JPH02131581A - 改良された生物学的窒素固定 - Google Patents
改良された生物学的窒素固定Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は農業的に有用な遭伝子工学に関するものである
． （従来の技術） ある種の天然に存在する微生物、例えばクレブシエラ（
Ｋｌｅｂｓ ｉｅ Ｉ ｌａ）属の微生物（例えばクレ
ブソエラ・二１−モニエ）およびリゾビウム（Ｒｈｉｚ
ｏｂｉｕｍ）属の微生物（例えばＲ．メリロティ（ｍｅ
ｌｉｌｏｔｉ）およびＲ．ジャポニカムＮａｐｏｎｉｃ
ｕｍ））は、空中窒素をアンモニアに変換する能力を有
する（窒素固定）．数十年にわたりリゾビウム・ジャポ
ニカムの名称で知られた生育の遅い大豆にコロニー化し
たバクテリア種を、生育の早い種類例えばＲ．メリロテ
イやＲ．ファゼオリ（ρｈａｓｅｏｌｌ）等と区別する
ために、プラディリゾビウム・ジャポニカム（Ｂｒａｄ
ｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍ）と再分類す
ることが従案されている．他の新たに発見された、以前
リゾビウム・フレディイ（ｆ ｒｅｄ ｉ ｉ）と分類
されていた急，速成長大豆へのコロニー化細菌は、現在
ではＲ．ジ中ボニカムとして知られており、本願の特許
請求の範囲でもそのように記載されている．本明細書中
でｒリゾビウムＪの用語は、リゾビウムおよびブラディ
リゾビウムの全ての種を含むものである．図面および好
ましい態様において使用するＲ．ジャポニカムとは、現
在１３．ジャポニカムとして知られている、生育の遅い
バクテリアおよびその遣伝子漫作物をいう．任意嫌気性
菌（ｆａｃｕｌＬａｔｉｖｅ ａｎａｅｒｏｂｅ）で
あるＫ．二二−モニエは、独立生育状態で窒素を固定す
ることができ、他方、リゾビウムおよびプラディリゾビ
うムの種は、通常σ科植物との共生関係を要求する． 生物圏の維持における窒素固定の重要性は、今世紀にま
すます認識されている．過去２ロないし３０年間、地球
の総人口は充分な食料生産を支えるための自然的および
生物字的な天然の窒素固定の姥力をｍ過してしまい、け
界の人口の３０％以上が最低限の′２養のために人工的
窒素源に依存している。
． （従来の技術） ある種の天然に存在する微生物、例えばクレブシエラ（
Ｋｌｅｂｓ ｉｅ Ｉ ｌａ）属の微生物（例えばクレ
ブソエラ・二１−モニエ）およびリゾビウム（Ｒｈｉｚ
ｏｂｉｕｍ）属の微生物（例えばＲ．メリロティ（ｍｅ
ｌｉｌｏｔｉ）およびＲ．ジャポニカムＮａｐｏｎｉｃ
ｕｍ））は、空中窒素をアンモニアに変換する能力を有
する（窒素固定）．数十年にわたりリゾビウム・ジャポ
ニカムの名称で知られた生育の遅い大豆にコロニー化し
たバクテリア種を、生育の早い種類例えばＲ．メリロテ
イやＲ．ファゼオリ（ρｈａｓｅｏｌｌ）等と区別する
ために、プラディリゾビウム・ジャポニカム（Ｂｒａｄ
ｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍ）と再分類す
ることが従案されている．他の新たに発見された、以前
リゾビウム・フレディイ（ｆ ｒｅｄ ｉ ｉ）と分類
されていた急，速成長大豆へのコロニー化細菌は、現在
ではＲ．ジ中ボニカムとして知られており、本願の特許
請求の範囲でもそのように記載されている．本明細書中
でｒリゾビウムＪの用語は、リゾビウムおよびブラディ
リゾビウムの全ての種を含むものである．図面および好
ましい態様において使用するＲ．ジャポニカムとは、現
在１３．ジャポニカムとして知られている、生育の遅い
バクテリアおよびその遣伝子漫作物をいう．任意嫌気性
菌（ｆａｃｕｌＬａｔｉｖｅ ａｎａｅｒｏｂｅ）で
あるＫ．二二−モニエは、独立生育状態で窒素を固定す
ることができ、他方、リゾビウムおよびプラディリゾビ
うムの種は、通常σ科植物との共生関係を要求する． 生物圏の維持における窒素固定の重要性は、今世紀にま
すます認識されている．過去２ロないし３０年間、地球
の総人口は充分な食料生産を支えるための自然的および
生物字的な天然の窒素固定の姥力をｍ過してしまい、け
界の人口の３０％以上が最低限の′２養のために人工的
窒素源に依存している。
リゾビウムおよびタレブシェラの菌に加えて、原核生物
は天然に窒素を固定することができる；例えば偏性鎌気
性生物（例えば、ク１〕ストリジウム・バスチャリアニ
ウム）、偏性好気性生物（例えばアゾトバクター・ビ不
ランディイ）、光合成細胞（例えば、ロドスピリラム・
ルブラム）、およびＩ１ｔ−緑藻川のある種（例えば、
アナヘナ・ンリンドリ力）がそれらに含まれる。
は天然に窒素を固定することができる；例えば偏性鎌気
性生物（例えば、ク１〕ストリジウム・バスチャリアニ
ウム）、偏性好気性生物（例えばアゾトバクター・ビ不
ランディイ）、光合成細胞（例えば、ロドスピリラム・
ルブラム）、およびＩ１ｔ−緑藻川のある種（例えば、
アナヘナ・ンリンドリ力）がそれらに含まれる。
共生生活の関係は、リゾビウノ、と曵ｊ科埴物（例えば
太りまたはアルファルファ）との間に存在しうる．その
ような関係は、宿ｉ已−共生生物の認識塾 ↓よびリゾビウムによる根への侵入により開始し、シム
バクテリアが根癲内で窒素固定性のバクテｌ１イド体に
分化することにより完成する．リゾビウムにより窒木が
固定されるのはハクテロイト体においてのみである．リ
ゾビウム神は宿上−範囲の特異性を有する：例えば、１
？．ジャボニカノーは大一ｉに感染し、Ｒ．メリロティ
はアルファルファに感染する． 農７で一般に用られる埴物は、窒素因定性徴ｌト物との
共生関係になければ、それ自身では窒素を固定すること
ができず、従って、−Ｃ的に窒素肥料の施肥に依存する
．しかしながら、豆科植物とりゾビウムとの共生関係は
、農業分野で利用されている．種々のりゾビウム細菌が
現在市販されていて、大豆、アルファルファ、およびク
ローバーのような豆科毀物の収穫増大に用いられている
．リゾビウムの接種細菌は１９５９年以来、米国で大菫
に販売されており、ＵＳＤＡの推定によれぼれば、米国
の大σの作付け面積の５０％、そしてアルファルファ栽
培地の８０％は、リゾビウムで接種されている． リゾビウム製剤は上記のように広く米国で使用されてい
るが、従来の製剤は収穫の増大のために非常に有効であ
るとは考えられていない．その理生 由の一つは、導入された＠種のその土壌に自濶している
菌種との競争力が乏しいごとにあると考えられる． 窒素固定微生物には、窒素固定経路に関与する生成物を
コードする蝮数の遺伝子−が存在する．Ｋニューモニエ
においては、そのような遺伝子は、ｎ ｉ ｆｉｉｌｉ
伝Ｌとして知られている。類似の遺伝子セントは他の窒
素固定神にも存在ずる（おそらく各神に辷って異なった
配列で存在する）．Ｋ，：ユーモニエのｎｉｆ遺伝ｆは
、７−８オベロンの中に順に配列されている．−つの才
ぺ１］ンは窒素固定経路の玉要酵素（ニトロゲナーゼ）
の蛋白サフ１二５・トをコード引る横造ａ伝ｒ一を含ん
Ｃいる．このニトロゲナーゼオペロンは、プロモーター
（ｎｉｆｌｌブ！」千一ター）二ミつのサプユニ，トＩ
Ｉ造遣伝子、ｎ ｉ ｒ Ｈ、ｎｉｆＤおよびｎｉｒＫ
；および未知機住のｎ ｉ ｆ ＴおよびｎｉｒＹ．ｆ
Ｉ伝子から構成されている．他のオペ・ンは、Ｉ墓’−
”’−，売およびｎ ｉ ｒ ＬおよびｎｉｒＡｉｉｉ
伝Ｙ−から構成されている。ｎｉｆＡ遺伝ｔは転写活性
化蛋白質（ｎｉｒＡ蛋白質）を：１−ドし、この蛋白質
はそれ自身を除く全てのｎｉｆ遣伝ｒを含むオベロンの
発現に要求される。ｎ ｉ ｆ Ｉ．遺伝子はｎｉｆΔ
転写活性化蛋白質を非ａｔ＃．性にする蛋白質をコード
し、従って窒素固定の抑制を司る．（本明細占において
、ｎｉｆＡ遺伝子、ｎｉｆＬプロモーターおよびｎ ｉ
ｆ Ｈ遺伝子およびプロモーターの用語は、Ｋ．ニエ
ーモニエに由来するＤＮＡならびに他の任意の窒素固定
バクテリア由来の機能的に均等なＤＮＡを含む．） フ゛キ中ナン＝−ウォラストン（ＢｕｃｈａｎａｎＷｏ
ｌｌａｓｔｏｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，２９４、７７６Ｎ
９８１）は、ｎｉｒ発現のｊＪ１節におけるｎｉｆＡ遺
伝子産物の役割に関する研究を報告している．それによ
れば、種々のタレブシェラ・ニューモニエ種が、ｎｉｆ
Ａ遺伝子産物の構成的発現のために造成された二つのブ
ラスミドのいずれかで形質転換された，ＰＭＣ７ １Ａ
においテハ、ｎｉｒＡ遣伝子はブラスミドρＡＣＹＣ
ｌ８４のテトラサイクリン耐性遺伝子中にクローン化さ
れテトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーターから転写
された．ｐＭＣ７３Ａにおいては、ｎｉｒＡ遺伝子はプ
ラスミドｐＡＣＹＣ ｌ ７ ７のカナマイシン耐性遺
伝子中にクローン化され、カナマイシン耐性遺伝子のプ
ロモーターから転写された．これらのブラスミドからの
ｎｉｆＡの発現は、正常ｎｉｆ八活性を発現しないＫ．
ニューモニエのミュータント株中で試験された．両ブラ
スミドはｎｉｆＡミエーテーションを補うために観察さ
れた，Ｎｌ＋４÷ （ｎ ｉ ｒ転写開始のネガティブ
因子）の存在下でのｎｉｆの構成的発現もまた、リーデ
ィングフレーム中でのｎ ｉ ｆ Ｉ｛プロモーターと
ｌａｃＺ遺伝子とのゲノム融合体を用いて、Ｋ．ニュー
モニエ株中でのβ−ガラクトース活性を測定することに
より、検討された． （発明が解決しようとする課題） 本発明は、遺伝Ｐ ．１ ？により窒素固定バクテリア
の窒素固定を増加させることによる、穀物収κの増加方
法を桿供する． 一般に、本発明は宿主微生物を形質転換するたしめる一
種もしくはそれ以上の蛋白質をコードするＤＮＡを含み
、該ベクターは該微生物が空中窒素を上記のように変換
する能力を増加することが出来、該ベクターはそのＤＮ
Ａの転写を活性化する催力を持つ活性化蛋白質をコード
する遺伝子を含み、該活性化蛋白質−コード遺伝子は好
ましくは一つの活性化可能プロモーター配列の転写支配
下に存在する． 上記ベクターで形質転換された微生物は向上した窒素固
定能力を有する．このベクターの力によって、通常は限
られた星でしか存在しない活性化蛋白質が、はるかに大
菫に生産され、その結果宿主微生物のｎｉｆｉｆｉ伝子
からのニトロゲナーゼの生産の増加がおこる（過剰に大
聞の活性化蛋白質は実際には植物の生育に致命的であり
うるが）．従って、ｎｉｆＬ一様抑制蛋白質の存在下に
おいてさえも、ニトロゲナーゼ生産を活性化するために
充分なｎｉｆＡの過剰生産が生じる．さらにまた、活性
化可置プロモーターの使用は、宿主細胞が窒素固定を開
始する時点におけるｎｉｒＡ蛋白質の高レベルでの生産
を可徒にする． 同様の効果は別法として、挿入されたｎｉｆＡ遺伝子を
構成的プロモーター（例えばカナマイシン耐性のバクテ
リア遺伝子のプロモーター）の転写調ｖ′Ｆに置くよう
に変化させることによっても、達成することができる． バクテリアが共生的に生存できる徨＃４穀物との共存に
おいて、本発明のベクターで形質転換された窒素同定バ
クデリアは、該バクテリアにより提供される向上した窒
素固定のために、該穀物の収りを増大することができる
． 本発明はさらに、ホモ口ガス・リコンビネーンヨンによ
ってｌ）ＮΔ配列をリゾビウムの染色体の沈黙領域（ｓ
ｉｌｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）に安定に組み込む方法を
桿供する．この方法は、空中窒素を変換する微生物の能
力を向上することのできる本発明のクローン化遺伝子、
または他の任，αの所望遺伝子を組み込むために使用で
きる．本発明の他の態様および利点は以下の記載および
特許請求の範囲の記載から明らかである．（課題を解決
するための手段） 次に本発明の好ましい態様を例にして、本発明を詳述す
る． 二久久二成分 上記のとおウ、本発明のベクターはいくつかの必須のＤ
Ｎ Ａ Ｓｌ域および部位を含み、以下にそれらにつ
いて詳細に説明する． およびプロモーター配 本発明によれば、窒素固定バクテリアとの共生によって
植物が窒素を同化する能力が、活性化蛋白質の遺伝子を
プロモーター、好ましくは活性化可徒なプロモーターの
転写調節下に含むベクターによって形質転換されたバク
テリア、好ましくはりゾビウムの導入によって増強され
る．任意の適当な活性化蛋白質を、任意の適当なプロモ
ーターと一緒に用いることが可能である．最も好ましい
活性化蛋白質遺伝子／プロモーターの組み合わせは、ｎ
ｉｌプロモーター（例えばｎ ｉ ｆ ｆ｛プロモータ
ー）の転写ｔＪ４節下に存在するｎｉｆＡｉ！ｉ伝子で
ある．次に、このｎｉｆシステムおよびこれらの二成分
の天然および本発明の方法での作用を、詳しく説明する
． 上記のとおり、ｎｉｆＡ遺伝子の生産物は、それ自身の
ものを除く全てのｎｉｆオペロンのプロモーターの転写
を開始するために必要な、転”；７．’ｉ性化蛋白質で
ある，ｎｉｆＬの遺伝子産物は、ｎｉｒＡｌｎ質とのコ
ンビネーションによってｎｉ１転写の抑制剤として作用
して該転写を不活性化し、ｎｉｒ転写の活性化および窒
素固定経路の発現を阻止する，ｎｉｆＬリブレッサーは
、その活性化型において、固定化窒素もしくは酸素濃度
の高い細胞内条件下においてのみ、ｎｉｆＡｌ白質を封
鎖する能力を持つ．細胞内固定化窒素濃度が低い条件下
では、ｎｉｆＬリブレッサーは不活性である。このよう
に、ｎｉｆＡおよびｎｉｆＬ．ｉ自質は、フィードバッ
ク阻害ループを形成し、この阻害ループは固定化窒素お
よび酸素が高Ｃ凌に存在する場合にのみ窒素固定を遮断
する．もうひとつのｎｉ［オベロンは、ｎ ｒ ｒ Ｈ
、ｎｉｆＤＳｎｉｆＫ，ｎｉｆＹおよびｎ ｉ ｒ Ｔ
から構成される．このオベロンの最初の三つの遣伝ｆは
、窒素固定経路の主要酵素（ニトロゲナーゼ）のそれぞ
れのサブユニットをコードする．このｎ１ｒオペロンの
全プロモーターの内、多分ｎｉ『Ｈプロモーターがｎｉ
ｆＡ活性化蛋白質に対して最も高い親和性を有してぃる
； ｎ ｉ ｆ Ｈプロモーターは活性化蛋白質に対し
て非常に強く結合するため、ｎｉｆＨプロモーターの複
数コピーがブラスミドに運ばれて細胞内に導入されると
、存在するｎｉｒＡ蛋白質を全て消失さセてしまうほど
である．この高い親和性が油数のＤｉｒプロモーターの
中でｎｉｆＨプロモーターが鰻も強い理由と考えられる
。
太りまたはアルファルファ）との間に存在しうる．その
ような関係は、宿ｉ已−共生生物の認識塾 ↓よびリゾビウムによる根への侵入により開始し、シム
バクテリアが根癲内で窒素固定性のバクテｌ１イド体に
分化することにより完成する．リゾビウムにより窒木が
固定されるのはハクテロイト体においてのみである．リ
ゾビウム神は宿上−範囲の特異性を有する：例えば、１
？．ジャボニカノーは大一ｉに感染し、Ｒ．メリロティ
はアルファルファに感染する． 農７で一般に用られる埴物は、窒素因定性徴ｌト物との
共生関係になければ、それ自身では窒素を固定すること
ができず、従って、−Ｃ的に窒素肥料の施肥に依存する
．しかしながら、豆科植物とりゾビウムとの共生関係は
、農業分野で利用されている．種々のりゾビウム細菌が
現在市販されていて、大豆、アルファルファ、およびク
ローバーのような豆科毀物の収穫増大に用いられている
．リゾビウムの接種細菌は１９５９年以来、米国で大菫
に販売されており、ＵＳＤＡの推定によれぼれば、米国
の大σの作付け面積の５０％、そしてアルファルファ栽
培地の８０％は、リゾビウムで接種されている． リゾビウム製剤は上記のように広く米国で使用されてい
るが、従来の製剤は収穫の増大のために非常に有効であ
るとは考えられていない．その理生 由の一つは、導入された＠種のその土壌に自濶している
菌種との競争力が乏しいごとにあると考えられる． 窒素固定微生物には、窒素固定経路に関与する生成物を
コードする蝮数の遺伝子−が存在する．Ｋニューモニエ
においては、そのような遺伝子は、ｎ ｉ ｆｉｉｌｉ
伝Ｌとして知られている。類似の遺伝子セントは他の窒
素固定神にも存在ずる（おそらく各神に辷って異なった
配列で存在する）．Ｋ，：ユーモニエのｎｉｆ遺伝ｆは
、７−８オベロンの中に順に配列されている．−つの才
ぺ１］ンは窒素固定経路の玉要酵素（ニトロゲナーゼ）
の蛋白サフ１二５・トをコード引る横造ａ伝ｒ一を含ん
Ｃいる．このニトロゲナーゼオペロンは、プロモーター
（ｎｉｆｌｌブ！」千一ター）二ミつのサプユニ，トＩ
Ｉ造遣伝子、ｎ ｉ ｒ Ｈ、ｎｉｆＤおよびｎｉｒＫ
；および未知機住のｎ ｉ ｆ ＴおよびｎｉｒＹ．ｆ
Ｉ伝子から構成されている．他のオペ・ンは、Ｉ墓’−
”’−，売およびｎ ｉ ｒ ＬおよびｎｉｒＡｉｉｉ
伝Ｙ−から構成されている。ｎｉｆＡ遺伝ｔは転写活性
化蛋白質（ｎｉｒＡ蛋白質）を：１−ドし、この蛋白質
はそれ自身を除く全てのｎｉｆ遣伝ｒを含むオベロンの
発現に要求される。ｎ ｉ ｆ Ｉ．遺伝子はｎｉｆΔ
転写活性化蛋白質を非ａｔ＃．性にする蛋白質をコード
し、従って窒素固定の抑制を司る．（本明細占において
、ｎｉｆＡ遺伝子、ｎｉｆＬプロモーターおよびｎ ｉ
ｆ Ｈ遺伝子およびプロモーターの用語は、Ｋ．ニエ
ーモニエに由来するＤＮＡならびに他の任意の窒素固定
バクテリア由来の機能的に均等なＤＮＡを含む．） フ゛キ中ナン＝−ウォラストン（ＢｕｃｈａｎａｎＷｏ
ｌｌａｓｔｏｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，２９４、７７６Ｎ
９８１）は、ｎｉｒ発現のｊＪ１節におけるｎｉｆＡ遺
伝子産物の役割に関する研究を報告している．それによ
れば、種々のタレブシェラ・ニューモニエ種が、ｎｉｆ
Ａ遺伝子産物の構成的発現のために造成された二つのブ
ラスミドのいずれかで形質転換された，ＰＭＣ７ １Ａ
においテハ、ｎｉｒＡ遣伝子はブラスミドρＡＣＹＣ
ｌ８４のテトラサイクリン耐性遺伝子中にクローン化さ
れテトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーターから転写
された．ｐＭＣ７３Ａにおいては、ｎｉｒＡ遺伝子はプ
ラスミドｐＡＣＹＣ ｌ ７ ７のカナマイシン耐性遺
伝子中にクローン化され、カナマイシン耐性遺伝子のプ
ロモーターから転写された．これらのブラスミドからの
ｎｉｆＡの発現は、正常ｎｉｆ八活性を発現しないＫ．
ニューモニエのミュータント株中で試験された．両ブラ
スミドはｎｉｆＡミエーテーションを補うために観察さ
れた，Ｎｌ＋４÷ （ｎ ｉ ｒ転写開始のネガティブ
因子）の存在下でのｎｉｆの構成的発現もまた、リーデ
ィングフレーム中でのｎ ｉ ｆ Ｉ｛プロモーターと
ｌａｃＺ遺伝子とのゲノム融合体を用いて、Ｋ．ニュー
モニエ株中でのβ−ガラクトース活性を測定することに
より、検討された． （発明が解決しようとする課題） 本発明は、遺伝Ｐ ．１ ？により窒素固定バクテリア
の窒素固定を増加させることによる、穀物収κの増加方
法を桿供する． 一般に、本発明は宿主微生物を形質転換するたしめる一
種もしくはそれ以上の蛋白質をコードするＤＮＡを含み
、該ベクターは該微生物が空中窒素を上記のように変換
する能力を増加することが出来、該ベクターはそのＤＮ
Ａの転写を活性化する催力を持つ活性化蛋白質をコード
する遺伝子を含み、該活性化蛋白質−コード遺伝子は好
ましくは一つの活性化可能プロモーター配列の転写支配
下に存在する． 上記ベクターで形質転換された微生物は向上した窒素固
定能力を有する．このベクターの力によって、通常は限
られた星でしか存在しない活性化蛋白質が、はるかに大
菫に生産され、その結果宿主微生物のｎｉｆｉｆｉ伝子
からのニトロゲナーゼの生産の増加がおこる（過剰に大
聞の活性化蛋白質は実際には植物の生育に致命的であり
うるが）．従って、ｎｉｆＬ一様抑制蛋白質の存在下に
おいてさえも、ニトロゲナーゼ生産を活性化するために
充分なｎｉｆＡの過剰生産が生じる．さらにまた、活性
化可置プロモーターの使用は、宿主細胞が窒素固定を開
始する時点におけるｎｉｒＡ蛋白質の高レベルでの生産
を可徒にする． 同様の効果は別法として、挿入されたｎｉｆＡ遺伝子を
