CN1039133C - 腈水解酶的制法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供特异性地针对溴苯腈中腈基起水解作用的腈水解酶酸、编码该酶的核苷酸顺序以及表达外源基因腈水解酶的转化细胞。该转化细胞能表达腈水解酶，对环境起解毒作用，并保护对溴苯腈敏感的细胞免受细胞毒作用的影响。特别是使植物改良为对溴苯腈具有抗性。
大肠杆菌菌株MM294(pBrx5)于1986年1月22日保藏于美国典型培养物保藏中心(A.T.C.C)，并获得登记号53435。

Description

腈水解酶的制法
本申请为1986年1月8日提出的编号为817,226申请的部分续展申请，817,226号申请揭示的内容在此合并作为参考。
对微生物及较高等生物体细胞提供新的遗传特性的可能性，为能获得新的遗传特性开辟了一条广阔的途径。涉及到的一个方面是许多制剂因其细胞毒作用而被采用，例如，农业上所用的许多化合物能直接杀灭害虫、去除杂草等。在很多情况下，这些化合物具有较长的土壤滞留时间或者持久地残留。
在许多情况下，人们希望将那些欲杀死的物种与欲保留的物种区分开来。例如，人们常常想要有选择地去除杂草而同时又对农作物产生最小的有害影响。在大多数情况下，许多广谱除草剂都对农作物产生相当大的有害影响，因而这些除草剂基本上限于农作物长出前使用或者农作物长出后谨慎地使用。
因而要是能够对活细胞加以改良使之产生对细胞毒制剂的抗性就具有很大的意义。
美国专利4,535,060号描述了一种用细菌的aroA基因将草甘磷(glyphosate)抗性赋于对草甘磷易感细胞。Hsu和Camper在Can.J.Microbiol.(1976)第22卷537-543页上描述了从富含土壤的培养物中分离到碘苯腈(ioxynil)降解物。Hsu和Clemson在Dissert.Abstr.Intrn.B36(1976)第8，3708号上描述了对3，5-二卤-4-羟苄腈一类除草剂的微生物降解作用。Ingram和Pullin在Pestic Sci.(1974)第5卷287-291页上描述了溴苯腈(bromoxynil)在三种土壤类型中的持久性。Smith在Abstrp.Meeting Weed Soc.Am.(1971)的第16-17页上描述了溴苯腈在勒吉那(Regina)重粘土中的降解作用。Smith和Fletcher在Hort.Res.(1964)第4卷60-62页上对3，5-二卤-4-羟苄腈和土壤微生物进行了报道。
本发明提供腈水解酶、编码腈水解酶的核酸顺序、含有编码腈水解酶基因的构建物(该构建物在调控基因的转录和转译调控下表达腈水解酶，腈水解酶基因对宿主而言是外源的，并且宿主能识别调控基因)、含有这类构建物的宿主细胞以及含有这类构建物的有机体、有机体部分或产物。已经发现溴苯腈和/或碘苯腈特异的腈水解酶可用于对含有溴苯腈及有关的除草剂的地方进行解毒，同时可保护宿主细胞免受这些除草剂的细胞毒作用。这些构建物被发现可用于区分那些含有构建物本身的宿主细胞与缺乏这种构建物的宿主细胞。
根据本发明，可以提供与卤代羟苄腈特别是与3，5-二溴-或3，5-二碘-4-羟苄腈水解有关的新的DNA顺序、构建物、转化了的细胞、植物以及肽。本发明涉及到一种酶的产生，这种酶能水解腈以致于会去除具有杀草活性的腈的毒力，并对除草剂敏感的细胞或宿主提供保护或者对被该除草剂污染的环境进行解毒。
这一感兴趣的结构基因可从单细胞微生物尤其是从细菌中获得，而这种细菌能够利用苄腈作为氮源且通常是以苄腈作为唯一氮源。关于苄腈或腈水解酶，意思是指苄腈是一种卤代对羟苄腈特别是指3，5-二碘-或3，5-二溴-4-羟苄腈；腈水解酶是一种能将卤代苄腈作为氮源特别是作为其唯一氮源的水解酶。
这种酶能通过不同的途径获得。可以方便地从细菌中获得，这些细菌天然地生活在含有溴苯腈或碘苯腈的环境中。特别感兴趣的是肠细菌，更确切地讲是克雷白氏杆菌属(klebsiella)种。可以采用的有肺炎杆菌(klebsiella pneumoniae)，特别是变异体臭鼻杆菌(kleb-siella ozaenae)。不要从土壤中分离出细菌，而让这些细菌在土壤或在其它的苄腈浓度越来越高的培养基中生长，同时减少可供选择的其它氮源量直至获得以苄腈作为唯一氮源而生存的细菌为止。
不管含有腈水解酶的细菌来源如何，必须进行筛选以确保腈水解酶对苄腈的解毒效力。此外，这种腈水解酶应对苄腈具有特异性，而对缺少卤素、具有其它取代基的其它类似物不具有特异性。因此，本发明的腈水解酶如定义的那样对苄腈具有特异性，对于类似物相对地没有活性或者活性非常低。在可比较的浓度下，与作为氮源的苄腈比较，正常氮源如氨存在时，理想的细菌增殖率没有显著减少，就是减少程度不大于约10％，这一结果对于非特异性的苄腈是得不到的。
一旦鉴定了一种或多种宿主品系，便可用一些技术来鉴定编码腈水解酶的顺序。该基因可能存在于染色体或者质粒上。用限制性内切酶将基因组酶切成许多片段，合适的大小从5Kb至50kb范围。这些片段可以被克隆至常用细菌(例如大肠杆菌)中的合适载体上。对产生的转化子进行筛选以选择腈水解酶活性，这一宿主有机体本身对腈水解酶而言是阴性的。一旦一种或多种克隆被确认具有腈水解酶活性，那么含有所需的DNA片段、质粒或者病毒的染色体外因子可以通过常规的技术进行分离，这些技术如宿主溶胞、DNA沉淀以及将载体DNA或质粒或病毒DNA从染色体DNA中分开。然后，染色体外因子可以用限制性核酸内切酶来酶切，用各种分离及鉴定不同大小片段的技术例如电泳、密度梯度离心法等分离所需要的片段。
根据片段的大小，通常还需进一步的处理以使片段减小到使其更接近于基因及基因侧翼调节区的大小。目前已有多种技术用于处理编码酶的顺序及其侧翼调节顺序的片段。可以采用在不同的反应混和物中用不同的限制性酶进行部分酶切，然后，对这些片段进行克隆以确定哪些片段仍然保留了表达腈水解酶的能力。
另外，可以分离出该酶并进行部分测序。根据氨基酸的顺序，制备出用于鉴定具有该基因的片段的探针。通过将这种方法与限制性酶切割相结合，能够对片段进行克隆并筛选所需要的基因。此外，也可以用核酸外切酶例如Bal31将片段一端或者两端的核苷酸切除以进一步减少多余的核苷酸数目。
另一方面，基因克隆到一个合适的宿主中后，通过用探针筛选及通过在合适的体内或体外转译系统，如非洲爪蟾(属)卵母细胞(Xenopus oocytes)或网织红细胞裂解物(reticulolysate)之类的转译系统中进行鉴定而分离到信使DNA。利用包括逆转录酶及用DNA聚合酶形成互补链的常规技术，从分离了的信使RNA中制备cDNA。此时，所得到的结构基因缺少与转录相关的调节区域。
包含这种表达腈水解酶结构基因的DNA顺序可以连接多种其它DNA顺序以导入合适的宿主细胞中。互伴顺序(companion se-quence)将取决于宿主的性质、该DNA顺序导入宿主的方式、以及附加体(episomal)是处于独立状态还是处于所期望的整合状态。
对于原核生物宿主而言，存在着许多种载体，它们可用于通过转化作用、接合作用、转导作用或转染作用而将DNA顺序导入原核生物宿主中。有许多种质粒如：pBR332、pACYC184、pMB9、pRK290等及柯斯质粒(cosmid)如pVK100或者病毒如P22等。
