DD263080A5

DD263080A5 - Nitrilasezusammensetzung

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Publication number: DD263080A5
Authority: DD
Publication date: 1988-12-21

Abstract

Die Erfindung betrifft Nitrilasezusammensetzungen, Nukleinsaeuresequenzen, die diese Nitrilase codieren, Konstruktionen, die Gene enthalten, die diese Nitrilasen unter der Kontrolle der fuer die Transkription und Translation regulatorischen Gene kodieren und von einem gewuenschten Wirt, dem die Nitrilasegene fremd sind, erkannt werden. Die Erfindung betrifft auch Wirtszellen sowie Organismen und Organismusteile oder -produkte, die diese Konstruktionen enthalten. Die erfindungsgemaesse Nitrilasezusammensetzungen weisen etwa 34 kDal auf mit einer spezifischen Aktivitaet von mindestens etwa 0,1 mmol NH3/min/mg und Bromoxynil als Substrat. Die Nitrilasezusammensetzung besteht aus Bakterien, insbesondere Klebsiella. Der erfindungsgemaesse bakterielle Wirt umfasst ein Fremdgen, das die fuer 3,5-dihalogen-4-hydroxybenzonitrilspezifische Nitrilase exprimiert und bromoxynilempfindliche Zellen vor den cytotoxischen Wirkungen des Bromoxynils schuetzt. Die Erfindung betrifft weiterhin bromoxynilresistente Pflanzen.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Der Erfindung betrifft Nitrilasezusammensetzungen, Nukleinsäuresequenzen, die diese Nitrilasen codieren, Konstruktionen, die Gene enthalten, die diese Nitrilasen unter der Kontrolle derfür die Transkription und Translation regulatorischen Gene codieren und von einem gewünschten Wirt, dem die Nitrilasegene fremd sind, erkannt werden. Die Ermittlung betrifft auch Wirtzellen, die diese Konstruktionen enthalten, sowie Organismen und Organismusteile oder-produkte, die diese Konstruktionen enthalten.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die Möglichkeit, Mikroorganismen und Zellen von höheren Organismen neue genetische Fähigkeiten zu verleihen, hat eine Vielzahl von neuen Anwendungszwecken eröffnet. Auf der einen Seite können verschiedene Mittel hergestellt werden, die wegen ihrer cytotoxischen Wirkung verwendet werden; so werden beispielsweise in der Landwirtschaft viele Verbindungen verwendet, die auf die Schädlings- und Unkrautbekämpfung gerichtet sind. In vielen Fällen haben diese Verbindungen eine relativ lange Verweilzeit.

In vielen Fällen ist es wünschenswert, zwischen der zu erhaltenden und der zu bekämpfenden Art zu unterscheiden. So ist es oft wünschenswert, Unkraut selektiv zu vernichten, wobei die Ertragspflanzen möglichst wenig geschädigt werden sollten. Meistens haben die Breitband-Herbicide eine deutlich nachteilige Wirkung auf die Ernte, so daß ihre Verwendung auf vorbeugende Behandlung oder vorsichtige Nachbehandlung begrenzt ist.

Es besteht daher ein großes Interesse, Lebendzellen so zu modifizieren, daß sie gegenüber Streßfaktoren, wie cytotoxischen Mitteln, resistent sind.

In der US-A-4535060 wird die Verwendung eines bakteriellen aroA-Gens beschrieben, das Glyphosat (N-Phosphonomethyl-(glycin)-empfindlichen Zellen Resistenz gegenüber dieser Verbindung verleiht. Hsu and Camper beschreiben in „Can. J. Microbiol.", 22, S. 537-543 (1976), die Isolierung von ioxynilabbauenden Produkten aus Bodenanreicherungskulturen. Hsu und Clemson beschreiben in „Dissert. Abstr. Intrn.", B 36,8, S. 3708 (1976), den mikrowellen Abbau einer Familie von 3,5-Di-halogen-4-hydroxybenzonitril-Herbiciden. Ingram und Pullin beschreiben in „Pestic. Sei.", 5, S.287-291 (1974), den Verbleib von Bromoxynil in drei Bodenarten. Gemäß Smith in „Abstrp. Meeting Weed Soc. Am." (1971), Seiten 16-17, wird Bromoxynil in schwerem Ton (Regina) abgebaut. Smith und Fletcher in „Hort. Res.", 4, S. 60-62 (1964), berichten von 3,5-Di-halogen-4-hydroxybenzonitrilen und Bodenmikroorganismen.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung neuer Mittel, welche Kulturpflanzen vor der phytotoxen Wirkung von Herbiziden schützen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, den Schutz gegenüber Herbiziden durch genetische Modifizierung in der Pflanzenzelle zu erreichen.

Erfindungsgemäß werden nun Nitrilasen, Nukleinsäuresequenzen, die diese Nitrilasen codieren, Konstruktionen, die Gene enthalten, die diese Nitrilasen unter derfür die Transkription und Translation regulatorischen Kontrolle der regulatorischen Gene in einem gewünschten Wirt codieren und von einem gewünschten Wirt, dem die Nitrilasegene frend sind, erkannt werden, Wirtzellen, die diese Konstruktionen enthalten, und Organismen sowie Organismusteile und -produkte, die diese Konstruktionen enthalten, beschrieben. Die Bromoxynil- und/oder loxynil-spezifischen Nitrilasen können dazu verwendet werden, Bromoxynil und verwandte Herbicide enthaltende Stellen zu entgiften und Wirtzellen vor den cytotoxischen Wirkungen dieser Herbicide zu schützen. Die Konstruktionen dienen dazu, zwischen Wirtzellen, die diese Konstruktionen enthalten, und Wirtzellen, denen diese Konstruktionen fehlen, zu unterscheiden.

Erfindungsgemäß werden neue DNA-Sequenzen, Konstruktionen, transformierte Zellen, Pflanzen und Peptide angegeben, die halogenierte Hydroxybenzonitrile und insbesondere 3,5-Dibrom- oder 3,5-Dijod-4-hydroxybenzonitril hydrolysieren.

Die Erfindung betrifft auch die Gewinnung eines Enzyms, das die Nitrile hydrolysieren kann, wodurch die herbicide Wirkung der Nitrile zerstört und eine Zelle oder ein Wirt, die gegenüber dem Herbicid empfindlich sind, geschützt oder eine Gegend, die mit dem Herbicid verunreinigt ist, entgiftet werden kann.

Das interessierende Strukturgen kann aus einem einzelligen Mikroorganismus und insbesondere einem Bakterium gewonnen werden, das das Benzonitril als Stickstoffquelle, bzw. als einzige Stickstoffquelle/verwenden kann. Der Ausdruck „Benzonitril" oder „Nitrilase" bedeutet im folgenden, daß das Benzonitril ein halogeniertes p-Hydroxybenzonitril und insbesondere 3,5-Dijod-. oder 3,5-Dibrom-4-hydroxybenzonitril (loxynil bzw. Bromoxynil) ist und eine Nitrilase verstanden wird, die diese halogenierten Benzonitrile als Stickstoffquelle, bzw. ausschließlich Stickstoffquelle verwenden kann.

Das Enzym kann auf verschiedene Weisen gewonnen werden, zweckmäßigerweise aus Bakterien, die in einer Bromoxynil oder loxynil enthaltenden Umgebung natürlich vorkommen. Von besonderem Interesse sind Enterobakterien und insbesondere Klebsiella-Arten. Klebsieila pneumoniae und insbesondere Klebsieila ozaenae können verwendet werden. Besser als durch Isolierung aus dem Boden können diese Organismen in einem Boden oder einem anderen Medium bei steigenden Benzonitrilkonzentrationen und verminderten Mengen an anderen Stickstoffquellen gezüchtet werden, bis die überlebenden Organismen das Benzonitril als einzige Stickstoffquelle verwenden.