構成的プロモーター（例えばカナマイシン耐性のバクテ
リア遺伝子のプロモーター）の転写調ｖ′Ｆに置くよう
に変化させることによっても、達成することができる． バクテリアが共生的に生存できる徨＃４穀物との共存に
おいて、本発明のベクターで形質転換された窒素同定バ
クデリアは、該バクテリアにより提供される向上した窒
素固定のために、該穀物の収りを増大することができる
． 本発明はさらに、ホモ口ガス・リコンビネーンヨンによ
ってｌ）ＮΔ配列をリゾビウムの染色体の沈黙領域（ｓ
ｉｌｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）に安定に組み込む方法を
桿供する．この方法は、空中窒素を変換する微生物の能
力を向上することのできる本発明のクローン化遺伝子、
または他の任，αの所望遺伝子を組み込むために使用で
きる．本発明の他の態様および利点は以下の記載および
特許請求の範囲の記載から明らかである．（課題を解決
するための手段） 次に本発明の好ましい態様を例にして、本発明を詳述す
る． 二久久二成分 上記のとおウ、本発明のベクターはいくつかの必須のＤ
Ｎ Ａ Ｓｌ域および部位を含み、以下にそれらにつ
いて詳細に説明する． およびプロモーター配 本発明によれば、窒素固定バクテリアとの共生によって
植物が窒素を同化する能力が、活性化蛋白質の遺伝子を
プロモーター、好ましくは活性化可徒なプロモーターの
転写調節下に含むベクターによって形質転換されたバク
テリア、好ましくはりゾビウムの導入によって増強され
る．任意の適当な活性化蛋白質を、任意の適当なプロモ
ーターと一緒に用いることが可能である．最も好ましい
活性化蛋白質遺伝子／プロモーターの組み合わせは、ｎ
ｉｌプロモーター（例えばｎ ｉ ｆ ｆ｛プロモータ
ー）の転写ｔＪ４節下に存在するｎｉｆＡｉ！ｉ伝子で
ある．次に、このｎｉｆシステムおよびこれらの二成分
の天然および本発明の方法での作用を、詳しく説明する
． 上記のとおり、ｎｉｆＡ遺伝子の生産物は、それ自身の
ものを除く全てのｎｉｆオペロンのプロモーターの転写
を開始するために必要な、転”；７．’ｉ性化蛋白質で
ある，ｎｉｆＬの遺伝子産物は、ｎｉｒＡｌｎ質とのコ
ンビネーションによってｎｉ１転写の抑制剤として作用
して該転写を不活性化し、ｎｉｒ転写の活性化および窒
素固定経路の発現を阻止する，ｎｉｆＬリブレッサーは
、その活性化型において、固定化窒素もしくは酸素濃度
の高い細胞内条件下においてのみ、ｎｉｆＡｌ白質を封
鎖する能力を持つ．細胞内固定化窒素濃度が低い条件下
では、ｎｉｆＬリブレッサーは不活性である。このよう
に、ｎｉｆＡおよびｎｉｆＬ．ｉ自質は、フィードバッ
ク阻害ループを形成し、この阻害ループは固定化窒素お
よび酸素が高Ｃ凌に存在する場合にのみ窒素固定を遮断
する．もうひとつのｎｉ［オベロンは、ｎ ｒ ｒ Ｈ
、ｎｉｆＤＳｎｉｆＫ，ｎｉｆＹおよびｎ ｉ ｒ Ｔ
から構成される．このオベロンの最初の三つの遣伝ｆは
、窒素固定経路の主要酵素（ニトロゲナーゼ）のそれぞ
れのサブユニットをコードする．このｎ１ｒオペロンの
全プロモーターの内、多分ｎｉ『Ｈプロモーターがｎｉ
ｆＡ活性化蛋白質に対して最も高い親和性を有してぃる
； ｎ ｉ ｆ Ｈプロモーターは活性化蛋白質に対し
て非常に強く結合するため、ｎｉｆＨプロモーターの複
数コピーがブラスミドに運ばれて細胞内に導入されると
、存在するｎｉｒＡ蛋白質を全て消失さセてしまうほど
である．この高い親和性が油数のＤｉｒプロモーターの
中でｎｉｆＨプロモーターが鰻も強い理由と考えられる
。
ｎ ｉ ｆ Ｈプロモーターの調節下に転写されるべく
遺伝子工学捏作されたｎｉｆＡ遺伝子は、ロｉ『Ａ蛋白
質の細胞内ｔ度の増加をもたらす．この増加した濃度は
天然には存在しえない：何故なら、細胞内固定化窒素も
しくは酸素濃度と無関係に、ｍ記のフィードバック阻害
システムがｎｉｆシステムの脱抑制および窒素固定と同
時のニトロゲナーゼの生産の増加の原因となるがらであ
る．ｎｉｆＡ遺伝子は、種間において実質的にボモ「１
ガスであるが、その配列は同一ではない．従って、本発
明によれば、宿王微生物と同一のｎｉｌＡ遺伝子または
その遺伝子部分を用いることが好ましい（例えばＲ．メ
リロティを宿主とするときは、Ｒ，メリロティの遺伝子
が好ましい）．完全なｎｉｆＡ遺伝子を用いることも出
来るが、またはｎｉｒｌ、リプレッサーの結合に関与す
ると考えられる相当するＮ−末端領域を削除したｎｉｆ
Ａ遺伝了の誘導体を用いることも出来る．この領域の削
除は、ｎｉｒＡ蛋白質をより効率的プロモーター活性化
剤とする．ドラモンド（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ）ら， （
１９８６．ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａ１，５：４４１）
は、Ｒ．メリロティとＫ．ニュモニエのｎｉｆＡ蛋白質
を比較して、種々の長さのより非類位のセグメントで分
醪されたホモロジー領域の存在を示した，ｎｉｆＡ蛋白
質のＮ末端ホモロガス領域（集合的にドメイン八と呼ば
れ、これはＲ．メリロティのｎｉｆＡのアミノｆａ１０
からアミノ酸！６３、およびＫ．ニューモニエｎＩｒＡ
のアミノ酸２２からアミノ＃１８２に及んでいる：前記
ドラモンドら）は、ｎｉｒＡプロモーター活性化の抑制
に機能的に関与することが判明した．本発明者らは、ｎ
ｉｆＡ蛋白質から１′メインＡを含むアミノｆａ２から
１６６の領域を削除すると、おそらくリプレッサーの結
合領域を失ったことにより、該蛋白質がより効率的転写
活性化剤となることを見出した． 制御された（例えば活性化可能な）ブロモー夕、例えば
ｎｉｆプロモーターに加えて、ｎｉｆＡ遺伝子の転写を
構成的に行うことのできるプロモーター、例えばカナマ
イシン耐性遺伝子から容易に得られるプロモーターもま
た使用できる．逸■１スニ友二 ブラスミドでの微生物の形質転換は比較的稀なできごと
であるため、本発明のブラスミドは好ましくは形質転換
体の同定のための選択性マーカー蛋白質をコードするＤ
ＮＡｓＪｆ域を含む．このマーカー蛋白質は宿主細胞で
発現できそして該蛋白質を発現した微生物の表現特性を
可能にする任意の蛋白質であってよい．好ましいマーカ
ー蛋白質は、一種もしくはそれ以上の抗生物質、例えば
クロラムフェニコールにたいする耐性を与える蛋白質で
ある．形質転換体は抗生物質の存在下に生育することの
できる微生物である． ｆ力λｌ玉夏造城， ブラスミドは、プロモーターとｎｉｒＡ遺伝子の多数の
異なる組合せによって構築することができる．数種のプ
ロモーターの任，αのものと組み合わせて、Ｒ．メリロ
ティｎｉｒＡ遺伝子をＲ．メリロティの形質転換に使用
する一適当なプロモーターと組み合わせてＢ．ジャポニ
カムのｎｉｒＡ遺伝子を、Ｂ．ジャポニカムのｎｉｆＡ
遣伝子と使用する． Ｒ メ ロー のｎｉｆＡ １冫．メリロティのｎｉｆＡ遺伝子はブラスミドｐＲｍ
Ｂ３．８Ｈの２ ． ４ ｋｂ■』ｉ Ａ ｌフラグ
メントから得られる（第１図参照；およびスゼト（Ｓｚ
ｅｔ）ら，１９８４，Ｃｅｌｌ，３６：１０３５参照）
．Ｒ．メリロティのｎｉｆＡ遺伝子の配列は、ブイケマ
（Ｂｕｉｋｅｍａ）ら．１９８５，Ｎｕｃｌ，Ａｃｉｄ
Ｒｅｓ．．１３：４５３９に記載されている． ■｛ ジ ボニカムのｎｉｆＡ Ｂ．ジャポニカムのｎｉｆＡ遺伝子は、候補のｆｉｘＡ
遣伝子の直ぐ上流に存在する．Ｂ．ジャポニカムのｆｉ
ｘＡコード配列（５’ ＣＣＧＧＡＣＴＣＧＧＣＧＣＡ
Ｃ．ＡＴＣＣＣ；３’）に基づ＜２０ｍｅｒのオリゴヌ
クレオチドを１ローブとして、本発明者らは両方の遺伝
子がＢ．ジ→・ボニカムのゲノムの５．４ｋｂのＨ ｉ
ｎ ｄ ｍＢａｍ｝ｌ ｌフラグメント上に存在する
ことを突き止めた．このフラグメントを’［するために
、Ｂ．ジャポニカムのｒ）ＮＡをＢａｍＨＩで消化し、
回塘勾配で分離した．大きいフラグメ７｝（２０〜２５
ｋｂ）を含むフラクションが標識２０ｍｃｒブローブに
最大のレベルのハイフリダイズを示した．このＤＮＡを
Ｈｉｎｄｎｌで消化しＨ ｉ ｎ ｄ ｍ、ＢａｍＨｌ
およびアルカリホスファターゼで処理しておいたｐＢＲ
３２７にライゲートした．このｎｉｆＡおよびｆｉｘＡ
遣伝子を含む５．４ｋｂのフラグメントをｐＦＣＣ３０
１と呼ばれるプラスミド上のＥ．ｃｏｉ形質転換体から
回収した，ｐＦｃｃ３０１からｎｉｆＡ遺伝子をもつ３
．４６ｋｂのＨ ｉ ｎｃｌ−１》ｓＬＩフラグメント
を取り出して、オリゴヌクレオチドリン力一を用いて両
端をＢａｍ１１ｌ部位に変換したのち、ｐＪｌ１１２０
（ｐＡＣＹＣ １ ８ ４からシャイン−ダルガノ（Ｓ
１））配列と転写開始部位の間のＴａｑｌ部位をＢｇｌ
ｌ１に変換することにより誘導された：第６図）の１３
ｇ ｌ Ｉ１部位にクローン化した．このサブクロー
ニングは、ｎｉｆＡフラグメントからｒｉｘＡ遺伝子を
除去するために行ったのである．得られたプラスミドｐ
ＲＡＲ５６６はＢ．ジ中ポニカムｎｉｆＡ遺伝子の貯蔵
ベクターである（第２図），ｎｉｆＡｉｆｉ伝子のヌク
レオチド配列は｝ニー（Ｔｈ ｏ ｎ ｙ）ら．１９８
７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．．１５：８４７９
に記載されている． ドメイン八が削除ぐーれ−たＲ．メリロティの−ｐ ｉ
−ｎｉｆＡ遺伝子のドメインＡが削除され、そして天然
に存在するシャインーダルガノ配列がより優れた合成Ｓ
Ｄ配列に置換されたブラスミドｐＪＢ２０３は、下記の
ようにして造成された．出発ブラスミドとして、Ｅ．ｃ
ｏｌｉのＣａｔプロモーターに融合した修飾型のｎ１ｆ
Ａ遺伝子を含むｐＪＢＩ８２を用いた．ブラスミドｐ＋
ＪＢ’１８２は、プラスミドｐＪＢｌ６０中のｎｉｆＡ
遺伝子の天然ＳＤ配列を、リポゾームに対する結合親和
性がより強い合成ＳＤ配列に置換し、そしてｐＪＢ１６
０のｒｉｘＡプロモーターをＣａＬプロモーターに置換
して誘導された．ｎｉｒＡ遺伝子の５′末端の天然配列
および上流の６１塩基対は、第１１図のパネル八に示し
た．一層効率の強いＳＤ配列をコードする合成ＤＮＡフ
ラグメント（パネルＢに示す）をバネルＡのＤＮＡ配列
にクローン化し、続いてｐＪＢｌ６０をＢｇｌｌ＋およ
びＦｓｐ ［（部分的）で消化して天然ＳＤ配列を除去
し、ρＪ Ｂ Ｉ ８ ０を得た，ｐＪＢ１８０のリン
ヵーフラグメントの３′末端にＳｐｈ１部位を導入した
，ｐＪＲＩ８０のｒｉｘＡプロモーターを、次にＣａＬ
プロモーターに交換してｐＪ８１８２を得た． ｐ Ｊ ８ １ Ｂ ２からドメイン八を削除するには
、次のようにした．ρＪＢ１８２をＳｐｈｌおよび１５
ｃ ｏ Ｒ Ｉで！墳裂してｎｉｆΔ蛋白質の゛？ミ
ノ酸２位からアミノＭｌ６８位の配列を削除し、削除し
たフラグメントを第１１図のパ享ルＣに示すオリゴヌク
レオチドで置換した．これにより、ドメイン八の全ての
削除が行われ、ドメインＡおよびＣ（アミノｌ％ｆ＋６
９−１７２）の間のリンカー領桟の最後の４アミノ酸の
再構築およびＥｃｏＲ１部位に先立つ領城Ｃの鏝初の７
アミノ酸（アミノｔＩＩｌ？３−１７９）の再構築が達
成された． 力ジ鼠〕 Ｌ記ｎｉｒＡＬｆｆ伝子または他のｎｉｆＡ遺伝子に連
結し、該ｎｉｆＡ遺伝子を適当なレベルで発現させて、
窒素固定の増大をもたらすために、種々のプロモーター
が単藺された．プロモーターがｎｉｆＡの最適の発現を
生じるかどうかを決定するためには、一定のガイドライ
ンに従うことができる．これらのガイドラインに関する
言及は、潜在的に有用な如何なるプロモーターを除外す
るためのものでもなく、従って、ガイドラインに対する
例外が存在するであろうことは認識されるであろう．に
もかかわらず、一般には窒素固定能力の増大をもたらす
ｎｉｆ八の生産の増加のための適当なプロモーターの選
択過程に、ガイドラインを頼りにすることができる． 一Ｍに、強力な構成的プロモーターは避けるべきである
．本発明者らは、緑適レベル以−トのｎｉｆＡの住産は
、植物の生育に致命的であることを見出した，ｎｉｆＡ
遺伝子の強力な非制御発現はり物の成長をＦ＠害するレ
ベルのｎｉｆＡ蛋白質の生産をもたらす．同様に、強力
なホモロガスブｌ】モーター（即ち、天然で同じバクテ
リアに見出されるプロモーター）は避けるべきである．
・強力なホモ口ガスプロモーターもまた、遇刺１ｄのｎ
ｉｆＡの生産を引き起こし、植物に致命的である．従っ
て、本発明者らは、強力胃神プロモーター（１１ｐち、
天然にはそのバク大を得るために適当であることを見出
した．ｎｉ『プロモーターは一般に非ホモロガス環境で
活性が低く、従って異種宿主内での強力ｎｉｆプロモー
ターは、ｉ！４度に増加したレベルのｎｉｆＡ蛋白質を
発現するであろう．そのようなプ１７モーターの例は、
次のとおりである．−Ｗ−２げ−ボニカみノとｎ ｉ
ｆ １１遺イ本子ブ煕±二−久Ｂ．ジャポニカムのｎ
ｉ ｒ １１遺伝子プロ土ターのヌクレオチド配列は、
ファーマンおよびへぶケ（ １’ ｕ ｈ ｒ ｍ ａ
ｎ ｎ ａ ｎ ｄ Ｈ ｅ ｎ ｎｅｃｋｅ）
．１９８４．Ｊ，Ｂａｃｔ．１５８：ｌＯ０５に記載さ
れている．第３図を参照すると、Ｂ．ジャボニカｌ１の
ｎ ｉ ｒ Ｈ遺伝子プロモーターは、ｐＢＲ３２２の
Ｓａｌｌ挿入片のｐＢＪ３３ Ｌ．シガン州立大ｔのバ
リー・ケルム（Ｂａ ｒ ｒ ｙ Ｃｈｅ ｌｍ）氏
から人手）によって運ばれる． Ｂ．ジャポニカムのｎｉｆＨプロモーターを含む領域は
、０．１５ｋｂＢｇｌ■−１１ｇｉＡｌフラグメント上
に単屠された．ＨｇｉＡｌ末端はリンカーを用いてＢａ
ｍ｝Ｉｆ部位に変換され、そしてこのフラグメントをρ
ＢＲ３２２のＢａｍＨＩ部位にクローン化して、ｐＭＷ
ｌ１５を得た，ｐＭＷ１１５のＢａｍＨ Ｉ−Ｓａ ｌ
ＩフラグメントのＢａｍｌ１１部位をリンカーによっ
てＢｇｌＩＩに変換し、このフラグメントをｐＳｔＪ
Ｐ ｌ ０ ４のＣ！ａｌ−Ｓａｌｔ部位へクローン化
した：ｐＳＵＰ１０４は、広域宿主ベクターであって、
サイモン（Ｓｉｍｏｎ）らの［モレキュラー・ジェネテ
ィックス・オブ・ザ・バクテリア・プラント・インタラ
クション（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
ｏｆ ｔｈ ｃ Ｉｓ ａ ｃ
Ｌ ｃ ｒ ｉ ａ Ｐ Ｉ ａ
ｎ Ｌ ｌ ｎ ｔｅｒａｃｔ ｉｏｎ）９
８ １０６ （Ａ− プーラ（１’ｕｈｌｅｒ）
編Ｊ）１９８３；およびブーラーらの米国特許４，６８
０，２６４ （参照により本明細書に含まれる）に記載
されている．Ｃｌａ ｌ部位をリンカーを用いてＢｇｌ
［Ｉに変換し、ρＭＷＩｌｆｉを得た（第３図）．Ｂ．
ジャポニカムｎｉｆＨ（およびｎｉｒＡ．下記参照）プ
ロモーターは、バック（Ｂｕｃｋ）ら，Ｎａｔｕｒｅ，
３２０：３７４．１９８６に記載されている、保存され
た候補上流ｎｉｆＡ結合配列を有する．これらの保存配
列の削除または変異は、Ｅ，ｃｏｌｉ中でのプロモータ
ーの強さの減少を起こすことが知られている（アルバレ
ズーモラレス（ＡｌｖａｒｅｚＭｏｒａｌｅｓ）ら，１
９８６，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，ｆ４：４２
０７）．Ｂ．ジャポニカムｎｉｆＨプロモーターは、二
つの上流ｎｉｒＡ結合部位を含み、一つは−１１１位に
、そして他方は＋１から数えて−１４０位に存在する．
分析の結果、ｐＭＷ１１６は−１１１位の結合部位のみ
を含むことが判明した．もう一方の−１４０位の部位は
、誤って削除されていた． １４０部位を含むｎ ｉ ｒ Ｈプロモーターをクロー
ン化するため、ベクターｐＭＷ１１６を次のように修飾
して、両方のト流ｎｉｆＡ結合配列を含めた，ｐＢＪ３
３からの両方の蚊補上流結合配列を含む１．８５ｋｂの
ＨｉｎｄＲｌ−ＳａｌｌフラグメントをｐＭＷｌ１６の
Ｉ｛ ｉ ｎ ｄ１１−Ｓａｌ１部位にクローン化して
、結合配列を一つしか含まないフラグメントと交換した
（第３図）．得られたブラスミドｐＭＷ１２２をＢａｍ
ＨＩで部分消化し、修復（Ｆ ｉ ｌ ｌｉｎ）Ｌ連結
してｎｉｆＡ結合配列の上流のＢａｍＨ１部位を削除し
た．得られたブラスミドｐＭＷ１２６をＢ．ジャポニカ
ムｎ ｉ ｒ Ｈプロモーターの下流のＢａｍｉ｛＋リ
ンカ一部位にクローン化させ、Ｂ．ジャポニカムｎ ｉ
ｒ ！ｆブロモーターの貯蔵ベクターとした． ｎ ｉ ｒ ＩＩによ の＠社，
イし， 第１表に示すデータは、三つのｍ樺の一つのｎｉｆＡ遺
伝子産物により活性化されたときのＫ．ニヱーモニエま
はたＲ．メリロティのｎｉ【Ｈプロモーターからの遺伝
子発現レベルを比較する．試験プラスミドにおいては、
全ての型のｎｉｆＡ遺伝子が、Ｅ，ｃｏｌｉのｃａｔプ
ロモーターから発現された．第１３図を参照すると、ｎ
ｉｆＡ遺伝子をその天然ＳＤ配列とともに含むｐＪＢｌ
３５は、ｐＪＢｌ３１ （下記ｐＪＢ１１０からｎｉｆ
Ａ遺伝子の末端から２４ｂｐのＮｒｕ１部位をＢｇｌｕ
部位に変換して誘導された）から、ｎｉｆＡ遺伝子を含
むＢｇ１■フラグメントを、Ｂｇｌｌ＋で消化したｐＪ
Ｂ１２０にクローン化して造成した＊ ｐ Ｊ Ｂ １
３５から発現されたｎｉｆＡ蛋白質は、ｎｉｆＨプロモ
ーターからのＩａｃＺの発現を引き起こすが、そのレベ
ルはバックグラウンドよりも若干高いだけである，ｎｉ
ｆＡ遺伝子が合成ＳＤ配列に勘合されたｐＪ１３１８２
においては、Ｒ．メリロティプロモーターからのｌａｃ
Ｚ遺伝子の発現は、バックグラウンドよりも約２．４倍
増大している．β−ガラクトシダーゼの発現の増大は、
合成ＳＤ配列がドメインＡのために削除されたｎｉｆＡ
遺伝子に融合している時、より一層ｗ４著であった（ｐ
ＪＢ２０３）．この場合、ｎｉｆ｝ｌプロモーターから
の発現は、バックグラウンドに比べて１５倍増大した．
第１表 ｐＪＢ１２０ ｐＪＢｌ３５ ｐＪＢ１８２ ＰＪＢ２０３ （ｐＪＢ３１） ２． １ ３．３ １ ６． ４ １８５３．０ （ｐＶｓＰ９） Ｂ．ジャポニカムｎｉｆＤ プロモーＢ．ジャポ
ニカムｎｉｆＤプロモーターのヌクレオナド配列は、カ
ルザおよびヘン不ツケ（Ｋａ ｌｕｚａ ａｎ
ｄ Ｈｅｎｎｅｃｋｅ）により，Ｍａｔ，Ｇｅｎ
．Ｇｅｎｔ．１９６：３５ （１９８４）に記載されて
いる．第４図を参照すると、Ｂ．ジ中ポニカムｎｉｆＤ
プロモーターは、ＰＲＪ６７６（ヘンネッヶ，Ｎａｔｕ
ｒｃ，２９１：３５４ （１９８１））の誘導体である
ｐＲＪ６７６Δｌ（バリー・ケルム（Ｂａｒｒｙ Ｃ
ｈｅｌｍ）から入手）に運ばれている．Ｂ．ジャポニカ
ムｎｉｆＤプロモーターをｐＲＪ６７６Δｌから、Ａｈ
ａｆｆｌからＢｇｌ［ｌまでの３７０ｂｐのフラグメン
ト上に単離した，Ａｈａｌｌ＋末端をリンカーによって
Ｂ ａ ｍＨ１に変換した．次にこのＢａｍＨＩ−Ｂｇ
ｌＰ ■フラグメントを一ＡＣＹＣｌ ８４のＢａｍＨ１部位
にサブクローニングして、ｐＭＷｌ１３を得た．テトラ
サイタリン耐性プロモーターを削除するためＣｌａｌお
よびＢａｍｌ｛＋で切断し、Ｂｇｌ［Ｉリンカーを挿入
したｐＭＷ１１４を得た．これにより、Ｂ．ジャポニカ
ムｎｉｆＤプロモーターの修飾物が得られ、ρＭＷＩＩ
４のＢｇｌｌ１部位に遺伝子を挿入してｎｉｆＤプロモ
ーターから該遺伝子を発現させることができる，ｐＭＷ
１１４のＸｂａ Ｉ−Ｓａ ｌ ｉ７ラグメントを、Ｘ
ｂａ Ｉ＋Ｓａ Ｉ １で切断したｐｓｔ，’Ｐｌ０４
にクローン化して、ｐＭＷ１１７を得た． Ｅ．ｃｏｌｉのｃａＬプロモーターのスクレオチド配列
は、アルトン（Ａｌｔｏｎ）ら．Ｎａ’ｒｕｒｅ，２８
２ ： ８６４ （１９７９）に記載されている，ｃａ
ｔ遺伝子のプロモーターはｐＪＢ１２０に運ばれている
構成的プロモーターである，（ｐＪＢ１２０はρＡＣＶ
Ｃ １ ８ ４（第４図）のＴａ４ １部位をオリゴヌ
クレオチドリンカーを用いてＢｇｌｌ１部位に変換する
ことにより造成された．）この部位は転写開始部位とｃ
ａｔ遺伝子のＳＤ配列の間に存在し、そしてｃａｔプロ
モーターの支配の下に遺伝子クローン化の好適な位置を
提供する． ５Ｒ．メリロティｎ ｉ Ｊ』ｊａ仮子”ｆ口Ｅ ９
二Ｒ．メリロティのｎｉｆＨ遺伝子プロモーターは、ス