对于真核生物宿主而言，有很多的技术可用于将DNA导入宿主，如用Ca++沉淀DNA的转化，包括转化一个非复制DNA顺序或一个质粒或一条小染色体；用一个土壤杆菌(属)(Agrobacterium)中带顺序的转移DNA(T-DNA)进行转化；利用微量吸管进行显微注射或用电空孔术。在该DNA结构中是否存在一个有效的复制系统，决定了DNA是象一个附加体因子一样而复制还是被整合到宿主的基因组中，以及决定结构基因在宿主中的表达。可以采用的附加体因子如肿瘤诱导质粒：例如Ti或Ri或其片段；或者病毒：花椰菜花叶病毒(CaMV)、烟草花叶病毒(TMV)或其片段，这些附加体因子对宿主是非致死的，并且以某种方式使结构基因存在于这类附加体因子中，使该结构基因可以表达。特别有意义的是这些片段具有复制功能而缺少其它功能如肿瘤形成及致病力等。
从腈水解酶来源处获得的一些片段可以采用一个合适的克隆载体而进行克隆。克隆能在一个合适的单细胞微生物例如大肠杆菌之类的细菌中进行。理想的是采用一种柯斯质粒，其部分或完全消化可提供具有所需要大小的片段。例如：柯斯粒pVK100用一种合适的限制酶进行部分消化，与通过部分或完全消化的质粒或染色体或其片段而获得的片段相连接。必须确保仅使所需要大小的片段被包装并转导入宿主有机体内。
针对抗苄腈抗性选择宿主有机体。对受体菌株可以进行改良以提供合适的遗传特性，这种遗传特性允许对转导子进行选择。在微生物中，转导子可以在有移动质粒时与其它的微生物接合。多种技术可用于进一步减少含腈水解酶结构基因片段的大小。例如：分离出柯斯质粒载体并用多种限制性核酸内切酶如EcoRI、Bgl II和SmaI等进行酶切，然后将得到的片段在合适的载体上克隆，可方便地利用先前使用过的柯斯质粒载体。许多克隆载体如pACYC177及pACYC184比较小，可用于代替柯斯质粒载体。因而，理想的小于5kb、通常小于4kb，最理想的小于2kb左右的片段可以进行克隆并提供对苄腈的抗性。
最理想的片段约1kb左右，一般小于5kb左右，较好的约小于4kb，特别是至少约1047bp，尤其以含有侧翼区的至少1100bp左右，最好小于约1.5kb的片段为佳。
比较感兴趣的是从臭鼻杆菌(klebsiella ozaenae)中得到的BglII-SmaI片段，更感兴趣的是大约1210bp的PstI-HincII片段。
腈水解酶可以在原核生物或真核生物包括细菌、酵母、丝状真菌或植物细胞等中表达。酶是根据已知的方式破细胞进行分离的。可用的方法包括色谱法、电泳、亲合色谱法及类似的方法。溴苯腈可以方便地通过合适的功能团例如羧基结合到非溶性的支持物上，用于作为腈水解酶分离的填充物。
在如Harper在Biochem.J.(1977)第167卷685～692页上所描述的条件下，腈水解酶的比活性至少为大约0.1微摩尔氨/分/毫克蛋白质，一般大约为0.5微摩尔氨/分/毫克蛋白质或者更高一些。
提纯了的酶可应用于许多方面。它可以直接用于测定溴苯腈、碘苯腈或其它相关的苄腈。该酶还可以通过与感兴趣的分析物如半抗原、抗原或抗体相结合而作为一种标记，用于诊断测定。这些诊断测定在美国专利第3,654,090、3,817,837及3,850,752号中有描述，这些专利极为详尽地描述了结合的方法和分析物浓度的确定。这些专利所揭示的适当部分在此合并作为参考。
编码腈水解酶的DNA顺序可应用于多种方面，它可以用作分离野生型或者变异型腈水解酶的探针。另外，该DNA顺序可以通过将其重组入宿主而进行整合，以向宿主提供对苄腈的抗性。
对植物细胞来说，作为结构部分的结构基因可以通过微量吸管注射导入植物细胞并通过重组进入宿主基因组而得到整合。此外，结构基因可用电穿孔术引入植物宿主中。来自结构基因获得处的调控信号不为植物所识别，需要引入合适的调控信号用于表达。采用病毒或者质粒如肿瘤诱导质粒，并对其作基因图分析，在启动子下游选择一个限制性位点并将结构基因插入，其离启动子有一合适的距离。在DNA顺序上无合适的限制性位点时，可以采用核酸外切酶如Bal31进行多次的消化，并插入一个人工合成的限制性核酸内切酶位点(接头)。特别有趣的是，使用肿瘤诱导质粒如Ti或Ri，可将腈水解酶基因整合进入植物细胞的染色体上。对于Ti质粒及Ri质粒使用的描述，可参见PCT公告第WO84/02913、02919、02920和EPO申请第0116718号及Matzke和Chilton所著的《J.Mol App.Genetics》(1981)第1卷39～49页。
通过采用转移DNA(T-DNA)右边缘或两侧边缘顺序，使两个边缘顺序位于包含腈水解酶结构基困的表达盒(expressioncassette)的两侧，针对起始和终止的转录和转译调控信号在腈水解酶结构基因的前面，能被植物宿主识别。表达盒可以整合进入植物基因组，使其在植物分化的各个不同阶段，能在植物细胞中表达。
可以制备各种构建物以供在植物细胞中表达。这些构建物提供一种在植物中具有功能的表达盒，能在植物宿主中表达腈水解酶。
为了提供转录，可以采用多种转录起始区(启动子区)，它们或是构建的或是诱导的。
转录起始区连接到编码腈水解酶的结构基因上以供位于起始密码子上游的转录起始，一般在含起始密码子的200个碱基中，不转录的5′端区缺乏ATG。
结构基因的3′末端有一个或多个终止密码子，将这些终止密码子与在植物宿主中具有功能的转录终止区相连，该终止区和起始区一样是与相同的或不同的结构基因相关联。
表达盒的特征为：在转录顺序方向上是起始区、在起始区转录控制下的结构基因和使转录终止并对信使RNA进行合适加工的终止区。作为转录及转译调节区，可采用冠瘿碱启动子和终止区，其允许腈水解酶基因组成型地表达(Constitutive expression)。也可使用其它的启动子和/或终止子，特别是能在植物宿主中提供诱导表达或调节表达的启动子。来自于Ti-质粒的启动子区包括启动子如章鱼碱合成酶启动子、胭脂碱合成酶启动子、冰草氨酸合成酶启动子及manopine合成酶启动子等。其它的启动子包括病毒启动子如花椰菜花叶病毒(CaMV)第四区启动子或者全长(35S)启动子，这些启动子与编码产生小亚单位的1，5-二磷酸核酮糖羧酸盐基因、编码储存蛋白的云扁豆蛋白基因和编码形成纤维素的β-Conglycinin基因等相关联。
各种顺序可以用常规的方法连接在一起。启动子区可以通过对结构基因的5′端区进行限制性作图和测序分析而选择和分离。同样，位于结构基因3′端区的终止区也可以进行分离。这些顺序取向正确地被克隆和被连接以使腈水解酶基因能在植物宿主中组成型地表达。
通过导入表达腈水解酶的功能基因而对农作物细胞进行改良后，人们可用足够浓度的溴苯腈和碘苯腈或类似除草剂彻底地除去杂草，同时对农作物不产生影响。采用这种方法，可以取得巨大的经济效益，因为肥料和水份可以有效被利用，并可以避免由于杂草存在引起的不利作用。
表达腈水解酶的表达盒可以导入许多种植物。单子叶植物和双子叶植物包括玉米、小麦、大豆、烟草、棉花、西红柿、土豆、蔓菁(属)(Brassica)、水稻、花生、矮牵牛、向日葵、甜菜和turfgrass等。这种基因可以存在于细胞或者植物的某部份，包括愈伤组织、组织、根、块茎、繁殖体、胚、种子、叶、苗及花粉等。