Unabhängig von dem die Nitrilase enthaltenden Bakterium muß selektiert werden, um sicherzustellen, daß die Nitrilase die Entgiftung des Benzonitrils durchführen kann. Außerdem sollte die Nitrialse für das Benzonitril spezifisch sein, eher als für Analoga, die kein Halogen und/oder andere Substituenten aufweisen. Die erfindungsgemäße Nitrilase ist für die oben angegebenen Benzonitrile spezifisch und gegenüber Analoga weniger oder nicht aktiv. Zweckmäßigerweise sollte bei Verwendung von Benzonitril in Vergleichbaren Konzentrationen als Stickstoffquelle die Proliferationsgeschwindigkeit nicht deutlich, d.h. unter etwa 10%, vermindert sein im Vergleich zur Proliferation eines Bakteriums in Gegenwart einer normalen Stickstoffquelle, wie beispielsweise Ammoniak. Dieses Ergebnis wird mit nichtspezifischen Benzonitrilen nicht beobachtet. Ist mindestens ein Wirtstamm identifiziert, so können zur Identifizierung der die Nitrilase codierenden Sequenz verschiedene Verfahren verwendet werden. Das Gen kann auf einem Chromosom oder Plasmid vorhanden sein. Das Genom kann fragmentiert werden, insbesondere mit einer Restriktionsendonuklease, d. h. mit einer oder mehreren Endonukleasen, die Fragmente von etwa 5 bis 50kb bilden. Diese Fragmente können auf entsprechenden Vektoren in einem geeigneten Bakterium, beispielsweise E. coli, kloniert werden. Die entstandenen Transformanten werden auf Nitrilaseaktivität untersucht, der Wirtorganismus bidlet dabei einen negativen Hintergrund.

Ist mindestens ein Klon mit Nitrilaseaktivität identifiziert, so können die extrachromosomalen Elemente, Plasmide oder Viren, die das gewünschte DNA-Fragment enthalten, in herkömmlicher Weise isoliert werden, beispielsweise durch Lyse des Wirts, Fällung der DNA und Abtrennung der Vektor-, Plasmid-oder Virus-DNA von der chromosomalen DNA. Die extrachromosomalen Elemente können durch Restruktionsendonuklease gespalten werden, die gewünschten Fragmente können durch verschiedene Verfahren zur Trennung und Identifizierung der verschiedenen großen Fragmente, beispielsweise durch Elektrophorese oder Dichtegradientzentrifugierung isoliert werden.

Das Fragment kann je nach Größe im allgemeinen weiter manipuliert werden, um es näher an die Größe des Gens und seiner flankierenden Steuerregionen zu bringen. Zur Manipulierung des Fragments, das die Codiersequenz für das Enzym und ihre regulatorischen flankierenden Sequenzen enthält, können verschiedene Verfahren angewendet werden. Teilspaltung mit verschiedenen Restriktionsenzymen in verschiedenen Reaktionsgemischen, anschließendes Klonieren der Fragmente zur Bestimmung der Fragmente, die die Expressionsfähigkeit für die Nitrilase noch aufweisen, können verwendet werden. Andererseits kann das Enzym isoliert und teilsequenziert werden. Auf der Grundlage der Aminosäurensequenz können Proben hergestellt werden, die dann zur Identifizierung der das Gen enthaltenden Fragmente verwendet werden können. Durch Kombination dieses Verfahrens mit der Restruktionsenzymspaltung können Fragmente geklont und auf die Anwesenheit des gewünschten Gens untersucht werden. Zusätzlich können Exonukleasen, wie Bal31, verwendet werden, um die Nukleotide von einem oder beiden Enden des Fragments zu entfernen und die Anzahl der überflüssigen Nukleotide weiter zu verringern. In einer anderen Ausführungsform kann das Gen in einem entsprechenden Wirt geklont und die Boten-RNA isoliert werden, und zwar durch Selektion mit einer Probe, Identifizieren in einem geeigneten in vitro- oder in vivo-Translationssystem, beispielsweise Xenopus oocytes oder Reticulolysat. Die isolierte Boten-RNA kann dann zur Herstellung von cDNA in herrkömmlicher Weise verwendet werden, d. h. unter Verwendung einer reversen Transkriptase und Bildung einer komplementären Kette mit einer DNA-Polymerase. In diesem Fall fehlen dem entstandenen Strukturgen die mit der Transkription verbundenen Steuerregionen.

Die DNA-Sequenz, die das die Nitrilase exprimierende Strukturgen enthält, kann mit einer Vielzahl anderer DNA-Sequenzen zur Einführung in eine entsprechende Wirtzelle verbunden werden. Die verbundene Sequenz hängt von der Art des Wirtes, der. Einführungsart der DNA-Sequenz in den Wirt und davon ab, ob episomale Erhaltung oder Integration gewünscht wird. Für prokaryotische Wirte gibt es eine Vielzahl von Vektoren, die zur Einführung durch Transformation, Konjugation, Transduktion oder Transfektion der DNA-Sequenz in einen prokaryotischen Wirt verwendet werden können. DNA-Sequenzen umfassen eine Vielzahl von Plasmiden, wie beispielsweise pBR322, pACYCI84, pMB9 oder pRK290, Cosmide, wie beispielsweise pVKIOO, oder Viren, wie beispielsweise P22.

Bei eukaryotischen Wirten können eine Vielzahl von Verfahren zur Einführung der DNA in den Wirt verwendet werden, wie Transformation mit Ca⁺⁺-ausgefällter DNA, worunter eine nichtreplikative DNA-Sequenz, ein Plasmid oder ein Minichromosom verstanden wird, Transormation mit einer T-DNA enthaltenden Sequenz in Agrobacterium, Mikroinjektion mit einer Mikropipette oder Elektroporation. Je nachdem, ob ein kompetentes Replikationssystem in der DNA-Konstruktion vorhanden ist, hängt es ab, ob die DNAalsepisomales Element repliziert oder in das Wirtgenom integriert wird und das Strukturgen im Wirt exprimiert wird. Episomale Elemente können verwendet werden, wie tumorinduzierende Plasmide oder deren Fragmente, beispielsweise Ti oder Ri, oder Viren oder deren Fragmente, beispielsweise CaMV oder TMV, die für den Wirt nicht letal sind und in denen das Strukturgen in solchen episomalen Elementen vorhanden ist, daß die Expression des Strukturgens möglich ist. Von besonderem Interesse sind Fragmente mit Replikationsfunktionen, denen andere Funktionen, wie Ontogenese oder Virulenz, fehlen. Die aus der Nitrilasequelle erhaltenen Fragmente.können unter Verwendung eines entsprechenden Kloniervektors geklont werden. Das Klonen kann in einem entsprechenden einzelligen Mikroorganismus, beispielsweise einem Bakterium, wie E.coli, durchgeführt werden. Zweckmäßigerweise wird ein Cosmid verwendet, in dem durch Teil- oder Vollabbau Fragmente der gewünschten Größe erhalten werden. So kann beispielsweise das Cosmid pVKIOO mit einem entsprechenden

Restriktionsenzym teilweise abgebaut und an Fragmente gebunden werden, die entweder aus dem Teil- oder Vollabbau eines Plasmids, Chromosoms oder deren Fragment entstanden sind. Verpacken gewährt, daß nur Fragmente der gewünschten Größe verpackt und in den Wirtorganismus transduziert werden.

Der Wirtorganismus kann wegen seiner Benzonitrilresistanz ausgewählt werden. Die aufnehmenden Stämme können modifiziert werden, um die entsprechenden genetischen Merkmale aufzuweisen, die eine Selektion derTransduktanten ermöglicht. Die Transduktanten können in Mikroorganismen zur Konjugation anderer Mikroorganismen verwendet werden, wobei gegebenenfalls ein Plasmid als Träger eingesetzt wird. Es können verschiedene Verfahren zur weiteren Verminderung der Größe der das Strukturgen für die Nitrilase enthaltenden Fragmente verwendet werden, beispielsweise kann der Cosmidvektor isoliert werden, mit einer Vielzahl von Restriktionsendonukleasen gespalten werden, beispielsweise mit EcoRI, Bg 11l oder Smal, die entstandenen Fragmente können in einem entsprechenden Vektor, zweckmäßigerweise mit dem vorher verwendeten Cosmidvektor, kloniert werden. Anstelle eines Cosmidvektors kann eine Vielzahl von Kloniervektoren kleiner Größe, wie pACYC177 oder pACYC184, eingesetzt werden. So können Fragmente von vorzugsweise unter etwa 5kb, im allgemeinen unter etwa4kb und insbesondere unter etwa 2 kb, geklont werden und Benzonitrilresistenz verleihen.