ンダレサン（Ｓｕｎｄａｒｃｓａｎ）ら．Ｎａｔｕｒｅ
，３０１ ：７２Ｂ （１９８３）に記載されている．
第５図を参照すると、Ｒ．メリロティのｎｉｒＨプロモ
ーターを含むプラスミドｐＪｌ１８１が示されている．
ｐＪｒ３８１Ｈは、先ずｐＲｍＲ２（ルプクン（Ｒｕｖ
ｋｕｎ）ら，Ｎａｔｕｒｅ，２８９．８５ （１９８１
））から、６８０ｂｐのＳａ ｌ Ｉ−ＳｐｈＩフラグ
メントを、Ｓａｌｌ−Ｓｐｈｌ消化ｐＡＣＹＣ １ ８
７１にクローニングし、次いで、得られたブラスミド
（ｐＪＢ８０）をＳＰｈｌおよびＨｉｎｄｌｌｌで消化
し、Ｓｍａ Ｉリンカーに連結して造成された．これに
より、Ｒ．メリロティのｎ ｉ ｒ Ｈプロモーター配
列の直ぐ下流にユニークＳｍａ Ｉ部位が形成された．
Ｒ，ｊユ刃−テ のｆｉｘＡ − ブロモーＲ．メリ
ロティのｆｉｘＡｉｉ伝子プロモーターは、アール（Ｅ
ａｒｌ）ら，Ｊ，ＢａｃＬ．ｐｌ６９：１１２７ （１
９８７）に記載されている．Ｒ．メリロティｆｉｘ遺伝
子クラスターは、ブラスミドｐＷＢ１０８３ （Ｆ．オ
ースベル ブイケマＣＦ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｂｕｉｋｃ
ｍａ）ら．Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌｉｅｄ ＧｅｎｅＬ
ｉｃｓ，２、２４９ （１９８３）から得られた）から
、５ｋｂのＥｃｏＲｌフラグメント上に単離された．こ
のＥｃｏＲＩフラグメントをρＡＣＶＣ１８４ （第４
図）のＥ ｃ ｏ Ｆ？ １部位にクローン化してｐＪ
Ｂ１１７（第６図）を得た．転写開始部位から＋２位置
にＭａｅ１部位が存在していた．ｐＪＢ１ １７をＭａ
ｅｌで開裂してｆｉｘＡプロモーター領域を除去し、Ｍ
ａｅｌ末端を合成リンカーでＢｇｌＩＩ末端に変換し、
次いでＥｃｏＲＩおよびＢｇｌ［Ｉ消化した，ｆｉｘＡ
プロモーター領域を含むフラグメントをＥｃｏＲＩ＋−
Ｂｇｌ［＋消化ｐＪＢ１２０に連結してｐＪＢＩ２４（
第６図）を造成した． Ｋ ニューモニエのｎｉｒｌｌ゛ブロモーＫ．二１−モ
ニエ遣伝子のヌクレオチド配列は、スンダレサン（Ｓｕ
ｎｄａｒｅｓａｎ）ら，Ｎａｔｕｒｅ， ３０１：７２
Ｂ （１９８３）およびスコット（ＳＣＯＬＬ）ら，Ｊ
，Ｍｏｌ．Ａｐｐ ｌ．Ｇｃｎｅｔ．，Ｉ ： ７ １
（１９８１）に記載されている．Ｋ．ニューモニエ
ｎｉｒ ＋ｔプロモーターはｐＫＡ３（ブキャナン−ウ
ォラストン（Ｂｕｃｈａｎａｎ−Ｗｏ ｌ ｌａｓｔｏ
ｎ）ら．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｃｔ．．１８４ ：１
０２ （１９８ １）に記載されている、ｌＥｃｏＲＩ
部位に挿入されたｐＶＷ１Ｇからの０． ６ｋｂ（７
）Ｅｃ ｏＲ ｌ −Ｂｇ Ｉ ｎフラグメントを有す
るｐＡｃＹｃ１８４）から４７１ｂＰのＩミｃｏＲＩ−
Ｓａｃｌフラグメント上で単離され、ＣｔａｌおよびＢ
ａｍ｝ＩＩ消化ＰＳＵＰ！０４中にクローニングし、ｐ
ＲＫ３７ （第７図ａ）を得た． ｎ ｉ ｒ Ｉｆプロモーターを含むフラグメントは、
ｎｉｒＪプロモーターｓＩｋＲの一部も含み、ｎｉｒＪ
プロモーター領域とはよりト流の部位から反対方向に転
写される．従って、ｎ ｉ ｆ Ｈブロモーターは、ｐ
ＲＫ３７からＮｃ．ｏＩ−ＢａｍＨｒフラグメントを除
去してこれをＮｃｏｌＢａｍＨｌ消化ｐＪＢ１２０に再
度クローニングすることにより、ｎｉｆＪプロモーター
領域とは独立にクローン化された．０られたプラスミド
はｐＲＫ３７２と命名された． Ｋ ニューモニエのｎｉｆ｝シ ープロモ−Ｋ．ニ
エーモニエｎ ｉ ｒ Ｉ！遺伝子プロモーターのヌク
レオチド配列は、ベイノン（Ｂ ｅ ｙ ｎｏｎ）ら，
Ｃｅｌ１，３４：６６５ （１９８３）に記載されてい
る．Ｋ．ニューモニエのｎｉｆＥプロモーターを、ＰＶ
ＷＩＯ（Ｋ．ニューモニエのｎｉｆＥプロモーターフラ
グメントのＥｃｏＲ ｌ−Ｓａ ｌ ｌフラグメントを
ＥｃｏＲｌ−Ｓａｌｌ部位に挿入して含むｐＢＲ３２２
；ベイノンら上記）からＳｍａｌ−ｆ｛ｉｎｃ■訓限フ
ラグメント上に単離しへこのＳｍａ ｌＨ ｉ ｎ ｃ
ｎ末端をＣｌａ ＋およびＢａｍＨＩ末端に１襖し、
Ｃｌａｌ＋ＢａｍＨＩ消化ｐｓＵＰｌ０４に挿入して、
ｐＲＫ１ １ （第７図ｂ）を造成した． Ｋ．二二一％ −’− ｒ− （’） ｎ ｉ ｒ Ｕ
ｉＬ伝子７’旦モニ久Ｋ．ニューモニエｎ ｉ ｒ Ｕ
遺伝子ブロモークーのヌクレオチド配列は上記ベイノン
らの文献に記載されている．Ｋ．ニューモニエｎｉｆＵ
遣伝子プロモーターをｐＭｃ１ １ （Ｋ．ニューモニ
エからのｎｉｆＵフラグメントを含むｐＢＲ３２２）か
ら、ＢａｍＨＩ−Ｓａｃｌフラグメント上に午曙し、ｐ
ｓＬＩＰｌ０４のＢ ａ ｍ Ｈ１−Ｓａｃ１部位に直
接クローン化し、ｐＲＫ３Ｂを造成した（第７図ｃ）ａ Ｋ．ニエーモニエのｎｉｆＭ プロモータＫ．ニ
ューモニエのｎｉｆＭ遺伝子プロモーターのヌクレオチ
ド配列は、上記ベイノンらの文献に記載されている．Ｋ
．ニューモニエｎｉｆＭプロモーターをｐＭｃ１２（Ｋ
．ニューモニエのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔｌｎｉｒＭプロモ
ーターフラグメントを含むｐＢＲ３２２；上記ベイノン
））から、Ｘｈｏｌ−Ｓａｉｌフラグメント上にサブク
ローニングし、ｐｓＵＰｌ０４の３ｉ＊ｌ：部位に入れ
て、ｐＲＫ４１５を得た．続いてこのテトラサイクリン
耐性遺伝子のプロ毫一ターを取り出すために、ブラスミ
ド配列をＣｌａ １部位からｓｐｈｔ部位まで削除した
．得られたブラスミドをｐＲＫ４ １５Δと命名した（
第７図ｄ）． ベ ー ＪＢ 一 の゜ゝ適当なプロモー
ターへのｎｉｒＡ遺伝子の融合物を、広域宿主ベクター
、例えばｐｓＵＰｌ０４を用いて、リゾビウム中に形質
転換した．本発明者らは、ｐｓＵＰｌ０４がＲ．メリロ
ティ中に形質転換すると窒素固定に本質的に致命的な影
響を与えることを見出した．第８図を参照すると、本発
明者らは従って、別の広域宿主ベクターであるｐＲＫ２
９０ （ヘリンスキ（Ｈｅｌｉｎｓｋｉ）の米国特許４
．５９０，１６３；参照により本明細書に含まれる）の
誘導体を用いるように選択し、これは上記のような致命
的影響を与えないことを見出した．この誘導体ベクター
ｐＪＢ１５１は次のようにして造成された． 先ずρＲＫ２９０のＬｃｏＲＩ部位に、カナマイシン耐
性遺伝子およびマルチブルークローニング部位ポリリン
力一を挿入してブラスミドｐＷＢ５を作製したく第８図
）．ＢａｍＨＩ消化によってカナマイシン耐性遺伝子を
除去し、プラスミドを再度連結してｐＪＢ１５１を得た
．ポリリン力一部位は先のＥｃｏＲｌ部位に残存してお
り、プロモーター：：ｎｉｆＡ融合体の挿入のために都
合よい制限エンドヌクレアーゼ部位を多数従供する．後
述する任意の融合体をｐＪＢ１５１の複数の部位の任意
の部分に挿入可能である． ｆＡ ｐＶＷ６０はＴｎ５カナマイシン耐性構造遺伝子および
その構成的プロモーターを含む．このプラスミドは、ｐ
Ｍｓ１０００ （フィイサー（Ｆｉｌｓｅｒ）ら，Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎ．ＧｅｎｅＬ．，１９１：４８５ （１９
８３））から得たＨｉｎｄＩＯ−Ｓａ ｌ ｌフラグメ
ントを、ＨｉｎｄｌｆｌおよびＳａｉ＋で消化したｐ
１３ Ｒ ３ ２ ７中に連結して構成した．このｐ
ＶＷ６ ０のＨ ｉｎｄ！ＩＩ−Ｓａ！ｌフラグメント
を取り出して、ＰＸＣＹＣｌ８４のＨ ｉ ｎｄｌｌｌ
−Ｓａ ｌ Ｉ部位にクローニングし（第４図）、ｐＪ
８９Ｂを得た． Ｒ．メリロティｎｉｆＡｉｆｉ伝子を有ずるＨ ｇｉＡ
ｌフラグメントを、．ｐＲｍＢ３．８Ｈ （第１図）か
ら中離した．このフラグメントに、ＰＪＢ９８のカナマ
イシン耐性構造遺伝子とそのプロモーターの間に存在す
るＢｇｌｆ１部位にクローニングできるように、Ｂｇｌ
ｎリンカーを付加した．この工程によって、ｐＪＢ１
１０（第９図）が得られ、その中ではＲ．メリロティｎ
ｉｆＡ遺伝子がＴ入ナマイシン耐性遺伝子プロモーター
から構成的に発現される．所望の構成を広域宿主範囲ベ
クターｐｓＵＰン耐性遺伝子プロモーター：：Ｒ．メリ
ロテイｎｉｒＡ遺伝子融合体を含むＨｉｎｄｍ−ＳＡＭ
フラグメントを単離し、そしてｐｓｔ，’ＰＩＯ４のｌ
ｌｉｎｄｍ−ＮｒｕｌｆｆＪ位にクローニングして、プ
ラスミドｐＪＢｌ１１（第１０図）を得た． ｐＪＢ１１０およびｐＪｒ目１１によって運ばれている
上記挿入片は、Ｒ．メリロテイｎｉ『Ｂ遺伝子の一部を
もまたそのプロモーターとともに含んでいる，ｎｉｒＢ
プロモーターの存在は、窒素固定の増強にとって致命的
でありうる：というのは、ｎｉｒＢは窒素に制？卸され
るプロモーターとして、ｎｉｆＡＨｉ白質の結合部位を
含有し、そのためプロモーターへ結合することが望まれ
るｎｉｆＡ蛋白質を除去する作用をするためである．従
って、本発明者らはｐＪＢＩＩＯからｎｉｆＡ遺伝子を
ｎｉｆＢプロモーターを含まない制限フラグメント上に
サブクローニングした．その方法は次のように行った．
このブラスミドの中には、他の三つのＮｒｕ１部位に加
えて、ｎｉｆＡ遺伝子の末端の２４ｂｐ下流に一つのＮ
ｒｕ １部位が存在することが発見された．ρＪＢＩＩ
ＯをＮｒｕｌで部分消化し、完全長の直線ＤＮＡを’ｌ
離し、Ｂｇｌｌｌリンカーを連結挿入した．これにより
、新たな１３ ｇ Ｉ Ｉ１部位を持つ四つの誘導体が
生じた．ρＪＢＩ３１が、所望位置にＢａｌｌ１部位を
有する誘導体であった．このプラスミドは、ｎｉｌＡ遺
伝子をｎｉｆＢプロモーターを含まないｌ．７ｋｂのＢ
ｇｌｌ＋フラグメントトに巾離することを可能にした．
上記の方法はＰＪＢＩ １ １でも同様に行われ、同じ
Ｂｇ＋■フラグメントを生じた． 第１！図のパネルＡを参照すると、Ｒ．メリロティのｎ
ｉｒＡ遺伝子の発現の増加のために、さらなる変更が行
われ、その中にはシャインダルガノ（ＳＤ）配列も含ま
れている．ｎｉｆＡｉ！ｉ伝子の前に存在する天然ＳＤ
配列は、他の公知ＳＤ配列に比較して、比較的弱いリボ
ゾーム結合部位である．本発明者らは、ｐＪ！’３１６
０（Ｒ．メリロティｒｉｘＡプロモーター：：Ｒ．メリ
ロティｎｉｒＡ遺伝子融合体、上記および第６図参照）
のｎｉｆＡ遺伝子の元のＳＤ配列を、Ｅ．ｃｏｌｉｌ６
Ｓ ＲＮＡリボゾーム結合部位により近像する合成Ｄ
ＮＡ配列に置換することを選択した．ｐＪＢ１２４をＢ
ｇ！■で開裂し、上記ｐＪ８９ＢのＢｇｌｎｎｉｆＡフ
ラグメントに連結してｐＪＢｌ４０を得；ｎｉｆＡ遺伝
子の下流のＢｇｌｌ１部位をリンカーによってＰｓＬｌ
に変史してｐＪＢ１５２を得；そしてｐＪＢ１５２のｆ
ｉｘＡプｏ−ｔ−一ターのＦ流の１４ ｃ ｏ Ｒ １
部位をＩＩ ｉ ｎ ｄ ＩＩＩに変更したｐＪＢ１６
０を得た．このＤＮＡをＦｓｐＩＣ部分消化して、ｎｉ
ｆＡ遺伝子の綴初のＡ′１゛Ｇの直後を切断した．５′
末端にＨ ｇ Ｉ Ｉ＋粘着末端を持つ３９ｂｐフラグ
メントを合成した．この合成ＤＮＡの配列は元のＡＴＧ
およびＦｓＰ１制限部位を再構成し、ＳＤ配列の変更も
もたらす，Ｆｓｐｌ消化ブラスミドをこの合成フラグメ
ントと連結し、続いてＢｇｌｎ消化し（天然ＳＤの直ぐ
−Ｌ流の遺伝子を切断するため）、再度連結して新たな
ＳＤ配列を挿入した．リンカーを正しい位置に挿入され
たクローンを選択した．選択されたブラスミドはｐＪＢ
１８０である．ｐＪＢ１８０から、ｆｉｘＡプロモータ
ーの代わりにｃａｔプロモーターを含む別のブラスミド
ρＪ Ｂ ｌ ８ ２も誘導された．Ｂ．ジャポニカム
ｎｉｆＨ：：Ｒ． メリロティｎｉｆＡ Ｒ．メリロティｎｉｆＡｉ！ｉ伝子をその天然Ｓ Ｉ）
配列とともに含むＰＪＢＩ３１から１．７ｋｂのＢ ｇ
Ｉ Ｉｔフラグメントを、ｐＭＷ１２６のＢａｍＨ１
部位にクローニングしてρＭＷ１２Ｂをえた：その巾に
おいては、ｎｉｆＡ遺伝子はＢ．ジャポニカムｎ ｉ
ｒ Ｈブタの支配下に存在する．この融合体をｐＲＫ２
９０を基本とするベクターに移動させるため、ｐＭＷ１
２８がらＳａｌ１フラグメントを取り出して、その両末
端をリンカーでＣｌａ １部位に変え、Ｃｌａｌ＋Ｘｂ
ａ１消化した．Ｒ．メリロティのｎｉｆＡ遺伝子に加え
て、Ｂ．ジャポニカムの完全なｎｉｆＡプロモーターお
よび二つの上流結合配列を含む、３．４ｋｂのＣｌａｌ
−ＸｂａｌフラグメントをＣＩａｍ｝−Ｘｂａｌ消化し
た，Ｊｌ３１５１（第８図）にクローン化して、プラス
ミドｐＭＷ１４２ （第１２図）を得た． ｐ Ｊ Ｂ ＋ ３ １からｎｉｒＡ遺伝子を１．７ｋ
ｂＢｇｌ■フラグメント上に切り出し、ｐＪＢ１２０の
ｃａｔプロモーターに隣接するＢ ｇ Ｉ Ｉ１部位に
クローニングして、ｐＪＢ＋３５（第１３図）を得た．
これをｐＪＢ１５１に移動させるために、ｃａｔプロモ
ーターおよびｎｉｆＡ遺伝子の両者を含むＰｖｕ■フラ
グメントをｐＪＢ１３５から切り出した．その両端を合
成リンカーの付加によってＢｉｎｄｌｌ＋に変換し、こ
のフラグメントをｐＪ［３１５１のＨｉｎｄｆｆ１部位
にクローニングしてｐＪＢ１５４ （第１３図）を得た
． 合成ＳＤ配列に続＜Ｒ．メリロティのｎｉ『Ａ遺伝子を
、次のようにしてＰＪＢｌ８２から取り出した．このブ
ラスミドを１’ ｓ Ｌ ｌで開賛し、この部位を合成
リンカーでＢｇｌ１１部位に変換した．続いてＲｇｌ［
Ｉで消化するとｎｉｆＡ遺伝子を含むｌ．７ｋｂのフラ
グメントが遊離された．このフラグメントをＢａｍＨＩ
消化ｐＭＷ１２６と連結して、ｐＭＷ１４５を｛｝たｉ
その中においては、Ｒ．メリロテイのｎｉｆＡ遺伝ｔは
、ｐ Ｓ Ｕ Ｐ Ｉ ０ ４ベクターをフ．一本とし
てＢ．ジャポニカムのｎ ｉ ｆ Ｈプロモーターの支
配下に存在ずる．ｐＭＷｌ４５からの合成ＳＤ配列を含
むｎｉｆＡ遺伝子を含むＨ ｉ ｎｄｎｌＸｂａ ｌフ
ラグメントを、ＩＩｉｎｄＨＩ｝Ｘｂａ１消化ＰＭＷｌ
４２（第１２図）にクローニングし、これによりｐＲＫ
２９０から．夫導された基本骨格中のオーセンチックな
ｎｉｆＡに変換した。この最終プラスミドをρＭＷｌ４
８と命名した（第１４図）． ｃａＬ：： たなＳＤＲ メ １１テ４−バーｉｒ
人 Ｒ．メリロティのｎｉｒＡｉｊｉ伝Ｙ−をｃａｔプロモ
ーターの支配下にクローニングするため、ｐ４目３１８
０からＢ ｇ ｌ Ｉｆ −Ｐ ｓ Ｌ Ｉフラグメン
トを取り出しこれをＢｇｌｌｌ＋Ｐｓｔｌ消化ｐＪＢ１
６７ （Ｊ，Ｖｉｒｏｉ．．６０：１０７５ （１９８
６）に記載されているｐＴＲ１３００をＢｇｌロで消化
し、ｌａｃＪｌ伝了一を含むフラグメントをＢｇｌ■消
化ｐＪＢ１２０に連結してｐＲＫｌ３０１を得、Ｉａｃ
Ｚ遣伝ｒに続（Ｎｃｏ１部位をＰｓｔｌに変換してＰＪ
Ｂ１６３を得、Ｘｍｎ １部位をＨ ｒ ｎ ｄ ［１
部位に変換してＰＪＢｌ６７とすることにより造成さ
れた）に連結し、ｃａｔ：：ｌａｃＺ融合ベクターでＩ
ａｃ遺伝子を置換した．次に、このＣａｔプロモーター
：：ｎｉｆＡ融合体を、この新規造成物（ｐＪＢｌ８２
）からＨｉｎｄｌｌ１およびＰｓＬＩで消化して取り出
し、Ｈ ｉ ｎ ｄ Ｉｌｌ＋ＰｓＬＩ消化ｐＪＢ１５
１ （第８図）にクローン化した．これにより、プラス
ミドｐ Ｊ Ｂ １９１（第１５図）が得られた． ｃａｔ：：Ｂ ジ ポニカムｎｉｒＡｃａｔプロモー
ター：：Ｂ．ジャポニカムｎｉｆＡ融合体造成物（ｐＲ
ＡＲ５６６）は、前述した．この融合体をｐＪＢ１５１
に再度クローン化するため、ｐＲＡＲ５６６からＰｖｕ
ｌｌフラグメントを切り出し、その両端を合成リンカー
でＨ ｉ ｎｄｌｌｌに変換し、次いでｐＪＢ１５ｌ（
第８図）の１１ ｉ ｎ ｄ ’１１部位に連結してｐ
ＲＡＲ５７Ｇを得た． 微ｉ物１５ ＝ｊ： 任，αのリゾビウムまたはブラディリゾビウム株が、ｉ
ｉｉ’ｉな宿主であり、特に効果的なｍｅ形成細菌であ
る．組換えブラスミドの伝達に通ずる宿主の例は次のと
おりである．Ｒ．メリロティＲＣＲ２０１１株、Ｓ ｔ
Ｊ ４ ７株および４１株一Ｂ．ジャポニカムＵＳＯＡ
１３６株；Ｂ．ジャポニカムＵＳＤＡ １１０株
およびＬＪ Ｓ ＤＡ １２３株：Ｒ．フレディイＵ
ＳＤＡ ２０５株．これらの株および他の多くの公知
株は、ＡＴＣＣまたはロートアムステフド・コレクショ
ン・オブ・リゾビウム（ＲｏＬ’ｈａｍｓＬｅｄ Ｅ
ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ＳＬａＬｉｏｎ，Ｈａｒｐ
ｅｎｄｅｎ．ｆｌｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ．ＬＪ．Ｋ
，）から人手可能である．さらに、ＩＢＰワールド・カ
タログ・オブ・リゾビウム・コレクションズ（アレン（
Ａｌｌｅｎ）ら．１９７３，インターナショナル・バイ
オロジカル・プログラム・ロンドン（Ｉｎｔｅｒｎａｔ
ｉｏｎａｌ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＰｒｏｇｒａｍｍ
ｅ， Ｌｏｎｄｏｎ））は、全世界に人手可能な接
１４菌のリストを擾供している． ある種の野性株を畑から、支配種としてｔｎ＃すること
ができる（ジェンキンス（Ｊｅｎｋｉｎｓ）ら．ソイル
・ナイエンス・オブ・アメリカ−Ｊ．（Ｓｏｌｉ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ｏｆＡｍｅｒｉｃａ Ｊ．），４９
：３２６ （１９８５）およびフィリップス（Ｐｈｉｌ
ｌｉｐＳ）ら．同誌．２０３ （１９８５））．多くの
他の株は競争力が強くそして有効な根瘤形成細菌である
ことが知られている．そのような株もまた、本発明の範
囲に含まれる． 三 − に ゾビウムへの 一スミ の走 ｍ換えプラスミドはヘルパーブラスミドｐＲＫ２０１３
を用いて、次のようにして、三親交配により所望宿主リ
ゾビウム種に伝達することができる（フィグルスキ（ｆ
ｉｇｕｒｓｋｉ）およびヘリンスキ（Ｈｅ ｌ ｉｎ
ｓｋｉ），Ｐｒｏｃ．Ｎａ Ｌ ｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃ
ｉ，ＵＳＡ，７６ ： １６４８ （＋９７９））．ブ
ラスミドを先ず、Ｅ．ｃｏｌｉ株、例えば、ＭＭ２９４
（Ａ１”ＣＣ＃３３６２５；ＮａＬｕｒｅ， ２１１
：１ １ １０ （１９６８））に、常法によって伝達
する．受容ａｌ１２Ｉｉであるリゾビウムの株、Ｈ．
ｃｏ１ｔ／ｐＲＫ２０１３ （これは途中でｔｒａお
よびｍｏｂｌ）１ｍを供給する）、およびｎｉｆ組換え
プラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株をの培養物
をＬＡ寒天プレート上で混合し、３０℃で一夜インキエ
ベートして接合させる．この交配により、接合（ｃｏｎ
ｊｕｇａＬｉｏｎ）によるブラスミドの宿主リゾビウム
株への伝達が生じる．トランスコンジュガントの選択は
受容体のりゾビウム株およびｎｉｆ！Ｉｆ換えプラスミ
ドの選択用成分を適当に含む培地で行う．ブラスミドｐ
ＲＫ２０１３はりゾビウム中で安定ではないから、交配
菌から回収できない．み１み ［ｎｔｅ ｒａｔｉｏ
ｎ 上記の造成物が宿主細胞内に保持されることを確実にす
るために、そして各株間でのプラスミドの保持のバラッ
キを防止するために、プロモーター：：遺伝子融合体を
染色体外の要素として含ませるよりも、適当な宿主の染
色体に組み込む方が有利である．そのような組み込みは
、プラスミド保持に関して観察されるバラッキ（そのよ
うなバラッキは、バタテロイド中のｎｉｆＡｉと、植物
置との関連の把握を困難にする）を克ｌＩｋするために
役立つ．そこで、バクテリア染色体中へのｎｉｆ遺伝子
融合体の、組み込みもしくは挿入のためのベクターを造
成した．一つの型の挿入ベクターはバクテリアゲノム中
の特定の位置にＤＮＡの挿入を引き起こすことが出来る
．そのような部位特異的挿入ベクターは、クローン化遺
伝子のバクテリア宿主への伝達を可能にするのｂならず
、好ましくは不安定システムもまた有する．そのような
システムの一つは、マーカーレスキエ−（ｍａｒｋｅｒ
ｒｅｓｃｕｅ）とよばれ、所望配列の染色体への組み込
みが選沢可能表現型を引き起こす．一つの例はベクター
