com a maioria das mutações agrupadas no PID. Grupo 1 (azul) PIDs com >98% de identidade a Nme1Cas9, grupo 2 (laranja) com PIDs ~ 52% idêntico a Nme1Cas9, e grupo 3 (verde) com PIDs ~ 86% idêntico a Nme1Cas9. Três ortólogos de Cas9 representativos de cada grupo (Nme1Cas9, Nme2Cas9 e Nme3Cas9) são marcados.

[0123]Figura 35B: Esquema mostrando o loci CRISPR de cepas codificando os três ortólogos Cas9 (Nme1Cas9, Nme2Cas9, e Nme3Cas9) de (A), Percentuais de identidades de cada componente CRISPR-Cas para N. meningitidis 8013 (codificando Nme1Cas9) são mostrados.

[0124]Figura 35C: Número de leituras para DNAs clivados a partir dos ensaios in vitro para Nme1Cas9 intacto, e para quimeras com PID do Nme1Cas9 trocada com aqueles de Nme2Cas9 e Nme3Cas9. A contagem de leitura reduzida indica eficiências de clivagem inferior em quimeras.

[0125]Figure 35D; Sequência logos a partir do ensaio de descoberta de PAM in vitro em um PAM NNNNCNNN randomizado por Nme1Cas9 com seu PID trocado com aqueles de Nme2Cas9 (esquerda) ou Nme3Cas9 (direita).

[0126]Figura 36 mostra que o Nme2Cas9 usa um espaçador de 22-24 nucleotídeos para reconhecer e editar sítios adjacentes a um N4CC de PAM. Todas as experiências foram realizadas em triplicata, e as barras de erro representam erro padrão de média (s.e.m.).

[0127]Figura 36A: Esquema mostrando o fluxo de trabalho de transfecção transiente em células HEK293T TLR2.0. Os plasmídeos Nme2Cas9 e sgRNA foram transfectados e células mChery+ foram detectadas 72 horas após a transfecção.

[0128]Figura 36B: Usando Nme2Cas9 para direcionar um conjunto de PAMs em TLR2.0. Todos os sítios com PAMs N4CC foram dirigidos com graus variados de eficiência, enquanto nenhum alvo Nme2Cas9 observado em um PAM N4GATT ou na ausência de sgRNA. SpyCas9 (direcionamento para NGG) e Nme1Cas9 (direcionamento para N4GATT) foram usados como controles positivos.

[0129]Figura 36C: O efeito do comprimento do espaçador sobre a eficiência da edição Nme2Cas9. Um sgRNA objetivando um sítio de TLR2.0 (com um PAM de N4CCA) com comprimentos de espaçador variando de 24 a 20 nts (incluindo um 5'- terminal G), mostrando eficiências de edição mais altas com espaçadores de 22-24 nucleotídeos.

[0130] Figura 36D: Nme2Cas9 nickases (HNH nickase = Nme2Cas9 D16A; RuvC nickase = Nme2Cas9H588A) pode ser usado em tandem para gerar indels em TLR2.0. Alvos com sítios de clivagem de 32 pares de bases e 64 pares de bases separados utilizando-se ambos nickase para gerar indels. A KNH nickase mostra uma edição eficiente, particularmente quando os sítios de clivagem foram fechados (32 bp). O Nme2Cas9 do tipo selvagem foi usado como um controle. Verde é GFP (HDR) e vermelho é mCherry (NBEJ).

[0131]Figura 37 apresenta os dados exemplares com relação aos elementos de PAM, espaçador, e semente para o direcionamento de Nme2Cas9 em células de mamíferos, de acordo com a Figura 36. Todas os experimentos foram realizados em triplicata e as barras de erro representam s.e.m.

[0132] Figura 37A: o direcionamento de Nme2Cas9 em sítios N4CD em TLR2.0. Quatro sítios para cada nucleotídeo não-C na posição testada (N4CA, N4CT e N4CG) foram examinados, e um sítio N4CC foi usado como um controle positivo.

[0133]Figura 37B: o direcionamento de Nme2Cas9 em sítios N 4DC em TLR2.0 [similar a (A)].

[0134]Figura 37C: truncagem de outro sítio de TLR2.0, revelando exigências de comprimento similares àquelas observadas na Figura 36C.

[0135]Figura 37D: eficiência de direcionamento de Nme2Cas9 é sensível de forma diferencial aos desemparelhamentos de um único nucleotídeo na sequência de sementes. Os dados mostram os efeitos dos desemparelhamentos de um único nucleotídeo no sgRNA ao longo do espaçador de 23-nt em um sítio alvo TLR.

[0136]Figura 38 apresenta dados exemplares que mostram a eficiência de edição do genoma Nme2Cas9 em locais genômicos em células de mamíferos através de métodos de distribuição múltipla. Todos os resultados representam 3 réplicas biológicas independentes, e barras de erro representam s.e.m.

[0137] Figura 38A: edição do genoma Nme2Cas9 utilizando transfecções transitórias com sgRNAs direcionamento os locais em todo o genoma humano em células HEK293T, 14 sítios foram selecionados com base na triagem inicial de 38 sítios para demonstrar a faixa de indels (como detectado por TIDE) em loci diferentes induzidos por Nme2Cas9. Um sítio alvo Nme1Cas9 (com PAM N4GATT) foi usado como um controle negativo.

[0138]Figura 38B: painel esquerdo: Transfecção transitória de um plasmídeo “all-in-one” (Nme2Cas9 + sgRNA) direcionamento os loci Pcsk9 e Rosa26 em células de camundongo Hepa 1-6, como detectado por TIDE. Painel direito: Eletroporação de plasmídeos de sgRNA em células K562 estavelmente expressando Nme2Cas9 a partir de um lentivetor resulta em uma formação de indel eficiente nos loci pretendidos.

[0139]Figura 38C: Nme2Cas9 pode ser eletroporada como um complexo de RNP para a edição eficiente do genoma. 40 picomoles Cas9 junto com 50 picomoles de sgRNAs transcritos in vitro que alvejam três diferentes locais foram eletroporados em células HEK293T. Indels foram medidas usando-se o TIDE após 72h.

[0140]Figura 39 apresenta dados exemplares que mostram dependência de dose e eliminações de blocos por Nme2Cas9, de acordo com a Figura 38.

[0141] Figura 39A: aumento da dose de plasmídeo Nme2Cas9 eletroporado (500 ng, vs 200 ng na Figura 3A) melhora a eficiência de edição em dois sítios (TS16 e TS6).

[0142]Figura 39B: Nme2Cas9 pode ser usado para criar eliminações de bloco. Dois alvos de TLR2.0 com sítios de clivagem de 32 bp separados foram dirigidos simultaneamente com Nme2Cas9. A maioria das lesões criadas foram exatamente deleções de 32 pb (verde).

[0143]Figura 40 apresenta dados exemplares que mostram que as proteínas Anti-CRISPR do Tipo II-C podem ser usadas para inibir a atividade de edição do gene

Nme2Cas9 (por exemplo, como um “off-switch”) in vitro e in vivo. Todas as experiências foram realizadas em triplicata e as barras de erro representam s.e.m.

[0144] Figura 40A: ensaio de clivagem in vitro de Nme1Cas9 e Nme2Cas9 na presença de cinco proteínas anti-CRISPR previamente caracterizadas (razão de 10:1 de Acr:Cas9). Superior: Nme1Cas9 cliva eficientemente um fragmento contendo um protoespaçador com um PAM N4GATT na ausência de um vírus Acr ou na presença de um controle Acr (AcrE2). Todos os outros Acrs previamente caracterizados inibiram Nme1Cas9, como esperado. Inferior: Nme2Cas9 cliva eficientemente um alvo contendo um protoespaçador com um PAM N4CC na presença de AcrE2 e AcrIIC5Smu, sugerindo que AcrIIC5Smu é incapaz de inibir Nme2Cas9 a uma proporção molar de 10:1.

[0145] Figura 40B: edição do genoma na presença das cinco proteínas anti- CRISPR previamente descritas. Os plasmídeos que expressam Nme2Cas9, sgRNA e cada Acr respectivo (200 ng de Cas9, 100 ng de sgRNA, 200 ng de Acr) foram co- transfectados em células HEK293T, e a edição do genoma foi medida usando-se o TIDE 72 h após a transfecção. Exceto para AcrE2 e AcrIIC5Smu, todos os outros Acrs inibiram a edição do genoma, embora em diferentes eficiências.

[0146]Figura 40C: inibição Acr de Nme2Cas9 é dependente da dose com potências aparentes distintas. AcrIIC1Nme e AcrIIC4Hpa inibem Nme2Cas9 completamente as razões de 2:1 e 1:1 de plasmídeos co-transfectados, respectivamente.

[0147]Figura 41 apresenta dados exemplares que mostram que troca de Nme2Cas9 PID torna Nme1Cas9 insensível à Inibição de AcrIIC5Smu, de acordo com a Figura 40. A clivagem in vitro pela quimera Nme1Cas9-Nme2Cas9PID foi realizada na presença de proteínas Acr previamente caracterizadas (10 uM Cas9-sgRNA + 100 uM Acr).

[0148]Figura 42 apresenta dados exemplares que mostram que Nme2Cas9 não tem nenhum fora de alvo detectável em células de mamíferos.

[0149]Figura 42A: Esquema mostrando os sítios duplos (DS) direcionáveis tanto por SpyCas9 quanto Nme2Cas9 em virtude de seus PAMs não sobrepostos. O PAM Nme2Cas9 (laranja) e PAM SpyCas9 (azul) são realçados.

[0150]Figura 42B: Nme2Cas9 e SpyCas9 induzem indels em sítios duplos.

Seis sítios duplos em VEGFA com sequências de GN3GN19NGGNCC foram selecionados para comparações diretas entre os dois ortólogos. Os plasmídeos que expressam cada Cas9 (com o mesmo promotor e NLSs) foram transfectados juntamente com cada guia cognato do ortólogo em células HEK293T. As taxas de indel foram determinadas pelo TIDE 72 h da pós-transfecção. A edição de Nme2Cas9 foi detectável em todos os seis sítios e era mais eficiente que SpyCas9 em dois sítios (DS2 e 6). SpyCas9 editada quatro de seis sítios (DS1, 2, 4 e 6), com dois sítios apresentando taxas de edição significativamente mais altas do que Nme2Cas9 (DS1 e 4). DS2, 4 e 6 foram selecionados para análise GUIDE-Seq como Nme2Cas9 era igualmente eficiente, menos eficiente e mais eficiente do que SpyCas9 nestes sítios, respectivamente.

[0151]Figura 42C: Nme2Cas9 tem um perfil fora de alvo limpo em células humanas.

[0152]Números de sítios fora-alvo detectados por GUIDE-Seq para cada nuclease em sítios alvo individuais são mostrados. Números fora de alvo SpyCas9 são mostrados em preto. Em adição a sítios duplos, TS6 (devido à sua alta eficiência e potencial para fora de alvos) e dois sítios de camundongos (para testar a precisão em um outro tipo de célula) também mostrou zero ou um local fora-alvo por guia.

[0153]Figura 42D: Sequenciamento profundo direcionado confirma a alta precisão Nme2Cas9 indicada por GUIDE-seq. Os locais fora-alvo acima detectados por GUIDE-seq foram amplificados e sequenciados profundos. SpyCas9 mostrou auto-direcionamento na maioria dos loci, enquanto para Nme2Cas9, somente um (o sítio Rosa26) mostrou a edição no local fora de alvo em níveis relativamente baixos (~40% no alvo vs ~1% fora de alvo). Observar a escala logarítmica sobre o eixo y.

[0154]Figura 42E: As eficiências de Nme2Cas9 e SpyCas9 variam com base no local e no sítio alvo. Os sítios em todo o genoma (com sequências GN3GN19NGGNCC) foram selecionados para comparações diretas de edição pelos dois ortólogos. Os plasmídeos que expressam cada Cas9 (com o mesmo promotor, ligantes, etiquetas e NLSs) e sua guia cognata foram transfectados em células HEK293T. As eficiências de indel foram determinadas por TIDE 72 horas pós- transfecção. Os gráficos “Box-and-whisker” indicam eficiências de edição em sítios duplos de vinte e oito (28) por Nme2Cas9 e SpyCas9 (esquerda). Os sítios que não mostraram nenhuma edição foram excluídos da análise. Eficiências relativas de Nme2Cas9 e SpyCas9 mostram que Nme2Cas9 é menos eficiente do que SpyCas9 (direita), em média. Edição de eficiências de ambos os ortólogos Cas9 em todos os vinte e oito (28) sítios foram incluídos na análise de eficiências relativas no painel direito.

[0155]Figura 42F apresenta sequências de ácidos nucleicos para o sítio fora de alvo validado da guia Rosa26, mostrando a região de PAM (sublinhada), o consenso CC de PAM dinucleotídeo (negrito), e três desemparelhamentos na porção distal de PAM do espaçador (vermelho).

[0156]Figura 43 apresenta dados exemplares que mostram a ortogonalidade e a precisão relativa de Nme2Cas9 e Spyas9 em sítios alvos duplos, de acordo com a Figura 42.

[0157] Figura 43A: guias Nme2Cas9 e SpyCas9 são ortogonais. Os resultados de TIDE mostram as frequências de indels criadas por ambas as nucleases que direcionam DS12 tanto com seus sgRNAs cognatos, quanto com os sgRNAs do outro ortólogo.

[0158]Figura 43B: Nme2Cas9 e SpyCas9 apresentam eficiências de edição no-alvo comparáveis durante o GUIDE-seq. Barras indicam contagens de leitura no- alvo de GUIDE-seq nos três sítios duplos dirigidos por cada ortólogo. Barras laranja representam Nme2Cas9 e barras pretas representam SpyCas9.

[0159] Figura 43C: As leituras no-alvo versus fora de alvo de SpyCas9 para cada sítio. Barras laranja representam as leituras no-alvo enquanto barras pretas representam fora-alvos.

[0160]Figura 43D: Leitura no-alvo vs fora de alvo de Nme2Cas9 para cada sítio.

[0161]Fig. 43E: Gráficos de barra que mostram o TIDE em sítios fora-alvo esperados com base em CRISPRseek, não detectando indels no loci fora de alvo.

[0162]Figura 44 apresenta dados exemplares que mostram a edição do genoma de Nme2Cas9 in vivo por meio de uma distribuição AAV “all-in-one”.

[0163]Figura 44A: Fluxo de Trabalho para distribuição de AAV8.Nme2Cas9 + sgRNA para diminuir os níveis de colesterol em camundongos por direcionamento Pcsk9. Superior: esquema do vetor de AAV “all-in-one” que expressa Nme2Cas9 e sgRNA. Inferior: Linha de Tempo para as injeções de veia da cauda AAV8.Nme2Cas9 + sgRNA, seguido por medições de colesterol no dia 14 e análise indel, de histologia e colesterol no dia 28.

[0164]Figura 44B: análise de sequenciamento profundo para medir indels em DNA extraído de fígados de camundongos injetados com AAV8.Nme2Cas9 + sgRNA alvo Pcsk9 e Rosa26 (controle).

[0165] Figura 44C: níveis reduzidos de colesterol de soro em camundongos injetados com a guia de direcionamento de Pcsk9 comparado com os controles de direcionamento de Rosa26. Valores de P são calculados por teste T não pareado.

[0166]Figura 44D: Coloração H&E de fígados de camundongos injetados com vetores AAV8.Nme2Cas9+sgRosa26 (esquerdo) ou AAV8.Nme2Cas9+sgPcsk9 (direito). Barra de escala, 25 um.

[0167]Figura 45 apresenta uma modalidade de uma cadeia principal de AAV minimizada e dados comparativos de TLR 2.0 exemplares para a cadeia principal de AAV de tamanho convencional.

[0168]Figura 46 apresenta uma comparação de estruturas Nme2Cas9 de sgRNA truncado 11 com sgRNA truncado 12.

[0169] Figura 47 ilustra uma modalidade de um AAV “all-in-one” mínimo com um sinal de poliA curto.

[0170]Figura 48 ilustra duas modalidades de uma cadeia principal de AAV “all-in-one” minimizada. sgRNAs duplos em tandem (Top). Gabarito doador para reparo dirigido por homologia (Inferior).

[0171] Figura 49 apresenta uma validação de uma construção AAV-sgRNA- hNme1Cas9 “all-in-one”.

[0172] Figura 49A: representação esquemática de um único vetor rAAV que expressa códon-humano Nme1Cas9 otimizado e seu sgRNA. A cadeia principal é flanqueada por repetições terminais invertidas de AAV (ITR). O sinal de poli (a) é de beta-globina de coelho (BGH).

[0173] Figura 49B: Diagrama esquemático dos genes de camundongo Pcsk9 (superior) e Rosa26 (inferior). Barras vermelhas representam éxons. Vistas em aumento mostram a sequência de protoespaçador (vermelho), enquanto a sequência de PAM Nme1Cas9 é realçada em verde. Os sítios de localização de ruptura de fita dupla são denotados (setas pretas).

[0174]Figura 49C: Histograma sobreposto mostrando uma distribuição percentual representativa de inserções-eliminações (indels) obtidas por TIDE após transfecções de plasmídeo AAV-sgRNA-hNme1Cas9 em células Hepal 1-6 direcionando genes Pcsk9 (sgPcsk9) e Rosa26 (sgRos26). Os dados são apresentados como valores médios ± SD a partir de três réplicas biológicas.

[0175]Figura 49D: Histograma sobreposto mostrando uma distribuição percentual representativa de indels em Pcsk9 no fígado de camundongos C57Bl/6 obtidos por TIDE após a injeção hidrodinâmica de plasmídeo AAV-sgRNA- hNme1Cas9.

[0176]Figura 50 apresenta dados exemplares que mostram que muitos PAMs N4GN3 são inativos, e não revelaram sítios não-alvos com menos de quatro desemparelhamentos no genoma do camundongo.

[0177]Figura 51 apresenta dados exemplares que mostram que o nocaute mediado por Nme1Cas9 de Hpd resgata o fenótipo letal em camundongos tirosinemia hereditárias Tipo I.

[0178]Figura 51A: diagrama esquemático do gene de camundongo Hpd.

Barras vermelhas representam éxons. Vistas em aumento mostram as sequências protoespaçadoras (vermelho) para direcionar o éxon 8 (sgHpd1) e o éxon 11 (sgHpd2). As sequências de PAM Nme1Cas9 estão verde e locais de ruptura de fita dupla são indicadas (setas pretas).

[0179]Figura 51B: Projeto Experimental. Três grupos de camundongos Tirosinemia Hereditária Tipo I Fah-/- são injetados com PBS ou plasmídeos sgHpd1 ou sgHpd2 AAV-sgRNA-hNme1Cas9 “all-in-one”.

[0180]Figura 51C: Peso de camundongos injetados hidrodinamicamente com PBS (verde), AAV-sgRNA-hNme1Cas9 plasmídeo sgHpd1 direcionado a Hpd éxon 8 (vermelho) ou sgHpd2-direcionando Hpd éxon 11 (azul) foram monitorados após retirada de NTBC. Barras de erro representam três camundongos para grupos PBS e sgHpd1 e dois camundongos para o grupo sgHpd2. Os dados são apresentados como média ± SD.

[0181] Figura 51D: Histograma sobreposto que mostra uma distribuição percentual representativa de indels em Hpd no fígado de camundongos Fah-/- obtidos por TIDE após a injeção hidrodinâmica de PBS ou plasmídeos sgHpd1 e sgHpd2. Os fígados foram coletados no final da retirada de NTBC (dia 43).

[0182]Figura 52 apresenta dados exemplares que mostram as eficiências médias de indel das guias apresentadas na Figura 51.

[0183] Figura 53 apresenta fotomicrografias histológicas exemplares que mostram que o dano do fígado é substancialmente menos severo nos camundongos tratados com sgHpd1 e sgHpd2 comparados com camundongos Fahmut/mut injetados com PBS, conforme indicado pelos números menores de hepatócitos multinucleados comparados com camundongos injetados com PBS.

[0184]Figura 54 apresenta a distribuição de AAV de Nme1Cas9 para a edição de genoma in vivo.

[0185]Figura 54A: perfil experimental de injeções na veia da cauda de vetor AAV8-sgRNA-hNme1Cas9 para tratar Pcsk9 (sgPcsk9) e Rosa26 (sgRos26) em camundongos C57Bl/6. Os camundongos foram sacrificados em 4 (n = 1) ou 50 dias (n = 5) pós-injeção e tecidos de fígado foram coletados. Os soros de sangue foram coletados nos dias 0, 25 e 50 após a injeção para a medição do nível de colesterol.

[0186]Figura 54B: níveis de colesterol no soro, valores p são calculados por teste t não pareado.

[0187]Figura 54C: Histograma sobreposto que mostra uma distribuição percentual representativa de indels em Pcsk9 ou Rosa26 em fígados de camundongos, conforme medido por análises de sequenciamento profundo direcionadas. Os dados são apresentados como média ± SD a partir de cinco camundongos por grupo.

[0188] Figura 54D: um western blot anti-PCSK9 representativo utilizando proteína total coletada a partir de homogenatos do fígado de camundongos de 50 dias. Um total de 2 ng de PCSK9 de camundongo recombinante (r-PCSK9) foi incluído como um padrão de mobilidade. O asterisco indica uma proteína de reação cruzada que é maior do que a proteína recombinante controle.

[0189]Figura 55 apresenta dados exemplares que mostram que os camundongos injetados com AAV8-sgRNA-hNme1Cas9 geram anticorpos anti- Nme1Cas9.

[0190] Figura 56 apresenta dados exemplares que mostram especificidades de amplo genoma GUIDE-seq de Nme1Cas9. Os dados são apresentados como média ± SD.

[0191] Figura 56A: Número de leituras de GUIDE-seq para os sítios no alvo (OnT) e fora do alvo (OT).

[0192]Figura 56B: Sequenciamento profundo direcionado para medir as taxas de lesões em cada um dos sítios OT em células Hepa 1-6. Os desemparelhamentos de cada sítio OT com os protoespaçadores OnT são realçados (azul). Os dados são apresentados como média ± SD a partir de três replicatas biológicas.

[0193]Figura 56C: Sequenciamento profundo direcionado para medir as taxas de lesões em cada um dos sítios OT usando DNA genômico obtido de camundongos injetados com AAV8-sgRNA-hNme1Cas9 “all-in-one” sgPcsk9 e sgRos26 e sacrificados no dia 14 (D14) ou dia 50 (D50) pós-injeção.

[0194] Figura 57 apresenta dados exemplares para a edição de gene Tyrosinase (Tyr) ex vivo por Nme2Cas9 em zigotos de camundongo, conforme relacionado à Figura 58.