Zweckmäßigerweise hat das Fragment etwa 1 kb und unter etwa 5kb, vorzugsweise unter etwa 4kb und insbesondere mindestens etwa 1047bpund insbesondere einschließlich der flankierenden Regionen mindestens etwa 1100 bp und vorzugsweise unter etwa 1,5 kb. Von besonderem Interesse ist ein Bglll-Smal-Fragment aus Klebsiella ozaenae und insbesondere ein Pstl-Hincll-Fragment von etwa 1 210bp.

Die Nitrilase kann durch jede geeignete Quelle, sei sie prokaryotisch oder eukaryötisch, wie Bakterien, Hefe, Fadenpilzen oder Pflanzenzellen, exprimiert werden. Wo keine Sekretion stattfindet, kann das Enzym durch Lyse der Zellen und Isolieren der Nitrilase in an sich bekannter Weise gewonnen werden. Geeignete Verfahren sind beispielsweise Chromatographie, Elektrophorese oder Affinitätschromatographie. Zweckmäßigerweise kann Bromoxynil über eine entsprechende Funktion, beispielsweise die Carboxylgruppe, an einen unlöslichen Träger gebunden werden und so immobilisiert zur Gewinnung der Nitrilase verwendet werden.

Die spezifische Aktivität der erfindungsgemäßen Nitrilase beträgt mindestens etwa 0,1 μιηοΙ Ammoniak/min/mg Protein, im allgemeinen mindestens etwa 0,5 oder mehr unter den von Harper, „Biochem. J.", 167, S.685-692 (1977), beschriebenen Bedingungen.

Das gereinigte Enzym kann auf viele verschiedene Weisen verwendet werden. Es kann direkt in Untersuchungen auf Bromoxynil, loxynil oder anderen-verwandten Benzonitrilen eingesetzt werden. Andererseits kann das Enzym als Nachweisreagens in diagnostischen Versuchen verwendet werden, beispielsweise dadurch, daß es an ein interessierendes Produkt gebunden wird, beispielsweise ein Hapten, Antigen oder einen Antikörper (vgl. USA 3654090,3817837 und 3850752). Die Konjugationsverfahren sowie die Bestimmung der Konzentration des nachzuweisenden Produkts sind eingehend in diesen Patentschriften beschrieben.

Die die Nitrilase codierende DNA-Sequenz kann auf verschiedene Weisen verwendet werden, beispielsweise zur Isolierung des Wild-Typs oder von mutierten Nitrilasen. Andererseits kann die DNA-Sequenz zur Integration durch Rekombination in einen Wirt verwendet werden, wodurch der Wirt Benzonitrilresistenz erhält.

Bei Pflanzenzellen kann das Strukturgen als Teil einer Konstruktion in einen Pflanzenzellkern durch Mikropipetteninjektion zur Integration durch Rekombination in das Wirtgenom eingeführt werden. Andererseits kann man Elektroporation verwenden, in die das Strukturgen zur Einführung in einen Pflanzenwirt eingebracht wird. Wurde das Strukturgen aus einer Quelle erhalten, die regulatorische Signale aufweist, die von dem Pflanzenwirt nicht erkannt werden, kann es notwendig sein, entsprechende regulatorische Signale für die Expression einzuführen. Wird ein Virus oder Plasmid, beispielsweise ein tumorinduzierendes Plasmid, verwendet und wurde es kartiert, so kann eine abwärts vom Promotor liegende Restriktionsstelle ausgewählt werden, in die das Strukturgen in einer geeigneten Entfernung vom Promotor eingeführt werden kann. Weisen die DNA-Sequenzen keine entsprechende Restriktionsstelle auf, so können sie mehrere Male mit einer Exonuklease, wie Bal31, abgebaut und eine synthetische Restriktionsendonuklease-Stelle (linker) eingebaut werden.

Von besonderem Interesse ist die Verwendung eines tumorinduzierenden Plasmids, beispielsweise Ti oder Ri, mit dem das Nitrilasegen in Pflanzenzellenchromosome eingeführt werden kann. Die Verwendung von Ti- und Ri-Plasmiden ist in PCT-A-W084/02913,02919 und 02920 sowie EP-A-0116718 sowie von Matzke und Chilton in „J. MoI. App. Genetics", 1, S. 39-49 (1981), beschrieben.

Bei Verwendung des rechten Endes oder beider Enden der T-DNA, die an eine Expressionscassette angrenzen, die das Nitrilase-Strukturgen unter der Kontrolle der für die Transkription und Translation regulatorischen Signale für den Anfang und das Ende, die von dem Pflanzenwirt erkannt werden, enthält, kann die Expressionscassette in das Pflanzengenom eingebaut werden und die Expression der Nitrilase in der Pflanzenzelle bei verschiedenen Entwicklungsstufen hervorrufen.

Es können verschiedene Konstruktionen zur Expression in Pflanzenzellen hergestellt werden, die eine Expressionscassette zur Verfügung stellen, die in Pflanzen für die Expression der Nitrilase im Pflanzenwirt verantwortlich ist.

Für die Transkription kann eine Vielzahl von Transkriptions-Initiationsregionen (Promotorregionen), die entweder konstitutiv oder induzierbar sind, verwendet werden.

Die Transkriptions-Initiationsregion ist an das die Nitrilase codierende Strukturgen gebunden, und zwar zur Initiation der Transkription aufwärts des Initiationscodons, normalerweise innerhalb etwa 200 Basen des Initiationscodons, dort, wo der nichttranslatierten 5'-Region ein ATG fehlt.

Das 3'-Ende des Strukturgens enthält ein oder mehrere Stop-Codons, die an eine im Pflanzenwirt funktionell Transkriptionsterminationsregion gebunden sind, wobei diese Terminationsregion mit den gleichen oder verschiedenen Strukturgenen wie die Anfangsregion verbunden sein kann.

Die Expressionscassette weist in Richtung der Transkription die Initiationsregion, das unter der Transkriptionskontrolle der Initiationsregion befindliche Strukturgen und die Terminationsregion auf, die für das Transkriptionsende und die Herstellung der Boten-RNA verantwortlich ist.

Als Transkriptions- und Translations-Steuerregionen können zweckmäßigerweise Pin-Promotor- und -Terminatorregionen verwendet werden, die die konstitutive Expression des Nitrilasegens gestatten. Andererseits können auch andere Promotoren und/oder Terminatoren verwendet werden, insbesondere Promotoren, die eine induzierbare Expression oder eine gesteuerte

Expression in einem Pflanzenwirt ermöglichen. Geeignete Promotorregionen aus dem Ti-Plasmid umfassen Opinpromotoren, wie Octopin-Synthetase-Promotor, Napolin-Synthetase-Promotor, Agropin-Synthetase-Prtomotor oder Manopin-Synthetase-Promotor. Andere Promotoren sind Virus-Promotoren, wie der CaMV-Region-VI-Promotor oder der Promotor mit der vollen Länge (35S), die mit den Ribulose-1,5-bis-phosphat-carboxylatgenen verbunden sind, beispielsweise die kleine Untereinheit, Gene, die mit Phaseoiin assoziierten Promotoren, Proteineinlagerungen, ß-Conglycinin oder Cellulosebildung assoziiert sind. Die verschiedenen Sequenzen können in an sich bekannter Weise miteinander verbunden werden. Die Promotorregion kann durch die 5'-Region des Strukturgens identifiziert werden, beispielsweise des Opingens, und durch Restriktionskartierung und -Sequenzierung selektiert und isoliert werden. Entsprechend kann die Terminatorregion als 3'-Region des Strukturgens isoliert werden. Die Sequenzen können geklont und in der richtigen Orientierung verbunden werden, um so die konstitutive Expression des Nitrilasegensin einem Pflanzenwirt zu ermöglichen.