ｐＲＫ２９０もしくはその誘導体である．このベクター
は不適合プラスミドの存在下で不安定化される．従って
、マーカーレスキューは、該ベクターを含む細胞内への
不適合ブラスミドの導入後に、組み込まれたベクター配
列を有する細胞を選択するために用いることができる（
後記参照）． 宿主染色体のゲノム領域は、所望ＤＮＡの組み込みのた
めに同定される．好まし《は、この領域は共生に関して
はサイレントな領域である；即ちＩＩ廟感染力ならびに
有効性が維持される．宿主染色体内の選択された部位へ
の所望ＤＮＡ配列の挿入は、バクテリアの生育に対して
全くもしくは殆ど影響を与えてはならず、そして全ての
代謝活性および異化活性は、該挿入によって特異的に変
更したものを除いて、ほぼ野性のレベルに保たれねばな
らない． ベクターは、好ましくは、組み込みのための全ての要素
を含む［カセッ｝Ｊを有する．このカセットの成分は、
同しベクターのパフクボーンを用いて、他の類似の成分
に置換することができる．カセットは、好ましくはｔＩ
ｌｌ数もしくは複数の所望遺伝子、特に窒素固定の増強
に関与する遺伝子、例えばｎ＋ＦＡ遺伝子に融合してオ
ペロンを形成する転写プロモーター、（２）カセットを
運ぶ組み込み体の選択のための選｝Ｒ可能マーカー遺伝
子、（３）上記遺伝子の上流に隣接するか、あるカセッ
トにおいては−ト記遺伝子を中断する転写および翻訳終
止シグナル（隣接する染色体ＤＮＡのプロモーターから
の転写読み越へを防止し、挿入されたカセットの下流に
存在する染色体遺伝子の過剰発現を防止する）、および
（４）宿主ゲノムのサイレント領域にホモロガスな、約
３〜６ｋｂの隣接ＤＮＡ配列．これらの隣接配列は、本
明細書中で「ホモロジー領域』と呼ばれ、相互のりコン
ビネーションによって外来ＤＮＡの組み込みを可能にす
る．組み込みベクターの成分を、以下に記載する．−組
−々−込ムづク−ク−二卑成−分 カバ１−Ｌ１咬さ−久タニ カセットの造成のための初期クローニングベクターとし
てｐｌｃ−２０１１を選沢した；というのは、これが長
いポリリンカーを持つ比較的小さいブラスミドであるか
らである，ｐｌｃ２ ０ − Ｈは、ｐＵｃからの誘導
ブラスミドであり、それが持つポリリンカーは、約１６
個のユニークな＠限部位を有し、それらの部イαはβガ
ラクトシダーゼ遺伝子の中に存在する（第１８図）（マ
ーシｚ（Ｍａｒｓｈ）ら，Ｇｅｎｅ．３２，４８２ （
１９Ｂ４））．本発明におい゛ζ、他のいかなるベクタ
ーも同様に適当である．Ｒ．メリロティの染色体の共生
的にサイレントな領域を同定するため、増殖および植物
との共生関係に害をリえないと名えられる公知代謝経路
の欠陥を有する変異体を選択した．細胞の増殖に致命的
でない、選択された経路は、利用可能炭素源のミオーイ
ノシトール（ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ）分解へと導い
た（アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）ら，Ｊ，Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２４６ ： ５６６２ （１９７ １
））この経路の第一過程は、ミオーイノシトールによっ
てのみ誘発されるＮＡＤ＋依存性デヒドロゲナーゼ（イ
ノシトール・デヒドロゲナーゼ）によって触媒される．
この経路は、他のポリオール類によっては誘発されず、
そして正常増殖条件下で活性ではない：何故ならイノシ
トールは天然には土壌中に存在しないからである．イノ
シトール利用経路の選択された変異体は、Ｒｍ Ｉｎ
ｏ’と命名され、Ｒ．メリロティ１０２ｌ株のＴｎ５挿
入変異形成および続いて単一炭素源としての糖ミオーイ
ノシトールを利用する能力の不在によって選択すること
により、製造された． 一つまたはそれ以上の特定のポリオールによって誘発さ
れるが、通常の増殖条件下または植物との共生関係下で
要求されない他の多くのポリオールデヒドロゲナーゼが
知られている（プリムローズ（Ｐｒｉｍｒｏｓｅ）およ
びａ７ソン（Ｒｏｎｓｏｎ），Ｊ．Ｂａｃｔ．１４１：
１１０９（１９８０））．これらの、および他の共生的
にサイレントな染色体領域もまた、異Ｊ４ＤＮＡの組み
込みのための適当な部位を提供し、そして選沢された経
路の酵素をコードもしくは制御するかまたはポリオール
の輸送に影響するであろう． この、イノシトールを利用可能炭素源に変換することに
関与する酵素イノシトールデヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ）
を、Ｒｍ ｌｎｏ−でアッセイし、野性型の親株であ
るＲ．メリロティｌ０２１での活性と比較した．変異株
においては検出可能な活性は発現されなかった．しかし
ながら、植物のＦＩｔ（バイオマス）のアッセイにおい
ては、変異株と親株の間に、検知できる相違は観察され
なかった．従って、ミオーイノシトールの利用に関与す
るＤＮＡ領域（Ｔｎ５挿大の部位）を、リゾピウムゲノ
ムのｎｉｆ融合体の組み込みの適当な部位として選択し
た。このサイレント遺伝子領域はＤＮＡ配列の組み込み
に汎用的に利川でき、本明細書に記載するＤＮＡ配列の
組み込みのみに限定されるわけではない． １） Ｎ Ａセグメントの組み込みのためのベクターを
構築するには、ホモロジー領域を’ｆｋ＃およびクロー
ン化することが必要である．その後ｎｉｆＡ融合体を、
両側の隣接配列を残したままこの配列に挿入することが
できる．カセットの両側のゲノム配列を有するホモロガ
スリコンビネーションは、そのゲノムへの挿入をもたら
す．化フラグメントをｐＲＡＲ５１２のＢａｍｌｌ１部
位にクローニングして、コスミドバンクを調製した，ｐ
ＲＡＲ５１２はｐＬＡＦＲｌ（フリードマン（Ｆｒｉｅ
ｄｍａｎ）ら，Ｇｅｎｅ，１８．２８９ （１９８２）
）から、ＢａｍＨｌリンカーをＥ ｃ ｏ Ｒ １部位
に挿入し、ＢａｍＨ１部位の一方の側にＥｃｏＲ１部位
を再度構成することにより、誘導した，Ｂａｍ８１部位
に挿入されたフラグメントは、Ｅｃ ｏＲ ｌ消化によ
って切り出すことができる．このコスミドバンクを｝≧
ｍｌｎｏ’変異株に交配し、各クローンを、単一炭素源
としてミオ−イノシトールを含む培地上で、ｌｎｏ一表
現型の補償に関して試験した．相当する補償ＤＮＡ配列
を運搬するＲｍ Ｉｎｏ’変異株のみが、生育可能で
あった． 四つの補信コスミドが単離され、そしてＢａｍＨｌおよ
びＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼを用いてＴｎ５挿
入の位置がマッピングされた．四つのコスミドのオーバ
ーラップから、クローン化領域のＴｎ５要素の概略位置
が決定された．各コスミド内における］ｎ０！変異体宿
主を補償する配列の存在および位置を確認するため、Ｔ
ｎ５挿入物を含むＲｍ Ｉｎｏ’ＤＮＡの領域をブロ
ーブとして用いて、サザンプロットを行った．（このブ
ロープは、Ｒ．メリロティ１０２１ １ｎｏ’ｉ異体
ＤＮＡのＥｃｏＲ１フラグメントをｐＢＲ３２７にクロ
ーニングし、Ｅ，ｃｏｌｉ中でカナマイシン耐性に関し
て選択して（Ｔｎ５はＥｃｏＲ１部位を含まずそしてカ
ナマイシン耐性遺伝子を有する）造成されたｐＭＷｌ６
１のＥＣＯＲＩ挿入片から製造された．）Ｉｎｏ’変異
体の中のＴｎ５の位置は、コスミドクローンの１”．
ｃ ｏ Ｒ Ｉフラグメントに対するブロープのハイブ
リダイゼーションを、ＰＭＷ１６１のＥｃｏｌ冫１フラ
グメントに対するハイブリダイゼーションと比較して決
定した，Ｔｎ５はミオ−イノシトールの利川に関与する
遺伝子配列を含む６，２ｋｂのＥｃｏＲ１フラグメント
中に挿入されていることが見出された．このことの確認
は、このフラグメントを運ぶベクターをＲｍｌｎｏ’株
中に形質転換し、そしてそれがｌｎｏ’表現型を補う能
力をアッセイすることにより行った．このフラグメント
は挿入ベクター内で使用するために適当なサイレント領
域の一例である． Ｂ，ジャポニカム ベクター Ｂ．ジャポニカム染色体のサイレント領域は、ｎ１ｆ遣
伝ｒクラスター内に発見された．ｎｉｆクラスターを有
し、そして挿入ベクターとして使用されたブラスミドは
、ボイス・トムソンイ ・チンスティチェート・フォア・プラント・リサーチ（
Ｂｏｙｃｅ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＩｎｓｔｉｔｕＬ
ｅ ｆｏｒ Ｐｌａｎむ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）から
入手した．このブラスミドｐＲＥＶＩＯＯＯ （レゴッ
キ（Ｌｅｇｏｃｋｉ）ら，ＰＮＡＳ，８１．５８０６
（１９８４））は、ベクター上の配列と染色体中の配列
の間のホモロガスリコンビネーションによって、ＤＮＡ
をブラディリゾビウムの染色体へ組み込むために一般に
使用される．ｐＲＥＶ１０００に運搬されるＢ．ジャポ
ニカムの３．４ｋｂａ域を、ｎｉｆＡ発現カセットの都
合よい挿入のために、ユニークなＨ ｉ ｎ ｄ Ｉ１
１部位によって中断した．Ｂ．ジャポニカム染色体のこ
の領域内へのＤＮＡの挿入は、その生育にも窒素固定能
力にも影響を及ぼさないようである． ロモー −：：ｎｉｆＡ 八 ｎｉｆプロモーターのｎｉｆＡ遺伝子への融合体は、前
記のように造成した．これらの融合体を修飾して、ｎｉ
ｆＡ遺伝子のＡＴＧコドンに先立つ、ユニバーサルなｍ
ＲＮＡリーダー配列を含め、こうしてｍＲＮＡの５′末
端の変動に起因するｎｉｆＡ発現のバラツキを防止した
．ユニバーサルリーダー配列をｎｉｆＡ遺伝子に結合す
ることにより、用いるプロモーターに依存せずに、合成
される転写物は同一である．従って、この融合の唯一の
変動はプロモーターであり、従って、プロモーターの強
さの精密な定量を可能にする．均一性を達成するには、
全ての融合体を直接各プロモーターの−１位とユニバー
サルリーダー配列の＋１位の間に置くことが必要であっ
た．そのような構造の例は次のとおりである． 植物根瘤中でｎｉｆＨ転写による蛋白質転写レベルは高
いので、Ｒ．メリロティｎｉｒＨリーダー配列を選択し
た，ｎｉｒｌｌリーダーの配列を含み、そしてＢｇｌｎ
粘着５′末端からＦｓｐｌ３’末端に伸びる、第１７図
に示す合成リンカーを造成した．この合成リンカーを用
いて、次のようにして、ｐＪＢ１８２中のｎｉｌＡＩＪ
−ダー餠域を置換した，ｐＪＢ１Ｂ２をＦｓｐｌで消化
し（第１１図）、合成ｎ ｉｒ Ｈリーダーに連結した
；このプラスミドを続いてＢｇ ｌ ＩＩで消化して、
合成リンカーのＢｇｌ［ｌ末端を再形成しブラスミド内
のｎｉｆＡリーダーを除去した．リンカーとブラスミド
のＢｇｌ１末端を連結してρＪＢ２００を形成した．得
られたｎｉｆＨ’Ｊ−ダー：：ｎｉｆ八遺伝−ｔ融合物
の前には、ユニークなＢｇｌ［１部位が存在し、Ｂｇｌ
ｎまたはＢａｍｌｌｌ末端を有する任意のプロモーター
フラグメントの挿入に好都合である． プロモーターフラグメントの挿入に引き続いて、ｎ ｉ
ｒ Ｈ ’Ｊ−ダー内のＢｓｓＨ［１部位と該プロモ
ーターフラグメント内の第二部位とを用いて、ｍＲＮＡ
の＋１位迄のプロモーター配列をｎｉｆＨリーダー内の
＋１位に正確に融合した．このブラスミドをＢ ｓ ｓ
Ｈ ＩＩで消化し、プロモーター−リーダー接合部フ
ラグメントを、プロモーターの＋１位をｎ ｉ ｒ Ｈ
リーダーの＋１位に整列させることにより該接合部を再
構成する合成オリゴヌクレオチドに置換した．Ｂ．ジャ
ポニカムｎｉｆＤプロモーターを操作して、次の一連の
工程によってｐＪＢ２００内のｎｉｆＨリーダー配列の
前に存在させた．ｐＭＷ１２１ （ｎｉｆＤプロモータ
ー配列を有する）をＳｐｈｌで部分消化し、プロモータ
ー配列の直ぐ上流部位のみで開裂した．その部位を合成
リンカーでＫｐｎ１部位に変換し、このプラスミドを次
いでＢｇｌｎで再度消化してｎｉｆＤプロモーターの直
ぐ下流を開裂した．ｐＭＷ１２１のＢｇｌ［Ｉ−Ｋｐｎ
ｌプロモーターフラグメントを、Ｒ．メリロティｎｉｆ
Ａ遺伝子に先立つｃａｔプロモーターの代わりとして、
ｐＪＢ２００中にクローン化した，ｐＪＢ２００をＨｉ
ｎｄｌｌｌ撫−の部分消化処理に付し、ｃａｔプロモー
ターの直ぐ−１二流の部位で切断した．この部位をプラ
ント化し、ＫｐｎｌリンカーでＫｐｎｌ部位に変換した
；このプラスミドを続いてＢａｌｌｌで消化してｃａｔ
プロモーターを取り出し、そしてＢｇｌｎ−Ｋｐｎｌｎ
ｉｒＤプロモーターフラグメントに連結した．得られた
ブラスミドはｐＭＷ１５３である，ｐＭＷ１５３を次に
ＳｐｈｌおよびＢ ｓ ｓ Ｈ■で消化した．このフラ
グメントを合成オリゴヌクレオチドで置換して、正確な
プロモーター−リーダー融合体を造成した． Ｂ．ジャポニカムｎｉｆＨプロモーター：：Ｒ．メリロ
ティｎｉｆＡ遺伝子融合体の遺伝子掻作は、同様な方法
により、ｐＭＷ１２６からのｎｉｆＨプロモーターを取
り出して、次のように行った．ｐＭＷ１２６をＥｃｏＲ
Ｉで消化し、その部位をプラント化してリンカーでＫＰ
ｎ１部位に変換した；このブラスミドを次いでＫｐｎｌ
およびＢａｍＨｌで消化して、そのフラグメントをＢｇ
ｌ■とＫｐｎｌで消化したｐＪ １３ ２ ０ ０にク
［１−ン化した．（Ｋｐｎ１部位はｐ Ｊ Ｂ ２ ０
０をｔ｛ ｉ ｎ ｄ ｍで部分消化しそしてＫｐｎ
ｌリンカーを挿入して造成した．｝得られたブラスミド
がＰＭＷ１５４である．プロモーターの１１位とｎ ｉ
ｒ Ｈリーダーとの間に正しい融合を得るために、両
端にＢ ｓ ｓ Ｈ■部位を有するオリゴヌ、クレオチ
ドを合成した．このフラグメントを、プロモーター内部
およびまたリーダー配列内部の二つの位置でＢ ｓ ｓ
Ｈ ＩＩで消化しておいたｐＭＷ１５４にクローン化
した。得られたプラスミドはｐＭＷ１９０である．便宜
のために、本発明者らは全てのプロモーターｎｉｆＡ融
合体に隣接Ｋｐｎ１部位を用意した．なぜならこの酵素
はＲ．メリロティｎｉｆ八遣伝子の内部で切断せず、ま
た使用するどのプロモーターフラグメント内部でも切断
しないからであり、そのため組み込みベクターボリリン
カー配列内でのユニーク部位となるからである． −選１ぐ４−二左二 本発明の目的のために、任意の選択マーカー偽１゛ 毒適当である．例えば、下記で使用した選択マ一カーは
、ブラスミドｐ Ｈ Ｐ ４ ５Ω（プレンナ（Ｐｒｅ
ｎｔｈｉ）ら，Ｇｅｎｅ，２９：３０３ （１９８４）
）から得られたスベクチノマイシン／ストレプトマイシ
ン抗生物質耐性オベロンである，ｐｌｌＰ４５Ωは、Ｉ
ｎ ｃ Ｆ Ｉ ｌプラスミド，ＲＩＯＯ．＋ （
ジェーコブ（Ｊ ａ ｃ ｏｂ）ら，ＤＮＡインサーシ
ョン・エレメンップラスミズ．アンド・エピソームズ（
ＤＮＡＩｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，
Ｐｌａｓｍｉｄｓ， ａｎｄ Ｅｐｉｓｏｍｅ
ｓ）．ブカリ，シャビロおよびアドヒア（［３ｕｋｈａ
ｒｉ，Ｓｈａｐｉｒｏ ａｎｄ Ａｄｈｙａ）編．
コールド・スプリング・ハーバーＮＹ，１９７８，ｐｐ
．６０７−６６４）からオメガフラグメント（抗生物質
耐性遺伝子を含む）をｉｓし、これをｐ Ｂ Ｒ ３
２ ２ ｇ導体にクローニングして造成した．この耐性
遺伝子のセットは、Ｔ４転写終止および転写終止ングナ
ルを運ぶ短い逆向き反復配列およびポリリンカー配列に
隣接されている．この領域はｐ Ｈ Ｐ ４ ５Ω多く
の適当な制限酵素により消化して、２．Ｏｋｂフラグメ
ント上に取り出すことが可能である．本発明のベクター
の造成のために、本発明者らはＥ ｃ ｏ Ｒ Ｉ制限
フラグメントを単離して、これをＥ ｃ ｏ Ｒ ｌで
消化したρＭＷ ＋ ５ ２巾にクローン化して（次章
を参照）ｐＭＷＩ５５（第１８図）をｉ！ｔだ． 終止λ久丈西城發一（双敗Ｙ 転写終止シグナル成分は知られており、本発明にかんし
ては任意の所望シグナルが適当である．例えば、Ｅ，ｃ
ｏｌｉのｒｒｎＢオペロン（ブロシウス（Ｂｒｏｓｉｕ
ｓ）ら，Ｊ．Ｍｏ１．Ｂｉｏ１．，１４８：１０７ （
１９８１））からの’ｒｌ／Ｔ２転写ターミネーターを
含むｌ．ｌｋｂフラグメントは、ベクターｐ ＥＡ３
Ｑ Ｏ（［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラト
リー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｔｏｎｉ
ｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ）Ｊ （コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），１８９２、マニアチス、フリ
ッシュおよびサムブロック！）から得られ、Ｓｍａ ｌ
消化ｐｌｃ２ＯＨ中にクローニングされ、ｐＭＷ１５２
が造成された′（第１８図） ｐｌｃ−２０ＨのＫｐｎ１部位に挿入されたプロモータ
ー：：ｎｉｒＡ遺伝子融合体は、隣接するりゾビウムゲ
ノムＤＮＡへの転写読み越しを防止するため、転写終止
シグナル成分（オメガフラグメントおよびＴＩ／Ｔ２か
らのもの）に隣接されている．カセット内部でのリコン
ビネーシッン現象の防止のためには、異なる隣接終止シ
グナルを用いることが好ましい．■点述ム■道程 カセットが造成されれば、このカセットを所望の宿主に
伝達するために、任意のベクターが使用できる，ｐｌｃ
−２０１１からカセットを取り出すためのポリリンカー
配列中には、多くの制限部位が利川できる． ＆Ｉｔみ
込みは標準的方法で誘発される．次の記載は、クローニ
ングベクタートし７ｐＲＫ２９０（ヘリンスキ．米国特
許４，５９０，１６３）を使用する例の説明である． ｐｌｃ−２００を基本とするベクターから、Ｂ．ジャポ
ニカムｎｉｆＡプロモーター：：Ｒ．メリロティＡｉｆ
ｆ伝子融合物およびオメガフラグメントを含むカセット
をＸｂａ Ｉフラグメント（ｐｌｃ−２０Ｈボリリンカ
ー内ｃ７）ＥｃｏＲＶ部位はＸｂａ １部位に変換され
た）上に取り出して、ｐＲＫ２９０の誘導体ｐＭＷ１８
４のＳｐｅｔ部位にクローン化した，（ｐＭＷ１８４は
、６．２ｋｂＥｃｏＲｌイノシトール’７ラグメントを
含むｐＲＫ２９０から、最初にＨｐａｌおよびＢａｌ３
１で消化してＴ ｎ ５配列をを取り出し、次いでＳｐ
ｅｌリンカーを挿入して組み込みカセットのユニークな
クローニング部位を造成することにより、誘導された．
）今やホモロジー領域で隣接されたカセットを含んでい
る上記構成物と、不適合性プラスミド例えばゲンタマイ
シン耐性選択マーカー遺伝子を含むＰＪＢ２５１とを、
Ｒ．メリロティ宿Ｈ冫Ｃ［冫２０１１に導入した．（ｐ
Ｊｌ３２５１はｐ Ｉ） Ｉ１ １（ハーシュ（Ｈｅｒ
ｓｈ）ら．Ｐｌａｓｍｉｄ１２ ： １３９ （１９
８４））から、ＩＩ ｉ ｎ ｄ ＩＩ１部分消化を行
ってスペクチノマイシン遣伝子を削除し、次いでゲンタ
マインン１に関して選択し、そしてスペクチノマイシン
Ｓに関してスクリーニングして誘導された．）受容体菌
株を、スベクチノマイシンおよびトリメトブリム耐性の
両者の発現に関して選沢した．使用した二種のブラスミ
ドは不適合性であるため、これらの遺伝子が同時に発現
されるのは、カセットが染色体中に組み込まれるか、ま
たはベクターが相互にリコンバインされる場合のみであ
る．可能な二つの場合を区別するため、形質転換体をテ
トラサイタリン感受性、即ちｐＲＫ２９０−由来ベクタ
ーの消失および単一炭素源としてのミオ−イノシトール
上での増殖能力の欠損に関してスクリーニングした（こ
れらの欠損はカセットがゲノムに組み込まれたことを示
唆する）．組み込み体のＩ） Ｎ Ａを次に適当な方法
で分析して組み込みが実際に生じたことを確認する。
遺伝子工学捏作されたｎｉｆＡ遺伝子は、ロｉ『Ａ蛋白
質の細胞内ｔ度の増加をもたらす．この増加した濃度は
天然には存在しえない：何故なら、細胞内固定化窒素も
しくは酸素濃度と無関係に、ｍ記のフィードバック阻害
システムがｎｉｆシステムの脱抑制および窒素固定と同
時のニトロゲナーゼの生産の増加の原因となるがらであ
る．ｎｉｆＡ遺伝子は、種間において実質的にボモ「１