获得了对苄腈抗性的植物后，可使用多种配方的除草剂以保护农作物免受杂草的危害，由此促进农作物生长和减少对营养的竞争。例如，溴苯腈可以单独地或者与其它产品一起，对与安全型的农作物例如向日葵、大豆、棉花或者玉米等一起生长的杂草出现后进行防治。
通常施用于田野的杀虫剂配方含量大约为0.1-4磅溴苯腈/英亩，更理想的含量为0.2-2磅溴苯腈/英亩。其它的杂草剂含量大约为0.1-4磅活性成分/英亩。配方中包括其它的添加剂例如去垢剂、佐剂、扩散剂、粘着剂和稳定剂等。如本领域所知的那样，配方既可以是湿的也可以是干的，包括分散的粉末、乳化的浓缩物和液体浓缩物。
除草剂溶液可以按照常规的方法施用，例如通过喷雾、灌溉或撒粉等。
以下实施例只提供作说明用而非用于限制。
                实施例
限制性酶和用于连接的T3连接酶的使用根据制造商推荐的方法进行。
根据纽约冷泉港(Cold Spring Harbor)实验室Maniatis等人编著的《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(1982)所介绍的标准方法进行克隆和分子水平分析。克隆分析按照Ish-Horowitz等人在《Nucl.Acids Res.》(1981)第9卷2989～2998页上所述的方法进行。
大肠杆菌菌株MM294被用于所有的克隆实验(Hanahan，Mol.Bilo.)(1993)第166卷577～80页)。
抗生素的工作浓度：Cm(氯霉素)25μg/ml；Tc(四环素)10μg/ml；Ap(氨苄青霉素)300μg/ml。
质粒DNA转化大肠杆菌根据Mandel和Higa在《J.Mol.Bi-ol.》(1970)第53卷159～162页上所介绍的方法进行。
对从含有溴苯腈的土壤样品中获得的多种细菌分离物进行分离和筛选，有一种微生物被确定是肺炎杆菌(Klebsiella Pneumoniae)的臭鼻杆菌(Ozaenae)亚种。针对来自上述有机体的溴苯腈特异的腈水解酶进行部分纯化和表征鉴定体，证实是一种活性酶，其表观分子量为34千道尔顿。
经过在固体L琼脂上对臭鼻杆菌(K.Ozaenae)重复传代接种获得一种变异体，当这种变异体在每升含KH2PO4(1.5g)、K2HPO4(3.5g)、MgSO4·7H2O(0.1g)、酵母抽提物(50mg)、0.1％的柠檬酸盐、甘油和琥珀酸盐以及微量元素的确定成份液体培养基上生长时，它们不再能利用溴苯腈作为唯一氮源。此确定成份液体培养基参见Barmett及Ingraham，《J.Appl.Bacteriol.》(1975)第18卷131～143页。该培养基以后将被称为YETE多碳培养基，YETE多碳培养基包含0.05％的溴苯腈。尽管该种有机体不能利用溴苯腈作为唯一氮源，但在含有0.05％溴苯腈L培养基中可以生长至最大密度。将臭鼻杆菌(K.Ozaenae)变异体菌落挑选出并在10ml L培养基中生长。三个独立的臭鼻杆菌(K.Ozaenae)菌落从含有苄腈的一个LB平板上挑选出并在相同条件下生长。这四个相同菌落同时在补充有0.05％溴苯腈的10ml L培养基中生长。在30℃下培养物生长至最大密度，从每一培养物中微量制备(mini-prep)质粒DNA，未经消化的质粒DNA在0.5％琼脂糖凝胶中电泳，电泳后以溴乙锭染色显示出质粒带。质粒微量制备法参见Ish-Horowitz等，《Nucl.Acids Res》(1981)第9卷2989页。
臭鼻杆菌(K.Ozaenae)变异体在有溴苯腈存在或不存在下生长时显示单一的质粒类型(68Kb大小)。三个臭鼻杆菌(K.Ozaenae)菌落在有0.05％溴苯腈存在下生长时显示一种较大的质粒类型(90Kb)。在没有溴苯腈存在时，三个臭鼻杆菌(K.Oza-enae)菌落中的二个有两种质粒形式存在。这数据表明，当溴苯腈选择解除时，大的质粒转化为小的质粒形式，伴随着丢失大约22Kb质粒DNA。四个菌落都生长在200ml含0.05％溴苯腈的L培养基中。细胞用French破碎器打碎，高速离心后获得的上清液经针对含有0.05M KPO4pH7.5和2.5mM二硫苏糖醇(DTT)的缓冲液进行透析后，对每个粗制抽提物进行溴苯腈特异的腈水解酶活性测定。从一个臭鼻杆菌(K.Ozaenae)变异体制备的粗制抽提物不含有可检测的腈水解酶活性，而其它臭鼻杆菌(K.Ozaenae)粗制抽提物显示的腈水解酶比活性分别为0.124、0.105和0.143μmol NH3/min/蛋白质。在30℃以下，细胞(200m1)在含有0.1％葡萄糖和0.04％溴苯腈的Mg培养基(Miller(1972)著《分子遗传学实验》(Cold Sping Har-bor实验室)上生长至对数期。粗制抽提物通过破碎细胞、超速离心和对含有0.05M KPO4(PH7.5)及2.5mM DTT缓冲液的上清液进行透析而制成。在所有的测定中，底物浓度均为3mM溴苯腈。按照Harper在Biochem.J.(1977)第167卷685～692页上描述的方法对NH3的释放进行监测。臭鼻杆菌(K.Ozaenae)变异体在含有溴苯腈的L培养基中生长的能力可能引起使该有机体对溴苯腈产生获得性的不渗透性。因而，该有机体不能在将溴苯腈作为唯一氮源的确定成份培养基中生长。
概括地说，臭鼻杆菌(K.Ozaenae)腈水解酶经显示是由质粒编码的。编码酶的基因好象存在于一个22Kb质粒DNA片段上。此片段在没有溴苯腈选择的情况下从臭鼻杆菌(K.Ozaenae)质粒中自发丢落。臭鼻杆菌(K.Ozaenae)溴苯腈特异的腈水解酶在大肠杆菌中的表达：
在0.05％溴苯腈选择下生长的臭鼻杆菌(K.Ozaenae)质粒DNA被制备后，转化大肠杆菌菌株MM294(thi、gyrA96、endI-、hs-dRl7)。在添加0.05％溴苯腈作唯一氮源的缺陷型(N-)固体琼脂糖基本培养基(每升含KH2PO4(1.5克)、K2HPO4(3.5克)、MgSO4·7H2O(0.1克)和0.1％葡萄糖)上选择转化子。培育5天后，在选择平板上出现了10个菌落，将这些菌落在含有0.05％溴苯腈的L-琼脂平板上再划线进行培养，并测试MM294中硫胺素营养缺陷型标记物的存在。结果这些菌落中没有一个能在缺少硫胺素的基本培养基上生长，表明该菌株是大肠杆菌MM294。所有的菌落都可以在添加硫胺素和作为唯一氮源的0.05％溴苯腈的M9培养基上生长。在缺少溴苯腈的这种培养基上没有看到菌落的生长。从这些菌落中选择两个作进一步分析。对含90Kb质粒的大肠杆菌MM294抽提物粗制品进行溴苯腈特异的腈水解酶活性测定，获得比活性为0.216μmol NH3/min/mg。含有较小质粒类型的大肠杆菌MM294不产生可检测的腈水解酶活性。大肠杆菌中较大的90Kb质粒称为pBrx1，较小的称为pBrx1Δ。