Durch Modifizierung von Ertragspflanzenzellen durch Einführung eines funktionellen Gens, das die Nitrilase- exprimiert, können Bromoxynil, loxynil oder analoge Herbicide bei einer Vielzahl von Ertragspflanzen bei Konzentrationen verwendet werden, die die vollständige oder fast vollständige Entfernung von Unkraut gewährleistet und die Ertragspflanzen unbeeinträchtigt läßt. Auf diese Weise können beachtliche Einsparungen erreicht werden, da Düngemittel und Wasser wirkungsvoller verwendet und die nachteiligen Wirkungen, die sich durch die Anwesenheit von Unkraut ergeben, vermieden werden. Die die Nitrilase exprimierende Expressionscassette kann in eine Vielzahl von Pflanzen eingeführt werden, sowohl in einkeimblättrige wie in zweiblättrige Pflanzen (Monocotyledone und Dicotyledone), wie Mais, Getreide, Sojabohnen, Tabak, Baumwolle, Tomaten, Kartoffeln, Brassica-Arten, Reis, Erdnüsse, Petunien, Sonnenblumen, Zuckerrüben oder Rasen. Die Gene können in Zellen oder Pflanzenteilen vorhanden sein, wie Kallus, Gewebe, Wurzeln, Knollen, Ablegern, Pflänzchen, Samen, Blättern, Stecklingen oder Pollen.

Dadurch, daß die Pflanzen benzonitrilresistent sind, können viele Formulierungen zum Schutz der Ertragspflanzen vor Unkraut verwendet werden, um das Wachstum der Ertragspflanzen zu erhöhen und den Wettbewerb um Nährstoffe zu verringern. So kann Bromoxynil allein zur Nachkontrolle des Unkrauts bei behandelten Erntepflanzen wie Sonnenblumen, Sojabohnen, Getreide oder Baumwolle, oder in Kombinationspräparaten mit anderen Produkten verwendet werden. In den Präparaten werden herkömmliche Mengen an Pestiziden auf die Felder aufgebracht, d.h. etwa 0,045 bis 1,8 und vorzugsweise 0,09 bis 0,9g/0,4047ha (0,1 bis 4 und vorzugsweise 0,2 bis 2 Ib/acre) Bromoxynil, wo andere Herbizide in Mengen von etwa 0,045 bis 1,8g/0,4047ha (0,1 bis4lb/acre) Wirkstoff aufgebracht werden. Die Präparate können andere Zusatzstoffe, wie Reinigungsmittel, Hilfsstoffe, Sprühhilfsmittel, Klebstoffe oder Stabilisatoren, enthalten. Die Präparate können Naß- oder Trockenpräparate sein, wie fließfähige Pulver, emulgierbare und flüssige Konzentrate, wie an sich bekannt. Herbicide Lösungen können in bekannter Weise angewendet werden, beispielsweise durch Sprühen, Berieseln oder Zerstäuben.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert

Materialien und Methoden

Restriktionsenzyme und T4-Ligase für die Verknüpfungen wurden nach den Anweisungen der Hersteller angewendet. Das Klonieren und die Molekularanalyse wurden in Standardverfahren gemäß Maniatisetal in „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982), durchgeführt. Die Klonanalyse wurde gemäß Ish-Horowitz et al, „Nucl. Acids Res.", 9, S.2989-2998 (1981), durchgeführt.

Der E. coli-Stamm MM 294 wurde für alle Klonierungsversuche verwendet (Hanahan in „Mol. Biol.", 1966, S.557-580 [1983]). Antibiotika wurden in folgenden Mengen verwendet:

Cm (Chloramphenicol): 25μg/ml; Tc (Tetracyclin): ΙΟμς/ΐηΙ; Ap (Penicillin): 300μιτ^/ηηΙ.

Die Transformationen der Plasmid-DNA in E. coli wurden gemäß Mandel und Higain „J. Mol. Biol.", 53, S. 159-162 (1970), durchgeführt.

Bakterien aus einer mit Bromoxynil verunreinigten Bodenprobe wurden isoliert und selektiert. Ein solcher Organismus war Klebsiella pneumoniae, Unterart ozaenae. Durch Teilreinigung und Charakterisierung der für Bromoxynil spezifischen Nitrilase aus diesem Organismus wurde ein Enzym mit einer Scheinmolekülmasse von 34kDal erhalten.

Nach wiederholtem Kultivieren von K. ozaenae auf festem L-Agar wurde eine Variante isoliert, die nicht mehr fähig war, Bromoxynil als einzige Stickstoffquelle zu verwerten, wenn sie in einem Flüssigmedium gezüchtet wurde, das je Liter 1,5 g KH₂PO₄,3,5g K₂HPO₄,0,1 g MgSO₄ · 7H₂O, 50mg Hefeextrakt, 0,1 % Citrat, Glycerin und Succinat und Spurenelemente enthielt (Barnett und Ingraham in „J. Appl. Bacteriol", 18, S. 131-143 [1975]). Dieses Medium ist als YETE-Multimedium bekannt, es enthielt 0,05% Bromoxynil. Obwohl dieser Organismus das Bromoxynil als einzige Stickstoffquelle nicht verwertete, konnte er bis zur vollen Dichte in L-Brühe mit 0,05% Bromoxynil gezüchtet werden. Eine K. ozaenae-Variante wurde selektiert und in 10 ml L-Brühe gezüchtet. Es wurden drei unabhängige K. ozaenae-Kolonien aus einer Bromoxynil enthaltenden LB-Platte gewählt und unter den gleichen Bedingungen gezüchtet. Diese vier K. ozaenae-Kolonien wurden gleichzeitig in 10ml 0,05% Bromoxynil enthaltender L-Brühe gezüchtet. Die Kulturen wurden bis zur vollen Dichte bei 30⁰C gezüchtet, aus jeder Kultur wurde gemäß Ish-Horowitz et al in „Nucl. Acids Res.", 9, S. 2989 (1981) Plasmid-DNA hergestellt. Nichtverdaute Plasmid-DNA wurden auf einem 0,5%igen Agarosegel der Elektrophorese unterworfen, die Plasmidstreifen wurden durch Anfärben mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht.

Die K. ozaenae-Variante zeigte eine einzige Plasmidart (Größe: 68 kb), die mit und ohne Bromoxynil entstand. Die drei K. ozaenae-Kolonien zeigten eine größere Plasmidart (90 kb), wenn sie in Gegenwart von 0,05% Bromoxynil gezüchtet wurden. In Abwesenheit von Bromoxynil waren beide Plasmidformen in zwei der drei K. ozaenae-Kolonien vorhanden. Das deutet auf eine Umwandlung der größeren Plasmidarten zu kleineren Formen unter gleichzeitigem Verlust von etwa 22 kb Plasmid-DNA, wenn die Bromoxynilselektion aufgehoben wird.