ガスであるが、その配列は同一ではない．従って、本発
明によれば、宿王微生物と同一のｎｉｌＡ遺伝子または
その遺伝子部分を用いることが好ましい（例えばＲ．メ
リロティを宿主とするときは、Ｒ，メリロティの遺伝子
が好ましい）．完全なｎｉｆＡ遺伝子を用いることも出
来るが、またはｎｉｒｌ、リプレッサーの結合に関与す
ると考えられる相当するＮ−末端領域を削除したｎｉｆ
Ａ遺伝了の誘導体を用いることも出来る．この領域の削
除は、ｎｉｒＡ蛋白質をより効率的プロモーター活性化
剤とする．ドラモンド（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ）ら， （
１９８６．ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａ１，５：４４１）
は、Ｒ．メリロティとＫ．ニュモニエのｎｉｆＡ蛋白質
を比較して、種々の長さのより非類位のセグメントで分
醪されたホモロジー領域の存在を示した，ｎｉｆＡ蛋白
質のＮ末端ホモロガス領域（集合的にドメイン八と呼ば
れ、これはＲ．メリロティのｎｉｆＡのアミノｆａ１０
からアミノ酸！６３、およびＫ．ニューモニエｎＩｒＡ
のアミノ酸２２からアミノ＃１８２に及んでいる：前記
ドラモンドら）は、ｎｉｒＡプロモーター活性化の抑制
に機能的に関与することが判明した．本発明者らは、ｎ
ｉｆＡ蛋白質から１′メインＡを含むアミノｆａ２から
１６６の領域を削除すると、おそらくリプレッサーの結
合領域を失ったことにより、該蛋白質がより効率的転写
活性化剤となることを見出した． 制御された（例えば活性化可能な）ブロモー夕、例えば
ｎｉｆプロモーターに加えて、ｎｉｆＡ遺伝子の転写を
構成的に行うことのできるプロモーター、例えばカナマ
イシン耐性遺伝子から容易に得られるプロモーターもま
た使用できる．逸■１スニ友二 ブラスミドでの微生物の形質転換は比較的稀なできごと
であるため、本発明のブラスミドは好ましくは形質転換
体の同定のための選択性マーカー蛋白質をコードするＤ
ＮＡｓＪｆ域を含む．このマーカー蛋白質は宿主細胞で
発現できそして該蛋白質を発現した微生物の表現特性を
可能にする任意の蛋白質であってよい．好ましいマーカ
ー蛋白質は、一種もしくはそれ以上の抗生物質、例えば
クロラムフェニコールにたいする耐性を与える蛋白質で
ある．形質転換体は抗生物質の存在下に生育することの
できる微生物である． ｆ力λｌ玉夏造城， ブラスミドは、プロモーターとｎｉｒＡ遺伝子の多数の
異なる組合せによって構築することができる．数種のプ
ロモーターの任，αのものと組み合わせて、Ｒ．メリロ
ティｎｉｒＡ遺伝子をＲ．メリロティの形質転換に使用
する一適当なプロモーターと組み合わせてＢ．ジャポニ
カムのｎｉｒＡ遺伝子を、Ｂ．ジャポニカムのｎｉｆＡ
遣伝子と使用する． Ｒ メ ロー のｎｉｆＡ １冫．メリロティのｎｉｆＡ遺伝子はブラスミドｐＲｍ
Ｂ３．８Ｈの２ ． ４ ｋｂ■』ｉ Ａ ｌフラグ
メントから得られる（第１図参照；およびスゼト（Ｓｚ
ｅｔ）ら，１９８４，Ｃｅｌｌ，３６：１０３５参照）
．Ｒ．メリロティのｎｉｆＡ遺伝子の配列は、ブイケマ
（Ｂｕｉｋｅｍａ）ら．１９８５，Ｎｕｃｌ，Ａｃｉｄ
Ｒｅｓ．．１３：４５３９に記載されている． ■｛ ジ ボニカムのｎｉｆＡ Ｂ．ジャポニカムのｎｉｆＡ遺伝子は、候補のｆｉｘＡ
遣伝子の直ぐ上流に存在する．Ｂ．ジャポニカムのｆｉ
ｘＡコード配列（５’ ＣＣＧＧＡＣＴＣＧＧＣＧＣＡ
Ｃ．ＡＴＣＣＣ；３’）に基づ＜２０ｍｅｒのオリゴヌ
クレオチドを１ローブとして、本発明者らは両方の遺伝
子がＢ．ジ→・ボニカムのゲノムの５．４ｋｂのＨ ｉ
ｎ ｄ ｍＢａｍ｝ｌ ｌフラグメント上に存在する
ことを突き止めた．このフラグメントを’［するために
、Ｂ．ジャポニカムのｒ）ＮＡをＢａｍＨＩで消化し、
回塘勾配で分離した．大きいフラグメ７｝（２０〜２５
ｋｂ）を含むフラクションが標識２０ｍｃｒブローブに
最大のレベルのハイフリダイズを示した．このＤＮＡを
Ｈｉｎｄｎｌで消化しＨ ｉ ｎ ｄ ｍ、ＢａｍＨｌ
およびアルカリホスファターゼで処理しておいたｐＢＲ
３２７にライゲートした．このｎｉｆＡおよびｆｉｘＡ
遣伝子を含む５．４ｋｂのフラグメントをｐＦＣＣ３０
１と呼ばれるプラスミド上のＥ．ｃｏｉ形質転換体から
回収した，ｐＦｃｃ３０１からｎｉｆＡ遺伝子をもつ３
．４６ｋｂのＨ ｉ ｎｃｌ−１》ｓＬＩフラグメント
を取り出して、オリゴヌクレオチドリン力一を用いて両
端をＢａｍ１１ｌ部位に変換したのち、ｐＪｌ１１２０
（ｐＡＣＹＣ １ ８ ４からシャイン−ダルガノ（Ｓ
１））配列と転写開始部位の間のＴａｑｌ部位をＢｇｌ
ｌ１に変換することにより誘導された：第６図）の１３
ｇ ｌ Ｉ１部位にクローン化した．このサブクロー
ニングは、ｎｉｆＡフラグメントからｒｉｘＡ遺伝子を
除去するために行ったのである．得られたプラスミドｐ
ＲＡＲ５６６はＢ．ジ中ポニカムｎｉｆＡ遺伝子の貯蔵
ベクターである（第２図），ｎｉｆＡｉｆｉ伝子のヌク
レオチド配列は｝ニー（Ｔｈ ｏ ｎ ｙ）ら．１９８
７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．．１５：８４７９
に記載されている． ドメイン八が削除ぐーれ−たＲ．メリロティの−ｐ ｉ
−ｎｉｆＡ遺伝子のドメインＡが削除され、そして天然
に存在するシャインーダルガノ配列がより優れた合成Ｓ
Ｄ配列に置換されたブラスミドｐＪＢ２０３は、下記の
ようにして造成された．出発ブラスミドとして、Ｅ．ｃ
ｏｌｉのＣａｔプロモーターに融合した修飾型のｎ１ｆ
Ａ遺伝子を含むｐＪＢＩ８２を用いた．ブラスミドｐ＋
ＪＢ’１８２は、プラスミドｐＪＢｌ６０中のｎｉｆＡ
遺伝子の天然ＳＤ配列を、リポゾームに対する結合親和
性がより強い合成ＳＤ配列に置換し、そしてｐＪＢ１６
０のｒｉｘＡプロモーターをＣａＬプロモーターに置換
して誘導された．ｎｉｒＡ遺伝子の５′末端の天然配列
および上流の６１塩基対は、第１１図のパネル八に示し
た．一層効率の強いＳＤ配列をコードする合成ＤＮＡフ
ラグメント（パネルＢに示す）をバネルＡのＤＮＡ配列
にクローン化し、続いてｐＪＢｌ６０をＢｇｌｌ＋およ
びＦｓｐ ［（部分的）で消化して天然ＳＤ配列を除去
し、ρＪ Ｂ Ｉ ８ ０を得た，ｐＪＢ１８０のリン
ヵーフラグメントの３′末端にＳｐｈ１部位を導入した
，ｐＪＲＩ８０のｒｉｘＡプロモーターを、次にＣａＬ
プロモーターに交換してｐＪ８１８２を得た． ｐ Ｊ ８ １ Ｂ ２からドメイン八を削除するには
、次のようにした．ρＪＢ１８２をＳｐｈｌおよび１５
ｃ ｏ Ｒ Ｉで！墳裂してｎｉｆΔ蛋白質の゛？ミ
ノ酸２位からアミノＭｌ６８位の配列を削除し、削除し
たフラグメントを第１１図のパ享ルＣに示すオリゴヌク
レオチドで置換した．これにより、ドメイン八の全ての
削除が行われ、ドメインＡおよびＣ（アミノｌ％ｆ＋６
９−１７２）の間のリンカー領桟の最後の４アミノ酸の
再構築およびＥｃｏＲ１部位に先立つ領城Ｃの鏝初の７
アミノ酸（アミノｔＩＩｌ？３−１７９）の再構築が達
成された． 力ジ鼠〕 Ｌ記ｎｉｒＡＬｆｆ伝子または他のｎｉｆＡ遺伝子に連
結し、該ｎｉｆＡ遺伝子を適当なレベルで発現させて、
窒素固定の増大をもたらすために、種々のプロモーター
が単藺された．プロモーターがｎｉｆＡの最適の発現を
生じるかどうかを決定するためには、一定のガイドライ
ンに従うことができる．これらのガイドラインに関する
言及は、潜在的に有用な如何なるプロモーターを除外す
るためのものでもなく、従って、ガイドラインに対する
例外が存在するであろうことは認識されるであろう．に
もかかわらず、一般には窒素固定能力の増大をもたらす
ｎｉｆ八の生産の増加のための適当なプロモーターの選
択過程に、ガイドラインを頼りにすることができる． 一Ｍに、強力な構成的プロモーターは避けるべきである
．本発明者らは、緑適レベル以−トのｎｉｆＡの住産は
、植物の生育に致命的であることを見出した，ｎｉｆＡ
遺伝子の強力な非制御発現はり物の成長をＦ＠害するレ
ベルのｎｉｆＡ蛋白質の生産をもたらす．同様に、強力
なホモロガスブｌ】モーター（即ち、天然で同じバクテ
リアに見出されるプロモーター）は避けるべきである．
・強力なホモ口ガスプロモーターもまた、遇刺１ｄのｎ
ｉｆＡの生産を引き起こし、植物に致命的である．従っ
て、本発明者らは、強力胃神プロモーター（１１ｐち、
天然にはそのバク大を得るために適当であることを見出
した．ｎｉ『プロモーターは一般に非ホモロガス環境で
活性が低く、従って異種宿主内での強力ｎｉｆプロモー
ターは、ｉ！４度に増加したレベルのｎｉｆＡ蛋白質を
発現するであろう．そのようなプ１７モーターの例は、
次のとおりである．−Ｗ−２げ−ボニカみノとｎ ｉ
ｆ １１遺イ本子ブ煕±二−久Ｂ．ジャポニカムのｎ
ｉ ｒ １１遺伝子プロ土ターのヌクレオチド配列は、
ファーマンおよびへぶケ（ １’ ｕ ｈ ｒ ｍ ａ
ｎ ｎ ａ ｎ ｄ Ｈ ｅ ｎ ｎｅｃｋｅ）
．１９８４．Ｊ，Ｂａｃｔ．１５８：ｌＯ０５に記載さ
れている．第３図を参照すると、Ｂ．ジャボニカｌ１の
ｎ ｉ ｒ Ｈ遺伝子プロモーターは、ｐＢＲ３２２の
Ｓａｌｌ挿入片のｐＢＪ３３ Ｌ．シガン州立大ｔのバ
リー・ケルム（Ｂａ ｒ ｒ ｙ Ｃｈｅ ｌｍ）氏
から人手）によって運ばれる． Ｂ．ジャポニカムのｎｉｆＨプロモーターを含む領域は
、０．１５ｋｂＢｇｌ■−１１ｇｉＡｌフラグメント上
に単屠された．ＨｇｉＡｌ末端はリンカーを用いてＢａ
ｍ｝Ｉｆ部位に変換され、そしてこのフラグメントをρ
ＢＲ３２２のＢａｍＨＩ部位にクローン化して、ｐＭＷ
ｌ１５を得た，ｐＭＷ１１５のＢａｍＨ Ｉ−Ｓａ ｌ
ＩフラグメントのＢａｍｌ１１部位をリンカーによっ
てＢｇｌＩＩに変換し、このフラグメントをｐＳｔＪ
Ｐ ｌ ０ ４のＣ！ａｌ−Ｓａｌｔ部位へクローン化
した：ｐＳＵＰ１０４は、広域宿主ベクターであって、
サイモン（Ｓｉｍｏｎ）らの［モレキュラー・ジェネテ
ィックス・オブ・ザ・バクテリア・プラント・インタラ
クション（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
ｏｆ ｔｈ ｃ Ｉｓ ａ ｃ
Ｌ ｃ ｒ ｉ ａ Ｐ Ｉ ａ
ｎ Ｌ ｌ ｎ ｔｅｒａｃｔ ｉｏｎ）９
８ １０６ （Ａ− プーラ（１’ｕｈｌｅｒ）
編Ｊ）１９８３；およびブーラーらの米国特許４，６８
０，２６４ （参照により本明細書に含まれる）に記載
されている．Ｃｌａ ｌ部位をリンカーを用いてＢｇｌ
［Ｉに変換し、ρＭＷＩｌｆｉを得た（第３図）．Ｂ．
ジャポニカムｎｉｆＨ（およびｎｉｒＡ．下記参照）プ
ロモーターは、バック（Ｂｕｃｋ）ら，Ｎａｔｕｒｅ，
３２０：３７４．１９８６に記載されている、保存され
た候補上流ｎｉｆＡ結合配列を有する．これらの保存配
列の削除または変異は、Ｅ，ｃｏｌｉ中でのプロモータ
ーの強さの減少を起こすことが知られている（アルバレ
ズーモラレス（ＡｌｖａｒｅｚＭｏｒａｌｅｓ）ら，１
９８６，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，ｆ４：４２
０７）．Ｂ．ジャポニカムｎｉｆＨプロモーターは、二
つの上流ｎｉｒＡ結合部位を含み、一つは−１１１位に
、そして他方は＋１から数えて−１４０位に存在する．
分析の結果、ｐＭＷ１１６は−１１１位の結合部位のみ
を含むことが判明した．もう一方の−１４０位の部位は
、誤って削除されていた． １４０部位を含むｎ ｉ ｒ Ｈプロモーターをクロー
ン化するため、ベクターｐＭＷ１１６を次のように修飾
して、両方のト流ｎｉｆＡ結合配列を含めた，ｐＢＪ３
３からの両方の蚊補上流結合配列を含む１．８５ｋｂの
ＨｉｎｄＲｌ−ＳａｌｌフラグメントをｐＭＷｌ１６の
Ｉ｛ ｉ ｎ ｄ１１−Ｓａｌ１部位にクローン化して
、結合配列を一つしか含まないフラグメントと交換した
（第３図）．得られたブラスミドｐＭＷ１２２をＢａｍ
ＨＩで部分消化し、修復（Ｆ ｉ ｌ ｌｉｎ）Ｌ連結
してｎｉｆＡ結合配列の上流のＢａｍＨ１部位を削除し
た．得られたブラスミドｐＭＷ１２６をＢ．ジャポニカ
ムｎ ｉ ｒ Ｈプロモーターの下流のＢａｍｉ｛＋リ
ンカ一部位にクローン化させ、Ｂ．ジャポニカムｎ ｉ
ｒ ！ｆブロモーターの貯蔵ベクターとした． ｎ ｉ ｒ ＩＩによ の＠社，
イし， 第１表に示すデータは、三つのｍ樺の一つのｎｉｆＡ遺
伝子産物により活性化されたときのＫ．ニヱーモニエま
はたＲ．メリロティのｎｉ【Ｈプロモーターからの遺伝
子発現レベルを比較する．試験プラスミドにおいては、
全ての型のｎｉｆＡ遺伝子が、Ｅ，ｃｏｌｉのｃａｔプ
ロモーターから発現された．第１３図を参照すると、ｎ
ｉｆＡ遺伝子をその天然ＳＤ配列とともに含むｐＪＢｌ
３５は、ｐＪＢｌ３１ （下記ｐＪＢ１１０からｎｉｆ
Ａ遺伝子の末端から２４ｂｐのＮｒｕ１部位をＢｇｌｕ
部位に変換して誘導された）から、ｎｉｆＡ遺伝子を含
むＢｇ１■フラグメントを、Ｂｇｌｌ＋で消化したｐＪ
Ｂ１２０にクローン化して造成した＊ ｐ Ｊ Ｂ １
３５から発現されたｎｉｆＡ蛋白質は、ｎｉｆＨプロモ
ーターからのＩａｃＺの発現を引き起こすが、そのレベ
ルはバックグラウンドよりも若干高いだけである，ｎｉ
ｆＡ遺伝子が合成ＳＤ配列に勘合されたｐＪ１３１８２
においては、Ｒ．メリロティプロモーターからのｌａｃ
Ｚ遺伝子の発現は、バックグラウンドよりも約２．４倍
増大している．β−ガラクトシダーゼの発現の増大は、
合成ＳＤ配列がドメインＡのために削除されたｎｉｆＡ
遺伝子に融合している時、より一層ｗ４著であった（ｐ
ＪＢ２０３）．この場合、ｎｉｆ｝ｌプロモーターから
の発現は、バックグラウンドに比べて１５倍増大した．
第１表 ｐＪＢ１２０ ｐＪＢｌ３５ ｐＪＢ１８２ ＰＪＢ２０３ （ｐＪＢ３１） ２． １ ３．３ １ ６． ４ １８５３．０ （ｐＶｓＰ９） Ｂ．ジャポニカムｎｉｆＤ プロモーＢ．ジャポ
ニカムｎｉｆＤプロモーターのヌクレオナド配列は、カ
ルザおよびヘン不ツケ（Ｋａ ｌｕｚａ ａｎ
ｄ Ｈｅｎｎｅｃｋｅ）により，Ｍａｔ，Ｇｅｎ
．Ｇｅｎｔ．１９６：３５ （１９８４）に記載されて
いる．第４図を参照すると、Ｂ．ジ中ポニカムｎｉｆＤ
プロモーターは、ＰＲＪ６７６（ヘンネッヶ，Ｎａｔｕ
ｒｃ，２９１：３５４ （１９８１））の誘導体である
ｐＲＪ６７６Δｌ（バリー・ケルム（Ｂａｒｒｙ Ｃ
ｈｅｌｍ）から入手）に運ばれている．Ｂ．ジャポニカ
ムｎｉｆＤプロモーターをｐＲＪ６７６Δｌから、Ａｈ
ａｆｆｌからＢｇｌ［ｌまでの３７０ｂｐのフラグメン
ト上に単離した，Ａｈａｌｌ＋末端をリンカーによって
Ｂ ａ ｍＨ１に変換した．次にこのＢａｍＨＩ−Ｂｇ
ｌＰ ■フラグメントを一ＡＣＹＣｌ ８４のＢａｍＨ１部位
にサブクローニングして、ｐＭＷｌ１３を得た．テトラ
サイタリン耐性プロモーターを削除するためＣｌａｌお
よびＢａｍｌ｛＋で切断し、Ｂｇｌ［Ｉリンカーを挿入
したｐＭＷ１１４を得た．これにより、Ｂ．ジャポニカ
ムｎｉｆＤプロモーターの修飾物が得られ、ρＭＷＩＩ
４のＢｇｌｌ１部位に遺伝子を挿入してｎｉｆＤプロモ
ーターから該遺伝子を発現させることができる，ｐＭＷ
１１４のＸｂａ Ｉ−Ｓａ ｌ ｉ７ラグメントを、Ｘ
ｂａ Ｉ＋Ｓａ Ｉ １で切断したｐｓｔ，’Ｐｌ０４
にクローン化して、ｐＭＷ１１７を得た． Ｅ．ｃｏｌｉのｃａＬプロモーターのスクレオチド配列
は、アルトン（Ａｌｔｏｎ）ら．Ｎａ’ｒｕｒｅ，２８
２ ： ８６４ （１９７９）に記載されている，ｃａ
ｔ遺伝子のプロモーターはｐＪＢ１２０に運ばれている
構成的プロモーターである，（ｐＪＢ１２０はρＡＣＶ
Ｃ １ ８ ４（第４図）のＴａ４ １部位をオリゴヌ
クレオチドリンカーを用いてＢｇｌｌ１部位に変換する
ことにより造成された．）この部位は転写開始部位とｃ
ａｔ遺伝子のＳＤ配列の間に存在し、そしてｃａｔプロ
モーターの支配の下に遺伝子クローン化の好適な位置を
提供する． ５Ｒ．メリロティｎ ｉ Ｊ』ｊａ仮子”ｆ口Ｅ ９
二Ｒ．メリロティのｎｉｆＨ遺伝子プロモーターは、ス
ンダレサン（Ｓｕｎｄａｒｃｓａｎ）ら．Ｎａｔｕｒｅ
，３０１ ：７２Ｂ （１９８３）に記載されている．
第５図を参照すると、Ｒ．メリロティのｎｉｒＨプロモ
ーターを含むプラスミドｐＪｌ１８１が示されている．
ｐＪｒ３８１Ｈは、先ずｐＲｍＲ２（ルプクン（Ｒｕｖ
ｋｕｎ）ら，Ｎａｔｕｒｅ，２８９．８５ （１９８１
））から、６８０ｂｐのＳａ ｌ Ｉ−ＳｐｈＩフラグ
メントを、Ｓａｌｌ−Ｓｐｈｌ消化ｐＡＣＹＣ １ ８
７１にクローニングし、次いで、得られたブラスミド
（ｐＪＢ８０）をＳＰｈｌおよびＨｉｎｄｌｌｌで消化
し、Ｓｍａ Ｉリンカーに連結して造成された．これに
より、Ｒ．メリロティのｎ ｉ ｒ Ｈプロモーター配
列の直ぐ下流にユニークＳｍａ Ｉ部位が形成された．
Ｒ，ｊユ刃−テ のｆｉｘＡ − ブロモーＲ．メリ
ロティのｆｉｘＡｉｉ伝子プロモーターは、アール（Ｅ
ａｒｌ）ら，Ｊ，ＢａｃＬ．ｐｌ６９：１１２７ （１
９８７）に記載されている．Ｒ．メリロティｆｉｘ遺伝
子クラスターは、ブラスミドｐＷＢ１０８３ （Ｆ．オ
ースベル ブイケマＣＦ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｂｕｉｋｃ
ｍａ）ら．Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌｉｅｄ ＧｅｎｅＬ
ｉｃｓ，２、２４９ （１９８３）から得られた）から
、５ｋｂのＥｃｏＲｌフラグメント上に単離された．こ
のＥｃｏＲＩフラグメントをρＡＣＶＣ１８４ （第４
図）のＥ ｃ ｏ Ｆ？ １部位にクローン化してｐＪ
Ｂ１１７（第６図）を得た．転写開始部位から＋２位置
にＭａｅ１部位が存在していた．ｐＪＢ１ １７をＭａ
ｅｌで開裂してｆｉｘＡプロモーター領域を除去し、Ｍ
ａｅｌ末端を合成リンカーでＢｇｌＩＩ末端に変換し、
次いでＥｃｏＲＩおよびＢｇｌ［Ｉ消化した，ｆｉｘＡ
プロモーター領域を含むフラグメントをＥｃｏＲＩ＋−
Ｂｇｌ［＋消化ｐＪＢ１２０に連結してｐＪＢＩ２４（
第６図）を造成した． Ｋ ニューモニエのｎｉｒｌｌ゛ブロモーＫ．二１−モ
ニエ遣伝子のヌクレオチド配列は、スンダレサン（Ｓｕ
ｎｄａｒｅｓａｎ）ら，Ｎａｔｕｒｅ， ３０１：７２
Ｂ （１９８３）およびスコット（ＳＣＯＬＬ）ら，Ｊ
，Ｍｏｌ．Ａｐｐ ｌ．Ｇｃｎｅｔ．，Ｉ ： ７ １
（１９８１）に記載されている．Ｋ．ニューモニエ
ｎｉｒ ＋ｔプロモーターはｐＫＡ３（ブキャナン−ウ
ォラストン（Ｂｕｃｈａｎａｎ−Ｗｏ ｌ ｌａｓｔｏ
ｎ）ら．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｃｔ．．１８４ ：１
０２ （１９８ １）に記載されている、ｌＥｃｏＲＩ
部位に挿入されたｐＶＷ１Ｇからの０． ６ｋｂ（７
）Ｅｃ ｏＲ ｌ −Ｂｇ Ｉ ｎフラグメントを有す
るｐＡｃＹｃ１８４）から４７１ｂＰのＩミｃｏＲＩ−
Ｓａｃｌフラグメント上で単離され、ＣｔａｌおよびＢ
ａｍ｝ＩＩ消化ＰＳＵＰ！０４中にクローニングし、ｐ
ＲＫ３７ （第７図ａ）を得た． ｎ ｉ ｒ Ｉｆプロモーターを含むフラグメントは、
ｎｉｒＪプロモーターｓＩｋＲの一部も含み、ｎｉｒＪ
プロモーター領域とはよりト流の部位から反対方向に転
写される．従って、ｎ ｉ ｆ Ｈブロモーターは、ｐ
ＲＫ３７からＮｃ．ｏＩ−ＢａｍＨｒフラグメントを除
去してこれをＮｃｏｌＢａｍＨｌ消化ｐＪＢ１２０に再
度クローニングすることにより、ｎｉｆＪプロモーター
領域とは独立にクローン化された．０られたプラスミド
はｐＲＫ３７２と命名された． Ｋ ニューモニエのｎｉｆ｝シ ープロモ−Ｋ．ニ
エーモニエｎ ｉ ｒ Ｉ！遺伝子プロモーターのヌク
レオチド配列は、ベイノン（Ｂ ｅ ｙ ｎｏｎ）ら，
Ｃｅｌ１，３４：６６５ （１９８３）に記載されてい
る．Ｋ．ニューモニエのｎｉｆＥプロモーターを、ＰＶ
ＷＩＯ（Ｋ．ニューモニエのｎｉｆＥプロモーターフラ
グメントのＥｃｏＲ ｌ−Ｓａ ｌ ｌフラグメントを
ＥｃｏＲｌ−Ｓａｌｌ部位に挿入して含むｐＢＲ３２２
；ベイノンら上記）からＳｍａｌ−ｆ｛ｉｎｃ■訓限フ