为了确证含有质粒pBrx1的大肠杆菌菌株MM294的确产生合适的作为溴苯腈特异的腈水解酶反应结果的代谢物，将2毫升MM294(含pBrx1)培养物在添加0.05％溴苯腈的M9培养基中于30℃生长24小时。培养物的滤液样品在一个C18 HPLC高效液相色谱柱上进行色谱。在培养物滤液中掺入所有的溴苯腈被转化成一个新的代谢物峰。用光谱分析对代谢物峰进行鉴定证实为3′，5′-二溴-4-羟基苯甲酸(DBHB)。因而，在大肠杆菌中表达的由质粒编码的溴化腈特异的腈水解酶水解产物与在克氏杆菌(K.Ozaenae)中观察到的是一样的。溴苯腈特异腈水解酶基因在大肠杆菌中的克隆：
为了确定编码溴苯腈特异的酶的DNA片段是否能克隆到大肠杆菌中，用BamHI消化质粒pBrx1，分别得到53Kb和37Kb两条带。这两个BamHI片段被连接入大肠杆菌质粒载体pACYC184(Chang和Cohen，《J.Bacteriol》(1978)第134卷1141页)的BamHI位点上，然后转化大肠杆菌菌株MM294。克隆到pA-CYC184的BamHI位点导致了抗四环素抗性基因的插入失活。选择出十个对氯霉素抗性、对四环素敏感的MM294菌落，微量制备分析用克隆DNA，用BamHI消化该DNA。四个克隆含有37KbBamHI片段，而有一个克隆含有pBrx1较大的53Kb BamHI DNA片段。五个克隆都包含一个克隆化BamHI片段，该片段也发现在质粒pBrx1Δ中，其与pBrx1自发地缺失22Kb质粒DNA后剩下的片段相对应。所有10个克隆在200ml含有20μg/ml氯霉素(选择该质粒)的L-培养基中生长，获得抽提物粗制品并对抽提物进行溴苯睛特异的腈水解酶活性测定。四个含有37Kb BamHI片段的克隆显示出的腈水解酶比活性在0.140μmole释放NH3/分/毫克蛋白质的范围内，而另六个克隆则检测不出有腈水解酶活性。该数据表明编码溴苯腈特异的腈水解酶活性的基因位于37Kb BamHI片段上，此片段从质粒pBrx1上克隆而来，并且在没有溴苯腈选择情况下自发地丢失的22Kb DNA片段位于37Kb BamHI片段之中。
相对于载体pACYCl84而言，为了确定BamHI片段的方向，来源于上述四个克隆的DNA用EcoRI消化，在0.7％琼脂糖凝胶上进行电泳。对质粒pBrx1和pBrx1Δ的EcoRI联合消化产物也作了分析。
相对于载体pACYC184而言，其中37Kb BamHI片段的两个方向都被确定，分别称为质粒pBrx2和pBrx3。同样也观察到，三个EcoRI片段位于自发地从质粒pBrx2及pBrx3丢失的22Kb DNA片段之中。这三个EcoRI片段的大小分别为18Kb、3Kb和1.9Kb。假如腈水解酶结构基因没有被EcoRI限制性位点分开的话，编码溴苯腈特异的腈水解酶基因应位于三个EcoRI片段中的一个之中。
对大肠杆菌(pBrx3)溴苯腈特异的腈水解酶位置作了研究。结果如下：
                  表    1
溴苯腈特异的腈水解酶是大肠杆菌中的外周胞质酶
                                    腈水解酶
培养条件a                          活性b
甲苯处理的细胞(L-培养基)            0.829
经溶菌酶处理的细胞(L-培养基)        0.796
完整细胞(L-培养基)                  0.770
完整细胞(L-培养基Brx1)              1.25
完整细胞(M9)                        0.950
完整细胞(M9+Brx1)                   1.45
完整细胞/pACYC184(M9)               0
a：含有质粒pBrx3的大肠杆菌(MM294)细胞在所指定的培养基中以5ml培养物于37℃生长到稳定期。培养物含20μg/ml氯霉素和0.04％溴苯腈(Brx1)(表中已指明)。从每一培养物中收集1ml，用腈水解酶缓冲液(0.1MKPO4，pH7.5)洗涤一次并使细胞悬浮于0.1ml该缓冲液中。按照Harper在Biochem.J.(1977)第167卷685～692页上介绍的方法，分别使用和不使用3mM溴苯腈作为底物对50μml样品进行腈水解酶活性测定。
b：μmoleNH3/分/mg。蛋白质的测定按O.D.600值1.4＝109细胞/毫升＝150μg计数。
这些数据表明腈水解酶在细胞中的位置是在外周胞质间隙中。第二个观察到的现象是，该酶在缺少溴苯腈的培养物中能表达，这就表明酶的表达不需要溴苯腈的诱导。
溴苯腈特异的腈水解酶的进一步纯化：
    臭鼻杆菌(K.ozaenae)腈水解酶的进一步纯化获得下列的结
果。
                            表    2
    从大肠杆菌中纯化溴苯腈特异的腈水解酶(起始材料为6克细胞)
    组分        体积    蛋白    μmoleNH/分  比活性b
    粗制a      100ml   210mg   18.15        0.086
    35-50％     6ml     83mg    26.77        0.250
    (NH4)2SO4
    DEAE        56ml    19mg    15.52        0.820
    葡聚糖凝胶
    (Sephadex)
a：在含有0.04％溴苯腈和葡萄糖的M9培养基上，细胞于30℃下生长至对数期中期。在含0.05M KPO4(pH7.5)和2.5mM二硫苏糖醇(DTT)的缓冲液中通过破碎细胞超速离心和透析制得粗制抽提物。在所有的腈水解酶测定中底物浓度均为3mM。b：μmoleNH3/分/mg
规格为2.5cm×10cm的柱用含0.05M KPO4(pH7.5)、2.5mM DTT和1mM EDTA的缓冲液中洗涤平衡。加入样品后，用上述缓冲液加上300ml0.02 M至0.40M NaCl形成的线性梯度溶液对柱进行洗脱。在梯度末端使用含1MNaCl的缓冲液。每5ml收集一组分，每一组分的0.075ml等分试样测定腈水解酶活性。一个单酶活性峰在0.22M盐浓度时被洗脱。大约75％掺入的腈水解酶活性被回收在活性组分中。
从DEAE柱得到的跨越腈水解酶峰的各组分针对0.02MKPO4(pH7.5)进行透析，每个组分取50μl(6μg蛋白质)加入到11.25％的变性Laemmli胶中电泳。与来自DEAE柱的活性峰相对应的富集蛋白带是分子量为34,000的多肽。由柱分离的活性组分中没有富集到其它的多肽。这些数据支持了这样的观点：溴苯腈特异的腈水解酶是一种分子量大约为34,000的多肽，并且可能是一个单一基因的产物。
克隆pBrx2用EcoRI完全消化，分离出一个约为19Kb的片段。该片段插入到EcoRI消化的pACYC184载体(3.9Kb)中产生质粒pBrx5，质粒pBrx5如上所述转化大肠杆菌。其中，E.coli MM294(pBrx5)已于1987年2月8日提交中国典型培养物保藏中心保藏，地点：中国武汉。保藏号CCTCC No.M87034。该质粒用常规方法分离后，用Bgl II消化获得大约6.7 Kb片段，此片段仍插入在pA-CYC184载体中形成pBrx7。分离到的质粒pBrx7再用SmaI及BglII消化获得一个约3.9Kb片段，此片段被插入到SmaI-BamHI消化的pACYC177(3.7Kb)中。(Chang及Cohen，J.Bacteriol.(1987)第134卷1141-1156页)。所产生的能提供抗青霉素抗性的质粒如前所述转化到大肠杆菌中，转化子在青霉素选择培养基上进行选择，以产生质粒pBrx8，该质粒携带一个含有腈水解酶基因的3.9Kb片段。