[0195]Figura 57A: Dois sítios em gene Tyr, cada um com N4CC PAMs, foram testados para edição em células Hepa 1-6. A guia sgTyr2 exibiu eficiência de edição mais elevada e foi selecionada para testes adicionais.

[0196]Figura 57B: Sete camundongos sobreviveram após o desenvolvimento pós-natal, e cada um exibiu fenótipos de cor de revestimento assim como a edição no-alvo, conforme avaliado por TIDE.

[0197] Figura 57C: Espectro Indel a partir da cauda de DNA de cada camundongo da Figura 57B, bem como um camundongo C57BL/6NJ não editado, conforme indicado por análise de TIDE.

[0198]Eficiências de inserções (positivas) e eliminações (negativas) de vários tamanhos são indicadas.

[0199]Figura 58 apresenta dados exemplares de edição de genoma de Nme2Cas9 ex vivo utilizando uma distribuição de AAV “all-in-one”.

[0200]Figura 58A: Fluxo de Trabalho para a edição única-AAV Nme2Cas9 ex vivo para gerar camundongos C57BL/6NJ albino pelo direcionamento do gene Tyr.

Os zigotos são cultivados em KSOM contendo AV6.Nme2Cas9: sgTyr por 5-6 horas, lavados em M2, e cultivados por um dia antes de serem transferidos para o oviduto de receptoras pseudo-grávidas.

[0201]Figura 58B: Camundongos albino (esquerda) e chinchila ou variegado (meio) gerados por 3 x 109 GCs, e camundongos chinchila ou variegado (direita) gerados por 3 x 108 GCs de zigotos com AAV6.Nme2Cas9: sgTyr.

[0202]Figura 58C: Resumo de experimentos de edição de Nme2Cas9.sgTyr único-AAV ex vivo Tyr em duas doses de AAV.

[0203]Figura 59 mostra um alinhamento de sequências de nucleotídeos Nme1Cas9 e Nme2Cas9 .

[0204]Legenda: diferenças de Não-PID aa (sombreamento turquesa); diferenças PID aa (sombreamento amarelo); resíduos de sítio ativo (letras vermelhas).

[0205]Figura 60 mostra um alinhamento de sequências de nucleotídeos Nme1Cas9 e Nme3Cas9.

[0206] Legenda: diferenças de não-PID aa (sombreamento turquesa); diferenças de PID aa (sombreamento amarelo); resíduos de sítio ativo (letras vermelhas).

[0207]Figura 61 mostra uma modalidade de uma sequência aminoácida de Nme2Cas9. Legenda: SV40 NLS (sombreamento amarelo); 3X-HA-Tag (sombreamento verde); NLS tipo cMyc (sombreamento turquesa); Ligante (sombreamento púrpura).

[0208]Figura 62 mostra uma modalidade de uma sequência de Nme2Cas9 aminoácidos. Legenda: SV40 NLS (sombreamento amarelo); 3X-HA-Tag (sombreamento verde); NLS tipo nucleoplasmina (sombreamento vermelho); c-myc NLS (sombreamento turquesa); Ligador (sombreamento roxo).

[0209]Figura 63 mostra uma modalidade de uma sequência de aminoácidos Nme2Cas9 (rNme2Cas9) recombinante. Legenda: SV40 NLS (sombreamento amarelo), NLS tipo nucleoplasmina (sombreamento vermelho); Ligador (sombreamento roxo).

[0210]Figura 64 mostra uma modalidade de uma sequência de nucleotídeos do plasmídio de AAV-sgRNA-hNmeCas9 “all-in-one”. Legenda: estrutura sgRNA

(letras marrons), sequência GUIDE (letras pretas); promotor U6 (letras azuis); promotor de U1a (letras roxas): NLS NLS (letras verdes); hNmeCas9 (letras vermelhas), NLS 3X-HA e NLS BGH-pA (letras verde/preta alternadas).

Descrição Detalhada da Invenção

[0211]A presente invenção refere-se a composições e métodos para terapia de genes. Várias abordagens aqui descritas utilizam o sistema Neisseria meningitidis Cas9 que proporciona uma plataforma de edição de gene de CRISPR hiperacurada.

Além disso, a invenção incorpora aperfeiçoamentos deste sistema Cas9: por exemplo, truncar as sequências guias de RNA fita simples, e o empacotamento de- Nme1Cas9 ou Nme2Cas9 com seu RNA guia em um vetor viral adeno-associado que é compatível para administração in vivo. Além disso, os ortólogos Cas9 Tipo II-C foram identificados com sequências de motivo adjacentes de protoespaçador alvo limitadas a entre um e quatro nucleotídeos requeridos.

I. Acurácia da Edição Gênica Neisseria meningitidis Cas9 (Nme1Cas9)/

CRISPR

[0212]Previamente, uma versão hiper-precisa de sistemas de CRISPR-Cas9 Tipo II-C denominada Neisseria meningitidis Cas9 (Nme1Cas9) foi relatada. Além de ser hiper-precisa, Nme1Cas9 é também menor do que os Streptococcus pyogenes Cas9 (SpyCas9) amplamente usados, permitindo que Nme1Cas9 seja liberado mais facilmente através de métodos baseados em RNA viral e mensageiro (mRNA). A edição do genoma com Nme1Cas9 tipicamente tem sido realizada usando transfecções de plasmídeo. Zhang e colaboradores., “Processing-independent CRISPR RNAs limit natural transformation in Neisseria meningitidis” Mol Cell 50:488- 503 (2013); Hou e colaboradores., “Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis” Procd Natl Acad Sci U.S.A.

110:15644-15649 (2013); Esvelt e colaboradores., “Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing” Nature Methods 10:1116-1121 (2013); Zhang e colaboradores., “DNase H activity of Neisseria meningitidis Cas9” Mol Cell 60:242-255 (2015); Lee e colaboradores., “The Neisseria meningitidis CRISPR-Cas9 system enables specific genome editing in mammalian cells” Molecular Therapy 24:645-654 (2016); Pawluk e colaboradores., “Naturally occurring off-switches for CRISPR-Cas9” Cell 167:1829-1838 (2016); e Amrani e colaboradores., “Nme1Cas9 is an intrinsically high-fidelity genome editing platform” biorxiv.org/content/early/2017/08/04/172650 (2017).

[0213]Entretanto, a distribuição baseada em Nme1Cas9 viral, RNA- e ribonucleoproteínas (RNP) não tem sido extensivamente explorada. A distribuição baseada em RNA e RNP de ortólogos Cas9 para engenharia genética mantém várias vantagens em relação a outros métodos de administração. Elas não só resultam em uma edição mais rápida uma vez que elas desviam os problemas de expressão relacionados com a distribuição baseada em DNA de Cas9 e seu sgRNA, mas também reduzem os efeitos fora-alvo associados com a edição baseada em Cas9. A atividade fora-alvo reduzida resulta do controle mais fino das concentrações de RNA Cas9 e RNP, e a partir de degradação de RNA Cas9 e RNP relativamente rápida e degradação de RNP em células. A presença prolongada de Cas9 ativo dentro da célula mostrou ser associada com efeitos não-alvo mais elevados. Visto que RNAs Cas9 e RNPs são mais rapidamente degradados dentro das células, Cas9 fornecido como RNA ou RNP não persistem por longos períodos de tempo e consequentemente têm reduzidos efeitos fora-alvo.

[0214]145 nt Nme1Cas9 sgRNA de comprimento total convencionalmente usado inclui 48 nucleotídeos (nt) crRNA, um ligador de 4 nt, e um tracrRNA de 93 nt.

A região crRNA do sgRNA é composta de uma primeira sequência espaçadora de 24 nt, e uma segunda sequência repetida de 24 nt que emparelha com uma região 5' de 24 nt tracrRNA anti-repetição, formando assim uma região de repetição: anti- repetição. A região de 69 nt tracrRNA restante inclui a região da Haste 1 e a região da Haste 2. Figura 1.

[0215] Este Nme1Cas9 sgRNA de comprimento total tem sido usado com sucesso para a edição do genoma utilizando métodos baseados em plasmídeo. Além disso, Nme1Cas9 sgRNA transcrito in vitro pode ser complexado com Nme1Cas9 purificado e usado para a edição do genoma em células humanas. Embora a edição do genoma de células humanas tenha sido bem-sucedida com sgRNAs transcritos in vitro, a eficiência de edição de Nme1Cas9 RNP é reduzida em linhagens de células humanas mais difíceis de transfectar como PLB985.

[0216]Foi previamente mostrado que a eficiência de edição dos RNPs Cas9 é proporcional à estabilidade química de seus sgRNAs. Embora não seja necessário entender o mecanismo da invenção, acredita-se que vários mecanismos celulares são empregados para degradar rapidamente RNAs. Por esta razão, os sgRNAs Cas9 são rotineiramente modificados por meios químicos. Algumas das modificações químicas que conferem estabilidade aumentada a sgRNA incluem, mas não são limitadas a ligações ribose 2'-O-metilação e/ou fosforotioato. Embora RNAs quimicamente modificados sejam opções para a edição de genoma melhorada por Cas9 RNPs, sua eficácia é limitada pelo fato de que a síntese química de RNAs torna- se cada vez mais difícil e cara como o comprimento de RNA aumenta. A 145 nt, a síntese de Nme1Cas9 sgRNA está fora de alcance para aplicações de edição de genoma de rotina que empregam sgRNAs quimicamente sintetizados.

II. Sequências de Nme1Cas9 sgRNA Truncadas

[0217]Devido à limitação acima identificada que um comprimento total de 145 nt Nme1Cas9 sgRNA é muito grande para a síntese química rotineira de sgRNAs para a edição do genoma, uma modalidade da presente invenção contempla um Nme1Cas9 sgRNA truncado. Embora não seja necessário entender o mecanismo da invenção, acredita-se que um Nme1Cas-sgRNA truncado não comprometa a função de Nme1Cas9 RNP. Além disso, sgRN para Nme1Cas9 e Nme2Cas9 são idênticos e intercambiáveis (Figure 35B), assim truncagens de sgRNA são igualmente aplicáveis tanto a Nme1Cas9 quanto Nme2Cas9. As sequências exemplares de sgRNA truncadas e sítios alvo associados são apresentados abaixo, onde os nts de sgRNA variáveis em regiões guia são dados como resíduos "N". Nas sequências alvo, os 24 nts reconhecidos pela região guia de sgRNA estão sublinhadas, e a região de motivo adjacente (PAM) protoespaçadora é dada em negrito. Tabela 1.

Tabela 1: Sequências sgRNA Truncadas Exemplares e Alvos Genômicos Associados

[0218]Como contemplado aqui, um Nme1Cas9 sgRNA truncado não só permitiria a síntese em custo razoável, mas também facilita o uso em métodos de distribuição baseados em vírus (por exemplo, por exemplo, plataformas de distribuição viral adeno-associadas) onde o comprimento permitido de DNA é limitado. Em uma modalidade, o sgRNA truncado reduz o efeito de edição Nme1Cas9 fora do alvo. Em uma modalidade, o Nme1Cas9 sgRNA truncado compreende pelo menos uma modificação química que aumenta a eficiência de edição Nme1Cas9.

[0219] Como discutido acima, o comprimento total 145 nt de sgRNA de Nme1Cas9 inclui uma região guia, uma região duplex de repetição: anti-repetição, uma região de Haste 1 e uma região de Haste 2. Figura 1. Entretanto, porque o comprimento do sgRNA é problemático para a edição genômica de rotina, e era altamente desejável desenvolver um sgRNA truncado para Nme1Cas9. Atualmente, os métodos de síntese de RNA comercialmente disponíveis requerem que o produto final de RNA não seja maior do que ~100 nt.

[0220]Em uma modalidade, a presente invenção contempla um sgRNA Nme1Cas9 compreendendo um duplex repetição: anti-repetição truncado. Em uma modalidade, a presente invenção contempla um Nme1Cas9 sgRN compreendendo uma Haste 2 truncada. Figura 2. Além disso, foi previamente mostrado que uma região crRNA de guia variável 5' (por exemplo, região espaçadora) de Nme1Cas9 também pode ser truncada por alguns poucos nucleotídeos sem perda de função.

Amrani e colaboradores , Amrani e colaboradores., “Nme1Cas9 is an intrinsically high-fidelity genome editing platform” biorxiv.org/content/early/ 2017/08/04/172650 (2017); e Lee e colaboradores., “The Neisseria meningitidis CRISPR-Cas9 system enables specific genome editing in mammalian cells” Molecular Therapy 24:645-654 (2016).

[0221]Em uma modalidade, a presente invenção contempla um sgRNA de 100 nt Nme1Cas9-truncado. Figura 3, Construção #11. Esta construção #11 de 100 nt Nme1Cas9 truncada-sgRNA foi testada em três sítios genômicos humanos diferentes por transfecções transientes em células HEK293T, e em todos os três sítios, elas suportam a função Nme1Cas9 no mesmo nível que, se não melhor do que, o Nme1Cas9 sgRNA de comprimento total. Figura 3, Painel Inferior. Além disso, sgRNA 11 e sgRNA 13 também foram testados em vários sítios de alvo genômico usando-se a distribuição de RNP e a eficiência de edição foi similar ou maior do que o sgRNA wt. Figura 4. A versão sintética da construção #11 foi também testada em células PLB985 resultando em maior eficiência de edição em relação ao sgRNA wt transcrito in vitro. Figura 5.

III. Plataformas de Distribuição CRISPR Adenovírus-Associados

[0222]Em comparação com as nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição (TALENs) e nucleases de dedo de zinco (ZFNs), Cas9s são distinguidas por sua flexibilidade e versatilidade. Komor e colaboradores., ”CRISPR-based technologies for the manipulation of eukaryotic genomes” Cell 2017;168:20–36. Tais características os tornam ideais para o direcionamento do campo de engenharia genômica para a frente. Nos últimos anos, a CRISPR-Cas9 tem sido usada para melhorar os produtos em agricultura, alimentos, e indústria, além das aplicações promissoras em terapia de genes e medicina personalizada. Barrangou e colaboradores., “Applications of CRISPR technologies in research and beyond” Nat Biotechnol. 2016;34:933–41. A despeito da diversidade de sistemas de CRISPR de classe 2 que foram descritos, somente um grupo deles foram desenvolvidos e validados para a edição do genoma in vivo. Como mostrado aqui, NmeCas9 é um Cas9 compacto, de alta fidelidade que pode ser considerado para aplicações futuras de edição de genoma in vivo, utilizando-se rAAV “all-in-one”. O PAM único NmeCas9' permite a edição de alvos adicionais que são inacessíveis para os outros dois ortólogos validados de rAAV “all-in-one” (SauCas9 e CjeCas9).

[0223] A edição do genoma utilizando um sistema de CRISPR bacteriano abriu uma nova avenida para a terapia de genes humanos. Nomeado como Repetições Palindrômicas Curtas Interespaçadas Regularmente Agrupadas, que capturam fragmentos de ácidos nucleicos invasivos em bactérias, o complexo de CRISPR compreende um RNA guia (por exemplo, sgRNA) que direciona uma nuclease Cas9 (proteína 9 associada à CRISPR) para clivar DNA de fita dupla complementar. O reparo não-homólogo de uma ruptura de DNA induzida por Cas9 leva a pequenas inserções ou eliminações (indels) que inativam genes alvos, mas quebras também podem ser reparadas por padrões de DNA homólogos que resultam em substituição de genes. Nelson e colaboradores., “In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy” Science 351: 403-407 (2016); e Ran e colaboradores., “In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9” Nature 520:186-191 (2015); e Yin e colaboradores., “Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype” Nature Biotechnology 32:551-553 (2014).

[0224]A corrente e amplamente usada Streptococcus pyogenes (Spy) Cas9 do Tipo II-A como uma ferramenta de edição de genoma flexível demonstra várias desvantagens: i) distribuição ineficiente; II) clivagem fora do alvo; e iii) atividade não regulada. Estas desvantagens limitam estritamente a SpyCas9 como uma ferramenta potencial de terapia de genes. Como discutido aqui, um complexo Nme1Cas9 ou Nme2Cas9 altamente acurado e preciso pode superar estas limitações SpyCas9.

[0225]Nme1Cas9 e Nme2Cas9 demonstraram ser uma plataforma de edição de genoma eficiente em células de mamíferos e, como proteína menor que SpyCas9, é mais fácil projetar vetores virais para administração in vivo. Além disso, Nme1Cas9 e Nme2Cas9 têm uma edição fora de alvo significativamente menor do que as proteínas SpyCas9 e anti-CRISPR que foram identificadas que permitem o controle da atividade Nme1Cas9 e Nme2Cas9. Esvelt e colaboradores., “Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing” Nature Methods 10:1116-1121 (2013); Amrani e colaboradores., “Nme1Cas9 is an intrinsically high-fidelity genome editing platform” biorxiv.org/content/early/2017/08/04/ 172650 (2017); Lee e colaboradores., 'The Neisseria meningitidis CRISPR-Cas9 System Enables Specific Genome Editing in Mammalian Cells” Molecular Therapy 24:645-654 (2016); Hou e colaboradores., “'Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis” Procd Natl Acad Sci USA 110:15644-15649 (2013); and Pawluk e colaboradores., “Naturally Occurring Off-Switches for CRISPR-Cas9” Cell 167:1829-38 e9 (2016); e Figura 21.

[0226]Vírus Adeno-Associado (AAV) foi demonstrado como um veículo de distribuição com patogenicidade mínima em configurações pré-clínicas e clínicas, mas tem uma capacidade de empacotamento limitada. Nme1Cas9, codificado por uma estrutura de leitura aberta de ~3,5 kb, e seus RNAs guias estão dentro do limite de empacotamento de AAV. Nme2Cas9 tem vantagens similares. Diferentemente de SpyCas9, que requer a distribuição por vetores separados para o sgRNA e Cas9, Nme1Cas9, Nme2Cas9 e seu sgRNA são suficientemente pequenos para serem distribuídos com um único vetor AAV.

[0227]Outros ortólogos Cas9 foram enviados com sucesso in vivo por AAV, tais como Campylobacter jejuni Cas9 (CjeCas9) and Staphylococcus aureus (SauCas9). Kim e colaboradores., “In vivo genome editing with a small Cas9 orthologue derived from Campylobacter jejuni” Nat Commun 8:14500 (2017); e Ran e colaboradores., “In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9” Nature 520:186-191 (2015). Nme1Cas9 é usualmente associado com um PAM N 4GATT, que é diferente do PAM CjeCas9 (por exemplo, N4RYAC), ou o PAM de SauCas9 (e g, NNGRRT) (R = purina (A ou G), Y = pirimidina ( C ou T)).

[0228]Nme1Cas9 foi enviado com sucesso como um complexo de ribonucleoproteína (RNP) em células humanas. Figura 2 e Figura 3. Ainda, os dados apresentados aqui mostram que uma sequência de ácido nucleico Nme1Cas9 pode ser expressa in vivo em camundongos para genes alvos utilizando um vetor sgRNA- Nme1Cas9-AAV “all-in-one” subsequente a uma injeção na veia da cauda.

[0229]Os dados apresentados aqui demonstram um alvo de um gene Pró- proteína Subtilisina Convertase/Kexina tipo 9 (Pcsk9) de camundongo. PCSK9 funciona como um antagonista para o receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDL) e limita a absorção de colesterol LDL. A detecção de níveis reduzidos de colesterol no soro pode desse modo fornecer uma leitura funcional direta de edição de Nme1Cas9 eficiente utilizando uma plataforma de Cas9 dirigida por PCSK9.

[0230]Em uma modalidade, a presente invenção contempla um vetor viral adeno-associado que compreende um complexo Nme1Cas9-sgRNA ou um complexo Nme2Cas9-sgRNA. Embora não seja necessário entender o mecanismo da invenção, acredita-se que complexo AAV/Nme1Cas9-sgRNA ou um complexo

AAV/Nme2Cas9-sgRNA é compatível com uma via de administração in vivo a fim de fornecer a edição de genes.

[0231]Em uma modalidade, a presente invenção contempla um vetor sgRNA- Nme1Cas9-AAV compreendendo uma sequência de sgRNA, uma sequência promotora de RNA Polimerase III U6, uma sequência Nme1Cas9 de códon humano otimizada e uma sequência promotora de RNA polimerase II U1a. Figura 6. U1a é um promotor ubíquo que permite a expressão versátil de Cas9 em vários tecidos de interesse. Genes específicos a serem editados podem ser dirigidos pela inserção de uma sequência espaçadora emparelhando um gene alvo em um cassete de sgRNA usando sítios de restrição convencionais (por exemplo, Sap1).

[0232]Sequências representativas dos vários elementos do sgRNA- Nme1Cas9-AAV são mostradas por anotações coloridas. Figuras 7 e 8.

[0233] As eficiências de edição de vários sítios alvos usando um plasmídeo Pgsk9-sgRNA-Nme1Cas9-AAV e um plasmídeo Rosa26-sgRNA-Nme1Cas9-AAV foram estimadas por um ensaio T7E1 após a transfecção transiente em células de hepatoma de Hepa 1-6 de camundongo. Figura 9. Sequências de sítio alvo representativas dentro de um gene Pcsk9 e um gene complementar Rosa26 com um plasmídeo Pcsk9-sgRNA-Nme1Cas9-AAV e plasmídeo Rosa26-sgRNA-Nme1Cas9- AAV são mostradas por anotações coloridas. Figura 10.

[0234] O projeto de plasmídeo foi validado in vivo com camundongos por injeção hidrodinâmica de 30 μg de plasmídeo sgRNA-Nme1Cas9-AAV livre de endotoxina direcionado para Pcsk9 via veia de cauda. A edição significativa do gene foi detectada no fígado do camundongo 10 dias após a injeção, conforme medido pelo Rastreamento dos Indels por Decomposição (TIDE), um método com base em sequenciamento para avaliar as eficiências de indel. Figura 11.

[0235]As cadeias principais de plasmídeo objetivando um gene Pcsk9 e um gene Rosa26 foram empacotadas em sorotipo AAV8 específico de hepatócitos, e uma dose de 4x1010 cópias genômicas (gc) por camundongo foi injetada através da veia de cauda. Dados preliminares mostram valores de indel de camundongos sacrificados em 14 dias após a injeção em um nível indel significativo em genes do fígado Pcsk9 e Rosa26. Figura 12A. Os dados de sequenciamento profundo também foram coletados no dia 50 após a injeção.

[0236] Os três grupos de camundongos foram sacrificados no dia 50 após a injeção, e o gDNA do fígado foi usado para medir os valores de indel em Pcsk9 e Rosa26 usando TIDE. Figura 12B. Análises de sequenciamento profundo também foram realizadas para registrar medições precisas de valores de indel.