ラグメント上に単離しへこのＳｍａ ｌＨ ｉ ｎ ｃ
ｎ末端をＣｌａ ＋およびＢａｍＨＩ末端に１襖し、
Ｃｌａｌ＋ＢａｍＨＩ消化ｐｓＵＰｌ０４に挿入して、
ｐＲＫ１ １ （第７図ｂ）を造成した． Ｋ．二二一％ −’− ｒ− （’） ｎ ｉ ｒ Ｕ
ｉＬ伝子７’旦モニ久Ｋ．ニューモニエｎ ｉ ｒ Ｕ
遺伝子ブロモークーのヌクレオチド配列は上記ベイノン
らの文献に記載されている．Ｋ．ニューモニエｎｉｆＵ
遣伝子プロモーターをｐＭｃ１ １ （Ｋ．ニューモニ
エからのｎｉｆＵフラグメントを含むｐＢＲ３２２）か
ら、ＢａｍＨＩ−Ｓａｃｌフラグメント上に午曙し、ｐ
ｓＬＩＰｌ０４のＢ ａ ｍ Ｈ１−Ｓａｃ１部位に直
接クローン化し、ｐＲＫ３Ｂを造成した（第７図ｃ）ａ Ｋ．ニエーモニエのｎｉｆＭ プロモータＫ．ニ
ューモニエのｎｉｆＭ遺伝子プロモーターのヌクレオチ
ド配列は、上記ベイノンらの文献に記載されている．Ｋ
．ニューモニエｎｉｆＭプロモーターをｐＭｃ１２（Ｋ
．ニューモニエのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔｌｎｉｒＭプロモ
ーターフラグメントを含むｐＢＲ３２２；上記ベイノン
））から、Ｘｈｏｌ−Ｓａｉｌフラグメント上にサブク
ローニングし、ｐｓＵＰｌ０４の３ｉ＊ｌ：部位に入れ
て、ｐＲＫ４１５を得た．続いてこのテトラサイクリン
耐性遺伝子のプロ毫一ターを取り出すために、ブラスミ
ド配列をＣｌａ １部位からｓｐｈｔ部位まで削除した
．得られたブラスミドをｐＲＫ４ １５Δと命名した（
第７図ｄ）． ベ ー ＪＢ 一 の゜ゝ適当なプロモー
ターへのｎｉｒＡ遺伝子の融合物を、広域宿主ベクター
、例えばｐｓＵＰｌ０４を用いて、リゾビウム中に形質
転換した．本発明者らは、ｐｓＵＰｌ０４がＲ．メリロ
ティ中に形質転換すると窒素固定に本質的に致命的な影
響を与えることを見出した．第８図を参照すると、本発
明者らは従って、別の広域宿主ベクターであるｐＲＫ２
９０ （ヘリンスキ（Ｈｅｌｉｎｓｋｉ）の米国特許４
．５９０，１６３；参照により本明細書に含まれる）の
誘導体を用いるように選択し、これは上記のような致命
的影響を与えないことを見出した．この誘導体ベクター
ｐＪＢ１５１は次のようにして造成された． 先ずρＲＫ２９０のＬｃｏＲＩ部位に、カナマイシン耐
性遺伝子およびマルチブルークローニング部位ポリリン
力一を挿入してブラスミドｐＷＢ５を作製したく第８図
）．ＢａｍＨＩ消化によってカナマイシン耐性遺伝子を
除去し、プラスミドを再度連結してｐＪＢ１５１を得た
．ポリリン力一部位は先のＥｃｏＲｌ部位に残存してお
り、プロモーター：：ｎｉｆＡ融合体の挿入のために都
合よい制限エンドヌクレアーゼ部位を多数従供する．後
述する任意の融合体をｐＪＢ１５１の複数の部位の任意
の部分に挿入可能である． ｆＡ ｐＶＷ６０はＴｎ５カナマイシン耐性構造遺伝子および
その構成的プロモーターを含む．このプラスミドは、ｐ
Ｍｓ１０００ （フィイサー（Ｆｉｌｓｅｒ）ら，Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎ．ＧｅｎｅＬ．，１９１：４８５ （１９
８３））から得たＨｉｎｄＩＯ−Ｓａ ｌ ｌフラグメ
ントを、ＨｉｎｄｌｆｌおよびＳａｉ＋で消化したｐ
１３ Ｒ ３ ２ ７中に連結して構成した．このｐ
ＶＷ６ ０のＨ ｉｎｄ！ＩＩ−Ｓａ！ｌフラグメント
を取り出して、ＰＸＣＹＣｌ８４のＨ ｉ ｎｄｌｌｌ
−Ｓａ ｌ Ｉ部位にクローニングし（第４図）、ｐＪ
８９Ｂを得た． Ｒ．メリロティｎｉｆＡｉｆｉ伝子を有ずるＨ ｇｉＡ
ｌフラグメントを、．ｐＲｍＢ３．８Ｈ （第１図）か
ら中離した．このフラグメントに、ＰＪＢ９８のカナマ
イシン耐性構造遺伝子とそのプロモーターの間に存在す
るＢｇｌｆ１部位にクローニングできるように、Ｂｇｌ
ｎリンカーを付加した．この工程によって、ｐＪＢ１
１０（第９図）が得られ、その中ではＲ．メリロティｎ
ｉｆＡ遺伝子がＴ入ナマイシン耐性遺伝子プロモーター
から構成的に発現される．所望の構成を広域宿主範囲ベ
クターｐｓＵＰン耐性遺伝子プロモーター：：Ｒ．メリ
ロテイｎｉｒＡ遺伝子融合体を含むＨｉｎｄｍ−ＳＡＭ
フラグメントを単離し、そしてｐｓｔ，’ＰＩＯ４のｌ
ｌｉｎｄｍ−ＮｒｕｌｆｆＪ位にクローニングして、プ
ラスミドｐＪＢｌ１１（第１０図）を得た． ｐＪＢ１１０およびｐＪｒ目１１によって運ばれている
上記挿入片は、Ｒ．メリロテイｎｉ『Ｂ遺伝子の一部を
もまたそのプロモーターとともに含んでいる，ｎｉｒＢ
プロモーターの存在は、窒素固定の増強にとって致命的
でありうる：というのは、ｎｉｒＢは窒素に制？卸され
るプロモーターとして、ｎｉｆＡＨｉ白質の結合部位を
含有し、そのためプロモーターへ結合することが望まれ
るｎｉｆＡ蛋白質を除去する作用をするためである．従
って、本発明者らはｐＪＢＩＩＯからｎｉｆＡ遺伝子を
ｎｉｆＢプロモーターを含まない制限フラグメント上に
サブクローニングした．その方法は次のように行った．
このブラスミドの中には、他の三つのＮｒｕ１部位に加
えて、ｎｉｆＡ遺伝子の末端の２４ｂｐ下流に一つのＮ
ｒｕ １部位が存在することが発見された．ρＪＢＩＩ
ＯをＮｒｕｌで部分消化し、完全長の直線ＤＮＡを’ｌ
離し、Ｂｇｌｌｌリンカーを連結挿入した．これにより
、新たな１３ ｇ Ｉ Ｉ１部位を持つ四つの誘導体が
生じた．ρＪＢＩ３１が、所望位置にＢａｌｌ１部位を
有する誘導体であった．このプラスミドは、ｎｉｌＡ遺
伝子をｎｉｆＢプロモーターを含まないｌ．７ｋｂのＢ
ｇｌｌ＋フラグメントトに巾離することを可能にした．
上記の方法はＰＪＢＩ １ １でも同様に行われ、同じ
Ｂｇ＋■フラグメントを生じた． 第１！図のパネルＡを参照すると、Ｒ．メリロティのｎ
ｉｒＡ遺伝子の発現の増加のために、さらなる変更が行
われ、その中にはシャインダルガノ（ＳＤ）配列も含ま
れている．ｎｉｆＡｉ！ｉ伝子の前に存在する天然ＳＤ
配列は、他の公知ＳＤ配列に比較して、比較的弱いリボ
ゾーム結合部位である．本発明者らは、ｐＪ！’３１６
０（Ｒ．メリロティｒｉｘＡプロモーター：：Ｒ．メリ
ロティｎｉｒＡ遺伝子融合体、上記および第６図参照）
のｎｉｆＡ遺伝子の元のＳＤ配列を、Ｅ．ｃｏｌｉｌ６
Ｓ ＲＮＡリボゾーム結合部位により近像する合成Ｄ
ＮＡ配列に置換することを選択した．ｐＪＢ１２４をＢ
ｇ！■で開裂し、上記ｐＪ８９ＢのＢｇｌｎｎｉｆＡフ
ラグメントに連結してｐＪＢｌ４０を得；ｎｉｆＡ遺伝
子の下流のＢｇｌｌ１部位をリンカーによってＰｓＬｌ
に変史してｐＪＢ１５２を得；そしてｐＪＢ１５２のｆ
ｉｘＡプｏ−ｔ−一ターのＦ流の１４ ｃ ｏ Ｒ １
部位をＩＩ ｉ ｎ ｄ ＩＩＩに変更したｐＪＢ１６
０を得た．このＤＮＡをＦｓｐＩＣ部分消化して、ｎｉ
ｆＡ遺伝子の綴初のＡ′１゛Ｇの直後を切断した．５′
末端にＨ ｇ Ｉ Ｉ＋粘着末端を持つ３９ｂｐフラグ
メントを合成した．この合成ＤＮＡの配列は元のＡＴＧ
およびＦｓＰ１制限部位を再構成し、ＳＤ配列の変更も
もたらす，Ｆｓｐｌ消化ブラスミドをこの合成フラグメ
ントと連結し、続いてＢｇｌｎ消化し（天然ＳＤの直ぐ
−Ｌ流の遺伝子を切断するため）、再度連結して新たな
ＳＤ配列を挿入した．リンカーを正しい位置に挿入され
たクローンを選択した．選択されたブラスミドはｐＪＢ
１８０である．ｐＪＢ１８０から、ｆｉｘＡプロモータ
ーの代わりにｃａｔプロモーターを含む別のブラスミド
ρＪ Ｂ ｌ ８ ２も誘導された．Ｂ．ジャポニカム
ｎｉｆＨ：：Ｒ． メリロティｎｉｆＡ Ｒ．メリロティｎｉｆＡｉ！ｉ伝子をその天然Ｓ Ｉ）
配列とともに含むＰＪＢＩ３１から１．７ｋｂのＢ ｇ
Ｉ Ｉｔフラグメントを、ｐＭＷ１２６のＢａｍＨ１
部位にクローニングしてρＭＷ１２Ｂをえた：その巾に
おいては、ｎｉｆＡ遺伝子はＢ．ジャポニカムｎ ｉ
ｒ Ｈブタの支配下に存在する．この融合体をｐＲＫ２
９０を基本とするベクターに移動させるため、ｐＭＷ１
２８がらＳａｌ１フラグメントを取り出して、その両末
端をリンカーでＣｌａ １部位に変え、Ｃｌａｌ＋Ｘｂ
ａ１消化した．Ｒ．メリロティのｎｉｆＡ遺伝子に加え
て、Ｂ．ジャポニカムの完全なｎｉｆＡプロモーターお
よび二つの上流結合配列を含む、３．４ｋｂのＣｌａｌ
−ＸｂａｌフラグメントをＣＩａｍ｝−Ｘｂａｌ消化し
た，Ｊｌ３１５１（第８図）にクローン化して、プラス
ミドｐＭＷ１４２ （第１２図）を得た． ｐ Ｊ Ｂ ＋ ３ １からｎｉｒＡ遺伝子を１．７ｋ
ｂＢｇｌ■フラグメント上に切り出し、ｐＪＢ１２０の
ｃａｔプロモーターに隣接するＢ ｇ Ｉ Ｉ１部位に
クローニングして、ｐＪＢ＋３５（第１３図）を得た．
これをｐＪＢ１５１に移動させるために、ｃａｔプロモ
ーターおよびｎｉｆＡ遺伝子の両者を含むＰｖｕ■フラ
グメントをｐＪＢ１３５から切り出した．その両端を合
成リンカーの付加によってＢｉｎｄｌｌ＋に変換し、こ
のフラグメントをｐＪ［３１５１のＨｉｎｄｆｆ１部位
にクローニングしてｐＪＢ１５４ （第１３図）を得た
． 合成ＳＤ配列に続＜Ｒ．メリロティのｎｉ『Ａ遺伝子を
、次のようにしてＰＪＢｌ８２から取り出した．このブ
ラスミドを１’ ｓ Ｌ ｌで開賛し、この部位を合成
リンカーでＢｇｌ１１部位に変換した．続いてＲｇｌ［
Ｉで消化するとｎｉｆＡ遺伝子を含むｌ．７ｋｂのフラ
グメントが遊離された．このフラグメントをＢａｍＨＩ
消化ｐＭＷ１２６と連結して、ｐＭＷ１４５を｛｝たｉ
その中においては、Ｒ．メリロテイのｎｉｆＡ遺伝ｔは
、ｐ Ｓ Ｕ Ｐ Ｉ ０ ４ベクターをフ．一本とし
てＢ．ジャポニカムのｎ ｉ ｆ Ｈプロモーターの支
配下に存在ずる．ｐＭＷｌ４５からの合成ＳＤ配列を含
むｎｉｆＡ遺伝子を含むＨ ｉ ｎｄｎｌＸｂａ ｌフ
ラグメントを、ＩＩｉｎｄＨＩ｝Ｘｂａ１消化ＰＭＷｌ
４２（第１２図）にクローニングし、これによりｐＲＫ
２９０から．夫導された基本骨格中のオーセンチックな
ｎｉｆＡに変換した。この最終プラスミドをρＭＷｌ４
８と命名した（第１４図）． ｃａＬ：： たなＳＤＲ メ １１テ４−バーｉｒ
人 Ｒ．メリロティのｎｉｒＡｉｊｉ伝Ｙ−をｃａｔプロモ
ーターの支配下にクローニングするため、ｐ４目３１８
０からＢ ｇ ｌ Ｉｆ −Ｐ ｓ Ｌ Ｉフラグメン
トを取り出しこれをＢｇｌｌｌ＋Ｐｓｔｌ消化ｐＪＢ１
６７ （Ｊ，Ｖｉｒｏｉ．．６０：１０７５ （１９８
６）に記載されているｐＴＲ１３００をＢｇｌロで消化
し、ｌａｃＪｌ伝了一を含むフラグメントをＢｇｌ■消
化ｐＪＢ１２０に連結してｐＲＫｌ３０１を得、Ｉａｃ
Ｚ遣伝ｒに続（Ｎｃｏ１部位をＰｓｔｌに変換してＰＪ
Ｂ１６３を得、Ｘｍｎ １部位をＨ ｒ ｎ ｄ ［１
部位に変換してＰＪＢｌ６７とすることにより造成さ
れた）に連結し、ｃａｔ：：ｌａｃＺ融合ベクターでＩ
ａｃ遺伝子を置換した．次に、このＣａｔプロモーター
：：ｎｉｆＡ融合体を、この新規造成物（ｐＪＢｌ８２
）からＨｉｎｄｌｌ１およびＰｓＬＩで消化して取り出
し、Ｈ ｉ ｎ ｄ Ｉｌｌ＋ＰｓＬＩ消化ｐＪＢ１５
１ （第８図）にクローン化した．これにより、プラス
ミドｐ Ｊ Ｂ １９１（第１５図）が得られた． ｃａｔ：：Ｂ ジ ポニカムｎｉｒＡｃａｔプロモー
ター：：Ｂ．ジャポニカムｎｉｆＡ融合体造成物（ｐＲ
ＡＲ５６６）は、前述した．この融合体をｐＪＢ１５１
に再度クローン化するため、ｐＲＡＲ５６６からＰｖｕ
ｌｌフラグメントを切り出し、その両端を合成リンカー
でＨ ｉ ｎｄｌｌｌに変換し、次いでｐＪＢ１５ｌ（
第８図）の１１ ｉ ｎ ｄ ’１１部位に連結してｐ
ＲＡＲ５７Ｇを得た． 微ｉ物１５ ＝ｊ： 任，αのリゾビウムまたはブラディリゾビウム株が、ｉ
ｉｉ’ｉな宿主であり、特に効果的なｍｅ形成細菌であ
る．組換えブラスミドの伝達に通ずる宿主の例は次のと
おりである．Ｒ．メリロティＲＣＲ２０１１株、Ｓ ｔ
Ｊ ４ ７株および４１株一Ｂ．ジャポニカムＵＳＯＡ
１３６株；Ｂ．ジャポニカムＵＳＤＡ １１０株
およびＬＪ Ｓ ＤＡ １２３株：Ｒ．フレディイＵ
ＳＤＡ ２０５株．これらの株および他の多くの公知
株は、ＡＴＣＣまたはロートアムステフド・コレクショ
ン・オブ・リゾビウム（ＲｏＬ’ｈａｍｓＬｅｄ Ｅ
ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ＳＬａＬｉｏｎ，Ｈａｒｐ
ｅｎｄｅｎ．ｆｌｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ．ＬＪ．Ｋ
，）から人手可能である．さらに、ＩＢＰワールド・カ
タログ・オブ・リゾビウム・コレクションズ（アレン（
Ａｌｌｅｎ）ら．１９７３，インターナショナル・バイ
オロジカル・プログラム・ロンドン（Ｉｎｔｅｒｎａｔ
ｉｏｎａｌ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＰｒｏｇｒａｍｍ
ｅ， Ｌｏｎｄｏｎ））は、全世界に人手可能な接
１４菌のリストを擾供している． ある種の野性株を畑から、支配種としてｔｎ＃すること
ができる（ジェンキンス（Ｊｅｎｋｉｎｓ）ら．ソイル
・ナイエンス・オブ・アメリカ−Ｊ．（Ｓｏｌｉ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ｏｆＡｍｅｒｉｃａ Ｊ．），４９
：３２６ （１９８５）およびフィリップス（Ｐｈｉｌ
ｌｉｐＳ）ら．同誌．２０３ （１９８５））．多くの
他の株は競争力が強くそして有効な根瘤形成細菌である
ことが知られている．そのような株もまた、本発明の範
囲に含まれる． 三 − に ゾビウムへの 一スミ の走 ｍ換えプラスミドはヘルパーブラスミドｐＲＫ２０１３
を用いて、次のようにして、三親交配により所望宿主リ
ゾビウム種に伝達することができる（フィグルスキ（ｆ
ｉｇｕｒｓｋｉ）およびヘリンスキ（Ｈｅ ｌ ｉｎ
ｓｋｉ），Ｐｒｏｃ．Ｎａ Ｌ ｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃ
ｉ，ＵＳＡ，７６ ： １６４８ （＋９７９））．ブ
ラスミドを先ず、Ｅ．ｃｏｌｉ株、例えば、ＭＭ２９４
（Ａ１”ＣＣ＃３３６２５；ＮａＬｕｒｅ， ２１１
：１ １ １０ （１９６８））に、常法によって伝達
する．受容ａｌ１２Ｉｉであるリゾビウムの株、Ｈ．
ｃｏ１ｔ／ｐＲＫ２０１３ （これは途中でｔｒａお
よびｍｏｂｌ）１ｍを供給する）、およびｎｉｆ組換え
プラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株をの培養物
をＬＡ寒天プレート上で混合し、３０℃で一夜インキエ
ベートして接合させる．この交配により、接合（ｃｏｎ
ｊｕｇａＬｉｏｎ）によるブラスミドの宿主リゾビウム
株への伝達が生じる．トランスコンジュガントの選択は
受容体のりゾビウム株およびｎｉｆ！Ｉｆ換えプラスミ
ドの選択用成分を適当に含む培地で行う．ブラスミドｐ
ＲＫ２０１３はりゾビウム中で安定ではないから、交配
菌から回収できない．み１み ［ｎｔｅ ｒａｔｉｏ
ｎ 上記の造成物が宿主細胞内に保持されることを確実にす
るために、そして各株間でのプラスミドの保持のバラッ
キを防止するために、プロモーター：：遺伝子融合体を
染色体外の要素として含ませるよりも、適当な宿主の染
色体に組み込む方が有利である．そのような組み込みは
、プラスミド保持に関して観察されるバラッキ（そのよ
うなバラッキは、バタテロイド中のｎｉｆＡｉと、植物
置との関連の把握を困難にする）を克ｌＩｋするために
役立つ．そこで、バクテリア染色体中へのｎｉｆ遺伝子
融合体の、組み込みもしくは挿入のためのベクターを造
成した．一つの型の挿入ベクターはバクテリアゲノム中
の特定の位置にＤＮＡの挿入を引き起こすことが出来る
．そのような部位特異的挿入ベクターは、クローン化遺
伝子のバクテリア宿主への伝達を可能にするのｂならず
、好ましくは不安定システムもまた有する．そのような
システムの一つは、マーカーレスキエ−（ｍａｒｋｅｒ
ｒｅｓｃｕｅ）とよばれ、所望配列の染色体への組み込
みが選沢可能表現型を引き起こす．一つの例はベクター
ｐＲＫ２９０もしくはその誘導体である．このベクター
は不適合プラスミドの存在下で不安定化される．従って
、マーカーレスキューは、該ベクターを含む細胞内への
不適合ブラスミドの導入後に、組み込まれたベクター配
列を有する細胞を選択するために用いることができる（
後記参照）． 宿主染色体のゲノム領域は、所望ＤＮＡの組み込みのた
めに同定される．好まし《は、この領域は共生に関して
はサイレントな領域である；即ちＩＩ廟感染力ならびに
有効性が維持される．宿主染色体内の選択された部位へ
の所望ＤＮＡ配列の挿入は、バクテリアの生育に対して
全くもしくは殆ど影響を与えてはならず、そして全ての
代謝活性および異化活性は、該挿入によって特異的に変
更したものを除いて、ほぼ野性のレベルに保たれねばな
らない． ベクターは、好ましくは、組み込みのための全ての要素
を含む［カセッ｝Ｊを有する．このカセットの成分は、
同しベクターのパフクボーンを用いて、他の類似の成分
に置換することができる．カセットは、好ましくはｔＩ
ｌｌ数もしくは複数の所望遺伝子、特に窒素固定の増強
に関与する遺伝子、例えばｎ＋ＦＡ遺伝子に融合してオ
ペロンを形成する転写プロモーター、（２）カセットを
運ぶ組み込み体の選択のための選｝Ｒ可能マーカー遺伝
子、（３）上記遺伝子の上流に隣接するか、あるカセッ
トにおいては−ト記遺伝子を中断する転写および翻訳終
止シグナル（隣接する染色体ＤＮＡのプロモーターから
の転写読み越へを防止し、挿入されたカセットの下流に
存在する染色体遺伝子の過剰発現を防止する）、および
（４）宿主ゲノムのサイレント領域にホモロガスな、約
３〜６ｋｂの隣接ＤＮＡ配列．これらの隣接配列は、本
明細書中で「ホモロジー領域』と呼ばれ、相互のりコン
ビネーションによって外来ＤＮＡの組み込みを可能にす
る．組み込みベクターの成分を、以下に記載する．−組
−々−込ムづク−ク−二卑成−分 カバ１−Ｌ１咬さ−久タニ カセットの造成のための初期クローニングベクターとし
てｐｌｃ−２０１１を選沢した；というのは、これが長
いポリリンカーを持つ比較的小さいブラスミドであるか
らである，ｐｌｃ２ ０ − Ｈは、ｐＵｃからの誘導
ブラスミドであり、それが持つポリリンカーは、約１６
個のユニークな＠限部位を有し、それらの部イαはβガ
ラクトシダーゼ遺伝子の中に存在する（第１８図）（マ
ーシｚ（Ｍａｒｓｈ）ら，Ｇｅｎｅ．３２，４８２ （
１９Ｂ４））．本発明におい゛ζ、他のいかなるベクタ
ーも同様に適当である．Ｒ．メリロティの染色体の共生
的にサイレントな領域を同定するため、増殖および植物
との共生関係に害をリえないと名えられる公知代謝経路
の欠陥を有する変異体を選択した．細胞の増殖に致命的
でない、選択された経路は、利用可能炭素源のミオーイ
ノシトール（ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ）分解へと導い
た（アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）ら，Ｊ，Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２４６ ： ５６６２ （１９７ １
））この経路の第一過程は、ミオーイノシトールによっ
てのみ誘発されるＮＡＤ＋依存性デヒドロゲナーゼ（イ
ノシトール・デヒドロゲナーゼ）によって触媒される．
この経路は、他のポリオール類によっては誘発されず、
そして正常増殖条件下で活性ではない：何故ならイノシ
トールは天然には土壌中に存在しないからである．イノ
シトール利用経路の選択された変異体は、Ｒｍ Ｉｎ
ｏ’と命名され、Ｒ．メリロティ１０２ｌ株のＴｎ５挿
入変異形成および続いて単一炭素源としての糖ミオーイ
ノシトールを利用する能力の不在によって選択すること
により、製造された． 一つまたはそれ以上の特定のポリオールによって誘発さ
れるが、通常の増殖条件下または植物との共生関係下で
要求されない他の多くのポリオールデヒドロゲナーゼが
知られている（プリムローズ（Ｐｒｉｍｒｏｓｅ）およ