pBrx8用PstI部分消化，消化片段被插入到PstI消化的pUC18上(Yanisch-perron等，《基因》(1985)第33卷103～119页)。所产生的质粒在大肠杆菌中克隆并对其腈水解酶活性进行筛选。一个克隆具有5.3Kb质粒pBrx9，此pBrx9质粒被分离并进一步用PstI及Hinc II消化，结果产生一个1210bp的片段，该片段在从PstI至Hinc II方向的顺序中，具有相对均匀间隔的ClaI、SalI、ScaI和SphI限制性位点。这一Pst I-Hinc II片段按照Sanger等在《Proc.Natl.Acad。Sci.USA》(1977)第74卷5463～5468页上所述的方法进行顺序测定。得到的顺序(包含有所编码的合适氨基酸)显示如下：
                                 95                                     125ATG GAC ACC ACT TTC AAA GCA GCC GCT GTT CAG GCC GAA CCG GTA TGG ATG GAT GCC GCTMet Asp Thr Thr Phe Lys Ala Ala Ala Val Gln Ala Glu Pro Val Trp Met Asp Ala Ala
                                155                                     185GCA ACA GCC GAT AAG ACC GTG ACG CTA GTA GCT AAA GCC GCA GCG GCT GGC GCG CAG CTCAla Thr Ala Asp Lys Thr Val Thr Leu Val Ala Lys Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gln Leu
                                215                                     245GTC GCA TTT CCC GAA TTG TGG ATT CCG GGC TAC CCA GGA TTC ATG CTC ACG CAC AAC CAAVal Ala Phe Pro Glu Leu Trp Ile Pro Gly Tyr Pro Gly Phe Met Leu Thr His Asn Gln
                                275                                     305ACC GAA ACC CTA CCA TTC ATC ATT AAA TAC CGC AAG CAG GCA ATC GCC GCC GAT GGA CCAThr Glu Thr Leu Pro Phe Ile Ile Lys Tyr Arg Lys Gln Ala Ile Ala Ala Asp Gly Pro
                                335                                     365GAA ATC GAA AAA ATT CGC TGC GCG GCT CAG GAG CAT AAC ATT GCG CTC TCC TTT GGG TACGlu Ile Glu Lys Ile Arg Cys Ala Ala Gln Glu His Asn Ile Ala Leu Ser Phe Gly Tyr
                                395                                     425AGC GAA CGG GCT GGC CGT ACG CTC TAC ATG TCA CAA ATG CTT ATC GAT GCC GAT GGC ATCSer Glu Arg Ala Gly Arg Thr Leu Tyr Met Ser Gln Met Leu Ile Asp Ala Asp Gly Ile
                                455                                     485ACC AAA ATT CGT CGT CGA AAG CTC AAA CCA ACC CGC TTT GAA CGA GAA CTC TTT GGC GAAThr Lys Ile Arg Arg Arg Lys Leu Lys Pro Thr Arg Phe Glu Arg Glu Leu Phe Gly Glu
                                515                                     545GGT GAC GGA TCG GAC TTA CAG GTC GCC CAA ACT AGC GTT GGT CGG GTG GGT GCC CTC AACGly Asp Gly Ser Asp Leu Gln Val Ala Gln Thr Ser Val Gly Arg Val Gly Ala Leu Asn
                                575                                     605TGC GCG GAG AAT TTG CAG TCG CTA AAC AAG TTT GCG CTT GCT GCC GAG GGT GAA CAG ATACys Ala Glu Asn Leu Gln Ser Leu Asn Lys Phe Ala Leu Ala Ala Glu Gly Glu Gln Ile
                                635                                     665CAT ATC TCC GCC TGG CCA TTC ACG CTT GGA AGC CCT GTG CTC GTC GGA GAC TCC ATC GGCHis Ile ser Ala Trp Pro Phe Thr Leu Gly Ser Pro Val Leu Val Gly Asp Ser Ile Gly
                                695                                     725GCC ATC AAC CAG GTC TAC GCG GCC GAG ACG GGG ACC TTC GTT CTC ATG TCG ACG CAG GTGAla Ile Asn Gln Val Tyr Ala Ala Glu Thr Gly Thr Phe Val Leu Met Ser Thr Gln Val