Alle vier Kolonien wurden in 200 ml 0,05% Bromoxynil enthaltender L-Brühe gezüchtet. Die Zellen wurden in einerfranzösischen Presse aufgebrochen, die Überstände nach dem Hochgeschwindigkeitszentrifugieren wurden gegen einen Puffer dialysiert, der 0,05mol/l Kaliumphosphat, pH7,5, und2,5mmol/l Dithiothreit (DTT) enthielt. Die einzelnen Rohextrakte wurden auf bromoxynilspezifische Nitrilaseaktivität untersucht. Ein Rohextrakt aus der K. ozaenae-Variante, enthielt keine nachweisbare Nitrilaseaktivität, wogegen die anderen K. ozaenae-Rohextrakte spezifische Nitrilaseaktivitäten von 0,124,0,105 bzw. 0,143 μιηοΙ NH₃/min/mg Protein aufwiesen. 200ml Zellen wurden bei 30⁰C bis zur mittleren Log-Phase in M9-Medium, das 0,1 % Glucose und 0,04% Bromoxynil enthielt, gezüchtet (Miller in „Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, 1972). Die Rohextrakte wurden durch Aufbrechen der Zellen, Ultrazentrifugieren und Dialyse des Überstands in Puffer, der 0,05 mol/l Kaliumphosphat, pH7,5, und 2,5 mmol/l DTT enthielt, gewonnen. Die Substratkonzentration betrug 3 mmol/l Bromoxynil in allen Versuchen. Die Freisetzung von Ammoniak wurde gemäß Harper in „Biochem. J.", 167, S. 685-692 (1977), überwacht. Die Fähigkeit der K. ozaenae-Variante in Bromoxynil enthaltender L-Brühe zu wachsen, kann zu einer Undurchlässigkeit des Organismus für diese Komponente führen. Der Organismus kann jedoch in bestimmten Medien unter Verwertung von Bromoxynil als einzige Stickstoffquelle nicht wachsen.

Zusammenfassend scheint die K. ozaenae-Nitrilase im Plasmid codiert zu sein. Das (die) das Enzym codierende(n) Gen(e) scheint auf einem 22 kb-Plasmid-DNA-Segment lokalisiert zu sein, das spontan aus dem K. ozaenae-Plasmid in Abwesenheit der Bromoxynil-Selektion verlorengeht.

Die Bromexynil-spezifische Nitrilase aus K. ozaenae wird in E. coli exprimiert.

Unter 0,05% Bromoxynilselektion gezüchtete Plasmid-DNA aus K. ozaenae wurde gewonnen, die DNA wurde in den E. coli-Stamm MM 294 (thi, gyrA96, endl", hdsR17) transformiert. Die Transform ante η wurden auf einem stickstoffarmen (N") festen Agarose-Minimalmedium, das je Liter 1,5g KH₂PO₄,3,5g K₂HPO₄,0,1 g MgSO₄ · 7H₂O und 0,1 % Glucose enthielt, unter Zugabe von 0,05% Bromoxynil als einzige Stickstoffquelle selektiert. Nach Stägiger Inkubation erschienen 10 Kolonien auf den Selektionsplatten. Diese Kolonien wurden auf L-Agar-Platten, die 0,05% Bromoxynil enthielten, wieder aufgestrichen und auf die Anwesenheit des auxotropen Thiaminmarkers in MM 294 untersucht. Keine der Kolonien wuchs in dem Minimalmedium in Abwesenheit von Thiamin, was darauf hinweist, daß der Stamm E. col! MM 294 ist. Alle Kolonien wuchsen in M9-Medium, dem Thiamin und 0,05% Bromoxynil als einzige Stickstoffquelle zugegeben wurden. Kein Wachstum wurde in diesem Medium in Abwesenheit von Bromoxynil beobachtet. Zwei der Kolonien wurden fürweitere Analysen ausgewählt. Rohextraktpräparate aus E. coli MM 294, die das 90kb-Plasmid enthielten, wurden auf bromoxynilspezifische Nitrilaseaktivität untersucht; dabei wurde eine spezifische Aktivität von 216μητιοΙ freigesetztem NH₃/min/mg erhalten. E. coli MM 294, die das kleinere Plasmidenthielten, zeigten keine nachweisbare Nitrilaseaktivität. Das größere 90kb-Plasmid in E. coli wurde mit pBrxi, das kleinere (68kb) Plasmid mit pBrxiA bezeichnet.

Zur Bestätigung, daß der E. coli-Stamm MM 294, der das Plasmid pBrxi enthält, den richtigen Metabiliten als Folge der bromoxynilspezifischen Nitrilasereaktion erzeugt, wurde eine 2-ml-MM 294-Kultur (pBrxi) 24 Stunden bei 30⁰C in einem M9-Medium, dem 0,05% Bromoxynil zugegeben wurde, gezüchtet. Eine Probe des Kulturfiltrats wurde auf einer C₁S-Hochdruckflüssigchromatographie-Säulechromatographiert. Die Gesamtmenge an dem Kulturfiltrat zugegebenem Bromoxynil wurde zu einem neuen Metabilitgipfel umgewandelt. Der Metabolitgipfel wurde durch Spektralanalyse als 3',5'-Dibrom-4-hydroxybenzoesäure (DBHB) identifiziert. Das heißt, daß das Produkt der bromoxynilspezifischen, plasmidcodierten Nitrilaseexpression in E. coli das gleiche ist wie das von K. ozaenae

Das bromoxynilspezifische Nitrilasegen wird in E. coli geklont.

Um festzustellen, ob das DNA-Segment, das das bromoxynilspezifische Enzym codiert, in E. coli klonierbar ist, wurde das Plasmid pBrxi mit BamHI verdaut, es entstanden zwei Streifen von 53kb bzw. 37 kb. Die BamHI-Fragmente wurden in die BamHI-Stelle des E. coli-Plasmidvektors pACYC 184 (Chang und Cohen in „J. Bacteriol.", 134, S. 1141 [1978]), eingebunden und in den E. coli-Stamm MM 294 transformiert. Das Klonen in die BamHi-Stelle von pACYC 184führt zu einer Insertions-Inaktivierung desTetracyclinresistenzgens. Zehn chloramphenocolresistente, tetracyclinempfindliche MM294-Kolonien wurden ausgewählt, durch Minipräparations-Klonanalyse wurde DNA hergestellt und mit BamHI verdaut. Vier Klone enthielten das 37-kb-BamHI-Fragment, wogegen nur ein Klon das größere 53-kb-BamHI-DNA-Fragment von pBrxi enthielt. Fünf Klone enthielten ein geklöntes BamHI-Fragment, das auch im Plasmid pBrx1 Δ gefunden wurde und dem DNÄ-Segment entspricht, das nach spontaner Deletion von 22 kbder Plasmid-DNA aus pBrxi zurückbleibt. Alle zehn Klone wurden in 200 ml L-Brühe in Anwesenheit von 20μg/ml Chloramphenicol (zur Selektion des Plasmids) gezüchtet, die erhaltenen Rohextraktpräparate wurden auf bromoxynilspezifische Nitrilaseaktivität untersucht. Vier Klone, die das 37-kb-BamHI-Fragment enthielten, zeigten spezifische Nitrilaseaktivität im Bereich von 0,140μιτιοΙ freigesetztem NH₃/min/mg Protein, wogegen in den anderen sechs Klonen keine Nitrilaseaktivität nachgewiesen werden konnte. Diese Ergebnisse zeigen, daß das eine bromoxynilspezifische Nitrilaseaktivität nachgewiesen werden konnte. Diese Ergebnisse zeigen, daß das eine bromoxynilspezifische Nitrilaseaktivität codierende Gen auf einem37-kb-BamHI-Fragment lokalisiert ist,.das aus dem Plasmid pBrxi kloniert wird, und daß das 22-kb-DNA-Segment, das spontan in Abwesenheit der Bromoxynilselektion verloren geht, sich innerhalb des 37-kb-BamHI-Fragments befindet. Um die Orientierung der BamHI-Fragmente in bezug auf den Vektor pACYC 184 zu bestätigen, wurde DNA aus den oben angegebenen vier Klonen mit EcoRI abgebaut und auf einem 0,07%igem Agarosegel der Elektrophorese unterworfen. Auch ein kombiniertes EcoRI-Abbauprodukt der Plasmide pBrxi und pBrxiA wurde analysiert.