[0237]A proteína PCSK9 "knock-down" pode conduzir a redução significativa de níveis de colesterol em camundongos. O nível de colesterol no soro foi medido por ensaio de pontual colorimétrico Infinity™ (Thermo - Scientific) em 3 grupos de camundongos injetados com vetores que visam um gene de Pcsk9, um gene de Rosa26 e um grupo controle de PBS. Os resultados sugerem que a formação indel induzida por Nme1Cas9 levou à interrupção da estrutura de leitura normal do gene de Pcsk9, conforme demonstrado por valores significativamente reduzidos de colesterol de soro em 25 e 50 dias após a injeção. Figura 13. Foi também realizado um ensaio de Western blot para medir o nível de proteína PCSK9 no fígado de camundongos no dia 50.

[0238] A identificação imparcial em todo o genoma de quebras de fita duplas (DSBs) habilitada por um ensaio de sequenciamento (por exemplo, GUIDE-Seq ®, Illumina) pesquisada para sítios de edição fora do alvo subsequentemente à injeção de vetores que alvejam um gene Pcsk9 e um gene Rosa26. Os dados revelaram quatro (4) potenciais sítios fora de alvo para Pcsk9 e seis (6) potenciais sítios fora de alvo para Rosa26. Figuras 14A e 14B.

[0239] A análise de TIDE direcionada revelou a edição do genoma no alvo em células e nos camundongos no dia 14 após a injeção de vetores AAV alvo e o gene Pgsk9 e um gene Rosa26. As análises de sequenciamento profundo para a clivagem fora do alvo nesses sítios também foram realizadas em 50 dias após a injeção.

[0240]Um ensaio de coloração hematoxilina e eosina não mostrou sinais de infiltração massiva de células imunes nas seções hepáticas de camundongos sacrificados no dia 14 subsequentemente à injeção de vetores que direcionam um gene Pcsk9 e um gene Rosa26. Figura 16. Ensaios de resposta imune específicos serão realizados em pós-injeção de 50 dias.

[0241]Em uma modalidade, a presente invenção contempla um método para a edição de genoma terapêutica in vivo por administração AAV “all-in-one” de um Nme2Cas9. Embora não seja necessário entender o mecanismo da invenção, acredita-se que a compacidade, pequena PAM e alta fidelidade tornam Nme2Cas9 uma ferramenta ideal para a edição de genoma in vivo utilizando AAV. Para este fim, o Nme2Cas9 foi clonado com seu sgRNA cognato e seus promotores correspondentes à cadeia principal do vetor AAV. Figura 44A; superior. Este “all-in- one” AAV.sgRNA.Nme2Cas9 foi empacotado em um capsídio AAV8 seletivo de hepatócitos. Dois genes foram dirigidos: i) Rosa26, um locus comumente usado como um controle negativo; e ii) a Pró-proteína Convertase Subtilisina/Kexina tipo 9 (Pcsk9), um regulador principal de homeostase de colesterol circulante. Estudos demonstraram que a eliminação de Pcsk9 utilizando o Cas9 resulta em níveis reduzidos de colesterol (Ran e colaboradores).

[0242] Dois grupos de camundongos (n = 5) foram injetados com AAV8.

SgNA.Nme2Cas9 empacotados que direciona ou Pcsk9 ou Rosa26. O soro foi coletado a 0, 14 e 28 dias após a injeção do vetor para a medição do nível de colesterol. Os camundongos foram sacrificados em 28 dias após a injeção e tecidos de fígado e fígado foram coletados. (Figura 44A. Inferior. Uma análise de sequenciamento profundo mostrou um nível significativamente elevado de indels em Pcsk9 e Rosa26. Figura 44B. Estes valores de indel foram avaliados por redução significativa no nível de colesterol no sangue em camundongos injetados com sgPcsk9 após 14 e 28 dias; onde os camundongos injetados com sgRosa26 mantiveram o nível normal de colesterol por todo o estudo. Figura 44C. Análises de H&E não mostraram sinais de toxicidade ou dano ao tecido em ambos os grupos após a expressão de Nme2Cas9. Figura 44D. Estes dados validam que Nme2Cas9 é altamente funcional in vivo, e o mesmo pode ser prontamente distribuído pela plataforma de AAV de “all-in-one” favorável.

[0243]Em uma modalidade, a presente invenção contempla uma construção AAV.hNmeCas9 minimizada. Ver, a Figura 44A. Como discutido acima, a presente invenção contempla uma construção “all-in-one” AAV.sgRNA.hNme1Cas9 desenvolvida, que é empacotada em vírions AAV8 que editam com sucesso os genes de Pcsk9 e Rosa26 no fígado de camundongos.

[0244]Em uma modalidade, a presente invenção contempla uma cadeia principal AAV8 que compreende um cassete Nme2Cas9. Similar a Nme1Cas9, Nme2Cas9 também mostrou uma edição robusta em Pcsk9 e Rosa26 em camundongos (infra). Os dados apresentados aqui mostram que a administração in vivo de AAV8-NmeCas9 a camundongos é acompanhada por redução significativa no nível de colesterol circulante após 28 dias pós-injeção.

[0245] A fim de aumentar a utilidade desta plataforma de AAV “all-in-one”, várias truncagens foram introduzidas para minimizar o tamanho da carga para fazer um espaço para características adicionais no capsídio AAV, tais como sgRNAs duplos ou segmento de DNA doador.

[0246]A fim de minimizar a carga de toda a cadeia principal AAV “all-in-one”, as características extras (3x etiquetas de HA e 2x sequências NLS) foram removidas sistematicamente sem comprometer a atividade nuclease do Cas9. Nme1Cas9, usando o sistema repórter de luz de tráfego (TLR), mostra que este mínimo de AAV.sgRNA.hNme1Cas9 (4,468 kb) “all-in-one” é tão potente quanto a versão mais longa anterior com 4 sequências NLS. Ver, Figura 45, sgRNAs truncados foram construídos para liberar mais espaço utilizando um novo sgRNA12, que é similar a uma versão sgRNAl 11, mas com UA adicionado na extremidade 3'. Ver, a Figura 46.

[0247] Anteriormente, foi reportado que uma sequência de poliA curta pode ser útil para construções de Cas9. Platt et. al. (2015). Em uma modalidade, a presente invenção contempla uma construção de AAV-Nme2Cas9 compreendendo um poliA

BGH. Ver, Figura 47. Embora não seja necessário entenda-se o mecanismo de uma invenção, acredita-se que esta sequência poliA reduz ainda mais o tamanho da cadeia principal AAV “all-in-one”.

[0248]Acredita-se ainda que esta cadeia principal de AAV “all-in-one” minimizada (4,4 kb) aumenta a utilidade de Nme1Cas9 e Nme2Cas9 incluindo um outro sgRNA para excisão de genes duplos noucautes ou de fragmentos de DNA.

Ver, Figura 48, superior. Esta configuração também proporciona espaço livre no capsídio AAV para incluir um padrão doador (~600 pares de bases) para aplicação de reparo direcionada por homologia. Ver, Figura 48, inferior. Em algumas modalidades, construções de sgRNA AAV duplas são empacotadas dentro de um único vetor de AAV.

[0249]O Nme1Cas9 relativamente compacto é ativo na edição do genoma em uma faixa de tipos celulares. Para explorar o tamanho pequeno deste ortólogo de Cas9, foi gerada uma construção de AAV “all-in-one” com Nme1Cas9 otimizada por códon humano sob a expressão do promotor U1a de camundongo e com seu sgRNA direcionado pelo promotor U6. Ver, Figura 49A. Dois sítios no genoma do camundongo foram selecionados inicialmente para testar a atividade nuclease de Nme1Cas9 in vivo: o gene Rosa26 "safe-harbor" (visado por sgRosa26); e o gene pró-proteína convertase subtilisina/kexina tipo 9 (Pcsk9) (direcionado por sgPcsk9), um alvo terapêutico comum para diminuir o colesterol circulante e reduzir o risco de doença cardiovascular. Figura 49B. As previsões fora do alvo em todo o genoma para estas guias foram determinadas computacionalmente usando-se o Pacote Biocondutor CRISPRseek 1.9.1 com PAMs N4GN3 e até seis desemparelhamentos.

Zhu e colaboradores., “CRISPRseek: a bioconductor package to identify target- specific guide RNAs for CRISPR-Cas9 genomeediting systems” PLoS One 2014;9:e108424. Muitos PAMs N4GN3 são inativos, de modo que estes parâmetros de busca são quase determinados para fundir uma rede mais larga do que o perfil fora-alvo verdadeiro. A despeito da natureza expansiva da pesquisa, uma análise não revelou sítios não-alvo com menos de quatro desemparelhamentos no genoma do camundongo. Ver, Figura 50. As eficiências de edição no-alvo nestes sítios alvo foram avaliadas em células de hepatoma de Hepa 1-6 de camundongo por transfecções de plasmídeo e quantificação de indel foi realizada por decomposição de traço de sequência usando a ferramente web Rastreamento de Indels de Decomposição (TIDE). Brinkman e colaboradores., “Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition” Nucleic Acids Res. 2014;42:e168. Os dados mostram valores indel > 25% para as fitas selecionadas, a maioria das quais foram eliminações. Ver, Figura 49C.

[0250]Para avaliar a eficácia preliminar do vetor AAV-sgRNA-hNme1Cas9 “all-in-one”, o plasmídeo sgPcsk9 livre de endotoxina foi administrado hidrodinamicamente nos camundongos C57Bl/6 via injeção de veia de cauda. Este método pode distribuir DNA de plasmídeo a ~40% de hepatócitos para expressão transiente. Liu e colaboradores. " Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA” Gene Ther. 1999;6:1258–66. Análises indel por TIDE usando DNA extraído de tecidos do fígado revelaram 5-9% de indels 10 dias após a administração de vetor, comparável às eficiências de edição obtidas com testes análogos de SpyCas9. Ver, Figura 49D; e Xue e colaboradores., “CRISPR- mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver” Nature 2014;514:380–4 - Estes resultados sugerem que Nme1Cas9 é capaz de editar células hepáticas in vivo.

[0251]Tirosinemia Hereditária Tipo I (HT-I) é uma doença genética fatal causada por mutações recessivas autossômicas no gene Fah, que codifica a enzima de fumarilacetoacetato hidroxilase (FAH). Os pacientes com FAH diminuída têm uma via catabólica de tirosina rompida, têm uma via catabólica de tirosina rompida, levando à acumulação de fumarilacetoacetato tóxico e acetoacetato de succinila, causando danos ao fígado e rim. Grompe M., “The pathophysiology and treatment of hereditary tyrosinemia type 1” Semin Liver Dis. 2001;21:563–71. Sobre as duas últimas décadas, a doença foi controlada por 2-(2-nitro-4-trifluormetilbenzoil)-1,3- cicloexanodiona (NTBC), que inibe a 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase a montante na via de degradação da tirosina, evitando assim a acumulação dos metabólitos tóxicos.

Lindstedt e colaboradores., “Treatment of hereditary tyrosinaemia type I by inhibition of 4-hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase” Lancet 1992;340:813–7. no Entanto, este tratamento requer administração de dieta e medicação e pode eventualmente requerer transplante de fígado. Das, Das, AM., “Clinical utility of nitisinone for the treatment of hereditary tyrosinemia type-1 (HT-1)” Appl Clin Genet. 2017;10:43–8.

[0252]Várias estratégias de terapia genética foram testadas para corrigir um gene Fah defeituoso utilizando mutagênese dirigida ao sítio ou reparo dirigido por homologia por CRISPR-Cas9. Paulk e colaboradores., “Adenoassociated virus gene repair corrects a mouse model of hereditary tyrosinemia in vivo” Hepatology 2010;51:1200–8; Yin e colaboradores., “Therapeutic genome editing by combined viral and non-viral delivery of CRISPR system components in vivo” Nat Biotechnol.

2016;34:328–33; and Yin e colaboradores., “Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype” Nat Biotechnol. 2014;32:551–3. Foi relatado que a modificação bem-sucedida de apenas 1/10.000 de hepatócitos no fígado é suficiente para a recuperação dos fenótipos de camundongos Fahmut/mut. Recentemente, foi sugerida uma abordagem de reprogramação de via metabólica na qual a função da enzima hidroxifenilpiruvato dioxigenase (HPD) foi interrompida pela deleção dos éxons 3 e 4 do gene Hpd no fígado. Pankowicz e colaboradores., “Reprogramming metabolic pathways in vivo with CRISPR/Cas9 genome editing to treat hereditary tyrosinaemia” Nat Commun. 2016;7:12642. Isto proporciona um contexto para testar a eficácia da edição Nme1Cas9, por exemplo, objetivando Hpd e avaliando a recuperação do fenótipo da doença em camundongos mutantes Fah. Grompe e colaboradores., “Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice” Genes Dev. 1993;7:2298–307. Para este propósito, dois sítios alvo (um em éxon 8 [sgHpd1] e éxon 11 [sgHpd2]) foram selecionados e identificados dentro da estrutura de leitura aberta de Hpd. Ver, Figura 51A. Estas guias (por exemplo, sgRNAs)

facilitaram as eficiências de indel médias induzidas por Nme1Cas9 de 10,8% e 9,1%, respectivamente, por transfecções de plasmídeo em células Hepa1-6. Figura 52.

[0253]Três grupos de camundongos foram tratados por injeção hidrodinâmica com ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou com um dos dois plasmídeos sgHpd1 e sgHpd2 “all-in-one” AAV-sgRNA-hNme1Cas9. Um camundongo no grupo sgHpd1 e dois no grupo sgHpd2 foram excluídos do estudo de acompanhamento devido às injeções na veia caudal falhadas. Os camundongos foram retirados de água contendo NTBC sete dias depois de injeções e seus pesos foram monitorados por 43 dias após a injeção. Ver, Figura 51B. Os camundongos injetados com PBS sofreram uma severa perda de peso (uma marca de HT-I) e foram sacrificados após a perda de 20% de seu peso corporal. No geral, todos os camundongos sgHpd1 e sgHpd2 mantiveram com sucesso seu peso corporal por 43 dias e durante pelo menos 21 dias sem NTBC. Ver, Figura 51C.

[0254] O tratamento de NTBC teve de ser retomado por 2-3 dias para dois camundongos que receberam sgHpd1 e um que recebeu sgHpd2 para permitir que os mesmos recuperem peso corporal durante a terceira semana após a injeção de plasmídeo, talvez devido a baixas eficiências de edição inicial, danos no fígado devido à injeção hidrodinâmica, ou ambos. Inversamente, todos os outros camundongos tratados com sgHpd1 e sgHpd2 alcançaram indels com frequências na faixa de 35- 60%. Ver, Figura 51 D. Este nível de inativação gênica provavelmente reflete não apenas os eventos de edição iniciais, mas também a expansão competitiva das linhagens de células editadas (após a retirada de NTBC) às custas de suas contrapartes não editadas. A histologia do fígado revelou que o dano do fígado é substancialmente menos severo nos camundongos tratados com sgHpd1 e sgHpd2 comparados com camundongos Fahmut/mut injetados com PBS, conforme indicado pelos números menores de hepatócitos multinucleados comparados com camundongos injetados com PBS. Ver, Figura 53.

[0255]Os vetores AAV foram recentemente usados para a geração de camundongos editados por genoma, sem a necessidade de microinjeção ou eletroporação, simplesmente por embebimento dos zigotos em meio de cultura contendo vetor(s) AAV, seguido por reimplantação em fêmeas pseudográvidas. A edição foi obtida previamente com um sistema duplo-AAV no qual SpyCas9 e seu sgRNA foram distribuídos em vetores separados. Yoon e colaboradores., “Streamlined ex vivo and in vivo genome editing in mouse embryos using recombinant adeno-associated viruses” Nat. Commun. 9:412 (2018). Para testar se o Nme2Cas9 poderia permitir uma edição precisa e eficiente em zigotos de camundongo com um sistema de distribuição de AAV “all-in-one”, o gene de tirosinase (Tyr) foi visado, onde uma inativação bi-alélica da qual rompe a produção de melanina, resultando em filhotes albino. Yokoyama e colaboradores., “Conserved cysteine to serine mutation in tyrosinase is responsible for the classical albino mutation in laboratory mice” Nucleic Acids Res. 18:7293-7298 (1990).

[0256]Um sgRNA Tyr eficiente (que cliva o locus Tyr somente 17 bp a partir do sítio da mutação albino clássica) foi validado nas células Hepa 1-6 por transfecções transitórias. Ver, Figura 57. Depois, os zigotos C57BL/6NJ foram incubados por 5-6 horas em meio de cultura contendo 3 x 10 9 ou 3 x 108 GCs de um vetor AAV6 “all-in-one” que expressa Nme2Cas9 junto com a Tyr sgRNA, Após a cultura de um dia para o outro em meio fresco, aqueles zigotos que avançaram para o estágio de duas células foram transferidos para o oviduto de receptores pseudográvidos e deixados desenvolver-se a termo. Ver, Figura 58A. A análise de cor de revestimento de filhotes revelou camundongos que foram albinos, cinza claro (sugerindo um alelo hipomórfico de Tyr), ou que tinham cor de revestimento variegado composta de manchas albina e cinza clara, mas sem pigmentação preta. Ver, Figuras 58B & 58C. Estes resultados sugerem uma alta frequência de mutações bialélicas, uma vez que a presença de um único alelo de Tyr do tipo selvagem deve tornar a pigmentação preta. Um total de cinco filhotes (10%) foram nascidos do experimento 3 x 109 GCs. Todos eles carrearam indels; fenotipicamente, dois eram albinos, um foi cinza claro, e dois tinham pigmentação variegada, indicando mosaicismo. A partir do experimento 3 x 108 GCs, foram obtidos quatro (4) filhotes (14%), dois dos quais morreram no nascimento, impedindo a coloração do revestimento ou análise do genoma. A análise de cor de revestimento dos dois filhotes restantes revelou um filhote cinza clara e um filhote mosaico. Estes resultados indicam que a distribuição simples de AAV de Nme2Cas9 e seu sgRNA pode ser usada para gerar mutações em zigotos de camundongo sem microinjeção ou eletroporação.

[0257]Para medir a formação de indel on-alvo no gene Tyr, DNA foi isolado das caudas de cada camundongo, o locus foi amplificado e uma análise de TIDE foi realizada. Os dados mostraram que todos os camundongos tinham altos níveis de edição no-alvo por Nme2Cas9, variando de 84% a 100%. Ver, Figuras 57B e 5C. A maioria das lesões no camundongo albino 9-1 ou uma deleção de 1- ou de 4-bp, sugerindo tanto o mosaicismo quanto a trans-heterozigosidade. O camundongo albino 9-2 apresentou uma deleção uniforme de 2-bp. Ver, Figura 58C. A análise de DNA de cauda a partir de camundongos cinzas claros revelou a presença de mutações em quadro que são potencialmente uma causa da cor de revestimento de cinza clara. A complexidade mutacional limitada sugere que a edição ocorreu cedo durante o desenvolvimento embriônico nestes camundongos. Uma fêmea (camundongo 9-2) foi acasalada com um macho albino clássico, e todos os seis filhotes resultantes foram albinos, demonstrando que as mutações geradas por administração zigótica “all-in-one” AAV de Nme2Cas9 + sgRNA podem ser transmitidas através da linha germinativa. Estes resultados proporcionam uma rota simplificada na direção da mutagênese de mamíferos através da aplicação de um único vetor de AAV, neste caso a liberação de Nme2Cas9 e de seu sgRNA.

[0258]Os pacientes com mutações no gene Hpd são considerados como tendo Tirosinemia tipo III e exibem alto nível de tirosina no sangue, mas de outra forma parecem ser grandemente assintomáticos. Szymanska e colaboradores., “Tyrosinemia type III in an asymptomatic girl. Mol Genet Metab Rep. 2015;5:48–50; e Nakamura e colaboradores., “Animal models of tyrosinemia” J Nutr. 2007;137:1556S– 60S. HPD age a montante de FAH na via de catabolismo de tirosina e o rompimento Hpd melhora os sintomas HT-I impedindo o acúmulo de metabólitos tóxicos que resulta da perda de FAH. Análises estruturais de HPD revelam que o domínio catalítico da enzima HPD está localizado no terminal C da enzima e é codificado por éxon 13 e 14. Huang e colaboradores., “The different catalytic roles of the metal- binding ligands in human 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase” Biochem J.

2016;473:1179–89. Assim, indels indutores de deslocação a montante do éxon 13 devem tornar a enzima inativa. Este contexto foi usado para demonstrar que a inativação Hpd por injeção hidrodinâmica de plasmídeo Nme1Cas9 é uma abordagem viável para a recuperação de camundongos HT-I. Nme1Cas9 pode editar sítios que carregam várias PAMs diferentes (N4GATT [consenso], N4GCTT, N4GTTT, N4GACT, N4GATA, N4GTCT, e N4GACA). Os experimentos de edição de Hpd confirmaram um dos PAMs variantes in vivo com a guia sgHpd2, que visa um sítio com uma PAM N4GACT.

[0259]Embora as injeções hidrodinâmicas de plasmídeo possam gerar indels, o desenvolvimento terapêutico pode requerer estratégias de entrega menos invasivos, tal como através do uso de rAAV. Para este fim, todos os plasmídeos de AAV-sgRNA-hNme1Cas9 “all-in-one” foram embalados em capsídeos AAV8 de hepatócitos-trópicos para a Pcsk9 alvo (sgPcsk9) e Rosa26 (sgRosa26). Ver, Figura 49B; Gao e colaboradores., “Novel adenoassociated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy” Proc Natl Acad Sci U S A 2002;99:11854–9; and Nakai e colaboradores., “Unrestricted hepatocyte transduction with adeno-associated virus serotype 8 vectors in mice” J Virol. 2005;79:214–24. Pcsk9 e Rosa26 foram usados em parte para permitir a distribuição de Nme1Cas9 AAV a ser comparado com aquela de outros ortólogos Cas9 fornecidos similarmente e dirigidos para os mesmos loci. Ran e colaboradores., “In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9” Nature 2015;520:186–91. Vetores foram administrados em camundongos C57BL/6 via veia de cauda. Ver, Figura 54A. Os níveis de colesterol foram monitorados no soro e medidas de proteína PCSK9 e frequências indel nos tecidos hepáticos 25 e 50 dias após a injeção.

[0260]Usando um ensaio pontual colorimétrico, determinou-se que o nível de colesterol do soro circulante nos camundongos administrados com Nme1Cas9/sgPcsk9 diminuiu significativamente (p < 0,001) comparado com os camundongos PBS e Nme1Cas9/sgRos26 em 25 e 50 dias após a injeção. Ver, Figura 54B. Análises de sequenciamento profundo direcionadas em sítios alvo de Pcsk9 e Rosa26 revelaram indels muito eficientes de 35% e 55%, respectivamente, em 50 dias pós-administração de vetor. Figura 54C. Adicionalmente, um camundongo de cada grupo foi submetido a eutanásia em 14 dias após a injeção e revelou eficiências de indel no-alvo de 37% e 46% em Pcsk9 e Rosa26, respectivamente.