                                755                                     785GTT GGA CCG ACC GGC ATC GCC GCC TTC GAG ATC GAA GAC AGG TAC AAC CCG AAT CAG TATVal Gly Pro Thr Gly Ile Ala Ala Phe Glu Ile Glu Asp Arg Tyr Asn Pro Asn Gln Tyr
                                815                                     845CTT GGT GGT GGG TAC GCG CGG ATC TAC GGG CCT GAC ATG CAG TTG AAG AGC AAG TCG TTGLeu Gly Gly Gly Tyr Ala Arg Ile Tyr Gly Pro Asp Met Gln Leu Lys Ser Lys Ser Leu
                                875                                     905TCA CCG ACC GAA GAG GGC ATC GTC TAC GCC GAG ATC GAC CTG TCG ATG CTT GAG GCA GCASer Pro Thr Glu Glu Gly Ile Val Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Ser Met Leu Glu Ala Ala
                                935                                     965AAG TAC TCG CTC GAT CCC ACG GGC CAC TAT TCG CGC CCT GAT GTG TTC AGC GTG TCG ATTLys Tyr Ser Leu Asp Pro Thr Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Phe Ser Val Ser Ile
                                995                                    1025AAC CGG CAA CGG CAG CCT GCG GTG TCA GAA GTT ATC GAC TCA AAC GGT GAC GAG GAC CCGAsn Arg Gln Arg Gln Pro Ala Val Ser Glu Val Ile Asp Ser Asn Gly Asp Glu Asp Pro
                               1055                                    1085AGA GCA GCA TGC GAG CCC GAC GAG GGG GAT CGT GAG GTC GTA ATC TCT ACG GCA ATA GGGArg Ala Ala Cys Glu Pro Asp Glu Gly Asp Arg Glu Val Val Ile Ser Thr Ala Ile GlyGTT CTA CCC CGT TAT TGC GGA CAT TCCVal Leu Pro Arg Tyr Cys Gly His Ser
Pst I-Hinc II片段两侧的5′-及用3′-非编码自由区域可以用EcoRI接头分别连接，然后再用EcoRI消化，接着便准备通过插入到pCGN451的EcoRI位点而导入到植物的表达盒中。
pCGN451包括一章鱼碱盒，该章鱼碱盒含有约1,566bp的5′端非编码区，其通过一EcoRI接头与基因的3′端部和约1,349bp的3′端非编码融合一起。根据Barker等在《Plant Molecular Biology》(1983)第2卷335页上确定的，pTi协同顺序在3′端区域是从11,207至12,823，而在5′端区域是从13,643至15,208。5′端片段以下列方法获得：一个含有5′端编码区的亚克隆小片段以BamHI-EcoRl片段形式克隆到质粒pBR322中成为pCGN407。BamHI-EcoRI片段在其编码区中有一个XmnI位点，而pBR322中有二个XmnI位点，用XmnI消化pCGN407，经Bal31核酸酶切割，用EcoRI接头连接这些酶切产生的片段。再经EcoRI和BamHI酶切后，酶切片段按大小进行分级分离，对分级分离的片段进行克隆和测序。在一个片段中，相应于原初的完整编码区域和10bp的5′端不翻译顺序已被去除，剩下完整的5′端不转录区域、mRNA帽位点和16bp的5′端不翻译区域(至BamHI位点)。这个小片段是在7％丙烯酰胺凝胶中通过按大小进行分级分离洗脱而得到的，约130bp长。此DNA连接到M13mp9上进行克隆并对若干个克隆进行测序，将测得的顺序与已知的章鱼碱合成酶基因顺序比较。M13构建物被称为pI4，此质粒用BamHI和EcoRI消化，得到一个小片段，将该小片段分别与一个XhoI-BamHI片段和一个EcoRI-XhoI片段相连接。XhoI-BamHI片段含有来自pTiA6的5′端上游顺序，而EcoRI-XhoI片段含有3′端顺序(Garfinkel和Nester，J.Bacteriol.(1980)第144卷732页)。结果产生的XhoI片段克隆到pUC8衍生质粒pCGN426的XhoI位点上。质粒pCGN426不同于pUC8，具有单一的由DNA聚合酶I产生的EcoRI位点，而由于在HincII限制性内切酶中有核酸酶的污染，因此丢失了PstI和HindIII位点。将一个XhoI接头插入到pUC8的单一HincII位点上，获得的质粒pCGN451有单一EcoRI位点，用于插入蛋白质编码顺序。该蛋白质编码顺序位于5′端非编码区域(其含有包括转移DNA(T-DNA)右侧边缘顺序的1550bp的5′端不转录顺序、mRNA帽位点和16bp的5′端不翻译顺序)和3′端区域(其含有267bp的编码区域、终止密码子、196bp的3′端不翻译DNA、多聚腺苷酸(polyA)位点和1153bp的3′端不转录顺序)之间。
包含章鱼碱合成酶(ocs)表达盒的XhoI片段被插入到具有抗四环素和抗卡那霉素(Kanamycin)抗性基因的质粒pCGN517中。pCGN517是从pHC79(Hohn，《Gene》(1980)第11卷291页)通过引入来自pUC4K(Vieira，《Gene》(1982)第19卷259页)的单一PstI位点、Kanr基因而制得。pCGN517用SalI消化，并将XhoI片段插入到单一SalI位点上。