Beide Orientierungen des 37 kb-BamHI-Fragments in bezug auf den Vektor pACYC 184 wurden bestimmt und mit Plasmid pBrx2 bzw. pBrx3 bezeichnet. Es wurde festgestellt, daß die drei EcoRI-Fragmente sich innerhalb des 22kb-DNA-Segments befinden, das spontan aus den Plasmiden pBrx2 und pBrx3 deletiert wird. Die Größe dieser EcoRI-Fragmente beträgt 18,3 bzw. 1,9 kb. Das die bromoxynilspezifische Nitrilase codierende Gen befindet sich vermutlich auf einem dieser drei EcoRI-Fragmente, vorausgesetzt, das Nitrilase-Strukturgen wird nicht durch eine EcoRI-Restriktionsstelle in zwei Teile geteilt. Die Lokalisierung der bromoxynilspezifischen Ntrilase von E. coli (pBrx3) wurde untersucht, die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1

Die bromoxynilspezifische Nitrilase ist ein periplasmatisches Enzym in E. coli

Kulturbedingungen^a

spezifische Nitrilaseaktivität

toluolbehandeite Zellen (L-Brühe)

lysozymbehandelte Zellen (L-Brühe)

Gesamtzellen (L-Brühe) Gesamtzellen (L-Brühe + Brx1) Gesamtzellen (M 9) Gesamtzellen (M9 + BrxD Gesamtzellen/pACYC184(M9)

0,829

0,796 0,770 1,25

0,950 1,45

a pBrx3-Plasmid enthaltende E. coli-Zellen (WIM 294) wurden bis zur stationären Phase in 5-ml-Kultiiren bei 30°C in dem angegebenen Medium gezüchtet. Die Kulturen enthielten 2(^g/ml Chloramphenicol und 0,04% Bromoxynil (Brx 1), wo angegeben. 1 ml aus jeder Kultur wurde gesammelt, einmal mit Nitrilasepuffer (0,1 mol/l Kalium phosphat, pH 7,5) gewaschen, die Zellen wurden in 0,1 ml dieses Puffers wieder suspendiert. 50-pl-Proben wurden gemäß Ha'rper in „Biochem. J.", 167, S. 685-692 (1977), mit und ohne 3mmol/l Bromoxynil als Substrat untersucht.

b μΜοΙ NH₃/min/mg. Das Protein wurde an Hand der optischen Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀) bestimmt: 1,4= 10⁹ Zellen/ml = 150μg.

Tabelle 1 zeigt, daß die Nitrilase im periplasmatischen Raum der Zelle lokalisiert ist. Außerdem wurde festgestellt, daß das Enzym in Abwesenheit von Bromoxynil im Medium exprimiert wird, was darauf hindeutet, daß für die Enzymexpression keine Bromoxynilinduktion notwendig ist.

Weitere Reinigung der bromoxynilspezifischen Nitrilase.

Die weitere Reinigung der Nitrilase aus K. ozaenae wurde mit folgenden Ergebnissen durchgeführt:

Tabelle 2

Reinigung der bromoxynilspezifischen Nitrilase'aus E. coli (Ausgangsmaterial: 6g Zellen)

Fraktion	Volumen	Protein	μιτιοΙ NH₃/min	spez. Aktivität¹¹
Roh^a	100 ml	210 mg	18,15	0,086
35-50%
NH₄SO₄	6 ml	83 mg	26,77	0,250
DEAE-
Sephadex	56 ml	19mg	15,52	0,820

^a Die Zellen wurden bei 30°C bis zur mittleren Log-Phase in M 9-Medium, das 0,04% Bromoxynil und Glucose enthielt, gezüchtet. Die Rohextrakte wurden durch Aufbrechen der Zellen, Ultrazentrif ugieren und Dialyse in Puffer gewonnen, der 0,05 mol/l Kaliumphosphat, pH 7,5, und 2,5 mmol/l DTTenthielt. Die Substratkonzentration betrug 3mmol/l in allen Nitriiaseversuchen.

^b μΜοΙ NH₃/min/mg.

Eine 2,5cm² χ 10cm große Säule wurde in.Puffer, der 0,05 mol/1 Kaliumphosphat, pH 7,5,2,5mmol/l DTT und 1 mmol/l EDTA enthielt, äquilibriert. Die Probe wurde aufgebracht, die Säule wurde mit 300 ml eines linearen Gradienten von 0,02 bis 0,40 mol/l NaCI in dem oben angegebenen Puffer entwickelt. Am Ende des Gradienten wurde 1 mol/l NaCI enthaltender Puffer aufgegeben. Es wurden 5-ml-Fraktionen gesammelt, 0,075-ml-Proben wechselnder Fraktionen wurden auf Nitrilaseaktivität untersucht. Ein einziger Gipfel mit Enzymaktivität wurde bei 0,22 mol/l Salz eluiert. Etwa 75% der aufgegebenen Nitrilaseaktivität wurde in den aktiven Fraktionen wieder gewonnen.

Die die Nitrilaseaktivität enthaltenden Fraktionen aus der DEAE-Säule wurden gegen 0,02 mol/l Kaliumphosphat, pH 7,5, αϊΒίνβϊβΓί,δΟμΙ (6μg Protein) jeder Fraktion wurden auf 11,25%iges denaturiertes Lämmli-Gel aufgegeben. Der mit Protein angereicherte Streifen, der der Aktivität aus der DEAE-Säule entspricht, ist ein Polypeptid mit einer Molekülmasse von 34000. Aus den aktiven Fraktionen aus der Säule konnten keine weiteren Polypeptide angereichert werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß die bromoxyniispezifische Nitrilase ein Polypeptid mit einer Molekülmasse von etwa 34000 und vermutlich das Produkt eines einzigen Gens ist.

Der Klon pBrx2 wurde vollkommen mit EcoRI abgebaut, es wurde ein Fragment von etwa 19kb isoliert. Das Fragment wurde in den mit EcoRI verdauten Vektor pACYC 184 (3,9 kb) zu dem Plasmid pBrx5 eingebaut, das wie oben beschrieben in E. coli transformiert wurde. Das Plasmid wurde in an sich bekannter Weise isoliert und mit BgIII zu einem etwa 6,7kb-Fragment verdaut, das im Vektor pACYC 184 eingebaut blieb. Das isolierte Plasmid pBrx7 wurde dann mitSmal und BgIII zu einem Fragment mit etwa 3,9 kb abgebaut, das in das mit Smal-BamHI verdaute pACYC 177 (3,7 kb) eingebaut wurde (Chang und Cohen in „J. Bacteriol.", 134, S. 1141-1156 [1978]). Das entstandene Plasmid, das Penicillinresistenz aufwies, wurde wie oben beschrieben, in E. coli transformiert, die Transformanten wurden auf einem Penicillinselektionsmedium zu dem Plasmid pBrx8 selektiert, das das Nitrilasegen auf einem 3,9 kb-Fragment trägt.

pBrx8 wurde teilweise mit Pstl abgebaut, die Fragmente wurden in ein mit Pstl verdautes pUC 18 eingebracht (vgl. Yanisch-Perron et al in „Gene", 33, S. 103-119 [1985]). Die entstandenen Plasmide wurden in E. coli geklont und auf Nitrilaseaktivität untersucht. Ein Klon wies ein 5,3kb-Plasmid pBrx9 auf, das isoliert und weiter mit Pstl undHinclIzu einem 1210 bp-Fragment abgebaut wurde, das in Richtung von Pstl zu Hindi, CIaI-, Sail-, Seal- und Sphl-Restriktionsstellen in relativ gleichmäßigen Abständen aufwies. Das Pstl-Hincll-Fragment wurde gemäß Sanger et al in „Proc. Nat. Acad. Sei. USA", 74, S. 5463-5468 (1977), sequenziert. Die erhaltene Sequenz (mit den entsprechenden codierten Aminosäuren) ist in den folgenden Tabellen angegeben.