Como esperado, os níveis de proteína PCSK9 nos fígados de camundongos tratados Nme1Cas9/sgPcsk9 foram substancialmente reduzidos em comparação com os camundongos injetados com PBS e Nme1Cas9/sgRosa26. Ver, Figura 54D. A edição eficiente, redução de PCSK9, e colesterol de soro diminuído indicam a distribuição bem-sucedida e a atividade de Nme1Cas9 no locus de Pcsk9.

[0261]SpyCas9 fornecido por vetores virais é conhecido por elicitar respostas imunes do hospedeiro. Chew e colaboradores., “A multifunctional AAV-CRISPR-Cas9 and its host response” Nat Methods 2016;13:868–74; and Wang e colaboradores., “Adenovirus-mediated somatic genome editing of Pten by CRISPR/Cas9 in mouse liver in spite of Cas9-specific immune responses” Hum Gene Ther. 2015;26:432–42.

Para investigar se os camundongos injetados com AAV8-sgRNA-hNme1Cas9 geram anticorpos anti-Nme1Cas9, soros foram usados a partir dos animais tratados para realizar ELISA lgG1. Estes resultados mostram que Nme1Cas9 elicita uma resposta humoral nesses animais. Ver, Figura 55. A despeito da presença de uma resposta imune, Nme1Cas9 fornecido por rAAV é altamente funcional in vivo, sem sinais aparentes de anormalidades ou danos no fígado. Ver, Figura 16.

[0262]Uma preocupação significativa na edição do genoma de CRISPR/Cas9 terapêutico é a possibilidade de atividade em edições fora do alvo. Por exemplo, descobriu-se que Nme1Cas9 do tipo selvagem é a plataforma de edição de genoma naturalmente de alta precisão em células de mamíferos cultivadas. Lee e colaboradores., “The Neisseria meningitidis CRISPR-Cas9 system enables specific genome editing in mammalian cells” Mol Ther. 2016;24:645–54. Para determinar se Nme1Cas9 mantém seu perfil mínimo para fora do alvo em células de camundongo e in vivo, os sítios fora do alvo foram selecionados no genoma do camundongo utilizando a identificação sem desvio do genoma de DSBs habilitados por sequenciamento (GUIDE-seq). Tsai e colaboradores., “Defining and improving the genome-wide specificities of CRISPR-Cas9 nucleases” Nat Rev Genet. 2016;17:300–

12. Células Hepa 1-6 foram transfectadas com plasmídeos sgPcsk9, sgRosa26, sgHpd1, e sgHpd2 “all-in-one” AAV-sgRNA-hNme1Cas9 e o DNA genômico resultante foi submetido a análise de GUIDE-seq. Consistente com observações em células humanas (dados não mostrados), o GUIDE-seq revelou muito poucos sítios fora do alvo (OT) no genoma do camundongo. Quatro sítios OT potenciais foram identificados para sgPcsk9 e outros seis para sgRosa26. Edições fora do alvo com sgHpd1 e sgHpd2 não foram detectadas. Ver, Figura 56A. Estes dados também validam que o Nme1Cas9 é intrinsecamente hiper-preciso.

[0263]Vários dos sítios OT putativos para sgPcsk9 e sgRosa26 carecem das preferências de PAM Nme1Cas9 (isto é, N4GATT, N4GCTT, N4GTTT, N4GACT, N4GATA, N4GTCT, e N4GACA). Ver, Figura 56B. Para validar estes sítios OT, o sequenciamento profundo direcionado foi realizado utilizando DNA genômico de células Hepal 1-6. Por meio desta leitura mais sensível, os indels foram indetectáveis acima de fundo em todos estes sítios OT, exceto o OT1 de Pcsk9, que tinha uma frequência de indel < 2%. Ver, Figura 56B. Para validar a alta fidelidade de Nme1Cas9 in vivo, a formação de indel foi medida nestes sítios OT em DNA genômico do fígado a partir dos camundongos tratados com AAV8-Nme1Cas9, sgPcsk9-alvo e sgRosa26-alvo. Pouca ou nenhuma edição fora do alvo detectável foi encontrada em fígado de camundongos sacrificado em 14 dias em todos os sítios exceto sgPcsk9 OT1, que exibiram uma eficiência de lesão < 2%. Mais importante, este nível de edição de OT permaneceu abaixo de < 2% mesmo depois de 50 dias e também permaneceu tanto não detectável quanto muito baixo para todos os outros sítios de

OT. Estes resultados sugeriram que a expressão prolongada (50 dias) de Nme1Cas9 in vivo não comprometem sua fidelidade de direcionamento. Ver, Figura 56C.

[0264]Para conseguir a distribuição direcionada de Nme1Cas9 a vários tecidos in vivo, os vetores rAAV são uma plataforma de distribuição promissora devido ao tamanho compacto do transgene Nme1Cas9, que permite a distribuição de Nme1Cas9 e sua guia em um formato “all-in-one”. Os dados apresentados aqui validam esta abordagem para o direcionamento dos genes Pcsk9 e Rosa26 em camundongos adultos, com a edição eficiente observada mesmo em 14 dias após a injeção. Nme1Cas9 é intrinsecamente preciso, mesmo sem a engenharia extensiva que foi necessária para reduzir a falta de direcionamento por SpyCas9. Lee e colaboradores., “The Neisseria meningitidis CRISPR-Cas9 system enables specific genome editing in mammalian cells” Mol Ther. 2016;24:645–54; Bolukbasi e colaboradores., “Creating and evaluating accurate CRISPRCas9 scalpels for genomic surgery” Nat Methods 2016;13:41–50; Tsai e colaboradores., “Defining and improving the genome-wide specificities of CRISPR-Cas9 nucleases” Nat Rev Genet.

2016;17:300–12; and Tycko e colaboradores., “Methods for optimizing CRISPR-Cas9 genome editing specificity” Mol Cell. 2016;63:355–70.

[0265]As comparações lado-a-lado da edição de Nme1Cas9 OT foram realizadas em células cultivadas e in vivo por sequenciamento profundo alvo e encontrou-se que o auto-direcionamento é mínimo em ambos os ajustes. A edição no sítio sgPcsk9 OT1 (dentro de um locus não anotado) foi a mais alta detectável a ~2%.

IV. Pequenos Cas9 Ortólogos com PAMs Ricos em Citosina

[0266] Conforme notado acima, os sistemas de CRISPR podem ser classificados em pelo menos seis (6) tipos diferentes. Geralmente, os sistemas do Tipo II são categorizados pela presença de uma proteína nuclease Cas9. Por exemplo, acredita-se que uma proteína nuclease Cas9 seja uma nuclease guiada por RNA que pode ser reproposta como uma plataforma de edição de genoma em quase todos os organismos, incluindo seres humanos. Os relatórios indicaram que a edição do genoma de Cas9 foi usada em medicina, agricultura, terapia de genes humanos e muitas outras aplicações.

[0267]Geralmente, o direcionamento de um locus de gene específico no genoma humano pode ser realizado por uma proteína nuclease Cas9 ligada a um RNA guia de fita única (sgRNA) que visa o locus através de uma interação com uma sequência específica de ácido nucleico (por exemplo, um motivo adjacente protoespaçador; PAM). sgRNA’s geralmente compreendem um segmento de nucleotídeos 20-24 que é complementar a uma sequência de ácido nucléico alvo seguida por uma região constante que interage (por exemplo, liga) com a proteína Cas9. Para a proteína nuclease Cas9 realizar a edição do genoma, o complexo Cas9: sgRNA primeiramente reconhece uma sequência motivo adjacente (PAM) protoespaçadora que é normalmente encontrada a jusante da sequência do sítio alvo.

Embora não seja necessário entender o mecanismo da invenção, acredita-se que cada proteína nuclease Cas9 tem afinidade para um PAM específico (isto é, mediada por um domínio de reconhecimento de motivo adjacente protoespaçador). Na ausência da ligação do domínio de reconhecimento de PAM a uma sequência de ácido nucleico alvo de PAM a jusante DNA de fita dupla (dsDNA) não pode ser clivada pela nuclease Cas9.

[0268] Os relatórios sugerem que apenas um grupo de ortólogos Cas9 foi validada para a edição do genoma humano. Três dos tipos de CRISPR-Cas9 relatados incluem II-a, II-B e II-C. Tipo II-A Cas9 (por exemplo, Streptococcus pyogenes (SpyCas9)), é o Cas9 mais comumente usado. Entretanto, SpyCas9 (e a maioria dos ortólogos do tipo II-A) possui várias características que podem tornar a mesma inadequada para certas aplicações. Primeiro, SpyCas9 é relativamente grande, tornando este Cas9 inadequado para o empacotamento eficiente em vetores virais. Segundo, SpyCas9 tem uma alta taxa de atividade fora do alvo (isto é, cliva DNA em loci involuntários no genoma humano), embora variantes de especificidade mais alta tenham sido construídas. Finalmente, o PAM de SpyCas9 (por exemplo, NGG) tem uso limitado em alguns sítios no genoma humano, ou para aplicações onde um nucleotídeo específico deve ser reconhecido durante a edição. Para superar estas deficiências, vários grupos demonstraram que outros ortólogos Cas9 funcionam em seres humanos e outros organismos. Como discutido acima, os ortólogos Cas9 Tipo II-C (por exemplo, Nme1Cas9) são pequenos o bastante para empacotamento viral “all-in-one” (por exemplo, vetores de vírus adeno-associado (AAV)] que resulta em maior atividade de fidelidade em células de mamíferos. No entanto, as PAMs de Cas9 II-C Do Tipo selvagens são usualmente aproximadamente quatro (4) nucleotídeos no comprimento, em oposição a uma PAM SpyCas9 que é usualmente dois (2) nucleotídeos no comprimento. Este comprimento de PAM adicional pode limitar o número de locais que podem ser dirigidos por uma PAM do tipo Cas9 II-C do tipo selvagem. Isto cria uma necessidade na técnica para a identificação dos ortólogos mais Cas9 para a edição do genoma.

[0269]Enquanto existem milhares de ortólogos Cas9 no banco de dados NCBI para escolher, é necessário um processo empírico para desenvolver os ortólogos do Cas9 Tipo II-C pequenos com PAMs menos restritivos que proporcionam funcionalidade melhorada em células de mamíferos. Em uma modalidade, a presente invenção contempla um ortólogo do Cas9 Tipo II-C melhorado que permite a edição precisa do genoma com uma faixa mais ampla de sítios alvos. Em uma modalidade, o ortólogo do Cas9 Tipo II-C melhorado tem um tamanho compacto capaz de administração viral eficiente. Em uma modalidade, o Cas9 Tipo II-C melhorada inclui, mas não é limitado a, Haemophilus parainfluenzae (HpaCas9), Simonsiella muelleri (SmuCas9) e Neisseria meningitidis cepa De10444 (Nme2Cas9).

A. PAMs Associados Curtos Com os Ortólogos do Cas9 Tipo II-C

[0270]Os dados apresentados aqui mostram a caracterização de alvos de PAM curtos para vários ortólogos Cas9 Tipo II-C. Figura 17. Por exemplo, os ortólogos do Cas9 Tipo II-C podem interagir com PAMs curtos compreendendo entre um-quatro nucleotídeos requeridos. Embora não seja necessário entender o mecanismo da invenção, acredita-se que estas PAMs ricas em C curtas proporcionam a edição de genoma Cas9 melhorada de sítios alvo não foi previamente acessível mesmo pelos ortólogos Cas9 mais compactos (por exemplo, Nme1Cas9). Em uma modalidade, o PAM Nme2Cas9 tem uma sequência de NNCNCc, em que "c" é a única preferência parcial. Em uma modalidade, um PAM SmuCas9 tem uma sequência de NNNNCT.

Figura 18.

[0271] Acredita-se, atualmente, que os ortólogos de Cas9 com PAMs ricos em C curtos foram validados para a edição do genoma e que Nme2Cas9 é particularmente atrativo como um candidato potencial para a atividade de edição de genes altamente eficiente em células humanas. Em uma modalidade, a presente invenção contempla uma nuclease Nme2Cas9 ligada a um Nme1Cas9 sgRNA do tipo selvagem (por exemplo, Neisseria meningitidis 8013 Cas9, previamente referido como NmeCas9). Nme1Cas9 foi previamente descrito. Sontheimer e colaboradores., “RNA-Directed DNA Cleavage and Gene Editing by Cas9 Enzyme From Neisseria Meningitidis”, Publicação do Pedido de Patente Norte-Americano Número 2014/0349.405 (aqui incorporado por referência). Embora Nme1Cas9 possa ser útil para a edição do genoma, sua limitação principal é o seu PAM relativamente longo, que restringe o número de sítios editáveis em qualquer locus genômico dado.

[0272]Em algumas modalidades, a presente invenção contempla PAMs mais curtos e menos rigorosos para os ortólogos Cas9 Tipo II-C incluindo, mas não se limitando a, Nme2Cas9. Embora não seja necessário entender o mecanismo da invenção, acredita-se que PAMs curtos e menos rigorosos aliviam parcialmente as limitações de restrição alvo, enquanto ainda deixam muitas, se não mais, as vantagens de Nme1Cas9 incluindo, mas não limitadas a, pequeno tamanho (por exemplo, compacidade) para distribuição de AAV “all-in-one” eficiente e acurácia alvo de maior precisão (por exemplo, reduções nas clivagens fora do alvo). Além disso, sgRNAs minimizados para Nme1Cas9 discutidos acima são também compatíveis com construções Nme2Cas9. Consequentemente, tais RNAs guias truncados poderiam provavelmente ser usados para a edição do genoma com Nme2Cas9 também.

[0273] Em uma modalidade, a presente invenção contempla um PAM de HpaCas9 tendo uma sequência de NNNNGNTTT. A despeito do fato de que o PAM longo limita o número de sítios direcionáveis no genoma humano acredita-se que o PAM HpaCas9 pode direcionar sítios com precisão muito alta que é similar à extrema acurácia Nme1Cas9 (acima).

[0274]Os dados apresentados aqui demonstram a capacidade de nucleases Cas9 Tipo II-C alvo em PAMs ricas em C curtos para realizar a edição do genoma em células humanas (HEK293T). Certo e colaboradores., “Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints” Nature Methods 8:671-676 (2011). Por exemplo, HpaCas9 e Nme2Cas9 demonstraram fornecer edição de genoma eficiente em loci específicos, demonstrando que são ativas em células de mamíferos. Figura Sequência Espaçadora Cromossomo Repórter de Tráfego de Luz 19 e a Tabela 2.

Tabela 2: Sequências Alvo Ortólogas do Cas9 Tipo II-C Representativas no Genoma Humano

[0275]Estes dados mostram que ambos Nme2Cas9 e HpaCas9 realizam a edição do genoma em níveis comparáveis com o Nme1Cas9 previamente validado no mesmo locus genômico. Para SmuCas9, a eficiência de edição é relativamente baixa, embora seja significativo que a atividade não seja zero, e aperfeiçoamentos de eficiência são esperados. Nme2Cas9 foi então usada para testar quatorze (14) sítios adicionais no repórter leve de tráfego (TLR) integrado no genoma das células HEK293T. Nestes ensaios, cada sítio se conforma a um padrão de PAM que um "C" é o quinto nucleotídeo da região de PAM (isto é, NNNNCNNN), Notavelmente, todos os quatorze sítios foram editados por Nme2Cas9, indicando que esta enzima é consistentemente ativa com uma variedade de guias em células de mamíferos. Os

RNAs guias mais bem-sucedidos se conformam ao consenso de NNNNCCN PAM.

Figura 20.

[0276] A clivagem do ortólogo do Cas9 Tipo II-C foi testada quanto à sensibilidade a proteínas anti-CRISPR. As proteínas anti-CRISPR são proteínas que ocorrem naturalmente que podem desligar Cas9 quando a atividade Cas9 não é mais desejada. Os dados mostram que todos os três ortólogos de Cas9 Tipo II-C são inibidos por certos anti-CRISPRs. Figura 21. A capacidade de controle destes ortólogos Cas9 por anti-CRISPRs poderia aumentar a sua utilidade potencial na edição do genoma.

B. Edição de Genes Nme2Cas9

[0277]Os dados apresentados aqui mostram a edição de genes utilizando o complexo Nme2Cas9-sgRNA. Os dados empregam o sistema repórter de tráfego de luz (TLR) para demonstrar que qualquer dinucleotídeo CC em uma sequência alvo gênica pode funcionar como um PAM, dentro do contexto de uma sequência NNNNCC (acima). Figura 22. Barras azuis são a % de células que exibem fluorescência, enquanto que barras vermelhas indicam % de edição com base mais precisamente no sequenciamento ("análise de TIDE"). Estes dados confirmam que um dinucleotídeo é suficiente para ligação de Nme2Cas9, em oposição a um requisito para uma sequência de trinucleotídeo (por exemplo, o "X" na sequência de NNNNCCX). Embora não seja necessário para entender o mecanismo da invenção, acredita-se que isto significa que os sítios alvos genômicos Nme2Cas9 editáveis são pelo menos tão frequentes como sítios editáveis SpyCas9, e mais frequentes do que com SauCas9, Nme1Cas9 ou CjeCas9 e outras alternativas atuais.

[0278]Além disso, ensaios T7E1 foram empregados para analisar a edição de sítios genômicos nativos (por exemplo, não um repórter fluorescente artificial integrado). Estes dados sugerem que, em algumas situações, o segundo "C" pode não ser necessário. Ver, Figura 23. Note que os sítios alvo DeTSl e DeTS4, ambos no locus AAVS1, permitem a edição em sítios alvo com candidatos PAMs de

NNNNCA e NNNNCG, respectivamente. Vários destes sítios alvo Nme2Cas9 são aqui descritos. Ver, Tabela 3.

Tabela 3: Sítios Alvo de PAM Representativos Para Nme2Cas9 Nome do Locus Sítio Alvo Alvo Sequência Alvo (Espaçador-PAM)

ATGTGGCTCTGGTTCTGGGTACTTTTATCTGTCCCCTCCA Nme2TS1 AAVS1 CCCCACAGTGGG

CAGATAAGGAATCTGCCTAACAGGAGGTGGGGGTTAGAC Nme2TS4 AAVS1 GAATATCAGGAGA

GGGGTTAGACGAATATCAGGAGACTAGGAAGGAGGAGGC Nme2TS5 AAVS1 CTAAGGATGGGGG

CCCACCCGGCGGCGCCTCCCTGCAGGGCTGCTCCCCAG Nme2TS6 Chr. 14 CCCAAACCGCCGCG

TCCGAGAGCTCAGCTAGTCTTCTTCCTCCAACCCGGGCC Nme2TS10 AAVS1 CTATGTCCACTTC

TGGGTACTTTTATCTGTCCCCTCCACCCCACAGTGGGGCC Nme2TS11 AAVS1 ACTAGGGACAGG

GTAGGGGAGCTGCCCAAATGAAAGGAGTGAGAGGTGACC Nme2TS12 AAVS1 CGAATCCACAGGA

TAGCACCTCTCCATCCTCTTGCTTTCTTTGCCTGGACACC Nme2TS13 AAVS1 CCGTTCTCCTGT

GTCTCCCTTGCGTCCCGCCTCCCCTTCTTGTAGGCCTGCA Nme2TS14 AAVS1 TCATCACCGTTT

CCTCACCCAACCCCATGCCGTGTTCACTCGCTGGGTTCC Nme2TS15 AAVS1 CTTTTCCTTCTCCT

GCGCAGGACAGGAGTCGCCAGAGGCCGGTGGTGGATTT Nme2TS16 Chr. 14 CCTCCCCGCATCTC

CGCGGGGACGCCCAGCGGCCGGATATCAGCTGCCACGC Nme2TS17 Chr. 14 CCGCGTGGGCGGA

GATTCCAATAGATCTGTGTGTCCCTCTCCCCACCCGTCCC Nme2TS22 VEGF TGTCCGGCTCTC

TGACCCCTGGCCTTCTCCCCGCTCCAACGCCCTCAACCC Nme2TS23 VEGF CACACGCACACAC

TCCCTCTCCCCACCCGTCCCTGTCCGGCTCTCCGCCTTC Nme2TS24 VEGF CCCTGCCCCCTTC

ACACGCACACACTCACTCACCCACACAGACACACACGTC Nme2TS25 VEGF CTCACTCTCGAAG Chr. 7 TAAGCACAGTGGAAGAATTTCATTCTGTTCTCAGTTTTCCT Nme2TS26 (CFTR) GGATTATGCCT Chr. 7 TTCATTCTGTTCTCAGTTTTCCTGGATTATGCCTGGCACCA Nme2TS27 (CFTR) TTAAAGAAAAT

[0279]Embora não seja necessário entender o mecanismo da invenção, acredita-se que estes dados sugerem que pode haver sítios de edição candidatos em um genoma a cada 4-8 pares de bases, em média. Estes dados também sugerem que a maioria dos sgRNAs de Cas9 têm alguma funcionalidade, consequentemente, a necessidade de triagem de sgRNA pode ser enfatizada na técnica.

C. Domínios de Interação de PAM que Evoluem Rapidamente

[0280]Aplicações in vivo de CRISPR-Cas9 têm o potencial de transformar muitas áreas de biotecnologia e terapêuticas. Existem milhares de ortólogos Cas9 na natureza, sendo que apenas algumas têm sido validadas para a edição de genoma in vivo. O Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpyCas9) tem sido amplamente usado devido à sua alta eficiência e motivo adjacente protoespaçador NGG não restritivo (PAM). No entanto, o tamanho relativamente grande de SpyCas9 restringe seu uso em aplicações terapêuticas in vivo, utilizando-se veículos de distribuição com capacidade de empacotamento limitada tal como vírus adeno-associado (AAV).

Sabe-se que vários ortólogos de Cas9 menores são ativos em células de mamíferos, mas possuem PAMs mais restritivos que limitam a densidade do sítio alvo. A variação natural nos Domínios de Interação de PAM (PIDs) de ortólogos Cas9 intimamente relacionados pode ser aproveitada para identificar uma enzima de edição do genoma que supera estas limitações. Em algumas modalidades, a presente invenção contempla o uso de um complexo Nme2Cas9 que é compacto, Cas9 naturalmente hiper-acurado com um N4CC PAM. Os dados apresentados aqui mostram que Nme2Cas9 é uma plataforma de edição de genoma de mamíferos de alta fidelidade que proporciona a mesma densidade de sítio alvo como SpyCas9. A liberação de Nme2Cas9 com seu RNA guia através de um vetor de AAV “all-in-one” leva a uma edição de genoma eficiente em camundongos adultos, com o direcionamento do gene de Pcsk9 no fígado induzindo a redução do colesterol no soro sem nenhum direcionamento significativo (infra). Nme2Cas9 também fornece uma combinação única de compatibilidade com relação à AAV “all-in-one”, hiper-acurácia natural, e densidade de sítio alvo elevada para a edição de genoma in vivo em mamíferos.