びａ７ソン（Ｒｏｎｓｏｎ），Ｊ．Ｂａｃｔ．１４１：
１１０９（１９８０））．これらの、および他の共生的
にサイレントな染色体領域もまた、異Ｊ４ＤＮＡの組み
込みのための適当な部位を提供し、そして選沢された経
路の酵素をコードもしくは制御するかまたはポリオール
の輸送に影響するであろう． この、イノシトールを利用可能炭素源に変換することに
関与する酵素イノシトールデヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ）
を、Ｒｍ ｌｎｏ−でアッセイし、野性型の親株であ
るＲ．メリロティｌ０２１での活性と比較した．変異株
においては検出可能な活性は発現されなかった．しかし
ながら、植物のＦＩｔ（バイオマス）のアッセイにおい
ては、変異株と親株の間に、検知できる相違は観察され
なかった．従って、ミオーイノシトールの利用に関与す
るＤＮＡ領域（Ｔｎ５挿大の部位）を、リゾピウムゲノ
ムのｎｉｆ融合体の組み込みの適当な部位として選択し
た。このサイレント遺伝子領域はＤＮＡ配列の組み込み
に汎用的に利川でき、本明細書に記載するＤＮＡ配列の
組み込みのみに限定されるわけではない． １） Ｎ Ａセグメントの組み込みのためのベクターを
構築するには、ホモロジー領域を’ｆｋ＃およびクロー
ン化することが必要である．その後ｎｉｆＡ融合体を、
両側の隣接配列を残したままこの配列に挿入することが
できる．カセットの両側のゲノム配列を有するホモロガ
スリコンビネーションは、そのゲノムへの挿入をもたら
す．化フラグメントをｐＲＡＲ５１２のＢａｍｌｌ１部
位にクローニングして、コスミドバンクを調製した，ｐ
ＲＡＲ５１２はｐＬＡＦＲｌ（フリードマン（Ｆｒｉｅ
ｄｍａｎ）ら，Ｇｅｎｅ，１８．２８９ （１９８２）
）から、ＢａｍＨｌリンカーをＥ ｃ ｏ Ｒ １部位
に挿入し、ＢａｍＨ１部位の一方の側にＥｃｏＲ１部位
を再度構成することにより、誘導した，Ｂａｍ８１部位
に挿入されたフラグメントは、Ｅｃ ｏＲ ｌ消化によ
って切り出すことができる．このコスミドバンクを｝≧
ｍｌｎｏ’変異株に交配し、各クローンを、単一炭素源
としてミオ−イノシトールを含む培地上で、ｌｎｏ一表
現型の補償に関して試験した．相当する補償ＤＮＡ配列
を運搬するＲｍ Ｉｎｏ’変異株のみが、生育可能で
あった． 四つの補信コスミドが単離され、そしてＢａｍＨｌおよ
びＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼを用いてＴｎ５挿
入の位置がマッピングされた．四つのコスミドのオーバ
ーラップから、クローン化領域のＴｎ５要素の概略位置
が決定された．各コスミド内における］ｎ０！変異体宿
主を補償する配列の存在および位置を確認するため、Ｔ
ｎ５挿入物を含むＲｍ Ｉｎｏ’ＤＮＡの領域をブロ
ーブとして用いて、サザンプロットを行った．（このブ
ロープは、Ｒ．メリロティ１０２１ １ｎｏ’ｉ異体
ＤＮＡのＥｃｏＲ１フラグメントをｐＢＲ３２７にクロ
ーニングし、Ｅ，ｃｏｌｉ中でカナマイシン耐性に関し
て選択して（Ｔｎ５はＥｃｏＲ１部位を含まずそしてカ
ナマイシン耐性遺伝子を有する）造成されたｐＭＷｌ６
１のＥＣＯＲＩ挿入片から製造された．）Ｉｎｏ’変異
体の中のＴｎ５の位置は、コスミドクローンの１”．
ｃ ｏ Ｒ Ｉフラグメントに対するブロープのハイブ
リダイゼーションを、ＰＭＷ１６１のＥｃｏｌ冫１フラ
グメントに対するハイブリダイゼーションと比較して決
定した，Ｔｎ５はミオ−イノシトールの利川に関与する
遺伝子配列を含む６，２ｋｂのＥｃｏＲ１フラグメント
中に挿入されていることが見出された．このことの確認
は、このフラグメントを運ぶベクターをＲｍｌｎｏ’株
中に形質転換し、そしてそれがｌｎｏ’表現型を補う能
力をアッセイすることにより行った．このフラグメント
は挿入ベクター内で使用するために適当なサイレント領
域の一例である． Ｂ，ジャポニカム ベクター Ｂ．ジャポニカム染色体のサイレント領域は、ｎ１ｆ遣
伝ｒクラスター内に発見された．ｎｉｆクラスターを有
し、そして挿入ベクターとして使用されたブラスミドは
、ボイス・トムソンイ ・チンスティチェート・フォア・プラント・リサーチ（
Ｂｏｙｃｅ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＩｎｓｔｉｔｕＬ
ｅ ｆｏｒ Ｐｌａｎむ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）から
入手した．このブラスミドｐＲＥＶＩＯＯＯ （レゴッ
キ（Ｌｅｇｏｃｋｉ）ら，ＰＮＡＳ，８１．５８０６
（１９８４））は、ベクター上の配列と染色体中の配列
の間のホモロガスリコンビネーションによって、ＤＮＡ
をブラディリゾビウムの染色体へ組み込むために一般に
使用される．ｐＲＥＶ１０００に運搬されるＢ．ジャポ
ニカムの３．４ｋｂａ域を、ｎｉｆＡ発現カセットの都
合よい挿入のために、ユニークなＨ ｉ ｎ ｄ Ｉ１
１部位によって中断した．Ｂ．ジャポニカム染色体のこ
の領域内へのＤＮＡの挿入は、その生育にも窒素固定能
力にも影響を及ぼさないようである． ロモー −：：ｎｉｆＡ 八 ｎｉｆプロモーターのｎｉｆＡ遺伝子への融合体は、前
記のように造成した．これらの融合体を修飾して、ｎｉ
ｆＡ遺伝子のＡＴＧコドンに先立つ、ユニバーサルなｍ
ＲＮＡリーダー配列を含め、こうしてｍＲＮＡの５′末
端の変動に起因するｎｉｆＡ発現のバラツキを防止した
．ユニバーサルリーダー配列をｎｉｆＡ遺伝子に結合す
ることにより、用いるプロモーターに依存せずに、合成
される転写物は同一である．従って、この融合の唯一の
変動はプロモーターであり、従って、プロモーターの強
さの精密な定量を可能にする．均一性を達成するには、
全ての融合体を直接各プロモーターの−１位とユニバー
サルリーダー配列の＋１位の間に置くことが必要であっ
た．そのような構造の例は次のとおりである． 植物根瘤中でｎｉｆＨ転写による蛋白質転写レベルは高
いので、Ｒ．メリロティｎｉｒＨリーダー配列を選択し
た，ｎｉｒｌｌリーダーの配列を含み、そしてＢｇｌｎ
粘着５′末端からＦｓｐｌ３’末端に伸びる、第１７図
に示す合成リンカーを造成した．この合成リンカーを用
いて、次のようにして、ｐＪＢ１８２中のｎｉｌＡＩＪ
−ダー餠域を置換した，ｐＪＢ１Ｂ２をＦｓｐｌで消化
し（第１１図）、合成ｎ ｉｒ Ｈリーダーに連結した
；このプラスミドを続いてＢｇ ｌ ＩＩで消化して、
合成リンカーのＢｇｌ［ｌ末端を再形成しブラスミド内
のｎｉｆＡリーダーを除去した．リンカーとブラスミド
のＢｇｌ１末端を連結してρＪＢ２００を形成した．得
られたｎｉｆＨ’Ｊ−ダー：：ｎｉｆ八遺伝−ｔ融合物
の前には、ユニークなＢｇｌ［１部位が存在し、Ｂｇｌ
ｎまたはＢａｍｌｌｌ末端を有する任意のプロモーター
フラグメントの挿入に好都合である． プロモーターフラグメントの挿入に引き続いて、ｎ ｉ
ｒ Ｈ ’Ｊ−ダー内のＢｓｓＨ［１部位と該プロモ
ーターフラグメント内の第二部位とを用いて、ｍＲＮＡ
の＋１位迄のプロモーター配列をｎｉｆＨリーダー内の
＋１位に正確に融合した．このブラスミドをＢ ｓ ｓ
Ｈ ＩＩで消化し、プロモーター−リーダー接合部フ
ラグメントを、プロモーターの＋１位をｎ ｉ ｒ Ｈ
リーダーの＋１位に整列させることにより該接合部を再
構成する合成オリゴヌクレオチドに置換した．Ｂ．ジャ
ポニカムｎｉｆＤプロモーターを操作して、次の一連の
工程によってｐＪＢ２００内のｎｉｆＨリーダー配列の
前に存在させた．ｐＭＷ１２１ （ｎｉｆＤプロモータ
ー配列を有する）をＳｐｈｌで部分消化し、プロモータ
ー配列の直ぐ上流部位のみで開裂した．その部位を合成
リンカーでＫｐｎ１部位に変換し、このプラスミドを次
いでＢｇｌｎで再度消化してｎｉｆＤプロモーターの直
ぐ下流を開裂した．ｐＭＷ１２１のＢｇｌ［Ｉ−Ｋｐｎ
ｌプロモーターフラグメントを、Ｒ．メリロティｎｉｆ
Ａ遺伝子に先立つｃａｔプロモーターの代わりとして、
ｐＪＢ２００中にクローン化した，ｐＪＢ２００をＨｉ
ｎｄｌｌｌ撫−の部分消化処理に付し、ｃａｔプロモー
ターの直ぐ−１二流の部位で切断した．この部位をプラ
ント化し、ＫｐｎｌリンカーでＫｐｎｌ部位に変換した
；このプラスミドを続いてＢａｌｌｌで消化してｃａｔ
プロモーターを取り出し、そしてＢｇｌｎ−Ｋｐｎｌｎ
ｉｒＤプロモーターフラグメントに連結した．得られた
ブラスミドはｐＭＷ１５３である，ｐＭＷ１５３を次に
ＳｐｈｌおよびＢ ｓ ｓ Ｈ■で消化した．このフラ
グメントを合成オリゴヌクレオチドで置換して、正確な
プロモーター−リーダー融合体を造成した． Ｂ．ジャポニカムｎｉｆＨプロモーター：：Ｒ．メリロ
ティｎｉｆＡ遺伝子融合体の遺伝子掻作は、同様な方法
により、ｐＭＷ１２６からのｎｉｆＨプロモーターを取
り出して、次のように行った．ｐＭＷ１２６をＥｃｏＲ
Ｉで消化し、その部位をプラント化してリンカーでＫＰ
ｎ１部位に変換した；このブラスミドを次いでＫｐｎｌ
およびＢａｍＨｌで消化して、そのフラグメントをＢｇ
ｌ■とＫｐｎｌで消化したｐＪ １３ ２ ０ ０にク
［１−ン化した．（Ｋｐｎ１部位はｐ Ｊ Ｂ ２ ０
０をｔ｛ ｉ ｎ ｄ ｍで部分消化しそしてＫｐｎ
ｌリンカーを挿入して造成した．｝得られたブラスミド
がＰＭＷ１５４である．プロモーターの１１位とｎ ｉ
ｒ Ｈリーダーとの間に正しい融合を得るために、両
端にＢ ｓ ｓ Ｈ■部位を有するオリゴヌ、クレオチ
ドを合成した．このフラグメントを、プロモーター内部
およびまたリーダー配列内部の二つの位置でＢ ｓ ｓ
Ｈ ＩＩで消化しておいたｐＭＷ１５４にクローン化
した。得られたプラスミドはｐＭＷ１９０である．便宜
のために、本発明者らは全てのプロモーターｎｉｆＡ融
合体に隣接Ｋｐｎ１部位を用意した．なぜならこの酵素
はＲ．メリロティｎｉｆ八遣伝子の内部で切断せず、ま
た使用するどのプロモーターフラグメント内部でも切断
しないからであり、そのため組み込みベクターボリリン
カー配列内でのユニーク部位となるからである． −選１ぐ４−二左二 本発明の目的のために、任意の選択マーカー偽１゛ 毒適当である．例えば、下記で使用した選択マ一カーは
、ブラスミドｐ Ｈ Ｐ ４ ５Ω（プレンナ（Ｐｒｅ
ｎｔｈｉ）ら，Ｇｅｎｅ，２９：３０３ （１９８４）
）から得られたスベクチノマイシン／ストレプトマイシ
ン抗生物質耐性オベロンである，ｐｌｌＰ４５Ωは、Ｉ
ｎ ｃ Ｆ Ｉ ｌプラスミド，ＲＩＯＯ．＋ （
ジェーコブ（Ｊ ａ ｃ ｏｂ）ら，ＤＮＡインサーシ
ョン・エレメンップラスミズ．アンド・エピソームズ（
ＤＮＡＩｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，
Ｐｌａｓｍｉｄｓ， ａｎｄ Ｅｐｉｓｏｍｅ
ｓ）．ブカリ，シャビロおよびアドヒア（［３ｕｋｈａ
ｒｉ，Ｓｈａｐｉｒｏ ａｎｄ Ａｄｈｙａ）編．
コールド・スプリング・ハーバーＮＹ，１９７８，ｐｐ
．６０７−６６４）からオメガフラグメント（抗生物質
耐性遺伝子を含む）をｉｓし、これをｐ Ｂ Ｒ ３
２ ２ ｇ導体にクローニングして造成した．この耐性
遺伝子のセットは、Ｔ４転写終止および転写終止ングナ
ルを運ぶ短い逆向き反復配列およびポリリンカー配列に
隣接されている．この領域はｐ Ｈ Ｐ ４ ５Ω多く
の適当な制限酵素により消化して、２．Ｏｋｂフラグメ
ント上に取り出すことが可能である．本発明のベクター
の造成のために、本発明者らはＥ ｃ ｏ Ｒ Ｉ制限
フラグメントを単離して、これをＥ ｃ ｏ Ｒ ｌで
消化したρＭＷ ＋ ５ ２巾にクローン化して（次章
を参照）ｐＭＷＩ５５（第１８図）をｉ！ｔだ． 終止λ久丈西城發一（双敗Ｙ 転写終止シグナル成分は知られており、本発明にかんし
ては任意の所望シグナルが適当である．例えば、Ｅ，ｃ
ｏｌｉのｒｒｎＢオペロン（ブロシウス（Ｂｒｏｓｉｕ
ｓ）ら，Ｊ．Ｍｏ１．Ｂｉｏ１．，１４８：１０７ （
１９８１））からの’ｒｌ／Ｔ２転写ターミネーターを
含むｌ．ｌｋｂフラグメントは、ベクターｐ ＥＡ３
Ｑ Ｏ（［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラト
リー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｔｏｎｉ
ｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ）Ｊ （コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），１８９２、マニアチス、フリ
ッシュおよびサムブロック！）から得られ、Ｓｍａ ｌ
消化ｐｌｃ２ＯＨ中にクローニングされ、ｐＭＷ１５２
が造成された′（第１８図） ｐｌｃ−２０ＨのＫｐｎ１部位に挿入されたプロモータ
ー：：ｎｉｒＡ遺伝子融合体は、隣接するりゾビウムゲ
ノムＤＮＡへの転写読み越しを防止するため、転写終止
シグナル成分（オメガフラグメントおよびＴＩ／Ｔ２か
らのもの）に隣接されている．カセット内部でのリコン
ビネーシッン現象の防止のためには、異なる隣接終止シ
グナルを用いることが好ましい．■点述ム■道程 カセットが造成されれば、このカセットを所望の宿主に
伝達するために、任意のベクターが使用できる，ｐｌｃ
−２０１１からカセットを取り出すためのポリリンカー
配列中には、多くの制限部位が利川できる． ＆Ｉｔみ
込みは標準的方法で誘発される．次の記載は、クローニ
ングベクタートし７ｐＲＫ２９０（ヘリンスキ．米国特
許４，５９０，１６３）を使用する例の説明である． ｐｌｃ−２００を基本とするベクターから、Ｂ．ジャポ
ニカムｎｉｆＡプロモーター：：Ｒ．メリロティＡｉｆ
ｆ伝子融合物およびオメガフラグメントを含むカセット
をＸｂａ Ｉフラグメント（ｐｌｃ−２０Ｈボリリンカ
ー内ｃ７）ＥｃｏＲＶ部位はＸｂａ １部位に変換され
た）上に取り出して、ｐＲＫ２９０の誘導体ｐＭＷ１８
４のＳｐｅｔ部位にクローン化した，（ｐＭＷ１８４は
、６．２ｋｂＥｃｏＲｌイノシトール’７ラグメントを
含むｐＲＫ２９０から、最初にＨｐａｌおよびＢａｌ３
１で消化してＴ ｎ ５配列をを取り出し、次いでＳｐ
ｅｌリンカーを挿入して組み込みカセットのユニークな
クローニング部位を造成することにより、誘導された．
）今やホモロジー領域で隣接されたカセットを含んでい
る上記構成物と、不適合性プラスミド例えばゲンタマイ
シン耐性選択マーカー遺伝子を含むＰＪＢ２５１とを、
Ｒ．メリロティ宿Ｈ冫Ｃ［冫２０１１に導入した．（ｐ
Ｊｌ３２５１はｐ Ｉ） Ｉ１ １（ハーシュ（Ｈｅｒ
ｓｈ）ら．Ｐｌａｓｍｉｄ１２ ： １３９ （１９
８４））から、ＩＩ ｉ ｎ ｄ ＩＩ１部分消化を行
ってスペクチノマイシン遣伝子を削除し、次いでゲンタ
マインン１に関して選択し、そしてスペクチノマイシン
Ｓに関してスクリーニングして誘導された．）受容体菌
株を、スベクチノマイシンおよびトリメトブリム耐性の
両者の発現に関して選沢した．使用した二種のブラスミ
ドは不適合性であるため、これらの遺伝子が同時に発現
されるのは、カセットが染色体中に組み込まれるか、ま
たはベクターが相互にリコンバインされる場合のみであ
る．可能な二つの場合を区別するため、形質転換体をテ
トラサイタリン感受性、即ちｐＲＫ２９０−由来ベクタ
ーの消失および単一炭素源としてのミオ−イノシトール
上での増殖能力の欠損に関してスクリーニングした（こ
れらの欠損はカセットがゲノムに組み込まれたことを示
唆する）．組み込み体のＩ） Ｎ Ａを次に適当な方法
で分析して組み込みが実際に生じたことを確認する。
続いて、受容体宿主をアルファルファに根荒形成させて
ＰＪＢ２５１から回復させ、バクテリアを再度Ｃｎ離し
そしてストレプトマイシン耐性およびゲンタマイシン感
受性のものをスクリニングする．そのような単離株をア
ルファルファで試験して植物のバイオマスを調べる．Ｌ
Ｉ艷止桂Ｗ宵 使用される修飾された窒素固定バクテリアの種は、接種
すべき植物の種類に依存ずる．一般的には、本発明のベ
クターの宿主種としてはその植物種に天然に付随するバ
クテリア種と同じ神を用いるのが好ましい。例えば、豆
科埴物が７ルファルフｙ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａＬ
ｉｖａ）である場合、修飾宿主バクテリアは好ましくは
、Ｒ．メリロティであり、豆科植物が大Ｒ（Ｇｌｙｃｉ
ｎｅ ｍａｘ）である場合、バクテリアは好ましくは
、Ｂ．ジャポニカムであり、豆科植物がいんげんまめ（
Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）である場合
は、ノくクテリアは好ましくはＲ．ファゼオリ（ρｈａ
ｓｅｏｌｉ）であり、そして豆科植物がク「Ｉ−バーで
あるときは、バクテリアは好ましくはＲ．定バクテリア
種ならびに窒素固定遣伝ｒ一が＆ｌｌ換えＤＮＡ技術で
窒素固定遺伝子を挿入された微生物にも適用可能である
。
ＰＪＢ２５１から回復させ、バクテリアを再度Ｃｎ離し
そしてストレプトマイシン耐性およびゲンタマイシン感
受性のものをスクリニングする．そのような単離株をア
ルファルファで試験して植物のバイオマスを調べる．Ｌ
Ｉ艷止桂Ｗ宵 使用される修飾された窒素固定バクテリアの種は、接種
すべき植物の種類に依存ずる．一般的には、本発明のベ
クターの宿主種としてはその植物種に天然に付随するバ
クテリア種と同じ神を用いるのが好ましい。例えば、豆
科埴物が７ルファルフｙ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａＬ
ｉｖａ）である場合、修飾宿主バクテリアは好ましくは
、Ｒ．メリロティであり、豆科植物が大Ｒ（Ｇｌｙｃｉ
ｎｅ ｍａｘ）である場合、バクテリアは好ましくは
、Ｂ．ジャポニカムであり、豆科植物がいんげんまめ（
Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）である場合
は、ノくクテリアは好ましくはＲ．ファゼオリ（ρｈａ
ｓｅｏｌｉ）であり、そして豆科植物がク「Ｉ−バーで
あるときは、バクテリアは好ましくはＲ．定バクテリア
種ならびに窒素固定遣伝ｒ一が＆ｌｌ換えＤＮＡ技術で
窒素固定遺伝子を挿入された微生物にも適用可能である
。
埴−飢会ｑ接−神
植物種子への組喚えリゾビウムの接種は、次の方法で行
うことが出来る（ア・マニュアル・フォア・ザ・スタデ
ィー・オブ・ルート・ノジェール・バクテリア（Ａ
Ｍａｎｕａｌ ｔｏｒ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ
ｏｒ Ｉ冫ｏｏｔ Ｎｏｄｕｌｅ Ｂａｃｔｅｒ
ｉａ）． ビンセント（ＶｉｎｃｅｎＬ）編、＋ ９
７ ０．ブラックウ工ル・サンエンティフィック・パ
ブリシャーズ（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ），オックスフォードおよ
びエジンバラ，１１３−１３１頁の一般的方法を参照）
．なまの種子を１０％次亜塩素酸ナトリウム溶液で２０
分間殺菌し、蒸留水で充分に洗浄する．次に、この種子
を滅菌バーミキュライトを詰めたポットに蒔いて、４日
間暗所に放置して発芽させる．接種物を調製するために
、適当な抗生物質を含むＹＭ＋培地にリゾビウム菌を接
種して３０時間増殖させる．その培養物を遠心分離して
ペレットとし、滅菌蒸留水に再度懸濁させて、最終濃度
を約ＩＸ１０９細胞／一とする．細胞を滅菌鉱物塩溶液
で１２５×に希釈し、４日令の発芽種子に接種するため
に用いる．（各ポットのりゾビウムの最終濃度は、約Ｉ
ＸＩＯ？細胞／一である．）植物に適当に水を与え、週
に一度は鉱物塩溶液を与える．４週間後に植物を収穫す
る． １ゾビウムの−− ・使■ 貼 リゾビウムの培養物の接種物を、豆科穀物の収穫向上の
ために市販用のいくつかの形態にすることができる．一
つの形態においては、培養物を泥炭または粘度に吸着さ
せ、次いで非常に薄いコーティングとして神子に適用す
ることができる．石灰および結合剤と混合すると、これ
を種子の５０％迄の重量で加えることによって、豆科植