95 125

ATG GAC ACC ACT TTC AAA GCA GCC GCT GTT CAG GCC GAA CCG GTA TGG ATG GAT GCC GCT

Met Asp Thr Thr Phe Lys Ala Ala Ala VaI Gin Ala GIu Pro VaI Trp Met Asp Ala Ala

155 . 185

GCA ACA GCC GAT AAG ACC GTG ACG CTA GTA GCT AAA GCC GCA GCG GCT GGC GCG CAG CTC

Ala. Thr Ala Asp Lys Thr VaI Thr Leu VaI Ala Lys Ala Ala Ala Ala GIy Ala Gin Leu

215 245

GTC GCA TTT CCC GAA TTG TGG ATT CCG GGC TAC CCA GGA TTC ATG CTC ACG CAC AAC CAA

VaI Ala Phe Pro GIu Leu Trp He Pro GIy Tyr Pro GIy Phe Met Leu Thr His Asn Gin

275 305

ACC GAA ACC CTA CCA TTC ATC ATT AAA TAC CGC AAG CAG GCA ATC GCC GCC GAT GGA CCA

Thr GIu Thr Leu Pro Phe lie lie Lys Tyr Arg Lys Gin Ala lie Ala Ala Asp GIy Pro

335 365

GAA ATC GAA AAA ATT CGC TGC GCG GCT CAG GAG CAT AAC ATT GCG CTC TCC TTT GGG TAC

GIu He GIu Lys He Arg Cys AIa ' Ala Gin GIu His Asn He AIa Leu Ser Phe GIy Tyc

395 425

AGC GAA CGG GCT GGC CGT ACG CTC TAC ATG TCA CAA" ATG CTT ATC GAT GCC GAT GGC ATC

Ser GIu Arg Ala GIy Arg Thr Leu Tyr Met Ser GIn Met Leu lie Asp Ala Asp GIy He

. 455 ' 485

ACC AAA ATT CGT CGT CGA AAG CTC AAA CCA ACC CGC TTT GAA CGA GAA CTC TTT GGC GAA

Thr Lys He Arg Arg Arg Lys Leu Lys Pro Thr Arg Phe GIu Arg GIu Leu Phe GIy GIu

515 545

GGT GAC GGA TCG GAC TTA CAG GTC GCC CAA ACT AGC GTT GGT CGG GTG GGT GCC CTC AAC

GIy Asp GIy Ser Asp Leu Gin VaI Ala GIn Thr Ser VaI GIy Arg VaI GIy AIa Leu Asn

575 605

TGC GCG GAG AAT TTG CAG TCG CTA AAC AAG TTT GCG CTT GCT GCC GAG GGT GAA CAG ATA

Cys Ala GIu Asn Leu GIn Ser Leu Asn Lys Phe AIa Leu Ala Ala GIu GIy GIu Gin He

635 665

CAT ATC TCC GCC TGG CCA TTC ACG CTT GGA AGC CCT GTG CTC GTC GGA GAC TCC ATC GGC

His He Ser AIa Trp Pro Phe Thr Leu GIy Ser Pro VaI Leu Vai GIy Asp Ser He GIy

695 ' 725

GCC ATC AAC CAG GTC TAC GCG GCC GAG ACG GGG ACC TTC GTT CTC ATG TCG ACG CAG GTG

Ala He Asn Gin VaI Tyr Ala Ala GIu . Thr GIy Thr Phe VaI Leu Met Ser Thr Gin VaI

755 785

GTT GGA CCG ACC GGC ATC GCC GCC TTC GAG ATC GAA GAC AGG TAC AAC CCG AAT CAG TAT

VaI GIy Pro Thry GIy lie Ala Ala Phe GIu He GIu Asp Arg Tyr Asn Pro Asn GIn Tyr

815 845

CTT GGT GGT GGG TAC GCG CGG ATC TAC GGG CCT GAC ATG CAG TTG AAG AGC AAG TCG TTG

Leu GIy GIy GIy Tyr AIa Arg He Tyr GIy Pro Asp Met GIn Leu Lys Ser Lys Ser Leu

875 905

TCA CCG ACC GAA GAG GGC ATC GTC TAC GCC GAG ATC GAC CTG TCG ATG CTT GAG GCA GCA

Ser Pro Thr GIu GIu GIy lie VaI Tyr Ala GIu lie Asp Leu Ser Met Leu GIu Ala AIa

935 965

AAG TAC TCG CTC GAT CCC ACG GGC CAC TAT TCG CGC CCT GAT GTG TTC AGC GTG TCG ATT

Lys Tyr Ser Leu Asp Pro Thr GIy His Tyr Ser Arg Pro Asp VaI Phe Ser VaI Ser He

995 1025

AAC CGG CAA CGG CAG CCT GCG GTG TCA GAA GTT ATC GAC TCA AAC GGT GAC GAG GAC CCG

Asn Arg GIn Arg GIn Pro Ala VaI Ser GIu VaI He Asp Ser Asn GIy Asp GIu Asp Pro

' . 1055 1085

AGA GCA GCA TGC GAG CCC GAC GAG GGG GAT CGT GAG GTC GTA ATC TCT ACG GCA ATA GGG

Arg Ala AIa Cys GIu Pro Asp GIu GIy Asp Arg GIu VaI VaI He Ser Thr Ala lie GIy

GTT CTA CCC CGT TAT TGC GGA CAT TCC .

VaI Leu Pro Arg Tyr Cys GIy His Ser

Das Pstl-Hincll-Fragment, das praktisch frei von 5'- und 3'-nichtcodierenden flankierenden Regionen ist, kann mit EcoRI-Linkern verbunden'und mitEcoRI verdaut werden, es ist dann fertig, um in eine Pflanzenexpressionscassette durch Insertion in die EcoRI-Stellevon pCGN451 eingeführt zu werden.

pCGN451 umfaßt eine Octopin-Cassette, die etwa 1 566bp der 5'-nichtcodierenden Region, die über einen EcoRI-Linkeran das 3'-Ende des Gens fusioniert ist, und etwa 1349bpder3'-nichtcodierenden DNA enthält. Die pTI-Koordinaten betragen 11207 bis 12823 für die 3'-Region und 13643 bis 15208 für die 5'-Region (wie definiert von Öarkeret al in „Plant Molecular Biology", 2, S.335 (1983). Das 5'-Fragment wurde wie folgt erhalten: Ein kleines, untergeklontes, das 5'-Ende der.codierenden Region enthaltende Fragment, wie ein BamHI-EcoRI-Fragment, wurde in pBr 322 als Plasmid pCGN407 gekiont. Das BamHI-EcoRI-Fragment hatte eine Xmnl-Stelle in der codierenden Region, während pBr322 zwei Xmnl-Stellen aufwies. pCGN 407 wurde mit Xmnl abgebaut und mit Bal31-Nuklease zerschnitten, den Fragmenten wurden EcoRI-Linker zugegeben. Nach dem Abbau mitEcoRI und Bam HI wurden die Fragmente der Größe nach fraktioniert, die Fraktionen wurden geklont und sequenziert. In einem Fall wurden die gesamte codierende Repion und 10bp der 5'-nichttranslatierten Sequenzen entfernt, wobei die 5'-nichttranskribierten Region, diemRNA-Überlappungbstelleund 16bpder5'-nichttranslatierten Region (zu einer BamHI-Stelle) intakt zurückblieben. Dieses kleine Fragment wurde durch Größenfraktionierung auf einem 7%igen Acrylamidgel erhalten, etwa 130bp lange Fragmente wurden eluiert. Diese der Größe nach fraktionierte DNA wurde in M13mp9 eingebunden, es wurden verschiedene Klone sequenziert; die Sequenz wurde mit der bekannten Sequenz des Octopin-Synthetasegens verglichen. Die

M 13-Konstruktion wurde mit ρ 14 bezeichnet. Das Plasmid wurde mit BamHI und EcoRI zu einem kleinen Fragment abgebaut, das an ein Xhol-BamHI-Fragment, das aufwärts 5'-Sequenzen von pTiA6 (Garfinkel und Nester in „J. Bacteriol.", 144, S.732 [1980]) enthielt,und an ein EcoRI-Xhol-Fragment, das die 3'-Sequenzen enthielt, gebunden.