[0281]Além da densidade alvo, a minimização da atividade fora do alvo (por exemplo, clivagem em loci indesejados) de um Cas9 é altamente desejável para sua utilização como um agente terapêutico seguro. O tipo selvagem (wt) SpyCas9 possui alto grau de atividade fora do alvo devido à sua cinética de hibridização única. (Klein e colaboradores, 2018). Em particular, as questões permanecem com relação a sua eficiência de edição no-alvo e estas variantes não superam as limitações discutidas acima com relação ao tamanho global. Em contraste, foi mostrado aqui que as modalidades de Nme1Cas9 e CjeCas9 compreendem atividade de edição de genes naturalmente precisa. Embora não seja necessário entender o mecanismo de uma invenção, acredita-se que não foi anteriormente reportado que não se relatou que nenhum Cas9 ortólogo que: i) esteja ativo em células humanas; ii) exibe a densidade de sítio alvo excepcionalmente alta de SpyCas9; iii) é suficientemente compacto para a capacidade de distribuição AAV “all-in-one”; e iv) é naturalmente hiper-acurado. Em uma modalidade, a presente invenção contempla um Nme2Cas9 como uma plataforma de edição de genoma compreendendo todas as características descritas acima. Por exemplo, Nme2Cas9 compreende um sítio de ligação que compreende uma alta afinidade para um PAM de N4CC, é hiper-acurado e funciona eficientemente em células de mamíferos. Em uma modalidade, Nme2Cas9 é empacotado em uma plataforma de distribuição de AAV “all-in-one” para edição de genoma terapêutico.

1. Os Ortólogos de Nme1Cas9 Intimamente Relacionados Com PIDs que Evoluem Rapidamente

[0282]Foi relatado previamente que Nme1Cas9 (da cepa de Neisseria meningitidis 8013) é um Cas9 pequeno, hiper-acurado para a edição de genoma in vivo (Amrandi e colaboradores, 2018). No entanto, Nme1Cas9 se liga a um PAM longo (N4GMTT) que limita seu uso em certos contextos onde uma janela pequena pode ser direcionada. O reconhecimento de P AM por Cas9 ocorre predominantemente através da interação proteína-DNA entre o Domínio de Interação de PAM (PID) de Cas9 e os nucleotídeos adjacentes ao PAM. PIDs são submetidos a alta pressão de seleção por fagos e outros elementos genéticos móveis (MGEs).

Por exemplo, as proteínas anti-CRISPR foram mostradas interagir com PIDs para inibir Cas9 (infra). Isto pode resultar em ortólogos Cas9 intimamente relacionados com PIDs que reconhecem PAMs drasticamente diferentes.

[0283]Recentemente, este princípio foi realçado utilizando duas espécies de Geobacillus. G. sterothermpophilu foi determinado como compreendendo um PID específico para um PAM de N4CRAA, mas quando trocado por uma cepa LC300 PID, sua afinidade mudou para um PAM N4GMAA (Harrington e colaboradores, 2017). Foi suposto que, dado que as cepas de N. meninigitidis são altamente sequenciadas, um Cas9 ortólogo intimamente relacionado poderia ser encontrado com PIDs rapidamente evoluídos que reconhecem PAMs diferentes. Ortólogos Cas9 com identidade de sequência elevada (> 80%) para NmeCas9 cepa 8013 foram investigados porque este Cas9 foi completamente caracterizado para a edição do genoma, é pequeno e hiper-preciso. Foram identificados diversos ortólogos Cas9 que diferiram em suas sequências de aminoácidos PID em comparação com a cepa

8013. Figura 34A.

[0284]Três grupos distintos de ortólogos Cas9 foram encontrados com PIDs drasticamente diferentes. Figura 35A. Uma cepa foi selecionada a partir de cada grupo PID, por exemplo, De11444 do grupo 2 e 98002 do grupo 3. Estes dois loci CRISPR tinham estruturas de leitura aberta Cas9 intactas e conjuntos de CRISPR com vários espaçadores, que sugerem que eles são loci ativos. De modo interessante, o crRNA e o tracrRNA destes loci CRISPR foram idênticos àqueles do 8013 e podem utilizar os mesmos sgRNAs. Figura 35B.

[0285] Para testar se estes ortólogos Cas9 realmente tiveram PIDs com afinidade para PAMs diferentes, por causa da identidade de sequência elevada no restante da proteína destes ortólogos, o PID 8013 foi intercambiado com o PID 98002 e o PID De De11444. Para identificar as PAMs, estas "quimeras" de proteína foram expressas recombinantemente, purificadas e usadas para identificação de PAM in vitro como descrito anteriormente. Resumidamente, um fragmento de DNA compreendendo um protoespaçador e uma sequência randomizada de dez (10) nucleotídeos a jusante foi clivado in vitro usando Cas9 recombinante e um sgRNA que direciona o protoespaçador. Figura 34B. Foi usado um comprimento espaçador de nucleotídeos G23 para o sgRNA, consistente com Nme1Cas9 8013 e outros sistemas Tipo II-C estudados. O ensaio de identificação de PAM revelou que estas diferentes quimeras Cas9 tiveram PIDs que reconhecem PAMs diferentes. Por exemplo, pelo reconhecimento de um resíduo C na posição 5 ao invés de um G reconhecido por Nme1Cas9 8013 com seu N4GATT PAM. Figura 34C.

[0286]Entretanto, os nucleotídeos restantes não puderam ser confiavelmente caracterizados devido à baixa eficiência de clivagem das proteínas quiméricas, o que sugere que os poucos resíduos fora do PID são provavelmente envolvidos para a atividade eficiente. Figura 35C. Para resolver ainda mais as PAMs, um ensaio in vitro foi realizado em uma biblioteca com um PAM randomizado de 7-nuciotídeo, com um C na posição 5 (por exemplo, NNNNCNNN). Os resultados sugeriram que NmeCas9- De11444 e NmeCas9-98002 reconheceram NNNNCC(A) e NNNNCAAA PAMs, respectivamente. Figura 35D. NmeCas9-De1444 teve uma forte preferência para o C na posição 5, mas menos de modo que os nucleotídeos 6 e 7. Como aqui usado, o Cas9 De11444 ortólogo é denominado "Nme2Cas9", e o ortólogo Cas9 980002 é denominado "Nme3Cas9".

[0287]Foi também realizado este ensaio utilizando-se o comprimento total (por exemplo, não-trocado por PID) Nme2Cas9 e observou-se resultados similares.

Figura 34E. Estes resultados sugerem que Nme2Cas9 e Nme3Cas9 têm PIDs que reconhecem PAMs drasticamente diferentes do que o de Nme1Cas9.

2. Nme2Cas9 em Células Humanas

[0288]Porque o PID Nme2Cas9 se liga a uma pequena sequência de PAM, este ortólogo é útil para a edição do genoma humano, especialmente quando alta densidade de direcionamento é envolvida. Para caracterizar o Nme2Cas9, o Nme2Cas9 humanizado de comprimento total (não trocado por PID) foi clonado em um plasmídeo direcionado por CMV junto com NLSs para expressão de mamíferos.

Para a caracterização em células humanas, um sistema Repórter de Luz de Tráfego foi usado similar àquele descrito anteriormente (Certo e colaboradores, 2011).

[0289] Indução de indels +1 “frameshift” foi criada por reparo imperfeito através da união de extremidade não homóloga (NHEJ) no locus TLR 2.0. Na ausência de um DNA doador, resultou uma proteína mCherry em quadro, que pode ser quantificada através de citometria de fluxo. Figura 36A. Como um teste inicial, um plasmídeo Nme2Cas9 foi transfectado juntamente com quinze (15) plasmídeos de sgRNA com espaçadores direcionando para protoespaçadores com PAMs N 4CCX.

Como controles, SpyCas9 e Nme1Cas9 foram usados junto com seus sgRNAs cognatos direcionamento protoespaçadores NGG e N4GATT, respectivamente. As células foram coletadas após setenta e duas (72) horas e o número de células positivas mCherry foi quantificado para cada sítio alvo. SpyCas9 e Nme1Cas9 mostraram uma edição eficiente em seus respectivos alvos (~28% e 10% de mCherry, respectivamente) Figura 36B. Para Nme2Cas9, todos os quinze (15) alvos com N4CCX PAMs foram funcionais a vários graus (variando de 4% a 20% de mCherry), enquanto os tratamentos NmeCas9 sem os controles de sgRNA e/ou N4GATT acompanhantes não produziram células mChesry. Figura 36B. Estes dados sugeriram que Nme2Cas9 reconhece um PAM N4CC em células humanas.

[0290]Para resolver ainda mais Nme2Cas9 PAMs, sítios alvo foram também testados com N5CX e N4CD (D = A, T, G) em células repórter TLR. Não foi observada edição detectável em sítios alvos PAMs N5CX e N4CD, sugerindo que ambos os nucleotídeos C nas posições 5 e 6 são requeridos para a atividade de Nme2Cas9 com base no repórter TLR 2.0. Figuras 37A e 37B. Estes resultados demonstram que Nme2Cas9 compreende um PID que se liga a um PAM de N 4CC e é consistentemente funcional em células de mamíferos no locus TLR 2.0.

[0291]O comprimento da porção espaçadora do crRNA difere entre os ortólogos Cas9 diferentes, o comprimento do espaçador ótimo SpyCas9's é vinte (20) nucleotídeos, no entanto, truncagem para dezessete (17) nucleotídeos são toleradas.

Fu e colaboradores., Nature Biotechnology 32, 279 (2014). Em contraste, Nme1Cas9 compreende sgRNAs com vinte e quatro (24) espaçadores de nucleotídeos e tolerados truncagem de até dezoito nucleotídeos (18). (Amrani e colaboradores, 2018). Para testar o comprimento do espaçador para Nme2Cas9, foram criados plasmídeos sgRNA que visam o mesmo locus, mas com comprimentos de espaçador variáveis. Figura 36C e Figura 37B. As atividades comparáveis foram observadas quando os espaçadores G23, G22 e G21 foram usados, com uma diminuição significativa na atividade quando a guia foi truncada a G20 e G19. Figura 36C. Estes resultados sugerem que o comprimento de espaçador ótimo de Nme2Cas9 é entre 22-24 nucleotídeos, similar àquele de Nme1Cas9, GeoCas9 e CjeCas9. Portanto, todas as experiências descritas a seguir foram realizadas com espaçadores de nucleotídeos 23-24.

[0292]Ortólogos Cas9 são descritos usar seus domínios HNH e RuvC para induzir uma ruptura de fita dupla nas fitas complementares e não-complementares do DNA alvo, respectivamente. Alternativamente, as nickases Cas9 têm sido usadas para melhorar a especificidade de edição do genoma e o reparo dirigido por homologia (HDR) pela criação de saliências. (Ran e colaboradores, 2013). Entretanto, esta abordagem tem sido apenas bem sucedida pelo uso de SpyCas9 devido à sua alta densidade alvo. Para o uso de Nme2Cas9 como uma nickase, Nme2Cas9 D16A e Nme2Cas9H588A foram criados, os quais proporcionam mutações nos resíduos catalíticos dos domínios RuvC e HNH, respectivamente. Uma vez que TLR 2.0 também pode ser usado para estudar a eficiência da HDR, onde um locus reparado expressa GFP quando um doador é fornecido, uma sequência de DNA doadora foi incluída para testar HDR com estas Nme2Cas9 nickases. Os sítios alvo foram selecionados dentro do gene TLR 2.0 para testar a funcionalidade de cada nickase usando-se RNAs guia que direcionam sítios de clivagem de 32 bp e 64 bp separados.

Como um controle, o Nme2Cas9 do tipo selvagem direcionado para um único sítio mostrou uma edição eficiente, acompanhada por indução de ambas as vias de reparo NHEJ e HDR. Para nickases, os sítios de clivagem espaçados de 32 bp e 64 bp separados mostraram a edição utilizando o Nme2Cas9D16A (HNH nickase), mas nenhum alvo foi cortado usando Nme2Cas9H588A. Figura 36D.

[0293] Ortólogos de Cas9 compreendem uma sequência de sementes que geralmente hibridiza a uma sequência alvo entre oito a doze nucleotídeos (8-12) proximais ao PAM. Desemparelhamentos (por exemplo, não complementaridade)

entre a sequência de sementes e o PAM podem reduzir a atividade nuclease Cas9.

Realizou-se uma série de transfecções transitórias que visam o mesmo locus no gene TLR 2.0 pelo deslocamento de desemparelhamentos de nucleotídeo simples ao longo de um espaçador de vinte e três (23) de nucleotídeos. Figura 37C. Similar a outros ortólogos de Cas9, os dados sugerem que Nme2Cas9 possui uma "sequência de sementes" nos primeiros oito a nove (8-9) nucleotídeos que hibridizam para uma sequência alvo próxima ao PAM, conforme deduzida a partir da diminuição no número de células mCherry positiva. Mesmo que a tolerância a desemparelhamentos seja altamente dependente da sequência e do locus alvo de um sgRNA, estes resultados sugerem que Nme2Cas9 tem tolerância muito baixa para desemparelhamentos particularmente em sua sequência de sementes.

3. Eficiência de Edição do Genoma Nme2Cas9

[0294] Nme2Cas9 foi usado para direcionar quarenta (40) sítios alvos diferentes por todo o genoma humano em células HEK293T usando transfecções transitórias. Tabela 4.

Tabela 4: Sítios Alvo Nme2Cas9 de Célula HEK293T Representativos

[0295] 72 horas após a transfecção, as células foram coletadas seguido por extração de gDNA e amplificação seletiva do locus direcionado. Uma análise de Rastreamento de Indels por Decomposição (TIDE) foi usada para medir as taxas de indel em cada locus. A edição eficiente de Nme2Cas9 foi observada, mesmo que as taxas de indel variaram significativamente dependendo da sequência alvo e do locus.

Figura 38A. Além disso, a afinidade de Nme2Cas9 para sítios alvos próximo/em locais terapeuticamente relevantes tais como CYBB (mutações causam doença granulomatosa crônica ligada a X) e AGA (mutações causa aspartilglicosaminuria) sugere que Nme2Cas9 tem potencial terapêutico. Além disso, a eficiência de edição pode ser aumentada pelo aumento da quantidade do plasmídeo Nme2Cas9. Figura 39A. Tomados juntos, estes resultados demonstram que Nme2Cas9 pode ser construído para editar seletivamente sítios genômicos alvos específicos em células HEK293T.

[0296]Em adição a células HEK293T, a eficiência de edição de gene Nme2Cas9 foi determinada em várias outras células de mamíferos, incluindo células de leucemia humana K562, células de osteossarcoma humano U20S e células de hepatoma Hepal 1-6 de fígado de camundongo. Uma construção lentivírus que expressa Nme2Cas9 foi criada e transduzida em células K562 para expressar estavelmente Nme2Cas9 sob o controle do promotor SFFV. Esta linhagem celular estável não mostrou nenhuma diferença significativa com relação ao crescimento e morfologia em comparação com células não tratadas, sugerindo que o Nme2Cas9 não é tóxico quando expresso estavelmente. Estas células foram transitoriamente eletroporadas com plasmídeos expressando sgRNAs que direcionam vários sítios alvos e analisadas após setenta e duas (72) horas para taxas de indel por TIDE. A edição eficiente foi observada nos três sítios testados, demonstrando a capacidade de Nme2Cas9 para funcionar em células K562. Para células Hepa 1-6, plasmídeos que codificam Nme2Cas9 e sgRNA foram co-transfectados usando técnicas similares à transdução HEK293T descrita acima. Estes dados também mostram que

Nme2Cas9, eficientemente editou os sítios Pcsk9 e Rosa26 nesta linhagem celular de camundongos. Figura 38B.

[0297]O trabalho anterior sugere que a administração de ribonucleoproteína (RNP) de Cas9s, em vez de transfecção de plasmídeo, pode ser uma escolha alternativa para algumas aplicações de edição de genoma. Por exemplo, efeitos fora de alvo de SpyCas9 podem ser reduzidos significativamente com eletroporações de RNP em comparação com a distribuição de plasmídeo. Kim e colaboradores., Genome Research 24:1012-1019 (2014). Para testar se Nme2Cas9 é funcional por liberação de RNP, um Nme2Cas9 marcado com His foi clonado junto com três (3) sinais de localização nuclear (NLSs) e uma proteína recombinante purificada em uma construção de expressão bacteriana. sgRNAs para direcionar vários sítios alvo validados foram gerados por transcrição in vitro de T7. A eletroporação de um complexo Nme2Cas9: sgRNA induziu uma edição bem-sucedida nos sítios alvo, como detectado por TIDE. Figura 38C. Estes resultados sugerem que Nme2Cas9 pode ser liberado como um plasmídeo, ou como um complexo RNP. No geral, estes resultados demonstram que Nme2Cas9 é funcional em vários tipos celulares com diferentes modos de administração.

4. Inibição de Proteína Anti-CRISPR

[0298]Cinco (5) famílias de proteínas anti-CRISPR (Acr) contra Nme1Cas9 de espécies bacterianas diversas foram relatadas para inibir Nme1Cas9 in vitro e em células humanas. (Pawluk e colaboradores 2016, Lee e colaboradores. mBio, in press). Considerando a alta identidade de sequência entre Nme1Cas9 e Nme2Cas9, pareceu provável que pelo menos algumas espécies dentro destas famílias Acr possam também Inibir Nme2Cas9. Todas as cinco famílias Acr foram recombinantemente expressas, purificadas e a capacidade de Nme2Cas9 para clivar uma sequência alvo in vitro foi testada (relação molar de 10:1 Acr: Cas9). Como um controle negativo, um inibidor para o sistema de CRISPR do tipo I-E em E. coli (AcrE2) foi usado. Como esperado, todas as famílias Arc inibiram Nme1Cas9, enquanto

AcrE2 falhou em fazê-lo. Em particular, Acrs IIC1Nme, -IIC2Nme, -IIC3Nme and -IIC4Hpa inibiu a atividade de edição de genes Nme2Cas9. Figura 40A, superior.

[0299]Surpreendentemente, AcrIIC5Smu não inibiu Nme2Cas9 in vitro mesmo em excesso de 10 vezes, sugerindo que ela provavelmente inibe Nme1Cas9 interagindo com um PID. Para ainda confirmar isto, o mesmo ensaio de clivagem in vitro foi realizado usando uma versão híbrida de NmeCas9 (por exemplo, Nme1Cas9 com o PID de Nme2Cas9). Devido à atividade reduzida deste híbrido, concentração mais elevada (~30X) de Cas9 foi usada para obter perfil de clivagem similar enquanto mantendo a proporção molar de 10:1 Cas9:Acr. Consistente com os resultados iniciais, nenhuma inibição por AcrIIC5Smu nesta quimera de proteína foi observada.

Figura 41. A incapacidade de AcrIIC5Smu para inibir a proteína híbrida ainda sugere que a AcrIIC5Smu provavelmente interage com o PID de Nme1Cas9.

[0300]Os dados in vitro acima, sugeriram que o Acrs -IIC1Nme, -IIC2Nme, - IIC3Nme e -IIC4Hpa poderia ser usado como desligadores para a edição do genoma Nme2Cas9. Para testar isto, as transfecções foram realizadas conforme descrito acima na presença ou ausência de plasmídeos que codificam Acrs dirigidos por promotores de mamíferos. Aproximadamente 150 ng de cada plasmídeo (por exemplo, tendo uma proporção de 1: 1: 1 de sgRNA: Cas9: Acr) foi transfectado, já que a maioria dos ACRs foi relatada inibir Nme1Cas9 nestas razões. (Pawluk e colaboradores, 2016). Como esperado do experimento in vitro, AcrIIC1Nme, -IIC2Nme, -IIC3Nme e -IIC4Hpa inibiu a edição do genoma Nme2Cas9, enquanto AcrIIC5Smu falhou em fazê-lo. (Figura 40B. Além disso, observou-se que a inibição completa está abaixo dos níveis de detecção por Acr3Nme e Acr4Hpa, sugerindo sua alta potência em comparação com AcrsIIC1Nme e AcrIIC2Nme. Para comparar ainda mais a potência de AcrIIC1Nme e AcrIIC4Hpa, os experimentos foram realizados em várias razões de Acr para Cas9. Figura 40C. Consequentemente, AcrIIC4Hpa é um inibidor altamente potente contra Nme2Cas9, com concentrações tão baixas quanto 25 ng: 100 ng Acr: Cas9 inibindo Nme2Cas9 por 4 vezes. Em conjunto, estes dados sugerem que proteínas Acr podem ser usadas como desligamentos para aplicações baseadas em Nme2Cas9.

5. Hiper-Acurácia Nme2Cas9

[0301]Os efeitos fora de alvo podem potencialmente confundir aplicações terapêuticas durante a terapia de genes humanos ex vivo e in vivo, por criação de mutações não pretendidas. Uma vez que o SpyCas9 do tipo selvagem tem um número relativamente alto de sítios fora do alvo em células humanas, tem havido diversos esforços para construir variantes SpyCas9 de alta fidelidade com sucesso variável. Em contraste, Nme1Cas9 é naturalmente hiper-acurado, demonstrando fidelidade notável em células e modelos de camundongos. O trabalho anterior mostra que a cinética de hibridização, que não é determinada pelo PID, pode determinar a fidelidade de um Cas9, portanto sugerindo que Nme2Cas9 também pode ser hiper- acurado.

[0302]Para avaliar empiricamente os perfis de NmeCas9 fora do alvo, técnicas identificação não enviesada, em escala genômica, de quebras de dupla fita possibilitada por sequenciamento (GUIDE-Seq) foram usadas para determinar os sítios fora do alvo potenciais de um modo não polarizado. O GUIDE-Seq baseia-se na incorporação de oligodesoxinucleotídeos de fita dupla (dsODNs) em sítios de ruptura de fita dupla de DNA por todo o genoma. Estes sítios de clivagem são detectados por amplificação e sequenciamento de alto rendimento.

[0303]Como uma referência para GUIDE-Seq, foi usado SpyCas9 do tipo selvagem. Em particular, SpyCas9 e Nme2Cas9 foram capazes de serem clonados em cadeias principais idênticas direcionadas pelo mesmo promotor, e usadas para direcionar os mesmos sítios por causa de seus PAMs não sobrepostos. Esta técnica permite a comparação lado a lado das duas nucleases. Seis (6) sítios duplos (DS) foram direcionados em VEGFA com uma sequência NGGNCCN. Figura 42A. Setenta e duas (72) horas após a transfecção, a análise de TIDE foi realizada nos sítios alvo.