该XhoI片段同样也插入到第二个质粒pCGN529中。pCGN529是从pACYC184通过插入细菌转座子Tn5的Kanr基因(Rothstein等，(1981)《Movable Genetic Elements》中99页，Clold SpringHarbor实验室，Cold Spring Harbor，纽约)，然后将来自pRiA4转移LDNA(T-LDNA)的一个2.4Kb Bgl II片段(White和Nester，《J.Bacteriol》(1980)第144卷710页)插入到用Tn5的Kanr基因置换pACYC184的Hind III-BamHI片段后形成的含BamHI位点的质粒上而制得。
含EcoRI位点的腈水解酶基因已插入到具有单一EcoRI位点的ocs表达盒中，包含有ocs表达盒的xhoI片段分别插入pCGN517和pCGN529中得到两个质粒，分别为pN1和pN2。这两个质粒pN1和pN2用于导入根瘤土壤杆菌(A.Tumefaciens)或发根土壤杆菌(A.rhizogenes)以整合到Ti-或Ri-质粒的转移DNA(T-DNA)中。在各个质粒中的整合可以按照Comai等在《plasmid》(1983)第10卷21-30页上所描述的三步杂交法(3-way mating)来完成。将含有质粒pRK2073、pN1或pN2的大肠杆茵宿主和根瘤土壤杆菌A722(GarfinKel，《J.Bacteriol.》(1980)第144卷732页)或发根土壤杆菌A4T(White，《ibid.》(1980)第144卷710页)过夜培养，混合合适的培养物并涂布到含有150μg/ml卡那霉素的AB平板上。单菌落进行再划线培养两次。对土壤杆菌(属)总DNA进行Southern印迹分析证实整合正确，这是通过用缺口平移标记的pBrx8去探查核酸内雪酶消化的DNA击进行的。与根瘤土壤杆菌共培养的烟草叶切片的转化和再生：
对烟草植物进行无菌培养(25℃，白光16小时)；MS(1mg/LIAA，0.15mg/L激动素)。通过主枝条移植培养出的三周龄烟草植物作为组织供体。选择(自顶部起第四层)嫩叶，剪出直径为2mm圆叶片，置于具有含1mg/L IAA的1ml MS培养基的Petri培养皿(直径3cm)中。经避光过夜培养之后，将土壤杆菌(属)(A772xpN1或pN2)细胞(在植物培养基中108-109/ml)加入到这些培养物中。然后在避光情况下共培养18～24小时。用没有激素和含350mg/升cefotaxine(Boehringer-Mannheim公司产品)的MS培养基洗涤叶片三次，以去除土壤杆菌。叶片被转移到具有10ml不含激素的MS培养基的培养Petri皿(直径9厘米)中。用石蜡膜对含植物琼脂(Phytagar)(Gibco，0.6％；cefotaxine，350mg/L)的培养皿进行封口，并置于与组织供体植物相同的条件下。将2至4周后出现的根割下，置于相同条件下，在相同的培养基中加入2mg/L LAA及2mg/L激动素。在随后的2至5周中可以看到有再生芽长出。
用溴苯腈溶液对盆载的具有6片叶子阶段的植物进行直接喷雾。每株植物用一个4号花盆栽种，喷上2.5ml溴苯腈溶液。植物在一个温度25℃，相对湿度70％的生长室中进行60小时的照光生长。喷雾9天之后，通过计数大于0.5厘米的新叶片记录植物的生长情况。
根据上述的步骤能获得对溴苯腈具有抗性的植物，这种植物可在有溴苯腈存在的田野里种植，溴苯腈对它们的生长不产生相当大的有害影响。
本发明通过使植物对除草剂特别是对特异性的苄腈除草剂产生抗性而使该植物得到改良。因此，编码腈水解酶的基因可以导入植物宿主中，该基因进行表达并赋于植物具有对苄腈的抗性。此外，腈水解酶可以通过克隆其基因到常用的细菌宿主中并在其中表达而产生。具有可检测活性的腈水解酶具有广泛用途，可用于测定不同的分析物或苄腈底物。此外，腈水解酶及表达该酶的细菌可用于去除被污染环境中的苄腈除草剂。
尽管为了便于理解前述的本发明，已经通过描述和举例作了详细的说明，但是在所附的权利要求范围内作某些变化和改进显然也是可行的。

Claims (2)

1.一种生产对于3，5-二卤-对-羟苄腈有特异性的腈水解酶的方法，其特征在于，包括：
(1)获得含有腈水解酶基因的片段，其中该腈水解酶基因的序列如下：
                                 95                                     125ATG GAC ACC ACT TTC AAA GCA GCC GCT GTT CAG GCC GAA CCG GTA TGG ATG GAT GCC GCTMet Asp Thr Thr Phe Lys Ala Ala Ala Val Gln Ala Glu Pro Val Trp Met Asp Ala Ala
                                155                                     185GCA ACA GCC GAT AAG ACC GTG ACG CTA GTA GCT AAA GCC GCA GCG GCT GGC GCG CAG CTCAla Thr Ala Asp Lys Thr Val Thr Leu Val Ala Lys Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gln Leu
                                215                                     245GTC GCA TTT CCC GAA TTG TGG ATT CCG GGC TAC CCA GGA TTC ATG CTC ACG CAC AAC CAAVal Ala Phe Pro Glu Leu Trp Ile Pro Gly Tyr Pro Gly Phe Met Leu Thr His Asn Gln
                                275                                     305ACC GAA ACC CTA CCA TTC ATC ATT AAA TAC CGC AAG CAG GCA ATC GCC GCC GAT GGA CCAThr Glu Thr Leu Pro Phe Ile Ile Lys Tyr Arg Lys Gln Ala Ile Ala Ala Asp Gly Pro
                                335                                     365GAA ATC GAA AAA ATT CGC TGC GCG GCT CAG GAG CAT AAC ATT GCG CTC TCC TTT GGG TACGlu Ile Glu Lys Ile Arg Cys Ala Ala Gln Glu His Asn Ile Ala Leu Ser Phe Gly Tyr