Das entstandene Xhol-Fragment wurde in die Xhol-Stelle eines pUC8-Derivats mit Bezeichnung pCGN426 geklont. Dieses Plasmid unterscheidet sich von pUC8 durch die einzige EcoRI-Stelle, die mit DNA-Polymerase I ausgefüllt ist, und durch den Verlust der Pstl- und Hindlll-Stellen durch Nukleaseverunreinigung der Hincll-Restrictionsendonuklease, wenn ein Xhol-Linker in die einzige Hincll-Stelle von pUC8 eingebaut wird. Das entstandene Plasmid pCGN451 hat eine einzige EcoRI-Stelle für die Insertion der proteincodierenden Sequenzen zwischen der 5'-nichtcodierenden Region (die 1 550 bp der ö'-nichttranskribierten Sequenz einschließlich des rechten Rands der T-DNA, der mRNA-Überlappungsstelle und 16bp der 5'-nichttranskribierten Sequenz enthält) und der 3'-Region, die 267bp der codierenden Region, das Stop-Codon, 196bp der 3'-nichttranslatierten DNA, die polyA-Stelle und 1153bp der 3'-nichttranskribierten Sequenz enthält.

Das Xhol-Fragment, das die Octopin-Synthetase-(ocs)-Cassette enthielt, wurde in das Plasmid pCGN 517 eingebaut, das Tetracyclinresistenz-und Kanamycinresistenzgene aufwies. pCGN517 wurde aus pHC79 (Hohn in „Gene", 11,S.291 [1980]) durch Einführen in die einzige Pstl-Stelle des Kanr-Gens aus pUC4K (Vieira in „Gene", 19, S.259 [1982]) hergestellt. pCGN517 wurde mit Sail abgebaut, das Xhol-Fragment wurde in die einzige Sall-Stelle eingebaut.

Das Xhol-Fragment wurde auch in ein zweites Plasmid pCGN 529 eingebaut. pCGN 529 wurde aus pACYC 184 durch Insertion des Kanr-Gens aus Tn 5 hergestellt (Rothstein et al, in „Movable Genetic Elements", S.99, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York, [1981 ]); ein Bglll-Fragment von 2,4kb aus pRiA4-T-DNA (White und Nester in „J. Bacteriol.", 144, S.710 [1980]) wurde in die BamHI-Stelle eingeführt, die nach der Substitution des Hindlll-BamHI-Fragments von pACYC 184 mit dem Kan^r-Gen von Tn 5 zurückblieb.

Das Xhol-Fragment, das die ocs-Cassette enthielt und in das das EcoRI-Nitrilase-Gen in die einzige EcoRI-Stelle der ocs-Cassette eingeführt wurde, wurde in pCGN 517 und pCGN~529 eingebaut, wobei zwei Plasmide pN 1 bzw. pN 2 entstanden, die zur Einführung in A. tumefaciens oder A. rhizogenes oder zur Integration in die T-DNA der Ti- oder Ri-Plasmide verwendet werden. Die Integration in die jeweiligen Plasmide kann gemäß Comai et al in „Plasmid", 10, S.21-30(1983) in drei Stufen durchgeführt werden: Eine Nacht alte Kulturen von E. coli-Wirten, die die Plasmide pRK 2073, PN1 oder PN 2 und A. tumefaciens A722 (Garfinkel in „J. Bacteriol.", 144, S.732 [1980]) oder A. rhizogenes A4T(White in „J. Bacteriol.", 144, S.710 [1980]) enthielten, wurden über Nacht gezüchtet, die entsprechenden Kulturen wurden vermischt und auf AB-Platten, die.150pg/ml Kanamycin enthielten, aufgestrichen. Einzelne Kolonien wurden zweimal aufgestrichen. Die richtige Integration wurde durch die Southern-Analyse der gesamten Agrobacterium-DNA nachgeprüft. Mit Endonuklease abgebaute DNA wurde mit einem mit Spalttranslatiertem pBrx8 untersucht.

Transformation und Regeneration von Tabakblattstücken, die zusammen mit A. rhizogenes kultiviert wurden. Tabakpflanzen wurden bei 25⁰C und 16 Stunden weißem Licht in MS-Medium (1 mg/l IAAundO,15mg/l Kinetin) gezüchtet. Drei Wochen alte Pflanzen, die eine Verpflanzung des Hauptsprosses überlebten, wurden als Gewebespender verwendet. Junge Blätter (bis zum 4. Blatt von oben) wurden ausgewählt, daraus Scheiben mit 2 mm im Durchmesser ausgestanzt und in Petrischalen (3cm Durchmesser) in 1 ml MS-Medium mit 1 mg/l IAAeingebracht. Nach Stehenlassen der Scheiben über Nacht in voller Dunkelheit wurden Agrobacterium-Zellen (A722 χ pN1 oder pN 2) in einer Menge von 10⁸ bis 10⁹/ml in Pflanzenkulturmedium diesen Kulturen zugegeben. Die Cokultivierung wurde 18 bis 24 Stunden im Dunkeln durchgeführt. Die Blattstücke wurden von dem Agrobacterium durch dreimaliges Waschen mit MS-Medium, dem Hormone fehlten und das 350mg/l Cefotaxin (Boehringer, Mannheim) enthielt, befreit. Die Blattstückchen wurden in Petrischalen mit einem Durchmesser von 9cm in 10ml hormonfreiem MS-Medium überführt. Die Petrischalen, die 0,6% Phytagar (Gibco) und350mg/l Cefotaxin enthielten, wurden mit Paraffin verschlossen und unter den gleichen Bedingungen wie die Gewebespenderpflanzen gehalten. Nach 2 bis 4 Wochen erschienen Wurzeln, die entnommen und in das gleiche Medium, das 2 mg/l IAA und 2 mg/l Kinetin enthielt, eingebracht wurden. Die Regenerationssprosse wurden in den folgenden 2 bis 5 Wochen sichtbar.

Die eingetopften Pflanzen wurden, wenn sie sechs Blätter hatten, mit einer Bromoxynillösung besprüht. Jede Pflanze in einem Topf mit 10cm Durchmesser (4 inch) erhielt 2,5ml Spray. Die Pflanzen wurden in einem Gewächshaus bei 25⁰C, 70% relativer Feuchtigkeit und 60stündiger Belichtung gezüchtet. Das Wachstum wurde 9 Tage nach dem Besprühen durch Zählen der neuen Blätter, die länger als 0,5cm waren, überprüft.

Nach dem oben beschriebenen Verfahren können Pflanzen erhalten werden, die bromoxynilresistent sind und im Feld in Gegenwart von Bromoxynil wachsen können, ohne daß dieses nachteilige Wirkungen auf ihr Wachstum ausübt. Erfindungsgemäß können nun Pflanzen erhalten werden, die herbicidresistent und insbesondere gegenüber spezifischen B'enzonitrilherbiciden resistent sind. Das heißt, daß die Nitrilase codierende Gen kann in einem Pflanzenwirt eingeführt werden, wodurch das Gen exprimiert wird und der Pflanze Benzonitrilresistenz verleiht. Außerdem kann das Enzym durch Klonen des Gens in einem geeigneten bakteriellen Wirt, in dem das Enzym exprimiert wird, gewonnen werden. Aktive Enzyme (was geprüft werden kann) finden eine Vielzahl von Anwendungen, beispielsweise bei Untersuchungen verschiedener Verbindungen oder des Benzonitrilsubstrats. Außerdem können die Enzyme und die die Enzyme exprimierenden Bakterien zur Entfernung der Benzonitrilherbicide aus verunreinigten Gegenden verwendet werden.

Der Stamm E. coli MM 294 (pBrx5) wurde bei ATCC am 22. Januar 1986 hinterlegt und durch die Freigabeerklärung Nr. 53435 freigegeben.

Claims

1. Nitrilasezusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie etwa 34kDal mit einer spezifischen Aktivität von mindestens etwa 0,1 μηηοΙ NH₃/min/mg Protein und Bromoxynil als Substrat aufweist.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine spezifische Aktivität von mindestens 0,5 μητιοΙ NH₃/min/mg Protein aufweist.

3. Verwendung der Nitrilasezusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie zur Entgiftung von mit Benzonitril-Herbiciden verunreinigten Gegenden, zum Schutz von Pflanzen gegen die cytotoxischen Wirkungen von Bromoxynil und zum Nachweis von Benzonitrilien und/oder anderen analogen Produkten eingesetzt wird.