Indels induzidas por Nme2Cas9 em todos os seis sítios (6), embora em baixas eficiências em dois dos mesmos, enquanto os SpyCas9 induziram indels nos sítios

4/6. Figura 42B. Em dois destes 4 sítios (DS1 e DS4), SpyCas9 induziram ~7 vezes mais indels do que Nme2Cas9, enquanto que Nme2Cas9 induziram por ~3 vezes de aumento em indels em DS6. Para GUIDE-seq, alvos DS2, DS4 e DS6 foram selecionados para determinar a clivagem fora do alvo em sítios onde Nme2Cas9 é tão eficiente, menos eficiente ou mais eficiente do que SpyCas9, respectivamente.

[0304]Além dos três sítios alvo duplos, um sítio alvo TS6 com uma taxa indel de 30-50% (dependendo do tipo de célula) juntamente com os genes Pcsk9 e Rosa26 de camundongo foram submetidos a análise de GUIDE-Seq. Foi considerado que os perfis fora de alvo seriam mais proeminentes porque o alvo TS6 é conhecido por uma edição de genes altamente eficiente. Além disso, o teste dos sítios de Pcsk9 e Rosa26 de camundongo revelaria então a fidelidade de Nme2Cas9 em uma linhagem celular diferente, e loci candidatos para edição de genoma in vivo. Consequentemente, transfecções foram realizadas para cada Cas9 junto com seus sgRNAs cognatos e as bibliotecas de dsODNs e GUIDE-Seq foram preparadas. A análise de GUIDE-Seq demonstrou a edição eficiente no alvo com ambos os ortólogos Cas9 com padrões similares observados por TIDE. Para identificação fora do alvo, a análise revelou que enquanto os três sítios SpyCas9 tiveram o alto número esperado de sítios fora do alvo (por exemplo, variando entre aproximadamente entre 10-1000). Nme2Cas9 tinha um perfil fora de alvo surpreendentemente limpo. Especificamente, Nme2Cas9 direcionamento o mesmo sítio duplo mostrou, no máximo, um sítio fora de alvo. Ver, Figura 42C.

[0305]Para validar os sítios fora de alvo detectados por GUIDE-seq, o sequenciamento profundo alvo foi realizado para medir a formação de indel nos loci fora de alvo superiores após a edição independente de GUIDE-seq (isto é, sem co- transfecção do dsODN). Enquanto SpyCas9 mostrou uma considerável edição na maioria dos sítios fora de alvo testados (em alguns casos, mais eficientes do que no sítio no-alvo correspondente), Nme2Cas9 não exibiu indels detectáveis nos sítios fora de alvo isolados DS2 e DS6. Com o Rosa26 sgRNA, Nme2Cas9 induziu ~1% de edição no sítio Rosa26-OT1 em células Hepa 1-6, em comparação com a edição de ~30% no alvo. Figura 42D.

[0306]A seguir, para permitir o uso de SpyCas9 como uma referência para GUIDE-seq, devido ao fato de que SpyCas9 e Nme2Cas9 têm PAMs não sobrepostos que eles podem portanto, potencialmente, editar qualquer sítio duplo (DS) flanqueado por uma sequência 5'- NGGNCC -3', que satisfaz simultaneamente as exigências de PAM de ambas as propriedades de ligação de Cas9. Isto permite comparações lado- a-lado de desligamento de direcionamento com sgRNAs que ligam o mesmo local no alvo. Utilizando os plasmídeos pareados que expressam cada Cas9 e seus respectivos sgRNAs, vinte e oito (28) DSs foram alvejados em múltiplos loci por todo o genoma humano. Setenta e duas (72) horas após a distribuição de plasmídeo, uma análise de TIDE foi realizada nos sítios alvo por cada nuclease. Nme2Cas9 induzidos por indels de dezenove (19), embora em baixas eficiências (< 5%) em quatro deles, enquanto as Indels induzidas por SpyCas9 em vinte e três (23) dos sítios alvo, em um caso com uma eficiência de < 5%. Três sítios alvo duplos foram recalcitrantes para a edição de ambas as nucleases. Enquanto SpyCas9 é claramente mais eficiente em geral, ambas as enzimas têm eficiências similares em muitos dos sítios, e em dois dos dezessete sítios que foram editados por ambas nucleases, Nme2Cas9 foi mais eficiente sob estas condições. Ver, Figura 42E.

[0307]Nota-se que este sítio fora-alvo tem um consenso Nme2Cas9 PAM (ACTCCCT) com apenas 3 desemparelhamentos na extremidade distal de PAM da região de fita-complementar (isto é, fora da semente). Ver, Figura 42F. Estes dados suportam e reforçam nossos resultados de GUIDE-seq indicando um alto grau de acurácia para a edição do genoma Nme2Cas9 em células de mamíferos.

[0308] No- vs fora do alvo nesses lados foram comparados por amplificação visada de cada locus seguido por análise de TIDE. Figura 43A. De modo interessante, não pode ser detectado nenhuma indicação nos sítios fora do alvo para o sgRNA por TIDE, enquanto foi observada uma edição eficiente no alvo. Além disso, as contagens de leitura para estes alvos fora foram negligenciáveis em comparação com aquelas observadas no caso de SpyCas9 sugerindo que Nme2Cas9 é altamente específica.

(Figura 43C, esquerda versus direita, respectivamente). Para corroborar ainda mais estes resultados de GUIDE-Seq, o CRISPRseek foi usado para prever computacionalmente os sítios fora de alvo potentes para dois dos sgRNAs mais ativos com sítios altamente similares no genoma. (Zhu e colaboradores, 2014). Estas foram realizadas com PAMs N4CX e 2-5 erros de pareamento, principalmente na região distal de PAM. Figura 43D. Tomados juntos, estes dados sugerem que Nme2Cas9 é uma nuclease de alta fidelidade em células mamíferas.

6. Aplicações Clínicas

[0309]Em uma modalidade, a presente invenção contempla um complexo Nme2Cas9 como o primeiro compacto, hiper-acurado Cas9 com um pequeno PAM não restritivo para a edição terapêutica do genoma por distribuição de AAV. Embora os pequenos ortólogos de Cas9 hiper-acurados, anteriormente relatados, tenham PAMs mais longos do que aqueles aqui descritos, restringindo, desse modo, seu uso terapêutico devido a sítios alvos limitados em um dado gene (e perfil fora do alvo no caso de SauCas9). Esta desvantagem é exacerbada em loci onde somente uma janela específica pode ser direcionada, ou uma deleção de bloco precisa é necessária.

[0310]A plataforma de distribuição de AAV “ all-in-one” estabelecida aqui pode ser usada para direcionar qualquer gene em qualquer tecido. Além disso, a hiper-acurácia de Nme2Cas9 permite a edição precisa dos genes alvos, desse modo melhorando as preocupações de segurança elevadas devido às atividades fora do alvo previamente observadas. Para este fim, o Nme2Cas9 tem o potencial de não apenas complementar as ferramentas existentes, mas tornar-se uma escolha preferida para a edição terapêutica do genoma por administração viral.

[0311] Além disso, a inibição de Nme2Cas9 por vários Acrs sugere uma possível pressão evolucionária imposta em Cas9 para evoluir rapidamente um domínio particular. Especificamente, a falta de inibição de Nme2Cas9 por AcrIIC5Smu aumenta a possibilidade de que seu mecanismo de inibição seja através de PID.

Considerando que AcrIIC5Smu é o inibidor mais potente de Nme1Cas9 até a data, é contemplado aqui onde AcrIIC5Smu pode ser usado para ligar de forma robusta Nme1Cas9 mas não Nme2Cas9. Este é de particular interesse em contextos celulares onde a multiplexação seria melhorada pela capacidade de controlar um ortólogo específico.

[0312]Finalmente, enquanto existem milhares de ortólogos Cas9 na base de dados pública, apenas um grupo deles tem sido caracterizado. Algumas modalidades aqui contempladas tiram vantagem da variação natural em ortólogos Cas9 intimamente relacionados para criar duas novas Cas9 nucleases, a saber Nme2Cas9 e Nme3Cas9, com PAMs N4CC e N4CAAA, respectivamente. Os dados apresentados aqui demonstram que os ortólogos intimamente relacionados podem ter propriedades vastamente diferentes. Por exemplo, estes ortólogos usam o mesmo sgRNA como Nme1Cas9, que superam as dificuldades na predição de tracrRNAs e determinando a extensão do espaçador direito para cada ortólogo. Além disso, é provável que sgRNAs mais curtos e mais estáveis (tais como modificações químicas) possam ser construídos para expandir para todas as três nucleases. Estas características podem facilitar os esforços de edição do genoma e reduzir os custos associados com a construção de proteína e RNA.

[0313]Deve ser evidente para aqueles versados na técnica que as modalidades aqui descritas não são restritas a Cas9s e podem ser aplicadas a outras proteínas Cas tais como Cas12 e Cas13. Deve-se também apreciar que a hipervariabilidade de Cas9 não é restrita aos PIDs. Considera-se aqui que existem cepas que compartilham alto grau de homologia com um dado Cas9 mas diferem em outros domínios devido a outros tipos de pressão seletiva. Em conjunto, Nme2Cas9 é uma nova nuclease que melhora as plataformas de CRISPR atuais para edição de genoma terapêutico.

V. Plataformas de Distribuição de Nucleotídeos

[0314] Além dos sistemas de distribuição de nucleotídeos AAV acima descritos, a presente invenção contempla vários sistemas de distribuição compatíveis com ácidos nucleicos que proporcionam distribuição aproximadamente uniforme e têm taxas de liberação controláveis. Algumas modalidades da presente invenção consideram sistemas de distribuição de ácido nucleico que codificam complexos Cas9 Tipo II-C-sgRNA como descrito aqui.

[0315]Uma variedade de meios diferentes é descrita abaixo, que são úteis na criação de sistemas de distribuição de ácido nucleico. Não se pretende que qualquer meio ou veículo seja limitante à presente invenção. Note que qualquer meio ou veículo pode ser combinado com outro meio ou veículo; por exemplo, em uma modalidade, um veículo de micropartículas de polímero anexado a um composto pode ser combinado com um meio de gel.

[0316]Veículos ou meios contemplados por esta invenção compreendem um material selecionado do grupo que compreende gelatina, colágeno, ésteres de celulose, sulfato de dextran, polissulfato de pentosan, quitina, sacarídeos, albumina, selantes de fibrina, polivinil pirrolidona sintética, óxido de polietileno, óxido de polipropileno, polímeros de bloco de óxido de polietileno e óxido de polipropileno, polietileno glicol, acrilatos, acrilamidas, metacrilatos incluindo, mas não limitados a, metacrilato de 2-hidroxietila, poli (orto ésteres), cianoacrilatos, bioadesivos do tipo gelatina-resorcina-aldeído, ácido poliacrílico e copolímeros e copolímeros em bloco dos mesmos.

Micropartículas

[0317] Uma modalidade da presente invenção contempla um sistema de distribuição de ácido nucleico que compreende uma micropartícula. Preferivelmente, as micropartículas compreendem lipossomas, nanopartículas, microesferas, nanoesferas, microcápsulas e nanocápsulas. Preferivelmente, algumas micropartículas contempladas pela presente invenção compreendem poli (lactídeo- co-glicolídeo), poliésteres alifáticos incluindo, mas não limitados a, ácido poli-glicólico e ácido poli-láctico, ácido hialurônico, polissacarídeos modificados, quitosana, celulose, dextrano, poliuretanos, ácidos poliacrílicos, pseudo - poli (aminoácidos),

copolímeros relacionados a poliidroxibutrato, polianidridos, polimetilmetacrilato, poli (óxido de etileno), lecitina e fosfolipídeos.

Lipossomas

[0318]Uma modalidade da presente invenção contempla lipossomas capazes de ligar e liberar ácidos nucleicos como descrito aqui. Os lipossomas são bicamadas de lipídeo esféricas microscópicas que circundam um núcleo aquoso que são feitos a partir de moléculas anfifílicas, tais como fosfolipídios. Por exemplo, um lipossoma pode capturar um ácido nucleico entre as caudas hidrofóbicas da micela de fosfolipídeo. Os agentes solúveis em água podem ser aprisionados no núcleo e os agentes solúveis em lipídios podem ser dissolvidos na bicamada tipo revestimento.

Os lipossomas têm uma característica especial pelo fato de que permitem que os produtos químicos solúveis em água e insolúveis em água sejam usados juntos em um meio sem o uso de tensoativos ou outros emulsificantes. Os lipossomas podem formar-se espontaneamente por meio da mistura forçada de fosoolipídeos em meios aquosos. Compostos solúveis em água são dissolvidos em uma solução aquosa capaz de hidratar fosfolipídeos. Mediante a formação dos lipossomas, estes compostos são aprisionados dentro do centro lipossômico aquoso. A parede de lipossomo, sendo uma membrana de fosfolipídeo, mantém materiais solúveis em gordura tais como óleos. Lipossomas proporcionam liberação controlada de compostos incorporados. Além disso, os lipossomas podem ser revestidos com polímeros solúvel em água, tais como polietileno glicol para aumentar a meia-vida farmacocinética. Uma modalidade da presente invenção contempla uma tecnologia de alto cisalhamento para refinar a produção de lipossoma, resultando em lipossomas estáveis unilamelares (camada simples) tendo características estruturais especificamente projetadas. Estas propriedades singulares dos lipossomas permitem o armazenamento simultâneo de compostos normalmente imiscíveis e a capacidade de sua liberação controlada.

[0319]Em algumas modalidades, a presente invenção contempla lipossomas catiônicos e aniônicos, bem como lipossomas que têm lipídios neutros.

Preferivelmente, os lipossomas catiônicos compreendem materiais negativamente carregados através da mistura dos materiais e dos componentes lipossômicos de ácido graxo e permitindo que os mesmos se associem. Claramente, a escolha de um lipossoma catiônico ou aniônico depende do pH desejado da mistura de lipossomo final. Exemplos de lipossomas catiônicos incluem lipofectina, lipofectamina e lipofectace.

[0320]Uma modalidade da presente invenção contempla um sistema de administração de ácido nucleico que compreende lipossomas que proporcionam liberação controlada de pelo menos um ácido nucleico. Preferivelmente, os lipossomas que são capazes de liberação controlada: i) são biodegradáveis e não tóxicos; ii) transporte de compostos solúveis em água e óleo; iii) solubilizar compostos recalcitrante; iv) evitar a oxidação do composto; v) promover a estabilização da proteína; vi) controlar a hidratação ; vii) liberação de composto de controle por variações na composição de bicamadas tais como, mas não limitadas a, comprimento de cadeia de ácido graxo, composição de lipídeo de ácido graxo, quantidades relativas de ácidos graxos saturados e insaturados, e configuração física; viii) ter dependência de solvente; iv) ter dependência de pH e v) ter dependência de temperatura.

[0321]As composições de lipossomas são amplamente categorizadas em duas classificações. Os lipossomas convencionais são geralmente misturas de lecitina natural estabilizada (PC) que pode compreender fosfolipídios sintéticos de cadeia idêntica que podem ou não conter glicolídeos. Lipossomas especiais podem compreender: i) ácidos graxos bipolares, ii) a capacidade de ligar anticorpos para terapias direcionadas ao tecido; iii) revestidos com materiais tais como, mas não limitados a lipoproteína e carboidrato, iv) encapsulação múltipla e v) compatibilidade de emulsão.

[0322]Lipossomas podem ser facilmente feitos no laboratório por métodos tais como, mas não limitados a sonicação e vibração. Alternativamente, os lipossomas de distribuição de composto são comercialmente disponíveis. Por exemplo, os Collaborative Laboratories, Inc. são conhecidos por fabricar lipossomas projetados personalizados para requisitos de distribuição específicos.

Microesferas, Micropartículas e Microcápsulas

[0323]As microesferas e microcápsulas são úteis devido à sua capacidade de manter uma distribuição geralmente uniforme, proporcionar liberação controlada do composto controlado e são econômicas para produzir e distribuir. Preferivelmente, um gel de distribuição associado ou gel impregnado com composto é claro ou, alternativamente, o referido gel é colorido para fácil visualização por pessoal médico.

[0324]As microesferas são obteníveis comercialmente (Prolease®, Alkerme's: Cambridge, Mass). Por exemplo, um meio seco por congelamento compreendendo pelo menos um agente terapêutico é homogeneizado em um solvente adequado e pulverizado para a fabricação de microesferas na faixa de 20 a 90 μm. São então seguidas técnicas que mantêm a integridade de liberação prolongada durante fases de purificação, encapsulação e armazenamento. Scott e colaboradores., Improving Protein Therapeutics With Sustained Release Formulations, Nature Biotechnology, Volume 16:153-157 (1998).

[0325] A modificação da composição de microesfera pelo uso de polímeros biodegradáveis pode proporcionar uma capacidade de controlar a taxa de liberação de ácido nucleico. Miller e colaboradores., Degradation Rates of Oral Resorbable Implants {Polylactates and Polyglycolates: Rate Modification and Changes in PLA/PGA Copolymer Ratios, J. Biomed. Mater. Res., Vol. II:711-719 (1977).

[0326]Alternativamente, uma preparação de microesfera de liberação sustentada ou controlada é preparada utilizando-se um método de secagem em água, onde uma solução de solvente orgânico de um sal de metal de polímero biodegradável é preparada primeiro. Subsequentemente, um meio dissolvido ou disperso de ácido nucléico é adicionado à solução de sal metálico de polímero biodegradável. A razão em peso de um ácido nucleico para o sal de metal de polímero biodegradável pode, por exemplo, ser de cerca de 1:100000 a cerca de 1:1, preferivelmente de cerca de 1: 20000 a cerca de 1:500 e, com mais preferivelmente,

de cerca de 1: 10000 a cerca de 1: 500. A seguir, a solução de solvente orgânico contendo o sal metálico de polímero biodegradável e o ácido nucleico é derramada em uma fase aquosa para preparar uma emulsão de óleo/água. O solvente na fase oleosa é então evaporado para fornecer microesferas. Finalmente, estas microesferas são então recuperadas, lavadas e liofilizadas. Em seguida, as microesferas podem ser aquecidas sob pressão reduzida para remover a água residual e o solvente orgânico.

[0327]Outros métodos úteis na produção de microesferas que são compatíveis com uma mistura de sal metálico de polímero biodegradável e ácido nucleico são: i) separação de fase durante uma adição gradual de um agente de coacervação; ii) um método de secagem em água ou método de separação de fase, onde um antifloculante é adicionado para evitar aglomeração de partículas e iii) por um método de secagem por pulverização.

[0328]Em uma modalidade, a presente invenção contempla um meio compreendendo uma microesfera ou microcápsula capaz de fornecer uma liberação controlada de um ácido nucleico por uma duração de aproximadamente entre 1 dia e 6 meses. Em uma modalidade, a microesfera ou micropartícula pode ser colorida para permitir ao profissional médico a capacidade de ver o meio claro como ele é dispensado. Em outra modalidade, a microesfera ou microcápsula pode ser clara. Em outra modalidade, a microesfera ou micropartícula é impregnada com um corante fluoroscópico rádio-opaco.

[0329]Microcápsulas de liberação controlada podem ser produzidas utilizando-se técnicas de encapsulação conhecidas, tais como extrusão centrífuga, revestimento de cobertura e suspensão de ar. Tais microesferas e/ou microcápsulas podem ser construídas para atingir as taxas de liberação desejadas. Por exemplo, Oliosphere® (Macromed) é um sistema de microesfera de liberação controlada. Estas microesferas particulares estão disponíveis em tamanhos uniformes variando entre 5 e 500 μm e compostas de polímeros biocompatíveis e biodegradáveis. As composições poliméricas específicas de uma microesfera podem controlar a taxa de liberação de ácido nucleico de tal modo que as microesferas personalizadas são possíveis, incluindo o gerenciamento eficaz do efeito de explosão. ProMaxx® (Epic Therapeutics, Inc.) é um sistema de distribuição de proteína-matriz. O sistema é de natureza aquosa e adaptável a modelos de distribuição farmacêutica padrão. Em particular, ProMaxx® são microesferas de proteína bioerodível que distribuem drogas pequenas e macromoleculares, e podem ser personalizadas com relação ao tamanho de microesfera e às características de liberação desejadas.

[0330]Em uma modalidade, uma microesfera ou micropartícula compreende um material de encapsulação sensível ao pH que é estável a um pH menor do que o pH do mesentério interno. A faixa típica no mesentério interno é de pH 7.6 a pH 7.2.

Consequentemente, as microcápsulas devem ser mantidas a um pH menor do que 7.

No entanto, se for esperada a variabilidade do pH, o material sensível ao pH pode ser selecionado com base nos diferentes critérios de pH necessários para a dissolução das microcápsulas. O ácido nucleico encapsulado, portanto, será selecionado para o ambiente de pH no qual a dissolução é desejada e armazenada em um pH pré- selecionado para manter a estabilidade. Exemplos de material sensível ao pH úteis como encapsulantes são Eudragit® L-100 ou S-100 (Rohm GMBH), ftalato de hidroxipropil metilcelulose, succinato de acetato de hidroxipropil metilcelulose, ftalato de acetato de polivinila, ftalato de acetato de celulose e trimelitato de acetato de celulose. Em uma modalidade, os lipídeos compreendem o revestimento interno das microcápsulas. Nestas composições, estes lipídios podem ser, mas não estão limitados a ésteres parciais de ácidos graxos e hexitiol anidridos, e gorduras comestíveis, tais como triglicerídeos. Lew C. W., Controlled-Release pH Sensitive Capsule And Adhesive System And Method. Patente Norte-Americana No. 5.364.634 (aqui incorporada por referência).

[0331]Em uma modalidade, a presente invenção contempla uma micropartícula compreendendo uma gelatina, ou outro cátion polimérico tendo uma densidade de carga similar à gelatina (isto é, poli-L-lisina) e é usado como um complexo para formar uma micropartícula primária. Uma micropartícula primária é produzida como uma mistura da seguinte composição: i) gelatina (60 bloom, tipo A da pele de suíno), ii) sulfato de 4-condroitina (0,005%-0,1 %), iii) glutaraldeído (25%, grau 1), e iv) cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (cloridrato de EDC), e sacarose ultrapura (Sigma Chemical Co, St. Louis, Mo). Acredita-se que a fonte de gelatina não é crítica; ela pode ser bovina, porcina, humana ou outra fonte animal. Tipicamente, o cátion polimérico está entre 19.000-30.000 daltons. Sulfato de condroitina é então adicionado ao complexo com sulfato de sódio, ou etanol como agente de coacervação.