                                395                                     425AGC GAA CGG GCT GGC CGT ACG CTC TAC ATG TCA CAA ATG CTT ATC GAT GCC GAT GGC ATCser Glu Arg Ala Gly Arg Thr Leu Tyr Met Ser Gln Met Leu Ile Asp Ala Asp Gly Ile
                                455                                     485ACC AAA ATT CGT CGT CGA AAG CTC AAA CCA ACC CGC TTT GAA CGA GAA CTC TTT GGC GAAThr Lys Ile Arg Arg Arg Lys Leu Lys Pro Thr Arg Phe Glu Arg Glu Leu Phe Gly Glu
                                515                                     545GGT GAC GGA TCG GAC TTA CAG GTC GCC CAA ACT AGC GTT GGT CGG GTG GGT GCC CTC AACGly Asp Gly Ser Asp Leu Gln Val Ala Gln Thr ser Val Gly Arg Val Gly Ala Leu Asn
                                575                                     605TGC GCG GAG AAT TTG CAG TCG CTA AAC AAG TTT GCG CTT GCT GCC GAG GGT GAA CAG ATACys Ala Glu Asn Leu Gln Ser Leu Asn Lys Phe Ala Leu Ala Ala Glu Gly Glu Gln Ile
                                635                                     665CAT ATC TCC GCC TGG CCA TTC ACG CTT GGA AGC CCT GTG CTC GTC GGA GAC TCC ATC GGCHls Ile Ser Ala Trp Pro Phe Thr Leu Gly Ser Pro Val Leu Val Gly Asp Ser Ile Gly
                                695                                     725GCC ATC AAC CAG GTC TAC GCG GCC GAG ACG GGG ACC TTC GTT CTC ATG TCG ACG CAG GTGAla Ile Ash Gln Val Tyr Ala Ala Glu Thr G1y Thr Phe Val Leu Met Ser Thr Gln Val
                                755                                     785GTT GGA CCG ACC GGC ATC GCC GCC TTC GAG ATC GAA GAC AGG TAC AAC CCG AAT CAG TATVal Gly Pro Thr Gly Ile Ala Ala Phe Glu Ile Glu Asp Arg Tyr Ash Pro Asn Gln Tyr
                                815                                     845CTT GGT GGT GGG TAC GCG CGG ATC TAC GGG CCT GAC ATG CAG TTG AAG AGC AAG TCG TTGLeu Gly Gly Gly Tyr Ala Arg Ile Tyr Gly Pro Asp Met Gln Leu Lys Ser Lys Ser Leu
                                875                                     905TCA CCG ACC GAA GAG GGC ATC GTC TAC GCC GAG ATC GAC CTG TCG ATG CTT GAG GCA GCASer Pro Thr Glu Glu Gly Ile Val Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Ser Met Leu Glu Ala Ala
                                935                                     965AAG TAC TCG CTC GAT CCC ACG GGC CAC TAT TCG CGC CCT GAT GTG TTC AGC GTG TCG ATTLys Tyr Ser Leu Asp Pro Thr Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Phe Ser Val Ser Ile
                                995                                    1025AAC CGG CAA CGG CAG CCT GCG GTG TCA GAA GTT ATC GAC TCA AAC GGT GAC GAG GAC CCGAsh Arg Gln Arg Gln Pro Ala Val Ser Glu Val Ile Asp Ser Ash Gly Asp Glu Asp Pro
                               1055                                    1085AGA GCA GCA TGC GAG CCC GAC GAG GGG GAT CGT GAG GTC GTA ATC TCT ACG GCA ATA GGGArg Ala Ala Cys Glu Pro Asp Glu Gly Asp Arg Glu Val Val Ile Ser Thr Ala Ile GlyGTT CTA CCC CGT TAT TGC GGA CAT TCCVal Leu Pro Arg Tyr Cys Gly His Ser
(2)将该片段插入表达载体，
(3)用该表达载体转化大肠杆菌，
(4)在合适的条件下培养转化的大肠杆菌，从而表达该腈水解酶，
(5)分离该腈水解酶。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，是从大肠杆菌MM294(pBrx5)，CCTCC No.M87034中获得含有腈水解酶的片段。
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