物の種子を比較的厚いコーティングで覆うことができる
． 第二の方法では、移植の間に適用するための液状物また
は泥炭の予備吸着物として培養物を用いることができる
．最後に、リゾビウムは植え込み箱の種子溝に直接適用
するために、大粒の泥炭に吸着させることもできる． 製造 リゾビウムの培養物を標準的好気培養で増殖させ、次い
で一般に微粉状態の泥炭または粘度の担体に混合する．
この混合は、細胞懸濁液のの一定量を特に選択した規格
の泥炭または粘度に混入し、一定時間吸着させ、その間
に菌はこの世体上で継続して生育する．細胞数を泥炭上
で適当な貯蔵を行うことにより、約１０倍に増加させる
ことができ、この培養物を使用前に９月まで貯蔵するこ
とが可能である． 寄五， ブラスミドｐＪＢ１ １ １は、アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション，１２３０１パークローンド
ライブ，ロックビル，ＭＤ２ ０ ８ ５ ２，米国に
、１９８４年１１月２ｌ日に寄託された．その寄託は、
ＡＴＣＣ寄託番号３９９３１が与えられた． 他の態様は、特許請求の範囲に記載されている．
うことが出来る（ア・マニュアル・フォア・ザ・スタデ
ィー・オブ・ルート・ノジェール・バクテリア（Ａ
Ｍａｎｕａｌ ｔｏｒ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ
ｏｒ Ｉ冫ｏｏｔ Ｎｏｄｕｌｅ Ｂａｃｔｅｒ
ｉａ）． ビンセント（ＶｉｎｃｅｎＬ）編、＋ ９
７ ０．ブラックウ工ル・サンエンティフィック・パ
ブリシャーズ（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ），オックスフォードおよ
びエジンバラ，１１３−１３１頁の一般的方法を参照）
．なまの種子を１０％次亜塩素酸ナトリウム溶液で２０
分間殺菌し、蒸留水で充分に洗浄する．次に、この種子
を滅菌バーミキュライトを詰めたポットに蒔いて、４日
間暗所に放置して発芽させる．接種物を調製するために
、適当な抗生物質を含むＹＭ＋培地にリゾビウム菌を接
種して３０時間増殖させる．その培養物を遠心分離して
ペレットとし、滅菌蒸留水に再度懸濁させて、最終濃度
を約ＩＸ１０９細胞／一とする．細胞を滅菌鉱物塩溶液
で１２５×に希釈し、４日令の発芽種子に接種するため
に用いる．（各ポットのりゾビウムの最終濃度は、約Ｉ
ＸＩＯ？細胞／一である．）植物に適当に水を与え、週
に一度は鉱物塩溶液を与える．４週間後に植物を収穫す
る． １ゾビウムの−− ・使■ 貼 リゾビウムの培養物の接種物を、豆科穀物の収穫向上の
ために市販用のいくつかの形態にすることができる．一
つの形態においては、培養物を泥炭または粘度に吸着さ
せ、次いで非常に薄いコーティングとして神子に適用す
ることができる．石灰および結合剤と混合すると、これ
を種子の５０％迄の重量で加えることによって、豆科植
物の種子を比較的厚いコーティングで覆うことができる
． 第二の方法では、移植の間に適用するための液状物また
は泥炭の予備吸着物として培養物を用いることができる
．最後に、リゾビウムは植え込み箱の種子溝に直接適用
するために、大粒の泥炭に吸着させることもできる． 製造 リゾビウムの培養物を標準的好気培養で増殖させ、次い
で一般に微粉状態の泥炭または粘度の担体に混合する．
この混合は、細胞懸濁液のの一定量を特に選択した規格
の泥炭または粘度に混入し、一定時間吸着させ、その間
に菌はこの世体上で継続して生育する．細胞数を泥炭上
で適当な貯蔵を行うことにより、約１０倍に増加させる
ことができ、この培養物を使用前に９月まで貯蔵するこ
とが可能である． 寄五， ブラスミドｐＪＢ１ １ １は、アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション，１２３０１パークローンド
ライブ，ロックビル，ＭＤ２ ０ ８ ５ ２，米国に
、１９８４年１１月２ｌ日に寄託された．その寄託は、
ＡＴＣＣ寄託番号３９９３１が与えられた． 他の態様は、特許請求の範囲に記載されている．
第１図はＲ．メリロティのｎｉｒＡ遺伝子を含むベクタ
ーｐＲｍ８３．８Ｈの模式図である，第２図はＲ．ジャ
ポニカムのｎｉｒＡ遺伝子を含むベクターＰ ＲＡＲ
５ ６ ６の模式図である．第３図および第５図はそれ
ぞれ、Ｒ．メリロティのｎｉｆＨプロモーターを含む二
つのベクターＰＭＷ１２２及びｐＪＢ８１の模式図であ
る．第４図はジャポニカムのｎｉｆＤプロモーターを含
むベクターｐＭＷＩｌ３の造成の工程図である． 第６図は、Ｒ．メリロティのｆｉｘＡプロモーターを含
むベクターρＪＢ１２４の造成の工程図である． 第７図（ａ）ないし（ｄ）は、それぞれＫ．ニューモニ
エのｎｉｆＨ，Ｋ．二ｘ−モニエのｎｉｆＥ，Ｋ．ニュ
ーモニエのｎ ｉ ｒ Ｕオ，ｋヒＫ．ニエーモニエの
ｎｉｆＭプロモーターを含むベクターの模式図である． 第８図は、広域宿主範囲ベクターｐＪＢ１５１の造成の
工程図である． 第９図は、第ｌＯ図のベクターの造成に使用したベクタ
ーｐＪＢ１ １０の模式図である．第１０図は、カナマ
イシン耐性遺伝子プロモーターと融合したＲ．メリロテ
ィのｎｉｆＡ遺伝子を含むベクターｐＪＢ１１１の模式
図である．第１１図八は、Ｒ．メリロティのｎｉｆＡ遺
伝Ｙ−の５′末端のヌクレオチド配列であり、第１１図
１３および第１１図Ｃはそれぞれ第１１図Ａの配列の誘
導体の造成に用いたオリゴヌクレオチドの配列図である
， 第１２図は、Ｒ．メリロティのｎｉｆＡ遺伝子に融合し
たＲ．ジャポニカムのｎｉｆＨプロモーターを含むベク
ターｐＭＷｌ４２の模式図である。 第１３図は、Ｒ．メリロティのｎｉｒＡ遺伝子に融合し
たｃａｔプロモーターを含むベクターＰＪ Ｂ ｌ ５
４の造成の工程図である．第１４図は、合成シャイン
ーダルガノ配列に続＜Ｒ．メリロティのロｉｆＡ遺伝子
に融合したＲ．ジャポニカムのｎ ｉ ｒ Ｈプロモー
ターを含むベクターｐＭＷ１４Ｂの模式図である． 第１５図は、合成シャイン−ダルガノ配列に続き、そし
てｃａｔプロモーターに融合したＲ．メリロティのｎｉ
ｆＡ遺伝子を含むベクターｐｊｂ１９１の模式図である
． 第１６図は、挿入ベクターの模式図である．第１７図は
、Ｒ．メリロティのｎ ｉ ｒ Ｈリーダー配列の大部
分を含む合成リンカーのヌクレオチド配列図である． 第１８図は、ベクターＰＩ（，−２０８およびその誘導
体の模式図である． 第１９図は、ｎｉｆＤプロモーターとｎｉｒＡ遺伝子に
融合したｎｉｆＨ合成リーダー配列とを含むｐＭＷ１’
５３の造成の工程図である．・） 代理人 弁理士 湯浅 恭三４１（外４名）図面
の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ．１ ＦＩＧ，２ ＦＩＧ．３ ＦＩＧ，６ ＦＩＧ．９ ＦＩＧ．ＩＯ １１ｇｌ／ｋｍ 一一−１．１１ Ｘｂ ２．０３ら一ＦＩ
Ｇ．Ｉ２ く ■ Ｑ ＥｃｏＲ Ｉ Ｂｇｌ ＸＸ １１ｇｌ ＸＸ １・８か一一−→セー２．０３ Ｋｂ→ＦＩＧ １４ オΦＮＫ７Ｆ プロ迅一クー 』１人与触合４本ｔｌ１よ尺マー力ヘ゛
７ク− ホモ口５゛一４｛１＜ フ０ロモーク−Ｎ邑１云与Ｉ瓢１合鳴本ｙｔＸフ 刀一 ＦＩＧ．＋６ 日Ｇ．１５ ＠ｉ Ｓ．Ｄ ＦＩＧ．１８
ーｐＲｍ８３．８Ｈの模式図である，第２図はＲ．ジャ
ポニカムのｎｉｒＡ遺伝子を含むベクターＰ ＲＡＲ
５ ６ ６の模式図である．第３図および第５図はそれ
ぞれ、Ｒ．メリロティのｎｉｆＨプロモーターを含む二
つのベクターＰＭＷ１２２及びｐＪＢ８１の模式図であ
る．第４図はジャポニカムのｎｉｆＤプロモーターを含
むベクターｐＭＷＩｌ３の造成の工程図である． 第６図は、Ｒ．メリロティのｆｉｘＡプロモーターを含
むベクターρＪＢ１２４の造成の工程図である． 第７図（ａ）ないし（ｄ）は、それぞれＫ．ニューモニ
エのｎｉｆＨ，Ｋ．二ｘ−モニエのｎｉｆＥ，Ｋ．ニュ
ーモニエのｎ ｉ ｒ Ｕオ，ｋヒＫ．ニエーモニエの
ｎｉｆＭプロモーターを含むベクターの模式図である． 第８図は、広域宿主範囲ベクターｐＪＢ１５１の造成の
工程図である． 第９図は、第ｌＯ図のベクターの造成に使用したベクタ
ーｐＪＢ１ １０の模式図である．第１０図は、カナマ
イシン耐性遺伝子プロモーターと融合したＲ．メリロテ
ィのｎｉｆＡ遺伝子を含むベクターｐＪＢ１１１の模式
図である．第１１図八は、Ｒ．メリロティのｎｉｆＡ遺
伝Ｙ−の５′末端のヌクレオチド配列であり、第１１図
１３および第１１図Ｃはそれぞれ第１１図Ａの配列の誘
導体の造成に用いたオリゴヌクレオチドの配列図である
， 第１２図は、Ｒ．メリロティのｎｉｆＡ遺伝子に融合し
たＲ．ジャポニカムのｎｉｆＨプロモーターを含むベク
ターｐＭＷｌ４２の模式図である。 第１３図は、Ｒ．メリロティのｎｉｒＡ遺伝子に融合し
たｃａｔプロモーターを含むベクターＰＪ Ｂ ｌ ５
４の造成の工程図である．第１４図は、合成シャイン
ーダルガノ配列に続＜Ｒ．メリロティのロｉｆＡ遺伝子
に融合したＲ．ジャポニカムのｎ ｉ ｒ Ｈプロモー
ターを含むベクターｐＭＷ１４Ｂの模式図である． 第１５図は、合成シャイン−ダルガノ配列に続き、そし
てｃａｔプロモーターに融合したＲ．メリロティのｎｉ
ｆＡ遺伝子を含むベクターｐｊｂ１９１の模式図である
． 第１６図は、挿入ベクターの模式図である．第１７図は
、Ｒ．メリロティのｎ ｉ ｒ Ｈリーダー配列の大部
分を含む合成リンカーのヌクレオチド配列図である． 第１８図は、ベクターＰＩ（，−２０８およびその誘導
体の模式図である． 第１９図は、ｎｉｆＤプロモーターとｎｉｒＡ遺伝子に
融合したｎｉｆＨ合成リーダー配列とを含むｐＭＷ１’
５３の造成の工程図である．・） 代理人 弁理士 湯浅 恭三４１（外４名）図面
の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ．１ ＦＩＧ，２ ＦＩＧ．３ ＦＩＧ，６ ＦＩＧ．９ ＦＩＧ．ＩＯ １１ｇｌ／ｋｍ 一一−１．１１ Ｘｂ ２．０３ら一ＦＩ
Ｇ．Ｉ２ く ■ Ｑ ＥｃｏＲ Ｉ Ｂｇｌ ＸＸ １１ｇｌ ＸＸ １・８か一一−→セー２．０３ Ｋｂ→ＦＩＧ １４ オΦＮＫ７Ｆ プロ迅一クー 』１人与触合４本ｔｌ１よ尺マー力ヘ゛
７ク− ホモ口５゛一４｛１＜ フ０ロモーク−Ｎ邑１云与Ｉ瓢１合鳴本ｙｔＸフ 刀一 ＦＩＧ．＋６ 日Ｇ．１５ ＠ｉ Ｓ．Ｄ ＦＩＧ．１８
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、空中窒素をアンモニアに変換する能力を増加する能
力を有する蛋白質をコードする遺伝子を有するベクター
で形質転換された、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）
またはブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉ
ｕｍ）属の微生物。 ２、Ｒ．メリロティ（ｍｅｌｉｌｏｔｉ）種である、請
求項１記載の微生物。 ３、Ｂ．ジャポニカム（ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）種である
、請求項１記載の微生物。 ４、宿主微生物中で空中窒素のアンモニアへの変換を引
き起こす能力を有する一種もしくはそれ以上の蛋白質を
コードするＤＮＡを有し、宿主微生物を形質転換するた
めのベクターであって、該微生物による空中窒素変換能
力を増加させることができ、且つ該ＤＮＡの転写を活性
化できる活性化蛋白質をコードする遺伝子をも含む、上
記ベクター。 ５、活性化蛋白質−コード遺伝子が活性化可能プロモー
ター配列の支配下に存在する、請求項４記載のベクター
。 ６、活性化可能プロモーター配列が、微生物中で空中窒
素のアンモニアへの変換を引き起こす能力を有する一種
もしくはそれ以上の蛋白質をコードする該微生物ＤＮＡ
のプロモーター配列と実質的に同一である、請求項５記
載のベクター。 ７、活性化蛋白質をコードする遺伝子が、遺伝子自体も
しくはそのフラグメントが生物学的に活性なポリペプチ
ドをコードする、￥ｎｉｆ￥Ａ遺伝子もしくはそのフラ
グメントである、請求項４記載のベクター。 ８、プロモーター配列がＫ．ニューモニエ（ｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅ）からの￥ｎｉｆ￥Ｈプロモーター、Ｒ．メ
リロティ（ｍｅｌｉｌｏｔｉ）からの￥ｎｉｆ￥Ｈプロ
モーター、Ｂ．ジャポニカム（ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）か
らの￥ｎｉｆ￥Ｈプロモーター、Ｂ．ジャポニカム（ｊ
ａｐｏｎｉｃｕｍ）からの￥ｎｉｆ￥Ｄプロモーター、
Ｒ．メリロティ（ｍｅｌｉｌｏｔｉ）からの￥ｆｉｘ￥
Ａプロモーター、またはＫ．ニューモニエ（ｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅ）からの￥ｎｉｒ￥Ｅ、￥ｎｉｆ￥Ｌ、￥ｎ
ｉｆ￥Ｍもしくは￥ｎｉｆ￥Ｕプロモーターの一つと実
質的に同一である、請求項５記載のベクター。 ９、ベクターが該遺伝子を微生物のゲノムへ挿入する能
力を有する、請求項４ないし８のいずれか１項に記載の
ベクター。 １０、ベクターが該ゲノムのＤＮＡとホモロガスなＤＮ
Ａを含む、請求項９記載のベクター。 １１、請求項４ないし８のいずれか１項記載のベクター
で形質転換された微生物。 １２、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属に属する請
求項１１記載の微生物。 １３、Ｒ．メリロティ（ｍｅｌｉｌｏｔｉ）種に属する
、請求項１２記載の微生物。 １４、Ｂ．ジャポニカム（ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）種に属
する、請求項１１記載の微生物。 １５、宿主微生物中で空中窒素のアンモニアへの変換を
引き起こす能力を有する一種もしくはそれ以上の蛋白質
をコードするＤＮＡを有し、 該遺伝子が該ＤＮＡの転写を活性化する能力のある活性
化蛋白質をコードし、 該活性化蛋白質−コード遺伝子が構成的プロモーター配
列の支配下に存在する、請求項１記載の微生物。 １６、該構成的プロモーターが、通常該バクテリアの抗
生物質クロラムフェニコールに対する耐性を付与する蛋
白質をコードする遺伝子の転写を支配するバクテリアの
プロモーターである、請求項１５記載の微生物。 １７、微生物による空中窒素変換を引き起こす能力のあ
る一種もしくはそれ以上の蛋白質をコードする該微生物
ＤＮＡの転写を活性化する能力のある活性化蛋白質の細
胞内レベルを増加させることよりなる、リゾビウム（Ｒ
ｈｉｚｏｂｉｕｍ）またはブラディリゾビウム（Ｂｒａ
ｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属の微生物内で、空中窒素を
アンモニアに変換する速度を増加する方法。 １８、微生物がＲ．メリロティ（ｍｅｌｉｌｏｔｉ）種
に属する、請求項１７記載の方法。 １９、微生物がＢ．ジャポニカム（ｊａｐｏｎｉｃｕｍ
）種に属する、請求項１７記載の方法。 ２０、活性化蛋白質の細胞内レベルの増加を、該活性化
蛋白質をコードする遺伝子を有するベクターで該微生物
を形質転換することにより行う、請求項１７記載の方法
。 ２１、該転写活性化蛋白質の遺伝子が、リゾビウム（Ｒ
ｈｉｚｏｂｉｕｍ）またはブラディリゾビウム（Ｂｒａ
ｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属の微生物の￥ｎｉｆ￥Ａ遺
伝子に実質的に等しい、請求項２０記載の方法。 ２２、植物に請求項１記載の微生物を接種することより
なる、植物の収穫量の向上方法。 ２３、植物が豆科に属する、請求項２２記載の方法。 ２４、豆科植物がアルファルファまたは大豆である、請
求項２３記載の方法。 ２５、請求項１、２、３、１１または１５いずれか１項
記載の微生物を含む根瘤を持つ植物。 ２６、共生生活に影響を及ぼさない蛋白質をコードもし
くは制御するＲ．メリロティ（ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のＤ
ＮＡとホモロガスなＤＮＡによって隣接された、異種Ｄ
ＮＡ配列挿入部位を含むベクターであって、該部位への
異種ＤＮＡの挿入が、自然の生育条件下でＲ．メリロテ
ィ（ｍｅｌｉｌｏｔｉ）に致命的でない、上記ベクター
。 ２７、挿入部位に挿入された異種ＤＮＡをさらに有する
、請求項２６記載のベクター。 ２８、該Ｒ．メリロティ（ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のＤＮＡ
がポリオールの代謝経路に含まれる酵素をコードもしく
は制御し、またはポリオールの輸送に影響する蛋白質を
コードもしくは制御し、該酵素もしくは蛋白質は、アラ
ビトール、ソルビトール、マニトール、リビトール、キ
シリトール、デュルシトール（ｄｕｌｃｉｔｏｌ）、ま
たはイノシトールからなる群から選ばれるポリオール代
謝物の代謝もしくは輸送に関与する、請求項２６記載の
ベクター。 ２９、Ｒ．メリロティ（ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のＤＮＡが
、イノシトールデヒドロゲナーゼをコードもしくは制御
する、請求項２８記載のベクター。 ３０、染色体が共生生活に影響しない蛋白質をコードす
るＤＮＡ配列を含み、且つ該染色体に異種遺伝子が挿入
されており、該挿入はＲ．メリロティ（ｍｅｌｉｌｏｔ
ｉ）細胞の自然の生育条件下で該細胞に致命的でない、
Ｒ．メリロティ（ｍｅｌｉｌｏｔｉ）の細胞。 ３１、挿入が該細胞の宿主豆科植物の根瘤形成または空
中窒素固定の能力に影響しない、請求項３０記載の細胞
。 ３２、ＤＮＡ配列が、ポリオールの代謝経路に含まれる
酵素をコードもしくは制御し、またはポリオールの輸送
に影響する蛋白質をコードもしくは制御し、該酵素もし
くは蛋白質は、アラビトール、ソルビトール、マニトー
ル、リビトール、キシリトール、デュルシトール（ｄｕ
ｌｃｉｔｏｌ）、またはイノシトールからなる群から選
ばれるポリオール代謝物の代謝もしくは輸送に関与する
、請求項３０記載の細胞。 ３３、ＤＮＡ配列がイノシトールデヒドロゲナーゼをコ
ードもしくは制御する、請求項３２記載の細胞。 ３４、ａ）Ｒ．メリロティ（ｍｅｌｉｌｏｔｉ）に由来
し、共生生活に影響しない蛋白質をコードするＤＮＡ配
列を含むＤＮＡフラグメントであって、異種ＤＮＡの挿
入が自然の生育条件下でＲ．メリロティ（ｍｅｌｉｌｏ
ｔｉ）細胞に致命的ではない、上記フラグメントを単離
し、 ｂ）該単離ＤＮＡフラグメントに所望遺伝子を挿入して
、該所望遺伝子が該単離ＤＮＡフラグメントを中断しお
よび該フラグメントに隣接されてなるクローン化ＤＮＡ
配列を得、 ｃ）該クローン化ＤＮＡ配列をリゾビウムの宿主細胞中
に形質転換して、該クローン化ＤＮＡ配列が、該フラグ
メントの隣接部と該宿主リゾビウム細胞のゲノムとの間
における相同組換え（ホモロガスリコンビネーション）
によって、該リゾビウムのゲノム中に安定に組み込まれ
た形質転換細胞を得る、 ことよりなる所望遺伝子をリゾビウム細胞のゲノム中に
安定に組み込む方法。 ３５、単離ＤＮＡ配列がポリオールの代謝経路に含まれ
る酵素をコードもしくは制御し、またはポリオールの輸
送に影響する蛋白質をコードもしくは制御し、該酵素も
しくは蛋白質は、アラビトール、ソルビトール、マニト
ール、リビトール、キシリトール、デュルシトール（ｄ
ｕｌｃｉｔｏｌ）、またはイノシトールからなる群から
選ばれるポリオール代謝物の代謝もしくは輸送に関与す
る、請求項３４記載の方法。 ３６、ＤＮＡフラグメントが該酵素をコードする、請求
項３５記載の方法。 ３７、ＤＮＡフラグメントが該酵素を制御する、請求項
３５記載の方法。 ３８、ＤＮＡフラグメントがイノシトールデヒドロゲナ
ーゼをコードもしくは制御する、請求項３５記載の方法
。
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