[0332]Seguindo a formação de uma micropartícula, um ácido nucleico é diretamente ligado à superfície da micropartícula ou é indiretamente ligado utilizando uma "ponte" ou "espaçador". Os grupos amino dos grupos lisina de gelatina são facilmente derivatizados para fornecer sítios para o acoplamento direto de um composto. Alternativamente, espaçadores (isto é, moléculas de ligação e porções de derivatização em ligadores de direcionamento) tais como avidina-biotina são também úteis para acoplar indiretamente ligantes de direcionamento às micropartículas. A estabilidade da micropartícula é controlada pela quantidade de reticulação do glutaraldeído-espaçador induzida pelo cloridrato de EDC. Um meio de liberação controlada é também empiricamente determinado pela densidade final de reticulações de glutaraldeído-espaçador.

[0333]Em uma modalidade, a presente invenção contempla micropartículas formadas por secagem por pulverização de uma composição compreendendo fibrinogênio ou trombina com um ácido nucleico. Preferivelmente, estas micropartículas são solúveis e a proteína selecionada (isto é, fibrinogênio ou trombina) cria as paredes das micropartículas. Consequentemente, os ácidos nucleicos são incorporados dentro, e entre, as paredes proteicas da micropartícula.

Heath e colaboradores., Microparticles And Their Use In Wound Therapy. Patente Norte-Americana No. 6.113.948 (aqui incorporado por referência). Após a aplicação das micropartículas ao tecido vivo, a reação subsequente entre o fibrinogênio e a trombina cria um selante de tecido liberando assim o composto incorporado na área circundante imediata.

[0334]Um versado na técnica entenderá que a forma das microesferas não precisa ser exatamente esférica, somente como partículas muito pequenas capazes de serem pulverizadas ou espalhadas para dentro ou sobre um local cirúrgico (isto é, aberto ou fechado). Em uma modalidade, as micropartículas são compreendidas de um material biocompatível e/ou biodegradável selecionado do grupo consistindo em polilactídeo, poliglicolídeo e copolímeros de lactídeo/glicolídeo (PLGA), ácido hialurônico, polissacarídeos modificados e qualquer outro material bem conhecido.

Experimental Exemplo I Construção de Plasmídeo Vetor sgRNA-Nme1Cas9-AAV “All-in-One”

[0335]Gene Nme1Cas9 bacteriano tem sido otimizado no códon para expressão em seres humanos, e clonado em um plasmídeo AAV2 sob promotor U1a ubíquo. O RNA guia é o promotor U6. O gene cas9 contém quatro sinais de localização nuclear e três sequências HA tag em tandem. As sequências espaçadoras foram inseridas no cassete de crRNA por digestão do plasmídeo com enzima de restrição SapI usando oligonucleotídeos sintéticos anelados para gerar um duplex com saliências compatíveis com aquelas geradas pela cadeia principal digerida Sapl.

[0336]O gene Nme1Cas9 de códon humano otimizado sob o controle do promotor de U1a e um cassete de sgRNA acionado pelo promotor U6 foram clonados em uma cadeia principal de plasmídeo AAV2. A ORF de NmeCas9 foi flanqueada por quatro sinais de localização nuclear - dois em cada terminal - além de uma etiqueta de epítopo de tripla-HA. Este plasmídeo está disponível através do Addgene (plasmídeo ID 112139). Ver, Figura 64. Oligonucleotídeos com sequências espaçadoras alvejando Hpd, Pcsk9 e Rosa26 foram inseridos no cassete de sgRNA por ligação em um sítio de clonagem de SapI.

[0337]A produção de vetor de AAV foi realizada no centro de Terapia de Gênica Horae na Universidade fr Massachusetts Medical School. Resumidamente, os plasmídeos foram empacotados em capsídeos AAV8 por transfecção de plasmídeo triplo em células HEK293 e purificados por sedimentação conforme descrito anteriormente. Gao e colaboradores., “Introducing genes into mammalian cells: viral vectors” In: Green MR, Sambrook J, editors. Molecular cloning: a laboratory manual.

Volume 2. 4th ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2012. p. 1209–

13. Os perfis fora do alvo destes espaçadores foram preditos computacionalmente utilizando o pacote Bioconductor CHISPRseek. Os parâmetros de busca foram adaptados para os ajustes Nme1Cas9: gRNA.size = 24, PAM = "NNNNGATT", PAM.

Tamanho = 8, RNA.PAM.padrão = “NNNNGNNN$,” pesos = c(0, 0, 0, 0, 0, 0, 0.014, 0, 0, 0.395, 0.317, 0, 0.389, 0.079, 0.445, 0.508, 0.613, 0.851, 0.732, 0.828, 0.615,

0.804, 0.685, 0.583), max.parelhamento = 6, oermitido.mismatch.PAM= 7, topN = 10,000, min.pontuação = 0.

Exemplo II Cultura e Transfecção de Células

[0338]Células de hepatoma Hepa 1-6 de camundongo foram cultivadas em DMEM com SFB a 10% e Penicilina/Estreptomicina a 1% (Gibco) em uma incubadora a 37° C com CO2 a 5%. Células HEK293T humanas e células PLB985 foram cultivadas em DMEM e meio RPMI, respectivamente. Ambos foram suplementados com SFB a 10% e Penicilina/Estreptomicina a 1% (Gibco). Transfecções transitórias de células Hepa 1-6 foram realizadas usando Lipofectamina LTX enquanto o reagente de transfecção Polyfect (Qiagen) foi usado para células HEK293T. Para transfecção transitória, aproximadamente 1x105 células por poço foram cultivadas em placa de 24 poços 24 horas antes da transfecção. Cada poço foi transfectado com 500 ng de plasmídeos sgRNA-Nme1Cas9-AAV “all-in-one”, usando Lipofectamina LTX com Plus Reagent (ThermoFisher) de acordo com o protocolo do fabricante. Células HEK293T foram transfectadas com 400 ng de plasmídeo all-in-one” expressando

Nme1Cas9 e sgRNA em placa de 24 poços de acordo com as diretrizes do fabricante (por exemplo, Psck9 & Rosa26).

[0339]Todas as linhagens celulares foram mantidas em uma incubadora a 37° C com CO2 a 5%. Células de hepatoma Hepa 1-6 de camundongo e HEK293T foram cultivadas em DMEM com SFB a 10% e Penicilina/Estreptomicina a 1% (Gibco).

Células K562 foram crescidas nas mesmas condições, mas utilizando IMDM, Células IMR-90 células foram cultivadas em EMEM e SFB a 10%. Finalmente, células HDFa cresceram em DMEM e FBS a 20%.

Exemplo III Expressão e Purificação de Nme1Cas9

[0340]Nme1Cas9 foi clonado em um vetor pMCSG7 contendo um promotor T7 seguido por His-tag 6X e então um sítio de clivagem de protease de vírus etch de tabaco (TEV). Esta construção foi transformada em cepa de Roseta2 DE3 de E. coli e Nme1Cas9 foi expressa. Resumidamente, cultura bacteriana foi cultivada a 37° C até que OD600 de 0,6 fosse atingida. Neste ponto, a temperatura foi diminuída para 18° C, seguido pela adição de 1 mM de Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosida (IPTG).

Células foram crescidas durante a noite, e então coletadas para purificação.

[0341]A purificação de Nme1Cas9 foi realizada em três etapas: cromatografia por afinidade de níquel, cromatografia de troca catiônica e, então, cromatografia por exclusão de tamanho. Os protocolos detalhados para estas podem ser encontrados em publicações anteriores (Jinek e colaboradores., Science 337, 816-821, 2012).

Exemplo IV Administração de Ribonucleoproteína (RNP) de Nme1Cas9

[0342]A distribuição RNP de Nme1Cas9 foi realizada usando o Sistema de Transfecção de Neon (ThermoFisher). Aproximadamente 20 picomoles de Nme1Cas9 e 25 picomoles de sgRNA foram misturados em tampão R e incubados em temperatura ambiente por 20-30 minutos. Este complexo pré-montado foi então misturado com 50.000-100.000 células, e eletroporado utilizando-se ponteiras de 10 µL. Após a eletroporação, as células foram plaqueadas em placas de 24 poços contendo os meios de cultura apropriados sem antibióticos.

Exemplo V Isolamento de DNA das células e tecido

[0343]DNA genômico foi isolado 72 horas pós-transfecção de células via Kit DNeasy® de sangue e tecido (Qiagen) de acordo com o protocolo do fabricante. Os camundongos foram sacrificados e o tecido do fígado foi coletado 10 dias pós-injeção hidrodinâmica ou 50 dias após a administração do vetor na veia da cauda, e o DNA genômico foi isolado com um kit DNeasy® de sangue e tecido (Qiagen) de acordo com o protocolo do fabricante.

Exemplo VI Análise Indel

[0344]50 ng de DNA genômico foi usado para amplificação de PCR com iniciadores específicos de sítio genômico e High Fidelity® 2X PCR Master Mix (New England Biolabs). Para análise de TIDE, 30 μL de produto PCR foram purificados usando Kit de purificação QIAquick® PCR (Qiagen), e submetido a sequenciamento Sanger. Os valores de indel foram obtidos utilizando-se a ferramenta web TIDE (tide- calculator.nki.nl/) como descrito anteriormente. Brinkman e colaboradores., Nucl.

Acids Res. (2014).

[0345] Para o ensaio de Endonuclease T7 I (T7EI), 10 μL do produto PCR foram hibridizados e tratados com 0,5 μL de Endonuclease T7 I (New England Biolabs) em Tampão NEB 2 durante 1 hora.

[0346]As amostras foram conduzidas em um gel de agarose a 2,5% e quantificadas com programa ImageMaster-TotalLab®. Percentagens de indel foram calculadas como previamente descrito. Guschin e colaboradores., Engineered Zinc Finger Proteins: Methods and Protocols (2010).

Exemplo VII GUIDE-Seq Para Análise Fora do Alvo

[0347]Análise de GUIDE-seq foi realizada conforme descrito anteriormente.

Tsai e colaboradores., Nature Biotechnology (2014), Bolukbasi e colaboradores., Nature Methods (2015a); Amrani e colaboradores., biorxiv.org/content/early/2017/08/04/172650 (2017).

[0348]Resumidamente, células Hepa 1-6 foram transfectadas com 500 ng plasmídeos sgRNA-Nme1Cas9-AAV “all-in-one” e 7,5 pmol de GUIDE-seq oligonucleotídeo analeado usando Lipofectamine LTX® com reagente Plus® (ThermoFisher), para os dois espaçadores visando genes Pcsk9 e Rosa26. DNA genômico foi extraído com um DNeasy® Blood e Tissue kit (Qiagen) em 72 horas após a transfecção seguindo o protocolo do fabricante. Preparações de biblioteca, sequenciamento profundo e análise de leituras foram realizadas conforme descrito anteriormente. Tsai e colaboradores., Nature Biotechnology (2014), Bolukbasi e colaboradores., Nature Methods (2015a); Amrani e colaboradores., biorxiv.org/content/early/2017/ 08/04/172650 (2017).

Exemplo IX Produção de Vetor AAV

[0349]Os plasmídeos foram empacotados em AAV8 por transfecção de plasmídeo triplo em células HEK 293 e purificados por sedimentação conforme descrito anteriormente no Centro de Terapia Gênica Horae na Escola Médica da Universidade de Massachusetts. Gao GP, Sena-Esteves M. Introducing Genes into Mammalian Cells: Viral Vectors. In: Green MR, Sambrook J, eds. Molecular Cloning, Volume 2: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2012:1209–1313.

Exemplo X Animais, Injeções de Vetor AAV, e Processamento do Tecido do Fígado

[0350]Todos os experimentos animais foram aprovados sob as diretrizes Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animal da Escola Médica da Universidade de Massachusetts. Para injeções hidrodinâmicas, 2,5 mL de 30 μg de plasmídeo sgRNA-Nme1Cas9-AAV livre de endotoxina direcionado para Pcsk9, ou PBS como um controle, foram injetados via veia da cauda em camundongos C57BL/6 fêmeas de 9-18 semanas de idade. Para as injeções de vetor AAV8, camundongos C57BL/6 fêmeas de 9-18 semanas de idade foram injetados com 4 x 10 11 cópias de genoma por camundongo na veia de cauda. Camundongos C57BL/6NJ fêmeas de 8 semanas de idade foram usados para experimentos de edição de genoma in vivo. Para experimentos ex vivo, embriões que foram avançados para estágio de duas células foram transferidos para o oviduto de camundongos fêmeas pseudo-grávidas E0.5.

[0351] Os camundongos foram submetidos à eutanásia por CO2 e o fígado foi coletado. Tecidos foram fixados em paraformaldeído 4% durante a noite, e embebidos em parafina, seccionados e corados com hematoxilina e eosina (H&E).

Exemplo XI Análise de Soro

[0352] Sangue (~200 μL) foi coletado da veia facial em 0, 25 e 50 dias pós- administração do vetor. O soro foi isolado utilizando-se um separador de soro (BD, Cat No. 365967) e armazenado a 80° C até o ensaio. Os níveis de colesterol no soro foram medidos por ensaio pontual colorimétrico InfinityTM (Thermo-Scientific) seguindo o protocolo do fabricante. Resumidamente, diluições em série de Calibrador Químico Data-Cal™ foram preparadas em PBS. Em uma placa de 96 poços, 2 μL de soro de camundongos ou diluição de calibrador foram misturados com 200 μL de reagente líquido de colesterol Infinity™, então incubados a 37° C durante 5 minutos.

A absorbância foi medida a 500 nm usando um leitor de microplaca BioTek Synergy® HT.

Exemplo XII Descoberta dos Ortólogos Cas9 Com PIDs Hiper-Envolvidos

[0353]Sequência Nme1Cas9 foi jateada para encontrar todos os ortólogos Cas9 na espécie Neisseria.

[0354]Ortólogos com identidade de > 80% a Nme1Cas9 foram selecionados para o restante desta análise. Os PIDs de cada um foram então alinhados utilizando

ClustalW2 com aquele de Nme1Cas9 (do 820º aminoácido a 1082º) e aqueles com grupos de mutações no PID foram selecionados.

[0355]A sequência de peptídeos Nme1Cas9 foi usada como uma consulta em pesquisas BLAST para encontrar todos os ortólogos Cas9 em cepas Neisseria meningitidis. Ortólogos com identidade de > 80% a Nme1Cas9 foram selecionados para estudo. Os PIDs foram então alinhados com o de Nme1Cas9 (resíduos 820- 1082) utilizando ClustalW2® e aqueles com grupos de mutações no PID foram selecionados para análise adicional. Uma árvore filogenética não enraizada de ortólogos NmeCas9 foi construída utilizando FigTree (tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree).

Exemplo XIII Clonagem e Purificação de Nme2 e Nme3 Cas9 e seus Ortólogos Acr

[0356] Os PIDs de Nme2Cas9 e Nme3Cas9 foram ordenados como gBlocks (IDT) para substituir o PID de Nme1Cas9 utilizando Gibson Assembly (NEB) em um plasmídeo de expressão bacteriana pMSCG7 com His-tag 6X. A construção foi transformada em E. coli, expressa e purificada conforme descrito anteriormente.

[0357] Resumidamente, as células Rosetta (DE3) contendo os respectivos plasmídeos Cas9 foram cultivadas a 37° C a uma densidade ótica de 0,6 e a expressão de proteína foi induzida por 1 mM de IPTG por 16 horas a 18° C. As células foram coletadas e lisadas por sonicação em tampão de lise (50 mM Tris pH 7.5, 500 mM de NaCl, 5 mM imidazol, 1 mM DTT) suplementado com lisozima e coquetel inibidor de Protease (Sigma).

[0358]O lisado foi então corrido através de uma coluna de agarose de Ni-NTA (Qiagen), a proteína ligada foi eluída com imidazol 300 mM e dialisada em tampão de armazenamento (20 mM HEPES pH 7.5, 250 mM NaCl, 1 mM DTT). Para proteínas Acr, proteínas marcadas 6x His foram expressas na cepa E. coli BL21 Rosetta (DE3).

Células foram crescidas a 37° C até uma densidade óptica (OD 600nm) de 0,6 em uma incubadora de agitação. As culturas bacterianas foram resfriadas a 18° C, e a expressão de proteína foi induzida por adição de IPTG 1 mM para a expressão de um dia para o outro. No dia seguinte, as células foram coletadas e ressuspensas em tampão de lise (50 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 5 mM imidazol, 1 mM DTT) suplementado com 1 mg/mL de Lisozima e coquetel inibidor de protease (Sigma) e proteína foi purificada utilizando o mesmo protocolo como para Cas9. A marcação 6X His foi removida por incubação com protease de Vírus Etch de Tabaco (TEV) de um dia para o outro a 4° C para isolar os Acrs não marcados e clivados com sucesso.

Exemplo IVX Ensaio de Descoberta de PAM in vitro

[0359]Uma biblioteca de protoespaçadores com sequências de PAM aleatorizadas foi gerada usando PCRs sobrepostos, com o iniciador forward contendo o PAM randomizado de 10 nucleotídeos.

[0360]A biblioteca foi purificada em gel e submetida a reação de clivagem in vitro por Cas9 purificado juntamente com sgRNAs transcritos in vitro. 300 nM de complexo Cas9: sgRNA foi usado para clivar 300 nM do fragmento alvo em Tampão 1X NE 3.1 (NEB) a 37° C por 1 hora. A reação foi então tratada com proteinase K a 50° C por 10 minutos e corrida em um gel de agarose a 4% com 1X TAE. O produto de clivagem foi purificado e submetido à preparação de biblioteca. A biblioteca foi sequenciada utilizando a plataforma de sequenciamento Illumina NextSeq500 ® e analisada. Sequências logos foram geradas usando R.

Exemplo XV Transfecções e Edição de Genoma de Mamíferos

[0361]Nme2Cas9 humanizado foi clonado em plasmídeo pCDest2 previamente usado para expressão de Nme1Cas9 e SpyCas9 utilizando Gibson Assembly. A transfecção das células HEK293T e HEK293T-TLR foi realizada conforme descrito anteriormente (Amrani e colaboradores. 2018). Para transfecções Hepa 1-6, Lipofectamina LTX foi usada para transfectar 500 ng de plasmídeo AAV.sgRNA.Nme2Cas9 “all-in-one” em aproximadamente 1x105 células por poço que foram cultivadas em placas 24-poços 24 horas antes da transfecção. Para células

K562 que expressam estavelmente Nme2Cas9, 50.000 e 150.000 células foram eletroporadas com plasmídeo de 500 sgRNA usando-se ponteiras Neon de 10 µL.

[0362] Para a medição de indels em todas as células, 72 horas após as transfecções, as células foram coletadas e o DNA genômico foi extraído utilizando o Kit de Sangue e tecido DNaesy® (Qiagen). O locus direcionado foi amplificado por PCR, sequenciado por Sanger (Genewiz®) e analisado por TIDE (Brinkman e colaboradores 2014).

Exemplo XVI Transdução de lentivírus de células K562 para expressar estavelmente células Nme2Cas9

[0363]Células K562 estavelmente expressando Nme2Cas9 foram geradas conforme descrito anteriormente. Para a produção de lentivírus, o vetor lentiviral foi co-transfectado em células HEK293T junto com os plasmídeos de empacotamento (Addgene 12260 & 12259) em placas de 6 poços usando Reagente de Transfecção TransIT-LT1 (Mirus Bio) conforme recomendado pelo fabricante. Após 24 horas, o meio foi aspirado das células transfectadas e substituído com 1 mL de meio DMEM fresco.

[0364]No dia seguinte, o sobrenadante contendo o vírus das células transfectadas foi coletado e filtrado através de filtro 0,45 μm. 10 uL do sobrenadante não diluído junto com 2,5 μg de Polibreno foi usado para a transdução de ~ 1 milhão de células K562 em placas de 6 poços. As células transduzidas foram selecionadas usando 2,5 ug/mL de meio contendo Puromicina.

Exemplo XVII Distribuição de RNP Para Edição de Genoma de Mamíferos

[0365]Para experimentos RNP, usou-se um sistema de eletroporação de Neon. 40 picomoles de 3X NLS Nme2Cas9 junto com 50 picomoles de sgRNA transcrito in vitro foram montados em tampão R, e eletroporados usando-se ponteiras Neon de 10 µL. Após a eletroporação, as células foram plaqueadas em placas de 24 poços pré-aquecidas contendo os meios de cultura apropriados sem antibióticos,

Parâmetros de eletroporação (tensão, largura, número de pulsos) foram de 1150 v, 20 ms, 2 pulsos para células HEK293T, 1000 v, 50 ms, 1 pulso para células K562.

Exemplo XVIII GUIDE-Seq

[0366]Experimentos GUIDE-Seq foram executados como descrito anteriormente com pequenas modificações (Amrani e colaboradores, 2018).

[0367]Em resumo, as células HEK293T foram transfectadas com 200 ng de Cas9, 200 ng de sgRNA, e 7,5 pmol de oligonucleotídeo GUIDE-S-seq anelado usando Polyfect (Qiagen) para guiar sítios duplos de direcionamento com SpyCas9 ou Nme2Cas9. Células Hepa 1-6 foram transfectadas como descrito acima.

[0368]DNA genômico foi extraído com um Kit de Sangue e Tecido DNeasy® (Qiagen) 72 h após transfecção de acordo com o protocolo do fabricante. A preparação e o sequenciamento da biblioteca foram executados exatamente conforme descrito anteriormente.

[0369] Para análise, sítios que combinam com uma sequência com dez desemparelhamentos com o sítio alvo foram considerados potenciais sítios fora de alvo. Os dados foram analisados usando-se o pacote Biocondutor GUIDEseq versão

1.1.17 (Zhu e colaboradores, 2017).

Exemplo XIX Sequenciamento e Análise Profunda Direcionada

[0370] O sequenciamento profundo direcionado foi usado para confirmar os resultados de GUIDE-Seq e medir quantitativamente as taxas de indel. Uma amplificação por PCR em duas etapas foi usada para produzir fragmentos de DNA para cada sítio no e fora do alvo. Para SpyCas9, as localizações de topo fora do alvo foram selecionadas.

[0371]Na primeira etapa, os iniciadores específicos de locus que apresentam saliências universais com extremidades complementares aos adaptadores foram misturados com a mistura mestre 2X Phusion® PCR (NEB) para gerar fragmentos que suportam as saliências. Na segunda etapa, os produtos de PGR purificados foram amplificados com um iniciador forward universal e iniciadores reversos indexados.

[0372]Produtos de tamanho total (~250 bp em comprimento) foram extraídos em gel e sequenciados usando-se uma corrida de MiSeq de extremidade pareada. A análise de dados de MiSeq foi realizada exatamente conforme descrito anteriormente (Amrani 2018).

Exemplo XX Análise Fora de Alvo Utilizando CRISPRseek

[0373] As análises globais fora de alvo para TS25 e TS47 foram realizadas utilizando-se o pacote Bioconductor CRISPRseek.

[0374]Pequenas mudanças foram feitas para acomodar as características de Nme2Cas9 não compartilhadas com SpyCas9. Especificamente, as seguintes mudanças foram usadas: gRNA.tamanho = 24, PAM = "NNNNCC", PAM.tamanho = 6, RNA.PAM.padrão = "NNNNCN", sítios fora do alvo com menos de 6 desemparelhamentos foram coletados. Os sítios fora do alvo de potencial superior com base no número e na posição de desemparelhamentos foram selecionados. DNA de células alvo por cada respectivo sgRNA foi usado para amplificar cada locus fora do alvo e analisado por TIDE.

Exemplo XXI Distribuição AV8.Nme2Cas9 In vivo e Processamento do Tecido do Fígado

[0375] Todos os procedimentos animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal Institucional (IACUC) na Escola Médica da Universidade de Massachusetts.

[0376]Para as injeções de vetor AAV8, camundongos C57BL/6 fêmeas de 8 semanas de idade foram injetados com 4 x1011 cópias do genoma por camundongo através da veia da cauda Pcsk9 ou Rosa26. Os camundongos foram sacrificados 28 dias após a administração do vetor e os tecidos do fígado foram coletados para análise. Tecidos do fígado foram fixados em formalina a 4% durante a noite, e embebidos em parafina, seccionados e corados com hematoxilina e eosina (H&E). O sangue foi retirado da veia facial a 0, 14 e 28 dias após a injeção, e o soro foi isolado utilizando um separador de soro (BD, Cat. No. 365967) e armazenado a -80° C até o ensaio. O nível de colesterol no soro foi medido usando-se o ensaio pontual colorimétrico Infinity™ (Thermo-Scientific) seguindo o protocolo do fabricante e conforme descrito anteriormente (Ibraheim e colaboradores. 2018).

Exemplo XXII Animais e Processamento de Tecidos Hepáticos

[0377]Para injeções hidrodinâmicas, 2,5 mL de 30 μg de plasmídeo AAV- sgRNA-hNme1Cas9 livre de endotoxina direcionando Pcsk9 ou 2,5 mL de PBS foram injetados na veia de cauda em camundongos C57BL/6 fêmeas de 9 a 18 semanas de idade. Os camundongos foram submetidos à eutanásia 10 dias depois e o tecido do fígado foi coletado. Para as injeções de vetor AAV8, camundongos C57BL/6 fêmeas de 12 a 16 semanas de idade foram injetados com 4 x 10 11 cópias de genoma por camundongo via veia de cauda, usando vetores que direcionam Pcsk9 ou Rosa26.

Os camundongos foram sacrificados 14 e 50 dias após a administração do vetor e os tecidos do fígado foram coletados para análise.

[0378]Para o alvo Hpd, 2 mL de PBS ou 2 mL de 30 μg de plasmídeo AAV- sgRNA-hNme1Cas9 livre de endotoxina foram administrados em camundongos nocautes Tirorosinemia Fah Tipo 1 de 15 a 21 semanas de idade (Fahneo) através da veia da cauda. Os sgRNAs codificados direcionam sítios no éxon 8 (sgHpd1) ou éxon 11 (sgHpd2). Os camundongos HT1 foram alimentados com 10 mg/L de NTBC (2-(2-nitro-4-trifluormetilbenzoil)-1,3-cicloexanodiona) (Sigma-Aldrich, Cat. No.

PHR1731-1G) em água potável, quando indicado. Ambos os sexos foram usados nesses experimentos. Os camundongos foram mantidos em água NTBC por sete dias após a injeção e então trocados para a água normal. O peso corporal foi monitorado a cada 1 a 3 dias. Os camundongos controle injetados com PBS foram sacrificados quando se tornaram moribundos após a perda de 20% de seu peso corporal após a remoção do tratamento de NTBC.

[0379]Camundongos foram eutanizados de acordo com o nosso protocolo e o tecido do fígado foi cortado e fragmentos armazenados a -80° C. Alguns tecidos do fígado foram fixados em formalina a 4% durante a noite, embebidos em parafina, seccionados e corados com hematoxilina e eosina (H&E).

XXIII Western Blot

[0380]Frações de tecido do fígado foram trituradas e ressuspensas em 150 μL de tampão de lise RIPA. O teor total de proteína foi estimado por Kit de Ensaio de Proteína de Pierce™ BCA (Thermo-Scientific) seguindo o protocolo do fabricante. Um total de 20 μg de proteína a partir de tecido ou 2 ng de Proteína 9/PCSK9 Convertase Pró-proteína de Camundongo Recombinante (R&D Systems, 9258-SE-020) foram carregadas em um 4–20% Mini-- Rotean ® TGX™ Precast Gel (Bio-Rad). As bandas separadas foram transferidas sobre a membrana PVDF e bloqueadas com 5% de solução Bloqueadora de Grau de Bloqueio (Bio-Rad) por 2 horas em temperatura ambiente. As membranas foram incubadas com anticorpos anti-GAPDH de coelho (Abcam ab9485, 1: 2000) ou anti-PCSK9 de cabra (R&D Systems AF3985, 1: 400) durante a noite a 4° C. Membranas foram lavadas cinco vezes em TBST e incubadas com anticorpos anti-coelho de cabra conjugado com peroxidase de raiz forte (HRP)- conjugada (Bio-Rad 1.706.515, 1: 4000) e anticorpos secundários anti-cabra de jumento (R&D Systems HAF109, 1: 2000) durante 2h em temperatura ambiente. As membranas foram lavadas cinco vezes em TBST e visualizadas com substrato Clarity™ western ECL (Bio-Rad) utilizando um processador M35A X-OMAT (Kodak).

Exemplo XXIV Resposta Imunológica Humoral

[0381]Resposta Imune Humoral IgG1 para Nme1Cas9 foi medida por ELISA (Bethyl; Kit ELISA de IgG1, E99-105) seguindo o protocolo do fabricante com algumas modificações.

[0382]Em resumo, a expressão e a purificação em três etapas de Nme1Cas9 e SpyCas9 foram realizadas. Um total de 0,5 μg de proteínas Nme1Cas9 ou SpyCas9 recombinantes suspensas em tampão de revestimento 1X (Bethyl) foi usada para revestir placas de 96 poços (Corning) e incubadas durante 12 horas a 4° C com agitação. Os poços foram lavados três vezes enquanto agitando durante 5 minutos utilizando tampão de lavagem 1X. As placas foram bloqueadas com Solução de Bloqueio de 1 X BSA (Bethyl) por 2 horas em temperatura ambiente, então lavadas três vezes. Amostras de soro foram diluídas 1: 40 utilizando PBS e adicionadas a cada poço em duplicata. Após a incubação das amostras a 4° C durante 5 horas, as placas foram lavadas 3 vezes por 5 minutos e 100 μL de anticorpo anti-camundongo IgG1 biotinilado (Bethyl; 1: 100.000 em solução de bloqueio de BSA 1x) foram adicionados a cada poço. Após incubação por 1 h em temperatura ambiente, as placas foram lavadas quatro vezes e 100 uL de Substrato TMB foram adicionados a cada poço. Permitiu-se que as placas se desenvolvam no escuro por 20 minutos à temperatura ambiente e adicionou-se então 100 μL de solução de Parada ELISA por poço. Após o desenvolvimento da solução amarela, a absorbância foi registrada a 450 nm usando-se um leitor de microplaca BioTek Synergy® HT.

Exemplo XXV Incubação e Transfecção de Zigoto Cepas de camundongos e coleta de embriões

[0383]Todas os experimentos com animais foram conduzidas sob a orientação do Comitê de Cuidado e Uso Animal Institucional (IACUC) da Escola Médica da Universidade de Massachusetts. Camundongos C57BL/6 NJ (Estoque No.

005304) foram obtidos a partir de O Laboratório Jackson. Todos os animais foram mantidos em um ciclo de luz de 12 horas. O meio do ciclo de luz do dia quando foi observado um tampão de acasalamento foi considerado o dia embriônico dia 0,5 (E0,5) de gestação. Os zigotos foram coletados a E0.5 pelo rasgamento da ampola com fórceps e incubação em meio M2 contendo hialuronidase para remover células do cumulus.

Administração in vivo de AAV8.Nme2Cas9 + sgRNA e processamento do tecido do fígado

[0384]Para as injeções de vetor AAV8, foram injetados camundongos C57BL/6NJ fêmeas de 8 semanas de idade com 4X1011 cópias do genoma por camundongo através da veia da cauda, com o sgRNA direcionando um sítio validado em Pcsk9 ou Rosa26. Os camundongos foram sacrificados 28 dias após a administração do vetor e os tecidos do fígado foram coletados para análise. Tecidos do fígado foram fixados em formalina a 4% durante a noite, embebidos em parafina, seccionados e corados com hematoxilina e eosina (H&E). O sangue foi retirado da veia facial em 0, 14 e 28 dias após a injeção, e o soro foi isolado utilizando um separador de soro (BD, Cat. No. 365967) e armazenado a -80° C até o ensaio. O nível de colesterol no soro foi medido usando-se o ensaio pontual colorimétrico Infinity™ (Thermo-Scientific) seguindo o protocolo do fabricante e conforme descrito anteriormente. Isbreim e colaboradores. Ibraheim e colaboradores., ” All-in-One Adeno-associated Virus Delivery and Genome Editing by Neisseria meningitidis Cas9 in vivo” Genome Biology 19:137 (2018).

[0385]Para um Western blot anti-PCSK9, 40 μg de proteína de tecido ou 2 ng de Proteína Recombinante PCSK9 de Camundongo (R&D Systems, 9258-SE-020) foram carregadas em um Gel Pré-Fundido MiniProtean ® TGX™ (Bio-Rad). As bandas separadas foram transferidas sobre uma membrana PVDF e bloqueadas com 5% de solução Blocking-Grade Blocker® (Bio-Rad) por 2 horas em temperatura ambiente. A seguir, a membrana foi incubada com anticorpos anti-GAPDH de coelho (Abcam ab9485, 1: 2.000) ou anti-PCSK9 de cabra (R&D Systems AF3985, 1: 400) durante a noite. As membranas foram lavadas em TBST e incubadas com anti-coelho de cabra conjugado com peroxidase de raiz forte (HRP) (Bio-Rad 1706515, 1: 4.000), e anticorpos secundários anti-cabra de jumento (R&D Systems HAF109, 1: 2.000) por 2 horas em temperatura ambiente. As membranas foram lavadas novamente em TBST e visualizadas usando-se um substrato Clarity™ western ECL (Bio-Rad) utilizando um processador M35A XOMAT (Kodak).

Administração ex vivo de AAV6.Nme2Cas9 em zigotos de camundongos

[0386] Zigotos foram incubados em gotas de 15 μL de KSOM (Meio Otimizado Simplex Suplementado por Potássio, Millipore, Cat. No. MR-106-D) contendo 3x109 ou 3x108 GCs de vetor AAV6.Nme2Cas9.sgTyr por 5-6 h (4 zigotos em cada gota).

Após a incubação, os zigotos foram lavados em M2 e transferidos para KSOM fresco para cultura durante a noite. No dia seguinte, os embriões que avançaram para o estágio 2-celular foram transferidos para o oviduto de receptores pseudográvidos e deixados desenvolver-se a termo.

Exemplo XXVI Quantificação e Análises Estatísticas

[0387]Uma análise de dados de descoberta de PAM in vitro foi realizada utilizando R. GraphPad Prism6® para todas as análises estatísticas. Para experimentos de células de mamíferos utilizando Nme2Cas9, 3 réplicas independentes foram realizadas e as percentagens de indel foram calculadas com o uso do programa TIDE, com barras de erro representando s.e.m. Os parâmetros de TIDE foram ajustados para quantificar a indels < 20 nucleotídeos para todas as figuras. Para comparações lado a lado de Nme2Cas9 e SpyCas9, percentagens de indel médias foram calculadas usando Microsoft Excel. Para experimentos in vivo em camundongos, n = 5 para indivíduos controle e teste. Os valores de P foram calculados por teste t de duas caudas não pareado.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Sequência de ácido ribonucleico de guia única (sgRNA) CARACTERIZADA pelo fato de compreender uma região de repetição: anti-repetição truncada.

2. Sequência de sgRNA, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de compreender ainda uma região de Haste 2 truncada.

3. Sequência de sgRNA, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de que compreender ainda uma região espaçadora truncada.

4. Sequência de sgRNA, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a referida sequência de sgRNA tem um comprimento de 121 nucleo- tídeos.

5. Sequência de sgRNA, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de que o comprimento da sequência de sgRNA é selecionado a partir do grupo que consiste em 111 nucleotídeos, 107 nucleotídeos, 105 nucleotídeos, 103 nucleotídeos, 102 nucleotídeos, 101 nucleotídeos e 99 nucleotídeos.

6. Sequência de sgRNA, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADA pelo fato de que a referida sequência de sgRNA tem um comprimento de 100 nucleo- tídeos.

7. Sequência de sgRNA, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a referida sequência de sgRNA é uma sequência de ácido ribonu- cleico de guia única Nme1Cas9 ou uma sequência de ácido ribonucleico de guia única Nme2Cas9.

8. Sequência de ácido ribonucleico de guia única (sgRNA) CARACTERIZADA pelo fato de compreender uma região de Haste 2 truncada.

9. Sequência de sgRNA, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de compreender ainda uma região de repetição: anti-repetição truncada.

10. Sequência de sgRNA, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA pelo fato de compreender ainda uma região espaçadora truncada.

11. Sequência de sgRNA, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA pelo fato de que o comprimento da sequência de sgRNA é sele- cionado a partir do grupo que consiste de 111 nucleotídeos, 107 nucleotídeos, 105 nucleotídeos, 103 nucleotídeos, 102 nucleotídeos, 101 nucleotídeos e 99 nucleotí- deos.

12. Sequência de sgRNA, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que a referida sequência de sgRNA tem um compri- mento de 100 nucleotídeos.

13. Plasmídeo viral adeno-associado (AAV) CARACTERIZADO pelo fato de compreender um vetor de ácido nucleico de ácido ribonucleico - Neisseria meningitidis Cas9 de guia única.

14. Plasmídeo AAV, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido vetor de ácido nucleico de ácido ribonucleico - Neisseria meningitidis Cas9 de guia única compreende pelo menos um promotor.

15. Plasmídeo AAV, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um promotor é selecionado a partir do grupo consistindo em um promotor U6 e um promotor U1a.

16. Plasmídeo AAV, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido vetor de ácido nucleico de ácido ribonucleico - Neisseria meningitidis Cas9 de guia única compreende uma sequência de Kozak.

17. Plasmídeo AAV, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido sgRNA compreende uma sequência de ácido nucleico que é complementar a uma sequência gene-de-interesse.

18. Plasmídeo AAV, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida sequência gene-de-interesse é selecionada a partir do grupo que consiste em uma sequência PCSK9 e uma sequência ROSA26.

19. Plasmídeo AAV, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido sgRNA compreende uma sequência repetição-anti-repeti- ção truncada.

20. Plasmídeo AAV, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido sgRNA compreende ainda uma região Haste 2 truncada.

21. Plasmídeo AAV, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido sgRNA compreende ainda uma região espaçadora trun- cada.

22. Plasmídeo AAV, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida sequência de sgRNA tem um comprimento de 121 nucleo- tídeos.

23. Plasmídeo AAV, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida sequência de sgRNA tem um comprimento selecionado do grupo que consiste em 111 nucleotídeos, 107 nucleotídeos, 105 nucleotídeos, 103 nucleotídeos, 102 nucleotídeos, 101 nucleotídeos e 99 nucleotídeos.

24. Plasmídeo AAV, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida sequência sgRNA tem um comprimento de 100 nucleotí- deos.

25. Plasmídeo AAV, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido sgRNA compreende uma região Haste 2 truncada.

26. Plasmídeo AAV, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido sgRNA compreende ainda uma região de repetição: anti- repetição truncada.

27. Plasmídeo AAV, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido sgRNA compreende ainda uma região espaçadora trun- cada.

28. Plasmídeo AAV, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida sequência de sgRNA tem um comprimento selecionado do grupo que consiste em 111 nucleotídeos, 107 nucleotídeos, 105 nucleotídeos, 103 nucleotídeos, 102 nucleotídeos, 101 nucleotídeos e 99 nucleotídeos.

29. Plasmídeo AAV, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida sequência de sgRNA tem um comprimento de 100 nucleo- tídeos.

30. Método CARACTERIZADO pelo fato de compreender: a) prover; i) um paciente exibindo pelo menos um sintoma de uma condição médica, em que o referido paciente compreende uma pluralidade de genes relacionados à referida condição médica; ii) um plasmídeo viral adeno-associado (AAV) que compreende um vetor de ácido nucleico de ácido ribonucleico-Neisseria meningitidis Cas9 de guia única, em que o referido sgRNA compreende uma sequência de ácido nucleico que é comple- mentar a uma porção de pelo menos um da referida pluralidade de genes, e b) administração do referido plasmídeo AAV ao referido paciente sob condi- ções de tal modo que o referido pelo menos um sintoma da referida condição médica seja reduzido.

31. Método, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida condição médica compreende hipercolesterolemia.

32. Método, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos uma da referida pluralidade de genes é um gene PCSK9.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido ácido nucleico de sgRNA é complementar a uma porção do referido gene PCSK9.

34. Método, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido sgRNA compreende uma sequência de repetição-anti-repetição truncada.

35. Método, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido sgRNA compreende ainda uma região Haste 2 truncada.

36. Método, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido sgRNA compreende ainda uma região espaçadora truncada.

37. Método, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida sequência de sgRNA tem um comprimento de 121 nucleotídeos.

38. Método, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida sequência de sgRNA tem um comprimento selecionado do grupo que consiste em 111 nucleotídeos, 107 nucleotídeos, 105 nucleotídeos, 103 nucleotí- deos, 102 nucleotídeos, 101 nucleotídeos e 99 nucleotídeos.

39. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida sequência de sgRNA tem um comprimento de 100 nucleotídeos.

40. Método, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido sgRNA compreende uma região Haste 2 truncada.

41. Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido sgRNA compreende ainda uma região de repetição: anti-repetição truncada.

42. Método, de acordo com a reivindicação 41, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido sgRNA compreende ainda uma região espaçadora truncada.

43. Método, de acordo com a reivindicação 41, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida sequência de sgRNA tem um comprimento selecionado do grupo que consiste em 111 nucleotídeos, 107 nucleotídeos, 105 nucleotídeos, 103 nucleotí- deos, 102 nucleotídeos, 101 nucleotídeos e 99 nucleotídeos.

44. Método, de acordo com a reivindicação 42, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida sequência de sgRNA tem um comprimento de 100 nucleotídeos.

45. Plasmídeo viral adeno-associado (AAV) que codifica uma proteína nuclease Tipo II-C Cas9 CARACTERIZADO pelo fato de que a referida proteína com- preende um domínio de reconhecimento de motivo adjacente protoespaçador confi- gurado com um sítio de ligação a uma sequência motivo adjacente protoespaçadora compreendendo entre um - quatro nucleotídeos requeridos.

46. Plasmídeo viral adeno-associado, de acordo com a reivindicação 45, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida proteína nuclease Tipo II-C Cas9 é selecionada a partir do grupo que consiste em uma proteína nuclease de Neisseria meningitidis cepa De10444 Nme2Cas9, uma proteína nucleasse de Haemophilus pa- rainfluenzae HpaCas9 e uma proteína nucleasse de Simonsiella muelleri SmuCas9.

47. Plasmídeo viral adeno-associado, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida sequência motivo adjacente protoes- paçadora compreendendo entre um - quatro nucleotídeos requeridos é selecionada do grupo consistindo de N4CN3, N4CT, N4CCN, N4CCA, e N4GNT3.

48. Plasmídeo viral adeno-associado, de acordo com a reivindicação 45, CARACTERIZADO pelo fato de que os referidos um - quatro nucleotídeos requeridos são selecionados do grupo consistindo em C, CC, CT, CCN, CCA, CN3 e GNT2.

49. Plasmídeo viral adeno-associado, de acordo com a reivindicação 45, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida proteína nuclease do Tipo II-C Cas9 é ligada a um sgRNA truncado.

50. Método CARACTERIZADO pelo fato de compreender: a) prover; i) um paciente exibindo pelo menos um sintoma de uma condição médica, em que o referido paciente compreende uma pluralidade de genes relacionados à referida condição médica, em que a referida pluralidade de genes compreende um motivo ad- jacente protoespaçador compreendendo entre dois - quatro nucleotídeos requeridos; ii) uma plataforma de distribuição compreendendo pelo menos um ácido nu- cleico que codifica uma proteína nuclease Tipo II-C Cas9, em que a referida proteína compreende um domínio de reconhecimento de motivo adjacente protoespaçador configurado com um sítio de ligação à referida sequência motivo adjacente protoes- paçadora compreendendo entre dois - quatro nucleotídeos requeridos; e b) administrar a referida plataforma de distribuição ao referido paciente sob condições de tal forma que o referido pelo menos um sintoma da referida condição médica seja reduzido.

51. Método, de acordo com a reivindicação 50, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida plataforma de distribuição compreende um plasmídeo viral adeno- associado.

52. Método, de acordo com a reivindicação 50, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida plataforma de distribuição compreende uma micropartícula.

53. Método, de acordo com a reivindicação 50, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida proteína nuclease Tipo II-C Cas9 é selecionada a partir do grupo consistindo em uma proteína nuclease de Neisseria meningitidis cepa De10444 Nme2Cas9, uma proteína nuclease Haemophilus parainfluenzae HpaCas9 e uma pro- teína nuclease Simonsiella muelleri SmuCas9.

54. Método, de acordo com a reivindicação 50, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida sequência motivo adjacente protoespaçadora compreendendo um - quatro nucleotídeos requeridos é selecionada do grupo consistindo em N4C3, N4CT, N4CCN, N4CCA, e N4GNT3.

55. Plasmídeo viral adeno-associado, de acordo com a reivindicação 50, CARACTERIZADO pelo fato de que os referidos um - quatro nucleotídeos requeridos são selecionados do grupo consistindo em C, CC, CT, CCN, CCA, CN3 e GNT2.

56. Método, de acordo com a reivindicação 50, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida proteína nuclease Tipo II-C Cas9 é ligada a um sgRNA truncado.

57. Método, de acordo com a reivindicação 50, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida condição médica é selecionada a partir do grupo que consiste em hiperlipidemia e tirosinemia.